DE3234203C2 - - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Macbecin-Derivate
mit antibakterieller und anderen Wirkungen sowie
Verfahren zur Herstellung derselben.
Die Antibiotika C-14919 E-1 und E-2 wurden als neue
Antibiotika isoliert (JP-OSen Nr. 121704/1978 und
121705/1978). Später wurden ihre Strukturen bestimmt,
und sie wurden Macbecin I bzw. II genannt [z. B. Tetra
hedron Letters 21, Nr. 3, Seite 309 (1980)].
Bei der Anmelderin wurde nach einem Verfahren gesucht,
Macbecin I und II mit Hilfe eines Mikroorganismus in
andere Verbindungen zu überführen. Dabei wurde gefun
den, daß die Behandlung von Macbecin I oder II mit der
Kulturbrühe eines bestimmten Mikroorganismus oder eines
von dieser abgeleiteten Verarbeitungsstoffes die be
treffende Verbindung in einer Verbindung umwandelt, die
in einer bestimmten Stellung eine Hydroxy-Gruppe an
stelle der Methoxy-Gruppe besitzt. Weitere eingehende
Untersuchungen der Anmelderin auf der Grundlage dieses
Befundes haben zu der vorliegenden Erfindung geführt.
Auf der Suche nach neuen Antibiotika wurde durch die
Anmelderin eine große Zahl von Mikroorganismen aus dem
Boden und anderen Quellen isoliert, nach von den Mikro
organismen erzeugten Antibiotika gesucht und dabei ge
funden, daß einige der Mikroorganismen Antibiotika er
zeugen, daß diese Mikroorganismen zu der Gattung Acti
nosynnema gehören und daß Antibiotika, die Aktivität
gegen grampositive Bakterien, Pilze und Protozoen zei
gen, in geeigneten Medien durch Kultivieren der Mikro
organismen in diesen Medien angereichert werden können.
Im Zuge dieser Untersuchungen wurden die Antibiotika
isoliert und gereinigt und auf Grund ihrer charakteri
stischen Eigenschaften als neue, den Macbecinen ver
wandte Verbindungen erkannt und als Antibiotika C-33196
E-3, E-3-R, E-4, E-4-R, E-5, E-5-R, E-6, E-6-R, E-7 und
E-7-R bezeichnet. Die Ergebnisse weiterer Forschung auf
der Grundlage der im Vorstehenden erwähnten Befunde
sind in die vorliegende Erfindung eingeflossen.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung
(1) Macbecin-Derivate der Formel
in der eine der Gruppen R₁, R₂ und R₃ Wasserstoff
ist und jede der beiden übrigen Methyl ist und X
eine der Gruppen
ist;
(2) ein Verfahren zur Herstellung von Macbecin-De
rivaten der Formel
in der eine der Gruppen R₁, R₂ und R₃ Wasserstoff
ist und jede der beiden übrigen Methyl ist und X
eine der Gruppen
ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine durch
die Formel
in der X die im Vorstehenden angegebene Bedeutung
hat, bezeichnete Verbindung mit einer Kulturbrühe,
die durch Kultivieren eines Mikroorganismus erhalten
wurde, der zur Gattung Streptomyces oder zur Gattung
Nocardia gehört und in der Lage ist, die Methoxy-
Gruppe in der Stellung 17, 18 oder 21 der genannten
Ausgangsverbindungen (II) in eine Hydroxy-Gruppe
umzuwandeln, oder einem sich von dieser Kulturbrühe
ableitenden Verarbeitungsprodukt in Berührung ge
bracht wird;
(3) Antibiotikum C-33196 E-4 oder C-33196 E-4-R
mit den folgenden Eigenschaften:
- a) Antibiotikum C-33196 E-4:
- I) Schmelzpunkt: 209-210°C;
- II) Aussehen: gelbe Kristalle;
- III) Spezifische Drehung: + 53° ± 5° (c = 0,5; CHCl₃);
- IV) Elementaranalyse (%):
C: 63,14 ± 0,5,
H: 7,57 ± 0,5,
N: 5,26 ± 0,5; - V) Massenspektrum (M⁺): m/z 532;
- VI) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
276 nm ± 2 nm 272 ± 20),390 nm ± 2 nm (E 33,5 ± 5); - VII) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden
(cm-1):
1735, 1700, 1670, 1650, 1625, 1605, 1500, 1380, 1305, 1290, 1210, 1010; - VIII) Löslichkeit:
Wenig löslich in Petrolether, Hexan, Wasser;
Löslich in Chloroform, Methylenchlorid, Toluol, Diethylether;
Leicht löslich in Aceton, Ethylacetat, Methanol, Dimethylsulfoxid; - IX) Farbreaktionen:
Positiver Kaliumpermanganat-Test (Entfär bung);
Negative Ninhydrin-, Ehrlich- und Barton- Reaktion; - X) Acidität, Neutralität oder Basizität: Neutral;
- b) Antibiotikum C-33196 E-4-R (Eigenschaften der
ein Molekül Ethylacetat als Kristallisations-
Lösungsmittel enthaltenden Kristalle):
- I) Schmelzpunkt: 224-225°C;
- II) Aussehen: farblose Kristalle;
- III) Spezifische Drehung: + 32° ± 5° (c = 0,5; MeOH);
- IV) Elementaranalyse (%):
C: 60,96 ± 0,5,
H: 8,25 ± 0,5,
N: 4,59 ± 0,5; - V) Massenspektrum (M⁺): m/z 534;
- VI) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
307 nm ± 2 nm 75 ± 8); - VII) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden
(cm-1):
1720, 1670, 1630, 1600, 1535, 1465, 1380, 1325, 1045; - VIII) Löslichkeit:
Wenig löslich in Petrolether, Hexan, Di ethylether, Chloroform und Ethylacetat;
Löslich in Methanol;
Leicht löslich in Dimethylsulfoxid; - IX) Farbreaktionen:
Positive Barton-Reaktion;
Negative Ninhydrin- und Ehrlich-Reaktion; - X) Acidität, Neutralität oder Basizität: Neutral;
(4) Antibiotikum C-33196 E-6, C-33196 E-6-R,
C-33196-E-7 oder C-33196-E-7-R mit der chemischen
Struktur
in der eine der Gruppen R₁, R₂ und R₃ Methyl ist und
die übrigen Wasserstoff sind und X eine der Gruppen
ist, und mit den folgenden Eigenschaften:
- a) Antibiotikum C-33196 E-6:
- I) Spezifische Drehung: + 258,8° ± 20° (c = 0,5; CHCl₃);
- II) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
273 nm ± 2 nm E 454 ± 45),
397 nm ± 2 nm E 50,3 ± 5); - III) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden
(cm-1):
1720, 1705, 1670, 1650, 1610, 1505, 1380, 1325, 1265, 1210, 1090, 1040;
- b) Antibiotikum C-33196 E-6-R:
- I) Spezifische Drehung: + 37,8° ± 4° (c = 0,5; MeOH);
- II) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
255 nm ± 2 nm 337 ± 30),
307 nm ± 2 nm 91 ± 9); - III) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden
(cm-1):
1720, 1650, 1600, 1535, 1460, 1380, 1320, 1090, 1040, 1010;
- c) Antibiotikum C-33196 E-7:
- I) Spezifische Drehung: + 37,4° ± 4° (c = 0,5; CHCl₃);
- II) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
274 nm ± 2 nm 502 ± 50),
396 nm ± 2 nm 59,8 ± 6); - III) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden
(cm-1):
1725, 1670, 1650, 1605, 1500, 1380, 1325, 1260, 1205, 1150, 1095, 1035;
- d) Antibiotikum C-33196 E-7-R:
- I) Spezifische Drehung: + 18,6° ± 2° (c = 0,5; MeOH);
- II) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
250 nm ± 2 nm 305 ± 30),
315 nm ± 2 nm 68 ± 7); - III) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden
(cm-1):
1710, 1640, 1600, 1485, 1455, 1380, 1310, 1250, 1090, 1040; und
(5) ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums
C-33196 E-3, C-33196 E-3-R, C-33196 E-4, C-33196
E-4-R, C-33196 E-5, C-33196 E-5-R, C-33196 E-6,
C-33196 E-6-R, C-33196 E-7 oder C-33196 E-7-R, das
dadurch gekennzeichnet ist, daß ein zu der Gattung
Actinosynnema gehörender Mikroorganismus, der zur
Erzeugung des Antibiotikums C-33196 E-3, C-33196
E-3-R, C-33196 E-4, C-33196 E-4-R, C-33196 E-5,
C-33196 E-5-R, C-33196 E-6, C-33196 E-6-R, C-33196
E-7 oder C-33196 E-7-R befähigt ist, in einem Kul
turmedium kultiviert wird, so daß dieser Mikroorga
nismus veranlaßt wird, die betreffende Verbindung in
der Kulturbrühe zu erzeugen und anzureichern, und
die betreffende Verbindung aus der Kulturbrühe ge
wonnen wird.
Die Verbindung der Formel (I), in der R₁, R₂ und R₃
jeweils Methyl sind und X
ist, wird "Macbecin I" genannt, und die Verbindung der
vorbezeichneten Strukturformel (I), in der R₁, R₂ und
R₃ jeweils Methyl sind und X
ist, wird "Macbecin II" genannt [vergl. die JP-OSen Nr.
121704/1978 und 121705/1978, die US-PS 41 87 292, Te
trahedron Letters 21, 309 (1980) und Tetrahedron 37
(6), 1123 (1981)].
Die Verbindung der Formel (I), in der R₁ Wasserstoff
ist, R₂ und R₃ Methyl sind und X
ist, wird "Antibiotikum C-33196 E-3" genannt;
die Verbindung der Formel (I), in der R₁ Wasserstoff
ist, R₂ und R₃ Methyl sind und X
ist, wird "Antibiotikum C-33196 E-3-R" genannt;
die Verbindung der Formel (I), in der R₁ und R₃ Methyl
sind, R₂ Wasserstoff ist und X
ist, wird "Antibiotikum C-33196 E-5" genannt;
die Verbindung der Formel (I), in der R₁ und R₃ Methyl
sind, R₂ Wasserstoff ist und X
ist, wird "Antibiotikum C-33196 E-5-R" genannt;
die Verbindung der Formel (I), in der R₁ und R₂ Methyl
sind, R₃ Wasserstoff ist und X
ist, wird "21-O-Desmethylmacbecin I" genannt;
die Verbindung der Formel (I), in der R₁ und R₂ Methyl
sind, R₃ Wasserstoff ist und X
ist, wird "21-O-Desmethylmacbecin II" genannt.
In der vorliegenden Beschreibung werden gelegentlich
als Bezeichnungen verwendet
für das Antibiotikum C-33196 E-3 "C-33196 E-3" oder
einfach "E-3",
für das Antibiotikum C-33196 E-3-R "C-33196 E-3-R" oder einfach "E-3-R",
für das Antibiotikum C-33196 E-4 "C-33196 E-4" oder einfach "E-4",
für das Antibiotikum C-33196 E-4-R "C-33196 E-4-R" oder einfach "E-4-R-",
für das Antibiotikum C-33196 E-5 "C-33196 E-5" oder einfach "E-5",
für das Antibiotikum C-33196 E-5-R "C-33196 E-5-R" oder einfach "E-5-R",
für das Antibiotikum C-33196 E-6 "C-33196 E-6" oder einfach "E-6",
für das Antibiotikum C-33196 E-6-R "C-33196 E-6-R" oder einfach "E-6-R",
für das Antibiotikum C-33196 E-7 "C-33196 E-7" oder einfach "E-7" und
für das Antibiotikum C-33196 E-7-R "C-33196 E-7-R" oder einfach "E-7-R".
für das Antibiotikum C-33196 E-3-R "C-33196 E-3-R" oder einfach "E-3-R",
für das Antibiotikum C-33196 E-4 "C-33196 E-4" oder einfach "E-4",
für das Antibiotikum C-33196 E-4-R "C-33196 E-4-R" oder einfach "E-4-R-",
für das Antibiotikum C-33196 E-5 "C-33196 E-5" oder einfach "E-5",
für das Antibiotikum C-33196 E-5-R "C-33196 E-5-R" oder einfach "E-5-R",
für das Antibiotikum C-33196 E-6 "C-33196 E-6" oder einfach "E-6",
für das Antibiotikum C-33196 E-6-R "C-33196 E-6-R" oder einfach "E-6-R",
für das Antibiotikum C-33196 E-7 "C-33196 E-7" oder einfach "E-7" und
für das Antibiotikum C-33196 E-7-R "C-33196 E-7-R" oder einfach "E-7-R".
Der für die Herstellung der Verbindung (I) durch Um
wandlung der Verbindung (II) zu verwendende Mikroorga
nismus kann ein beliebiger Mikroorganismus, der zur
Gattung Streptomyces oder Nocardia gehört und befähigt
ist, die Methoxy-Gruppe in der Stellung 17, 18 oder 21
der Verbindung (II) in eine Hydroxy-Gruppe umzuwandeln,
oder eine Mutante desselben sein. Die Mikro
organismen, die gemäß der vorliegenden Erfindung ver
wendet werden, sind
Streptomyces platensis IFO 12901
(ATCC 23948 = 13865) und Nocardia mediterranei ATCC
13685 (IFO 13415).
Die genannten Stämme IFO 12901 und IFO 13415 sind beim
Institute for Fermentation, Osaka, Verzeichnis der Kul
turen (List of Cultures) 1978, 6. Auflage, eingetragen.
Die Stämme ATCC 23948 ( =13865) und ATCC 13685 sind in
der American Type Culture Collection, Katalog der Stämme
(Catalogue of Strains) I, 14. Auflage, 1980, und 15. Auflage,
1982, eingetragen.
Die morphologischen Charakteristika von Streptomyces
platensis sind in International Journal of Systematic
Bacteriology 18, Nr. 4, Seite 360 (1968) beschrieben.
Die morphologischen Charakteristika von Nocardia medi
terranei ATCC 13685 sind in Mycopathologia 13, Seite
321-330 (1960) beschrieben. Der vorbezeichnete Stamm
ATCC 13685 wurde zunächst in die Gattung Streptomyces
eingeordnet, in einer späteren Mitteilung jedoch als zu
der Gattung Nocardia gehörend bezeichnet [vergl. Archiv
für Mikrobiologie 67, Seite 147 (1969)].
Es ist eine allgemeine Eigentümlichkeit der Mikroorga
nismen der Gattungen Streptomyces und Nocardia, daß sie
in ihren kennzeichnenden Eigenschaften labil sind. In
folgedessen können leicht Mutanten von ihnen durch
künstliche mutagene Behandlungen erhalten werden, etwa
durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, ultravioletter
Strahlung oder anderer Strahlung oder durch Verwendung
künstlicher Mutagene (z. B. N-Methyl-N'-nitro-N-nitroso
guanidin, Ethylenimin). Jede solcher Mutanten kann
auch bei der praktischen Durchführung des Verfahrens
der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, sofern
sie befähigt ist, die Methoxy-Gruppe in der Stellung
17, 18 oder 21 der Verbindung (II) in eine Hydroxy-
Gruppe umzuwandeln.
Das Medium zur Kultivierung der oben genannten Mikro
organismen für den Einsatz bei der praktischen Durch
führung der vorliegenden Erfindung kann sowohl ein
flüssiges als auch ein festes Medium sein, sofern es
Nährstoffe enthält, die der Stamm zu verwerten vermag,
wenngleich ein flüssiges Medium für die Behandlung im
großen Maßstab bevorzugt wird. Das Medium sollte in
angemessener Form Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen
enthalten, die die Assimilation dieser Elemente und
ihre Nutzung im Stoffwechsel durch die bezeichneten
Mikroorganismen ermöglichen, anorganische Substanzen,
Spurennährstoffe und so weiter. Beispiele für die Koh
lenstoff-Quelle sind Glucose, Lactose, Sucrose, Maltose,
Dextrin, Stärke, Glycerin, Mannit, Sorbit, Fette
und Öle (z. B. Sojaöl, Schmalzöl, Hühneröl) und derglei
chen. Beispiele für die Stickstoff-Quelle sind Fleisch
extrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Sojabohnenmehl,
Maisquellwasser, Pepton, Baumwollsamenöl, ausgelaugte
Melasse, Harnstoff, Ammonium-Salze (z. B. Ammoniumsul
fat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat)
und dergleichen. Das Medium kann weiterhin Salze von
Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium etc., Salze solcher
Metalle wie Eisen, Mangan, Zink, Cobalt und Nickel,
Salze der Phosphorsäure, Borsäure etc. und Salze orga
nischer Säuren wie Acetate und Propionate enthalten.
Weiterhin kann das Medium Aminosäuren (z. B. Glutamin
säure, Asparaginsäure, Alanin, Glycin, Lysin, Methionin,
Prolin), Peptide (z. B. Dipeptide, Tripeptide),
Vitamine (z. B. B₁, B₂, Nicotinsäure, B₁₂, C, E) Nu
cleinsäuren (z. B. Purine, Pyrimidine und Derivate von
diesen) und dergleichen enthalten. Zur Einstellung des
pH des Mediums können eine anorganische oder organische
Säure, ein Alkali, ein Puffer oder dergleichen zuge
setzt werden. Geeignete Mengen von Ölen, Fetten, ober
flächenaktiven Mitteln etc. können dem Medium zum
Zwecke des Entschäumens zugesetzt werden.
Die Kultivierung kann mit Hilfe jedes der Stationär-,
Schüttel- und aeroben Tauchkulturverfahren oder eines
anderen Kulturverfahrens durchgeführt werden. Für hohe
Produktionsansätze wird naturgemäß die aerobe Tauchkul
tur bevorzugt. Wiewohl die Kultivierungsbedingungen
naturgemäß in Abhängigkeit vom Zustand und der Zusam
mensetzung des Mediums, dem Typ des Stammes, dem Kul
turverfahren und anderen Faktoren variieren, wird all
gemein bevorzugt, die Inkubation bei etwa 20°C bis 45°C
mit einem etwa neutralen pH zu Beginn durchzuführen.
Besonders zweckmäßig ist eine Temperatur von 24°C bis
37°C im intermediären Stadium der Kultivierung, mit
einem Anfangs-pH von etwa 6,5 bis 8,5. Die erforderliche
Inkubationszeit liegt normalerweise im Bereich von
etwa 6 bis 100 h, vorzugsweise von etwa 10 bis 48 h.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendende
"Kulturbrühe" ist eine solche, die durch die im Vorste
henden beschriebene Kultivierung erhalten wurde.
Der gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendende
"Verarbeitungsstoff" umfaßt die mikrobiellen Zellen und
die Desmethylase enthaltenden Zerfallsprodukte von Zel
len, die aus der vorgenannten Kulturbrühe durch physi
kalische oder chemische Behandlungen erhalten werden,
etwa durch Filtrieren, Zentrifugieren, Ultraschallbe
handlung, Behandlung mit einer französischen Presse
(French press treatment), Vermahlen mit Aluminiumoxid,
Behandlung mit einem lytischen Enzym und Behandlung mit
einem organischen Lösungsmittel oder einem oberflächen
aktiven Mittel. Er umfaßt auch die mittels üblicher
Reinigungsverfahren gewonnene Desmethylase sowie die
Zellen oder die Desmethylase, die mittels eines üblichen
Verfahrens immobilisiert wurden.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird
praktisch so durchgeführt, daß die Ausgangs-Verbindung
(II) mit der Kulturbrühe der oben genannten Mikroorga
nismen oder einem daraus erhaltenen Verarbeitungsstoff
in Berührung gebracht wird. Die Konzentration der Aus
gangs-Verbindung (II) in der Reaktionsmischung beträgt
vorzugsweise 10 bis 1000 µg/ml. Die Reaktionstempera
tur beträgt vorzugsweise etwa 20°C bis 50°C, besonders
bevorzugt etwa 24°C bis 40°C, und der pH beträgt vor
zugsweise etwa 5 bis 10, besonders bevorzugt etwa 6 bis
9. Es ist ratsam, die Reaktion während eines Zeitraums
von etwa 1 bis 100 h, vorzugsweise etwa 16 bis 72 h,
durchzuführen. Die Reaktion kann im stationären (unbe
wegten) Zustand, unter Schütteln, unter Belüften oder unter
Rühren durchgeführt werden, wenngleich die Reaktionsführung
unter Schütteln, unter Belüften oder unter
Rühren bevorzugt wird.
Wenn irgendeine der Verbindungen (I) allein das Reak
tionsprodukt ist, kann die gewünschte Verbindung (I) in
kristalliner Form durch einfaches Extrahieren der Kul
turbrühe mit einem mit Wasser nicht mischbaren organi
schen Lösungsmittel, beispielsweise mit Ethylacetat,
und anschließendes Konzentrieren des Extrakts isoliert
werden. Im allgemeinen liefert die Reaktion jedoch eine
Mischung von Verbindungen (I). Aus diesem Grunde ist es
für Reinigungszwecke vorzuziehen, die Verbindungen 21-
O-Desmethylmacbecin II, E-5-R und E-3-R vor dem Ar
beitsschritt der Abtrennung unter Verwendung eines Oxi
dationsmittels in die entsprechenden Chinone zu über
führen. Zu den Oxidationsmitteln gehören solche, die
allgemein für die Oxidation von Hydrochinonen zu Benzo
chinonen verwendet werden, etwa Eisen(III)chlorid,
Eisen(III)sulfat und Silberoxid.
In einigen Fällen, je nach dem Gehalt an den Verbindun
gen 21-O-Desmethylmacbecin I, E-5 und E-3 sowie an Ver
unreinigungen, ist es vorzuziehen, daß die Produkte in
Form der Hydrochinone behandelt werden. Die Verbindungen,
die in Form der Hydrochinone vorliegen, nämlich
die Verbindungen 21-O-Desmethylmacbecin II, E-5-R und
E-3-R sind durch Reaktion der Verbindungen 21-O-Des
methylmacbecin I, E-5 und E-3 mit einem für die Reduk
tion von Benzochinonen einsetzbaren Reduktionsmittel,
etwa Natriumdithionit, erhältlich.
Das Ausbeuten-Verhältnis unter den Verbindungen 21-O-
Desmethylmacbecin I, E-5 und E-3 variiert in Abhängig
keit von dem verwendeten Mikroorganismus, und dement
sprechend können auch die angemessenen Verfahren zur
Reinigung der Verbindungen verschieden sein. Im allge
meinen werden jedoch die normalen Reinigungsverfahren,
die für die Abtrennung von Mikroorganismen erzeugter,
lipophiler Metaboliten eingesetzt werden, angewandt,
beispielsweise die Extraktion mit einem mit Wasser
nicht mischbaren organischen Lösungsmittel und Absorp
tion durch Aktivkohle oder ein nicht-ionisches makro
poröses Harz.
Zu den für diese Extraktion verwendeten Lösungsmitteln
zählen Ester wie Ethylacetat und n-Butylacetat, Alkohole
wie i-Butanol, halogenierte Kohlenwasserstoffe wie
Methylenchlorid und Ketone wie Methylisobutylketon.
Im einzelnen wird die Kulturbrühe filtriert, das Fil
trat wird neutralisiert oder schwach angesäuert und mit
einem organischen Lösungsmittel wie Ethylacetat extra
hiert, und der Extrakt wird mit einem Oxidationsmittel
wie Eisen(III)chlorid oder einem Reduktionsmittel wie
Natriumdithionit behandelt und dann unter vermindertem
Druck konzentriert. Der Zusatz eines unpolaren Lösungs
mittels wie Hexan liefert ein rohes Produkt. Die ge
wünschte Verbindung oder die gewünschten Verbindungen
werden aus dem Rohprodukt in geeigneter Weise durch
Adsorptionschromatographie mit Hilfe eines solchen Trä
gers wie Silicagel oder Aluminiumoxid isoliert. Im ein
zelnen können die betreffende Verbindung oder die be
treffenden Verbindungen beispielsweise durch Säulen
chromatographie oder Dünnschichtchromatographie an Si
licagel mittels eines Lösungsmittelgemisches wie eines
Ethylacetat-n-Hexan oder eines Chloroform-Methanol-
Systems isoliert werden.
Die sechs O-desmethylierten Produkte, die mittels des
im Vorstehenden beschriebenen Verfahrens isoliert wer
den können, können jeweils in kristalliner Form bei
spielsweise aus Ethylacetat, einem Ethylacetat-n-Hexan-
Gemisch oder einem Methylenchlorid-n-Hexan-Gemisch ge
wonnen werden.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von 21-O-Des
methylmacbecin I, C-33196 E-5 und C-33196 E-3, wie sie
in Beispiel 2 erhalten wurden, sind in der Tabelle 1
und der Tabelle 2 aufgeführt.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von 21-O-Des
methylmacbecin II, C-33196 E-5-R und C-33196 E-3-R, wie
sie in Beispiel 3 erhalten wurden, sind in der Tabelle 3
und der Tabelle 4 aufgeführt.
Für jede der Verbindungen 21-O-Desmethylmacbecin I, E-5
und E-3 wird das Molekülion M⁺ im Massenspektrum bei
m/z 544 gefunden. Somit sind die Verbindungen Isomere
mit der gleichen Molekülformel C₂₉H₄₀N₂O₈, die um eine
CH₂-Gruppe kleiner ist als diejenige der Ausgangsver
bindung (II) C₃₀H₄₂N₂O₈. In den ¹H-NMR-Spektren werden
für die Verbindung (II) Signale für drei OCH₃-Gruppen
gefunden, während für jede der Verbindungen 21-O-Des
methylmacbecin I, E-5 und E-3 nur zwei OCH₃-Gruppen
nachgewiesen werden. Aus diesem Grunde werden die letzteren
Produkte als O-desmethylierte Produkte angesehen.
Die drei desmethylierten Produkte, d. h. 21-O-Desmethyl
macbecin I, E-5 und E-3 unterscheiden sich voneinander
in bezug auf die von der desmethylierten OCH₃-Gruppe
herrührende chemische Verschiebung. Ihre jeweiligen
Strukturen wurden durch einen Feinspin-Entkopplungsver
such identifiziert, und es wurde daraus geschlossen,
daß 21-O-Desmethylmacbecin I das Produkt der Desmethylierung
in der Stellung 21, E-5 das Produkt der Desme
thylierung in der Stellung 18 und E-3 das Produkt der
Desmethylierung in der Stellung 17 ist.
Die auf diese Weise erhaltene Benzochinon-Verbindungen
[nämlich 21-O-Desmethylmacbecin I, E-5 oder E-3] und
Hydrochinon-Verbindungen [nämlich 21-O-Desmethylmacbecin II,
E-5-R oder E-3-R] lassen sich jeweils gegen
seitig ineinander umwandeln.
Die Überführung der Benzochinon-Form in die Hydrochi
non-Form kann mit Hilfe eines üblichen Verfahrens zur
Reduktion von Benzochinonen durchgeführt werden. So
kann beispielsweise das Reduktionsmittel Natriumdithionit,
Natriumhydrogensulfit, Natriumborhydrid oder der
gleichen sein, und das Lösungsmittel kann irgendein
Lösungsmittel sein, das gegenüber der oben angegebenen
Reaktion inert ist, wie beispielsweise Ester (z. B.
Ethylacetat), Alkohole (z. B. Methanol, Ethanol) und
Wasser oder Gemische aus diesen. Weiterhin kann ein aus
Wasser und einem mit Wasser nicht mischbaren organi
schen Lösungsmittel bestehendes binäres System eben
falls mit Vorteil verwendet werden. Die Reaktion wird
im allgemeinen bei einer Temperatur von etwa 0°C bis
40°C, normalerweise bei Raumtemperatur, durchgeführt
und innerhalb einer Zeit von etwa 30 s bis 24 h voll
ständig, je nach der Reaktionstemperatur.
Für die Überführung der Hydrochinon-Form in die Benzo
chinon-Form kann jedes der üblicherweise für die Oxida
tion von Hydrochinonen verwendeten Verfahren eingesetzt
werden. So umfassen die Oxidationsmittel beispielsweise
Eisen(III)chlorid, Eisen(III)sulfat, Silberoxid und
dergleichen, und das Lösungsmittel kann irgendein Lö
sungsmittel sein, das die Reaktion nicht stört, bei
spielsweise ein Ester (z. B. Ethylacetat), ein Keton
(z. B. Aceton), Wasser oder ein Gemisch aus diesen. Ein
aus Wasser und einem mit Wasser nicht mischbaren orga
nischen Lösungsmittel bestehendes binäres System kann
ebenfalls mit Vorteil verwendet werden.
Die Reaktionstemperatur ist nicht kritisch, und die
Reaktion wird im allgemeinen bei einer Temperatur von
etwa 0°C bis 40°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur,
durchgeführt. Je nach der Reaktionstemperatur kommt die
Reaktion innerhalb einer Zeit von etwa 30 s bis 24 h
zum Abschluß.
Die auf diese Weise erhaltenen Macbecin-Derivate, d. h.
Verbindungen der Formel (I), besitzen antibakterielle,
fungizide und protozoozide Wirksamkeit und erwartungs
gemäß Antitumor-Aktivität. Weiterhin können sie als
Ausgangsstoffe für die Synthese wertvoller Derivate
eingesetzt werden.
E-5, E-5-R, E-3 und E-3-R hemmen jeweils Staphylococcus
aureus und Bacillus subtilis, wobei die MHK 50 bis
100 µg/ml beträgt. Infolgedessen sind sie als antibak
terielle Mittel einsetzbar. Hinsichtlich der akuten
Toxizität beträgt der LD₅₀-Wert beispielsweise für
E-5-R 100 bis 200 mg/kg (Maus, intraperitoneal), was
die niedrige Toxizität der Verbindung anzeigt. Es wird
angenommen, daß die Verbindungen (I) niedrige Toxizität
besitzen.
Die Verbindungen (I) der vorliegenden Erfindung können
als Desinfektionsmittel in Form von Ethanol enthaltenden
(z. B. 5 Vol.-% Ethanol enthaltenden) wäßrigen Lö
sungen, die die Verbindungen (I) in einer Konzentration
von 10 bis 100 µg/ml enthalten, eingesetzt werden. Sol
che Lösungen können zur Desinfektion von Vogelkäfi
gen, Hundehütten, Ställen, Versuchsgeräten und -apparaturen
und so weiter angewandt werden.
Die Mikroorganismen, die bei der Durchführung der Er
zeugung von E-3, E-3-R, E-4, E-4-R, E-5, E-5-R, E-6,
E-6-R, E-7 und/oder E-7-R (diese Verbindungen werden
kollektiv "Antibiotika C-33196 E-3 bis E-7-R" genannt)
zu verwenden sind, können beliebige Mikroorganismen
sein, die zu der Gattung Actinosynnema gehören und zur
Herstellung eines oder mehrerer der betreffenden Anti
biotika befähigt sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird Acti
nosynnema sp. Stamm Nr. C-33196 (im Folgenden auch als
"Stamm Nr. C-33196" bezeichnet) verwendet.
Die taxonomischen Eigenschaften des Stammes C-33196
wurden mit Hilfe von Arbeitsweisen untersucht, die analog
zu denen von Shirling und Gottlieb [International
Journal of Systematic Bacteriology 16, Seiten 313-340
(1966)] waren. Die folgenden Ergebnisse wurden auf
Grund 21tägiger Beobachtung bei 28°C erhalten:
Das vegetative Myzel, das farblos bis blaßgelb oder
orangegelb ist, breitet sich gut aus und entwickelt
sich unter Bildung von Verzweigungen, sowohl auf
Agar als auch in flüssigem Medium. Die Hyphen zeigen
meistens Abmessungen von 0,5 bis 1,2 µm Durchmesser
und fragmentieren in späteren Stadien der Inkubation
zu bazillären oder verlängerten bazillären Elementen
oder verzweigten kurzen Hyphen-Abschnitten. Der
Stamm zeigt gutes Wachstum auf verschiedenen taxono
mischen Medien, wobei das Luftmyzel auf dem vegeta
tiven Myzel wächst. In vielen Fällen erscheinen die
Luftmyzele so, als ob sie auf einer großen Zahl von
Coremia (50 bis 180 µm × 400 bis 1500 µm) gewachsen
seien. Viele der Luft-Hyphen sind gebogen oder gerade,
jedoch einige scheinen in loser Form spiralig zu
sein, treten allerdings nur in seltenen Fällen auf.
Die mikroskopische Untersuchung gealterter Kulturen
zeigt, daß in einigen wenigen Fällen die Sporen of
fensichtlich in Ketten auftreten, wobei es wenige
von denen gibt, die als Konidien oder Sporen be
zeichnet werden. Bei der Untersuchung unter dem Mi
kroskop zeigte eine von der Oberfläche einer derar
tigen Kultur entnommene Zellsuspension die Anwesen
heit vieler verlängert-ellipsoider (0,5 bis 1,2 µm × 4,8
bis 6,8 µm) und ellipsoider (0,8 bis 1,2 µm × 1,5
bis 4 µm) Zellen, die wie fragmentierte Zellen
oder Arthrosporen aussahen und deren Oberfläche
glatt war, wie die elektronenmikroskopische Unter
suchung ergab. Das Luftmyzel ist im allgemeinen
spärlich, und obwohl auf vielen Medien im Laufe einer
drei- bis siebentägigen Inkubation ein annehm
bares Wachstum beobachtet wird, verschwindet es
manchmal, wenn die Kultivierung länger als 10 Tage
durchgeführt wird.
Wenn gealtertes Luftmyzel in ein flüssiges Medium
eingetaucht wird, werden nach 15 bis 30 min motile
Zellen freigesetzt. Die elektronenmikroskopische
Untersuchung dieser motilen Zellen zeigt lange peri
trichöse Geißeln um die Zellen herum. Wenn der Stamm
in einem flüssigen Medium kultiviert wird, bildet er
in späteren Inkubationsphasen manchmal polymorphe
fragmentierte Hyphen, von denen einige motil sind.
Der Stamm wurde unter Schütteln in modifiziertem
ISP-Medium Nr. 1 bei 28°C 66 bis 99 h kultiviert,
und in der gut gewachsenen stationären Phase wurden
Zellen gesammelt und gespült. Nach der Methode von
B. Becker et al. [Applied Microbiology 12, Seite
421 (1964)] und der Methode von L. P. Lechevalier
[Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 71,
Seite 934 (1968)] wurden die obigen Zellen auf Di
aminopimelinsäure und die Zucker-Zusammensetzung
untersucht. Für die erstere wurde gefunden, daß sie
in der meso-Form vorliegt, und für die letztere wurde
ein der Galactose entsprechender Fleck beobachtet.
Eine Probe der Zellwand wurde präpariert nach
der Methode von B. Becker et al. [Applied Microbio
logy 13, Seite 236 (1965)] und auf Diaminopimelin
säure, Zucker und Aminosäuren untersucht. Was die
Diaminopimelinsäure betrifft, so wurde die meso-Form
gefunden. An Zuckern wurde eine große Menge Galactose
gefunden, während Arabinose nicht nachgewiesen
wurde. Als Aminosäuren wurden Glutaminsäuren und Ala
nin deutlich nachgewiesen, wenngleich Lysin und Glycin
nur in Spuren gefunden werden konnten. Somit
gehört der Stamm zum Typ III bei der Klassifizierung
des Zellwand-Typs.
Der Stamm zeigt vergleichsweise ein gleichbleibend
gutes Wachstum auf verschiedenen Medien, und die
Farbe des vegetativen Myzels ist farblos bis blaß-
gelb in den frühen Inkubationsphasen, jedoch blaß-
gelblich-braun bis gelblich-braun in den späteren
Stadien. Der Organismus erzeugt in den meisten taxo
nomischen Medien keine löslichen Pigmente. Das Luft
myzel ist pulvrig, wächst im allgemeinen in mäßigem
Ausmaß und zeigt eine weiße bis gelbe oder blaß-
gelblich-braune Färbung. Das Luftmyzel verschwindet
auf vielen Medien bei verlängerter Kultur (ungefähr
zwei Wochen oder mehr), wobei die Oberfläche des
vegetativen Myzels glänzend zu werden beginnt. Die
Kulturmerkmale dieses besonderen Stammes auf ver
schiedenen taxonomischen Medien sind in der folgen
den Tabelle 5 zusammengefaßt.
Die in der Tabelle verwendeten Abkürzungen bedeuten
G: Wachstum;
AM: Luftmyzel;
SP: Lösliches Pigment.
*: Die Farb-Codes entsprechen dem Color Harmony Manual, 4. Auflage (Container Corporation of America, 1958).
AM: Luftmyzel;
SP: Lösliches Pigment.
*: Die Farb-Codes entsprechen dem Color Harmony Manual, 4. Auflage (Container Corporation of America, 1958).
(A) Sucrose-Nitrat-Agar:
G: Mäßig, dünn, leicht elfenbeinfarben (2ca)*;
AM: Dürftig, weiß;
SP: Keines.
G: Mäßig, dünn, leicht elfenbeinfarben (2ca)*;
AM: Dürftig, weiß;
SP: Keines.
(B) Glycerin-Nitrat-Agar:
G: Mäßig, leicht elfenbeinfarben (2ca)*;
AM: Dürftig, weiß;
SP: Keines.
G: Mäßig, leicht elfenbeinfarben (2ca)*;
AM: Dürftig, weiß;
SP: Keines.
(C) Glucose-Asparagin-Agar:
G: Mäßig, gelb (3ga)*;
Coremium-ähnliche Körper werden gebildet;
AM: Dürftig, leicht melonengelb (3ea)*;
SP: Keines.
G: Mäßig, gelb (3ga)*;
Coremium-ähnliche Körper werden gebildet;
AM: Dürftig, leicht melonengelb (3ea)*;
SP: Keines.
(D) Glycerin-Asparagin-Agar:
G: Mäßig, leicht elfenbeinfarben (2ca)*;
Coremium-ähnliche Körper werden gebildet;
AM: Dürftig, weiß bis leicht elfenbeinfarben (2ca)*;
SP: Keines.
G: Mäßig, leicht elfenbeinfarben (2ca)*;
Coremium-ähnliche Körper werden gebildet;
AM: Dürftig, weiß bis leicht elfenbeinfarben (2ca)*;
SP: Keines.
(E) Nährstoff-Agar:
G: reichlich, leuchtend gelb (21a)*;
AM: Keines;
SP: Keines.
G: reichlich, leuchtend gelb (21a)*;
AM: Keines;
SP: Keines.
(F) Calcium-Malat-Agar:
G: Dürftig, leicht elfenbeinfarben (2ca)*;
AM: Dürftig, weiß;
SP: Keines.
G: Dürftig, leicht elfenbeinfarben (2ca)*;
AM: Dürftig, weiß;
SP: Keines.
(G) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar:
G: reichlich, leuchtend gelb (31a)*;
AM: Dürftig, weiß;
SP: Keines.
G: reichlich, leuchtend gelb (31a)*;
AM: Dürftig, weiß;
SP: Keines.
(H) Hafermehl-Agar:
G: Mäßig, leicht weizenfarben (2ea)*;
Coremium-ähnliche Körper werden gebildet;
AM: Dürftig, weiß;
SP: Keines.
G: Mäßig, leicht weizenfarben (2ea)*;
Coremium-ähnliche Körper werden gebildet;
AM: Dürftig, weiß;
SP: Keines.
(I) Anorganische Salze-Stärke-Agar:
G: Mäßig, leicht elfenbeinfarben (2ca)*;
bis leicht melonengelb (3ea)*;
AM: Dürftig, leicht weizenfarben (2ea)*;
SP: Keines.
G: Mäßig, leicht elfenbeinfarben (2ca)*;
bis leicht melonengelb (3ea)*;
AM: Dürftig, leicht weizenfarben (2ea)*;
SP: Keines.
(J) Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar:
G: Mäßig, leuchtend gelb (31a)*;
AM: Keines;
SP: Keines.
G: Mäßig, leuchtend gelb (31a)*;
AM: Keines;
SP: Keines.
(K) Tyrosin-Agar:
G: Mäßig, leuchtend gelb (31a)*;
AM: Dürftig, weiß;
SP: Keines.
G: Mäßig, leuchtend gelb (31a)*;
AM: Dürftig, weiß;
SP: Keines.
Die physiologischen Eigenschaften des Stammes sind
in der nachstehenden Tabelle 6 angegeben. Der Tempe
ratur-Bereich für das Wachstum ist 12°C bis 35°C.
Der Temperatur-Bereich, in dem gutes Luft-Wachstum
auf Agar (ISP Nr. 2) stattfindet, ist 16°C bis 32°C.
Physiologische Eigenschaften des Stammes C-33196:
Temperatur-Bereich für das Wachstum: 12°C bis 35°C
Temperatur-Bereich für das Luft-Wachstum: 16°C bis 32°C
Temperatur-Bereich für das Wachstum: 12°C bis 35°C
Temperatur-Bereich für das Luft-Wachstum: 16°C bis 32°C
Verflüssigung von Gelatine: | |
Positiv | |
Hydrolyse von Stärke: | Positiv |
Reduktion von Nitraten: | Positiv |
Peptonisierung von Milch: | Positiv |
Koagulierung von Milch: | Negativ |
Zersetzung von Casein: | Positiv |
Erzeugung melanoider Pigmente: | Negativ |
Zersetzung von Tyrosin: | Positiv |
Zersetzung von Xanthin: | Negativ |
Zersetzung von Hypoxanthin: | Negativ |
Toleranz gegen Lysozym: | Positiv |
Toleranz gegen Natriumchlorid: | 2%. |
Die Verwertung verschiedener Kohlenstoff-Quellen
wurde unter Verwendung eines Basalmediums unter
sucht, das
0,05% Asparagin,
0,05% Dikaliumphosphat,
0,02% Magnesiumsulfat,
0,001% Eisen(II)sulfat,
0,1% Ammoniumsulfat und
2% Agar
0,05% Dikaliumphosphat,
0,02% Magnesiumsulfat,
0,001% Eisen(II)sulfat,
0,1% Ammoniumsulfat und
2% Agar
enthielt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der
nachstehenden Tabelle 7 aufgeführt.
Die Zeichen bedeuten
++: Üppiges Wachstum;
+: Mäßiges Wachstum;
±: Schlechtes Wachstum.
++: Üppiges Wachstum;
+: Mäßiges Wachstum;
±: Schlechtes Wachstum.
Die Zellen wurden mittels des im Vorstehenden unter
2) beschriebenen Verfahrens gewonnen, und DNA wurde
mit Hilfe eines Verfahrens analog zu demjenigen von
J. Marmur et al. [Journal of Molecular Biology 3,
Seite 208 (1961)] präpariert. Der G-C (Guanin-Cytosin)
-Gehalt der DNA wurde zu etwa 72 Mol-% gefun
den.
Die Gram-Färbung des vegetativen Myzels dieses Stam
mes war positiv.
Die im Vorstehenden aufgeführten Eigenschaften des
Stammes C-33196 wurden verglichen mit den Beschreibun
gen in S. A. Waksman, "The Actinomycetes", Band 2 (The
Williams and Wilkins Co., 1961), R. E. Buchanan und N. E.
Gibbons (Hrsg.), "Bergey's Manual of Determinative Bac
teriology", 8. Aufl., 1974, und anderen Literaturstel
len.
Die vorstehenden Beobachtungen
1), daß der Stamm in späteren Phasen des vegetativen
Wachstums polymorphe, fragmentierte Hyphen bildet,
von denen bei einigen Motilität beobachtet wird,
2), daß peritrichöse motile Zellen sich aus reifen (ma turen) Luft-Hyphen bilden,
3), daß Luft-Hyphen Koremia oder Synnemata auf einigen der Agar-Medien ausbilden, und
4), daß der Stamm zum Zellwand-Typ III gehört,
2), daß peritrichöse motile Zellen sich aus reifen (ma turen) Luft-Hyphen bilden,
3), daß Luft-Hyphen Koremia oder Synnemata auf einigen der Agar-Medien ausbilden, und
4), daß der Stamm zum Zellwand-Typ III gehört,
zeigen, gekoppelt mit anderen Eigenschaften, an, daß
der Stamm zu der Gattung Actinosynnema gehört. Aus die
sem Grunde wurde er Actinosynnema sp. Nr. C-33196 ge
nannt.
Die Gattung Actinosynnema ist eine Gattung aus der Ord
nung Actinomycetales, und deren bakterielle Eigenschaf
ten werden von Hasegawa et al. in dem International
Journal of Systematic Bacteriology 28, Seiten 304-310
(1978) mitgeteilt und sind ebenfalls beschrieben in der
gleichen Zeitschrift 30, Seite 245 (1980).
Der Stamm C-33196 wurde am 11. August 1981 bei dem In
stitute for Fermentation, Osak, Japan (IFO) unter der
Zugangs-Nr. IFO 14 127 hinterlegt und am 26. August
1981 bei dem Fermentation Research Institute, the Agency
of Industrial Science and Technology, Ministery of
International Trade and Industry, Japan (FRI) unter der
Zugangs-Nr. FERM P-6138 hinterlegt, wobei die Hinter
legung in eine unter den Budapester Vertrag fallende
Hinterlegung umgewandelt wurde, und wird bei dem FRI
unter der Zugangs-Nr. FERM-BP-166 aufbewahrt.
Im allgemeinen sind Mikroorganismen der Gattung Actino
synnema in ihren Eigenschaften labil und können spontan
oder unter dem Einfluß von Mutagenen Mutationen erlei
den. Deshalb ist darauf hinzuweisen, daß beispielsweise
die vielen Mutanten-Stämme, die durch Bestrahlung mit
Röntgenstrahlen, Gammastrahlen, ultravioletter Strah
lung etc., durch Isolierung von Monosporen, durch Kul
tur auf verschiedene Chemikalien enthaltenden Medien
oder durch irgendwelche andere, eine Mutagenese indu
zierende Mittel erhältlich sind, ebenso wie die Mutan
ten, die aus dem Stamm spontan erhalten wurden, nicht
als irgendwelche andere, im Vergleich mit den oben dar
gelegten bakteriologischen Eigenschaften unterschiedene
Species zu betrachten sind, sondern daß jede solcher
Mutanten und Varianten, wenn sie zur Erzeugung der ge
nannten Antibiotika befähigt ist, in gleicher Weise für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden
können. Beispielsweise können verschiedene, eine Muta
genese induzierende eines zur Erzeugung der genannten
Antibiotika befähigten Stammes Mutanten liefern, die
leicht gelbe bis leicht gelblich-braune oder braune
lösliche Pigmente erzeugen, Mutanten, die farblos ve
getative Myzelien bilden, Mutanten, die rötlich-braune
bis orangerote vegetative Myzelien bilden, Mutanten,
die gelblich-grüne vegetative Myzelien oder lösliche
Pigmente bilden, Mutanten, die in reichlicher Menge
weiße Luft-Myzelien bilden, sowie Mutanten, deren My
zelien fähig sind, zu fragmentieren.
Das bei der Kultivierung eines Mikroorganismus, der zur
Erzeugung der genannten Antibiotika befähigt ist, zu
verwendende Medium kann entweder im flüssigen oder im
festen Zustand vorliegen, vorausgesetzt, daß es Nähr
stoffe enthält, die von dem betreffenden Mikroorganis
mus verwertet werden können, wenngleich für Arbeiten im
großen Maßstab ein flüssiges Medium bevorzugt wird. In
geeigneter Weise in das Medium formuliert werden Koh
lenstoff- oder Stickstoff-Quellen, die die Assimilation
dieser Elemente und ihre Nutzung im Stoffwechsel durch
die bezeichneten Mikroorganismen ermöglichen, anorgani
sche Substanzen und Spurennährstoffe. Beispiele für die
Kohlenstoff-Quelle sind Glucose, Lactose, Sucrose, Mal
tose, Dextrin, Stärke, Glycerin, Mannit, Sorbit, Fette
und Öle (z. B. Sojaöl, Schmalzöl, Hühneröl) und n-Paraf
fin. Beispiele für die Stickstoff-Quelle sind Fleisch
extrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Sojabohnenmehl,
Maisquellwasser, Pepton, Baumwollsamenöl, ausgelaugte
Melasse, Harnstoff und Ammonium-Salze (z. B. Ammonium
sulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat).
Das Medium kann weiterhin Salze von Natrium, Ka
lium, Calcium, Magnesium etc., Salze solcher Metalle
wie Eisen, Mangan, Zink, Cobalt und Nickel und anderer
Metalle, Salze der Phosphorsäure, Borsäure etc. und
Salze organischer Säuren wie Essigsäure und Propionsäure
enthalten. Weiterhin kann das Medium Aminosäuren
(z. B. Glutaminsäuren, Asparaginsäure, Alanin, Lysin,
Methionin, Prolin), Peptide (z. B. Dipeptide, Tripeptide),
Vitamine (z. B. B₁, B₂, Nicotinsäure, B₁₂, C), Nu
cleinsäuren (z. B. Purine, Pyrimidine, Derivate von diesen)
und so weiter enthalten. Naturgemäß können zur
Einstellung des pH des Mediums eine anorganische oder
organische Säure, ein Alkali oder ein Puffer oder der
gleichen zugesetzt werden, und/oder ein Fett oder Öl,
ein oberflächenaktives Mittel oder dergleichen können
in einer geeigneten Menge zum Zwecke des Entschäumens
zugesetzt werden.
Die Kultivierung kann mit Hilfe jedes der Stationär-,
Schüttel- und aeroben Tauchkulturverfahren oder eines
anderen Kulturverfahrens durchgeführt werden. Für Pro
duktionsansätze mit großen Volumina, wird naturgemäß
die sogenannte aerobe Tauchkultur bevorzugt. Wiewohl
die Kultivierungsbedingungen naturgemäß vom Zustand und
der Zusammensetzung des Mediums, dem Typ des Stammes,
dem Kulturverfahren und anderen Faktoren variieren,
wird normalerweise bevorzugt, die Inkubation bei etwa
20°C bis 32°C mit einem etwa neutralen pH zu Beginn
durchzuführen. Besonders zweckmäßig ist eine Temperatur
von 25°C bis 28°C im intermediären Stadium der Kulti
vierung, mit einem Anfangs-pH von etwa 6,5 bis 7,5.
Wenn auch die Inkubationszeit von den gleichen
Faktoren, die oben erwähnt wurden, abhängt, ist es rat
sam, die Inkubation fortzusetzen, bis der Titer des
gewünschten Antibiotikums seinen maximalen Wert er
reicht. Im Falle einer Schüttelkultur oder aeroben
Tauchkultur in einem flüssigen Medium liegt die norma
lerweise erforderliche Zeit im Bereich von etwa 48 bis
96 h.
Die bezeichneten, in der Kulturbrühe erzeugten Antibio
tika können mittels einer Verfahrensweise isoliert wer
den, die passend aus den normalerweise bei der Isolie
rung und Reinigung von Metaboliten, die von Mikroorga
nismen erzeugt wurden, eingesetzten Verfahren ausge
wählt wurde, da die betreffenden Antibiotika neutral
und fettlöslich sind. Beispielsweise werden die Mittel,
die die Unterschiede in den Löslichkeiten der Produkte
und der Verunreinigungen ausnutzen, die Adsorptions
chromatographie unter Verwendung einer Mannigfaltigkeit
von Adsorbentien wie Aktivkohle, nicht-ionische makro
poröse Harze, Silicagel und Aluminiumoxid sowie andere
Mittel allein oder in Kombination verwendet.
Wiewohl die betreffenden Antibiotika hauptsächlich im
Filtrat der Kulturbrühe vorliegen, können sie jedoch
auch, soweit erforderlich, aus den Zellen extrahiert
werden. Für die Extraktion der Mikroben-Zellen kann ein
mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel, etwa
ein niederer Alkohol (z. B. Methanol, Ethanol) oder ein
Keton (z. B. Aceton, Methylethylketon) oder eine Mi
schung desselben mit Wasser benutzt werden. Die Ex
traktion kann auch mit einem mit Wasser nicht mischba
ren organischen Lösungsmittel wie Ethylacetat oder einem
ähnlichen Ester durchgeführt werden. Weiterhin kön
nen die Antibiotika auch dadurch extrahiert werden, daß
ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel wie
Methanol oder Aceton der Vollkulturbrühe zugesetzt
wird.
Zur Isolierung der Antibiotika aus dem Filtrat der Kul
turbrühe können mit Wasser nicht mischbare organische
Lösungsmittel wie Fettsäureester (z. B. Ethylacetat,
Butylacetat), Alkohole (z. B. Butanol), halogenierte
Kohlenwasserstoffe (z. B. Chloroform) und Ketone (z. B.
Methylisobutylketon) eingesetzt werden. Die betreffenden
Antibiotika können im rohen Zustand durch Waschen
des Extrakts mit Wasser, Konzentrieren desselben und
Zugabe von n-Hexan oder dergleichen erhalten werden. In
dem Fall, in dem eines der betreffenden Antibiotika als
Hauptbestandteil, d. h. in größerer Menge vorliegt, kann
es manchmal in kristalliner Form durch den einfachen
Arbeitsgang der Extraktion mit einem organischen Lö
sungsmittel und anschließendes Konzentrieren erhalten
werden.
Die Antibiotika können aus der Kulturbrühe auch durch
Adsorption an einem nicht-ionischen makroporösen Harz
wie Diaion HP-10 (Mitsubishi Chemical Industries, Japan)
und nachfolgende Elution mit einem wäßrigen Alko
hol oder Keton oder dergleichen isoliert werden.
Wenn das in der im Vorstehenden beschriebenen Weise aus
der Kulturbrühe durch Schritte der Extraktion, Konzen
trierung und so weiter erhaltene Rohprodukt ein Gemisch
der genannten Antibiotika ist, kann für die Trennung
der Bestandteile eine Vielzahl von Techniken der Ad
sorptionschromatographie eingesetzt werden. Das Adsor
bens kann ein herkömmlicher Träger wie Silicagel, Alu
miniumoxid oder ein adsorptionsfähiges Harz sein oder
ein Phasenumkehr-Träger wie µBondapak C₁₈ (Waters
Associates, Inc., USA).
Wenn das Adsorbens Silicagel ist, wird die Entwicklung
im allgemeinen mit einer Kombination aus einem polaren
organischen Lösungsmittel und einem unpolaren organi
schen Lösungsmittel, beispielsweise einem Lösungsmittel
gemisch aus Ethylacetat und n-Hexan oder aus Metha
nol und Chloroform durchgeführt, um die Bestandteile
voneinander zu trennen. Beispielsweise können die Kom
ponenten dadurch getrennt werden, daß zunächst die Ent
wicklung mit einem unpolaren Lösungsmittel durchgeführt
wird und anschließend die Elution durchgeführt wird,
während der Anteil des polaren Lösungsmittels schritt
weise erhöht wird. In dem Fall, in dem das pulvrige
Rohprodukt ein Vielkomponenten-Gemisch ist und/oder
Verunreinigungen in relativ großen Mengen enthält, kön
nen die betreffenden Komponenten dadurch voneinander
getrennt werden, daß die Chromatographie unter Varia
tion der Kombinationen der organischen Lösungsmittel
wiederholt wird.
Die genannten Antibiotika umfassen die Benzochinon-Form
und die Hydrochinon-Form, die ineinander überführbar
sind. Infolgedessen ist es zum Zwecke der Reinigung
vorteilhaft, die Zahl der Komponenten auf die Hälfte zu
vermindern, indem die Hydrochinon-Form in die Benzochi
non-Form oder die Benzochinon-Form in die Hydrochinon-
Form durch Oxidation bzw. durch Reduktion überführt
wird.
Die Oxidation kann mit Hilfe eins Verfahrens durchge
führt werden, das allgemein für die Oxidation von Hy
drochinonen verwendet wird. So ist das Oxidationsmittel
beispielsweise Eisen(III)chlorid, Eisen(III)sulfat,
Kaliumeisen(III)cyanid oder Silberoxid, und das Lö
sungsmittel kann ein beliebiges Lösungsmittel sein, das
gegenüber der Reaktion inert ist, beispielsweise ein
Ester wie Ethylacetat, ein Keton wie Aceton, Wasser
oder ein Gemisch aus diesen. Weiterhin kann auch ein
aus Wasser und einer mit Wasser nicht mischbaren Flüs
sigkeit bestehendes binäres System mit Vorteil verwen
det werden. Die Reaktionstemperatur ist nicht kritisch,
jedoch wird die Reaktion im allgemeinen bei etwa 0°C
bis 40°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, durchgeführt
und gelangt im allgemeinen leicht, je nach der Reak
tionstemperatur, in etwa 30 s bis 24 h zum Abschluß.
Die Reduktion wird in einer Weise durchgeführt, wie sie
für die Reduktion von Benzochinonen üblich ist. So zäh
len zu den Reduktionsmitteln Natriumdithionit, Natrium
hydrogensulfat und Natriumborhydrid, und die Lösungs
mittel umfassen sämtliche Lösungsmittel die gegenüber
der Reaktion inert sind, etwa Ester (z. B. Ethylacetat),
Alkohole (z. B. Methanol, Ethanol), Wasser sowie aus
diesen zusammengesetzte gemischte Lösungsmittel. Wei
terhin kann auch ein aus Wasser und einer mit Wasser
nicht mischbaren Flüssigkeit bestehendes binäres System
mit Vorteil verwendet werden. Die Reaktion wird im all
gemeinen bei etwa 0°C bis 40°C, vorzugsweise bei Raum
temperatur, durchgeführt und gelangt im allgemeinen
leicht, je nach der Reaktionstemperatur, in etwa 30 s
bis 24 h zum Abschluß.
Bei der Durchführung der Silicagel-Chromatographie werden
die Antibiotika im allgemeinen in der Benzochinon-
Form gereinigt. In einigen Fällen ist jedoch die Hydrochinon-
Form für die Reinigung besser geeignet. Infolgedessen
sollten die Komponenten in der Weise getrennt
werden, daß entweder die Methode der Oxidation oder die
Methode der Reduktion unter angemessener Berücksichtigung
der Verunreinigungen und deren Gehalte in der Mischung
gewählt werden.
Die auf diese Weise erhaltenen Bestandteile können aus
einem geeigneten Lösungsmittel wie Ethylacetat, Methanol,
Methylenchlorid oder Methanol-Wasser kristallisiert
werden.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Antibiotikums
C-33196 E-4 und des Antibiotikums C-33196 E-4-R,
das ein Molekül Ethylacetat als Kristallisations-Lösungsmittel
enthält, wie sie in Beispiel 8 und Beispiel
6, die im Folgenden beschrieben werden, erhalten wurden,
sind in der Tabelle 8 aufgeführt.
Die Struktur des Antibiotikums C-33196 E-4 und
C-33196 E-4-R konnte jeweils bestimmt werden und ist wie
nachfolgend angegeben:
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Antibiotika
C-33196 E-6 und C-33196 E-6-R, wie sie in Beispiel
11 erhalten wurden, und diejenigen der Antibiotika
C-33196 E-7 und C-33196 E-7-R, wie sie in Beispiel 10
erhalten wurden, sind in der Tabelle 9 bzw. der Tabelle
10 aufgeführt.
Das magnetische Kernresonanzspektrum (NMR-Spektrum) ist
in Tabelle 11 angegeben.
Auf der Grundlage der im Vorstehenden angegebenen physikalisch-
chemischen Eigenschaften und der Daten der
NMR-Spektren wird angenommen, daß die Antibiotika gemäß
der vorliegenden Erfindung, nämlich C-33196 E-6, E-6-R,
E-7 und E-7-R, die folgende allgemeine Formel aufweisen
in der R₁, R₂, R₃ und X die im Vorstehenden angegebenen
Bedeutungen haben. Es wird ebenfalls angenommen, daß in
E-6 und E-7 X
ist und in E-6-R und R-7-R X
ist.
In Anbetracht der vorstehenden Ausführungen sind die
Antibiotika gemäß der vorliegenden Erfindung, d. h.
C-33196 E-6, E-6-R, E-7 und E-7-R, aller Voraussicht
nach neue Verbindungen, wie aus ihren physikalisch-chemischen
Eigenschaften, NMR-Spektren und Strukturformeln
gefolgert wird.
In bezug auf die Mischung, die mindestens zwei Individuen
der Gruppe der Antibiotika C-33196 E-3 bis E-7-R
enthält, ist das Verhältnis der einzelnen Bestandteile
zueinander nicht kritisch, jedoch ist beispielsweise
die Menge eines Bestandteils in jeder Mischung nicht
kleiner als etwa 5%.
Die Antibiotika C-33196 E-3 bis E-7-R besitzen antibakterielle,
fungizide und protozoozide Wirksamkeit. Da
sie zytozide Wirkungen gegen Tumor-Zellen zeigen, wird
erwartet, daß sie Antitumor-Aktivität besitzen. Weiterhin
können sie als Ausgangsstoffe bei der Synthese
wertvoller Derivate eingesetzt werden.
Die Antibiotika C-33196 E-3 bis E-7-R, deren MHK-Werte
gegen Staphylococcuns aureus und Bacillus subtilis 50
bis 100 µg/ml betragen, sind in ihrer antibakteriellen
Wirkung gegen diese Species etwa mit Macbecin I und II
vergleichbar. Im Test mittels der Methode der Verdünnung
der Brühe hemmen E-6 und E-7 das Wachstum von Tetrahymena
pyriformis W bei 10 µg/ml bzw. 40 µg/ml. Aus
diesem Grunde können die Bakterien und gegen Protozoen
verwendet werden.
Hinsichtlich der akuten Toxizität ist festzustellen,
daß die LD₅₀ von E-5-R, beispielsweise, bei 100 bis
200 mg/kg (Maus, intraperitoneal) liegt, was seine
geringere Toxizität im Vergleich zu Macbecin I und II
anzeigt. Das Antibiotikum C-33196 E-7-R weist geringe
Toxizität auf, wie die Werte der akuten Toxizität beweisen,
d. h. die bei intraperitonealer Verabreichung an
Mäuse ist die LD₅₀ nicht niedriger als 400 mg/kg. Daher
wird angenommen, daß die Antibiotika C-33196 E-3 bis
E-7-R eine geringe akute Toxizität besitzen.
Die C-33196 E-3 bis E-7-R können als Desinfektionsmittel
zur Desinfizierung von Vogelkäfigen, Versuchgeräten
und -apparaturen, Scheunen, Nutzvieh-Stallungen und so
weiter eingesetzt werden, beispielsweise in Form von
Lösungen von 10 bis 100 µg/ml in Ethanol enthaltendem
Wasser.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele
näher beschrieben. Falls nicht anders angegeben,
bezeichnet die Angabe "Prozent (%)" Gewichts-Volumen-
Prozent.
Ein Medium (pH 7,2), das 1% Dextrin, 1% Glucose, 1%
Glycerin, 0,5% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5%
Fleischextrakt, 0,3% Natriumchlorid und 0,5% gefälltes
Calciumcarbonat enthielt, wurde mit Streptomyces
platensis IFO 12 901 beimpft, und die Kultur wurde 17 h
bei 28°C geschüttelt. Macbecin I (1,9 g) wurde zu 20 l
der erhaltenen Kulturbrühe hinzugefügt, und die Reaktion
wurde unter Schütteln 24 h bei 28°C durchgeführt.
Die Kulturbrühe wies nach der Reaktion einen verminderten
Gehalt an Macbecin I und enthielt O-desmethylierte
Produkte, wie durch Dünnschichtchromatographie nachgewiesen
wurde.
Das durch Filtration von 20 l der in Beispiel 1 erhaltenen
Reaktions-Kulturbrühe mit Hyflo Super Cel (Johns
Manville, USA), das dieser zugesetzt wurde, erhaltene
Filtrat wurde auf pH 6,0 eingestellt und zweimal mit je
10 l Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser
gewaschen und auf 1 l eingeengt. Dazu wurden 500 ml
einer 2proz-wäßrigen Eisen(III)chlorid-Lösung gegeben,
und die Mischung wurde 1 h gerührt. Danach wurde
die Ethylacetat-Schicht zweimal mit Wasser gewaschen
und eingeengt. Der Zusatz von n-Hexan lieferte 1,45 g
eines pulverförmigen Rohprodukts.
Das rohe Pulver wurde der Säulenchromatographie an 65 g
Silicagel (E. Merck A. G., Bundesrepublik Deutschland)
unterworfen und zuerst mit n-Hexan (200 ml) und dann
mit Hexan-Ethylacetat-Gemischen [1 : 1 (300 ml), 1 : 2
(300 ml), 1 : 4 (300 ml) und 1 : 9 (300 ml) der Reihe
nach] eluiert, wobei das verbliebene Ausgangsmaterial
(Macbecin I), E-3, 21-O-Desmethylmacbecin I und E-5 in
dieser Reihenfolge eluiert wurden. Jede Fraktion wurde
dünnschichtchromatographisch geprüft, und die jeweils
eine einzige Verbindung enthaltenden Fraktionen wurden
eingeengt. Dabei wurden 43 mg 21-O-Desmethylmacbecin I,
248 mg E-5 und 111 mg E-3 erhalten.
Macbecin II (1 g) wurde zur 10 l der in Beispiel 1 erhaltenen
Kulturbrühe hinzugefügt, und die Reaktion wurde
unter Schütteln 24 h bei 28°C durchgeführt. Mittels
TLC wurde bestätigt, daß Macbecin II in der Reaktions-
Kulturbrühe in O-desmethylierte Verbindungen umgewandelt
worden war.
Nach Zusatz von Hyflo Super Cel wurden 10 l der Reaktions-
Kulturbrühe filtriert, und das Filtrat wurde auf
pH 6,0 eingestellt und zweimal mit je 3,5 l Ethylacetat
extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und
auf 1 l eingeengt. Nach Zusatz von 500 ml einer 2proz.-
wäßrigen Eisen(III)chlorid-Lösung wurde die Mischung
1 h gerührt. Danach wurde die Ethylacetat-Schicht mit
Wasser gewaschen und konzentriert. Auf Zusatz von n-
Hexan wurden 610 mg eines pulverförmigen Rohprodukts
erhalten.
Dieses Pulver wurde der Säulenchromatographie an 30 g
Silicagel (E. Merck A. G., Bundesrepublik Deutschland)
unterworfen und mit n-Hexan, n-Hexan-Ethylacetat
(1 : 1), n-Hexan-Ethylacetat (1 : 2), n-Hexan-Ethylacetat
(1 : 4) und n-Hexan-Ethylacetat (1 : 9) der Reihe
nach eluiert. Die n-Hexan-Ethylacetat-(1 : 2)-Elutions-
Fraktionen wurden zur Trockne eingeengt, der Rückstand
wurde in Ethylacetat aufgelöst, mit 2-proz. wäßrigem
Natriumdithionit reduziert, mit Wasser gewaschen und
konzentriert, wodurch 62 mg E-3-R erhalten wurden.
Die n-Hexan-Ethylacetat-(1 : 4)-Elutions-Fraktionen
wurden zur Trockne eingeengt, und der Rückstand wurde
weiter mittels präparativer TLC auf Silicagel (E. Merck
A. G., Bundesrepublik Deutschland) (n-Hexan-Ethylacetat
= 1 : 4) weiter gereinigt, danach in Ethylacetat gelöst
und mit 2proz. wäßrigem Natriumdithionit reduziert.
Die Ethylacetat-Schicht wurde mit Wasser gewaschen und
konzentriert, wodurch 23 mg 21-O-Desmethylmacbecin II
erhalten wurden.
Die n-Hexan-Ethylacetat-(1 : 9)-Elutions-Fraktionen von
der Silicagel-Säule wurden zur Trockne eingeengt, und
der Rückstand wurde, nach ähnlicher Reinigung mittels
präparativer TLC auf Silicagel) (n-Hexan-Ethylacetat =
1 : 4), in Ethylacetat gelöst und mit 2proz. wäßrigem
Na₂S₂O₄ reduziert. Die Ethylacetat-Schicht wurde mit
Wasser gewaschen und konzentriert, wodurch 23 mg E-5-R
erhalten wurden.
Nocardia mediterranei IFO 13 415 wurde unter Schütteln
in einem 1% Glucose, 1% Tryptone (Difco, USA) und
0,6% Hefeextrakt enthaltenden Medium 2 d bei 30°C kultiviert.
Die Kulturbrühe wurde für die Beimpfung eines
Fermentationsmediums der selben Zusammensetzung wie
vorstehend verwendet, wobei die Impfmenge 5% betrug.
Nach 24stündiger Inkubation bei 30°C wurde die erhaltene
Fermentationsbrühe zentrifugiert, und die dabei
erhaltenen Zellen wurden mit sterilem Wasser gewaschen
und in sterilem Wasser in einer Menge von einem Fünftel
der Fermentationsbrühe suspendiert, so daß eine Suspension
gewaschener Zellen erhalten wurde. Zu 4,5 ml dieser
Zellsuspension wurden 0,2 ml eines 1M Phosphat-Puffers
(pH 7,0) und 0,2 ml einer Lösung von 20 mg/ml Macbecin
I in Methanol hinzugefügt. Die Reaktion wurde in
einem Reagensglas bei 30°C 20 h unter Schütteln durchgeführt.
Die flüssige Reaktionsmischung wurde mit der
gleichen Menge Ethylacetat extrahiert, der Extrakt wurde
mit Wasser gewaschen, 2 Volumina einer 2proz. wäßrigen
Eisen(III)chlorid-Lösung wurden zugegeben, und
die Mischung wurde gerührt. Danach wurden 5 µl der
Ethylacetat-Schicht auf eine Silicagel-Platte (E. Merck
A. G., 60 F₂₅₄) getüpfelt und mit Wasser gesättigtem
Ethylacetat entwickelt. Die Analyse mit Hilfe eines
Shimadzu Zwei-Wellenlängen-TLC-Abtastgeräts CS-910
(Shimadzu Seisakusho Ltd., Japan) ergab eine 80proz.
Umwandlung des eingesetzten Macbecin I in O-desmethylierte
Verbindungen.
Macbecin I (500 mg) wurde zu 1,3 l der durch die Verfahrensweise
von Beispiel 4 erhaltenen Kulturbrühe hinzugefügt,
und die Reaktion wurde unter Schütteln 20 h
bei 30°C durchgeführt. Die flüssige Reaktions-Mischung
wurde filtriert, und das Filtrat wurde auf pH 6,5 eingestellt
und zweimal mit je 650 ml Ethylacetat extrahiert.
Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, 1,1 l
einer 2proz. wäßrigen Eisen(III)chlorid-Lösung wurden
zugesetzt, und die Mischung wurde 1 h gerührt. Danach
wurde die Ethylacetat-Schicht zweimal mit Wasser gewaschen
und konzentriert. Auf Zusatz von n-Hexan wurden
400 mg eines pulverförmigen Rohprodukts erhalten.
Das rohe Pulver (400 mg) wurde der Säulenchromatographie
an 65 g Silicagel (Merck) unterworfen und der Reihe
nach mit n-Hexan und n-Hexan-Ethylacetat-Gemischen
der Zusammensetzungen 2 : 1, 1 : 1, 1 : 2 und 1 : 4
entwickelt. Die das Haupt-Reaktionsprodukt enthaltenden
Fraktionen wurden vereinigt, zur Trockne eingeengt und
weiter der Silicagel-Säulenchromatographie (40 g) unterworfen,
wonach mit n-Hexan und Chlorform-Methanol-
Mischungen (100 : 1 → 100 : 2 → 100 : 3, in dieser Reihenfolge)
entwickelt wurde. Die durch nur einen einzigen
Fleck gekennzeichneten Fraktionen wurden vereinigt
und bis fast zur Trockne eingeengt, und der Rückstand
wurde in Ethylacetat gelöst. Nach dem Abkühlen wurden
84 mg E-3 in Form gelber Kristalle erhalten. Eine zweite
Fraktion (51 mg) E-3 wurde aus der Mutterlauge gewonnen.
Ein Impfkultur-Medium (pH 7,0) in einem 200 ml-Erlenmeyer-
Kolben, das 2% Glucose, 3% lösliche Stärke, 1%
Roh-Sojabohnen-Mehl, 1% Maisquellflüssigkeit, 0,5%
Pepton, 0,3% NaCl und 0,5% CaCO₃ enthielt, wurde beimpft
mit Actinosynnema sp. Nr. C-33196 (IFO 14 127;
FERM BP-166), das auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar kultiviert
worden war, und die Inkubation wurde in einem
Drehschüttelgerät 48 h bei 28°C durchgeführt. Ein Anteil
von 10 ml der so erhaltenen Kulturbrühe wurde in
einen 2-l-Sakaguchi-Kolben überführt, der 500 ml des
selben Impfkultur-Mediums enthielt. Die Inkubation wurde
auf einem Reziprokschüttler 48 h bei 28°C durchgeführt.
1 l der so erhaltenen Kulturbrühe wurde zur Beimpfung
von 100 l des selben Impfkultur-Mediums in einem
200-l-Behälter aus nichtrostendem Stahl verwendet.
Die Inkubation wurde 48 h bei 28°C durchgeführt mit
einer Belüftungs-Rate von 100 l/min und unter Rühren
mit 200 Umdrehungen/min, wodurch eine Impfkulturbrühe
erhalten wurde. Ein Anteil von 60 l der Impfkulturbrühe
wurde in einen 2000-l-Behälter aus nichtrostendem
Stahl überführt, der 1200 l eines Fermentationsmediums
enthielt, das 5% Glycerin, 2% Maisquellflüssigkeit,
2% Trockenhefe, 0,5% MgCl₂, 2% KH₂PO₄ und 0,1%
CaCO₃ enthielt, und die Inkubation wurde 114 h bei 28°C
unter einem inneren Druck von 0,981 bar (1 kg/cm²) mit
einer Belüftungsrate von 1200 l/min und unter Rühren
mit 150 Umdrehungen durchgeführt. Die Fermentationsbrühe
(1100 l) wurde mit 61,8 kg Hyflo Super Cel durchgeführt.
Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten wurden
vereinigt (1200 l), auf pH 6,5 eingestellt und mit
600 l Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit
Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck auf ein
Volumen von etwa 40 l eingeengt. Dann wurden 20 l einer
2proz. wäßrigen Eisen(III)chlorid-Lösung zugesetzt,
und die Mischung wurde 1 h gerührt. Nach dem Oxidationsvorgang
wurde die Ethylacetat-Schicht zweimal mit
je 20 l Wasser gewaschen und dann unter vermindertem
Druck eingeengt. Der ölige Rückstand (etwa 200 ml)
wurde zweimal mit je 1 l n-Hexan gewaschen. Zu dem
Rückstand (etwa 100 ml) wurden 500 ml Ethylacetat gegeben,
und die Mischung wurde an einem kühlen Ort stehen
gelassen, woraufhin sich Kristalle abschieden. Die Kristalle
wurden abfiltriert, die Mutterlauge wurde eingeengt,
und der Rückstand wurde der Säulen-Chromatographie
an 450 g Silicagel (E. Merck A. G.) unterworfen.
Die Säule wurde mit n-Hexan (500 ml) gewaschen und dann
der Reihe nach mit n-Hexan-Ethylacetat-Gemischen (4 : 1
→ 2 : 1 → 1 : 1 → 1 : 2 → 1 : 4 → 1 : 8) entwickelt.
E-3 wurde in den n-Hexan-Ethylacetat-(1 : 2)-Elutionsfraktionen,
C-33196 E-4 in den n-Hexan-Ethylacetat-
(1 : 4)-Fraktionen und E-5 in den n-Hexan-Ethylacetat-
(1 : 8)-Fraktionen gefunden.
Jedes der auf diese Weise erhaltenen Produkte bestand
noch nicht nur aus einem einzigen Bestandteil und wurde
dementsprechend nochmals durch Silicagel-Chromatographie
gereinigt.
Die Mischung, deren Hauptbestandteil E-3 war, wurde an
einer Silicagel-Säule von 100 g adsorbiert und, in dieser
Reihenfolge, mit Hexan, Chloroform und Chloroform-
Methanol (100 : 1 - 25 : 1) entwickelt. Das Einengen
der vereinigten Fraktionen, die jeweils nur einen Fleck
bei der TLC zeigten, lieferte 66 mg E-3. Die Mutterlauge
wurde der Reduktion mit 2proz. wäßrigem Natriumdithionit
unterworfen. Das Reduktionsprodukt wurde der
Säulenchromatographie an Silicagel (100 g) unterworfen.
Die Entwicklung, in dieser Reihenfolge, mit Hexan,
Chloroform und Chloroform-Methanol (50 : 1 - 50 : 4)
und das Einengen der Fraktionen, die jeweils nur einen
Fleck bei der TLC zeigten, lieferte 170 mg E-3-R in
kristalliner Form.
Die Mischung, deren Hauptbestandteil das Antibiotikum
C-33196 E-4 war, wurde an einer Silicagel-Säule (150 g)
adsorbiert und, in dieser Reihenfolge, mit Hexan, Chloroform
und Chloroform-Methanol (50 : 1 → 10 : 1) entwickelt.
Die das angestrebte Produkt enthaltenden Fraktionen
wurden vereinigt und eingeengt; der Rückstand
wurde in Ethylacetat aufgelöst und mit 2proz. wäßrigem
Natriumdithionit behandelt. Das Reduktionsprodukt wurde
nochmals der Säulenchromatographie an Silicagel (130 g)
unterworfen. Die Entwicklung, in dieser Reihenfolge,
mit Hexan, Chloroform und Chloroform-Methanol (25 : 1 →
5 : 1) und das anschließende Einengen der vereinigten,
nur einen Fleck zeigenden Fraktionen lieferte Kristalle
(430 g) des Antibiotikums C-33196 E-4-R.
Die Fraktion, in der E-5 der Hauptbestandteil war, wurde
an einer Silicagel-Säule (200 g) adsorbiert und, in
dieser Reihenfolge, mit Hexan, Chloroform und Chloroform-
Methanol (25 : 1 → 10 : 1) entwickelt. Die E-5
enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und eingeengt;
der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und mit 2proz.
Natriumdithionit behandelt. Das Reduktionsprodukt
wurde nochmals der Säulenchromatographie an Silicagel
(130 g) unterworfen und, in dieser Reihenfolge, mit
Hexan, Chloroform und Chloroform-Methanol (50 : 1 →
10 : 1) entwickelt. Das Einengen der vereinigten, nur
einen Fleck zeigenden Fraktionen lieferte Kristalle
(1,325 g) E-5-R.
Methanol (1 l) wurde zu einem Anteil von 1 l der in
gleicher Weise wie in Beispiel 6 erhaltenen Fermentationsbrühe
hinzugefügt, und die Mischung wurde filtriert.
Das Methanol wurde aus dem Filtrat durch Destillation
entfernt. Der Rückstand wurde auf einen pH 6
bis 7 eingestellt und zweimal mit je 500 ml Ethylacetat
extrahiert, und der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen
und eingeengt. Die TLC des Konzentrats bestätigte die
Anwesenheit des Antibiotikums C-33196 E-4, das Antibiotikums
C-33196 E-4-R, sowie von E-5, E-5-R, E-3 und
E-3-R.
In 100 ml Ethylacetat wurden 100 mg des Antibiotikums
C-33196 E-4-R, das wie in Beispiel 6 erhalten wurde,
gelöst. Dazu wurden 50 ml einer 2proz. wäßrigen Eisen
(III)chlorid-Lösung zugesetzt, und die Mischung wurde
1 h gerührt. Danach wurde das Ethylacetat abgetrennt,
mit Wasser gewaschen und eigeengt, wonach 88 mg des
Antibiotikums C-33196 E-4 erhalten wurden.
Die Verbindungen E-5-R und E-3-R, die wie in Beispiel 6
erhalten wurden, wurden in gleicher Weise wie in Beispiel
8 behandelt, wonach die Verbindungen E-5 bzw.
E-3, beide in kristalliner Form, erhalten wurden.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der in den
Beispiel 6 und Beispiel 9 erhaltenen Verbindungen E-5
und E-3 sowie derjenigen von E-5-R und E-3-R sind mit
denjenigen der in Beispiel 2 erhaltenen Verbindungen
identisch.
Ein Impfkultur-Medium (pH 7,0) in einem 200-ml-Erlenmeyer-
Kolben, das 2% Glucose, 3% lösliche Stärke, 1%
Roh-Sojabohnen-Mehl, 1% Maisquellflüssigkeit, 0,5%
Pepton, 0,3% NaCl und 0,5% CaCO₃ enthielt, wurde beimpft
mit Actinosynnema sp. Nr. C-33196 (IFO 14 127;
FERM BP-166), das auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar kultiviert
worden war, und die Inkubation wurde in einem
Drehschüttelgerät 48 h bei 28°C durchgeführt. Ein Anteil
von 10 ml der so erhaltenen Kulturbrühe wurde in
einen 2-l-Sakaguchi-Kolben überführt, der 500 ml des
selben Impfkultur-Mediums enthielt. Die Inkubation wurde
auf einem Reziprokschüttler 48 h bei 28°C durchgeführt.
1 l der so erhaltenen Kulturbrühe wurde zur Beimpfung
von 100 l desselben Impfkultur-Mediums in einem
200-l-Behälter aus nichtrostendem Stahl verwendet.
Die Inkubation wurde 48 h bei 28°C durchgeführt mit
einer Belüftungs-Rate von 100 l/min und unter Rühren
mit 200 Umdrehungen/min, wodurch eine Impfkulturbrühe
erhalten wurde. Ein Anteil von 60 l der Impfkulturbrühe
wurde in einen 2000-l-Behälter aus nichtrostendem
Stahl überführt, der 1200 l eines Fermentationsmediums
enthielt, das 5% Glycerin, 2% Maisquellflüssigkeit,
2% Trockenhefe, 0,5% MgCl₂, 2% KH₂PO₄ und 0,1%
CaCO₃ enthielt, und die Inkubation wurde 114 h bei 28°C
unter einem inneren Druck von 0,981 bar (1 kg/cm²) mit
einer Belüftungsrate von 1200 l/min und unter Rühren
mit 150 Umdrehungen durchgeführt. Die Fermentationsbrühe
(1100 l) wurde mit 61,8 kg Hyflo Super Cel filtriert.
Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten wurden
vereinigt (1200 l), auf pH 6,5 eingestellt und mit
650 l Ethylacetat extrahiert.
Die Dünnschichtchromatographie [Elutionsmittel: Chloroform-
Methanol (9 : 1)] zeigte die Anwesenheit von
E-7 (Rf: 0,65) und E-7-R (Rf: 0,18) an.
Zur leichteren Isolierung und Reinigung der angestrebten
Produkte wurde E-7-R in dem Extrakt zunächst zu E-7
oxydiert, das dann gereinigt und weiter wieder zu E-7-R
reduziert wurde. Zu diesem Zweck wurde der Extrakt mit
300 l Wasser gewaschen und dann unter vermindertem
Druck konzentriert (auf ein Volumen von 28 l). Dazu
wurden 14 l einer 2proz. wäßrigen Eisen(III)chlorid-
Lösung gegeben, und die Mischung wurde gerührt. Eine
Stunde später wurde die Ethylacetat-Schicht zweimal mit
je 14 l Wasser gewaschen und eingeengt. Das ölige Konzentrat
wurde viermal mit je 500 ml n-Hexan gewaschen,
und der verbleibende viskose Rückstand wurde in 500 ml
Ethylacetat gelöst. Die Mischung wurde mit 250 mg Silicagel
(Kieselgel 60, E. Merck A. G., Bundesrepublik
Deutschland) gemischt. Die erhaltene Mischung wurde zur
Trockne eingeengt und auf eine Säule aus Silicagel
(500 g) gegeben. Die gesamte Säule wurde mit n-Hexan
gewaschen und dann der Reihe nach mit n-Hexan-Ethylacetat-
Gemischen (4 : 1 → 2 : 1 → 1 : 1 →1 : 1 → 2 : 1 → 1 : 4 →
1 : 8) eluiert. Die n-Hexan-Ethylacetat-(2 : 1 →
1 : 1)-Elutionsfraktionen enthielten C-33196 E-7. Diese
Fraktionen wurden vereinigt und auf etwa 50 ml eingeengt
und weiter mit 200 ml Ethylacetat verdünnt. Danach
wurden 120 ml einer 2proz. wäßrigen Natriumdithionit-
Lösung hinzugegeben, und die Mischung wurde gerührt.
Nach dem Entfernen der wäßrigen Schicht wurde die Reduktions-
Behandlung noch einmal in der gleichen Weise
wiederholt. Die organische Schicht wurde mit Wasser
gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck auf
20 ml eingeengt. Dann wurden 10 g Silicagel hinzugefügt,
und die Mischung wurde zur Trockne eingeengt. Der
Rückstand wurde auf eine Säule aus Silicagel (50 g)
gegeben. Nach der Entwicklung mit n-Hexan wurde die
gesamte Säule der Reihe nach mit Chloroform und Chloroform-
Methanol-Gemischen (100 : 1 → 50 : 1 → 4 : 1) eluiert.
Die Chloroform-Methanol-(4 : 1)-Elutionsfraktionen,
die C-33196 E-7-R enthielten, wurden unter vermindertem
Druck eingeengt, und der Rückstand wurde in Ethylacetat
gelöst. Nach dem Abkühlen lieferte die Lösung 423 mg
C-33196 E-7-R in Form farbloser Kristalle.
Auflösen von 200 mg C-33196 E-7-R in 100 ml Ethylacetat,
Oxidation mit 100 ml einer 2proz. wäßrigen Eisen
(III)chlorid-Lösung, Waschen mit Wasser und Zusatz von
n-Hexan ergaben 180 mg C-33196 E-7 in Form eines gelben
Pulvers.
Aliquote Anteile von jeweils 2 ml der durch Kultivierung
in dem Erlenmeyer-Kolben in Beispiel 10 erhaltenen
Impfkultur wurden in einen 200-ml-Erlenmeyer-Kolben
überführt, der 40 ml eines Hauptkulturmediums enthielt,
das 5% Glycerin, 2% Trockenhefe, 2% Meisquellflüssigkeit
und 3% Monoammoniumphosphat enthielt (pH 7,0).
Die Inkubation wurde auf einem Drehschüttler 90 h bei
28°C durchgeführt. Fünf Liter der Kulturbrühe wurden
mit Hyflo Super Cel filtriert, und das Filtrat wurde
auf pH 7 eingestellt und zweimal mit je 2,5 l Ethylacetat
extrahiert.
Die Dünnschichtchromatographie [Elutionsmittel: Chloroform-
Methanol (9 : 1)] zeigte die Anwesenheit von
E-6 (Rf: 0,41) und E-6-R (Rf: 0,22) an.
Zur Erleichterung der Isolierung der angestrebten Produkte
wurde das in dem Extrakt erhaltene E-6-R zu E-6
oxydiert, das dann zusammen mit dem ursprünglich von
dem Mikroorganismus erzeugten E-6 isoliert und gereinigt
wurde. Zu diesem Zweck wurde nach dem Waschen mit
Wasser die Ethylacetat-Schicht auf ein Volumen von 1 l
konzentriert. Dazu wurden 500 ml einer 2proz. wäßrigen
Eisen(III)chlorid-Lösung gegeben, und die Mischung wurde
1 h gerührt, und dann wurde die Ethylacetat-Schicht
mit Wasser gewaschen und eingeengt. Zu dem Konzentrat
(etwa 30 ml) wurden 10 g Silicagel gegeben. Die Mischung
wurde wieder zur Trockne eingeengt, und der
Rückstand wurde auf eine Säule aus Silicagel (50 g)
gegeben.
Die gesamte Silicagel-Säule wurde der Reihe nach mit
n-Hexan, Chloroform und Chloroform-Methanol-Gemischen
(100 : 1 → 30 : 1) entwickelt. Die E-6 enthaltenden
Fraktionen (aufgrund der dünnschichtchromatographischen
Ergebnisse) wurden vereinigt und konzentriert, woraufhin
160 mg C-33196 E-6 in Form gelber Kristalle erhalten
wurden.
Zu der Mutterlauge wurden 5 g Silicagel hinzugefügt,
die Mischung wurde zur Trockne eingeengt, und der Rückstand
wurde auf eine Säule aus Silicagel (25 g) gegeben.
Die gesamte Säule wurde in gleicher Weise wie im
Vorstehenden entwickelt. Die E-6 enthaltenden Fraktionen
wurden konzentriert, in 100 ml Ethylacetat gelöst
und zweimal nacheinander mit jeweils 50 ml einer
2proz. Natriumdithionit-Lösung reduziert. Die Ethylacetat-
Schicht wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet
und konzentriert, woraufhin 45 mg C-33196 E-6-R in Form
farbloser Kristalle erhalten wurden.
Claims (9)
1. Desmethylmacbecin-Derivate der Formel
in der eine der Gruppen R₁, R₂ und R₃ Wasserstoff ist
und die übrigen Methyl sind und X eine der Gruppen
ist.
2. Macbecin-Antibiotikum-Derivat C-33196 E-4 erhältlich
nach dem Verfahren gemäß Anspruch 9, mit der folgenden
Formel:
und mit den folgenden Eigenschaften:
- I) Schmelzpunkt: 209-210°C;
- II) Aussehen: gelbe Kristalle;
- III) Spezifische Drehung: + 53° ± 5° (c = 0,5; CHCl₃);
- IV) Elementaranalyse (%):
C: 63,14 ± 0,5,
H: 7,57 ± 0,5,
N: 5,26 ± 0,5; - V) Massenspektrum (M⁺): m/z 532;
- VI) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
276 nm ± 2 nm 272 ± 20);390 nm ± 2 nm 33,5 ± 5); - VII) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden
(cm-1):
1735, 1700, 1670, 1650, 1625, 1605, 1500, 1380, 1305, 1290, 1210, 1050; - VIII) Löslichkeit:
Wenig löslich in Petrolether, Hexan, Wasser;
Löslich in Chloroform, Methylenchlorid, Toluol, Diethylether;
Leicht löslich in Aceton, Ethylacetat, Methanol, Dimethylsulfoxid; - IX) Farbreaktionen:
Positiver Kaliumpermanganat-Test (Entfärbung);
Negative Ninhydrin-, Ehrlich- und Barton- Reaktion; - X) Acidität, Neutralität oder Basizität: Neutral;
3. Macbecin-Antibiotikum C-33196 E-4-R erhältlich
nach dem Verfahren gemäß Anspruch 9, mit der folgenden
Formel
und mit den folgenden Eigenschaften (der ein Molekül
Ethylacetat als Kristallisations-Lösungsmittel enthaltenden
Kristalle):
- I) Schmelzpunkt: 224-225°C;
- II) Aussehen: farblose Kristalle;
- III) Spezifische Drehung: + 32° ± 5° (c = 0,5; MeOH);
- IV) Elementaranalyse (%):
C: 60,96 ± 0,5,
H: 8,25 ± 0,5,
N: 4,59 ± 0,5; - V) Massenspektrum (M⁺): m/z 534;
- VI) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
307 nm ± 2 nm 75 ± 8); - VII) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden
(cm-1):
1720, 1670, 1630, 1600, 1535, 1465, 1380, 1325, 1045; - VIII) Löslichkeit:
Wenig löslich in Petrolether, Hexan, Diethylether, Chloroform und Ethylacetat;
Löslich in Methanol;
Leicht löslich in Dimethylsulfoxid; - IX) Farbreaktionen:
Positive Barton-Reaktion;
Negative Ninhydrin- und Ehrlich-Reaktion; - X) Acidität, Neutralität oder Basizität: Neutral;
4. Antibiotikum C-33196 E-6 erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 9
mit der chemischen Struktur
in der eine der Gruppen R₁, R₂ und R₃ Methyl ist und
die übrigen Wasserstoff sind und X eine der Gruppen
ist, und mit den folgenden Eigenschaften:
- I) Spezifische Drehung: + 258,8° ± 20° (c = 0,5; CHCl₃);
- II) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
273 nm ± 2 nm (E 454 ± 45),
397 nm ± 2 nm (E 50,3 ± 5); - III) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden
(cm-1):
1720, 1705, 1670, 1650, 1610, 1505, 1380, 1325, 1265, 1210, 1090, 1040;
5. Antibiotikum C-33196 E-6-R erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 9 mit der in Anspruch 4 angegebenen
chemischen Struktur und mit den folgenden Eigenschaften:
- I) Spezifische Drehung: + 37,8° ± 4° (c = 0,5; MeOH);
- II) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
255 nm ± 2 nm 337 ± 30),
307 nm ± 2 nm 91 ± 9); - III) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden
(cm-1):
1720, 1650, 1600, 1535, 1460, 1380, 1320, 1090, 1040, 1010;
6. Antibiotikum C-33196 E-7 erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 9 mit der in Anspruch 4 angegebenen
chemischen Struktur und mit den folgenden Eigenschaften:
- I) Spezifische Drehung: + 37,4° ± 4° (c = 0,5; CHCl₃);
- II) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
274 nm ± 2 nm 502 ± 50),
396 nm ± 2 nm 59,8 ± 6); - III) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden
(cm-1):
1725, 1670, 1650, 1605, 1500, 1380, 1325, 1260, 1205, 1150, 1095, 1035;
7. Antibiotikum C-33196 E-7-R erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 9 mit der in Anspruch 4 angegebenen
chemischen Struktur und mit den folgenden Eigenschaften:
- I) Spezifische Drehung: + 18,6° ± 2° (c = 0,5; MeOH);
- II) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
250 nm ± 2 nm 305 ± 30),
315 nm ± 2 nm 68 ± 7); - III) Infrarot-Absorptionsspektrum, Haupt-Banden
(cm-1):
1710, 1640, 1600, 1485, 1455, 1380, 1310, 1250, 1090, 1040; und
8. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Desmethylmacbecin-
Derivate der Formel
in der eine der Gruppen R₁, R₂ und R₃ Wasserstoff ist
und die übrigen Methyl sind und X eine der Gruppen
ist, dadurch gekennzeichnet, daß eine durch die Formel
in der X eine der Gruppen
ist, bezeichnete Verbindung mit einer Kulturbrühe, einschließlich
eines Verarbeitungsstoffes der Kulturbrühe,
des Mikroorganismus Streptomyces platensis IFO 12 901
oder Nocardia mediterranei IFO 13 414, der in der Lage ist,
eine der Methoxy-Gruppen in den Stellungen 17, 18 und
21 der genannten Ausgangsverbindungen in eine Hydroxy-
Gruppe umzuwandeln, in Berührung gebracht wird.
9. Verfahren zur Herstellung der Antibiotika C-33196 E-3,
C-33196 E-3-R, C-33196 E-4, C-33196 E-4-R, C-33196 E-5,
C-33196 E-5-R, C-33196 E-6, C-33196 E-6-R, C-33196 E-7
oder C-33196 E-7-R, dadurch gekennzeichnet, daß der
Mikroorganismus Actinosynnema sp. Nr. C-33196 (IFO 14127),
der zur Erzeugung der Antibiotika C-33196 E-3, C-33196
E-3-R, C-33196 E-4, C-33196 E-4-R, C-33196 E-5, C-33196
E-5-R, C-33196 E-6, C-33196 E-6-R, C-33196 E-7 oder
C-33196 E-7-R befähigt ist, in einem Kulturmedium kultiviert
wird, so daß dieser Mikroorganismus veranlaßt
wird, die betreffende Verbindung in der Kulturbrühe zu
erzeugen und anzureichern, und die betreffende Verbindung
aus der Kulturbrühe gewonnen wird.
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