DE2952520A1 - Antibiotikum tm-531 - Google Patents

Antibiotikum tm-531

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DE2952520A1
DE2952520A1 DE19792952520 DE2952520A DE2952520A1 DE 2952520 A1 DE2952520 A1 DE 2952520A1 DE 19792952520 DE19792952520 DE 19792952520 DE 2952520 A DE2952520 A DE 2952520A DE 2952520 A1 DE2952520 A1 DE 2952520A1
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agar
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DE19792952520
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Hiroshi Hara
Akira Kawashima
Kazutoshi Mizoue
Taku Mizutani
Sadafumi Omura
Noboru Otake
Haruo Seto
Michio Yamagishi
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Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Taisho Pharmaceutical Co Ltd
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Description

HOFFMANN · EITLK & PARTNER
PAT E N TAN WALTE
OLING. E. HOFFMANN (1730-1976) ■ DIFL.-ING. V/. HUE · D R. RER. NAT. K. HOFFMANN · D IFL.-ING. W. LEHN
DIFl.-ING. K. FOCHSIf · DR. RER. NAT. B. HANSEN AIABELLASTRASSE 4 (SIERNHAUS) · D-8000 MÖNCHEN SI · TELEFON (08») 911087
32 880 o/fi
TAISHO PHARMACEUTICAL Co.,Ltd, Tokyo / Japan
Antibiotikum TM-531
Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum TM-531 der Formel
OCH3
CH3 CJI3
030028/0836
Das erfindungsgemäße Antibiotikum TM-531 gehört zu der Gruppe der Polyäther-Antibiotika mit einer 0v,ß-ungesättigen Ketongruppe. Eine Reihe von Verbindungen dieser Gruppe sind bekannt und typische Beispiele hierfür sind das Antibiotikum A-1304, beschrieben in J. Antibiotics 28, 931 (1975), Ro 21-6150 (Lenoremycin), beschrieben in J. Antibiotics, 29, 21 (1976) und Dianemycin, beschrieben in J. Antibiotics, 22, 161 (1969).
Antibiotikum TM-531 unterscheidet sich von den Antibiotika A-130A, Ro 21-6150 und Dianemycin in der Strukturformel.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues Antibiotikum zur Verfügung zu stellen, das mit TM-531 bezeichnet wird und daß wirksam gegen Gram-positiv Bakterien, pflanzenpathogene Mikroorganismen und Protozen ist.
Fig. 1 zeigt das UV-Absorptionsspektrum von Antibiotikum TM-531, gemessen in einer Äthanollösung;
Fig. 2 zeigt das IR-Absorptionsspektrum von Antibiotikum TM-531, gemessen nach der KBr-Tablettenmethode;
Fig. 3 zeigt das H-NMR-Spektrum des Antibiotikums TM-531, gemessen in Deuterochloroform (CDCl3) bei 60 MHz;
Fig. 4 zeigt das C-NMR-Spektruiu des Anlibiotikuius TM-531, gemessen in CDCl3 bei 25,05 MHz.
030028/0636
Gegenstand der Erfindung ist das neue Antibiotikum TM-531 der Formel
OCH.
CH3 CH3
Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß durch Kul· tivierung vom TM-531-Stamm vom Genus Streptomyces ein Antibiotikum mit einer starken Wachstums-inhibierenden Aktivität, insbesondere gegen Gram-positive Bakterien in einer Kulturbrühe angesammelt werden kann, und daß man das Antibiotikum TM-531 aus der Kulturbrühe durch Extraktion und Reinigung gewinnen kann.
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030028/0836
Aufgrund umfangreicher Untersuchungen der verschiedenen Eigenschaften des Antibiotikums TM-531 wurde festgestellt, daß die Substanz ein neues Antibiotikum ist, das sich von bekannten Antibiotika unterscheidet.
Erfindungsgemäß wird Streptomyces hygroscopicus TM-531, der zum Genus Streptomyces gehört, als Antibiotikum TM- 531 produzierender Stamm verwendet. Dieser Stamm ist neu isoliert worden aus einer Bodenprobe von Omiya-shi, Saitama, Japan, und ist unter der Bezeichnung Streptomyces TM-531 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan unter FERM-P 4737 am 29. November 1978 und bei der American Type Culture Collection als ATCC Nr. 31590 hinterlegt worden. Die mikrobiologischen Eigenschaften des TM-531-Stammes sind die folgenden:
I. Morphologische Eigenschaften
Aeriale Myzele entwickeln sich auf Hafermehlagar, Hefeextrakt-Malzextraktagar und Glyzerin-Asparagin-Agar und der gleichen und es werden reichlich Sporen ausgebildet. Die sporenbildende Hypha ist monopodial und das Ende der aerialen Myzele ist spiral. Unter dem Elektronenmikroskop erkennt man, daß die Oberfläche der Sporen warzig ist. Sporenketten am Ende der Sporenträger, die sich aus aerialen Mycelen entwickeln, enthalten im allgemeinen mehr als 10 Sporen und die Form der Sporen ist oval oder zylindrisch mit einer Grpße von 0,8 bis 1,0 χ 1,3 bis 1,6 um. Geißelsporen, Sporangium und Scletrotium werden nicht beobachtet.
030028/0838
II. Kultivierungseigenschaften
Die Kultivierungseigenschaften vom TM-531-Stamm, kultiviert auf verschiedenen Medien bei 28°C während Tagen werden in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt.
TABELLE
Medium Wachstum Aeriale
Myzele		 Lösliches
Pigment Anderes
Sucrose-
Nitratagar		 gut, naß
grau		 keine keine
Glucose-
Asparagin-
agar		 ziemlich
schlecht,
schwach
gelblich weiß		 nahezu
keine
Entwicklung		 keine
Glyzerin-
Asparagin-
agar
(I.S.P.
Medium Nr. 5)		 gut,
schwach gelb
lich weiß,
zum Teil
grau		 sehr stark
gelblich
weiß bis
graubraun		 keine
Stärkeagar
(I.S.P.Me
dium Nr. 4)		 gut,
weiß bis
grau		 sehr stark,
gräulich
braun, zum
Teil weiß		 keine
Tyrosinagar
(I.S.P. Me
dium Nr. 7)		 recht gut,
gelblich weiß
bis grau weiß		 ziemlich
stark,schwach
gelb bis grau
braun		 sehr schwach
hellbraunes
- Pigment
Nähragar ziemlich
schlecht,
schwach gelb
liches weiß		 keine keine
Hefeextrakt-
Mal zextrakt-
agar (I.S.P.
Medium Nr. 2)		 recht gut,
gelblich
weiß bis
grau		 ziemlich
stark,
schwach gelb
bis graubraun		 keine
030028/0836
2952B20
Medium TABELLE - 1 (Fon bsetzung
• Hafermehl- Wachstum Aeriale Lösliches
agar (I.S. gut, Myzele Pigment
P. Medium weiß bis ziemlich keine
Nr. 3) grau stark grau
Pepton- braun
Hefeex- Ziemlich
trakt-Ei- schlecht. keine keine
senagar hellgelb
(I.S.P.Me-
dium Nr. 6)
Glucose-
Czapek- gut,
agar weiß bis gut. keine
gelblich weiß bis
Blutagar weiß graubraun
gut,
Kartoffel- naßgrau keine keine
dextrose- gut.
agar schwach gelb ziemlich keine
weiß bis stark gelb
Magermilch grauweiß weiß bis
geringes graubraun
Wachstum an keine keine
der Rohrwand,
Glucose- weiß
Pepton- geringes
Gelatine Wachstum an keine keine
der Rohrwan-
dung
Anderes
Hämolyse
keine Koagulation, starke Peptonisierung
schwache Verflüssigung
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III. Physiologische Eigenschaften
(1) Temperaturbereich des Wachstums
Der Stamm wächst bei einer Temperatur im Bereich von 18 bis 45°C auf Hafermehl-Agarmedium. Der optimale Temperaturbereich liegt zwischen 28 und 35°C.
(2) Aerobe oder nichtaerob Aerob
(3) Wirkung auf Proteine
(a) Verflüssigung von Gelatine Koagulation von Magermilch
(d)
Peptonisierung von Magermilch !
Verflüssigung von Loeffler's koaguliertem Serum i
Positiv Negativ Positiv Positiv
(4) Hydrolyse von Stärke
(5) Reduktion von Nitraten
(6) Produktion von Melanoid-Pigmenten
Positiv Positiv
Negativ
IV. Verwertung von Kohlenstoffquellen:
Die Verwertung von verschiedenen Kohlenstoffquellen durch TM-531-Stamm wird festgestellt, indem man die folgenden Kohlenstoffquellen zu Pridham und Gottlieb-Agarmedium (I.S.P. Medium Nr. 9) in einer Konzentration von 1 % gibt und den Stamm 14 Tage bei 28°C kultiviert. Die Ergebnisse werden nachfolgend gezeigt:
030028/0836
Kohlenstoff quelle Verwertung
L-Arabinose +
D-Xylose +
D-Glucose +
Mannose +
D-Fructose +
L-Rhamnose +
Raffinose +
D-Mannit +
Galactose +
Maltose +
Stärke +
Inulin +
Lactose Saccharose
Inosit -
± Trehalose
Sorbit
Cellulose
Die morphologischen, Kultur- und physiologischen Eigenschaften sowie die Verwertung von Kohlenstoffquellen des TM-531-Stammes wurden mit einer Vielzahl von bekannten Stämmen verglichen, die in R.E. Buchanan & N.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. Ausgabe 1974; S.A. Waksman's "The Actinomycetes", Band 2, 1961 und "The International Streptomyces Project" (I.S.P.) und es wurden folgende typische Eigenschaften festgestellt.
(1) TM-531-Stamm bildet eine Spirale mit 2 oder 3 Windungen am Ende des aerialen Myzels.
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- 1O -
(2) Die Farbe des aerialen Myzels, die sich durch TM-531-Stamm entwickelt, ist im wesentlichen bräunlichgrau, obwohl die Farbe sich etwas, je nach der Art der verwendeten Kulturmedien und dem Fortschreiten der Kultierung ändert
(3) Auf Medien, bei denen TM-531 sehr starke aeriale Myzele bildet, können einige feuchte, dunkelbraune Spots zum Teil an dem aerialen Myzel in fortgeschrittenem Zustand beobachtet werden und anschließend verbreiten sich die Spots über die Gesamtheit der aerialen Myzele.
(4) TM-531 produziert nahezu keine löslichen Pigmente bei der Kultivierung auf synthetischen Medien und natürlichen Medien. Diese grundsätzlichen und wichtigen Eigenschaften stimmen weitgehend überein mit denen von Streptomyces hydroscopicus Waksman und Henrici (1948), aber der TM-531-Stamm unterscheidet sich etwas von dem letzeren Stamm hinsichtlich der Wachstumscharakteristika auf Sucrosenitrag-Agar und Nähragar.
Aufgrund dieser Eigenschaften wurde von den Erfindern festgestellt, daß der TM-531-Stamm zur der Gattung Streptomyces hydroscopicus gehört und er wurde deshalb als Streptomyces hygrodcopicus TM-531 bezeichnet.
Das bei der Hers (.ellung des erfindunysgemäßen Antibiotikums TM-531 verwendete Kulturmedium besteht aus etwa 1 bis Gew.-% Kohlenstoffquellen, etwa 0,1 bis 4 Gew.-% Stickstoffquellen und etwa 0,01 bis 1 Gew.-% anorganischen Komponenten.
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Gegebenenfalls kann das Medium noch weniger als etwa 1 Gew.-% eines "Entschäumungsmittels enthalten. Ein bevorzugtes Medium enthält 2 bis 6 Gew.-% Kohlenstoffquellen und O,5 bis 2 Gew.-% Stickstoffquellen.
Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Glucose, Maltose, Saccharose, Stärke, Glyzerin, Dextrin und dergleichen oder eine Mischung davon.
Beispiele für Stickstoffquellen sind Pepton, Rinderextrakt, Sojabohnenmehr, Maismaische, Hefeextrakt, Hafermehl, Tripton und dergleichen oder eine Mischung davon.
Beispiele für anorganische Komponenten sind Phosphate, Sulfate oder Chloride von Magnesium, Eisen Zink oder Mangan und dergleichen.
Beispiele für Entschäumungsmittel sind Adekanol, Silikon und dergleichen.
Die Kultivierung wird vorzugsweise durch eine aerobe Kultur, wie eine Schüttfelkultur, eine belüftete Untertauchkultur und dergleichen bei einem pH-Wert von etwa 5,5 bis etwa 8,0 und einer Temperatur zwischen etwa 20 bis 50°C während etwa 2 bis etwa 5 Tagen, vorzugsweise bei einem pH von 6,6 bis 7,0 bei 28 bis 35°C während etwa 3 Tagen vorgenommen.
Die Isolierung des Antibiotikums TM-530 kann in üblicher Weise wie sie zur Gewinnung von Fermentationsprodukten aus Kulturbrühen bekannt ist, erfolgen. Zum Beispiel kann man nach Beendigung der Kultivierung die Kulturbrühe zentrifugieren, um die Mikrobenzellen und das überstehende zu trennen. Man kann dann aus dem überstehenden mit einem wasserunlöslichen organischen Lösungsmittel, wie /ithylacetatbenzol. Chloroform und dergleichen, eine aktive Substanz gewinnen.
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Die gleiche aktive Substanz kann man auch aus den Mikrobenzellen mit einem organischen Lösungsmittel, wie einem niedrigen Alkohol, z.B. Methanol, Äthanol und dergleichen, Aceton und dergleichen extrahieren. Das Extrakt wird dann konzentriert und die in dem Konzentrat enthaltene aktive Substanz wird in dem gleichen Lösungsmittel, das für die Extraktion des überstehenden verwendet worden war, gelöst. Das so erhalten Extrakt wird dann mit dem Extrakt des überstehenden vereint und die vereinten Extrakte werden unter vermindertem Druck konzentriert, wobei man einen konzentrierten Sirup erhält. Der Sirup wird in einem organischen Lösungsmittel, wie Benzol, Aceton und dergleichen gelöst und die Lösung wird einer Reihe von üblichen Reinigungsverfahren unterworfen, wie einer Kieselgel-Säulenchromatographie, Gelfiltration über Sephadex LH-2O und dergleichen, wobei man aktive Fraktionen erhält, aus denen man das Antibiotikum TM-531 isolieren kann.
Durch Elementaranalyse, Bestimmung des Molekulargewichtes, des UV-Absorptionsspektrum, des IR-Absorptionsspektrums, H-NMR-Spektrum und C-NMR-Spektrums sowie der physikochemischen Eigenschaften von Antibiotikum TM-531 wurde die folgende Strukturformel festgestellt
OCH3
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(II) Physiko-chemische Eigenschaften
(a) (b) (c)
(d)
Aussehen
Schmelzpunkt
Elementaranalyse
Molekulargewicht
UV-Absorptionsspektrum
(g) IR-Absorptions-Spektrum Weißes Pulver
88 bis 910C
C, 66,40 %; H, 9,49 %; 0, 24,25 %
850
+ 81,2° (C = 1, Chloroform)
Das in Äthanol bestimmte Spektrum wird in Fig. 1 gezeigt.
E1cm = (232 Tm) = 177'6
Das mit der KBr-Tablette bestimmte Spektrum wird in Fig. 2 gezeigt, aus welcher die folgenden charakteristischen Absorptionsbanden hervorgehen.
(cm"1)
3490, 2960, 2920, 2860, 2810, 1735,
1710, 1667, 1648, 1460, 1376, 1342,
1318, 1262, 1232, 1220, 1200, 1162,
1112, 1095, 1075, 1060, 1046, 1022, 1015, 1000, 982, 950, 938, 930, 908,
890, 874, 864, 830, 810, 790, 775,
760, 738, 700.
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(h) Kernmagnetisches Resonanzspektrum: Das 1H-NMR-Spektrum, bestimmt in CDCl3 bei 60 MHz wird in Fig. 3 gezeigt, wobei man ein Signal bei T" = 6,72 (Methoxy-Gruppe) erkennt. Das 13C-NMR-Spektrum bei 25,05 MHz in CDCl3 zeigt die charakteristische Resonanz bei 144,9 und 134,2 ppm, wodurch eine Olefingruppe und bei 204,4 ppm wodurch eine Ketongruppe angezeigt wird.
(i) Löslichkeit:
Antibiotikum TM-531 ist unlöslich in Wasser und löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat, Diäthyläther, Benzol, Chloroform, Hexan und Petroläther.
(j) Farbreaktion:
Antibiotikum TM-531 ergibt eine positive Farbreaktion mit Jod und Kaliumpermanganat und negative Reaktionen mit Ninhydrin und Ferrichlorid.
(III) Physiologische Eigenschaften:
Antibiotikum TM-531 entwickelt wachstumsinhibierende Aktivität auf Gram-positive und pflanzenpathogene Mikroorganismen und ist wirksam auch auf Protozon, wie Schweinedurchfall, Coccidium, Toxoplasma, Trypanosom, Malaria und dergleichen. Antibiotikum TM-531 ist jedoch nicht wirksam bei Gram-negativen Bakterien und Hefepilzen.
Antibiotikum TM-531 verbessert auch die Futterverwertung, wenn man es zum Futter von Geflügel, Rindern, Schweinen und dergleichen gibt.
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Antibiotikum TM-531 ist ein neues Antibiotikum mit einer ausgezeichneten Wachstums-inhibierenden Aktivität gegen Gram-positive Bakterien, pflanzenpathogene Mikroorganismen und Protozoen und ist deshalb auch geeignet für pharmazeutische und veterinärmedizinische Mittel und als Antimikrobenmittel bei Pflanzen. Außerdem kann man Antibiotikum TM-531 Futterstoffen zusetzen für die Behandlung und Vorbeugung von Coccidiose bei Haustieren und Geflügel oder auch, um das Wachstum von Haustieren und Geflügel zu beschleunigen.
Die vorliegende Erfindung wird in dem nachfolgenden Versuchsbeispiel, in dem die physiologische Aktivität von Antibiotikum TM-531 beschrieben wird, erläutert und in den Beispielen wird dann die Herstellung von Antibiotikum TM-531 beschrieben.
Versuchsbeispiel 1
Die Antimikroben-Aktivität von Antibiotikum TM-531 wurde bestimmt und ausgedrückt durch die minimale Inhibierungskonzentration (MIC) unter Verwendung eines Herzinfusions-Agarmediums für die Bestimmung der Aktivität bei Bakterien und eines Kartoffeldextrose-Agarmediums für die Bestimmung der Aktivität auf Fungi und Hefepilze. Die gefundenen Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.
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TABELLE
Antimikroben-Aktivität von Antiotikum TM-531
Testorganismus
Staphylococcus aureus FDA 209 P Staphylococcus aureus Smith Staphylococcus aureus TRP-23 Staphylococcus epidermidis TRP-13 Staphylococcus epidermidis TPR-25 Bacillus subtilis ATCC 6633 Bacillus Licheniformis Micrococcus luteus NIHJ Coryncbacterium xerosis Streptococcus faecalis ATCC 8043 Escherichia coli NIHJ C-2 Pseuctomonas aerupinosa HD 1052 Proteus vulgalis HX 19 Asperp,illus niger NHL 5088 Pcnicillium citrinuin IAM 7003 Trichophyton astcroides Candida aIbicons Saccharoir.vces cerevisiae Minimale Inhibierungskonzentration (mcg/ml)
56
25
3, 13
3, 13
3, 13
1, 56
1, 56
3, 13
Ϊ, 56
...... 6, 25
>100
>100
>100
>100
>ioo
>100
>100
>100
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030028/0838
Versuchsbeispiel
10 ml eines Kartoffeldextrose-Agars wurde in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 9 cm gegeben und mit den in der nachfolgenden Tabelle 3 gezeigten pflanzenpathogenen Mikroorganismen inokuliert. Das Medium wurde 4 Tage bei 28°C inkubiert, wobei sich der Organismus über die gesamte Oberfläche des Mediums verbreitete und eine Scheibe der Kolonie mit einem Durchmesser von 8mm wurde von dem Medium abgeschnitten. Getrennt davon wurden 10 ml des gleichen Kartoffeldextrose-Agarmediums, enthaltend Antibiotikum TM-531 in einer Konzentration von 100 mcg/ml in einer Petrischale mit einem Durchmesser von 9 cm gegeben und die vorerwähnte Scheibe des Mediums wurde in die Mitte des Mediums gelegt. Das so gebildete Medium wurde dann 7 Tage bei 28°C inkubiert und die Wachstums-inhibierende Aktivität von Antibiotikum TM-531 gegen pflanzenpathogene Mikroorganismen wurde bewertet und ausgedrückt durch den Durchmesser der Kolonie, verglichen mit dem Durchmesser der Kolonie auf einem Kontrollmedium, d.h. des gleichen Kartoffeldextrose-Agarmediums, das vorher verwendet worden war, jedoch kein Antibiotikum TM-531 enthielt. Die erzielten Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle 3 gezeigt.
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TABELLE 3
Wachstums-inhibierende Aktivität von Antibiotikum TM-531 auf pflanzenpathogene Mikroorganismen
Koloniedurchmesser (mm)
Testorganismus
Glorocrella cinpulata Piricularia sasakii Gibbcrella fujilcuroi Botrytis einerea
Helminthosporium siginoidevim
Kontroll
medium		 TM-531
enthaltendes Medium
27,3 13,4
63,3 63,0
27,6 20,2
47,7 46,7
22,8 15,4
Versuchsbeispiel
Ein Mäusephagozit, kultiviert auf einem TC-199-Medium, enthaltend 20 % Kalbserum, wurde mit Toxoplasma taehyzoites (nachfolgend als ^T. taehyzoites" bezeichnet) infiziert und etwa 1 Stunde bei 37°C kultiviert. Anschließend wurde die erhaltene Kultur mit einem Phosphatpuffer mit einem pH von 7,2 zum Auswaschen von nichtinfiziertem T_^ taehyzoites gewaschen und eine äthanolische Lösung des Antibiotikums TM-531 wurde zu dem Medium in einer geeigneten Konzentration von Antibiotikum TM-531 ge geben. Das die Protozon und das Antibiotikum TM-531 enthaltende Medium wurde 48 Stunden bei 37°C inkubiert und dann mit Trypan-Blau gefärbt, und die Anzahl der T. taehyzoites pro 100 Phagozyten wurde zur Bestimmung der Antitoxoplasmoaktivität von Antibiotikum TM-531 gezählt und mit der Zahl von T.taehyzoites pro 100 Phagozyten in dem kein Antibiotikum TM-531 enthaltenden Kontrollmedium verglichen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.
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- 19 -TABELLE 4
Antitoxoplasmaaktivität von Antibiotikum TM-531
Prozent Phagozyten infiziert mit T. tachyszoites
T. tachyzoites T. tachyzoites TTv 5/Zelle > 6/Zelle
Kontrollmedium 30,8 22,4
TM-531 enthaltendes
Medium (0,1 ppm) 0 0
Eine Untersuchung des obigen Kulturmediums durch ein optisches Mikroskop zeigte keine toxischen Einwirkungen auf die Phagozitenzellen aufgrund der Einwirkung des Antibiotikums TM-531.
Versuchsbeispiel
Männliche Küken (weiße Leghorn) wurden unmittelbar nach dem Ausbrüten mit einer Mischnahrung für Küken, enthaltend kein Anti-Coccidium, gefüttert bis zu Beginn des Versuches. Am 8. Tag der Fütterung wurde die Gesundheit der geprüften Küken untersucht und das Körpergewicht bestimmt und dabei wurden die Versuchsküken in drei Gruppen eingeteilt, wobei jede Gruppe aus 10 Küken bestand und eine gleiche Verteilung des Körpergewichts aufwies. Die Versuchsgruppe wurde mit einem Kükenmischfutter, enthaltend 0,01 Gew.-% Antibiotikum TM-531, gefüttert und die infizierte Kontroll-
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gruppe und die gesunde Kontro11gruppe wurden mit dem gleichen Kükenmischfutter ernähert, daß jedoch kein Antibiotikum TM-531 enthielt. 48 Stunden nach dem Füttern wurde jedes Küken der Versuchgruppe und der infizierten Kontroll-
4
gruppe mit 9 x 10 reifen Oocyten von Eimerla tellena durch orale Verabreichung infiziert. Acht Tage nach der Infizierung wurde die Zunahme des Körpergewichtes (%), die Mortalität (%) und O.P.G. (die Anzahl der Oocyten
4
(x10 ) in 1 g des Zökum-Inhaltes) festgestellt und der Zustand der Fäzes wurde untersucht und mit dem der gesunden Gruppe verglichen, um die Aktivität von Antibiotikum TM-531 gegen Elmeria tellena festzustellen. Die erzielten Ergebnisse werden in der Tabelle 5 gezeigt.
TABELLE
Aktivität von Antibiotikum TM-531 gegen Elmeria tellena
Körper
gewichts-
zunahme (%)		 Mortalität
(%)		 O.P.G.
(x1O4)		 Fäzes-
zustand
Gruppe, der
ΊΜ-531 verab
reicht wurde		 105,1 0 0 Normal
Infizierte
Kontrollgruppe		 77,0 60 17,3 Normaler
Hämafäka;
Gesunde
Kontrollgruppe		 100,0 0 0 Normal
- 21 -
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Herstellungsbeispiel
Ein steriles flüssiges Medium, enthaltend 2 % Glucose, 2 % Hafermehl, 0,3 % Rinderextrakt, 0,3 % Natriumchlorid, 0,25 % Calciumcarbonat, 0,04 % Ferrisulfat und 0,04 % Manganchlorid wurde mit TM-531-Stamm inokuliert und der inokulierte Stamm wurde aerob bei 30 C während 72 Stunden unter Rühren und unter Ausbildung einer Saatkultur kultiviert.
200 1 eines sterilen Mediums der gleichen Zusammensetzung wie oben wurden in einen 250 1 Fermentationstank gegeben und mit 5 1 der zuvor hergestellten Saatkultur inokuliert und aerob unter Rühren 72 Stunden bei 30 C kultiviert. Nach Beendigung der Kultivierung wurde die Fermentationsbrühe abzentrifugiert unter Auftrennung der Brühe in die Mikrobenzellen und das überstehende. Das überstehende wurde dreimal mit Äthylacetat extrahiert und die vereinten Extrakte wurden aufgehoben. Die Mikrobenzellen wurden zweimal mit 15 1 Anteilen Azeton extrahiert und die vereinten Azetonextrakte wurden konzentriert bis das Azeton abdestilliert war und dann wurden sie mit Äthylazetat extrahiert. Die dabei entstandenen Extrakte wurden mit den zuvor erhaltenen Äthylazetatextrakten vereint und die vereinten Extrakte wurden unter vermindertem Druck konzentriert, wobei man 112 g eines braunen Sirups erhielt. Die Gesamtmenge des Sirups wurde in 500 ml Benzol gefüllt Und die Lösung wurde auf einer Kieselgelsäule (Wakogel C-200), die zuvor mit Benzol behandelt worden war, absorbiert.
Die Säule wurde zunächst mit Benzol und dann mit Benzol/ Azeton (95:5 v/v) eluiert und das Eluat wurde verworfen. Anschließend wurde die Säule mit Benzol/Azeton (90:10 v/v)
030028/0836
eluiert und die dabei erhaltenen Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Das erhaltene Rohprodukt wurde in Azeton gelöst. Die erhaltene Azetonlösung wurde mit Azeton gelfiltriert über Sephadex LH-2O und die erhaltene aktive Fraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert, wobei man 6 g eines hellgelben Pulvers erhielt.
Beim Umkristallisieren des Produktes aus Azeton/Wasser (2:1 v/v) wurden 5,2 g Antibiotikum TM-531 in Form von nadeiförmigen Kristallen erhalten.
Die Kristallnadeln schienen Kristallwasser zu enthalten und wurden in Benzol gelöst und dann unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert, wobei man ein weißes Pulver erhielt. Die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften wurden an dem weißen Pulver festgestellt:
Schmelzpunkt: 88 bis 910C
Elementaranalyse: C, 66,40 %; H, 9,49 %; O, 24,25*
Molekulargewicht: 850
^6 . +81,2° (C=1, Chloroform)
030028/0636
L e e r s e i t e

Claims (1)

  1. HOPFMANN · VATIJR Λ PARTNER
    PAT K N TAX AVALT K
    DR. ING. E. HOFFMANN |1930-1?76/ ■ DIf l.-ING.W. EITlE · DR. R f R. NAT. K. HOFFMAN H · D I PL.· I NG. W. tf H N
    OIPl.-ING. K. FOCHSlE · OR. RER. NAT. B. HANSEN ARAUEItASTtASSt 4 (STER NHAUS) . D-8090 MÖNCHEN 81 · T E IE FC N (OE?) »11087 . TElE X OS-TMIt {ΓΑΤΗ E)
    32 880 o/fi
    TAISHO PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Tokyo / Japan
    Antibiotikum TM-531
    Patentanspruch
    Antibiotikum TM-531 der Formel
    HOCC
    CH3 CH3
    OCH3
    030028/0836
    'AL
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