CZ285992B6 - Indaceno (3,2-d) oxacyklododecin-7,15-diony, způsob jejich přípravy, ektoparasiticidní prostředky a způsoby inhibice hmyzu, roztočů a hmyzích ektoparazitů - Google Patents

Abstract

Řešení se týká indaceno /3,2-d/oxacyklododecin-7,15-dionů obecného vzorce I, produkovaných nově popsanými třídami Saccharopolyspora spinosa, a jejich adiční solí s kyselinami, které jsou použitelné jako insekticidy, zejména proti druhům Lepidoptera a Diptera. Jsou popsány ektoparaziticidní prostředky a neterapeutické způsoby kontroly populace hmyzích ektoparazitů.ŕ

Description

Indaceno (3,2-d)oxacyklododecin-7,15-diony, způsob jejich přípravy, ektoparaziticidní prostředky a způsoby inhibice hmyzu, roztočů a hmyzích ektoparazitů

Oblast techniky

Vynález se týká nové skupiny makrolidových sloučenin, které mají insekticidní a akaricidní účinek.

Dosavadní stav techniky

Stále je zapotřebí vyvíjet nové insekticidy a akaricidy, neboť cílové organismy si rychle vyvíjejí rezistenci vůči běžně užívaným insekticidům a akaricidům. U antropodů je rezistence vůči insekticidům velmi rozšířená, alespoň 400 druhů je rezistentních vůči jednomu nebo více insekticidům běžně užívaným. Vývoj rezistence vůči starším insekticidům, jako jsou DDT, karbamáty a organofosfáty, je dobře znám. Rezistence se však vyvinula i vůči některým novým pyrotroidním insektidům a akaricidům. Proto je potřeba stále vyvíjet nové insekticidy a akaricidy.

Hubení ektoparazitů, jako jsou blechy, roztoči, bodalky stájové a pod., je již dlouho důležitým problémem při chovu dobytka. Obvyklé ošetřování domácích zvířat se provádí topickou aplikací insekticidů, jako jsou známé koupele pro ovce. Tato ošetřování jsou stále velmi rozšířena. V současné době je úkolem výzkumů nalézat sloučeniny, které by se mohly aplikovat zvířatům, zejména orálně, a které by hubily ektoparazity, jakmile by tito požili krev ošetřených zvířat.

Podstata vynálezu

Předložený vynález se týká nových fermentačních produktů, indaceno(3,2-d)oxacyklododecin7,15-dionu, které jsou označovány jako „A83543“ a které se skládají zjednotlivých složek, označovaných jako A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A85543G, A83543H a A83543J. A83543 a jednotlivé složky A83543 jsou použitelné k hubení hmyzu, zejména druhů Lepidoptera, jako je Prodenia eridania, a Diptera, jako jsou masařky, bodalky stájové a moskyti, a lze z nich připravit užitečné insekticidní prostředky, čímž se jejich použitím snižují populace hmyzu nebo roztočů.

Sloučeniny A83543 podle vynálezu jsou sloučeniny obecného vzorce I

R¹

RO ,R'

(I), kde R je H nebo skupina, vybraná ze souboru, zahrnujícího skupiny vzorců (a) až (d)

- 1 CZ 285992 B6

(C) nebo

R² je

R¹, R³, R⁵ a R⁶ jsou atomy vodíku nebo methyl a R⁴ je methyl nebo ethyl, nebo soli s kyselinami těch sloučenin, kde R je jiné než vodík.

Výhodnými sloučeninami podle vynálezu z hlediska jejich snadné přípravy jsou ty, kde R, R¹, R³, R⁴, R⁵ a R⁶ mají následují významy:

R	R1	R3	R4	R5	R6
(a)	Me	H	Et	Me	Me
(b)	Me	H	Et	Me	Me
(o)	Me	H	Et	Me	Me
(a)	Me	Me	Et	Me	Me
(a)	Me	H	Me	Me	Me
(a)	H	H	Et	Me	Me
(d)	Me	H	Et	Me	Me
(a)	Me	H	Et	H	Me
(a)	Me	H	Et	Me	H
H	Me	H	Et	Me	Me
H	Me	Me	Et	Me	Me
H	Me	H	Me	Me	Me
H	H	H	Et	Me	Me
H	Me	H	Et	H	Me
H	Me	H	Et	Me	H

nebo soli s kyselinami těch sloučenin, kde Rje jiné než vodík.

Aminocukrem v A83543A je β-D-forosamin a neutrálním cukrem v A83543A je a-2,3,4-triO-methylramnóza.

-2CZ 285992 B6

Bylo charakterizováno devět složek A83543. Tyto složky jsou sloučeninami obecného vzorce I, kde R je jiné než vodík.

Mají následující struktury:

Složka	R	R1	R3	R4	R5	R6
A	(a)	Me	H	Et	Me	Me
B	(b)	Me	H	Et	Me	Me
C	(c)	Me	H	Et	Me	Me
D	(a)	Me	Me	Et	Me	Me
E	(a)	Me	H	Me	Me	Me
F	(a)	H	H	Et	Me	Me
G	(d)	Me	H	Et	Me	Me
H	(a)	Me	H	Et	H	Me
J	(a)	Me	H	Et	Me	H
Odstraněním aminocukru ze složek A83543 vzorce I, kde R je H). Složky A, B, C	se získají pseudoaglykony (sloučeniny obecného a G mají společný pseudoaglykon (A83543A

pseudoaglykon nebo pseudo-A). A83543A pseudoaglykon byl nalezen jako přírodní produkt

jako složka A8543. pseudoaglykony mají pseudoaglykon3	Složky D, E, F, H a J mají specifický pseudoaglykon. A83543 následující struktury:
R1	R3	R4	R5	R6
A83543A	Me	H	Et	Me	Me
A83543D	Me	Me	Et	Me	Me
A83543E	Me	H	Me	Me	Me
A83543F	H	H	E	Me	Me
A83543H	Me	H	Et	H	Me
A83543J	Me	H	Et	Me	H

^aR=H

Pseudoaglykony jsou použitelné jako meziprodukty, například pro složky A83543.

Následující odstavce uvádějí souhrnně fyzikální a spektrální vlastnosti složek A83543 a pseudoaglykonů. Níže se používají následující zkratky:

EI-MS:	hmotnostní spektrometrie - ozařování elektrony,
FAB-MS:	hmotnostní spektrometrie - ozařování rychlými atomy,
FD-MS:	hmotnostní spektrometrie - desorpce polem,
HPLC:	vysokotlaká kapalinová chromatografie,
IR:	infračervené spektrum (osa x - vlnočet v cm'1 a osa y - % propustnosti)
NMR:	nukleární magnetická rezonance,
UV:	ultrafialové spektrum.

Charakteristiky A8354A molekulární hmotnost: 731,

Empirický vzorec: C41H65NO10,

FD-MS: viz obr. 4,

FAB-MS(M+1) nalezeno: 732,4706; vypočteno pro C4iH6₆NOi₀ = 732,4687 (viz obr. 8),

-3CZ 285992 B6

EI-MS: nalezeno: 731,4612; vypočteno 731,4608 (viz obr. 10),

UV (EtOH) 243 nm (ε 8 920),

IČ (CHC1₃): v (lakton) 1713; (konjugovaný keton) 1657; multiplety pro C-H, vibrace kolem 2940 a pro C-O vibrace kolem 1060 cm'¹ (viz obr. 1) [a]_D ⁵²⁹: -121,8° (c 1,03, CHC1₃), [a]_D ³⁶⁵: +6,8° (c 1,03, CHC1₃).

Tabulka I uvádí *H a ^,3C NMR data, naměřená u A83543A (v acetonu-d₆).

Tabulka I *H a ¹³C NMR data A83543A v acetonu d₆

poloha	I3C	*Ha
1	172,02	—
2	33,83	3,07/2,45
3	48,13	2,94
4	41,65	3,48
5	129,12	5,86
6	129,66	5,89
7	41,46	2,15
8	36,50	1,99/1,34
9	76,3 Γ	4,31
10	37,65	2,36/1,36
11	46,42	0,93
12	49,74	2,87
13	147,78	7,01
14	144,27	—
15	202,46	—
16	47,74	3,30
17	80,41	3,53
18	30,33	1,51
19	21,85	1,78/1,17
20	34,45	1,50
21	76,24+	4,66
22	28,51	1,48
23	8,97	0,8+
24	15,71	1,12
1'	96,34	4,81
2'	77,61	3,51
3'	81,87	3,37
4'	82,43	3,00
5'	68,03	3,48
6'	17,64	1,18
2'-OCH3	56,66*	3,37
3'-OCH3	58,39*	3,41
4'-OCH3	60,12	3,45
1	103,45	4,45
2	31,24	1,92/1,37
3	18,14	1,84/1,52

-4CZ 285992 B6

Tabulka I - pokračování

poloha	13c	’Ha
4	65,34	2,12
5	73,35	3,56
6”	18,87	1,21
N(CH3)2	40,38	2,22

a některá měření odvozená z 'H/^C korelace, ⁺, * rezonance se stejnými indexy mohou být zaměňovány.

Charakteristiky A83543B

Molekulární hmotnost: 717,

Empirický vzorec: C₄oH₆₃NOio,

FAB-MS: (viz obr. 9).

Charakteristiky A83543C

Molekulární hmotnost: 703,

Empirický vzorec: C^H^NCho,

FD-MS: (viz obr. 5).

Charakteristiky A83543D

Molekulární hmotnost: 745,

Empirický vzorec: C₄₂H₆7NOio,

UV (EtOH) λ^: 244 nm (ε 9 910),

IČ (CHC1₃): v(lakton) 1708; (konjugovaný keton) 1658; multiplety pro C-H, vibrace kolem 2940 a pro C-O vibrace kolem 1070 cm'¹ (viz obr. 2), [a]_D ³⁸⁹: -142,9° (c 1,02, CHC1₃), [a]_D ³⁶⁵: -29,9° (c 1,02, CHC1₃),

FD-MS. Viz obr. 6.

Tabulka II uvádí *H a ¹³C NMR data, naměřená u A83543D (v acetonu-d₆ú.

-5CZ 285992 B6

Tabulka II *H a ¹³C NMR data A83543D v acetonu-d₆

poloha	13C	'Ha
1	172,68	—
2	34,38	3,08/2,43
3	49,01	2,90
4	42,83	3,47
5	123,27	5,54
6	137,26	—
6-CH3	20,81	1,74
7	44,41	2,18
8	35,61	2,01/1,45
9	76,72	4,32
10	38,64	2,37/1,37
11	47,04	1,02
12	50,05	2,78
13	148,47	7,04
14	145,19	—
15	203,16	-
16	48,47	3,30
17	81,03	3,53
18	30,99	1,49
19	22,51	1,78/1,19
20	35,12	1,49
21	76,84	4,65
22	29,16	1,48
23	9,55	0,81
24	16,32	1,12
1'	97,11	4,85
2'	78,33	3,54
3'	82,58	3,40
4'	83,15	3,03
5'	68,71	3,50
6'	18,26	1,18
2'-OCH3	57,31*	3,40
3'-OCH3	59,02*	3,43
4'-OCH3	60,71	3,47
1	104,14	4,47
2	31,96	1,94/1,39
3	18,83	1,81/1,49
4	66,06	2,12
5	74,12	3,55
6	19,42	1,20
N(CH3)2	40,99	2,21
a některá stanovení odvozená z	‘H/13/C korelace,

* rezonance mohou být zaměňovány.

-6CZ 285992 B6

Charakteristiky A83543E molekulární hmotnost: 717,

Empirický vzorec: C40H63NO10,

FAB-MS(M+1): nalezeno: 718, 4526; vypočteno pro ¢^^0,0 = 718,4530,

UV (EtOH) X_max: 244 nm (ε 8 600),

IČ spektrum (KBr) (viz obr. 13).

Tabulka III uvádí *H a ¹³C NMR data, naměřená u A83543E (v acetonu-d₆).

Tabulka III ’H a ^l3C NMR data A83543E v acetonu-dů

poloha	13C	’Ha
1	172,46	—
2	34,95	3,06/2,40
3	48,88	2,95
4	42,11	3,43
5	129,78	5,86
6	130,39	5,90
7	42,11	2,14
8	37,18	2,96/1,39
9	77,06	4,33
10	38,31	2,36/1,36
11	47,18	0,93
12	50,40	2,86
13	148,37	7,06
14	144,84	—
15	203,09	-
16	48,05	3,34
17	81,35	3,55
18	34,98	1,62/1,48
19	22,25	1,77/1,13
20	33,73	1,50
21	72,97	4,68
22	21,61	1,12
23	-	-
24	16,52	1,13
1'	97,11	4,83
2'	78,36	3,55
3'	82,55	3,37

-7CZ 285992 B6

Tabulka ΠΙ - pokračování

poloha	13c	'Ha
4'	83,13	3,02
5'	68,72	3,50
6'	18,26	1,18
2'-OCH3	59,01	3,43
3'-OCH3	57,30	3,40
4'-OCH3	60,69	3,46
1	104,24	4,47
2	32,00	1,93/1,39
3	18,86	2,12
4	66,06	2,12
5	74,13	3,57
6	19,42	1,21
N(CH3)2	40,99	2,21

^aněkterá měření odvozená z *H/¹³C korelace.

Charakteristiky A83543F molekulární hmotnost: 717,

Empirický vzorec: C₄oH₆₃NOio,

FAB-MS (M+l): nalezeno: 718,4534; vypočteno pro

C^HmNOjo = 718,4530,

UV (EtOH) λ,™: 243 nm (ε 10 500) a 282 nm (ε 109),

IČ spektrum (KBr): (viz obr. 14).

Tabulka IV uvádí ^!H a ^l3C NMR data, naměřená u A83543F (v acetonu-d₆).

Tabulka IV ’H a ¹³C NMR data A83543F v acetonu-d₆:

poloha	13C	’Ha
1	172,60	—
2	34,50	3,06/2,42
3	48,82	2,95
4	42,46	3,45
5	129,56	5,87
6	130,39	5,92
7	42,19	2,16
8	37,18	1,97/1,35
9	77,15	4,65
10	38,30	2,33/1,34
11	46,89	0,94
12	50,34	2,84
13	148,86	7,03
14	145,73	—
15	198,68	—
16	45,49	3,22/2,50

-8CZ 285992 B6

Tabulka IV - pokračování

Poloha	13C	’Ha
17	74,17	3,58
18	30,74	1,52
19	22,41	1,70/1,17
20	34,45	1,51
21	77,09	4,32
22	29,05	1,48
23	9,56	0,81
1'	97,19	4,83
2'	78,38	3,53
3'	82,58	3,38
4'	83,15	3,00
5'	68,74	3,48
6'	18,25	1,18
2'-OCH3	59,02	3,43
3'-OCH3	57,31	3,40
4'-OCH3	60,69	3,47
1	100,19	4,53
2	32,41	1,80/1,38
3”	18,86	1,83/1,53
4	66,16	2,13
5	74,01	4,01
6	19,46	1,22
N(CH3)2	41,01	2,22

^aněkterá měření odvozená z ’H/¹³C korelace.

Charakteristiky A83543G molekulární hmotnost: 731,

Empirický vzorec: C4iH₆₅NOio,

FAB-MS (M+l): nalezeno: 732,4661; vypočteno pro

C₄iH6₆NOio = 732,4687,

UV (EtOH) 243 (ε 8 970),

IČ spektrum (KBr): (viz obr. 15).

Tabulka V uvádí *H a ¹³C NMR data, naměřená u A83543G (acetonu-d₆).

Tabulka V 'H a ¹³C NMR data A83543G v acetonu-d₆.

poloha	13C	*Ha
1	172,59	—
2	34,67	3,04/2,46
3	48,72	2,94
4	42,25	3,50
5	129,85	5,84
6	130,26	5,89

-9CZ 285992 B6

Tabulka V - pokračování

poloha	13C	‘Ha
7	42,02	2,14
8	37,12	1,95/1,34
9	76,99	4,32
10	38,28	2,36/1,36
11	47,23	0,91
12	50,43	2,87
13	148,228	7,04
14	144,61	—
15	203,20	—
16	47,94	3,30
17	81,73	3,57
18	35,20	1,55
19	21,68	1,64/1,16
20	31,41	1,64/1,36
21	76,47	4,64
22	28,84	1,48
23	9,61	0,80
24	15,29	1,18
1'	96,98	4,81
2'	78,23	3,52
3'	82,46	3,37
4'	83,05	2,29
5'	68,64	3,49
6'	17,18	1,12
2'-OCH3	58,97	3,42
3'-OCH3	57,25	3,39
4'-OCH3	60,70	3,46
1	99,51	4,80
2	29,62	1,87/1,48
3”	19,31	1,73
4	62,13	2,29
5	69,93	4,20
6	18,22	1,17
N(CH3)2	43,47	2,24
“některá měření odvozena z	'H/^C korelace.

Charakteristiky A83543H

Molekulární hmotnost: 717,

Empirický vzorec: C^H^NOm,

UV (EtOH): λ^: 243 nm (ε 10 000)*, IČ spektrum (KBr): viz obr. 16*.

* stanoveno pro A83543H:J (58:42) směs.

-10CZ 285992 B6

Charakteristiky A83543J

Molekulární hmotnost: 171,

Empirický vzorec: C₄₀H₆₃NO|o,

UV (EtOH): X_max: 243 nm (ε 10 000)*,

IČ spektrum (CHC1₃): viz obr. 16*.

* stanoveno pro A83543 H:J (58:42) směs.

A83543H a J se oddělí zA83543 jako směs (H:J= 58:42), kterou lze dělit kapalinovou chromatografií s vysokou rozlišovací schopností, jak je popsáno níže. Struktury, stanovené jako A83543H a J, jsou založeny na ’H a ¹³C NMR studiích směsi A83543H : J v acetonu-d₆. NMR spektra jsou si podobná a byla srovnávána se spektry A83543A. Větší změny spekter u H a J jsou soustředěny kolem ramnózy. H a J mají pouze dvě OCH₃ v tomto cukru. U složky Η H-Γ je posunuto o 0,1 δ v ’H NMR spektrum a 3 δ v ¹³C NMR spektrum (4,81 a 99,68). Tyto posuny jsou způsobeny nepřítomností methylu na methoxyskupině v poloze 2'. Posuny u složky J odpovídají podobně nepřítomnosti methylu na methoxyskupině v poloze 3'.

Charakteristiky A83543A pseudoaglykonu

Molekulární hmotnost: 590,

Empirický vzorec: C₃₃H₅o09,

UV (EtOH): X_max: 243 nm (ε 10 300),

IČ spektrum (CHC1₃): v (lakton) 1724: (konjugovaný keton 1632; multiplety pro C-H, vibrace kolem 3017; multiplety pro C-0 vibrace kolem 1140 cm’¹ (viz obr. 3),

FD-MS: viz obr. 7,

EI-MS: vizobr. 11.

Charakteristiky A83543D pseudoaglykonu

Molekulární hmotnost: 604,

Empirický vzorec: C34H₅₂O₉.

Složky A83543 lze navzájem rozdělit jednu od druhé použitím následujících analytických HPLC systémů:

Systém I

Kolona: ODA, 3 pm, 4,5 x 50 mm (IBM). Rozpouštědlo: CH₃OH: CH₃CN:H₂O (2:2:1). Průtoková rychlost: 1,0 ml/min.

Detekce: UV při 245 nm.

Teplota: teplota místnosti:

Složka

A

B

C

D retenční čas (min)

8,50

6,15

3,92

11,47

-11CZ 285992 B6

Systém II

Kolona: 4,6 x 100 mm, ODS (AQ-301, S-5; YMC, lne., Mt. Freedom, NJ).

Rozpouštědla: CH₃OH:CH₃CN:0,05% NH₄Oac (H₂O), (A) 35:35:30-pH 7,8, (B) 45:45:10-pH 6,7.

Průtoková rychlost: 2,0 ml/min.

Průtoková doba: 35 min.

Detekce: UV, 250 nm.

Gradient: 10 % B na 25 % B v 20 min; na 50 % B v 30 min.

složka___________

A

A-pseudoaglykon

B

C

D

E

F

G

H

J retenční čas (min)

22,62

7,27

12,65

10,62

25,47

19,22

16,30

18,92

16,30

17,50

Systém III

Kolona: 4,6 x 100 mm, ODS (AQ-301, S-5; YMC, lne. Mt, Freedom, NJ).

Rozpouštědla: CH₃OH:CH₃CN: 0,05% NF^Oac (H₂O)

35:35:30-pH 6,0.

Průtoková rychlost: 2,0 ml/min.

Doba průtoku: 10 min.

Detekce: UV, 250 nm.

složka__________________________________________________retenční čas (min)

F 4,32

H 3,42

J 3,42

Složka A83543 nejsou rozpustné ve vodě, ale jsou rozpustné v rozpouštědlech, jako je methanol, ethanol, dimethylformamid, dimethylsulfoxid, acetonitril, aceton apod.

A83543 a jednotlivé složky, jako je A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H a A83543J, mohou reagovat za vzniku různých solí. Všechny tyto formy těchto sloučenin jsou součástí tohoto vynálezu. A83543 soli jsou použitelné například pro oddělování a čištění A83543. Navíc některé soli mají zlepšenou rozpustnost ve vodě.

Soli A83543 se připravují postupy obvyklými pro přípravu solí. Například A83543 může být neutralizována příslušnou kyselinou na sůl s kyselinou.

Soli s kyselinami jsou obzvláště vhodné. Reprezentativní vhodné soli zahrnují soli, vzniklé standardními reakcemi s jak organickými, tak s anorganickými kyselinami, jako jsou například

-12CZ 285992 B6 kyselina sírová, kyselina chlorovodíková, kyselina fosforečná, kyselina octová, kyselina jantarová, kyselina citrónová, kyselina mléčná, kyselina maleinová, kyselina fiímarová, kyselina cholová, kyselina jablečná, kyselina mukonová, kyselina glutamová, kyselina kafrová, kyselina glykolová, kyselina ftalová, kyselina vinná, kyselina mravenčí, kyselina laurová, kyselina stearová, kyselina salicylová, kyselina methansulfonová, kyselina benzensulfonová, kyselina sorbová, kyselina pikrová, kyselina benzoová, kyselina skořicová a podobné kyseliny.

V dalším popisu výraz „A83543 sloučenina“ s výhodou znamená látku, vybranou ze skupiny, zahrnující A83543, jednotlivé složky A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H a A83543J ajejich soli s kyselinami.

Fermentační produkt A83543 se připravuje kultivací kmene nového mikroorganismu Saccharopolyspora spinosa, vybraného zNRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 a NRRL 18539 nebo z jeho mutantu, produkujícího A83543 za submerzních aerobních podmínek ve vhodném produkčním médiu až do vzniku dostatečného množství A83543. Jak je známo odborníkům v oboru fermentačních postupů, poměr složek v A83543 se mění v závislosti na fermentačních podmínkách, užitých při přípravě. Obecně A83543 obsahuje asi 85-90 % A83543A, asi 10-15 % A83543D a menší množství A83543B, C, E, F, G, H a J a A83543A pseudoaglykonu. Jednotlivé složky, jako je A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H a A83543J a A83543A pseudoaglykon, se mohou rozdělit a izolovat postupem popsaným níže.

Dalším předmětem vynálezu je způsob přípravy sloučeniny A83543, který se vyznačuje tím, že se kultivuje kmen Saccharopolyspora spinosa, vybraný ze skupiny, zahrnující NRRL 18395, NRRL 18357, NRRL 18538 nebo NRRL 18539 nebo jeho mutant, produkující A83543 v produkčním médiu, které obsahuje asimilované zdroje uhlíku, dusíku a anorganické soli, za submerzních aerobních fermentačních podmínek až do vytvoření dostatečného množství A83543. Jednotlivé složky se potom mohou izolovat známými způsoby.

Předložený vynález se také týká biologicky vyčištěné kultury mikroorganismu Saccharopolyspora spinosa, vybraného zNRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 nebo NRRL 18539 nebo jeho mutantu, produkujícího A83543. Tyto mikroorganismy jsou použitelné pro přípravu A83543.

V následujících diskusích jsou kmenům dána následující označení: A83543.1, A83543.3, A83543.4 a A83543.5. Kultura A83543.1 byla získána chemickou mutací kultury (A83543), izolované ze vzorku půdy, sebrané zVirgin Islands. Kultury A83543.3, A83543.4 a A83543.5 byly získány z derivátů kultury A83543.1 chemickými mutacemi.

Kultury A83543.1, A83543.3, A83543.4 a A83543.5 byly uloženy a jsou součástí sbírky kultur v Midwers Area Northem Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604, kde jsou dostupné veřejnosti pod následujícími čísly:

NRRLč.

18395

18537

18538

18539 kmen č.

A83543.1

A83543.3

A83543.4

A83543.5

Taxonomické studie kultury A83543.1 byly provedeny Freederickem P. Mertzem zLilliy

Research Laboratories. Na základě těchto studií byly mikroorganismy A83543.1, A83543.3,

-13CZ 285992 B6

A83543.4 a A83543.5 klasifikovány jako členové nových druhů rodu Saccharopolyspora, který je nazýván Saccharopolyspora spinosa sp. nov. Tyto klasifikace jsou založeny na přímých laboratorních srovnáváních a zkoušeních publikovaných popisů podobných druhů.

Použití metody

Následující metody byly doporučeny projektem Intemational Streptomyces Project (ISP) pro charakterizaci druhů Streptomyce [E. B. Shirling a D. Gottlieb, „Methods for Characterization of

Streptomyces Speciaes“, Int. J. Syst. Bacteriol. 16:313-340 (1966)] a pro charakterizaci druhů

Nocardia v článku R. E. Gordon, D. A. Bamett, J. E. Handerhan a C. H. Pang., „Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica a the Nocardin Strain“, Ing. J. Syst. Bacteriol. 24(1), 54-63 (1974).

Pro určení barvy na spodní straně a na vzdušných hyfách byl použit standardní vzorek ISCC15 NGS Centroid Color Charts, standardní vzorek č. 2106 (National Bureau of Standards, 1958, US.

Department of Commerce, Washington, D.C).

Morfologické studio byly prováděny světelným optickým mikroskopem a rastrovacím elektronovým mikroskopem (SEM).

Izomer diaminopimelové kyseliny (DAP) a sacharidy v hydrolyzátech celých buněk byly stanoveny chromatografickými metodami Beckera a j., [B. Becker, Μ. P. Lechevalier, R. E. Gordon a Η. E. Lechevalier, „Rapid Differentiation between Nocardia and Streptomyces by Páper Chromatography of Whole-cell Hydrolysates,“ Appl. Microbiol. 12, 421-423 (1964)] a 25 Lechevaliery [Μ. P. Lechevalier a H. Lechevalier, „Chemical Composition as a Criterion in the

Classification of Aerobic Actinomycetes.“ Ing. J. Syst. Bacteriol. 20, 435-443 (1970)].

Fosfolipidy byly stanoveny postupem M.P. Lechevalier a H. Lechevalier [v A University

Laboratory Approach, Dietz a Thayer (eds.), Society for Industrial Microbiology Speciál 30 Publication č. 6, Arlington, VA, str. 227-233 (1980)].

Složení menachinonu bylo stanoveno následujícími postupy: R. M. Kroppensteds [v Chemical Methods in Bacterial Systematics, M. Goodfellow a D. E. Minnikin (eds.) 1985, str. 173-196] a M. D. Collins (tamtéž, str. 267-285).

Rezistence na antibiotika byla měřena položením kotoučků pro měření citlivosti antibiotika na povrch agarových desek, naočkovaných ISP č. 2.

Hydrolýza škrobu byla stanovena testováním přítomnosti škrobu jodem na agarových deskách 40 ISP č. 4 (anorganické soli - škrob).

Analýza mastných kyselin byla provedena použitím HP5898A mikrobiologického identifikačního systému [viz L. Miller a T. Berger, „Bacterial Indentification by Gas Chromatography of Whole Cell Fatty Acids,“ Hewlett-Packard Application Notě 228-41, 8pp. (1985), str. 25].

Methylestery mastných kyselin byly stanoveny z lyofilizovaných celých buněk, rostoucích za stejných podmínek.

Analýza základních složek byla dvojrozměrná a generovaná počítačem. Změřené jednotky 50 v diagramu základních složek (viz obr. 12) jsou standardní odchylky. Na obr. 12 osa x = základní složka 1, osa y = základní složka 2.

-14CZ 285992 B6 □ A83 543.1 • S. erythreae

Θ S. hirsuta

O S. hirsuta subsp. Kobensis

Mykolové kyseliny byly stanoveny metodou, navrženou Minnkinem [D. E. Minnikin, I. G. Hutchinson a A. B. Caldicott, „Thin-Layer Chromatography of Methanolysates of Mycolic Acid-Cortaining Bacteria,“ J. Chromatography 188, 221-223 (1980).

Charakteristiky kultur

Kultura A83543. roste dobře jak na komplexu, tak na definovaném médiu. Kultura produkuje vzdušné mycelium na všech použitých médiích. Barva hmoty vzdušných sporů je převážně světle žlutorůžová, ale na mnohých médiích je bílá.

Spodní strana je žlutá až žlutohnědá. Nebyla pozorována žádná zvláštní pigmentace. V některých médiích se do média uvolňoval rozpustný hnědý pigment.

Charakteristiky kultury jsou shrnuty v tabulce VI.

Tabulka VI

Charakteristiky kultury A83 543.1“

medium	růst	barva spodní strany	vzdušné mycelium	rozpustný pigment
růst	barva
ISP médium 2	hojný	76. světle žlutohnědá	hojný	92. žlutobílá	žádný
ISP médium 3	dobrý	264. světle šedá	dobrý	263. bílá	žádný
ISP médium 4	dobrý	92. žlutobílá	dobrý	263. bílá	žádný
ISP médium 5	hojný	73. p. OY	hojný	31. p. yPink	světlehnědý
ISP médium 7	hojný	77. m. yBr	hojný	31. p. yPink	světlehnědý
AIA Agar5	hojný	89. p. Y	hojný	31. p. yPink	hnědý
ATCC č. 172	hojný	92. žlutobílá	hojný	31. p. yPink	žádný
Bennetts	hojný	92. žlutobílá	hojný	31. p. yPink	světlehnědý
malát vápenatý	dobrý	73. p. OY	přiměřený	9. pk. bílá	hnědý
Chitin	přiměřený	92. žlutobílá	přiměřený	263. bílá	žádný
Czapek	dobrý	92. žlutobílá	dobrý	263. bílá	žádný
Emerson	hojný	76. světle žlutohnědá	hojný	31. p. yPink	hnědý
glukózaaspiragin	dobrý	90. gy. Y	přiměřený	31. p. yPink	světlehnědý
glycerolglycin	hojný	78. tmavě žlutohnědá	hojný	80. gy. YBr	tmavěhnědý
Nutrient	hojný	90. gy. Y	hojný	31. p. yPink	světlehnědý
TPOC	hojný	90. gy. Y	hojný	31. p. yPink	žádný
TWAd	přiměřený	93. žlutošedá	slabý	263. bílá	žádný
YDA'	hojný	77. m. yBr	přiměřený	9. pk. White	tmavohnědý

“inkubace při 30 °C po 21 dní, ^bagar pro izolaci aktinomycet, difco, ^cagar s pastou z rajčat a s ovesnou moukou, THE Actinomycetes, sv. 2, S. A. Waksman, The Williams a Wilkins Co., Baltimore, 1961), ^dagar - pitná voda (Gordon, Bamett, Handerhan a Pang, výše), ^eagar kvasinky, dextróza (Gordon, Bamett, Handerhan a Pang, výše).

-15CZ 285992 B6

Morfologické charakteristiky

Kultura A83543.1 produkovala rozsáhlé povrchové mycelium, které se rozpadávalo ve fermentační kapalině. Na agarovém médiu nebyla fragmentace provozována.

Když se kultura umístila na ISP médiu 1, byla pozorovány bílé kruhové kolonie 8 až 10 mm v průběhu se zvýšeným centrem a žlutohnědou barvou na spodní straně.

Na většině médií byly přítomny dobře vytvořené vzdušné hyfy. Vzdušné hyfy se rozdělily do dlouhých řetězců spor, uspořádaných jako zákruty a otevřené smyčky. Byly též pozorovány spirály, avšak byly krátké a nekompletní.

Obecná morfologie byla „Rectus-flexibilis“ (RA).

Vzdušné hyfy měly charakteristický korálkovitý vzhled s mnoha prázdnými místy v řetězci spor. Tento jev demonstroval, že povrch spor obsahuje řetězec spor. Povrch spor je pokryt velmi charakteristickými tmy. Tyto tmy jsou přibližně 1 pm dlouhé a na konci jsou zakulacené.

Tvar spor je protáhlý a měří průměrně přibližně 1,1 x 1,5 pm. Řetězec spor je dlouhý přes 50 spor. Nebyly pozorovány žádné cik-cak charakteristiky, sklerotie, sporangie nebo pohyblivé buňky.

Fyziologické charakteristiky

Kultura A83543.1 produkuje kyselinu z následujících sacharidů: adonitu, D-arabinózy, erythritu, fluktózy, glukózy, glycerinu, mannitu, mannózy, ribózy a trehalózy.

Kultura neprodukuje kyselinu z: L-arabinózy, cellobiózy, celulózy, dextrinu, dulcitu, ethanolu, galaktózy, glykogenu, inositu, inulinu, laktózy, maltózy, melizitózy, melebiózy, a-methyl-Dglukosidu, rafmózy, L-ramnózy, salicinu, sorbitu, L-sorbózy, sacharózy, xylitu nebo xylózy.

Růst byl pozorován u galaktózy, maltózy a melizitózy, avšak z těchto sacharidů nevznikla žádná kyselina.

Kultura A83543.1 využívá následující sodné soli organických kyselin: acetát, butyrát, citrát, formiát, laktát, malát, propionát, pyruvát a sukcinát. Kultura nevyužila benzoát, galaktarát, oxalát nebo vinan.

A83543.1 rozkládá allantoin, malát vápenatý, kasein, elastin, hippurát, hypoxanthin, testosteron, L-tyrosin, močovinu. Nebyla schopna rozkládat adenin, eskulin, guanin, škrob nebo xynthin.

A83543.1 produkuje katalázu, fosfatázu, ureázu a H₂S.

Zkapalňuje želatinu a snižuje dusičnany. Nyní rezistentní vůči lysozynu a neprodukuje melanoidní pigmenty. Nepeptonizuje ani nehydrolyzuje odstředěné mléko. A83543.1 snáší koncentraci NaCl až do a včetně 11 %. Je neschopná přežít 8 hodin 50 °C, ale roste při teplotě mezi 15°Ca37°C.

A83543.1 je rezistentní vůči cefalotinu (30 pg) penicilinu G (10 jednotek) a rifampinu (5 pg). Je citlivá vůči bacitracinu (10 jednotek), gentamicinu (10 pg), linkomycinu (2 pg), neomycinu (30 pg), oleandomycinu (15 pg), streptomycinu (10 pg), tetracyklinu (30 pg), tobramycinu (10 pg) a vankomycinu (30 pg).

-16CZ 285992 B6

Analýza buněčné stěny

Hydrolyzované celé buňky A83543.1 obsahují meso-diaminopimelovou kyselinu. Diagnostikovanými cukry v extraktech celých buněk byly galaktróza a arabinóza. Tak 83543.1 má charakter buněčné stěny typu IV a charakter cukru typu A (Lechevalier a Lechevalier, výše). Buňky neobsahují mykolové kyseliny.

Analýza fosfolipidů celých buněk ukazuje na přítomnost fosfatidylcholinu a kardiolipinu. Fosfatidylethanolamin nebyl detekován. Tak A83543.1 má charakter fosfolipidu typu PIU [Μ. P. Lechevalier, A. E. Stem a H.A . Lechevalier, „Phospholipids in the Taxonomy of Actinomycetes“, Actinomycetes, Zbl. Bakt. Suppl. 11, K. P. Schaal a G. Pulverer (eds), Gustav Fischer Verlag, New York, 1981],

Jako hlavní menachinon byl detekován MK-9 (H4). Rovněž bylo pozorováno menší množství MK-9 (H6).

Povlaky fágů

Řada fágů Streptomycet, Saccharopolyspora a Amycolatopsis byla umístěna na A83543.1. Nebyly pozorovány žádné skvrny.

Identita A83 543.1

Jak bylo uvedeno výše, kultura A83543.1 má charakter buněčné stěny typu IV a charakter cukru celé buňky typu A. V buněčné chemii má tento charakter 13 následujících rodů: Nocardia, Rhodococcus, Corynebacterium, Caseobacter, Mycobacterium, Faenia (Micropolyspora), Pseudonocardia, Saccharomynospora, Saccharopolyspora, Actinopolyspora, Amycoleta, Amycolatopsis a Kibdelosporangium. Tyto rody se rozlišují přítomností nebo nepřítomností mykolových kyselin, složením mastných kyselin a typu fosfolipidu a menachinonu. Faenia, Pseudonocardia a Saccharopolyspora mají chemotaxonomické charakteristiky identické s A83543.1, avšak tyto rody se liší od A83543.1 v morfologických vlastnostech a ve vlastnostech kultur.

Rod Faenia (Micropolyspora) má hebké spory a krátké řetězce spor, které vznikají jak na vzdušných, tak na substrátových hyfách. Jako vzdušné hyfyjsou řídké a mají bílou barvu. Je to termofil, který roste při 60 °C. A83543.1 nemá žádnou z těchto vlastností a tak se liší od rodu Faenia.

Ros Pseudonocardia má spory jak na vzdušných, tak na substrátových hyfách. Rozlišují se aktopetálními očky a blastospory. Mají charakteristickou cik-cak morfologii hyf. Hyfy jsou popsány jako členité, ale nemají přepážky [viz A. Henssen a D. Schafer, „Amended Description of the Genus Pseudonocardia Henssen and Description of a New Species Pseudonocardia spinosa Schafer“, Ing. J. Syst. Bacteriol. 21:29-34 (1971)]. Rostou velmi pomalu. K fragmentaci nedochází neboje pozorována zřídka. A83 543.1 nemají žádnou z těchto vlastností.

Rod Saccharopolyspora je charakteristický obalem spor a zřetelným korálkovitým vzhledem řetězce spor. Tento jev je velmi význačný u A83543.1. Fragmentace byla u rodu Saccharopolyspora také pozorována. Typ třídy S. hirsuta byl izolován z vylisované cukrové třtiny. Mateřská kultura, ze které byl A83543.1 získán, pochází z cukrovaru. Protože A83543.1 má vlastnosti tohoto rodu, je proto považován za kmen Saccharopolyspora.

-17CZ 285992 B6

Jedinými publikovanými třídami rodu Saccharopolyspora jsou S. erythrea a S. hirsuta. Známé podtřídy jsou S. hirsuta subsp. taberi a S. hirsuta subsp. kobensis. A83543.1 se liší od těchto kmenů buď v barvě vzdušných sporů a spodní strany, nebo v produkci rozpustných pigmentů.

Biochemická podobnost byla posuzována sestavením tabulky koeficientů podobnosti, založených na všech možných biochemických měřeních. Byly užity koeficienty Jaccard Sj a jednoduchý přizpůsobovací koeficient S_sm [viz W. Kurylowicz, A. Paszkiewicz, W. Woznicka, W. Kurzatkowski a T. Szulga, „Numerical Taxonomy of Streptomycetes“, Polish Medical Publishers, Warsaw, 1975, str. 37].

Tabulka VII uvádí souhrnně tyto koeficienty podobnosti.

Tabulka VII

Koeficienty podobnosti A83543.1 a tříd Saccharopolyspora

kultura	Ssm	Si
A83543.1	100	100
S. hirsuta subsp. taberi	68	57
S. hirsuta subsp. kobensis	67	60
S. erythraea	63	54
S. hirsuta	55	50

Analýza mastných kyselin A83543.1 a známých tříd Saccharopolyspora ukázala, že obě mají jak nasycené kyseliny, tak mastné kyseliny s rozvětveným řetězcem. Složení mastných kyselin A83543.1 je podobné, ale ne identické, s ostatními kyselinami uvedených tříd. Tabulka VIII srovnává složení mastných kyselin A83543.1 a známých tříd Saccharopolyspora.

Tabulka VII

Procentické složení mastných kyselin A83543.1 a kmenů Saccharopolyspora

mastná kyselina	A83543.1	S. erythraea	S. hirsuta	S. hirsuta subsp. kobensis
15.0 iso	11,80	17,86	15,44	17,94
15:0 anteiso	0,64	1,33	1,38	1,25
16:0 iso	22,47	25,70	15,61	19,05
16:1 trans 9	1,15	-	4,14	2,63
17:1 isoF	7,22	7,97	-	-
17:1 isoG	-	-	3,75	6,82
17:0 iso	17,59	13,37	26,26	19,41
17:0 anteiso	15,30	12,46	14,19	12,72
17:1 B	4,77	1,90	-	0,67
17:1 C	1,65	-	2,70	1,81
17:0	2,74	1,01	1,43	0,94
16:1 20H	1,27	2,07	4,74	4,85
18:1 isoF	7,57	11,31	6,83	7,47
TBSA lOMe	1,15	1,34	1,77	1,00
18:0a

^aTBSA = tuberkulostearová kyselina

-18CZ 285992 B6

Analýza základní složek směsí mastných kyselin, uvedená v tabulce VIII, ukazuje dostatečný rozptyl, což svědčí o tom, že všechny kultury jsou rozdílné třídy téhož rodu. Diagram základních složek, uvedených v tabulce VIII, je znázorněn na obr. 12, viz výše.

Tabulka IX srovnává fyziologické charakteristiky A83543.1 s charakteristikami existujících tříd a podtříd Saccharopolyspora:

Tabulka IX

Různé fyziologické charakteristiky A83543.1 a tříd Saccharopolyspora

charakteristika	A83543.1	S.erythraea	S. hirsuta	S. hirsuta subsp. taberi	S. hirsuta subsp. kobensis
Rozklad:
adeninu	-		+	4-	4-
eskulinu		+	4-	+	+
škrobu	-	+	+	4-	+
xanthinu	-	+	+	+	+
allantoinu	+	-	—	—	ND
redukce dusičnanu	+	4-	-	4-	4-
fosfatáza	+	-	4-	—	ND
Využití:
benzoátu	-	-	+	-	ND
galaktarátu	-	-	4-	-	ND
oxalátu	-	-	4-	-	ND
teplotní rozmezí (°C)	15-37	20-42	25-50	20-42	20-42
snášitelnost NaCl (%)	11	ND*	15	ND	12
Kyselina produkovaná z:
arabinózy	4-	4-	-	4-	-
cellobiózy	-	4-	4-	4-	4*
dextrinu	-	4-	+	+	ND
galaktózy	-	4-	4-	4-	4-
inositu	-	+	4-	4-	-
maltózy	-	4-	4-	+	4-
melezitózy	-	4-	-	4-	ND
melibiózy	-	+	ND	-	ND
rafinózy	-	4-	4-	4-	4-
ramnózy	-	+	4-	4-	-
Salicinu	-	4-	—	-	ND
Sacharózy	-	4-	+	4-	4-
Xylózy	-	+	+	-	-
Laktózy	-	-	4-	-	ND
a-Me-D-glukosidu	-	-	+	4-	ND
Sorbitu	-	-	4-	-	—
Inulitu	-	ND	4-	ND	+

* ND - neděláno

Tato srovnání ukazují, že A83543.1 se dostatečně liší od dříve popsaných tříd Saccaropolyspora a jsou tedy novými třídami Saccharopolyspora, pro které byl vybrán název Saccharopolyspora spinosa. Název ukazuje na spinovou omamentaci spor těchto tříd.

Kmeny A83543.3, A83543.4 a A83543.5 jsou makroskopicky dostatečně podobné kmenu A83543.1, takže byly klasifikovány jako kmeny Saccaropolyspora spinosa. Tyto čtyři kmeny se liší v množství produkovaného A83543. Kmen A83543.3 produkuje přibližně čtyřikrát více A83543 než kmen A8543.1 a kmen A83543.4 a A83543.5 produkují přibližně osm- až devětkrát více než kmen A83543.1.

Tak jako v případě jiných organismů, mohou se i charakteristiky kultur, produkujících A83543 podle vynálezu, Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 a NRRL

-19CZ 285992 B6

18539 nadále obměňovat. Tak lze známými fyzikálními a chemickými metodami připravit mutanty těchto kmenů. Například lze získat jiné kmeny reakcí s chemikáliemi, jako je Nmethyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin. Přírodní i uměle indukované mutanty kmenů Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 a NRRL 18539, které si zachovávají schopnost produkovat dostatečné množství A83543, jsou součástí tohoto vynálezu.

Médiem, užitým pro růst kultur Saccharopolyspora spinosa, může být jakékoliv médium. Určitá média jsou však preferována, a to pro ekonomii produkce, optimální výtěžek a snadnou izolaci produktu. Tak například výhodnými zdroji uhlíku při fermentaci ve velkém měřítku jsou glukóza a maltóza, i když lze též užít ribózu, xylózu, fruktózu, galaktózu, mannózu, mannit, rozpustný škrob, rajčatový dextrin, methyloleát, oleje, jako je sojový olej a pod.

Výhodnými zdroji dusíku jsou moučka z bavlněných semen, peptonizované mléko a vyluhovaná moučka ze sojových bobů, jakož i rybí moučka, kukuřičný výluh, extrakt z kvasinek, enzymem hydrolyzovaný kyselin, extrakt z hovězího masa apod.

Nutriční anorganické soli, které lze dodat do kultivačního média, jsou obvyklé rozpustné soli, které poskytují ionty zinku, sodíku, hořčíku, vápníku, amonné ionty, chloridy, uhličitany, sírany, dusičnany apod.

Do kultivačního média se také dodávají nezbytné stopové prvky, které jsou nutné pro růst a vývin organismů. Tyto stopové prvky se obvykle vyskytují jako nečistoty v ostatních složkách média v množství dostatečném pro požadavky na růst organismu.

Obvykle se do fermentačního média, pracujícího ve velkém měřítku, mohou přidat malá množství (tj. 0,2 ml/1) protipěnicího činidla, jako je polypropylenglykol - je-li pěnění problémem. V případě kultur, produkujících A83543, však běžná protipěnicí činidla inhibují produkci A83543. Pěnění může být kontrolováno použitím oleje ze sojových bojů nebo Pluronic L-101 (BASF) do média (1-3%). Pokračuje-li pěnění, lze přidat další olej.

Procentické složení složek A83543 se může měnit se změnami média. Například přídavkem valinu nebo izobutyrové kyseliny nebo propionové kyseliny vzrůstá procento produkovaného A83543D.

Pro produkci podstatných množství A83543 je výhodné provádět submerzní aerobní fermentaci v míchaných biorektorech. Malá množství A83543 lze připravit kultivací v třepací láhvi. Protože doba produkce ve velkých bioreaktorech je obvykle spjata s inokulaci sporami organismu, je výhodné použít vegetativní očko. Vegetativní očko se připraví inokolací malého objemu kultivačního média sporami nebo myceliálními fragmenty organismu, čímž se získá čerstvá aktivní rostoucí kultura organismu. Vegetativní očko se potom přenese do většího bioreaktoru. Médium s vegetativním očkem může být totéž, jako při větších fermentacích, avšak jsou vhodná i jiné média.

A83543 je produkováno organismy, produkujícími A83543, které rostou při teplotách mezi asi 24 °C a asi 33 °C. Optimální teplota pro produkci A83543 je asi 28 až 30 °C.

Jak je obvyklé u submerzních aerobních kultivací, probublává se nádobou ode dna sterilní vzduch, zatímco médium se míchá běžnými turbínovými čerpadly. Stupeň provzdušňování a rychlost míchání by měly obvykle být takové, aby udržovaly hladinu rozpuštěného kyslíku na nebo nad 35 %, s výhodou na nebo nad 50 %, za vnitřního tlaku v reaktoru 34,3 kPa.

Produkci složek A83543 lze během fermentace sledovat testováním extraktů živné půdy. Pro tyto účely lze užít HPLC za použití systému, popsaného v příkladu 1.

-20CZ 285992 B6

Po provedení submerzní aerobní fermentaci lze složky A83543 izolovat z fermentačního média známými způsoby. A8353, produkované během fermentace organismu, produkujícího A83543, se vyskytuje jak v myceliu, tak v živné půdě. A83543 je lipofilní. Takže, použije-li se při fermentaci podstatné množství oleje, je více účinná extrakce celé živné půdy. Použijí-li se pouze malá množství oleje, pak větší část A83543 je v myceliu. V tomto případě se účinnější izolace A83543 dosáhne tím, že se nejprve přefiltruje médium, čímž se oddělí živná půda od myceliální hmoty (biomasa).

Z biomasy lze A83543 získat různými způsoby. Výhodný způsob spočívá v promývání oddělené biomasy vodou, čímž se odstraní zbylá živná půda, dále ve smíchání biomasy s polárním rozpouštědlem, ve kterém je A83543 rozpustné, například smethanolem nebo acetonem, v oddělení a zahuštění rozpouštědla, v extrakci koncentrátu nepolárním rozpouštědlem a/nebo v adsorpci na silikagel s reverzní fází, jako je RP-C8 nebo RP-C18, nebo vysoce porézní polymer, jako HP-20 apod.

Aktivní materiál se eluuje z adsorbentu vhodným rozpouštědlem, jako jsou například směsi acetonitrilu s methanolem s obsahem malých množství tetrahydrofuranu.

A83543 lze rozdělit na jednotlivé složky A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H a A83543J a A83543A pseudoaglykon podobnými technikami. Výhodná je chromatografie na silikagelu (Ci₈ nebo Cg) s reverzní fází.

Jako zdroje A83543 lze alternativně užít pevné látky z kultury, včetně složek média a mycelia, bez extrakce a rozdělování, ale výhodně po odstranění vody. Například po produkci A83543 lze celo fermentační živnou půdu vysušit Iyofilizací, vysušením v bubnu nebo azeotropickou destilací a sušením. Vysušenou živnou půdu lze potom užít přímo, například jejich přimíšením přímo do krmivových předsměsí.

Insekticidní a akaricidní účinek

Sloučeniny podle vynálezu lze použít k hubení hmyzu a roztočů. Předmětem předloženého vynálezu je tedy také způsob inhibice hmyzu nebo roztočů, který spočívá v aplikaci inhibičních množství sloučeniny A83543 na místa, kde se hmyz a roztoči vyskytují.

Sloučeniny A83543 jsou účinné proti řadě hmyzu a roztočů. Zejména vykazují účinek proti Spodoptera eridania, který je členem řádu Lepidoptera. Ostatními typickými členy tohoto řádu jsou obaleč jablečný, osenice polní, šatní moli, moli z kukuřičné mouky, „leaf rollers“, Heliothis zea, zavíječ kukuřičný, bělásek řepový, Trichoplusia ni, Pectinophora gossypiella, Thyridopteryx ephemerae-formis, Malacosoma americanum, „sod webrorm“ a Spodoptera frugiperda.

Sloučeniny jsou také účinné proti mšici bavlníkové, která je členem hmyzu řádu Homoptera. Ostatní členy Homoptera jsou pidikřískové, „planthopera“, mera hrušňová, mera jablečná, červci „whiteflies“ a pěnodějky, jakož i řada dalších tříd mšic, specifických pro hostitele.

Navíc sloučeniny A83543 jsou účinné proti bodalkám stájovým, masařkám a komárům, kteří jsou členy řádu Diptera. Dalším typickým členem tohoto řáduje obyčejná moucha domácí.

Sloučeniny A83543 jsou použitelné pro snižování populací hmyzu a roztočů a používají se při způsobu inhibice populace hmyzu a roztočů, který spočívá v aplikaci účinného množství sloučeniny A83543 na místo, kde se hmyz a roztoči vyskytují.

„Místo“, kde se vyskytuje hmyz nebo roztoči, znamená prostředí, kde hmyz nebo roztoči žijí nebo kde jsou přítomna jejich vajíčka, včetně okolního vzduchu, jídla, která požírají, nebo

-21CZ 285992 B6 předmětů, jichž se dotýkají. Například hmyz nebo roztoče, živící se rostlinami, lze hubit aplikací účinné látky na části rostlin, které hmyz nebo roztoči požírají nebo obývají, zejména listy.

Uvažuje se i o tom, že tyto sloučeniny by mohly být také použitelné k ochraně textilu, papíru, skladovaného obilí nebo semen aplikací účinné látky na tyto látky.

Výraz „inhibice hmyzu nebo roztočů“ znamená snižování počtu živého hmyzu nebo roztočů nebo snižování počtu životaschopných vajíček hmyzu nebo roztočů. Rozsah snížení, dosahovaný danými sloučeninami, závisí samozřejmě na množství aplikované sloučeniny, speciální použité sloučenině a cílových třídách hmyzu nebo roztočů. Mělo by se používat alespoň množství, inaktivující hmyz nebo roztoče.

Výrazy „množství inaktivující hmyz“ a „množství inaktivující roztoče“ se používají pro množství, které je dostatečné pro to, aby se dosáhlo měřitelného snížení populace ošetřeného hmyzu nebo roztočů. Obvykle se používá množství v rozmezí od asi 1 do asi 1 000 ppm (nebo 0,01 až 1 kg/ha) účinné látky.

Výhodným rysem předloženého vynálezu je způsob inhibice příhodného hmyzu řádu Lepidoptera, který se vyznačuje aplikací účinného hmyz inaktivujícího množství sloučeniny A83543 podle vynálezu na rostliny.

Dalším výhodným rysem předloženého vynálezu je způsob inhibice bodavých much řádu Diptera u zvířat, který se vyznačuje podáváním účinného škůdce inhibujícího množství sloučeniny A83543 orálně nebo parenterálně zvířeti.

Testy na roztoče/hmyz

Sloučeniny A83543 byly testovány na akaricidní a insekticidní účinnost následujícím způsobem.

Každá testovaná sloučenina byla formulována rozpouštěním sloučeniny ve směsi aceton/alkohol (1 : 1), obsahující 23 g Toximulu R (směs sulfonátu a neionogenního emulgátoru) a 13 g Toximulu S (směs sulfonátu a neionogenního emulgátoru) na litr. Tyto směsi se potom zředí vodou za vzniku doporučovaných koncentrací.

Na cotyledony tykve se nanesou svilušky snovací (Tetranychus urticae Koch) a bavlníkové nebo melounové mšice (Aphis gossypii Glover) a nechají se usadit na obou površích listů. Ostatní rostliny vtémže ošetřovaném květináči se nechají nezamořené. Listy se potom postříkají 5 ml testovaného roztoku pomocí DeVilbissova rozprašovače při tlaku 6,9 kPa. Oba povrchy listů se pokryjí roztokem až do stečení a potom se nechají schnout 1 hodinu. Potom se odříznou dva nezamořené listy a umístí se do Petriho misky, obsahující Spodoptera eridania Cramer.

Další hmyz se vyhodnocuje použitím podobných prostředků a vyhodnocovacích postupů s uvedenými výjimkami.

Po uplynutí standardních dob působení prostředku se vyhodnotí procento úmrtnosti. Výsledky jsou níže shrnuty v tabulkách. Následující zkratky znamenají:

-22CZ 285992 B6

Výraz	hmyz/roztoč	vědecký název
BW	květopas	Anthonomus grandis
CA	mšice bavlníková '	Aphis gossypii
CBW	Heliothis zea	Heliothis zea
CLH	Dalbulus maidis	Dalbulus maidis
CRW	Diabrotica undecimpunctata howardi	Diabrotica undecimpunctata howardi
SAW	Spodoptera eridania	Spodoptera eridania
SM	sviluška snovací	Tetranychus Urticae

Tabulka X

Účinnost A83543A proti vylíhlým larvám CBW

ošetření	dnya	množství (ppm)	% inhibiceb
topické'	1	1,00	20,00
		5,0	100,00
topickéc	1	10,00	100,00
		50,00	100,00
		100,00	100,00
dietad	4	1,00	30,00
		5,00	100,00
		10,00	100,00
		50,00	100,00
		100,00	100,00
vajíčka'	6	10,00	0,00
		50,00	0,00
		100,00	30,00
topické'	1	0,50	10,00
		1,00	40,00
		5,00	80,00
		10,00	100,00
		50,00	100,00
		100,00	70,00
dieta	3	0,50	15,00
		1,00	45,00
		5,00	100,00
		10,00	100,00
		50,00	100,00

Poznámky:

^a počet dní mezi ošetřením a pozorováním, ^b střední hodnota dvou testů, ^c ošetření 1 ml upraveného A83543A, ^d dieta je povrch, ošetřený A83543A, usušený a zamořený, ' vajíčka topicky ošetřená A83543A a nechaná až do kompletního vylíhnutí kontrolních vajíček.

-23CZ 285992 B6

Tabulka XI

Procento hubení vylíhnutých larev CBW složkami A83543¹ složka² ppm

	0,5	1	5	10
A	55 (d)	100 (a)	100 (a)	100 (a)
B	35 (e)	80 (c)	100 (a)	100 (a)
C	5 (g)	85 (bc)	93 (bc)	100 (a)
D	58 (d)	90 (ac)	100 (a)	100 (a)
E	28 (ef)	58 (d)	100 (a)	100 (a)
F	0(g)	0(g)	0(g)	95 (ab)
G	0 (g)	0(g)	20 (f)	80 (c)

1) ošetření se stejnými písmeny v závorkách jsou obdobná při koncentraci 0,05,

2) topická aplikace pipetou - 20 larev/pokus a 4 opakování; mezi ošetřením a pozorováním 1 den.

Tabulka XII

Účinnost A83543A proti larvám SAW

stadium	ošetření	dnya	množství (ppm)	% inhibice6
vylíhlé	listy keříčkových fazolí	3	1,00	10,00
			5,00	40,00
			10,00	100,00
			50,00	100,00
			100,00	100,00
vylíhlé	topickéd	3	1,00	0,00
			5,00	60,00
			10,00	100,00
			50,00	100,00
			100,00	100,00
vylíhlé	listy keříčkových	4	0,50	0,00
	fazolí		1,00	66,67
			5,00	100,00
			10,00	100,00
			50,00	100,00
druhý instar	topickéd	1	1,00	0,00
			5,00	0,00
			10,00	0,00
			50,00	80,00
			100,00	100,00
druhý instar	listy keříčkových	4	1,00	0,00
	fazolí		5,00	0,00
			10,00	80,00
			50,00	80,00
			100,00	100,00

-24CZ 285992 B6

Tabulka ΧΠ - pokračování

stadium	ošetření	dnya	množství (ppm)	% inhibiceb
třetí instar	Topické6	2	1,00	0,00
			5,00	0,00
			10,00	13,33
			50,00	73,33
třetí instar	listy keříčkových	4	0,50	0,00
	fazolí		1,00	0,00
			5,00	40,00
			10,00	100,00
			50,00	100,00
pátý instar	topické6	2	10,00	0,00
			50,00	0,00
pátý instar	listy keříčkových	4	10,00	0,00
	fazolí6		50,00	0,00
a dny mezi ošetřením a pozorováním,	d dvě opakování,
b střední hodnota testů,	6 tři opakování,
5 6 jedno opakování,		1 ošetřeno topicky 1 ml formulovaného A83543A.

Tabulka XIII

Účinnost A83543A proti dospělcům BW ošetřené množství (ppm)% inhibice^a

1,00	0,00
5,00	20,00
10,00	20,00
50,00	100,00
100,00	100,00

^a jedno opakování, pozorováno 3 dny po ošetření, ^b formulovaný A83543A (1 ml) nalit na dospělce hmyzu na Petriho misce.

Tabulka XIV

Účinnost A83543A při skleníkových testech proti různým škůdcům plodin

plodina	Škůdce	množství (ppm)	inhibice'
kukuřice	CRQ	30	100
		15	50
		7,5	10
		3,75	0
tykev	SAW	250	100
		125	100
		62,5	100
		31,25	55
		15,63	40
		7,8	20

-25CZ 285992 B6

Tabulka XIV - pokračování

plodina	škůdce	množství (ppm)	inhibice3
		3,9	20
		1,9	0
tykev	SM	250	70
		125	40
		62,5	20
		31,25	0
tykev	CA	100	0
		50	0
kukuřice	CLH	200	90
		100	30
		50	0
keříčkové	SAW	100	100
fazole
		50	80
		25	40
		12,5	0
keříčkové	SM	100	100
fazole
		50	80
		25	30
		12,5	10
		6,25	0
tykev	CA	100	80
		50	40
		25	0
kukuřice	CRW	6	30

0

Tabulka XV srovnává účinnost a stálost ošetření prostředkem A83543A s methomylem při 5 testech v květináčích, prováděných venku na Spodoptera eridania.

Tabulka XV Účinnost A83543 proti Spodoptera eridania při testech v květináčích, prováděných venku
ošetření	množství (ppm)		dny po ošetření3
		1	5	7	14
A83543A	63	100	88	90	5
A83543A	125	100	88	95	90
A83543A	250	100	95	100	100
A83543A	500	100	100	100	100
methomyl	63	100	20	15	0
methomyl	125	100	35	40	20
methomyl	250	100	85	45	40
methomyl	500	100	90	85	60
žádné	0	0	0	0	0
žádné	0	0	0	0	0

-26CZ 285992 B6 “výsledky jsou v % úmrtnosti.

Tabulka XVI souhrnně uvádí letální koncentrace LC 50, při kterých testovaná sloučenina inhibuje 50 % testovaného hmyzu nebo roztočů, kterých se dosahuje ošetřením A83543A ve srovnání s methomylem jako známým insekticidem.

Tabulka XVI

LC 50 pro A83543“ cílový druh LC 50 (ppm)

	A83543	methomyl
CRW	15	6
kyjatka osenní	>250	5,4
SM	150	71,4
SAW/listy	1,3	11,4
CBW/kontaktně	0,6	14,5

^a množství Diabrotica undecimpunctata howardi v půdě hmotnostně; ostatní jako postřikové koncentrace.

Složky A83543 jsou účinné vůči larvám Aedes aegypti při standardních larvicidních testech na komárech. Tabulky XVII a XVIII uvádějí souhrnně účinnosti složek při těchto testech.

Tabulka XVII

Účinek in vitro A83543B a A83543C proti prvnímu instaru larev komára

A83543 složka		minimální inhibice koncentrace (pg/miy
A		0,016, 0,03 lb
B		0,016
C		0,031

^a nejnižší koncentrace, která vykazuje 100% inhibice po 24 hodinách (mikrolitr-desky), ^b testy na dvou místech.

Tabulka XVIII

Účinek složek A83543 na čtvrtý instar larev komárů“

složka A B C D E F

procento hubení“ 60, 70b 60 60 30 80 0

____________G_________________________0 “ po 24 hodinách při ošetření 0,312 ppm, ^b výsledky dvou testů.

-27CZ 285992 B6

Polní pokusy

Účinnost A83543 byla vyhodnocována v polních pokusech. V těchto pokusech vykazovala sloučenina A83543A účinek proti bělásku řepnému (Pieris rapae) a Trichoplusia ni na klíčící brokolici a proti směsi sojových housenek (75 %) a Spodoptera frugiperda (25 %) na sojových bobech.

Insekticidní prostředky

Sloučeniny podle vynálezu se aplikují ve formě prostředků, které jsou také součástí vynálezu. Tyto prostředky obsahují množství A83543, inaktivující hmyz nebo roztoče, a fytologicky přijatelný inertní nosič. Tato účinná složka, tj. sloučenina A83543 může být v prostředku přítomna jako:

1) jednotlivá složka A83543, 2) směs dvou nebo více složek,

3) rozdělená A83543 směs nebo 4) A83543 spolu s vysušenou částí fermentačního média, ve kterém byla vyprodukována, t.j. jako surová, vysušená fermentační živná půda.

Prostředky jsou buď ve formě koncentrovaných přípravků, které se pro aplikaci dispergují ve vodě, nebo ve formě poprašů nebo granulovaných přípravků, které se aplikují přímo bez dalšího upravování.

Prostředky se připravují podle postupů a receptů, běžně užívaných v agrochemii, ale tyto prostředky jsou nové a důležité, protože obsahují jednu nebo více sloučenin podle vynálezu.

Disperze, ve kterých se sloučeniny nebo surový vysušený materiál aplikují, jsou nejčastěji vodné suspenze nebo emulze, připravené z koncentrovaných přípravků sloučenin nebo surového materiálu. Tyto ve vodě rozpustné, ve vodě suspendovatelné nebo emulgovatelné přípravky jsou buď pevné látky (obvykle jako smáčitelné prášky) nebo kapaliny (obvykle jako emulgovatelné koncentráty nebo vodné suspenze).

Smáčitelné prášky, které mohou být slisovány do formy granulí, dispergovatelných ve vodě, jsou tvořeny dokonalou směsí účinné sloučeniny, inertního nosiče a povrchově aktivních látek. Koncentrace účinné sloučeniny je obvykle od asi 1%, s výhodou 10%, do asi 90% hmotnostních. Inertní nosič je obvykle vybrán ze skupiny, zahrnující attapulgitové hlinky, montmorillonitové hlinky, diatomické hlinky nebo čištěné silikáty.

Jako účinné povrchově aktivní látky, tvořící od asi 0,5 % do asi 10 % smáčitelného prášku, lze použít sulfonované ligniny, kondenzované naftalensulfonáty, naftalensulfonáty, alkylbenzensulfonáty, alkylsulfáty a neionogenní povrchově aktivní látky, jako jsou adukty ethylenoxidu a alkylfenolů.

Emulgovatelné koncentráty sloučenin obsahují vhodnou koncentraci sloučeniny, jako například od asi 50 do asi 500 g/1 kapaliny, ekvivalent od asi 10 % do asi 50 %, rozpuštěné v inertním nosiči, kterým je buď s vodou mísitelné rozpouštědlo nebo směs s vodou nemísitelného organického rozpouštědla a emulgátorů.

Jako organická rozpouštědla lze použít aromatická rozpouštědla, zejména xyleny, a ropné frakce, zejména vysokovroucí naftalenické a olefinické podíly ropy, jako je těžká aromatická nafta. Lze použít také ostatní organická rozpouštědla, jako jsou terpenická rozpouštědla včetně pryskyřičných derivátů, alifatické ketony, jako je cyklohexanon, a komplexní alkoholy, jako je 2-ethoxyethanol.

-28CZ 285992 B6

Vhodnými emulgátory pro emulgovatelné koncentráty jsou běžná neionogenní povrchově aktivní činidla, která byla již uvedena výše.

Vodné suspenze jsou tvořeny suspenzemi ve vodě nerozpustných sloučenin podle vynálezu, dispergovaných do vodného nosiče v koncentraci v rozmezí od asi 5 % do asi 50 % hmotnostních. Suspenze se připravují jemným rozemletím sloučeniny a jejím důkladným vmícháním do nosiče, tvořeného vodou a povrchově aktivními látkami, uvedenými již výše. Pro zvýšení hustoty a viskozity vodného nosiče lze též přidat inertní složky, jako jsou anorganické soli a syntetické nebo přírodní gumy. Často je nejúčinnější rozemlít a mísit sloučeninu současně s přípravou vodné směsi a homogenizací v zařízení, jako je pískový mlýn, kulový mlýn nebo pístový homogenizér.

Sloučeniny také lze aplikovat jako granulované směsi, které jsou obzvláště vhodné pro aplikaci na půdu. Granulované směsi obvykle obsahují od asi 0,5 % do asi 10 % hmotn. sloučeniny, dispergované v inertním nosiči, který sestává zcela nebo z větší části z hlinky nebo podobné levné látky.

Tyto prostředky se obvykle připravují rozpuštěním sloučeniny ve vhodném rozpouštědle a její aplikací na granulovaný nosič, předem upravený na příslušnou velikost částic v rozmezí od asi 0,5 do 3 mm. Tyto prostředky lze také formulovat tak, že se připraví těsto nebo pasta z nosiče a sloučeniny, ta se rozdrtí a vysuší, čímž se získají granulované částice požadované velikosti.

Popraše s obsahem sloučenin podle vynálezu se připraví jednoduše důkladným smísením sloučeniny v práškové formě s vhodným práškovým zemědělským nosičem, jako je kaolin, hlinka, rozemletá vulkanická hornina apod. Popraše výhodně obsahují od asi 1 % do asi 10 % sloučeniny.

Je rovněž praktické, je-li to žádoucí, aplikovat sloučeninu ve formě roztoku v příslušném organickém rozpouštědle, obvykle nedráždivém ropném oleji, jako jsou stříkací oleje, které se běžně používají v agrochemickém průmyslu.

Insekticidy a akaricidy se obvykle aplikují ve formě disperze účinné látky v kapalném nosiči. Je výhodné udávat aplikační množství v koncentraci účinné látky v nosiči. Nejčastěji používaným nosičem je voda.

Sloučeniny podle vynálezu lze také aplikovat ve formě aerosolových prostředků. V těchto prostředcích je účinná sloučenina rozpuštěna nebo dispergována v inertním nosiči, kterým je tlakem se uvolňující hnací směs. Aerosolový prostředek je balen v kontejneru, z něhož se směs uvolňuje rozprašovací tryskou. Hnací směsi obsahují buď nízkovroucí halogenouhlovodíky, které se mísí s organickými rozpouštědly, nebo stlačené vodné suspenze s inertními plyny nebo plynnými uhlovodíky.

Skutečné množství sloučeniny, které se má aplikovat na místa, kde hmyz nebo roztoči žijí, není rozhodující a může být snadno stanoveno na základě pokusu, provedeného pracovníky, pracujícími v oboru. Obecně lze předpokládat, že se dobrých výsledků dosáhne při koncentracích od 10 ppm do 5 000 ppm. U mnohých sloučenin podle vynálezu stačí koncentrace od 100 do 1000 ppm. Pro polní plodiny, jako jsou sojové boby a bavlna, je vhodné aplikační rozmezí sloučenin asi 0,01 až 1 kg/ha, obvykle aplikované jako postřik v množství 47 až 470 1/ha.

Místem, na které se sloučenina aplikuje, může být jakékoliv místo, kde se hmyz nebo roztoči vyskytují, například rostlinná sklizeň, ovoce a ořešáky, vinná réva a okrasné rostliny.

-29CZ 285992 B6

Vzhledem ke specifické schopnosti vajíček roztočů přežívat toxické působení, je žádoucí provádět opakované aplikace ke zničení nově vzniklých larev, jak je to též známo u ostatních známých akaricidů.

Ektoparaziticidní účinek

Sloučeniny A83543 jsou také účinné proti členům hmyzu řádu Diptera.

Tabulky XIX až XXI uvádějí souhrnně studie s A83543A a A83543D in vitro.

Tabulka XIX

Účinek in vitro A83543A proti larvám Phormia regina dávka (ppm)účinek¹ 'účinek = % úmrtnosti.

Tabulka XX

100	100
50	100
25	100
10	100
5	100
2	100
1	95
0,5	60
0,25	25

Účinek in vitro A83543A proti dospělcům bodalky stájové

dávka (ppm)	24 hodiny účinek1	48 hodin účinek1
100	100	100
50	100	100
25	100	100
10	100	90
5	80	100
2	70	90
1	10	60
0,5	0	10

'účinek = % úmrtnosti.

-30CZ 285992 B6

Tabulka XXI

Účinek in vitro A83543A a A83543D^1,2

A83543A

A83543D

ASF	LBF	ASF	LBF
M	24 hodin	48 hodin	24 hodin	48 hodin	24 hodin	48 hodin	24 hodin	48 hodin
10	80	100	100	100	50	100	100	100
5	50	100	100	100	20	90	90	100
2,5	30	100	100	100	20	100	90	100
1,25	20	100	100	100	10	90	80	90
0,625	0	70	60	90	0	60	50	75
0,312	0	50	25	50	0	0	25	25

procento úmrtnosti hmyzu po 24 až 48 hodinách po vystavení vzorků séra in vitro působení chemikálie, ² ASF = dospělci bodalky stájové,

LBF = larvy Phormia regina.

Při testech in vivo sloučeniny A83543 vykazují systemický insekticidní účinek na morčatech a ovcích proti larvám Phormia regina a proti dospělcům bodalky stájové s žádnými zřetelnými známkami toxicity. Reprezentativní sloučeniny A83543A a A83543D byly testovány v laboratoři a na cílových živočiších, čímž se stanovil rozsah účinnosti. Následující testy jsou ilustrativní.

Systemický test na morčatech

V tomto testu se použijí dospělci morčat. Testované sloučeniny se rozpustí ve vodném polyvinylpyrrolidonu nebo v polythylenglykolu 200 a příslušné množství roztoku se podá buď orálně nebo intraperitoneální injekcí. Použijí se různé dávky sloučeniny, jak je dále patrné z dalších tabulek.

Morčatům se odebere krev po 30 minutách, pokud není uvedeno jinak, a vzorky krve se odcentrifugují. Zubní tampony se nasytí krevním sérem a potom se v Petriho miskách vystaví působení dospělců bodalky stájové; larvy Phormia regina se nechají působit ve zkumavkách. Po 24 a 48 hodinách se hmyz hodnotí a spočte se počet mrtvého hmyzu. Výsledky testů se vypočtou jako procenta úmrtnosti hmyzu.

Systemický test na ovcích

Na ovcích se provádí testy stejné, jaké jsou uvedeny výše u morčat. Testovaná sloučenina se podává intraperitoneální nebo intravenózní injekcí nebo do žaludku; vzorky krve se odeberou 24 hodin po ošetření ovcí.

Výsledky systemických testů u morčat a ovcí za použití sloučenin A83543A a A83543D jsou shrnuty v tabulkách ΧΧΠ až XXV.

A83543A nevykazuje antelmintický účinek u ovcí, ošetřených jednou intraperitoneální dávkou nebo dávkou do žaludku 50 mg/kg tělesné hmotnosti, nebo u myší, infikovaných experimentálně intestinálním nematodem Nematospiroides dubius, který byl podán orálně jednou dávkou 500 mg/kg.

-31CZ 285992 B6

Tabulka ΧΧΠ

In vivo insekticidní účinek A83543A“ systemicky u morčat systemicky u ovcí

mg/kg	LBF	ASF	Tox	mg/kg	LBF	ASF	Tox
10 (IP)	0	0	N	10 (IP)	0	0	N
20 (IP)	0	0	N	10 (IP)	0	0	N
30 (IP)	90	50	N	30 (IP)	80	0	N
50 (IP)	100	100	N	30 (IR)	100	30	N
50 (OR)	100	60*	N	50 (IP)	20	30	N
				50 (IR)	100	70	N
				2 x 25 (IR)	25	10	N

* vzorek krve po 5 hodinách; žádný vzorek neodebrán po 30 minutách, ^a účinek měřený jako % úmrtnosti, ASF = dospělci bodalky stájové, LBF = Phormia regina,

IP = intraperitoneálně, IR = do žaludku, IV = intravenózně, IV = intravenózně, OR = orálně.

Tox = toxicita vůči hostitelskému zvířeti (N = žádný),

Tabulka XXIII

Systemický insekticidní účinek A83543A a A83543D u morčať

dávka	způsob ošetření	doba odebírání krve	A83543A % účinnosti	A83543D % účinnosti
LBF	ASF	LBF	ASF
10	IP	30 min	0	0	0	0
		5h	0	0	0	0
		24 h	0	0	0	10
20	IP	30 min	0	0
		5h	0	0
		24 h	0	0
30	IP	30 min	90	50	0	0
		5h	50	0	0	0
		24 h	30	0	0	0
50	IP	30 min	100	100	75	0
		5	95	40	0	0
		24 h	25	30	25	0
50	orálně	5h	100	60
		24 h	0	0

^a LBF = Phormia regina, IP - intraperitoneálně.

ASF = dospělci bodalky stájové,

Tabulka XXIV

Insekticidní hodnocení A83543A v krvi ovcí, napadených Haemonchus contortus - 24 hodin in vitro působení hmyzu na vzorky séra, odebraného u ovcí^a

-32CZ 285992 B6

ošetření	původní hmotnost (kg)	procento úmrtnosti hmyzuc
den 0	35 min	5h	den 1	den 2	den 3	den 4	den 5
L	A	L	A	L	A	L	A	L	A	L	A	L	A	L	A
50x1 (IP)	38,6	0	0	0	0	10	0	10	0	20	10	20	0	10	10	10	0
50x1 (IR)	31,8	0	0	0	10	40	10	90	0	90	20	80	0	40	0	20	0
25x2 (IR)	34,1	0	0	0	20	25	10	100	10	90	20	90	0	60	0	50	0
1x1 (IV)	25,9	0	0	25	10	10	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
nosič	44,5	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
kontrola neošetřeno	30,9	0	0	0	0	0	0	0	0	0	10	0	0	0	0	0	0

^aL = larvy Phormia regina, IV = intravenózně,

A = dospělci bodalky stájové, ^b množství (mg/kg) počet podaných dávek,

IP = intraperitoneálně, ^c doby po podání, po kterých se odebere krev.

IR = do žaludku,

Tabulka XXV

Insekticidní hodnocení A83543A v krvi ovcí, napadených Haemonchus contortus - 48 hodin in vitro působení hmyzu na vzorky séra, odebraného u ovcí³

ošetřeni6	původní hmotnost (kg)	procento úmrtnosti hmyzuc
den 0	35 min	5h	den 1	den 2	den 3	den 4	den 5
L	A	L	A	L	A	L	A	L	A	L	A	L	A	L	A
50x1 (IP)	38,6	0	20	10	0	10	10	10	0	20	30	20	10	20	20	25	0
50x1 (IR)	31,8	0	0	0	10	75	30	100	60	100	70	100	20	40	20	25	0
25x2 (IR)	34,1	0	10	0	30	50	10	100	90	100	90	100	70	90	30	75	30
lxl (IV)	25,9	0	0	25	10	10	20	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
nosič	44,5	0	10	0	0	0	20	0	10	0	0	0	20	0	0	0	0
kontrola neošetřeno	30,9	0	40	0	0	0	0	0	0	0	10	0	0	0	0	0	0

^aL - larvy Phormia regina, IV = intravenózně,

A = dospělci bodalky stájové, ^b množství (mg/kg) počet podaných dávek,

IP = intraperitoneálně, ^c doby po podání, po kterých se odebere krev.

IR = do žaludku,

Testy in vitro proti intestinálním nematodům Haemonchus contortus u ovcí ukazují, že koncentrace 100 pm A83543A usmrtí 30 % hlístů.

Ektoparaziticidní způsoby

Předložený vynález se také týká způsobu kontroly populace hmyzích ektoparazitů, kteří se živí krví hostitelského zvířete, který spočívá v podávání účinného množství sloučeniny A83543 hostitelskému zvířeti. Hmyzími ektoparazity jsou hmyzí paraziti a paraziti řádu Acarina. Sloučeniny lze aplikovat zvířatům na kůži, orálně nebo parenterálně.

Parazitický hmyz a roztoči zahrnují druhy, které sají krev, jakož i samožravé, a jsou parazitičtí během celého svého životního cyklu, nebo během pouze části svého životního cyklu, a to buď v larvách nebo dospělém stadiu. Reprezentativními třídami jsou:

ovád bodalka stájová muchnička veš zákožka svrabová prašivka veš

Tabanus spp.

Stomoxys calcitrans Simulium spp. Haematopinus asini Sarcoptes scabiei

Psoroptes equi Haematobia irritans

-33CZ 285992 B6

veš	Bovicola bovis
veš kravská	Haematopinus eurystemus
veš	Linognathus vituli
bodalka dobytčí	Glossina spp.
roztoč	Demodex bovis
klíště	Boophilus microplus a B. decoloratus
klíště	Amblyomma maculatum
klíště	Amblyomma americanum
klíště	Otobius megnini
klíště	Dermacentor andersoni
moucha	Cochliomyia hominivorax
Reduvius spp.	Reduvius spp.
komár	Culiseta inomota
klíště	Rhipicephalus appendiculatus
klíště	Rhipicephalus evertsi
klíště	Amblyomma spp.
klíště	Hyalomma spp.
veš	Haematopinus suis
blecha	Tunga penetrans
veš	Haematopinus ovillus
veš	Linognathus pedalis
kloš ovčí	Melophagus ovinus
prašivka ovčí	Psoroptes ovis
moucha	Phaenica sericata
moucha	Phormia regina
vrták	Cochliomyia macellaria
moucha	Phaenicia čupřina
štěnice domácí	Cimex lextularius
blecha	Echidnophaga gallinacea
klíšťák	Argas persicus
čmelík kuří	Darmanyssus gallinea
roztoč	Knemidokoptes mutans
roztoč	Knemidokoptes gallinae
roztoč	Demodex canis
blecha psí	Ctenocephalis canis
piják	Dermacentor variabilis
piják psí	Rhipicephalus sanguineus

Tento způsob podle vynálezu lze užívat k ochraně hospodářských a společenských zvířat před ektoparazity. Sloučeniny mohou být například s úspěchem podávány koňům, dobytku, ovcím, prasatům, kozám, psům, kočkám apod., jakož i exotickým zvířatům, jako jsou velbloudi, lamy, jeleni a ostatní druhy, které jsou obvykle označovány jako divoká zvířata. Sloučeniny mohou být také s úspěchem podávány drůbeži a ostatním ptákům, jako jsou krocani, kuřata, kachny apod. S výhodou je však způsob aplikován na hospodářská zvířata a nejvýhodněji na dobytek a ovce.

Množství, doba a způsob účinné aplikace jsou různé a mění se podle druhu parazita, stupně napadení a ostatních faktorů. Aplikace lze provádět periodicky během celé průměrné délky života hostitele nebo pouze při vrcholném údobí útoku parazita. Obecně se kontroly parazitů dosáhne topickou aplikací kapalných přípravků, obsahujících od asi 0,0005 do 95,0 % sloučeniny, s výhodou do 5 % a nejvýhodněji do asi 1 % sloučeniny. Účinné kontroly parazitů se dosáhne podáním množství od asi 5 do asi 100 mg/kg.

Sloučeniny se aplikují hostitelských zvířatům obvyklými veterinárními praktikami. Sloučeniny se upravují do ektoparaziticidních směsí, které jsou tvořeny sloučeninou a fyziologicky

-34CZ 285992 B6 přijatelným nosičem. Například kapalné prostředky lze jednoduše stříkat na zvířata, u nichž je třeba ektoparazity hubit. Zvířata se také mohou ošetřovat sama takovými zařízeními, jako jsou škrabadla hřbetu, která mohou obsahovat toxickou látku a proti kterým zvířata procházejí a nebo jsou s nimi v kontaktu. K aplikaci účinné látky hostitelskému zvířeti lze též použít ponořovací lázně.

Sloučeniny podle vynález vykazují systemický ektoparaziticidní účinek. Sloučeniny mají schopnost pronikat tkáněmi hostitelského zvířete, kterému byla podána jedna ze sloučenin podle vynálezu. Hmyzí paraziti, kteří konzumují krev nebo ostatní tkáně hostitelského zvířete, jsou takto zabíjeni. Sloučeniny se podávají kůží, orálně nebo perkutánně.

Předložený vynález se také týká ektoparaziticidního prostředku, který se vyznačuje tím, že obsahuje fyziologicky přijatelný inertní nosič a sloučeninu A83543. Tyto prostředky lze připravovat známými způsoby, například rozpuštěním sloučeniny v jedné nebo více fyziologicky přijatelných pomocných látek nebo ředidel. Orální aplikaci lze provádět smísením sloučeniny se zvířecí potravou nebo s pitnou vodou, nebo podáváním dávkových forem, jako jsou tablety, kapsle, bolusy nebo implantáty. Perkutánní aplikace se s výhodou provádí subkutánní, intraperitoneální a intravenózní injekcí injikovatelného přípravku.

Pro orální podávání lze sloučeniny upravovat do obvyklých forem, jako jsou nálevy, tablety nebo kapsle. Tyto prostředky ovšem vyžadují použití orálně přijatelných inertních nosičů. Sloučeniny lze také upravovat jako injikovatelné roztoky nebo suspenze pro subkutánní, kožní, žaludeční, intraperitoneální, intramuskulámí nebo intraenózní injekce. Při některých aplikacích se sloučeniny formulují jako jedna složka standardní potravy zvířete. Podle tohoto iysu vynálezu se sloučenina upraví nejdříve jako premix, ve kterém je sloučenina dispergována v kapalném nebo v částečně pevném nosiči. Premix může obsahovat od asi 4,40 do 551 g sloučeniny na 1 g. Premix se formuluje do konečné potravy běžným míšením.

Protože útok ektoparazitů obvykle trvá během podstatné části životního cyklu hostitelského zvířete, je výhodné podávat sloučeniny podle vynálezu v takové formě, která zajišťuje postupné uvolňování účinné látky během delší doby. Obvykle se to provádí pomocí matrice, která fyziologicky inhibuje rozpouštění, přičemž matrice je voskovitá polopevná látka, jako jsou rostlinné vosky nebo polyethylenglykol s vysokou molekulovou hmotností. Dobrou formu podávání sloučenin představuje trvale působící bolus, jak je popsáno Labym v US patentu č. 4 251 506 a Simpsonem v britském patentu č. 2 059 767. Pro takovýto bolus je sloučenina enkapsulována do polymemí matrice, jak je popsáno Nevinen v US patentu č. 4 273 920. Trvalého uvolňování sloučenin podle vynálezu lze také dosáhnout použitím implantátu, například z pryše, obsahující silikon.

Předložený vynález je blíže objasněn v následujících příkladech.

Příklad 1

Zkoušení A83543 pomocí HPLC

Pro monitorování fermentace při přípravě A83543 se použije následující analytická HPLC metoda.

Vzorek celé živné půdy se centrifuguje, dekantuje a odstraní se supematant. K biomase se přidá dostatečné množství methanolu tak, aby vzorek měl původní objem, míchá se a směs se nechá stát minimálně 15 minut. Odcentrifuguje se a supenatant se odfiltruje filtrem 0,45 pm.

-35CZ 285992 B6

Alternativně se může celá živná půda extrahovat auetonitrilem (1 : 4 živná půda : rozpouštědlo) nebo acetonem.

HPLC systém:

Kolona: kolona 8-x lOOmm, silikagel—4 pm sférický Cu (Nova Cl8, Weters).

Mobilní fáze: CH₃NC/MeOH/H₂O (45/45/10), obsahující 0,05 % amoniumacetátu, průtoková rychlost: 4 ml/min, retenční časy: A83543A - 3,6 - 3,7 min,

A83543D - 4,4-4,5 min, detekce: UV při 250 nm.

Příklad 2

Příprava A83543 s kulturou A83543.1

A. Fermentace v třepací lahvi

Kultura Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395, buď jako lyofilizované peletky nebo jako suspenze, udržovaná pod kapalným dusíkem, se použije pro naočkování vegetativního média o složení A nebo B (přičemž médium B je výhodné pro přípravu ve velkém měřítku):

Vegetativní médium A složka množství (%)

sojová živná půda*	3,0
extrakt z kvasnic	0,3
MgSO4.7H2O	0,2
glukóza	0,5
maltóza	0,4
deionizovaná voda	do 1 litru
pH neupravováno.

* Baltimore Biological Laboratories.

Vegetativní médium B __________________složka________________________Množství (%) enzymem hyrolyzovaný kyselin*3,0 extrakt z kvasnic0,3

MgSO₄.7H₂O0,2 glukóza1,0 deionizovaná voda do 1 litru pH 6,2, upraveno na 6,5 NaOH.

* NZ Amine A, Sheffield Products, P.O. Box 638 Norwich, NY 13815.

Šikmé půdy nebo desky se mohou připravit přidáním 2,5% agaru k vegetativnímu očkovacímu médiu A nebo B. Naočkované šikmé půdy se inkubují při 30 °C od asi 10 do 14 dnů. Vzrostlá šikmá kultura se seškrábne sterilním nožem, čímž se uvolní spory a odstraní se a maceruje se myceliální koláč. Asi jedna čtvrtina uvolněných spor a kultivační živné půdy takto připravená se

-36CZ 285992 B6 použije pro naočkování 50 ml prvního stadia vegetativního očkovacího média. Alternativně může být první stadium média naočkováno z ampulky s kapalným dusíkem.

Udržuje-li se kultura v kapalném dusíku, připraví se ampule použitím stejných objemů vegetativní kultury (inkubace 48 až 72 hodin, 30 °C) a suspendovaného média. Suspendované médium obsahuje laktózu (100 g), glycerin (200 ml) a deionizovanou vodu (do 1 litru).

Ampulky s kapalným dusíkem se použijí pro naočkování 100 ml vegetativního média v 500ml Etlenmeyerových baňkách (nebo 50 ml v 250ml baňkách). Kultury se inkubují při 30 °C po dobu 48 hodin na třepačce, kroužící v kruhu (5,08 cm) při 250 otáčkách za minutu.

Inkubovaná kultura (5 % obj./obj. očko) se použije pro naočkování 100 ml produkčního média následujícího složení:

Produkční médium I

složka	množství (%)
glukóza	4
rostlinný protein, částečně enzymatický
hydrolyzovaný*	1,5-3
moučka z bavlníkových semen**	1,0
CaCO3 (chemicky čistý nebo technický)	0,3
olej ze sojových bobů	1,0
voda z vodovodu	do 1 litru

(před sterilizací pH upraveno na 7,0 NaOH).

* Sheftone H, Sheffleld Products.

** Proflo, Traders Protein, P.O. Box 8407, Memphis, TN 38108.

Naočkované produkční médium se inkubuje v 500 ml Erlenmeyerových baňkách při 28 až 30 °C 6 až 8 dnů na třepačce, kroužící v kruhu (5,08 cm), při 250 otáčkách za minutu

B. Fermentace v míchaném bioreaktoru

Pro přípravu velkého objemu očka se 10 ml inkubovaného prvního stadia média, připraveného podle odstavce A, použije pro naočkování 400 ml druhého stadia vegetativního média, které má stejné složení jako první stadium vegetativního média. Druhé stadium média se inkubuje 48 hodin ve 2 1 širokohrdlé Erlenmeyerově baňce při 30 °C na třepačce, otáčející se v kruhu (5,08 cm) při 250 otáčkách za minutu.

Takto připravené inkubované druhé stadium vegetativního média (2 1) se použije pro naočkování 80 až 115 litrů sterilního produkčního média, připraveného postupem podle odstavce A. Je-li třeba, pro kontrolu pěnění se přidá olej ze sojových bobů.

Naočkované produkční médium se nechá fermentovat ve 165 litrovém míchaném bioreaktoru 5 až 8 dnů při teplotě 28 °C. Profukování vzduchem a rychlost míchání v míchané nádobě se řídí počítačem tak, aby byla udržována hladina rozpuštěného kyslíku při nebo na 50 % nasycení ve vzduchu.

-37CZ 285992 B6

Příklad 3

Izolace A83543A, B, C a D

Fermentační živná půda (225 I), připravená podle příkladu 2, se přefiltruje (1% Hyflo) a oddělená biomada se promyje vodou (asi 50 1). Biomasa se potom protřepává s methanolem (asi 100 1) po dobu asi 1 hodiny a přefiltruje se.

Methanolický filtrát se zahustí na objem asi 1 litru. Koncentrát se extrahuje třikrát diethyletherem (vždy 1 litr). Spojené etherové extrakty se zahustí na objem asi 200 ml.

Část koncentrátu (8 ml) se chromatografuje na koloně silikagelu (RP-8 Lobar, velikost B, E.M. Science, a Division of Ε. M. Industries, lne.).

Tento postup se opakuje celkově 12x. Přístrojové vybavení a provedení postupu preparativní chromatografíe způsobem „Autoprep“ je následující:

Kompletní HPLC systém „Autoprep“ je tvořen třemi pumpami Rainim Rabbit HPX, jedním tlakovým modulem, jedním kolektorem frakcí Gilson Model 20 1 B HPLC, jedním detektorem absorpce ISCO-V⁴ a jedním počítačem Apple Macintosh Plus. Kompletní systém je uspořádán podle instrukcí, daných v Dynamax HPLC Method Manager manual od Rainin Instrument Company, lne. „Autoprep“ HPLC konfigurace využívá automatický systém k provedení preparativních separací opakován za skutečně identických podmínek se skutečně identickými výsledky. Sbírání a spojování odpovídajících frakcí z vícenásobných pracovních operací zajišťuje chromatografickou kapacitu bez potřeby použití velké kolony.

Používají se izokraticky dvě směsi rozpouštědel (A) a (B) s průtokovou rychlostí 8,0 ml/min.

Systémy rozpouštědel

rozpouštědlo	množství (ml)
	A	B
CH3OH	95	10 0
CH3CN	95	10 0
h2o	10	-

Izokratická směs obsahuje 60 % rozpouštědla B.

Doba průběhu každého cyklu je 28,0 minut. Eluáty z prvních 16 minut každého běhu se vylijí. Následující eluáty se sbírají vždy po 6 frakcích, 2 minuty (16 ml). Z automaticky odebíraných frakcí ze všech 12 cyklů vznikne 6 konečných frakcí (chromatografické řezy).

Přítomnost účinných sloučenin A83543 se stanovuje analýzou všech konečných frakcí na účinnost vůči larvám komárů a také analyticky pomocí HPLC.

Účinné frakce se potom spojí podle jejich účinnosti a HPLC profilů a dále se čistí za použití stejného „Autoprep“ HPLC a rozpouštědlového systému, avšak s vysokou rozlišovací schopností, preparativní kolem 21,4 mm x 25 cm (Rainin Dynamax), naplněná silikagelem 8 pm s reverzní fází C-18. Získá se A83543, složky A, B, C a D. Faktory A a D krystalují ze směsi methanolu a vody.

FD-MS složky A83543C je zobrazeno na obr. 5 a FAB-MS složky A83543B je na obr. 9.

-38CZ 285992 B6

Příklad 4

Čištění A83543A a D

Připraví se fermentační živná půda (101) postupem podle příkladu 2, odstavce A s tou výjimkou, že 1) použije se 200 ml produkčního média v 1 litrové baňce; 2) pro produkční médium se nepoužije sojový olej; a 3) inkubace se provádí při 30 °C po dobu 4 až 6 dnů. Živná půda se přefiltruje. Filtrát, obsahující 4 pg A83543A/ml a nedetekovatelná množství A83543B, C nebo D/ml, se vylije.

Biomasa se promyje vodou a extrahuje se 1 hodinu methanolem. Extrakt (7 1) obsahuje 72 pg A83543A/ml a 7 pg A83543D/ml.

Methanolický extrakt se zahustí na objem 5 1 a přidá se pryskyřice HP-20 (150 ml, Mitsubishi Chemichal Industries, Ltd, Japonsko) ve vodě (2 1). Směs se míchá 1 hodinu.

Směs s pryskyřicí HP-20 se potom naplní do skleněné kolony. Původní vytékající kapalina a eluát, používající methanol a vodu (1 : 1, 1 litr), nejsou účinné. Druhý eluát, používající methanol a vodu (7 : 3, 1 litr), obsahoval stopová množství A83543A. Následující eluát, používající methanol (1 litr), obsahoval aktivní A83543A a A83543D.

Methanolický eluát se zahustí a spojí s 2 podobnými frakcemi z ostatních zpracování a zahustí se do sucha. Zbytek se rozpustí v 75 ml methanolu a tetrahydrofuranu (4 : 1) a vysráží se přidáním do 10 objemů acetonitrilu. Směs se přefiltruje a filtrát se zahustí k suchu.

Zbytek se rozpustí v methanolu (25 ml) a nalije se na kolonu 5,5 x 90 cm Sephadexu LH-20 (Pharmacia LKB Biotechnology lne., USA), připraveného v methanolu, načež se sbírá a analyzuje 125 25ml frakcí použitím HPLC postupu, popsaného v příkladu 1.

Frakce, obsahující požadované sloučeniny, se spojí a zahustí. Zbytek se rozpustí v methanolu (10 ml) a naleje se na preparativní kolonu 41,1 m x 25 cm, naplněnou silikagelem C-18 s reverzní fází 8 pm (Rainin Dynamax).

Kolona se upraví methanolem, acetonitrilem a vodou (37,5 : 37,5 : 25). Po aplikaci vzorku se kolona vyvíjí použitím 180 minutového lineárního gradientu následujících rozpouštědel:

Systém rozpouštědel rozpouštědlo množství (ml)

	A	B
CH3OH	37,5	45
CH3CN	37,5	45
h2o	25	10

Gradient probíhá od 100% A do 100% B, sbírají se 25 ml frakce.

Frakce, obsahující A83543A, se spojí, zahustí k suchu, rozpustí v terč, butanolu (5 ml) a lyofilizují. Získá se 778 mg čisté A83543A.

IČ spektrum A8354A v CHCI3 je uvedeno na obr. 1. FD-MS spektrum A83543A je uvedeno na obr. 4; FAB-MS spektrum A83543A je uvedeno na obr. 8 [FAB dispersant dithiothreitol: dithioerythritol (5:1)] a EI-MS spektrum A83543A je uvedeno na obr. 10.

-39CZ 285992 B6

Frakce, obsahující A83543D, se spojí s frakcemi, obsahujícími složku D z 6 podobných zpracování a zahustí a chromatografují, jak je popsáno výše, za použití stejné kolony, avšak s jinými rozpouštědly.

Kolona se upraví methanolem, acetonitrilem a vodou (40 : 40 : 20). Pro vyvíjení kolony 180 minutovým lineárním gradientem se použijí tyto rozpouštědlové systémy:

Systémy rozpouštědel

Rozpouštědlo množství (ml)

	A	B
ch3on	40	95
ch3cn	40	95
h2o	20	10

Frakce, obsahující A83543D, se spojí a zahustí. Zbytek se rozpustí v terč, butanolu (5 ml) a lyofilizaci se získá 212 mg A83543D.

IČ spektrum A83543D v CHC1₃ je uvedeno na obr. 2 a FD-MS spektrum A83543D je uvedeno na obr. 6.

Příklad 5

Izolace složek A83543 E, F, G, H a J a pseudoaglykonu A

Fermentační živná půda (8 1), připravená podobným postupem, jak je popsáno v příkladu 2, se zpracuje postupem, popsaným v příkladu 4. Frakce z kolony Sephadexu LH-20, obsahující požadované sloučeniny, se spojí s odpovídajícími frakcemi z podobných fermentací. Protože složky E, F, G, H, J a pseudoaglykon A vznikají ve velmi malých množstvích, je třeba provést řadu fermentací, aby se získala dostatečná množství pro další čištění.

Spojené menší frakce, připravené tímto způsobem a obsahující přibližně 1,6 g pevného materiálu, se aplikují na HPLC kolonu (Rainin Dynamax), naplněnou silikagelem Cl8 s reverzní fází - 8 pm (ODA), jak je popsáno v příkladu 4. Kolona se upraví methanolem, acetonitrilem a vodou (75:75:50) a gradient proběhne od 100 % rozpouštědla A do 50 % B; systémy rozpouštědel jsou následující:

Systémy rozpouštědel

rozpouštědlo	množství (%)
	A	B
CH3OH	75	95
ch3cn	75	95
h2o	50	10

Sbírají se 25 ml frakce. Následující frakce se spojí

-40CZ 285992 B6 spojení frakce

131-44

245-63

364-69

470-80

81-130

131-160

Část spojení 5 (100 ml) se rozpustí a zbytek se rozpustí v methanolu (1 ml) a nalije se na HPLC kolonu 21,4 mm x 250 mm (Rainin Dynamax), jak je popsáno v příkladu 3. Kolona se upraví 5 systémem rozpouštědel A z následujících systémů rozpouštědel:

Systémy rozpouštědel rozpouštědlo Množství (%)

	A	B
CH3OH	30	95
CH3CN	30	95
H2O(1NNH4OAC, pH5, O)	40	-
H2O	-	10

a vyvíjí se 120 minutovým lineárním gradientem ze 100% rozpouštědla A do 50% rozpouštědla B, sbírají se při průtoku rychlostí 7,5 ml/min 15 ml frakce. Eluce pokračuje při 50% B dalších 60 minut.

Následující frakce se spojí:

spojení	frakce	složka
1	37	F
2	38-48	E
3	52-63	B,G
4	65-70	H, J

Tyto spojené frakce se spojí s ostatními spojenými frakcemi z ostatních chromatografických průběhů za použití podobných výchozích látek. Spojené frakce se dále čistí použitím chromatografické kolony, jak je popsáno výše; zbaví se soli na pryskyřici HP-20 běžnými 20 technikami a zahustí se a lyofilizací se získají následující složky:

složka	množství (mg)	mol. hmotnost	IR**
E	249	717	obr. 13
F	E	717	obr. 14
G	104	731	obr. 15
H, J	87	717	obr. 16
pseudo A	288	590	ob. 3

* hmotovou spektrometrií, ** KBr disky.

FD-MS a EI-MS spektra A83543A pseudoaglykonu jsou uvedena na obr. 7 a 11.

-41CZ 285992 B6

Příklad 6

Příprava A83543 s kulturou A83543.3

A. Fermentace v třepací láhvi

Použitím postupu podle příkladu 2, odstavec A se vtřepacích baňkách kultivuje kultura Sacharopolyspora spinosa NRRL 18537, ale za použití vegetativního média C následujícího složení:

Vegetativní médium C

složka enzymem hydrolyzovaný kasein* extrakt z kvasnic MgSO4.7H2O glukóza glycerin deionozovaná voda

množství 30,0 g 3,0 g 0,2 g 10,0 g 20 ml do 1 litru

pH 6,6 upraveno na 7,0 NaOH * NZ Amine A.

B Fermentace v míchaném bioreaktoru

Ampulky s kulturou v kapalném dusíku se připraví postupem podle příkladu 2 za použití obecných postupů podle odstavce b. Jedna ampulka se použije pro naočkování prvního stadia vegetativní kultury (50 ml média C v 250ml baňkách), která se inkubuje asi 48 až 72 hodin. Inkubovaná kultura prvního stadia se použije pro naočkování (10 ml očko) druhého stadia kultury (400 ml média C ve 21 baňkách), která se inkubuje asi 48 hodin. Inkubovaná kultura druhého stadia (5 1) se použije pro naočkování produkčního média (115 1) následujícího složení:

Produkční médium II

Složka Glukóza Peptonizované mléko* moučka z bavlníkových semen** CaCO3 Methyloleát voda z vodovodu

množství (g/1) 80 20 20 5 30ml/l doplnit do 1 litru

* výživné peptonizované mléko, Sheffield Products; navíc stálá potrava, počínaje čtvrtým dnem v množství 5 mg/ml/den.

** Proflo, (před sterilizací pH upraveno na 7,0 NaOH).

Naočkované produkční médium se nechá fermentovat ve 165 litrovém míchaném bioreaktoru asi 8 až 10 dnů nebo déle při teplotě 30 °C. Hladina rozpouštěného kyslíku (DO) se reguluje počítačem tak, aby se udržovala hladina DO nad 50 % nasycení vzduchu, jako je popsáno v příkladu 2, odstavec B.

-42CZ 285992 B6

Příklad 7

Příprava A83543 s kulturou A83543.5

A. Fermentace v třepacích lahvích

Podle postupu, popsaného v příkladu 2, odstavci A, se v třepacích lahvích kultivuje kultura Saccharopolyspora spinosa NRRL 18539 za použití vegetativního média B.

B. Fermentace v míchaném bioreaktoru

Ampulky s kulturou v kapalném dusíku se připraví postupem podle příkladu 2 za použití obecných postupů, popsaných v odstavci B. Jedna ampulka se použije pro naočkování prvního stadia vegetativní kultury (50 ml média B ve 250ml baňkách), která se inkubuje 48 až 72 hodin. Inkubovaná kultura prvního stadia se použije pro naočkování (10 ml očko) druhého stadia kultury (400 ml média B ve 21itrových baňkách), která se inkubuje asi 48 hodin. Inkubovaná kultura druhého stadia (2 1) se použije pro naočkování produkčního média (115 1) následujícího složení:

Produkční médium III

složka	množství (g/1)
glukóza	80
rostlinný protein, částečně hydrolyzovaný
enzymaticky*	20
moučka z bavlníkových semen**	10
CaCO3	5
methyloleát	30 ml/1
Voda z vodovodu	doplnit do 1 1

* Sheftone H. ** Proflo.

(před sterilizací pH upraveno na 7,0 NH4OH).

Produkční médium IV

složka	množství (procenta)
glukóza	8
moučka z bavlníkových semen*	3
peptonizované mléko*	2
kukuřičný výluh	1
CaCO3 (technický)	0,5
methyloleát	3,0
voda z vodovodu	doplnit do 1 litru

* Proflo.

** Výživné peptonizované mléko.

(před sterilizací pH upraveno na 7,0 NaOH).

Naočkované produkční médium se nechá fermentovat ve 165 1 míchaném bioreaktoru asi 8 až 10 dnů nebo déle při teplotě 30 °C. Hladiny DO se regulují jako v příkladu 6.

Příklad 8

Příprava A83543 s kulturou A83543.4

Použitím postupů podle příkladů 2 a 7 se kultivuje kultura Saccharopolyspora spinosa NRRL 18538 použitím vegetativního médie B a produkčního média ΙΠ.

Příklad 9

Fermentační živná půda se připraví podle příkladu 8. A83543 se oddělí ze živné půdy následujícím způsobem:

1. K živné půdě se přidá stejný objem acetonu a přefiltruje se za použití keramického filtru nebo tlakového filtračního zařízení.

2. Upraví se pH filtrátu živné půdy na hodnotu 10.

3. Přidá se ethylacetát (1/4 až 1/2 objemu živné půdy).

4. Získá se ethylacetátový extrakt oddekantováním podílu nemísitelného s vodou a ten se zahustí ve vakuu na polovinu objemu.

5. Zahuštěný ethylacetátový roztok se extrahuje vodným 0,lm roztokem kyseliny vinné (1/2 objemu) a fáze se rozdělí.

6. Rozpustný ethylacetát se odstraní z vodné fáze odpařením ve vakuu (asi 5%). Vodný roztok se zahustí pomocí reverzní osmózy.

7. Upraví se pH koncentrovaného vodného roztoku na 10 až 11 hydroxidem sodným.

8. Filtrací se oddělí sraženina; promyje se vodou; vysušením ve vakuu se získá A83543.

Příklad 10

A83543A pseudoaglykon

Vzorek A83543, obsahující převážně složku A (asi 100 mg), se rozpustí v methanolu (50 ml), vodě (2 ml) a koncentrované HC1 (3 ml). Tento roztok se zahustí do sucha při 50 °C. Zbytek se zpracuje dvakrát diethyletherem (vždy 200 ml) a nerozpustná látka se vyhodí. Spojené etherové roztoky, obsahující surový pseudoaglykon, se zahustí do sucha. Zbytek se rozpustí v methanolu (20 ml) a vyčistí za použití HPLC systému Autoprep podle příkladu 3. Získá se 20 mg čistého A83543A pseudoaglykonu.

Příklad 11

A83543D pseudoaglykon se připraví z A83543D použitím postupu podle příkladu 10.

Příklad 12

Typickými insekticidními prostředky podle vynálezu jsou následující přípravky:

-44CZ 285992 B6

A. Vodná suspenze

A-83543A 12,5 % „Tergitol TMN-6“ (neionogenní povrchově aktivní látka) 1,0 % „Zeosyl 200“ (kysličník křemičitý) 1,0 % „AF-100“ (protipěnicí činidlo na bázi silikonu) 0,2 % xanthanový roztok (2%) 10,0 % „Makon 10“ (10 mol ethylenoxidu na nonylfenolu - povrchově aktivní látka) 9,0 % voda z vodovodu 66,3 %

B. Emulgovatelný koncentrát

A83543D 12,4 % „Exxon 200“ (naftalenové rozpouštědlo) 83,6 % „Toximul H“ (směs eionogenních a anionaktivních povrchově aktivních látek) 2,0 % „Toximul D“ (směs neionogenních a anionaktivních povrchově aktivních látek) 2,0 %

Příklad 13

Dále jsou uvedeny příklady směsí prakticky použitelných a obsahujících látky podle vynálezu:

A. Krmivový premix

A83543A rýžové slupky lehký minerální olej

10%

85%

5%

B. Krmivový premix

A83543E	25%
moučka z vojtěšky	60%
práškovaná hlinka	5%
melasa	10%

C. Suspenze

A83543A	30%
naftalensulfonát	5%
neionogenní povrchově aktivní látka	5%
pálený kysličník křemičitý	1 %
voda	59%

D. Kapací roztok

A83543A neionogenní povrchově aktivní látka propylenglykol voda

20% 0,8 % 15% 64,2 %

-45CZ 285992 B6

E. Kapací roztok

A83543B neionogenní povrchově aktivní látka lehký minerální olej

10% 1 % 89%

F. Injekční roztok

A83543A propylenglykol

15% 85%

G. Injekční suspenze

A83543C propylenglykol voda

25% 15% 60%

H. Injekční suspenze

A83543D polyvinylpyrrolidon voda

30% 2% 68%

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (9)

1. Indaceno(3,2-d)oxacyklododecin-7,15-diony obecného vzorce I:

RO

O •·,Λ^.......^or2 o, H rf' R³

ve kterém

R znamená atom vodíku nebo skupinu, vybranou ze souboru

-46CZ 285992 B6

R¹, R³, R⁵ a R⁶ znamenají atom vodíku nebo methylovou skupinu;

R⁴ znamená methylovou nebo ethylovou skupinu;

nebo jejich fytologicky přijatelná sůl, pokud Rje různý od atomu vodíku.

2. Indaceno(3,2-d)oxacyklododecin-7,15-diony podle nároku 1, obecného vzorce I, kde substituenty R, R¹, R³, R⁴, R⁵ a R⁶ jsou v jedné z následujících kombinaci:

R R¹ R³ R⁴ R⁵ R⁶ (a) Me H Et Me Me (b) Me H Et Me Me (c) Me H Et Me Me (a) Me Me Et Me Me (a) Me H Me Me Me (a) H H Et Me Me (d) Me H Et Me Me (a) Me H Et H Me (a) Me H Et Me H H Me H Et Me Me H Me Me Et Me Me H Me H Me Me Me H H H Et Me Me H Me H Et H Me H Me H Et Me H

nebo jejich adiční sůl s kyselinou, pokud R neznamená atom vodíku.

3. Indaceno(3,2-d)oxacyklododecin-7,15-dion podle nároku 1 nebo 2, obecného vzorce I, ve kterém Rje skupina označená (a); R¹, R⁵ a R⁶ znamenají methylovou skupinu, R³ znamená atom vodíku a R⁴ znamená ethylovou skupinu.

4. Indaceno(3,2-d)oxacyklododecin-7,15-dion podle nároku 1 nebo 2, obecného vzorce I, ve kterém Rje skupina označená (a); R¹, R³, R⁵ a R⁶ znamenají methylovou skupinu a R⁴ znamená ethylovou skupinu; nebo její adiční sůl s kyselinou.

-47CZ 285992 B6

5. Způsob inhibice hmyzu nebo roztočů, vyznačující se tím, že se na místa, kde se hmyz nebo roztoči vyskytují, aplikuje účinné množství sloučeniny obecného vzorce I podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, nebo její fytologicky přijatelné soli.

6. Ektoparaziticidní prostředek, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje od 0,00005 do 95 % hmotn. sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 spolu s jedním nebo více fyziologicky přijatelnými inertními nosiči nebo ředidly.

7. Způsob neterapeutické kontroly populace hmyzích ektoparazitů, kteří se živí krví hostitelského zvířete, vyznačující se tím, že se hostitelskému zvířeti podá účinné množství sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 nebo její fyziologicky přijatelné soli.

8. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce I podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že se kultivuje kmen Saccharopolyspora spinosa, vybraný z NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 nebo NRRL 18539 nebo mutant, produkující sloučeninu obecného vzorce I v kultivačním médiu, obsahujícím asimilovatelné zdroje uhlíku, dusíku a anorganických solí za submerzních aerobních fermentačních podmínek až do vzniku izolovatelného množství sloučeniny obecného vzorce I.

9. Biologicky čistá kultura Saccharopolyspora spinosa, vybraná z NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18358 nebo NRRL 18539 nebo její mutant, produkující sloučeninu obecného vzorce I.