DE1767565A1 - Neue Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung,Isolierung und Reinigung - Google Patents
Neue Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung,Isolierung und ReinigungInfo
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Description
Angemeldet am (A ){beanspruchte Priorität:
Anspruch vom 26.Mai I967 (Ser.Nr. 641 522)
Anspruch vom 21.Peber I968 (Ser.Nr. 707 lOO)
(Anmeldungen in den Vereinigten Staaten von Amerika).
Beginn der Patentdauer:
Die Erfindung betrifft einen neuen Komplex von Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung, Isolierung und Reinigung.
Insbesondere betrifft die Erfindung neue und nützliche Antibiotika,
die durch Züchtung einer bisher nicht beschriebenen Art (Species) der Gattung Micromonospora der Ordnung Actinomycetales
erhalten werden.
Die bisher nicht beschriebenen Species der Gattung Micromonospora,
welche bei der ersten Herstellung des neuen Komplexes von Antibiotika gemäß der Erfindung verwendet wurden, wurden
ursprünglich aus einer direkt aus der Erde genommenen Bodenprobe isoliert und als Micromonospora sp.W847 bezeichnet. Zwei
Stämme dieser Microraonospora Art wurden isoliert und als besonders brauchbar für das Verfahren gemäß der Erfindung gefunden.
Diese zwei Stämme sind natürliche Farbvarianten und
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können mikroskopisch durch den Grad der auftretenden Sporenbildung unterschieden werden. Kulturen der lebenden Organismen
dieser zwei Stämme wurden in der KuItürenSammlung des
Landwirtschaftsministeriums (Department of Agriculture) der Vereinigten Staaten von Amerika, Northern Utilization Research
and Development Division, Peoria, Illinois, hinterlegt, wo sie mit den Nummern NRRL 3274 und NRRL 3275 bezeichnet wurden.
Diese Stämme sind von der Sammlungsstelle auf Verlangen erhältlich.
Diese Stämme werden im folgenden einzeln als Micromonospora sp. W847 (NRRL 327*0 und als Micromonospora sp. W847
(NRRL 3275) und zusammen als Micromonospora sp. W847 bezeichnet. Venn in der folgenden Beschreibung auf Nicromonospora sp.
W847 ohne Angabe der Stammnummer Bezug genommen wird, so betreffen
die Ausführungen beide vorgenannten Stämme.
Die male ro skopi sehe Untersuchung von 28 Tagen alten Kulturen
(24 - 260C) von Micromonospora sp. W847 (NRRL 3274) auf
Czapek1s Sucrose Agar zeigt gutes Wachstum ohne Luftmycel und
erhöhte und faltige Kolonien mit einer weichen, feuchten und nicht wachsartigen Konsistenz, die nicht diffusierbares Pigment
erzeugen. Die Farbe der Kolonieoberfläche ist gemäß den "Descriptive Color Name Dictionary" von Taylor, Knoche und
Granville, herausgegeben durch die Container Corporation of America, 1950, (USA), in Verbindung mit einer diesem Namen
entsprechenden Nummer, welche dem "Color Harmony Manual",
k. Auflage (1958),herausgegeben ebenfalls von der Container
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Corporation of America, entnommen ist, orange m4-ia. Diese
Farbe entspricht dem Synonym oder nahezu Synonym von kräftigem Orange 50 gemäß National Bureau of Standards Circular
Nr. 553 vom 1.November 1955, USA (alle im folgenden verwendeten
Bezeichnungen für Koloniefarben beruhen auf demselben Farbbezugsystem).
Die mikroskopische Untersuchung derselben Kultur zeigt ein regelmäßiges Mycel, das aus langen verzweigten Fäden mit etwa
0,6 u im Durchmesser zusammengesetzt ist. Sporen werden selten gefunden.
Die makroskopische Untersuchung von 28 Tage alten Kulturen von Micromonospora sp. W847 (NRRL 3275), gewachsen auf demselben
Medium und unter denselben Bedingungen wie oben beschrieben, zeigt gutes Wachstum mit den gleichen Hauptcharakteristiken
der Kolonien wie der vorhergehend genannte Stamm mit Ausnahme der Farbe. Die Farbe der Kolonieoberfläche
ist Schwarz. Mikroskopisch zeigt diese Kultur ein regelmäßiges Mycel, das aus langen verzweigten Fäden mit einem ungefähren
Durchmesser von 0,6 u zusammengesetzt ist. In diesem Stamm sind jedoch die Sporen sehr reichlich und unregelmäßig
im Mycel erzeugt. Diese Sporen sind ei- bis kugelförmig mit einem Durchmesser von 0,7 - l»0 η und sind nach Reifung dunkelbraun.
Die Kolonien von Micromonospora spt ¥847 können ferner durch
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ihre Wachstumscharakteristika unter aeroben Bedingungen auf verschiedenen Nährmedien charakterisiert werden. Tabelle 1
zeigt die Wachstumscharakteristika von Micromonospora sp. W847 auf einigen der umfassender verwendeten Nährmedien. Die
Koloniebeobachtungen wurden an Ik Tagen alten Kulturen (24 260C),
außer es ist anders angegeben, angestellt.
Koloniecharakterxstika von Micromonospora sp. W847 auf ververschiedenen
Medien
Glucose-Asparagin Agar | Wachstum spärlich |
Bennett's Agar | Wachstum spärlich |
Emerson's Agar | Wachstum spärlich |
Tomatenmark-Hafermehl- Agar |
Wachstum spärlich |
Glucose-Hefeextrakt- Agar |
Wachstum gut, erhöht, fein faltig |
Kartoffel scheiben | Wachstum spärlich |
Sucrose Nitrat Agar (Czapek's Agar) |
Wachstum gut, erhöht, faltig |
Tyrosin Agar Beobachtungen nach 2, 7 und lh Tagen (Gordon and Smith, J.Bact. 69,147) 109842/0495 |
Wachstum mittelmäßig,Kri stalle spärlich gelöst di rekt unter der Kolonie, braunes diffusionsfähiges Pigment nach 3 Wochen er zeugt ,diffusionsfähiges Pigment nicht schwarz oder typisch für ein Tyrosinpo- eitiν wie durch Strepto- myces erzeugt |
Micromonospora sp, W847 zeigt besonders gutes Wachstum
bei Temperaturen zwischen 26 und 37°C,aber kein wesentliches Wachstum bei Temperaturen in der Höhe von 500C.
Sie sind aerob und reduzieren Nitrat nicht zu Nitrit. Diese Species verflüssigen Gelatine nicht; hydrolisieren
Milch nicht und zersetzen Zellulose nicht. Auf Pepton-Eisen-Agar wird kein diffusionsfähiges Pigment erzeugt.
Micromonospora sp. W 847 zeigt gutes Wachstum auf Kohlehydratmedien
enthaltend 0,5% Hefeextraktbase und 1% an
1-Arabinose, Glucose, Stärke und Sucrose, aber nur mittelmäßiges Wachstum,wenn die Kohlehydratquelle 1% Xylose ist.
Sie zeigen spärliches Wachstum auf solchen Medien, in welchen die einzigen Kohlehydratquelle 1% d-Arabinose, Zellulose,
Dulcit, Galactose, Glyzerin, Lactose, Laevulose, Melibiose, Melizitose, Raffinose, Rhamnose, Ribose, Inosit
oder Mannit ist.
Eine weitere Charakteristik von Micromonospora sp. W847
sind ihre Fähigkeit sich Stickstoffquellen nutzbar zu machen. Die Wachstumscharakteristika von Kolonien auf typischen
Stickstoffquellen mit 1% Glucose, beobachtet nach Ik Tagen
(24 - 260C) Wachstum, sind in der Tabelle 2 angegeben.
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Nutzbarmachung von Stickstoffquell en
Stickstoffquelle | Wachstumscharakteristika |
0,5% Difco Hefeextrakt |
Wachstum gut, erhöht, fein faltig |
1,0% NZ Amin Type A* | Wachstum mittelmäßig |
Yfo Asparagin | Wachstum spärlich |
1% Glutaminsäure | Wachstum spärlich |
1% Ammoniumnitrat | Wachstum spärlich |
♦Erzeugnis der Sheffield Chemical Company, Norwich, New York
Der im folgenden beschriebene neue antibiotische Komplex kann
hergestellt werden durch Verwendung von Micromonospora sp. W847 var. NRRL 3274 und/oder var. NRRL 3275 und/oder anderer
Stämme der genannten Species (einschließlich Mutanten und
Varianten davon) welche im wesentlichen dieselbe biologische Aktivität haben, indem sie Antibiotika desselben Komplexes
erzeugen. Die vorliegende Erfindung ist daher nicht so beschränkt, daß sie die Verwendung von Varianten von Micromonospora
sp. W847 oder Mutanten,die aus diesem Organismus durch
mutierende Mittel, wie z.B. Hochfrequenzbestrahlung einschließlich Röntgenstrahlen und Ultraviolettlicht, Actinophagen und
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Stickstoff-Lost erhalten werden, ausschließt. In der folgenden
Beschreibung des Verfahrens zur Herstellung des Antibiotikums ist die Verwendung des Ausdruckes Micromonospora
sp. W847 so zu verstehen, daß sie die oben beschriebenen
spezifischen Farbvarianten sowie alle anderen vollständig äuqivalenten Varianten und Mutanten dieses
Species einschließt.
1. Herstellung des Antibiotikums W847 Komplexes
Micromonospora sp. W8A7 erzeugt, insbesondere durch im folgenden
beschriebene gesteuerte Fermentationsverfahren, eine Komplexmischung von antibiotischen Substanzen, die im folgenden
als der Antibiotikum ¥847 Komplex bezeichnet wird.
Zur Herstellung eines geeigneten Inoculum für die nachfolgende Fermentation wird Micromonospora sp. W847 vorzugsweise
unter submersen aeroben Bedingungen und kontinuierlichem Rühren bei Temperaturen im Bereich von etwa 22 bis etwa
57°G für eine Zeitspanne von etwa 2 bis etwa k Tagen wachsen
gelassen. Im allgemeinen wurde gefunden, daß eine Temperatur von 55 C über eine Zeitspanne von 3 Tagen am meisten
befriedigt.Das in dieser ersten Keimungsstufe normalerweise
verwendete Medium ist wässerig und enthält Mengen an Kohlenstoff- und Stickstoffquell en ι die durch den Organismus
assimilierbar sind. Die Alkalinität des gewünschten Mediums
wird vor dem Auto kl avisieren durch Zusatz von Base, z.B. Katrium-
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hydroxyd, auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt.
Beispiele für in der Keimungsstufe verwendeten Medien sind
folgende: Medium I: Bacto-Rindfleischextrakt (Difco), 3,0 g;
Bacto-Trypton (Difco), 5,0 g; Dextrose, 1,0 g; Stärke (Kartoffel),
24,0 g; Bacto-Hefeextrakt (Difco), 5,0 g; CaCO-,
2,0 g; Leitungswasser, 1000 ml; Medium II: Bacto-Hefeextrakt (Difco), 5,0 g; Fischsäfte, 1,0 g; Getreidequellwasser,
1,0 g; Dextrose, 20,0 g; CaCO,, 1,0g; Leitungswasser, 1000 ml.
Gewünschtenfalls wird vor der Fermentation und Gewinnung
des Antibiotikums eine zweite Keimungsstufe (z.B. Inoculumsstufe) angewendet, um das Inoculum anzureichern. Unter Verwendung
der oben beschriebenen Medien kann ein frisches Medium mit der vorher hergestellten gekeimten Kultur (5%ig
Gewicht/Volumen) beimpft und bei etwa 22 bis etwa 37°C für etwa 2 bis etwa k Tage bebrütet werden. Es wurde gefunden,
daß gewöhnlich eine Temperatur von 280C über eine Zeitspanne
von 3 Tagen am meisten befriedigt.
Um den Antibiotikum W8^7 Komplex herzustellen, kann ein
5%iges (Gewicht/Volumen) Inoculum aus der Inoculumstufe
zum wässerigen Fermentationsmedium zugesetzt werden, das vor dem Autoklavisieren auf einen pH-Wert von 7,1 bis 7,8 eingestellt
wurde. Luft, gewöhnlich etwa 3 bis etwa 6 l/min, wird in die Fermentation eingeführt, welche im allgemeinen
— 9 —
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bei einer Temperatur zwischen etwa 22 und etwa 37°C über eine Zeitspanne von etwa 2 bis etwa 6 Tage unter kontinuierlichem
Rühren durchgeführt wird. Insbesondere mit dem unten beschriebenen Medium III wurde gefunden, daß
maximale Ausbeuten an Antibiotikum W847 Komplex erhalten
wurden durch eine Fermentation von 66 h bei 31°C unter
Einleitung von Luft mit einer Geschwindigkeit von 4,5 l/min und unter Rühren mit einem Rührer,der 250 Umdr/min macht?
Unter Verwendung von 14 1 Fermentern, die 10 1 an Medium enthalten, wurden unter diesen Bedingungen Ausbeuten im
Bereich von 300 bis 800 /ug/ml erhalten.
Zweckmäßige Medien in der Fermentationsstufe umfassen z.B.
folgende: Medium III: Sucrose, 30,0 g; Dextrose, 2,5 g; Trypticase, 17,0 g; NaNO3, 3,0 g; K2HPO4, 3,5g; MgSO4.7H2O,
0,5 g; KCl, 0,5 g; FeSO4, 0,01 g; NaCl, 5,0 g; Leitungswasser,
1000 ml; Medium IV: Bacto-Hefeextrakt (Difco), 5,0 g;
Dextrose, 10,0 g; Stärke, 20,0 g; Caseinhydrolysat, 5,0 g; Ca
C0_, 4,0 g; Leitungswasser, 1000 ml; Medium V: Sucrose, 20,0 g;
Pepton, 5,0 g; Baumwollsamenproteinhydrolysat, 5,0 g; CaCO.-,
4,0 g; Leitungswasser, 1000 ml; Medium VI: Sucrose, 30,0 g; Pepton, 8,0 g; NaNO3, 3,0 g; K2HPO4, 1,0 g; MgSO4.7H2O, 0,5 g;
FeSO., 0,01 g; Leitungswasser, 1000 ml; Medium VII: Trypticase, 17 g; NaCl, 5,0 g; K2IIPO4, 2,5 g; Dextrose, 2,5 g; Czapek-Dox-Brühe,
35,0 g; Leitungswasser, q.s. 1000 ml.
"- 10 -
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Zur Gewinnung des Antibiotikum ¥8^7 Komplexes aus dem
Ferraentationsmedium kann einmal z.B. wie folgt verfahren werden: Die ganze Brühe wird mit Base,z.B. Natriurahydroxyd,
auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt. Die ganze Brühe wird dann mit etwa 2 Vol.-Teilen/Vol.-Teil der Brühe
eines geeigneten mit Wasser nicht- mischbaren organischen Lösungsmittel, z.B. Äthylacetat, Methylendichlorid, Butylacetat,
Chloroform, Butanol u.dgl., extrahiert. Die Lösungsmittelphase wird anschließend unter Vakuum auf ein
kleines Volumen konzentriert, ungefähr auf die lOOfache Konzentration, und durch Säulenchromatographie gereinigt,
wozu z.B. LH 20 Sephadex, ein alkyliertes vernetztes Dextran (Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Uppsala, Sweden),
suspendiert in etwa 95%igem, wässerigem Äthanol verwendet wird. Die Säule wird mit dem wässerigen Äthanol eluiert.
Die Säulenfraktionen werden gemäß ihrer antibakteriellen
Wirksamkeiten.wie sie durch Agarscheibentest gegen Staphylococcus
aureus (ATCC 6538P) festgestellt werden, vereinigt, zur Trockene konzentriert, in einer kleinen Menge von Äthyläther
oder Aceton gelöst und zu einem überschüssigen Volumen an Petroleumäther (Siedepunkt etwa 30 bis etwa 60°C) zugesetzt.
Die Mischung wird dann in ein Trockeneis/Acetonbad (ungefähr -500C) übergeführt und für etwa 20 min stehengelassen,
wonach die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen gelassen wird. Die Mutterlauge wird von irgendwelchen öligen
Rückständen durch Dekantation abgetrennt und zur Trockene
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konzentriert. Es wurde gefunden, daß das auf diese Weise hergestellte Material gewöhnlich eine Stärke von etwa
232 ug/ing gemäß der unten beschriebenen Bio-Probe hat.
Die Probe ist eine Zylinderschalenprobe unter Verwendung von Sarcina lutea (ATCC 934i) als Testorganismus. Die Bedingungen
der Probe sind ähnlich denen der Zylinderplattenprobe für Erythromycin (Grove and Randall, 1955» Med. Encyclopedia,
Inc., N.Y.). Ein ug an Antibiotikum W847 Komplex-Aktivität
ist die Menge des Materials, die eine zonenförmige Wirkung von 20,8 - 0,5 mm unter den Bedingungen
dieser Probe erzeugt.
Alternativ kann der Antibiotikum W847 Komplex z.B. durch
Anwendung der folgenden Fermentations- und Isolierungsverfahren hergestellt werden:
Unter Verwendung von Medium I zur Herstellung eines Inoculums werden Fermentationskolben, die dieses Medium enthalten,
mit einer Kultur (ungefähr 55» Gewicht/Volumen) von
Micromonospora sp. V8^7 beimpft. Diese Kolben werden auf
einen Drehrüttler gegeben, der etwa 280 Umdr/min macht, und bei 280C für 72 h bebrütet. Am Ende dieser Zeit werden
Fermenter, die mit Fermentationsmedium (z.B. Medium VIl), das auf einen pH-Wert von 7,15 bis 7,25 eingestellt ist,
mit ungefähr 5$ (Volumen/Volumen) der 72 h Inoculumkultur
beimpft. Das Fermentationsmedium wird mit einer Geschwin-
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digkeit von etwa 500 Umdr/min bei einer Temperatur von 31 C gerührt. Ein Luftstrom wird durch das Medium mit
einer Geschwindigkeit von etwa 0,5 1 Luft/l der Brühe/min hindurchgeführt. Die Rührgeschwindigkeit kann nach 2k h
auf 600 Umdr/min und nach 48 h auf 700 Umdr/min gesteigert
werden. Die Fermentation ist am Ende von etwa 69 h beendet. Die Brühe aus allen Fermentern wird für die
unten beschriebene Extraktion und Gewinnung des Antibiotikum W847 Komplexes gesammelt.
Die gesammelte Fermentationsbrühe wird auf einen pH-Wert von etwa 9,25 mit wässerigem Natriumhydroxyd (50$) ein-
gestellt und mit etwa 2 Volumen Äthylacetat extrahiert und die Extrakte werden auf etwa 1-2% des ursprünglichen
Volumens konzentriert. Das Äthylacetatkonzentrat wird dann zumindest zweimal mit dem halben Volumen an Chlorwasserstoff
säure (etwa 0,14 n) extrahiert. Alternativ kann die Säureextraktion auch mit anderen Mineral säuren etwa derselben
Normalität durchgeführt werden. Die vereinigten Säureextrakte werden mit 5%igem wässerigen Natriumhydroxyd
schwach alkalisch gemacht (auf einen pH-Wert von etwa 8,5 bis 9,0) und zumindest zweimal mit etwa dem gleichen
Volumen an Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Äthylacetatextrakte werden unter vermindertem Druck zur Trockene
konzentriert,um den Antibiotikum W847 Komplex zu erhalten.
Der Komplex dieser Stufe zeigt eine Stärke von 450 - 550 ug/iag
in der oben beschriebenen Probe.
109842/0495 " 13 "
2. Charakterisierung des Antibiotikum W847 Komplexes
Der Antibiotikum ¥847 Komplex wurde durch Papierchromatographie
mit einer Vielzahl von Antibiotika einschließlich verschiedenen Macroliden verglichen. In
einer Serie von Lösungsmittelsystemen, \\rie in Tabelle
gezeigt, bewegt sich der Antibiotikum W847 Komplex als
ein einziger Fleck und ist unterschieden von allen anderen getesteten Antibiotika, ausgenommen den Macroliden
(z.B. Magnamycin, Oleandomycin, Spiramycin und Erythromycin).
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ρ | < | 'Sg | CS | 'CO | fil | W Ό | ο |
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η | 1444 | Ό | |
O | P | C | ρ: | P | OB HJ | νθ | P | S5 00 | P | |||
^"■»OD | ι—ι | CQ | C»· | C | C | CB O | U4 | σ· | H- | P O | ||
C | CQ | P | H> | Η··0 | O | CQ | O | et- "^ | H- | |||
O | sr | 5 | Φ | B | φ | 09 | OT P | νθ | ff | 3" | HJ | Φ |
H- | φ | φ | »1 | O | et- | οι B | Φ | et- | H- S | |||
C | 3 | B | μ— | φ | OK O | O | H- | C Φ | O | |||
S | .O | "-ν | κ ·· | H- | C H- | VO | (R | 3 ct- | CO V | |||
φ | H- | Λ- | W | (R | W ·· | UJ | Φ | O | O Β* | «<ί *■{ | ||
3 | O | CO | φ | Φ "β | ό | 3 | H- | 3* P | CO O | |||
P | H- | M. | CO | B | ** **ί | 4« VO |
α | C | H- B | γ* 3 | ||
< | C | C | ·. | H- | (X | S^ HJ | UJ | * | B | O O | Φ W | |
O | H1 | a | Ul(R | PJ H- | O | Φ | H, H- | 5 C+ | ||||
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C | C* | B | CO H- | UJ | α C | CR | ||||||
B | 'φ | P | O | Φ B | O | 3 | W | |||||
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Φ | CO | 00 | B | O | ·· | UJ | H- | |||||
3 | C* | O | Φ | CN | ^ | CO | ||||||
Ω | Φ | B | *· | 09 | μ* | O- | ||||||
H- | 00 | O | O | |||||||||
(R | O | ·· |
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Antibiotikum V8^7 | ||||||||
2 | O | ·· | O | Komplex | ||||||||
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Φ | O | Magnamycin | ||||||||||
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Ο | O | — | Cs | |||||||||
OO | -J | ο | Oleandomycin | |||||||||
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O | O | O | VO | |||||||||
OO | 03 | O | Erythromycin | |||||||||
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σ* | O | O | ||||||||||
ο | νθ | |||||||||||
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O | O | νθ | ||||||||||
CD | O | O | Chloramphenicol | |||||||||
Η» | O | O | ||||||||||
O | O | ChIortetracyeline | ||||||||||
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Ul | ο | |||||||||||
O | CP | UJ | Gentamicin | |||||||||
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O | O | |||||||||||
09 | CO | Streptomycin | ||||||||||
-O | O | Tetracyclin | ||||||||||
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Die Differenzierung des Antibiotikum W847 Komplexes von
diesen bedeutenden Macrolideantibiotika erfolgte durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagel-GF-Platten
(Analtech Inc., Wilmington, Delaware). Die Zonen wurden durch die folgenden zwei Methoden untersucht:
1. Die Platten wurden mit einer Mischung aus konzentrierter Schwefelsäure und Methanol (l : 1 Volumen/Volumen)
besprüht und durch einige Minuten langes Erhitzen auf 1050C
entwickelt. Die Zonen des organischen Materials erscheinen als gefärbte Flächen gegen einen weißen Hintergrund.
2. Die Platten werden mit einer Agarschicht, die mit S. aureus besät ist, in Kontakt gehalten. Eine Schicht von
Whatman Nr. i Papier wird zwischen der besäten Agarschicht und der Platte vorgesehen·um sicherzustellen, daß das
Silicagel nicht an dem Agar haftet. Das Papier und das Silicagel werden nach 15 min entfernt. Die Agarplatte
wird bei 37°C über Nacht bebrütet und die Inhibitionszonen beurteilt.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle k gezeigt.
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Vergleichende Dünnschichtchromatographie des Antibiotikum W847 Komplexes
System | Antibiotikum | R- und Farbe durch HgSOj1 Besprühung |
R- der InhiBition- Zone |
Chloroform:Methanol: 17%ig Ammoniak 2:1:1 (Volum en /Volumen) |
Antibiotikum W847 Komplex Oleandomycin Erythromycin Magnamycin |
blau schwarz 0,98 grün 0,98 gelbbraun 0,98 blaupurpurn 0,98 |
0,98 0,98 0,98 0,98 |
Butanol!Essigsäure:
Vaster 3:1:1 (Volumen/Volumen) |
Antibiotikum
Komplex Erythromycin Spiramycin Oleandomycin Magnamycin |
rotpurpurn 0,13 grUnbraun 0,26 purpurn;grau O,O6;O,3O grün 0,19 purpurn; O,40;O,47 rotpurpurn |
0,13 0,26 0,06 0,19 0,40 |
Ferner durch Vergleich der hier beschriebenen physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften des Antibiotikum
¥847 Komplexes und seiner abgetrennten Fraktionen mit den Eigenschaften der bekannten, in der Literatur beschriebenen
Macroliden ist der Antibiotikum ¥847 Komplex und seine Bestandteile von allen bekannten Macrolidenantibiotika unterscheidbar.
Antibiotikum ¥847 Komplex gibt eine positive Farbreaktion
in den Ninhydrin-, Stärke-KI- und Biuret-Testsund eine negative
Farbreaktion in den Stannochlorid-, Molisch- und ™ Sakaguchi-Tests.Oer Komplex ist wesentlich transparenter
in dem Ultraviolettbereich. Die Wirksamkeit des Antibiotikum ¥847 Komplexes ändert sich nicht bedeutend, wenn eine
Lösung davon einer Temperatur von 100 C für 30 min über den
pH-Bereich von 2-10 unterworfen wird (die Stabilität wird geprüft durch Lösung des Antibiotikums in Äthanolverdünnung
mit Puffer und Scheibentest gegen S. aureus und Escherichia coil). Der Komplex zeigt keinen Verlust an Wirksamkeit nach
Behandlung mit Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, CH»-Amylase oder M
Penicillinase in gepufferten Lösungen (wahlweiser pH-Wert für jedes Enzym) bei 37°C, wobei die Einwirkzeit bis zu 24 h
betragen kann. Der Antibiotikum ¥847 Komplex ist in den meisten polaren organischen Lösungsmittel, wie z.B. Äthylacetat,
Methanol, Äthanol und Aceton,löslich.
3. Trennung der Antibiotikum ¥847 Bestandteile
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Die Bioautographie von Dünnschicht - Silioagel-Platten auf mit Sarcina lutea besätem Agar und anschließender Chromatographie in einem Lösungsmittelsystem,bestehend aus Chloroform und Methanol (60:40 VoIumen/Volumen) zeigt, daß der
Antibiotikum W847 Komplex zumindest aus 4 Antibiotikumkomponenten besteht, welche im folgenden als Antibiotikum W847
Fraktionen A1 B, C. und C„ (oder als Antibiotikum W847-A,
Antibiotikum W847-B, Antibiotikum ¥847-C1 und Antibiotikum
W847-C2) bezeichnet werden. Diese Fraktionen zeigen in dem
oben beschriebenen Lösungsmittelsystem R- Werte von 0,19
(Fraktion A), 0,38 (Fraktion B), 0,52 (Fraktion C1) und
0,65 (Fraktion C2).
Die Trennung der Fraktionen kann durch Lösung des Antibiotikum W847 Komplexes in mit Kieselsäure gemischten Aceton,
Verdampfung des Acetone und Aufbringung der trockenen Mischung auf den Anfang einer Kieselsäuresäule zustandegebracht
werden. Die Säule wird mit Chloroform:Methanol (60:40 Volumen/ Volumen) eluiert und die Fraktionen werden gesammelt. Die
Säule wird durch Scheibentest jeder Fraktion gegen S. aureus und E. coli überwacht. Die aktiven Fraktionen werden auf
Silicagel-Dünnschichtplatten in denselben für die Säule verwendeten Lösungsmittelsystem für etwa 1,5 h Chromatograph!ert.
Die Muster der Antibiotikumfraktionen werden durch die zwei vorher beschriebenen Nethoden untersucht. Die Fraktionen werden gemäß ihren Chromatographisehen Mustern gesammelt und
konzentriert.
- 19 -
109842/0495
Durch diese Methode wird die Fraktion C„ als ein Hydrochloridsal
ζ abgetrennt und als weißes Pulver durch Lösung der gesammelten aktiven Fraktionen in Methanol und Ausfällen
ait etwa 10 Volumen an Äthyläther isoliert« Das Fraktion-Cg-Bydroehlorid dieser Stufe zeigt eine Stärke
von etwa1100 ng/mg.
Während der Chromatographie wird die we^-Cg-Base durch Reaktion
ext einer geringen Menge an Hydrochiοrid, das in dem
Lösungsmittel vorhanden ist, zu einem Hydrochloridsalζ umgesetzt.
Das Hydrochlorid zeigt, wie anzunehmen war, keine merkbare Löslichkeit in Äthyläther und ist daher durch Zusatz
desselben aasfällbar.
Die freie Base von W847-C2 kann durch Zusatz verdünnter Alkali;
wie 0,1 η NaOH1Zu einer wässerigen Lösung des Hydrochloride
bis zu einem pH-Wert von etwa 8,5 - 9»5 und Abtrennung der freien Base durch Filtration von der wässerigen
Suspension erhalten werden.
Die späteren,von der oben beschriebenen Säule gesammelten
Fraktionen liefern, wenn sie gesammelt und konzentriert werden, ein weißes Pulver,die Antibiotikum We^-Cj-Fraktion.
Das erhaltene Antibiotikum W847-C ^Pulver dieser Stufe zeigt
eine Stärke von etwa 880 ug/mg gemäß der vorher beschriebenen Zylinderschalenprobe.
Bei Anwendung der vorher beschriebenen bioautographisehen
- 20 -
109842/0495
Verfahren und Chloroform und Methanol (60:40 Volumen/Volumen) als Lösungsmittelsystem zeigt das isolierte Antibiotikum Ve^-C1 ein breites Spektrum antibakterieller Wirksamkeit in vitro gegen die folgenden grampositiven und gramnegativen Organismen:
Bacillus subtilis ATCC 6633 Sarcina lutea ATCC 9341
Staphylococcus aureus ATCC 6538P Pseudomonas aeruginosa ATCC 8689
Die verbleibenden wirksamen Fraktionen von der Kieselsäuresäule können vereinigt und weitere Ergebnisse durch Florisil
(Nagnesiumsilikat)Säulenchromatographie wie folgt erhalten werden: Die Säule wird durch Aktivierung des Florisils bei
1000C für 16 h, Fixierung in Hexan und Gießen der erhaltenen Aufschlämmung in eine Glassäule hergestellt. Die Säule wird mit dem restlichen Antibiotikum ¥847 Komplex (nach
Abtrennung der Fraktionen C1 und Cp), gelöst in Methylenchlorid, beschickt und fortschreitend mit einem dem Aufnahmevolumen des Absorbtionsmittels entsprechenden Volumen (im
folgenden Aufnahmevolumen genannt) Hexan, einem Aufnahmevolumen Äthyläther, einem Aufnahmevolumen Äthylacetat und dann
in zunehmenden Mengen mit Aceton in Äthylacetat entwickelt. Die Abtrennung wird durch Scheibentest der Fraktionen gegen
S. aureus und E.coli und DünnschichtChromatographie, wie vorher beschrieben, überwacht.
109842/0495 " 21 "
Bei Anwendung dieses Verfahrens kann die Abtrennung der Fraktion A und der Fraktion B ausgeführt werden. Beide
werden als minderweiße Pulver durch Konzentration der gesammelten chromatographischen Fraktionen zur Trockene
isoliert. Die Fraktionen A und B hatten eine Stärke von 1^5 /Ug/mg bzw. 71 ug/mg in der S. lutea-Probe.
werden als minderweiße Pulver durch Konzentration der gesammelten chromatographischen Fraktionen zur Trockene
isoliert. Die Fraktionen A und B hatten eine Stärke von 1^5 /Ug/mg bzw. 71 ug/mg in der S. lutea-Probe.
Alternativ kann eine Mischung der Antibiotikum W847-C-Fraktionen
aus dem, wie oben beschrieben, hergestellten Äthylacetat-Konzentrat wie folgt isoliert werden: Der Rückstand
wird in Aceton gelöst und unter kräftigem Rühren in kaltes Wasser gegossen. Die Suspension wird auf Zimmertemperatur
erwärmen gelassen und filtriert. Der Niederschlag besteht aus einer Mischung des Antibiotikums¥8^7-0^ und Antibiotikums
¥8^7-Cg und wird im folgenden als Antibiotikum V847-C-Komplex
bezeichnet und liegt unter diesen Umständen in Form der freien Base vor. Ein Säureadditionssalz des Komplexes kann bequem
durch Titrierung einer Methanollösung der Base mit der entsprechenden Säure und durch Ausfällung des Salzes durch Zusatz
von Äthyläther hergestellt werden. Wenn der vorgenannte Vorgang angewendet wird)um den Antibiotikum W8^7-C-Komplex
zu erhalten;können die Antibiotika W847-A und W847—B aus dem
wässerigen Filtrat extrahiert werden und der Extrakt nachfolgend zu einem Rückstand konzentriert und,wie oben beschrieben,
an Magnesiumsilikat Chromatograph!ert werden.
- 22 -
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Chemische Charakterisierung der Antibiotikum W847-Fraktionen-A,
B, C. und C„
Die Antibiotika dieser Erfindung sind Stickstoffbasen; dementsprechend ist jede Fraktion geeignet, in einer
Weise die gleich der für den Antibiotikum W8*i7-C-Komplex
beschriebenen ähnlich ist, Säureadditionssalze bilden. Typische solche Salze sind jene, die mit solchen Säuren
wie Chlorwasserstoff-, Schwefel-, Phosphor-, Stearin-, Propion-, Wein-, Maleinsäure u.ähnl. gebildet werden.
Wie zu erwarten ist, zeigen solche Salze auch antibiotische Wirksamkeit, die ähnlich ist jener des freien Antibiotikums,
gewöhnlich unterschiedlich in den Stärke- und Löslichkeitseigenschaften.
Die Antibiotika dieser Erfindung sind auch hydroxylierte
Verbindungen. Dementsprechend sind sie auch zur Veresterung geeignet, vorzugsweise mit einer Karbonsäure. Beispiele
derselben sind Ester, wie Acetate, Propionate, Cyclopropylcarboxylate, Succinate, Benzoate u.dgl. Solche
Ester zeigen im allgemeinen eine antibiotische Wirksamkeit, die ähnlich jener des freien Antibiotikums ist, gewöhnlich
unterschiedlich in den Stärke- und Löslichkeitseigenschaften.
In Tabelle 5 sind die chemischen und physikalischen Eigenschaften der Antibiotikum V847-Fraktionen a, B, C1 und C2
gezeigt.
- 23 -
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C7O6UL Chemische und physikalische Eigenschaften der Antibiotikum W847 Fraktionen | Fraktion A | Fraktion B | Fraktion C1 | Fraktion C2 |
-90° | -92% | -104° | 1 -102° | |
Optische Drehung FuLi25C1^ in Äthanol) |
255-259°C (Zers.) | 1,25-1350C (Zers.)* | 243-2460C (Zers.) | 146-15O0C (Zers.) |
Schmelzpunkt | 9,1 | 8,8 | 8,8 | 8,6 |
PKa | 490 | 488 | L 492 »f |
|
Neutralisation Äquivalent |
gefun- berech- den net 60,23 60,25 9,28 9,19 3,30 3,19 27,19 27,36 |
gefun- berech- den net 58,90 60,11 8,94 8,99 2,88 3,05 29,18 27,85 |
gefun- berech- den net 60,23 59,98 8,93 8,81 2,94 2,92 27,90 28,30 |
gefun- berech- den net 58,93 60,35 8,73 8,89 2,88 2,87 29,46 27,89 |
Fl einen taranalyse: | c^H8ON2°15 | S6H82N2°l6 | C48H84N20i7 | C*9H86N2Oi7 |
Kohlenstoff Wasserstoff Stickstoff Sauerstoff (durch Un t e rs ch i edb i i dung) |
877,10 | 919,14 | 961,17 | 975,20 |
Empirische Formel | ||||
Molekulargewicht |
* Monohydrat
Die Infrarotspektren der Antibiotikum W847-Fraktionen A,B,C.
und C„ sind in den Fig.1,2,3 bzw. k gezeigt. Die Wellenlängen
(l) sind in yu angegeben, die Frequenzen (*v) in esf" ; T steht für
die Durchlässigkeit und A für die Absorbtion. Die Spektren der verschiedenen antibiotisehen Fraktionen wurden in Mineralöl (Kujol)
ausgeführt und die bedeutenderen Ab&orbtionsmaxima sind in
der folgenden Tabelle 6 zusammengestellt, wobei bedeutet: sst = sehr stark, st = stark, m-st = mittel bis stark, m =
mittel, schw = schwach, br = breit, sch = scharf, schu = Schulter und sb = Seitenband. Spitzen, welche eher auf dem
Vorhandensein des Nujolmediums als der jeweiligen W847-Fraktion beruhen, sind mit "N" (für Nujol) bezeichnet.
Die Antibiotikum W8^7-Fraktionen A, B, C. und C„ haben charakteristische
kernmagnetische Resonanz-Spektren (NMR), welche
in den Fig.5, 6,7 bzw. 8 gezeigt sind. Die NHR-Spektren
wurden auf einem Varian-A-60-A-Spektrometer mit einer Lösung
(zirka 0,4 ml, Konzentration zirka 20 mg/ml) einer Probe jeder
Fraktion in Deuterochloroform. Die Spektren sind in Teile per Million (PPM) von Tetramethylsilan aufgezeichnet.
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56*0/2*8601
Infrarot-Spektren der Antibiotikum-W847-Fraktionen
OJ I
Fraktion A | Intensität | Fraktion B | Intensität | Fraktion C. | Intensität | Fraktion C2 | Intensität |
Wellenlänge (yu) |
m-st, br | Wellenlänge (/*) |
m | Wellenlänge | sb | Wellenlänge (/*) |
schw-m |
2,82-2,90 | N | 2,87 | schu | 2,82 | schw | 2,83 | N |
3,35-3,50 | st | 2,97 | N | 2,87 | N | 3,33-3,48 | St |
5,77 | (instrument | 3,35-3,50 | St | 3,35-3,50 | st | 5,70 | (instrument |
5,82 | artifact) | 5,72 | 5,72 | 5,80 | artifact) | ||
m-st | St | schw-m | schu | ||||
5,88 | N | 5,83 | N | 5,87 | N | 5,88 | N |
6,82 | N | 6,82 | N | 6,82 | N | 6,80 | N Ϊ |
7,24 | sb | 7,25 | St | 7,25 | m | 7,23 | st tÄ |
7,36 | m-st, sch | 8,05 | st, br | 7,^5 | m | 8,00 | st, br |
7,82 | sst, br | 8,45 | st | 7,57 | m | 8,53 | st f |
8,45 | sst | 8,59 | st | 7,82 | St | 8,93 | schu |
8,92 | sst | 8,94 | st | 8,03 | sst | 9,08 | m-st |
9,02 | sst | 9,30 | st | 8,13 | St | 9,27 | St |
9,12 | m-st | 9,62 | m-st | 8,60 | m-st | 9,65 | m-st, br |
9,32 | sst | 9,91 | m-st | 8,94 | St | 10,00 | m |
9,53 | sst | 10,02 | m | 9,05 | st | 10,38 | m |
9,63 | sst | 10,29 | sch-m | 9,56 | st | 10,97 | m |
9,98 | st | 10,84 | sch-m | 9,70 | m-st | 11,15 | schw |
10,27 | m-st | 11,08 | sch-m | 10,13 | m | 11,52 | schw-m |
11,02 | m-st | 11,20 | 10,48 | schw-m | 11,92 | ||
11,17 | 11,02 | schw-m | |||||
11,18 |
Die Antibiotikum W847-Fraktionen A, B, C1 und C„ zeigen folgende
Stabilitäten: Bei einem pH-Wert von 2,0 — 6,0 und einer
Temperatur von 1000C zeigen die Fraktionen A und B einen bedeutenden
Verlust an Wirksamkeit in 30 min; sie sind jedoch stabil, wenn sie denselben Bedingungen bei einem pll-Wert von
7,0 - 10,0 unterworfen werden. Die Fraktion C. ist demgegenüber
bei einem pH-Wert von 2,0 - 8,0 für 30 min bei 100°C stabil und unstabil unter denselben Bedingungen bei einem pH-Wert
von 10,0. Die Fraktion C„ ist sowohl unter sauren Bedingungen
(pH 2,0) als auch alkalischen Bedingungen (pH 10,0) bei 1000C
unstabil,aber sie ist stabil bei einem pH-Wert von k,Q - 8,0
für 30 min bei 1000C.
5. Biologische Eigenschaften des Antibiotikum W847 Komplexes,
Fraktionen A, B, C. und C„ und Antibiotikum W847—C Komplexes
A. In-vitro-Test
Der Antibiotikum W847 Komplex, Fraktionen A, B, C1 und C„ und
der Antibiotikum W847-C Komplex besitzen ein breites Spektrum
antibakterieller In-vitro-Aktivität gegen eine Vielzahl von grampositiven und gramnegativen Organismen. Entweder als Komplex
oder als einzelne Fraktion können sie daher zur Reinigung und Sterilisation von Laboratoriumsglaswaren und zur Reinigung
und Sterilisation chirurgischer Instrumente u.dgl. verwendet werden. Diese Antibiotika können auch in Kombination mit Seifen
und Waschmitteln zum Reinigen und Desinfizieren von Räumen;
die für die Bereitung von Nahrungsmitteln verwendet werden, z.B,
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Das antibakterielle In-Titro-Spektrum des Antibiotikum
W847-KOMpIexes, Fraktionen A, D, C. und C„ und des Antibiotikiuü ¥847—C Komplexes gegen typische grampositive und
gramnegative Organismen ist in der folgenden Tabelle 7 gezeigt. Die Empfindlichkeit der Testorganismen gegen die
Antibiotika wurde durch ein Rohrverdiinnungsverfahren in Hefe—Rindfleisch-Brühe die mit Natriumhydroxyd auf einen
pH—Wert von 8,0 eingestellt wurde, bestimmt. Die getesteten Stämme der Organismen sind durch Sammlungsnummem gekennzeichnet; hier und in anderen folgenden Tabellen beziehen sich diese Nummern, denen die Buchstaben "DA" vorangestellt sind, auf die Sammlung der Schering Corporation,
Bloomfield (N.J.), Ü.S.A.
109842/0495
Tabelle 7 Antibakterielles Spektrum des Antibiotikum W847 Komplexes und der Fraktionen
und des C-Komplexes
Minimale Inhibitionskonzentration (ug/ml) des Antibiotikums
Mikroorganismus
Komplex Base
Komplex
CHlsalz
Fraktion
A
A
Fraktion B
Fraktion Fraktion C-Komplex
Bacillus megatherium DA 7064 0.3
Bacillus subtilis ATCC 6633 0.03
Diplococcus pneumoniae DA 700 -
Diplococcus pneumoniae ATCC 10015 -
Diplococcus pneumoniae DA 150 6.0
Enterococcus sp. DA 800 0.3
Enterococcus sp. DA 801 0.3
Enterococcus sp. DA 802 0.3
Sarcina lutea ATCC 93Ul 0.0075
Staphylococcus aureus ATCC 12715 0.3
Staphylococcus aureus ATCC 6538P 0.3
Staphylococcus aureus ATCC 11631* 0.3
Staphylococcus aureus (Gray) 0.3
Staphylococcus aureus DA 2001 0.03
Staphylococcus aureus DA 2003 0.03
Staphylococcus aureus DA 2010 0.3
Staphylococcus aureus DA 2014 0.3
Staphylococcus aureus DA 2018 0.3
Staphylococcus aureus DA 2032 0.075
Staphylococcus aureus DA 2033** >16
Streptococcus faecalis DA 20 0.3
Streptococcus pyogenes DA 21 0.75
Streptococcus pyogenes DA 11 0.3
Streptococcus pyogenes DA 12. -
0.75
0.75
0.0ü75
0.75
0.03 "
0.075
0.3
0.3
0.03
U.3
0.3
0,3
0.3
0.75
0.03 "
0.075
0.3
0.3
0.03
U.3
0.3
0,3
0.3
0.6
0.005
1.2
0.5
>2.7
>2.7
0.6
0.6
0.2
0.005
0.08
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
>2.7
>2.7
0.03
5.0
0.6
0.2
1.2
0.05
1.2
0.5 >-2.7
0.6
0.6
0.2
0.005
0.2
0.2
0.6
0.6
0.2
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6 >2.7
0.1
5.0
0.2
0.2
>32
0.3 0.03
12.0 0.3 0.3 0.3
0.0075 0.3 0.03 0.3 0.3 0.03 0.075 0.3 0.03 0.075 0.075
0 0.3 0.3 0.3
0.6 0.005 0.6 0.05
0.08 0.6 0.03 0.0005 0.005 0.005 0.6 0.6 0.03 0.6 0.2 0.6 0.1 0.08
2.7 0.005 0.6 0.03 0.03
0.3 0.005
>2.7
0.3
0.3
0.3
0.00075
0.03
0.03
0.3
0.5
0.03
0.3
0.25
0.03
0.1
0.08 >2.7
0.075
0.3
0.3
(Forts.)
Tabelle 7 (Forts.)
Minimale Inhibitionskonzentration (ug/ml) des Antibiotikums W847
Mikroorganismus
Komplex | Komplex |
Base | HCl- |
salz | |
0,75 | 0,3 |
6,0 | > 16 |
12,0 | > 16 |
6,0 | > 16 |
6,0 | 12,0 |
6,0 | 12,0 |
Fraktion Fraktion Fraktion Fraktion C-Komplex
C.
Mycobacterium smegmatis ATCC 10143 Escherichia coli ATCC 10536
Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 Proteus vulgaris DA Pseudoraonas aeruginosa ATCC 8689
Salmonella schottmuelleri DA
5,0
6,0
6,0
12,0
6,0
6,0
6,0
6,0
12,0
6,0
6,0
5,0 | O1 | ,3 |
12,0 | 12, | »0 |
24,0 | 12, | »0 |
24,0 | 24, | »0 |
12,0 | 6, | »0 |
12,0 | 12 | »0 |
0,05
12,0 24,0 24,0 6,0 12,0
* ein gegen Penicillin resistenter Stamm
** ein gegen Erythromycin resistenter Stamm
** ein gegen Erythromycin resistenter Stamm
üie antibakterielle Aktivität des Antibiotikum W8'»7 Komplexes
mit jener von Erythromycin, Penicillin G und Methicillin
wird in der folgenden Tabelle 8 verglichen (die Empfindlichkeit wurde durch das oben beschriebene Itohrverdünnungsverfahren
bestimmt). Die Tests wurden unter Verwendung der folgenden Medien durchgeführt": Antibiotikum W8'*7 Komplex
und Erythromycin in liefe-Rindfleisch-Bruhe bei pH-Wert
von 8,0; Penicillin G und Methicillin in liefe-Ilindfleisch-Bruhe
bei pH-Wert von 6,8. Die Ergebnisse zeigen, daß der Antibiotikum W847 Komplex im Vergleich zu den anderen geprüften
Antibiotika eine bessere Aktivität gegen grampositive Bakterien hat. Der Antibiotikum V847 Komplex ist darüber
hinaus aktiv gegen Mycobacterium smegmatis bei einer niedrigeren
Konzentration als Erythromycin, wogegen Penicillin G und Methicillin bis zu 10 yug/ml inaktiv sind.
- Ji -
109842/0495
Tabelle 8
Penicillin G und Methicillin
W847 Komplex Erythromycin Penicillin G Methicillin
Bacillus cereus Bacillus subtilis Diplococcus pneuraoniae Sarcina lutea
Staphylococcus aureus (3 verschiedene Stämme)O,OO5-O,2
Staphylococcus aureus(7 verschiedene Stämme )* 0,03-0,6 Staphylococcus aureus(i Stamm)**
Streptococcus faecalis Streptococcus pyog en es (4 verschiedene Stämme)
iA Mycobacterium smegraatis ι
^1 Antibiotikum W847 Komplex und Erythromycin in liefe-Itindfleisch-Brühe bei pH 8,0; Penicillin G
o und Methicillin in Hefe-Rindfleisch-Brühe bei pH 6,8.
^ * klinisch isoliert, umfaßt gegen Penicillin resistente Organismen
** ** klinisch isoliert, resistent gegen Erythromycin
0,2 | 0,05 | 0,12 | 4,8 |
0,005 | 0,005 | 0,01 | 0,03 |
0,2 | 0,05 | 0,12 | 1,8 |
0,0005 | 0,005 | 0,06 | 0,3 |
0,005-0,2 | 0,005-0,05 | 0,003-0,06 | 0,12-0,6 |
0,03-0,6 | 0,005-0,5 | 1,2-9,4 | 1,2-7,5 |
2,7 | 50,0 | - | - |
0,005 | 0,0005 | 0,75 | 25,0 |
0,03-0,2 | 0,05 | 0,01-0,02 | 0,6 |
0,5 | 5,0 | 10 | 10 |
Vie oben ausgeführt wurde, zeigen der Antibiotikum W847
Komplex, der Antibiotikum W847-C Komplex und die Fraktionen A, B, C1 und C2 einen breiten Bereich antimikrobiell er
Aktivität gegen grampositive und gramnegative Mikroorganismen. Zu der grampositiven Gruppe gehören pathogene Mikroorganismen
einschließlich Species der Gattung Streptococcus, Staphylococcus und Diplococcus, welche, wie bekannt, zahlreiche
Krankheiten verursachen. Verschiedene Species von Staphylococcus und Streptococcus sind die Ursache für Rindermastitis.
Diese Species werden leicht durch die beschriebenen Antibiotika nach einer verhältnismäßig kurzen Zeit
nach der Verabreichung unter Kontrolle gebracht und behandelt.
Der Antibiotikum W847 Komplex, die Fraktionen A, B, C., C2
und W847-C Komplex sind auch gegen gramnegative Organismen
einschließlich Species der Gattung Escherichia, Salmonella, Proteus und Pseudomonas wirksam. Diese Organismen sind die
Ursache für viele ernste K rankheit β Symptome einschließlich
Harntraktinfektionen und Diarrhö es. Solche Symptome sind sehr üblich bei Haustieren wie Hornvieh, Pferden, Schafen, Schweinen,
Hunden und Katzen und können wirkungsvoll unter Kontrolle gebracht und behandelt werden durch die beschriebenen Antibiotika.
- 31 -106842/0495
Der in Erdnußöl suspendierte Antibiotikum ¥847 Komplex
ergibt eine LDen (letale Dosis für 50% der getesteten)
von 270 mg/kg bei Mäusen auf interperitonealem Wege. Bei subcutaner und oraler Verabreichung ist die LD^0 größer
als 5000 mg/kg. Die PD50 (Scnutzdosis für 50$ der getesteten)
ist 150 mg/kg bei subcutaner Verabreichung (Erdnußölsuspension) gegen eine letale Infektion von
S. aureus bei Mäusen. Gegen Streptococcus pyogenes ist die PD-q bei Mäusen auf demselben Verabrei chungsvrege
100 mg/kg.
Darüber hinaus ist der Antibiotikum ¥847 Komplex verabreicht an Hunden in Mengen von 17»5 mg/kg im Blutserum
für 7 Tage feststellbar. Dies ist überraschend im Hinblick auf die Tatsache, daß bei Verabreichung einer vergleichbaren
Dosis an Erythromycin diese nicht über einen Intervall von 24 h vorhanden bleibt.
Daten der akuten Toxizität für die Antibiotikum ¥847 Fraktionen
und Komplexe sind in Tabelle 10 angeführt.
Die Tabellen 11, 12 und 13 zeigen den durch die Antibiotika
vorliegender Erfindung bewirkten Tierschutz.
- 3Ü -109842/0495
Toxizität der Antibiotikum W8yi7 Fraktionen und Komplexe in Mäusen
in mg/kg)
Verabreichungsweg
W8'i7 Komplex Base in Erdnußöl
W847 Komplex | W8'i7 Fraktion | W847 | Fraktion B | W847-C Kom |
HCl in H2O | A Base* | Base | in Erdnuß | plex |
öl | ||||
> 2500 | 7500 | - | ■ρ, 500 | |
2500 | 7000 | 500 | V 500 | |
300 | 350 | 400 |
Subcutan
75
Dase*
Oral | >1000 |
Subcutan | >1000 |
Intraperitoneal | 500 |
> 500
> 500
>500
* In 0,5#iger wässeriger Carboxymethyl-zellulose
cn
T a b e I 1 e
11
in Mäusen (I ß-Q in /)
Antibiotikum W847 Komplex in Krdnußöl
Antibiotikum ¥847 Komplex HCl in H2O
Antibiotikum W847 Fraktion C„HC1
•in H2O Λ
Subcutano Behandlung
Staphylococcus aureus Gray Staphylococcus aureus DA 2030
Staphylococcus aurous DA 2000 Staphylococcus aurous Smith Streptococcus pyogenos C DA
Streptococcus pyogenes DA 32 Streptococcus pyogenes DA 31 Streptococcus pyogenes DA 12
Streptococcus pyogenes DA 9 Diplococcus pneumoniae DA 150
Diplococcus pneumoniae DA 150
(2 Tage Behandlung) Diplococcus pneumoniae DA 151 Diplococcus pneuraoniae DA 10015
Staphylococcus aureus Gray Streptococcus pyogenes DA 21 Diplococcus pneumoniae DA 150
35 23
35 23/Tag
4,3 | 5 |
4,3 | |
3,5 | - |
2,3 | - |
4,6 | 45 |
1,5* | - |
1,5* | - |
1,5* | - |
1,5* | - |
23,2 | 150 |
11,6/Tag | 30/Tag |
11,6 | mm |
1,5* | - |
Orale Behandlung |
> 116
116
PD
100
Aktivität von Antibiotikum W8;»7 Fraktionen
ι*ορ,βη
letale intraperitoneale Infektionen in
Mäusen ( Pl) rn in mg/kg)
Behandlungsweg
W847-A
Base *
W847-C.
Base *J
Streptococcus
Streptococcus
Streptococcus
Strep tococcus
Streptococcus
Strep tococcus
Streptococcus
Streptococcus
Staphylococcus S taphylococcus
Staphylococcus Staphylococcus
Staphylococcus Staphylococcus Staphylococcus
Staphylococcus Diplococcus
Diplococcus
Diplococcus
pyogenes
pyogenes
pyogenes
pyogenes
pyogenes
pyogenes
pyogenes
pyogenes
aureus
aureus
aureus
aureus
aureus
aureus
aureus
aureus
pneumoniae
pneumoniae
pneumoniae
C
C
Nr
Nr
Nr
Nr
Smith Smith Gray Gray W W
Nr. Nr.
eye
eye
Nr.
Diplococcus pneumoniae Nr. Enterococcus Nr. 802 Enterococcus Nr. 802
Enterococcus Nr. 804 Enterococcus Nr. 804 Escherichia coli
Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa
Oral.
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
300 220 300 134 180 180 250
167 250
75
300
20
117
20 150
20 300
90 250
70 300 160 250 180 200 100 250 150 >25O
161
207 118 300 180
>25O 200
>25O 250 180
117 >25O
62 150
25 170
25 300
167
200
170
>25O
180
250
250
250
250
>250 >25O >25O >25O
in 0,5%igcr wässeriger Carboxymethylzellulose; ( ) S.C. = subcutan
intraperi toneal e Infektionen in Mäusen (PD rQ in /)' "
W847-B
Base in Base* x HCl in^HgO Komplex Komplex
Erdnußöl Base* HCl in F
Staphylococcus aureus Gray Streptococcus pyogenes C
Staphylococcus aureus Smith Streptococcus pyogenes Nr.
200 150
10
50 | 50 |
50 | 50 |
86 | |
39 |
Orale Verabreichung der Antibiotika
mm
M
Organismus
<p Staphylococcus aureus Gray •©Streptococcus pyogenes C
!^Staphylococcus aureus Smith ^»,Streptococcus pyogenes Nr.
>250 >25O
100 100
390 310
310 390
>25O >250
«η* Mit Ultraschall behandelte Suspension in wässeriger 0,5$iger Carboxymethylcellulose
«cn CD
Die in 0,5%iger wässeriger Carboxymethylzellulose suspendierte
und durch Behandlung mit Ultraschall dispergierte Antibiotikum ¥8^7 Fraktion A ist bei subcutaner Verabreichung
in Mäusen gegen S. aureus Gray mit einer PD™ (Schutzdosis
für 50% der getesteten) von 20 mg/kg und gegen P.
aeruginosa mit einer PDj-q von 161 mg/kg wirksam. Die LD
in Mäusen bei subcutaner Verabreichung ist 7OOO mg/kg.
Die in Erdnußöl suspendierte Antibiotikum ¥8^7 Fraktion ist
bei subcutaner Verabreichung in Mäusen gegen S. aureus mit einer PD^0 von 15O mg/kg wirksam und gegen P. aeruginosa
wird mit 350 mg/kg eine Verzögerung des Todes um 2k h erreicht. Die LDcQ in Mäusen bei subcutaner Verabreichung ist
größer als 500 mg/kg.
Die in 0,5%iger wässeriger Carboxymethylzellulose suspendierte
und durch Behandlung mit Ultraschall dispergierte Antibiotikum ¥847 Fraktion C. ist in Mäusen gegen S. aureus
wirksam. Bei subcutaner Verabreichung gegen S. aureus Gray beträgt die PDr0 62 mg/kg. Bei der gleichen Verabreichungsart beträgt die PD_0 180 mg/kg gegen S. pyogenes C. Das Antibiotikum
ist etwas weniger wirksam bei oraler Verabreichung mit einer PDKn gegen S. aureus Gray und .S. pyogenes C von
mehr als 250 mg/kg. Die LD^n in Mäusen bei subcutaner Verab
reichung ist größer als 1000 mg/kg. Das Antibiotikum zeigt auch eine Antimalaria-Wirksamkeit gegen Plasmodium
berghei und bei Verabreichung an Nagetieren (lOO mg/kg/Tag)
1Q9842/CU95
wird bei einer Nachinfektion nach 2k h eine bedeutende Unterdrückung
in der Blutparasitzahl bewirkt.
Die Antibiotikum W847 Fraktion C2 ist als Suspension in
wässeriger Carboxymethylzellulose bei subcutaner Verabreichung wirksam. Es ist jedoch vorteilhafter, sie als wässerige Lösung des Hydrochloridsalzes zu verwenden und bei subcutaner Verabreichung an Mäusen beträgt die PDtn ^5 mg/kg
gegen S. aureus Gray und 10 mg/kg gegen S. pyogenes C. Bei oraler Verabreichung weist diese Fraktion eine PD-0 von
100 mg/kg gegen diese beiden Organismen auf. Die LDc0 i-n
Mäusen bei intraperitonealer Verabreichung ist größer als
500 mg/kg.
wässeriger Carboxymethylzellulose bei subcutaner Verabreichung wirksam. Es ist jedoch vorteilhafter, sie als wässerige Lösung des Hydrochloridsalzes zu verwenden und bei subcutaner Verabreichung an Mäusen beträgt die PDtn ^5 mg/kg
gegen S. aureus Gray und 10 mg/kg gegen S. pyogenes C. Bei oraler Verabreichung weist diese Fraktion eine PD-0 von
100 mg/kg gegen diese beiden Organismen auf. Die LDc0 i-n
Mäusen bei intraperitonealer Verabreichung ist größer als
500 mg/kg.
Die folgenden Beispiele erläutern in einer ausführlicheren Weise die bevorzugten Verfahren zur Herstellung der beschriebenen
Antibiotika. ■
1. Fermentation der Mikroorganismen
Beispiel 1: Schüttelkolbenfermentation
A. Keimungsstufe
0,5 ml einer lyophilisierten Kultur von Micromonospora sp.
W8^7 werden in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben, der
100 ml des folgenden Mediums enthält, das vor der Sterilisation mit verdünntem Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von
7,5 eingestellt wurde:
7,5 eingestellt wurde:
109842/0495
Bacto-Rindfleisch-Extrakt (Difco) 3,0 g
Bacto-Tryptose (Difco) 5,0 g
Dextrose 1,0 g
Stärke (Kartoffel) 24,0 g
Bacto-Hefe-Extrakt (Difco) 5,0 g
Kalziumkarbonat 2,0 g
Leitungswasser 1000,0 ml
Man bebrütet 3 Tage lang bei 37°C auf einer rotierenden
Schüttelmaschine (280 Umdr/min; 5 cm Rüttelbewegung).
B. Inoculumstufe
Man überträgt aseptisch 25 ml des durch die vorstehende
Keimung gewonnenen Inoculums auf einen 2 1-Erlenmeyer-Kolben,
der 500 ml des für die Keimung verwendeten sterilen Mediums enthält. Man bebrütet den Kolben samt Inhalt
3 Tage lang bei 280C auf einer rotierenden Schüttelraaschine
(280 Umdr/min; 5 cm Ru tt el bewegung).
C. Fermentationsstufe
Man überträgt aseptisch je 25 ml aus der Inoculumstufe auf
2 1-Erlenmeyer-Kolben,die 500 ml des folgenden sterilen
Mediums enthalten, welches vor der Sterilisation durch verdünntes wässeriges Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von
7,8 eingestellt wurde.
- 4ffl-
1Q9842/049S
30 | ,0 | g | IT O |
g |
3 | ,0 | g | ml | |
1 | ,0 | g | ||
0 | ,5 | (T O |
||
0 | ,01 | |||
8 | ,0 | |||
1000 | ,0 |
Sucrose
Natriumnitrat Dikaliumphosphat
Magnesiumsulfat Ferrosulfat
Pepton
Leitungswasser
Man bebrütet die Flaschen samt Inhalt k Tage lang bei 280C
auf einer rotierenden Schüttelmaschine (280 Umdr/min; 5 cm Rüttelbewegung), vereinigt die Inhalte der Flaschen, stellt
in einem aliquoten Teil der ganzen Brühe den pH-Wert auf 9,5 ein und extrahiert mit Äthylacetat (ungefähr 2 Volumen/
Volumen der Brühe). Man trennt die Lösungsmittelphase ab und konzentriert unter Vakuum auf das lOOfache. Das Konzentrat
wird auf seine Wirksamkeit durch das Agarscheiben-Diffusionsverfahren
unter Verwendung von S. aureus (ATCC 6538P) als Testorganismus geprüft. Das Konzentrat ergibt
eine Inhibitionszone von ungefähr 20 - 35 mm.
Beispiel 2: Tankfermentation
A. Keimungsstufe
Die Keimungsstufe und die Inoculumstufe werden in der in
Beispiel 1 beschriebenen Weise ausgeführt,
B. Fermentationsstufe
500 ml des Inoculums werden aseptisch in einen lh 1-Fermen-
109842/0495
ter übertragen, der 10 1 des in Beispiel l beschriebenen
sterilen Mediums enthält, dem ό ml Antischaummittel,
Dow Corning B (Dow Corning Corporation, Midland, Michigan), zugesetzt wurden. Man bebrütet 66 h
lang unter folgenden Bedingungen:
Temperatur . 310C
Zufuhr an steriler Luft h l/rain
Bewegung 250 Umdr/min
Antischaummittel
(Dow Corning B) Zusatz wie er
forderlich
Am Ende dieser Periode erreicht die Intensität des erzeugten Antibiotikums eine Höhe,welche im wesentlichen konstant
bleibt. Während der Fermentation bleibt der pH-Wert der Fermentationsmischung im wesentlichen im Bereich von 7,2
8,2. Das kompakte Zellvolumen erreicht einen konstanten Wert von 2,5 - ^>5 ml. Die Aktivität des hergestellten Antibiotikums
in der ganzen Brühe ergibt beim Scheibentest gegen S. aureus oder P. aeruginosa einen Zonendurchmesser
von 15 - 25 mm.
Beispiel 3: Tankfermentation
A. Herstellung des Inoculums
A. Herstellung des Inoculums
In vier 2 1-Kolben, die je 500 ml der in Beispiel IA beschriebenen
sterilen Brühe enthalten, werden je 0,5 nil einer lyophilisierten Kultur von Micromonospora sp.
1 08842/0495
gegeben. Die Kolben werden auf eine rotierende Schüttelmaschine, die 280 Umdr/min macht (5 cm Rüttelbewegung)>gegeben
und bei 28°C 72 Ii lang bebrütet.
B. Fermentationsstufe
In jeden von 4 Fermentationsbehältern werden 10 1 des folgenden
sterilen Herstellungsmediums gegeben, das vor der Sterilisation auf einen pH-Wert von 7,15 - 7,25 eingestellt
wurde:
Trypticase 170,0 g
Natriumchlorid 50,0 g
Dikaliumphosphat 25,0 g
Dextrose 25,0 g
Czapek-Dox-Brühe 550,0 g
G.E.-60 Antischaummittel
(General Electric Company
Scheneetady, Xew York) wie erforderlich
Leitungswasser q.s. 10,0 1
Man beimpft jeden Fermenter mit 500 ml der oben beschriebenen
72 h-Kultur. Man bringt die Temperatur des Fermentationsmediums auf 31 C und rührt mit 500 Umdr/min,
wobei ein Luftstrom mit einer Geschwindigkeit von 0,5 1 Luft/ 1 Brühe/min durch das Medium geführt wird. Nach 24 h wird
die Bewegungsgeschwindigkeit auf 600 Umdr/min und nach 4S h auf 700 Umdr/min gesteigert. Die Fermentation ist am Ende
von 69 h beendet. Für die Extraktion vereinigt man die Brühen aus den 4 Fermentationsbehültern (etwa 37 l).
1 09842/0495
•J 17675S5
2. Extraktion des Antibiotikum W847 Komplexes
Beispiel 4: Extraktion des Antibiotikum W8^7 Komplexes
aus der Laboratoriumsfermentation (chromatographisches Verfahren).
60 1 der gemäß den in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellten Brühe werden mit verdünntem wässerigen Natriumhydroxyd
auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt. Man extrahiert mit 2 Volumen Äthylacetat pro jedem Volumen
Brühe, trennt die Lösungsmittelphase ab und konzentriert unter Vakuum,um einen öligen Rückstand zu erhalten (ungefähr
30,0 g). Die biologische Aktivität (l/20 Verdünnung) dieses öligen Rückstandes ergibt eine Inhibitionszone mit
einem Durchmesser von etwa 20#- 30 ram gegen S. aureus und
etwa 15 - 25 mm gegen P. aeruginosa. Man reinigt den öligen Rückstand durch Säulenchromatographie gemäß dem folgenden
Verfahren:
Unter Verwendung von 1000 g LH20 Sephadex (Pharmacia Fine Chemical, Inc.) die in 95%igem wässerigem Äthanol suspendiert
sind, \iird eine Säule hergestellt. Man überträgt den
öligen Rückstand auf die Säule und eluiert mit 95%igein
Äthanol mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 200 ml/h. Man sammelt 50 ml Fraktionen und vereinigt die Fraktionen gemäß
ihrer antibakteriellen Aktivität (bestimmt durch den Agarscheibentest gegen S. aureus ATCC 6538P). Die Fraktionen
109842/0498
HS
mit der höchsten Aktivität werden zur Trockene konzentriert,
der feste Rückstand in einer kleinen Menge von Aceton gelöst und die Lösung in ein überschüssiges Volumen
von Petroleumäther (Siedepunkt 30 - 60°C) gegossen. Die Mischung wird in ein Trockeneis/Acetonbad (ungefähr
-50°C)übergeführt und für 20 min stehen gelassen. Die Temperatur der Mischung wird auf Zimmertemperatur ansteigen
gelassen und die Mutterlauge von dem öligen Rückstand durch Dekantation abgetrennt. Man konzentriert die Mutterlauge
zur Trockene und erhält den gereinigten Antibiotikum ¥847 Komplex.
Der auf diese Weise hergestellte Antibiotikum ¥847 Komplex zeigt bei der Probe gemäß den oben beschriebenen Zylinderschalenverfahren
eine Stärke von etwa 225 - 275 /J
Beispiel 5'· Extraktion des Antibiotikum ¥847 Komplexes aus
der Tankfermentation (Lösungsmittelextraktionsverfahren).
Die gemäß Beispiel 3 erhaltene gesammelte Brühe (etwa 37 l)
wird mit 50%igem wässerigem Natriumhydroxyd auf den pH— ¥ert 9,5 eingestellt. Man extrahiert mit 2 Volumen Äthylacetat
und verdampft den Extrakt auf ein Volumen von 2.150 ml Man isoliert den Antibiotikum ¥847 Komplex durch eines der
folgenden Verfahren:
A. Chlorwasserstoffsäureextraktion
- 4t -
1098A2/0A95
Man extrahiert 500 ml des Äthylacetatkonzentrates zweimal
mit 250 ml einer 0,5#igen (Ο,ΙΛ η) Chlorwasserstoffsäure.
Durch Zusatz von 5/oigeiu wässerigem Natriumhydroxyd werden
die vereinigten Säureextrakte schwach alkalisch gemacht (ph-Wert etwa 8,5 - 9,0) worauf zweimal mit 250 ml Äthylacetat
extrahiert wird. Die Äthylacetatextrakte werden ver-• einigt und unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert.
Der so hergestellte Komplex zeigt bei der Probe nach dem vorher beschriebenen Zylinderschalenverfahren eine
fe Stärke von etwa 525/ug/mg.
B. Schwefelsäureextraktion
Man führt die in Beispiel 5A beschriebene Extraktion aus, wobei jedoch die Chlorwasserstoffsäure durch eine 0,1 n-Schwefelsäure
ersetzt ist. Der so hergestellte Komplex zeigt bei der Zylinderschalenprobe eine Stärke von 550 ug/mg.
3. Zerlegung des Antibiotikum ¥847 Komplexes und Herstellung
von Derivaten
Beispiel 6: Isolierung der Antibiotikum W847 Fraktion C2.
Man stellt eine Säule (105 cm lang, 7»6 cm Durchmesser) unter Verwendung von 2000 g Kieselsäure (analytisches Reagenz,
Mallinkrodt) her, wobei kleine Segmente in ein kompaktes Bett gegeben werden. Man löst 13*0 g des gemäß Beispiel h hergestellten
Antibiotikum W847 Komplexes in Aceton, das mit Kie-
1098Λ2/0Α9Ε
seisäure gemischt ist, auf und verdampft das Aceton unter Vakuum. Die trockene Mischung wird auf den oberen Teil der
Säule gegeben und die Säule mit einer Mischung von Chloroform (60 Vol.-Teile) und Methanol (40 Vol.-Teile) bei einer
Strömungsgeschwindigkeit von 100 ml/h eluiert. Man sammelt 200 ml Fraktionen und überwacht die Säule durch Scheibentest
jeder Fraktion gegen S. aureus und E. coli. Man ehromatographiert
die aktiven Fraktionen auf Kieselsäure-Dünnschichtplatten, die 1 1/2 h in demselben für die Kolonne
verwendeten Lösungsmittelsystem eingesetzt sind. Die Fraktionen werden gemäß ihren chromatographischen Mustern, wie
sie durch die vorher beschriebenen zwei Methoden bestimmt werden (vgl. Charakterisierung des Antibiotikum WS47 Komplexes)
gesammelt. Die Fraktionen werden unter Vakuum konzentriert. Durch Vereinigung der Fraktionen, wie in Tabelle lh
angegeben, wird das Antibiotikum-We^T-Fraktion-Crj-Hydrochlorid
als ein weißes Pulver durch Lösung der vereinigten Rückstände in einem Volumen Methanol und Ausfällung mit 10 Volumen Äthyläther
isoliert. Dieses Material dieser Stufe zeigt bei der vorher beschriebenen Zylinderschalenprobe eine Stärke von etwa
1000 ug/mg.
Isolierung des Antibiotikum-WS^V-Fraktion-C.-Material
Durch Vereinigung der späteren Fraktionen,wie in Tabelle Ik
angegeben,wird eine isolierte Antibiotikum ¥847 Fraktion C.
als ein weißes Pulver durch Konzentrierung der ausgewählten
109842/0495
Säulen!'raktionen zur Trockene erhalten. In dieser Stufe
zeigt dieses Material bei der vorher beschriebenen Zylinderschalenprobe
eine Stärke von etwa 900 ug/mg. Das verbleibende aktive Material wird aus der Säule eluiert, gesammelt
und zu einem Rückstand konzentriert.
Beispiel 7: Isolierung der Antibiotikum V847 Fraktion Λ
und Fraktion B.
Man aktiviert 500 g Florisil.bei 1000C für 16 h, nimmt in
Hexan auf und gibt die Aufschlämmung in eine Glassäule
(105 cm lang, 3,8 cm Durchmesser, Aufnahmevolumen 700 ml). Die Säule wird mit 2,S g des Rückstandes gemäß Beispiel 6
beschickt, die in 10 ml Methylenchlorid gelöst sind. Die
Säule wird fortschreitend mit 700 ml Hexan, 700 ml Äther,
7OO ;;;1 Athylacetat und amvachsenden Mengen Aceton in Allylacetat
(Strömungsgeschwindigkeit 200 ml/h) eluiert. Man sammelt 100 ml Fraktionen. Die Säule wird wie vorher beschrieben
durch Testung der Fraktionen gegen S. aureus und E. coli mit anschließender Dünnschichtchromatographie überwacht.
Die Fraktionen werden,wie in Tabelle lh angegeben, vereinigt.
109842/0495
Ergebnisse der Säulentrennung
Fraktion
Säulenschnitt
W847C.
Ki eselsäure-Säule
28-48 56-58
Florisil-Säule
W847B
V847A
164-227
(30% Aceton in Äthylacetat)
370-397
(80% Aceton in Äthylacetat
Gewicht
1,2 g 625 mg
540 rag
283
Dünnschicht
Muster Rf Chloroform-Methanol
(60/40)
0,65 0,52
0,38
0,19
Stärke ig/mg)
900-100 850-100
125-175
ί 50-100
Beispiel 8: Antibiotikum W847 Komplex Hydrochloric! Salz.
Etwa 140 mg des Antibiotikum ¥847 Komplexesjwie er gemäß Beispiel
5 isoliert wurde, wird in etwa 50 ml Wasser suspendiert.
Man stellt den pH-Wert der Suspension durch Zusatz von verdünnter (n/l) Chlorwasserstoffsäure auf etwa 6,5 - 7,0 ein und rührt
kräftig. Man entfernt das unlösliche, falls vorhanden, durch Filtration und lyophilisiert das FiItrat, wodurch ein Antibiotikum
W847 Hydroehlorid erhalten wird, Gewicht ungefähr 90 mg und Stärke
etwa 550 ug/ing.
109842/0495
Durch Anwendung des Verfahrens dieses Beispieles auf entweder
den Antibiotikum W8'i7 Komplex oder den verschiedenen
Fraktionen desselben und durch Einsatz äquivalenter Mengen anderer Säuren, wie z.B. Schwefel- oder Phosphorsäure, können
die entsprechenden Salze hergestellt werden. Alle Salze werden als zu dem Antibiotikum W82i7 Komplex gehörend und als
Äquivalent zu den beschriebenen freien Antibiotika betrachtet und fallen in den Rahmen dieser Erfindung.
In der Tabelle 15 ist die Aktivität der Hydrochlorid-, Sufat-
und Phosphatsalze, die aus dem Antibiotikum WS^ 7 Komplex,
Stärke des Antibiotikum W847 Komplexes 232 ng/mg, hergestellt
sind, gegen eine Vielzahl von grainpositiven und
grcmnegativen Organismen in einer Hefe-Rindf 1 eisch-Iirühe bei
einem pH-Wert von 8,0 angegeben.
109842/0495
CC'
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c -< co co -<
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I | ||||||||
^ !C | CO | O | ||||||
~- ^. | co | |||||||
-I
- χ Ξ ^
""^ ■— C d
χ χ ^:
108842/0496
BAD
Beispiel 9: Isolierung des Antibiotikum W8^7*-C Komplexes,
542 g des ¥8^7 Komplexes (vgl. Beispiel 5) werden in 5»^ 1
Aceton gelöst und die sich ergebende Lösung mit 81 g Entfärbungskohlθ
für etwa 30 min bei etwa Raumtemperatur behandelt. Die Entfärbungskohle wird durch Filtration entfernt
und das Filtrat im Vakuum auf ungefähr 2 1 konzentriert. Man stellt eine Aufschlämmung von etwa 80 1 von Eis und Wasser
her und fügt unter kräftigem Rühren die Acetonlösung hinzu. Die Temperatur der sich ergebenden Suspension wird auf etwa
25°C unter Rühren ansteigen gelassen und durch Filtration sammelt man das Produkt. Der Feststoff wird mit einer kleinen
Menge Wasser gewaschen und bei etwa 500C im Vakuum getrocknet,
man erhält etwa 212 g Antibiotikum W847-C Komplex mit einer
Stärke von etwa 1075 /Ug/mg.
Zusätzliches Produkt (etwa 85 g) kann durch Konzentration der Mutterlauge erhalten werden, dieses Produkt kann jedoch durch
Fraktionen A und B verunreinigt sein.
Der gemäß obigen Ausfuhrungen hergestellte Antibiotikum VS'iT-C
Komplex kann vorteilhafterweise für die Herstellung von Säureadditionssalzen,
wie im folgenden gezeigt wird, verwendet werden.
Beispiel 10: Herstellung eines Tartratsalzes eines Antibiotikum
WS'»7-C Komplexes.
Zu einer festen Zusammensetzung,die 2,0 g eines Komplexes von
109842/0495
Antibiotikum ¥847-0^ und Antibiotikum W847-C2 enthält und gemäß
Beispiel 9 erhalten wurde, werden unter Rühren 30 ml Diäthyläther zugesetzt. Zu der sich ergebenden Lösung werden
0,5 g Weinsäure, die in 2,5 ml Äthanol gelöst ist,zugesetzt.
Die Mischung wird etwa 15 min lang gerührt, dann das ausgefällte
Salz filtriert. Man wäscht den Niederschlag mit Diäthyläther und trocknet das Produkt, wobei man ungefähr 2,0 g Tartratsalz
erhält, dessen Bioprobe ungefähr 575 «g/mg ergibt und dessen Drehung gemessen in einer l%igen Lösung in Äthanol -57° ist.
Beispiel 11: Antibiotikum W8*t7-C Komplex Propionat-Ester.
1,0 g Antibiotikum W847-C Komplex wird in 5»0 ml trockenem
Aceton gelöst und 0,35 ml Propionsäureanhydrid werden zugesetzt.
Die Mischung wird bei Raumtemperatur k h lang gerührt, dann langsam und unter Rühren 8 ml eines l,2%igen wässerigen
Ammoniaks zugesetzt. Der sich bildende Niederschlag wird abfiltriert und mit 40%igem wässerigem Aceton und dann mit Wasser
gewaschen, wobei das gewünschte Produkt erhalten wird. Das auf diese Weise erhaltene Produkt hat folgende Konstanten:
Schmelzpunkt = 207-2100C ;£*-]25= -63°C (C = i% in Äthanol).
Beispiel 12: Antibiotikum W8'i7-C Komplex Diacetat-Ester.
Man löst 11,8 g des W847-C Komplexes in 55 ml Pyridin und
setzt 5,5 ml Essigsäureanhydrid zu. Man rührt die Reaktionsmischung bei Zimmertemperatur etwa 18 h lang und gibt sie
dann unter kräftigem Rühren in 2 1 Eiswasser, das 50 ml
109842/0495
n wässerigen Ammoniak enthält. Der sich bildende Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet,
rfobei das gewünschte Produkt enthalten wird, das einen Schmelzpunkt
von 237 - 2410C und eine Drehung von etwa -86° (C = i%
in Äthanol) hat.
Alternativ kann das ausgefällte Produkt mit Äthylacetat extrahiert,
der Extrakt mit Wasser gewaschen und in Vakuum zu einem Rückstand verdampft werden. Der Rückstand wird anschließend in
Aceton gelöst, mit Entfärbungskohle behandelt und durch Zusatz
eines gleichen Volumen Wassers ausgefällt, wobei man das genannte Produkt erhält.
Im Hinblick auf die vorhergehenden Beispiele ist es für den Fachmann offensichtlich, daß die Antibiotika vorliegender Erfindung
andere Ester bilden werden. Alle Ester werden als zu dem Antibiotikum W847 Komplex gehörend und als vollständig
äquivalent mit jenen, deren Herstellung beschrieben wurde, betrachtet und solche Ester fallen in den Rahmen dieser Erfindung.
Pharmazeutische Dosisformen.
Die folgenden Beispiele betreffen einige der pharmazeutischen Dosisformen, in denen die Antibiotika verwendet werden können.
Die Formierungen, ausgenommen die äußerliche Verabreichung,
sind für die Verabreichung von etwa 5 - 50 mg Antibiotikum per Kilogramm Körpergewicht per Tag bestimmt. Es ist natürlich
- 5ί-
109842/0495
beabsichtigt, daß die Medikamente in unterteilten Dosen zweibis
achtmal in einer Zeitspanne von 2k h gegeben werden.
Die Formierungen für äußerliche Verabreichung werden im allgemeinen
auf den infizierten Bereich zwei- bis viermal täglich aufgebracht.
Bei der Anwendung der unten angeführten Formierungen hängt die Dosis des gegebenen Antibiotikums und die Anzahl der Verabreichungen
im großen Maße von dem Stadium und der Ernsthaftigkeit der Infektion, der Art der Infektion und den individuellen Eigenschaften
der zu behandelnden Tierart ab.
Beispiel 13: Kapseln.
Antibiotikum W847 Komplex 250,00 mg
Lactose 2*t8,75 mg
Magnesiumstearat ' 1,25 mg
500,00 mg
Herstellung:
1. Man mischt den Antibiotikum ¥8^7 Komplex und die Lactose,
2. Man setzt das Magnesiumstearat zu und mischt.
3. Man füllt die Kapseln.
Beispiel lh: Oralsuspension:
-5t-
1Q9842/0495
25,0 | g | • | β |
9,5 | g | • | £ |
2,5 | g | g | |
25,0 | g | g | |
q.s | ■1 | ||
q.s | |||
0,9 | |||
0,2 | |||
i#o | |||
500,0 | |||
1000,0 |
Antibiotikum W8^7A
Magnesium-Aluminium-Silikat Natriumcarboxymethylzellulose, USP
Natriumcitrat, USP Geschmackstoff
Farbstoff
Methylparaben, USP
Propylparaben, USP Polysorbat 80, USP Sorbitlösung, USP
Wasser q.s.
Herstellung:
1. Man erhitzt 200 ml Wasser zum Sieden und löst in diesem eine Hälfte des Parabens. Man kühlt auf etwa 700C ab und
vermischt mit dem Polysorbat 80. Man gießt in das Silikat und rührt bis eine gleichmäßig glatte Suspension entstanden
ist, welche die Vormischung 1 darstellt.
2. Man erhitzt zusätzlich 200 ml Wasser zum Sieden und löst in diesem das verbliebene Paraben. Man dispergiert die
Carboxymethylzellulose mit diesem bis ein glattes Gel entsteht. Man vermischt mit der Sorbitlösung und löst dann
das Natriumcitratj wodurch man die Vormischung 2 erhält.
3. Man fügt die Vormischung 2 langsam der Vormischung 1 unter konstantem Rühren zu. Die sich ergebende Mischung wird auf
25°C gekühlt. Man setzt das Antibiotikum We^Ajden Geschmackstoff
und den Farbstoff zu und mischt durch. Man fugt eine
109842/0495
ausreichende Menge an Wasser zu,um ein Gesamtvolumen
von 1000 ml zu erhalten.
Beispiel 15: Creme äußerlich:
Antibiotikum W847B 10 g
Stearinsäure 200 g
Sorbitanmonostearat 104 g
Sorbitanraonooleat 20 g
Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat 56 g
Wasser q.s. 1000 g
Herstellung:
1. Die Stearinsäure, das Sorbitanmonostearat, Sorbitanmonooleat
und Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat werden auf 650C erhitzt, wodurch man eine Vormischung 1 erhält.
2. Man erhitzt etwa 90$ des erforderlichen Wassers auf 7O0C
und fügt es dann der Vormischung 1 zu und mischt zur Bildung der Cremegrundlage.
3. Das Antibiotikum W847B wird mit etwa 10% des Wassers aufgeschlämmt,
durch eine Kolloidmühle hindurchgeflihrt und dann die gemahlene Aufschlämmung der geschmolzenen Cremgrundlage
zugesetzt, durchgemischt und abkühlen gelassen.
Beispiel l6: Salbe äußerlich:
- 5f-
1Ü9842/0495
Antibiotikum Petrolatum
Herstellung:
1. Man schmilzt das Petrolatum.
2. Man schlämmt das Antibiotikum W847C. mit etwa 10% des
Petrolatums auf und führt durch eine Kolloidmühle hindurch.
3. Man mischt die gemahlene Aufschlämmung mit dem verbliebenen
des geschmolzenen Petrolatums und läßt abkühlen.
Beispiel 17: Losung für parenterale Verabreichung:
Antibiotikum W847A Tartrat 250 mg/Phiole
Zitronensäure ~1 di η η *** mg/Phiole
Dinatriumphosphat J Puffer ' mg/Phiole
Steriles destilliertes Wasser . 5,0 mg/Phiole
Herstellung:
1. Man mischt das sterile Antibiotikum W8^7A-Tartrat mit
sterilem Citrat/Phosphat-Puffer aseptisch.
2. Man füllt in sterile Phiolen.
3. Man setzt Wasser zu und schüttelt gut unmittelbar vor Gebrauch.
1139842/04
Beispiel 18: Suspension für parenterale Verabreichung:
Antibiotikum W8W2 250 mg/Phiole
Natriumcarboxymethylzellulose 3 mg/Phiole
Polysorbat 80, USP 1 mg/Phiole
Methylparaben 3,6 mg/Phiole
Propylparaben 0,k mg/Phiole
Wasser q.s. 2,0 ml/Phiole
Herstellung:
1. Man stellt aus den oben angegebenen Mengen an Natriumcarboxymethylzellulose,
Polysorbat 80, Methylparaben und Propylparaben eine Lösung her und autoclavisiert die Lösung
.
2. Man schlämmt steriles Antibiotikum We^-Cg aseptisch mit
einem Teil des obigen Trägers auf und führt durch eine Kolloidmühle.
3. Man mischt die gemahlene Aufschlämmung mit dem verbliebenen
Träger.
k. Man füllt in sterile Phiolen.
Unter Bezugnahme auf die obigen Beispiele 13 bis 18 wird bemerkt,
daß die antibiotischen Bestandteile durch einen anderen antibiotischen Komplex, eine andere antibiotische Fraktion
oder Mischung von antibiotischen Fraktionen gemäß der Erfindung in freier Form oder in Form von Derivaten, wie Estern
- 64 -
109842/0495
oder Salzen, ersetzt werden kann, ausgenommen, daß parenterale
Lösungen, wie in Beispiel 17» gewünschtenfalls den antibiotischen
Komplex, Fraktion oder Mischung von Fraktionen in Form eines Säureadditionssalzes enthalten.
109842/0498
Claims (45)
1. Verfahren zur Herstellung von Antibiotika, die zu einem
als W847 Komplex bezeichneten Antibiotikum—Komplex gehören,
dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus der Art Micromonospora sp. W847 bebrütet wirdjbis zumindest
eine Verbindung mit wesentlicher antibiotischer Aktivität gebildet wurde.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus in einem wässerigen Nährmedium unter
aeroben Bedingungen bebrütet wird,
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bebrütung unter submersen aeroben Bedingungen durchgeführt
wird.
k. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet,
daß als Mikroorganismus Micromonospora sp. ¥847 (NRRL 3274) oder eine W847-Komplex-bildende Mutante
oder Variante davon eingesetzt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß als Mikroorganismus Micromonospora sp. W847 (NRRL 3275) oder eine W847-Komplex-bildende Mutante
oder Variante davon eingesetzt wird.
- 631,-
109842/0495
6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet,
daß der Mikroorganismus bei einer Temperatur von etwa 22 400C,vorzugsweise
28 - 37°C, und einem pH-Wert von etwa 7,0 - 8,5, vorzugsweise von 7,2 - 8,2, bebrütet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch ge-
* kennzeichnet, daß ein antibiotisches, aktives Produkt (Antibiotikum), das zumindest eine antibiotische, aktive
Verbindung enthält, gewonnen wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das
Antibiotikum in freier Form gewonnen wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibiotikum in Form eines funktioneilen Derivates gewonnen
wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat ein Ester ist.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat ein Salz ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das
Salz ein Säureadditionssalz ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet,
daß zur Gewinnung des Antibiotikum W8^7
Komplexes oder einer Fraktion oder Fraktionen davon die Brühe alkalisch gemacht und mit einem mit Wasser nicht
109842/0495
mischbaren Lösungsmittel extrahiert wird und aus dem Extrakt der Antibiotikum ¥847 Komplex oder eine Fraktion oder Fraktionen
davon isoliert werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet,
daß das zuerst erhaltene antibiotische, aktive Produkt in Fraktionen zerlegt und zumindest eine solche
Fraktion isoliert wird.
13. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die isolierte Fraktion Antibiotikum W847 Fraktion A ist.
16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die
isolierte Fraktion Antibiotikum W847 Fraktion B ist.
17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die isolierte Fraktion Antibiotikum W847 Fraktion C. ist.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die
isolierte Fraktion Antibiotikum W847 Fraktion C„ ist.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zerlegung durch Verfahren erreicht wird, die die chromatographische Trennung umfassen.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zerlegung durch Verfahren erreicht wird, die die Lösungsmittelextraktion umfassen.
109842/0495
21. Verfahren zur Herstellung von Antibiotika, die zu den als ¥847 Komplex bezeichneten Antibiotikum-Komplex gehören,
wie es im wesentlichen beschrieben wurde, insbe-» sondere in den Beispielen 1 bis 12.
22. Antibiotisch wirksames Produkt, welches eine nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis. 21 erhältliche
antibiotisch wirksame Verbindung, Fraktion oder Komplex ist oder enthält oder in einer solchen enthalten ist.
23* Antibiotikum-Komplex der als Antibiotikum W847 Komplex
bezeichnet ist und alle Fraktionen, welche durch Zerlegung desselben erhalten werden<
24. Antibiotikum ¥847 Fraktion A.
25. Antibiotikum ¥847 Fraktion B.
26. Antibiotikum ¥847 Fraktion C1.
27. Antibiotikum ¥847 Fraktion C„.
28. Mischung der Antibiotikum ¥847 Fraktionen C1 und C2, die
als Antibiotikum ¥847-C Komplex bezeichnet wird.
29. Salze und Ester der antibiotisch wirksamen Produkte nach den Ansprüchen 23 bis 28.
30. Hydrochloride der Produkte gemäß den Ansprüchen 23 bis
109842/0495
XtS
31. Tartrate der Produkte gemäß den Ansprüchen 23 bis 28.
32. Antibiotikum W8^7-C2-Hydrochlorid.
33. Antibiotikum W847-A-Hydroehlorid.
3^.
Antibiotikum ¥847-A-Tartrat.
35. Antibiotisch wirksames Produkt, welches in seiner chemischen Struktur mit einem, durch das Verfahren gemäß einem
der Ansprüche 1 bis 21 erhaltenen Produkt oder mit einer, in einem so erhaltenen Produkt enthaltenen antibiotisch
wirksamen Verbindung oder Fraktion identisch ist oder ein identisches antibiotisch wirksames Produkt, Verbindung
oder Fraktion enthält.
36. Verfahren zur Herstellung einer antibiotisch wirksamen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest
eine Fraktion des Antibiotikum W847 Komplexes in freier
Form.oder in Form eines Derivates,insbesondere eines Esters
oder Salzes, in eine für die therapeutische Verabreichung geeignete Form gebracht wird.
37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger
vermischt wird.
38. Antibiotisch wirksame Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet,
daß sie zumindest eine Fraktion des Antibiotikum W847 Komplexes in freier Form oder in Form eines
Derivates, insbesondere eines Esters oder Salzes, enthält.
109842/Q495 _ U-
39. Zusammensetzung nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet,
daß sie einen geeigneten, pharmazeutischen Träger
enthält.
40. Zusammensetzung gemäß Anspruch 39 wie sie im wesentlichen
beschrieben wurde, insbesondere in den Beispielen 13 bis 18.
41. Geformte Zusammensetzung der Stoffe,wie z.B. Tabletten
oder Kapseln, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest eine Fraktion des Antibiotikum ¥847 Komplexes in freier
Form oder in Form eines Derivates, insbesondere eines Esters oder Salzes,enthält.
42. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 38 bis 41,
dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion die Antibioti kum ¥847 Fraktion A ist.
43. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 38 bis 41,
dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion die Antibio tikum ¥847 Fraktion B ist.
44. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 38 bis 41,
dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion die Antibio tikum ¥847 Fraktion C1 ist.
45. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 38 bis 41, dadurch
gekennzeichnet, daß die Fraktion die Antibiotikum ¥847 Fraktion C2 ist.
109842/0495
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