NL8002210A - Antibioticum en werkwijze ter bereiding ervan. - Google Patents
Antibioticum en werkwijze ter bereiding ervan. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8002210A NL8002210A NL8002210A NL8002210A NL8002210A NL 8002210 A NL8002210 A NL 8002210A NL 8002210 A NL8002210 A NL 8002210A NL 8002210 A NL8002210 A NL 8002210A NL 8002210 A NL8002210 A NL 8002210A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- antibiotic
- substance
- streptomyces
- formula
- strain
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D477/00—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring
- C07D477/10—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2
- C07D477/12—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, attached in position 6
- C07D477/16—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, attached in position 6 with hetero atoms or carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 3
- C07D477/20—Sulfur atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
- C12P17/184—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system containing a beta-lactam ring, e.g. thienamycin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
s i
Antibioticum en werkwijze ter bereiding ervan.
De uitvinding heeft betrekking op een nieuw antibioticum en een werkwijze ter bereiding ervan.
Er werden verschillende stammen van grondmicro-organismen geïsoleerd om hun produktiviteit van antibiotica te 5 onderzoeken. Gevonden werd toen dat een nieuw geïsoleerde stam KC-6643 in staat is twee variëteiten van een nieuw antibioticum te produceren met uitstekende antibacteriele eigenschappen tegen gram-positieve en gram-negatieve bacteriën, en men is er in geslaagd een dergelijk antibioticum te isoleren uit de cultuur-10 vloeistof.
Deze twee variëteiten van het antibioticum volgens de uitvinding zijn nauw verwant in structuur met elkaar. Uit hun fysico-chemische eigenschappen en biologische eigenschappen die hierna zullen worden beschreven, blijkt dat het antibioticum 15 een nieuwe stof is, die verschilt van elk van de bekende antibiotica.
De uitvinding heeft betrekking op een antibioticum, dat geproduceerd wordt door stammen behorend tot Strepto-myces, welk antibioticum wordt voorgesteld door de formule 1 op het 20 formuleblad, waarin R een waterstofatoom of -SO^H voorstelt.
In deze beschrijving wordt het mengsel van de bovengenoemde twee variëteiten van het nieuwe antibioticum aangeduid als de stof KA-6643. Een van deze variëteiten (waarin R in formule 1 een waterstofatoom is) wordt verder aangeduid als de 25 stof KA-6643-A en de andere (waarin R in de formule 1 is -SO^H) als de stof KA-6643-B.
Andere doeleinden, kenmerken en voordelen van de 8002210 2 uitvinding zullen duidelijk worden uit de volgende beschrijving van bepaalde voorkeursuitvoeringsvormen ervan, in samenhang met bijgaande tekeningen, hoewel variëteiten en modificaties kunnen worden bewerkstelligd zonder van de geest en het kader van de 5 uitvinding a£ te wijken, en waarin figuur 1 een ultraviolet absorptiespectrum is van een natriumzout van de stof KA-6643-A, figuur 2 een infrarood absorptiespectrum van het natriumzout, 10 figuur 3 een kernmagnetisch resonantiespectrum van hetzelfde zout, figuur 4 een infrarood absorptiespectrum van een methylester van de verbinding KA-6643-A, figuur 5 een kernmagnetisch resoüantiespectrum 15 van de methylester, 13 figuur 6 een C kernmagnetisch resonantiespectrum van dezelfde ester, figuur 7 een ultraviolet absorptiespectrum van een dinatriumzout van de verbinding KA-6643-B, 20 figuur 8 een infrarood absorptiespectrum van het dinatriumzout, en figuur 9 een kernmagnetisch resonantiespectrum van hetzelfde dinatriumzout.
Het stof KA-6643 producerende organisme volgens 25 de uitvinding heeft de volgende taxonomische eigenschappen. Opgemerkt kan worden dat het morfologische kenmerk in verschillende ISP media is waargenomen bij kweken bij 27°C gedurende 21 dagen op de gebruikelijke methodes en dat de kleur van de rijpe cultuur is volgens de klassificatie van de Color Harmony Manual (Container 30 Corporation of America), tenzij anders aangegeven.
1. Morfologische eigenschappen.
De stam van de stof KA-6643 stelt in staat tot de vorming van een luchtmycelium in verschillende media, welke enkelvoudig vertakt is. De sporofore wordt geproduceerd op het 35 luchtmycelium, waardoor de rechte sporeketens worden geproduceerd. Elke spore heeft een afmeting van 0,4-0,5 x 0,9-l,0^u en heeft een 8002210 3 * i ovale tot cilindrische vorm en vormt een keten van 20 of meer sporen, waarvan het oppervlak glad is. De sporeketens zijn vaak versmolten tot een sclerotium-achtige structuur, en de fragmentatie van het substraatmycelium wordt waargenomen in sommige 5 media die men gebruikt voor de taxonomische studies.
II. Cultuureigenschappen in verschillende media.
(1) Sucrose-nitraat agar
Groei: Goed, spreidt zich vlak uit, kleurloos, bruingeel (2fb) luchtmycelium: matig, poeder-10 achtig, wit (a) oplosbaar pigment: geen (2) Glucose-asparagine agar
Groei: matig, vlak en boterachtig, room (Igca) - pastel geel (2hb) 15 Luchtmycelium: geen
Oplosbaar pigment: geen (3) Glycerine-Asparagine agar
Groei: Goed, wratachtig, rimpelig, bruingeel (2fg) -bamboe (2gc) 20 Luchtmycelium: Goed, poederachtig, parel (3ba)
Oplosbaar pigment: geen (4) Zetmeel-anorganisch zout agar
Groei: Goed, rimpelig, boterachtig, blboe (2gc) -honing goud (2ic) 25 Luchtmycelium: Goed, poederachtig, wit (a) - parel (3ba)
Oplosbaar pigment: geen (5) Tyrosine-agar
Groei: Goed, aanzienlijk wratachtig, rimpelig, 30 gelatineus kaneel (3£e)
Luchtmycelium: Goed, poederachtig, parel (3ba)
Oplosbaar pigment: geen (6) Voedings-agar
Groei: middelmatig, enigszins wratachtig, rimpe-35 lig, gelatineus, kleurloos-lichtgeel (l|ea)
Luchtmycelium: geen 8002210 4
Oplosbaar pigment: geen (7) Gistextract-moutextract-agar
Groei: overvloedig, rimpelig, boterachtig -gelatineus mosterd (2£e) 5 Luchtmycelium: Goed, poederachtig, wit (a) - parel (3ba)
Oplosbaar pigment: geen (8) Havermeelagar
Groei: matig, vlak gespreid, room (l|ca) - 10 botergeel (l|ga)
Luchtmycelium: matig, poederachtig, wit (a)
Oplosbaar pigment: geen (9) Pepton-gist-ijzer-agar
Groei: Goed, aanzienlijk wratachtig, rimpelig, 15 boterachtig, licht geel (l|ea)
Luchtmycelium: geen Oplosbaar pigment: geen III. Fysiologische eigenschappen ---------------(-l·)—Groei*-temperatuur-tra j eet: 3 - 35°C ------------
20 (2) Optimum groei-temperatuurtraject: 27 - 33°C
(3) Vervloeiing van gelatine: positief (4) Hydrolyse van zetmeel: positief (5) Coagulering van taptemelk: negatief Peptisering van taptemelk: positief 25 (6) Formering van melanoide pigment: negatief IV. Benutting van koolstofbronnen.
De benutting van koolstofbronnen in het agarmedium volgens Pridham en Gottlieb werd onderzocht met de volgende resultaten: 30 Gebruikte koolstofbronnen: L-arabinose, D-xylose, D-glucose, D-furactose, inositol en L-rhamnose
Niet-g-ebruikte koolstofbronnen: sucrose, raffinose en D-mannitol.
35 V. De onderhavige stam bevat LL-diaminopimelinezuur in celwanden.
Met het oog op de voorgaande eigenschappen meent 8002210 jt f 5 men dat de stam KC-6643 behoort tot het genus Streptomyces, maar toont karakteristieke eigenschappen zoals fragmentatie van het substraatmyeelium, versmelting van de sporeketens en dergelijke, die enigszins verschillen van die van de typische mycelia van het 5 genus Streptomyces.
Het is echter wijdverbreid bekend dat de stammen, geklassificeerd als behorend tot het genus Streptomyces, vaak dergelijke specifieke structuren aannemen als bijvoorbeeld van fragmentatie van hyphen in het medium en abnormaliteit in de spore-10 ketens, en daarom meent men dat het juist is de stam KC-6643 te klassificeren als behorend tot het genus Streptomyces.
Wanneer stammen van de aard, waarbij de spore-keten recht is, het sporenoppervlak glad, het luchtmycelium wit van kleur, de achterkant van de kolonie geen karakteristieke tint 15 vertoont, en zij niet enig oplosbaar of melanoïd pigment produceren worden uitgezocht uit de bekende stammen aangegeven in "Bergy’s Manual Of Determinative Bacteriology", 8 Editie, ISP van Shirling en Gottlieb, en "The Actinomycetes" door S.A. Waksman, 2, (1961), kunnen er zeven mogelijke stammen genoemd worden, waar-20 onder Streptomyces albovinaceus (ISP 5136), Streptomyces aureocircuratus (ISP 5386), Streptomyces baarnensis (ISP 5232), Streptomyces chrysomallus (ISP 5128), Streptomyces Candidas (ISP 5141), Streptomyces gougeroti (ISP 5324) en Streptomyces griseoloalbus (ISP 5468).
25 De Streptomyces albovinaceous (ISP 5136) verschilt van de stam KC-6643, doordat zij slecht groeit in een sucrose-nitraatagarmedium en bij 5°C in verschillende media, en in vloei-baarmaking van gelatine en verder in vermogen om koolstofbronnen te benutten (dat wil zeggen zij gebruikt D-mannitol en geen inosi-30 tol). De Streptomyces aureocirculatus (ISP 5386) verschilt van de stam KC-6643, doordat zij slecht haar luchtmycelium vormt en groeit bij 37°C maar slecht bij 5°C en dat zij slechts zwak zetmeel hydrolyseert en verschillende graden vertoont van vermogen om koolstofbronnen te benutten (dat wil zeggen zij benut D-mannitol 35 niet L-rhamnose). De Streptomyces Candidas (ISP 5141) verschilt van de stam KC-6643, doordat zij slecht groeit in een sucrose- 8002210 6 nitraatagarmedium en nauwelijks bij 5°C en ook in de benutting van koolstofbronnen (dat wil zeggen zij benut D-mannitol niet inositol). De Streptony ces gougeroti (ISP 5324) verschilt van de stam van KC-6643 doordat zij slecht groeit in een sucrose-nitraatagarme-5 dium en in het vormen van het luchtmycelium ervan en in de vervloeiing van de gelatine, peptonisering van taptemelk en benutting van koolstofbronnen (dat wil zeggen zij benutten L-mannitol niet inositol noch L-rhamnose). De Streptomyces griseoloalbus (ISP 5468) verschilt van de stam KC-6643, doordat zij groeit bij 10 37°C maar niet bij 5°C en ook in de vervloeiing van gelatine, de benutting van koolstofbronnen (dat wil zeggen zij benut D-mannitol) en de enigszins geelachtige tint van luchtmycelium. De Streptomyces baarnensis (ISP 5232) is betrekkelijk gelijk in aard aan de cultuur van de stam KC-6643 maar verschilt ervan doordat zij 15 slecht groeit bij 5°C en een bruin oplosbaar pigment produceert in een gelatinemedium, en ook slecht koolstofbronnen benut (dat wil zeggen zij benut D-mannitol niet inositol). De Streptomyces chrysomallus (ISP 5128)is erg gelijk in culturele eigenschappen aan de stam KC-6643 maar groeit niet bij 5°C of in een taptemelk-20 medium. Verder verschilt zij van de stam KC-6643 in de produktie van een geel oplosbaar pigment in verscheidene media en het vermogen om koolstofbronnen te benutten (dat wil zeggen zij benut D-mannitol niet inositol).
Als een stam die in staat is een produkt te 25 produceren gelijk aan het metaboliet van de stam KC-6643, zijn er 32 stammen bekend, behorend tot 11 species, waaronder Streptomyces cattleya, Streptomyces flavogriseus, Streptomyces olivaseus, Streptomyces flavovirence, Streptomyces flaves, Streptomyces flavoviridis, Streptomyces algenteolus, Streptomyces shioyaensis, 30 Streptomyces lipmanii, Streptomyces cremeus en Streptomyces gedanensis. Geen van deze bekende stammen hebben echter een zodanige aard, dat het luchtmycelium wit van kleur is en dat inositol en niet D-mannitol wordt gebruikt.
Uit de bovengenoemde resultaten heeft men de 35 conclusie getrokken dat de stam KC-6643 een nieuwe stam is, die behoort tot het genus Streptomyces en die wordt aangeduid als 8002210 * t 7
Streptomyces sp. KC-6643. Deze stam is gedeponeerd bij het Fermentation Research Institute van de Agency of Industrial Science & Technology te No. 1 - 3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaragi-ken, Japan, op April 7, 1978, en heeft daar 5 het nummer FERM-P 4467 gekregen. De stam is ook gedeponeerd bij de American Type Culture Collection te 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland, Ver.St.v. Amerika, op March 12, 1979, en heeft daar het nummer ATCC 31493 gekregen.
De uitvinding strekt zich niet alleen tot de 10 stam KC-6643 uit, maar ook tot de spontane en kunstmatige mutanten ervan.
Het cultiveren van de onderhavige stam kan geschieden op elke gewone wijze van cultiveren van actinomyceten.
Als koolstofbron voor het medium kan men een aantal bronnen ge-15 bruiken. Bij voorkeur gebruikt men zetmeelglycerol, maltose, dextrine, fructose, melasses en dergelijke enkelvoudig of in combinatie. Men kan ook gebruikmaken van koolwaterstoffen, organische zuren, plantaardige oliën en dergelijke. Stikstofbronnen ——------ zijn onder andere sojameel, gistextracten,_droge, gisten, pepton, 20 vleesextracten, maisweekvloeistoffen,casaminozuur, de oplosbare rest uit de destilleerderij, ammoniumchloride, ammoniumsulfaat, ureum, natriumnitraat en dergelijke. Deze bronnen worden afzonderlijk of in combinatie gebruikt. Zo nodig kan men anorganische zouten zoals natriumchloride, kaliumfosfaat, natriumfosfaat, 25 magnesiumsulfaat, calciumchloride, calciumcarbonaat, calcium- hydroxyde, cobaltchloride, zinksulfaat, ijzerchloride, ijzer-sulfaat en dergelijke en sporen van zware metalen toevoegen. Verder kan men geschikt organische en anorganische stoffen, die zullen bijdragen tot de groei van het mycelium van de stof KA-30 6643 en eventueel de produktie ervan vergemakkelijken, toevoegen.
Wanneer een geaëreerde cultuurmethode wordt gebruikt, verdient het de voorkeur verder een antischuimmiddel toe te voegen zoals een vetzuurolie, siliconolie of paraffine.
Hoewel cultuur van de stam in een vast medium 35 mogelijk is, gebruikt men bij voorkeur een vloeistofcultuur, in het bijzonder een ondergedompelde cultuur, zoals in het geval 8002210 8 waarbij gewone antibiotica worden geproduceerd. Een dergelijke cultuur wordt gehouden onder aërobe omstandigheden bij temperaturen van 3-35°C, bij voorkeur 27-33°C.
Het antibioticum KA-6643 kan worden geproduceerd 5 volgens hetzij een schudcultuur of een tankcultuur. Wanneer een dergelijke cultuur wordt voortgezet gedurende 2-10 dagen, verzamelt zich een actieve stof in de cultuurvloeistof. Men stopt de cultuur wanneer de hoeveelheid van het produkt in de cultuurvloeistof een maximum heeft bereikt.
10 Om de stof KA-6643 uit de aldus verkregen cul tuurvloeistof te isoleren en de geïsoleerde stof te zuiveren, kan men verschillende bekende methodes gebruiken die gebruikelijk zijn voor dergelijke doeleinden.
Men kan bijvoorbeeld de cultuurvloeistof eerst 15 centrifugeren of filtreren om het mycelium er uit te verwijderen, en het filtraat te onderwerpen aan welke arbitraire combinatie dan ook van de volgende behandelingen. Dat wil zeggen men voert het filtraat door een basische anionuitwisselingshars om het be-- oogde produkt te laten absorberen door de hars en het beoogde _ 20 produkt wordt verkregen door elutie met een zoutoplossing of een waterige methanolische oplossing van het zout. Voorbeelden van dergelijke ionuitwisselingshars zijn onder andere sterke basische anionuitwisselingsharsen zoals Dowex 1 x 2 (The Dow Chemical Co.), Diaion PA-318, 316, 306S, 308 en 312 (Mitsubishi Chem. Ind., 25 Ltd.), Amberlite IRA-400, 401 en 410 (Rohm & Haas Co.) en dergelijke, en zwakbasische anionuitwisselingsharsen zoals Amberlite IRA-68. Anderzijds kan men het cultuurfiltraat onderwerpen aan adsorptie met een adsorptiemiddel zoals actieve kool en het beoogde produkt verkrijgen door elutie met waterige methanol, wa-30 terige aceton en dergelijke.
Daarna voert men de actieve fractie, die de stof KA-6643 bevat, door een sterk basische anionuitwisselingshars, '* zoals bijvoorbeeld Dowex 1 x 2 om de stof KA-6643 te absorberen waarna men de stof trapsgewijze elueert, terwijl men geleidelijk 35 een zoutconcentratie in een fosfaatbufferoplossing verandert. Bij deze elutiebewerking elueert men de stof KA-6643-A bij een begin- 8002210 9 fase, waarna men de stof KA-6643-B elueert, zodat de stof KA-6643-A gescheiden is van de stof KA-6643-B. Anderzijds kan men de actieve fractie voeren door een kolom, die gepakt is met een matig polair of niet-polair hydrofoob verknoopt polymeer, zoals bijvoor-5 beeld Amberlite XAD-2 of Diaion HP-20 om de stof KA-6643-A te scheiden van de stof KA-6643-B door verschil in adsorptiviteit ertussen.
De aldus verkregen stof KA-6643-A en stof KA-6643-B worden verder onderworpen aan gelfiltratie onder toepassing van 10 een gel, zoals Biogel P-2 (BIO.RAD Lab.) of Sephadex G-10 (Pharmacia Fine Chemicals) of onderworpen aan omkeerfase-chroma-tografie onder toepassing van een kolom, die gepakt is met Bondapack Cjg (Waters Associates, Ine.), waardoor zeer zuivere KA-6643-A en KA-6643-B worden verkregen.
15 Desgewenst kan men zowel de stof KA-6643-A als de stof KA-6643-B omzetten op elke gebruikelijke wijze in alkali-zouten, aardalkalizouten, primaire, secundaire of tertiaire amines of kwaternaire ammoniumzouten.
De stof KA-6643 volgens de uitvinding heeft de 20 volgende fysio-chemische eigenschappen en biologische eigenschap pen en vertoont antibacteriële activiteit tegen gram-positieve en gram-negatieve bacteriën. Verder vertoont deze stof een uitstekende antibacteriële activiteit tegen bacteriën, die resistent zijn tegenover verschillende types van β-lactam-antibiotica en 25 heeft β-lactamase-inhibitoire activiteit.
I. Fysico-chemische eigenschappen.
(A) Natriumzout van de stof KA-6643-A
(1) Uiterlijk: wit poeder (2) Smeltpunt: geleidelijke ontleding boven 145°C.
30 (3) Ultraviolet-absorptiespectrum: indien gemeten in een wa terige oplossing, is het spectrum nagenoeg hetzelfde als getoond in figuur 1 met maximum absorptie bij 240 en 288 nm en minimum absorptie bij 265 nm.
(4) Infraroodabsorptiespectrum: indien opgenomen in KBr heeft 35 de stof nagenoeg hetzelfde spectrum als getoond in figuur 2.
8002210 10 (5) Oplosbaarheid in oplosmiddel: Gemakkelijk oplosbaar in water maar nagenoeg onoplosbaar in aceton, chloroform, ethylacetaat en petroleumether.
(6) Kernmagnetisch resonantiespectrum. *H kernmagnetisch 5 resonantiespectrum: bij meting in D2O is het spectrum nagenoeg hetzelfde als getoond in figuur 3.
(7) Dunnelaagchromatografie.
R^-waarde: 0,6 /plaat: TLC aluminium vel cellulose *254’ nm ^erc^ ^ ^°·» Ine.)» oplosmiddel: butanol-10 isopropylalkohol-water (7:7:6)_7 R^-waarde: 0,55 / plaat: TLC aluminium vel siliciumoxyde gel 60F22^s 0,2 mm (Merck & Co., Ine.), oplosmiddel: isopropylalkohol-water (7:1)_/ (8) Snelle vloeistofchromatografie 15 Elutieduur 10,5 minuten
Kolom: μ-Bondapack Cjg (Waters Associates, Ine.), 4 x 300 mm
Oplosmiddel: methanol - 0,01 M fosfaatbufferoplossing (1:9), pH 6,8 20 Stroomsnelheid: 1 ml/min.
(9) Molecuulgewicht: 364 (berekend uit de waarde verkregen door massaspectrometrie van de monomethylester) (10) Moleculair formule: Cj^Hjy^OgSNa (bepaald uit de moleculaire formule van de methylester berekend uit de re- 25 sultaten van de massaspectrometrie).
(11) Stabiliteit: de halfwaardetijd bij verschillende pH- waarden zijn als volgt: _pH KA-6643-A /~tj(u) 7 MM-4550* 30 4,0 33 5,5 6.0 144 18 7.0 187 10,5 7,8 110 8,5 10,0 2,8 19 35 Oplosmiddel: pH 4,0-7,0: Mcllvanine's bufferoplossing (natriumfosfaat-citroen- 8002210 * ί
II
zuur) pH 10,0: 0,1 M natriumcarbonaat-natriumhydrogeencarbonaat buffer-oplossing.
Meting: 5 Ultravioletabsorptiespectroscopie s J. Antibiot., 32, 295 - 304 (1979)
(B)Monomethytester van de stof KA-6643-A
(1) Uiterlijk: Kleurloze vaste stof (2) Molecuulgewicht: 356 (massaspectrometrie) 10 (3) Elementair-analyse (als C^^Q^OgS)
C Η N S
Berekend (%) 50,55 5,66 7,87 9,00
Gevonden (Z) 50,38 5,45 7,59 8,60 (4) Moleculair formule: ^55^20^2^6^ 15 (5) Ultravioletabsorptiespectrum: het spectrum in methanol heeft een maximum absorptie bij 243 nm en 300 nm en een minimum absorptie bij 274 nm.
(6) Infraroodabsorptiespectrum
Indien opgenomen in de KBr,heeftde stof nagenoeg het 20 spectrum zoals getoond in figuur 4.
(7) Kernmagnetisch resonantiespectrum 1) kernmagnetisde resonantie: bij meting in CDClg onder toepassing van tetramethylsilan als een interne standaard, is het verkregen spectrum nagenoeg ge- 25 lijk aan dat van figuur 5.
13 2) C kernmagnetisch resonantiespectrum. Bij meting in CDClg onder toepassing van tetramethylsilan als een interne standaard, is het verkregen spectrum nagenoeg gelijk aan dat van figuur 6.
30 (8) Dunnelaagchromatografie R^-waarde: 0,44 / plaat: TLC aluminium vel silica gel 60 0,2 mm, (Merck & Co., Ine.), oplosmiddel: methyleenchloride-methanol (9:11)_/ (9) Specifieke rotatie: / a/^ - 96,0 (cl, CH9C12)
35 (C) Dinatriumzout van de stof KA-6643-B
(1) üiterlijk: wit poeder 800 2 2 1 0 12 (2) Smeltpunt: geen bepaald punt aangegeven maar wordt geleidelijk geel tot bruin boven ongeveer 130°C.
(3) Elementair-analyse:
_C_ _H_ JL JL
5 32,5 3,48 5,17 11,00 (Z) (4) Ultravioletabsorptiespectrum: nagenoeg hetzelfde als getoond in figuur 7 en met maximum absorptiebanden bij 240 en 285 nm en een minimum absorptieband bij 265 nm.
(5) Infraroodabsorptiespectrum: het infraroodabsorptiespectrum 10 van de stof opgenomen in KBr tabletten is nagenoeg het zelfde als getoond in figuur 8.
(6) Kernmagnetischresonantiespectrum.
Bij meting in D^O onder toepassing van tetramethyl-silan als een uitwendige standaard, is het kernmagnetisch 15 resonantiespectrum nagenoeg dat zoals getoond in figuur 9.
(7) Oplosbaarheid in oplosmiddel: gemakkelijk oplosbaar in water maar nagenoeg onoplosbaar in organische oplosmiddelen zoals aceton, chloroform, ethylacetaat, petroleum-ether en dergelijke.
20 (8) Specifiek rotatievermogen: / a_7^ “ 145° (cl, ï^O) (9) Stabiliteit: De halfwaardetijd bij verschillende waarden van de pH zijn als volgt: PH tj (u) 4.0 21,8 25 6,0 210 7.0 170 7,8 130 10,0 7,9
Het oplosmiddel en de metingen zijn dezelfde 30 als van destof KA-6643-A.
(10) Dunnelaagchromatografie: de resultaten zijn getoond in de volgende tabel A.
800 2 2 1 0 é r 13
Tabel A
Plaat _Oplosmiddel _Rf-waarde_ TLC aluminium plaat Butanol-ethanol- 0,13 kieserite gel water 5 60F9i., (bovenlaag van 4:1:5) 0,2 mm (Merck & Co.,Ine.)__ " Isopropanol-water 0,85 _Ol3)_ 10 " Butanol-azijnzuur 0,16 water _(12:3:5)_ TLG aluminium plaat Butanol-isopropanol- 0,46 cellulose F__, water 15 0,1 mm 0 (7:7:6) (Merck & Co., Ine.)___ (11) Papierchromatografie
Filtreerpapier: Toyo fileter papier no. 51 (Toyo Filter 20 Paper Co., Ltd.)
Oplosmiddel: acetonitri1-water (3:2), opstijgende methode Rf-waarde 0,9 (12) Snelle vloeistofchromatografie
Kolom: pBonapack Cjg (Waters Associates, Ine.), 25 4 x 300 mm
Oplosmiddel: 0,1 M fosfaatbufferoplossing, pH 6,8 Stroomsnelheid; 1 ml/min.
Verblijfduur: 23,5 minuten.
(13) Hoge voltage papieieLektroforese.
30 Bij toepassing van een hoge voltage papierelektroforese- inrichting en bij migratie in een 1/30 M fosfaatbufferoplossing (pH 7,0) bij 3000 V gedurende 30 minuten, beweegt de onderhavige stof zich naar de anode over 8,5 cm. Penicilline N, dat beproefd is op een dergelijke wijze, 35 beweegt naar een anode over 4,4 cm.
II. Biologische eigenschappen (1) Antibacterieel spectrum.
De antibacteriële spectra tegen verschillende micro- organismen zijn getoond in tabel B in vergelijking met die 40 van aminobenzylpenicilline (AB-Pc) en cefoxitine (CFX).
8002210 14
Tabel B
Beproefde bacterie Minimum inhibitoire concentratie (mcg/ml)
ΚΔ-6643-Α KA-6643-B Ab-Pc CFX
(natrium- (dinatriumr- _zout)_zout)_
Staphylococcus aureus 0,39 6,25 0,05 1,56 209P JC-1
Staphylococcus epidermidis0,78 6,25 0,78 1,56 1228
Bacillus subtilis 6633 0,2 6,25 <0,025 1,56
Escherichia coli NIHJ JC-2 0,05 1,56 6,25 6,25
Klebsiella pneumoniae 602 0,2 6,25 12,5 0,78
Serratia mareeseens NHL 0,2 6,25 50 12,5
Enterobacter cloacae 977 0,78 6,25 100 >100
Enterobacter aerogenes 972 0,1 3,13 6,25 >100
Hafnia alvei 978 0,2 6,25 50 6,25
Pseudomonas aeruginosa 6,25 50 >100 >100 A"3 " " 6,25 25 100 >100 10490
Pseudomonas putida 5121 1,56 100 >100 >100
Proteus vulgaris 874 0,39 12,5 >100 6,25
Proteus morganii 3168 0,39 12,5 >100 6,25
Proteus rettgeri 13501 1,56 50 0,2 1,56
Proteus inconstans Rmll5 0,78 12,5 100 6,25
Escherichia coli 0,2 3,13 >100 3,13 EC-1 (Pease I) " " 0,05 1,56 >100 6,25 EC-59 (Pease II) " " 0,05 3,13 >100 6,25 EC-68 (Pease IV)
Citrobacter 1 (PC ase) 0,78 6,25 >100 >100
Citrobacter 24 (CS ase) 1,56 12,5 >100 >100
Klebsiella 25 (PCase) 0,78 6,25 >100 6,25
Klebsiella 32 (CS ase) 3,13 12,5 >100 >100 80 0 2 2 1 0 15
Zoals uit het voorgaande blijkt, vertoont de stof KA-6643 intense antibacteriële activiteit tegen gram-nega-tieve en gram-positieve bacteriën, waaronder die welke bestendig zijn tegen verschillende penicilline- en cefalosporine antibiotica. 5 (2) β-Lactamase-inhibitoire activiteit (i) Antibacteriële activiteitverbeterende werking tegen β-lactam resistente bacteriën.
In de Penassay-agar (waarvan 12 g is opgelost in 500 ml gedestilleerd water, Kyoei Pharm. Co. Ltd.) ent men 10 Escherichia coli EC-1 (PC ase) en Citrobacter 24 (CS ase), wat β-lactamase producerende organismen zijn, en men laat 10 ml van het geëntte medium vloeien op een Petrischaal met een diameter van9 cm en laat vastworden ter verkrijging van een testmedium.
In dit agarmedium plaatst men pulpschijfjes van 15 8 mm diameter, waarin 30^ug waterige oplossing van respectieve lijk antibiotica zijn gebracht gevolgd door kweken bij 37 C gedurende 18 uur, waarna men de diameter meet van een inhiberings-zone rond elke schijf. De resultaten worden getoond in de volgende tabel C.
20 Tabel C
Diameter van inhiberende zone
Antibiotische _ (mm)_ samenstelling Medium met Medium met _E.coli EC-1_Citrobacter 24_ 25 AB-Pc* (1 mg/ml) KA-6643-A (10 γ/ml) 18,0 16,0 KA-6643-B (10 γ/ml) AB-Pc (1 mg/ml)+KA-6643+ 20,0 20,0 KA-6643-A (10 γ/ml) 30 AB-Pc (1 mg/ml) + 23,0 14,0 KA-6643-B (10 γ/ml) s AB-Pc: Aminobenzylpenicilline.
(ii) β-lactamase-inhibitoire activiteit.
Wanneer men als β-lactamase -enzym penicilline 35 aminohydrolase EC 3.5.2.6 (Tokyo Chem. Syn. Co., Ltd.) gebruikt afgeleid van bacteriën behorend tot het genus Bacillus, is de I^q waarde van de stof KA-6643-A 0,5 ng/ml en die van de stof 8002210 16 KA-6643-B is 12,8 ng/ml.
De Ij-q waarde wordt gemeten volgensde methode van C. Reading en M. Cole / Antimicr. Agents and Chemoth. 11, 852-857 (1977)_7.
5 Bijgevolg kan worden verwacht, dat de stoffen KA-6643-A en KA-6643-B uitgesproken synergistische effecten vertonen in combinatie met andere 8-lactam-antibiotica.
In het licht van de verschillende eigenschappen, die hierboven zijn aangegeven, werd besloten dat de onderhavige 10 stoffen antibiotica zijn op β-lactambasis. Hoewel er een bekende verbinding is, dat wil zeggen MM 4550 (MC696-SY2-A), die gelijk is in ultraviolet absorptiespectrum aan de onderhavige stoffen, verschilt het bekende antibioticum van de stoffen KA-6643-A en KA-6643-B in de volgende opzichten.
15 1) Papierelektroforese.
Onderwerping aan papierelektroforese bij 3000 volt gedurende 25 minuten.
Oplosmiddel: 0,1 M fosfaatbufferoplossing (pH 8,0). KA-6643-A beweegt naar de anodekant 20 toe over 5 cm. MM 4550 beweegt naar de anode kant toe over 10,2 cm.
2) Snelle vloeistofchromatografie.
Kolom: β-Bondapack Cjg (Waters Associates,
Ine.) 4 x 30 cm 25 Oplosmiddel: 0,05 M fosfaatbufferoplossing (pH 7,0).
Stroomsnelheid: 1 ml/min.
Verblijfduur: KA-6643-A 1 uur KA-6643-B 30 min.
30 MM 4550 17 min.
Uit debovengenoemde resultaten blijkt, dat de stof KA-6643 een nieuwe verbinding is, die verschilt van het bekende β-lactam antibioticum.
Daar de stof KA-6643 volgens de uitvinding een 35 carboxylgroep heeft in het molecuul ervan, kan zij gebruikt worden in de vorm van een vrij zuur, maar wordt bij voorkeur gebruikt in 8002210 17 de vorm van zouten. Geschikte zouten zijn bijvoorbeeld zouten van alkali- of aardalkalimetalen, zoals natrium, kalium, calcium en dergelijke; en ammoniumzouten zoals ammonium, trimethylamine, dimethylamine en dergelijke. Verder kan de stof gebruikt worden in 5 de vorm van lagere alkylesters, zoals methylester, ethylester en dergelijke, of hogere vetzuuresters.
De uitvinding zal nu op niet beperkende wijze worden geïllustreerd met de volgende voorbeelden.
Voorbeeld I
10 (i) Men voorziet in 30 liter van een vloeibaar medium, dat een samenstelling heeft van 3 % zetmeel, 1,5 % sojameel, 0,28 % monobasisch kaliumfosfaat, 0,18 % dibasisch natrium-fosfaat.dodecahydraat, 0,0005 % cobaltchloridehexahydraat, 0,05 % magnesiumsulfaatheptahydraat en 0,001 % ferrosulfaat en waarvan 15 de pH is ingesteld op 6,0, en brengt dan porties van 100 ml van het medium in een Erlenmeyerkolf van 500 ml en steriliseert. Men ent mycelia van de stam KC-6643 in het medium en schudt de cultuur bij 27°C gedurende 4 dagen bij 220 omwentelingen per minuut.
(ii) Na voltooiing van de cultuur, voegt men 20 Celite (Johns-Manville Co., Ine.) toe als een filtreerhulpmiddel aan de cultuurvloeistof en verwijdert het mycelium door filtratie. Het filtraat (25 liter) voert men door een kolom (6 x 30 cm) van een sterk basische anionuitwisselingshars, Diaion PA316 (Cl type, Mitsubishi Chem. Ind., Ltd.) gevolgd door wassen met water en 25 elueren met een 0,01 M fosfaatbufferoplossing bij pH 7,0, die 0,5 M natriumchloride bevat, om een actieve fractie te verzamelen. Men voert de verkregen actieve fractie door een kolom (4 x 30 cm) van actieve kool en na wassen met water behandelt men dan met 50 vol/vol % waterig aceton om een actieve fractie te verzamelen. Men voert 30 de verzamelde actieve fractie door een kolom (4 x 40 cm) van een basische anionuitwisselingshars, Amberlite IRA-68 (Cl type), gevolgd door wassen met water en daarna elueren met een 0,01 M fosfaatbufferoplossing van pH 7,0, die 0,2 M natriumchloride bevat, om een actieve fractie te verzamelen.
35 (iii) De aldus verkregen fractie voert men door een kolom (4 x 30 cm) van een sterk basische anionuitwisselings- 8002210 18 hars, Dowex 1 x 2 (100 - 200 mesh, Cl type) gevolgd door wassen met water en onderwerpen aan een concentratiegradiënt-elutie bij een stroomsnelheid van 3 ml per minuut tussen een oplossing van 0,01 M fosfaatbuffer van pH 7,0, die 0,1 M natriumchloride bevat, 5 en een oplossing, die 0,4 M natriumchloride bevat, waardoor de fractie verdeeld wordt in twee andere fracties, waarvan de ene een eerste geëlueerde fractie is en de andere een vervolgens geëlueer-de fractie, waarna men de twee fracties afzonderlijk verzamelt.
(iv) De aanvankelijk geëlueerde actieve fractie, 10 die men aldus verzamelt, (ongeveer 1 liter) concentreert men tot ongeveer 100 ml onder gereduceerde druk beneden 30°C. Men voert het concentraat door een kolom van Diaion HP-20, die te voren gewassen is met een 20 %'s pekeloplossing, gevolgd door elutie met gedeioniseerd water bij een stroomsnelheid van 4 ml per minuut.
15 Men verzamelt een actieve fractie en concentreert tot ongeveer 2 ml beneden 30°C, gevolgd door vriesdrogen om 80 mg te verkrijgen van een ruw poeder van KA-6643-A.
(v) De vervolgens geëlueerde actieve fractie behandelt men op dezelfde wijze-ala in trap (iv), waardoor men 240 20 mg verkrijgt van een ruw poeder van KA-6643-B.
Voorbeeld II
(i) Men ent een medium, dat een samenstelling heeft van 2 % zetmeel, 1,5 % sojameel, 0,28 % monobasisch kalium-fosfaat, 0,18 % dibasisch natriumfosfaatdodecahydraat, 0,0005 % 25 cobaltchloride.hexahydraat, 0,05 % magnesiumsulfaat.heptahydraat en 0,001 % ferrosulfaat, en waarvan de pH is ingesteld op 6,0 en gesteriliseerd, met mycelium van de stam KC-6643, gevolgd door voorkweken bij 27°C gedurende ongeveer 28 uur ter verkrijging van een eerste zaaimedium. In elk van twee tanks met elk een volume van 30 200 liter doet men 100 liter van een medium van dezelfde samen stelling als boven gebruikt, maar met 1 % katoenzaadolie er aan toegevoegd. De eerste zaadcultuur ent men in elke tank in een hoeveelheid van 500 ml en kweekt bij 30°C met een geaëreerd geroerd systeem (300 omwentelingen per minuut, een stroomsnelheid van 35 lucht van 50 liter per minuut) gedurende 4 dagen.
(ii) Na voltooiing van het kweken, voegt men aan 8002210 19 de cultuurvloeistof (170 liter) 10 vol/vol % Dicalite Perlite 4109 (Dicalite Orient Co., Ltd.) toe als een filtreerhulpmiddel en verwijdert het mycelium door filtratie.
Men stelt de geleidbaarheid van het verkregen 5 filtraat (150 liter) in op 1,5 ml per cm en voert door een kolom (21,5 x 45 cm) van een sterk basische anionuitwisselingshars,
Diaion PA316 (Cl type: Mitsubishi Chem. Ind., Ltd.) met een stroomsnelheid van 200 ml per minuut. Na wassen met een 0,01 M fosfaatbufferoplossing (pH 7,0) onderwerpt men de hars aan elutie 10 met een 0,01 M fosfaatbufferoplossing (pH 7,0), die 2 M aan natriumchloride bevat in een hoeveelheid van 2 vol/vol.% bij een stroomsnelheid van 150 ml per minuut om een actieve fractie te verzamelen. De aldus verzamelde actieve fractie voert men door een kolom van 16 x 10 cm van Diaion HP-20, die is ingesteld met een 15 10 gew./vol. % natriumchloride-oplossing bij een stroomsnelheid van 400 ml per minuut en na wassen met een 10 gew./vol.% natriumchloride-oplossing, elueert men met gedeioniseerd water met een stroomsnelheid van 200 ml per minuut om een actieve fractie te verzamelen.
20 (iü) De aldus verzamelde actieve fractie voert men door een kolom (6 x 70 cm) van een sterk basische anionuitwisselingshars, Amberlite ISA-458 (Cl type, Rohm & Haas Co.) bij een stroomsnelheid van 50 ml per minuut en elueert met een 0,01 M fosfaatbufferoplossing (pH 7,0), die 0,15 M natriumchloride bevat.
25 Daarna elueert men de resterende actieve fractie met een 0,01 M fosfaatbufferoplossing (pH 7,0), die 2 M natriumchloride bevat.
(iv) De aanvankelijk geëlueerde fractie verkregen in trap (iii) onderwerpt men aan dezelfde behandeling als beschreven in trap (iv) van voorbeeld I, waarbij men 700 mg verkrijgt van 30 een ruw poeder van de stof KA-6643-A.
(v) De vervolgens geëlueerde actieve fractie voert men door een kolom van 6 x 70 cm van Diaion HP-20, die te voren behandeld is met een 20 gew./vol.% waterige natriumchloride-oplossing en daarna geëlueérd met gedeioniseerd water bij een stroom- 35 snelheid van 20 ml per minuut om een actieve fractie te verzamelen. Men verdunt de aldus verzamelde actieve fractie met gedeioniseerd 8002210 20 water om de elektrogeleidbaarheid op ongeveer 700 micro-ohm per cm te brengen en voert door een kolom van 3 x 30 cm van een zwak-basische anionuitwisselingshars, DEAE-Sepbadex A-25 (Pharmacia Fine Chemicals) die is ingesteld op een pH 7,0 onder toepassing 5 van een 0,01 M fosfaatbufferoplossing, gevolgd door wassen met water en elutie met een fosfaatbufferoplossing (pH 7,0), die 0,15 M natriumchloride bevat bij een stroomsnelheid van 35 ml per minuut om een actieve fractie te verzamelen. Het aldus verzamelde eluaat concentreert men onder verminderde druk bij minder dan 10 30°C en voert dan door een kolom van 3,5 x 40 cm van Diaion HP-20,, die te voren behandeld is met een 10 gew./vol.% waterige natrium-chloride-oplossing en elueert met gedeioniseerd water bij een stroomsnelheid van 20 ml per minuut om een actieve fractie te verzamelen. Men concentreert de actieve fractie onder verminderde 15 druk tot ongeveer 2 ml en vriesdroogt ter verkrijging van 190 mg van een ruw poeder van de stof KA-6643-B.
Het aldus verkregen ruwe poeder lost men op in 1 ml gedeioniseerd water en voert door een kolom van 2 x 30 cm van Diaion HP-20 en elueert dan met gedeioniseerd water bij een 20 stroomsnelheid van 1 ml per minuut om een actieve fractie te verzamelen. Men concentreert de aldus verzamelde actieve fractie onder verminderde druk en voert door een kolom van Sephadex G-10 gevolgd door ontwikkeling met gedeioniseerd water bij een stroomsnelheid van 0,2 ml per minuut. Men verzamelt de actieve fractie, 25 concentreert onder verminderde druk tot ongeveer 2 ml en vriesdroogt dan ter verkrijging van 80 mg van een ruw poeder.
(vi) Men lost 80 mg van het aldus verkregen poeder op in 0,1 ml van een 0,1 M fosfaatbufferoplossing (pH 6,8) en
voert door een kolom (0,8 x 120 cm) van Bondapack C,0/Polasil B
i o
30 (Waters Associates, Inc.) die is voorbehandeld met een 0,l M
fosfaatbufferoplossing, gevolgd door elutie met dezelfde buffer-oplossing bij een stroomsnelheid van 6 ml per minuut om een actieve fractie te verzamelen. Men voert de actieve fractie door een kolom (0,9 x 5 cm) van actieve kool, wast met gedeioniseerd water en 35 elueert met 50 gew./vol.% waterhoudende aceton om een actieve fractie te verzamelen. Men concentreert de actieve fractie onder 8002210 21 verminderde druk tot ongeveer 1 ml en vriesdroogt ter verkrijging van 35 mg van een gezuiverd poeder van KA-6643-B.
Voorbeeld III
Hen lost 120 mg van het ruwe poeder verkregen 5 in voorbeeld I (iv) of voorbeeld II (iv) op in 1 ml gedeioniseerd water en voert dan door een kolom (0,8 x 60 cm) van Bondapack Cjg/Polasil B (Waters Associates, Ine.) voor een snelle vloeistof-chromatografie en elueert met een 0,01 M fosfaatbufferoplossing bij pH 6,8, die 2 % methanol bevat bij een stroomsnelheid van 10 6 ml per minuut om een actieve fractie te verzamelen.
Men concentreert de aldus verzamelde actieve fractie tot 5 ml onder verminderde druk en voert door een kolom (2 x 15 cm) van Diaion HP-20, die gewassen is met een pekeloplos-sing, gevolgd door elutie met gedeioniseerd water bij een stroom-15 snelheid van 1 ml per minuut om een actieve fractie te verzamelen. Men concentreert de fractie tot 1 ml, en voert dan door een kolom (3x150 cm) van Cephadex G-10 en elueert met gedeioniseerd water bij een stroomsnelheid van 1 ml per minuut. Daarna concentreert ----------------mien-de verkregen actieve fractie tot 2 ml onder verminderde- druk 20 en vriesdroogt ter verkrijging van 4 mg van een gezuiverd produkt van een natriumzout van KA-6643-A.
8002210
Claims (9)
1. Antibioticum, met het kenmerk, dat deze de formule 1 heeft, waarin R een waterstofatoom of de groep -SO^H voorstelt.
2. Antibioticum volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat R in de formule een waterstofatoom is.
3. Antibioticum volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat R in de formule de groep -SO^H is.
4. Antibioticum volgens een van de voorgaande 10 conclusies 1-3, met het kenmerk, dat dit in de vorm is van de zouten ervan.
5. Antibioticum volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat het een ultraviolet absorptie, infrarood-absorptie en kernmagnetisch resonantiespectrum heeft, zoals getoond in de 15 figuren 1-9.
6. Werkwijze ter bereiding van een antibioticum, met het kenmerk, dat men een antibiotische substantie en zouten ervan van de formule 1, waarin R een waterstofatoom of de groep -SO^H voorstelt, bereidt door een stof KA-6643 producerend micro- 20 organisme behorend tot het genus Streptomyces cultiveert en de antibiotische substantie uit de cultuurvloeistof isoleert.
7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat R in defcrmule een waterstofatoom voorstelt.
8. Werkwijze volgens conclusie 6, met het ken- 25 merk, dat R in de formule de groep -SO^H voorstelt.
9. Een stam / gedeponeerd in de American Type Culture Collection onder het nummer ATCC 31493/, aangeduid als Streptomyces sp. KC-6643 en nuttig voor het produceren van het antibioticum KA-6643. 30 8002210 o CH} f _S-CH=CHNHCOCHj ch3—| | j" γ OR J-N-\ O COOH 8002210 Kowa Co.,Ltd., te Nagoya-shi, Japan
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4651679A JPS55139380A (en) | 1979-04-16 | 1979-04-16 | Antibiotic and its preparation |
| JP4651679 | 1979-04-16 | ||
| JP11913979 | 1979-09-17 | ||
| JP11913979A JPS5643284A (en) | 1979-09-17 | 1979-09-17 | Antibiotic and its preparation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8002210A true NL8002210A (nl) | 1980-10-20 |
Family
ID=26386608
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8002210A NL8002210A (nl) | 1979-04-16 | 1980-04-16 | Antibioticum en werkwijze ter bereiding ervan. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4530791A (nl) |
| AT (1) | AT371146B (nl) |
| DD (1) | DD157345A5 (nl) |
| DE (1) | DE3014434A1 (nl) |
| DK (1) | DK161880A (nl) |
| ES (1) | ES490574A0 (nl) |
| FR (1) | FR2454441A1 (nl) |
| GB (1) | GB2047700B (nl) |
| IT (1) | IT1194646B (nl) |
| NL (1) | NL8002210A (nl) |
| PT (1) | PT71091A (nl) |
| SE (1) | SE8002827L (nl) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU534530B2 (en) * | 1979-02-02 | 1984-02-02 | Takeda Chemical Industries Ltd. | 5-aza-(3.2.0)-heptane derivatives |
| US4409147A (en) * | 1980-03-10 | 1983-10-11 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Carbapenem compounds and their production |
| US4497742A (en) * | 1981-03-04 | 1985-02-05 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Isomerization of β-lactam compounds |
| WO1983000867A1 (en) * | 1981-09-09 | 1983-03-17 | Takeda Chemical Industries Ltd | 5,6-cis-carbapenem-3-carboxylic acid derivatives and process for their preparation |
| EP0074599A1 (en) * | 1981-09-09 | 1983-03-23 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | 5,6-cis-Carbapenem derivatives, their production and use |
| WO1983002614A1 (en) * | 1982-02-02 | 1983-08-04 | Takeda Chemical Industries Ltd | 5,6-cis-carbapenem-3-carboxylic acid derivatives and process for their preparation |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1489235A (en) * | 1974-03-28 | 1977-10-19 | Beecham Group Ltd | Antibiotics |
| GB1467413A (en) * | 1974-03-28 | 1977-03-16 | Beecham Group Ltd | Antibiotics |
| US4172129A (en) * | 1974-03-28 | 1979-10-23 | Beecham Group Limited | Antibiotics |
| GB1483142A (en) * | 1975-03-15 | 1977-08-17 | Beecham Group Ltd | Streptomycetal antibiotic |
| GB1577725A (en) * | 1976-06-30 | 1980-10-29 | Beecham Group Ltd | Azetidinone derivatives |
| GB1531141A (en) * | 1976-08-17 | 1978-11-01 | Beecham Group Ltd | Beta-lactam antibiotics |
| NL7712091A (nl) * | 1976-11-17 | 1978-05-19 | Merck & Co Inc | Werkwijze ter bereiding van een nieuw antibiotisch middel. |
| DE2862419D1 (en) * | 1977-11-12 | 1984-07-26 | Beecham Group Plc | Derivatives of 7-oxo-1-azabicyclo(3.2.0)-hept-2-ene-2-carboxylic acid, their preparation, pharmaceutical compositions containing them and intermediates |
| US4211707A (en) * | 1978-08-10 | 1980-07-08 | Merck & Co., Inc. | Process for hydrolytically cleaving O-sulfo thienamycins |
| EP0008885B1 (en) * | 1978-09-09 | 1983-11-30 | Beecham Group Plc | Beta-lactam compounds, their preparation and use |
| US4232036A (en) * | 1978-10-24 | 1980-11-04 | Merck & Co., Inc. | 6-, 1- and 2-Substituted-1-carbadethiapen-2-em-3-carboxylic acids |
| AU534530B2 (en) * | 1979-02-02 | 1984-02-02 | Takeda Chemical Industries Ltd. | 5-aza-(3.2.0)-heptane derivatives |
-
1980
- 1980-04-04 US US06/137,259 patent/US4530791A/en not_active Expired - Lifetime
- 1980-04-10 GB GB8011860A patent/GB2047700B/en not_active Expired
- 1980-04-14 PT PT71091A patent/PT71091A/pt unknown
- 1980-04-14 FR FR8008325A patent/FR2454441A1/fr active Granted
- 1980-04-15 IT IT21374/80A patent/IT1194646B/it active
- 1980-04-15 DD DD80220468A patent/DD157345A5/de unknown
- 1980-04-15 ES ES490574A patent/ES490574A0/es active Granted
- 1980-04-15 SE SE8002827A patent/SE8002827L/xx not_active Application Discontinuation
- 1980-04-15 DE DE19803014434 patent/DE3014434A1/de not_active Withdrawn
- 1980-04-16 NL NL8002210A patent/NL8002210A/nl unknown
- 1980-04-16 DK DK161880A patent/DK161880A/da not_active IP Right Cessation
- 1980-04-16 AT AT0205080A patent/AT371146B/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB2047700B (en) | 1983-06-15 |
| ES8104829A1 (es) | 1981-04-16 |
| DK161880A (da) | 1980-10-17 |
| DD157345A5 (de) | 1982-11-03 |
| ATA205080A (de) | 1982-10-15 |
| FR2454441B1 (nl) | 1984-10-26 |
| IT8021374A0 (it) | 1980-04-15 |
| PT71091A (en) | 1980-05-01 |
| FR2454441A1 (fr) | 1980-11-14 |
| DE3014434A1 (de) | 1981-01-29 |
| IT1194646B (it) | 1988-09-22 |
| GB2047700A (en) | 1980-12-03 |
| US4530791A (en) | 1985-07-23 |
| ES490574A0 (es) | 1981-04-16 |
| SE8002827L (sv) | 1980-10-17 |
| AT371146B (de) | 1983-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1131144A (en) | Antibiotic c-15003 pnd | |
| IE42067B1 (en) | Antibiotic azetidinopyrrole derivative | |
| FI98739C (fi) | Menetelmät benanomisiinien A ja B sekä deksylosyylibenanomisiinin B valmistamiseksi | |
| Okamura et al. | PS-5, A NEW β-LACTAM ANTIBIOTIC. I TAXONOMY OF THE PRODUCING ORGANISM, ISOLATION AND PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES | |
| US4006060A (en) | Thienamycin production | |
| US4235882A (en) | Antibiotic MM 4550A | |
| NL8002210A (nl) | Antibioticum en werkwijze ter bereiding ervan. | |
| US4189473A (en) | Antibiotic MM 13902 | |
| Okabe et al. | STUDIES ON THE OA-6129 GROUP OF ANTIBIOTICS, NEW CARBAPENEM COMPOUNDS I. TAXONOMY, ISOLATION AND PHYSICAL PROPERTIES | |
| AU599650B2 (en) | Substance 4181-2 and its derivatives | |
| US4146610A (en) | Antibiotics mm13902 | |
| US4451401A (en) | Antibiotics and process for production thereof | |
| NL8000628A (nl) | Antibiotica c-19393s2 en h2. | |
| CH643262A5 (de) | Antibioticum mit betalactamasehemmender wirksamkeit sowie verfahren zu ihrer herstellung. | |
| US4113856A (en) | Antibiotic mm 13902 | |
| US4172129A (en) | Antibiotics | |
| US4329426A (en) | Process for preparation of antibiotics and biologically pure culture for use therein | |
| US4468350A (en) | KA-6643-Series antibiotics, process for producing same and medical composition containing same | |
| SHIBAMAMOTO et al. | PS-8, a minor carbapenem antibiotic | |
| US4304867A (en) | Culture of Streptomyces cattleya | |
| US4165379A (en) | N-acetyl thienamycin | |
| US4508648A (en) | Phosphoric ester of antibiotic OA-6129 | |
| US3819485A (en) | Process for producing spectinomycin | |
| US4203973A (en) | Antibiotics | |
| US4206202A (en) | Antibiotics |