Sposób wytwarzania nowego antybiotyku zwanego megalomycyna Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego antybiotyku zwanego megalomycyna i stanowiacego mieszanine frakcji A, B, Ci i C2 o ogólnym wzorze przedstawionym na rysunku, w którym we frakcji A megalomyieyny Rx i R2 oznaczaja atom wodoru, we frakcji B megalomy- cyny Rx oznacza atom wodoru, R2 oznacza gru¬ pe acetylowa, we frakcji Cx megalomycyny Rx i R2 oznaczaja grupe acetylowa, a we frakcji C2 me¬ galomycyny Ri oznacza grupe acetylowa, R2 ozna¬ cza grupe propiionylowa oraz jej estrów i soli. No¬ wy antybiotyk wytwarza sie z hodowli dotychczas nie opisanych galtunków z rodzaju Mileriomoooispo- ra, rzedu Actfiinomycetales.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze no¬ wy mikroorganizm gatunku Microspora megalo¬ micea oznaczony indywidualnie numerami NRRL 3274 lub NRRL 3275 infcubuje sie w wodnej po¬ zywce w warunkach tlenowych az do uzyskania w pozywce zadanej aktywnosci antybiotyku, po czym megalomycyne lub oo najmniej jedna frak¬ cje A, B, Ci lub C2 megalomycyny wydziela sie i wyosabnia sama lub w postaci soli lub estru.Dotychczas nie opasane gatunki Micromonospo¬ ra uzyte po raz pierwszy do produkcji nowego antybiotyku, której dotyczy niniejszy wynalazek, zostaly wyodrebnione z gleby pobranej bezposre¬ dnio przez jednego z wspóltwórców wynalazku i nazwano je Mtoomonospora megalomicea. Wy¬ odrebniono dwa szczepy Micromonospora megalo- 10 irtfcea i zastosowano je w procesie bedacym przed¬ miotem wynalazku. Szczepy te sa naturalnymi barwnymi odmianami i mozna je odróznic pod mikroskopem na podstawie róznic w szybkosci pojawiania sie zarodników. Kultury tych dwóch szczepów zostaly zdeponowane i sa one przecho¬ wywane przez Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych, Northern Utilization Research and Deyelopment Biwision, Peoria, Illinois, gdzie zo¬ staly oznaczone symbolami NRRL 3274 i NRRL 3275. Szczepy te dostepne sa na zadanie. W dal¬ szej czesci opisu sa one oznaczone indywidualnie jako Micromonospora megalomicea (NRRL 3274) i Micromonospora megalomicea (NRRL 3275) 15 i zbiorczo jako Micromonospora megatamicea. Je¬ zeli w niniejszym opisie przytoczone beda dana dla Micromonospora megalomicea bez wskazania symbolu indywidualnego szczepu, to beda one do¬ tyczyly obu wyzej wymienionych szczepów.Makroskopowa ocena kultury 28 dniowej wyka¬ zala, ze w temperaturze 24^26°C: Micromonospo¬ ra megalomicea (NRRL 3274) na agarze sacharo- zowym wg. Czapka rosnie dobrze, nie wykazujac napowietrznej grzybni i tworzac rozrosniete i po¬ faldowane kolonie o miekkiej, wiOjgotnej i nie- woskowej konsystencji, produkujacej niezdolny do dyfuzji pigment. Barwa powierzchni kultury, opi¬ sana zgodnie z „Descriptive Color Mane Dictiona- ry", Taylor, Knoche i Granvillie, wydanej przez Container Corporation of America, 1950 (U.S.A.), 20 25 30 793953 79395 4 a takze numerem barwy wg. „Color Harmony Manual" Wyd. 4, 1958, wydany przez te sama fir¬ me, jest pomaranczowa — o symbolu m4 — la.Kolor ten odipowialda, lulb jest zblizony do ciemno- pomaranczowego 50, zigodnie z the National Bure- au of Standairds Circular Nr 553, Listopad 1, 1955, USA (wszystkie oznaczenia barwy kultur stoso¬ wane w dalszym ciagu opieraja sie na tym sa¬ mym systemie symboli barw).Mikroskopowe badania omawianej kultury wy¬ kazuja regularna grzybnie zlozona z dlugich roz¬ galezionych wlókien o srednicy wynoszacej w przy¬ blizeniu 0^6 U. Zarodniki wystepuja rzadko.Makroskopowe badania 28-dniowej hodowli Mi¬ cromonospora Megalomicea (NRRL 3275) rosna¬ cej na takim samym podlozu i w tych samych warunkach, jak opisano wyzej, wykazuja dobry wzrost. Ogólna charakterystyka, z wyjatkiem bar¬ wy, jest taka saina, jak poprzedniego szczepu.Barwa powierzchni hodowli jest czarna. Pod mi¬ kroskopem widoczna jest regularna grzybnia zlo¬ zona z dlugich rozgalezionych wlókien o srednicy wynoszacej w przyblizeniu 0,6 ^. Kultura tego szczepu wykazuje bardzo liczne zarodniki, produ¬ kowane przez grzybnie w sposób nieregularny.Zarodniki maja (ksztalt od jajowatego do okragle¬ go, srednice 0,7—1,0 \i i barwe ciemnobrazowa w stanie dojrzalym (w warunkach tlenowych).W dalszym ciagu podano charakterystyke wzro- situ hodawli Micromonospora megalomicea na róz¬ nych (pozywkach.Tabela 1 1 Piozywfca Agar z glikoza i asparagina Agar Bennefa Agar Emerson^ Agar z pasta 'pomidorowa i maka 1 owsiana Agar z glikoza i wyciagiem 'drozdzowym Plasterki ziemniaków Agar z azotem i sacharoza i(agar Czapka) Agar z tyrozyna obserwacje po 2, 7 i 14 dniach (Gondon, Smith, J. Bact 69, 147) Charakterystyka kultur Micromonospora megalomicea Bo$nie slabo Rosnie slabo Rosnie slaJbo Rosnie slabo Rosnie dobrze, kultura rozwinieta, drobno sfal- dowana Rosnie slabo Rosnie dobrze, kultura rozwinieta sfaldowana Rosnie dobrze, krysztaly rozpuszczaja sie slabo pod kultura; po 3 tygo¬ dniach produkowany byl brazowy dyfundujacy pi¬ gment; zdolny do dyfuzji pigment nie jest czarny i nie posiada barwy ty¬ powej dla pozytywnej reakcji z tyrozyna, jak wytwarzany przez Strep- tomyces W tabeli 1 podano charakterystyke wzrostu Mi¬ cromonospora megalomicea na kilku sposród naj- powszechniej stosowanych pozywkach. Obserwacje hodowli dokonywano po uplywie 14 dni, tempe¬ ratura hodowli, o ile nie podano inaczej, wynosila 24^-26°C.Micromonospora megalomicea szczególnie dobrze rosnie w temperaturze 26—37°C, natomiast w tem¬ peraturze okolo 50°C brak rzeczywistego wzrostu.Jest idrobnoustrojem Itlenowoowyim i nie redukuje azotanu do azotynu. Gatunek ten nie rozpuszcza zelatyny, nie hydrolizuje mleka i nie rozklada ce¬ lulozy. Nie prodkuje zdolnego do dyfuzji pigmentu na agarze z peptonem i zelazem. Micromonospora megalorriicea dobrze rosnie na pozywce weglowo¬ danowej, zawierajacej 0,5% wyciagu drozdzowego i 1 procent 1-arabinozy, glikozy, skrobi i sacha¬ rozy, ale dosc dobrze wzrasta na pozywce, której zródlem weglowodanu jest dodatek l°/o ksylozy.Slabo rosnie na takich pozywkach, w którym wy¬ lacznym zródlem wegOowoidanów jest lfyo d—ara- binozy, celulozy, dulcytu, galaktozy, glicerolu, lak¬ tozy, lewulozy, melibiozy, melizytozy, ramnozy, ri- bozy, inozytu lub mamnitoUu.Dalsza cecha Micromonosipory megalomicea jest jej zdolnosc do wykorzystywania zródel azotu.Charakterystyke wzrostu kultury na typowych po¬ zywkach, zawierajacych azot oraz l°/o glikozy, po 14 dniowej hodowli w temperaturach 24—26°C, po¬ dano w tabeli 2.Tabela 2 Wykorzystanie zródel azotu Zródlo azotu 0,5*/o ekstrakt drozdzowy Drfico l*/o NZ aminy Typ A * l*/o asparaginy l°/o kwasu glutaminowego l*/o azotanu amonowego Charakterystyka [rozwoju Rosnie dobrze, kultu¬ ra powiekszona, dro¬ bno pofaldowana Rosnie dosc dobrze Rosnie slabo Rosnie slabo Rosnie slabo | *) Produkowana przez Sheffield Chemical Com¬ pany, Norwich, New Jork.Nowy antybiotyk otrzymuje sie przez wykorzy¬ stanie Micromonospora megalomicea NRRL 3274 lulb NRRL 3275, wykazujacych taka sama aktyw¬ nosc biologiczna polegajaca na produkowaniu ta¬ kiej samej grupy antybiotyków. Niniejszy wyna¬ lazek nie ogranicza i nie wyklucza innych zasto¬ sowan Micromonospora megalomicea. Micromono¬ spora megalomicea produkuje, szczególnie przy za¬ stosowaniu kontrolowanej techniki fermentacyjnej -miszanine antybiotyków zwanych megalomycyna.W celu otrzymania odpowiedniego inokulum dla dalszej fermentacji, Micromonospora megalomicea najlepiej hoduje sie w warunkach glebinowej fer¬ mentacji przy dostepie tlenu i przy ciaglym mie¬ szaniu, w temperaturze okolo 22°—37°C w ciagu 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 605 79395 6 okolo dwóch do okolo czterech dni. Stwierdzono, ze najlepiej hodowle prowadzi sie w temperaturze 35°C w ciagu trzech dni. W pierwszym stadium kielkowania stosuje sie podloze wodne zawiera¬ jace dostateczne ilosci skladników stanowiacych zródla wegla i azotu, przyswajalne przez te orga- nuzmy. Pozadanym jest, aby odczyn podloza do¬ prowadzic do wartosci pH okolo 7,5 przed podda¬ niem go procesowi sterylizacji w autoklawie, przez dodanie zasady na przyklad wodorotlenku sodo¬ wego.W stadium kielkowania mozna stosowac nizej wymienione podloza. Podloze I. Bacto — wyciag z miesa wolowego (Difco) 3,0 g; Bacto — trypton na 24,0 g; Bacto — wyciag drozdzowy (Difco) 5,0 g; Ca003 2,0 g; woda wodociagowa 1000 ml; Podloze II. Bacto — wyciag drozdzowy (Difco) 5,0 g; wyciag z ryb 1,0 g; wyciag namokowy ku¬ kurydziany 1,0 g; dekstroza 20,0 g; CaC03 1,0 g; woda wodociagowa 1000 ml.Pozadanym jest, aby drugie stadium kielkowania (tj. stadium inokulacyjne) bylo wykorzystywane przede wszystkim do wzbogacenia inokulum przed fermentacja i odzyskaniem antybiotyków. Wyko¬ rzystujac opisane wyzej podloza, swieze podloze moze byc zaszczepione kultura przygotowana wstepnie (5f/« wag/obj.) i utrzymywane w tempe¬ raturze okolo 22—37°C w ciagu okolo dwóch do czterech dni.. Stwierdzono, ze najlepiej prowadzi sie hodowle w temperaturze 28°C, w ciagu trzech dni.W celu wyprodukowania megalomycyny (5°/o wag/obj.) inokulum pobranego ze stadium inoku- lacyjnego dodaje sie do wodnego podloza fermen¬ tacyjnego, które przed poddaniem go procesowi sterylizacji w autoklawie, doprowadza sie do war¬ tosci pH = 7,1—7,8. Powietrze wprowadza sie do podloza, w ilosci okolo 3—6 litrów na minute.Proces fermentacji prowadzi sie w temperaturze okolo 22°C do 37°C w ciagu okolo dwóch do 6 dni, mieszajac.W przypadku stosowania podloza III, opisanego nizej, stwierdzono, ze maksymalna wydajnosc me¬ galomycyny uzyskuje sie w procesie fermentacji prowadzonym w ciagu 66 godzin, w temperaturze 31°C, przy natezeniu przeplywu powietrza 4,5 li¬ trów na minute i przy mieszaniu mieszadlem ó 250 obrotach na minute. Dane te odnosza sie dc 14 litrowego aparatu fermentacyjnego zawieraja¬ cego 10 litrów podloza. W podanych warunkach uzyskuje sie wydajnosc antybiotyku wynoszaca 300—800 ^g/ml.Podlozami stosowanymi w stadium fermentacyj¬ nym moga byc, na przyklad Podloze III. sacharoza 30,0 g; dekstroza 2,5 g; tryptikoza 17,0 g, NaNOs 3,0 g; K2HP04 3,5 g; MgS04.7H20 0,5 g; KC1 0,5 g; PeS04 0,01 g; NaCl 5,0 g; woda wo¬ dociagowa 1000 ml.Podloze IV. Bacto — wyciag drozdzowy (Difco) 5,0 g; dekstroza 10,0 g; skrobia 20,0 g; produkt hydrolizy kazeiny 5,0 g; CaCOs 4,0 g; woda wo¬ dociagowa 1000 ml.Podloze V. sacharoza 20,0 g; pepton 5,0 g; pro¬ dukt hydrolizy proteiny z nasion bawelny 5,0 g; CaCOs 4,0 g; woda wodociagowa 1000 ml; Podlo¬ ze VI — sacharoza 30,0 g; pepton 8,0 g; NaN03 3,0 g; K2HP04 1 g; MigS04*7HiO 0,5 g; FeS04 0,01 g; woda wodociagowa 1000 mL Podloze VII — 5 tryptikaza 17 g; Nad 5,0 g, K2HP04 2,5 g;. de¬ kstroza 2,5 g; wyciag miesny Czapek — Dox 35,0 g; woda wodociagowa 1000 mL W celu otrzymania megalomycyny z brzeczki postepuje sie w sposób nastepujacy. Odczyn io brzeczki doprowadza sie do wartosci pH = 9,5 za pomoca zasady, na przyklad wodorotlenku so¬ dowego. Nastepnie calosc ekstrahuje sie odpowie¬ dnim rozpuszczalnikiem organicznym nierozpusz¬ czalnym w wodzie, uzytym w stosunku okolo 15 dwóch objetosci na jedna objetosc brzeczkL Jako odpowiedni rozpuszczalnik organiczny stosuje sie na przyklad octan etylu, chlorek metylenu, octan butylu, chloroform, butanol i inne. Ekstrakt zate- za sie pod obnizonym cisnieniem do malej objeto- » sci, przy czym stezenie wzrasta w przyblizeniu 100-krotnie i oczyszcza sie na kolumnie chromato- ficznej, przy uzyciu, na przyklad Sephadexu, LH 20 lub alkilowego dekstranu z wiazaniami po¬ przecznymi (Pharmacia Hne Chemicafls, Inc. Upp- V sala, Szwecja) zawieszonego w okolo 95f/t etanolu.Kolumne eluuje sie roztworem wodnym etanolu, a uzyskiwane frakcje laczy sie zgodnie z ich ak¬ tywnoscia antybiotyczna wykazywana w testach plytkowo4cratzkowych w stosunku do Staphylococ- 3t ouis aureus (ATCC 6538P), odparowuje do sucha, rozpuszcza sie w malych ilosciach eteru etylowe¬ go lub acetonu i wprowadza do duzej objetosci eteru naftowego o temperaturze wrzenia 30—60°C.Nastepnie mieszanine chlodzi sie w lazni miesza- 35 nina oziebiajaca (suchy lód i aceton) do tempera¬ tury okolo -h50°C i pozostawia sie w tej tempera¬ turze w ciagu 20 minut. Po uplywie tego czasu ogrzewa sie ona samorzutnie do temperatury oto¬ czenia. Ciecz macierzysta oddziela sie od pozosta- 4° losci oleistej za pomoca dekantacji i odparowuje do sucha. Otrzymany w ten sposób produkt wy¬ kazuje aktywnosc antybiotyczna okolo 232 /ig/mg (wedlug testu biologicznego opisanego nizej).Metoda oceny jest metoda cylindryczna, w któ- 45 rej szczepem testowym jest Sarcina lutea (ATCC 9341). Warunki oceny sa podobne, jak w meto¬ dzie oceny cyOindrowo-plyitkowej opisanej dla ery¬ tromycyny (Grove and RandU, 1955, Med. Encyclo- pedia, Inc, N. J.). Aktywnoscia antybiotyczna me- 50 galomycyny wyrazona w pg jest ilosc produktu odpowiadajaca strefie zahamowania o srednicy 20,8±0,5 mm, w warunkach, w jakach prowadzi sie badanie. Megalomycyne wytwarza sie w sposób opisany ponizej. 55 Podloze I znajdujace sie w kolbach fermentacyj¬ nych zaszczepia sie hodowla (w przyblizeniu 5f/t wag/obj.) Micromonospora megalomicea. Kolby umieszcza sie na rotacyjnej wytrzasarce (okolo 280 wstrzasów na minute) i inkubuje w temperaturze 60 28°C w ciagu 78 godzin. Po uplywie tego czasu podloze fermentacyjne (na przyklad podloze VII) znajdujace sie w aparatach fermentacyjnych, po doprowadzeniu jego odczynu do pH = 7,15—7,25 zaszczepia sie w przyblizeniu 5% 65 manego poprzednio inokulum* Podloze fermenta-79395 cyjne miesza sie z szybkoscia okolo 500 obrotów na minute w temperaturze 31°C napowietrzajac w przeplywie brzeczka w ilosci okolo 0,5 1 na 1 minute. Szybkosc mieszania zwieksza sie do 600 obrotów na minute po uplywie 24 godzin i do 700 obrotów na minute po uplywie 48 godzin. Fermen¬ tacje przerywa sie po uplywie 69 godzin.Brzeczke zebrana ze wszystkich aparatów fer¬ mentacyjnych poddaje sie ekstrakcji i po dalszym przerobie otrzymuje sie z niej megalomycyne w sposób opisany ndzej. Odczyn pH zebranej par¬ tii brzeczki doprowadza sie do wartosci okolo 9,25 za pomoca wodnego roztworu wodorotlenku sodo¬ wego (50*/t) i ekstrahuje aie ja za pomoca okolo 2 objetosci octanu etyiu. Ekstrakt zatejza sie do 1—2V§ poczatkowej objetosci.Koncentrat octanu etylowego ekstrahuje sie na¬ stepnie co najmniej dwukrotnie 1/2 objetosci kwa- 10 15 su solnego (okolo 0,14 n). Ekstrakcje motna rów¬ niez przeprowadzic za pomoca Innych kwasów mi¬ neralnych o tej samej normalnosci Polaczone eks¬ trakty kwasowe lekko aMcalizuje sie 5°/t roztwo¬ rem wodnym wodorotlenku sodowego (do pH okolo 8,5 do 9,0) i ekstrahuje sie co najmniej dwa razy w przyblizeniu równymi obdetoscfemi octanu etylu. Polaczone ekstrakty octanu etylowego od¬ parowuje sie do sucha pod obnizonym cisnieniem otrzymujac megalomycyne. Otrzymany produkt wykazuje w tym stadium aktywnosc antybiotycz- na 450—550 /*g/mg wedlug testu nizej opisanego.Charakterystyke megalomycyny przedstawiono ponizej. Megalomycyne porównuje sie za pomoca chromatografii bibulowej z róznymi antybiotyka¬ mi, w tym z kilkoma makrolldami, w róznych ukladach rozpuszczalnikowych, jak to pokazano nizej w tabeli 3.Tabela 3 Systemy chromatografii bibulowej ¦a s i I s g ti s 1 80V# metanol + 3*/t chlorku sodowego (wag./ /obj.) 1:1 zstepujac *) Propanol : pirydyna : kwas octowy : woda (6:4:1:3) wstepujac (oW^obj.J Butanol : kwas octowy woda (4:1:5) wstepujac 80°/t fenol wstepujac (objyotaj.) 0,90 0,93 0,78 0,86 0,90 0,93 0,78 0,86 0,90 0,93 0,78 0,86 0,90 0,93 0,78 0,86 0,90 0,93 0,78 0,86 0,63 0,30 0,91 0,85 0,81 0,18 0,00 0,17 0,84 0,91 0,92 Ó793 0,74 0,75 0,46 0,87 0,59 0,26 0,00 0,50 0,57 0,40 0,00 0,00 0,72 0,70 0,38 0,83 *) Bibula buforowana 0,95 M Na*S04 + 0,05 M NaHSÓ4 Megalomycyna przemieszcza sie jako pojedyn¬ cza plama i rózni sie od wszystkich innych anty¬ biotyków, z wyjatkiem badanych makrolidów (tj. magnamycyny, oleandomycyny, spiramycyny i ery¬ tromycyny).Megalomycyne mozna odróznic od znanych anty¬ biotyków makrolidowych za pomoca chromatogra¬ fii cienkowarstwowej na plytkach z silikazelem GF (Analtech Inc, WUmington, Delaware). Odpo¬ wiednie strefy wykrywa sie za pomoca dwóch ni¬ zej wymienionych metod. 1. Plytki opryskuje sie mieszanina stezonego kwasu siarkowego i metanolu (1:1 óbj./obj.) i roz- 55 60 65 wija ogrzewajac w temperaturze 106°C w ciagu kilku minut. Strefy substancji organicznej poja¬ wiaja sie w postaci barwnych plam na bialym tle. 2. Plytka styka sie z warstwa agarowa z "po¬ siana na niej kultura S. aureus. Pomiedzy zaka¬ zona warstwe agarowa i plytka umieszcza sie ar¬ kusz bibuly firmy Whatman Nr 1, tak aby silika- zel nie dotykal bezposrednio do agaru. Bibule i sdlikazel usuwa sie po 15 minutach. Plytke aga- irowa inkubuje sie w temperaturze 37°C w ciagu nocy i ocenia strefe zahamowania wzrostu bakte¬ rii. Wyniki tych badan umieszczono w tabeli '4.7939S Tabela 4 19 Uklad * : Ohloroiform : metanol : lWt roztwór wodny amo¬ niaku 2:1:1 (obj7obj.) Butanol : kwas octowy woda 3:1:1 (obj7obj.) Antybiotyk 2 megalomycyna cfleandomycyna erytromycyna magnamycyna megalomycyna erytromycyna spiramycyna oleandomycyna magnamycyna Barwa przy oprysku kwasem siarkowym Hf 3 niebiesko-czarna 0,98 zielona 0,9$ zólto, brunatna 0,98 niebiesko-piiipurowa 0,98 czerwono-purpurowa 0,13 zielono-brazowa 0,26 purpurowa, szara 0,06; 0,30 zielona 0,f9 purpurowa, czerwono- -purpurowa 0,40; 0,47 Rf strefy zahamowanej 4 ~ 0,96 0,96 0,98 0,98 043 0,26 0,06 0,19 0,40 Wlasciwosci fizyczne, chemiczne i biologiczne megalomycyny i jej wydzielonych frakcji podano nizej, oraz porównano ich wlasciwosci z wlasciwo¬ sciami znanych makrotidów, opisanych w litera¬ turze, co pozwala na odróznienie megalomycyriy i jej poszczególnych frakcji od znanych antybio¬ tyków makrolidówych.Megalomycyna daje dodatnie reakcje barwne z ninhydryna, skrobia z jodkiem potasowym i w reakcji biuretowej oraz negatywne reakcje barwne z chlorkiem cynawym i w testach Moli- sha i Sakaguchi. Megalomycyna jest zupelnie przezroczysta w swietle promieniowania nadfiole¬ towego. Aktywnosc megalomycyny nie zmienia sie w widoczny sposób w ciagu trzydziestu minut utrzymywania jej w temperaturze 100°C w zakre¬ sie pH = 2—ilO (stabilnosc badano przez rozpusz¬ czenie antybiotyku w etanolu, rozcienczenie roz¬ tworem buforowym i testami plytkowymi na S. aureus i Escherichia coli). Megalomycyna nie wy¬ kazuje obnizenia aktywnosci pod wplywem tryp- syny, chymotrypsyny, pepsyny, a-amylazy lub pe- nicyMnazy w roztworach buforowanych (dowolne pH dla kazdego enzymu) w temperaturze 37°C w ciagu do 24 godzin. Jest ona rozpuszczalna w wiekszosci polarnych, organicznych rozpuszczal¬ ników, takich jak octan etylu, metanol, etanol i aceton.Ponizej przedstawiono wydzielanie poszczegól¬ nych frakcji megalomycyny. Za pomoca chroma¬ tografii denkowarstwowej na silkazelu w ukla¬ dzie rozpuszczalników chloroform: metanol (60:40 ob]7obj.) i nastepnie zetkniecia plytek silikazelo- wych z agarem zasianym Sarcina lutea wykaza¬ no, ze w sklad megalomycyny wchodza co naj¬ mniej cztery frakcje obdarzone aktywnoscia an- tybiotyczna, które w dalszym ciagu zidentyfiko¬ wane zostaly jako frakcje A, B, Cb i C2. Frakcje te, w ukladzie rozpuszczalników opisanym wyzej, wykazuja nastepujace wartosci Hf: 0,19 — frak¬ cja A; frakcja — B; 0,52 — frakcja Cx i 0,65 — frakcja C2.Rozdzielenie poszczególnych frakcji uzyskuje sie przez rozpuszczenie megalomycyny w acetonie wy- 25 30 35 40 45 50 55 65 mieszanym z kwasem krzemowym, odparowanie acetonu i wprowadzenie suchej mieszaniny na wierzcholek kolumny chromatograficznej wypel¬ nionej kwasem krzemowym i nastepnie jej eluo- wanie mieszanina: chloroformu z metanolem (60: :40 obj7obj.). Poszczególne frakcje zbiera sie, kontrolujac prace kolumny za pomoca testów plytkowych przeprowadzanych dla kazdej frakcji (przeciwko S. aureus i E. coli). Aktywne frakcje bada sie' metoda chromatografii denkowarstwo¬ wej na silikazelu rozdzielajac je w ciagu okolo 1,5 godziny w takim samym ukladzie rozpuszczal¬ ników, jaki stosowano w kolumnie. Cechy cha¬ rakterystyczne frakcji antybiotyków oznacza sie za pomoca dwóch metod opisanych poprzeoWo.Frakcje laczy sie nastepnie zgodnie z ich charak¬ terystyka chromatograficzna i zatejza.Wedlug wynalazku frakcje C2 wydziela sie w postaci chlorowodprku jako proszek koloru bia¬ lego rozpuszczajac zebrane aktywne frakcje wme¬ tanolu i wytracajac okolo 10 objetosciami eteru etylowego. Frakcja otrzymanego w tym stadium chlorowodorku megalomycyny C2 wykazuje ak¬ tywnosc 1100 fsgkag.W czasie rozdzialu chromatograficznego zasade megalomycyny C2 przeksztalca sie w jej chloro¬ wodorek za pomoca malych ilosci kwasu solnego znajdujacego sie w rozpuszczalniku. Chlorowodo¬ rek ten, jak nalezalo oczekiwac, nie wykazuje znaczniejszej rozpuszczalnosci w eterze etylowym i wytraca sie po jego dodaniu.Wolna zasade megalomycyny Cj otrzymuje sie, dodajac rozcienczony roztwór alkaliczny, na przy¬ klad 0,1 n NaOH, do wodnego roztworu jej chlo¬ rowodorku do uzyskania pH okolo 8,5—9,5 i wy¬ dzielajac zasade przez odsaczenie z zawiesiny wod¬ nej.Dalsze frakcje zebrane razem z kolumny po od¬ parowaniu do sucha daja frakcje Ci megalomy¬ cyny w postaci proszku o barwie bialej. Otrzy¬ mana frakcja Cx megalomycyny wykazuje aktyw¬ nosc okolo 860 /jgtag {wejdlug opisanego poprzed¬ nio testu cyiHndrowego).Stosujac technike chromatografowania opisana79395 11 wyzej i uklad rozpuszczalników chloroform/meta¬ nol (60:40 obj./obj.) wydziela sie frakcje Ci me¬ gailomycyny, która wykazuje szeroki zakres ak¬ tywnosci przeciwbakteryjnej in vitro wobec na¬ stepujacych gram dodatnich i gramujemnych drobnoustrójów: Baoilhis subtilis . ATCC 6633 Sarcina lutea ATCC 9341 Staphylococcus ,aureus ATCC6538F Pseudomonas aureginosa ATCC 12 Pozostale aktywne frakcje z kolumny wypelnio¬ nej kwaseim krzemowym laczy sie i dalszy roz¬ dzial przeprowadza sie na kalumnie chromatogra¬ ficznej wypelnionej Flordisilem (krzemian magne¬ zowy), w sposób nastepujacy: FlorML aktywowuje sie w temperaturze 100°C w ciagu 16 godzin a na¬ stepnie zawiesza sie go w heksanie i otrzymana zawiesine wlewa sie do szklanej kolumny.Do kolumny tej wprowadza sie pozostale frak¬ cje megalomycyny (po usunieciu frakcji Cr i C2) rozpuszczone w chlorku metylenu i rozwija stop- jnaiotwo dbdetoscia heksanu równa objetosci roz¬ puszczalnika utrzymywanej przez adsorbent wko- lufnnde i kolejno taka sama objetoscia eteru ety¬ lowego, octanu etylowego, a nastepnie zwieksza¬ jacymi sie ilosciami acetonu w octanie etylowym.Rozdzial kontroluje sie za pomoca testów plytko¬ wych (przeciwko S. aureus i E. coli) po rozdzie¬ leniu metoda chromatografii cienkowarstwowej w sposób poprzednio opisany.Przy wykorzystaniu tej techniki rozdziela sie frakcje A od frakcji B. Obie frakcje wydzielono w postaci bialego proszku, przez odparowanie do sucha zebranych frakcji chromatograficznych.Frakcje A i B wykazuja w tescie przeciwko S. lu¬ tea aktywnosc biologiczna odpowiednio: 145 /*g/ /mg i 71 //g/mg.Mieszanine frakcji C megalomycyny wydziela sie równiez z ekstraktu octanu etylowego, otrzy¬ manego w sposób opisany ponizej. Pozostalosc roz¬ puszcza sie w acetonie i wlewa do zimnej wody 10 15 20 25 30 40 przy energicznym mieszaniu. Zawiesine ogrzewa sie do temperatury otoczenia i saczy. Osad za¬ wiera mieszanine frakcji Ci i C2 megalomycyny i dlatego w dalszym ciagu oznacza sie ja jako frakcje C. Jest ona wolna zasada i otrzyimuje sie z niej w zwykly sposób sól np. przez miareczfco- wamie jej roztworu metanolowego za pomoca od¬ powiedniego kwasu i wytracanie soli przez doda¬ nie eteru etylowego.Po zastosowaniu opisanego sposobu otrzymania frakcji C megalomycyny, frakcje A i B ekstrahuje sie z wodnego przesaczu, ekstrakt zateza sie i chromatografuje na krzemianie magnezowym, w sposób opilsany powyzej.Ponizej podano wlasciwosci chemiczne frakcji A, B, Ci i C2 megalomycyny.Antybiotyk, który wytwarza sie sposobem we¬ dlug wynalazku, jest zaisada azotowa; kazda wiec frakcja jest zdolna do utworzenia soli z kwasami w podobny sposób, jak frakcja C. Tworzy on tak¬ ze sole z kwasami takimi, jak solny, siarkowy, fosforowy, stearynowy, proplionowy, winowy, ma¬ leinowy itp.Jak oczekiwano, otrzymane sole wykazuja rów¬ niez aktywnosc antyfoiotyczna, rózniac sie od wol¬ nych zasad zwykle pod wzgledem stopnia aktyw¬ nosci i rozpuszczalnosci.Antybiotyk, wytwarzany sposobem wedlug wy¬ nalazku ma równiez grupy hydroksylowe, a wiec jest zdolny do esforyfikacji, szczególnie z kwasami karbofcsylowymi. Przykladami odpowiednich es¬ trów sa estry kwasu octowego, propionowego, cy- klopropylokarbokfsylowego, bursztynowego, benzo¬ esowego itp. Estry te wykazuja zazwyczaj anty- biotyozna rózniaca sie od wyjsciowego antybio¬ tyku aktywnosc i rozpuszczalnosc.W tabeli 6 przedstawiono wildma wpodczerwieni wosci frakcji A, B, Ci, C2 megalomycyny.W tabeli 6 przedstawiono widma w podczerwieni poszczególnych frakcji* megalomycyny, natomiast w tabeli 7, przedstawiono spektrum przeciwbak- teryjne frakcji A, B, Ci, C2 i C megalomycyny.SkecaJeosc optyczna D25 (1% roztwór etanolowy) Temperatura topnienia pKia Równowaznik zobojetnienia Analiza elementarna: Wegiel Wodór Azot Tlen (z róznicy) Wzór empiryczny Ciezar czasteczkowy T Frakcja A —90° 255^259°C (rozklad) 9,1 442 znale¬ ziono 60,23 9,28 3,30 27,19 obli¬ czono 60,25 9,10 3,19 27,36 C44H8oN2Oi5 877,10 abela 5 Frakcja B —92° 125—135° (rozklad) * 8,8 490 znale¬ ziono 58,90 8,94 2,88 29,18 obli¬ czono 60,11 8,99 3,05 27,85 C46H82N2O16 919,14 Frakcja Cx 1 -h104° 243—246° (rozklad) 8,8 488 znale¬ ziono 60,23 8,93 2,94 27,90 obn¬ azono 59,98 8,81 2,92 28,30 C48H84N2O17 961,17 Frakcja C2 1 | —102° 146—Ili50° (rozklad) 8,6 492 znale¬ ziono 58,93 8,73 2,88 29,46 obli¬ czono 60,53 8,80 2,87 27,89 | C49H86N2Oi7 ] 975,20 | — * . ' .' ¦ ¦¦ 11 w *) Monohydrat79395 13 M Tabela 6 Frakcja A dlugosc Fali (u) 1 2,82—2,90 3,35—3,50 5,77 5,82 5,88 6,82 7,24 7,82 7,82 8,45 8,92 9,02 9,12 9,32 9,53 9,63 9,98 10,27 11,02 11,17 absorpcja 2 M—S,brd N S pomiar niepewny M—S N N sb MS, shd VS, brd VS VS VS M—S vs vs vs s M—S M—S Frakcja B dlugosc falii (u) 3 2,87 2,97 3,35—3,50 5,72 5,82 6,82 7,25 8,05 8,45 8,59 8,94 9,30 9,62 9,91 10,02' 10,29 10,84 11,08 11,20 absorpcja 4 M S-hd N S S N N S S, hrd S S S S M-^S M—S M W—M W—M Frakcja Ci dlugosc fali (u) 5 2,89 2,87 3,35—3,50 5,72 5,82 6,82 7,25 7,45 7,57 7,82 8,03 8,13 8,60 8,94 9,05 9,56 9,70 10,13 10,48 11,02 11,18 absorpcja 6 sb 'W N S W—M N N M M M S VS S M-^S S S S M—S M W-^M W-^LM Frakcja C2 dlugosc fali (u) 7 2,83 . 3,33—3,48 5,70 5,8 5,88 6,80 7,23 8,00 8,53 8,93 9,08 9,27 9,65 10,00 10,38 10,97 11,15 11,52 11,92 absorpcja 8 W—M N ' S pomiar niepewny Shd N N S S, brd S shd M—S S M—S, brd M M M W W—M Tabela 7 Drobnoustroje 1 Bacillus megatherium DA 7064 Bacillus subtlilis ATCC 6633 Diplococcus pneumondae DA 700 Diplococcus pneumonliae ATCC 10015 Diplococcus pneumoniae DA 150 Minimalne stezenie hamujace (g/ml) megalomycyny postac zasadowa megalo¬ mycyny 2 0,3 0,03 6,0 chloro¬ wodorek megalo¬ mycyny 3 0,3 0,3 6,0 frakcja A 4 0,6 0,005 1,2 0,5 2,7 frakcja B 5 1,2 0,05 1,2 0,5 2,7 frakcja Ci 6 0,3 0,03 12,0 frakcja C2 7 0,6 0,005 0,6 0,05 2,7 frakcje C 8 | 0,3 0,005 2,779395 Tabela7 ciag dalszy 15 16 1 1 Enterocoecus sp. DA 800 Enterococcus sp. DA 80* Eniteroooccus sp. DA 802 Sancima dultea ATOC 9341 Staphylooaccus aureus ATCC 12715 Sitapihylloicaooiis aureus ATCC 6538 iStapIhyllacaiocus aureus ATCC 1163il*) StapttiyHoicaoous aureus (Gray) iStaiphyOioealocus aureus DA 2001 StaipiliyHocafocus aureus DA 2003 StiaipIhyfLociaocuis aureus DA 2010 StiafphyiLolcaiocus aureus DA 2014 Staphylococcus aureus DA 2018 StaipihyHocaocus aureus DA 2031 Staphylococcus aureus DA 2033 **) Staphylococcus 1 faecalis DA 20 Staphylococcus pyogenes DA 21 Staphylococcus pyogenes DA 11 Staphylococcus pyogenes DA 12 2 0,3 0,3 0,3 0,0075 0,3 0,3 0,3 0,3 0,03 0,03 0,3 0,3 0,3 0,075 16 0,3 0,75 0,3 3 0,75 0,75 0,1 1 0,0075 - 0,75 0,03 0,075 0,3 0,3 0,03 0,3 0,3 0,3 0,3 16 0,3 1,0 ^~ 4 0,6 0,6 0,2 0,005 0,08 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 2,7 0,03 5,0 0,6 0,2 1 5 0,6 0,6 0,2 0,005 0,2 0,2 0,6 0,6 0,2 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 2,7 0,1 5,0 0,2 0,2 f 6 0,3 0,3 0,3 0,0075 0,3 ' 0,03 0,3 0,3 0,03 0,075 0,3 0,6 0,075 0,075 32,0 0,3 0,3 0,3 i 7 0,08 0,6 0,03 0,0005 0,005 0,005 0,6 0,6 0,03 0,6 0,2 0,03 0,1 0,08 2,7 0,005 0,6 0,03 0,03 1 « ¦ 0,3 0,3 0,3 0,00075 0,03 0,03 0,3 0,5 0,03 0,3 0,25 0,6 0,1 0,08 2,7 0,075 0,3 0,379395 17 18 11 Mylcofbatóteriuim smegmatis ATCC 10143 Escherichia coli ATCC 10586 Klebstielia pneumoniac ATCC 10031 Proteus vulgaos DA 121 Pseudomonas aeruginosa ATCC 8689 Salmonella sohottmelleria DA 10 2 0,75 6,0 12,0 6,0 6,0 6,0 3 0,3 16 16 16 12,0 12,0 4 5,0 6,0 6,0 12,0 6,0 6,0 5 5,0 12,0 24,0 24,0 12,0 12,0 6 0,3 12,0 12,0 24,0 6,0 12,0 TtalbeOa 7 ciag dalszy ¦ ^ 0,05 12,0 24,0 24,0 6,0 12,0 1 8 1 0,3 ; . 12,0 12,0 24,0 6,0 12,0 *) Szczep oidporny na penicyline **) Szczep odporny na erytromycyne Wiidima w podczerwieni frakcji A, B, Ci i C2 megalomycyny pokazano odpowiednio na rysun- kaich 1, 2, 3 i 4. DluigoM fal (i) podano w ^cze¬ stotliwosc (y) w cm—1, T oznacza transmisje, a A — absorpcje. Widma poszczegóilnych frakcji antybiotyku badano w oleju mineralnym (Nujol).Charakterystyczne pasma absorpcji padano w ta¬ beli 6 stosujac nastepujace oznaczenia: VS — bar¬ dzo mocne, S — mocne, M—S umiarkowane do mocnego; M — umiarkowane; W = slabe; brd — szerokie; shp — ostre, shd = pnzegliecie i zb = pasmo boczne. Maksima, które odnosza sie raczej do rozpuszczalnika Nujol, anizeli do odpowiednich fnakcjd megalomycyny oznaczono symbolem „N".Frakcje A, B, Ci i C2 'megalomycyny maja cha¬ rakterystyczne wtidma magnetycznego rezonansu jajdrowego (NMR), które pokazano odpowiednio na rysunkach 5, 6, 7 i 8. Widma NMR badano za po¬ moca spektometru typu Varian A-60-A w roz¬ tworach deuteryzowanego chloroformu ((chloroform pooialdadacy altomy deuteru zaimdaist wodoru) pró¬ bek poszczególnych fralkcji (ok. 0,4 ml; stezenie ok. 20 mg/ml). Wyniki badan podano w czesciach na imillion iflppm) stosujac c^teronrótylosilan i me¬ tode normalizacji wewnetrznej.Stabilnosc frakcji A, B, Cx i C2 antybiotyku jest nastepujaca. W zakresie pH = 2,0—6,0 i w temperaturze 100°C frakcje A i B wykazuja znaczna strate aktywnosci w ciagu 30 minut; fra¬ kcje te sa naifcomiast stabilne w tych samych wa¬ runkach, lecz w zakresie pH = 7,0—110,0. Frakcja Ci jest stabilna w zakresie pH = 2,0—8,0, w cia¬ gu 30 minut, w temperaturze 100°C, ale traci swoja stabilnosc w tych samych warunkach, lecz przy pH = 10,0. Frakcja C2 jest niestabilna w warunkach kwasnych i(pH = 2,0) i alkalicznych miast stabilna w ciagu 30 minut w zakresie pH = 30 4,0-8,0, w temperaturze 100°C.Wlasciwosci biologiczne zbioru frakcji A, B, Cj, C2 i C megalomycyny przedstawiono ponizej.Frakcje A, B, Ci i C2 oraz C antybiotyku wy¬ kazuja szeroki zakres aktywnosci antybtiotycznej 35 in vitro w dzialaniu na rozne gramododatnie i gramoujemne organizmy. Zarówno wszystkie ra¬ zem jak i poszczególne frakcje nadaja sie do oczyszczania i sterylizacji laboratoryjnej apara¬ tury szklanej, narzedzi chirurgicznych itp. Anty- 40 biotyki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku stosuje sie, w polaczeniu z mydlami i detergen¬ tami do oczyszczania i dezynfekcji pomieszczen, w których przygiotowuje sie zywnosc, takich jak kuchnie, jadalnie itp.« Zakres aktywnosci przeciwkobalkteryjnej mega¬ lomycyny frakcji A, B, Ci i C2 oraz frakcji C woibec typowych gramododatnich i graimoujem- nych organizmów podano w tabeli 7. Wrazliwosc organizmów testowych na antybiotyki oznaczono 50 za pomoca testu cyHndrowo-irozciuencaeniowego przy uzyciu wyciagu z drozdzy i miejsa wolowego, którego odczyn doprowadzono do wartosci pH = = 8,0 za pomoca wodorotlenku sodowego. Szczepy drobnoustrojów testowych oznaczone sa numerami 55 katalogowymi, numery takie w dalej zamieszczo¬ nych tabelach poprzedzone literami „DA" odnosza sie do zbioru Shertiing Corporation, Bloomfield (N.J), USA.Aktywnosc przecawbakteryjna megalomycyny 60 porównywano z aktywnoscia biologiczna erytromy¬ cyny, penicyliny i methocyliny.Wyniki podano w tabeli 8 {wrazliwosc okreslo¬ no metoda cylfindrowo-rozcieniczeniiowa opisana wyzej). Testy przeprowaidzono na nastepujacych «5 podlozach;79395 19 20 jmegalomycyne i erytromycyny w wydiagiu droz¬ dzowym i z miesa wolowego przy pH = 8,0, pe¬ nicyline G i methicyline na takim samym podlo¬ zu, przy pH = 6,8. Wyniki wskazuja, ze aktyw¬ nosc megalomycyny jest porównywalna z aktyw¬ noscia innych baidanych antybiotyków w dziala- Jak podano wyzej frakcje A, B, Cx i C2 oraz C megalomycyny wykazuja szeroki zakres aktywno¬ sci przeciwbakteryjnej w dzialaniu na graimodo- idatnie i graimouijemne drobnoustroje. Do grupy graniododaitnich patogennych drobnoustrojów na¬ leza gaitunki z rodzaju Streptococcus, Staphylo- coccuis i Diploooccus, o których wiadomo, ze wy¬ woluja wiele chorób. Rózne gatunki Staphylococ- cus i Streptococcus powoduja zapalenie miazszu wymienia u bydla. Drobnoustroje te sa latwo zwalczane przez antybiotyki, wytwarzane sposo¬ bem wedlug wynalazku, po stosunkowo krótkim okresie ich podawania.Frakcje A, B, Cx i C2 i grupa frakcji megalo¬ mycyny sa takze aktywne w dzialaniu przeciw gram)U'jemnym organizmom z rodzaju Escherlehia, Salmonella, Proteus i Piseudamonas. Organizmy te powoduja szereg powaznych chorób miedzy inny¬ mi zakazenia dróg moczowych i biegunki. Takie synchromy sa bardzo pospolite wsród zwierzat do¬ mowych, takich jak bydlo, konie, owce, swinie, psy i koty. Sa one skutecznie zwalczane za po¬ moca antybiotyku wytwarzanego sposobem we¬ dlug wynalazku. niu przeciwko gramododatnini bakteriom. Megalo- mycyna wykazuje ponadto aktywnosc w stosunku do Mycóbacteriuim smegmatis w nizszych steze¬ niach, anizeli erytromycyna, podczas gdy penicy¬ lina G i melthicyldna byly niealkltywnie ponizej ste¬ zenia 10 //g/ml.Megalomycyna stosowana w postaci zawiesiny w oleju z orzeszków ziemnych wykazuje LD50 = = 270 mg/kg dla myszy przy podwaniu dootrzew- nym. Przy podawaniu podskórnym i per os LD50 jest wieksze od 5000 mg/kg. PD50 (dawka ochron¬ na dla 50% organizmów testowych) wynosi 150 mig/kg dla myszy smiertelnie zakazanych. S. au- reus przy podawaniu podskórnym w zawiesinie w oleju z orzeszków ziemnych.Przeciwko Streprocodcus pyogenes, przy iden¬ tycznej metodzie stosowania PD50 wynosi dla my¬ szy 100 mg/kg.Megalomycyna podawana psom w ilosci 17,5 mg/kg jest wykrywalna w surowicy krwi po siedmiu dniach. Jest to znamienne z tego wzgle¬ du, ze odpowiednia dawka erytromycyny zanika po 25 godzinach.Dane dotyczace ostrej toksycznosci frakcji me¬ galomycyny podano w tabeli 10.Tabele 11, 12 i 13 zamieszczono w celu zilustro¬ wania dzialania ochronnego megalomycyny u zwie¬ rzat.Lbelc w po dzowy liesa ¦ ni od] nycyni 45 60 55 60 Tal bela 8 Spektrum dzialania megalomycyny w porównaniu do znanych antybiotyków Mikroorganizm BaciHus cereus Bacillus sulbtiiliis Dipilococcus pneuimoniae Sarcina lutea Staiplhylocoicous aiuneiuis |(SEcaep Nr 3) Staiplnylococlcius aiuneuis KSBcaep " Nir 7)*) 6!ba Nr 1**) Streprococcus fiaecalis Sfcreproooccus pyogenes (Szczep Nr 4) Mycobacterium smegmatis (MegaiLomycyna i erytromycyna unegalomycyna 0,2 0,005 0,2 0,0005 0,005^0,2 0,02—0,6 2,7 0,005 0,03—0,2 0,5 w wyciagu drozd erytromycyna 0,05 0,005 0,05 0,005 0,005-hO,05 0,005^0,5 50,0 0,0005 0,05 5,0 zowym d z miesa penicylina G 0,12 0,01 0,12 0,06 0,003-0,06 1,2-9,4 — 0,75 0,01^0,02 10 imethicylina 4,8 0,03 1,8 0,3 0,12^0,6 1,2—7,5 — 25,0 0,6 10 wolowego przy pH = 8,0; Penicyli- na G i methicylina w wyciagu drozdzowym i z miesa wolowego przy pH = 6,8.*) Klinicznie wyizolowane lacznie z organizmami odpornymi na penicyline.**) Klinicznie wyizolowane odporne na erytromycyne.79395 21 22 Tabela 10 Toksycznosc megalomycyny dla myszy (LD5q w mg/kg) Sposób stasowania Per os Podskórnie Dootrzewnowo Sposób stosowania Per os Podskórnie Dootrzewnowo megalomycyna w postaci za¬ sady w oleju z orzeszków ziemnych 1160 1160 75 W 847-Ci po¬ stac zasado¬ wa*) 1000 1000 500 chlorowodorek megailomycyny w wodzie iiio o o Chlorowodo¬ rek frakcji C2 megalomy¬ cyny w HzO 500 500 500 frakcja A megalomycyny w postaci zasady 7500 7000 350 frakcja B megalomycyny w postaci zasady w ole¬ ju z orzeszków ziemnych 500 frakcje C 'megalomycyny 500 500 400 *) W 0,5% roztworze karbometoksycelulozy.Tabela 11 Aktywnosc megalomycyny w dzialaniu przeciwko smiertelnej dootrzewnowej infekcji u myszy (PDso w mg/kg) Staphylococcus aureus Gray Staphylococcus aureus DA 2030 Staphylococcus aureus DA 2000 Staphyloccoous aureus Amith Strejytooocicus pyogenes O DA 211 Streptococcos pyogenes DA 32 Streptococcus pyogenes DA 31 Streptococcus pyogenes DA 12 Streptococcus pyogenes DA 9 Diplococcus pneuimoniae DA 150 1 (po 2 dniiach podawania) Ddiploooccus pneuimonliae DA 151 Daplococous pneumoniae ATCC 10015 Staphylococcus aureus Gray Streptococcus pyogenus DA 21 Diplococcus pneumoniae DA 150 grupa antybiotyków W 847 w oleju z orzeszków ziemnych cMcawiwodorek grapy •antybiotyków W 847 w HzO stosowanie podskórnie 35 23 35 23/dzien Stosowanie per os 116 4,3 1 4,3 3,5 2,3 4,6 1,5* 1,5* 1,5* 1,5* 23,2 11,6/dzien 11,6 1,5* 110 116 116 chlorowodorek frakcji C2 anltybtiotyku W 847 w HjO 5 45 . 150 30/oMen 50- *) PD 10079395 23 24 Tabela 12 1 Aktywnosc frakcji megalomycyny w dzialaniu przeciwko smiertelnej dootrzewnowej infekcji | Streptocoouis pyogenes C 203 Streptocoous pyogenes C 203 Streptococcus pyogenes C Streptococcus pyogenes C Staepibooooaus pyiagenes Nr. 22 Stoejpbocooaufi pyogenes Nr. 22 Streptococcus pyogenes Nr. 9 Streptococcuis pyogenes Nr. 9 Staphyloooccus aureus Smith Staphyloooccus aureus Smith Staphylococcus aureus Gray Staphyilococcuis aureons Staphylococcus aureus W Staphylococcus aureus W Staphyloooocus aureus Nr. 41 Staphyloooccus aureus Nr. 41 Diplocooouis pneumoniae oka Diplococcus pneuimoniae oka Diplococcus pneumoniiiae Nr. 2 Diplococcus pneumoniiae Nr. 2 Enterococcus Nr. 802 Enterococcus Nr. 802 Enterococcus Nr. 804 Enterococcus Nr. 804 Escherichia coli Esicheridhia coli Klebsiella pneuimoniae Klebaiella pneuimoniae Pseudomonas aeruginosa Pseuidomonas aeruginosa u myszy i(PD50 w mg/ikg) sposób stosowania Per ios S.C.Per os S.C.Per os S.C.Per os S.C.Per os S.C.Per os S.C.Per ios S.C.Per os S.C.Per os S.C.Per os S.C.Per os S.C.Per os S.C.Per os S.C, Per os S.C.Per os S.C. frakcja A megalomy¬ cyny wpostaci zasady 300 220 300 134 180 180 250 167 250 75 300 20 117 20 150 20 300 90 250 70 300 160 250 180 200 100 250 150 250 161 frakcja Cx megalo¬ mycyny w postaci izasady 207 118 .300 180 250 200 250 250 180 M7 250 62 150 25 170 ' 25 300 167 200 170 250 180 ¦250 250 250 250 250 250 250 250 *) w 0,5°/o wodnym roztworze toairtookisyinetylocelulozy; (1) S.C. = podskórnie Tabela 13 Aktywnosc poszczególnych frakcji megalomycyny i ich kombinacji w dzialaniu przeciwko dootrzew¬ nowej smiertelnej infekcji u myszy (PD5o w mg/kg) Stosowanie podskórne Organizm Staphyloooccus aureus Gxiay Streptococcus pyogenes C frakcja B postac zasadowa w( oleju z orzeszków ziemnych 150 frakcja Cx postac zasadowa * 200 1150 chlorowo¬ dorek frakcji C2 w H^O 45 10 frakcja C postac zasadowa (50 150 chloroiwodo- irek frakcji C w H20 50 5079395 25 26 Staiphyilococcus aureus Smith Streptococcus pyogenes Nr. 5 Stosowanie per os Organizm Staphyloooceus aureus Gray Streptococcus pyogenes C Staphylococcuis aureus Smith Streptococcus pyogenes Nr. 5 — — — — — — — — 250 250 — — — . — 100 1100 — — TaJbeJa 13 ciag dalszy 86 39 i390 310 310 390 • ¦ — — \ 250 250 — — *) Zawiesina w 0,5% rozltworze kairfoometoksycelulozy, zdysperigowama falalmii uLtradzwiekowymi.Frakcja A megalomycyny zawieszona w 0,5 roz¬ tworze wodnymi ikanboksymetylocelulozy i zdy- spergowana falami ultradzwiekowymi jest ak¬ tywna przy podskórnym stosowaniu myszom przeciwko S. aureus Gray (PD5q — dawka chro¬ niaca 50°/o badanych zwierzat wynosi 1330 mg/kg) i przeciwko P. aeruglinosa (PD5o wynosi 161 mg/ :^kg). LD50 óla. mylszy przy sltosawamiiu podskór¬ nym wynosi 7000 imig/kg.Fmakcjia B anegaWomycyny zawieszona w oleju z orzeszków ziemnych wykazuje alktywmosc przy staowainiu podskórnym myiszam przeciwko S. aiureuis — (PD50 wynosi mg/kg) i przeciwko P. aefuriuigdjnosia (dawka 3150 mg/kg powodiuue smierc w ciagu 24 gddzdm). UD50 dla myszy przy poda¬ waniu podskórnym jest wieksza, aniizeM 500 mgykg.Frakcja Cx megalomycyny zawieszona w 0,5% roztworze wodnymi karbdksymetylocelulozy i zdy- spergowana falaimi ultradzwiekowymi wykazuje w badaniach przeprowadzonych na myszach ak¬ tywnosc przeciwko S. aureus. Przy stosowaniu podskórnym myszy przeciwko S. aureus Gray PD50 wynosi 62 mg/kg, podczas gdy w stosunku przeciwko S. pyogenes aktywnosc frakcji C wy¬ nosi 180 mg/kg. Antybiotyk ten jest nieco mniej aktywny przy podawaniu per os. PD5q przeciwko S. aureus Gray i S. pyogenes aktywnosc frakcji C jest wówczas wieksze od 250 mg/kg. LD50 dla myszy przy podawaniu podskórnym wynosi ponad 1000 mg/kg. Ponadto frakcja Ci megalomycyny wykazuje aktywnosc antymalaryjna przeciwko Plasmodium berghei; podawana gryzoniom (100 mg/fcg/dzien/24 godziny po infekcji wywoluje znaczne zmniejszenie liczby pasozytów we krwi.Frakcja C2 megalomycyny stosowana podskór¬ nie w postaci zawiesiny w wodnym roztworze kar¬ bdksymetylocelulozy wykazuje aktywnosc biolo¬ giczna. Bardziej celowe jest stosowanie wodnych roztworów jej chlorowodorku. Podawana w tej postaci podskórnie myszom wykazuje PD50 = = 45 mg/kg przeciwko S. aureus Gray i PD50 = = 10 mg/kg przeciwko S. pyogenes C. Podawana per os wykazuje PD50 = 100 mg/kg przeciwko 25 30 35 40 45 50 55 60 obu tym organizmom. LD5q dla myszy przy po¬ dawaniu dootrzewnowo jest wieksze od 500 mg/ /kg.Nizej zamieszczone przepisy podaja sposób przy¬ gotowania i sklad kilku srodków farmaceutycz¬ nych, zawierajacych laJnitylbioltyiki, wytwarzane spo¬ sobem wedlug wynalazku. Srodki te z wyjatkiem stosowanych miejscowo, przystosowane sa do dziennych dawek wynoszacych od okolo 5 do 50 mg antybiotyku na 1 kg wagi ciala. Sa one wytwarzane w postaciach pozwalajacych na po¬ dawanie tych dawek w 2 do 8 porcjach.Srodki stosowane miejscowo podawane sa za¬ zwyczaj od 2 do 4 razy dziennie (na miejsce za¬ infekowane). Wykorzystanie opisanych nizej srod¬ ków: wielkosc dawki antybiotyku i czestotliwosc stosowania zaleza w duzym stopniu od stadium i stopnia nasilenia infekcji, rodzaju infekcji i od indywidualnych cech traktowanych nimi gatun¬ ków zwierzat.Przepis I Kapsulke wytwarza sie z megalomycyny laktozy stearynianu (magnezowego w.ilosci 250,00 mg w ilosci 248,75 mg w ilosci 1,25 mg 500,00 mg Miesza sie megalomyeyne z laktoza.Dodaje sie stearynianu magnezowego i ponownie miesza.Otrzymana mieszanina napelnia sie kapsulki.Przepis II Zawiesiny do stosowania doustnego wytwarza sie Megafliomyicyny — frakcji A w ilosci 25,0 g, GMnolknzemiainiu magnezowego 9,5 g, Soli sodowej kariboksymetyiocelulozy 2,5 g, Cytrynianu sadowego 25,0 g, Zapachu qjs.Barwnika q.s.Metyloparabenu 0,9 g79395 27 Fropyloparafoenu Pochodnej kwasu polisorbowego (Podysorbate 80) Roztworu sorbitolu Woda qjs. 0,2 g 1,0 g 500,0 g 1000,0 ml.Sposób postepowania: 1. 200 ml wody ogrzewa sie do wrzenia i roz¬ puszcza w niej polowe lacznej ilosci zwiazków pe- raibenowydh. Roztwór oziejbia sie do "temperatury okolo 70°C, nastepnie miesza sie z pochodna kwa¬ su polisorbowego (Polysonbate 80). Dodaje siegli- nokrzemianu, mieszajac az do uzyskania jednoli¬ tej zawiesiny (mieszanina 1). 2. 200 ml wody ogrzewa sie do wrzenia i roz¬ puszcza w niej pozostala ilosc zwiazków parabe- nowych. Do tego roztworu wprowadza sie sól so¬ dowa kairiboksyimetyiocelulLoEy i dyspensuje ja az do uzyskania jednolitego zelu. Dodaje sie do niego roztwór sorbitolu i rozpuszcza sie w otrzymanej mieszaninie cytrynian sodowy (mieszanina 2). 3. Mieszanine 2 dodaje sie powoli do mieszani¬ ny ciagle mieszajac. Otrzymana mieszanine ozie¬ bia sie do temperatury 25°C. Dodaje sie frakcje A megalomycyny, skladnik zapachowy i barwnfik i nastepnie miesza razem, po czym dopelnia sie woda do objetosci 1000 ml.Przepis III Krem do stosowania miejscowego wytwarza sie z frakcji B megalomycyny w ilosci kwasu stearynowego Jednoetearynianu alkoholu sorbitowego Jednoolednianu alkoholu sorlbitoweigo Jednolaurynianu alkoholu polioksyetyfleno- sorbitowego fWiddy qjs. 10 g 200 g 104 g 20 g 56 g 1000 g Sposób postepowania: 1. Ogrzewa sie kwas stearynowy w mieszaninie z pochodnymi, alkoholu sorbitowego do tempera¬ tury 65°C otrzymujac mieszanine 1. 2. Okolo 900 g wody ogrzewa sie do tempera¬ tury 70°C, nastepnie dodaje sie do mieszaniny 1 i miesza do utworzenia jednolitej masy. 3. Frakcje B megalomycyny miesza sie z okolo 1O0 g wody, przejpuszciza pnziez mlyn koMdialkiy, a nastepnie zmielona zawiesine dodaje sie do sto¬ pionej mieszaniny otrzymanej wedlug punktu 2 i miesza studzac powoli do temperatury otoczenia.Przepis IV Masc wytwarza sie z frakcji Ci Megalomycyny w ilosci Wazeliny w ilosci 10 g 990 g 1000 g Sposób postepowania: 1. Wazeline topi sie. 2. Frakcje Ci megalomycyny miesza sie w oko¬ lo 10% wazeliny i miele w mlynie koloidalnym. 3. Zmielona mieszanine miesza sie z pozostala iloscia stopionej wazeliny i pozwala sie, aby masc samorzutnie oziebila sie. 15 25 30 35 40 50 28 Przepis V 250 mg/ampulka Roztwór do stosowania pozajelitowego wytwarza sie z frakcji A Megalomycyny w ilosci Kwasu cytrynowego skladniki dzialajace jako bufor Ortofosforanu dwusodowego io Sterylnej wody destylowanej 14 mig/ampulka 36 mg/ampulka 5,0 mg/ampulka Sposób postepowania: 1. Sterylny winian frakcji A megalomycyny mie¬ sza sie ze sterylnym buforem cytrynowo-fosfora- nowym w warunkach aseptycznych. 2. Otrzymanym' roztworem napelnia sie sterylne ampulki. 3. Do ampulek dodaje sie wode i dobrze wy¬ trzasa bezposrednio przed uzyciem.Prze p is VI Zawiesine do stosowania pozajelitowego wytwarza sie z frakcji C2 megalomycyny w ilosci soli sodowej fcariboksymetylo- celulozy w ilosci pochodnej kwasu polisorbowego (Polysorbate 80), Metyloparabenu Propytloparabenu Wody q.s. 250 mg/ampulka 3 mg/ampulka 1 mg/ampulka 3,6 mg/ampulka 0,4 mg/ampulka 2,0 ml/ampulka.Sposób -postepowania: 1. Przygotowuje sie roztwór z soli sodowej kar- boksymetyHocelulozy pochodnej kwasu poMsorbó- wego, metyloparabenu i propyloparajbenu.'Roztwór ten poddade sie sterylizacji w autokla¬ wie. 2. Sterylna frakcje C2 megalomycyny miesza sie z porcja wyzej opisanego roztworu i miele w mly¬ nie koloidalnym w warunkach aseptycznych. 3. Miesza sie zmielony produkt z reszta roztwo¬ ru oltinzyimanego w pumltacdle 1. 4. Otrzymanym preparatem napelnia sie steryl¬ ne ampulki.Podane nizej przyklady zilustruja przedmiot wy¬ nalazku.Przyklad I. Fermentacja w wytrzasanych kolbach.A. Stadium kielkowania: 55 0,5 liofilizowanej kultury Micromonospora sp.W 847 wprowadza sie do 300 ml kolby Erlenme- yera zawierajacej 100 ml opisanego nizej podlo¬ za, które doprowadzono — przed wyjalowie¬ niem — do pH7,5, za pomoca rozciiencBonego 60 roztworu wodorotlenku sodowego: Bacto — wyciag z miesa wolowego 3,0 g i(Difco) Bacto — tirypoza (Difoo) 5,0 g 65 Deikstroza 1,0 g793*5 Skrobia ziemniaczana 24,0 g Bioto — wyciag drozdzowy (Difoo) 5,0 g Weglan wapniowy 2,0 g Woda wodociagowa 1000,0 ml.Inkubacje prowadzi sie w ciagu trzech dni, w temperaturze 37°C na wytrzasarce obrotowej (380 obrotów na mtinute/ekiofc 5 om).B. Stadium inokulacyjne. 25 ml inokulum przenosi sie w warunkach aseptycznych ze stadium kielkowania do 2-Mtro- wej kolby Erflenmeyera zawierajacej 500 ml ste¬ rylnego podloza stosowanego w stadium kielkowa¬ nia, opisanego wyzej. Inkubacje prowadzi sie w ciagu trzech dni, w temperaturze 28°C na wy¬ trzasarce obrotowej (MO obrotów na minute, skok 5 om).C. Stadium fermentacyjne. 25 ml inokulum przenosi sie w warunkach aseptycznych do 2-fitrowej kolby Ettenmeyera za¬ wierajacej 500 ml opisanego nizej sterylnego pod¬ loza, doprowadzonego do pH = 7,8 za pomoca roz¬ cienczonego roztworu wodorotlenku sodowego przed sterylizacja.Sacharoza Azotan sodowy Ortofoaforan dwupotasowy Siarczan magnezowy Siarczan zelazowy * Pepton Woda wodociagowa 30,0 g 3,0 g 1.0 g 0£ g 0,01 g 8,0 g 1000,0 ml Inkubacje prowadzi sie w ciagu 4 dni w tem¬ peraturze 28°C na wytrzasarce obrotowej (280 ob¬ rotów na minute; skok 5 cm). Zbiera sie zawar¬ tosc kolb i doprowadza sie pH brzeczki do war¬ tosci 0,5 a nastepnie ekstrahuje sie ja octanem etylu (w przyblizeniu 2 objetosci na 1 objetosc brzeczki).Oddziela sie faze organiczna i zateza 100-krot- nie pod obnizonym cisnieniem. Aktywnosc kon¬ centratu oznacza sie metoda krazkowo-plytowa; stosujac S. aureus (ATOC 8538P) jako organizm testowy. Koncentrat daje strefe zahamowania o wielkosci srednicy okolo 20—35 mm.Przyklad II. Fermentacja w pojemniku.A. Stadium kielkowania.Stadia kielkowania i inokulacyjne prowadzi sie w sposób opisany w przykladzie I.B. Stadium fermentacyjne: 500 ml inokulu przenosi sie w warunkach asep- iytaznyoh do Metrowego ferimentora zawieraja¬ cego 10 litrów sterylnego podloza opisanego w przykladzie I, do którego dodano 6 ml srodka przeciwdzialajacego pienieniu, Dow Corninh 8 (Dow Corning Corporation, Midland, Michigan).Proces fermentacji przebiega w ciagu 66 godzin w nastepujacych warunkach: Temperatura 3tl°C Doplyw sterylnego powietrza 4 1 Mieszanie 250 obr. na minute Srodek przeciwdzialajacy dodaje sie w miare pienieniu (Dow OornAng B) potrzeby.Pod koniec tego okresu stezenie produkowane¬ go antybiotyku osiaga swoje maksimum. Objetosc 8 wlasna komórek osiaga stala wartosc 3,5—4,5 raL Wyprodukowany antybiotyk zawarty w brzeczce wywoluje w tescie plyftfcowym strefe hamowania o srednicy 15—25 mm w próbach dzialania prze¬ ciw S. aureus i P. aerugmosa. io Przyklad III. Fermentacja w pojemniku.A. Przygotowanie mokulum.Do czterech kolb o pojemnosci 2 litrów kazda zawierajacych po 500 ml sterylnego podloza opi¬ sanego w przykladzie IA, dodaje sie po 0,5 ml 15 liofilizowanej kultury Micromonospora sp. W 847.Koilby umieszcza sie na rotacyjnej wytrzasarce pracujacej przy 280 wstrzasach na minute (skok 5 om) i inkubuje sie w temperaturze 28°C w cia¬ gu 72 godzin. 20 B. Sfealdkiim flerimenltacyjne.Do kazdego z czterech fenmenitorów dodaje sie po 10 litrów nastepujacego podloza produkcyjnego doprowadzonego do pH = 7,15—7,25 przed steryli¬ zacja. 28 Tryptikaza 170,0g Chlorek sodowy 50,0 g Ortofosforan dwupotasowy 25,0 g Dekstroza 25,0 g jh Wyciag Czapka—Doza 350,0 g Srodek pizeciw pienieniu G.E-00 (General Electric Company) w miare potrzeby (Schenectady, Nowy Jork) 3g. Woda wodociagowa q.s. 10,0 litrów Zawartosc kazdego fermentora zaszczepia sie 500 ml. 72 godzinnego inokulum, przygotowanego w sposób opisany wyzej. Temperature podloza fer¬ mentacyjnego podnosi sie do 31°C i miesza sie ^o przy ilosci obrotów mieszadla wynoszacej 500/mm napowietrzajac podloze 0,5 Ultra powietrza na litr brzeczki 1 minute. Po 24 godzinach liczba obro¬ tów mieszadla zwieksza sie do 800 na minute, a nastepnie po 48 gofcjrfnach Ido 700 na minute.« Fermentacje przerywa sie po uplywie 89 godzin.Brzeczke z czterech fermentów (ok. 37 litrów) poddaje sie ekstrakcji.Przyklad IV. Ekstrakcja megalomycyny z la¬ boratoryjnej fermentacji (metoda chromatografkz- 50 na). Calkowita ilosc brzeczki (60 litrów) otrzyma¬ nej sposobem opisanym w przykladzie II, dopro¬ wadza sie do pH = 9,5 za pomoca rozcienczonego roztworu wodorotlenku sodowego i ekstrahuje sto¬ sujac dwfte objetosci octanu etylu na 1 objetosc ss brzeczki. Oddziela sie faze organiczna i zateza pod próznia otrzymujac oleista pozostalosc (okolo 30,0 g).Aktywnosc biologiczna oleistej pozostalosci o* fy zahamowania wzrostu drobnoustrojów o sred* tnticy okolo 20—30 mm w przypadku S. aureus 6 okolo 15—125 mm w przypadku P. aureginosa.Oleista pozostalosc oczyszcza sie na kjolumnie chromatograficznej w nastepujacy sposób.« Przygotowuje sie kolumne stosujac 1000 g Sep-SI hadexu LH 20 (Pharmacia Fine Chemical, Inc) za¬ wieszonego w 959/t roztworze wodnym etanolu.Oleista pozostalosc przenosi sie do kolumny i elu¬ uje 95f/o etanolem z szybkoscia 200 ml ma godzine.Zbiera sie 50 ml frakcje, które laczy sie zgodnie z ich aktywnoscia praeciwbakteryjna (oznaczana za pomoca metody krajzkowo-plytfcowej) w sto¬ sunku do S. aureus ATOC 6538P. Frakcje wyka¬ zujace maksymalne aktywnosci odparowuje sie do sucha. Sucha pozostalosc rozpuszcza stie w malej ilosci acetonu i wlewa do nadmiaru eteru nafto¬ wego (t. wz. 30-40^).Mieszanine oziebia sie w lazni iflsuchy lód/ace¬ ton) do temperatury okolo —60°C i pozostawiana 20 minut. Nastepnie pozwala sie jej ogrzac dq 'temperatury otoczenia i oddziela stie ciecz macie¬ rzysta od oleistej pozostalosci za pomoca dekan- tacji. Ciecz macierzysta odparowuje sie do sucha otrzymujac oczyszczona megalomycyne wykazuja¬ ca aktywnosc okolo 225 do 275 /ig/mg (wg testu cylindrowego opisanego wyzej).Przyklad V. Ekstrakcja megalomycyny po fermentacji w pojemniku (ekstrakcja rozpuszczal¬ nikami). Zebrana brzeczke (okolo 37 litrów) otrzy¬ mana w sposób opisany w przykladzie III dopro¬ wadza stie do pH = 9,5 za pomoca 50*/t roztworu wodnego wodorotlenku sodowego. Ekstrahuje sie ja dwukrotnie wieksza objetoscia octanu etylowe¬ go i ekstrakt zateza sie do objetosci 2150 ml. Me¬ galomycyne wyodrebnia sie jednym z opisanych sposobów.A. Ekstrakcja kwasem solnym. 500 ml skoncentrowanego roztworu octanu ety¬ lowego ekstrahuje sie dwukrotnie 250 ml porcja¬ mi 0,5f/t (0,14 n) kwasu solnego. Polaczone kwa¬ sne ekstrakty slabo alkalizuje sie aa pomoca 5*/t roztworu wodnego wodorotlenku sodowego (pH = = 8,5—9,0) i ekstrahuje sie dwukrotnie 250 ml porcjami octanu etyki. Ekstrakty laczy sie i od¬ parowuje pod obnizonym cisnieniem do sucha.Tak otrzymany antybiotyk wykazuje w tescie cy¬ lindrowym, opisanym poprzednio, aktywnosc bio¬ logiczna wynoszaca okolo 525 /4g/mg.B. Ekstrakcja feratasem siarkowym.Przeprowadza sie ekstrakcje w sposób opisany w przykladzie VA zastepujac jedynie kwas solny 0,1 n kwasem siarkowym. Otrzymana megalomy- cyna badana testem cylindrowym wykazuje ak¬ tywnosc biologiczna wynoszaca okolo 550 /jg/mg.Przyklad VI. W celu wydzielenia frakcji C2 megalomycyny przygotowuje sie kolumne (dlugo¬ sci 105 om, srednicy 7,6 om) wypelniajac ja 20O0 g kwasu krzemowego (Analytoteal Reagent, MaOflintcflcnaidt) uktadanego w niej imalymi segmen¬ tami. 15,0 g megalomycyny otrzymanej wedlug przykladu IV, rozpuszcza sie w acetonie, miesza z kwasem krzemowym i odparowuje aceton pod obnizonym cisnieniem. Sucha mieszanine wprowa¬ dza sie u szczytu kolumny. Kolumne eluuje sie mieszanina chloroformu (60 oz. obj.) i ^metanolu (40 cz. obj.) z szybkoscia 100 ml na godzine. Zbie¬ ra sie finakcje po 200 ml.Dzialanie kolumny kontroluje sie za pomoca te¬ stów plytkowych badajac aktywnosc kazdej frak¬ cji przeciw S. aureus i E. coli. Aktywne frakcje S* ohromatografuje sie na cienkich plytkach kwasu krzemowego w ciagu 1,5 godziny, stosujac taki sam uklad rozpuszczalników, jak w kolumnie.Frakcje laczy sie zgodnie z ich charakterystyka 5 chromatograficzna oznaczona dwoma metodami opisanymi poprzednio (patrz charakterystyka me¬ galomycyny).Frakcje zateza sie pod obnizonym cisnieniem.Laczac frakcje, jak pokazano w tabeli 14, za- io mieszczonej . nizej, otrzymuje sie chlorowodorek frakcji C2 megalomycyny o postaci bialego pro¬ szku przez rozpuszczenie polaczonych pozostalosci w jednej objetosci metanolu i wytracenie 10 obje- tosoiami eteru etylowego. Otrzymany w ten spo- 15 sób antybiotyk wykazuje w tescie cylindrowym (opisanym uprzednio) aktywnosc biologiczna wy¬ noszaca okolo 1000 fjg/mg.W celu wydzielenia frakcji Cx megalomycyny z polaczonych dalszych frakcji, jak pokazano w ta- 20 beli 14, wydziela sie frakcje C% megalomycyny w postaci proszku o barwie bialej przez odparo¬ wanie ich do sucha. Otrzymany antybiotyk ba¬ dany metoda cylindrowa opisana wyzej wykazuje aktywnosc biologiczna wynoszaca okolo 900 pg/mg. 25 Pozostala substancje aktywna eluuje sie z ko¬ lumny zbiera i zateza.Przyklad VII. W celu wydzielenia frakcji A i B megalomycyny. 500 g Morfisillu aktywuje sie w feo^perafrjfze 100°C w ciagu 16 gojdzin, za- 30 wiesza w heksanie i gesta zawiesine wprowadza sie do szklanej kolumny (o dlugosci 105 cm i sre¬ dnicy 3,8 cm; zatrzymanie 700 ml rozpuszczalnika).Do kolumny wprowadza sie 2,8 g pozostalosci z przykladu VI rozpuszczonej w 10 ml chlorku me- 35 tylenu.Kolumne eluuje sie kolejno 700 ml heksanu, 700 ml eteru, 700 ml octanu etylu i zwiekszaja¬ cymi sie ilosciami acetonu w octanie etylowym (przy szybkosci przeplywu 200 ml/godzina). Zbiera 40 sie 100 ml frakcje. Dzialanie kolumny kontroluje sie w sposób opisany poprzednio stosujac chroma¬ tografie cienkowarstwowa i badajac dzialanie kaz¬ dej frakcji na S. aureus i E. coli. Frakcje laczy sie. Wyniki rozdzielania poszczególnych frakcji po- 45 dano w tabeli 14.Tabela 14 Frakcja Wycinek (kolumny Kolumna wypelniona kwasem krzemowym Frakcja C2 iw postaci chlorowo- Idorku Frakcja C\ 28—48 56—58 Cie¬ zar 1,2 g 625 g Rf (cienko¬ warstwowa chromato¬ grafia; cbfloroform ((metanol 60/40) 0,65 0,52 Aktyw¬ nosc (biolo¬ giczna ifjg/mg) 000—100 850—100179395 U 1 Kolumna wypelniona Mosilem Frakcja 8 Frakcja A 164—227 (30% acetonu wj octa¬ nie etylu) 370—397 (80% acetonu w| octa¬ nie etylu) MO iirtg 283 mg c.d. 0,38 0,19 . tablicy 14 125—175 50—100 Przyklad VIII. Chlorowodorek megalomycy¬ ny. Okolo 140 mg megalomycyny, wydzielonej we¬ dlug przykladu V, zawiesza sie w okolo 50 ml wody, pH zawiesiny doprowadza sie do wartosci 6,5—7,0 dodajac rozcienczonego 1 n kwasu solnego przy energicznym mieszaniu. Ewentualnie obecni? czesci nierozpuszczalne odsacza sie, a przesacz lio¬ filizuje sie. Otrzymuje sie chlorowodorek megalo¬ mycyny w ilosci okolo 90 mg, wykazujacy aktyw¬ nosc biologiczna wynoszaca okolo 550 ^g/mg.Stosujac opisany w tym przykladzie sposób po¬ stepowania do megalomycyny lub poszczególnych jej frakcji i zastepujac kwas solny równowaznymi Tabela 15 1 Spektnum dzialania przeciiwkobalkteryjnego | rozpuszczalnych w wodzie soli Drobnoustrój 1 a Bacillus subtilis ATCC 6633 Staphylococcuis aureus ATCC 6538P Stiaphylococcus aureus ATCC 11163 Sarcina lutea ATCC 9341 Streptococcus faecalils ATCC 10541 Bscherichia coli ATCC 10536 KHebsiella Pheumoniae ATCC 10031 Proteus vu'lgaris DA 121 Pseudomonas aerufinosa ATCC 8689 Salmonella schottmuelleri DA 10 i Najnizsze stezenie hamujace (/^g/mg) chlo¬ rowo¬ dorek z 0,01 0,1 0,1 0,001 0,1 2,8 1,4 5,6 1,4 1,4 siair- czan 3 0,01 0,01 0,1 0,001 0,1 2,8 1,4 11,1 ' 1,4 2,8 fos¬ fora¬ nu 4 0,01 0,1 0,1 0,001 0,1 2,8 2,8 11,1 1,4 2,8 ilosciami innych kwasów, takich Jak na przyklad kwas siarkowy lub fosforowy, otrzymuje sie takze inne odpowiednie sole. Wynalazek dotyczy wszyst¬ kich soli megalomycyny równocennych z opisa- 5 nymi w nim antybiotykami.W tabeli 15 podano aktywnosc chlorowodorków, siarczanów i fosforanów megalomycyny o aktyw¬ nosci biologicznej wynoszacej 232 /^g/mg przeciw róznym gramdodatnim i gramujemnym organiz¬ uj mom, w wyciagu sporzadzonym z drozdzy i z mie¬ sa wolowego przy pH wynoszacym 8,0.Przyklad IX. W celu wydzielenia frakcji C megalomycyny. 542 g megalomycyny (patrz przy¬ klad V) rozpuszcza sie w 5,4 litrach acetonu i do- 15 daje sie do otrzymanego roztworu 81,0 g wegla aktywowanego. Calosc pozostawia sie na okres okolo 30 minut w temperaturze otoczenia.Wegiel odsacza sie, a przesacz zateza pod obni¬ zonym cisnieniem do objetosci okolo 2 litrów. Przy- 20 gotowuje sie mieszanine okolo 80 litrów/lodu i wo¬ dy i wlewa sie do niej zatezony roztwór aceto¬ nowy, energicznie mieszajac. Calosc miesza sie po¬ zwalajac, aby temperatura otrzymanej zawiesiny podniosla sie do okolo 25°C, po czym odsacza sie 25 wytracony produkt. Osad przemywa sie mala ilo¬ scia wody i suszy pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze okolo 50°C. Otrzymuje sie okolo 212 g frakcji C megalomycyny w badaniach testo¬ wych, aktywnosc biologiczna wynoszaca okolo 30 1075 fig/mg.Dodatkowa ilosc produktu {okolo 85 g) otrzy¬ muje sie po zatezeniu ciefczy macierzystej. Oczy¬ wiscie produkt ten moze byc zanieczyszczony fra¬ kcjami A i B. 35 Z frakcji C antybiotyku otrzymanej w sposób opisany mozna szczególnie latwo otrzymac sole z kwasami w sposób opisany nizej.Przyklad X. W celu otrzymywania soli kwa¬ su winowego frakcji C megalomycyny. Do 2,0 g 40 stalej mieszaniny zawierajacej frakcje Cx i C2 me¬ galomycyny, otrzymanej sposobem opisanym w przykladzie IX, dodaje sie przy mieszaniu 30 ml eteru etylowego. Do otrzymanego roztworu wpro¬ wadza sie 0,5 g kwasu winowego rozpuszczonego 45 w 2,5 ml etanolu. Mieszanine miesza sie w ciagu okolo 15 minut, a potem odsacza wytracona sól.Osad przemywa sie eterem etylowym i suszy, otrzymujac okolo 2,0 winianu, który wykazuje w badaniach testowych akrtywnosc biologiczna wy- 50 noszaca okolo 575 /jgMng, który wykazuje skre- calnosc optyczna, mierzona w 1% roztworze ety- nolowym, wynoszaca -^57°C.Przyklad XI. W celu otrzymywania estru kwasu propdonowego frakcji C megalomycyny. 55 1,0 g frakcji C megalomycyny rozpuszcza sie w 5 ml bezwodnego acetonu i dodaje 0,35 ml bez- wodinilka kwasu pflopionioiweigo. Mieszanine miesza sie w temperaturze otoczenia w ciagu czterech godzin, a nastepnie powoli i przy mieszaniu do- 60 daje sie 8 ml 1,2% wodnego roztworu amoniaku.Otrzymany osad odsacza sie i przemywa 40% roz¬ tworem acetonu, a potem woda, otrzymujac za¬ dany produkt, o temperaturze topnienia 210°C i («)D 25 = —63° (w 1% roztworze etanolowym). 65 Przyklad XII. W celu otrzymywania dwu-35 octanu frakcji C megalomycyny 11,0 g frakcji C megaflomycyny rozpuszcza sie w 55 ml pirydyny i dodaje 5,5 ml bezwodnika kwasu octowego. Ca¬ losc miesza sie w temperaturze otoczenia w ciagu okolo 18 godzin, a nastepnie wlewa sie przy ener¬ gicznymi mieszaniu do 2 litrów wody z lodem za¬ wierajacej 50 ml 14*/t wodnego roztworu amonia¬ ku. Wytracony osad odsacza sie, przemywa woda i suszy otrzymujac zadany produkt o tempera¬ turze topnienia 237—241° i skreoaflnosci optycznej okolo —86° (w l*/« roztworze etanoiowym).Wytracony produkt mozna równiez ekstrahowac octanem etylu. Ekstrakt ten przemywa sie woda i zateza pod obnizonym cisnieniem. Pozostalosc rozpuszcza sie w acetonie, oczyszcza za pomoca wegla aktywowego i wytraca produkt przez do¬ danie równelj objejtasci wddy.Sposobem opisanym w powyzszych przykladach mozna otrzymywac inne estry antybiotyków, któ¬ rych dotyczy niniejszy wynalazek. Wynalazek obej¬ muje otrzymywanie wszystkich estrów megalomy- cyny równocennych z tymi, których sposób otrzy¬ mywania opisano wyzej. PL