NO128225B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte ved fremstilling av antibiotika-kompleks megalomicin og dets komponenter A, B, og .

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved fremstilling av et antibiotika-kompleks , og dets komponenter A,

.3, C-j^ og C2, hvilket antibiotikum nå har fått betegnelsen megalomicin. Det nye antibiotiske' kompleks har formelen:

hvor i antibiotikum W 8V7 A, R-^f^hydrogen,

i antibiotikum W 8>+7 3, R-^hydrogen, T^acetyl;

i antibiotikum W 8>+7 C^,R-^=R2=acetyl; og-

i antibiotikum W C2, R-^ = acetyl, R2=propionyl.

'Det karakteristiske trekk ved fremgangsmåten består i at det

som mikroorganisme anvendes en hittil ikke -beskrevet art av slekten Micromonospora av ordenen Actinomcetales,. og at det antibiotiske kompleks eller en av komponentene A, 3, eller C utvinnes og isoleres i form av "fri base eller i form av et salt eller en ester.

Ved en foretrukket utforelsesform isoleres megalomicin-komplekset eller fraksjon A, 3, C-, eller Cp i form av et fosfatsalt, da det har vist seg at fosfatsalter utmerker seg ved stabilitet både i fast til-stand og i vandig losning.

Den nye art av slekten Micromonospora har fått den offisielle betegnelse Micromonospora megalomicea, men i det etterfølgende er den opprinnelige betegnelse Micromonospora ■ sp. W8W-7 bibeholdt.

To stammer av nevnte Micromonospora-art er, som nedenfor nærmere omtalt, blitt isolert og funnet spesielt anvendelig ved foreliggende fremgangsmåte. Således anvendes det ved foreliggende fremgangsmåte fortrinnsvis Micromonospora sp. VS8hj (NRRL 327<1>*-) med offisiell betegnelse Micromonospora megalomicea var. megalomicea, som betraktes som hovedrepresentant for arten, eller Micromonospora sp. \ J8hj (NRRL 3275) med offisiell betegnelse Micromonospora megalomicea var. nigra, som

betraktes som variant.

Den hittil ikke beskrevne art av slekten Micromonospora som ble anvendt ved den fors te fremstilling av det nye kompleks av antibiotika ifolge denne oppfinnelse, ble opprinnelig isolert fra en jord-prøve som ble tatt direkte fra marken av en av oppfinnerne, og er blitt betegnet Micromonospora sp. W8V/. To stammer av denne Micromonospora-art er.blitt isolert og har vist seg å være særlig,anvende-lige ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen. Disse to stammer er naturlige farvevarianter og kan skjelnes fra hverandre mikroskopisk ved graden i hvilken sporedannelse finner sted. Kulturer av levende organismer av disse to stammer er levert samlingen i United States Department of Agriculture, Northern Utilization Research and Develop-ment Division, Peoria, Illinois, hvor de er gitt betegnelsene NRRL 327'+ og NRRL 3275. Disse stammer kan skaffes fra samlingen på anmodning. Stammene vil i det nedenstående betegnes individuelt som Micromonospora sp. WS^-7 (NRRL 327<*>0 og som Micromonospora sp. W3'+7 (NRRL 3275) og kollektivt som Micromonospora sp. W8V7. Når der i denne beskrivelse refereres til Micromonospora sp. W8<1>+7 uten at stamme-nummeret er angitt, vil de angjeldende uttalelser gjelde begge de nevnte stammer.

Makroskopisk undersøkelse av 28 dager gamle kulturer ( <2>h - 26°C). av Micromonospora sp. ] tJ8h7 (NRRL 327*0 i Gzapek' s sucrose-agar viser at kulturene utmerker"seg ved god vekst uten å oppvise noe luftmycelium, og ved oppreiste og foldede kolonier av en myk, fuktig og ikke-voksaktig konsistens som ikke danner noe spredbart pigment. -Farven av kolonioverflaten, beskrevet i henhold til. "Descriptive Color Name Dictionary", Taylor, Knoche og Granville publisert av Container Corp-oration of America, 1950 (USA), sammen med farvetallet bestemt i henhold til ."Color Harmony Manual", håe utgave 1958, publisert av samme selskap er orange m^f-la. Denne farve er synonym med eller nesten synonym med sterk orange 50, som finnes i National Bureau of Standards Circular nr. 553 (samtlige kolonifarveangivelser som anvendes i det nedenstående, er basert på samme farvereferansesystem).

Mikroskopisk undersøkelse av den samme kultur viser et regel- - messig mycelium sammensatt av lange forgrenede filamenter av diameter omtrent 0,6/^. Sporer er sjeldne.

Makroskopisk undersøkelse av 28 dager gamle kulturer av Micromonospora sp. W8<>>+7 (NRRL 3275) , dyrket i det medium og under de ovenfor beskrevne betingelser, viser at disse utmerker seg ved god vekst og at kolonien som helhet oppviser de samme egenskaper som den ovenfor omtalte stamme bortsett fra at farven er en annen. Koloni-overflatens farve er sort. Ved mikroskopisk undersøkelse viser denne kultur et regelmessig' mycelium'bestående av lange, forgrenede filamenter av diameter omtrent 0,6/*.. Hos denne stamme forekommer imidlertid sporer i rikelig mengde og produseres tilfeldig fordelt gjennom nyceliet. Sporene er fra eggformede til kuleformede med en diameter fra 0,7 til ljO/t-og er mork brune når de er modne.

I et næringsmedium sammensatt av 0,1$ Difco-gjærekstrakt, 1,0$ dextrose og 0,1$ CaCO^ ble det etter 96 timers dyrkning av Micromonospora sp. W8<*>+7 under omrøring ved 28°C på en rotasjonsrister, gjort følgende morfologiske iakttagelser: Sporoforer lange eller korte, frembragt lateralt eller terminalt. Sporoforer frembragt for det meste enkeltvis eller av og til i klynger eller spredt forgrenet. Sporer frembragt enkeltvis, undertiden funnet tett ved siden av hverandre. Sfæriske sporer med 0,8 - 1, 0 u- m i diameter. Luftmycelium fra-værende.

Kolonier av Micromonospora sp. W8M-7 kan ytterligere karakteri-seres ved deres vekstegenskaper under aerobe betingelser i forskjellige næringsmedier. Nedenstående tabell 1 viser vekstegenskapene av Micromonospora sp. w8*+7 i noen av de alminnelig anvendte næringsmedier. Undersøkelsene av kolonien ble gjort på lh dager gamle ( 2h - 26°C) kulturer, dersom ikke annet er angitt.

Micromonospora sp. W8hy~ oppviser særlig god vekst ved temperaturer mellom 26 og 37°C men ingen vesentlig vekst ved temperaturer så hoye som 50°C. Den er aerob og reduserer ikke nitrat til nitrit. Denne art overforer ikke gelatin i væskeform, hydrolyserer ikke melk og spalter ikke cellulose. Intet spredbart pigment dannes ved dyrkning i pepton-jern-agar.

Micromonospora sp. W8V7 viser god vekst i carbohydrat-medier inneholdende 0,5$ gjærekstraktbasis og 1% 1-arabinose, glucose, stivelse og sucrose men bare middels god vekst når carbohydratmateri-alet er 1% xylose. Den vokser dårlig i medier hvor det eneste carbo-hydratmateriale er 1% d-arabinose, cellulose, dulcitol, galactose, glycerol, lactose, levulose, melibiose, melizitose, raffinose, rhamnose, ribose, inostol eller mannitol.

Ytterligere karakteristiske egenskaper ved Micromonospora sp. W8V7 er dens evne til å utnytte nitrogenkilder. Koloniens vekstegenskaper i typiske nitrogenmaterialer som er tilsatt 1% glucose, vurdert efter lh dagers vekst (2^- - 26°C) er oppfort i den nedenstående tabell 2.

Micromonospora sp. W8M-7 gir ved dyrkning på nedenfor angitte medier de folgende farver: "Bennett<1>s Agar"

g^pe = orange rust, deep orange 51.

"Emerson<1>s Agar"

g^-NC = russet orange, strong orange 50.

"Glucose Yeast Extract Agar"

ghPC - russet orange, strong orange 50.

"Czapeks Agar"

g31c = amber, deep orange yellow 69

Folgende tabell IIA viser sammenligning av Micromonospora sp. W8^-7 med andre kjente arter av slekten Micromonospora:

Det nye antibiotiske kompleks som nedenfor skal beskrives kan fremstilles ved anvendelse av Micromonospora sp. W8V7 var. NRRL

327<!>+ og/eller var. NRRL 3275 og/eller en annen stamme av denne art. I den folgen.de beskrivelse, hvor fremgangsmåten ved fremstilling

av antibiotikaet vil bli beskrevet i detalj er betegnelsen Micromonospora sp. W8<*>+7 ment å skulle innbefatte de farvevarianter som'

er beskrevet særskilt ovenfor, og likeledes alle andre fullt ut ekvivalente organismer av denne art.

(1) Fremstilling av antibiotikakomplekset W81+ 7

Micromonospora sp. W8V7 produserer, spesielt ved regulert dyrkning som senere beskrevet, en kompleks blanding av antibiotisk materiale som i det nedenstående vil bli betegnet Antibiotika-kompleks W8V7.

For å fremstille et egnet podestoff for senere dyrkning, dyrkes Micromonospora sp. W8V7 fortrinnsvis i neddykket, aerobt miljo under kontinuerlig omroring ved temperaturer i området fra ca. 22° til ca. 37°C i et tidsrom av fra 2 til ca. h dager. Vanligvis vil en temperatur på 35°C og et tidsrom av 3 dager finnes mest tilfredsstillende. Det medium som vanligvis anvendes i dette forste formeringstrinn, er vandig og inneholder carbon- og nitrogenmaterialer som kan opptas ay. organismen. Alkaliniteten av mediet innstilles på ca. pH 7,5 ved tilsetning av base såsom natriumhydroxyd, for behandlingen i autoklav foretas.

Eksempler på medier som anvendes ved dette forste formeringstrinn, er de folgende: Medium I: "Bacto" oksekjottekstrakt (Difco), 3,0 gj "Bacto-trypton (Difco)", 5,0 g; dextrose, 1,0 g; potetstiv-else, 2<>>+,0 g; "Bacto" gjærekstrakt .(Difco), 5,0 g;. CaCO^, 2,0 g; ledningsvann 1000 ml; Medium II: "Bacto" gjærekstrakt (Difco), 5,0 g; opploselige fiskestoffer 1,0 g; maisstopvæske 1,0 g; dextrose 20,0 g; CaCO^ 1,0 g-, ledningsvann 1000 ml.

Det er onskelig å utfore et annet formeringstrinn (f.eks. et podnihgstrinn) for man utforer dyrkningen og innhøstningen av antibiotikaet, i den hensikt å anrike podestoffet. Idet der anvendes medier som ovenfor beskrevet, kan friskt medium innpodes i den tidligere fremstile f ormer ing skultur (5$ vektr-volum) og inkuberes ved en temperatur mellom' 22° og 37°C i et tidsrom av mellom 2 og h dager. Vanligvis vil en temperatur av 28°C og et tidsrom av 3 dager finnes å være mest tilfredsstillende.

For fremstilling av Antibiotikakompleks W8V7 kan et 5#-ig (vekt/volum) podestoff tatt fra podetrinnet tilsettes det vandige dyrkningsmedium som for autoklavbehandlingen er blitt innstilt på

pH ca. 7,1 - 7,8. Luft, vanligvis i en mengde av fra 3 til 6 liter pr. minutt, innfores i dyrkningsmediet, og dyrkningen utfores vanligvis ved en temperatur mellom 27° og 37°C i et tidsrom av fra 2 til 6 dager under kontinuerlig omroring. Særlig med hensyn til Medium III, som er omtalt nedenfor, har det vist seg at maksimale utbytter av antibiotikakompleks W8h7 fåes når dyrkningen utfores i 66 timer ved 31°C, under tilforsel av luft i en mengde av h, 5 liter pr. minutt og under anvendelse av en skovlblander som gjor 250 omdreininger pr. minutt. Ved anvendelse av lh liters dyrkningskar inneholdende 10 liter medium ble det under disse betingelser oppnådd utbytter fra 300 til 800g/ml.

Medier som kan anvendes i dyrkningstrinnet, innbefatter f.eks. de folgende: Medium III: sucrose 30,0 g; dextrose 2,5'g; trypticase 17,0 g; NaN03 3,0 g: K^PO^ 3,5 g; MgSO^HgO 0,5 gj FeSO^ 0,01 g; NaCl 5,0 g; ledningsvann 1000 ml; Medium IV: "Bacto" gjærekstrakt (Difco) 5,0 g; dextrose 10,0 g; stivelse 20,0 g; caseinhydrolysat .5,0 g; CaCO^ U-,0 g; ledningsvann 1000 ml-, Medium V: sucrose 20,0 g; pepton 5,0 g; bomullsfrp-proteinhydrolysat 5,0 g"; -CaCO^ >+,0' g; ledningsvann 1000 ml; Medium VI: sucrose 30,0 g; pépton-8,0 g; NaN03, 3,0 g; KgHPO^ 1,0 gj MgSO^^^O 0,5 gj FeSO^ 0,01 g; led-' ningsvann 1000 mlj Medium VII: trypticase" 17 g; NaCl 5,0 g; K2HP0lf 2,5 g,' dextrose 2,5 gj Czapek-Dox dyrknings væske 35,0 g; ledningsvann q.s. 1000 ml.,

For å utvinne Antibiotikakompleks W81+7 fra dyrkningsmediet kan man f.eks. gå frem på folgende.måte: Hele dyrkningsvæsken innstilles på pH ca. 9,5 med base .såsom f.eks. natriumhydroxyd. Hele dyrkningsvæsken ekstraheres derefter med 2.. volumdeler 'pr. volumdel dyrk-' ningsvæske av et egnet, med vann ikke blandbart organisk opplosnirigs-middel, såsom f. eks. ethylacetat, methylendiklbrid, butylacetat, kloroform, butanol og lignende. Opplosningsmiddelfasen.konsentreres derefter under vakuum til et lite volum, hvor konsentrasjonen er omtrent hundredobbelt, og renses ved soylekromatografering under.-anvendelse f.eks. av "LH 20 Sephadex", et alkylert, tverrbundet dextran oppslemmet i ca. 95 $-ig vandig ethanol....Soylen-elueres med den vandige ethanol. Soylefraksjonene slåes sammen i henhold til deres antibakterielle virkninger bestemt ved agarplatetesting . mot Staphylococcus aurens (ATCC 6538P), inndampes til torrhet, opploses i en liter<i> mengde ethylether eller aceton og tilsettes'til ét overskudd av petrolether (kokepunkt ca. 30 - 60°C). Blandingen overfores derefter til' et bad av torris og aceton (omtrent -50°C) og tillates å stå i ca. 20 minutter hvorefter den tillates å anta romtemperatur. Moderluten skilles fra eventuelle oljerester ved dekantering og inndampes til torrhet. Materialet som er fremstilt på denne måte, finnes vanligvis å ha en styrke på ca. 23?-/i/mg i henhold til den nedenfor beskrevne biotestmetode.

Testen utfores i en sylindrisk kopp under anvendelse av Sarcina lutea (ATCC 93^1) som testorganisme. Betingelsene under testen er lik de som anvendes ved sylinderplatetesten beskrevet for erythromycin (Grove og Randall, 1955, Med. Encyclopedia, ln. , X.Y.).

En [ Lg aktivitet av antibiotika-kompleks W8V7 er den mengde materiale som gir en sonerespons på 20,8-0,5 mm under betingelsene ved denne test.

Alternativt kan Antibiotika-kompleks W8V7 f.eks. fremstilles ved anvendelse av den folgende dyrknings- og isoleringsteknikk: Idet Medium I anvendes for tilberedelse av et podestoff, podes kulturflasker inneholdende dette medium med en kultur (omtrent 5$' vekt/volum) av Micromonospora sp. W8V7. Flaskene anbringes på en roterende rystemaskin som drives ved ca. 280 slag pr. minutt og inkuberes ved 28°C i 72 timer. Efter dette tidsrom blir dyrkningskar, som hvert er fylt med dyrkningsmedium (Medium VII f.eks.), innstilt på pH 7,15 - 7,25, podet med omtrent 5$ (volum/volum) av den 72 timers podekultur. Dyrkningsmediet omrores med en hastighet av ca. 500 omdreininger pr. minutt ved en temperatur av 31°0. En luftstrom fores så gjennom mediet i en mengde av ca. 0,5 liter luft pr. liter dyrkningsvæske pr. minutt. Omrbringshastigheten kan okes til 600-omdreininger pr. minutt efter 2h timer og til 700 omdreininger pr.. • minutt efter lf8 timer. Dyrkningen avsluttes efter ca. 69 timer. Dyrkningsvæsken fra samtlige dyrkningskar slåes sammen for ekstra-hering og utvinning av Antibiotika-kompleks W8'+7 som beskrevet nedenfor.

Den sammenslåtte dyrkningsvæske innstilles på pH ca. 9,25 med vandig 50%-ig natriumhydroxyd og ekstraheres med ca. 2 volumdeler ethylacetat, hvorefter ekstraktene konsentreres til omtrent 1 - 2%' av det opprinnelige volum. Ethylacetatkonsentratet ekstraheres derefter minst 2 ganger med halve volumdeler saltsyre (ca. Ojl^+N). Alternativt kan syreektraksjonen utfores med andre mineralsyrer av omtrent samme normalitet. De sammenslåtte syreekstrakter gjores svakt alkaliske med 5%-ig vandig natriumhydroxyd-(til pH ca. 8,5 - 9,0) og ekstraheres minst 2 ganger med omtrent like store volumdeler ethylacetat. De sammenslåtte ethylacetatekstrakter inndampes til torrhet under forminsket trykk, hvorved man får Antibiotika kompleks W8V7. Komplekset vil på dette trinn oppvise en styrke på ^50 - 550 /-cg/mg ved den ovenfor beskrevne test.

(2) ' Karakterisering av Antibiotika- kompleks W3k7

Antibiotika-kompleks ble ved papirkromatograferlng sammenlignet med en rekke antibiotika, deri innbefattet flere macrolider.

I en rekke opplosningssystemer, som vist i den nedenstående tabell 3, beveger Antibiotika kompleks W8V7 seg som en enkelt flekk og skiller seg fra samtlige av de ovrige antibiotika unntatt fra de testede macrolider (nemlig magnamycin, oleandomycin, spiramycin og erythromycin).

.Skjelning mellom Antibiotika-kompleks w8<>>+7 og disse viktige macrolid-antibiotika ble gjort ved tynnskiktskromatografering på kiselsyregel GF plater (Analtech Inc., Wilmiq^on, Delaware). Soner ble påvist efter de folgende to metoder: 1. Plater påsproytes en blanding av konsentrert svovelsyre og methanol (1:1 på volumbasis) og utvikles ved oppvarmning ved 105°C i flere minutter. Sonene av organisk materiale fremtrer som farvede områder mot en hvit bakgrunn.

2. Plater tillates å stå i kontakt med et agarlag podet med

S. aureus. Et ark Whatman papir nr. 1 anbringes mellom det podete agarlag og platen for å sikre at kiselsyregelen ikke hefter til agaren. Papiret og kiselsyregelen fjernes efter 15 minutter. Agarplaten inkuberes ved 37°C natten over, og inhiberingssonene vurderes.

■Resultatene av disse forsok er vist i den nedenstående tabell h.

Ved sammenligning av de fysikalske, kjemiske og biologiske egenskaper av Antibiotikakompleks W8V7 og dets separerte fraksjoner som nedenfor beskrevet med egenskapene av kjente macrolider beskrevet i litteraturen, viser Antibiotikakompleks WS^ og dets komponenter seg å være forskjellige fra alle kjente macrolid-antibiotika.

Antibiotikakompleks W8V7 gir positiv: farvereaksjon ved Nin-hydrin-testen, stivelse-KI-testen og Biuret-testen og negativ farvereaksjon ved stannoklorid-testen, Molisch-testen og Sakaguchi-testen. Komplekset er hovedsakelig gjennomsiktig i det ultrafiol-ette område. Aktiviteten av Antibiotikakompleks W8L+7 endres ikke i noen vesentlig grad når en opplesning av dette underkastes en temperatur av 100°C i 30 minutter gjennom pH-området 2-10 (stabiliteten testes ved å opplose antibiotikumet i ethanol, fortynne med puffer og plateteste mot S. aureus og Escherichia coli). Komplekset viser intet tap av aktivitet efter behandling med trypsin, chymotrypsin, pepsin, a-amylase eller penicillanase i pufrede opplesninger (valg-fri pH for hvert anzym) ved 37°C i opp til 2k timer. Antibiotika-kompleks W3'+7 er oppldselig i de fleste polare organiske opplbs-ningsmidler, såsom f.eks. ethylacetat, methanol, ethanol og aceton.

(3) Separasjon av komponentene av Antibiotikakompleks W8U- 7

Bioautografering av tynne kiselsyregelplater på agar podet

med Sarcinalutea efter kromatografering i et opplosningsmiddelsystem bestående av kloroform og methanol (volumforhold bOt^O) viser at Antibiotikakompleks W8V7 består av minst fire antibiotiske komponenter som i det nedenstående vil bli identifisert som Antibiotikum W3V7 fraksjon A, B, C-^ og C2 (eller som Antibiotikum W8>+7-A, Antibiotikum W8<>>+7-B, Antibiotikum W8<1>f7-C1 og Antibiotikum W8V7-C2). Disse fraksjoner oppviser i det ovenfor beskrevne opplosningsmiddelsystem Rf-verdier på henholdsvis 0,19 (fraksjon A), 0,38 (fraksjon B), 0,52 (fraksjon C^) og 0,65 (fraksjon C?).

Separasjon av fraksjonene kan oppnåes ved at antibiotika-kompleks W8<*>+7 opploses i aceton blandet med kiselsyre, acetonet av-destilleres, og den torre blanding tilsettes på toppen av en kiselsyre soyle. Sbylen elueres med kloroform i methanol (i et volumforhold 60:*+0) og fraksjonene oppsamles. Sbylen analyseres ved at hver fraksjon platetestes mot S. aureus og E. coli. De aktive fraksjoner kromatograferes på kiselsyregel-tynnskiktplater, som tillates å stå i ca. 1,5 timer i det samme opplosningsmiddelsystem som be-nyttes for sbylen. Antibiotikafraksjonenenes monstre bestemmes efter de to ovenfor beskrevne metoder. Fraksjonene slåes.sammen i henhold til deres kromatografiske monstre og konsentreres.

Ved denne metode separeres fraksjon C0 i form av hydrokloridet og isoleres som et hvitt pulver ved opplbsning av de sammenslåtte aktive fraksjoner i methanol og utfeining med ca. 10 volumdeler ethylether. Hydrokloridet av fraksjon C2 har på dette trinn en styrke av ca. 1100 //.g/mg.

Under kromatograferingen overfores W8V7-C2-base til hydrokloridet v^d omsetning med små mengder hydrogenklorid som er til-stede i opplbsningsmidlet. Som ventet oppviser hydrokloridet ingen nevneverdig opplbselighet i ethylether og utfelles fblgelig ved tilsetning av ethylether.

Den frie baseform av W8V7-C2 kan fåes ved tilsetning av fortynnet alkali såsom 0,1N NaOH til en vandig opplbsning av hydro-' kloridet til pH ca. 8,5-9,5 og separasjon av den frie base fra den vandige suspensjon ved filtrering.

Senere fraksjoner som oppsamles fra den ovenfor omtalte sbyle, gir efter sammenslåing og inndampning til torrhet en W8V7-C^-fraksjon i form av et hvitt pulver. På dette trinn oppviser det pulverformige antibiotikum WS^Z-C-^ en styrke på ca. 880 /^g/mg i den ovenfor beskrevne sylinderkopptest.

Ved anvendelse av den ovenfor beskrevne bioautografiske teknikk og kloroform:methanol (i volumforholdet 60:^0) som opplosningsmiddelsystem kan det vises at antibiotikumisolat WS^-C-^ har bred antibakteriell aktivitet in vitro mot de folgende grampositive og gram-negative organismer:

Bacillus subtilis ATCC 6633

Sarcina lutea ATCC 93<»>fl

Staphylococcus aureus ATCC 6538P

Pseudomonas aeruginosa ATCC 8689

De gjenværende aktive fraksjoner fra kiselsyresbylen kan slåes sammen og ytterligere separasjon oppnåes ved kromatografering på en "Florisil"-sbyle (magnesiumsilikat) på folgende måte: Sbylen til-beredes ved at man aktiverer "Florisil"-materialet i 16 timer ved 100°C, fikserer i hexan og heller den erholdte oppslemning på en glassbyle. Sbylen tilfores gjenværende del av antibiotikakompleks W3'+7 (efter fraskillelse av fraksjonene C-^ og C2) opplost i methylenklorid og utvikles i rekkefolge med et absorbsjonsvolum (dvs. det volum opplosningsmiddel som tilbakeholdes av absorberingsmidlet) hexan, et absorbsjonsvolum ethylether, et absorbsjonsvolum ethylacetat og derefter med okende mengder aceton i ethylacetat. Separa-sjonen folges ved platetesting av fraksjonene mot S. aureus og E. coli med påfolgende tynnskiktkromatografering som ovenfor beskrevet.

Ved anvendelse av denne metode kan separasjon av fraksjonene

A og 3 utfores. Begge isoleres som ikke helt hvite pulvere ved inndampning av de sammenslåtte kromatografiske fraksjoner til torrhet. Fraksjoner A og B oppviser styrker på henholdsvis V+ 5/ mg/mg og 71/^ g/mg ved S. lutea testen.

Alternativt kan en blanding av antibiotikafraksjoner W8^7-C isoleres fra det ovenfor omtalte ethylacetatkonsentrat, på folgende måte:_ Residuet opploses i aceton og helles over i koldt vann under kraftig omroring. Oppslemmingen tillates å oppvarmes til romtemperatur og filtreres. Utfelningen består av en blanding av antibiotikum WS^Z-C-^ og antibiotikum W8<1>+7-C2 og vil i det nedenstående bli betegnet som antibiotikakompleks W3!+7-C. Det fåes i dette tilfelle i form av den frie base. Et syreaddisjonssalt av komplekset kan hen-siktsmessig fremstilles ved at man titrerer en methanolopplosning av basen med den onskede syre og utfeller saltet ved tilsetning av ethylether. Når den ovenstående fremgangsmåte anvendes for fremstilling av antibiotikakompleks W8V7-C, kan antibiotikum W8<l>f7-A og antibiotikum W3'+7-B ekstraheres fra det vandige filtrat og ekstrakten derefter konsentreres til et residuum og kromatograferes på magnesiumsilikat som ovenfor beskrevet.

(<!>+) Kjemisk karakterisering av antibiotikafraksjoner

W8'+7-A, -B, -C1 og C2

Antibiotikaene ifolge oppfinnelsen er nitrogenbaser. Folgelig er hver fraksjon istand til å danne syreaddisjonssalter på tilsvarende måte som angitt for antibiotikakompleks W8V7-C. Typiske for slike salter er de som dannes med syrer såsom saltsyre, svovelsyre, fosforsyre, stearinsyre, propionsyre, vinsyre, maleinsyre og lignende. Som det var å vente oppviser også slike salter antibiotisk aktivitet på tilsvarende måte som det frie antibiotikum, idet de imidlertid varierer i styrke og opploselighetsegenskaper.

Antibiotikaene ifolge oppfinnelsen er også hydroxylerte for-bindelser. Folgelig er de istand til å kunne forestres, fortrinnsvis med en hydrocarboncarboxylsyre. Eksempler på slike er estere såsom acetater, propionater, cyclopropyl-carboxylater, succinater, benzoater og lignende. Slike estere oppviser vanligvis antibiotisk aktivitet på tilsvarende måte som det frie antibiotikum, men vanligvis med forskjellig styrke og opploselighetsegenskaper.

Den nedenstående tabell 5 angir de kjemiske og fysikalske egenskaper av antibiotikafraks joner W8V7-A, -B, -C-^ og -C^.

De infrarøde spektra for antibiotikafraksjoner ¥8*4-7-A,

-B, -C-^ og-C2 er vist på tegningen som henholdsvis fig. 1, fig. 2, fig. 3 og fig. h. Bolgelengden ( ju ) er angitt i/£og frekvensen ( y) ) i cm""'", mens T betegner transmittansen og A absorbsjonsevnen. Spektrene for de forskjellige antibiotikafraksjoner ble opptatt under anvendelse av mineralolje "Nujol", og de viktigste absorb-sjonstopper er angitt i tabell 6 med de folgende betegnelser: VS = meget sterk (very strong), S = sterk (broad), M-S = moderat til sterk (moderateto strong), M = moderat (moderate), W = svak (weak), bid!? = bred (broad), shp = skarp (sharp), shd = skulder (shoulder)

og sb = sidebånd (side band). Topper som skyldes "Nujol"-mediet snarere enn den testede W8V7-fraksjon er betegnet "N" (for "Nujol").

Antibiotikaf raks joner W8*4-7-A, -B, -C^ og -C2 har karakteristiske kjernemagnetiske resonansspektra (NMR) som vist på tegningen som henholdsvis fig. 5, fig. 6? fig. 7 og fig. 8. NMR-spektrene ble opptatt ved hjelp av et Varian-A-60-A spektrometer ved anvendelse av en opplbsning (ca. 0,<*>f ml, av konsentrasjon ca. 20 mg/ml) av en prove av hver fraksjon i deutertert kloroform. Spektrene er gjen-gitt i deler pr. million deler (DPM) fra tetramethylsilan, som er den interne standard.

På grunnlag av de foregående kjemiske og fysikalske egenskaper er den antibiotiske konstituent av antibiotikum. W8V7 antatt å ha folgende molekylæré struktur:

hvor i antibiotika W8V7-A, R^=Rp=hydrogen;

i antibiotika ¥8*1-7-B, R-^hydrogen, R2=acetyl;

i antibiotika ¥8*f7-C, R1=R2=acetyl; og

i antibiotika ¥8*f7-C2, R^=acetyl, R2=propionyl.

Stabiliteten av antibiotikafraks joner ¥8<*>f7-A, -B, -C-^ og -C2 er som folger: Ved pH 2,0 - 6,0 og temperatur 100°C påviser fraksjoner A og B betydelig tap av aktiviteten i lopet av 30 minutter. De er imidlertid stabile når de underkastes de' samme betingelser ved pH 7,0 - 10,0. Fraksjon C 1 er derimot stabil ved pH 2,0 - 8,0 i 30 minutter ved 100°C men er ustabil under de samme betingelser ved pH 10,0. Fraksjon C2 er ustabil både i surt miljb (pH = 2,0) og alkalisk mil jo (pH = 10,0) ved 100°C, men er stabil ved pH *f,0 - 8,0 i 30 minutter ved 100°C.

(5) Biologiske egenskaper av antibiotikakompleks ¥8<*>+7, av fraksjoner A, B, C, og C9 og av antibiotikakompleks W8* f7- C <1> ^

A. Tester in vitro

Antibiotikakompleks ¥8<*>+7, fraksjoner A, B, C-^ og C2 og Antibiotikakompleks ¥81+7-C har alle et bredt spektrum av antibakteriell aktivitet in vitro mot et stort utvalg av gram-positive og gram-negatijve organismer. De kan derfor anvendes både i form av et kompleks og^.i form av individuelle fraksjoner for rengjoring og sterilisering av gl^ssuts.tyr. t laboratoriet, for rengjoring og steri-o, i rie' r\ v;> alnitseio rbiinogtC^iCkåva^ .)kanirvuerndgeiss kes-amimnesn trummeed ntsåepr er og og ligvnaesnkdeme. idlVer idefroe r kraen ngdjoisrsineg av områder ;som inve'ndes for tilberedning og servering av mat, såsom kjokkener-, £ p i s e r o m ~ 6 g T1 i'g n e n cf é'"

O o

pet; antibakterielle spektrum in vitro av antibiotikakompleks W3h7J', fråks^one::- A, B, C-, og Cp og antibiotikakompleks WB^+7-C mot typiske g-råm-positive ©g -gram-negative organismer er vist i den nedeffstå.eAdé tabell 7T' De' testede organismers folsomhet overfor antibiotikaene Die bestemt ved en rbrtest i en dyrkningsvæske av gjær^og q,ks'ekjo';t inn st i;Lt rpå:vpH:> 8, 0 med natr iumhydroxyd. Mikroorganisme-:;Vamme:ie s'øm ^ble testet, er identifisert ved samlings - nummer. denne tabell og i senere tabeller refererer de tall som folger ef4er bokstavene "DA" seg til samlingen tilhbrende Schering

-Corporlation^.BlcomfieM f(-N.cJ..% rUSA.

I den nedenstående tabell 8 er den antibakterielle aktivitet av Antibiotikakompleks W3<!>+7 sammenlignet med aktiviteten av erythromycin, penicillin G og methicillin (idet. folsomheten ble bestemt ved hjelp av ovennevnte rortest). Testene ble utfort under anvendelse av de folgende medier: Antibiotikakompleks W8V7 og erythromycin i gjær-oksekjott-dyrkningsvæske ved pH 8,0; penicillin G og methicillin i gj^r-oksekjott-dyrkningsvæske ved pH 6,8. Resultatene viser at Antibiotikakompleks W8'+7 kommer heldig ut av sammenligningen med hensyn på aktivitetet med de andre antibiotika som ble testet mot gram-positive bakterier. Dessuten er antibiotikakompleks W8<*>+7 aktivt mot Mycobacterium smegmatis ved lavere konsentrasjon enn erythromycin, mens penicillin og methicillin er inaktive opp til 10 /kg/ml.

B« Tester i " vivo . <• , o ■, ^--^ • -, -, ^

i—-u^u :i'.:itt:.:ci"caenae tabell o er nen -tnt iDaktem elle aktivitet

av Ant Sbmobi/Ienifforn arig:itVt3Vpp;vis:eæn:ah^ fanttLtrro-b ioitlkakompleks 1 WtS<!->K7-fig o.ge tfir.aksgi»h>e r(-Jt|cB,f'iG^sogh.et,eietbIbre"d<fcs spektrum alvj ahtt imi kro.-b.ielln Jaktii>Mtett mo t ngÆ\'amp:os iM«.veu b gb :g r anmé-gativee .mitkivos-orgaMsffiérgenl-nnbef "a-tite tArit dehoJgr]amtp©såMv.e Igruppeg e.rr,pJait:ogieBei mikro-orgianlfsmerk.inhlbef^aitlt-ehdes^riter -avd siléktehe ravn Sctr:ep±iocfåc(Gus^e Slt:aphylbiT cb cgjiisr ø.gkjMlpiib^beKja-s^n:sioms «iifes -å » f oarårs alke nfangiel "sykdom s\tlclsitaader. F.otr Jsklj :eltL:'iig,ek <arjté rk :a vV/fS-t/åphyiloeo cleu sd b;g iS it rep tøe o:e;cusi gæiidæ 10 ngah iteme-r S;omn fpTårls-akertin&st iM:s <h®sirkv.eg. - rn Dils set arterorkanleleittts bek jrempegr am-veds tofl élp Vavkdef her. beisfcrevnen anit i-b.lbiiikat elf-tle-R-n rfeliat Mtivkoæftv.asrtigno t b<*>éhanal(ihgi; ium smegnnfcis ved luve ru konsentrasjon enn erythromycin,

mens P^ibUVikåko^l^ ^B^t^^^g ant i-biotikakompleks W8V7-C er også aktive mot gråmnegative organismer, inklusive arter av slektene Escherichia, Salmonella, Prbteus og Pseudomonas. Disse organismer er ansvarlige for mange sykdomssymptom-komplekser såsom infeksjoner i urinaltrakten og diareer. Slike sym-tomkomplekser er meget vanlige hos husdyr såsom kveg, hester, får, svin, hunder og katter og kan bekjempes effektivt og behandles ved hjelp av de her beskrevne antibiotika.

Antibiotikakompleks W8<*>+7 gir oppslemmet i peanbttolje en

LD^q (dbdelig dose for 50$ av de testede dyr) på 270 mg/kg for mus ved intraperitoneal administrering. Ved subkutan og oral administrering er LD^q stbrre enn 5000 mg/kg. Den beskyttende dose for 50$ av de testede dyr, PD^q er 150 mg/kg ved subkutan administrering (oppslemmet i peanbttolje) mot en dbdelig infeksjon av S. aureus på mus. Mot Streptococcus pyogenes er PD^q for mus 100 mg/kg ved subkutan administrering.

I tillegg til det ovenstående kan det opplyses at antibiotika-kompleks W8<!>+7 s°a administreres på hunder i en dose av 17,5 nig/kg kan påvises i blodserumet i 7 dager. Dette er overraskende, tatt i be-traktning av at en sammenlignbar dose av erythromycin ikke kan spores efter 2h timer.

Data for akutt toksisitet av Antibiotikakomplekset og

-fraksjonene W8<!>+7 er oppfort i den nedenstående tabell 10.

Tabeller 11, 12 og 13 illustrerer den beskyttelse av dyr som oppnåes med antibiotikaene ifolge oppfinnelsen.

Antibiotikafraks jon w8'+7-A oppslemmet i 0,5%-ig vandig carboxymethylcellulose og dispergert ved ultralydbehandling er aktiv ved subcutan administrering på mus mot S. aureus Gray med en PD-0 (beskyttende dose for 50$ av de testede dyr) på 20 mg/kg og mot P. aeruginosa med en PD^Q på 161 mg/kg. LD^Q ved subcutan administrering på mus er 7000 mg/kg.

Antibiotikafraksjon W8V7-B oppslemmet i peanbttolje er aktiv ved subcutan administrering på mus på S. aureus med en PD^q på

150 mg/kg, og mot P. aeruginosa forsinker 350 mg/kg dbden med 2h timer. ^ >^ q vsci subcutan administrering på mus er stbrre enn 500 mg/kg.

Antibiotikafraks jon W8!+7-C-L oppslemmet i 0,5%-ig vandig carboxymethylcellulose og dispergert ved ultralydbehandling er aktiv på mus mot S. aureus. Ved subcutan administrering mot S. aureus Gray har den en PLVq på 62 mg/kg. Likeledes har den ved subcutan administrering en PD^g på 180 mg/kg mot S. pyogenes C. Antibiotikumet er noe mindre aktivt oralt, idet det har en PD^Q mot S. aureus Gray og S. pyogenes stbrre enn 250 mg/kg. Ved subcutan administrering er LD^0 for mus stbrre enn 1000 mg/kg. Antibiotikum WS<i>+7-C^ oppviser også antimalariaaktivitet mot Plasmodium berghei, og når det administreres på gnagere (100 rng/kg/dag) 2k timer efter infisering forår-saker det en betydelig nedsettelse av blodparasittmengden.

Antiotikafraksjon ¥8<*>1-7-02 er i form av en suspensjon i vandig carboxymethylcellulose aktiv ved subcutan administrering. Det anvendes imidlertid med stbrre fordel i form av en vandig opplbsning av dens hydroklorid og har ved subcutan administrering på mus en PD^0 på *+5 mg/kg mot S. aureus Gray og en PD^Q på 10 mg/kg mot

S. pyogenes C. Ved oral administrering har den en PD^Q på 100 mg/kg mot begge organismer. Ved intraperitoneal administrering er LD^0 for mus stbrre enn 500 mg/kg.

De folgende eksempler vil illustrere foretrukne metoder for fremstilling av de ovenfor beskrevne antibiotika.

(1) Dyrkning av mikroorganismene

Eksempel 1 - Dyrkning i rysekolbe

A. Formeringstrinnet

0,5 ml av en lyofilisert kultur av Micromonospora sp. W8V7 ble tilsatt til en 300 ml's Erlenmeyerkolbe inneholdende. 100 ml av det folgende medium, innstilt på pH 7,5 med fortynnet natrium-

hydroxyd for sterilisering:

Kolben med innhold ble inkubert i 3 dager ved 37°G på en roterende ryster (280 omdreininger pr. minutt, 5 cm slag).

B. Podningstrinnet

25 ml podningsstoff fra formeringstrinnet ble overfort aseptisk til en 2 liters Erlenmeyerkolbe inneholdende 500 ml av det sterile medium som ble amendt ved formeringstrinnet. Kolhen med innhold ble inkubert i 3 dager ved 28°C på en roterende ryster (280 omdreininger pr. minutt, 5 cm slag).

C. Dyrkningstrinnet

25 ml's aliquotdeler ble overfort aseptisk fra podningstrinnet til en 2 liters Erlenmeyerkolbe inneholdende 500 ml av det folgende sterile medium, innstilt på pH 7,8 med fortynnet vandig natriumhydroxyd for sterilisering:

Kolbene og deres innhold ble inkubert i h dager ved 28°C på en roterende ryster (280 omdreininger pr. minutt, 5 cm slag). Innholdet av kolbene ble slått sammen og en aliquotdel av hele dyrkningsvæsken ble innstilt på pH 9,5 og ekstrahert med ethylacetat (omtrent 2 volumdeler pr. volumdel dyrkningsvæske). Losningsmiddelfasen ble fraskilt og konsentrert til en prosent av det opprinnelige volum under vakuum. Konsentratet ble undersokt på aktivitet ved agarplate-diffusjonsteknikk under anvendelse av S. aureus (ATCC 6538P) som testorganisme.■ Konsentratet ga en hemningssone på omtrent 20 - 35 mm.

Eksempel 2 - Dyrkning i t ank

A. Formeringstrin.net

FormerLigstrinnet og podningstrinnet ble utfort som beskrevet

i eksempel 1.

B. Dyrkningstrinnet

500 ml podestoff ble overfort aseptisk til en 1<*>+ liters dyrkningstank inneholdende 10 liter sterilt medium som angitt i eksempel 1, til hvilket det var tilsatt 6 ml antiskumningsmiddel, "Dow Corning B". Dyrkningen fikk pågå i 66 timer under folgende betingelser:

Efter dette tidsrom hadde styrken av det fremstilte antibiotikum nådd en topp, som forble hovedsakelig konstant. Under dyrkningen forble dyrkningsblandingens pH hovedsakelig innenfor området 7,2 - 8,2. Volumet av sammenpakkede celler nådde en konstant verdi av 3,5 - <*>+,5 ml. Aktiviteten av det fremstilte antibiotikum i hele dyrkningsvæsken av en sonediameter på 15 - 25 mm ved platetesting mot S. aureus eller P. aeruginosa.

Eksempel 3 - Dyrkning i tank

A. Fremstilling av podestoffet

Til fire 2 liters kolber som hver inneholdt 500 ml steril dyrkningsvæske som beskrevet i eksempel 1 A, ble tilsatt 0,5 ml av en lyofilisert kultur av Micromonospora sp. W8V7. Kolben ble anbragt på en roterende ryster som ble drevet ved 280 slag pr. minutt (5 cm slag) og inkubert ved 28°C i 72 timer.

B. Dyrkningstrinnet

Til hver av de fire dyrkuingstanker ble tilsatt 10 liter av folgende sterile dyrkningsmedium, innstilt på pH 7,15 - 7,25 for s terilisering:

Hver dyrkningstank ble podet med 500 ml av den ovenfor fremstilte 72 timers podekultur. Temperaturen av dyrkningsmediet ble bragt til 31°C og omrort ved 500 omdreininger pr. minutt mens en luftstrom ble ledet gjennom mediet i en mengde av 0,5 liter luft pr. liter dyrkningsvæske pr. minutt. Omroringshastigheten ble oket til 600 omdreininger pr. minutt efter 2<*>+ timer og til 700 omdreininger pr. minutt efter <*>f8 timer. Dyrkningen■ble avsluttet efter 69 timer. Dyrkniagsvæskene av de fire dyrkningstanker ble slått sammen for ekstraksjon (ca. 37 liter).

(2) Ekstraksjon av Antibiotikumkompleks W8*+ 7

Eksempel h

Ekstraksjon av Antibiotikakompleks w8'+7 ved dyrkning i laboratoriet ( kromatograferingsteknikk)

60 liter av dyrkningsvæsken fremstilt efter fremgangsmåten beskrevet i eksempel 2 ble innstilt på pH 9,5 med fortynnet vandig natriamhydroxyd. Det ble ekstrahert med 2 volumdeler ethylacetat for hver volumdel dyrkningsvæske. Losningsmiddelfasen ble fraskilt og konsentrert under vakuum til det var oppnådd et oljeaktig residuum (ca. 30,0 g). Den biologiske aktivitet (1/20 fortynning) av dette oljeaktige residuum ga en sone av hemningsdiameter ca. 20 - 30 mm mot S. aureus og ca. 15 - 25 mm mot P. aeruginosa. Det oljeaktige residuum ble renset ved soylekromatografering efter folgende metode: Det ble fremstilt en sbyle under anvendelse av 1000 g "LH20 Sephadex" oppslemmet i 95$ vandig ethanol. Det oljeaktige residuum ble overfort til sbylen og eluert med 95$ ethanol ved en strbmningshastighet av 200 ml/time. 50 ml's fraksjoner ble oppsamlet. Fraksjonene ble slått sammen i henhold til deres antibakterielle aktivitet (bestemt ved agarplatetesting mot S. aureus ATCC 6538P). De fraksjoner som oppviste markert aktivitet ble inndampet til torrhet.

Det faste residuum ble lost i en liten mengde aceton og lbsningen ble helt over i et overskudd-av petrolether (kokepunkt 30 - 60°C). Blandingen ble overfort til et torris/aceton-bad (ca. e-50°C) og blandingen fikk stå i 20 minutter. Derefter fikk blandingen anta romtemperatur, og moderluten ble skilt fra det oljeaktige residuum ved dekantering. Ved Inndampning av moderluten til torrhet ble det erholdt renset Antibiotikakompleks ¥8<*>+7.

Det således fremstilte Antibiotikakompleks W8V7 hadde en styrke

av ca. 225 - 275 Ag/mg når det ble underkastet den ovenfor beskrevne sylinderkopptest.

Eksempel 5

Ekstraksjon av Antibiotikakompleks ¥8*1-7 efter dyrkning i tank ( opplosningsmiddelekstraJtsjon)

Den samlede dyrkningsvæske (ca. 37 liter) som ble erholdt som

i eksempel 3 hie innstilt på pH 9,5 med 50%-ig vandig natriumhydr-

oxyd. Det ble ekstrahert med to. volumdeler ethylacetat og ekstrakten ble inndampet til et volum av 2150 ml. Antibiotikakompleks ¥8*1-7 hie isolert efter en av de folgende metoder:

A. Ekstraksjon med saltsyre

En 500 ml's aliquotdel av ethylacetatkonsentratet ble ekstra-

hert to ganger med 250 ml's porsjoner av 0,5$ (0,l<*>fN) saltsyre. De sammenslåtte syreekstrakter ble gjort svakt alkaliske ved tilsetning av 5$-ig vandig natriumhydroxyd (pH ca. 8,5 - 9,0) og ekstrahert to ganger med 250 ml's porsjoner ethylacetat. Ethylacetatekstraktene ble slått sammen og inndampet til torrhet under redusert trykk-. Det således erholdte kompleks hadde en styrke av ca. 525 /tLg/mg når det ble underkastet den ovenfor beskrevne sylinderkopptest.

B. Ekstraksjon med svovelsyre

Man gikk frem som beskrevet i eksempel 5 A, idet 0,1 N svovelsyre ble benyttet i stedet for saltsyre. Det således erholdte kompleks hadde en styrke av ca. 550 Aug/mg når det ble underkastet sylinderkopptesten.

(3) Oppdeling av Antibiotikakompleks ¥8*+7 og fremstilling

av derivater

Eksempel 6

Isolering av Antibiotikaf raks jon ¥8<*>+7-0o

Det ble fremstilt en soyle (105 cm lang, 7,5 cm i diameterX

under anvendelse av 2000 g kiselsyre (analytisk reagens, Mallinck-.. rbdt) ved å pakke små stykker sammen til et kompakt lag."13,0 g Antibiotikakompleks ¥8*1-7 fremstilt som angitt i eksempel *f, ble lost

i aceton blandet med kiselsyre og acetonet ble destillert av under

vakuum. Den torre blanding ble tilsatt på toppen av sbylen. Sbylen ble eluert med en blanding av kloroform (60 volumdeler) og methanol ( k0 volumdeler) i en mengde av 100 ml pr. time. 200 ml's fraksjoner ble oppsamlet. Sbylen ble kontrollert ved platetesting av hver fraksjon mot S. aureus og E. coli. De aktive fraksjoner ble kromato-grafert ved syre-tynnskiktplater som fikk stå i 1,5 timer i det samme lbsningsmiddelsystem som det som ble anvendt for sbylen. Fraksjonene ble slått sammen i henhold til deres kromatografiske monstre bestemt efter de to tidligere beskrevne metoder (se kapitlet Karakterisering av Antibiotikakompleks W6V7). Fraksjonene ble konsentrert under vakuum. Ved å kombinere fraksjoner som angitt i den nedenstående tabell V+ ble antibiotikafraks jon W8if7-C2-hydroklorid isolert som et hvitt pulver ved at de sammenslåtte residuer ble lost i en volumdel methanol og utfelt med 10 volumdeler ethylether. Dette materiale hadde på dette trinn en styrke av ca. 1000 /^g/mg når det ble underkastet den ovenfor beskrevne sylinderkopptest.

Isolering av Antibiotikaf raks j on W8<1>+7-G1

Ved kombinasjon av senere fraksjoner som angitt i den nedenstående tabell 1}+ ble en antibiotikaf raks jon WS^-C-^ isolert i form av et hvitt pulver ved at de utfelte sbylefraksjoner ble Inndampet til torrhet. På dette trinn hadde dette materiale en styrke av ca. 900 / jcg/ mg ved sylinderkopptesten. Det gjenværende aktive materiale ble eluert fra sbylen, samlet og konsentrert til et residuum.

Eksempel 7

Isolering av Antibiotikafraksjon W8V7- A og W8V7- B

500 g "Florisil" ble aktivert ved 100°C i 16 timer, fiksert i hexan og oppslemmet i en glassbyle (lengde 105, diameter 3,8 cm, absorbsjonsvolum 700 ml). Sbylen ble tilfort 2,8 g av residuet fra eksempel 6, opplost i 10 ml methylenklorid, Derefter ble sbylen eluert i rekkefolge med 700 ml hexan, 700 ml ether, 700 ml ethylacetat og bkende mengder aceton i ethylacetat (strbmningshastighet 200 ml/time). 100 ml's fraksjoner ble oppsamlet. Sbylen ble kontrollert som tidligere beskrevet ved testing av fraksjonene mot S. aureus og E. coli med påfblgende tynnskiktskromatografering. Fraksjonene ble slått sammen som angitt i den nedenstående tabell l<*>f.

Resultater av soyleseparasjoner

Eksempel 8

Hydrokloridet av Antibiot ikakompleks W8* f7

Ca. 1<*>1-0 mg Antibiotikakompleks W3*f7, som isolert i eksempel 5 ovenfor ble oppslemmet i ca. 50 ml vann. Suspensjonens pH.ble innstilt på ca. 6,5 - 750 ved tilsetning av fortynnet (n/l) saltsyre og ble kraftig omrort. Eventuelle uoppløselige materialer ble fjernet ved filtrering og filtratet ble lyofilisert. Herved fikk man hydrokloridet av Antibiotikakompleks W8V7 i en mengde av ca. 90 mg og av styrke ca. 551 A-g/mg.

Ved å anvende hovedsakelig samme fremgangsmåte som den beskrevet

i dette eksempel på enten antibiotikakompleks W8<!>+7 eller de forskjellige fraksjoner av dette og ved å anvende ekvivalente mengder av andre syrer såsom f.eks. svovelsyre eller fosforsyre, ble tilsvarende salter fremstilt.

Den nedenstående tabell angir aktiviteten av hydrokloridet, sulfatet og fosfatet fremstilt ut fra et Antibiotikakompleks W3}+7 av styrke 232 /tf,g/mg, mot en rekke grampositive og gramnegative organismer, i et gjær-oksekjbtt-dyrkningsmedium ved pH 8,0.

Eksempel 9

Isolering av Antibiotikakompleks ¥81+7-C

g WS^-ko.mpleks (se 3k3.3-.1pel 5) ble lost i 5,>+ liter aceton og den erholdte opplbsning ble behandlet mel 31 g avfarvende' kull i ca. 30 minutter ved omtrent romtemperatur. Det avfarvende kull ble fjernet ved filtrering og filtratet ble konsentrert i

vakuum til omtrent 2,0 liter. En oppslemning av ca. 80 liter is og vann ble tilbedredt og acetonopplbsningen ble tilsatt under kraftig omroring.. Den erholdte suspensjons temperatur fikk oke til ca. 25°C under omroring og produktet ble adskilt ved filtrering.. Det. faste

materiale ble vasket mel en liten mengde vann og tbrket ved •ia. 50°C i vakuum. Det ble erholdt ca. 212 g Antibiotikakompleks ¥8*+7-C av.. styrke ca. 1075/^g/mg.

Ytterligere mengder produkt (ca. 85 g) kunne utvinnes ved kon-sentrering av moderluten. Dette produkt var imidlertid forurenset med fraksjoner A og B.

Det ovenfor fremstilt Antibiotikakompleks W8V7-C kunne med fordel anvendes for fremstilling av syreaddisjonssalter som vist nedenfor.

Eksempel 10

Fremstilling av tartratet av et Antibiotikakompleks WQh7 - Q

Til et fast materiale bestående av 2,0 g av et kompleks av Antibiotikum' W8V7-C-^ og Antibiotikum W8V7-C25 erholdt som beskrevet i eksempel 9 ovenfor, ble tilsatt under omroring 30 ml diethylether. Til den erholdte opplbsning ble tilsatt 0,5 g vinsyre opplost i 2,5 ml ethanol. Blandingen ble omrbrt i ca. 15 minutter, hvorefter det utfelte salt ble filtrert fra. Qtfelningen ble vasket med diethylether og produktet ble tbrket, hvorved det ble erholdt ca. 2, 0 g tartrat hvis styrke, målt ved biotesten, var ca. 575 A-g/mg og hvis dreining var- -'57° målt med en 1%- ig opplbsning i ethanol.

Eksempel 11

Prppjonatet av Antibiotikakompleks W8V7- C

1,0 g Antibiotikakompleks ¥8*1-7-0 ble lost i 5,0 ml tort aceton og<1> 0,35 ml propionsyreanhydrid ble tilsatt. Blandingen ble omrbrt ved romtemperatur i *+• timer og derefter ble langsomt og under omroring tilsatt 8 ml 1,2$ vandig ammoniakk. Den erholdte utfeining

ble filtrert og vasket med kO%- ±g vandig aceton og derefter med vann. Det erholdte produkt hadde de folgende konstanter: smeltepunkt 207 - 210°C; [cc]j^ ='"-63° (C = 1% i ethanol).

Eksempel 12

Diacetatet av Antibiotikakompleks W8V7- C

11,0 g Wo^+7-C-kompleks ble lost i 55 ml pyridin og 5,5 ml eddiksyreanhydrid ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrbrt Ved romtemperatur i ca. 18 timer og ble derefter under' kraftig )^aroring helt over i 2,0 liter isvann inneholdende 50 ml lk%- ig vandig ammoniakk. Den erholdte utfeining ble filtrert fra, vasket med vann og torret. Herved fikk man det onskede produkt, med smeltepunkt 237 - 2<*>fl°C og med en dreining på ca. -86° (C = 1% i ethanol).

Altérnativt kunne det utfelte produkt ekstraheres med ethyl- ' acetat og ekstrakten vaskes med vann og inndampes til et residuum i vakiinm. Residuet ble derefter lost i aceton, behandlet med avfarvende kull og utfelt ved tilsetning av et like stort "volum vann, hvorved produktet ble erholdt.

( k) Farmasoytis ke doseringsformer

Antibiotikaene ifolge oppfinnelsen kan administreres i de vanlige administreringsformer, i en mengde av omtrent fra 5 til 50 mg antibiotikum pr. kg kroppsvekt pr. dag. Administrering kan hensikts-messig skje fra 2 til 8 ganger pr. dogn. De topiske preparater på-fores vanligvis ved infiserte områder fra 2 til h ganger daglig. Det vil forståes at antibiotikaene ifolge oppfinnelsen kan administreres i form av komplekser, fraksjoner derav eller blandinger av fraksjoner, i fri form eller i form av estere'eller salter. Når antibiotikaene skal administreres i parenterale opplosninger, er det imidlertid;bnskelig at antlbiotikakomplekset, antibiotikafraksjonen eller blandingen av fraksjoner anvendes i form av et syreaddisjonssalt.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av et antibiotisk kompleks med betegnelsen megalomicin og komponentene A, B, C-^ og Q, derav, hvilket kompleks har den generelle formel: hvor R-^ og R2 er hydrogen i megalomicin Å, hvor R er hydrogen og R2 er acetyl i megalomicin B, hvor R^ og R2 er acetyl i megalomicin i C^, og hvjr R er acetyl og R2 er propionyl i megalomicin C2, og salter og estere derav, karakterisert ved at en mikroorganisme av arten Micromonospora megalomicea inkuberes i et vandig næring smedium under aerobe betingelser, og at megalomicin-kompleks eller i det minste en av komponentene A, B, C-^ eller- C2 utvinnes og isoleres i form av fri base eller i form av et salt eller ester derav.

2. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at det som mikroorganisme anvendes Micromonospora megalomicea var. megalomicea (NRRL 327*0.

3> Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at det som mikroorganisme anvendes Micromonospora megalomicea var, nigra (NRRL 3275).<l>+. Fremgangsmåte ifolge hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at megaloml ein-komplekset eller fraksjon A, 3, C-L eller Cp isoleres i form av et fosfatsalt.