DE2034245A1

DE2034245A1 - Neue Antibiotika und ihre Herstellung

Info

Publication number: DE2034245A1
Application number: DE19702034245
Authority: DE
Inventors: Motoo Toyonaka Hatano Kazunori Yamana Hideo Osaka Kishi Toyokazu Nara Higashide Eiji Takarazuka Hyogo Shibata, (Japan)
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1969-07-11
Filing date: 1970-07-10
Publication date: 1971-02-25
Also published as: DE2034245C2; FR2059505A1; US3767793A; GB1321436A; FR2059505B1

Description

. - PATENTANWÄLTE

D.R.-IN.G. VON KREISLER DR.-ING. SCHÖNWALD

DR-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VOisJ KREISLER DIPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖ'PSCH

KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 6.7.1970 Kl/Ax

Takeda Chemical Industries, Ltd»,

27, Doshomachi 2>-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan).

Die Erfindung "betrifft neue Antibiotika "Juvenimicin'¹ und ihre Herstellung.

Es wurde gefunden, daß eine Gruppe von neuen antibiotischen Substanzen von einem zur Gattung Micromonospora gehörenden Mikroorganismus gebildet und in der Kulturbrühe angehäuft wird, und daß die einseinen Mitglieder der Gruppe der neuen Antibiotika in ihren Eigenschaften sowie in ihren chemischen Strukturen eng miteinander verwandt sind, daß sie jedocih aus der Kulturbrühe getrennt als Einzelverbindungen oder als Gemisch in jedem gewünschten Reinheitsgrad iaoliert werden können. Die Gruppe der neuen Antibiotika ist mit dem Sammelbegriff »Juvenimicin¹¹ bezeichnet worden·

Es wurde, ferner gefunden, daß Juvenimicin als aktive Bestandteile die Antibiotika enthält, die ebenfalls als "Juvfmimiein A-" (früher von der Anmelderin als «Antibiotikum T-1124-A" bezeichnet), »Juvenimicin A₂" (früher »Antibiotikum T-1124-B"), «Juveniraicin A₃" (früher !"Antibiotikum T-1124-0"), '»Juvenimioin A₄" (früher »Antibiotikum φ-1124-D»), "Juveniraicin Bj", "Jiiveniiaioin Bg", »Juvenimicin Β," und "Juveniraioin B^"

H Ö 8 β · / 1 A 4-8 ORIGINAL INSPECTED

bezeichnet worden sind. In dieser Beschreibung und in den Ansprüchen wird daher jeder dieser aktiven Bestandteile oder ein Gemisch von zwei oder mehr dieser Bestandteile einfach mit äem Sammelbegriff "Juvenimieln" bezeichnet« falls nicht anders angegeben.

Die Erfindung umfaßt demgemäß das neue und wertvolle Juvenimicin als Gesamtgemisch oder in Form der einzelnen Mitglieder oder von Gemischen bestimmter Mitglieder» ein Verfahren zur Herstellung der Antibiotika "Juveniraicin" durch Züchtung von Mikrobien sowie Verfahren zur Isolierung des Produkts Juvenimicin als Gesamtgemisch oder in Form der Einzelmitglieder oder in Form von Gemischen der Einzelmitglieder.

Die Aufgabe^ die die Erfindung sich stellt, wird gelöst durch Kultivierung eines Juvenimicin bildenden Mikroorganismus der Gattung Mi<£sromonospora in einem geeigneten Kulturmedium, das eine Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff und eine Quelle von verwertbarem Stickstoff enthält, bis Juvenimicin in der Kulturbrühe in wesentlichen Mengen angehäuft worden ist, und Isolierung der Produkte.

Für die Zwecke der Erfindung werden Mikroorganismen verwendet, die zur Gattung Micromonospora gehören und Juvenimicin zu bilden vermögen. Zu diesen Mikroorganismen gehört beispielsweise der Stamm $-1124, der von einer Bodenprobe des Bezirks Isumi von Osaka (Japan) isoliert wurde. Dieser Stamm hat die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften:
1) Morphologische Eigenschaften

Das. vegetative Mycel ist gut entwickelt and verzweigt, jedoch ist kein Septum festzustellen. Der Durchmesser beträgt 0,4 bis 0,8 u. Auf verschiedenen Medien ist das Wachstum ziemlich gut, jedoch wire! kein Luftmyoel gebildet. Eine einzelne Spore wird an üqt Spitze der sporentragenden Hyphen gebildet, die-vom vegetativen ■

1 09809/134B - original inspected

y 3 -

Mycel abzweigen. Die sporentragenden Hyphen haben gewöhnlich eine länge von 1 bis 2 ii, gelegentlich jedoch von 3 bis 6 n. Zahlreiche Sporen werden gebildet, und jede Spore ist kugelförmig bis oval oder elliptisch und hat eine Größe von 0,5 bis 1 α. χ 0,5 bis 1,3 ja und eine glatte Oberfläche·

2) Eigenschaften der Kultur

Das Wachstum ist langsamer als bei Streptomyces im allgemeinen. Das vegetative Myeel ist in der Anfangsphase des Wachstums farblos» jedoch später orange-gelb bis orange-braun. Auf gewissen Medien zeigt es ein schwarzes, feucht glänzendes Wachstum.

Auf fast allen Medien wird kein lösliches Pigment gebildet. Der Pjj-Wert für das Wachstum liegt zwischen 5 und Das Optimum ist ungefähr der Neutralpunkt. Die Temperatur für das Wachstum "beträgt etwa 20 bis 45°C und optimal 30 bis 37⁰C.

In der folgenden Beschreibung bedeutet "Rdg." die entsprechende Parbbezeichnung aus Ridgway "Color Standard and Nomenclature¹¹. Die Beobachtungen wurden an Kultivierungen bei 28⁰C für 14 Tage gemacht, falls nicht anders angegeben. Die Abkürzungen ^HW^H, "R" und "LP" bedeuten "Wachstum¹*, "Rückseite" und "lösliches Pigment".

a) Czapek-Agart

W.j mäßig, Pinkish Buff (Rdg. XXIX, 17^M-d) bis

Dark Olive (Rdg. XL, 21"· - m). R: Dark Olive (Rdg.XL, 21»» - m).

b) Ozapek-Lösungi

W.; mäßig, sinkt zu Boden, farblos mit einem leichten

Stich nach Seashell Pink (Rdg.XIV, 11' - f). LP: nicht vorhanden.

c) Glncoae-Gzapek-Agar;

W.: schlecht, Wood Brown (Rdg. XL, 17^MI) R.t farblos bis Vinaceous-Fawn (Rdg. XL, 13^MI - b). 109809/1345

LPi nicht vorhanden.

d) Glycerin-Czapek-Agar:

W.: spärlich, farblos "bis Vinaceous Buff (Rdg. XL,

17^Mt - d). R..: farblos
LP: nicht vorhanden

e) Glucose~Asparagin-Agar:

W.: mäßig, Cinnamon Buff (Rdg. XXIX, 17" - b) bis

Olive-Brown (Rdg. XL, 17"' - k). R·: Deep Olive (Rdg. XL, 21"' - k) bis schwarz LPi nicht vorhanden

f) Nähragar;

W.: schlecht, farblos bis Pinkish Buff (Rdg.XXIX,

17^H-d).
R.ί farblos
LPj nicht vorhanden

ß) Glucose-Mhragar;

W. j mäßig, faltig, Pinkish Buff (Rdg." XXIX, 17" - d) bis Tawny Olive (Rdg. XXIX, 17^M-i).

R.: farblos

LP: nicht vorhanden h) Glvcerin-Nähragar:

W.: spärlich, farblos bis Pinkish Buff (Rdg.XXIX,

17"-d) '..,■'■:

R.: farblos
LP: nicht vorhanden

i) Stärke-Agar:

W.: mäßig, dringt in das Medium ein, farblos bis Tawny Olive (Rdg. XXIX, 17"-i) oder Brownish Olive (Rag. XXX, 19"-m) mit schwarzen Flecken«

R.: Pale Pinkish Buff (Rdg. XXIX, 17^H-f). LP: nicht vorhanden .1) Reines Agar:

W,: nicht vorhanden oder sehr spärlich, farblos LP: nicht vorhanden.

109809/1346

- 5 - V- ■

k) Hefeextrakt-Affar:

W.: reichlich, lichenös, faltig, Snuff Brown (Rdg. XXIX, 15"-k) bis Bister (Rdg. XXIX, 15"-m) oder schwarz.

R.r Sayal Brown (Rdg.XXIX, 15^M-i). IiPi nicht vorhanden, einen Monat später zuweilen schwach braun.

1) Kartoffel-Stichkultur:

W,i reichlich, lichenös, faltig, Zinc Orange (Rdg.XV,

13') bis Snuff Brown (Rdg. XXIX, 15"-k). LP: schwach grau bis dunkel gräulich-braun.

m) Möhren-Stichkultur:

W.: spärlich, Zinc Orange (Rdg. XV, 13*)· LP: nicht vorhanden

n) Cellulose:

W.ί mäßig, Roman Sreen (Rdg. XVI, 23'-m), wird später . gräulich-schwarz.

Der Papierstreifen bleibt unzersetzt.

o) Calclummaleat-Agar:

W,: sehr schlecht, Dark Olive-Buff (Rdg. XL, 21"·)»

später Deep Olive (Rdg. XL, 21w'-k). R.s farblos
LP: nicht vorhanden

p) Tyrosin-Agar:

W.j sehr schlecht, farblos, später Olive Buff

(Rdg. XL, 21^M'-d). R.i farblos
LP: nicht vorhanden

q) Peptpn-Aflar:

W. ι Schlecht, Clay Color (Rdg. XXIX, 17") bis Saooardo'8 Umber (Rdg. XXIX, 17"-Ic), später Deep Olive (Rdg. XL, 21^M1^k).

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. Rj farblos
LP: nicht vorhanden

r) Hydrolyse von Stärke

Enzymzone/Wachsturns% one ι 27 bis 32 mm/9 bis 10 mm.

s) Lackmusmilch

W.: Ringform auf dem Glas, orangefarben, Koagulierung und Peptonisierung. Der p_H-Wert ändert sich von 6,0 bis 6,1.

t) LSffler-Hedium (bei 37⁰O);

W.: mäßig, Zinc Orange (Rdg. XV, 13^f)j Verflüssigung.

u) Gelatine-Stichkultur (1 Monat bei 24⁰C): W.: kein Wachstum

v) Nitratreduktion; negativ
v) Chitin: zersetzt

x) Diß Sporen widerstehen 1 bis 5 Minuten einer Temperatur von 80⁰C.

Die Kulturmerkmale bei 37⁰C sind ähnlich wie die oben beschriebenen Merkmale, außer daß das Wachstum üppiger ist und die Farben im allgemeinen dunkler sind oder ins Schwarze übergehen. ·

3) Ausnutzung von Kohlenstoffquellen

Die Beobachtungen nach der Methode von Pridham and Gottlieb (Journal of Bacteriology, Band 59, Seite 107 (1946)) sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

losses/mi

Tabelle 1

Kohlenstoff quelle	Kultivie rungstempe ratur . 28⁰C 37⁰C	Kohlenstoff quelle	Kultivierungs temperatur 28⁰C 37⁰C
Erythrit	-	Melibiose	++ ++
Adonit	■ ■- ■ -	Maltose	+++ ++
D-Sorbit		Saccharose	++ ++
Inosit		lactose	++ + bis ++
D-Mannit	- -	Raffinose	+ bis ++ +
Dulcit		Trehalose	++ ++
D-Xylose		Salicin	++ ++
L-Arabinose	- -	Esculiη	-
L-Sorbose	- -	Inulin	+ bis +
D-Galactose		Stärke	+++ +++
D-Glucöse		Na-Acetat	++ + bis ++
D-Pructose	+ +	Glycerin	-
D-Mannose Rhamnose	- -	Kontrolle	■ -■■■■■ -

+++s reichliches Wachstum
++! gutes Wachstum
+ι ziemlich gutes Wachstum
+: schwaches Wachstum
-: kein Wachstum

Die durch den Stamm T-1124 gebildeten Antibiotika sind sog. Makrolid-Antibiotika, aber der einzige Stamm von Micromonospora, von dem bekannt ist, daß er ein Makrolid-Antibiotikum bildet, ist Micromonospora W-847» dessen Fähigkeit, Megalomicine zu bilden, in der holländischen Patentanmeldung 68 07 363 und in The Journal of Antibiotics, Band 22 (Nr.6), Seite 253 ff. (1969) beschrieben wurde. Diese bekannten Stämme der Gattung Micromonospora wachsen auf Glucose-Asparagin-Agar und Bennet-Agar nur schlecht, bilden auf Tyrosin Agar ein braunes lösliches Pigment und sind im wesentlichen unfähig, auf Medien zu Wachsen, die Cellulose, Galactose oder Raffinose als einzige Kohlenstoffquelle enthalten. Im Gegensatz hierzu zeigt der Stamm T-1124 gutes Wachstum auf den oben ge-

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nannten Medien ohne Pigmentbildung«, Der letztgenannte Stamm ist somit von den bekannten Stämmen Micromono~ epora W-84-7 verschieden»

Hinsichtlich der mikrobiologischen Eigenschaften des Stamms 3M124 läßt ein Vergleich mit ⁹¹Bergey^ss Manual of Determinative Bacteriology's 7«»Auflage (herausgegeben von The Williams & Wilkins Co₉ 1957), S₀A₀ Waksman "Actinomycetes"j Band 2 (herausgegeben von The Williams & Wilkins Co« 1961) usw_e darauf schließen^ daß der Stamm T—1124 mit Micromonospora chalcea verwandt istο Der Stamm ist somit aerob,, und seine sporentragenden Hyphen sind, verhältnismäßig lang und nicht stark ver~ sweigt. Außerdem bildet der Stamm kein Luftmycelo In dieser Hinsicht ähnelt er Micromonospora chalcea_o Der Stamm ähnelt ferner Micromonospora chalcea insofern^ als er Milch koaguliert und peptonisiertp Stärke hydro™ lysiert, Chitin zersetzt und Saccharose invertierte

Während jedoch Micromonospora chalcea Mitrate reduziert„ Gelatine verflüssigt, und Cellulose schnell zersetzt_D reduziert der Stamm QM124 Nitrate nicht₀ Er wächst nicht auf Gelatine und zersetzt Cellulose nicht„ obwohl er darauf wächst· Angesichts der vorstehenden Beobachtungen wurde der Stamm T-1124 als Micromonospora chalcea var. izumensiSg d.h. als Variant νο.Ώ Micromonospora chalcea bezeichnete

Der Stamm T-1124 ist beim Institute for Fermentation Osaka (Japan) unter der Nr₀ IFO=I2988 hinterlegt worden«

Ebenso wie andere Actinomyceten wie Streptomyces unterliegen die Charakteristiken der Stämme von Micromonospora im allgemeinen der Mutation_s gleichgültig^ ob die Mutation spontan oder künstlich beispielsweise mit Röntgenstrahlen, Ultraviolettlicht oder Einwirkung von chemischen rautagenen Verbindungen wie Stickstofflost,, Nitroooguanidin oder Schwermetallsalzen hervorgebracht

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wird· Von diesen Mutanten sowie ihren Wildstämmen können für das Verfahren gemäß der Erfindung alle diejenigen verwendet werden, die Juvenimicin "bilden.

Gemäß der Erfindung werden Mikroorganismen, die Juvenimicin bilden und zur Gattung Micromonospora gehören, in einem Medium kultiviert, das Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff, Quellen von verwertbarem Stickstoff und andere Nährstoffe enthält. Das Kulturmedium kann flüssig oder fest sein, jedoch ist ein flüssiges Medium vorteilhafter und zweckmäßiger. Am vorteilhaftesten ist die Subraerskultur mit Bewegung durch Belüftung.

Im Medium für den Juvenimicin bildenden Mikroorganismus werden Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff wie Glucose, lösliche Stärke, Saccharose und Dextrin und Stickstoffquellen, die durch den Mikroorganismus verwertbar sind, z.Bo Maisquellwasser, Polypepton, rohes Sojabohnenraehl und Baumwollsaatmehl, sowie die üblicherweise für die Kultivierung von Mikroorganismen verwendeten anorganischen Salze verwendet. Besondere Schwermetallsalze, z.B. Eisen(IZ)-sulfat und Magnesiumsulfat, oder ein Antischaummittel können nach Bedarf zugesetzt werden.

Die Kultivierungsbedingungen, z.B. die Temperatur, die Bebrütungsdauer und der p^-Wert des Mediums, werden so gewählt, daß der verwendete Mikroorganismus wächst und die Bildung von Antibiotika maximal ist. Wenn beispielsweise Micromonospora chalcea var. izumensis verwendet wird, beträgt die Kultivierungszeit vorteilhafte bis 7 Tage. Das Medium wird vorzugsweise bei einem p„-Wert zwischen etwa 5 und 8 gehalten, und die Bebrütungstemperatur liegt zwischen etwa 20 und 45⁰O und zur Erzielung besserer Ergebnisse zwischen 27 und 34⁰C.

Die in der beschriebenen Weise erhaltene Permentationsbrühe enthält die Komponenten von Juvenimicin. Die Isolierung dieser Gruppe von Antibiotika aus der Fer-

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mentationsbrühe kann nach den Methoden erfolgen,, die bisher zur Gewinnung der Metaboliten eines Mikroorganismus aus seiner Fermentationsgase angewandt wurden. Beispielsweise kann unter Wahrnehmung des Vorteils₉ daß die Antibiotika dieser Klasse basische fettlösliche Substanzen sind, die Abtrennung nach Methoden, bei denen diese Eigenschaften ausgenutzt werden^ erfolgen.

Da diese Antibiotika vorwiegend in der flüssigen Phase der Fermentationsbrühe angehäuft werden, kann die Brühe zuerst filtriert werden, worauf die aktiven Bestandteile mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel aus der filtrierten Brühe oder aus dem Filtrat extrahiert werden können» Beispielsweise wird die Fermentationsbrühe bei ρ»! 7 bis 10 in Gegenwart von etwa 3 bis 5 Gew.-$ Diatomeenerde als Filterhilfsmittel gut gerührt und dann filtriert. Das erhaltene Filtrat wird mit einem organischen lösungsmittel extrahiert, das mit Wasser nicht oder nicht vollständig mischbar istj z.B. mit einem Ester einer niederen Fettsäure (z.B, Ä'thylacetat und Amylacetat), einem aromatischen Kohlenwasserstoff (z.B· Benzol und Toluol), einemchlorierten Kohlenwasserstoff (z.B. Methylenchlorid und Chloroform), einem Keton (z.B. Methylisobutylketon und Methyläthylketon), einem Alkohol (z.B. n-Butanol und Isoamylalkohol) oder einem Gemisch von zwei oder mehreren dieser Lösungsmittel.

Die aktiven Bestandteile können an einem Adsorptionsmittel wie Aktivkohle, weißer. Kohle (kolloidales SiIlciumdioxyd, im Handel beispielsweise unter der Bezeichnung "Amberlite XAD" erhältlich), einem schwach sauren Kationenaustauscherharz (z.B. "Amberlite IRC-SO") oder einem stark sauren Kationenaustauscherhars (z.B. "Amberlite iR-120ⁿ oder "Dowex 50^w), adsorbiert und dann mit einem geeigneten Lösungsmittel eluiert werden·

Der auf diese Weise erhaltene Extrakt wird mit einer sauren wässrigen Lösung, z.B. einer Pufferlösung, die .einen PjT-Wert von etwa 2 bis 6 hat, oder einer verdünn» ten anorganischen Säure, die einen pg-Wert von 3 ."bis 6 hat, weiter extrahiert, wobei die aktiven Bestandteile in die wässrige Phase überführt werden. Diese wässrige Lösung wird abgetrennt und dann durch Alkalizusatz auf p_H 7 bis 10 eingestellt, wodurch die aktiven Bestandteile erneut in eine neu zugesetzte, mit Wasser nicht oder nicht vollständig mischbare organische Lösungsmittelphase überführt werden können. Die organische Lösungsmittelschicht wird abgetrennt, mit Wasser gewaschen, dehydr.atisiert und unter vermindertem Druck eingeengt. Hierbei wird das Antibiotikum Juvenimicin in Form eines Pulvers erhalten.

Aus diesem pulverförmigen Juvenimicin können die jeweils gewünschten Antibiotika nach Methoden wie Adsorptionschromatographie, .Gelfiltration, Adsorption an Ionenaustauschern usw„, die allein oder in T asfei nation.,angewandt werden, abgetrennt werden. Als Adsorptionsmittel . eignen sich beispielsweise Kieselgel_t *-Aluminiumoxyd,.-Aktivkohle, -kollc? dales Siliciumdioxyd "Amberlite■ XAJ)." ' u.dgl.. Pur die'Gelfiltration eignet sich das Produkt der Handelsbezeichnung "Sephadex LH-20" (Dextranteilchen, Hersteller Pharmacia Co., Schweden). Als Ionenaustauscherharze eignen sich die Produkte der Handelsbezeichnung »Amberlite IRC-50», "Amberlite IR-120» und ^HDowex 50" (siehe oben). Es ist zweckmäßig, als Lösungsmittel, das als Elutionsmittel im Falle der Verwendung von Kieselgel als Adsorptionsmittel dient, ein Gemisch eines niedrigpolaren Lösungsmittels (z.B. Chloroform oder Äthylacetat) und eines polaren Lösungsmittels (z.B. Methanol oder wässriges Ammoniak) zu verwenden. Bei Verwendung, von Aktivkohle als Adsorptionsmittel eignen sich beispielsweise wässriges Methanol, wässriges Aceton, Methanol, Aceton, Äthylacetat und Chloroform

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als Elutionsmittel. Äthanol ist besonders zu empfehlen, wenn das Produkt "Sephadex LH-20" als Adsorptionsmittel verwendet wird.

Wie bereits erwähnt, besteht das Antibiotikum gemäß der Erfindung aus mehreren Komponenten· Dies läßt sich leicht bestätigen, indem das Gemisch der Antibiotika der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unterworfen wird, z.B, an dem Produkt der Handelsbezeichnung "Spotfilm f (Hersteller Tokyo lasei K₉K₀, Japan) unter Verwendung eines Entwicklergemisches, das aus Chloroform, Methanol und einer Tfoigen wässrigen Ammoniaklösung besteht (Volumenverhältnis 40x12120), wobei deutliche Flecken auf dem Ohromatogramm erscheinen» Die Komponenten werden grob in zwei Gruppen eingeteilt₉ nämlich Juvenimicin A und Juvenimicin B, wobei diese Gruppen mehrere Komponenten umfassen. Alle Komponenten werden als A^₂ A«, A,, Α., Β.« _s Bp₉ B,, und B« in der Reihenfolge abnehmender Rf-Werte auf dem Dünnschichtchromatogramm bezeichnet. Die Komponenten haben die folgenden Rf-Wertes

	A₁ s	0,85	+	0,05
Juvenimicin A	Ia₂ :	0,80	± ±	0,05
	P:	0,65		0,05
	Tb₁ :	0,50	±	0,05
Juvenimicin B	Jb₂ , JB₃ ί	0,40	±	0,05 0,05
	Bl *	0,25	+	0,05

Die charakteristischen Eigenschaften der jeweiligen Gruppen (Juvenimicin A und Juvenimicin B) sowie die hauptsächlichen speziellen Bestandteile sind nachstehend genannt,

Juvenimicin A (hergestellt gemäß Beispiel 1) 1) Elementaranalyse:

C: 63,39 + I₁O; H: 8,83 + 0,5» Ni 2,80 + O₉5 109809/134S

2) Spezifische Drehung

j⁴ =-13,4°± 10° (C= O,5# in CHCl)

^) Molekulargewicht

a). Dampfdruck-Osmosemethode: 655 + 70 (in CgHg) b) Höchste Massenzahl: m/e = 581

4) farbreaktion

a) Erythromyeintest: negativ

b) Carbomyeintest: negativ

c) Dragendorff-Reaktion: positiv

5) Löslichkeiten löslich in Benzol, Chloroform, Äthylacetat, Dimethylformamid, Äthanol und wässrigen Säure

/..-■■

lösungen; unlöslich in Petroläther, η-Hexan oder neutralem Wasser.

6) Ultraviolettabsorption: wie in Pig.5 dargestellt

^(E iom ■ ²³° i

7) Infrarotabsorption: wie in Pig,1 dargestellt. Hauptsächliche Absorptionsbanden in Wellenzahlen (cm )i 3450 (stark), 2960 (stark), 1725 (stark), 1695 (mittel) 1625 (stark), 1458 (mittel), 1383 (mittel), 13H (mittel), 1276 (mittel), 1250 (schwach), 11.80. (stark), 1167 (stark), 1111 (stark), 1072 (stark), 1047(stark), 1027 (mittel), 983 (stark), 966 (Schulter), 932 (schwach), 896 (mittel), 869 (schwach), 846 (schwach), 834 (schwach), 792(mittel), 755 (schwach), 713 (schwach).

8) Akute Toxizitat bei der Maus (LD₅₀); Intravenöse Injektion von 100 bis 200 mg/kg Intraperitoneale Injektion: 200 bis 400 mg/kg Orale Verabreiqhungj >1000 mg/kg

9) Effektive Dosis (EDcq)j Beobachtet an 4 Wochen alten Mäusen, die mit Staphylococcus aureus infiziert waren; subkutane Injektion* ED^₀ » 7»1 mg/kg

10*809/1-345.

Juvenimiein A^ (hergestellt gemäß Beispiel 3):

Elementaranalys'e

C: 62,97 + 1,0; H: 8,62 + 0,5; N: 3,00 + 0,5

2) Spezifische Drehung §

ßjjf = -17,6° + 10° (C= 0,29$ in CHCl₃).

3) Molekulargewicht:

a) Dampfdruck-Osmosemethodet 541 + 60 (in CgHg)

b) Titrationsmethodei 562 + 60

c) Höchste Massenzahl: m/e = 581

4) pKa¹ = 8,4 (in 66#igem Dimethylformamid)

5) Farbreaktion: wie bei Juvenimiein A

6) Löslichkeiten: . wie bei Juvenimiein A

7) Rf-Werte auf dem Papierchromatogramm: Papier: Toyoroshi Nr.51; entwickelt mit

a) wässriger 0,05 n-Ammoniaklösung,

gesättigt mit Methylisobutylketpn: 0,74 +0,1

b) Gemisch von Methylisobutylketon

und Methyläthylketon (4:1) 0,68+0,1

c) Methylisobutylketon 0,57 + 0,t

d) M-15-Phosphatpuffer, gesättigt mit n-Butylacetat (p« 8,0; (das Papier wird mit 2# flüssigem Paraffin imprägniert) 0,60+0,1

e) Gemisch von Benzol und Cyclohexan (IM), gesättigt mit Formamid (das Papier wird mit einem Gemisch von Formamid und Methanol (1s1) imprägniert) 0,02 + 0,02

f) Wässriger0,05 n-Ammoniaklösung,

mit n-Butyläthylketon gesättigt 0,^ + 0,1

8) Rf-Werte bei der Dünnschichtchromatographie»

a) Adsorptionsmittel: Kieselgel ("Chromatospot", Tokyo Kasei K.K.)

Elutionsmittels Gemisch von Chloroform, Methanol

und 7^iger wässriger Ammoniaklösung(4Oi12iao) 0,7 + 0,p5

' 109809/1348 ■

■ ' - 15 -

b) Adsorptionsmittel; Aluminiumoxyd (Merck & Co.) Elutionsmittel: Xther 0₉49 + 0,05 Unter den gleichen Bedingungen hatten andere Komponenten die folgenden Rf-Werte:

A₁ ϊ 0,72 + 0,05 A₂ i 0,72 +0,05 A, : 0,07 + 0,05

c) Adsorptionsmittel! Aluminiumoxyd (Merck & Co.) Elutionsmitteli Gemisch von Benzol und Aceton (4:1)

0,65 + 0,05

Unter den gleichen Bedingungen hatten andere Komponenten die folgenden Rf-Werte: • A₁ ί 0,80 + 0,05 A₂ : 0,80 + 0,05 A₄ : 0,29 £ 0,05

9) Ultraviolettabsorption: wie bei Juvenimicin A

10) Infrarotspektrum: wie in 3?ig.2 dargestellt mit folgenden hauptsächlichen Absorptionsbanden als Wellenzahl (cm ):

3450 (stark), 2960 (stark), 1725 (stark), 1695(mittel), 1625 (stark), 1 ^8 (mittel), 1383 (mittel), 13H (mittel), 1276 (mittel), 1250 (schwach), 1180 (stark), 1167 (stark), 1111 (stark), 1072 (stark), 1047(stark), 1027 (mittel), 983 (stark), 966 (Schulter), 932 (schwach), 896 (mittel), 869 (schwach), (schwach), 834 (schwach), 792 (mittel), 755 (schwach), 713 (schwach).

Juvenimicin B₁ (hergestellt gemäß Beispiel 6)

1) Elementaranalyses

C: 64,0 + 1,0; H: 9,4 ±0,5; N: 2,5 + 0,5

2) Spezifische Drehung:

ß.J?Q =-3,0° + 5° (C= 0,5$ in Methanol)

-J²^ = 7,6° + 5° (C= 0,5# in CHCl₃) 109809/1345

3) Massenspektrometrie: Höchste Massenzahl! m/e =

4) Farbreaktionί

a) Erythromycintest: negativ

\>) Oarboraycintesti negativ

c) Dragendorff-Reaktionί positiv

5) Löslichkeiten; wie bei Juvenimicin A

6) Ultraviolettabsorption: wie in Pig.6 dargestellt

± ²T ^(K1 cm

7) Infrarotabsorptionsspektrumi wie in Fig. 3 dargestellt, gemessen nach der KBr-Methode. Hauptsächliche Absorptionsbanden in Wellenzahlen (cm ): 5450 (sehr stark), 2940 (sehr stark), 1715 (stark), 1670 (stark), 1595 (sehr stark), 1455 (mittel), 1380 (mittel), 1312 (stark), 1272 (mittel), 1175 (sehr stark), 1110 (stark), 1065(sehr stark) 1050 (sehr stark), 1024(SCIhUItOr), 985 (aehr stark), 928 (schwach), 905 (schwach), 889 (schwach), 843 (schwach), 805 (schwach).

8) Akute Toxizität (LD₅₀) ^^ei <*^e]r Maus: Intraperitoneale Injektionϊ 125 bis 250 mg/kg

9) Effektive Dosis: ermittelt an 4 Wochen alten Musen, die mit Staphylococcus aureus infiziert wurden: Subkutane Injektion: /· i^GQ = 5#81 mg/kg Orale Verabreichung: BPcq=81,2 mg/kg

Juvenimicin B, (hergestellt gemäß Beispiel 6)ί

1) Elementaranalyse:

C: 64,7 +1,0; H: 10,2 + 0,5; N: 3,6 + 0,5

2) Spezifische Drehung:

= -9,0° +5° (c = 0,5$in Methanol) ■ = +5,6° + 5° (c= 0,5$ in OHCU)

109809/1345

3) Massenspektrometrie:
Höchste Massenzahl m/θ = 583

4) Farbreaktion: wie bei Juvenimicin B^

5) Iiöslichkeiten: wie bei Juvenimicin B.. .

6) Ultraviolettabsorption: wie in Pig .7 dargestellt»

² ψ ^]L ~^UQ ± ²⁵>

7) Xnfrarotspektrum: wie in Pig,4 dargestellt, gemessen nach der KBr-Methode. Hauptsächliche Absorptionsbanden in Wellenzahlen (cm-¹): {mittel), 3450 (sehr stark), 2940 (sehr stark5/1670 (mittel), 1595.(stark), 1455 (stark), 1380 (stark), 1312(stark). 1275(mittel),117O(stark)_i111O(stark),1O7O(sehr stark), 1045 (sehr stark), 985 (stark), 935 (schwach), 905 (schwach), 887 (schwach), 840 (schwach), 808 (schwach).

8) Akute Toxizität (LD₅₀) ^ei ^der
Intraperitoneale Injektion: 250-500 mg/kg

9) Effektive Dosis:

Beobachtet an 4 V/ochen alten Mäusen, die mit Staphylococcus aureus infiziert waren, bei subkutaner Injektion: ED₅₀ = 5,0 mg/kg . ..

Die Antibiotika "Juvenimicin" gemäß der Erfindung werden nachstehend mit bisher bekannten Antibiotika verglichen. Von den durch Micromonospora gebildeten Antibiotika sind lediglich die Megalomicine A, B, Cj und C^ als Makrolid-Antibiotika bekannt. Die letzteren werden durch Micromonospora sp. W-847 (URRL-3274) (siehe holländische Patentanmeldung 68.07363)gebildet»Javenimicin unterschGidet sich davon wesentlich in der Elementaranalyse ₉ im Xnfrarotspektrum und in der spezifischen Drehung von den Meßalomicinen, die ein größeres Molekül haben als Juveniraicin: und die zwei Stickstoffatome im Molekül enthalten, während Juvenimicin nur'ein Stickstoffatom 1. MoXem enthält.

Von den bekannten Makrolid-Antibiqtika haben Girramycin A (A₁ bis A^) und R-491-A die maximale UV-Absorption bei 240 mu, jedoch Werden diese Antibiotika sämtlich durch Mikroorganismen der Gattung Streptomyces gebildet. Juvenimicin A unterscheidet sich jedoch deutlich von Cirramycin A^ (Koshiyama und Mitarbeiter, Journal of Antibiotics, Japan, (A) Band 22, Seite 61 (1969)) in der Löslichkeit, im Molekulargewicht, in der Infrarotabsorption, im Erythromycintest, Carbomycintest usw. und auch von Cirramycin A₂, A,, A- und A,- in den Rf-Werten der Papierchromatographie. Bas Antibiotikum R-491-A. (ishida und Mitarbeiter, Vortrag bei der Tagung des Tohoku Branch der Pharmaceutical Society of Japan, gehalten im Dezember 1964) unterscheidet sich deutlich von Juvenimicin A in der Infrarotabsorption«,

Aus den vorstehend genannten Beobachtungen wurde geschlossen, daß Juvenimicin A und Beine Komponenten A^, A«, A, und A. neue Antibiotika sind.

Für Juvenimicin B₁ und B, ist eine starke Xnfrarotab-

-1

sorption bei 1720 cm , die bestätigt, daß es sich um Makrolid-Antibiotika handelt, sowie eine maximale UV-Absorption in der Nähe von 280 mu/ charakteristisch. Zu den bekannten Makrolid-Antibiotika haben die folgenden die maximale UV-Absorption in der Mähe von 280 ims Carbomycin B (F»A.Hochstein und Mitarbeiter, The Journal of American Chemical Society, Band 7β_έ S.5080 (1954))» Niddamycin. (G.Huber and Mitarbeiters, Jtaa©imittelfor-> scliung Banö 12, S₀1191 (1962)),, Kelomycin (HoA₀ Whaley and Mitarbeiter_s Antimierotial Ageats and CJaemotaerapy 1963» S₆45)₀ Tylosin (J₀M₀ MeGtair® und MItarbeit@r₉, Antibiotics and Chemotherapy_s Baaä .11₈ S₀520 (1961))_D Antibiotic PA-108 (K₀Murai and Mitarbeiters IMa₀ Band 9,

5 (1959)) j. Maorociia (EoioHamill und Mitarbeiter_t

(japanische Patentveröffentlichung 2994/1964). Die Juveniniicine B.. und B, unterscheiden sich jedoch deutlich von diesen bekannten Makrolid-Antibiotika in der spezifischen Drehung, in der Infrarotabsorption, Elementaranalyse usw., so daß sie als neu anzusehen sind.

Die antimikrobischen Spektren sind in Tabelle 2 genannt. Pur die Messung der hemmenden Mindestkonzentration wurden übliche Bakterien als Testorganismen 18 Stunden bei 37⁰C auf Bouillon-Agar bebrütet. Säurefeste Bakterien wurden auf Glycerin-Bouillon-Agar 40 Stunden bei 37°C bebrütet. Im Falle der phytotoxischen Bakterien wurde Glucose-Bouillon-Agar als Versuchsmedium verwendet.

. Tabelle 2

Test-Mikroorganismus	Hemmende A	Mindestkonzentration,/Ug/m! ' -A₃ B₁ B₃	100	>100
Escherichia coli	10	5	100	100
Proteus vulgaris	20	10	>100	>100
Pseudomonas aeruginosa	100	100	10	10
Staphylococcus aureus	0,5	0,5	>100	>100
dto.. (gegen Oleando- mycin und Erythromycin resistenter Stamm)	>100	>100	1	10
Bacillus subtilis	0,1	0,1	5	10
Bacillus cereus	0,1-0,2	0,1	10	50
Bacillus brevis	0,5,	0,2	0,5	0,5
Sarcina lutea	0,05	0,05	0,5	0,5
Micrococcus flavus	0,05	0,05	>100	MOO
Mycobacterium avium	>100	>100

dto.(Streptomycin-re-

sistent) >100 >100 >100 >100

dto.(Neomycin-resi-

stent) >100 >100 >100 >100

Mycobacterium sp.6O7 >100 >100 >100 >100

Mycobacterium ijhlei 50 100 100 >100

Mycobacterium smeg- *

matis 50 100 100 >100

Xanthomonas oryzae. <1,0 <1,0 — —

109809/134S.

Staphylokokken sind pyogene oder eiterbildende Bakterien« Sie pflegen umgrenzte Läsionen beispielsweise in^:Form von Abszessen u»dgl_e hervorzurufeη _B die häufig in der Haut ■ auftreten. Staphylokokken sind die Ursache von Furunkeln und Karbunkeln «ad anderen üblichen Wundinfektionen© Die neuen' Produkte gemäß der Erfindung sind wertvoll für örtlich anzuwendende Zubereitungen für die Behandlung dieser Art von Infektionen bei Warmblütern (Hunde₈Kat2en₉ Menschen usw,)· Eine brauchbare Zubereitung für die örtliche Anwendung sur Behandlung einer auf Staphylopoccus aureus zurückzuführenden Infektion hat beispielsweise die folgende Zusammensetzung %

In 1 g Wollfett wird elaes der folgenden Antibiotika gleichmäßig eingearbeitet 8

1) 20 mg Juvenimiein A₉ 2) 20 mg Juvenimicin A^ 3) 50 mg Juvenimioin B₁ oder 4) 50 mg Javenimiein B^o Das Gemisch wird dann gleichmäßig mit weißem Petrolatum in einer solchen Menge gemischt _s daß 10 g Salbe erhalten werden» Diese Salbe wird örtlich in einer Menge₈ die zur Bedeckung der behandelten Wunde genügt₉ unter leichtem Einreiben aufgebrachte Die Behandlung erfolgt wenigstens einmal täglich und wird,, falls erforderlich oder erwünscht, mehrmals täglich

Infolge der oben genanatea "bakteriziden unä "bakteriosta^ tischen Eigenschaften eignen sich die neuen Produkt© gemäß der Erfindung beispielweise zur Desinfektion ύόώ Geräten in Krankenhäusern usw_Oi) äie im allgem©in@n pathogenen grampositiveo- ©der grasmegativen Bakt©ri©sa ausgesetzt sind₉ äie ©apfindlich gegenüber den oben ge=» nannten Produkten sind₀ Die Desinfektion ©rf©Igt dureh Auftrag oder Aufsprühen einer Lösung (s_oB_o iß Methanol oder Äthanol)₉ die ©ine der folgenden Komponenten enthält ι 1) 20 fig/nl JüveaiiBieiß Ag 2) 20 jug/ml Jiw 3) 50 /ig/ml Juvenimiein B^, ©der 4) 50 lag/ml B

In den folgenden Beispielen beziehen sich die Prozentsätze bei der Angabe der Zusammensetzung der Kulturmedien auf Gewicht/Volumen, d.h. g/100 ml. Im übrigen sind alle Prozentsätze auf das Gewicht bezogen, falls nicht anders angegeben.

Beispiel 1

Je 30 ml eines Impfkulturmediums (pH 7,0)* bestehend aus 5,0 % -löslicher Stärke, 0,5 % Glycerin, 1,0 % Sojabohnenmehl, 0,5 % Fleischextrakt, 0,01 % Eisen (Il)-sulfat, 0,1 % Magnesiumsulfat, 0,5 % Kaliumcarbonat, 0,05 % PoIyoxypropylentriol mit einer OH-Zahl von 56 (Handelsbezeichnung "Äctoeol", hergestellt von der Anmelderin) als Antischaummittel und Wasser wurden in 200 ml-Kolben sterilisiert und mit einer Schlaufenmenge Micromonospora chalcea var. izurnensis (IFO-I2988) von einer Agar-Schrägkultur geimpft. Die geimpften Kulturen wurden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung 40 Std, bei J57°C bebrütet. Die Impfkulturen wurden in 5OO ml des sterilisierten Impfkulturmediums der gleichen Zusammensetzung in 2 1-Sakaguchi-Kolben überführt, worauf weitere 40 Stunden bei 28 C auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung bebrütet wurde.

Die Impfkultür wurde in einer Menge von 1,5 1 in einen 50 1-Behälter aus nichtrostendem Stahl überführt, der ^O 1 eines sterilisierten Hauptkulturmediums (pH 7*0) enthielt, das aus 5,0 % löslicher Stärke, 5,0 % Mais» quellwasser, 0,5 % Fleischextrakt, 0,01 % Eisen (II)-sulfat, 0,1 % Magnesiumsulfat, 1 $ Kaliumcarbonat, 0,05 % des obengenannten Polyoxypropylentriols als Antischaummittel und Wasser bestand. Das Gemisch wurde bei 28 C unter Belüftung mit JO 1 Luft/Minute und unter Rühren mit 28Ο UpM 114 Stunden bebrütet. Der.Fortgang der Fermentation ergibt sich aus der folgenden Tabelle:

109809/1345

Bebrütungs-	- pH-Wert.	Wirksamkeit"'	_	0
dauer (Std.)	der Brühe	(7 /ml)	0
O	7,20		5,0
18 ·	7,50	13,5
30	6,70	18,0
42	7,30	21,0
54	7,65	. 27,0
66	7,50	25,0
78	7,55
90	7,95
102	8,33
114 .	8,25

⁺'Ermittelt nach der Papierscheibenmethode mit Azotobacter vinelandii als Test-Mikroorganismus»

Die auf diese Weise erhaltene Kulturbrühe (23*5 1) wurde mit 750 g Diatomeenerde als Filterhilfsmittel filtriert. Das Filtrat wurde mit einer wäßrigen 2n-Natriumhydroxydlösung auf pH 9,0 eingestellt, worauf 2 kg Natriumsulfat zugesetzt wurden. Nach vollständiger Auflösung des Natriumsulfats wurde das Filtrat zweimal mit je 11 1 Äthylacetat extrahiert. Die Lösungsmittelschicht wurde mit Wasser gewaschen* deh'ydratisiert und unter vermindertem Druck auf 1 1 eingeengt» Das Konzentrat wurde mit 3 1 verdünnter Salzsäure (pH-Wert etwa 3-4) ausgeschüttelt,, um die wirksamen Bestandteile in die wäßrige Schicht zu überführen. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt _s erneut auf pH 9 eingestellt und zweimal mit je 1 1 Kthylacetat extrahiert. Mit den so erhaltenen Extrakten wurde die Überführung mit Säure und die Extraktion mit Äthylacetat wiederholt. Der endgültige Äthylacetatextrakt wurde mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck einge-

dampft, wobei 450 mg eines rohen Pulvers erhalten wurden» Das Pulver wurde in 10 ml Äthanol gelöst und die Lösung der Säulenchromatographie an 150 ml "Sephadex LH-20" (siehe oben) unterworfen, wobei I65 mg Juvenimicin A erhalten wurden.

Beispiel 2

Eine Impfkultur wurde auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise in einem 2 1-Sakaguchi-Kolben hergestellt und in 30 1 eines sterilisierten Impfkulturmediums der gleichen Zusammensetzung in einem 50 1-Behälter aus nichtrostendem Stahl geimpft. Die Kultivierung wurde 48 Stunden bei 28 C unter Belüftung und Rühren auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise durchgeführt. Die Kulturbrühe wurde als Impfkultur verwendet.

Die Impfkultur wurde in 100 1 eines sterilisierten Hauptkulturmediums (pH 7,0) überführt, das aus 5*0 % löslicher Stärke, 3,0 % Maisquellwasser, 0,5 % Fleischextrakt;, 0,05 % Eisen (Il)-sulfat, 0,1 fo Magnesiumsulfat^ O₁₁ 5 % Kaliumcarbonat, 0,05 $ des oben genannten Polyoxypropylentriols als Antischaummittel und Wasser bestand ur.d in einem 200 1-Behälter aus nichtrostendem Stahl enthalten war. Die Fermentation wurde'90 Stunden bei 28⁰C unter Belüftung mit 100 1 Luft/Minute und unter Rühren bei 150 UpM durchgeführt. Der Verlauf der Fermentation ergibt sich aus der folgenden Tabelle:

Wirksamkeit ( 7/ml)

20,0 40,0 70,0 95,0 100,0 100,0

Bebrütungs-	pH-Wert
dauer (Std.)	der Brühe
0	7,05
18	7,05
30	7,10
42	6,60
54	7,28
66	7,30
78	7,55
90	7,90

109809/134

Die auf diese Weise erhaltene Kulturbrühe (58 l) wurde mit 1,5 kg Diatomeenerde als Filterhilfsmittel filtriert. Das Piltrat wurde auf pH 9 eingestellt und auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet, d„ h₀ unter Verwendung von Äthylacetat und verdünnter Salzsäure, wobei 4,5 g eines rohen Pulvers erhalten wurden» Das Pulver wurde mit j5OO ml "Sephadex LH-20" (siehe oben) gereinigt, wobei 2,9 g pulverförmiges Juvenimicin A erhalten wurden.

Beispiel 3

w In 20 ml Äthylacetat wurden 1₄8 g Juvenimicin A, das auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise erhalten worden war, gelöst. Die Lösung wurde der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (Merck, HP 254) (40 χ 40 cm) unterworfen, wobei ein Gemisch von Chloroform, Methanol und 7$igem wäßrigem Ammoniak (Volumenverhältnis 40 : 12 s 20) als Entwickler verwendet wurde. Das Kieselgel wurde bei einem Rf-Wert von etwa 0,7 entnommen und mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingedampft_s wobei 650 mg Juvenimicin A^, erhalten wurden«

Beispiel 4

45 1 einer KuIturbrühe, die auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise erhalten worden war_s wurde auf pH 9 eingestellt und zweimal mit Qe ²5 ml Äthylacetat extrahiert«, Die Extrakte wurden vereinigt und auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitete wobei 4^0 g eines rohen Pulvers erhalten wurden» Das Pulver wurde an Kieselgel unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Entwicklers chromatographiertj, wobei 1_S4 g Juvenimicin A. erhalten wurden„

1 0 Q ft fl 9 J

1 y j o u w /

- 25 Beispiel 5

Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde wiederholt mit dem Unterschied, daß j50 1 eines sterilisierten Hauptkulturmediums (pH 7) der folgenden Zusammensetzung verwendet wurden: 5,0 % lösliche Stärke, 1 % Maisquellwasser, 1 % Baumwollsaatmehl, 0,5 % Fleischextrakt, 0,5 % Pepton, 0,05 % Eisen (II)-sulfat, 0,1 % Magnesiumsulfat, 1 % Kalziumcarbonat, 0,05 % des in Beispiel 1 genannten Polyoxypropylentriols und Wasser. In diesem Fall verlief die Fermentation wie folgt:

Bebrütungs-	pH-Wert	Wirksamkeit
dauer (S td.)_	der Brühe	(7/ml)
0	' 7,10
18	7,25	-
30	7,50	0
42	6,85	0
54	7,00	0
66	7,12	5
78	7,23	8,5
90	7,30	17,5
102	7,00	18,5
114	7,00	29

Die von mehreren Ansätzen erhaltenen Kulturbrühen wurden vereinigt, und 100 1 der vereinigten Brühe wurden filtriert. Das FiItrat wurde auf pH 8,5 eingestellt und mit der Halfte seines Volumens an Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und zweimal mit jeweils dem halben Volumen an verdünnter Salzsäure, die einen pH-Wert von 3 hatte, extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde mit wäßriger 2n-Natriumhydroxydlösung auf pH 8,5 eingestellt und dann zweimal jeweils mit dem halben Volumen Sthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, dehydratlsiert und unter verminder-

109809/1345

tem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde in 40 ml Äthanol gelöst und die Lösung der Saulenchromatographie an 600 ml "Sephadex LH-20" (siehe oben) unterworfen, wobei 45O .mg pulverförmiges Juvenimicin erhalten wurden.

100 mg des Pulvers wurden der Säulenchromatographie an 5 g Aluminiumoxyd (Merck & Co.) unterworfen, worauf wie folgt eluiert wurde:

a) mit einem Gemisch von Benzol und Aceton (Volumenverhältnis 4 ; 1), wobei J mg eines Gemisches von Juvenimicin A, und Juvenimicin Ap erhalten wurden ι

b) mit einem Gemisch von Benzol und Aceton (Volumenverhältnis
wurden j

hältnis 4 t 2), wobei Ij5 mg Juvenimicin A-, erhalten

c) mit einem Gemisch von Benzol und Aceton (Volumenverhältnis 1 2 I), wobei 10 mg Juvenimicin B, erhalten wurdenj

d) mit Aceton^ wobei JH rag Juvenimicin B, erhalten wurden,

Beispiel 6

Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde wiederholt mit dem Unterschied^ daß 1000 1 eines sterilisierten Hauptkulturmediums (pH 7*0) der folgenden Zusammensetzung verwendet wurdens 1 % lösliche Stärke, 4 % Saccharose, 2 % gereinigtes Baumwollsaatmehl der Handelsbezeichnung "Profile" (Hersteller Traders Protein DiViSiOn₈ USA)* 0,5 % Fleischextrakt,, O₃5 % Pepton, 0_a05 % Eisen (II)-sulfat, 0,1 # Magnesiumsulfat _B 1 % Kalziumcarbonati, 0*05 % des in Beispiel 1 genannten Polyoxypropylentriols und Wasser. Die Kultivierung wurde unter Belüftung mit 1000 l/Minute durchgeführt» Die Wirksamkeit der Kulturbrühe beträgt nach einer Kultivierungsdauer von 90 Stunden etwa

109809/mS

hO Mikrogramm/ml und erreicht nach einer Bebrütungsdauer von Hh Stunden 80 Mikrogramm/ml.

Insgesamt 1100 1 der in dieser Weise erhaltenen Kulturbrühe wurden auf pH 8,5 eingestellt und mit 550 1 Äthylacetat extrahiert. Die Lösungsmittelschicht wurde abgetrennt, mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck auf etwa J>0 1 eingeengt. Zum Konzentrat wurden 30 1 verdünnte Salzsäure (pH j5) gegeben. Das Gemisch wurde gerührt, worauf die wäßrige Schicht abgetrennt wurde. Die wäßrige Schicht wurde auf pH 8,5 eingestellt und zweimal mit je 15 1 Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem T^ruck eingedampft, wobei 15 g rohes, pulverförmiges Juvenimicin erhalten wurden.

Das rohe Pulver wurde in J> 1 Äthylacetat gelöst. Die Lösung wurde dreimal mit je 1 1 einer l/15-molaren Phosphatpufferlösung (pH 6,2) extrahiert.

Die Äthylacetatschicht wurde dann mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (Merck & Co., Teilchengröße weniger als 0,08 mm) unterworfen, worauf mit'einem Gemis ch von Chloroform, Methanol und einer 7$igen wäßrigen Ammoniaklösung (Volumenverhältnis 40 : 17 ί 20.) entwickelt wurde, um die einzelnen Komponenten abzutrennen. Jede Komponente wurde unter einer Ultraviolettlampe nachgewiesen und mit Äthylacetat extrahiert, wobei 0,8 g Juvenimicin A_v, 1,0 g Juvenimicin B. und 0,2 g Juvenimicin B-, erhalten wurden.

109809/1346

Bei einem weiteren Versuch wurden die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Phosphatpufferextrakte vereinigt, auf pH 9 eingestellt und dreimal mit jeweils l/j5 ihres Volumens an Äthylacetat extrahiert. Die Äthyl acetatschichten wurden vereinigt, mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde der DünnschichtChromatographie auf die oben beschriebene Weise unterworfen, wobei weitere 0*5 g Juvenimicin B^ erhalten wurden.

Claims

Patentansprüche

/l) Verfahren zur Herstellung von Juvenimicin, dadurch ge^v—""" kennzeichnet, daß man einen Juvenimicin bildenden Mikroorganismus der Gattung Micromonospora in einem Kulturmedium, das eine Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff und eine Quelle von verwertbarem Stickstoff enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert, bis sich Juvenimicin in wesentlichen Mengen in der Kulturbrühe angehäuft hat, und das angehäufte Juvenimicin aus der Kulturbrühe isoliert.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Micromonospora ehaleea var. izumensis als Mikroorganismus verwendet wird.
3) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Micromonospora chalcea var. izumensis IPO-129-88 als Mikroorganismus verwendet wird.
4) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Juvenimicin A gewonnen wird.
5) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Juvenimicin A, gewonnen wird.
6) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Juvenimicin B, gewonnen wird.
7) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Juvenimicin B^, gewonnen wird.
8) Juvenimioin A, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

a) Elementaranalyse:

C t 6^,j59 - 1,Oi H : 8,83 ί 0,5jN ! 2,80 ± 0,5

109809/1345

b) spezifische Drehung:

^⁰ * 10° ( C = 0,5 % in CHCl,)

c) Molekulargewicht:

aa) durch Dampfdruckosmose: 655 - 70 (in CgH/-) bb) höchste Massenzahl: m/e = 58I

d) Farbreaktion:

aa) Erythromycintest: negativ
bb) Carbomycintest: negativ
cc) Dragendorffreaktion: positiv

e) Löslichkeiten: löslich in Benzol, Chloroform, Äthylacetat, Dimethylformamid, Äthanol und wäßriger Säurelösung, unlöslich in Petroläther, η-Hexan oder neutralem Wasser;

f.) Ultraviolettabsorption:

X^fiwn = 240 - 2 m/u (E _χ ^p = 23O »30) max '

g) hauptsächliche Infrarotabsorptionsbanden in Wellenzahlen (cm~ ) nach der KBr-Scheibenmethodes

3450, 2960, 1725, 1695, I625, 1458, 1276, 1250, 1180, 1167, 1111, 1072, 1047, 1027, 983, 966, 932, 896, 869p 846, 834, 792, 755, 713»
9) Juvenimicin A,, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

a) Elementaranalyse %

C : 62,97 - 1,0; H.': 8,62 ~ 0,55 M g 3,00 ± 0,5

b) spezifische Drehung?

ⁿ= - 17,6° t 10° (0 = 0,29 % in

c) Molekulargewicht:

aa) Dampfdruckosmose: 54l - 60 (in bb) Titrationsmethode: 562 ί 6θ cc) höchste Massenzahl: m/e = 58I

d) pKa¹-Wert: 8,4 (in 66#igem Dimethylformamid)

e) Farbreaktion:

aa) Erythromycintest: negativ bb) Carbomycintest: negativ cc) Dragendorffreaktion: positiv

f) Löslichkeiten: löslich in Benzol, Chloroform, Äthylacetat, Dimethylformamid, Äthanol und wäßriger Säurelösung, unlöslich in Petroläther, η-Hexan und neutralem Wasser;

g) Rf-Werte, ermittelt durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel und Elution mit einem Gemisch von Chloroform, Methanol und 7$iger wäßriger Ammoniaklösung (40 : 12 : 20):Rf = 0,7 - 0,05;

h) Ultraviolettabsorption:

⁺- ² ■ (^Elo_m -850*30).

i) hauptsächliche Infrarotabsorptionsbanden in Wellenzahlen (cm~ ) nach der KBr-Scheibenmethode: 3450, 296O, 1725, I695, I625, 1458, 1383, 1314, 1276, 1250, 1180, 1167, 1111, 1072, 1047, 1027, 983, 966, 932, 896, 869, 846,'834, 792, 755, 713.
10) Juvenimicin B,, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

a) Elementaranalyse:

C : 64,0 ± 1,0; H : 9,4 t 0,5; N : 2,5 + 0,5

1Ü98Q9/13

- 22 -

b) spezifische Drehung:

JP = -3*0° - 5° (c = 0,5 % in Methanol) 23 = +7,6° ±5° (c = 0,5 % in CHCl,)

c) höchste Massenzahl: m/e = 567

d) Farbreaktion:

aa) Erythromycintest: negativ bb) Carbomycintest: negativ cc) Dragendorffreaktion: positiv

e) Löslichkeiten: löslich in Benzol, Chloroform, Äthylacetat, Dimethylformamid, Äthanol und wäßriger Säurelösung, unlöslich in Petroläther, n-Hexan oder neutralem Wasser:

f) Ultraviolettabsorptiont

- äö ± 2 7« (*}*, =526 ±30)

g) hauptsächliche Infrarotabsorptionsbanden in Wellenzahlen ( cm" ) nach der KBr-Scheibenmethode:

3450, 2940, 1715, I67O, 1595, 1455, I38O, 1312, 1272, II75, 1110, 1065, 1050, 1024, 985, 928, - 905, 889, 84^, 805.
11) Juvenimicin EL·, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

■ a) Elementaranalyse:

C : 64,7 - 1,0; H : 10,2 ± 0,5 ; N : J>,6 ± 0,5

b) spezifische Drehung:

p = -9,0° t 5° ( c = 0,5 % in Methanol) = +5,6° - 5° (c ■--- 0,5 fo in CHCl₃)

109809/1345

ο) höchste Massenzahl! m/e =583

d) Farbreaktion: ·

aa) Erythromycintest: negativ bb) Carbomycintest: negativ cc) Dragendorffreaktion: positiv

e) Löslichkeiten: löslich in Benzol, Chloroform, Äthylacetat, Dimethylformamid, Äthanol und wäßriger Säurelösung, unlöslich in Petroläther, n-Hexan und neutralem Wasser;

f) Ultraviolettabsorption:

- 248 t ₂₅)

g) hauptsächliche Infrarotabsorptionsbanden in Wellenzahlen (cm~ ) nach der KBr-Scheibenmethode: 5450, 2940, 1720/I670, 1595, 1455, I38O, 1312, 1275/1170, 1110, 1070, 1045, 985, 935, 905, 887, 840, 808.

109809/ 13 4'S