DE1767565A1 - Neue Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung,Isolierung und Reinigung - Google Patents

Description

Angemeldet am (A ){beanspruchte Priorität:

Anspruch vom 26.Mai I967 (Ser.Nr. 641 522)

Anspruch vom 21.Peber I968 (Ser.Nr. 707 lOO)

(Anmeldungen in den Vereinigten Staaten von Amerika).

Beginn der Patentdauer:

Die Erfindung betrifft einen neuen Komplex von Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung, Isolierung und Reinigung.

Insbesondere betrifft die Erfindung neue und nützliche Antibiotika, die durch Züchtung einer bisher nicht beschriebenen Art (Species) der Gattung Micromonospora der Ordnung Actinomycetales erhalten werden.

Die bisher nicht beschriebenen Species der Gattung Micromonospora, welche bei der ersten Herstellung des neuen Komplexes von Antibiotika gemäß der Erfindung verwendet wurden, wurden ursprünglich aus einer direkt aus der Erde genommenen Bodenprobe isoliert und als Micromonospora sp.W847 bezeichnet. Zwei Stämme dieser Microraonospora Art wurden isoliert und als besonders brauchbar für das Verfahren gemäß der Erfindung gefunden. Diese zwei Stämme sind natürliche Farbvarianten und

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können mikroskopisch durch den Grad der auftretenden Sporenbildung unterschieden werden. Kulturen der lebenden Organismen dieser zwei Stämme wurden in der KuItürenSammlung des Landwirtschaftsministeriums (Department of Agriculture) der Vereinigten Staaten von Amerika, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, hinterlegt, wo sie mit den Nummern NRRL 3274 und NRRL 3275 bezeichnet wurden. Diese Stämme sind von der Sammlungsstelle auf Verlangen erhältlich. Diese Stämme werden im folgenden einzeln als Micromonospora sp. W847 (NRRL 327*0 und als Micromonospora sp. W847 (NRRL 3275) und zusammen als Micromonospora sp. W847 bezeichnet. Venn in der folgenden Beschreibung auf Nicromonospora sp. W847 ohne Angabe der Stammnummer Bezug genommen wird, so betreffen die Ausführungen beide vorgenannten Stämme.

Die male ro skopi sehe Untersuchung von 28 Tagen alten Kulturen (24 - 26⁰C) von Micromonospora sp. W847 (NRRL 3274) auf Czapek¹s Sucrose Agar zeigt gutes Wachstum ohne Luftmycel und erhöhte und faltige Kolonien mit einer weichen, feuchten und nicht wachsartigen Konsistenz, die nicht diffusierbares Pigment erzeugen. Die Farbe der Kolonieoberfläche ist gemäß den "Descriptive Color Name Dictionary" von Taylor, Knoche und Granville, herausgegeben durch die Container Corporation of America, 1950, (USA), in Verbindung mit einer diesem Namen entsprechenden Nummer, welche dem "Color Harmony Manual", k. Auflage (1958),herausgegeben ebenfalls von der Container

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Corporation of America, entnommen ist, orange m4-ia. Diese Farbe entspricht dem Synonym oder nahezu Synonym von kräftigem Orange 50 gemäß National Bureau of Standards Circular Nr. 553 vom 1.November 1955, USA (alle im folgenden verwendeten Bezeichnungen für Koloniefarben beruhen auf demselben Farbbezugsystem).

Die mikroskopische Untersuchung derselben Kultur zeigt ein regelmäßiges Mycel, das aus langen verzweigten Fäden mit etwa 0,6 u im Durchmesser zusammengesetzt ist. Sporen werden selten gefunden.

Die makroskopische Untersuchung von 28 Tage alten Kulturen von Micromonospora sp. W847 (NRRL 3275), gewachsen auf demselben Medium und unter denselben Bedingungen wie oben beschrieben, zeigt gutes Wachstum mit den gleichen Hauptcharakteristiken der Kolonien wie der vorhergehend genannte Stamm mit Ausnahme der Farbe. Die Farbe der Kolonieoberfläche ist Schwarz. Mikroskopisch zeigt diese Kultur ein regelmäßiges Mycel, das aus langen verzweigten Fäden mit einem ungefähren Durchmesser von 0,6 u zusammengesetzt ist. In diesem Stamm sind jedoch die Sporen sehr reichlich und unregelmäßig im Mycel erzeugt. Diese Sporen sind ei- bis kugelförmig mit einem Durchmesser von 0,7 - l»0 η und sind nach Reifung dunkelbraun.

Die Kolonien von Micromonospora sp_t ¥847 können ferner durch

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ihre Wachstumscharakteristika unter aeroben Bedingungen auf verschiedenen Nährmedien charakterisiert werden. Tabelle 1 zeigt die Wachstumscharakteristika von Micromonospora sp. W847 auf einigen der umfassender verwendeten Nährmedien. Die Koloniebeobachtungen wurden an Ik Tagen alten Kulturen (24 26⁰C), außer es ist anders angegeben, angestellt.

Tabelle

Koloniecharakterxstika von Micromonospora sp. W847 auf ververschiedenen Medien

Glucose-Asparagin Agar	Wachstum spärlich
Bennett's Agar	Wachstum spärlich
Emerson's Agar	Wachstum spärlich
Tomatenmark-Hafermehl- Agar	Wachstum spärlich
Glucose-Hefeextrakt- Agar	Wachstum gut, erhöht, fein faltig
Kartoffel scheiben	Wachstum spärlich
Sucrose Nitrat Agar (Czapek's Agar)	Wachstum gut, erhöht, faltig
Tyrosin Agar Beobachtungen nach 2, 7 und lh Tagen (Gordon and Smith, J.Bact. 69,147) 109842/0495	Wachstum mittelmäßig,Kri stalle spärlich gelöst di rekt unter der Kolonie, braunes diffusionsfähiges Pigment nach 3 Wochen er zeugt ,diffusionsfähiges Pigment nicht schwarz oder typisch für ein Tyrosinpo- eitiν wie durch Strepto- myces erzeugt

ORiQlNAL INSPECTED

Micromonospora sp, W847 zeigt besonders gutes Wachstum bei Temperaturen zwischen 26 und 37°C,aber kein wesentliches Wachstum bei Temperaturen in der Höhe von 50⁰C. Sie sind aerob und reduzieren Nitrat nicht zu Nitrit. Diese Species verflüssigen Gelatine nicht; hydrolisieren Milch nicht und zersetzen Zellulose nicht. Auf Pepton-Eisen-Agar wird kein diffusionsfähiges Pigment erzeugt.

Micromonospora sp. W 847 zeigt gutes Wachstum auf Kohlehydratmedien enthaltend 0,5% Hefeextraktbase und 1% an 1-Arabinose, Glucose, Stärke und Sucrose, aber nur mittelmäßiges Wachstum,wenn die Kohlehydratquelle 1% Xylose ist. Sie zeigen spärliches Wachstum auf solchen Medien, in welchen die einzigen Kohlehydratquelle 1% d-Arabinose, Zellulose, Dulcit, Galactose, Glyzerin, Lactose, Laevulose, Melibiose, Melizitose, Raffinose, Rhamnose, Ribose, Inosit oder Mannit ist.

Eine weitere Charakteristik von Micromonospora sp. W847 sind ihre Fähigkeit sich Stickstoffquellen nutzbar zu machen. Die Wachstumscharakteristika von Kolonien auf typischen Stickstoffquellen mit 1% Glucose, beobachtet nach Ik Tagen (24 - 26⁰C) Wachstum, sind in der Tabelle 2 angegeben.

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Tabelle

Nutzbarmachung von Stickstoffquell en

Stickstoffquelle	Wachstumscharakteristika
0,5% Difco Hefeextrakt	Wachstum gut, erhöht, fein faltig
1,0% NZ Amin Type A*	Wachstum mittelmäßig
Yfo Asparagin	Wachstum spärlich
1% Glutaminsäure	Wachstum spärlich
1% Ammoniumnitrat	Wachstum spärlich

♦Erzeugnis der Sheffield Chemical Company, Norwich, New York

Der im folgenden beschriebene neue antibiotische Komplex kann hergestellt werden durch Verwendung von Micromonospora sp. W847 var. NRRL 3274 und/oder var. NRRL 3275 und/oder anderer Stämme der genannten Species (einschließlich Mutanten und Varianten davon) welche im wesentlichen dieselbe biologische Aktivität haben, indem sie Antibiotika desselben Komplexes erzeugen. Die vorliegende Erfindung ist daher nicht so beschränkt, daß sie die Verwendung von Varianten von Micromonospora sp. W847 oder Mutanten,die aus diesem Organismus durch mutierende Mittel, wie z.B. Hochfrequenzbestrahlung einschließlich Röntgenstrahlen und Ultraviolettlicht, Actinophagen und

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Stickstoff-Lost erhalten werden, ausschließt. In der folgenden Beschreibung des Verfahrens zur Herstellung des Antibiotikums ist die Verwendung des Ausdruckes Micromonospora sp. W847 so zu verstehen, daß sie die oben beschriebenen spezifischen Farbvarianten sowie alle anderen vollständig äuqivalenten Varianten und Mutanten dieses Species einschließt.

1. Herstellung des Antibiotikums W847 Komplexes

Micromonospora sp. W8A7 erzeugt, insbesondere durch im folgenden beschriebene gesteuerte Fermentationsverfahren, eine Komplexmischung von antibiotischen Substanzen, die im folgenden als der Antibiotikum ¥847 Komplex bezeichnet wird.

Zur Herstellung eines geeigneten Inoculum für die nachfolgende Fermentation wird Micromonospora sp. W847 vorzugsweise unter submersen aeroben Bedingungen und kontinuierlichem Rühren bei Temperaturen im Bereich von etwa 22 bis etwa 57°G für eine Zeitspanne von etwa 2 bis etwa k Tagen wachsen gelassen. Im allgemeinen wurde gefunden, daß eine Temperatur von 55 C über eine Zeitspanne von 3 Tagen am meisten befriedigt.Das in dieser ersten Keimungsstufe normalerweise verwendete Medium ist wässerig und enthält Mengen an Kohlenstoff- und Stickstoffquell en ι die durch den Organismus assimilierbar sind. Die Alkalinität des gewünschten Mediums wird vor dem Auto kl avisieren durch Zusatz von Base, z.B. Katrium-

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hydroxyd, auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt.

Beispiele für in der Keimungsstufe verwendeten Medien sind folgende: Medium I: Bacto-Rindfleischextrakt (Difco), 3,0 g; Bacto-Trypton (Difco), 5,0 g; Dextrose, 1,0 g; Stärke (Kartoffel), 24,0 g; Bacto-Hefeextrakt (Difco), 5,0 g; CaCO-, 2,0 g; Leitungswasser, 1000 ml; Medium II: Bacto-Hefeextrakt (Difco), 5,0 g; Fischsäfte, 1,0 g; Getreidequellwasser, 1,0 g; Dextrose, 20,0 g; CaCO,, 1,0g; Leitungswasser, 1000 ml.

Gewünschtenfalls wird vor der Fermentation und Gewinnung des Antibiotikums eine zweite Keimungsstufe (z.B. Inoculumsstufe) angewendet, um das Inoculum anzureichern. Unter Verwendung der oben beschriebenen Medien kann ein frisches Medium mit der vorher hergestellten gekeimten Kultur (5%ig Gewicht/Volumen) beimpft und bei etwa 22 bis etwa 37°C für etwa 2 bis etwa k Tage bebrütet werden. Es wurde gefunden, daß gewöhnlich eine Temperatur von 28⁰C über eine Zeitspanne von 3 Tagen am meisten befriedigt.

Um den Antibiotikum W8^7 Komplex herzustellen, kann ein 5%iges (Gewicht/Volumen) Inoculum aus der Inoculumstufe zum wässerigen Fermentationsmedium zugesetzt werden, das vor dem Autoklavisieren auf einen pH-Wert von 7,1 bis 7,8 eingestellt wurde. Luft, gewöhnlich etwa 3 bis etwa 6 l/min, wird in die Fermentation eingeführt, welche im allgemeinen

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bei einer Temperatur zwischen etwa 22 und etwa 37°C über eine Zeitspanne von etwa 2 bis etwa 6 Tage unter kontinuierlichem Rühren durchgeführt wird. Insbesondere mit dem unten beschriebenen Medium III wurde gefunden, daß maximale Ausbeuten an Antibiotikum W847 Komplex erhalten wurden durch eine Fermentation von 66 h bei 31°C unter Einleitung von Luft mit einer Geschwindigkeit von 4,5 l/min und unter Rühren mit einem Rührer,der 250 Umdr/min macht_? Unter Verwendung von 14 1 Fermentern, die 10 1 an Medium enthalten, wurden unter diesen Bedingungen Ausbeuten im Bereich von 300 bis 800 /ug/ml erhalten.

Zweckmäßige Medien in der Fermentationsstufe umfassen z.B. folgende: Medium III: Sucrose, 30,0 g; Dextrose, 2,5 g; Trypticase, 17,0 g; NaNO₃, 3,0 g; K₂HPO₄, 3,5g; MgSO₄.7H₂O, 0,5 g; KCl, 0,5 g; FeSO₄, 0,01 g; NaCl, 5,0 g; Leitungswasser, 1000 ml; Medium IV: Bacto-Hefeextrakt (Difco), 5,0 g; Dextrose, 10,0 g; Stärke, 20,0 g; Caseinhydrolysat, 5,0 g; Ca C0_, 4,0 g; Leitungswasser, 1000 ml; Medium V: Sucrose, 20,0 g; Pepton, 5,0 g; Baumwollsamenproteinhydrolysat, 5,0 g; CaCO.-, 4,0 g; Leitungswasser, 1000 ml; Medium VI: Sucrose, 30,0 g; Pepton, 8,0 g; NaNO₃, 3,0 g; K₂HPO₄, 1,0 g; MgSO₄.7H₂O, 0,5 g; FeSO., 0,01 g; Leitungswasser, 1000 ml; Medium VII: Trypticase, 17 g; NaCl, 5,0 g; K₂IIPO₄, 2,5 g; Dextrose, 2,5 g; Czapek-Dox-Brühe, 35,0 g; Leitungswasser, q.s. 1000 ml.

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Zur Gewinnung des Antibiotikum ¥8^7 Komplexes aus dem Ferraentationsmedium kann einmal z.B. wie folgt verfahren werden: Die ganze Brühe wird mit Base,z.B. Natriurahydroxyd, auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt. Die ganze Brühe wird dann mit etwa 2 Vol.-Teilen/Vol.-Teil der Brühe eines geeigneten mit Wasser nicht- mischbaren organischen Lösungsmittel, z.B. Äthylacetat, Methylendichlorid, Butylacetat, Chloroform, Butanol u.dgl., extrahiert. Die Lösungsmittelphase wird anschließend unter Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert, ungefähr auf die lOOfache Konzentration, und durch Säulenchromatographie gereinigt, wozu z.B. LH 20 Sephadex, ein alkyliertes vernetztes Dextran (Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Uppsala, Sweden), suspendiert in etwa 95%igem, wässerigem Äthanol verwendet wird. Die Säule wird mit dem wässerigen Äthanol eluiert. Die Säulenfraktionen werden gemäß ihrer antibakteriellen Wirksamkeiten.wie sie durch Agarscheibentest gegen Staphylococcus aureus (ATCC 6538P) festgestellt werden, vereinigt, zur Trockene konzentriert, in einer kleinen Menge von Äthyläther oder Aceton gelöst und zu einem überschüssigen Volumen an Petroleumäther (Siedepunkt etwa 30 bis etwa 60°C) zugesetzt. Die Mischung wird dann in ein Trockeneis/Acetonbad (ungefähr -50⁰C) übergeführt und für etwa 20 min stehengelassen, wonach die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen gelassen wird. Die Mutterlauge wird von irgendwelchen öligen Rückständen durch Dekantation abgetrennt und zur Trockene

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konzentriert. Es wurde gefunden, daß das auf diese Weise hergestellte Material gewöhnlich eine Stärke von etwa 232 ug/ing gemäß der unten beschriebenen Bio-Probe hat.

Die Probe ist eine Zylinderschalenprobe unter Verwendung von Sarcina lutea (ATCC 934i) als Testorganismus. Die Bedingungen der Probe sind ähnlich denen der Zylinderplattenprobe für Erythromycin (Grove and Randall, 1955» Med. Encyclopedia, Inc., N.Y.). Ein ug an Antibiotikum W847 Komplex-Aktivität ist die Menge des Materials, die eine zonenförmige Wirkung von 20,8 - 0,5 mm unter den Bedingungen dieser Probe erzeugt.

Alternativ kann der Antibiotikum W847 Komplex z.B. durch Anwendung der folgenden Fermentations- und Isolierungsverfahren hergestellt werden:

Unter Verwendung von Medium I zur Herstellung eines Inoculums werden Fermentationskolben, die dieses Medium enthalten, mit einer Kultur (ungefähr 55» Gewicht/Volumen) von Micromonospora sp. V8^7 beimpft. Diese Kolben werden auf einen Drehrüttler gegeben, der etwa 280 Umdr/min macht, und bei 28⁰C für 72 h bebrütet. Am Ende dieser Zeit werden Fermenter, die mit Fermentationsmedium (z.B. Medium VIl), das auf einen pH-Wert von 7,15 bis 7,25 eingestellt ist, mit ungefähr 5$ (Volumen/Volumen) der 72 h Inoculumkultur beimpft. Das Fermentationsmedium wird mit einer Geschwin-

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digkeit von etwa 500 Umdr/min bei einer Temperatur von 31 C gerührt. Ein Luftstrom wird durch das Medium mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,5 1 Luft/l der Brühe/min hindurchgeführt. Die Rührgeschwindigkeit kann nach 2k h auf 600 Umdr/min und nach 48 h auf 700 Umdr/min gesteigert werden. Die Fermentation ist am Ende von etwa 69 h beendet. Die Brühe aus allen Fermentern wird für die unten beschriebene Extraktion und Gewinnung des Antibiotikum W847 Komplexes gesammelt.

Die gesammelte Fermentationsbrühe wird auf einen pH-Wert von etwa 9,25 mit wässerigem Natriumhydroxyd (50$) ein-

gestellt und mit etwa 2 Volumen Äthylacetat extrahiert und die Extrakte werden auf etwa 1-2% des ursprünglichen Volumens konzentriert. Das Äthylacetatkonzentrat wird dann zumindest zweimal mit dem halben Volumen an Chlorwasserstoff säure (etwa 0,14 n) extrahiert. Alternativ kann die Säureextraktion auch mit anderen Mineral säuren etwa derselben Normalität durchgeführt werden. Die vereinigten Säureextrakte werden mit 5%igem wässerigen Natriumhydroxyd schwach alkalisch gemacht (auf einen pH-Wert von etwa 8,5 bis 9,0) und zumindest zweimal mit etwa dem gleichen Volumen an Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Äthylacetatextrakte werden unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert,um den Antibiotikum W847 Komplex zu erhalten. Der Komplex dieser Stufe zeigt eine Stärke von 450 - 550 ug/iag in der oben beschriebenen Probe.

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2. Charakterisierung des Antibiotikum W847 Komplexes

Der Antibiotikum ¥847 Komplex wurde durch Papierchromatographie mit einer Vielzahl von Antibiotika einschließlich verschiedenen Macroliden verglichen. In einer Serie von Lösungsmittelsystemen, \\rie in Tabelle gezeigt, bewegt sich der Antibiotikum W847 Komplex als ein einziger Fleck und ist unterschieden von allen anderen getesteten Antibiotika, ausgenommen den Macroliden (z.B. Magnamycin, Oleandomycin, Spiramycin und Erythromycin).

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Die Differenzierung des Antibiotikum W847 Komplexes von diesen bedeutenden Macrolideantibiotika erfolgte durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagel-GF-Platten (Analtech Inc., Wilmington, Delaware). Die Zonen wurden durch die folgenden zwei Methoden untersucht:

1. Die Platten wurden mit einer Mischung aus konzentrierter Schwefelsäure und Methanol (l : 1 Volumen/Volumen)

besprüht und durch einige Minuten langes Erhitzen auf 105⁰C entwickelt. Die Zonen des organischen Materials erscheinen als gefärbte Flächen gegen einen weißen Hintergrund.

2. Die Platten werden mit einer Agarschicht, die mit S. aureus besät ist, in Kontakt gehalten. Eine Schicht von Whatman Nr. i Papier wird zwischen der besäten Agarschicht und der Platte vorgesehen·um sicherzustellen, daß das Silicagel nicht an dem Agar haftet. Das Papier und das Silicagel werden nach 15 min entfernt. Die Agarplatte wird bei 37°C über Nacht bebrütet und die Inhibitionszonen beurteilt.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle k gezeigt.

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Tabelle

Vergleichende Dünnschichtchromatographie des Antibiotikum W847 Komplexes

System	Antibiotikum	R- und Farbe durch HgSOj1 Besprühung	R- der InhiBition- Zone
Chloroform:Methanol: 17%ig Ammoniak 2:1:1 (Volum en /Volumen)	Antibiotikum W847 Komplex Oleandomycin Erythromycin Magnamycin	blau schwarz 0,98 grün 0,98 gelbbraun 0,98 blaupurpurn 0,98	0,98 0,98 0,98 0,98
Butanol!Essigsäure: Vaster 3:1:1 (Volumen/Volumen)	Antibiotikum Komplex Erythromycin Spiramycin Oleandomycin Magnamycin	rotpurpurn 0,13 grUnbraun 0,26 purpurn;grau O,O6;O,3O grün 0,19 purpurn; O,40;O,47 rotpurpurn	0,13 0,26 0,06 0,19 0,40

Ferner durch Vergleich der hier beschriebenen physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften des Antibiotikum ¥847 Komplexes und seiner abgetrennten Fraktionen mit den Eigenschaften der bekannten, in der Literatur beschriebenen Macroliden ist der Antibiotikum ¥847 Komplex und seine Bestandteile von allen bekannten Macrolidenantibiotika unterscheidbar.

Antibiotikum ¥847 Komplex gibt eine positive Farbreaktion in den Ninhydrin-, Stärke-KI- und Biuret-Testsund eine negative Farbreaktion in den Stannochlorid-, Molisch- und ™ Sakaguchi-Tests.Oer Komplex ist wesentlich transparenter in dem Ultraviolettbereich. Die Wirksamkeit des Antibiotikum ¥847 Komplexes ändert sich nicht bedeutend, wenn eine Lösung davon einer Temperatur von 100 C für 30 min über den pH-Bereich von 2-10 unterworfen wird (die Stabilität wird geprüft durch Lösung des Antibiotikums in Äthanolverdünnung mit Puffer und Scheibentest gegen S. aureus und Escherichia coil). Der Komplex zeigt keinen Verlust an Wirksamkeit nach Behandlung mit Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, CH»-Amylase oder M Penicillinase in gepufferten Lösungen (wahlweiser pH-Wert für jedes Enzym) bei 37°C, wobei die Einwirkzeit bis zu 24 h betragen kann. Der Antibiotikum ¥847 Komplex ist in den meisten polaren organischen Lösungsmittel, wie z.B. Äthylacetat, Methanol, Äthanol und Aceton,löslich.

3. Trennung der Antibiotikum ¥847 Bestandteile

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Die Bioautographie von Dünnschicht - Silioagel-Platten auf mit Sarcina lutea besätem Agar und anschließender Chromatographie in einem Lösungsmittelsystem,bestehend aus Chloroform und Methanol (60:40 VoIumen/Volumen) zeigt, daß der Antibiotikum W847 Komplex zumindest aus 4 Antibiotikumkomponenten besteht, welche im folgenden als Antibiotikum W847 Fraktionen A₁ B, C. und C„ (oder als Antibiotikum W847-A, Antibiotikum W847-B, Antibiotikum ¥847-C₁ und Antibiotikum W847-C₂) bezeichnet werden. Diese Fraktionen zeigen in dem oben beschriebenen Lösungsmittelsystem R- Werte von 0,19 (Fraktion A), 0,38 (Fraktion B), 0,52 (Fraktion C₁) und 0,65 (Fraktion C₂).

Die Trennung der Fraktionen kann durch Lösung des Antibiotikum W847 Komplexes in mit Kieselsäure gemischten Aceton, Verdampfung des Acetone und Aufbringung der trockenen Mischung auf den Anfang einer Kieselsäuresäule zustandegebracht werden. Die Säule wird mit Chloroform:Methanol (60:40 Volumen/ Volumen) eluiert und die Fraktionen werden gesammelt. Die Säule wird durch Scheibentest jeder Fraktion gegen S. aureus und E. coli überwacht. Die aktiven Fraktionen werden auf Silicagel-Dünnschichtplatten in denselben für die Säule verwendeten Lösungsmittelsystem für etwa 1,5 h Chromatograph!ert. Die Muster der Antibiotikumfraktionen werden durch die zwei vorher beschriebenen Nethoden untersucht. Die Fraktionen werden gemäß ihren Chromatographisehen Mustern gesammelt und konzentriert.

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Durch diese Methode wird die Fraktion C„ als ein Hydrochloridsal ζ abgetrennt und als weißes Pulver durch Lösung der gesammelten aktiven Fraktionen in Methanol und Ausfällen ait etwa 10 Volumen an Äthyläther isoliert« Das Fraktion-Cg-Bydroehlorid dieser Stufe zeigt eine Stärke von etwa1100 ng/mg.

Während der Chromatographie wird die we^-Cg-Base durch Reaktion ext einer geringen Menge an Hydrochiοrid, das in dem Lösungsmittel vorhanden ist, zu einem Hydrochloridsalζ umgesetzt. Das Hydrochlorid zeigt, wie anzunehmen war, keine merkbare Löslichkeit in Äthyläther und ist daher durch Zusatz desselben aasfällbar.

Die freie Base von W847-C₂ kann durch Zusatz verdünnter Alkali; wie 0,1 η NaOH₁Zu einer wässerigen Lösung des Hydrochloride bis zu einem pH-Wert von etwa 8,5 - 9»5 und Abtrennung der freien Base durch Filtration von der wässerigen Suspension erhalten werden.

Die späteren,von der oben beschriebenen Säule gesammelten Fraktionen liefern, wenn sie gesammelt und konzentriert werden, ein weißes Pulver,die Antibiotikum We^-Cj-Fraktion. Das erhaltene Antibiotikum W847-C ^Pulver dieser Stufe zeigt eine Stärke von etwa 880 ug/mg gemäß der vorher beschriebenen Zylinderschalenprobe.

Bei Anwendung der vorher beschriebenen bioautographisehen

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Verfahren und Chloroform und Methanol (60:40 Volumen/Volumen) als Lösungsmittelsystem zeigt das isolierte Antibiotikum Ve^-C₁ ein breites Spektrum antibakterieller Wirksamkeit in vitro gegen die folgenden grampositiven und gramnegativen Organismen:

Bacillus subtilis ATCC 6633 Sarcina lutea ATCC 9341 Staphylococcus aureus ATCC 6538P Pseudomonas aeruginosa ATCC 8689

Die verbleibenden wirksamen Fraktionen von der Kieselsäuresäule können vereinigt und weitere Ergebnisse durch Florisil (Nagnesiumsilikat)Säulenchromatographie wie folgt erhalten werden: Die Säule wird durch Aktivierung des Florisils bei 100⁰C für 16 h, Fixierung in Hexan und Gießen der erhaltenen Aufschlämmung in eine Glassäule hergestellt. Die Säule wird mit dem restlichen Antibiotikum ¥847 Komplex (nach Abtrennung der Fraktionen C₁ und Cp), gelöst in Methylenchlorid, beschickt und fortschreitend mit einem dem Aufnahmevolumen des Absorbtionsmittels entsprechenden Volumen (im folgenden Aufnahmevolumen genannt) Hexan, einem Aufnahmevolumen Äthyläther, einem Aufnahmevolumen Äthylacetat und dann in zunehmenden Mengen mit Aceton in Äthylacetat entwickelt. Die Abtrennung wird durch Scheibentest der Fraktionen gegen S. aureus und E.coli und DünnschichtChromatographie, wie vorher beschrieben, überwacht.

109842/0495 " ²¹ "

Bei Anwendung dieses Verfahrens kann die Abtrennung der Fraktion A und der Fraktion B ausgeführt werden. Beide
werden als minderweiße Pulver durch Konzentration der gesammelten chromatographischen Fraktionen zur Trockene
isoliert. Die Fraktionen A und B hatten eine Stärke von 1^5 /Ug/mg bzw. 71 ug/mg in der S. lutea-Probe.

Alternativ kann eine Mischung der Antibiotikum W847-C-Fraktionen aus dem, wie oben beschrieben, hergestellten Äthylacetat-Konzentrat wie folgt isoliert werden: Der Rückstand wird in Aceton gelöst und unter kräftigem Rühren in kaltes Wasser gegossen. Die Suspension wird auf Zimmertemperatur erwärmen gelassen und filtriert. Der Niederschlag besteht aus einer Mischung des Antibiotikums¥8^7-0^ und Antibiotikums ¥8^7-Cg und wird im folgenden als Antibiotikum V847-C-Komplex bezeichnet und liegt unter diesen Umständen in Form der freien Base vor. Ein Säureadditionssalz des Komplexes kann bequem durch Titrierung einer Methanollösung der Base mit der entsprechenden Säure und durch Ausfällung des Salzes durch Zusatz von Äthyläther hergestellt werden. Wenn der vorgenannte Vorgang angewendet wird)um den Antibiotikum W8^7-C-Komplex zu erhalten;können die Antibiotika W847-A und W847—B aus dem wässerigen Filtrat extrahiert werden und der Extrakt nachfolgend zu einem Rückstand konzentriert und,wie oben beschrieben, an Magnesiumsilikat Chromatograph!ert werden.

- 22 -

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Chemische Charakterisierung der Antibiotikum W847-Fraktionen-A, B, C. und C„

Die Antibiotika dieser Erfindung sind Stickstoffbasen; dementsprechend ist jede Fraktion geeignet, in einer Weise die gleich der für den Antibiotikum W8*i7-C-Komplex beschriebenen ähnlich ist, Säureadditionssalze bilden. Typische solche Salze sind jene, die mit solchen Säuren wie Chlorwasserstoff-, Schwefel-, Phosphor-, Stearin-, Propion-, Wein-, Maleinsäure u.ähnl. gebildet werden. Wie zu erwarten ist, zeigen solche Salze auch antibiotische Wirksamkeit, die ähnlich ist jener des freien Antibiotikums, gewöhnlich unterschiedlich in den Stärke- und Löslichkeitseigenschaften.

Die Antibiotika dieser Erfindung sind auch hydroxylierte Verbindungen. Dementsprechend sind sie auch zur Veresterung geeignet, vorzugsweise mit einer Karbonsäure. Beispiele derselben sind Ester, wie Acetate, Propionate, Cyclopropylcarboxylate, Succinate, Benzoate u.dgl. Solche Ester zeigen im allgemeinen eine antibiotische Wirksamkeit, die ähnlich jener des freien Antibiotikums ist, gewöhnlich unterschiedlich in den Stärke- und Löslichkeitseigenschaften.

In Tabelle 5 sind die chemischen und physikalischen Eigenschaften der Antibiotikum V847-Fraktionen a, B, C₁ und C₂ gezeigt.

- 23 -

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Tabelle

C7O6UL Chemische und physikalische Eigenschaften der Antibiotikum W847 Fraktionen	Fraktion A	Fraktion B	Fraktion C1	Fraktion C2
	-90°	-92%	-104°	1 -102°
Optische Drehung FuLi25C1^ in Äthanol)	255-259°C (Zers.)	1,25-1350C (Zers.)*	243-2460C (Zers.)	146-15O0C (Zers.)
Schmelzpunkt	9,1	8,8	8,8	8,6
PKa		490	488	L 492 »f
Neutralisation Äquivalent	gefun- berech- den net 60,23 60,25 9,28 9,19 3,30 3,19 27,19 27,36	gefun- berech- den net 58,90 60,11 8,94 8,99 2,88 3,05 29,18 27,85	gefun- berech- den net 60,23 59,98 8,93 8,81 2,94 2,92 27,90 28,30	gefun- berech- den net 58,93 60,35 8,73 8,89 2,88 2,87 29,46 27,89
Fl einen taranalyse:	c^H8ON2°15	S6H82N2°l6	C48H84N20i7	C*9H86N2Oi7
Kohlenstoff Wasserstoff Stickstoff Sauerstoff (durch Un t e rs ch i edb i i dung)	877,10	919,14	961,17	975,20
Empirische Formel
Molekulargewicht

* Monohydrat

Die Infrarotspektren der Antibiotikum W847-Fraktionen A,B,C. und C„ sind in den Fig.1,2,3 bzw. k gezeigt. Die Wellenlängen (l) sind in yu angegeben, die Frequenzen (*v) in esf" ; T steht für die Durchlässigkeit und A für die Absorbtion. Die Spektren der verschiedenen antibiotisehen Fraktionen wurden in Mineralöl (Kujol) ausgeführt und die bedeutenderen Ab&orbtionsmaxima sind in der folgenden Tabelle 6 zusammengestellt, wobei bedeutet: sst = sehr stark, st = stark, m-st = mittel bis stark, m = mittel, schw = schwach, br = breit, sch = scharf, schu = Schulter und sb = Seitenband. Spitzen, welche eher auf dem Vorhandensein des Nujolmediums als der jeweiligen W847-Fraktion beruhen, sind mit "N" (für Nujol) bezeichnet.

Die Antibiotikum W8^7-Fraktionen A, B, C. und C„ haben charakteristische kernmagnetische Resonanz-Spektren (NMR), welche in den Fig.5, 6,7 bzw. 8 gezeigt sind. Die NHR-Spektren wurden auf einem Varian-A-60-A-Spektrometer mit einer Lösung (zirka 0,4 ml, Konzentration zirka 20 mg/ml) einer Probe jeder Fraktion in Deuterochloroform. Die Spektren sind in Teile per Million (PPM) von Tetramethylsilan aufgezeichnet.

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56*0/2*8601

Tabelle

Infrarot-Spektren der Antibiotikum-W847-Fraktionen

OJ I

Fraktion A	Intensität	Fraktion B	Intensität	Fraktion C.	Intensität	Fraktion C2	Intensität
Wellenlänge (yu)	m-st, br	Wellenlänge (/*)	m	Wellenlänge	sb	Wellenlänge (/*)	schw-m
2,82-2,90	N	2,87	schu	2,82	schw	2,83	N
3,35-3,50	st	2,97	N	2,87	N	3,33-3,48	St
5,77	(instrument	3,35-3,50	St	3,35-3,50	st	5,70	(instrument
5,82	artifact)	5,72		5,72		5,80	artifact)
	m-st		St		schw-m		schu
5,88	N	5,83	N	5,87	N	5,88	N
6,82	N	6,82	N	6,82	N	6,80	N Ϊ
7,24	sb	7,25	St	7,25	m	7,23	st tÄ
7,36	m-st, sch	8,05	st, br	7,^5	m	8,00	st, br
7,82	sst, br	8,45	st	7,57	m	8,53	st f
8,45	sst	8,59	st	7,82	St	8,93	schu
8,92	sst	8,94	st	8,03	sst	9,08	m-st
9,02	sst	9,30	st	8,13	St	9,27	St
9,12	m-st	9,62	m-st	8,60	m-st	9,65	m-st, br
9,32	sst	9,91	m-st	8,94	St	10,00	m
9,53	sst	10,02	m	9,05	st	10,38	m
9,63	sst	10,29	sch-m	9,56	st	10,97	m
9,98	st	10,84	sch-m	9,70	m-st	11,15	schw
10,27	m-st	11,08	sch-m	10,13	m	11,52	schw-m
11,02	m-st	11,20		10,48	schw-m	11,92
11,17				11,02	schw-m
		11,18

Die Antibiotikum W847-Fraktionen A, B, C₁ und C„ zeigen folgende Stabilitäten: Bei einem pH-Wert von 2,0 — 6,0 und einer Temperatur von 100⁰C zeigen die Fraktionen A und B einen bedeutenden Verlust an Wirksamkeit in 30 min; sie sind jedoch stabil, wenn sie denselben Bedingungen bei einem pll-Wert von 7,0 - 10,0 unterworfen werden. Die Fraktion C. ist demgegenüber bei einem pH-Wert von 2,0 - 8,0 für 30 min bei 100°C stabil und unstabil unter denselben Bedingungen bei einem pH-Wert von 10,0. Die Fraktion C„ ist sowohl unter sauren Bedingungen (pH 2,0) als auch alkalischen Bedingungen (pH 10,0) bei 100⁰C unstabil,aber sie ist stabil bei einem pH-Wert von k,Q - 8,0 für 30 min bei 100⁰C.

5. Biologische Eigenschaften des Antibiotikum W847 Komplexes, Fraktionen A, B, C. und C„ und Antibiotikum W847—C Komplexes

A. In-vitro-Test

Der Antibiotikum W847 Komplex, Fraktionen A, B, C₁ und C„ und der Antibiotikum W847-C Komplex besitzen ein breites Spektrum antibakterieller In-vitro-Aktivität gegen eine Vielzahl von grampositiven und gramnegativen Organismen. Entweder als Komplex oder als einzelne Fraktion können sie daher zur Reinigung und Sterilisation von Laboratoriumsglaswaren und zur Reinigung und Sterilisation chirurgischer Instrumente u.dgl. verwendet werden. Diese Antibiotika können auch in Kombination mit Seifen und Waschmitteln zum Reinigen und Desinfizieren von Räumen_; die für die Bereitung von Nahrungsmitteln verwendet werden, z.B,

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Küchen, Speiseräumen u.dgl., angewendet werden.

Das antibakterielle In-Titro-Spektrum des Antibiotikum W847-KOMpIexes, Fraktionen A, D, C. und C„ und des Antibiotikiuü ¥847—C Komplexes gegen typische grampositive und gramnegative Organismen ist in der folgenden Tabelle 7 gezeigt. Die Empfindlichkeit der Testorganismen gegen die Antibiotika wurde durch ein Rohrverdiinnungsverfahren in Hefe—Rindfleisch-Brühe die mit Natriumhydroxyd auf einen pH—Wert von 8,0 eingestellt wurde, bestimmt. Die getesteten Stämme der Organismen sind durch Sammlungsnummem gekennzeichnet; hier und in anderen folgenden Tabellen beziehen sich diese Nummern, denen die Buchstaben "DA" vorangestellt sind, auf die Sammlung der Schering Corporation, Bloomfield (N.J.), Ü.S.A.

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Tabelle 7 Antibakterielles Spektrum des Antibiotikum W847 Komplexes und der Fraktionen

und des C-Komplexes

Minimale Inhibitionskonzentration (ug/ml) des Antibiotikums

Mikroorganismus

Komplex Base

Komplex

CHlsalz

Fraktion
A

Fraktion B

Fraktion Fraktion C-Komplex

Bacillus megatherium DA 7064 0.3

Bacillus subtilis ATCC 6633 0.03

Diplococcus pneumoniae DA 700 -

Diplococcus pneumoniae ATCC 10015 -

Diplococcus pneumoniae DA 150 6.0

Enterococcus sp. DA 800 0.3

Enterococcus sp. DA 801 0.3

Enterococcus sp. DA 802 0.3

Sarcina lutea ATCC 93Ul 0.0075

Staphylococcus aureus ATCC 12715 0.3

Staphylococcus aureus ATCC 6538P 0.3

Staphylococcus aureus ATCC 11631* 0.3

Staphylococcus aureus (Gray) 0.3

Staphylococcus aureus DA 2001 0.03

Staphylococcus aureus DA 2003 0.03

Staphylococcus aureus DA 2010 0.3

Staphylococcus aureus DA 2014 0.3

Staphylococcus aureus DA 2018 0.3

Staphylococcus aureus DA 2032 0.075

Staphylococcus aureus DA 2033** >16

Streptococcus faecalis DA 20 0.3

Streptococcus pyogenes DA 21 0.75

Streptococcus pyogenes DA 11 0.3

Streptococcus pyogenes DA 12. -

0.75

0.75

0.0ü75
0.75
0.03 "
0.075
0.3
0.3
0.03
U.3
0.3
0,3
0.3

0.6

0.005

1.2

0.5
>2.7

0.6

0.6

0.2

0.005

0.08

0.6

0.6

0.6

0.6

0.6

0.6

0.6

0.6

0.6
>2.7

0.03

5.0

0.6

0.2

1.2

0.05

1.2

0.5 >-2.7

0.6

0.6

0.2

0.005

0.2

0.2

0.6

0.6

0.2

0.6

0.6

0.6

0.6

0.6 >2.7

0.1

5.0

0.2

0.2

>32

0.3 0.03

12.0 0.3 0.3 0.3

0.0075 0.3 0.03 0.3 0.3 0.03 0.075 0.3 0.03 0.075 0.075

0 0.3 0.3 0.3

0.6 0.005 0.6 0.05

0.08 0.6 0.03 0.0005 0.005 0.005 0.6 0.6 0.03 0.6 0.2 0.6 0.1 0.08 2.7 0.005 0.6 0.03 0.03

0.3 0.005

>2.7

0.3

0.3

0.3

0.00075

0.03

0.03

0.3

0.5

0.03

0.3

0.25

0.03

0.1

0.08 >2.7

0.075

0.3

0.3

(Forts.)

Tabelle 7 (Forts.)

Minimale Inhibitionskonzentration (ug/ml) des Antibiotikums W847

Mikroorganismus

Komplex	Komplex
Base	HCl-
	salz
0,75	0,3
6,0	> 16
12,0	> 16
6,0	> 16
6,0	12,0
6,0	12,0

Fraktion Fraktion Fraktion Fraktion C-Komplex

C.

Mycobacterium smegmatis ATCC 10143 Escherichia coli ATCC 10536 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 Proteus vulgaris DA Pseudoraonas aeruginosa ATCC 8689 Salmonella schottmuelleri DA

5,0
6,0
6,0
12,0
6,0
6,0

5,0	O1	,3
12,0	12,	»0
24,0	12,	»0
24,0	24,	»0
12,0	6,	»0
12,0	12	»0

0,05

12,0 24,0 24,0 6,0 12,0

* ein gegen Penicillin resistenter Stamm
** ein gegen Erythromycin resistenter Stamm

üie antibakterielle Aktivität des Antibiotikum W8'»7 Komplexes mit jener von Erythromycin, Penicillin G und Methicillin wird in der folgenden Tabelle 8 verglichen (die Empfindlichkeit wurde durch das oben beschriebene Itohrverdünnungsverfahren bestimmt). Die Tests wurden unter Verwendung der folgenden Medien durchgeführt": Antibiotikum W8'*7 Komplex und Erythromycin in liefe-Rindfleisch-Bruhe bei pH-Wert von 8,0; Penicillin G und Methicillin in liefe-Ilindfleisch-Bruhe bei pH-Wert von 6,8. Die Ergebnisse zeigen, daß der Antibiotikum W847 Komplex im Vergleich zu den anderen geprüften Antibiotika eine bessere Aktivität gegen grampositive Bakterien hat. Der Antibiotikum V847 Komplex ist darüber hinaus aktiv gegen Mycobacterium smegmatis bei einer niedrigeren Konzentration als Erythromycin, wogegen Penicillin G und Methicillin bis zu 10 yug/ml inaktiv sind.

- Ji -

109842/0495

Tabelle 8

Vergleich des antibakteriellen Spektrums des Antibiotikum W847 Komplexes mit Erythromycin,

Penicillin G und Methicillin

W847 Komplex Erythromycin Penicillin G Methicillin

Bacillus cereus Bacillus subtilis Diplococcus pneuraoniae Sarcina lutea Staphylococcus aureus (3 verschiedene Stämme)O,OO5-O,2 Staphylococcus aureus(7 verschiedene Stämme )* 0,03-0,6 Staphylococcus aureus(i Stamm)** Streptococcus faecalis Streptococcus pyog en es (4 verschiedene Stämme) iA Mycobacterium smegraatis ι

^₁ Antibiotikum W847 Komplex und Erythromycin in liefe-Itindfleisch-Brühe bei pH 8,0; Penicillin G

_o und Methicillin in Hefe-Rindfleisch-Brühe bei pH 6,8.

^ * klinisch isoliert, umfaßt gegen Penicillin resistente Organismen

** ** klinisch isoliert, resistent gegen Erythromycin

0,2	0,05	0,12	4,8
0,005	0,005	0,01	0,03
0,2	0,05	0,12	1,8
0,0005	0,005	0,06	0,3
0,005-0,2	0,005-0,05	0,003-0,06	0,12-0,6
0,03-0,6	0,005-0,5	1,2-9,4	1,2-7,5
2,7	50,0	-	-
0,005	0,0005	0,75	25,0
0,03-0,2	0,05	0,01-0,02	0,6
0,5	5,0	10	10

B. In-vivo-Test

Vie oben ausgeführt wurde, zeigen der Antibiotikum W847 Komplex, der Antibiotikum W847-C Komplex und die Fraktionen A, B, C₁ und C₂ einen breiten Bereich antimikrobiell er Aktivität gegen grampositive und gramnegative Mikroorganismen. Zu der grampositiven Gruppe gehören pathogene Mikroorganismen einschließlich Species der Gattung Streptococcus, Staphylococcus und Diplococcus, welche, wie bekannt, zahlreiche Krankheiten verursachen. Verschiedene Species von Staphylococcus und Streptococcus sind die Ursache für Rindermastitis. Diese Species werden leicht durch die beschriebenen Antibiotika nach einer verhältnismäßig kurzen Zeit nach der Verabreichung unter Kontrolle gebracht und behandelt.

Der Antibiotikum W847 Komplex, die Fraktionen A, B, C., C₂ und W847-C Komplex sind auch gegen gramnegative Organismen einschließlich Species der Gattung Escherichia, Salmonella, Proteus und Pseudomonas wirksam. Diese Organismen sind die Ursache für viele ernste K rankheit β Symptome einschließlich Harntraktinfektionen und Diarrhö es. Solche Symptome sind sehr üblich bei Haustieren wie Hornvieh, Pferden, Schafen, Schweinen, Hunden und Katzen und können wirkungsvoll unter Kontrolle gebracht und behandelt werden durch die beschriebenen Antibiotika.

- 31 -106842/0495

Der in Erdnußöl suspendierte Antibiotikum ¥847 Komplex

ergibt eine LDen (letale Dosis für 50% der getesteten) von 270 mg/kg bei Mäusen auf interperitonealem Wege. Bei subcutaner und oraler Verabreichung ist die LD^₀ größer als 5000 mg/kg. Die PD₅₀ (^{Scnutzdosis für} 50$ der getesteten) ist 150 mg/kg bei subcutaner Verabreichung (Erdnußölsuspension) gegen eine letale Infektion von S. aureus bei Mäusen. Gegen Streptococcus pyogenes ist die PD-q bei Mäusen auf demselben Verabrei chungsvrege 100 mg/kg.

Darüber hinaus ist der Antibiotikum ¥847 Komplex verabreicht an Hunden in Mengen von 17»5 mg/kg im Blutserum für 7 Tage feststellbar. Dies ist überraschend im Hinblick auf die Tatsache, daß bei Verabreichung einer vergleichbaren Dosis an Erythromycin diese nicht über einen Intervall von 24 h vorhanden bleibt.

Daten der akuten Toxizität für die Antibiotikum ¥847 Fraktionen und Komplexe sind in Tabelle 10 angeführt.

Die Tabellen 11, 12 und 13 zeigen den durch die Antibiotika vorliegender Erfindung bewirkten Tierschutz.

- 3Ü -109842/0495

Tabelle 10

Toxizität der Antibiotikum W8^yi7 Fraktionen und Komplexe in Mäusen

in mg/kg)

Verabreichungsweg

W8'i7 Komplex Base in Erdnußöl

W847 Komplex	W8'i7 Fraktion	W847	Fraktion B	W847-C Kom
HCl in H2O	A Base*	Base	in Erdnuß	plex
			öl
> 2500	7500		-	■ρ, 500
2500	7000		500	V 500
300	350			400

Subcutan

Intraperitoneal

75

Verabreichungsweg

Dase*

Oral	>1000
Subcutan	>1000
Intraperitoneal	500

> 500

> 500

>500

* In 0,5#iger wässeriger Carboxymethyl-zellulose

cn

T a b e I 1 e

11

Aktivität von Antibiotikum W8^;>7 Komplex gcg;cn letale intraperitoneale-Infektionen

in Mäusen (I ß-_Q in /)

Antibiotikum W847 Komplex in Krdnußöl

Antibiotikum ¥847 Komplex HCl in H₂O

Antibiotikum W847 Fraktion C„HC1 •in H₂O ^Λ

Subcutano Behandlung

Staphylococcus aureus Gray Staphylococcus aureus DA 2030 Staphylococcus aurous DA 2000 Staphylococcus aurous Smith Streptococcus pyogenos C DA Streptococcus pyogenes DA 32 Streptococcus pyogenes DA 31 Streptococcus pyogenes DA 12 Streptococcus pyogenes DA 9 Diplococcus pneumoniae DA 150 Diplococcus pneumoniae DA 150

(2 Tage Behandlung) Diplococcus pneumoniae DA 151 Diplococcus pneuraoniae DA 10015

Staphylococcus aureus Gray Streptococcus pyogenes DA 21 Diplococcus pneumoniae DA 150

35 23

35 23/Tag

4,3	5
4,3
3,5	-
2,3	-
4,6	45
1,5*	-
1,5*	-
1,5*	-
1,5*	-
23,2	150
11,6/Tag	30/Tag
11,6	mm
1,5*	-
Orale Behandlung

> 116

116

PD

100

Tabelle 12

Aktivität von Antibiotikum W8^;»7 Fraktionen ι*ορ,βη letale intraperitoneale Infektionen in

Mäusen ( Pl) _rn in mg/kg)

Behandlungsweg

W847-A Base *

W847-C. Base *^J

Streptococcus

Streptococcus

Streptococcus

Strep tococcus

Streptococcus

Strep tococcus

Streptococcus

Streptococcus

Staphylococcus S taphylococcus Staphylococcus Staphylococcus Staphylococcus Staphylococcus Staphylococcus Staphylococcus Diplococcus

Diplococcus

Diplococcus

pyogenes

pyogenes

pyogenes

pyogenes

pyogenes

pyogenes

pyogenes

pyogenes

aureus

aureus

aureus

aureus

aureus

aureus

aureus

aureus

pneumoniae

pneumoniae

pneumoniae

C

C

Nr

Nr

Nr

Nr

Smith Smith Gray Gray W W

Nr. Nr.

eye

eye

Nr.

Diplococcus pneumoniae Nr. Enterococcus Nr. 802 Enterococcus Nr. 802 Enterococcus Nr. 804 Enterococcus Nr. 804 Escherichia coli Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

Oral.
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.
Oral
S.C.

300 220 300 134 180 180 250

167 250

75

300

20

117

20 150

20 300

90 250

70 300 160 250 180 200 100 250 150 >25O 161

207 118 300 180

>25O 200

>25O 250 180

117 >25O

62 150

25 170

25 300

167

200

170

>25O

180

250

250

250

250

>250 >25O >25O >25O

in 0,5%igcr wässeriger Carboxymethylzellulose; ( ) S.C. = subcutan

Tabelle Aktivität von Antibiotikum W8^;t7 Fraktionen und deren Kombinationen gegen letale

intraperi toneal e Infektionen in Mäusen (PD _rQ in /)' "

W847-B

Base in Base* ^x HCl in^HgO Komplex Komplex

Erdnußöl Base* HCl in F

Subcutane Verabreichung der Antibiotika Organismus

Staphylococcus aureus Gray Streptococcus pyogenes C

Staphylococcus aureus Smith Streptococcus pyogenes Nr.

200 150

10

50	50
50	50
86
39

Orale Verabreichung der Antibiotika

_{mm M} Organismus

<p Staphylococcus aureus Gray •©Streptococcus pyogenes C

!^Staphylococcus aureus Smith ^»,Streptococcus pyogenes Nr.

>250 >25O

100 100

390 310

310 390

>25O >250

«η* Mit Ultraschall behandelte Suspension in wässeriger 0,5$iger Carboxymethylcellulose

«cn CD

Die in 0,5%iger wässeriger Carboxymethylzellulose suspendierte und durch Behandlung mit Ultraschall dispergierte Antibiotikum ¥8^7 Fraktion A ist bei subcutaner Verabreichung in Mäusen gegen S. aureus Gray mit einer PD™ (Schutzdosis für 50% der getesteten) von 20 mg/kg und gegen P. aeruginosa mit einer PDj-q von 161 mg/kg wirksam. Die LD in Mäusen bei subcutaner Verabreichung ist 7OOO mg/kg.

Die in Erdnußöl suspendierte Antibiotikum ¥8^7 Fraktion ist bei subcutaner Verabreichung in Mäusen gegen S. aureus mit einer PD^₀ von 15O mg/kg wirksam und gegen P. aeruginosa wird mit 350 mg/kg eine Verzögerung des Todes um 2k h erreicht. Die LDcQ iⁿ Mäusen bei subcutaner Verabreichung ist größer als 500 mg/kg.

Die in 0,5%iger wässeriger Carboxymethylzellulose suspendierte und durch Behandlung mit Ultraschall dispergierte Antibiotikum ¥847 Fraktion C. ist in Mäusen gegen S. aureus wirksam. Bei subcutaner Verabreichung gegen S. aureus Gray beträgt die PDr₀ 62 mg/kg. Bei der gleichen Verabreichungsart beträgt die PD_₀ 180 mg/kg gegen S. pyogenes C. Das Antibiotikum ist etwas weniger wirksam bei oraler Verabreichung mit einer PD_Kn gegen S. aureus Gray und .S. pyogenes C von mehr als 250 mg/kg. Die LD^n in Mäusen bei subcutaner Verab

reichung ist größer als 1000 mg/kg. Das Antibiotikum zeigt auch eine Antimalaria-Wirksamkeit gegen Plasmodium berghei und bei Verabreichung an Nagetieren (lOO mg/kg/Tag)

1Q9842/CU95

wird bei einer Nachinfektion nach 2k h eine bedeutende Unterdrückung in der Blutparasitzahl bewirkt.

Die Antibiotikum W847 Fraktion C₂ ist als Suspension in
wässeriger Carboxymethylzellulose bei subcutaner Verabreichung wirksam. Es ist jedoch vorteilhafter, sie als wässerige Lösung des Hydrochloridsalzes zu verwenden und bei subcutaner Verabreichung an Mäusen beträgt die PDtn ^5 mg/kg
gegen S. aureus Gray und 10 mg/kg gegen S. pyogenes C. Bei oraler Verabreichung weist diese Fraktion eine PD-₀ von
100 mg/kg gegen diese beiden Organismen auf. Die LDc₀ i-ⁿ
Mäusen bei intraperitonealer Verabreichung ist größer als
500 mg/kg.

Die folgenden Beispiele erläutern in einer ausführlicheren Weise die bevorzugten Verfahren zur Herstellung der beschriebenen Antibiotika. ■

1. Fermentation der Mikroorganismen

Beispiel 1: Schüttelkolbenfermentation

A. Keimungsstufe

0,5 ml einer lyophilisierten Kultur von Micromonospora sp. W8^7 werden in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben, der 100 ml des folgenden Mediums enthält, das vor der Sterilisation mit verdünntem Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von
7,5 eingestellt wurde:

109842/0495

Bacto-Rindfleisch-Extrakt (Difco) 3,0 g

Bacto-Tryptose (Difco) 5,0 g

Dextrose 1,0 g

Stärke (Kartoffel) 24,0 g

Bacto-Hefe-Extrakt (Difco) 5,0 g

Kalziumkarbonat 2,0 g

Leitungswasser 1000,0 ml

Man bebrütet 3 Tage lang bei 37°C auf einer rotierenden Schüttelmaschine (280 Umdr/min; 5 cm Rüttelbewegung).

B. Inoculumstufe

Man überträgt aseptisch 25 ml des durch die vorstehende Keimung gewonnenen Inoculums auf einen 2 1-Erlenmeyer-Kolben, der 500 ml des für die Keimung verwendeten sterilen Mediums enthält. Man bebrütet den Kolben samt Inhalt 3 Tage lang bei 28⁰C auf einer rotierenden Schüttelraaschine (280 Umdr/min; 5 cm Ru tt el bewegung).

C. Fermentationsstufe

Man überträgt aseptisch je 25 ml aus der Inoculumstufe auf 2 1-Erlenmeyer-Kolben,die 500 ml des folgenden sterilen Mediums enthalten, welches vor der Sterilisation durch verdünntes wässeriges Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 7,8 eingestellt wurde.

- 4ffl-

1Q9842/049S

30	,0	g	IT O	g
3	,0	g	ml
1	,0	g
0	,5	(T O
0	,01
8	,0
1000	,0

Sucrose

Natriumnitrat Dikaliumphosphat Magnesiumsulfat Ferrosulfat Pepton

Leitungswasser

Man bebrütet die Flaschen samt Inhalt k Tage lang bei 28⁰C auf einer rotierenden Schüttelmaschine (280 Umdr/min; 5 cm Rüttelbewegung), vereinigt die Inhalte der Flaschen, stellt in einem aliquoten Teil der ganzen Brühe den pH-Wert auf 9,5 ein und extrahiert mit Äthylacetat (ungefähr 2 Volumen/ Volumen der Brühe). Man trennt die Lösungsmittelphase ab und konzentriert unter Vakuum auf das lOOfache. Das Konzentrat wird auf seine Wirksamkeit durch das Agarscheiben-Diffusionsverfahren unter Verwendung von S. aureus (ATCC 6538P) als Testorganismus geprüft. Das Konzentrat ergibt eine Inhibitionszone von ungefähr 20 - 35 mm.

Beispiel 2: Tankfermentation

A. Keimungsstufe

Die Keimungsstufe und die Inoculumstufe werden in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise ausgeführt,

B. Fermentationsstufe

500 ml des Inoculums werden aseptisch in einen lh 1-Fermen-

109842/0495

ter übertragen, der 10 1 des in Beispiel l beschriebenen sterilen Mediums enthält, dem ό ml Antischaummittel, Dow Corning B (Dow Corning Corporation, Midland, Michigan), zugesetzt wurden. Man bebrütet 66 h lang unter folgenden Bedingungen:

Temperatur . 31⁰C

Zufuhr an steriler Luft h l/rain

Bewegung 250 Umdr/min

Antischaummittel

(Dow Corning B) Zusatz wie er

forderlich

Am Ende dieser Periode erreicht die Intensität des erzeugten Antibiotikums eine Höhe,welche im wesentlichen konstant bleibt. Während der Fermentation bleibt der pH-Wert der Fermentationsmischung im wesentlichen im Bereich von 7,2 8,2. Das kompakte Zellvolumen erreicht einen konstanten Wert von 2,5 - ^>5 ml. Die Aktivität des hergestellten Antibiotikums in der ganzen Brühe ergibt beim Scheibentest gegen S. aureus oder P. aeruginosa einen Zonendurchmesser von 15 - 25 mm.

Beispiel 3: Tankfermentation
A. Herstellung des Inoculums

In vier 2 1-Kolben, die je 500 ml der in Beispiel IA beschriebenen sterilen Brühe enthalten, werden je 0,5 nil einer lyophilisierten Kultur von Micromonospora sp.

1 08842/0495

gegeben. Die Kolben werden auf eine rotierende Schüttelmaschine, die 280 Umdr/min macht (5 cm Rüttelbewegung)>gegeben und bei 28°C 72 Ii lang bebrütet.

B. Fermentationsstufe

In jeden von 4 Fermentationsbehältern werden 10 1 des folgenden sterilen Herstellungsmediums gegeben, das vor der Sterilisation auf einen pH-Wert von 7,15 - 7,25 eingestellt wurde:

Trypticase 170,0 g

Natriumchlorid 50,0 g

Dikaliumphosphat 25,0 g

Dextrose 25,0 g

Czapek-Dox-Brühe 550,0 g

G.E.-60 Antischaummittel

(General Electric Company

Scheneetady, Xew York) wie erforderlich

Leitungswasser q.s. 10,0 1

Man beimpft jeden Fermenter mit 500 ml der oben beschriebenen 72 h-Kultur. Man bringt die Temperatur des Fermentationsmediums auf 31 C und rührt mit 500 Umdr/min, wobei ein Luftstrom mit einer Geschwindigkeit von 0,5 1 Luft/ 1 Brühe/min durch das Medium geführt wird. Nach 24 h wird die Bewegungsgeschwindigkeit auf 600 Umdr/min und nach 4S h auf 700 Umdr/min gesteigert. Die Fermentation ist am Ende von 69 h beendet. Für die Extraktion vereinigt man die Brühen aus den 4 Fermentationsbehültern (etwa 37 l).

1 09842/0495

BAD ORIGINAL

•J 17675S5

2. Extraktion des Antibiotikum W847 Komplexes

Beispiel 4: Extraktion des Antibiotikum W8^7 Komplexes aus der Laboratoriumsfermentation (chromatographisches Verfahren).

60 1 der gemäß den in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellten Brühe werden mit verdünntem wässerigen Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt. Man extrahiert mit 2 Volumen Äthylacetat pro jedem Volumen Brühe, trennt die Lösungsmittelphase ab und konzentriert unter Vakuum,um einen öligen Rückstand zu erhalten (ungefähr 30,0 g). Die biologische Aktivität (l/20 Verdünnung) dieses öligen Rückstandes ergibt eine Inhibitionszone mit einem Durchmesser von etwa 20_#- 30 ram gegen S. aureus und etwa 15 - 25 mm gegen P. aeruginosa. Man reinigt den öligen Rückstand durch Säulenchromatographie gemäß dem folgenden Verfahren:

Unter Verwendung von 1000 g LH20 Sephadex (Pharmacia Fine Chemical, Inc.) die in 95%igem wässerigem Äthanol suspendiert sind, \iird eine Säule hergestellt. Man überträgt den öligen Rückstand auf die Säule und eluiert mit 95%igein Äthanol mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 200 ml/h. Man sammelt 50 ml Fraktionen und vereinigt die Fraktionen gemäß ihrer antibakteriellen Aktivität (bestimmt durch den Agarscheibentest gegen S. aureus ATCC 6538P). Die Fraktionen

109842/0498

HS

mit der höchsten Aktivität werden zur Trockene konzentriert, der feste Rückstand in einer kleinen Menge von Aceton gelöst und die Lösung in ein überschüssiges Volumen von Petroleumäther (Siedepunkt 30 - 60°C) gegossen. Die Mischung wird in ein Trockeneis/Acetonbad (ungefähr -50°C)übergeführt und für 20 min stehen gelassen. Die Temperatur der Mischung wird auf Zimmertemperatur ansteigen gelassen und die Mutterlauge von dem öligen Rückstand durch Dekantation abgetrennt. Man konzentriert die Mutterlauge zur Trockene und erhält den gereinigten Antibiotikum ¥847 Komplex.

Der auf diese Weise hergestellte Antibiotikum ¥847 Komplex zeigt bei der Probe gemäß den oben beschriebenen Zylinderschalenverfahren eine Stärke von etwa 225 - 275 /J

Beispiel 5'· Extraktion des Antibiotikum ¥847 Komplexes aus der Tankfermentation (Lösungsmittelextraktionsverfahren).

Die gemäß Beispiel 3 erhaltene gesammelte Brühe (etwa 37 l) wird mit 50%igem wässerigem Natriumhydroxyd auf den pH— ¥ert 9,5 eingestellt. Man extrahiert mit 2 Volumen Äthylacetat und verdampft den Extrakt auf ein Volumen von 2.150 ml Man isoliert den Antibiotikum ¥847 Komplex durch eines der folgenden Verfahren:

A. Chlorwasserstoffsäureextraktion

- 4t -

1098A2/0A95

Man extrahiert 500 ml des Äthylacetatkonzentrates zweimal mit 250 ml einer 0,5#igen (Ο,ΙΛ η) Chlorwasserstoffsäure. Durch Zusatz von 5/oigeiu wässerigem Natriumhydroxyd werden die vereinigten Säureextrakte schwach alkalisch gemacht (ph-Wert etwa 8,5 - 9,0) worauf zweimal mit 250 ml Äthylacetat extrahiert wird. Die Äthylacetatextrakte werden ver-• einigt und unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert. Der so hergestellte Komplex zeigt bei der Probe nach dem vorher beschriebenen Zylinderschalenverfahren eine fe Stärke von etwa 525/ug/mg.

B. Schwefelsäureextraktion

Man führt die in Beispiel 5A beschriebene Extraktion aus, wobei jedoch die Chlorwasserstoffsäure durch eine 0,1 n-Schwefelsäure ersetzt ist. Der so hergestellte Komplex zeigt bei der Zylinderschalenprobe eine Stärke von 550 ug/mg.

3. Zerlegung des Antibiotikum ¥847 Komplexes und Herstellung von Derivaten

Beispiel 6: Isolierung der Antibiotikum W847 Fraktion C₂.

Man stellt eine Säule (105 cm lang, 7»6 cm Durchmesser) unter Verwendung von 2000 g Kieselsäure (analytisches Reagenz, Mallinkrodt) her, wobei kleine Segmente in ein kompaktes Bett gegeben werden. Man löst 13*0 g des gemäß Beispiel h hergestellten Antibiotikum W847 Komplexes in Aceton, das mit Kie-

1098Λ2/0Α9Ε

seisäure gemischt ist, auf und verdampft das Aceton unter Vakuum. Die trockene Mischung wird auf den oberen Teil der Säule gegeben und die Säule mit einer Mischung von Chloroform (60 Vol.-Teile) und Methanol (40 Vol.-Teile) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 100 ml/h eluiert. Man sammelt 200 ml Fraktionen und überwacht die Säule durch Scheibentest jeder Fraktion gegen S. aureus und E. coli. Man ehromatographiert die aktiven Fraktionen auf Kieselsäure-Dünnschichtplatten, die 1 1/2 h in demselben für die Kolonne verwendeten Lösungsmittelsystem eingesetzt sind. Die Fraktionen werden gemäß ihren chromatographischen Mustern, wie sie durch die vorher beschriebenen zwei Methoden bestimmt werden (vgl. Charakterisierung des Antibiotikum WS47 Komplexes) gesammelt. Die Fraktionen werden unter Vakuum konzentriert. Durch Vereinigung der Fraktionen, wie in Tabelle lh angegeben, wird das Antibiotikum-We^T-Fraktion-Crj-Hydrochlorid als ein weißes Pulver durch Lösung der vereinigten Rückstände in einem Volumen Methanol und Ausfällung mit 10 Volumen Äthyläther isoliert. Dieses Material dieser Stufe zeigt bei der vorher beschriebenen Zylinderschalenprobe eine Stärke von etwa 1000 ug/mg.

Isolierung des Antibiotikum-WS^V-Fraktion-C.-Material

Durch Vereinigung der späteren Fraktionen,wie in Tabelle Ik angegeben,wird eine isolierte Antibiotikum ¥847 Fraktion C. als ein weißes Pulver durch Konzentrierung der ausgewählten

109842/0495

Säulen!'raktionen zur Trockene erhalten. In dieser Stufe zeigt dieses Material bei der vorher beschriebenen Zylinderschalenprobe eine Stärke von etwa 900 ug/mg. Das verbleibende aktive Material wird aus der Säule eluiert, gesammelt und zu einem Rückstand konzentriert.

Beispiel 7: Isolierung der Antibiotikum V847 Fraktion Λ und Fraktion B.

Man aktiviert 500 g Florisil.bei 100⁰C für 16 h, nimmt in Hexan auf und gibt die Aufschlämmung in eine Glassäule (105 cm lang, 3,8 cm Durchmesser, Aufnahmevolumen 700 ml). Die Säule wird mit 2,S g des Rückstandes gemäß Beispiel 6 beschickt, die in 10 ml Methylenchlorid gelöst sind. Die Säule wird fortschreitend mit 700 ml Hexan, 700 ml Äther, 7OO ;;;1 Athylacetat und amvachsenden Mengen Aceton in Allylacetat (Strömungsgeschwindigkeit 200 ml/h) eluiert. Man sammelt 100 ml Fraktionen. Die Säule wird wie vorher beschrieben durch Testung der Fraktionen gegen S. aureus und E. coli mit anschließender Dünnschichtchromatographie überwacht. Die Fraktionen werden,wie in Tabelle lh angegeben, vereinigt.

109842/0495

BAD ORIGINAL Tabelle

Ergebnisse der Säulentrennung

Fraktion

Säulenschnitt

W847C.

Ki eselsäure-Säule

28-48 56-58

Florisil-Säule

W847B

V847A

164-227

(30% Aceton in Äthylacetat)

370-397

(80% Aceton in Äthylacetat

Gewicht

1,2 g 625 mg

540 rag

283

Dünnschicht Muster R_f Chloroform-Methanol (60/40)

0,65 0,52

0,38

0,19

Stärke ig/mg)

900-100 850-100

125-175

ί 50-100

Beispiel 8: Antibiotikum W847 Komplex Hydrochloric! Salz.

Etwa 140 mg des Antibiotikum ¥847 Komplexesjwie er gemäß Beispiel 5 isoliert wurde, wird in etwa 50 ml Wasser suspendiert. Man stellt den pH-Wert der Suspension durch Zusatz von verdünnter (n/l) Chlorwasserstoffsäure auf etwa 6,5 - 7,0 ein und rührt kräftig. Man entfernt das unlösliche, falls vorhanden, durch Filtration und lyophilisiert das FiItrat, wodurch ein Antibiotikum W847 Hydroehlorid erhalten wird, Gewicht ungefähr 90 mg und Stärke etwa 550 ug/ing.

109842/0495

Durch Anwendung des Verfahrens dieses Beispieles auf entweder den Antibiotikum W8'i7 Komplex oder den verschiedenen Fraktionen desselben und durch Einsatz äquivalenter Mengen anderer Säuren, wie z.B. Schwefel- oder Phosphorsäure, können die entsprechenden Salze hergestellt werden. Alle Salze werden als zu dem Antibiotikum W8²i7 Komplex gehörend und als Äquivalent zu den beschriebenen freien Antibiotika betrachtet und fallen in den Rahmen dieser Erfindung.

In der Tabelle 15 ist die Aktivität der Hydrochlorid-, Sufat- und Phosphatsalze, die aus dem Antibiotikum WS^ 7 Komplex, Stärke des Antibiotikum W847 Komplexes 232 ng/mg, hergestellt sind, gegen eine Vielzahl von grainpositiven und grcmnegativen Organismen in einer Hefe-Rindf 1 eisch-Iirühe bei einem pH-Wert von 8,0 angegeben.

109842/0495

CC'

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108842/0496

BAD

Beispiel 9: Isolierung des Antibiotikum W8^7*-C Komplexes,

542 g des ¥8^7 Komplexes (vgl. Beispiel 5) werden in 5»^ 1 Aceton gelöst und die sich ergebende Lösung mit 81 g Entfärbungskohlθ für etwa 30 min bei etwa Raumtemperatur behandelt. Die Entfärbungskohle wird durch Filtration entfernt und das Filtrat im Vakuum auf ungefähr 2 1 konzentriert. Man stellt eine Aufschlämmung von etwa 80 1 von Eis und Wasser her und fügt unter kräftigem Rühren die Acetonlösung hinzu. Die Temperatur der sich ergebenden Suspension wird auf etwa 25°C unter Rühren ansteigen gelassen und durch Filtration sammelt man das Produkt. Der Feststoff wird mit einer kleinen Menge Wasser gewaschen und bei etwa 50⁰C im Vakuum getrocknet, man erhält etwa 212 g Antibiotikum W847-C Komplex mit einer Stärke von etwa 1075 /Ug/mg.

Zusätzliches Produkt (etwa 85 g) kann durch Konzentration der Mutterlauge erhalten werden, dieses Produkt kann jedoch durch Fraktionen A und B verunreinigt sein.

Der gemäß obigen Ausfuhrungen hergestellte Antibiotikum VS'iT-C Komplex kann vorteilhafterweise für die Herstellung von Säureadditionssalzen, wie im folgenden gezeigt wird, verwendet werden.

Beispiel 10: Herstellung eines Tartratsalzes eines Antibiotikum WS'»7-C Komplexes.

Zu einer festen Zusammensetzung,die 2,0 g eines Komplexes von

109842/0495

Antibiotikum ¥847-0^ und Antibiotikum W847-C₂ enthält und gemäß Beispiel 9 erhalten wurde, werden unter Rühren 30 ml Diäthyläther zugesetzt. Zu der sich ergebenden Lösung werden 0,5 g Weinsäure, die in 2,5 ml Äthanol gelöst ist,zugesetzt. Die Mischung wird etwa 15 min lang gerührt, dann das ausgefällte Salz filtriert. Man wäscht den Niederschlag mit Diäthyläther und trocknet das Produkt, wobei man ungefähr 2,0 g Tartratsalz erhält, dessen Bioprobe ungefähr 575 «g/mg ergibt und dessen Drehung gemessen in einer l%igen Lösung in Äthanol -57° ist.

Beispiel 11: Antibiotikum W8*t7-C Komplex Propionat-Ester.

1,0 g Antibiotikum W847-C Komplex wird in 5»0 ml trockenem Aceton gelöst und 0,35 ml Propionsäureanhydrid werden zugesetzt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur k h lang gerührt, dann langsam und unter Rühren 8 ml eines l,2%igen wässerigen Ammoniaks zugesetzt. Der sich bildende Niederschlag wird abfiltriert und mit 40%igem wässerigem Aceton und dann mit Wasser gewaschen, wobei das gewünschte Produkt erhalten wird. Das auf diese Weise erhaltene Produkt hat folgende Konstanten:

Schmelzpunkt = 207-210⁰C ;£*-]²⁵= -63°C (C = i% in Äthanol).

Beispiel 12: Antibiotikum W8'i7-C Komplex Diacetat-Ester.

Man löst 11,8 g des W847-C Komplexes in 55 ml Pyridin und setzt 5,5 ml Essigsäureanhydrid zu. Man rührt die Reaktionsmischung bei Zimmertemperatur etwa 18 h lang und gibt sie dann unter kräftigem Rühren in 2 1 Eiswasser, das 50 ml

109842/0495

n wässerigen Ammoniak enthält. Der sich bildende Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, rfobei das gewünschte Produkt enthalten wird, das einen Schmelzpunkt von 237 - 241⁰C und eine Drehung von etwa -86° (C = i% in Äthanol) hat.

Alternativ kann das ausgefällte Produkt mit Äthylacetat extrahiert, der Extrakt mit Wasser gewaschen und in Vakuum zu einem Rückstand verdampft werden. Der Rückstand wird anschließend in Aceton gelöst, mit Entfärbungskohle behandelt und durch Zusatz eines gleichen Volumen Wassers ausgefällt, wobei man das genannte Produkt erhält.

Im Hinblick auf die vorhergehenden Beispiele ist es für den Fachmann offensichtlich, daß die Antibiotika vorliegender Erfindung andere Ester bilden werden. Alle Ester werden als zu dem Antibiotikum W847 Komplex gehörend und als vollständig äquivalent mit jenen, deren Herstellung beschrieben wurde, betrachtet und solche Ester fallen in den Rahmen dieser Erfindung.

Pharmazeutische Dosisformen.

Die folgenden Beispiele betreffen einige der pharmazeutischen Dosisformen, in denen die Antibiotika verwendet werden können. Die Formierungen, ausgenommen die äußerliche Verabreichung, sind für die Verabreichung von etwa 5 - 50 mg Antibiotikum per Kilogramm Körpergewicht per Tag bestimmt. Es ist natürlich

- 5ί-

109842/0495

beabsichtigt, daß die Medikamente in unterteilten Dosen zweibis achtmal in einer Zeitspanne von 2k h gegeben werden.

Die Formierungen für äußerliche Verabreichung werden im allgemeinen auf den infizierten Bereich zwei- bis viermal täglich aufgebracht.

Bei der Anwendung der unten angeführten Formierungen hängt die Dosis des gegebenen Antibiotikums und die Anzahl der Verabreichungen im großen Maße von dem Stadium und der Ernsthaftigkeit der Infektion, der Art der Infektion und den individuellen Eigenschaften der zu behandelnden Tierart ab.

Beispiel 13: Kapseln.

Antibiotikum W847 Komplex 250,00 mg

Lactose 2*t8,75 mg

Magnesiumstearat ' 1,25 mg

500,00 mg

Herstellung:

1. Man mischt den Antibiotikum ¥8^7 Komplex und die Lactose,

2. Man setzt das Magnesiumstearat zu und mischt.

3. Man füllt die Kapseln.

Beispiel lh: Oralsuspension:

-5t-

1Q9842/0495

25,0	g	•	β
9,5	g	•	£
2,5	g	g
25,0	g	g
q.s	■1
q.s
0,9
0,2
i#o
500,0
1000,0

Antibiotikum W8^7A Magnesium-Aluminium-Silikat Natriumcarboxymethylzellulose, USP Natriumcitrat, USP Geschmackstoff

Farbstoff

Methylparaben, USP Propylparaben, USP Polysorbat 80, USP Sorbitlösung, USP

Wasser q.s.

Herstellung:

1. Man erhitzt 200 ml Wasser zum Sieden und löst in diesem eine Hälfte des Parabens. Man kühlt auf etwa 70⁰C ab und vermischt mit dem Polysorbat 80. Man gießt in das Silikat und rührt bis eine gleichmäßig glatte Suspension entstanden ist, welche die Vormischung 1 darstellt.

2. Man erhitzt zusätzlich 200 ml Wasser zum Sieden und löst in diesem das verbliebene Paraben. Man dispergiert die Carboxymethylzellulose mit diesem bis ein glattes Gel entsteht. Man vermischt mit der Sorbitlösung und löst dann das Natriumcitratj wodurch man die Vormischung 2 erhält.

3. Man fügt die Vormischung 2 langsam der Vormischung 1 unter konstantem Rühren zu. Die sich ergebende Mischung wird auf 25°C gekühlt. Man setzt das Antibiotikum We^Ajden Geschmackstoff und den Farbstoff zu und mischt durch. Man fugt eine

109842/0495

ausreichende Menge an Wasser zu,um ein Gesamtvolumen von 1000 ml zu erhalten.

Beispiel 15: Creme äußerlich:

Antibiotikum W847B 10 g

Stearinsäure 200 g

Sorbitanmonostearat 104 g

Sorbitanraonooleat 20 g

Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat 56 g

Wasser q.s. 1000 g

Herstellung:

1. Die Stearinsäure, das Sorbitanmonostearat, Sorbitanmonooleat und Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat werden auf 65⁰C erhitzt, wodurch man eine Vormischung 1 erhält.

2. Man erhitzt etwa 90$ des erforderlichen Wassers auf 7O⁰C und fügt es dann der Vormischung 1 zu und mischt zur Bildung der Cremegrundlage.

3. Das Antibiotikum W847B wird mit etwa 10% des Wassers aufgeschlämmt, durch eine Kolloidmühle hindurchgeflihrt und dann die gemahlene Aufschlämmung der geschmolzenen Cremgrundlage zugesetzt, durchgemischt und abkühlen gelassen.

Beispiel l6: Salbe äußerlich:

- 5f-

1Ü9842/0495

Antibiotikum Petrolatum

Herstellung:

1. Man schmilzt das Petrolatum.

2. Man schlämmt das Antibiotikum W847C. mit etwa 10% des Petrolatums auf und führt durch eine Kolloidmühle hindurch.

3. Man mischt die gemahlene Aufschlämmung mit dem verbliebenen des geschmolzenen Petrolatums und läßt abkühlen.

Beispiel 17: Losung für parenterale Verabreichung:

Antibiotikum W847A Tartrat 250 mg/Phiole

Zitronensäure ~1 di η η *** mg/Phiole

Dinatriumphosphat J Puffer ' mg/Phiole

Steriles destilliertes Wasser . 5,0 mg/Phiole

Herstellung:

1. Man mischt das sterile Antibiotikum W8^7A-Tartrat mit sterilem Citrat/Phosphat-Puffer aseptisch.

2. Man füllt in sterile Phiolen.

3. Man setzt Wasser zu und schüttelt gut unmittelbar vor Gebrauch.

1139842/04

Beispiel 18: Suspension für parenterale Verabreichung:

Antibiotikum W8W₂ 250 mg/Phiole

Natriumcarboxymethylzellulose 3 mg/Phiole

Polysorbat 80, USP 1 mg/Phiole

Methylparaben 3,6 mg/Phiole

Propylparaben 0,k mg/Phiole

Wasser q.s. 2,0 ml/Phiole

Herstellung:

1. Man stellt aus den oben angegebenen Mengen an Natriumcarboxymethylzellulose, Polysorbat 80, Methylparaben und Propylparaben eine Lösung her und autoclavisiert die Lösung .

2. Man schlämmt steriles Antibiotikum We^-Cg aseptisch mit einem Teil des obigen Trägers auf und führt durch eine Kolloidmühle.

3. Man mischt die gemahlene Aufschlämmung mit dem verbliebenen Träger.

k. Man füllt in sterile Phiolen.

Unter Bezugnahme auf die obigen Beispiele 13 bis 18 wird bemerkt, daß die antibiotischen Bestandteile durch einen anderen antibiotischen Komplex, eine andere antibiotische Fraktion oder Mischung von antibiotischen Fraktionen gemäß der Erfindung in freier Form oder in Form von Derivaten, wie Estern

- 64 -

109842/0495

oder Salzen, ersetzt werden kann, ausgenommen, daß parenterale Lösungen, wie in Beispiel 17» gewünschtenfalls den antibiotischen Komplex, Fraktion oder Mischung von Fraktionen in Form eines Säureadditionssalzes enthalten.

109842/0498

Claims (45)

Patentansprüche :

1. Verfahren zur Herstellung von Antibiotika, die zu einem als W847 Komplex bezeichneten Antibiotikum—Komplex gehören, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus der Art Micromonospora sp. W847 bebrütet wirdjbis zumindest eine Verbindung mit wesentlicher antibiotischer Aktivität gebildet wurde.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus in einem wässerigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen bebrütet wird,

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bebrütung unter submersen aeroben Bedingungen durchgeführt wird.

k. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Micromonospora sp. ¥847 (NRRL 3274) oder eine W847-Komplex-bildende Mutante oder Variante davon eingesetzt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Micromonospora sp. W847 (NRRL 3275) oder eine W847-Komplex-bildende Mutante oder Variante davon eingesetzt wird.

- 631,-

109842/0495

6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus bei einer Temperatur von etwa 22 40⁰C,vorzugsweise 28 - 37°C, und einem pH-Wert von etwa 7,0 - 8,5, vorzugsweise von 7,2 - 8,2, bebrütet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch ge- * kennzeichnet, daß ein antibiotisches, aktives Produkt (Antibiotikum), das zumindest eine antibiotische, aktive Verbindung enthält, gewonnen wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibiotikum in freier Form gewonnen wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibiotikum in Form eines funktioneilen Derivates gewonnen wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat ein Ester ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat ein Salz ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Salz ein Säureadditionssalz ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß zur Gewinnung des Antibiotikum W8^7 Komplexes oder einer Fraktion oder Fraktionen davon die Brühe alkalisch gemacht und mit einem mit Wasser nicht

109842/0495

mischbaren Lösungsmittel extrahiert wird und aus dem Extrakt der Antibiotikum ¥847 Komplex oder eine Fraktion oder Fraktionen davon isoliert werden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das zuerst erhaltene antibiotische, aktive Produkt in Fraktionen zerlegt und zumindest eine solche Fraktion isoliert wird.

13. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die isolierte Fraktion Antibiotikum W847 Fraktion A ist.

16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die isolierte Fraktion Antibiotikum W847 Fraktion B ist.

17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die isolierte Fraktion Antibiotikum W847 Fraktion C. ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die isolierte Fraktion Antibiotikum W847 Fraktion C„ ist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Zerlegung durch Verfahren erreicht wird, die die chromatographische Trennung umfassen.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Zerlegung durch Verfahren erreicht wird, die die Lösungsmittelextraktion umfassen.

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21. Verfahren zur Herstellung von Antibiotika, die zu den als ¥847 Komplex bezeichneten Antibiotikum-Komplex gehören, wie es im wesentlichen beschrieben wurde, insbe-» sondere in den Beispielen 1 bis 12.

22. Antibiotisch wirksames Produkt, welches eine nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis. 21 erhältliche antibiotisch wirksame Verbindung, Fraktion oder Komplex ist oder enthält oder in einer solchen enthalten ist.

23* Antibiotikum-Komplex der als Antibiotikum W847 Komplex bezeichnet ist und alle Fraktionen, welche durch Zerlegung desselben erhalten werden<

24. Antibiotikum ¥847 Fraktion A.

25. Antibiotikum ¥847 Fraktion B.

26. Antibiotikum ¥847 Fraktion C₁.

27. Antibiotikum ¥847 Fraktion C„.

28. Mischung der Antibiotikum ¥847 Fraktionen C₁ und C₂, die als Antibiotikum ¥847-C Komplex bezeichnet wird.

29. Salze und Ester der antibiotisch wirksamen Produkte nach den Ansprüchen 23 bis 28.

30. Hydrochloride der Produkte gemäß den Ansprüchen 23 bis

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XtS

31. Tartrate der Produkte gemäß den Ansprüchen 23 bis 28.

32. Antibiotikum W8^7-C₂-Hydrochlorid.

33. Antibiotikum W847-A-Hydroehlorid. 3^.

Antibiotikum ¥847-A-Tartrat.

35. Antibiotisch wirksames Produkt, welches in seiner chemischen Struktur mit einem, durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 erhaltenen Produkt oder mit einer, in einem so erhaltenen Produkt enthaltenen antibiotisch wirksamen Verbindung oder Fraktion identisch ist oder ein identisches antibiotisch wirksames Produkt, Verbindung oder Fraktion enthält.

36. Verfahren zur Herstellung einer antibiotisch wirksamen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eine Fraktion des Antibiotikum W847 Komplexes in freier Form.oder in Form eines Derivates,insbesondere eines Esters oder Salzes, in eine für die therapeutische Verabreichung geeignete Form gebracht wird.

37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger vermischt wird.

38. Antibiotisch wirksame Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest eine Fraktion des Antibiotikum W847 Komplexes in freier Form oder in Form eines Derivates, insbesondere eines Esters oder Salzes, enthält.

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39. Zusammensetzung nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen geeigneten, pharmazeutischen Träger enthält.

40. Zusammensetzung gemäß Anspruch 39 wie sie im wesentlichen beschrieben wurde, insbesondere in den Beispielen 13 bis 18.

41. Geformte Zusammensetzung der Stoffe,wie z.B. Tabletten oder Kapseln, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest eine Fraktion des Antibiotikum ¥847 Komplexes in freier Form oder in Form eines Derivates, insbesondere eines Esters oder Salzes,enthält.

42. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 38 bis 41, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion die Antibioti kum ¥847 Fraktion A ist.

43. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 38 bis 41, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion die Antibio tikum ¥847 Fraktion B ist.

44. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 38 bis 41, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion die Antibio tikum ¥847 Fraktion C₁ ist.

45. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 38 bis 41, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion die Antibiotikum ¥847 Fraktion C₂ ist.

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