DE2034245A1 - Neue Antibiotika und ihre Herstellung - Google Patents
Neue Antibiotika und ihre HerstellungInfo
- Publication number
- DE2034245A1 DE2034245A1 DE19702034245 DE2034245A DE2034245A1 DE 2034245 A1 DE2034245 A1 DE 2034245A1 DE 19702034245 DE19702034245 DE 19702034245 DE 2034245 A DE2034245 A DE 2034245A DE 2034245 A1 DE2034245 A1 DE 2034245A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- juvenimicin
- negative
- test
- ethyl acetate
- chloroform
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
- C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/29—Micromonospora
- C12R2001/30—Micromonospora chalcea
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/863—Mycobacterium
- Y10S435/864—Mycobacterium avium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
. - PATENTANWÄLTE
D.R.-IN.G. VON KREISLER DR.-ING. SCHÖNWALD
DR-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VOisJ KREISLER
DIPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖ'PSCH
KÖLN 1, DEICHMANNHAUS
Köln, den 6.7.1970 Kl/Ax
27, Doshomachi 2>-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan).
Die Erfindung "betrifft neue Antibiotika "Juvenimicin'1
und ihre Herstellung.
Es wurde gefunden, daß eine Gruppe von neuen antibiotischen
Substanzen von einem zur Gattung Micromonospora
gehörenden Mikroorganismus gebildet und in der Kulturbrühe
angehäuft wird, und daß die einseinen Mitglieder
der Gruppe der neuen Antibiotika in ihren Eigenschaften sowie in ihren chemischen Strukturen eng miteinander
verwandt sind, daß sie jedocih aus der Kulturbrühe getrennt
als Einzelverbindungen oder als Gemisch in jedem
gewünschten Reinheitsgrad iaoliert werden können. Die Gruppe der neuen Antibiotika ist mit dem Sammelbegriff
»Juvenimicin11 bezeichnet worden·
Es wurde, ferner gefunden, daß Juvenimicin als aktive
Bestandteile die Antibiotika enthält, die ebenfalls als "Juvfmimiein A-" (früher von der Anmelderin als
«Antibiotikum T-1124-A" bezeichnet), »Juvenimicin A2"
(früher »Antibiotikum T-1124-B"), «Juveniraicin A3"
(früher !"Antibiotikum T-1124-0"), '»Juvenimioin A4"
(früher »Antibiotikum φ-1124-D»), "Juveniraicin Bj",
"Jiiveniiaioin Bg", »Juvenimicin Β," und "Juveniraioin B^"
H Ö 8 β · / 1 A 4-8 ORIGINAL INSPECTED
bezeichnet worden sind. In dieser Beschreibung und in den Ansprüchen wird daher jeder dieser aktiven Bestandteile
oder ein Gemisch von zwei oder mehr dieser Bestandteile einfach mit äem Sammelbegriff "Juvenimieln"
bezeichnet« falls nicht anders angegeben.
Die Erfindung umfaßt demgemäß das neue und wertvolle
Juvenimicin als Gesamtgemisch oder in Form der einzelnen
Mitglieder oder von Gemischen bestimmter Mitglieder»
ein Verfahren zur Herstellung der Antibiotika "Juveniraicin"
durch Züchtung von Mikrobien sowie Verfahren zur Isolierung des Produkts Juvenimicin als Gesamtgemisch
oder in Form der Einzelmitglieder oder in Form von Gemischen der Einzelmitglieder.
Die Aufgabe^ die die Erfindung sich stellt, wird gelöst
durch Kultivierung eines Juvenimicin bildenden Mikroorganismus der Gattung Mi<£sromonospora in einem geeigneten
Kulturmedium, das eine Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff und eine Quelle von verwertbarem Stickstoff
enthält, bis Juvenimicin in der Kulturbrühe in wesentlichen Mengen angehäuft worden ist, und Isolierung der
Produkte.
Für die Zwecke der Erfindung werden Mikroorganismen verwendet, die zur Gattung Micromonospora gehören und
Juvenimicin zu bilden vermögen. Zu diesen Mikroorganismen gehört beispielsweise der Stamm $-1124, der von
einer Bodenprobe des Bezirks Isumi von Osaka (Japan)
isoliert wurde. Dieser Stamm hat die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften:
1) Morphologische Eigenschaften
1) Morphologische Eigenschaften
Das. vegetative Mycel ist gut entwickelt and verzweigt,
jedoch ist kein Septum festzustellen. Der Durchmesser
beträgt 0,4 bis 0,8 u. Auf verschiedenen Medien ist das
Wachstum ziemlich gut, jedoch wire! kein Luftmyoel gebildet. Eine einzelne Spore wird an üqt Spitze der
sporentragenden Hyphen gebildet, die-vom vegetativen ■
1 09809/134B - original inspected
y 3 -
Mycel abzweigen. Die sporentragenden Hyphen haben gewöhnlich eine länge von 1 bis 2 ii, gelegentlich jedoch
von 3 bis 6 n. Zahlreiche Sporen werden gebildet, und jede Spore ist kugelförmig bis oval oder elliptisch und
hat eine Größe von 0,5 bis 1 α. χ 0,5 bis 1,3 ja und
eine glatte Oberfläche·
2) Eigenschaften der Kultur
Das Wachstum ist langsamer als bei Streptomyces im allgemeinen. Das vegetative Myeel ist in der Anfangsphase
des Wachstums farblos» jedoch später orange-gelb bis
orange-braun. Auf gewissen Medien zeigt es ein schwarzes, feucht glänzendes Wachstum.
Auf fast allen Medien wird kein lösliches Pigment gebildet.
Der Pjj-Wert für das Wachstum liegt zwischen 5 und
Das Optimum ist ungefähr der Neutralpunkt. Die Temperatur für das Wachstum "beträgt etwa 20 bis 45°C und optimal
30 bis 370C.
In der folgenden Beschreibung bedeutet "Rdg." die entsprechende
Parbbezeichnung aus Ridgway "Color Standard
and Nomenclature11. Die Beobachtungen wurden an Kultivierungen bei 280C für 14 Tage gemacht, falls nicht
anders angegeben. Die Abkürzungen HWH, "R" und "LP"
bedeuten "Wachstum1*, "Rückseite" und "lösliches Pigment".
a) Czapek-Agart
W.j mäßig, Pinkish Buff (Rdg. XXIX, 17M-d) bis
Dark Olive (Rdg. XL, 21"· - m).
R: Dark Olive (Rdg.XL, 21»» - m).
b) Ozapek-Lösungi
W.; mäßig, sinkt zu Boden, farblos mit einem leichten
Stich nach Seashell Pink (Rdg.XIV, 11' - f).
LP: nicht vorhanden.
c) Glncoae-Gzapek-Agar;
W.: schlecht, Wood Brown (Rdg. XL, 17MI)
R.t farblos bis Vinaceous-Fawn (Rdg. XL, 13MI - b).
109809/1345
LPi nicht vorhanden.
d) Glycerin-Czapek-Agar:
W.: spärlich, farblos "bis Vinaceous Buff (Rdg. XL,
17Mt - d). R..: farblos
LP: nicht vorhanden
LP: nicht vorhanden
e) Glucose~Asparagin-Agar:
W.: mäßig, Cinnamon Buff (Rdg. XXIX, 17" - b) bis
Olive-Brown (Rdg. XL, 17"' - k).
R·: Deep Olive (Rdg. XL, 21"' - k) bis schwarz
LPi nicht vorhanden
f) Nähragar;
W.: schlecht, farblos bis Pinkish Buff (Rdg.XXIX,
17H-d).
R.ί farblos
LPj nicht vorhanden
R.ί farblos
LPj nicht vorhanden
ß) Glucose-Mhragar;
W. j mäßig, faltig, Pinkish Buff (Rdg." XXIX, 17" - d)
bis Tawny Olive (Rdg. XXIX, 17M-i).
R.: farblos
LP: nicht vorhanden h) Glvcerin-Nähragar:
W.: spärlich, farblos bis Pinkish Buff (Rdg.XXIX,
17"-d) '..,■'■:
R.: farblos
LP: nicht vorhanden
LP: nicht vorhanden
i) Stärke-Agar:
W.: mäßig, dringt in das Medium ein, farblos bis
Tawny Olive (Rdg. XXIX, 17"-i) oder Brownish Olive (Rag. XXX, 19"-m) mit schwarzen Flecken«
R.: Pale Pinkish Buff (Rdg. XXIX, 17H-f).
LP: nicht vorhanden .1) Reines Agar:
W,: nicht vorhanden oder sehr spärlich, farblos LP: nicht vorhanden.
109809/1346
- 5 - V- ■
k) Hefeextrakt-Affar:
W.: reichlich, lichenös, faltig, Snuff Brown
(Rdg. XXIX, 15"-k) bis Bister (Rdg. XXIX, 15"-m)
oder schwarz.
R.r Sayal Brown (Rdg.XXIX, 15M-i).
IiPi nicht vorhanden, einen Monat später zuweilen
schwach braun.
1) Kartoffel-Stichkultur:
W,i reichlich, lichenös, faltig, Zinc Orange (Rdg.XV,
13') bis Snuff Brown (Rdg. XXIX, 15"-k).
LP: schwach grau bis dunkel gräulich-braun.
m) Möhren-Stichkultur:
W.: spärlich, Zinc Orange (Rdg. XV, 13*)·
LP: nicht vorhanden
n) Cellulose:
W.ί mäßig, Roman Sreen (Rdg. XVI, 23'-m), wird später
. gräulich-schwarz.
Der Papierstreifen bleibt unzersetzt.
o) Calclummaleat-Agar:
W,: sehr schlecht, Dark Olive-Buff (Rdg. XL, 21"·)»
später Deep Olive (Rdg. XL, 21w'-k).
R.s farblos
LP: nicht vorhanden
LP: nicht vorhanden
p) Tyrosin-Agar:
W.j sehr schlecht, farblos, später Olive Buff
(Rdg. XL, 21M'-d).
R.i farblos
LP: nicht vorhanden
LP: nicht vorhanden
q) Peptpn-Aflar:
W. ι Schlecht, Clay Color (Rdg. XXIX, 17") bis
Saooardo'8 Umber (Rdg. XXIX, 17"-Ic), später
Deep Olive (Rdg. XL, 21M1^k).
1098 09/134
. Rj farblos
LP: nicht vorhanden
LP: nicht vorhanden
r) Hydrolyse von Stärke
Enzymzone/Wachsturns% one ι 27 bis 32 mm/9 bis 10 mm.
s) Lackmusmilch
W.: Ringform auf dem Glas, orangefarben, Koagulierung und Peptonisierung. Der pH-Wert ändert sich von
6,0 bis 6,1.
t) LSffler-Hedium (bei 370O);
W.: mäßig, Zinc Orange (Rdg. XV, 13f)j Verflüssigung.
u) Gelatine-Stichkultur (1 Monat bei 240C):
W.: kein Wachstum
v) Nitratreduktion; negativ
v) Chitin: zersetzt
v) Chitin: zersetzt
x) Diß Sporen widerstehen 1 bis 5 Minuten einer Temperatur
von 800C.
Die Kulturmerkmale bei 370C sind ähnlich wie die oben
beschriebenen Merkmale, außer daß das Wachstum üppiger ist und die Farben im allgemeinen dunkler sind oder ins
Schwarze übergehen. ·
3) Ausnutzung von Kohlenstoffquellen
Die Beobachtungen nach der Methode von Pridham and Gottlieb (Journal of Bacteriology, Band 59, Seite 107
(1946)) sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
losses/mi
Kohlenstoff quelle |
Kultivie rungstempe ratur . 280C 370C |
Kohlenstoff quelle |
Kultivierungs temperatur 280C 370C |
Erythrit | - | Melibiose | ++ ++ |
Adonit | ■ ■- ■ - | Maltose | +++ ++ |
D-Sorbit | Saccharose | ++ ++ | |
Inosit | lactose | ++ + bis ++ | |
D-Mannit | - - | Raffinose | + bis ++ + |
Dulcit | Trehalose | ++ ++ | |
D-Xylose | Salicin | ++ ++ | |
L-Arabinose | - - | Esculiη | - |
L-Sorbose | - - | Inulin | + bis + |
D-Galactose | Stärke | +++ +++ | |
D-Glucöse | Na-Acetat | ++ + bis ++ | |
D-Pructose | + + | Glycerin | - |
D-Mannose Rhamnose |
- - | Kontrolle | ■ -■■■■■ - |
+++s reichliches Wachstum
++! gutes Wachstum
+ι ziemlich gutes Wachstum
+: schwaches Wachstum
-: kein Wachstum
++! gutes Wachstum
+ι ziemlich gutes Wachstum
+: schwaches Wachstum
-: kein Wachstum
Die durch den Stamm T-1124 gebildeten Antibiotika sind
sog. Makrolid-Antibiotika, aber der einzige Stamm von Micromonospora, von dem bekannt ist, daß er ein Makrolid-Antibiotikum
bildet, ist Micromonospora W-847» dessen
Fähigkeit, Megalomicine zu bilden, in der holländischen Patentanmeldung 68 07 363 und in The Journal of Antibiotics,
Band 22 (Nr.6), Seite 253 ff. (1969) beschrieben wurde. Diese bekannten Stämme der Gattung Micromonospora
wachsen auf Glucose-Asparagin-Agar und Bennet-Agar nur
schlecht, bilden auf Tyrosin Agar ein braunes lösliches Pigment und sind im wesentlichen unfähig, auf Medien zu
Wachsen, die Cellulose, Galactose oder Raffinose als einzige Kohlenstoffquelle enthalten. Im Gegensatz hierzu
zeigt der Stamm T-1124 gutes Wachstum auf den oben ge-
109809/1345
nannten Medien ohne Pigmentbildung«, Der letztgenannte
Stamm ist somit von den bekannten Stämmen Micromono~
epora W-84-7 verschieden»
Hinsichtlich der mikrobiologischen Eigenschaften des Stamms 3M124 läßt ein Vergleich mit 91Bergeyss Manual
of Determinative Bacteriology's 7«»Auflage (herausgegeben
von The Williams & Wilkins Co9 1957), S0A0 Waksman
"Actinomycetes"j Band 2 (herausgegeben von The Williams
& Wilkins Co« 1961) uswe darauf schließen^ daß der
Stamm T—1124 mit Micromonospora chalcea verwandt istο
Der Stamm ist somit aerob,, und seine sporentragenden
Hyphen sind, verhältnismäßig lang und nicht stark ver~
sweigt. Außerdem bildet der Stamm kein Luftmycelo In
dieser Hinsicht ähnelt er Micromonospora chalceao Der
Stamm ähnelt ferner Micromonospora chalcea insofern^ als er Milch koaguliert und peptonisiertp Stärke hydro™
lysiert, Chitin zersetzt und Saccharose invertierte
Während jedoch Micromonospora chalcea Mitrate reduziert„
Gelatine verflüssigt, und Cellulose schnell zersetztD
reduziert der Stamm QM124 Nitrate nicht0 Er wächst
nicht auf Gelatine und zersetzt Cellulose nicht„ obwohl
er darauf wächst· Angesichts der vorstehenden Beobachtungen wurde der Stamm T-1124 als Micromonospora
chalcea var. izumensiSg d.h. als Variant νο.Ώ Micromonospora chalcea bezeichnete
Der Stamm T-1124 ist beim Institute for Fermentation
Osaka (Japan) unter der Nr0 IFO=I2988 hinterlegt worden«
Ebenso wie andere Actinomyceten wie Streptomyces unterliegen die Charakteristiken der Stämme von Micromonospora
im allgemeinen der Mutations gleichgültig^ ob die
Mutation spontan oder künstlich beispielsweise mit Röntgenstrahlen, Ultraviolettlicht oder Einwirkung von
chemischen rautagenen Verbindungen wie Stickstofflost,,
Nitroooguanidin oder Schwermetallsalzen hervorgebracht
109809/134$
wird· Von diesen Mutanten sowie ihren Wildstämmen können
für das Verfahren gemäß der Erfindung alle diejenigen verwendet werden, die Juvenimicin "bilden.
Gemäß der Erfindung werden Mikroorganismen, die Juvenimicin bilden und zur Gattung Micromonospora gehören,
in einem Medium kultiviert, das Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff, Quellen von verwertbarem Stickstoff
und andere Nährstoffe enthält. Das Kulturmedium kann
flüssig oder fest sein, jedoch ist ein flüssiges Medium
vorteilhafter und zweckmäßiger. Am vorteilhaftesten ist die Subraerskultur mit Bewegung durch Belüftung.
Im Medium für den Juvenimicin bildenden Mikroorganismus
werden Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff wie Glucose, lösliche Stärke, Saccharose und Dextrin und
Stickstoffquellen, die durch den Mikroorganismus verwertbar
sind, z.Bo Maisquellwasser, Polypepton, rohes Sojabohnenraehl
und Baumwollsaatmehl, sowie die üblicherweise für die Kultivierung von Mikroorganismen verwendeten
anorganischen Salze verwendet. Besondere Schwermetallsalze,
z.B. Eisen(IZ)-sulfat und Magnesiumsulfat, oder
ein Antischaummittel können nach Bedarf zugesetzt werden.
Die Kultivierungsbedingungen, z.B. die Temperatur, die Bebrütungsdauer und der p^-Wert des Mediums, werden so
gewählt, daß der verwendete Mikroorganismus wächst und die Bildung von Antibiotika maximal ist. Wenn beispielsweise
Micromonospora chalcea var. izumensis verwendet wird, beträgt die Kultivierungszeit vorteilhafte bis
7 Tage. Das Medium wird vorzugsweise bei einem p„-Wert zwischen etwa 5 und 8 gehalten, und die Bebrütungstemperatur
liegt zwischen etwa 20 und 450O und zur Erzielung besserer Ergebnisse zwischen 27 und 340C.
Die in der beschriebenen Weise erhaltene Permentationsbrühe
enthält die Komponenten von Juvenimicin. Die Isolierung dieser Gruppe von Antibiotika aus der Fer-
109809/1345
mentationsbrühe kann nach den Methoden erfolgen,, die
bisher zur Gewinnung der Metaboliten eines Mikroorganismus aus seiner Fermentationsgase angewandt wurden.
Beispielsweise kann unter Wahrnehmung des Vorteils9 daß
die Antibiotika dieser Klasse basische fettlösliche Substanzen sind, die Abtrennung nach Methoden, bei denen
diese Eigenschaften ausgenutzt werden^ erfolgen.
Da diese Antibiotika vorwiegend in der flüssigen Phase der Fermentationsbrühe angehäuft werden, kann die Brühe
zuerst filtriert werden, worauf die aktiven Bestandteile mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen
Lösungsmittel aus der filtrierten Brühe oder aus dem Filtrat extrahiert werden können» Beispielsweise wird
die Fermentationsbrühe bei ρ»! 7 bis 10 in Gegenwart von
etwa 3 bis 5 Gew.-$ Diatomeenerde als Filterhilfsmittel
gut gerührt und dann filtriert. Das erhaltene Filtrat wird mit einem organischen lösungsmittel extrahiert, das
mit Wasser nicht oder nicht vollständig mischbar istj
z.B. mit einem Ester einer niederen Fettsäure (z.B, Ä'thylacetat und Amylacetat), einem aromatischen Kohlenwasserstoff
(z.B· Benzol und Toluol), einemchlorierten
Kohlenwasserstoff (z.B. Methylenchlorid und Chloroform), einem Keton (z.B. Methylisobutylketon und Methyläthylketon),
einem Alkohol (z.B. n-Butanol und Isoamylalkohol) oder einem Gemisch von zwei oder mehreren dieser Lösungsmittel.
Die aktiven Bestandteile können an einem Adsorptionsmittel wie Aktivkohle, weißer. Kohle (kolloidales SiIlciumdioxyd,
im Handel beispielsweise unter der Bezeichnung "Amberlite XAD" erhältlich), einem schwach sauren
Kationenaustauscherharz (z.B. "Amberlite IRC-SO") oder einem stark sauren Kationenaustauscherhars (z.B.
"Amberlite iR-120n oder "Dowex 50w), adsorbiert und dann
mit einem geeigneten Lösungsmittel eluiert werden·
Der auf diese Weise erhaltene Extrakt wird mit einer sauren wässrigen Lösung, z.B. einer Pufferlösung, die
.einen PjT-Wert von etwa 2 bis 6 hat, oder einer verdünn»
ten anorganischen Säure, die einen pg-Wert von 3 ."bis 6
hat, weiter extrahiert, wobei die aktiven Bestandteile
in die wässrige Phase überführt werden. Diese wässrige
Lösung wird abgetrennt und dann durch Alkalizusatz auf pH 7 bis 10 eingestellt, wodurch die aktiven Bestandteile
erneut in eine neu zugesetzte, mit Wasser nicht oder nicht vollständig mischbare organische Lösungsmittelphase
überführt werden können. Die organische Lösungsmittelschicht wird abgetrennt, mit Wasser gewaschen,
dehydr.atisiert und unter vermindertem Druck eingeengt. Hierbei wird das Antibiotikum Juvenimicin in Form eines
Pulvers erhalten.
Aus diesem pulverförmigen Juvenimicin können die jeweils
gewünschten Antibiotika nach Methoden wie Adsorptionschromatographie,
.Gelfiltration, Adsorption an Ionenaustauschern
usw„, die allein oder in T asfei nation.,angewandt
werden, abgetrennt werden. Als Adsorptionsmittel . eignen sich beispielsweise Kieselgelt *-Aluminiumoxyd,.-Aktivkohle,
-kollc? dales Siliciumdioxyd "Amberlite■ XAJ)." '
u.dgl.. Pur die'Gelfiltration eignet sich das Produkt
der Handelsbezeichnung "Sephadex LH-20" (Dextranteilchen,
Hersteller Pharmacia Co., Schweden). Als Ionenaustauscherharze eignen sich die Produkte der Handelsbezeichnung
»Amberlite IRC-50», "Amberlite IR-120» und
HDowex 50" (siehe oben). Es ist zweckmäßig, als Lösungsmittel,
das als Elutionsmittel im Falle der Verwendung von Kieselgel als Adsorptionsmittel dient, ein Gemisch
eines niedrigpolaren Lösungsmittels (z.B. Chloroform oder Äthylacetat) und eines polaren Lösungsmittels
(z.B. Methanol oder wässriges Ammoniak) zu verwenden. Bei Verwendung, von Aktivkohle als Adsorptionsmittel
eignen sich beispielsweise wässriges Methanol, wässriges Aceton, Methanol, Aceton, Äthylacetat und Chloroform
109809/
als Elutionsmittel. Äthanol ist besonders zu empfehlen, wenn das Produkt "Sephadex LH-20" als Adsorptionsmittel
verwendet wird.
Wie bereits erwähnt, besteht das Antibiotikum gemäß der Erfindung aus mehreren Komponenten· Dies läßt sich
leicht bestätigen, indem das Gemisch der Antibiotika der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unterworfen
wird, z.B, an dem Produkt der Handelsbezeichnung "Spotfilm f (Hersteller Tokyo lasei K9K0, Japan) unter
Verwendung eines Entwicklergemisches, das aus Chloroform, Methanol und einer Tfoigen wässrigen Ammoniaklösung
besteht (Volumenverhältnis 40x12120), wobei deutliche
Flecken auf dem Ohromatogramm erscheinen» Die Komponenten
werden grob in zwei Gruppen eingeteilt9 nämlich Juvenimicin
A und Juvenimicin B, wobei diese Gruppen mehrere Komponenten umfassen. Alle Komponenten werden als A^2
A«, A,, Α., Β.« s Bp9 B,, und B« in der Reihenfolge abnehmender
Rf-Werte auf dem Dünnschichtchromatogramm
bezeichnet. Die Komponenten haben die folgenden Rf-Wertes
A1 s | 0,85 | + | 0,05 | |
Juvenimicin A | Ia2 : | 0,80 |
±
± |
0,05 |
P: | 0,65 | 0,05 | ||
Tb1 : | 0,50 | ± | 0,05 | |
Juvenimicin B | Jb2 , JB3 ί |
0,40 | ± | 0,05 0,05 |
Bl * | 0,25 | + | 0,05 |
Die charakteristischen Eigenschaften der jeweiligen Gruppen (Juvenimicin A und Juvenimicin B) sowie die
hauptsächlichen speziellen Bestandteile sind nachstehend genannt,
Juvenimicin A (hergestellt gemäß Beispiel 1)
1) Elementaranalyse:
C: 63,39 + I1O; H: 8,83 + 0,5» Ni 2,80 + O95
109809/134S
2) Spezifische Drehung
j4 =-13,4°± 10° (C= O,5# in CHCl)
^) Molekulargewicht
a). Dampfdruck-Osmosemethode: 655 + 70 (in CgHg)
b) Höchste Massenzahl: m/e = 581
4) farbreaktion
a) Erythromyeintest: negativ
b) Carbomyeintest: negativ
c) Dragendorff-Reaktion: positiv
5) Löslichkeiten löslich in Benzol, Chloroform, Äthylacetat,
Dimethylformamid, Äthanol und wässrigen Säure
/..-■■
lösungen; unlöslich in Petroläther, η-Hexan oder
neutralem Wasser.
6) Ultraviolettabsorption: wie in Pig.5 dargestellt
(E iom ■ 23° i
7) Infrarotabsorption: wie in Pig,1 dargestellt. Hauptsächliche
Absorptionsbanden in Wellenzahlen (cm )i 3450 (stark), 2960 (stark), 1725 (stark), 1695 (mittel)
1625 (stark), 1458 (mittel), 1383 (mittel), 13H (mittel), 1276 (mittel), 1250 (schwach), 11.80. (stark),
1167 (stark), 1111 (stark), 1072 (stark), 1047(stark),
1027 (mittel), 983 (stark), 966 (Schulter), 932 (schwach), 896 (mittel), 869 (schwach), 846 (schwach),
834 (schwach), 792(mittel), 755 (schwach), 713 (schwach).
8) Akute Toxizitat bei der Maus (LD50);
Intravenöse Injektion von 100 bis 200 mg/kg Intraperitoneale Injektion: 200 bis 400 mg/kg
Orale Verabreiqhungj >1000 mg/kg
9) Effektive Dosis (EDcq)j Beobachtet an 4 Wochen alten
Mäusen, die mit Staphylococcus aureus infiziert waren; subkutane Injektion* ED^0 » 7»1 mg/kg
10*809/1-345.
Juvenimiein A^ (hergestellt gemäß Beispiel 3):
Elementaranalys'e
C: 62,97 + 1,0; H: 8,62 + 0,5; N: 3,00 + 0,5
2) Spezifische Drehung §
ßjjf = -17,6° + 10° (C= 0,29$ in CHCl3).
3) Molekulargewicht:
a) Dampfdruck-Osmosemethodet 541 + 60 (in CgHg)
b) Titrationsmethodei 562 + 60
c) Höchste Massenzahl: m/e = 581
4) pKa1 = 8,4 (in 66#igem Dimethylformamid)
5) Farbreaktion: wie bei Juvenimiein A
6) Löslichkeiten: . wie bei Juvenimiein A
7) Rf-Werte auf dem Papierchromatogramm: Papier: Toyoroshi Nr.51; entwickelt mit
a) wässriger 0,05 n-Ammoniaklösung,
gesättigt mit Methylisobutylketpn: 0,74 +0,1
b) Gemisch von Methylisobutylketon
und Methyläthylketon (4:1) 0,68+0,1
c) Methylisobutylketon 0,57 + 0,t
d) M-15-Phosphatpuffer, gesättigt mit
n-Butylacetat (p« 8,0; (das Papier wird mit 2# flüssigem Paraffin imprägniert)
0,60+0,1
e) Gemisch von Benzol und Cyclohexan (IM), gesättigt mit Formamid
(das Papier wird mit einem Gemisch von Formamid und Methanol (1s1)
imprägniert) 0,02 + 0,02
f) Wässriger0,05 n-Ammoniaklösung,
mit n-Butyläthylketon gesättigt 0,^ + 0,1
8) Rf-Werte bei der Dünnschichtchromatographie»
a) Adsorptionsmittel: Kieselgel ("Chromatospot",
Tokyo Kasei K.K.)
Elutionsmittels Gemisch von Chloroform, Methanol
und 7^iger wässriger Ammoniaklösung(4Oi12iao)
0,7 + 0,p5
' 109809/1348 ■
■ ' - 15 -
b) Adsorptionsmittel; Aluminiumoxyd (Merck & Co.) Elutionsmittel: Xther 0949 + 0,05
Unter den gleichen Bedingungen hatten andere Komponenten die folgenden Rf-Werte:
A1 ϊ 0,72 + 0,05
A2 i 0,72 +0,05 A, : 0,07 + 0,05
c) Adsorptionsmittel! Aluminiumoxyd (Merck & Co.) Elutionsmitteli Gemisch von Benzol und Aceton (4:1)
0,65 + 0,05
Unter den gleichen Bedingungen hatten andere Komponenten die folgenden Rf-Werte:
• A1 ί 0,80 + 0,05
A2 : 0,80 + 0,05 A4 : 0,29 £ 0,05
9) Ultraviolettabsorption: wie bei Juvenimicin A
10) Infrarotspektrum: wie in 3?ig.2 dargestellt mit folgenden
hauptsächlichen Absorptionsbanden als Wellenzahl (cm ):
3450 (stark), 2960 (stark), 1725 (stark), 1695(mittel),
1625 (stark), 1 ^8 (mittel), 1383 (mittel), 13H
(mittel), 1276 (mittel), 1250 (schwach), 1180 (stark),
1167 (stark), 1111 (stark), 1072 (stark), 1047(stark), 1027 (mittel), 983 (stark), 966 (Schulter),
932 (schwach), 896 (mittel), 869 (schwach), (schwach), 834 (schwach), 792 (mittel), 755 (schwach),
713 (schwach).
Juvenimicin B1 (hergestellt gemäß Beispiel 6)
1) Elementaranalyses
C: 64,0 + 1,0; H: 9,4 ±0,5; N: 2,5 + 0,5
2) Spezifische Drehung:
ß.J?Q =-3,0° + 5° (C= 0,5$ in Methanol)
-J2^ = 7,6° + 5° (C= 0,5# in CHCl3)
109809/1345
3) Massenspektrometrie: Höchste Massenzahl! m/e =
4) Farbreaktionί
a) Erythromycintest: negativ
\>) Oarboraycintesti negativ
c) Dragendorff-Reaktionί positiv
5) Löslichkeiten; wie bei Juvenimicin A
6) Ultraviolettabsorption: wie in Pig.6 dargestellt
± 2T (K1 cm
7) Infrarotabsorptionsspektrumi wie in Fig. 3 dargestellt,
gemessen nach der KBr-Methode. Hauptsächliche
Absorptionsbanden in Wellenzahlen (cm ): 5450 (sehr stark), 2940 (sehr stark), 1715 (stark),
1670 (stark), 1595 (sehr stark), 1455 (mittel), 1380 (mittel), 1312 (stark), 1272 (mittel), 1175
(sehr stark), 1110 (stark), 1065(sehr stark)
1050 (sehr stark), 1024(SCIhUItOr), 985 (aehr stark),
928 (schwach), 905 (schwach), 889 (schwach), 843 (schwach), 805 (schwach).
8) Akute Toxizität (LD50) ^ei <*e]r Maus:
Intraperitoneale Injektionϊ 125 bis 250 mg/kg
9) Effektive Dosis: ermittelt an 4 Wochen alten Musen, die mit Staphylococcus aureus infiziert wurden:
Subkutane Injektion: /· i^GQ = 5#81 mg/kg
Orale Verabreichung: BPcq=81,2 mg/kg
Juvenimicin B, (hergestellt gemäß Beispiel 6)ί
1) Elementaranalyse:
C: 64,7 +1,0; H: 10,2 + 0,5; N: 3,6 + 0,5
2) Spezifische Drehung:
= -9,0° +5° (c = 0,5$in Methanol) ■ = +5,6° + 5° (c= 0,5$ in OHCU)
109809/1345
3) Massenspektrometrie:
Höchste Massenzahl m/θ = 583
Höchste Massenzahl m/θ = 583
4) Farbreaktion: wie bei Juvenimicin B^
5) Iiöslichkeiten: wie bei Juvenimicin B.. .
6) Ultraviolettabsorption: wie in Pig .7 dargestellt»
2 ψ ^]L ~UQ ± 25>
7) Xnfrarotspektrum: wie in Pig,4 dargestellt, gemessen
nach der KBr-Methode. Hauptsächliche Absorptionsbanden
in Wellenzahlen (cm-1): {mittel),
3450 (sehr stark), 2940 (sehr stark5/1670 (mittel),
1595.(stark), 1455 (stark), 1380 (stark), 1312(stark). 1275(mittel),117O(stark)i111O(stark),1O7O(sehr stark),
1045 (sehr stark), 985 (stark), 935 (schwach), 905 (schwach), 887 (schwach), 840 (schwach), 808
(schwach).
8) Akute Toxizität (LD50) ^ei der
Intraperitoneale Injektion: 250-500 mg/kg
Intraperitoneale Injektion: 250-500 mg/kg
9) Effektive Dosis:
Beobachtet an 4 V/ochen alten Mäusen, die mit Staphylococcus aureus infiziert waren, bei subkutaner Injektion:
ED50 = 5,0 mg/kg . ..
Die Antibiotika "Juvenimicin" gemäß der Erfindung werden
nachstehend mit bisher bekannten Antibiotika verglichen.
Von den durch Micromonospora gebildeten Antibiotika sind lediglich die Megalomicine A, B, Cj und C^ als
Makrolid-Antibiotika bekannt. Die letzteren werden durch
Micromonospora sp. W-847 (URRL-3274) (siehe holländische
Patentanmeldung 68.07363)gebildet»Javenimicin unterschGidet
sich davon wesentlich in der Elementaranalyse 9 im Xnfrarotspektrum
und in der spezifischen Drehung von den Meßalomicinen, die ein größeres Molekül haben als
Juveniraicin: und die zwei Stickstoffatome im Molekül
enthalten, während Juvenimicin nur'ein Stickstoffatom
1. MoXem enthält.
Von den bekannten Makrolid-Antibiqtika haben Girramycin A
(A1 bis A^) und R-491-A die maximale UV-Absorption bei
240 mu, jedoch Werden diese Antibiotika sämtlich durch
Mikroorganismen der Gattung Streptomyces gebildet. Juvenimicin A unterscheidet sich jedoch deutlich von
Cirramycin A^ (Koshiyama und Mitarbeiter, Journal of
Antibiotics, Japan, (A) Band 22, Seite 61 (1969)) in
der Löslichkeit, im Molekulargewicht, in der Infrarotabsorption, im Erythromycintest, Carbomycintest usw. und
auch von Cirramycin A2, A,, A- und A,- in den Rf-Werten
der Papierchromatographie. Bas Antibiotikum R-491-A.
(ishida und Mitarbeiter, Vortrag bei der Tagung des Tohoku Branch der Pharmaceutical Society of Japan,
gehalten im Dezember 1964) unterscheidet sich deutlich
von Juvenimicin A in der Infrarotabsorption«,
Aus den vorstehend genannten Beobachtungen wurde geschlossen, daß Juvenimicin A und Beine Komponenten A^,
A«, A, und A. neue Antibiotika sind.
Für Juvenimicin B1 und B, ist eine starke Xnfrarotab-
-1
sorption bei 1720 cm , die bestätigt, daß es sich um
Makrolid-Antibiotika handelt, sowie eine maximale UV-Absorption in der Nähe von 280 mu/ charakteristisch.
Zu den bekannten Makrolid-Antibiotika haben die folgenden die maximale UV-Absorption in der Mähe von 280 ims
Carbomycin B (F»A.Hochstein und Mitarbeiter, The Journal
of American Chemical Society, Band 7βέ S.5080 (1954))»
Niddamycin. (G.Huber and Mitarbeiters, Jtaa©imittelfor->
scliung Banö 12, S01191 (1962)),, Kelomycin (HoA0 Whaley
and Mitarbeiters Antimierotial Ageats and CJaemotaerapy
1963» S645)0 Tylosin (J0M0 MeGtair® und MItarbeit@r9,
Antibiotics and Chemotherapys Baaä .118 S0520 (1961))D
Antibiotic PA-108 (K0Murai and Mitarbeiters IMa0 Band 9,
5 (1959)) j. Maorociia (EoioHamill und Mitarbeitert
Α1)1)ο·6·6«29119 (PoPoHuog assi Mitarbeiter0 AppÜeä
biology0 Band 13e Se216 (1965)) mä Antibioti© 1=188
(japanische Patentveröffentlichung 2994/1964). Die
Juveniniicine B.. und B, unterscheiden sich jedoch deutlich
von diesen bekannten Makrolid-Antibiotika in der spezifischen Drehung, in der Infrarotabsorption, Elementaranalyse
usw., so daß sie als neu anzusehen sind.
Die antimikrobischen Spektren sind in Tabelle 2 genannt.
Pur die Messung der hemmenden Mindestkonzentration wurden übliche Bakterien als Testorganismen 18 Stunden
bei 370C auf Bouillon-Agar bebrütet. Säurefeste Bakterien
wurden auf Glycerin-Bouillon-Agar 40 Stunden bei 37°C bebrütet. Im Falle der phytotoxischen Bakterien
wurde Glucose-Bouillon-Agar als Versuchsmedium verwendet.
. Tabelle 2
Test-Mikroorganismus | Hemmende A |
Mindestkonzentration,/Ug/m! ' -A3 B1 B3 |
100 | >100 |
Escherichia coli | 10 | 5 | 100 | 100 |
Proteus vulgaris | 20 | 10 | >100 | >100 |
Pseudomonas aeruginosa | 100 | 100 | 10 | 10 |
Staphylococcus aureus | 0,5 | 0,5 | >100 | >100 |
dto.. (gegen Oleando- mycin und Erythromycin resistenter Stamm) |
>100 | >100 | 1 | 10 |
Bacillus subtilis | 0,1 | 0,1 | 5 | 10 |
Bacillus cereus | 0,1-0,2 | 0,1 | 10 | 50 |
Bacillus brevis | 0,5, | 0,2 | 0,5 | 0,5 |
Sarcina lutea | 0,05 | 0,05 | 0,5 | 0,5 |
Micrococcus flavus | 0,05 | 0,05 | >100 | MOO |
Mycobacterium avium | >100 | >100 |
dto.(Streptomycin-re-
sistent) >100 >100
>100 >100
dto.(Neomycin-resi-
stent) >100 >100 >100 >100
Mycobacterium sp.6O7 >100 >100 >100 >100
Mycobacterium ijhlei 50 100 100
>100
Mycobacterium smeg- *
matis 50 100 100 >100
Xanthomonas oryzae. <1,0 <1,0 — —
109809/134S.
Staphylokokken sind pyogene oder eiterbildende Bakterien«
Sie pflegen umgrenzte Läsionen beispielsweise in:Form von
Abszessen u»dgle hervorzurufeη B die häufig in der Haut ■
auftreten. Staphylokokken sind die Ursache von Furunkeln
und Karbunkeln «ad anderen üblichen Wundinfektionen© Die neuen' Produkte gemäß der Erfindung sind wertvoll für örtlich
anzuwendende Zubereitungen für die Behandlung dieser Art von Infektionen bei Warmblütern (Hunde8Kat2en9
Menschen usw,)· Eine brauchbare Zubereitung für die örtliche
Anwendung sur Behandlung einer auf Staphylopoccus
aureus zurückzuführenden Infektion hat beispielsweise die folgende Zusammensetzung %
In 1 g Wollfett wird elaes der folgenden Antibiotika
gleichmäßig eingearbeitet 8
1) 20 mg Juvenimiein A9 2) 20 mg Juvenimicin A^
3) 50 mg Juvenimioin B1 oder 4) 50 mg Javenimiein B^o
Das Gemisch wird dann gleichmäßig mit weißem Petrolatum in einer solchen Menge gemischt s daß 10 g Salbe erhalten werden» Diese Salbe wird örtlich in einer Menge8 die
zur Bedeckung der behandelten Wunde genügt9 unter leichtem Einreiben aufgebrachte Die Behandlung erfolgt wenigstens einmal täglich und wird,, falls erforderlich oder
erwünscht, mehrmals täglich
Infolge der oben genanatea "bakteriziden unä "bakteriosta^
tischen Eigenschaften eignen sich die neuen Produkt© gemäß der Erfindung beispielweise zur Desinfektion ύόώ
Geräten in Krankenhäusern uswOi) äie im allgem©in@n
pathogenen grampositiveo- ©der grasmegativen Bakt©ri©sa
ausgesetzt sind9 äie ©apfindlich gegenüber den oben ge=»
nannten Produkten sind0 Die Desinfektion ©rf©Igt dureh
Auftrag oder Aufsprühen einer Lösung (soBo iß Methanol
oder Äthanol)9 die ©ine der folgenden Komponenten enthält ι
1) 20 fig/nl JüveaiiBieiß Ag 2) 20 jug/ml Jiw
3) 50 /ig/ml Juvenimiein B^, ©der 4) 50 lag/ml
B
In den folgenden Beispielen beziehen sich die Prozentsätze bei der Angabe der Zusammensetzung der Kulturmedien
auf Gewicht/Volumen, d.h. g/100 ml. Im übrigen
sind alle Prozentsätze auf das Gewicht bezogen, falls
nicht anders angegeben.
Je 30 ml eines Impfkulturmediums (pH 7,0)* bestehend aus
5,0 % -löslicher Stärke, 0,5 % Glycerin, 1,0 % Sojabohnenmehl,
0,5 % Fleischextrakt, 0,01 % Eisen (Il)-sulfat,
0,1 % Magnesiumsulfat, 0,5 % Kaliumcarbonat, 0,05 % PoIyoxypropylentriol
mit einer OH-Zahl von 56 (Handelsbezeichnung "Äctoeol", hergestellt von der Anmelderin) als Antischaummittel
und Wasser wurden in 200 ml-Kolben sterilisiert
und mit einer Schlaufenmenge Micromonospora chalcea var. izurnensis (IFO-I2988) von einer Agar-Schrägkultur
geimpft. Die geimpften Kulturen wurden auf einer rotierenden
Schüttelvorrichtung 40 Std, bei J57°C bebrütet. Die
Impfkulturen wurden in 5OO ml des sterilisierten Impfkulturmediums
der gleichen Zusammensetzung in 2 1-Sakaguchi-Kolben
überführt, worauf weitere 40 Stunden bei 28 C auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung
bebrütet wurde.
Die Impfkultür wurde in einer Menge von 1,5 1 in einen
50 1-Behälter aus nichtrostendem Stahl überführt, der
^O 1 eines sterilisierten Hauptkulturmediums (pH 7*0)
enthielt, das aus 5,0 % löslicher Stärke, 5,0 % Mais»
quellwasser, 0,5 % Fleischextrakt, 0,01 % Eisen (II)-sulfat,
0,1 % Magnesiumsulfat, 1 $ Kaliumcarbonat, 0,05 %
des obengenannten Polyoxypropylentriols als Antischaummittel und Wasser bestand. Das Gemisch wurde bei 28 C
unter Belüftung mit JO 1 Luft/Minute und unter Rühren
mit 28Ο UpM 114 Stunden bebrütet. Der.Fortgang der Fermentation ergibt sich aus der folgenden Tabelle:
109809/1345
Bebrütungs- | - pH-Wert. | Wirksamkeit"' | _ | 0 |
dauer (Std.) | der Brühe | (7 /ml) | 0 | |
O | 7,20 | 5,0 | ||
18 · | 7,50 | 13,5 | ||
30 | 6,70 | 18,0 | ||
42 | 7,30 | 21,0 | ||
54 | 7,65 | . 27,0 | ||
66 | 7,50 | 25,0 | ||
78 | 7,55 | |||
90 | 7,95 | |||
102 | 8,33 | |||
114 . | 8,25 |
+'Ermittelt nach der Papierscheibenmethode mit Azotobacter
vinelandii als Test-Mikroorganismus»
Die auf diese Weise erhaltene Kulturbrühe (23*5 1) wurde
mit 750 g Diatomeenerde als Filterhilfsmittel filtriert.
Das Filtrat wurde mit einer wäßrigen 2n-Natriumhydroxydlösung auf pH 9,0 eingestellt, worauf 2 kg Natriumsulfat
zugesetzt wurden. Nach vollständiger Auflösung des Natriumsulfats wurde das Filtrat zweimal mit je 11 1 Äthylacetat
extrahiert. Die Lösungsmittelschicht wurde mit Wasser gewaschen* deh'ydratisiert und unter vermindertem
Druck auf 1 1 eingeengt» Das Konzentrat wurde mit 3 1
verdünnter Salzsäure (pH-Wert etwa 3-4) ausgeschüttelt,,
um die wirksamen Bestandteile in die wäßrige Schicht zu überführen. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt s erneut
auf pH 9 eingestellt und zweimal mit je 1 1 Kthylacetat extrahiert. Mit den so erhaltenen Extrakten wurde die
Überführung mit Säure und die Extraktion mit Äthylacetat wiederholt. Der endgültige Äthylacetatextrakt wurde mit
Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck einge-
dampft, wobei 450 mg eines rohen Pulvers erhalten wurden»
Das Pulver wurde in 10 ml Äthanol gelöst und die Lösung der Säulenchromatographie an 150 ml "Sephadex
LH-20" (siehe oben) unterworfen, wobei I65 mg Juvenimicin
A erhalten wurden.
Eine Impfkultur wurde auf die im Beispiel 1 beschriebene
Weise in einem 2 1-Sakaguchi-Kolben hergestellt und in
30 1 eines sterilisierten Impfkulturmediums der gleichen
Zusammensetzung in einem 50 1-Behälter aus nichtrostendem
Stahl geimpft. Die Kultivierung wurde 48 Stunden bei 28 C unter Belüftung und Rühren auf die in Beispiel 1
beschriebene Weise durchgeführt. Die Kulturbrühe wurde
als Impfkultur verwendet.
Die Impfkultur wurde in 100 1 eines sterilisierten Hauptkulturmediums
(pH 7,0) überführt, das aus 5*0 % löslicher
Stärke, 3,0 % Maisquellwasser, 0,5 % Fleischextrakt;,
0,05 % Eisen (Il)-sulfat, 0,1 fo Magnesiumsulfat^ O11 5 %
Kaliumcarbonat, 0,05 $ des oben genannten Polyoxypropylentriols
als Antischaummittel und Wasser bestand ur.d in einem 200 1-Behälter aus nichtrostendem Stahl enthalten
war. Die Fermentation wurde'90 Stunden bei 280C unter Belüftung
mit 100 1 Luft/Minute und unter Rühren bei 150
UpM durchgeführt. Der Verlauf der Fermentation ergibt sich aus der folgenden Tabelle:
Wirksamkeit ( 7/ml)
20,0 40,0 70,0 95,0 100,0 100,0
Bebrütungs- | pH-Wert |
dauer (Std.) | der Brühe |
0 | 7,05 |
18 | 7,05 |
30 | 7,10 |
42 | 6,60 |
54 | 7,28 |
66 | 7,30 |
78 | 7,55 |
90 | 7,90 |
109809/134
Die auf diese Weise erhaltene Kulturbrühe (58 l) wurde
mit 1,5 kg Diatomeenerde als Filterhilfsmittel filtriert. Das Piltrat wurde auf pH 9 eingestellt und auf die in
Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet, d„ h0 unter
Verwendung von Äthylacetat und verdünnter Salzsäure, wobei 4,5 g eines rohen Pulvers erhalten wurden» Das Pulver
wurde mit j5OO ml "Sephadex LH-20" (siehe oben) gereinigt,
wobei 2,9 g pulverförmiges Juvenimicin A erhalten wurden.
w In 20 ml Äthylacetat wurden 148 g Juvenimicin A, das auf
die in Beispiel 1 beschriebene Weise erhalten worden war, gelöst. Die Lösung wurde der Dünnschichtchromatographie
an Kieselgel (Merck, HP 254) (40 χ 40 cm) unterworfen, wobei ein Gemisch von Chloroform, Methanol und 7$igem
wäßrigem Ammoniak (Volumenverhältnis 40 : 12 s 20) als Entwickler verwendet wurde. Das Kieselgel wurde bei einem
Rf-Wert von etwa 0,7 entnommen und mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, dehydratisiert
und unter vermindertem Druck eingedampfts wobei
650 mg Juvenimicin A^, erhalten wurden«
45 1 einer KuIturbrühe, die auf die in Beispiel 2 beschriebene
Weise erhalten worden wars wurde auf pH 9 eingestellt
und zweimal mit Qe 25 ml Äthylacetat extrahiert«,
Die Extrakte wurden vereinigt und auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitete wobei 4^0 g eines rohen
Pulvers erhalten wurden» Das Pulver wurde an Kieselgel unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Entwicklers
chromatographiertj, wobei 1S4 g Juvenimicin A.
erhalten wurden„
1 0 Q ft fl 9 J
1 y j o u w /
- 25 Beispiel 5
Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde wiederholt mit dem Unterschied, daß j50 1 eines sterilisierten Hauptkulturmediums
(pH 7) der folgenden Zusammensetzung verwendet wurden: 5,0 % lösliche Stärke, 1 % Maisquellwasser, 1 % Baumwollsaatmehl, 0,5 % Fleischextrakt, 0,5 %
Pepton, 0,05 % Eisen (II)-sulfat, 0,1 % Magnesiumsulfat,
1 % Kalziumcarbonat, 0,05 % des in Beispiel 1 genannten
Polyoxypropylentriols und Wasser. In diesem Fall verlief die Fermentation wie folgt:
Bebrütungs- | pH-Wert | Wirksamkeit |
dauer (S td.)_ | der Brühe | (7/ml) |
0 | ' 7,10 | |
18 | 7,25 | - |
30 | 7,50 | 0 |
42 | 6,85 | 0 |
54 | 7,00 | 0 |
66 | 7,12 | 5 |
78 | 7,23 | 8,5 |
90 | 7,30 | 17,5 |
102 | 7,00 | 18,5 |
114 | 7,00 | 29 |
Die von mehreren Ansätzen erhaltenen Kulturbrühen wurden
vereinigt, und 100 1 der vereinigten Brühe wurden filtriert.
Das FiItrat wurde auf pH 8,5 eingestellt und mit
der Halfte seines Volumens an Äthylacetat extrahiert.
Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und zweimal mit jeweils dem halben Volumen an verdünnter Salzsäure, die
einen pH-Wert von 3 hatte, extrahiert. Die wäßrige
Schicht wurde mit wäßriger 2n-Natriumhydroxydlösung auf
pH 8,5 eingestellt und dann zweimal jeweils mit dem halben Volumen Sthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde
mit Wasser gewaschen, dehydratlsiert und unter verminder-
109809/1345
tem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde in 40 ml Äthanol
gelöst und die Lösung der Saulenchromatographie an 600 ml "Sephadex LH-20" (siehe oben) unterworfen, wobei
45O .mg pulverförmiges Juvenimicin erhalten wurden.
100 mg des Pulvers wurden der Säulenchromatographie an 5 g Aluminiumoxyd (Merck & Co.) unterworfen, worauf wie
folgt eluiert wurde:
a) mit einem Gemisch von Benzol und Aceton (Volumenverhältnis 4 ; 1), wobei J mg eines Gemisches von Juvenimicin
A, und Juvenimicin Ap erhalten wurden ι
b) mit einem Gemisch von Benzol und Aceton (Volumenverhältnis
wurden j
wurden j
hältnis 4 t 2), wobei Ij5 mg Juvenimicin A-, erhalten
c) mit einem Gemisch von Benzol und Aceton (Volumenverhältnis 1 2 I), wobei 10 mg Juvenimicin B, erhalten
wurdenj
d) mit Aceton^ wobei JH rag Juvenimicin B, erhalten wurden,
Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde wiederholt mit dem Unterschied^ daß 1000 1 eines sterilisierten
Hauptkulturmediums (pH 7*0) der folgenden Zusammensetzung
verwendet wurdens 1 % lösliche Stärke, 4 % Saccharose,
2 % gereinigtes Baumwollsaatmehl der Handelsbezeichnung "Profile" (Hersteller Traders Protein DiViSiOn8 USA)*
0,5 % Fleischextrakt,, O35 % Pepton, 0a05 % Eisen (II)-sulfat,
0,1 # Magnesiumsulfat B 1 % Kalziumcarbonati, 0*05
% des in Beispiel 1 genannten Polyoxypropylentriols und Wasser. Die Kultivierung wurde unter Belüftung mit 1000
l/Minute durchgeführt» Die Wirksamkeit der Kulturbrühe
beträgt nach einer Kultivierungsdauer von 90 Stunden etwa
109809/mS
hO Mikrogramm/ml und erreicht nach einer Bebrütungsdauer
von Hh Stunden 80 Mikrogramm/ml.
Insgesamt 1100 1 der in dieser Weise erhaltenen Kulturbrühe
wurden auf pH 8,5 eingestellt und mit 550 1 Äthylacetat
extrahiert. Die Lösungsmittelschicht wurde abgetrennt, mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter
vermindertem Druck auf etwa J>0 1 eingeengt. Zum Konzentrat
wurden 30 1 verdünnte Salzsäure (pH j5) gegeben. Das
Gemisch wurde gerührt, worauf die wäßrige Schicht abgetrennt wurde. Die wäßrige Schicht wurde auf pH 8,5 eingestellt
und zweimal mit je 15 1 Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, mit Wasser gewaschen, dehydratisiert
und unter vermindertem T^ruck eingedampft,
wobei 15 g rohes, pulverförmiges Juvenimicin erhalten wurden.
Das rohe Pulver wurde in J> 1 Äthylacetat gelöst. Die Lösung
wurde dreimal mit je 1 1 einer l/15-molaren Phosphatpufferlösung
(pH 6,2) extrahiert.
Die Äthylacetatschicht wurde dann mit Wasser gewaschen,
dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde der Dünnschichtchromatographie an
Kieselgel (Merck & Co., Teilchengröße weniger als 0,08 mm) unterworfen, worauf mit'einem Gemis ch von Chloroform,
Methanol und einer 7$igen wäßrigen Ammoniaklösung (Volumenverhältnis 40 : 17 ί 20.) entwickelt wurde, um
die einzelnen Komponenten abzutrennen. Jede Komponente wurde unter einer Ultraviolettlampe nachgewiesen und mit
Äthylacetat extrahiert, wobei 0,8 g Juvenimicin Av,
1,0 g Juvenimicin B. und 0,2 g Juvenimicin B-, erhalten wurden.
109809/1346
Bei einem weiteren Versuch wurden die in der oben beschriebenen
Weise erhaltenen Phosphatpufferextrakte vereinigt, auf pH 9 eingestellt und dreimal mit jeweils
l/j5 ihres Volumens an Äthylacetat extrahiert. Die Äthyl acetatschichten
wurden vereinigt, mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt.
Das Konzentrat wurde der DünnschichtChromatographie auf
die oben beschriebene Weise unterworfen, wobei weitere 0*5 g Juvenimicin B^ erhalten wurden.
Claims (11)
- Patentansprüche/l) Verfahren zur Herstellung von Juvenimicin, dadurch gev—""" kennzeichnet, daß man einen Juvenimicin bildenden Mikroorganismus der Gattung Micromonospora in einem Kulturmedium, das eine Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff und eine Quelle von verwertbarem Stickstoff enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert, bis sich Juvenimicin in wesentlichen Mengen in der Kulturbrühe angehäuft hat, und das angehäufte Juvenimicin aus der Kulturbrühe isoliert.
- 2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Micromonospora ehaleea var. izumensis als Mikroorganismus verwendet wird.
- 3) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Micromonospora chalcea var. izumensis IPO-129-88 als Mikroorganismus verwendet wird.
- 4) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Juvenimicin A gewonnen wird.
- 5) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Juvenimicin A, gewonnen wird.
- 6) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Juvenimicin B, gewonnen wird.
- 7) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Juvenimicin B^, gewonnen wird.
- 8) Juvenimioin A, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:a) Elementaranalyse:C t 6^,j59 - 1,Oi H : 8,83 ί 0,5jN ! 2,80 ± 0,5109809/1345b) spezifische Drehung:^0 * 10° ( C = 0,5 % in CHCl,)c) Molekulargewicht:aa) durch Dampfdruckosmose: 655 - 70 (in CgH/-) bb) höchste Massenzahl: m/e = 58Id) Farbreaktion:aa) Erythromycintest: negativ
bb) Carbomycintest: negativ
cc) Dragendorffreaktion: positive) Löslichkeiten: löslich in Benzol, Chloroform, Äthylacetat, Dimethylformamid, Äthanol und wäßriger Säurelösung, unlöslich in Petroläther, η-Hexan oder neutralem Wasser;f.) Ultraviolettabsorption:Xfiwn = 240 - 2 m/u (E χ p = 23O »30) max 'g) hauptsächliche Infrarotabsorptionsbanden in Wellenzahlen (cm~ ) nach der KBr-Scheibenmethodes3450, 2960, 1725, 1695, I625, 1458, 1276, 1250, 1180, 1167, 1111, 1072, 1047, 1027, 983, 966, 932, 896, 869p 846, 834, 792, 755, 713» - 9) Juvenimicin A,, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:a) Elementaranalyse %C : 62,97 - 1,0; H.': 8,62 ~ 0,55 M g 3,00 ± 0,5b) spezifische Drehung?n= - 17,6° t 10° (0 = 0,29 % inc) Molekulargewicht:aa) Dampfdruckosmose: 54l - 60 (in bb) Titrationsmethode: 562 ί 6θ cc) höchste Massenzahl: m/e = 58Id) pKa1-Wert: 8,4 (in 66#igem Dimethylformamid)e) Farbreaktion:aa) Erythromycintest: negativ bb) Carbomycintest: negativ cc) Dragendorffreaktion: positivf) Löslichkeiten: löslich in Benzol, Chloroform, Äthylacetat, Dimethylformamid, Äthanol und wäßriger Säurelösung, unlöslich in Petroläther, η-Hexan und neutralem Wasser;g) Rf-Werte, ermittelt durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel und Elution mit einem Gemisch von Chloroform, Methanol und 7$iger wäßriger Ammoniaklösung (40 : 12 : 20):Rf = 0,7 - 0,05;h) Ultraviolettabsorption:+- 2 ■ (Elom -850*30).i) hauptsächliche Infrarotabsorptionsbanden in Wellenzahlen (cm~ ) nach der KBr-Scheibenmethode: 3450, 296O, 1725, I695, I625, 1458, 1383, 1314, 1276, 1250, 1180, 1167, 1111, 1072, 1047, 1027, 983, 966, 932, 896, 869, 846,'834, 792, 755, 713.
- 10) Juvenimicin B,, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:a) Elementaranalyse:C : 64,0 ± 1,0; H : 9,4 t 0,5; N : 2,5 + 0,51Ü98Q9/13- 22 -b) spezifische Drehung:JP = -3*0° - 5° (c = 0,5 % in Methanol) 23 = +7,6° ±5° (c = 0,5 % in CHCl,)c) höchste Massenzahl: m/e = 567d) Farbreaktion:aa) Erythromycintest: negativ bb) Carbomycintest: negativ cc) Dragendorffreaktion: positive) Löslichkeiten: löslich in Benzol, Chloroform, Äthylacetat, Dimethylformamid, Äthanol und wäßriger Säurelösung, unlöslich in Petroläther, n-Hexan oder neutralem Wasser:f) Ultraviolettabsorptiont- äö ± 2 7« (*}*, =526 ±30)g) hauptsächliche Infrarotabsorptionsbanden in Wellenzahlen ( cm" ) nach der KBr-Scheibenmethode:3450, 2940, 1715, I67O, 1595, 1455, I38O, 1312, 1272, II75, 1110, 1065, 1050, 1024, 985, 928, - 905, 889, 84^, 805.
- 11) Juvenimicin EL·, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:■ a) Elementaranalyse:C : 64,7 - 1,0; H : 10,2 ± 0,5 ; N : J>,6 ± 0,5b) spezifische Drehung:p = -9,0° t 5° ( c = 0,5 % in Methanol) = +5,6° - 5° (c ■--- 0,5 fo in CHCl3)109809/1345ο) höchste Massenzahl! m/e =583d) Farbreaktion: ·aa) Erythromycintest: negativ bb) Carbomycintest: negativ cc) Dragendorffreaktion: positive) Löslichkeiten: löslich in Benzol, Chloroform, Äthylacetat, Dimethylformamid, Äthanol und wäßriger Säurelösung, unlöslich in Petroläther, n-Hexan und neutralem Wasser;f) Ultraviolettabsorption:- 248 t 25)g) hauptsächliche Infrarotabsorptionsbanden in Wellenzahlen (cm~ ) nach der KBr-Scheibenmethode: 5450, 2940, 1720/I670, 1595, 1455, I38O, 1312, 1275/1170, 1110, 1070, 1045, 985, 935, 905, 887, 840, 808.109809/ 13 4'S
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP5520169 | 1969-07-11 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2034245A1 true DE2034245A1 (de) | 1971-02-25 |
DE2034245C2 DE2034245C2 (de) | 1984-02-02 |
Family
ID=12992048
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2034245A Expired DE2034245C2 (de) | 1969-07-11 | 1970-07-10 | Antibiotikum Juvenimicin A↓3↓ |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US3767793A (de) |
DE (1) | DE2034245C2 (de) |
FR (1) | FR2059505B1 (de) |
GB (1) | GB1321436A (de) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4234690A (en) * | 1979-07-16 | 1980-11-18 | Schering Corporation | Method for producing rosaramicin (rosamicin) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE1617890A1 (de) * | 1966-04-02 | 1970-03-19 | Takeda Chemical Industries Ltd | Neues Antibiotikum und Verfahren zu seiner Herstellung |
DE1667923A1 (de) * | 1967-02-25 | 1971-04-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Neues Antibiotikum und Verfahren zu seiner Herstellung |
DE1767565A1 (de) * | 1967-05-26 | 1971-10-14 | Scherico Ltd | Neue Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung,Isolierung und Reinigung |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3454696A (en) * | 1968-02-19 | 1969-07-08 | Schering Corp | Antibiotics 460 and methods for their production |
-
1970
- 1970-07-10 FR FR7025881A patent/FR2059505B1/fr not_active Expired
- 1970-07-10 DE DE2034245A patent/DE2034245C2/de not_active Expired
- 1970-07-10 US US00053736A patent/US3767793A/en not_active Expired - Lifetime
- 1970-07-13 GB GB3380670A patent/GB1321436A/en not_active Expired
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE1617890A1 (de) * | 1966-04-02 | 1970-03-19 | Takeda Chemical Industries Ltd | Neues Antibiotikum und Verfahren zu seiner Herstellung |
DE1667923A1 (de) * | 1967-02-25 | 1971-04-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Neues Antibiotikum und Verfahren zu seiner Herstellung |
DE1767565A1 (de) * | 1967-05-26 | 1971-10-14 | Scherico Ltd | Neue Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung,Isolierung und Reinigung |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Journal of Antibiotics, 1972, S. 641-646 * |
Journal of Antibiotika, 1969, S. 259-264 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2059505A1 (de) | 1971-06-04 |
FR2059505B1 (de) | 1974-10-11 |
GB1321436A (en) | 1973-06-27 |
US3767793A (en) | 1973-10-23 |
DE2034245C2 (de) | 1984-02-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE2455230C2 (de) | Lipiarmycin, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Antibiotikum | |
DE2435160B2 (de) | Fortimicin A und dessen pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze sowie Arzneimittel mit einem Gehalt dieser Verbindungen | |
DE2167325C2 (de) | Antibiotikum A-201B und Verfahren zu seiner Herstellung | |
DE2004686C3 (de) | Makrolid-Antibioticum SF-837 und dessen Diacetylderivat und deren pharmakologisch nichtgiftige Säureanlagerungssalze sowie Verfahren zur Herstellung des Antibioticums SF-837 | |
CH646432A5 (de) | Beta-lactam-antibiotika. | |
DE2034245A1 (de) | Neue Antibiotika und ihre Herstellung | |
DE2839668A1 (de) | Als antibiotika wirksame saframycine a, b, c, d und e und verfahren zu ihrer herstellung | |
CH646712A5 (de) | Istamycine und deren herstellung. | |
DE2641908A1 (de) | Antibiotisch wirksame substanzen, mimosamycin und chlorocarcin a, b und c und verfahren zu ihrer herstellung | |
DE2654266C3 (de) | Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 5,10,11,1 la-Tetrahydro-9,1 ldihydroxy-e-methyl-Soxo-lH-pyrrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepin-2acrylamid | |
DE1770441C2 (de) | Neue Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
DE2344780A1 (de) | Antibiotikum xk-49-1-b-2, verfahren zu seiner herstellung auf mikrobiologischem wege und arzneipraeparate | |
DE2233555C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von Spectinomycin | |
DE1926458A1 (de) | Antibiotische Substanzen und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
DE2444110A1 (de) | Neues antibiotikum | |
DE2039990C2 (de) | Neue Antibiotika B-5050 A bis F (Maridomycin I bis VI), Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre pharmazeutische Zubereitung | |
DE1667923C3 (de) | Neue Antibiotika, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie pharmazeutische Zubereitung, die diese Antibiotika enthält | |
DE2408121A1 (de) | Platomycin a und b, verfahren zu ihrer herstellung, arzneimittel und ihre verwendung als desinfektionsmittel | |
US3265588A (en) | Antibiotic danomycin and method of production | |
AT226878B (de) | Verfahren zur Herstellung von Porfiromycin | |
AT266316B (de) | Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums | |
DE1617890A1 (de) | Neues Antibiotikum und Verfahren zu seiner Herstellung | |
DE3012665C2 (de) | 13-Desoxycarminomycin, Verfahren zu seiner Herstellung und diese Verbindung enthaltende pharmazeutische Mittel | |
DE1767835C (de) | Quintomycin A,B und D, deren Pentahydro chloride und Sulfate, Verfahren zu deren Her stellung und diese enthaltende Antibiotika | |
US3367833A (en) | Antibiotic erizomycin and process for making same |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8125 | Change of the main classification |
Ipc: C12P 1/04 |
|
D2 | Grant after examination | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |