DE2431270A1

DE2431270A1 - Antibiotische substanz, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung dieser antibiotischen substanz als wachstumsfoerderndes mittel

Info

Publication number: DE2431270A1
Application number: DE2431270A
Authority: DE
Inventors: Mamoru Arai; Hisayoshi Fukatsu; Noritoshi Kitano; Toshiaki Matsuzawa; Akio Torikata
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1973-06-30
Filing date: 1974-06-28
Publication date: 1975-01-16
Also published as: ATA539974A; NL7408869A; FR2234901B1; JPS5018266A; JPS5716640B2; DE2431270C2; AT329754B; FR2234901A1; CH596309A5; CH595775A5; AU7083774A; US3912811A; ZA744146B; BE817097A; GB1415618A

Description

ANTIBIOTISCHE SUBSTANZ, VERFAHREN ZU IHRER HERSTELLUNG UND VBRWEMDUNQ DIESER ANTISEPTISCHEN SUBSTANZ ALS WACHSTUMSFÖRDERNDES MITTEL

Die Erfindung betrifft eine neue antibiotisch wirksame Substanz, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung als wachstumsförderndes Mittel für Tiere.

Die Erfindung betrifft spezieller eine neue antibiotisch wirksame Substanz, die als "Pholipomycin" bezeichnet wird, und ein Verfahren zur Herstellung dieser Substanz mit Hilfe eines neuen Stammes des Genus Streptomyces. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung dieser neuen antibiotisch wirksamen Substanz als wachstumsförderndes Mittel für verschiedene Tiere, wie verschiedene Nutztiere, Geflügel und Haustiere.

Es wurde gefunden, daß· die neue, antibiotisch wirksame Substanz, Pholipomycin, in einer Kulturbrühe von Streptomyces lividoclavatus, Stamm Nr. 3176, gebildet wird, der aus einer in Obana, Tochigi Prefecture, Japan gewonnenen Erdprobe isoliert wurde und daß die so erhaltene neue antibiotische Substanz einen hochwirksamen wachstumsfördernden Effekt auf verschiedene Tiere zeigt,.wie Nutztiere, Geflügel, Haustiere und dergleichen.

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Bisher wurden einige antibiotisch wirksame Substanzen, wie Chloramphenicol, Aureomycin und dergleichen Tieren verabreicht, um eine prophylaktische Behandlung verschiedener Krankheiten, beispielsweise bei Nutztieren, Geflügel und dergleichen gleichzeitig mit einer Verbesserung der Mästung, einer Wachstumsförderung und einer Erhöhung der Futterauswertungsrate zu erreichen. Es hat sich jedoch gezeigt, daß diese bisher verwendeten Antibiotika einige Nachteile aufweisen, da sie Neigung haben,„in tierischen Produkten, wie Eiern, Fleisch und dergleichen zurückzubleiben und daß Mikroorganismen auftraten, die resistent gegen diese Arzneimittel sind. Unter diesen Umständen bestand auf diesem Fachgebiet ein ernsthaftes Bedürfnis nach der Entwicklung eines neuen Arzneimittels, das weniger stark aus dem Gastrointestinaltrakt der Tiere absorbiert wird.

Die erfindungsgemäß aufgefundene antibiotisch wirksame Substanz ist außerordentlich wertvoll für den praktischen Zweck der Nahrungsmitte !hygiene, da es sich gezeigt hat, daß sie bei oraler Verabreichung weniger stark in den inneren Organen absorbiert wird.

Die Erfindung bezieht sich daher zunächst auf eine neue antibiotisch wirksame Substanz, Pholipomycin, die wertvoll als wachstumsförderndes Mittel für Tiere ist.

Durch die Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Pholipomycin mit Hilfe eines neu aufgefundenen Mikroorganismus, Streptomyces lividoclavatus Nr. 3176 (NRRL 8022) zugänglich.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem die Verwendung des neuen Antibiotikums Pholipomycin als wachstumsförderndes Mittel für Tiere.

Andere Gegenstände und Vorteile der Erfindung sind aus der nachstehenden Beschreibung ersichtlich.

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Der erf indungsgemäß verwendete Pholipomycin bildende Stamm Streptomyces lividoclavatus Nr. 3176 hat folgende morphologische Eigenschaften:

1.) Bei Betrachtung unter dem Mikroskop zeigt sich, daß das Luftmyzel gut verzweigt ist und langgestreckte Lufthyphen aufweist. Die Lufthyphen sind sympodisch verzweigt, es werden jedoch keine Spiralen und Konidienketten beobachtet. Die^ Sporen sind kugelig bis elliptisch und haben eine Größe von 0,6 bis 0,8 χ 0,8 bis 1,1 p. Die Sporenoberfläche ist glatt. Die Sporenketten enthalten 10 bis 50 Sporen pro Sporenkette und sind durch kurze und am Ende verdickte Seitenzweige gekennzeichnet, die aus 2 bis 3 Sporen gebildet sind. Es bilden sich keine Geißelsporen und kein Sporangium und die Sporophoren befinden sich auf dem Luftmyzel.

2.) In Tabelle 1 sind die Ergebnisse gezeigt, die bei der Züchtung auf verschiedenen Kulturmedien erhalten wurden. Die Beob·^ achtung erfolgte nach zweiwöchiger Züchtung bei 28°C, wenn nichts anderes angegeben ist.

Tabelle 1

Medium Wachstum Luftmyzel

Substrat- Rückseite lösliches myzel Pigment

Saccharose- Nitrat- Agar	spärlich, weiß	spärlich, weiß	weiß	keines
Glucose- Asparagin- Agar	spärlich, bläulich grau	spärlich, weiß	bläulich- grau	keines
Glycerin- . Asparagin- Agar	spärlich, bläulich grau	reichlich, dunkel orange	dunkel orange	keines
Anorgani sche Sa^ze- St ärke- Agar	mäßig, bläulich grau	mäßig blaßgelb lich-braun	blaßgelb lich- braun	keines
mäßig
gut
gut
gut

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Tabelle 1 (Fortsetzung)

Tyrosinagar

Nähragarmedium

Hefeextrakt ■
Halzextrakt-Agar

Hafermehlagar

gut

spärlich, bläulichgrau

spärlich, weiß

reichlich reichlich, bläulichgrau

mäßig, blaßgelblich-orange lich-orange

mäßig, hellbräun- spärlich, hellbräun- lich-grau bräunlich-grau lich-grau

spärlich, blaßgelb- keines blaßgelb- lichlieh-braun braun

reichlich, hellbräun- keines hellbräun- lich-grau lich-grau

reichlich, blaßbraun keines blaßgelb-

3.) Die physiologischen Eigenschaften des Stammes Nr. 3176 sind in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle

Temperaturbereich für das Wachstum: Gelatine-Verflüssigung (18⁰C): Stärkehydrolyse:
Koagulation von Milch: Peptonisierung von Milch: Melaninb ildung:

10 bis 37 C

schwach

25°C, -

25⁰C, + (pH 6,4)

+ (in Tyrosin-Agar-Medium)

- (in Pepton-Hefeex-

trakt-Eisen-Agar-Medium)

- (in"Triptone-Bacto"*

-Hefeextrakt-Brühe)

Nitratre dukt ion:

* Handelsname der Difco Laboratories, USA.

4.) Das Schema der Ausnutzung von Kohlenstoffquellen des Stammes Nr. 3176 auf Pridham-Gottlieb-Agarmedium ist in Tabelle 3 gezeigt.

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Tabelle 3

L-Arabinose - Inosit ++

D-Xylose . - L-Rhamnose ++

D-rGlucose ++ Raffinose ++

D-Fructose . ++ D-Mannit

Saccharose ++

Aus der Gesamtheit der vorstehend angegebenen Eigenschaften zeigt sich, daß der Stamm Nr. 3176 dem Genus Streptomyces angehört, dessen Luftmyzel sympodisch verzweigt ist und auf den meisten Medien bläulich-rgrau ist. Auch sind seine Sporen kugelig bis elliptisch und die Sporenoberfläche ist glatt. Die am stärksten ausgeprägten Eigenschaften sind speziell darin zu sehen, daß er Sporenketten mit kurzen und am Ende verdickten Seitenzweigen aufweist, die zwei bis drei Sporen bilden.

Die Überprüfung von bekannten Stämmen mit den vorstehenden Eigenschaften zeigte, daß als nächstverwandter Stamm im Hinblick auf die Sporenbildung Streptomyces clavuligerus zu erwähnen ist, der in dem International Journal of Systematic Bacteriology, Band 21, Nr. 4, Seite 326 bis 331 (1971) beschrieben ist. Dieser bekannte Stamm unterscheidet sich jedoch darin grundlegend von dem Stamm Nr. 3176, daß der bekannte Stamm rechteckige bis zylindrische Sporen aufweist und daß sein Luftmyzel auf vielen Medien blaßgelblich-grün ist und darin, daß er Kohlenstoffquellen, wie D-Glucose, D-Fructose, Saccharose, L-Rhamnose, Raffinose und dergleiche, nicht verwertet. Aus den vorstehenden Vergleichsversuchen kann klar abgeleitet werden, daß sich der erfindungsgemäße Stamm deutlich von Streptomyces clavuligerus unterscheidet.

Aufgrund der vorstehend beschriebenen Kennzeichnen wurde der Stamm Nr. 3176 als neue Spezies identifiziert und als Strepto-

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myces lividoclavatus Stamm Nr. 3176 bezeichnet. Dieser Stamm Kr. 3176 wurde unter der Hinterlegungsnummer 2101 bei dem Technical Research Institute of Microbial Industry, Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan und unter der Hinterlegungsnummer NRRL-8022 in dem Northern Regional Research Laboratory, Northern Central Region, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, in Peoria, Illinois, USA hinterlegt.

Wenn auch die Eigenschaften des Stammes Nr. 3176 vorstehend erläutert wurden, ist es doch gut bekannt, daß verschiedene Eigenschaften von Streptomyces nicht feststehend sind, sondern natürlich und künstlich leicht variiert werden können. Die Stämme, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen alle Stämme des Genus Streptomyces, die zur Bildung von Pholipomycin befähigt sind.

Die Züchtung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann nach der allgemein für Streptomyces angewendeten Methode durchgeführt werden. Bevorzugt wird eine Schüttelkultur oder Submerskultur in einem flüssigen Medium.

Als Bestandteile des Mediums können beliebige der gut bekannten Nährstoffe für Streptomyces verwendet werden. So können beispielsweise als assimilierbare Kohlenstoffquelle Glucose, Glycerin, Maltose, Dextrin, Stärke, Lactose, Saccharose, Melassen, Sojabohnenöl, Bauinwollsamenöl und dergleichen und assimilierbare Stickstoffquelle Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl, Fischmehl, Korn- bzw. Maisquellflüssigkeit, Pepton, Fleischextrakt, Hefe, Hefeextrakt, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und dergleichen verwendet v/erden. Als anorganisches Salz können Natriumchlorid, Phosphate, Calciumcarbonat und dergleichen eingesetzt werden. Erforderlichenfalls können auch Spurenmengen eines Metallsalzes zugesetzt werden.

Bei der Durchführung der Züchtung in flüssiger Phase unter Be-

4098»':/ 1 3b "i

lüftung lind Rühren können in geeigneter Weise ein Antischaummittel, beispielsweise Silikonöl, Pflanzenöle, oberflächenaktive Mittel und dergleichen verwendet werden.

Der pH-Wert des Mediums kann in geeigneter Weise auf einen Wert im neutralen Bereich oder in der Nähe des·neutralen Bereiches eingestellt werden und die Züchtungstemperatur kann gewöhnlich 25 bis 30⁰C betragen, wobei speziell etwa 27°C bevorzugt werden.

Die Veränderung der Aktivität der antibiotisch wirksamen Substanz Pholipomycin, die im Verlauf der Züchtung in der Kulturbrühe gebildet wird, im Verlauf der Zeit, kann mit Hilfe der gut bekannten Zylinderabdruck-Testmethode (cylinder-plate-Testmethode) unter Verwendung von Staphylococcus aureus 209P als Test-Mikroorganismus bestimmt werden. Gewöhnlich kann die maximale Produktion von Pholipomycin mit Hilfe einer Züchtung während etwa 96 bis 240 Stunden erreicht werden.

Pholipomycin liegt überwiegend im festen Anteil der Kulturbrühe vor.

Pholipomycin kann aus der Kulturbrühe mit Hilfe verschiedener Methoden gewonnen werden, die auf dem Fachgebiet der Gewinnung antibiotischer Substanzen gut bekannt sind. So wird beispielsweise nach Beendigung der Züchtung die Kulturbrühe durch Zugabe einer geeigneten Säure angesäuert, mit einem Filterhilfsmittel, wie Diatomeenerde und dergleichen, filtriert, wobei Myzel und sonstige feste Masse gewonnen, die Diatomeenerde enthält, in welcher Pholipomycin aufgrund seiner ziemlich geringen Löslichkeit in Wasser unter sauren Bedingungen enthalten ist, und die so gewonnene Masse wird mit einem wassermischbaren Lösungsmittel, wie beispielsweise Aceton, Methanol oder einem Gemisch solcher Lösungsmittel extrahiert, um das gewünschte Pholipomycin zu gewinnen.

Andererseits kann das Pholipomycin, das in dem Filtrat der

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Kulturbrühe oder der Restflüssigkeit vorliegt, die nach der Destillation des organischen Lösungsmittels aus dem Myzelextrakt erhalten wird, durch Extraktion mit einem wasserunmischbaren organischen Lösungsmittel, wie n-Butanol, unter sauren Bedingungen gewonnen werden.

Der so erhaltene Pholipomycin enthaltende Extrakt wird der Destillation unter vermindertem Druck unterworfen, durch eine Schicht eines Anionenaustauscherharzes geleitet, so daß Pholipomycin aufgrund seiner ihm eigenen Acidität adsorbiert wird, und danach kann das adsorbierte Eholipomycin mit Hilfe eines geeigneten Elutionsmittels eluiert werden. In einigen Fällen kann der Extrakt durch eine Schicht eines Kationenaustauscherharzes geleitet werden, um basische Verunreinigungen zu entfernen.

Als Beispiele für Anionenaustauscherharze können stark basische Anionenaustauscherharze genannt werden, wie Dowex IxI (der Dow Chemical Co.) und dergleichen; vorzugsweise werden jedoch schwach basische Anionenaustauscherharze verwendet, wie Duolite A-2 (der Diamond-Alkali Co., USA).

Zu Beispielen für geeignete Kationenaustauscherharze gehören stark saure Kationenaustauscherharze, beispielsweise Dowex 50V/ χ 4 (Dow Chemical Co., USA), Amberlite IR-120 (Rohm & Haas Co., USA) und dergleichen.

Zur weiteren Reinigung von Pholipomycin kann die Chromatographie unter Verwendung von Silicagel, mikrokristalliner Cellulose (Avicel, Asahi Kasei Kogyo K.K., Japan), Diäthylaminoäthylcellulose (Anionenaustauschercellulose der Serva Feinbiochemica, Deutschland) und dergleichen durchgeführt werden.

Ferner kann Pholipomycin mit Hilfe anderer Methoden gereinigt werden, wie durch Dialyse zur Entfernung niedrigmolekularer Verunreinigungen im Hinblick auf die Tatsache, daß Pholipomycin

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selbst eine hochmolekulare Substanz ist, durch Gelfiltration mit Sephadex G-50 (Pharmacia Fine Chemical A.B., Schweden) und dergleichen.

Die wässerige Lösung, die das so extrahierte und gereinigte Pholipomycin enthält, wird danach konzentriert und gefriergetrocknet, oder zu der Lösung wird ein wassermischbares organisches Lösungsmittel, wie Aceton und dergleichen, zugesetzt, um die gewünschte antibiotische Substanz auszufällen, wobei reines Pholipomycin in Form eines weißen Pulvers erhalten wird.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Pholipomycin v/erden nachstehend angegeben.

1.) Aussehen:

Yfeißes Pulver

2.) Schmelzpunkt:

Kein deutlicher Schmelzpunkt, allmähliche Braunverfärbung bei 250⁰C oder darüber.

3.) Elementaranalyse:

C : 50,1556 H : 7,14 # N : 5,4850 P: 2,33 %.

4.) Mole kulargewicht:

5.100, festgestellt durch die Gelfiltrationsmethode unter Verwendung von Sephadex G-100 in einer 0,05 m Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7jO.

5.) Spezifische Drehung

2i
D

[α] £° = + 6,0° (C = 1, H₉O)

6.) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:

Die ¥erte der Absorptionsmaxima sind in Figur 1 gezeigt und die entsprechenden Werte von E₁ ⁰S sind in Tabelle 4 angegeben.

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	Tabelle 4	2431270
Lösungsmitte1		Absorptionsmaxima
H₂O 0,1 η HCl 0,1 η NaOH		257 142 245 93 258 144

7.) Infrarot-Absorptionsspektrum:

Das IR-Spektrum. ist in Figur 2 gezeigt (gemessen im KBr-Preßling).

8.) Neutralität, Basizität oder Acidität:

Es handelt sich um eine saure Substanz (pKa= 4,37» 9,43 HpO)

9.) Löslichkeit:

Leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol und n-Butanol, wenig löslich in Aceton, Chloroform und Äther.

10.) Farbreaktion:

Zeigt positive Tollens-Reaktion. Vorgetäuscht positive Elson-Morgan-Reaktion. Negativ gegenüber der Ninhydrin-, Benedict-, Biuret-, Bial-, Ferrichlorid- und Anthron-Reaktion. Beim Erhitzen mit Pyridin wird eine positive Ninhydrin-Reaktion erhalten.

11.) Stabilität:

Die wässerige Lösung ist außerordentlich stabil bei pH 4 bis 10. Beim Erhitzen der wässerigen Lösung von Pholipomycin in einer Konzentration von 200 ug/ml während 30 Minuten auf 60°C bleibt bei einem pH-Wert von 6 bis 8 die Aktivität unverändert bei 100% und selbst bei pH 4 und 6 bleibt eine Aktivität von 90% erhalten.

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12.) Dünnschichtehromatographie:

Durch Dünnschichtchromatographie (aufsteigende Methode) unter Verwendung einer Cellulose-Chromatographieplatte 6065 (Eastman Kodak Co., USA) und mit Hilfe einer Silicagel-beschichteten Platte (Silicagel Chromatogram 6060 der Eastman Kodak Co.) betragen die Rf-Werte 0,74 bzw. 0,25 in n-Propanol/2n ΝΗλΟΗ (7:3). Als Nachweismathode wird die Bioautographie mit Staphilococcus aureus 209P oder eine UV-Absorptionsmethode verwendet.

Die biologische Aktivität von Pholipomycin wird nachstehend aufgezeigt.

1.) Antimikrobielles Spektrum.

Die inhibierenden Mindestkonzentrationen gegenüber verschiedenen Mikroorganismen sind in Tabelle 5 angegeben.

Tabelle 5

Te storganismus

Inhibierende Mindeskonzen-

tration,
MIC (/l)

Medium A

Medium B

Staphylococcus aureus 209P JC-2 0,39

S. aureus 56 (mehrfach resistent) 0,39

S. aureus 193 ( " " ) 0,39

50

Bacillus subtilis PCI 219 -

Sarcina lutea PCI 1001 >100

Corynebacterium xerosis B 58-3 >100

Escherichia coli NIHJ JC-2 50

E. coli K-12 · 12,5

E. coli (ST-resistent) 25

Pseudomonas aeruginosa B-1-1 3,12

P. Sp. SC-8328 100

0,09 0,19 0,19 0,09

12,5 100
25

12,5 25
0,78

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Tabelle 5 (Fortsetzung)

Proteus vulgaris B-30-8 Klebsiella pneumonia PCI 602■ Aeromonas liquefacieus Y-^62 Mycobacterium smegmatis ATCC 607

0,78	3	,12
25	12	,5
0,78	0	,39
50	_

Medium C

Candida albicans YU 1200 >100

Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 >100

Trichophyton mentagrophytes F 63-9 >100

Fusarium moniliforme IAM 5062 >100

Piricularia oryzae IAM 5087 >100

Medium A: Nähragar mit 1 % Glycerin Medium B: Herzinfusion-Agar Medium C: Dextrose-Agar nach Sabouraud

Züchtung: Die MIC wurde nach 24-stündiger Inkubation bei 37⁰C bei Bakterien (48 Stunden bei Mycobacterium smegmatis) und nach stündiger Inkubation bei 28⁰C bei Hefen und Fungi bestimmt.

2.) Toxizität:

Der Wert LDc₀ von Pholipomycin bei der Maus bei Verabreichung durch intravenöse Injektion beträgt 600 bis 800 mg/kg. Beim Test der Fischtoxizität mit Killifisch in einem Bad mit 200 ppm Pholipomycin wurde keine abnormale Erscheinung beobachtet.

3.) Schützende Aktivität:

Es wurde festgestellt, daß Pholipomycin Wirksamkeit bei einem mit Staphylococcus aureus an der Maus durchgeführten Schutztest zeigt. Dabei wurden im einzelnen Mäuse des RFVL-Stammes mit einem Durchschnittskörpergewicht von etwa 20 g in Gruppen, die aus je 5 Tieren bestanden, mit Staphylococcus aureus Nr. 42, einem mehrfach resistenten Stamm, in

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eine Menge von 1 χ 10 Zellen pro Maus inokuliert und Pholipomycin wurde subkutan in einer sterilen Natriumchloridlösung in Dosen von 50, 100 und 200 mg/kg verabreicht. Die Verabreichung erfolgte zweimal, nämlich unmittelbar nach der Inokulation und 4 Stunden nach der Inokulation. Die Anzahl der überlebenden Mäuse betrug 0,1 bzw 5.

Wie aus den vorstehenden Angaben 1.)-bis 3.) ersichtlich ist, zeigt Pholipomycin starke antibakterielle Aktivität gegen grampositive und gram-negative Bakterien und ist insbesondere hochwirksam gegen verschiedene resistente Mikroorganismen und zeigt extrem geringe Toxizität. Das erfindungsgemäße Antibiotikum ist daher auch ^rertvoll als Arzneimittel für den Menschen.

Durch die Ergebnisse von Untersuchungen von bekannten Antibiortika, die die vorstehend beschriebenen physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften zeigen, wurde bestätigt, daß das erfindungsgemäße Pholipomycin wahrscheinlich nahe verwandt mit Antibiotika ist, wie Macarbomycin, Diumycin A und Moenomycin.

Bs ist jedoch zu betonen, daß das erfindungsgemäße Antibiotikum Pholipomycin sich von den vorstehend genannten bekannten Antibiotika in den nachstehend genannten Punkten unterscheidet.

1.) Physikalisch-chemische Eigenschaften

Ein Vergleich der physikalisch-chemischen Eigenschaften von Pholipomycin und den vorstehend genannten-bekannten antibiotischen Substanzen wird in Tabelle 6 gegeben.

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Tabelle 6

%_/
to

Eigenschaften

H₂O

Pholipomycin

A

Moenomvcin

C

,4

D

N₇

-

- Macarbomycin

MeOH)

Diumycin
A

CO

00
00

F. (Zers.)

0,1 η NaOH

25O⁰C

,3

190 - 200

251 - 257

N)

CJ
*■«%.

Analyse-(%)

0,1 η HCl

- ^NH4

,7

-Na

"" 4 Q/

-Na

O

00
>

C

50,15^?0

48,6^

49

H₁₃₅

43,7°^

47,35^

48,65^

H

7,14

7,2

7

P

7,1

7,25

5,42

O
m

N

5,48

5,3

5

5,7

4,90

4,00

ο

P

. 2,33

1,8

1

1,9

2,12

1,91

\—

Empirische
Formel

^C5O~65

^C70^H124

^C75

^C68~79

^C68~72

'ζ.
ω
Τ3

H₈₅-₁₁₁

°40^P

^N6

°42

^H125~144

^H93"1O7^N5

„TED

^N5"6°25-35^P

^N6"7°41"48^P

°38-40^Na8^P

UV

Ψ ^E1cm

257 142

258

0.1 η KOH

258 144

258

106

-259 120

257 120

245 93

246

106

246 70

246 78

78

-247

+ 6,0°(C=1

+8,0°(C=:1

Tabelle 6 (Fortsetzimg)

Glucosamin + + + + Chinovosamin + + +

Glucose ■ - + + +

DC * 0,53 0,61 0,73 0,43 0,39

S '* EtOH-concNH₃~H₂0 (8:1:1)

cc Viermalige Mehrfachentwicklung auf einer Silicagelchromatographieplatte 6060.

Wie aus Tabelle 6 ersichtlich ist, unterscheidet sich Pholipomycin deutlich von Macarbomycin, Diumycin A und Moenomycinen dadurch, daß Pholipomycin keine Glucose als Konstitutions-Zucker enthält, während alle bekannten Antibiotika Glucose als Zucker in ihrer Konstitution enthalten. In anderer Hinsicht ist es jedoch den bekannten Antibiotika ähnlich. Die Analyse der in der Konstitution vorhandenen Zucker erfolgt durch Hydrolyse jeder

^Tr ο

antibiotischen Substanz in 2 η Chlorwasserstoffsäure bei 105 C während 3 Stunden und anschließende Papierchromatographie des Hydrolysats (n-Butanol-Pyridin-Wasser 6:4:3, absteigende Methode, 20 Stunden).

Als andere bekannte Antibiotika, von denen angenommen wird, daß sie dem erfindungsgemäßen Pholipomycin ähnlich sind, sind Prasinomycine A, B und C, Moenomycine E, F, G und H, Diumycin B, 19402RP, 8036RP, 11837RP und dergleichen zu nennen. Diese Antibiotika unterscheiden sich jedoch in mehrerer Hinsicht deutlich von Pholipomycin. So sind im einzelnen die Prasinomycine in Chloroform löslich, das Antibiotikum 19402RP enthält ein Schwefelatom und andere zeigen im UV-Spektrum kein Absorptionsmaxima und unterscheiden sich dadurch deutlich von Pholipomycin.

2.) Vergleichstests der antibakteriellen Aktivität.

Die Aktivität jedes Antibiotikums wurde mit Hilfe der Zylinderabdruck-Methode (cylinder-plate-Methode) unter Verwendung von 12,5, 50 bzw. 200 pg/ml des Antibiotikums in m/15 Phosphatpuffer vom pH 7,0 geprüft. Die prozentuale Aktivität wurde unter Verwendung von Pholipomycin als Standard-Antibiotikum berechnet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefaßt.

Tabelle 7

Pholipomycin Macarbo-. Diumycin Moenomymycin ein (A+C)

S. aureus 209P 100 164 99,3 131 E. coli NIHJ 100 16,2 11,6 37,0

P. aeruginosa B-I-»1 100 ~35,7 . 27,7 48,3

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Wie aus Tabelle 7 ersichtlich ist, unterscheidet sich Pholipomycin von den vorstehend erwähnten antibiotischen Substanzen, die ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften haben, im Hinblick auf die antibakterielle Aktivität und das antibakterielle Spektrum. So hat speziell Pholipomycin die charakteristische Eigenschaft einer starken antibakteriellen Aktivität gegen gramnegative Bakterien.

Aus den. Vergleichsuntersuchungen der vorstehend angegeben physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften ist leicht zu schließen, daß das erfindungsgemäße Antibiotikum Eholipomycin klar unterscheidbar oder verschieden ist von anderen bekannten antibiotischen Substanzen und daher eine neue antibiotische Substanz darstellt.

Die vorstehend genannten antibiotischen Substanzen sind in nachstehend aufgeführten Literaturstellen beschrieben:

1) Moenomycin Ä, C, D, E, F, G und H:

Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1965, S. 734 bis 736

und 737 bis 742 (1966)und

Journal of Antibiotics, 22, S. 12, S. 597 bis 602 (1969).

2) Macarbomycin:

Journal of Antibiotics, 2£, S. 1, 48 bis 50 (1970).

3) Diumycin A und B:

Journal of Antibiotics, 22, S. 10, 490 bis 493 (1969)

4) 19402RP:

NL-OS 6 802 093 (1968).

5) Prasinomycin A, B und C:

Nature, 213 , S. 1092 bis 1094 (1967).

6) 8036RP:

Südafrikan. PS 65/6204 (1966).

40988 3/138 1

7) 11837RP:

Abstract, The 9th International Congress for Microbiology, 165 (1966).

Die Herstellung von Pholipomycin wird nachstehend anhand einiger repäsentativer Beispiele vollständig beschrieben. Diese Herstellung kann vorteilhaft mit Hilfe verschiedener Verfahrensweisen durchgeführt v/erden, die von der Art und den Eigenschaften abhängen, wie sie erfindungsgemäß aufgefunden wurden. Das Verfahren zur Herstellung von Pholipomycin ist daher nicht auf die nachstehend angegebenen Beispiele beschränkt, sondern kann nach all den verschiedenen üblichen Verfahren vorgenommen werden, welche die Herstellung, Extraktion und Reinigung von Pholipomycin mit Hilfe eines Pholipomycin bildenden Mikroorganismus des Genus Streptomyces ermöglichen und es können bekannte Verfahrensmaßnahmen angewendet werden.

Beispiel 1

Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Glucose	2,0%	FIe is chextrakt	0,5#
Stärke	1,QJfi	Calciumcarbonat	0,396
Bäckerhefe	0,996	Natriumchlorid	*0,5%*
Polypepton	*0,5%*

Auf dem vorstehend angegebenen Medium wurde eine Impfkultur des Stammes 3176 während 24 Stunden in einem Tank mit einem Volumen von 100 1 gezüchtet". Mit je 30 1 der so erhaltenen Impfkultur wurden zwei Fermentationstanks mit einem Fassungsvermögen von 600 1 angeimpft, die 300 1 des vorstehenden Mediums enthielten (pH 7,2 vor der Sterilisation). Die Züchtung erfolgte bei einer Temperatur von 28 + 1°C, 150 Upm und einer Belüftung von 300 l/Minute. Nach 114 Stunden wurde die maximale Bildung von Pholipomycin erreicht.

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640 1 der so erhaltenen Kulturbrühe wurden mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt, dann wurden 40 kg Diatomeenerde zugesetzt und die Filtration erfolgte mit Hilfe einer Filterpresse.

Zu dem mit Diatomeenerde vermischten Myzelkuchen wurden 300 1 wasserfreies Aceton zugegeben, wobei eine Acetonkonzentration von 80% erzielt wurde. Auf diese Weise wurde Pholipomycin extrahiert. Der Sxtraktionsrückstand wurde mit Hilfe einer Filterpresse abgetrennt und erneut mit 300 1 80%-igem wässerigem Aceton extrahiert. 580 1 der kombinierten Extrakte (Pholipomycingehalt 57»8 g) wurden unter vermindertem Druck auf 60 1 konzentriert und nach dem Abdestillieren des Acetons wurde der pH-Wert des Rückstandes mit Schwefelsäure auf 2,5 eingestellt und der Rückstand wurde zweimal mit 35 1-Ante ilen n-Butanol extrahiert.

Der erhaltene Extrakt (56 1) wurde zweimal mit 37,5 1-Anteilen 0,1 η xtfässerigem Ammoniak extrahiert, wobei Pholipomycin in die wässerig-ammoniakalische Phase übergeführt wurde.

Der so erhaltene Extrakt (79 1) wurde unter vermindertem Druck auf 1,19 1 konzentriert (Pholipomycingehalt 22,6 g, Ausbeute 39,1 %).

Das so erhaltene Konzentrat wurde an einer Säule adsorbiert, die mit 3 1 Duolite-A-2 (0H-Form) gefüllt war, und, nach dem Waschen mit 6 1 Wasser, wurde Pholipomycin mit 0,1 η wässerigem Ammoniak extrahiert.

25,5 1 des so erhaltenen aktiven Eluats wurden unter vermindertem Druck auf 1,62 1 konzentriert. Dieser Anteil wurde dann gefriergetrocknet, wobei 26,2 g Pholipomycin als rohe pulverförmige Substanz erhalten wurden. Die Reinheit betrug 50,0 %, die Ausbeute 22,6%.

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Beispiel 2

Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung verwendet:

Glucose	4 %	FeSO₄.7H₂O	0,002
Fleischextrakt	0,2 %	CuSO₄.7H₂O	0,002
Sojab ohnenmehl	1,5 %	AlCl₃.6H₂O	0,002
NaH₂PO₄	0,05%	Na₂MoO₄.2H₂O	0,002
MgSO₄.7H₂O	0,01%	CoSO₄.7H₂O	0,002
MhSO₄.7H₂O	0,002%	Baumwollsamenöl	0,1
ZnSO₄.7H₂O	0,002%	Antis chaummitte1	0,002
		(Adekanol LG126
		der Asahi Denka
		Kogyo K. K.)

15 1 des vorstehend beschriebenen Mediums (pH 7,0 vor der Sterilisation) wurden in einen Fermenter (jar fermenter) mit 30 Fassungsvermögen gegeben, der Inhalt wurde bei 120⁰C während 30 Minuten sterilisiert und dann abgekühlt. Danach wurden 50 ml der Impfkultur vom Stamm 3175, die auf 500 ml des vorstehend beschriebenen Mediums in einem Erlenmayer-Kolben mit 2 1 Fassungsvermögen während 72 Stunden bei 28⁰C unter Schütteln auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung gezüchtet worden war, in den Fermenter eingeimpft und die Züchtung erfolgte bei einer Temperatur von 28 + 1⁰C, unter Belüftung mit 20 l/Minute, bei 135 Upm und einem Innendruck von 1,1 kg/cm . Nach 240 Stunden wurde die maximale Bildung von Philipomycin von 150 iig/ml erreicht.

Die aus 3 Fermentern (jar fermenters) erhaltene kombinierte Kulturbrühe von 40 1 wurde mit Diatomeenerde als Filterhilfsmittel filtriert und mit dem gleichen Volumen Wasser gewaschen.

8,5 kg des mit Diatomeenerde erhaltenen Myzelkuchens wurden dreimal mit 75%-igem wässerigem Methanol extrahiert, wobei 36 Extrakt, erhalten wurden.

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Der Extrakt wurde durch eine Kolonne geleitet, die mit 1,9 1 Dowex 5OW4 (H⁺-Form) gefüllt war. Die Kolonne wurde dann mit 70^-igem wässerigem Methanol gewaschen, wobei ein Gesamtvolumen von 40 1 der kombinierten Flüssigkeiten erhalten wurde. Die so erhaltene Flüssigkeit wurde durch eine mit 2 1 Duolite-A-2 (Essigsäureform) gefüllte Kolonne geleitet, wobei Eholipomycin an der Kolonne adsorbiert wurde. Die Kolonne wurde dann mit 2 1 7096-igem wässerigem Methanol und anschließend mit 2 1 Was-' ser gewaschen und dann mit 0,5 η wässerigem Ammoniak eluiert.

2,49 1 des aktiven Eluats (Aktivitätsausbeute 58,5#) wurden unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft und unlösliche Verunreinigungen wurden durch Zugabe von Methanol entfernt.

84 ml der in Methanol löslichen Fraktionen wurden tropfenweise in 2 1 Aceton gegeben, um Pholipomycin auszufällen«

Der so erhaltene Niederschlag wurde gewonnen und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 12,7 g Pholipomycin in Form einer pulverförmigen Rohsubstanz (Reinheit 27,1 %, Ausbeute 56,Ο?6) erhalten wurden.

Das rohe Pulver wurde in Methanol gelöst, die resultierende Lösung wurde an einer mit 160 ml Silicagel gefüllten Säule (Wakogel C-200 der Wako Pure Chemical Industries Ltd., Japan) in Chloroform-Methanol (6:4) adsorbiert. Verunreinigungen wurden mit 3 1 Chloroform-Methanol (6:4) entfernt und Pholipomycin wurde dann mit Chloroform-Methanol (5:5) eluiert.

Die Aktivität der Eluate wurde durch Dünnschichtchromatographie überwacht, wobei 4 1 der Fraktionen mit einem geringeren Gehalt an Verunreinigungen gewonnen wurden, die dann zur Trockene eingedampft wurden. Dabei wurden 2,07 g Pholipomycin in Form eines rohen Pulvers erhalten (Reinheit 75,8 %, Ausbeute 25,6 %).

Die so erhaltene rohe pulverförmige Substanz wurde in 9 ml Was-

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ser gelöst und an einer Säule adsorbiert, die mit 200 ml DEAE-Cellulose (OH~-Form) gefüllt war. Nach dem Waschen mit 1 1 wässerigem Ammoniak vom pH 9 wurde die Elution mit 0,01 η wässerigem Ammoniak durchgeführt, wobei 1,06 1 der aktiven Fraktionen gewonnen wurden, die jeweils einen einzigen Flecken im Dünnschichtchromatogrannn ergaben. Die vereinigten Fraktionen wurden unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, ■wobei 955 mg Fholipomycin einer Reinheit von 97,0% erhalten wurden. Die Ausbeute betrug 15,1 %» Das Produkt wurde in 5 ml Methanol unter Erhitzen gelöst und die resultierende Lösung wurde abgekühlt. Der Niederschlag wurde abgetrennt und getrocknet, wobei 474 mg reines Pholipomycin erhalten wurden. Ausbeute 7

Das Pholipomycin, das mit Hilfe des vorstehend beschriebenen Verfahrens hergestellt werden kann, eignet sich als wachstumsförderndes Mittel für Tiere.

Wie vorstehend erläutert wurde, zeigt Pholipomycin starke antibakterielle Aktivität gegen Bakterien und Brauchbarkeit zum Verhindern und zur Behandlung von Krankheiten bei Tieren, die durch solche Bakterien verursacht werden. Von größerer Bedeutung ist außerdem die Tatsache, daß Pholipomycin in wirksamer Weise zum Zweck der Wachstumsförderung verschiedener Tiere verwendet werden kann. Speziell wenn Pholipomycin Tieren oral verabreicht wird, kann das Wachstum von Tieren stark gefördert werden, während extrem geringe Absorption aus dem Gastrointestinaltrakt und geringe Rückstandsbildung in tierisehen Geweben beobachtet werden.

Es wird angenommen, daß diese Tatsache das fast vollständige Fehlen von Pholipomycin in tierischen Produkten anzeigt, wie in Eiern, Fleisch und dergleichen, wodurch ein großer Vorteil im Hinblick auf die Nahrungsmittelhygiene erzielt werden kann.

Unter der Bezeichnung "Wachstumsförderung von Tieren* soll eine Erhöhung der Körpergewichtszunähme, eine Verbesserung

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der Rate des Futterumsatzes und eine Erhöhung der Eierlegeleistung und dergleichen verstanden werden.

Tiere, auf vrelche die Erfindung angewendet werden kann und denen das erfindungsgemäße Pholipomycin verabreicht werden kann, sind beispielsweise Nutztiere, wie Rinder, Pferde, Schweine, Schafe, Ziegen und dergleichen, Geflügel, wie Hühner, Truthühner, Enten und dergleichen, Haustiere, wie Hunde, Katzen, kleine Vögel und dergleichen.

Die Verabreichung von Pholipomycin kann vorzugsweise auf oralem Weg erfolgen; Pholipomycin kann jedoch auch im Gemisch mit einem Futtermittel oder mit Trinkwasser verabreicht werden. Am stärksten bevorzugt wird die Verabreichung von Pholipomycin im Gemisch mit einem Futtermittel. Wenn Pholipomycin als Futtermittelzusatz verwendet v/erden soll, kann es dem Futter für sich oder in Kombination mit einem Exzipienten oder Streckmittel niederer Toxizität, mit einem Nahrungsmittel-Zusatzstoff, wie Vitaminen, Mineralstoffen, Aminosäuren und dergleichen, einer antibiotischen Substanz, wie Macarbomycin, Moenomycinen und dergleichen, einem Antikokzidiosemittel, wie Beclothiamin, Amprolium, Buquinolat, Clopidol (3,5-Dichlor-2,6-dimethyl-4-pyridinol) und dergleichen, oder einem Enzym, wie Lysozym und dergleichen, zugemischt werden.

Als wachstumsförderndes Mittel kann Pholipomycin nicht nur in gereinigter Form, sondern auch in Form des gezüchteten Myzels selbst oder in roher Form verwendet werden, wie sie in jeder beliebigen Stufe während der Extraktion und Reinigung der Substanz erhalten wird.

Die Menge des dem Futter einzuverleibenden Pholipomycins beträgt gewöhnlich und vorzugsweise 0,1 bis 10 ppm (auf Basis seiner Aktivität), bezogen auf das Futter, Wasser oder eine andere Grundlage, die zugesetzt werden soll, und die vorstehend angegebene Menge zeigt auch nach langer Dauer

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der Verabreichung keine nachteilige Wirkung auf die Tiere.

Der überragende wachstumsfordernde Effekt, der erfindungsge mäß erzielt wird, wird nachstehend ausführlicher anhand der Beispiele erläutert.

Beispiel ^

Wirkung auf das Wachstum von Fleischhühnern (Hühnerhaus;. Floor-pen-test).

1.) Küken:

Männliche und weibliche junge Küken eines Fleischhühnerstammes (GOTO 606) wurden in Gruppen von je 15 Küken verwendet. Nach dem Ausbrüten wurde ein einzelnes Küken mit einem Flügelband gewogen.

2.) Futtermittel:

Die Hauptbestandteile des verwendeten Futtermittels sind in Tabelle 8 zusammengefaßt. Es ist zu beachten, daß das Futter weder wachstumsfördernde Mittel noch antibiotische Substanzen enthält.

Tabelle 8

Gelber Mais 56,98 %

Fischmehl 10,00 %

Sojabohnenmehl 24,00 %

Qualitätstalg (tallow fancy) 5,00 %

Alfalfamehl ' 1,00 %

Mineralstoffe* . 2,17 9^

Vitamin A 20.000IE/kg

Vitamin D₃ 4.000ICE/kg

Vitamin E 1OOIE/kg

Andere Vitamine** 0,16 %

Methionin " 0,30 %

Lysin 0,20 %

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Tabelle 8 (Fortsetzung)

Ethoxyquin (Antioxydationsmittel) 10 ppm

Beclothiamine (Antikokzidiosemittel) 100 ppm

Clopidol (Antikokzidiosemittel) ' 100 ppm

* Mineralstoffe (in 1 kg des Futters)

CaCO^ 8,0 g

CaHPO₄.2H₂O 6,0 g

NaCl 5,0 g

KH₂PO₄ 2,0 g

MhSO/, 55 mg

MgSO₄ 500 mg

KT . 0,53 mg

FeCgH₅O₇^H₂O 80 mg

CuSO₄.5H₂O 4 mg

5ZnO.2CO₃.4H₂O 50 mg

CoCl₂.6H₂O 0,30 mg

Andere Vitamine (in 1 kg des Futters)

2,5 mg 5,5 mg 9,3 mg 37,0 rag 6,7 mg 0,09mg 1000 mg 500 mg 0,55mg 0,53mg 0,01 rag

3.) Konzentration des zuzusetzenden Pholipomycins:

Dem Futtermittel wurden 2,5 ppm (bezogen auf die Aktivität)

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vitamin	^B1	^B6	K₁
Vitamin	^B?
Ca-Pantothenat	Cholinchlorid
Niacin	Inosit
Vitamin	Folsäure
Biotin	Vitamin
	Vitamin

Pholipomyein einer Reinheit -von 58,3 % einverleibt. Sine Vergleichsprobe ohne Zusatz von Pholipomycin wurde gesondert hergestellt.

4.) Testmethode:

Junge Küken wurden auf ihren Gesundheitszustand untersucht und gesunde Küken wurden gewogen. Die Küken wurden in mehrere Testgruppen unterteilt, die keinen Unterschied im durchschnittlichen Körpergewicht zeigten und ständig mit einer Starterration für Fleischhühner während eines Monats gefüttert. Jede Gruppe bestand aus 30 Küken und die Küken wurden frei mit dem Futtermittel und Trinkwasser gefüttert. Das Körpergewicht der Küken wurde α ede Woche bestimmt und die Futtermittelaufnahme wurde stets dann gemessen, wenn neues Futter zugeteilt wurde.

5.) Auswertung und Testergebnisse:

Der durch das erfindungsgemäße Pholipomycin erzielte Effekt wurde aus der Zunahme des Körpergewichts und der Futterumsatzrate ausgewertet.

Körpergewichtszunahme (g) = End-Körpergewicht

- Anfangs-Körpergewicht

Gesamt-Futteraufnähme

Futterumsatzrate =

Gesamt-Körpergewicht

Die Testergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengefaßt.

Tabelle 9

Pholipomycin-Gruppe Kontrollgruppe

Durchschnittliches Anfangs -Körpergewicht (g) 39,0+2,4* 39,1+2,6*

Durchschnittliche Körpergewichtszunahme (g) 560,6 +67,2* 529,4 +62,5*

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Tabelle 9 (Fortsetzung)

Futter-Umsatzrate 1,77 1,92

* Standardabweichung

Wie aus Tabelle 9 ersichtlich ist, wird bei der Pholipomycingruppe im Vergleich mit der Kontrollgruppe der Effekt einer er-, höhten Körpergewichtszunähme und einer verbesserten Futterumsatzrate beobachtet.

Beispiel 4

Wirkung auf das Wachstum von Fleischhühnern (Batterietest).

Der Versuch wurde im wesentlichen nach den gleichen Verfahrensweisen und unter den gleichen Bedingungen wie in dem vorstehenden Beispiel durchgeführt, mit der Ausnahme, daß eine Käfig-Mästung durchgeführt wurde. Dabei wurden die in Tabelle 10 angegebenen Testergebnisse erhalten. Die Käfig-Mästung wurde durchgeführt, indem die Hühnchen in einem Brüter gehalten wurden, der mit einem elektrisch geheizten Drahtboden ausgestattet war, und kontinuierlich während 4 Wochen gefüttert wurden.

Tabelle 10

Pholipomycin-Gruppe Kontrollgruppe

Durchschnittliches Anfangs-Körpergewicht (g) "37,6+ 1,7* 37,5+ 2,1*

Durchschnittliche Kör- - ·

pergewichtszunähme (g) 490,6 + 66,5* 460,2 + 56,5*

Futterumsatzrate 1,61 1,65 * Standardabweichung

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Beispiel

Wirkung auf das Wachstum von Fleischhühnern (Peldtest) 1.) Hühnchen:

Es "wurden Hühnchen der französischen Spezies Studier verwendet, wobei jede Gruppe aus 100 Hühnchen ohne Trennung nach dem Geschlecht bestand. Nach dem Ausbrüten wurde ein einzelnes Küken mit einem Flügelband gewogen.

2.) Futtermittel:

Es wurde eine handelsübliche Futtermittelration verwendet (hergestellt von Sumitomo shiryo K.K., Japan), die keine wachstumsfördernden Mittel und keine Antibiotika enthielt.

3.) Konzentration des zuzumischenden Pholipomycins:

2,5 ppm (bezogen auf die Aktivität) von Fholipomycin einer Reinheit von 50% wurden dem Futtermittel einverleibt. Gesondert wurde eine Vergleichsprobe ohne Zusatz von Pholipomycin hergestellt.

4.) Testmethode:

In einem Brüter vom Regenschirmtyp (umbrella-typed brooder), der sich mit Propangas beheizen ließ, wurden Küken bis zum Alter von 2 Wochen aufgezogen und dann kontinuierlich bis zum Alter von 8 Wochen. Das Futter und das Trinkwasser wurden frei angeboten und während der Testperiode wurden in üblicher Weise die Impfung mit Geflügelpocken- Vakzine und Vakzine gegen die Newcastle-Krankheit durchgeführt.

5.) Auswertung und Testergebnisse:

Die Auswertung erfolgte in gleicher Weise wie im vorstehenden Beispiel 3. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammengefaßt, in der die Bezeichnung Lebensfähigkeit (%) folgende Bedeutung hat:

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1989 +	269*	1869 i	333*
2,	32	2,	68
99		94

Anzahl der beim abschließenden Wiegen nach dem anfänglichen Wiegen überlebenden Küken
^_ . , _x 100

Anzahl der ursprünglich verwendeten Küken

Tabelle 11

Pholipomycin-Gruppe Kontrollgruppe

Durchschnittliches Anfangs-Körpergewicht (g) 41,0 40,9

Durchschnittliche Körpergewichts zunähme (g) Putterumsat zrate Lebensfähigkeit {%)

* Standardabweichung

Wie aus Tabelle 11 ersichtlich ist, wird mit Hilfe des erfindungsgemäßen Zusatzes nicht nur eine Verbesserung der Körpergewichtszunahme und der Futterumsatzrate erreicht, sondern die Aufzuchtrate wird stark verbessert.

Beispiel 6

Wirkung auf das Wachstum von Schweinen (Feldtest).

Schweine einer ersten' Kreuzung. (Hump χ Rand) wurden in einem Alter von 32 Tagen nach ihrer Geburt in zwei Gruppen unterteilt (Pholipomycingruppe und Kontrollgruppe), wobei die Schweine jeder Gruppe ungefähr gleiches Durchschnittsgewicht und gleiche Zahl haben. Jede Gruppe bestand aus 8 Schweinen. Die angewendete Dosierung von Pholipomycin (in ppm) hatte folgende Werte:

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Zeitraum mit Futter für die synth. Putter Schv/eine

Kontrollgruppe O 0

Pholipomycin-Gruppe 5 2

Als Futter wurde ein handelsübliches Futtermittel verwendet, das frei von wachstumsfördernden Mitteln oder Antibiotika war.

Das Körpergewicht der Schweine wurde zu einem festgelegten Zeitpunkt alle 15 Tage ausgewogen und die Futteraufnahme wurde in gleicher Weise gemessen.

Ergebnisse:

Die Testergebnisse sind nachstehend zusammengefaßt:

1.) Änderung des durchschnittlichen Körpergewichts

Zeitraum der Fütterung Mästung (erster

mit synthetischer Milch Abschnitt)

Wochen anfänglich 2 4 6 8 10

Vergleichs-

gruppe 8,5 14,6 19,6 25,3 33,0 48,9

Pholipomycin-

Gruppe 8,4 14,4 20,5 26,9 35,1 52,2

2.) Zunahme des Körpergewichts

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Zeit der Fütterung mit synthetischer Milch

Mästung (erster Abschnitt)

Gesamt-Zeit raum

GewrZu- Index nähme

Gew.-Zu- Index Gew.- Index nähme Zunahme

Vergleichsgruppe

Pholipomycin-Gruppe

11,1

12,1

100

109

23,6 100 34,7

25,3 107 37,4

3.) Futteraufnahme und Futterumsatzrate

	Abschnitt der Fütte rung mit synthetischer Milch	Futterum satz	Mästung (erster Abschnitt	Futter umsatz
	Aufnahme	2,8 2,6	Aufnahme	3,2 2,9
Ve rgle ichsgruppe Pholipomycin-Gruppe	11,1 12,1	23,6 25,3

Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß Pholipomycin eine hervorragende Wirkung zur Förderung des ¹WaChStUmS von Schweinen zeigt.

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Claims

Patentansprüche

1. Antibiotisch wirksame Substanz Pholipomycin, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften und Kenndaten: Weißes Pulver mit saurer Reaktion,

Elementaranalyse: C: 50,15%, H: 7,14%, N: 5,48%, P: 2,33%, empirische Formel C₅₀ _ ^ H₈₅ _ _ΛΛΛ ^N5 - 6 °25 - 35^P* durch Gelfiltration bestimmtes Molekulargewicht von 5.100, Schmelzpunkt 250⁰C (unter Zersetzung),
spezifische Drehung in Wasser + 6,0° bei 20⁰C,
Ultraviolett-Absorptionsspektrum: Maxima bei 257 mu (H₂O), 245 mu (0,1 η HCl) und 258 mu (0,1 η NaOH).

E.1«™ = 142 (H₀O), 93 (0,1 η HCl) und 144 (0,1 η HCl),
ι cm ί_

pKa-Wert 4,37,

unterscheidbare Banden im Infrarot-Absorptionsspektrum (in KBr):

3.500, 2.980, 1.740, 1.650, 1.565, 1.410, 1.390, 1.340, 1.240, 1.080, 1.050, 975, 950, 890, 860, 825, 805, 760, 670 cm"¹, leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol und n-Butanol,

wenig löslich in Aceton, Chloroform und Äther,

positive Tollens-Reaktion, täuschend positive Elson-Morgan-Reaktion, negative Ninhydrin-," Benedict-, Biuret-, Bial-, Ferri-

chlorid- und Anthron-Reaktion , beständig bei pH 4 bis 10,

Rf-Werte von 0,74 und 0,25 bei der Dünnschxchtchromatographie an Cellulose und Silicagel in n-Propanol-2n ΝΗλΟΗ (7:3).

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-33- 243127Q;

2. Verfahren zur Herstellung der antibiotisch wirksamen Substanz Pholipomycin gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces lividoclavatus Stamm Nr. 3176 (NRRL-8022) in einem üblichen Nährmedium züchtet und die antibiotisch wirksame Substanz aus der Kulturbrühe ge-, winnt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man die Züchtung unter aeroben Bedingungen durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , daß man die Züchtung bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 30⁰C vornimmt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß man die Züchtung während 96 bis 240 Stunden vornimmt.

6. Wachstumsförderndes Mittel für Tiere, dadurch gekennzeichnet,' daß es als Wirkstoff die antibiotisch wirksame Substanz Eholipomycin- nach einem der Ansprüche 1 bis

5 enthält.

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