DE3014434A1

DE3014434A1 - Antibiotikum, verfahren zu seiner herstellung und es enthaltendes arzneimittel

Info

Publication number: DE3014434A1
Application number: DE19803014434
Authority: DE
Inventors: Tokio Higashi-Murayama; Hisakatsu Ito; Akio Iwasaki; Shigeru Kimura; Toshimi Mizoguchi; Toshihito Mori; Akira Murakami; Masahito Nakayama; Masao Okuchi; Sohei Tanabe; Isamu Watanabe
Original assignee: Kowa Co Ltd
Current assignee: Kowa Co Ltd
Priority date: 1979-04-16
Filing date: 1980-04-15
Publication date: 1981-01-29
Also published as: AT371146B; IT8021374A0; NL8002210A; GB2047700A; ES490574A0; PT71091A; FR2454441B1; FR2454441A1; DD157345A5; ES8104829A1; IT1194646B; US4530791A; GB2047700B; SE8002827L; ATA205080A; DK161880A

Description

"³" 30HA3A

Kowa Co., Ltd.

6-29, Nishiki 3-chome, Naka-ku,

Nagoya-shi, Aichi-ken, Japan

Antibiotikum, Verfahren zu seiner Herstellung und es

enthaltendes Arzneimittel

Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum, ein Verfahren zu seiner Herstellung und ein dieses neue Antibiotikum enthaltendes Arzneimittel.

Aufgrund umfangreicher Untersuchungen wurde verschiedene Stamme aus dem Erdreich vorkommenden Mikroorganismen isoliert, um ihre Verwertbarkeit bei der Herstellung von Antibiotika zu untersuchen. Bei diesen Untersuchungen wurde gefunden, daß ein neu isolierter Stamm KC-664-3 in der Lage ist, zwei verschiedene Arten eines neuen Antibiotikums zu bilden, welches ausgezeichnete antibakterielle Aktivitäten gegenüber gram-positiven und gram-negativen Bakterien aufweist. Im Verlauf dieser Arbeiten wurden solche Antibiotika aus Kulturbrühen isoliert.

Diese beiden Arten von erfindungsgemäßen Antibiotika besitzen eine nahe verwandte Struktur. Aus ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften und ihren biologischen Eigenschaften, welche im folgenden noch näher beschrieben werden, ergibt sich, daß die Antibiotika neue, von irgendwelchen bekannten Antibiotika verschiedene Substanzen sind.

Die erfindungsgemäßen Antibiotika werden von Stämmen, welche zu Streptomycesarten gehören, gebildet, und sie besitzen die folgende allgemeine Formel (I):

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	0	ι	O ί S-Ch=CHNHCOCH-	3014434
Γ³			X COOH
L			(I)

worin R ein Wasserstoff atom oder den Rest -SO-,Η bedeutet.

In der folgenden Beschreibung wird das Gemisch der zuvor genannten beiden Arten des neuen Antibiotikums als Substanz KA-664-3 bezeichnet; eine dieser Arten, bei welcher der Rest R in der Formel (I) ein Wasserstoffatom ist, wird weiter als Substanz KA-664-3-A und die andere Art, bei welcher der Rest R in der Formel (I) -SO₅Ii bedeutet, als Substanz KA-6643-B bezeichnet.

Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert, weitere Merkmale und vorteilhafte Eigenschaften der erfindungsgemäßen Substanzen ergeben sich aus der folgenden Beschreibung von bestimmten bevorzugten Ausführungsformen hiervon, wobei hier auf die Zeichnung Bezug genommen wird. Selbstverständlich sind jedoch Variationen und Modifikationen möglich.
In der Zeichnung sind:

Fig. 1 die Darstellung eines UV-Absorptionsspektrums eines Natriumsalzes der Substanz KA-664-3-A;

Fig. 2 die Darstellung eines IR-Absorptionsspektrums des Natriumsalzes;

1 Fig. 3 die Darstellung des Spektrums der H-kernmagnetischen Resonanz des gleichen Salzes;

Fig. 4 die Darstellung eines IR-Absorptionsspektrums eines Methylesters der Substanz KA-6643-A;

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Figo 5 die Darstellung des Spektrums der H-kernmagnetischen Resonanz des Methylesters;

Fig» 6 die Darstellung des Spektrums der "O-kernmagnetischen Resonanz des gleichen Esters;

Figo 7 die Darstellung des UV-Absorptionsspektrums eines Dinatriumsalzes der Substanz KA-664-3-B;

Figo 8 die Darstellung des IR-Absorptionsspektrums des Dinatriumsalzes; und

Fig» 9 die Darstellung des Spektrums der kernmagnetischen Resonanz des gleichen Dinatriumsalzes„

Im folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert=

Der die Substanz KA-664-3 bildende Organismus gemäß der Erfindung besitzt folgende taxonomische Eigenschaften«, Es sei darauf hingewiesen, daß die morphologischen Merkmale in unterschiedlichen ISP-Medien bei der Züchtung bei 27 ⁰C während Tagen nach den üblichen Methoden beobachtet werden, und daß die Far be für die reife Kultur in Übereinstimmung mit der Klassifizierung des "Color Harmony Manual" (Container Corporation of America) angegeben ist, falls keine anderen Angaben gemacht sind ο

Der Stamm- der Substanz KA-6643 erlaubt die Bildung eines Luf tmycels in verschiedenen Medien, welches einfach verzweigt ist. Die Sporophoren werden auf dem Luftmycel gebildet, wodurch gerade Sporenketten erzeugt werden. Jede Spore besitzt eine Größe von 0,4 bis O,5,um x 0,9 bis 1,0 um mit einer ovalen bis

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zylindrischen Gestalt, und sie "bilden eine Kette von 20 oder mehr Sporen, deren Oberfläche glatt ist. Die Sporenketten sind oft miteinander unter Bildung einer sclerotium-ähnlichen Struktur miteinander verschmolzen, und die Fragmentierung des Substratmycels in einigen Medien, welche für die taxonomischen Untersuchungen verwendet wurden, wird "beobachtet.

(1) Saccharose-Nitrat-Agar

Wachstum: gut, flach ausbreitend, farblos-braungelb (2fb) Luftmycel: mäßig, pulverförmig, weiß (a), lösliches Pigment: keines

(2) Glucose-Asparagin-Agar

Wachstum: mäßig, flach und butterartig, crernig (1^ca) pastellgelb (2hb)
Luftmycel: keines
lösliches Pigment: keines

(3) Glyzerin-Asparagin-Agar

Wachstum: gut, warzig, runzlig, braungelb (2fg) - bambusfarbig (2gc)

Luftmycel: gut, pulverförmig, perlfarbig (3ba) lösliches Pigment: keines

(4) Stärke-anorganisches Salz-Agar

Wachstum: gut, runzlig, butterartig, bambusfarbig (2gc) honiggelb (2ic)

Luftmycel: gut, pulverförmig, weiß (a) - perlfarbig (3ba) lösliches Pigment: keines

(5) Tyrosin-Agar

Wachstum: gut, nennenswert warzig, runzlig, gelatineartig, zimtfarben (3Ie)

Luftmycel: gut, pulverförmig, perlfarbig (3ba) lösliches Pigment: keines

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(6) Nähragar

Wachstum; mittel, schwach-warsig, runzlig, gelatineartig, farblos-hellgelb (1^-ea) Luftmycel: keines lösliches Pigment; keines

(7) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar

Wachstum: übermäßig, runzlig, butterartig - gelatineartig, senffarben (2Ie); Luftmycel: gut, pulverförmig, weiß (a) - perlfarbig (3ba) lösliches Pigment: keines

(8) Hafermehl-Agar

Wachstum: mäßig, flach ausbreitend, cremig (1^ca) buttergelb (1rjga) Luftmycel: mäßig, pulverförmig, weiß (a) lösliches Pigment: keines

(9) Pepton-Hefe-Eisen-Agar

Wachstum: gut, nennenswert warzig, runzlig, butterartig, hellgelb (1jea); Luftmycel: keines lösliches Pigment: keines

(1) Wachstumstemperaturbereich: 3-35 C

(2) optimaler Wachstumstemperaturbereich: 27 - 33 ⁰C

(3) Verflüssigung von Gelatine: positiv

(4) Hydrolyse von Stärke: positiv

(5) Koagulation von Magermilch: negativ Peptisierung von Magermilch: positiv

(6) Bildung von Melanoidpigment: negativ

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IYi_Ausnutzung_von_EohlenstoffStellen

Die Ausnutzung von Kohlenstoffquellen in Pridliam- und Gottlieb-Agarmedium wurde mit folgenden Erge'bnissen bestimmt:

Ausgenutzte Kohlenstoffquellen; L-Arabinose, D-Xylose,

D-Glucose, D-Fructose, Inosit und L-Ehamnose

Nient-ausgenutzte Kohlenstoff- Saccharose, Haffinose und 1^uellen: D-Mannit

V. Der betreffende Stamm enthält LL-Diaminopimelinsäure in den Zellwänden.

Im Hinblick auf die zuvor beschriebenen Eigenschaften wird angenommen, daß der Stamm KC-664-3 zur Gattung Streptomyces gehört, daß er jedoch charakteristische Eigenschaften wie Fragmentierung des Substratmycels, Verschmelzen der Sporenketten und ähnliche Eigenschaften aufweist, welche von denjenigen der typischen Mycelien der Gattung Streptomyces schwach verschieden sind.

Jedoch ist es an sich bekannt, daß Stämme, welche als zur Gattung Streptomyces gehörend klassifiziert werden, oftmals solche spezifische Strukturen wie beispielsweise eine Fragmentierung der Hyphen in dem Medium und Abnormalität in den Sporenketten aufweisen, und daher wird es als zulässig angesehen, den Stamm KC-664-3 als zur Gattung Streptomyces gehörend zu klassifizieren.

Wenn Stämme aus der Natur, bei denen die Sporenkette gerade ist, die Oberfläche der Sporen glatt ist, das Luftmycel eine weiße Färbung besitzt, die Rückseite der Kolonie überhaupt keine charakteristische Farbtönung zeigt und sie überhaupt

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BAD

kein lösliches Pigment oder Melanoidpigment bilden, unter den bekannten, in "Bergy's Manual of Determinative Bacteriology", 80 Auflage, ISP of Shirling and Gottlieb, und "The Actinomycetes" von S₀ A₀ Waksman, 2_ (1961) gesucht v/erden, können sieben mögliche Stämme ermittelt werden, einschließlich Streptomyces albovinaceus (ISP 5136), Streptomyces aureocircuratus (ISP 5386), Streptomyces baarnensis (ISP 5232), Streptomyces chrysomallus (ISP 5128), Streptomyces Candidas (ISP 5141), Streptomyces gougeroti (ISP 5324) und Streptomyces griseoloalbus (ISP 5^-68)ο

Der Stamm Streptomyces albovinaceous (ISP 5136) ist von dem Stamm KC-664-3 dadurch verschieden, daß er ein schlechtes Wachstum auf Saccharose-Nitrat-Agarmedium und ein schlechtes Wachstum bei 5 °C in verschiedenem Medium zeigt, i-/eiterhin hinsichtlich der Verflüssigung von Gelatine und xireiter in der Fähigkeit zur Ausnutzung von Kohlenstoffquellen, d« h_o dieser Stamm nutzt D-Mannit jedoch nicht Inosit aus» Der Stamm Strepto= myces aureocirculatus (ISP 5386) unterscheidet sich vom Stamm KC-6643 hinsichtlich der schlechten Eigenschaften bei der Aus= bildung seines Luftmycels und wächst bei 37 °C jedoch nur sehr schlecht bei 5 °C, !weiterhin besitzt er eine schwache Hydrolyse von Stärke und zeigt unterschiedliche Werte der Fähigkeit zur Ausnutzung von Kohlenstoffquellen, do h. er nutzt D=Mannit jedoch nicht L=Rhamnose aus» Der Stamm Streptomyces Candidas (ISP 514-1) unterscheidet sich vom Stamm KC-6643 hinsichtlich der schlechten Eigenschaften beim Wachstum auf einem Saccharose=Mtrat=Agar~Medium und er i-jächst kaum bei 5 ⁰C, v/eiterhin hinsichtlich der Ausnutzung von Kohlenstoffquellen, do iu er nutzt D-Mannit jedoch nicht Inosit aus_o Der Stamm Streptomyces gougeroti (ISP 5324) unterscheidet sich vom Stamm KC-6643 hinsichtlich des schlechten Wachstums in einem Saccharose-Nitrat-Agar-Medium und hinsichtlich der Bildung seines Luftmycels sowie der Verflüssigung von Gelatine, der Peptonisierung von Magermilch und der Ausnutzung von

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Kohlenstoffquellen, d. h. er nutzt L-Mannit jedoch weder Inosit noch L-Ehamnose aus. Der Stamm Streptomyces griseoloalbus (ISP 5368) unterscheidet sich vom Stamm KC-664-3 dadurch, daß er bei 37 ⁰C jedoch nicht "bei 5 ⁰C wächst, weiterhin hinsichtlich der Verflüssigung von Gelatine, der Ausnutzung von Kohlenstoffquellen, d. h. er nutzt D-Mannit aus, und der blaßgelblichen Farbtönung des Luftmycels. Der Stamm Streptomyces baarnensis (ISP 5232) ist hinsichtlich der Art der Züchtung dem Stamm KC-6643 sehr ähnlich, jedoch ist er hiervon hinsichtlich seines schlechten Wachstums bei 5 °C und der Bildung eines braunen, löslichen Pigments in einem Gelatinemedium verschieden, weiterhin besitzt er nur eine schlechte Fähigkeit zur Ausnutzung von Kohlenstoffquellen, d. h. er nutzt D-Mannit jedoch nicht Inosit aus. Der Stamm Streptomyces chrysomallus (ISP 5128) ist hinsichtlich der Züchtungsmerkmale dem Stamm KC-6643 sehr ähnlich, jedoch wächst er nicht bei 5 °C oder in einem Nagermilchmedium. Weiterhin unterscheidet er sich vom Stamm KC-664-3 durch die BiI-dung eines gelben, löslichen Pigments in verschiedenen Medien und der Fähigkeit zur Ausnutzung von Kohlenstoffquellen, d.h . er nutzt D-Mannit jedoch nicht Inosit aus.

Als ein Stamm, welcher zur Bildung eines einem Metaboliten des Stammes KC-6643 ähnlichen Produktes in der Lage ist, sind 32 Stämme bekannt, welche alle zu 11 Arten gehören einschließlich Streptomyces cattleya, Streptomyces flavogriseus, Streptomyces olivaseus, Streptomyces flavovirence, Streptomyces flaves, Streptomyces flavoviridis, Streptomyces algenteolus, Streptomyces shioyaensis, Streptomyces lipmanii, Streptomyces cremeus und Streptomyces gedanensis. Jedoch besitzt keiner dieser bekannten Stämme die Eigenschaft, daß das Luftmycel eine weiße Färbung besitzt, und daß Inosit und nicht D-Mannit ausgenutzt wird.

Aus diesen Ergebnissen wird geschlossen, daß der Stamm KC-6643 ein neuer Stamm ist, welcher zur Gattung Streptomyces gehört.

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Dieser Stamm wird© als Streptosyees sp„ £G~664-3 bezeichnet. Dieser Stamm wurde bei dem Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science & Technology, No₀ 1 - 3, Higashi 1~chome, Yatabe-maehi, Tsukuba-gun, Ibaragi-ken, Japan, am 7» April 1978 unter der Kummer FERM-P 446? hinterlegt ο Weiterhin wurde der Stamm bei der American Type Culture Collection, No₀ 12301, Parklavra Drive, Rockville, Maryland, USA, am 12_O März 1979 unter der Nummer ATCC 314-93 hinterlegt»

Bei der praktischen Durchführung der Erfindung kann nicht nur der Stamm KG-664-3 sondern ebenfalls seine spontanen und künstlichen Mutanten verwendet werden_o

Die Kultur des erfindungsgemäß verwendeten Stamms ist nach jeder gewöhnlichen Methode zur Züchtung von Actinomyceten mögliche Als Kohlenstoffquelle für Medien können verschiedene Quellen verwendet werden» Vorzugsi-jeise werden Stärke, Glyzerin, Maltose, Dextrin, Fructose, Molassen und dergleichen einzeln oder in Kombination veri-;endet_o Heiterhin werden Kohlenwasserstoffe, organische Säuren, Pflanzenöle und dergleichen verwendete Stickstoffquellen umfassen Sojabohnenmehl, Hefeextrakte, Trockenhefen, Pepton, Fleischextrakte, Maisquellwasser, Casaminosäure, Rückstände der Alkoholdestillation, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Natriumnitrat und dergleichen. Diese Quellen werden einzeln oder in Kombination eingesetzt. Falls erforderlich, können anorganische Salze wie Natriumchlorid, Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumchlorid, Calciumcarbonat, Calciumhydroxid, KobaltChlorid, Zinksulfat, Eisenchlorid, Eisensulfat und dergleichen und Spuren von Schwermetallen zugesetzt werden« Weiterhin können organische und anorganische Substanzen, welche das Wachstum der Mycelien der Substanz KA-664-3 unterstützen und gegebenenfalls die Bildung hiervon erleichtern, gewünschtenfalls zugesetzt werden. Wenn eine Arbeitsweise einer belüfteten Kultur

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verwendet wird, wird weiterhin vorzugsweise ein Antischaummittel zugesetzt, beispielsweise ein fettes öl, Silikonöl oder Paraffin.

Obwohl die Züchtung des Stammes in einem festen Medium möglich ist, wird eine Flussigkultur und insbesondere eine Tauchkultur vorzugsweise wie im FaIl der Herstellung von gewöhnlichen Antibiotika angewandt. Eine solche Kultur wird unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen im Bereich von 3 bis 35 ⁰C und vorzugsweise 27 bis 33 ⁰C durchgeführt.

Das Antibiotikum KA-664-3 kann entweder in einer Schüttelkultur oder in einer Tankkultur hergestellt werden. Wenn eine solche Züchtung für zwei bis zehn Tage fortgeführt wird, wird die aktive Substanz in der Kulturbrühe angesammelt. Die Züchtung wird zu dem Zeitpunkt beendet, zu welchem die Produktmenge in der Kulturbrühe ein Maximum erreicht.

Zur Isolierung der Substanz KA-664-3 aus einer so hergestellten Kulturbrühe und Reinigung des isolierten Produktes können verschiedene, üblicherweise für solche Zwecke verwendete und an sich bekannte Methoden angewandt werden.

Beispielsweise kann die Kulturbrühe zuerst zur Entfernung des Mycels hieraus zentrifugiert oder filtriert werden, und das Filtrat wird einer willkürlichen Kombination der folgenden Behandlungen unterworfen. Das Piltrat kann durch ein basisches Anionenaustauscherharz durchgeschickt werden, um das gewünschte Produkt auf dem Harz zu absorbieren, und das gewünschte Produkt kann durch Elution einer Salzlösung oder einer wäßrigen methanolischen Lösung des Salzes erhalten werden. Beispiele solcher Ionenaustauscherharze umfassen stark basische Anionenaustauscherharze (z. B. die Produkte mit den Warenbezeichnungen Dowex 1x2 von Dow Chemical Co., Diaion PA-318, 316, 3o6S, 308 und 312 von Mitsubishi Chem. Ind., Ltd., Amberlite LEA-400,

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4-01 und 4-10 von Roehm & Haas Co. und dergleichen) und handelsübliche, schwach basische Anionenaustauscherharze (beispielsweise das Produkt mit der Warenbezeichnung Amberlite IRA-68). Alternativ kann das Kulturfiltrat einer Adsorption mit einem Adsorbens wie Aktivkohle unterworfen werden, und das gewünschte Produkt wird durch Elution mit wäßrigem Methanol, wäßrigem Aceton und dergleichen erhalten.

Danach wird die aktive Fraktion, welche die Substanz KA-6643 einschließt, durch ein stark basisches Anionenaustauscherharz (beispielweise das Produkt mit der Warenbezeichnung Dowex 1 χ 2) zur Absorption der Substanz KA-6643 durchgeschickt, danach wird die Substanz stufenweise unter allmählicher Veränderung der Salzkonzentration in einer Phosphatpufferlösung eluiert. Bei diesem Elutionsvorgang wird die Substanz KA-6643-A in einer Anfangsstufe eluiert, hierauf folgt die Elution der Substanz KA-6643-B, wodurch die Substanz KA-6643-A und die Substanz KA-6643-B voneinander getrennt werden. Alternativ kann die aktive Fraktion durch eine mit einem mäßig polaren oder nicht-polaren, hydrophoben, vernetzten Polymerisat gefüllte Säule (beispielsweise mit dem Produkt mit der Warenbezeichnung Amberlite XAD-2 oder Diaion HP-20) geschickt werden, um die Substanz KA-6643-A und die Substanz KA-6643-B als Folge des Adsorptionsunterschiedes hierzwischen zu trennen.

Die so erhaltenen Substanzen KA-6643-A und KA-6643-B werden weiter einer Gelfiltration unter Verwendung eines handelsüblichen Gels (beispielsweise das Produkt mit der Warenbezeichnung Biogel P-2 von BIO.RAD Lab. oder Sephadex G-10 von Pharmacia Fine Chemicals) unterworfen, oder sie werden einer Umkehrphasenchromatografie unter Verwendung einer üblichen Säule (beispielsweise gepackt mit dem Produkt mit der Warenbezeichnung Bondapack C.g von Waters Associates, Inc.) unterworden, wodurch hochreine Substanzen KA-6643-A und KA-6643-B erhalten werden.

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Falls erforderlich, können sowohl die Substanz KA-6643-A als auch die Substanz KA-6643-B nach jeder üblichen Methode in Alkalimetallsalze, Erdalkalimetallsalze, Salze von primären, sekundären oder tertiären Aminen oder quaternäre Ammoniumsalze hiervon umgewandelt werden.

Die erfindungsgemäße Substanz KA-6643 besitzt die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften und biologischen Eigenschaften und zeigt antibakterielle Aktivität gegenüber gram-positiven und gram-negativen Bakterien. Weiterhin zeigt diese Substanz eine ausgezeichnete antibakterielle Aktivität gegenüber Bakterien, welche gegenüber verschiedenen Typen von ß-Lactamantibiotika resistent sind und sie besitzt eine ß-Lactamasehemmaktivität.

(A) Natriumsalz der Substanz KA-6643-A

(1) Aussehen: weißes Pulver

(2) Schmelzpunkt: allmähliche Zersetzung oberhalb 145 ⁰C

(3) UV-Absorptionsspektrum: Bei der Messung in einer wäßrigen Lösung ist das Spektrum praktisch das gleiche wie in der Fig. 1 angegeben mit maximaler Absorption bei 240 nm und 288 nm und minimaler Absorption bei 265 nm·

(4) LR-Absorptionsspektrum: Bei der Aufnahme in KBr besitzt die Substanz praktisch das gleiche Spektrum wie in der Fig. 2 angegeben.

(5) Löslichkeit in Lösungsmittel: Leicht löslich in Wasser, jedoch praktisch unlöslich in Aceton, Chloroform, Äthylacetat und Petroläther.

(6) KMR-Spektrum (kernmagnetische Resonanz)

H-MMR-Spektrum: Bei der Messung in D^O ist das Spektrum praktisch das gleiche wie in der Fig. 3 dargestellt.

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(7) Dünnschichtchromatografie

Rf-Wert: 0,6 (Platte: TLC-Aluminiumfolie-cellulose F₂C/,, 0,2 mm (Merck & Co«, Inc.); Lösungsmittel: Butanol-Isopropylalkohol-Wasser (7:7:6) ) Rf-Wert: 0,55 (Platte: TLC-Aluminiumfolie-kieselerdegel 6OF₂C/,, 0,2 mm (Merck & Co., Inc.); Lösungsmittel: Isopropylalkohol-Wasser (7:1) )

(8) Hochleistungsflüssigkeitschromatografie Elutionszeit: 10,5 Minuten

Säule: yU-Bondapack C^₈ von Waters Associates, Inc., 4 χ 300 mm

Lösungsmittel: Methanol-Ο,ΟΙΜ Phosphatpufferlösung (1:9), pH = 6,8

Strömungsrate: 1 ml/min

(9) Molekulargewicht: 364- (berechnet aus dem bei der Massenspektrometrie des Monomethylesters erhaltenen Wertes)

(10) Molekülformel: C-^H.„^OgSNa (bestimmt aus der Molekülformel des Methylesters, berechnet aus den Ergebnissen der Massenspektrometrie)

(11) Stabilität: Die Halbwertszeit bei unterschiedlichen pH-Werten sind wie folgt:

pH	KA-6643-A (t^· (h) )	Lösungsmittel:	MM-4550*
4,0	33	pH - 4	5,5
6,0	144	■,0 - 7,0 : Mcllvanine's P	18
7,0	187	10,5
7,8	110	8,5
10,0	2,8	19

ufferlösun

phosphat-Zitronensäure) pH »10,0 :0,1M Natriumcarbonat-Natriumhydrogen-

carbonat-pufferlösung

Messung : UV-Absorptionsspektroskopie * J.Antibiot., ^². (1979), 295-304

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(B) Monomethylester der Substanz EA-6643-A

(1) Aussehen: farbloser Feststoff

(2) Molekulargewicht: 356 (Massenspektrum)

(3) Elementaranalyse auf ⁰^c^Hp0^N2°6^S

	C	H	7	N	9	S
"berechnet (%):	50,55	5,66	7	,86	8	,00
gefunden (%):	50,38	5,45		,59		,60
Molekülformel:	°15^H20^N2°6^S

(5) UV-Absorptionsspektrum: Das Spektrum in Methanol besitzt eine maximale Absorption bei 243 nm und 300 um und eine minimale Absorption bei 274 nm.

(6) Iß-Absorptionsspektrum: Bei der Aufnahme in EBr hat die Substanz ein Spektrum, wie es in Fig. 4 wiedergegeben ist.

(7) NMR-Spektrum (kernmagnetische Resonanz)

1) ¹H-NMR:

Bei der Messung in CDCl, unter Verwendung von Tetramethylsilan als internem Standard wird ein Spektrum erhalten, das im wesentlichen dem in Fig. 5 wiedergegebenen Spektrum entspricht.

2) ¹⁵C-NMR:

Bei der Messung in CDCl, unter Verwendung von Tetramethylsilan als internem Standard wird ein Spektrum erhalten, das im wesentlichen dem in Fig. 6 wiedergegebenen Spektrum gleich ist.

(8) Dünnschichtchromatografie:

Rf-Wert: 0,44 (Platte: TLC-Aluminiumfolie-kieselerdegel 60 F₂C^i» 0,2 mm (Merck & Co., Inc.), Lösungsmittel: Methylenchlorid-Methanol (9:11) ) (9) spezifische Drehung: Ca] ψ « -96,0° (el,

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(C) Dinatriumsalz der Substanz KA-6643-B

(1) Aussehen: weißes Pulver

(2) Schmelzpunkt: nicht als definierter Punkt angebbar, wird allmählich gelb bis braun oberhalb von etwa 130 °c.

(3) Elementaranalyse :

C H N S
32,5 3,48 5,17 11,00 (%)

(4) UV-Absorptionsspektrum: Praktisch das Spektnam, wie es in der Fig. 7 dargestellt ist mit maximalen Absorptionsbanden bei 240 nm und 285 nm und einer minimalen Absorptionsbande bei 265 um·

(5) IR-Absorptionsspektrum: Das IR-Absorptionsspektrum der Substanz wurde in KBr-Tabletten aufgenommen und entspricht im wesentlichen dem in Fig. 8 gezeigten Spektrum.

(6) NMR-Spektrum (kernmagnetische Resonanz):

Bei der Messung in D£U unter Verwendung von Tetramethylsilan als externem Standard wurde im wesentlichen das NMR-Spektrum der Fig. 9 erhalten.

(7) Löslichkeit in Lösungsmittel: Leicht löslich in Wasser, jedoch praktisch unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Aceton, Chloroform, Äthylacetat, Petroläther und dergleichen.

(8) spezifische Drehung: Ca] „ = -145° (el, HpO)

(9) Stabilität: Die Halbwertszeit bei unterschiedlichen pH-Werten ist wie folgt:

pH ti

4,0	21,8
6,0	210
7,0	170
7,8	130
10,0	7,9

Die Lösungsmittel und die. Messungen waren die gleichen wie bei der Messung der Substanz KA-6643-A.

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(10) Dünnschichtchromatografie: Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I

Platte	Lösungsmittel	Rf-Wert
TLC-Aluminiumfοlie- kieseritgel 6OF₂₅₄ 0,2 mm (Merck & Co. Inc.)	Butano1-Äthano1- Wasser (obere Schicht von 4:1:5)	0,13
It	Isopropanol- Wasser (7:3)	0,85
π	Butano1-Essigsäure- Wasser (12:3:5)	0,16
TLC-Aluminiumfolie- cellulose ^F254 0,1 mm (Merck & Co., Inc.)	But ano 1- Is opr op ano 1- Wasser (7:7:6)	0,46

(11) Papierchromatografie:

Filterpapier: Toyo-Filterpapier Nr. 51 (Toyo Filter Paper Co., Ltd.)

Lösungsmittel: Acetonitril-Wasser (3:2), aufsteigende Methode, Rf-Wert 0,9

(12) Hochleistungsflüssigkeitschromatografie:

Säule: u-Bonapack C^₈ von Waters Associates, Inc., 4 χ 300 mm

Lösungsmittel: 0,1M Phosphatpufferlösung, pH » 6,8 Strömungsrate: 1 ml/min

Retentionszeit: 23,5 Minuten

(13) Hochspannungspapierelektrophorse

Unter Einsatz einer Hochspannungspapierelektrophoreseapparatur und bei einer Wanderung in einer 1/30M Phosphatpufferlösung (pH =7,0) bei 3000 V während 30 Minuten bewegte sich die erfindungsgemäße Substanz zur Anode um 8,5 cm.

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Penicillin N, das in ähnlicher Weise untersucht wurde, bewegte sich zur Anode mit 4,4 cm.

(1) Antibakterielles Spektrum

Die antibakteriellen Spektren gegenüber verschiedenen Mikroorganismen sind in der folgenden Tabelle II im Vergleich zu den Spektren von Aminobenzylpenicxllin (AB-Pc) und cefoxitin (CFX) zusammengestellt.

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3QH434

- 20 Tabelle II
untersuchtes Bakterium minimale Hemmkonzentration (ug/ml)

	KA.-6643-A (Natrium salz)	ΚΑ.-6643-ί (Dinatri- umsalz)	AB-Pc	*CFX*
Staphylococcus aureu3 209? JC-I	0-39	6.25	0.05	1.56 ·
Staphylococcus epideinidis I77fl Bacillus subtüis 6653	0.78 0.2	6.25 6.25	0.7a ." <0.025	1.56 1.56
Escherichia coil HIEJ JC-2	0.05	1-55	6.25	6.25
EZLefcaieUa pneLsaniae 602	0.2	6.25	12-5	0.78
Serratia maxcsacana HHL	0.2	6.25	50	12.5
Entercbactar cloacae 977	0.78	6.25	ICO	>1CO
Enterobacter aerogene3 972	0.1	3-13	6.25	>100
Enfnin alvei 978 Paendc-acnsa aeniginoSa A-3	0.2 6.25	6.25 50	'SO >1CO	6.25 >1CO
" .ID490 Eaeudcnonas putida 5121	6.25 .1.55	• 25 ICO	100 >iCO	>1CO >100
Prateu3 Tnlgaxi3 874·	0.39	12.5	>1CO	6.25
Proteua morgam'i 516S	0.39	12.5	>10O	6.25
Proteua rsttgerl 13501	1.56	50	0.2	1.56
Proteua inconstans Üinll5	0.78	12.5	ICO	6.25
Eschericiria ccli EC-I (Pcase i)	0.2	3.13	>100	3.13
" EC-59 (Pcaae Π) " EC-68 (Pcaae 17) Citrobacter 1 (PC ase)	0.05 0.05 .0.7a	1.55 3.13 6.25	>1CO >iCO >100	6.25 " 6.25 >1CO
¹¹ 24- (CS ase) ELebaiella 25 (PC aae)	I.56 0.73	12.5 6.25	>100 >1DO	>100 6.25
32 (CS aae) '	3-13	12.5	>100	>100

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BAD

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Wie hieraus ersichtlich ist, zeigt die Substanz KA-6643 eine intensive antibakterielle Aktivität gegenüber gramnegativen und gram-positiven Bakterien einschließlich solcher, welche gegenüber verschiedenen Penicillin- und Cephalosporin-antibiotika resistent sind.

(2) ß-Lactamase-Hemmaktivität

(i) Die antibakterielle Aktivität der verbesserten Wirkung gegenüber ß-Lactam-resistenten Bakterien

Im Penassay-Agar (12 g hiervon waren in 500 ml destilliertem Wasser gelöst,(Kyoei Pharm. Co., Ltd.) wurde Escherichia coli EC-1 (PC ase) und Citrobacter 24 (CS ase) eingeimpft, wobei dies ß-Lactamase bildende Organismen sind, und 10 ml des beimpften Mediums wurden auf einer Petrischale von 9 cm Durchmesser verteilt und unter Bildung eines Testmediums festwerden gelassen.

In dieses Agarmedium wurden Zellstoffscheiben von 8 mm Durchmesser eingelegt, in welche 30 ug wäßrige Lösungen von Antibiotika jeweils eingegeben wurden, anschließend wurde 18 Stunden bei 37 ⁰C inkubiert und dann der Durchmesser einer Hemmzone um jede Scheibe bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt:

Tabelle III

Antibiotikazusammen- Durchmesser der Hemmzone (mm)

Medium mit Medium mit Citro-

setzung

E.coli EC-1 bacter 24

AB-Pc* (1 mg/ml)	-	.0	-
KA-6643-A (10 γ/ltlÄ)	18		16.0
KA-6643-B (10 y/rnlL)	-	.0	-
AB-Pc(I mg/mJl)+KA-6643 +KA-6643-A(10 γ/mJl)	20	.0	20.0
AB-Pc91 mg/nU) +KA-6643-B(10Y/mJt)	23	14.0

* AB-Pc: Aminobenzyl-penicillin 030065/0610

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(ii) ß-Lactamase-Hemmaktivität

Bei der Verwendung von Penicillinamidohydrolase EC 3·5*2.6 von Tokyo Chem. Syn. Co., Ltd. als ß-Lactamaseenzym, abstammend aus zur Gattung Bacillus gehörenden Bakterien,betrug der 1,-Q-Wert der Substanz KA-664-3-A 0,5 ng/ml und derjenige der Substanz KA.-664-3-B 12,8 ng/ml.

Der Ij-Q-Wert wurde entsprechend der Methode von

C. Reading und M. CoIe, Antimicr. Agents and Chemoth., H (1977), 852-857, bestimmt.

Hieraus ist ersichtlich, daß die Substanzen KA-664-3-A und KA-6643-B ausgeprägte Synergistisehe Effekte in Kombination mit anderen ß-Lactam-antibiotika zeigen.

Im Hinblick auf die zuvor beschriebenem,verschiedenen Eigenschaften können die erfindungsgemäßen Substanzen als ß-Lactam-antibiotika bezeichnet werden. Obwohl es eine bekannte Substanz gibt, d. h. MM 4550 (MC969-SY2-A), welche hinsichtlich des UV-Absorptionsspektrums den erfindungsgemäßen Substanzen ähnlich ist, unterscheidet sich dieses bekannte Antibiotika von den Substanzen KA-6643-A und KA-664-3-B in folgenden Werten:

(1) Papierelektrophorese

Bei der Untersuchung bei der Papierelektrophorese bei 3OOO V für 25 Minuten mit 0,1M Phosphatpufferlösung (pH «8,0) als Lösungsmittel: KA-664-3-A: bewegte sich zur Anodenseite um 5 cm MM 4-550: bewegte sich zur Anodenseite um 10,2 cm

(2) Hochleistungsflüssigkeitschromatografie:

Säule: ß-Bondapack C^₈ von Waters Associates, Inc., 4 χ 30 cm

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Lösungsmittel: 0,05M Phosphatpufferlösung (pH «

7,0)

Strömungsrate: 1 ml/min

Retentionszeit:

KA-6643-A 1 Stunde

KA-6643-B 30 Minuten

HM 4550 17 Minuten

Aus diesen Werten ist ersichtlich, daß die Substanz KA-6643 eine neue Verbindung ist, welche sich von dem bekannten ß-Lactam-Antibiotikum unterscheidet.

Da die erfindungsgemäße Substanz KA-6643 eine Carboxylgruppe im Molekül besitzt, kann sie in Form einer freien Säure eingesetzt werden, jedoch wird sie vorzugsweise in Form von Salzen verwendet. Geeignete Salze sind beispielsweise Salze von Alkali-oder Erdalkalimetallen wie von Natrium, Kalium, Calcium und dergleichen sowie Ammoniumsalzen wie von Ammoniak, Trimethylamin, Dimethylamin und dergleichen. Weiterhin kann die Substanz in Form von Niederalkylestern wie in Form des Methylesters, Äthylesters und dergleichen, oder in Form von Estern von höheren Fettsäuren verwendet werden.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele, welche Formulierungen und experimentelle Ergebnisse zeigen, näher erläutert.

Beispiel 1

(i) 30 1 eines flüssigen Mediums mit folgender Zusammensetzung: 3 % Stärke, 1,5 % Sojabohnenmehl, 0,28 % monobasisches Kaliumphosphat, 0,18 % dibasisches Natriumphosphat-dodecahydrat, 0,0005 % Kobaltchloridhexahydrat, 0,05 % Magnesiumsulfatheptahydrat und 0,001 % Eisen(II)-sulfat, das auf pH = 6,0 eingestellt worden war, wurde hergestellt. Teilmengen von 100 ml

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des Mediums wurden Jeweils in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben eingeführt und sterilisiert. Mycelien des Stammes KC-6643 wurden in das Medium eingeimpft und es wurde eine Schüttelkultur während 4 Tagen "bei 27 ⁰C und 220 Upm durchgeführt.

(ii) Nach dem Abschluß der Züchtung wurde ein Filterhilfsmittel (Warenbezeichnung Celite von Johns-Manville Co., Inc.) zu der Kulturbrühe zugesetzt und die Mycelien wurden durch Filtration entfernt. 25 1 Filtrat wurden durch eine Säule (6 χ 30 cm) mit einem stark basischen Anionenaustauscherharζ (Produkt mit der Warenbezeichnung Diaion PA316 von Mitsubishi Chem. Ind., Ltd.) in der Cl~-Form durchgeschickt, anschließend wurde mit Wasser gewaschen und mit einer 0,01M Phosphatpufferlösung mit pH = 7»0, welche 0,5M Natriumchlorid enthielt, zur Gewinnung einer aktiven Fraktion eluiert. Die erhaltene, aktive Fraktion wurde durch eine Säule (4 χ 30 cm) mit Aktivkohle durchgeschickt und nach dem Waschen mit Wasser wurde mit 50 Vol./Vol.-% wäßrigem Aceton zur Gewinnung einer aktiven Fraktion behandelt. Die aufgefangene, aktive Fraktion wurde durch eine Säule (4 χ 40 cm) eines basischen Anionenaustauscherharzes in der Cl~-Form (Produkt mit der Warenbezeichnung Amberlite IRA-68) durchgeschickt, anschließend wurde mit Wasser gewaschen und dann mit einer 0,01M Phosphatpufferlösung mit pH a 7*0 und einem Gehalt von 0,2M Natriumchlorid zur Gewinnung einer aktiven Fraktion eluiert. Die so erhaltene, aktive Fraktion wurde durch eine Säule (3 x 30 cm) mit Aktivkohle durchgeschickt, diese wurde mit Wasser gewaschen und mit 50 Vol./Vol.-% wäßrigem Aceton zur Gewinnung einer aktiven Fraktion eluiert.

(iii) Die so erhaltene Fraktion wurde durch eine Säule (4 χ 30 cm) eines stark basischen Anionenaustauscherharzes in der Cl~-Form (Produkt mit der Warenbezeichnung Dowex 1x2, 100 200 mesh) durchgeschickt, anschließend wurde mit Wasser gewaschen und eine Konzentrationsgradientenelution bei einer

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Strömungsrate von 3 ml/min zwischen einer Lösung von O,O1M Phosphatpuffer mit pH = 7»O und einem Gehalt von 0,1M Natriumsalz sowie einer Lösung mit einem Gehalt von 0,4M Natriumchlorid durchgeführt, wodurch die Fraktion in zwei Fraktionen aufgeteilt wurde, eine anfänglich isolierte Fraktion und eine anschließend eluierte Fraktion,und die beiden Fraktionen getrennt aufgefangen wurden.

(iv) Die auf diese Weise aufgefangene, anfänglich eluierte, aktive Fraktion von etwa 1 1 wurde auf etwa 100 ml unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unterhalb von 30 ⁰C eingeengt. Das Konzentrat wurde dann durch eine mit einem vernetzten Polymerisat (Diaion HP-20) gefüllte Säule, welche zuvor mit einer 20 %igen Salzlösung gewaschen worden war, durchgeschickt, anschließend wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Strömungsrate von 4 ml/min eluiert. Es wurde eine aktive Fraktion aufgefangen und auf etwa 2 ml bei einer Temperatur unterhalb von 30 C eingeengt, hierauf wurde eine Gefriertrocknung durchgeführt, wobei 80 mg eines rohen Pulvers von KA-6643-A erhalten wurden.

(v) Die anschließend eluierte, aktive Fraktion wurde in der gleichen Weise wie bei der Stufe (iv) behandelt, hierbei wurden 240 mg eines rohen Pulvers von KA-6643-B erhalten.

Beispiel 2

(i) In ein Medium mit folgender Zusammensetzung; 2 % Stärke, 1,5 % Sojabohnenmehl, 0,28 % monobasisches Kaliumphosphat, 0,18 % dibasisches Natriumphosphatdodecahydrat, 0,0005 % Kobaltchloridhexahydrat, 0,05 % Magnesiumsulfatheptahydrat und 0,001 % Eisen(II)sulfat, welches auf pH - 6,0 eingestellt und sterilisiert worden war, wurden Mycelien des Stammes KC-6643 eingeimpft, anschließend erfolgte eine Vorkultur bei 27 °C während etwa 48 Stunden, um ein erstes Saatmedium zu

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erhalten. In jeweils zwei Tanks mit einem Volumen von jeweils 200 1 wurden 100 1 Medium der gleichen Zusammensetzung, wie es zuvor verwendet wurde, jedoch mit dem weiteren Zusatz von 1 % Baumwollsaatöl, zugegeben. Die erste Saatkultur wurde in jeden Tank in einer Menge von 500 ml eingeimpft und bei 30 in einem belüfteten Rührsystem (300 Upm, Luftströmungsrate 50 l/min) während 4 Tagen gezüchtet.

(ii) Nach dem Abschluß der Züchtung wurden zu 170 1 Kulturbrühe 10 Vol./Vol.-% einer Filterhilfe (Warenbezeichnung Dicalite Perlite 4109 von Dicalite Orient Co., Ltd.) zugesetzt, und die Mycelien wurden durch Filtration entfernt.

150 1 erhaltenes Filtrat wurden hinsichtlich der Leitfähigkeit auf 1,5 mil/cm eingestellt und durch eine Säule (21,5 x 45 cm) eines stark basischen Anxonenaustauscherharzes in der Cl~-IOrm (Produkt mit der Warenbezeichnung Diaion PA3I6 von Mitsubishi Chem. Ind., Ltd.) bei einer Strömungsrate von 200 ml/min durchgeschickt. Nach dem Waschen mit einer 0,01M Phosphatpufferlösung mit pH » 7»0 wurde das Harz einer Elution mit einer 0,01M Phosphatpufferlösung mit pH « 7»Q und. einem

.wässrigem Methanol

Gehalt von 2M Natriumchlorid in 2 v/v %/bei einer Strömungsrate von 150 ml/min unterzogen und eine aktive Fraktion aufgefangen. Die so aufgefangene, aktive Fraktion wurde durch eine Säule (16 χ 10 cm) eines vernetzten Polymerisates (Produkt mit der Warenbezeichnung Diaion HP-20), das mit einer 10 Gew./Vol.-% Natriumchloridlösung eingestellt worden war, bei einer Strömungsrate von 400 ml/min durchgeschickt, und nach dem Waschen mit einer 10 Gew./Vo1.% Natriumchloridlösung wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Strömungsrate von 200 ml/min unter Auffangen einer aktiven Fraktion eluiert.

(iii) Die so aufgefangene, aktive Fraktion wurde durch eine Säule (6 χ 70 cm) eines stark basischen Anionenaustauscherharzes in der Cl"-Form (Produkt Amberlite IEA-458 von Eoehm & Haas Co.) mit einer Strömungsrate von 50 ml/min durchgeschickt

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und mit einer O,O1M Phosphatpufferlösung mit pH ■ 7>0 einem Gehalt an 0,15^ Natriumchlorid eluiert. Danach wurde die erhaltene, aktive Fraktion mit einer 0,01M Phosphatpufferlösung mit pH = 7*0 und einem Gehalt an 2M Natriumchlorid eluiert. -

(iv) Die in Stufe (iii) erhaltene, zu Anfang eluierte Fraktion wurde der gleichen Behandlung, wie sie in Stufe (iv) von Beispiel 1 angegeben ist, unterworfen, hierbei wurden 700 mg eines rohen Pulvers der Substanz KA-664-3-A erhalten.

(v) Die im Anschluß eluierte, aktive Fraktion wurde durch eine Säule ( 6 χ 70 cm) eines vernetzten Polymerisates (Produkt mit der Warenbezeichnung Diaion HP-20), das zuvor mit einer 20 Gew./Vol.% wäßrigen Natriumchloridlösung behandelt worden war, durchgeschickt, dann wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Strömungsrate von 20 ml/min zum Auffangen einer aktiven Fraktion eluiert. Die so aufgefangene, aktive Fraktion wurde mit entionisiertem Wasser bis auf eine elektrische Leitfähigkeit von etwa 700 u0hm/cm verdünnt und dann durch eine Säule (3 x 30 cm) eines schwach basischen Anionenaustauscherharzes (Produkt DEAE-Sephadex A-25 von Pharmacia Fine Chemicals), das auf pH « 7>0 unter Verwendung einer 0,01M Phosphatpufferlösung eingestellt worden war, durchgeschickt, anschließend mit Wasser gewaschen und mit einer Phosphatpufferlösung mit pH = 7»0 und einem Gehalt von 0,15M Natriumchlorid bei einer Strömungsrate von 35 ml/min unter Auffangen einer aktiven Fraktion eluiert. Das so aufgefangene Eluat wurde unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unterhalb von 30 ⁰C eingeengt und dann durch eine Säule (3»5 χ 40 cm) eines vernetzten Polymerisates (Produkt Diaion HP-20), das zuvor mit einer 10 Gew./Vol.% wäßrigen Natriumchloridlösung behandelt worden war, durchgeschickt, dann wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Strömungsrate von 20 ml/min unter Auffangen einer aktiven Fraktion eluiert. Die aktive

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Fraktion wurde unter vermindertem Druck auf etwa 2 ml eingeengt und anschließend gefriergetrocknet, wobei 190 mg eines rohen Pulvers der Substanz KA-664-3-B erhalten wurden.

Das so erhaltene, rohe Pulver wurde in 1 ml entionisiertem Wasser aufgelöst und durch eine Säule (2 χ 30 cm) eines vernetzten Polymerisates (Produkt Diaion HP-20) durchgeschickt und dann mit entionisiertem Wasser bei einer Strömungsrate von

1 ml/min unter Auffangung einer aktiven Fraktion eluiert. Die so aufgefangene, aktive Fraktion wurde unter vermindertem Druck eingeengt und durch eine Säule mit Sephadex G-10 durchgeschickt, anschließend wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Strömungsrate von 0,2 ml/min entwickelt. Die aktive Fraktion wurde aufgefangen, unter vermindertem Druck auf etwa

2 ml eingeengt und dann gefriergetrocknet, hierbei wurden 80 mg eines rohen Pulvers erhalten.

(vi) 80 mg des so erhaltenen Pulvers wurden in 0,1 ml einer 0,1M Phosphatpufferlösung mit pH = 6,8 aufgelöst und durch eine Säule (0,8 χ 120 cm) mit Bondapack C.g/Polasil B von Waters Associates, Inc., die zuvor mit einer 0,1M Phosphatpufferlösung behandelt worden waren, durchgeschickt, anschließend wurde mit der gleichen Pufferlösung bei einer Strömungsrate von 6 ml/min unter Auffangung einer aktiven Fraktion eluiert. Die aktive Fraktion wurde durch eine Säule (0,9 x 5 cm) mit Aktivkohle durchgeschickt, mit entionisiertem Wasser gewaschen und mit 50 Gew./Vol.% Wasser enthaltendem Aceton unter Auffangen einer aktiven Fraktion eluiert. Die aktive Fraktion wurde unter vermindertem Druck auf etwa 1 ml eingeengt und gefriergetrocknet, hierbei wurden 35 mg eines gereinigten Pulvers von KA-6643-B erhalten.

Beispiel 3

120 mg des in Beispiel 1 (iv) oder Beispiel 2 (iv) erhaltenen, rohen Pulvers wurden in 1 ml entionisiertem Wasser aufgelöst

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und dann durch eine Säule (0,8 χ 60 cm) mit Bondapack CLg/ Polasil B von Waters Associates, Inc. für eine Hochleistungsflüssigkeitschromatografie durchgeschickt und mit 0,01M Phosphatpufferlösung mit pH » 6,8 und einem Gehalt von 2 % Methanol bei einer Strömungsrate von 6 ml/min unter Auffangung einer aktiven Fraktion eluiert.

Die so erhaltene, aktive Fraktion wurde auf 5 ml unter vermindertem Druck eingeengt und durch eine Säule (2 χ 15 cm) mit vernetztem Polymerisat (Produkt Diaion HP-20), welches mit einer Salzlösung gewaschen worden war, durchgeschickt, anschließend wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Strömungsrate von 1 ml/min unter Auffangung einer aktiven Fraktion eluiert. Die Fraktion wurde auf 1 ml eingeengt und dann durch eine Säule (3 x 150 cm) von Sephadex G-10 durchgeschickt und mit entionisiertem Wasser bei einer Strömungsrate von 1 ml/min eluiert. Danach wurde die erhaltene, aktive Fraktion auf 2 ml unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 4 mg eines gereinigten Produktes eines Natriumsalzes von KA-664-3-A erhalten wurden.

Die erfindungsgemäße, antibiotische Substanz kann wie entsprechende andere, vergleichbare Antibiotika als Arzneimittel eingesetzt werden.

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Claims

Patentansprüche

worin E ein Wasserstoffatom oder den Rest -S(KH bedeutet.
2. Antibiotische Substanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R in der Formel ein Wasserstoffatom bedeutet.
3· Antibiotische Substanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R in der Formel den Rest -SO₅H bedeutet.
4. Antibiotische Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form ihrer Salze vorliegt.
5· Antibiotische Substanz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie Werte des UV-Absorptionsspektrums, des IR-Absorptionsspektrums,wie in den Fig. 1 bis 9 gezeigt, aufweist. 030065/0610

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6. Verfahren zur Herstellung einer antibiotischen Substanz und von Salzen hiervon der folgenden allgemeinen Formel:

O

- CH-, t '*.

J-Ch=CHNHCOCH ₃ j «

CH ■

3 I I V-r Il I ' ' Q;

^R Q^ "COOH

worin R ein Wasserstoffatom oder den Rest -SO,H bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß ein die Substanz KA-6643 bildender Mikroorganismus, welcher zur Art Streptomyces gehört, gezüchtet und die antibiotische Substanz aus der Kulturbrühe isoliert wird.
7· Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine antibiotische Substanz, in welcher R in der Formel ein Wasserstoffatom darstellt, hergestellt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine antibiotische Substanz, in welcher R in der Formel den Rest -SO^H darstellt, hergestellt wird.
9. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an wenigstens einer antibiotischen Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 5·
10. Stamm, hinterlegt bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 31493» bezeichnet als Streptoayces sp. KC-6643, der bei der Herstellung der antibiotischen Substanz KA-6643 brauchbar ist.

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