DE2034245C2 - Antibiotikum Juvenimicin A↓3↓ - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft das neue Antibiotikum »Juveni- ίο micln Ai« mit den Parametern gemäß dem Patentanspruch.

Es wurde gefunden, daß eine Gruppe von neuen antibiotischen Substanzen von einem zur Gattung Micromonospora gehörenden bestimmten Mikroorganismus gebildet und In der Kulturbrühe angehäuft wird, und daß die einzelnen Mitglieder der Gruppe der neuen Antibiotika in ihren Eigenschaften sowie In ihren chemischen Strukturen eng miteinander verwandt sind, daß sie jedoch aus der Kulturbrühe getrennt als Einzelverbindungen oder als Gemisch In jedem gewünschten Reinheitsgrad isoliert werden können. Das neue, erfindungsgemäße Antibiotikum ist als »Juvenlmicin Αι« bezeichnet worden.

Die Erfindung betrifft den Im Patentanspruch dargelegten Gegenstand.

Das Juvenlmicin A, wird hergestellt durch Kultivierung eines bestimmten, -las Juvenlmicin Aj bildenden Mikroorganismus der Gattung Mlcromonospora in einem geeigneten Kulturmedium, das eine Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff und eine Quelle von verwertbarem ^b0 Stickstoff enthält, bis Juvenlmicin A₅ in der Kulturbrühe in wesentlichen Mengen angehäuft worden Ist, und Isolierung des Juvenlmyclns Ai. Dafür wird der Stamm ΤΙ 124, der von einer Bodenprobe des Bezirkes Izuml von Osaka (Japan) Isoliert wurde und dei zur Gattung Micro- ^b5 monospora gehört und Juvenlmicin zu bilden vermag, verwendet. Dieser Stamm hat die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften:

i) Morphologische Eigenschaften

Das vegetative Mycel ist gut entwickelt und verzweigt, jedoch ist kein Septum festzustellen. Der Durchmesser beträgt 0,4 bis 0,8 μηι. Auf verschiedenen Medien ist das Wachstum ziemlich gut, jedoch wird kein Luftmyce! gebildet. Eine einzelne Spore wird an der Spitze der sporentragenden Hyphen gebildet, die vom vegetativen Mycel abzweigen. Die sporentragenden Hyphen haben gewöhnlich eine Länge von 1 bis 2 μηι, gelegentlich jedoch von 3 bis 6 pm. Zahlreiche Sporen werden gebildet, und jede Spore ist kugelförmig bis oval odtv elliptisch und hat eine Größe von 0,5 bis 1 pm χ 0,5 bis 1,3 μηπ und eine glatte Oberfläche.

2) Eigenschaften der Kultur

Das Wachstum ist langsamer als bei Streptomyces im allgemeinen. Das vegetative Mycel ist in der Anfangsphase des Wachstums farblos, jedoch später orange-gelb bis orange-braun. Auf gewissen Medien zeigt es ein schwarzes, feucht glänzendes Wachstum.

Auf fast allen Medien wird kein lösliches Pigment gebildet. Der pH-Wert für das Wachstum liegt zwischen 5 und 9. Das Optimum ist ungefähr der Neutralpunkt. Die Temperatur für das Wachstum beträgt etwa 20 bis 45° C und optimal 30 bis 37" C.

In der folgenden Beschreibung bedeutet »Rdg.« die entsprechende Farbbezeichnung aus Ridgway »Color Standard and Nomenclature«. Die Beobachtungen wurden an Kultivierungen bei 28° C für 14 Tage gemacht, falls nicht anders angegeben. Die Abkürzungen »W«, »R«, und »LP« bedeuten »Wachstum«, »Rückseite« und »lösliches Pigment«.

a) Czapek-Agar:

W: mäßig, Plnlsh Buff (Rdg. XXIX, 17"- d) bis

Dark Olive (Rdg. XL, 2Γ" - m)
R: Dark Olive (Rdg. XL, 21"·-m)

b) Czapek-Lösung:

W: mäßig, sinkt zu Boden, farblos mit einem leichten Stich nach Seashell Plnk (Rdg. XIV, 1Γ - Π LP: nicht vorhanden

c) Glucose-Czapek-Agar:

W: schlecht, Wood Brown (Redg. XL, 17" ')

R: farblos bis Vlnaceous-Fawn (Redg. XL, 13" '-b) LP: nicht vorhanden

d) Glycerin-Czapek-Agar:

W: spärlich, farblos bis Vinaceous Buff (Redg. XL,

17"' - d)
R: farblos
LP: nicht vorhanden

e) Glucose-Asparagin-Agar:

W: mäßig. Cinnamon Buff (Rdg. XXIX, 17" - b) bis Olive Brown (Rdg. XL, 17"' - k).

R: Deep Olive (Rdg. XL, 21"'- k) bis schwarz

LP: nicht vorhanden
0 Nähragar:

W: schlecht, farblos bis Pinkish Buff (Rdg. XXIX, 17"-d)

R: farblos

LP: nicht vorhanden
g) Glucose-Nähragar:

W: mäßig, faltig. Pinkish Buff (Rdg. XXlX, 17"- d) bis Tawny Olive (Rdg. XXIX, 17" - I)

R: farblos

LP: nicht vorhanden

h) Glycerin-Nähragar:

W: spärlich, farblos bis Pinkish Buff (Rdg. XXIX,

17" - d)
R: farblos
LP: nicht vorhanden
i) Stärke-Agan

W: mäßig, dringt in das Medium ein, farblos bis Tawny Olive (Rdg. XXlX, 17" - i) oder Brownish Olive (Rdg. XXX, 19" - m) mit schwarzen Flecken

R: Pale Pinkish Buff «Rdg. XXlX, 17" - Π LP: nicht vorhanden
j) Reines Agar:

W: nicht vorhanden oder sehr spärlich, farblos LP: nicht vorhanden

k) Hefeextrakt-Agar:

W: reichlich, Üchenös, faltig. Snuff Brown (R<ig. XXlX, 15" - k) bis Bister (Rdg. XXlX, 15" - m) oder schwarz

R: Sayal Brown (Rdg. XXIX, 15" - i) LP: nicht vorhanden, einen Monat später zuweilen

schwach braun
I) Kartorfel-Sllchkultur:

W.: reichlich, Üchenös, faltig. Zinc Orange (Rdg.

XV, 13') bis Snuff Brown (Rdg. XXIX, 15" - k) LP: schwach grau bis dunkel gräulich-braun, m) Möhren-Stlchkultur:

W: spärlich. Zinc Orange (Rdg. XV, 13') LP: nicht vorhanden

n) Cellulose:

W: mäßig, Roman Green (Rdg. XVI, 23' - m), wird später gräulich-schwarz
Der Papiersirelfen bleibt unzersetzt o) Calclummaleat-Agar:

W: sehr schlecht, Dark Olive-Buff (Rdg. XL, 2Γ"), »

später Deep Olive (Rdg. XL, 21" ' - k) R.: farblos
LP: nicht vorhanden
p) Tyrosin-Agar:

W: sehr schlecht, farblos, später Olive Buff (Rdg.

XL, 21"'-d)
R: farblos
LP: nicht vorhanden
q) Pepton-Agar:

W: schlecht. Clay Color (Rdg. XXIX, 17") bis Sac- 4->

cardo's Umber (Rdg. XXIX, 17" - k), später Deep Olive (Rdg. XL, 2Γ" - k) R: farblos
LP: nicht vorhanden

r) Hydrolyse von Stärke: ><>

Enzymzone/Wachstumszone: 27 bis 32 mm/9 bis 10 mm
s) Lackmusmilch:

W: Ringform auf dem Glas, orangefarben, Koagulierung und Peptonisierung. Der pH-Wert ändert sich von 6,0 bis 6,1
t) Löffler-Medlum (bei 37° C):

W: mäßig. Zinc Orange (Rdg. XV, 13'), Verflüssigung,
u) Gelatine-Stichkultur (1 Monat bei 24"C): «>

W.: kein Wachstum
v) Nitratreduktion: negativ
w) Chitin: zersetzt

x) Die Sporen widerstehen 1 bis 5 Minuten einer Temperatur von 80" C b5

Die Kulturmerkmale bei 37° C sind ähnlich wie die oben beschriebenen Merkmale, außer, daß das Wachstum üppiger ist und die Farben im allgemeinen dunkler sind oder ins Schwarze übergehen.

3) Ausnutzung von Kohlenstoffquellen

Die Beobachtungen nach der Methode von Pridham und Gottlieb (Journal of Bacteriology, Band 59, Seite 107 (1948)) sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

Tabelle 1
Kohlenstoffquelle

Kultivierungstemperatur 28°C 37°C

Erythrit

Adonit

D-Sorbit

Inosit

D-Mannit

Dulcit

D-Xylose

L-Arabinose

L-Sorbose

D-Galactose

D-Glucose

D-Fruciose

D-Mannose

Rhamnose

Melibiose

Maltose

Saccharose

Lactose

Ra (Ti η öse

Trehalose

Salicin

Esculin

Inulin

Stärke

Na-Acetat

Glycerin

Kontrolle

+ 4-

+ bis ++

+ bis ++

± bis +

+ bis ++

reichliches Wachstum gutes Wachstum ziemlich gutes Wachstum schwaches Wachstum kein Wachstum

Die durch den Stamm T-1124 gebildeten Antibiotika sind sog. Makrolld-Antlbiotika, aber der einzige Stamm von Mlcromonospora, von dem bisher bekannt ist, daß er ein Makrolld-Antiblotlkum bildet, ist Micromonospora W-847, dessen Fähigkeit, Megalomicine zu bilden, in der holländischen Patentanmeldung 68 07 363 und in The Journal of Antibiotics, Band 22 (Nr. 6). Seite 253 ff. (1969) beschrieben wurde. Dieser bekannte Stamm der Gattung Micromonospora wächst auf Glucose-Asparagin-Agar und Bennel-Agar nur schlecht, bildet auf Tyrosin Agar ein braunes lösliches Pigment und ist im wesentli-

chen unfähig, auf Medien zu wachsen, die Cellulose, Galactose oder Raffinose als einzige Kohlenstoffquelle enthalten. Im Gegensatz hierzu zeigt der Stamm T-1124 gutes Wachstum auf den oben genannten Medien ohne Pigmentbildung. Der letztgenannte Stamm ist somit vom bekannten Stamm Micromonospora W-847 verschieden. Hinsichtlich der mikrobiologischen Eigenschaften des Stamms T-1124 läßt ein Vergleich mit »Bergey's Manual of Determinative Bacterilogy«, 7. Auflage (herausgegeben von The Williams & Wilkins Co. 1957), S.A. Waksman »Aktinomycetes«, Band 2 (herausgegeben von The Williams & Wilkins Co. 1961) usw. darauf schließen, daß der Stamm T-1124 mit Micrcmonospora chalcea verwandt ist. Der Stamm ist somit aerob, und seine sporentragenden Hyphen sind verhältnismäßig lang und nicht stark verzweigt. Außerdem bildet der Stamm kein Luftmycel. In dieser Hinsicht ähnelt er Micromonospora chalcea. Der Stamm ähnelt ferner Micormonospara chalcea insofern, als er Milch koaguliert und peptonisiert. Stärke hydrolysiert, Chitin zersetzt und Saccharose invertiert.

Während jedoch Micromonospora chalcea Nitrate reduziert, Gelatine verflüssigt und Cellulose schnell zersetzt, reduziert der Stamm T-1124 Nitrate nicht. Er wächst nicht auf Gelatine und zersetzt Cellulose nicht, obwohl er darauf wächst. Angesichts der vorstehenden Beobachtungen wurde der Stamm T-1124 als Micromonospora chalcea var. izumensis, d. h. als Variant von Micromonospora chalcea bezeichnet.

Der Stamm T-1124 ist beim Institute for Fermentation, jo Osaka (Japan) unter der Nr. IFO-12988 hinterlegt worden.

Der Mikroorganismus, der Juvenimicin A₁ bildet und zur Gattung Micromonospora gehört, wird in einem Medium kultiviert, das Quellen von assimilierbarem J5 Kohlenstoff, Quellen von verwertbarem Stickstoff und andere Nährstoffe enthält. Das Kulturmedium kann flüssig oder fest bein, jedoch ist ein flüssiges Medium vorteilhafter und zweckmäßiger. Am vorteilhaftesten ist die Submerskultur mit Bewegung durch Belüftung.

Im Medium für den Juvenimicin Aj bildenden Mikroorganismus werden Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff wie Glucose, lösliche Stärke, Saccharose und Dextrin und Stickstoffquellen, die durch den Mikroorganismus verwertbar sind, z. B. Maisquellwasser, Polypepton, rohes Sojabohnenmehl und Baumwolisaatmehl, sowie die üblicherweise für die Kultivierung von Mikroorganismen verwendeten anorganischen Salze verwendet. Besondere Schwermetallsalze, z. B. ElsendU-sulfat und Magnesiumsulfat, oder ein Antischaummittel können nach Bedarf zugesetzt werden.

Die Kultivierungsbedingungen, z. B. die Temperatur, die Bebrütungsdauer und der pH-Wert des Mediums, werden so gewählt, daß der verwendete Mikroorganismus wachst und die Bildung von Antibiotika maximal ist. Beim Stamm Micromonospora chalcea var. Izumensis IFO-12988 beträgt die Kultlvlsrungszelt vorteilhaft 2 bis 7 Tage. Das Medium wird vorzugsweise bei einem pH-Wert zwischen etwa 5 und 8 gehalten, und die Bebrütungstemperatur liegt zwischen etwa 20 und 45° C und bo zur Erzielung bester Ergebnisse zwischen 27 und 34" C. Dabei ist 7u bemerken, daß der Stamm IFO-12988 ein Gemisch antlbloiischer Substanzen - als »Juvenlmycln« bezeichnet - produziert. In dem auch das Juveniimycin A, enthalten Ist. t>5

Die Isolierung des Juvenimicin Ai au., der Fermentationsbrühe kann nach den Methoden erfolgen, JIe bisher zur Gewinnung der Metabollten eines Mikroorganismus aus einer Fermentationsbrühe angewandt wurden. Beispielsweise kann unter Wahrnehmung des Vorteils, daß die Antibiotika dieser Klasse basische fettlösliche Substanzen sind, die Abtrennung nach Methoden, bei denen diese Eigenschaften ausgenutzt werden, erfolgen.

Da diese Antibiotika vorwiegend in der flüssigen Phase der FermentatioRsbrühe angehäuft werden, kann die Brühe zuerst filtriert werden, worauf die aktiven Bestandteile mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel aus der filtrierten Brühe oder aus dem Filtrat extrahiert werden können. Beisp'elsweise wird die Fermentationsbrühe bei pH 7 bis 10 in Gegenwart von etwa 3 bis 5 Gew.-»,, Diatomeenerde als Filterhilfsmittel gut gerührt und dann filtriert. Das erhaltene Filtrat wird mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, das mit Wasser nicht oder nicht vollständig mischbar ist, z. B. mit einem Ester einer niederen Fettsäure (z. B. Ethylacetat und Amylacetat), einem aromatischen Kohlenwasserstoff (z. B. Benzol und Toluol), einem chlorierten Kohlenwasserstoff (z. B. Methylenchlorid und Chloroform), einem Keton (ζ. B. Methylisobutylketon und Methylethylketon), einem Alkohol (z. B. n-Butanol und Isoamylalkohol) oder einem Gemisch von zwei oder mehreren dieser Lösungsmittel.

Die aktiven Bestandteile können an einem Adsorptionsmittel wie Aktivkohle, kolloidales Siliciumdioxyd, einem schwach sauren Kationenauslauschharz oder einem stark sauren Kationenaustauschharz adsorbiert und dann mit einem geeigneten Lösungsmittel eluiert werden.

Der auf diese Weise erhaltene Extrakt wird mit einer sauren wäßrigen Lösung, z. B. einer Pufferlösung, die einen pH-Wert von etwa 2 bis 6 hat, oder einer verdünnten anorganischen Säure, die einen pH-Wert von 3 bis 6 hat, weiter extrahiert, wobei die aktiven Bestandteile in die wäßrige Phase überführt werden. Diese wäßrige Lösung wird abgetrennt und dann durch Alkalizusatz auf pH 7 bis 10 eingestellt, wodurch die aktiven Bestandteile erneut in eine neu zugesetzte, mit Wasser nicht oder nicht vollständig mischbare organische Lösungsmlltelphase überführt werden können. Die organische Lösungsmittelschicht wird abgetrennt, mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt. Hierbei wird das Juvenimicin in Form eines Pulvers erhalten.

Aus diesem pulverförmigen Juvenimicin können die jeweils gewünschten Antibiotika nach Methoden wie Adsorptionschromatographie, Gelfiltration, Adsorption an Ionenaustauschern usw., die allein oder in Kombination angewandt werden, abgetrennt werden. Als Adsorptionsmittel eignen sich beispielsweise Kieselgel, Aluminiumoxyd, Aktivkohle, kolloidales Siliciumdioxyd u.dgl. Für die Gelfiltration eignet sich Sephadex LH-20. Als Ionenaustauscherharze eignen sich Amberlite IRC-50, Amberllte IR-120 und Dowex 50. Es Ist zweckmäßig, als Lösungsmittel, das als Elutionsmittel im Falle der Verwendung von Kieselgel als Adsorptionsmittel dient, ein Gemisch eines niedrigpolaren Lösungsmittels (z. B. Chloroform oder Ethylacetat) und eines polaren Lösungsmittels (z. B. Methanol oder wäßriges Ammoniak) zu verwenden. Bei Verwendung von Aktivkohle als Adsorptionsmittel eignen sich beispielsweise wäßriges Methanol, Aäßriges Aceton, Methanol, Aceton, Ethylacetat und Chloroform als Elutionsmittel. Ethanol 1st besonders zu empfehlen, wenn Sephadex LH-20 als Adsorptionsmittel verwendet wird.

Die charakteristischen Eigenschalten des Juvenimicin Ai sind nachstehend genannt.

541 ±60 (in ClI,,);

562 ±60; m/e = 581;

0,57 ±0,1; ±0,1;

Juvenimicin Ai (hergestellt gemäß Beispiel 3):

1) Elementaranalyse

C: 62,97 ± i,0; II: 8,62 ±0,5; N: 3,00 ±0,5;

2) Spezifische Drehung:

{*}]} = -17,6° ± 10° (C = 0,29-',, in ClICI₁);

3) Molekulargewicht:

a) Dampfdruck-Osmosemethode:

b) Titrationsmethode:

c) Höchste Massenzahl:

4) pKa' = 8,4 (in 66"oigem Dimethylformamid);

5) Farbreaktion:

a) Erythromyclntest: negativ;

b) Carbomyclntest: negativ;

c) Dragendorff-Reaktion: positiv;

6) Löslichkeiten:

Löslich in Benzol, Chloroform, Ethylacetat, Dimethylformamid, Ethanol und wäßrigen Säurelösungen; unlöslich In Petrolether, n-llexan oder neutralem Wasser

7) Rf-Werte auf dem Papierchromatogramm: Papier: Toyoroshi Nr. 51; entwickelt mit

a) wäßriger 0,05 n-Ammoniaklösung, 0,74 ±0,1; gesättigt mit Methylisobutylketon:

b) Gemisch von Methyllsobutylketon 0,68 ±0,1; und Methylethylketon (4:1)

c) Methyllsobutylketon

d) M-15-Phosphatpuffer, gesättigt 0,60 mit n-Butylacetat (pH 8,0) (das Papier wird mit 2% flüssigem Paraffin imprägniert)

e) Gemisch von Benzol und Cyclo- 0,02 ±0,02; hexan (1:1), gesättigt mit Formamid (das Papier wird mit einem Gemisch von Formamid und Methanol (1:1) imprägniert)
0 wäßrige 0,05 n-Ammoniaklösung, 0,7 ±0,1; mit n-Butylethylketon gesättigt

8) Rf-Werte bei der Dünnschichtchromatographie:

a) Adsorptionsmittel: Kieselgel 0,7 ±0,05; Elutlonsmittel: Gemisch von Chloroform, Methanol und 7%lger wäßriger Ammoniaklösung (.40: 12:20)

b) Adsorptionsmittel: Aluminium- 0,49 ±0,05; oxyd

Elutionsmittel: Ether

c) Adsorptionsmittel: Aluminium- 0,65 ±0,05; oxid

Eiiitiönsmittel: Gemisch von Benzol und Aceton (4:1)
g) Ultraviolettabsorption:

SS^H = 240 ± 2 τημ (Ei^% _cm = 230 ± 30); 10) Infrarotspektrum: mit folgenden hauptsächlichen Absorptionsbanden als Wellenzahl (cm"¹): 3450 (stark), 2960 (stark), 1725 (stark), 1695 (mittel), 1625 (stark), 1458 (mittel), .1383 (mittel), 1314 (mittel), 1276 (mittel), 1250 (schwach), 1180 (stark), 1167 (stark), 1111 (stark), 1072 (stark), 1047 (stark), 1027 (mittel), 983 (stark), 966 (Schulter), 932 (schwach), 896 (mittel), 869 (schwach), 846 (schwach), 834 (schwach), 792 (mittel), 755 (schwach), 713 (schwach).

Das Antibiotikum »Juvenimicin A3« gemäß der Erfindung wurde nachstehend mit bisher unbekannten Antibiotika verglichen. Von den durch Mlcromonospora

gebildeten Antibiotika sind lediglich die Megalomicine A, B, C, und C₂ als Makrolid-Antlbiotlka bekannt. Die letzteren werden durch Micromonospora sp. W-847 (NRRL-3274) (siehe holländische Patentanmeldung 68 07 363), gebildet. Juvenimicin unterscheidet sich davon wesentlich In der Elementaranalyse, Im Infrarotspektrum und in der spezifischen Drehung von den Megalomlcinen, die ein grölleres Molekül haben als Juvenimicln und die zwei Stickstoffatome Im Molekül enthalten, während Juvenimicin nur ein Stickstoffatom im Molekül enthalt.

Von den bekannten Makrolid-Antiblotika haben CIrramycln A (A, bis A,) und R-491-A die maximale UV-Absorption bei 240 μηι, jedoch werden diese Antibiotika sämtlich durch Mikroorganismen der Gattung Streplomyces gebildet. Juvenimicin Ai unterscheidet sich jedoch deutlich von Cirramycin Ai (Koshiyama und Mitarbeiter, Journal of Antibiotics, Japan, (A) Band 22, Seite 61 (1969)) In der Löslichkeit, im Molekulargewicht, in der Infrarotabsorption, im Erythromycintest, Carbomycintest usw. und auch von Cirramycin A₂, Ai, A₄ und A₅ in den Rf-Werten der Papierchromatographie. Das Antibiotikum R-491-A (Ishida und Mitarbeiter, Vortrag bei der Tagung des Tohoku Branch der Pharmaceutical Society of Japan, gehalten im Dezember 1964) unterscheidet sich deutlich von Juvenimicin A in der Infrarolabsorplion.

Aus den vorstehend genannten Beobachtungen wurde geschlossen, daß Juvenimicin Ai ein neues Antibiotikum ist.

Die antimikrobischen Spektren sind in Tabelle 2 genannt. Für die Messung der hemmenden Mindestkonzentration wurden übliche Bakterien als Testorganismen 18 Stunden bei 37'C auf Boulilon-Agar bebrütet. Säurefeste Bakterien wurden auf Glycerin-Bouillon-Agar 40 Stunden bei 37'C bebrütet. Im Falle der phytotoxischen Bakterien wurde Glucose-Bouillon-Agar als Versuchsmedium verwendet.

Tabelle 2

Test-M i kroorgan ism us	Hemmende Mindestkonzentration,	5
	A3	10
Escherichia coli	100
Proteus vulgaris	0,5
Pseudomonas aeruginosa	>100
Staphylococcus aureus	0,1
Staphylococcus aureus (gegen Oleandomycin und Erythromycin resistenter Stamm)	0,1
Bacillus subtilis	0,2
Bacillus cereus	0,05
Bacillus brevis	0,05
Sarcina lutea	>100
Micrococcus flavus	>100
Mycobacterium avium	>100
Mycobacterium avium (Streptomycin-resistent)
Mycobacterium avium (Neomycin-resi stent)

Fortsetzung

Test-Mikroorganismus

Hemmende

Mindest konzentrat ion,

jig/ ml

Mycobacterium sp. 607 > 100

Mycobacterium phlei 100

Mycobacterium smegmatis 100

Xanthomonas oryzae < 1,0

Staphylokokken sind pyogene oder eiterbildencie bakterien. Sie pflegen umgrenzte Läsionen beispielsweise in Form von Abszessen u. dgl. hervorzurufen, die häufig in der Haut auftreten. Staphylokokken sind die Ursache von Furunkeln und Karbunkeln und anderen üblichen Wundinfektionen. Das neue Produkt gemäß der Erfindung Ist wertvoll für örtlich anzuwendende Zubereitungen für die Behandlung dieser Art von Infektionen bei Warmblütern (Hunde, Katzen, Menschen usw.).

Infolge der oben genannten bakteriziden und bakteriostalischen Eigenschaften eignet sich das neue Produkt gemäß der Erfindung beispielsweise zur Desinfektion von Geräten in Krankenhäusern usw., die im allgemeinen pathogenen gramposlliven oder gramnegativen Bakterien ausgesetzt sind, die empfindlich gegenüber den oben genannten Produkten sind. Die Desinfektion erfolgt durch Auftragen oder Aufsprühen einer Lösung (z. B. in Methanol oder Ethanol), die folgende Komponente enthält: Juvenimicin Aj, 20 ng/mi.

In den folgenden Beispielen beziehen sich die Prozentsätze bei der Angabe der Zusammensetzung der Kulturmedien auf Gewicht/Volumen, d.h. g/100 ml. Im übrigen sind alle Prozentsätze auf das Gewicht bezogen, falls nicht anders angegeben.

Beispiel 1

(1) Je 30 ml eines Impfkulturmediums (pH 7,0), bestehend aus 5,0% löslicher Stärke, 0,5% Glycerin, 1,0% Sojabohnenmehl, 0,5% Fleischextrakt, 0,01% ElsendD-suirat, 0,1% Magnesiumsulfat, 0,5% Kaliumcarbonat, 0,05% Polyoxypropylentriol mit einer OH-Zahl von 56 als Antischaummittel und Wasser, wurden In 200-ml-Kolben sterilisiert und mit einer Schlaufenmenge Mlcromonospora chalcea var. Izumensis lFO-12988 von einer Agar-Schrägkultur geimpft. Die geimpften Kulturen wurden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung 40 Std. bei 37° C bebrütet. Die Impfkulturen wurden In 500 ml des sterilisierten Impfkulturmediums der gleichen Zusammensetzung In 2-1-Sakaguchl-Kolben überführt, worauf weitere 40 Stunden bei 28° C auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung bebrütet wurde.

Die impfkultur wurde In einer Menge von 1,5 1 In einen 50-1-Behälter aus nichtrostendem Stahl überführt, der 301 eines sterilisierten Hauptkulturmediums (pH 0,7) enthielt, das aus 5,0« löslicher Stärke, 3,0% Malsquellwasser, 0,5« Fleischextrakt, 0,01« Elsen(II)-sulfat, 0,1« Magnesiumsulfat, 1« Kaliumcarbonat, 0,05« des obengenannten Polyoxypropylentrlols als Antischaummittel und Wasser bestand. Das Gemisch wurde bei 28° C unter Belüftung mit 301 Luft/Minute und unter Rühren mit 280 UpM 114 Stunden bebrütet. Der Fortgang der Fermentation ergibt sich aus der folgenden tabelle:

Bebrütungsdauer
(Sld.)

pH-Wert der Brühe

Wirksamkeit *) (y/ml)

7,20	-
7,50	-
6,70	0
7,30	0
7,65	5,0
7,50	13,5
7,55	18,0
7,95	21,0
8.33	27.0
8,25	25,0

18

30

42

54

66

78

90

102

114

♦) Ermittelt nach der Papierscheibenmelhode mit Azotobacter vinelandii als Tesl-Mikroorganismus.

Die auf diese Welse erhaltene Kulturbrühe (23,5 1) wurde mit 75Og Diatomeenerde als Filterhilfsmittel filtriert. Das Flltrat wurde mit einer wäßrigen 2n-Natrlumhydroxydlösung auf pH 9,0 eingestellt, worauf 2 kg Natriumsulfat zugesetzt wurden. Nach vollständiger Auflösung des Natriumsulfats wurde das Flltrat zweimal mit je 11 I Ethylacetat extrahiert. Die Lösungsmittelschicht wurde mit Wasser gewaschen, dehydratislert und unter vermindertem Druck auf 1 1 eingeengt. Das Konzentral wurde mit 3 1 verdünnter Salzsäure (pH-Wert etwa 3 bis 4) ausgeschüttelt, um die wirksamen Bestandteile In die wäßrige Schicht zu überführen. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt, erneut auf pH 9 eingestellt und zwelmal mit je 11 Ethylacetat extrahiert. Mit den so erhaltenen Extrakten wurde die Überführung mit Säure und die Extraktion mit Ethylacetat wiederholt. Der endgültige Ethylacetatextrakt wurde mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei 450 mg eines rohen Pulvers erhalten wurden. Das Pulver wurde in 10 ml Ethanol gelöst und die Lösung der Säulenchromatographie an 150 ml Scphadex LH-20 unterworfen, wobei 165 mg rohes Produkt erhalten wurden. (2) In 20 ml Ethylacetat wurden 1,8 g rohes Produkt,

4-, das auf die oben beschriebene Welse erhalten worden war, gelöst. Die Lösung wurde der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel Hf 254 (40 χ 40 cm) unterworfen, wobei ein Gemisch von Chloroform, Methanol und 7%igem wäßrigem Ammoniak (Volumenverhältnis 40 : 12 : 20) als Entwickler verwendet wurde. Das Kieselgel wurde bei einem Rf-Wert von etwa 0,7 entnommen und mit Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, dehydratislert und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei 650 mg Juvenimicin A₃ erhalten wurden.

Beispiel 2

(1) Eine Impfkultur wurde auf die Im Beispiel 1 beschriebene Welse In einem 2-1-Sakaguchl-Kolben hergestellt und In 301 eines sterilisierten Impfkulturmediums der gleichen Zusammensetzung in einem 50-1-Behälter aus nichtrostendem Stahl geimpft. Die Kultivierung wurde 48 Stunden bei 28° C unter Belüftung und Rühren auf die in Beispiel 1 beschriebene Welse durchgeführt. Die Kulturbrühe wurde als Impfkultur verwendet.

Die impfkultur wurde in 1001 eines sterilisierten

Hauptkuiturmedlums (pH 7,0) überführt, das aus 5,0« löslicher Stärke^ 3,0« Malsquellwasser, 0,5« Flelschex-

Ii

trakt, 0,05% ElsendO-sulfat, 0,1% Magnesiumsulfat, 0,5% Kaliumcarbonat, 0,05% des oben genannten Polyoxypropylentrlols als Antischaummittel und Wasser bestand und In einem 200-1-Behälter aus nichtrostendem Stahl enthalten war. Die Fermentation wurde 90 Stunden bei 28⁰C unter Belüftung mit 1001 Luft/Minute und unter Rühren bei 150 UpM durchgeführt. Der Verlauf der Fermentation ergibt sich aus der folgenden Tabelle:

Bebrütungsdauer
(Std.)

pH-Wert der
Brühe

Wirksamkeit (γ/ml)

7,05	-
7,05	-
7,10	20,0
6,60	40,0
7,28	70,0
7,30	95,0
7,55	100,0
7,90	100,0

Die auf diese Welse erhaltene Kulturbrühe (58 I) wurde mit 1,5 kg Diatomeenerde als Filterhilfsmittel filtriert. Pas F.'ltrat wurde auf pH 9 eingestellt und auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet, d. h. unter Verwendung von Ethylacetat und verdünnter Salzsäure, wobei 4,5 g eines rohen Pulvers erhalten wurden. Das Pulver wurde mit 300 ml Sephadex LH-20 gereinigt, wobei 2,9 g pulverförmiges rohes Produkt erhalten wurden. Die Weiterverarbeitung des rohen Produkts erfolgt in der bereits beschriebenen Weise.

(2) 45 1 einer Kulturbrühe, die auf die oben beschriebene Weise erhalten worden war, wurde auf pH 9 eingestellt und zweimal mit je 25 ml Elhylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und auf die in Beispiel 1 beschriebene Welse aufgearbeitet, wobei 4,0 g eines rohen Pulvers erhalten wurden. Das Pulver wurde an Kieselgel unter Verwendung des In Beispiel 1 (2) beschriebenen Entwicklers chromatographlert, wobei 1,4 g Juvenlmicln Aj erhalten wurden.

Beispiel 3

Der In Beispiel 1(1) beschriebene Versuch wurde wiederholt mit dem Unterschied, daß 30 I eines sterilisierten Hauptkulturmediums (pH 7) der folgenden Zusammensetzung verwendet wurden: 5,0% lösliche Stärke, 1% Maisquellwasser, 1% Baumwollsaatmehl, 0,5% Fleischextrakt, 0,5% Peptor., 0.05% E!seri(!!)-su!fat, 0,1% Magnesiumsulfat, 1% Kaliumcarbonat, 0,05% des in Beispiel 1 genannten Polyoxypropylentriols und Wasser. In diesem Fall verlief die Fermentation wie folgt:

Bebrütungsdauer	pH-Wert der	Wirksamkeit
(Std.)	Brühe	(γ/ml)
0	7,10	_
18	7,25	-
30	7,50	0
42	6,85	0
54	7,00	0
66	7,12	5

Bebrütungsdauer
(Sid.)

pH-Wert der Brühe

Wirksamkeit (γ/ml)

7,23
7,30
7,00
7,00

8,5 17,5 18,5 29

Die von mehreren Ansätzen erhaltenen Kulturbrühen wurden vereinigt, und 100 I der vereinigten Brühe wurden filtriert. Das Flltrat wurde auf pH 8,5 eingestellt und mit der Hälfte seines Volumens an Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und zweimal mit jeweils dem halben Volumen an verdünnter Salzsäure, die einen pH-Wert von 3 hatte, extrahiert, die wäßrige Schicht wurde mit wäßriger 2n-Natrlumhydroxydlösung auf pH 8,5 eingestellt und dann zweimal jeweils mit dem halben Volumen Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, dehydratislert und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde in 40 ml Ethanol gelöst und die Lösung der Säulenchromatographie an 600 ml Sephadex LH-20 unterworfen, wobei 450 mg pulverförmiges rohes Produkt erhalten wurden.

100 mg des Pulvers wurden der Säulenchromatographie an 5 g Aluminiumoxid unterworfen, worauf wie folgt eluiert wurde:

mit einem Gemisch von Benzol und Aceton (VoIumenverhältnls 4 : 2). wobei 13 mg Juvenlmictn A₁ erhalten wurden.

Beispiel 4

Der In Beispiel 1(1) beschriebene Versuch wurde wiederholt mit dem Unterschied, daß 10001 eines sterilisierten Hauptkulturmediums (pH 7,0) der folgenden Zusammensetzung verwendet wurden: 1% lösliche Stärke, 4% Saccharose. 2% gereinigtes Baumwollsaatmehl, 0,5% Fleischextrakt, 0,5% Pepton, 0,05% ElsendDsulfat, 0,1% Magnesiumsulfat, 1% Kaliumcarbonat, 0,5% des In Beispiel 1 genannten Polyoxypropylentriols und Wasser. Die Kultivierung wurde unter Belüftung mit 1000 l/Minute durchgeführt. Die Wirksamkeit der Kluturbrühe beträgt nach einer Kultivierungsdauer von 90 Stunden etwa 40 Mlkrogramm/ml und erreicht nach einer Bebrütungsdauer von 1!4 Stunden 80 Mikrogramm/ml.

Insgesamt 11001 der In dieser Weise erhaltenen Kulturbrühe wurden auf pH 8,5 eingestellt und mit 5501 Ethylacetat extrahiert. Die Lösungsmittelschicht wurde abgetrennt, mit Wasser gewaschen, dehydratislert und unter vermindertem Druck suf etwa 301 eingeengt. Zürn Konzentrat wurden 30 1 verdünnte Salzsäure (pH 3) gegeben. Das Gemisch wurde gerührt, worauf die wäßrige » Schicht abgetrennt wurde. Die wäßrige Schicht wurde auf. pH 8,5 eingestellt und zweimal mit je 15 1 Ethylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, mit Wasser gewaschen, dehydratislert und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei 15 g pulverförmiges rohes Produkt erhalten wurden.

Das rohe Pulver wurde in 3 1 Ethylacetat gelöst. Die Lösung wurde dreimal mit je 11 einer Vis-molaren Phosphatpufferlösung (pH 6,2) extrahiert.

Die Ethylacetatschlcht wurde dann mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (Teilchengröße weniger als 0.08 mm) unterworfen, worauf mit einem Gemisch von

Chloroform, Methanol und einer 7%lgen wäßrigen Ammoniaklösung (Volumenverhältnis 40:70:20) entwickelt wurde, um die einzelnen Komponenten wieder abzutrennen. Jede Komponente wurde unter einer Ultraviolettlampe nachgewiesen und mit !allylacetat extra- "> hlert. wobei 0,8 g Juvenlmicln Ai erhalten wurden.

Claims (1)

10

Patentanspruch:

Juvenlmicin Aj, gekennzeichnet durch folgende Parameter

a) Elemeniaranalyse:

C : 62,97 ± 1,0; H : 8,62 ±0,5; N : 3,00 ± 0,5;

b) Spezifische Drehung:

[a]% - -17,6° ± 10° (c = 0,29% in CHCl₁);

c) Molekulargewicht:

aa) Dampfdruckosmose: 541 ±60 (in CjH,,); bb) Titrationsmethode: 562 ± 60; cc) höchste Massenzahl: m/e = 581;

d) pKa'-Wert: 8,4 (in 66%igem Dimethylformamid);

e) Farbreaktion:

aa) Erythromycintest: negativ; bb) Carbomycintest: negativ; cc) üragendorffreaktion: positiv;

f) Löslichkeiten: löslich in Benzol, Chloroform, ^ Ethylacetat, Dimethylformamid, Ethanol und wäßriger Säurelösung, unlöslich in Pelrolether, n-Hexan und neutralem Wasser;

g) Rf-Werte, ermittelt durch Dünnschlchtchromatographle an Kieselgel und Elution mit einem ,₅ Gemisch von Chloroform, Methanol und 7%lger * wäßriger Ammoniaklösung (40 : 12 : 20): Rf = 0,7 ±0,05;

h) Ultraviolettabsorption:

λ S.T = 240 ± 2 m (Ei c_m = 230 .t 30);

30

I) hauptsächliche Infrarotabsorptionsbanden in Wellenzahlen (cm¹) nach der KBr-Scheibenmethode:

3450, 2960, 1725, 1695, 1625, 1458, 1383, 1314, 1276, 1250, 1180, 1167, 1111, 1072, 1047, 1027, _!5 983, 966, 932, 896, 869, 846, 843, 792, 755, 713.