DD157345A5 - Ein verfahren zur herstellung einer antibiotischen substanz - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Herstellungsverfahren eines Antibiotikums mit der Bezeichnung KA-6643 und der allgemeinen Formel, worin R Wasserstoff oder -SO tief 3 H ist. Das Antibiotikum wird von einem Stamm produziert, der unter der Nummer FERM-P4467 bzw. ATCC31493 registriert wurde. Ziel der Erfindung war die weitere Bereicherung des Standes der Technik.

Description

wgQ -.4- AP G 12 D / 220 468

Berlin, 29* 10. 1980

2 57 343 12

Verfahren zur Herstellung einer antibiotischen Substanz

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, das in der Medizin als Heilmittel eingesetzt werden kann*

Es sind bereits eine Reihe von Antibiotika durch mikrobiologische Züchtung von Streptomyces-Arten bekannt geworden«. Wegen der immer wieder auftretenden Resistenzerscheinungen bei behandelten Patienten besteht die ständige Forderung nach Bereitstellung neuer Antibiotika«

Es ist Ziel der Erfindung, eine neue antibiotische Substanz zu entwickeln, um damit den Stand der Technik zu bereichern*

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung e#Lner neuen antibiotischen Substanz bereitzustellen*

Bei der Isolierung von·Boden-Mikroorganismen wurde gefunden, daß der Stamm KC-6643 in der Lage ist, zwei Varianten eines neuen Antibiotikums zu produzieren, die hervorragende antibakterielle Eigenschaften gegen grampositive und gramnegative Bakterien besitzen« Die Isolierung dieser Antibiotika aus dem Kulturnährboden ist erfolgreich gewesen.

29« 1O₉ 1980 AP C 12 D / 220 468 57 343 12 » t c P - 2 - '

Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich daher mit einem Antibiotikum, welches von Stämmen_f die zur Gruppe der Streptomyces gehören, produziert wird, wobei das Antibiotikum die Formel (I)

S-Ch=CHJIHCOCH₃

COOH

aufweist j worin R ein Wasserstoffatom oder »SO^H darstellt. In dieser Beschreibung wird die Mischung der oben genannten zwei Varianten des neuen Antibiotikums als Substanz KA-6643 bezeichnet*

Eine dieser Varianten (R in der Formel (I) ist ein Wasser» stoffatom) wird weiterhin als die Substanz KA-6643-A· bezeichnet, und die andere (R in der Pormel (I) ist ~S0.J3) als die Substanz KA-6643-B·

Aus der gezüchteten Kulturbrühe wird erfindungsgemäß die antibiotische Substanz abgetrennt» ·

Die Organismen der Erfindung,, welche die Substanz KA-6643 produziert, haben die folgenden taxonomisehen Eigenschaften«

Es sollte bemerkt v/erden, daß die Morphologie in verschie-» denen ISP-Medien beobachtet wurde, wenn die Kultur bei 27 ⁰C 21 Tage lang mit den herkömmlichen Verfahren angesetzt wird, und daß die Farbe der reifen Kultur mit der Klassifikation des Color Harmony Handbuches (Container Corporation of America) übereinstimmt, wenn nicht anders vorgesehen.

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Der Stamm der Substanz KC-6643 gestattet die Bildung eines Flächenmyzeliums in verschiedenen Medien, die einzeln unter teilt sind_o Die Sporophore wird auf dem Flächenmyzelium gebildet j wobei eine gerade Sporenkette gebildet wird. Jede Spore hat eine Größe von 0_s4 bis 0,5 /um χ 0,9 bis 1,0 ,um. von ovaler bis zylindrischer Gestalt und formt eine Kette von 20 oder mehr Sporen; die Oberfläche ist glatt. Die Sporenketten sind oft zusammengeschmolzen und bilden so eine eklerotiumartige Struktur, und die Bruchstückbildimg des Substratmyzeliums wird in einigen Medien, die in den taxono mischen Studien benutzt werden, beobachtet«

iH2i!^

1. Sucrose-Hitrat-lTährboden

Wachstum: gut, sich flach ausbreitend, farblos - glänzend (2fb)

Flächenmyzelium.: mittelmäßig, puderartig, weiß (a) Lösliches Pigment: keines

2* Glukose-Asparagin-Nährboden . Wachstum: mittelmäßig, flach und butterartig, kremig (1¹/2 ca)-pastell-gelb (2hb)

Flächenmyzelium:' keines

Lösliches Pigment: keines

3· Glyzerin-Asparagin-Uährboden

Wachstum: gut, warzenartig,¹ runzelig, glänzend (2 fg) Bambus (2 gc)

Flächenmyzelium: gut, puderartig, perlartig (3 ba) Lösliches Pigment: keines

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4e Stärke-anorganischer Salznährboden Wachstum: gut, runzelig, fettartig, Bambus (2 gc) .-.honiggoldfarben (2 ic) Flächenmyzelium: gut, puderartig,· weiß (a) - perlartig (3 ba)

Lösliches Pigment: keines

If

5ο Tyrosin-lTährboden Wachstum:'gut, beträchtlich warzig, runzelig, Gelatine·» zimt (3 e)

Flächenmyzelium: gut, puderartig_? perlartig (3 ba) Lösliches Pigment: keines

6* Mhrstoff-Agar

Yfachstura: leicht warzenartig, runzelig, gelatineartig, farblos - leicht gelb (1¹/2 ea). Flächenmyzelium: keines Lösliches Pigment: keines

7« Hefe~Extrakt«Malz-Extrakt-Hährboden V/achstum: übermäßig, runzelig, butterartig-gelatineartig

senffarben (2 e) ,

Fläehenmyzelium: gut, puderartig, weiß (a) - perlartig (3 ba)

Lösliches Pigment: keines

8_e Hafermehl-Hährboaen Wachstum: mittelmäßig, sich flach ausbreitend, kremfarben (1¹/2 ca) - butterartig - gelb (1 ¹/2 ga) Fläehenmyzelium: mittelmäßig, puderartig, weiß (a) Lösliches Pigment: keines '

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Pepton«Hefe~Sisen~Nährboden-

Wachstum: gut, recht warzig, runzelig, butterartig, leicht gelb (1 ¹/2 ea) '

Flächenmyzeliuin: keines

Lösliches Pigment; keines

(1) Bereich der Wachstumstemperatur: 3 bis 35 ⁰C

(2) Bereich der optimalen Y/achsturastemperatur; 27 bis 33 ⁰G

(3) Verflüssigung der Gelatine: positiv

(4) Hydrolyse der Stärke % positiv

(5) Koagulation der abgeschöpften Milch: negativ yepioin'>s'>tru,r.g £_er abgeschöpften Milch: positiv

(6) Bildung des melanoiden Pigments: negativ

Der Einsatz der Kohlenstoffquellen in dem Pridham- und Gottlieb-ITährstoffmedium wurde mit den folgenden Ergebnissen erforscht:

Genutzte Kohlenstoffquellen: -L-Arabinose, D-Xylose, D-Glukose,

D-Puractosej, Inositol und L-Rliamnose

Nichteingesetzte Kohlenstoffquellen: Sukrose, Raffinose und

¹ D~Mannitol

V* Der vorliegende Stamm enthält LL-Diaminopimelinsäure in den Zellwänden*

Im Hinblick auf die vorhergehenden Eigenschaften scheint der Stamm KC-6643 zum Genus Streptomyces zu gehören, aber er zeigt charakteristische Eigenschaften wie z_e B#

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04 β 8

die Fragmentation'des Substratmyzels₃ die Fusion der Sporenketten u_eä_e$ die leicht von den typischen Eigen-» schäften der Myzelien des Genus Streptomycins abweichen.

Es ist jedoch allgemein bekannt, daß die den Streptomyces zugeordneten Stämme oft solche spezifischen Strukturen annehmen» wie z.-B. die Fragmentation der Hyphen im Medium und Abnormalitäten in der Sporenkette, und folglich wird es als angemessen betrachtet, den Stamm KC~6643 als zum Genus Streptomyces gehörig zu klassifi«= zieren*

Stämme_s bei denen die Sporenkette gerade ist, die Oberfläche der Spore glatt, das Flächenmycelium weiß, wo die Rückseite der Kolonie keine charakteristischen Eigenschaften bezüglich der Tönung zeigt und keine löslichen Pigmente oder melanoiden Pigmente gebildet werden, werden von den bekannten Arten, die in "Bergys Handbuch der bestimmenden Bakteriologie", 8* Ausgabe, ISP von Shirling und Gottlieb, und die "Aktinomyzeten" von S* A* Waksman, 2 (1961) angezeigt sind, herausgesucht; es können 7 mögliche Arten erwähnt werden, Streptomyze Albovinaceus (ISP 5136), Streptomyces Aureocircuratus (ISP 5136)s Streptomyces baarnensis (ISP 5232), Streptomyces chrysomallus (ISP 5128), Streptomyces Candidas (ISP 5141), Streptomyces gougeroti (ISP 5324) und Streptomyces griseoloalbus (ISP 5468).

Die Streptomyces albovinaceous (ISP 5136) sind vom Stamm KC-6643 insofern verschieden, daß ein schwaches Wachstum in einem Sukrose-Nitrat-Nährbodenmedium und ein Wachstum bei 5 ⁰C in verschiedenen Medien zu verzeichnen ist sowie eine Verflüssigung der Gelatine und die Fähigkeit der Nutzung von Kohlenstoffquellen (z„-B, wird D-Mannitol genutzt, nicht Inositol),

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2 2 04 6 8- - γ -

Streptomyces aureocirculatus (ISP 5386) unterscheidet sich vom Stamm KC~6643 insofern, als sein Flä'chenmycel schwach ausgebildet ist und daß es bei 37 ⁰G wächst, aber bei 5 ⁰C nur'sehr wenig Wachstum zu verzeichnen ist, sowie dadurch,' daß nur eine sehr schwache Stärkehydrolyse auftritt und verschiedene Grade der Fähigkeit, Kohlenstoffquellen zu nutzenj vorhanden sind (es wird z* B. D-Mannitol genutzt, nicht L«'Rhamnose)_e·

Streptomyces Candidas (ISP 5141) unterscheidet sich vom Stamm KC-6643 insofern, daß nur ein schwaches Wachstum in einem Sukrose-Mtrat-Hährstoffmedium auftritt, bei 5 ⁰O kaum ein Wachstum und auch die Kohlenstoffquellen kaum genutzt werden (es wird D-Mannitoi benutzt, nicht Inositol)« Streptomyces gougeroti (ISP 5324) unterscheidet sich vom' Stamm KC-6643 insofern, daß ein schwaches Wachstum in einem Sucrosenitratnährbod.en, eine schwache Bildung des Plächenmyzels und eine schwache Verflüssigung von Gelatine zu verzeichnen sind, und weiterhin durch geringe Peptonisierung der Magermilch und geringe nutzung von Kohlenstoff-» quellen (d* h_e es wird B-Mannitol verwendet und ni'Cht Inositol oder L-Rhamnose).

Streptomyces griseoloalbus (ISP 5468) unterscheidet sich vom Stamm KC-6643 durch sein Wachstum bei 37 ⁰C und' nicht bei 5 ⁰C und auch durch die Verflüssigung von Gelantine und die Anwendung von Kohlenstoffquellen (d„ h* es wird D-Mannitol verwendet) und durch einen leicht gelblichen Farbton seines Flächenmyzels« Streptomyces baarnensis (ISP 5232),ist in der Art der Zucht dem Stamm KC-6643 relativ ähnlich, unterscheidet sich aber dadurch, daß es bei 5 ⁰C schlecht wächst'und in.einem Gelatinemedium ein braun lösliches Pigment produziert, durch geringe Fähigkeit,

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• _Λ 57 343 12

£ %j h Ό Ό -. 8 -

Kohlenstoffquellen zu nutzen (d_e h* es wird D-Mannitol und nicht Inositol benutzt)* Streptomyces chrysomallus . (ISP 5128) ist in bezug auf die Zuchtmerkmale dem Stamm KC-6643 sehr ähnlich,' aber wächst nicht bei 5 ⁰C und in einem Mageimilchme.diunu Es unterscheidet sich weiterhin vom Stamm KC~6643 in der Herstellung eines gelb-löslichen Pigments in verschiedenen Medien und durch die Fähigkeit, Kohlenstoffquellen zu nutzen (d„ h_e es wird D-Mannitol und nicht Inositol genutzt)«

Es sind 32 Stämme bekannt, die in der Lage sind, ein einem Metaboliten ähnliches Produkt des Stammes KC-6643 herzustellen, die zu 11 Arten gehören?

Streptomyces cattleya

Streptomyces flavogriseus

Streptomyces olivaseus

Streptomyces flavorirence

Streptomyces flaves

Streptomyces flavovifidis

Streptomyces algenteolus

Streptomyces shioyaensis

Streptomyces lipmanii

Streptomyces cremeus ,

Streptomyces gedanensis

Keine dieser bekannten Stämme haben jedoch ein weißes Flächenmycelium, und Inositol und nicht D-Mannitol v/ird benutzt.

Die Erfinder sehen daher den Stamm KC-6643 als neuen Stamm gehörend zum Genus Streptomyces an, und er wurde als Streptomyces sp» KC-6643 .bezeichnet, sich ergebend aUs den obigen Ergebnissen·

2-2 06-6 8 ~ ⁹ - 27,10,81

AP O12D/220 4β8 '. · 57 343 12

Der Stamm wurde im Fermentationsforschungsinstitut· der Agentur für Industrielle Wissenschaft und Technik, Io, 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaragi-ken,, Japan, am 7» April 1978 hinterlegt, Aufnähmenummer PERM-P 4467» Der Stamm wurde.auch in der American Type Culture Collection hinterlegt, ITo. 12301 Park lawn Drive, Rockville, Maryland, USA, am 12. März 1979 unter der Annahmenummer ATCC 31493, sowie bei ZIMET Jena am 19.-6. 1981»

Bei der Umsetzung der Erfindung in die Praxis wurde nicht nur der Stamm KC-6643 j sondern auch seine spontanen und künstlichen Mutanten benutzt» Eine Kultur des vorliegenden Stamms ist mit jeder 'herkömmlichen Methode der KuItüractionmyceten durchführbar. Als Kohlenstoff quelle für das Medium sind eine Reihe von Stoffen benutzbare Vorzugsweise wird Stärke, Glyzerol, Maltose, Dextrin, Pruktose, Melasse u»..ä, einzeln oder in Kombinationen benutzte Ebenso werden Kohlenwasserstoffe, organische Säuren, Pflanzenöle u. ä_e benutzt'* Stickstoffquellen sind z« B, Sojabohnenmehl, Hefeextrakte, Trockenhefe, Peptone, Fleischextrakte, Getreide-Touchflüssigkeiten, Casaminsäure, -Brennerei-Lösliches (distillers soluble), Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Natriumnitrat U₀ äe· Diese Stoffe werden einzeln oder in Kombination benutzt« Wenn'erforderlich, k.önnen anorganische Salze, wie z„ B₀ Natriumchlorid, Kaliumphosphat., Eatriumphosphat, Magnesiumphosphat, Magnesiumsulfat, Kalziumchlorid, Kalziumkarbonat, Kalziumhydroxid,.Kobaltchlorid, Zinksulfat, Eisenchlorid, Eisensulfat U₀ ä₀, sowie Spuren von Schwermetallen zugesetzt werden. Weiterhin können organische oder anorganische Substanzen, die zum Wachstum des Myzelins beitragen und. eventuell die Bildung der Substanz KA-6643 erleichtern, entsprechend zugesetzt werden. Wenn ein Verfahren mit Belüftung angewandt .werden soll, ist es'ratsam, weiterhin' ein Antischaummittel

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wie ζ. B. fettes Ql₉ Silikonöl oder Paraffin zuzusetzen* Obwohl eine Kultur des Stamms in einem festen-Medium möglich ist, wird eine flüssige Kultur, besonders eine Unterwasserkultur, vorgezogen,, z« B«, dann, wenn .herkömmliche Antibiotika produziert, werden. Solch eine Kultur wird unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von 3 bin 35 ⁰C, vorzugsweise bei 27 bis 33 ⁰C, angesetzt.

Das Antibiotikum KA<-6643 kann entweder durch eine Schütteloder durch eine Tankkultur hergestellt werden. Yfenn solch eine Kultur 2 bis'10 Tage stehen gelassen wird, sammelt sich in dem Nährboden eine aktive Substanz an» Die Kultivierung wird dann abgebrochen, wenn die Menge des Produktes in dem Nährboden ein Maxima erreicht*

Um die Substanz -KA~6643 aus dem auf diese Weise erhaltenen Kulturboden zu isolieren und danach zu reinigen, können verschiedene bekannte Methoden angewandt werden, die gewöhnlich für solche Zwecke verwendet v/erden,.

Zum Beispiel wird der Kulturnährboden zuerst zentrifugiert und gefiltert, um das Mycel daraus zu entfernen, und das Piltrat wird dann v/eiterbehandelt« Das Piltrat hat ein basisches Anionenaustauschharz zu passieren, um zu gewährleisten, daß das jeweilige Produkt am Harz absorbiert wird» Das erwünschte Produkt wird durch die Eluierung mit einer Salzlösung oder einer wäßrigen methanolischen Lösung des Salzes erhalten»

Beispiele solcher Ionenaustauschharze sind starke basische Anionenaustauschharze,.wie ζ« ·Β, Dowex 1x2, Diaion PA-318, 316, 306Sj-308 und 312, Amberlit IRA-400, 401 und 4Ί0 u„ä_e und schv/ache basische Anionaustauschharze, wie

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• ^;22 0* 6 8 -11 -

ζ« Β« Amberlit IRA - 6δ_β

Als Alternative kann das KuIturfiltrat Gegenstand der Adsorption sein rait einem Adsorptionsmittels wie ζ* Β* Aktivkohle, und das beabsichtigte Produkt wird durch Eluierung mit wäßrigem Methanol, wäßrigem Azeton o.ä« erhalten« .

Danach wird die aktive Fraktion mit der Substanz KA-6643' durch'ein stark basisches Anionenaustausch.ha.rz, wie z* B„ Dowex 1x2 geschickt, um die Substanz KA-6643 zn absorbieren« Danach erfolgt schrittweise Eluierung während gradueller Änderung der Salzkonzentration in einer Phosphat pufferlösung« Bei dieser Eluierung wird die Substanz KA~6643-A im Anfangsstadium eluiert_? mit nachfolgender Eluierung der Substanz KA~6643-B, wobei die Substanzen KA~6643^mB und'KA-6643~A voneinander getrennt v/erden· Als Alternative kann die aktive Fraktion durch eine Säule mit einer Füllung aus einem mittleren polaren oder nichtpolaren hydrophoben vernetzten Polymer geschickt werden, wie z_e Be Amberlit XAD~=2 oder Diaion HP-20, um die Substanzen KA~6643*"A und IiA-=6643*™B voneinander zu trennen, ermöglicht durch unterschiedliche Absorptionsfähigkeit beider«

Die so erhaltene Substanz KA~6643~A und die Substanz KA~6643~B werden weiterhin einer Gelfiltration unterworfen, wobei ein Gel,wie z. B, Diog'el P~2, benutzt wird, oder Sephadex G-10, oder sie wird einer Umkehrchromatografie mit einer Bondapack C-g-Säule ausgesetzt, wobei hochgradig reine Substanzen KA-*6643 und KA~6643^B anfallen«

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Wenn erforderlich, können sowohl die Substanz ΚΑ-6643-Ά als-auch die Substanz KA-6643-B auf herkömmliche Weise in deren Alkalimetallsalze umgewandelt v/erden, sowie auch in Erdalkalimetallsalze, primäre, sekundäre und tertiäre Aminsalze oder quartäre Ammoniumsalze»

Erfindungrgemäß hat die Substanz KA-6643 die folgenden physico-chemischen und biologischen Eigenschaften und zeigt antibakterielle Aktivität gegen grampositive und gramnegative Bakterien« Weiterhin zeigen solche Substanzen hervorragende antibakteriell Aktivitäten gegen Bakterien, die gegen verschiedene Arten von ß~Lactam-Anti~ biotika resistent sind und besitzen außerdem ß-Lactamase hemmende Wirkung,

I« Physico-chemische Eigenschaften

A) Hatriuin sal ζ der Substanz KA~6643-A

1« Aussehen: weißes Puder

2* Schmelzpunkt: schrittweise Zersetzung über 145 G 3o UV-Spektrums Wenn in wäßriger lösung bestimmt, ist das Spektrum im Prinzip das gle'iche wie in Fig«, 1 mit einer Maximalabsorption bei 240 nm und 288 nm und einer Minimalabsorption bei 265 nm,

• 4# IR-Spektrum: In KBr hat die Substanz im wesentlichen das gleiche Spektrum wie in Pig« 2 gezeigt,

5. Löslichkeit in Lösungsmitteln: leicht löslich in Wasser, aber im wesentlichen unlöslich·in Azeton, Chloroform, Ethylacetat und Petrolether«

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22 O^ 6 ⁸ - 13 -

_β iffiR-Sp e k t rum;

H HMR-Spektrum: Bei Bestimmimg in D_?0 ist das Spektrum im wesentlichen das gleiche vde in Fig_e 3„

7* Dümischichtchromatographie

• Rf ?/ertj 0,6 (Platte: TLC Aluminium-Biai;tZellulose ^254" ^j2 sam, Lösungsmittel: Butanol-isopropylalkohol-Wasser (7:7:6)

Rf Wert: 0,55 (Platte: TLC Äluminilum-Blattsilikagel .6OF₂J-^j 0j2 niEj Lösungsmittel: Isopropylalkohol-Wasser (7 : 1)

8«, Hochleistungs-Plüssigkeitschromatographie Eluierungszeit: 10_s5 min Säule : (o*»Bondapack Co 4 x 300 mm Lösungsmittel: Methanol«-0,01 M Phosphatpufferlösung (1 : 9), pH 6,8 St römungsge s chv/indigkeit: 1 ml/min

9# Molekulargev/icht:

364 (berechnet aus dem Y/ert, der aus der Massenspektrometrie des Monomethylesters erhalten wird)

10«, Molekularformel: C. .H^NgOgSNa (bestimmt aus der Formel des Methylesters, berechnet aus den Ergebnissen der Massenspektrometrie)

11„ Stabilität f

Die Halbwertszeit bei verschiedenen pH-Werten ist wie folgt:

⁶⁸ - -14

29« 10.· .1980 .AP C.12 D / 220 468 57 3.43 12

4,0	33
6,0	144
7,0	187
7,8	110
10,-0 i	2,8

pH KA-6643-A β ¹/2 (Stunden)/ MM-4550

5,5 18.

• 10,5

8,5 19

Lösungsmittel :

pH ;4,0 - 7,0: Mcllvanine's Pufferlösung

(Natrium Phosphat-Zitronensäure) pH 10,0? 0,1M Hatriumkarbonat-liatriumhydrogen·

karbonat-Pufferlösung

Messungen:

Ultraviolett"Absorptionsspektroskopie

* J_e Antibiot., ^2, 295 -304 (1979)

B) Monomethylester der Substanz KA-»6643~A

1_e Erscheinung: farbloser Peststoff 2c Molekulargewicht: 356 (Massenspektromotrie) 3, Elementaranalyse (C^H₂₀U₂OgS)

C H N S

berechnet (%) 50,55 5,66 7,86 9,00 gefunden {%) 50,38 5,45 7,59 8,60

4. Molekularformel: C₁₅H₂₀Ii₂OgS

5« Ultraviolettes Absorptionsspektrum:

Das Spektrum in Methanol hat eine maximale Absorption bei 243 μ und 3OO mn und eine minimale Absorption bei 274 nm.

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. APC 12 D / 220

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6ί Infrarot-Absorptionsspektrum

Wenn in KBr gemessen, hat die Substanz im wesentlichen ein Spektrum wie in Pig«» -4 gezeigte

7«. OTR-Spektrum

1

1) H Kernmagnet!sehe Resonanz:

Bei Messung in CDCl- unter Benutzung von Tetraiaetbyl« silan als innerer Standard ist das erhaltene Spektrum im wesentlichen das gleiche wie in Fig, 5«

13

2) C Kernmagnet!sehes Resonanzspektrum

Bei Messung in CDCl- unter Benutzung von Tetramethyl· silan als innerer Standard ist das erhaltene Spektrum im wesentlichen das gleiche wie in Pig. 6„

8_e DünnschichtChromatographie

Rf Wert; 0,44 (Platte: TIC Aluminiumschicht-Silicagel 60 Ppr/> 0,2 mm, Lösungsmittel: Methylenchlorid-Methanol (9 : 11)°

9_e Spezifische Drehung: [c<]²p - 96.0° (el, CH₂Cl₂)

C) Dinatriumsalz der Substanz KA~6643~B

Erscheinung: weißes Pulver

2« Schmelzpunkt: kein spezieller Punkt, über 130 ⁰C schrittweise Gelb- und Braunfärbung

3e Elementaranälyse

C H Έ S

32,5, 3,48 5,17 11,00 (%)

4· Ultraviolett-Absorptionsspektrum:

im v/esentlichen das gleiche wie in Pig# 7 mit maximalen Absorptionsbanden bei 240 nm und 285 nm und einer Minimalabsorptionsbande bei 265-nm

4 6 8

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5« Infrarot-Absorptionsspektrum:

Das IR-Spektrum der Substanz in ICBr Tabletten ist im wesentlichen das gleiche wie in Fig«, 8_C

6_e Kernmagnetisches Resonanzspektrum Bei Messung in D^O unter Benutzung von Tetramethylsilan als äußeren Standard ist das BMR«»Spektrum im wesentlichen das gleiche wie in Pig* 9·

7« löslichkeit in Lösungsmitteln;

leicht wasserlöslich, aber unlöslich in organischen lösungsmitteln wie z* B. Azeton, Chloroform, Ethylazetat, Petrolether Ucä*

8-. Spezifische Drehung: jöc] ²J - 145 ⁰C (el, H₂O)

9· Stabilität: Die Halbwertszeit bei verschiedenen pH-Werten ist wie folgt:

pH	tY2 (Std.)
4,0	21,8
6,0	210
7,0	170
7,8	• 130
10,0	7,9

Das lösungsmittel und die.Messungen sind die gleichen wie in der Substanz Κά.-6643-Α·

10« Dünnsclii cht Chromatographie: Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt*

A 6 8

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- 17

Tabelle 1	Lösungsmittel	Rf	Wert
Platte	Bütanol-Ethanol·»	0,	13
TLC Aluminium«	Wa s s e r (Ob e rs chi cht
schicht Kieserit	von 4:1 : 5)
Gel 60 P254
0,2 ram	Isopropanol-Wasser		85
	(7 : 3)
	Butanol-Essigsäure«	o,	16
Ii	Wasser (12 : 3 : 5)
	Butanol-Isopropanol»	o,	46
TLC Aluminium-	Wasser (7 : 7 : 6)
schicht Zellu
lose P254
0,1 mm

11s Papierchromatographie

Filterpapier: Toyo Pilter Paper ITo_β 51 Lösungsmittel j Azetonitr.il-Wasser (3 ι 2), aufsteigend, Rf Werts 0_s9

12« Hochleistungs-Plüssigkeitschromatographie Säule: /U~Bonapack C.g, 4 χ 300 mm Lösungsmittel: 0,1 M Phosphatpufferlösung, pH 6,8 Pließverhältnis; 1 ml/min Retentionszeit: 23»5 min

13« Hochspannungs-Papierelektrophorese Bei Benutzung einer'Hochspannungs-Papierelektrophorese-Einrichtung und Wanderung in einer 1/30 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) bei 3000 V für 30 min. bewegt

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22 04 6 8 57 343 12

sich die vorliegende Substanz in-Richtung.der Anode bis zu 8,5 cm_e

Penicillin N, das auf die ähnliche Weise getestet •wurdej bewegt sich bis zu 4>4 cm auf die Anode zu*

II«. Biologische Eigenschaften

1· Antibakterielles Spektrum

Die antibakteriellen Spektren gegen verschiedene Mikroorganismen sind in Tabelle 2 gezeigt-, im Vergleich mit denen des Aminobenzy!-»Penizillin (AB-Pc) und Cefoxitin (CPJ).

4,-

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Tabelle 2

TestQd bacterium	Minimale Heramkonzentration (/Ug/ml)	ΚΛ-6643-Β Dinatri« umsalz	AB-Pc	CPX
Staphylococcus aureus 209P JC-I	KA-6643rA Na-SaIz	6.25	0·Ό5	1.56
Staphylococcus epidermidis ,1228	0.39	6.25	0.78	1*56
Bacillus subtilis 6633	0e78	6,25	10.025	1.56
Sscherichia coil HIHJ JC-2	0.2	1.56	6.25	6.25
Klebsiella pneumoniae 602	0.05	6.25	12.5	0.78.
Serratia marcescens ML	0.2	6.25	50	12.5
Snterobacter cloacae 977	0.2	6.25	100	>100
Snterobacter aerogenes 972	0.78	3.13	6.25	>100
Hafnia alvei 978	0.1	6o25	50	6.25
Pseudomonas aeruginosa A«3	0.2	50	>100	>100
Pseudomonäs aeruginosa IO49O	6c25	25	100	>100
Pseudomonas putida 5121	6.25	100	>100	>100
Proteus vulgaris 874	1.56	12.5	>100	6.25
Proteus morganii 3168	0.39	12.5	>100	6.25
Proteus rettgeri 13501	0.39	50	0,2	1.56
Proteus inconstans Km115	1.56	..' 12.5	100	6.25
Sscherichia coli EC-*1 (Pease I)	0.78	3.13	>100	3.13
Bscherichia coli EC-59 (Pcase II)	0c2	1.56	>100	6.25
Bscherichia coli BC~68 (Pease IV) '"	0.05	3.13	>100	6.25
Cütrobacter 1(PC ase)	0e05	6.25	>ibo	>100
Citrobacter 24 (CS ase)	0.78 .	12.5	>100	>100
Klebsiella 25 (PC ase)	1.56	6.25	>100	6.25
Klebsiella 32 (CS ase)	0.78	12.5	>100	>100
3.13 •

29« 10. 1980 . AP C 12 D / 220 468 ' ... 57-343 12

. 22Ό4 8 8 · -.20 - .

Y/ie aus den vorhergehenden Ausführungen ersichtlich ist, zeigt die Substanz KA-6643 intensive antibakterielle Wirkung gegen gramnegative und grampositive Bakterien einschließlich derer, die gegen verschiedene Penizillien und Cephalosporin-Antibiotika resistent sind·

(2) "ß-Lactamase-Aktivität

(i) Antibakterielle aktivitätsverbessernde Tätigkeit gegen ß-laktam~resistente Bakterien

In den Penassay-Nährbpden (12 g davon wurden in 500 ml destiliertem Wasser aufgelöst) wurden Escheriehia coil (PC ase) und Citrobacter 24 (GS ase) eingeimpft, die ß-Iaktamase produzierende Organismen sind, und 100 ml des eingeimpften Mediums wurde in eine Petrischale -von 9 cm Durchmesser ge~ geben und als Testmedium verfestigt«

In dieses Nährmedium wurden Pulpescheiben von 8 mm Durchmesser eingebracht, in die 30 /Ug der wäßrigen Lösungen der Antibiotika eingeführt wurden, darauf folgt eine Kultur, die bei 37 ⁰C 18 Stunden stehen gelassen wird, und wo dann der Durchmesser der inhibierenden Zone um jede Scheibe herum gemessen wirds Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt.

Tabelle 3

Durchmesser der inhibierenden Zone

(mm)

Antibiotische Medium einschl. Medium einschl»

Zusammensetzung E* CoIi EC-1 Citrobacter 24

AB-Pc⁺ (1mg/ml)

KA-6643-A(1O /ml) 18,0 , 16,0

KA~6643~B(1O /ml) ~ ' -

AB-PcC1mg/ml> . ' ·

+KA~6643~A(1O /ml) 20,0. : 20,0

AB-PC91 mg/ml)+KA-

6643-B(IO /ml) 23,0 · 14,0

+ AB-Pc:.Aminobenzylpenicillin ·

29- 10. 1980

AP C 12 D / 220 468

^ ..... a ' ^{51 343 12}«.' &, M » «. 21 ·» _

(Ii) ß«Iactainase~inliibierende Aktivität

Bei der Verwendung von ß«=Laktamase~Snzympenizillinamdo~ hydrolase EC 3·5*2·6* aus Bakterien-, die zum Genus Bacillus gehören«, war der I₁-Q-Wert der Substanz KA~6643~A 0,5 ng/ml und der der Substanz KA.-6643-B 12,8 ng/ml_e Der If-Q"Wert wurde in Übereinstimmung mit dem Verfahren von C_e Reading und M* CoIe (Antiraicr* Agensen und Chemoth, 11 ,, 852 - 857» 1977) gemessen«,

Entsprechend kann erwartet werden", daß die Substanzen KA-6643"A und "KA~6643~"B ausgeprägte synergistische Effekte in Kombination mit anderen ß-Lactam-Antibiotika zeigen«,

Hinsichtlich der verschiedenen oben beschriebenen Eigenschaften sind die vorliegenden Substanzen als Antibiotika auf ß·» Lactambasis eingeordnet worden* Während es eine bekannte Substanz gibt j z* B_e MM 4550 (MC696~SY2~A), welche ein ähnliches Absorptionsspektrum wie die vorliegenden Substanzen hat, iat das bekannte Antibiotikum in folgender Hinsicht anders als die Substanzen KA«=6643~A und KA«6643'"B,

(1) Papierelektrophorese

Papierelektrophorese bei 3000 V für 25 min Lösungsmittel: 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 8,0) -KA«?6643~A: um 5 cm auf die Anodenseite zubewegt 4550: um 10,2 cm auf die Anodeneeite zubewegt

(2) Hochleistungs~Plüssigkeitschromatograp.hie

Säule: ß-Bondapack. C.g 4 x 30 cm

Lösungsmittel: 0,05 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) Durchflußgeschwindigkeit: 1 ml/min

- 22 ~ 27.10.81

AP G12D/220 57 343

Retentionszeit: KA-6643-A 1 Stunde

KA-6643-B 30 min '

MM 4550 17 min

Aus den obigen Ergebnissen geht hervor, daß die Substanz KA-6643 eine neue Verbindung ist, die sich von dem bekannten β-Iactarn-Antibiotikum unterscheidet,. Da die Substanz KA-6643 in Übereinstimmung mit der Erfindung eine Karboxyl- gruppe im Molekül hat, kann sie in Form der freien Säure eingesetzt werden, vorzugsweise aber in Form von Salzen. Geeignete Salze sind.z_o B₀ Salze von Alkali- oder Erdalkalimetallen wie z« B. Natrium, Kalium, Kalzium u« ä„ sowie Ammoniumsalze wie z_a B_Q Ammonium, Trimethylamin, Dimethylamin u_e ä«

Weiterhin können sie in Form niederer Alkylester wie. z« B. Methylester, Ethylester u„ ä„ oder höherer Fettsäureester eingesetzt werden_fl

In den in der Erfindung gehörenden Zeichnungen zeigen;

Figo 1: UV-Absorptionsspektrum des Ua-Salzes der Substanz KA-66.43-A; '" ·. .

IR-Absorptionsspektrum des EA-Salzes; 1 H-MR-Spektrum des gleichen Salzes; IR-Absorptionsspektrum des Methylesters der Substanz KA~6643-A;

1 H-MiR-Spektrum des Methylesters; 13 C-MiR-Sp ek tr um des gleichen Esters; UV-Absorptionsspektrum des Dinatriumsalzes der Substanz KA-6643-B; ;

5.3

4 ρ 8 - ^^a ™ 27c 10.81

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Pig,·8: IR~Absorptionsspektrum des Dinatriumsalzes; Pige'9: 1 H-HMR-Spektrum des gleichen Dinatriumsalzes*

Ausführungsbeispiel

Ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung kann durch Bezug auf die folgenden Formulierungen Lind experimentellen Ergebnisse erreicht werden, die zur Erläuterung dienen und nicht als Begrenzung' anzusehen sind₀

Beispiel 1

(i) Von 30 1 eines flüssigen Mediums mit einer Zusammensetzung von 3 % Stärke, 1,5 % von Sojabohnenmehl, 0,28 % Kaliumphosphat, monobasisch, 0,18 % ITatriumphosphat, dibasisches Dodecahydrat, 0,0005 % Kobaltchlorid~Hexahydrat, 0,05 % Magnesiumsulfat-Heptahydrat und 0,001 % Eisensulfat, das auf pH 6_f0 gebracht wurde, würden aliquote Teile von 100 ml dee Mediums in einen 500~ml~Erlenmeyerkolben eingegeben und

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sterilisiert* Mycelien des Stamms KC-6643 wurden in das Medium eingeimpft und in einer Schüttelkultur bei 27 ⁰O 4 Tage lang bei 200 U/min stehengelassen«,

(ii) Uac.h Fertigstellung der Kultur wurde Celite dem Nährboden als Filtrierhilfe zugesetzt, und das Mycel wurde durch Filtration entfernt. Das Piltrat (25 1) hatte eine Säule (6 χ 30 cm) eines stark anionischen Austauschharzes zu passieren, Diaion·PA316 (Gl" Typ)_} wonach ein Auswaschen mit Wasser erfolgte und eine Eluierung mit 0,01 M Phosphat-» pufferlösung (pH-Wert 7,0)_s wobei die Lösung 0;5 M Natriumchlorid enthielt, um eine aktive Fraktion zu erhalten. Die daraus resultierende aktive Fraktion hatte eine Säule (4 x 30 cm) Aktivkohle zu passieren, und nach dem Auswaschen mit Wasser wurde sie mit 50 V/V % wäßrigem Azeton behandelt, um die aktive Fraktion zu erhalten» Die erhaltene aktive Fraktion hatte eine Säule zu passieren (4 x 40 cm) eines basischen Anionaustauschharzes, Amberlit IRA-68 (Cl"" Typ), Nach dem Auswaschen mit Wasser und der Eluierung mit einer 0,01 M Phosphatpufferlösung (pH~Wert 7), wobei die Lösung 0,2 M Natriumchlorid enthielt, erhielt man die aktive Fraktion₀ Die so erhaltene aktive Fraktion -hatte eine Aktivkohle-Säule zu passieren (3 x 30 cm), die danach mit Wasser ausgewaschen wurde und dann mit 50 V/V % wäßrigem Azeton eluiert wurde, um wiederum die aktive Fraktion zu erhalten,

(iii) Die so erhaltene Fraktion hatte eine Säule eines stark basischen Anionenaustauschharzes (4 x 30 cm) zu passieren, Dowex 1 χ 2 (100 bis 200 mesh, Cl"" Typ), worauf eine Auswaschung mit Wasser folgte, um die Lösung einer Konzentrationsgradienteneluierung zu unterwerfen bei einer 'Strömungsgeschwindigkeit von 3 ml/min zwischen einer Lösung von 0,01 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7»0), wobei diese Lösung 0,1 M Natriumsalz enthielt und einer Lösung, die 0,4 M Natrium-

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chlorid "enthielt, wodurch die Fraktion in zwei oder mehrere Fraktionen aufgeteilt wurde· Dabei ist eine die anfänglich . eluierte Fraktion und die andere die nachfolgend eluierte Fraktion; beide Fraktionen wurden getrennt gesammelt«

(iv) Die so erhaltene anfänglich eluierte Fraktion (ungefähr 11) wurde unter reduziertem Druck bei einer Temperatur unter 30 ⁰G auf 100 ml konzentriert* Das Konzentrat hatte eine Säule von Diaion HP»20 zu passieren, welche zuvor mit einer 20-%-SaIzlösung gewaschen worden war, worauf eine Eluierung mit deionisiertem Wasser mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 4 ml/min folgt* Eine aktive Fraktion wurde erhalten und bei einer Temperatur unter 30 C-auf etwa 2 ml konzentriert, worauf eine Gefrietrocknung folgte, um 80 mg der Substanz 3iA°6643-A als rohes Pulver zu erhalten«

Beispiel 2

(i) Zu einem Medium mit einer Zusammensetzung von 2 % Stärke, 1,5 % Sojabohnenmehlj 0,28" % Kaliumphosphat, monobasisch, 0,18 % Eatriumphosphat, dibasisches Dodecahydrat, 0,0005 % Kobaltchloridhexahydrat und 0,001 % Bisensulfat, das auf einen pH-Wert von 6,0 gebracht und sterilisiert worden war, wurden Mycel des Stammes KC-6643 aufgeimpft, worauf eine Vorkultur bei 27 ⁰C für ungefährt 48 Stunden folgte, um ein erstes Mahrmedium herzustellen» In jeden der beiden Tanks mit einem Volumen von 200· 1 wurden 100 1 des Mediums gegeben mit derse3.ben Zusammensetzung wie oben, aber mit einem Zusatz von 1 % Baumwollsaatöl. Die erste Nährkultur wurde in jeden Tank mit einer Menge von 500 ml beimpft und bei einer' Temperatur von 30 C mittels eines belüfteten 'Rührsystems (300 U/min, Strömungsgeschwindigkeit der luft 50 l/min) 4 Tage lang ge~ -züchtet«, '

- 26 - 27.10.81

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(ii) Nach Vervollkommnung der Kultur wurde dem Nährboden (170 1) ein 10 V/V % Dicalite- Perlite 4109 als Filtrierhilfe zugesetzt, und das Myeel wurde durch Filtration entfernt.

Das resultierende Filtrat (150 1) wurde mit einer Leitfähigkeit bis zu 1,5 m /cm versehen und hatte eine Säule (21,5 x 45 cm) eines stark basischen Anionenaustauschharzes zu passieren, Diaion PA31-6 (Cl~-Typ) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 200 ml/min, lach dem Waschen mit einer 0,01 M Phosphatpufferlösung (pH 7>0) wurde das Harz -mit einer . 2 Vol./Volo%-Methanol-0,01 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0), die 2 M Natriumchlorid enthielt mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 150 ml/min eluiert, um die aktive Fraktion zu erhalten».Die so erhaltene aktive Fraktion wurde mit 400 ml/ min über eine Säule (1β χ 10 cm) aus Diaion HP-20 geschickt, die mit einer 10 Gew,/Vol.-%igen Natriumchloridlösung eingestellt worden war. Nach dem Waschen mit einer 10 Gew.-/VoI,-%igen Natriumchloridlösung wurde mit deionisiertem Wasser. bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 200 ml/min eluiert, um die aktive Fraktion zu erhaltene

(iii) Die so erhaltene aktive Fraktion wurde mit 50 ml/min über eine Säule (6 χ 70 cm) eines stark basischen Anionenaustauschharzes Amberlit IRA-458 (Gl~-Typ) geschickt und mit einer 0,01 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0), die 0,15 M Natriumchlorid enthielt, eluierto Danach wurde die verbliebene aktive Fraktion mit einer 0,01"M Phosphatpufferlösung (pH 7,0), die 2 M Natriumchlorid enthielt, eluiert,

Xiv) Die anfänglich im Schritt (iii) erhaltene eluierte Fraktion wurde der gleichen' Behandlung ausgesetzt, die im Schritt (iv) des Beispiels 1 beschrieben wurde·, wobei 700 mg rohes Pulver der Substanz KA-6643-A erhalten wurden.

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(Y) Die nachfolgend eluierte aktive Fraktion hatte eine Säule (6 χ 70 cm) von Diaion HF-20 zu passieren» das vorher mit einer 20 Gew. «=/Vol, ~%igen wäßrigen Hatriumchloridlösung be-~ handelt wurde und dann -mit de ionisiert era Wasser bei einer' Strömungsgeschwindigkeit von 20 ml/rain eluiert wurde, um die aktive Fraktion zu erhaltene Die so erhaltene aktive Fraktion wurde mit deionisiertem V/asser verdünnt, um eine Leitfähigkeit von ungefähr 700 -uiZ/cm zu erhalten und dann über eine Säule (3 x 30 cm), eines schwach basischen Anionenaustauschharzes, DEAE-Sephadex A-25» geschickte Die lösung-wurde.auf einen pH-Wert von 7 gebracht, indem man eine 0,01 m !Phosphatpufferlösung benutzte«. Anschließend wurde mit Wasser gewaschen und mit einer Phosphatpufferlösung (pH 7,0),-die 0,15 M Natriumchlorid enthielt, bei einer Strömungsgeschwindigkeit von ' 35 ml/min eluiert, um die aktive Fraktion zu erhalten»

Das so erhaltene Eluat wurde unter reduziertem Druck bei weniger als 30 C konzentriert, über eine Säule (3»5 χ 40 cm) von Diaion HP~>20 geschickt, die vorher mit 10 Gew»/Vol«-%iger wäßriger liatriumchloridlösung behandelt worden war und dann mit deionisiertem Wässer bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 ml/min eluiert wurde, um die aktive Fraktion zu er-» halten«, Die aktive Fraktion wurde unter reduziertem Druck auf ungefähr 2 ml konzentriert und dann gefriergetrocknet, um 190 mg pulverförmige Substanz KA~6643-B zu erhalten«. Das so erhaltene Pulver wurde in 1 ml deionisiertem Wasser aufgelöst und dann "über eine Säule (2 χ 30 cm) von Diaion HP~20 geschickt und mit deionisiertem V/asser eluiert bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min, um die aktive Fraktion zu erhalten» Die so erhaltene aktive Fraktion wurde unter reduziertem Druck konzentriert und durch eine Säule von Sephadex G-10 passieren gelassen, gefolgt von einer Behandlung mit deionisiertem Wasser bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,2 ml/min. Die aktive Fraktion wurde erhalten, und

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unter vermindertem Druck auf ungefähr 2 ml konzentriert und dann gefriergetrocknet, um 80 mg pulverförmiges Rohprodukt zu erhalten. . ·

(vi) 80 mg des so erhaltenen Pulvers .wurden in 0,1 ml einer 0,1 M Phosphatpufferlösung gelöst (pH 6,8) und über eine Säule (0,8 χ 20 cm) Bondapack CLg/Polasil B geschickt, die mit einer 0,1 M Phosphatpufferlösung vorbehandelt worden war, gefolgt von einer Eluierung mit der gleichen Pufferlösung bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 6 ml/min, um die aktive Fraktion zu erhalten« Die aktive Fraktion wurde über eine Aktivkohle-Säule (0,9 χ 5 cm) geschickt, mit deionisiertem Wasser ge?/aschen und dann mit 50 Gew«/Vol.~%igem wasserhaltigem Azeton eluiert, um die aktive fraktion zu erhalten· Die aktive Fraktion wurde unter reduziertem Druck auf ungefähr 1 ml konzentriert und dann gefriergetrocknet, . um 35 mg gereinigtes, pulverförmiges KA~6643'~B zu erhalten..

Beispiel 3 ·

120 mg des in Beispiel 1 (iv) oder Beispiel 2 (iv) erhaltenen Pulvers wurde in 1 ml deionisiertein Wasser gelöst und dann über eine Säule (0,8 χ 60 cm) Bondapack C₁₈ / Polasil B zur Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie geschickt«, Danach wurde mit einer 0,01 M Phosphatpufferlösung mit pH 6,8, die 2 % Methanol enthielt, mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 6 ml/min eluiert, um die aktive¹ Fraktion zu erhalten. Die so erhaltene aktive Fraktion wurde unter reduziertem Druck auf 5 ml konzentriert.und über eine Säule (2 χ 15 cm) von Diaion HP-20 geschickt, die mit einer Salzlösung gewaschen worden war, gefolgt von einer Eluierung mit deionisier~ tem Wasser bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min,

29· 10. 1980 AP C 12 D / 220 468 _ag 57 343 12

' M 0 4 'S 8 - 28 -

um die aktive Fraktion zu erhalten*

Die Fraktion wurde auf 1 ml konzentriert und dann über eine Säule (3 x 150 cm) von Sephadez 6-10 geschickt und mit deionisiertem Wasser bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert* Danach wurde die resultierende aktive Fraktion unter reduziertere. Druck auf 2 ml konzentriert_s um 4 mg des gereinigten Produkts des latriumsalzes KA.~6643»A zu erhalten*

Claims (2)

1_β Verfahren zur Herstellung einer.antibiotisGhen Substanz der Formel ·

CH,

CH.

OR

-ch^chmcoch.

COOH

v/orin R Y/asserstoff oder -SO Ji ist, und deren Salze, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Substanz KA-6643 züch tet, die einen zur Art Streptomyces gehörenden Mikroorga nismus produziert und die antibiotische Substanz von der Kulturbrühe abtrennt,

.2« Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß R Wasserstoff ist« .

Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß R -SO₃H ist,

Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die antibiotische Substanz und deren Salze ein UV-Absorptionsspektrum, ein Infrarot-Absorptionsspektrum und ein KLiR-Spektrum entsprechend den Pig* 1 bis 9 aufweisen,.