HU208998B - Insecticidal and acaricidal compositions containing macrolide derivatives as active ingredients, process for preparing compositions against ectoparasites and process for producing the active ingredients - Google Patents

Description

A találmány makrolidszármazékokat tartalmazó inszekticid és akaricid készítményekre, valamint a hatóanyagok, ektoparazita-ellenes készítmények, és a hatóanyagot termelő mikroorganizmusok biológiailag tiszta tenyészetének előállítására vonatkozik.

A találmány szerinti inszekticid és miticid készítmények hatóanyagai a makrolid vegyületek új csoportját alkotják.

Az utóbbi időben egyre nagyobb szükség merült fel új inszekticid és miticid készítmények kidolgozására, mivel az irtani kívánt kártevők gyors ütemben rezisztenssé válnak a jelenleg használatban lévő inszekticid és miticid szerekkel szemben. Az inszekticid készítményekkel szembeni rezisztencia az ízeltlábúaknál nagyon elterjedt, így legalább 400 fajta rezisztenssé vált egy vagy több inszekticid készítménnyel szemben. Jól ismert az, hogy rezisztencia alakult ki régebbi inszekticid szerekkel, így DDT-t, karbamátokat vagy szerves foszfátokat hatóanyagként tartalmazó készítményekkel szemben. Ugyancsak rezisztencia alakult ki az újabb piretroid hatóanyagú inszekticid és miticid készítményekkel szemben is. így tehát szükség van új inszekticid és miticid hatású vegyületek és ezeket hatóanyagként tartalmazó készítmények kidolgozására.

Már régen felismerték azt, hogy ektoparaziták, így bolhák, kullancsok, szúró legyek és hasonlók irtása nagy probléma az állattenyésztésben. A háziállatok hagyományos kezelésére topikálisan alkalmaztak inszekticid szereket, ilyenek például a juhok fürdetésére szolgáló híres fürdők. Valóban, ilyen kezelések még mindig széles körben használatosak. Jelenleg a kutatás olyan - hatóanyagként alkalmazható - vegyületek kidolgozására irányul, amelyek beadhatók az állatoknak, mégpedig orálisan, és amelyek úgy irtják az ektoparazitákat, hogy akkor mérgezik meg azokat, ha beszívják a kezelt állatok vérét.

A találmány szerinti inszekticid és miticid készítmények hatóanyaga új fermentációs termék, amelyet „A83543”-mal jelölünk, és amely A83543A, A83 543B, A83 543C, A83 543D, A83 543E, A83 543F, A83 543G, A83 543H és A83 543J egyes komponenseket foglal magában. Az A83 543 és az egyedi A83 543 komponensek felhasználhatók rovarok, főként pikkelyes szárnyúak (Lepidoptera-fajták), így déli sereghernyó, és kétszárnyúak (Diptera-fajták), így döglégy, istállólégy és szúnyogok irtására inszekticid készítmények alakjában. A találmány kiterjed az A83 543 vegyületek előállítására és a találmány szerinti készítmények alkalmazására rovarok vagy atkák szaporodásának a gátlására és csökkentésére szolgáló eljárásra is.

Az A83543 vegyületek az (1) általános képletnek felelnek meg. Ebben a képletben R jelentése H vagy (a), (b), (c) vagy (d) általános képletű csoport és

R² jelentése (e) általános képletű csoport, amelyekben R¹, R³, R⁵ és R⁶ hidrogénatom vagy metilcsoport; és R⁴ jelentése metil- vagy etilcsoport, vagy azoknak a vegyületeknek a savaddíciós sói, amelyekben R jelentése eltér hidrogénatomtól.

A könnyű előállítás szempontjából nézve előnyösek azok az (1) általános képletű származékok, amelyekben R, R’, R³, R⁴ és R⁶ a következő kombinációk egyikében vannak jelen:

R	R1	R3	R4	R5	R6
(a)	Me	H	Et	Me	Me
(b)	Me	H	Et	Me	Me
(c)	Me	H	Et	Me	Me
(a)	Me	Me	Et	Me	Me
(a)	Me	H	Me	Me	Me
(a)	H	H	Et	Me	Me
(d)	Me	H	Et	Me	Me
(a)	Me	H	Et	H	Me
(a)	Me	H	Et	Me	H
H	Me	H	Et	Me	Me
H	Me	Me	Et	Me	Me
H	Me	H	Me	Me	Me
H	H	H	Et	Me	Me
H	Me	H	Et	H	Me
H	Me	H	Et	Me	H

A találmány magában foglalja azoknak az (1) általános képletű vegyületeknek a savaddíciós sóit is, amelyekben R jelentése eltér hidrogénatomtól.

Az aminocukor az A83 543A vegyületben β-D-forozamin; és a semleges cukor az A83 543A vegyületben a-2,3,4-tri-O-metil-ramnóz.

Kilenc A83 543 vegyületet jellemzünk. Ezek a vegyületek olyan (1) általános képletnek megfelelő vegyületek, amelyekben R jelentése eltér hidrogénatomtól. Ezek a következő szerkezetekkel rendelkeznek:

Vegyü- let	R	R1	R3	R4	R5	R6
A	(a)	Me	H	Et	Me	Me
B	(b)	Me	H	Et	Me	Me
C	(c)	Me	H	Et	Me	Me
D	(a)	Me	Me	Et	Me	Me
E	(a)	Me	H	Me	Me	Me
F	(a)	H	H	Et	Me	Me
G	(d)	Me	H	Et	Me	Me
H	(a)	Me	H	Et	H	Me
J	(a)	Me	H	Et	Me	H

Az aminocukrot kivonhatjuk az A83543 komponensekből és így pszeudoaglikonokat kapunk, amelyek olyan (1) általános képletű vegyületek, amelyekben R = H. Az A, B, C és G komponensek egy közös pszeudoaglikonnal rendelkeznek (az A83 543A pszeudoaglikon vagy pszeudo-A). Az A83 543A pszeudoaglikonról később megállapítottuk, hogy a természetben keletkezik az A83 543 komponenseként. A D, E, F, H és J

HU 208 998 Β komponensek mindegyike egyedi pszeudoaglikon. Az A83 543 pszeudoaglikonok a következő szerkezetekkel rendelkeznek:

Pszeudoaglikon11	R1	R3	R4	R5	R6
A83543A	Me	H	Et	Me	Me
A83543D	Me	Me	Et	Me	Me
A83 543E	Me	H	Me	Me	Me
A83543F	H	H	Et	Me	Me
A83543H	Me	H	Et	H	Me
A83 543J	Me	H	Et	Me	H

^aR = H

A pszeudoaglikonok közbenső termékekként használhatók például az A83 543 komponensekhez.

A következőkben összefoglaljuk az A83 543 komponensek és a pszeudoaglikonok fizikai és spektrális tulajdonságait. Ennek során a következő rövidítéseket alkalmazzuk:

EI-MS: elektronütközéses tömegspektrometria FAB-MS: gyors atombombázásos tömegspektrometria FD-MS: meződeszorpciós tömegspektrometria HPLC: nagyteljesítményű folyadékkromatográfia IR: infravörös spektrológia

NMR: mágneses magrezonancia spektroszkópia UV: ultraibolya spektroszkópia

Az A83 543A jellemzői:

Molekulatömeg: 731 Tapasztalati képlet: C₄₁H₆₅NO₁₀ FD-MS: (4. ábra)

FAB-MS (M+l):

Talált: 732,4706;

Számított C^H^NOkj képletre: 732,4687 (8. ábra) EI-MS:

Talált: 731,4612;

Számított: 731,4608 (10. ábra)

UV (EtOH) λ^: 243 nm (ε 8,920)

IR (CHC1₃): υ (lakton) 1713; (konjugált keton) 1657; többszörös csúcs C-H rezgésekre 2940 körül és C-0 rezgésekre 1060 cm'¹ körül (1. ábra) [a]⁵^⁹:-121,8° (c 1,03, CHC1₃) [a]$⁵: +6,8° (c 1,03, CHC1₃)

Az I. táblázat összefoglalja az *H és ¹³C-NMR adatokat, amelyeket A83 643A-val észleltünk (acetond₆-ban).

I. táblázat

Az A83543A *H és ¹³C-NMR adatai aceton-d₆-ban (δ ppm)

Helyzet	13C	tHa
1	172,02	-
2	33,83	3,07/2,45
3	48,13	2,94
4	41,65	3,48
5	129,12	5,86

Helyzet	13C	’Ha
6	129,66	5,89
7	41,46	2,15
8	36,50	1,99/1,34
9	76,31+	4,31
10	37,65	2,36/1,36
11	46,42	0,93
12	49,74	2,87
13	147,78	7,01
14	144,27	-
15	202,46	-
16	47,74	3,30
17	80,41	3,53
18	30,33	1,51
19	21,85	1,78/1,17
20	34,45	1,50
21	76,24+	4,66
22	28,51	1,48
23	8,97	0,81
24	15,71	1,12
1’	96,34	4,81
2’	77,61	3,51
3’	81,87	3,37
4’	82,43	3,00
5’	68,03	3,48
6’	17,64	1,18
2’-OCH3	56,66*	3,37
3’-OCH3	58,39*	3,41
4’-OCH3	- 60,12	3,45
1”	103,45	4,45
2”	31,24	1,92/1,37
3”	18,14	1,84/1,52
4”	65,34	2,12
5”	73,35	3,56
6”	18,87	1,21
N(CH3)2	40,38	2,22

^a Bizonyos méréseket végeztünk 'h/¹³C kölcsönös viszonyból ⁺, * Ugyanazon indexszel ellátott rezonanciák egymás között felcserélhetők

Az A83 543B jellemzői Molekulatömeg: 717 Tapasztalati képlet: C^H^NOio FAB-MS: (9. ábra).

AzA83543C jellemzői Molekulatömeg: 703 Tapasztalati képlet: Ο₃₉Η₆₁ΝΟ₁₀ FD-MS: (5. ábra).

Az A83 543D jellemzői

HU 208 998 Β

Molekulatömeg: 745

Tapasztalati képlet: C₄₂H₆₇NO₁₀

UV (EtOH) λ^: 244 nm (ε 9,910)

IR (CHC1₃): υ (lakton) 1708; (konjugált keton) 1658; többszörös csúcs C-H rezgésekre 2940 körül és C-0 rezgésekre 1070 cm^-1 körül (2. ábra).

[a]o⁹ :-142,9° (c 1,02, CHC1₃) [ct]§⁵ :-29,9° (cl,02, CHC1₃)

FD-MS: (6. ábra).

A II. táblázat összefoglalja az *H és ¹³C-NMR adatokat, amelyeket A83 543D-vel észleltünk (acetond₆-ban).

II. táblázat

Az A83 543D 'H és ¹³C-NMR adatai aceton-d₆-ban

Helyzet	I3C	'Ha
1	172,68	-
2	34,38	3,08/2,43
3	49,01	2,90
4	42,83	3,47
5	123,27	5,54
6	136,26	-
<uch3	20,81	1,74
7	44,41	2,18
8	35,61	2,01/1,45
9	76,72	4,32
10	38,64	2,37/1,37
11	47,04	1,02
12	50,05	2,78
13	148,47	7,04
14	145,19	-
15	. 203,16	-
16	' 48,47	3,30
17	81,03	3,53
18	30,99	1,49
19	22,51	1,78/1,19
20	35,12	1,49
21	76,84	4,65
22	29,16	1,48
23	9,55	0,81
24	16,32	1,12
1’	97,11	4,85
2’	78,33	3,54
3’	82,58	3,40
4’	83,15	3,03
5’	68,71	3,50
6’	18,26	1,18
2’-OCH3	57,31+	3,40
3’-OCH3	59,02+	3,43

Helyzet	13C	'Ha
4’-OCH3	60,71	3,47
1”	104,14	4,47
2”	31,96	1,94/1,39
3”	18,83	1,81/1,49
4”	66,06	2,12
5”	74,12	3,55
6”	19,42	1,20
N(CH3)2	40,99	2,21

^a Bizonyos jelöléseket vettünk fel *H/¹³C kölcsönös viszonyból ⁺ Rezonanciák egymás között felcserélhetök

AzA83543E jellemzői Molekulatömeg: 717 Tapasztalati képlet: C^H^NOjo FAB-MS (M+l):

Talált: 718,4526;

Számított C^H^NOjo képletre=718,4530 UV (EtOH) : 244 nm (ε 8,600)

IR (KBr) (13. ábra).

A III. táblázat összefoglalja az *H és ¹³C-NMR adatokat, amelyeket A83 543E-vel kaptunk (aceton-d₆ban).

III. táblázat

Az A83 543E *H és ¹³C-NMR adatai aceton-d₆-ban

Helyzet	13C	lHa
1	172,46	-
2	34,95	3,06/2,40
3	48,88	2,95
4	42,11	3,43
5	129,78	5,86
6	130,39	5,90
7	42,11	2,14
8	37,18	1,96/1,39
9	77,06	4,33
10	38,31	2,36/1,36
11	47,18	0,93
12	50,40	2,86
13	148,37	7,06
14	144,84	-
15	203,09	-
16	48,05	3,34
17	81,35	3,55
18	34,98	1,62/1,48
19	22,25	1,77/1,13
20	33,73	1,50
21	72,97	4,68
22	21,61	1,12

HU 208 998 Β

Helyzet	13c	*Ha
23	-	-
24	16,52	1,13
1’	97,11	4,83
2’	78,36	3,55
3’	82,55	3,37
4’	83,13	3,02
5’	68,72	3,50
6'	18,26	1,18
2’-OCH3	59,01	3,43
3’-OCH3	57,30	3,40
4’-OCH3	60,69	3,46
1”	104,24	4,47
2”	32,00	1,93/1,39
3”	18,86	1,82/1,50
4”	66,06	2,12
5”	74,13	3,57
6”	19,42	1,21
N(CH3)2	40,99	2,21

^a Bizonyos méréseket végeztünk *H/¹³C kölcsönös viszonyból

Az A83 543F jellemzői Molekulatömeg: 717 Tapasztalati képlet: C^H^NOjq FAB-MS (M+l):

Talált: 718,5434,

Számított: C^H^NOjq képletre=718,4530 UV (EtOH) λπΗχ: 243 nm (ε 10,500) és 282 nm (ε 109) IR (KBr): (14. ábra).

A IV. táblázat összefoglalja az ³H és ^l3C-NMR adatokat, amelyeket A83543F-el észleltünk (acetond₆-ban).

IV táblázat

Az A83 543F *H és ^l3C-NMR adatai aceton-d₆-ban

Helyzet	l3C	’H“
1	172,60	-
2	34,50	3,06/2,42
3	48,82	2,95
4	42,46	3,45
5	129,56	5,87
6	130,39	5,92
7	42,19	2,16
8	37,18	1,97/1,35
9	77,15	4,65
10	38,30	2,33/1,34
11	46,89	0,94
12	50,34	2,84
13	148,86	7,03
14	145,73	-

15	198,68	-
16	45,49	3,22/2,50
17	74,17	3,58
18	30,74	1,52
19	22,41	1,70/1,17
20	34,45	1,51
21	77,09	4,32
22	29,05	1,48
23	9,56	0,81
1’	97,19	4,83
2’	78,38	3,53
3’	82,58	3,38
4’	83,15	3,00
5’	68,74	3,48
6’	18,25	1,18
2’-OCH3	59,02	3,43
3’-OCH3	57,31	3,40
4’-OCH3	60,69	3,47
1”	100,19	4,53
2”	32,41	1,80/1,38
3”	18,86	1,83/1,53
4”	66,16	2,13
5”	74,01	4,01
6”	19,46	1,22
N(CH3)2	41,01	2,22

^a Bizonyos méréseket végeztünk *H/¹³C kölcsönös viszonyból

A83543G jellemzői Molekulatömeg: 731 Tapasztalati képlet: C4iH₆₅NO₁₀ FAB-MS (M+l):

Talált: 732,4661;

Számított: C₄₁H₆₆NO₁₀ képletre=732,4687 UV (EtOH) λ^: 243 nm (ε 8,970)

IR (KBr): (15. ábra).

Az V. táblázat összefoglalja az 'H és ¹³C-NMR adatokat, amelyeket A83 543G-vel észleltünk (acetondg-ban).

V. táblázat

Az A83 543G *H és ¹³C-NMR adatai aceton-d₆-ban

Helyzet	13c	*Ha
1	172,59	-
2	34,67	3,04/2,46
3	48,72	2,94
4	42,25	3,50
5	129,85	5,84
6	130,26	5,89
7	42,02	2,14
8	37,12	1,95/1,34
9	76,99	4,32

HU 208 998 Β

Helyzet	13C	>Ha
10	38,28	2,36/1,36
11	. 47,23	0,91
12	50,43	2,87
13	148,28	7,06
14	144,61	-
15	203,20	-
16	47,94	3,30
17	81,73	3,57
18	35,20	1,55
19	21,68	1,64/1,16
20	31,41	1,64/1,36
21	76,47	4,64
22	28,84	1,48
23	9,61	0,80
24	15,29	1,18
1’	96,98	4,81
2’	78,23	3,52
3’	82,46	3,37
4’	83,05	2,29
5’	68,64	3,49
6’	17,18	1,12
2’-OCH3	58,97	3,42
3’-OCH3	57,25	3,39
4’-OCH3	60,70	3,46
1”	99,51	4,80
2”	29,62	1,87/1,48
3”	19,31	1,73
4”	62,13	2,29
5”	69,93	4,20
6”	18,22	1,17
N(CH3)2	43,47	2,24

^a Bizonyos méréseket végeztünk 'h/’³C kölcsönös viszonyból

Az A83 543H jellemzői Molekulatömeg: 717 Tapasztalati képlet: C^H^NOjq UV (EtOH) λ^»: 243 nm (ε 10000)+

IR (KBr): (16. ábra)+ + A83 543H: J (58:42) arányú elegyen meghatározva.

A83 543J jellemzői Molekulatömeg: 717 Tapasztalati képlet: C₄₀H₆₃NO₁₀ UV (EtOH) λ™.: 243 nm (ε 10.00)+

IR (CHC1₃): (16. ábra)+ + A83 543H: J (58:42) arányú elegyen meghatározva.

Az A83 543H és J komponenseket kiválasztjuk az A83 543-ból H:J=58:42 arányú elegyként, amelyet analitikai nagyteljesítményű vékonyréteg-kromatográfiás módszenei végezhetünk, amelyet leírunk. Az A83 543H és J szerkezeteket 'H és ¹³C-NMR segítségével határoztuk meg az A83 543H: J elegyének aceton-d₆-ban történt tanulmányozása során. Az NMRspektrumok hasonlók és ezeket összehasonlítottuk az A83 543A komponens spektrumaival. A nagyobb változások a H és J spektrumokban a ramnóz-cukor körül összpontosulnak. A H és J komponensek csak két -OCH₃ csoportot tartalmaznak a cukorban. A H komponensben H-l’ körülbelül δ 0,1 ppm-mel tolódik el az Ή-NMR spektrumban és δ 3 ppm-mel a ¹³C-NMR spektrumban (4,81 és 99,68). Ezek az eltolódások a 2’-helyzetű metoxi-csoporton lévő metilcsoport hiányának köszönhetőek. Hasonló módon a J komponensben lévő eltolódások a 3’-helyzetű metoxi-csoporton lévő metilcsoport hiánya miatt vannak.

Az A83 543A pszeudoaglikon jellemzői Molekulatömeg: 590 Tapasztalati képlet: C₃₃H₅₀O₉ UV (EtOH) λ^: 243 nm (ε 10300)

IR (CHC1₃): υ (lakton) 1724; (konjugált keton) 1652;

többszörös csúcs C-H rezgésekre 3017 körül; többszörös csúcs C—O rezgésekre 1140 cm^-1 körül (3. ábra).

FD-MS: (7. ábra)

EI-MS: (11. ábra).

Az A83 543D pszeudoaglikon jellemzői Molekulatömeg: 604 Tapasztalati képlet: C34H52OC)

Az A83 543 komponenseket a következő analitikai HPLC rendszerekkel különböztetjük el egymástól:

I. rendszer

Oszlop: ODS, 3 pm, 4,5x50 mm (IBM)

Oldószer: CH₃OH: CH₃CN: H₂O (2:2:1) térfogatszám,

Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc

Meghatározás: UV 245 nm-nél

Hőmérséklet: szobahőmérséklet

Komponens	Retenciós idő (perc)
A	8,50
B	6,15
C	3,92
D	11,47

11. rendszer

Oszlop: 4,6x100 mm, ODS (AQ-301, S-5; YMG, Inc., Mt. Freedom, NJ) Oldószerek: CH₃OH: CH₃CN: 0,05% NH₄OAc(H₂O) (A) 35:35:30-pH=7,8 (B) 45:45:10 - pH=6,7 (tf arányok)

Áramlási sebesség: 2,0 ml/perc Futtatási idő: 35 perc Meghatározás (detekció): UV 250 nm

Gradiens: 10% B - 25% B 20 perc alatt; 50% B-ig perc alatt

Komponens	Retenciós idő (perc)
A	22,62
A-pszeudoaglikon	7,27

HU 208 998 Β

Komponens	Retenciós idő (perc)
B	12,65
C	10,62
D	25,47
E	19,22
F	16,30
G	18,92
H	16,30
J	17,50

III. rendszer

Oszlop: 4,6x100 mm, ODS (AQ-301, S-5; YMC. Inc., Mt Freedom, NJ)

Oldószerek: CH₃OH: CH₃CN=0,05% NH₄OAc (H₂O) 35:35:30 - pH=6,0 (tf. arány)

Áramlási sebesség: 2,0 ml/perc

Futtatási idő: 10 perc

Meghatározás: UV 250 nm

Komponens	Tartózkodási idő (perc)
F	4,32
H	3,42
J	3,42

Az A83 543 komponensek nem oldhatók vízben, de oldhatók oldószerekben, így metanolban, etanolban, dimetil-formamidban, dimetil-szulfoxidban, acetonitrilben, acetonban és hasonlókban.

Az A83543 és az egyedi komponensek, így az A83543A, A83543B, A83543C, A83543D,

A83543E, A83 543F, A83543G, A83543H és az A83 543J különböző sókat alkothatnak. Ezeknek a vegyületeknek valamennyi formája alkalmas a találmány szerinti készítmények hatóanyagaként. Az A83 543 sói felhasználhatók például az Á83543 elválasztására és tisztítására. Ezenkívül bizonyos sók különösen jól oldódnak vízben.

Az A83 543 sóit hagyományos sóképzési reakciókkal állítjuk elő. így például az A83543-at semlegesíthetjük megfelelő savval savaddíciós só képzése érdekében.

A savaddíciós sók különösen hasznosak. Előnyösek azok a sók, amelyek hagyományos sóképző reakciókkal előállíthatok, így a szerves és szervetlen savakkal alkotott sók. Ilyen savak például a kénsav, hidrogén-klorid, foszforsav, ecetsav, borostyánkősav, citromsav, tejsav, maleinsav, fumársav, kolinsav, pamoasav, nyálkasav, glutaminsav, kámforsav, glutársav, glikolsav, ftálsav, borkősav, hangyasav, laurinsav, sztearinsav, szalicilsav, metánszulfonsav, benzolszulfonsav, szorbinsav, pikrinsav, benzoesav, fahéjsav és hasonló savak.

A használhatóság tárgyalásánál az „A83 543 vegyület” megjelölés előnyösen magában foglalja az A83 543 vegyület valamennyi komponensét, egyedi tagját, így az A83 543A, A83 543B, A83 543C, A83 543D, A83 543E, A83 543F, A83 543G, A83 543H és A83 543J vegyületeket, valamint ezek savaddíciós sóit.

Az A83543 fermentációs terméket az NRRL 18 395, az NRRL 18 537, az NRRL 18 538 és az NRRL 18539 törzsekből kiválasztott Saccharopolyspora spinosa mikroorganizmus törzsének, vagy ezek A83 543at termelő mutánsának tenyésztése útján állítjuk elő, süllyesztett, aerob körülmények között megfelelő tápközegben tenyésztve addig, ameddig kinyerhető mennyiségű A83543 vegyületet nem állítunk elő. Ahogy a fermentációs eljárások területén ismert, az A83 543 vegyületben lévő komponensek aránya függ és változik az alkalmazott fermentációs körülményekkel. Általában az A83543 körülbelül 85-90% A83 543A-Í, körülbelül 10-15% A83 543D-t és kis mennyiségű A83 543B, C, E, F, G, H és I komponenseket, valamint A83 543A pszeudoaglikont tartalmaz. Az egyes komponenseket, így az A83 543A-t, A83 543B-t, A83543C-t, A83543D-t, A83543E-t, A83543F-et, A83543G-t, A83543H-t és A83 543J-t, valamint az A83543A pszeudoaglikont a leírt módon választjuk szét és különítjük el.

A találmány más szemszögéből tekintve, úgy állítunk elő A83543 vegyületet, hogy NRRL 18395, NRRL 18357, NRRL 18538 vagy NRRL 18539 törzsekből kiválasztott Saccharopolyspora spinosa törzset, vagy ezek A83 543-at termelő mutánsát tenyésztjük olyan tápközegben, amely asszimilálható szenet, nitrogént és szervetlen sókat tartalmaz, süllyesztett, aerob körülmények között mindaddig, ameddig kinyerhető mennyiségű A83 543 terméket nem állítunk elő. Az egyes komponenseket ezután a szakterületen önmagában ismert módszerekkel különíthetjük el.

Más változat szerint az NRRL 18 395, NRRL 18 537, NRRL 18538 vagy NRRL 18539 törzsekből kiválasztott Saccharopolyspora spinosa mikroorganizmus biológiailag tisztított kultúráját vagy ezek egy A83 543-at termelő mutánsát tenyésztjük. Ezek a mikroorganizmusok hasznosak, mivel A83 543-at termelnek.

Egyszerűség kedvéért az ezután következő részekben a törzseket a következő módon jelöljük: A83 543.1, A83 543.3, A83 543.4 és A83 543.5. Az A83 543.1 egy a Virgin Islandsről származó talajmintából származó tenyészet (A83 543) kémiai mutációjával kapott kultúra. Az A83 543.3, A83 543.4 és az A83 543.5 tenyészeteket az A83 543.1 kultúra származékaiból kaptuk kémiai mutációk útján.

Az A83 543.1, A83 543.3, A83 543.4 és A83 543.5 kultúrákat deponáltuk és részét képezi a Midwest Area Northern Régiónál Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illionis, 61604, törzstenyészet gyűjteménynek, amelyből közhasználatra a következő nyilvántartási számon igényelhetők:

NRRL-szám	Törzs-szám
18 395	A83 543.1
18537	A83 543.3
18538	A83 543.4
18539	A83 543.5

HU 208 998 Β

Az A83 543.1 kultúra rendszertani tanulmányozását Frederick P. Mertz végezte a Lilly Research Laboratories munkatársaként. E tanulmányok alapján az A83 543.1, az A83 543.3, az A83 543.4 és az A83 543.5 mikroorganizmusokat a Saccharopolyspora nemzetség új fajának tagjaiként osztályozták és sorolták be, amelyeket Saccharopolyspora spinosa sp. nov.-nak neveztek el. Ez az osztályozás közvetlen laboratóriumi öszszehasonlításokon alapszik és hasonló fajták közzétett leírásainak a figyelembevételével történt.

Alkalmazott módszerek

A következő módszereket az International Streptomyces Project (ISP) ajánlotta a Streptomyces fajták jellemzésére [E. B. Shirling and D. Gottlieb, „Methods fór Characterization of Streptomyces Species,” Int. J. Syst. Bacteriol. 16:313 - 340 [1966)]. Ugyancsak ajánl módszereket a Nocardia fajták jellemzésére R. E. Gordon, D. A. Bamett, J. E. Handerhan és C. H. Pang a „Nocardia coelia, Nocardia autotrophica, and the Nocardin Strains”, Int. J. Syst. Bacteriol. 24(1), 54-63 (1974) irodalomban.

Az ISCC-NBS Centroid Color Charts 2106 számú szabvány minta (National Bureau of Standards, 1958, U. S. Department of Commerce, Washington, D. C.) felhasználásra került a színmegnevezés, az ellenkező oldal és a gombasejt föld feletti részének a meghatározására.

Morfológiai vizsgálatokat optikai fénymikroszkóppal és letapogató elektronmikroszkóppal végeztek (SEM).

Az egész sejtek hidrolizátumaiban a diamino-pimelinsav (DAP)-izomert és a szénhidrátokat kromatográfiás módszerekkel határozták meg: B. Becker, Μ. P. Lechevalier, R. E. Gordon and Η. E. Lechevalier, „Rapid Differencíation between Nocardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole-cell Hydrolysates,” Appl. Micropiol. 12, 421-423 (1964), és Μ. P. Lechevalier and H. Lechevalier, „Chemical Composition as a Criterion in the Classification of Aerobic Actinomycetes”, Int. J. Syst. Bacteriol. 20, 435-443 (1970).

Foszfolipideket Μ. P. Lechevalir és H. Lechevalier módszere szerint határozták meg [A University Laboratory Approach, Dietz and Thayer (eds.), Sociaty fór Industrial Microbiology Special Publication No. 6, Arlington, VA, pp. 227-233 (1980)].

Manokinon készítményt R. M. Kroppenstedt módszere szerint határoztak meg [Chemical Methods in Bacterial Systematics, M. Goodfellow and D. E. Minnikin (eds.), 1985, pp 173-196] és M. D. Collins módszerét követve vizsgálták a készítményt (ugyanott 267285. oldal).

Az antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát antibiotikumra érzékeny korongnak ISP No. 2 beoltott agar lapok felületébe való beágyazása útján mérték.

A keményítő hidrolizálásának a mértékét a jelenlévő keményítő meghatározásával jód felhasználása útján végezték, amelyhez ISP No. 4. agar lapokat használtak (szervetlen sók - keményítő).

Zsírsav-metil-észtereket azonos körülmények között fejlődött liofilizált egész sejtekből készítettek.

A fő komponens analízise kétdimenziós volt, amelyet számítógéppel készítettek. Az egységek mérete a fő komponens-diagramban (12. ábra) szabványos eltérésű.

A mikolsavakat Minnikin által javasolt módszerrel határozták meg [D. E. Minnikin, I. G. Hutchinson and A. B. Caldicott, „Thin-Layer Chromatogryphy of Methanolysates of Mycolic Acid-Containing Bacteria,” J. Chromatography 188,221-233 (1980)].

Tenyésztési jellemzők

Az A83 543.1 tenyészet jól fejlődik mind komplex, mind meghatározott közegekben. A tenyészet föld feletti (kiemelkedett) micellákat fejlesztett valamennyi alkalmazott közegben. A kiemelkedett spóratömeg színe túlnyomóan világossárga-lazacszín volt, de fehér is jelent meg számos közegen.

A hátoldal sárga - sárgásbarna volt. Nem volt észlelhető megkülönböztető pigmentáció. Oldható barna színű pigment szabadult fel számos közegben.

A tenyésztési jellemzőket a VI. táblázatban foglaljuk össze.

VI. táblázat

Az A83 543. l^a tenyésztési jellemzői

Közeg	Növekedés	Hátoldal színe (ICCNBS Centroid Color Charts jelölés)	Kiemelkedett micélium	Oldható pigment
Növekedés	Szín (ICC-NBS jelölés)
ISP közeg 2	kitűnő	76. l.yBr	kitűnő	92. yWhite	nincs
ISP közeg 3	jó	264. 1. Gray	jó	263. yWhite	nincs
ISP közeg 4	jó	92. yWhite	jó	263. yWhite	nincs
ISP közeg 5	kitűnő	73. p. OY	kitűnő	31. p. yPink	halvány-barna
ISP közeg 7	kitűnő	77. m. yBr	kitűnő .	31. p. yPink	halvány-barna
AIAAgarb	kitűnő	89. p. Y	kitűnő	31. p. yPink	barna
ATCC 172	kitűnő	92. yWhite	kitűnő	31. p. yPink	nincs
Bennetts	kitűnő	92. yWhite	kitűnő	31. p. yPink	halvány-barna
Kalcium-maleát	jó	73. p. OY	megfelelő	9. pk. White	barna

HU 208 998 Β

Közeg	Növekedés	Hátoldal színe (ICCNBS Centroid Color Charts jelölés)	Kiemelkedett micélium	Oldható pigment
Növekedés	Szín (ICC-NBS jelölés)
Chitin	megfelelő	92. yWhite	megfelelő	263. White	nincs
Czapek	jó	92. yWhite	jó	263. White	nincs
Emerson	kitűnő	76. l.pBr	kitűnő	31. p. yPink	barna
Glukóz-asparagin	jó	90. gy. Y	megfelelő	31. p. yPink	halvány-barna
Glicerin-glicin	kitűnő	78. d. yBr	kitűnő	80. gy. yBr	sötét-barna
Tápanyag	kitűnő	90. gy. Y	kitűnő	31. p. yPink	halvány-barna
TPOC	kitűnő	90. gy. Y	kitűnő	31. p. yPink	nincs
YWAd	megfelelő	93. y. Gray	gyenge	363. White	nincs
YDAe	kitűnő	77. m. yBr	megfelelő	9. pk. White	sötét-barna

^a Inkubálás 30 °C-on 21 napig ^b Actinomycete Isolation Agar, Difco ^c Paradicsompaszta-zabliszt agar. A The actinomycetes, vol. 2, S. A. Waksman, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1961 ^d Csapvíz-agar (Gordon, Bamett, Handerhan and Pang) ^e Élesztő-dextróz-agar (Gordon, Bamett, Handerhan and Pang).

Morfológiai jellemzők

Az A83 543.1 tenyészet kiterjedt altalaj-micéliumot termelt, amely széttöredezett folyadék-fermentálásnál. Széttöredezés nem volt észlelhető, ha a tenyésztés agar talajokon történt.

Fehér kör alakú, 8-10 mm átmérőjű kolóniákat figyeltünk meg, ha a tenyészetet ISP médium 1-re rétegeztük rá, a kolóniák közepe pedig kiemelkedett és a hátoldal sárgás-barna színű volt.

Jól formált, kiemelkedett gombasejtek voltak jelen a közeg legnagyobb részén. A kiemelkedett gombasejtek szeletekre oszlottak a hosszú spóraláncokban, amelyek kampókként és nyitott hurkokként rendeződtek el. Megfigyelhetők voltak spirálok is, de ezek rövidek voltak és nem voltak teljesek.

Az általános morfológia Rectus-flexibilis (RA) volt.

A kiemelkedett gombasejtek jellegzetes, gyöngyhöz hasonló megjelenésűek voltak és néhány üres nyílást tartalmaztak a spóraláncban. Ez a sajátosság azt mutatta, hogy a spórahüvely beburokolta a spóraláncot. A spórahüvelyt nagyon jellegzetes tüskék borították. Ezeknek a tüskéknek a hossza 1 pm volt és a végük le volt kerekítve. A spóra alakja hosszúkás volt és átlagos mérete megközelítően 1,1x1,5 pm-t tett ki. A spóralánc hossza olyan volt, hogy jóval 50 felett tartalmazott spórákat. Nem volt észlelhető cikcakkos felépítés, fehérpenész, spórátok vagy mozgékony sejt.

Fiziológiai jellemzők

Az A83 543.1 tenyészet savat termelt a következő szénhidrátokból: adonit, D-arabinóz, eritrit, fruktóz, glukóz, glicerin, mannit, mannóz, ribóz és trehalóz.

A tenyészet nem termelt savat a következő vegyületekből·. L-arabinóz, cellobióz, cellulóz, dextrin, dulcit, etanol, galaktóz, glikogén, inozit, inulin, laktóz, maltóz, melizitóz, melebióz, α-metil-D-glukozid, raffinóz, L-ramnóz, szalicin, szorbit, L-szorbóz, szacharóz, xilit vagy xilóz.

Növekedés volt megfigyelhető galaktózzal, maltózzal és melizitózzal, de nem termelődtek savak ezekből a szénhidrátokból.

Az A83 543.1 tenyészet a következő szerves savakat használta nátriumsók formájában: acetát, butirát, citrát, formiát, laktat, maleát, propionát, piruvát és szukcinát. A tenyészet nem használt benzoátot, mikonátot, oxalátot vagy tartarátot.

Az A83 543.1 lebontott allantoint, kalcium-maleátot, kazeint, elasztint, hippurátot, hipoxantint, tesztoszteront, L-tirozint és karbamidot. Nem volt képes lebontani az adenint, eszkulint, guanint, a keményítőt vagy a xántint.

Az A83 543.1 termelt katalázt, foszfatázt, ureázt és H₂S-t. Folyósított zselatint és redukált nitrátot. Nem volt ellenálló lizozimmel szemben és nem tenmelt melanotikus pigmenteket. A tenyészet nem peptonizált és nem hidrolizált sovány tejet. Az A83 543.1 elviselte az NaCltartalmat egészen 11%-ig. Nem volt képes túlélni 50 ’Cot 8 óra hosszat, de növekedett 15 ’C és 37 ’C között.

Az A83 543.1 ellent tudott állni cefalotinnak (30 pg), penicillin G-nek (10 egység) és rifampinnak (5 pg). Érzékeny volt bacitracinra (10 egység), gentamicinre (10 pg), linkomicinre (2 pg), neomicinre (30 pg), oleandomycinre (15 pg), sztreptomicinre (10 pg), tetraciklinre (30 pg/, tobramicinre (10 pg) és vankomicinre (30 pg).

Sejtfal-elemzés

Hidrolizált A83 543.1 egész sejtek mezo-diaminopimelinsavat tartalmaztak. Diagnosztikai cukrok az egészsejt-kivonatokban a galaktóz és az arabinóz voltak. Az A83 543.1 tenyészet egy IV típusú sejtfal-rendszert és egy A típusú cukorrendszert tartalmazott (Lechevalier és Lechevalier fenti irodalom). A sejtek nem tartalmaztak mikolinsavakat.

Foszfolipid-meghatározások az egész sejteken foszfatidil-kolin és kardiolipin jelenlétét mutatják.

HU 208 998 Β

Nem volt kimutatható foszfatidil-etanolamin. így az A83 543.1 tenyészet egy PIII típusú foszfolipid-rendszert tartalmaz [Μ. P. Lechevalier, A. E. Stem and H. A. Lechevalier, „Phospholipids in the Taxonomy of Actinomycetes”, in Actinomycetes, Zbl. Bakt. Suppl. 11, K. P. Scheal and G. Pulverer (eds), Gustav Fischer Verlag, New York, 1981].

A több kimutatott menakinon MK-9(H₄) volt. Kisebb mennyiségű MK-9(H₆) volt észlelhető.

Falósejttel való bevonás

Nagy számú Streptomycete, Saccharopolyspora és Amycolatopsis falósejtet vittünk rá A83 543.1 tenyészetre. Foltok nem voltak megfigyelhetők.

A83 543.1 azonosítása

Ahogy az előzőekben ismertettük, az A83 543.1 tenyészet egy IV típusú sejtfal-rendszerrel és egy A típusú egészsejt cukorrendszerrel rendelkezik. A következő tizenhárom fajta ilyen sejtkémia-rendszerrel rendelkezik: Nocardia, Rhodococcus, Corynebacterium, Caseobacter, Mycobacterium, Faenia (Micropolyspora), Pseudonocardia, Saccharomonospora, Saccharopolyspora, Actinopolyspora, Amycolata, Amycolatopsis és Kibdelosporangium. Ezeket a fajtákat mikolsavak, zsírsav-kompozíció, valamint foszfolipid és menakinon típusok jelen- vagy távolléte különbözteti meg. A Faenia, Pseudonocardia és Saccharopolyspora chemotaxonómiai jellemzői azonosak az A83 543.1 tenyészet ilyen jellemzőivel, de ezek a fajták különböznek az A83 543.1 tenyészettől morfológiai és tenyésztési tulajdonságaikban.

A Faenia (Micropolyspora) fajta sima spórákkal és rövid spóraláncokkal rendelkeznek, amelyek mind a kiemelkedett, mind az alsó gombasejteket kötődnek. Ennek a kiemelkedett gombasejtjei ritkák és fehér színűek. Ez hőkedvelő, amely 60 °C-on növekszik. Az A83 543.1 tenyészetnek nincsenek ilyen tulajdonságai és így különbözik a Faeniától.

A Pseudonocardia fajta spórákat tartalmaz mind a kiemelkedett, mind az alsó gombasejteken. Ezt megkülönböztetik az akropetális (csúcs felé haladó) csírázás és a csíraspórák. Jellemző a gombasejtek cikcakkos morfológiája. A gombasejteket tagolt, de nem-válaszfalas anyagként írták le [A. Henssen and D. Schafer, „Amanded Description of the Genus Pseudonocardia Henssen and Description of a New Species Pseudonocardia spinosa Schafer”, Int. J. Syst. Bacteriol. 21:2934 (1971)]. A növekedés valóban lassú. Széttöredezés nincs vagy nagyon ritka. Az A83 543.1 tenyészetnek nincsenek ilyen tulajdonságai.

A Saccharopolyspora fajta jellemzője a spórahüvely és a spóralánc megkülönböztető gyöngyhöz hasonló megjelenése. Ez a jellemző valóban kiemelkedő az A83 543.1 tenyészetben. Széttöredezés szintén észlelhető volt a Saccharopolyspora fajtánál. Az S. hirsuta fajtatípust elkülönítettük a kisajtolt cukornádból. Azt az eredeti tenyészetet, amelyből az A83 543.1-et kaptuk, izoláltuk a cukorőrlőből. Mivel az A83 543.1 rendelkezik ennek a fajtának a tulajdonságaival, a Saccharopolyspora egy törzsének tekinthető.

A ténylegesen ismertetett fajták a Saccharopolyspora nemben az S. erythraea és az S. hirsuta. Ismert fajták az S. hirsuta subsp. taberi és az S. hirsuta subsp. kobensis. Az A83 543.1 különbözik ezektől a törzsektől mind a kiemelkedett gombasejtekben és a hátoldali színben, mind pedig az oldható pigmentek képzésében.

Mértük a biokémiai hasonlóságot egy számos lehetséges biokémiai mérésen alapuló ún. hasonlósági koefficiens alapján. A Jaccard Sj koefficienst és az egyszerű S_sm összeillő koefficienst használtuk [W. Kurylowicz, A. Paszkiewicz, W. Woznicka, W. Kurzatkowski és T. Szulga, „Numerical Taxinomy of Streptomycetes”, Polish Medical Publishers, Warsaw, 1975. p. 37].

A VII. táblázat összefoglalja ezeket a fenti hasonlósági koefficienseket.

VII. táblázat

Hasonlósági koefficiensek az A83 543.1 tenyészetre és Saccharopolyspora fajtákra

Tenyészet	Q usm	Sj
A83 543.1	100	100
S. hirsuta subsp. taberi	68	57
S. hirsuta subsp. kobensis	67	60
S. erythraea	63	54
S. hirsuta	55	50

Az A83 543.1 és az ismert Saccharopolyspora fajták zsírsav-analízise azt mutatta, hogy valóban mindegyik telített és elágazó láncú zsírsavakkal rendelkezik. Az A83 543.1 zsírsav-összetétel hasonló, de nem azonos más fajták összetételével. A VIII. táblázat az A83 543.1 és az ismert Saccharopolyspora fajták zsírsavösszetételeit mutatja be.

VIII. táblázat

Az A83 543.1 és a Saccharopolyspora törzsek százalékos zsírsavösszetétele '

Zsírsav	A83 543.1	S. erythraea	S. hirsuta	S. hirsuta subsp. kobensis
15:0 izo	11,80	17,86	15,44	17,94
15:0 anteizo	0,64	1,33	1,38	1,25
16:0 izo	22,47	25,70	15,61	19,05
16:1 transz 9	1,15	-	4,14	2,63
17:1 izoF	7,22	7,97	-	-
17:1 izo G	-	-	3,75	6,82
17:0 izo	17,59	13,37	26,26	19,41
17:0an- teizo	15,30	12,46	14,19	12,72
17: IB	4,77	1,90	-	0,67

998 B 2

HU

Zsírsav	A83 543.1	S. erythraea	S. hirsuta	S. hirsuta subsp. kobensis
17:1 C	1,65	-	2,70	1,81
17:0	2,74	1,01	1,43	0,94
16:1 20H	1,27	2,07	4,74	4,85
18:1 izo F	7,57	11,31	6,83	7,47
TBSA lOMe 18:1	1,15	1,34	1,77	1,00

^aTBSA - tuberkulósztearinsav

A zsírsavösszetételek főkomponens analízise a VIII. táblázatban azt mutatja, hogy elegendő szóródás van ahhoz, hogy segítse a tenyészeteket a különböző fajtáknál ugyanazon nemen belül. A VIII. táblázat adatainak a fő komponens-diagramját a 12. ábra szemlélteti.

AIX. táblázat összehasonlítja az A83 543.1 fizikai jellemzőit a Saccharopolyspora fajták és alfajták fizikai jellemzőivel.

IX. táblázat

Az A83 543.1 és a Saccharopolyspora fajták különböző fizikai jellemzői

Jellemzők	A83 543.1	S. erythraea	S. hirsuta	S. hirsuta subsp. taberi	S. hirsuta subsp. kobensis
adenin bomlása	-	+	+	+	+
eszkulin bomlása	-	+	+	+	+
keményítő bomlása	-	+	+	+	+
xantin bomlása	-	+	+	+	+
allantoin bomlása	+	-	-	-	ND
nitrát-re- dukció	+	+	-	+	+
foszfatáz	+	-	+	-	ND
benzoát használata	-	-	+	-	ND
mukát használata	-	-	+	-	ND
oxalát használata	-	-	+	-	ND
hőmérséklet-tartomány °C	15-37	20-42	25-50	20-42	20-42
NaCl-tűrés (%)	11	ND’	15	ND	12

Jellemzők	A83 543.1	S. erythraea	S. hirsuta	S. hirsuta subsp. taberi	S. hirsuta subsp. kobensis
savképződés: arabinózból	+	+	-	+	-
cellobióz- ból	-	+	+	+	+
dextrinből	-	+	+	+	ND
galaktóz- ból	-	+			+
inozitból	-	+	+	+	-
maltózból	-	+	+	+	+
melezitóz- ból	-	+	-	+	ND
melibióz- ból	-	+	ND	-	ND
raffinóz- ból	-	+	+	+	+
ramnózból	-	+	+	+	-
szalicinból	-	+	-	-	ND
szukróz- ból	-	+	+	+	+
xilózból	-	+	+	-	-
laktózból	-	-	+	-	ND
a-Me-D- glukozid- ból	-	-	+	+	ND
szorbitból	-	-	+	-	-
inulinból	-	ND	+	ND	+

Az összehasonlítások azt mutatják, hogy az A83 543.1 tenyészet jelentős mértékben különbözik az előző időkben leirt Saccharocolyspora fajtáktól és a Saccharopolyspora új fajtái ezek, amelyeknek a Saccharopolyspora spinosa nevet adtuk. Ez a spinosa név ezeknek a fajtáknak tüskés spóra díszítését tükrözi vissza.

Az A83 543.3, az A83 543.4 és az A83 543.5 törzsek mikroszkopikusan eléggé hasonlóak az A83 543.1 törzshöz és a Saccharopolyspora spinosa törzseiként kell besorolni. A négy törzs mennyiségben különbözik az A83 543 mennyiségétől, amelyek azt termelik. Az A83 543.3 törzs körülbelül négyszer több A83 543-at termel, mint az A83 543.1 törzs, míg az A83 543.4 és az A83 543.5 törzsek körülbelül nyolcszor-kilencszer többet termelnek, mint az A83 543.1 törzs.

Ahogy más organizmusok esetében, a találmány szerinti készítmények hatóanyagául szolgáló A83 543at termelő tenyészetek jellemzői, így a Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 és NRRL 18539 jellemzői olyanok, hogy variációk lehetségesek. így e törzsek mutánsai előállíthatók a szakterületen ismert fizikai és kémiai módszerekkel.

HU 208 998 Β így például más törzseket kaphatunk kémiai anyagokkal, így N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidinnel való kezelés útján. A Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 és NRRL 18539 törzsek természetes és létrehozott mutánsai, amelyek rendelkeznek azzal a jellemzővel, hogy kinyerhető mennyiségű A83 543-at termelnek, szintén a találmány körébe tartoznak.

A Saccharopolyspora spinosa kultúrák tenyésztésére alkalmazott kultúrközeg a nagy számú közegek bármelyike lehet. A gazdaságos termelés, a lehető legjobb hozam és a termék könnyű elkülönítése szempontjából azonban bizonyos tenyészközegek előnyben részesülnek. így például előnyös szénforrások nagy méretű fermentációnál a glükóz és a maltóz, bár a ribóz, xilóz, fruktóz, galaktóz, mannóz, mannit, oldható keményítő, burgonyadextrin, metil-oleát, olajok, így a szójaolaj és hasonlók szintén használhatók.

Előnyös nitrogénforrások a gyapotmagliszt, peptonizált tej és a digerált szójababliszt, bár a halliszt, kukorica-áztató folyadék, élesztőkivonat, enzimmel hidrolizált kazein, marhahús-kivonat és hasonlók is használhatók.

A tápértékű szervetlen sók, amelyek a tenyészközegbe bevihetők, a szokásos sók, amelyek képesek cink, nátrium, magnézium, ammónium, klorid, karbonát, szulfát, nitrát és hasonló ionok szolgáltatására. Olyan fontos nyomelemeket, amelyek szükségesek az organizmus növekedéséhez és fejlődéséhez, szintén be kell vinnünk a tenyészközegbe. Ilyen nyomelemek rendszerint szennyezésekként fordulnak elő a közeg más szubsztituenseiben olyan mennyiségben, amely elegendő az organizmus fejlődéséhez.

Abban az esetben, ha habzási problémák merülnek fel, akkor rendszerint kis mennyiségű (például 0,2 ml/liter) habzásgátló anyagot (így polipropilénglikolt) a nagy terjedelmű fermentációs közegekhez. Az A83 543-at termelő tenyészetek esetében azonban a hagyományos habzásgátló szerek gátolják az A83 543 termelését. A habzást gátolhatjuk szójababolaj vagy Pluronic L-101 (BASF) habzásgátlónak a közegbe történő bevitelével, amelynek a mennyisége 1-3%. További olajat adhatunk a közeghez, ha a habzás fokozódik.

Az A83 543 komponens százaléka változhat a közegek változásaival. Abban az esetben például, ha valint vagy izovajsavat vagy propionsavat adagolunk, akkor az A83 543D százalékos termelése megnő.

Jelentős mennyiségű A83 543 termelésére alámerített levegőigényes (oxigénigényes) fermentáció előnyös kevert bioreaktorokban. Kis mennyiségű A83 543-at rázólombikos kultúrában kaphatunk. A termelésben való időelhúzódás miatt, amely általában a nagy bioreaktoroknak az organizmus spóraformájával történő beoltásával kapcsolatos, előnyös vegetatív inokulum használata. A vegetatív inokulumot úgy állítjuk elő, hogy a tápközeg kis mennyiségét beoltjuk az organizmus spóraformájával vagy micélium-töredékével és így az organizmus friss, jelentős mértékben növekvő tenyészetét kapjuk. A vegetatív inokulumot ezután átvisszük a nagyobb bioreaktorba. A vegetatív inokulumközeg ugyanaz lehet, mint a nagyobb fermentációkhoz használt közeg, de más közeget is alkalmazhatunk.

A83 543-at termelünk A83 543D-termelő organizmussal, ha körülbelül 24 °C és körülbelül 33 °C közötti hőmérsékleten tartjuk. A legkedvezőbb hőmérséklet A83543 termelésére körülbelül 28-30 °C tartományban van.

Ahogy az alámerített levegőigényes tenyésztési folyamatoknál említettük, steril levegőt fúvatunk be az edény alján és közben a közeget hagyományos turbinakeverőlapátos keverővei keverjük. A levegőbevezetés és a keverés sebességének általában olyannak kell lennie, hogy az oldott oxigén-szintet 35%-on vagy e felett tartsuk. Az oldott oxigén szintje előnyösen 50% vagy e felett van. A szükséges levegőtelítettséget 34 kPa belső túlnyomással biztosítjuk.

Az A83 543 komponensek termelését a fermentáció folyamán a táptalaj extrakcióinak a vizsgálatával követhetjük. A HPLC egy használható vizsgálati módszer erre a célra, amelyet az 1. példában írunk le.

Az A83 543 komponenseket az alámentett levegőigényes fermentációs körülmények közötti előállítás után az alkotóanyagoknak a fermentációs közegekből való kinyerésére alkalmas és a szakterületen ismert módszerekkel nyerhetjük ki. Az A83 543-at termelő organizmus fermentálása során termelt A83 543 mind a micéliumokban, mind a táptalajban előfordul. Úgy tűnik, hogy az A83543 lipofil jellegű. Ily módon, ha jelentős mennyiségű olajat használtunk a fermentációban, akkor az egész táptalaj extrakciója hatásosabb. Abban az esetben, ha csak kis mennyiségű olajat használtunk, akkor az A83 543 nagyobb része a micéliumokban van. Ebben az esetben hatásosabban nyerhetjük ki az A83 543-at, ha először szűrjük a micéliumot és így elkülönítjük a micéliumtömegtől (biomasszától).

Az A83 543-at különböző módszerekkel nyerhetjük ki a biomasszából. Egy előnyös módszer abban áll, hogy az elkülönített biomasszát vízzel mossuk annak érdekében, hogy kinyerjük a visszamaradó táptalajt, a biomasszát olyan poláros oldószerrel keverjük, amelyben az A83 543 oldható, például metanollal vagy acetonnal keverjük össze, ezután elkülönítjük az oldószert és betöményítjük, a kapott koncentrátumot nempoláros oldószerrel extraháljuk és/vagy adszorbeáljuk valamely fordított fázisú szilikagél adszorbensen, így ROC8 vagy RP-C18 nagy pórusú polimeren, így HP-20on és hasonlókon.

Az aktív anyagot alkalmas oldószerrel, így például acetonitril/metanol-elegyekkel, amelyek kis mennyiségű THF-et tartalmaznak, eluáljuk az adszorbensről.

Az A83 543-at elkülöníthetjük (szétválaszthatjuk) az egyes komponensekre, így az A83 543A, A83 543B, A83 543C, A83 543D, A83 543E, A83 543F, A83 543G, A83543H és A83543J alkotókra, valamint A83543A pszeudoaglikonra hasonló módszerekkel. Egy előnyös szétválasztási módszer a fordított fázisú szilikagél (C_lg vagy Cg) kromatográfia.

Más változatban a tenyészet szilárd anyagait, ide számítva a közeg alkotóit és a micéliumot is, extrahálás és elkülönítés nélkül, előnyösen azonban a víz eltávolí12

HU 208 998 Β tása után, felhasználhatjuk az A83 543 forrásaként. így például az A83 543 termelése után az egész fermentációs táptalajt száríthatjuk liofilizálással, dobszárítással vagy azeotrópos desztillációval és szárítással. A szárított táptalajt ezután közvetlenül felhasználhatjuk, például közvetlenül belekeverhetjük a tápkeverékbe.

Inszekticid és akaricid hatás

A találmány szerinti készítmények rovarok és atkák irtására használatosak. A találmány kiterjed e készítmények alkalmazására is, rovarok és atkák irtására. A módszer abban áll, hogy a találmány szerinti készítmények A83543 hatóanyagának a hatásos mennyiségét rávisszük a rovarok vagy atkák tartózkodási helyére.

Az A83 543 vegyületek, illetve ezeket a vegyületeket hatóanyagként tartalmazó készítmények kedvező hatást mutatnak számos rovar- és atkafajta ellen. A találmány szerinti készítmények különösen hatásosak a déli sereghemyó ellen, amely a Lepidoptera rend rovarjainak egy tagja. Ennek a rendnek más jellegzetes tagjai az almamoly, bagolypille, ruhamoly, lisztilonca, sodrólepkék, búzakalász-féreg, európai kukoricafúró rovar, importált káposztaféreg, káposztalégy, rózsaszínű bagolylepke hernyója, zsákhordó lepke hernyója, keleti sátoros rovar, gyepszövő rovar és az amerikai fehér seregbogár.

A találmány szerinti készítmények hatásosak a gyapotlevél-tetű ellen is, amely az egyenesszámyú rovarok, amelyek a Homoptera rendbe tartoznak, egyik tagja. Más Homoptera rendbe tartozó rovarok a levélsáskák, növénysáskák, körtelevélbolha, almaszívó bogár, pajzstetvek, a fehérlegyek és a nyálaspoloskák, valamint számos más jellegzetes tetűfajta.

Az A83 543 vegyületeket hatóanyagként tartalmazó készítmények hatásosak istállólegyek, döglegyek és szúnyogok ellen is, amelyek a kétszárnyúak (Diptera) rendbe tartozó rovarok tagjai. Más jellegzetes tagjai ennek a rendnek a közönséges házi legyek.

Az A83 543 vegyületeket hatóanyagként tartalmazó készítmények hatásosan gátolják a rovarok és az atkák szaporodását is és így felhasználhatók a rovarok és atkák szaporodásának a csökkentésére és akadályozására. A módszer abban áll, hogy az A83 543 vegyületek hatásos mennyiségét tartalmazó találmány szerinti készítmények szükséges mennyiségét rávisszük a rovarok és atkák tenyészhelyére.

A rovarok és atkák „tenyészhelye” megjelölés arra a körzetre vonatkozik, amelyben a rovarok és az atkák élnek vagy ahol a petéiket lerakják, ide számítva az azokat körülvevő légteret, az általuk fogyasztott táplálékot vagy minden olyan tárgyat vagy területet, amellyel érintkezésbe kerülnek. így például a növényfogyasztó rovarokat vagy atkákat úgy irthatjuk, hogy a találmány szerinti inszekticid vagy miticid készítmények hatásos mennyiségét visszük rá a növényekre, amelyeket azok megesznek vagy részben elfoglalnak.

A találmány szerinti készítményeket felhasználhatjuk textíliák, papír, raktáron lévő gabona vagy magvak védelmére rovarok és atkák ellen oly módon, hogy e készítmények hatásos mennyiségét visszük rá ezekre az anyagokra.

A „rovarok vagy atkák gátlása, illetve irtása” megjelölés azt jelenti, hogy csökkentjük az élő rovarok vagy atkák számát vagy csökkentjük az életképes rovarok vagy atkák petéinek a mennyiségét. A találmány szerinti készítmények irtóhatása, illetve a kártevők mennyiségének a csökkentése természetesen függ az alkalmazott hatóanyag-mennyiségtől, magától a hatóanyagtól és az irtani kívánt rovar- vagy atkafajtáktól. Erre a célra legalább olyan hatóanyag-mennyiséget kell használnunk, amely hatástalanítja a rovarok vagy atkák életképességét.

A „rovarok vagy atkák életképességét hatástalanító mennyiség” olyan találmány szerinti készítménymennyiségre, illetve hatóanyag-mennyiségre vonatkozik, amely elegendő ahhoz, hogy mérhető mértékben csökkenti a rovarok vagy atkák szaporodását és irtja a kezelt rovarokat és atkákat. Általában az alkalmazott hatóanyag-mennyiség nagysága körülbelül 11000 ppm (vagy 0,01-1 kg/ha) tartományban van.

A találmány kiterjed olyan módszer alkalmazására is, amellyel gátolhatjuk, illetve irthatjuk a Lepidptera rendbe tartozó érzékeny rovarokat is, amely abban áll, hogy az A83 543 vegyület hatásos mennyiségét tartalmazó találmány szerinti készítmény szükséges menynyiségét visszük rá az említett kártevőkre, illetve azok telephelyeire.

A találmány magában foglal egy módszert a Diptera rendbe tartozó szúró legyek irtására is, amely szerint az A83543 vegyületet tartalmazó találmány szerinti készítmény hatásos mennyiségét orálisan vagy parenterálisan beadjuk a veszélyeztetett állatoknak és így akadályozzuk az említett kártevők szaporodását és így elősegítjük azok irtását.

Inszekticid!miticid hatásvizsgálat

Az A83 543 vegyületek inszekticid és miticid hatását a következő inszekticid/miticid hatásvizsgálatokkal állapítottuk meg.

Mindegyik vizsgálandó vegyületet úgy formáltuk, hogy a vegyületet feloldottuk 1:1 térfogatarányú aceton/alkohol-elegyben, amely 23 g „Toximul R”-t (szulfonát/nemionos emulgeáló elegy) és 13 g „Toximul S”-t (szulfonát/nemionos emulgeáló elegy) tartalmazott literenként. Ezeket az elegyeket azután vízzel a megadott koncentrációkra hígítottuk.

Kétpettyes szövőatkákat (Tetranychus urticas Koch) és gyapot vagy dinnyelevéltetveket (Aphis gossypii Glover) vittünk rá tök-sziklevelekre és hagytuk, hogy kifejlődjenek mindkét levélfelületen. Más növények ugyanabban a kezelőedényben megfertőzetlenül maradtak. A leveleket ezután megpermeteztük 5 ml vizsgálandó oldattal egy DeVilbiss-féle porlasztó permetezővel 70 kPa túlnyomáson. A levelek mindkét felületét lecsepegésig permeteztük meg és utána egy óra hosszat száradni hagytuk. A két megfertőzetlen levelet ezután levágtuk és Petri-csészébe helyeztük azokat. A csészébe déli sereghemyót (Spodoptera eridania Cramer) helyeztünk.

További rovarokat vizsgáltunk hasonló készítmények és értékelési módszerek segítségével néhány kivétellel, amelyet jelöltünk.

HU 208 998 Β

Szabványos kezelési időtartam után megállapítottuk a százalékos pusztulást. Az eredményeket táblázatokban foglaltuk össze. A következő rövidítéseket használtuk:

Jelölés	Rovar/atka	Tudományos név
BW	gyapotmagfúró bogár	Anthonomus grandis
CA	gyapot levéltetű	Aphis gossypii
CBW	gyapotmag bagolylepke	Heliothis zea
CLH	kukorica levélsáska	Dalbulus maidis
CRW	déli gabonagyökérféreg	Diabrotica undecimpunctata howardi
SAW	déli seregbogár	Spodoptera eridania
SM	kétpettyes szövőatka	Tetranychus urticae

X. táblázat

Az A83 543A hatása újszülött CBW lárvák ellen

Kezelés	Napok*	Mennyiség (ppm)	%-os gátlás6
topikális0	1	1,00	20,00
5,00	100,00
10,00	100,00
50,00	100,00
100,00	100,00
felviteld	4	1,00	30,00
kezelés		5,00	100,00
10,00	100,00
50,00	100,00
100,00	100,00
petee	6	10,00	0,00
50,00	0,00
100,00	30,00
topikális0	1	0,50	10,00
1,00	40,00
5,00	80,00
10,00	100,00
50,00	100,00
100,00	70,00
felvitel	3	0,50	15,00
kezelés		1,00	45,00
5,00	100,00
10,00	100,00
50,00	100,00

^a Napok száma a kezelés és az értékelés között ^b Két vizsgálat átlaga ^d Kezelés 1 ml formált A83 543A-val ^d Felvitel a felület A83 543A-val való kezeléssel, szárítás és fertőzés ^e Peték topikális kezelése A83 543A-val és várakozás a kontrolipeték teljes kikeléséig

XI. táblázat

Újszülött CBW lárvák százalékos irtóhatása A83 543 komponensekkel¹

Kompo- nens2	PPM
0,5	1	5	10
A	55 (d)	100 (a)	100 (a)	100 (a)
B	35 (e)	80 (c)	100 (a)	100 (a)
C	5 (g)	85 (be)	93 (be)	100 (a)
D	58 (d)	90 (ac)	100 (a)	100 (a)
E	28 (ef)	58 (d)	100 (a)	100 (a)
F	0(g)	0(g)	0(g)	95 (ab)
G	0(g)	0 (g)	20 (f)	80 (c)

¹ Kezelések a zárójelekben lévő ugyanazon betűkkel jelölve hasonlóak a 0,05 szintnél

Topikális pipetta-módszer 20 lárva/ismétlés és 4 ismétlés; egy nap a kezelés és az értékelés között

XII. táblázat

Az A83 543A hatása SAW lárvák ellen

Állapot	Kezelés	Na- pok*	Mennyiség (ppm)	%-os gátlás6
újszülött	levél/bokor- bab°	3	1,00	10,00
5,00	40,00
10,00	100,00
50,00	100,00
100,00	100,00
újszülött	topikális0	3	1,00	0,00
5,00	60,00
10,00	100,00
50,00	100,00
100,00	100,00
újszülött	levél/bokor- babe	4	0,50	0,00
1,00	66,67
5,00	100,00
10,00	100,00
50,00	100,00
második lárvaállapot	topikális0	1	1,00	0,00
5,00	0,00
10,00	0,00
50,00	80,00
100,00	100,00
második lárvaállapot	levél/bokor- babd	4	1,00	0,00
5,00	0,00
10,00	80,00
50,00	80,00
100,00	100,00

HU 208 998 Β

Állapot	Kezelés	Na- pok3	Mennyiség (ppm)	%-os gátlás6
harmadik lárvaállapot	topikálise	2	1,00	0,00
5,00	0,00
10,00	13,33
50,00	73,33
harmadik lárvaállapot	levél/bokor- babe	4	0,50	0,00
1,00	0,00
5,00	40,00
10,00	100,00
50,00	100,00
ötödik lárvaállapot	topikálise	2	10,00	0,00
50,00	0,00
ötödik lárvaállapot	levél/bokor- babe	4	10,00	0,00
50,00	0,00

^a Napok száma a kezelés és az értékelés között ^b Az ismételt vizsgálatok átlaga ^c Egy ismétlés ^d Két ismétlés ^e Három ismétlés ^f Topikálisan kezelve 1 ml formált A83 543A-val

XHI. táblázat

Az A83 543 vegyület aktivitása

Kezelés	Mennyiség (ppm)	%-os gátlás3
topikálisb	1,00	0,00
5,00	20,00
10,00	20,00
50,00	100,00
100,00	100,00

^a Egy ismétlés; értékelés 3 nappal a kezelés után ^b Egy ml formált A83 543A-t öntöttünk Petri-csészében levő kifejlett rovarokra

XIV. táblázat

Az A83 543A vegyület hatása melegházi vizsgálat esetén különböző haszonnövénykárosító kártevők ellen

Haszonnövény	Kártevő	Mennyiség (ppm)	Gátlóhatás3
Kukorica	CRW	30	100
15	50
kukorica	CRW	7,5	10
3,75	0

Haszonnövény	Kártevő	Mennyiség (ppm)	Gátlóhatás3
tök	SAW	250	100
		125	100
62,5	100
31,25	55
15,63	40
7,8	20
3,9	20
1,9	0
tök	SM	250	70
125	40
62,5	20
31,25	0
tök	CA	100	0
50	0
kukorica	CLH	200	90
100	30
50	0
bokorbab	SAW	100	100
50	80
25	40
bokorbab	SM	100	100
50	80
25	30
12,5	10
6,25	0
tök	CA	100	80
50	40
25	0
kukorica	CRW	6	30
3	0

A XV. táblázatban összehasonlítjuk az A83 543Aval való kezelés hatásosságát és tartósságát a metomillal való kezelés hatásosságával és tartósságával szabadföldi vizsgálatok esetén déli sereghemyó ellen.

XV. táblázat

Az A83 543 hatóanyag hatásossága Spodoptera eridania ellen szabadföldi kísérletben

Kezelés	Meny nyiség (ppm)	Napok száma kezelés után3
1	5	7	14
A83543A	63	100	88	90	5
A83543A	125	100	88	95	90
A83543A	250	100	95	100	100
A83543A	500	100	100	100	100
metomil	63	100	20	15	0
metomil	125	100	35	40	20
metomil	250	100	85	45	40
metomil	500	100	90	85	60
nincs	0	0	0	0	0
nincs	0	0	0	0	0

^a Az eredmények pusztulási %-ban vannak megadva

HU 208 998 Β

A XVI. táblázatban megadjuk az IC₅₀-értékeket, azokat a halálos (lethalis) koncentrációkat, amelyeknél a vizsgált vegyület a vizsgált rovarok és atkák 50%-át elpusztítja. Ennek során összehasonlítjuk az A83 543A hatását az ismert metomil inszekticid hatóanyag hatásával.

XVI. táblázat

IC₅₀-értékek A83 543-ra^a metomillal összehasonlítva

Irtandó kártevő	IC50-érték (ppm)
A83 543	metomil
CRW	15	6
gabona-levéltetű	250	5,4
SM	150	71,4
SAW/Ievélkezelés	1,3	11,4
CBW/kontakt	0,6	14,5

^a gabonagyökérféreg esetén a mennyiség talajban tömegben van megadva, egyébként permetkoncentrációként

Az A83 543 komponensek hatásosaknak bizonyultak sárgalázat okozó szúnyogok lárvái ellen (Aedes aegypti) szabványos in vitro moszkitó lárvicid vizsgálatoknál. A XVII. és a XVIII. táblázatok bemutatják az ezeknél a vizsgálatoknál alkalmazott komponensek hatását.

XVII. táblázat

Az A83 543B és az A83 543C komponensek hatása in vitro vizsgálatban első lárvaállapotú szúnyoglárvák ellen

A83 543 komponens	Legkisebb gátlóhatás Koncentráció (mcg/ml)a
A	0,016,0,031b
B	0,016
C	0,031

^a legkisebb koncentráció, amely 100%-os gátlást mutat 24 óra után (mikrotiter lapokon) ^b vizsgálat két mennyiséggel

XVIII. táblázat

Az A83 543 komponensek hatása negyedik lárvaállapotú szúnyoglárvák ellen³

Komponens	Százalékos irtóhatás3
A	60, 70b
B	60
C	60
D	30
E	80
F	0
G	0

^a 24. óránál 0,312 ppm-mel való kezelés esetén ^b két vizsgálat eredményei

Szabadföldi vizsgálatok

Az A83 543A hatását szabadföldi kísérletek során is vizsgáltuk. Ezeknél a vizsgálatoknál az A83 543A hatást mutatott importált káposztaféreg és káposztasáska ellen csírázó brokkolin és szójabab-sáskák (75% és amerikai fehér seregbogár (25%) ilyen keverékével szemben szójababon.

Inszekticid készítmények

Az (1) általános képletű vegyületeket készítmények formájában alkalmazzuk. Ezek a készítmények az A83543 vegyület rovarok és atkák inaktiválásához szükséges mennyiségét és fitológiailag elfogadható közömbös vivőanyagot tartalmaznak. A hatóanyag, például az A83543 vegyület jelen lehet 1. egyedüli A83 543 komponensként, 2. két vagy több komponens elegyeként, 3. elkülönített A83 543 elegyként vagy 4. az A83 543 annak a fermentációs közegnek a szárított részével együtt, amely termelte, például nyers, szárított fermentációs táptalajként.

A készítmények tömény készítmények lehetnek, amelyek vizes diszperzió formájában kerülnek alkalmazásra, de lehetnek por- vagy granulált készítmények, amelyek további kezelés nélkül is már felhasználhatók.

A találmány szerinti készítményeket a mezőgazdasági kémiában szokásos eljárások és módszerek szerint állíthatjuk elő, de a készítmények újak az (1) általános képletű vegyületek legalább valamelyikének a jelenléte miatt.

Azok a diszperziók, amelyekben az (1) általános képletű vegyületek vagy a nyers, szárított anyag leggyakrabban vizes szuszpenziók vagy emulziók, ezeknek a vegyületeknek vagy a száraz anyagnak a tömény formáiból készülnek. Az ilyen vízoldható, vízben szuszpendálható vagy emulgeálható formák lehetnek szilárd anyagok, amelyek szokásosan nedvesíthető porokként ismertek, vagy folyadékok, amelyek emulgeálható koncentrátumokként vagy vizes emulzióként váltak ismertté.

A nedvesíthető porok, amelyek vízben diszpergálható granulátumokként formálhatók, a hatóanyag, valamely felületaktív anyag és közömbös vivőanyag bensőleg kevert elegyei. A hatóanyag koncentrációja ezekben a porokban szokásosan körülbelül 1%-tól, előnyösen 10%-tól körülbelül 90%-ig terjed tömeg%-ban számítva. A közömbös vivőanyag szokásosan az attapulgit-kréták, a montmorrilonit-kréták, a diatómaföldek vagy a tisztított szilikátok közül kerül ki.

A tényleges felületaktív anyagok a nedvesíthető por körülbelül 0,5-10 tömeg%-át teszik ki, amelyek szulfonált ligninek, kondenzált naftalin-szulfonátok, naftalin-szulfonátok, alkil-benzol-szulfonátok, alkil-szulfátok és nem-ionos felületaktív anyagok, így alkilfenolok etilénoxid adduktumai lehetnek.

Az (I) általános képletű vegyületek emulgeálható koncentrátuma valamely hatóanyag alkalmas koncentrációját foglalja magában, amely körülbelül 50-500 g/Iiter folyadék, és amely körülbelül 10-50 tömeg%-nak felel meg, valamely közömbös vivőanyagban oldva, amely vízzel elegyíthető oldószer vagy vízzel nem elegyedő szerves oldószer és emulgeáló szer elegye lehet.

Használható szerves oldószerek az aromás oldószerek, így a xilolok, és az ásványolajfrakciók, mégpedig az ásványolaj magas forráspontú naftalinos és ole16

HU 208 998 Β fines részei, így a nehéz aromás nafta. Más szerves oldószerek is használhatók, így a terpénes oldószerek, ide számítva a terpentin desztillációs származékait is, aromás ketonok, így a ciklohexanon, valamint a komplex alkoholok, így a 2-etoxi-etanol.

Alkalmas emulgeáló szerek az emulgeálható koncentrátumok készítéséhez a hagyományos nem-ionos felületaktív anyagok, így a fent említett vegyületek.

A vizes szuszpenziók az (1) általános képletű vegyületek, amelyek vízben oldhatatlanok, vizes vivőanyagokkal képezett diszperziói, amelyek körülbelül 5-50 tömeg% hatóanyagot tartalmaznak. A szuszpenziókat úgy állítjuk elő, hogy a hatóanyagot finomra megőröljük és beleviszszük élénk keverés közben vizet és felületaktív anyagot tartalmazó vivőanyagba. A felületaktív anyagot a fent említett típusú vegyületek közül választjuk ki. Közömbös alkotóanyagokat, így szervetlen sókat és szintetikus vagy természetes gumikat szintén adhatunk a szuszpenziókhoz a vizes vivőanyag sűrűségének és viszkozitásának a növelése érdekében. Gyakran az a legelőnyösebb, ha a hatóanyagot egyidejűleg őröljük és összekeverjük, így vizes elegyet készítünk, amelyet homogenizálunk valamely alkalmas készülékben, így homokmalomban, golyósmalomban vagy dugattyús homogenizátorban.

Az (1) képletű hatóanyagokat granulált készítményekként is alkalmazhatjuk, amelyeket különösen talajkezelésre használunk. A granulált készítmények szokásosan körülbelül 0,5-10 tömeg% hatóanyagot tartalmaznak közömbös vivőanyagban diszpergálva, amely egészen vagy nagy részben kréta vagy hasonló kevésbé költséges anyag.

Ilyen készítményeket úgy állítunk elő, hogy a hatóanyagot feloldjuk alkalmas oldószerben és az oldatot rávisszük valamilyen szemcsés vivőanyagra, amelyet a megfelelő szemcseméretre előformáltunk. Ez a szemcseméret körülbelül 0,5-3 mm nagyságú. Ilyen készítményeket úgy is előállíthatunk, hogy a vivőanyagból és a hatóanyagból pépet vagy pasztát készítünk, ezt felaprítjuk és megszárítjuk, így a kívánt szemcseméretű terméket kapjuk.

Az (1) általános képletű vegyületeket hatóanyagként tartalmazó porokat úgy készítjük, hogy egyszerűen alaposan összekeverjük a porított formában lévő hatóanyagot alkalmas por alakú mezőgazdasági vivőanyaggal, így kaolinkrétával, őrölt vulkanikus kőzettel és hasonlókkal. A porok rendszerint körülbelül ΙΙΟ tömeg% hatóanyagot tartalmaznak.

Ugyancsak gyakorlati jelentőségű, ha az kívánatos, az (1) általános képletű vegyületek oldatok alakjában való használata. Ilyen oldatokat megfelelő szerves oldószerekkel, szokásosan alkalmas petróleumolajjal, így spray-olajjal készítünk, amelyek széles körben használatosak a mezőgazdasági kémiában.

Az inszekticid és miticid készítményeket a hatóanyagnak valamely folyékony vivőanyaggal készített diszperziója formájában alkalmazzuk. Az alkalmazásra kerülő mennyiséget hagyományosan a hatóanyagnak valamely vivőanyagban lévő koncentrációjában adjuk meg. A legnagyobb mértékben alkalmazott vivőanyag a víz.

Az (1) általános képletű hatóanyagokat aeroszolkészítmény formájában is alkalmazhatjuk. Az ilyen készítményeket úgy állítjuk elő, hogy a hatóanyagot feloldjuk vagy diszpergáljuk valamely közömbös vivőanyagban, amely nyomásképző hajtóanyagkeverék. Az aeroszol készítményt egy tartályba visszük, amelyből az elegy egy porlasztó szelepen keresztül kerül ki. A hajtóanyagelegyek vagy alacsony fonáspontú halogénezett szénhidrogének, amelyek szerves oldószerekkel vannak keverve, vagy vizes szuszpenziók, amelyeket közömbös gázokkal vagy gáz alakú szénhidrogénekkel helyezünk nyomás alá.

A rovarok és atkák telephelyére rávitt tényleges hatóanyagmennyiség nem kritikus és a szakterületen járatos szakember könnyen meghatározhatja a példák alapján. Általában 10 ppm-től 5000 ppm-ig terjedő hatóanyag-mennyiséggel jó irtóhatást érhetünk el. A vegyületek legtöbbjénél a 100-1000 ppm koncentrációtartomány kielégítő és jó irtási hányad érhető el. Szabadföldi haszonnövényeknél, így szójababnál és gyapotnál a megfelelő alkalmazási hányad az (1) képletű hatóanyagokra körülbelül 0,01-1 kg/ha, elsősorban 60-6001/ha spray formában.

Az a hely, amelyre valamely hatóanyagot rávihetünk készítmény alakjában, minden olyan hely lehet, amelyen a rovarok vagy az atkák előfordulnak, illetve tenyésznek, így például a haszonnövények, a gyümölcsök és a mogyorócserjék, a szőlő és a dísznövények.

Az atkák petéi nagy mértékben ellenállnak az irtási műveletnek, ezért ajánlatos és szükséges a kezelés megismétlése az újólag kikelt lárvák elpusztítása végett, ahogy más ismert akaricidek esetében.

Ektoparazita hatás

Az A83 543 vegyületek hatásosak számos - a kétszárnyúak (Diptera) - rendjébe tartozó rovar ellen is.

A XIX-XXI. táblázatokban összefoglaljuk az A83 543A és A83543D komponensekkel kapott eredményeket.

XIX. táblázat

Az A83 543A in vitro hatása kék döglégy lárvák ellen

Adagszint (ppm)	Hatás1
100	100
50	100
25	100
10	100
5	100
2	100
1	95
0,5	60
0,25	25

¹ hatás = %-os pusztulás

XX. táblázat

Az A83 543A in vitro hatása kifejlett istállólégy ellen

Adagszint (ppm)	Hatás 24 óra után1	Hatás 48 óra után1
100	100	100
50	100	100

HU 208 998 Β

Adagszint (ppm)	Hatás 24 óra után1	Hatás 48 óra után1
25	100	100
10	100	90
5	80	100
2	70	90
1	10	60
0,5	0	10

¹ hatás = %-os pusztulás

XXI. táblázat

Az A83 543A és A83 543D in vitro hatása^1,2

ppm	A83 543A	A83 543D
ASF	LBF	ASF	LBF
24 óra	48 óra	24 óra	48 óra	24 óra	48 óra	24 óra	48 óra
10	80	100	100	100	50	100	100	100
5	50	100	100	100	20	90	90	100
2,5	30	100	100	100	20	100	90	100
1,25	20	100	100	100	10	90	80	90
0,625	0	70	60	90	0	60	50	75
0,312	0	50	25	50	0	0	25	25

¹ %-os rovarpusztulás 24-48 óra után, miután in vitro kémiailag adagoltunk szérum-mintákat ² ASF = kifejlett istállólégy

LBF = kék döglégy lárvák ppm = parts per millión

In vitro vizsgálatoknál az A83543 vegyületek szisztémiás inszekticid hatást mutattak tengerimalacoknál és juhoknál lárvaállapotú döglégy és kifejlett istállólégy ellen észlelhető toxicitás nélkül. Az A83 543A és az A83 543D komponenseket vizsgáltuk laboratóriumban és kis állatokban annak érdekében, hogy meghatározzuk az aktivitás mértékét. A következő vizsgálatok bemutató jellegűek.

Tengerimalac-szisztémiás vizsgálat

Kifejlett tengerimalacokat használtunk ennél a vizsgálati rendszernél. A vizsgálandó vegyületeket feloldottuk vizes poli(vinil-pirrolidon)-ban vagy polietilénglikol 200 vegyületben és megfelelő mennyiségű oldatot adtunk be az állatoknak orálisan és intraperitoneálisan. A vegyületek különböző adagjait használtuk, ahogy a táblázatokban megadjuk.

Vért vettünk a tengerimalacokból 30 perckor (az ettől eltérő időpontot jelöltük) és a vérmintákat centrifugáltuk. Foggézcsíkokat vérszérummal telítettünk és utána Petri-csészékben kifejlett istállólegyek számára, kémcsövekben pedig döglégy lárvák számára hozzáférhetővé tettük. A rovarokat megvizsgáltuk 24 és 48 óra múlva és az elpusztult kártevőket megszámoltuk. A vizsgálatok eredményeit azoknak a rovaroknak a százalékaként adjuk meg, amelyek elpusztultak.

Juh szisztémiás vizsgálat

A vizsgálatokat juhokkal végeztük a tengerimalacokra leirt módszer szerint. A vizsgálandó vegyületet intraperitoneálisan vagy intravénás injekcióként vagy intraruminálisan (bendőbe). A vérmintákat a vizsgálatok 24. órájában vettük le.

A tengerimalac és a juh szisztémiás vizsgálatok eredményeit, amelyhez A83 543A-t és A83 543D-t használtunk, a XXII-XXV. táblázatokban foglaljuk össze.

Az A83 543A nem mutatott féregelleni hatást juhoknál, ha intraperitoneálisan vagy intreruminálisan egyetlen 50 mg/kg testsúly adaggal kezeltük a juhokat, vagy egereknél, amelyeket kísérletileg megfertőztünk intestinalis (bélben tenyésző) Nematospirides dubius nematódával, ha orálisan adtunk be nekik egyetlen adagot gyomorszondán át 500 mg/kg mennyiségben.

XXII. táblázat

Az A83 543A vegyület in vivő inszekticid hatása³

Tengerimalac szisztémiás hatás	Juh szisztémiás hatás
mg/kg	LBF	ASF	Toxi- citás	mg/kg	LBF	ASF	Toxi- citás
10 (IP)	0	0	N	10 (IP)	0	0	N
20 (IP)	0	0	N	10 (IR) ,	0	0	N
30 (IP)	90	50	N	30 (IP)	80	0	N
50 (IP)	100	100	N	30 (IR)	100	30	N
50 (OR)	100	60+	N	50 (IP)	20	30	N
				50 (IR)	100	70	N
				2x25 (IR)	100	90	N
				1,0 (IV)	25	10	N

⁺ 5 órás vérminta; nem 30 perces mintavétel ^a a hatást %-os pusztulásként mértük ASF - kifejlett istállólégy LBF - döglégy lárvák

Toxicitás - mérgezés a gazdaállatra nézve N- nincs

IP- intraperitoneális

IR - intraruminális

IV - intravénás

OR- orális

XXIII. táblázat

Az A83 543Aés az A83 543D vegyületek szisztémiás inszekticid hatása tengerimalacoknál⁸

Adag (mg/kg)	Beadás módja	Vérvétel ideje	A83 543A%-os hatása	A83543D%-os hatása
LBF	ASF	LBF	ASF
10	IP	30 perc	0	0	0	0
5 óra	0	0	0	0
24 óra	0	0	0	10
20	IP	30 perc	0	0
5 óra	0	0
24 óra	0	0
30	IP	30 perc	90	50	0	0
5 óra	50	0	0	0
24 óra	30	0	0	0
50	IP	30 perc	100	100	75	0
5 óra	95	40	0	0
24 óra	25	30	25	0
50	orális	5 óra	100	60
24 óra	0	0

^aLBF- döglégy lárvák ASF - kifejlett istállólégy IP - intraperitoneális beadás

HU 208 998 Β

XXIV. táblázat

Az A83 543A vegyület inszekticid hatásának a vizsgálata Haemonchus contortus-szal kezelt juhok vérében 24 órán át in vitro kitéve a rovarokat juhokból vett szérumminták hatásának⁴

Kezelésb	Kezdeti tömeg (kg)	Százalékos inszekticid pusztulás0
0 nap	35 perc	5 óra	1 nap	2 nap	3 nap	4 nap	5 nap
L	A	L	A	L	A	L	A	L	A	L	A	L	A	L	A
50x1 (IP)	38,6	0	0	0	0	10	0	10	0	20	10	20	0	10	10	10	0
50x1 (IR)	31,8	0	0	0	10	40	10	90	0	90	20	80	0	40	0	20	0
25x2 (IR)	34,1	0	0	0	20	25	10	100	10	90	20	90	0	60	0	50	0
lxl (IV)	25,9	0	0	25	10	10	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
vivő- anyag kontroll	44,5	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
kezeletlen	30,9	0	0	0	0	0	0	0	0	0	10	0	0	0	0	0	0

^aL = döglégy lárva

A = kifejlett istállólégy

IP= intraperitoneális

IR= intraruminális

IV = intravénás ^b a beadott adagok mennyisége (mg/kg) szorozva a számmal ^c adagolás utáni idő, amelynél vért vettünk

XXV. táblázat

Az A83 543A vegyület inszekticid hatásának a vizsgálata Haemonchus contortus-szal kezelt juhok vérében 48 órán át in vitro kitéve a rovarokat juhokból vett szérumminták hatásának³

Kezelés0	Kezdeti tömeg (kg)	Százalékos inszekticid pusztulás0
θ nap	35 perc	5 óra	1 nap	2 nap	3 nap	4 nap	5 nap
L	A	L	A	L	A	L	A	L	A	L	A	L	A	L	A
50x1 (IP)	38,6	0	20	10	0	10	10	10	0	20	30	20	10	20	20	25	0
50x1 (IR)	31,8	0	0	0	10	75	30	100	60	100	70	100	20	40	20	25	0
25x2 (IR)	34,1	0	10	0	30	50	10	100	90	100	90	100	70	90	30	75	30
lxl (IV)	25,9	0	0	25	10	10	20	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
vivő- anyag kontroll	44,5	0	10	0	0	0	20	0	10	0	0	0	20	0	0	0	0
kezeletlen	30,9	0	40	0	0	0	0	0	0	0	10	0	0	0	0	0	0

^aL = döglégy lárva A«= kifejlett istállólégy IP = intraperitoneális IR= intraruminális

IV = intravénás ^b a beadott adagok mennyisége (mg/kg) szorozva a számmal ^c adagolás utáni idő, amelynél a vért vettük

A Haemonchus contortus juh bélnematóda elleni in vitro vizsgálatai azt mutatják, hogy az A83 543A vegyület a férgek 30%-át pusztították el 100 ppm koncentráció esetén.

Ektoparazitaellenes módszerek

A találmány magában foglal olyan módszert is, amely olyan ektoparazita rovarok szaporodásának a gátlását teszi lehetővé, amelyek a gazdaállat vérét szívják. A módszer abban áll, hogy a gazdaállatnak a találmány szerinti készítmények hatásos mennyiségét adjuk be, amelyek hatóanyagként A83 543 vegyületet tartalmaznak. A rovar ektoparaziták mind a rovar-, mind az atkakártevőket foglalják magukban. A beadás az állatoknak dermálisan, orálisan vagy parenterálisan végezhető.

A parazita rovarok és atkák körébe olyan fajták tartoznak, amelyek vérszívók és húsevők, valamint olyan paraziták, amelyek az életciklusok egész tarta19

HU 208 998 Β mában vagy az életciklusuknak csak egy része alatt, így csak lárvaállapotban vagy csak kifejlett állapotban

károsítják az állatokat, néhány fontosabb fajtát:	A következőkben felsorolunk
bögölylégy	Tabanus spp.
istállólégy	Stomoxys calcitrans
tripsz	Simulium spp.
lóvérszívó tetű	Haematopinus asini
rühatka	Sarcoptes scabiei
lórühatka	Psoroptes equi
marhabögöly	Haematobia irritans
marhavérszívó tetű	Bovicola bovis
rövidorrú marhatetű	Haematopinus eurystemus
hosszúorrú marhatetű	Linognathus vituli
csecselégy	Glossina spp.
marhatüsző atka	Demodex bovis
marhakullancs	Boophilus micropolus és Boophilus decoloratus
mexikóparti kullancs	Amblyomma maculatum
texasi kullancs	Amblyomma americanum
fülkullancs	Otobius megnini
szikláshegyi kullancs	Dermacentor andersoni
csavaros nyűlégy	Cochliomyia hominivorax
gyilkos poloska	Reduvius spp.
szúnyog	Culisata inomata
barna fülkullancs	Rhipicephalus appendiculatus
afrikai vöröskullancs	Rhipicephalus evertsi
tetűkullancs	Amblyomma sp.
soklábú kullancs	Hyalomma sp.
disznótetű	Haematopinus suis
homoki bolha	Tunga penetrans
ruhatetű	Haematopinus ovillus
lábas tetű	Linognathus pedalis
birkakullancs	Melophagus ovinus
birkarühatka	Psoroptes ovis
aranyzöld döglégy	Phaenicia sericata
kék döglégy másodlagos csavaros	Phormia regina
nyű	Cochliomyia macellaria
juh döglégy	Phaenicia cuprina
ágypoloska	Cimex lectularius
déli bolyhos bolha	Echidnophaga gallinacea
szárnyas kullancs	Argas persicus
bolyhos atka	Dermanyssus gallinae
pikkelyeslábú atka	Knemidokoptes mutáns
kopasz atka	Knemidokoptes gallinae
kutyatüsző atka	Demodex canis
kutyabolha amerikai kutyakul-	Ctenocephalis canis
lancs	Dermacenter variábilis
barna kutyakullancs	Rhipicephalus sanguineus

A találmány szerint előállított készítményt felhasználhatjuk haszonállatok és szobaállatok védelmére ektoparaziták ellen. így például a találmány szerinti eljárással előállított készítményeket előnyösen adhatjuk be lovaknak, szarvasmarháknak, juhoknak, sertéseknek, kecskéknek, kutyáknak, macskáknak és hasonló állatoknak, valamint egzotikus állatoknak, így tevéknek, lámáknak, szarvasoknak és más fajtáknak, amelyeket általában vadállatoknak nevezünk. A találmány szerinti készítményeket előnyösen adhatjuk be baromfiaknak és más madaraknak, így pulykáknak, csirkéknek, kacsáknak és hasonlóknak. A készítményeket és a módszert előnyösen haszonállatoknál, különösen szarvasmarháknál és juhoknál alkalmazzuk.

A mennyiség, a beadás és kezelés gyakorisága, valamint a tényleges alkalmazási mód az élősködők fajtájától, a megtámadottság mértékétől és más tényezőktől függően széles tartományban változhat. Az alkalmazást a gazdaállat egész életében szabályos időközökben vagy csak a parazita által történő megtámadottság csúcsidejében végezzük. Általában az ektoparazita irtását olyan folyékony készítmények topikális alkalmazása útján végezzük, amelyek körülbelül 0,0000595,0%, előnyösen legfeljebb 5% és főként legfeljebb 1% hatóanyagot tartalmaznak. Hatásos parazitairtást érünk el, ha körülbelül 5-100 mg/kg hatóanyagot adunk be az állatoknak.

A találmány szerinti készítményeket hagyományos állatgyógyászati módszerek szerint alkalmazzuk. A hatóanyagokat szokásosan először ektoparazita kompozíciókként formáljuk, amelyek a hatóanyag mellett fiziológiailag elfogadható vivőanyagokat tartalmaznak. A folyékony kompozíciókat egyszerűen rápermetezzük azokra az állatokra, amelyeken az ektoparazitákat irtani akarjuk. Az állatokat kezelhetjük megfelelő eszközökkel, így bedörzsölő gépekkel is, amelyek a találmány szerinti készítményeket szövetbe ágyazva tartalmazzák, például, amelyek járásnál vagy más módon ismételten érintkeznek az állatokkal. Fürösztőmedencék szintén használhatók a hatóanyagoknak az állatokra való juttatására.

Az (1) általános képletű vegyületek szisztémiás ektoparazita hatással rendelkeznek. Ezek a vegyületek képesek bejutni a gazdaállat szöveteibe a vegyületek valamelyikével való érintkezés után. Azok az élősködő rovarok, amelyek a gazdaállat vérét vagy más élő szövetét fogyasztják ily módon elpusztulnak. A találmány szerinti készítményeket dermálisan, orálisan vagy perkután úton adhatjuk be.

A találmány szerinti ektoparazita készítmények az A83 543 vegyületet fiziológiailag elfogadható közömbös vivőanyaggal együtt tartalmazzák. Ezeket a készítményeket a szakterületen ismert módszerekkel állíthatjuk elő, így például a vegyületet feloldjuk valamely fiziológiailag elfogadható segédanyagban vagy hígítószerben. Orális beadásra a találmány szerinti készítményeket hozzákeverjük az állatok táplálékához vagy az ivóvizéhez, de beadhatjuk a hatóanyagot orálisan is tabletták, kapszulák, bóluszok vagy behelyezett készítmények alakjában. A perkután bevitelt kényelmesen végezhetjük szubkután, intraperitoneális és valamely oldat befecskendezése útján.

A hatóanyagokat formálhatjuk orális bevitelre a szokásos formákban, így folyékony orvosság, tabletták vagy kapszulák alakjában. Az ilyen készítmények előállításához természetesen orábsan elfogadható közömbös vivőanyagokat kell használnunk. A hatóanyagokat formálhatjuk injektálható oldatok vagy szuszpenziók alakjában is, szubkután, dermális, intraruminális, intra20

HU 208 998 Β peritoneális, intramuszkuláris vagy intravénás beadásra. Más alkalmazásokra a vegyületeket kényelmesen formálhatjuk valamely szabványos állati táp alkotójaként is. Ilyen esetben rendszerint a hatóanyagot először előkeverék (premix) formában formáljuk, amelyben a hatóanyag folyékony vagy szilárd vivőanyagban van diszpergálva. Az előkeverék körülbelül 2-250 g hatóanyagot tartalmazhat 0,45 kg összmennyiségnyi készítményben. Az előkeveréket ezután a végső tápba keverjük be hagyományos keveréssel.

Mivel az ektoparaziták által történő támadás a gazdaállatoknak úgyszólván az egész életükben vagy az életük jelentős részében megtörténhet, ezért a hatóanyagokat olyan készítmények formájában adjuk be az állatoknak, amelyek hosszabb idő alatt, elnyújtva adják le, illetve bocsátják ki a hatóanyagot. Hagyományosan olyan mátrixot tartalmaznak ezek a készítmények, amelyek fizikailag gátolják az oldódást, és ez a mátrix félszilárd viaszos anyag, például növényi viasz vagy nagy molekulatömegű polietilén-glikol. Egy jó beadási mód a hatóanyagok számára, ha azokat nyújtott hatású bóluszban adjuk be az állatoknak. Ilyen készítményformát írnak le a 4251506 számú USA-beli, valamint a 2059767 számú brit szabadalmi leírásokban. Egy ilyen bólusz számára a hatóanyagot valamely polimer mátrixba kapszulázzuk be, ahogy az a 4273920 számú USA-beli szabadalmi leírásban le van írva. A hatóanyag elnyújtott leadását vagy kibocsátását úgy is elérhetjük, hogy valamely szilikontartalmú gumiból álló anyagba ágyazzuk be azt, amelyet behelyezünk az állat emésztőcsatornájába.

Annak érdekében, hogy még jobban bemutassuk a találmány szerinti műveletet, következő példákban részletesen ismertetjük azt. A leírásban előforduló anyagrészek és százalékok tömegszázalékokat, illetve tömegrészeket jelentenek.

7. példa

A83 543 HPLC próba módszer

A következő analitikai HPLC módszert használjuk az A83543 vegyület termelésére szolgáló fermentáció követésére.

Az egész táptalaj egy mintáját centrifugáljuk, dekantáljuk és a felülúszót elkülönítjük. Ezután elegendő metanolt adunk a biomasszához azért, hogy a mintát az eredeti térfogatára állítsuk vissza, utána keverjük és a keveréket legalább tizenöt percig állni hagyjuk. Ezt követően a felülúszót centrifugáljuk és 0,45 pm-es szűrőn szűrjük.

Más változatban az egész táptalajt acetonitrillel (1:4 tf. arányú táptalaj/oldószer-elegy) vagy acetonnal extrahálhatjuk.

HPLC rendszer

Hordozó oszlop: 8x100 mm-es oszlop, C₁₈ gömb alakú pm-es szilikagél (Nova C18, Waters)

Mozgó fázis: CH₃CN/MeOH/H₂O (45/45/10), amely

0,05 t% ammónium-acetátot tartalmaz.

Áramlási sebesség: 4 ml/perc Kimutatás: UV 250 nm-nél Tartózkodási idő: A83 543A 3,6-3,7 perc

A83 543D 4,4-4,5 perc

2. példa

A83543 előállítása A83 543.1 tenyészettel

A) Rázólombikos fermentáció

Saccharopolyspora spinosaNRRL 18 395 tenyészetet liofilizált pelletként vagy szuszpenzióként, amelyet folyékony nitrogénben tartottunk, használunk A) vagy B) kompozíciójú vegetatív közeg beoltására, amelyek közül a B) közeg előnyben részesül nagybani termelés céljára.

A) tápközeg

Alkotóanyag	Mennyiség (%)
triptikáz szójatáptalaj*	3,0
élesztőkivonat	0,3
MgSO4x7 H2O	0,2
glukóz	0,5
maltóz	0,4
ionmentesített víz	szükséges mennyiség 1,0 literre

pH nem beállított ⁺ Baltimore Biological Laboratories

B) tápközeg

Alkotóanyag	Mennyiség (%)
enzimmel hidrolizált kazein*	3,0
élesztőkivonat	0,3
MgSO4x7 H2O	0,2
glukóz	1,0
ionmentesített víz	szükséges mennyiség 1,0 literre

pH 6,2-re beállítva NaOH-val ⁺ NZ Amine A, Sheffield Products

Ferde- és lemeztenyészetet készíthetünk oly módon, hogy 2,5 t% agart adunk az A vagy B vegetatív oltóközeghez. A beoltott ferdetenyészetet 30 °C-on inkubáljuk körülbelül 10-14 napig. Az érett ferdetenyészetet megkaparjuk valamely steril szerszámmal avégett, hogy kiszabadítsuk a spórákat és szétoszlassuk a micellaszövődményt. Körülbelül egynegyedét használjuk fel a szétoszlatott spóráknak és a táptalajnak arra, hogy az első fázisú oltóközeg 50 ml-nyi mennyiségét beoltsuk. Más változatban az első fázisú közeget beolthatjuk egy cseppfolyós nitrogén fiolából.

Abban az esetben, ha a tenyészetet cseppfolyós nitrogénben tartjuk, akkor a fiolákat úgy készítjük, hogy egyenlő mennyiségben használunk vegetatív tenyészetet (48-72 órás inkubálás 30 °C-on) és szuszpendáló közeget. A szuszpendáló közeg 100 g laktózt, 200 ml glicerint és az egy literre való kiegészítéshez szükséges mennyiségű ionmentesített vizet tartalmaz.

HU 208 998 Β

Egy cseppfolyós nitrogén fiolát használunk arra, hogy beoltsunk 100 ml vegetatív közeget 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokban (vagy 250 ml-es lombikokban 50 ml közeget alkalmazunk). A tenyészeteket 30 °C-on inkubáljuk 48 óra hosszat olyan rázógépen, amely 5,08 cm-es körön kering 250 ford/perc sebességgel.

Ezután 5 tf/tf% inokulumnak megfelelő inkubált tenyészetet használunk 100 ml termelőközeg beoltására, amelynek az összetétele a következő:

I. termelőközeg

Alkotóanyagok	Mennyiség (%)
glukóz	4,0
növényi protein, részben enzimesen hidrolizálva+	1,5-3
gyapotmagliszt++	L0
CaCO3 (kémiai vagy technikai tisztaságú)	0,3
szójababolaj	LO
csapvíz	szükséges mennyiség 1,0 literhez

(Elősterilizálás, pH-beállítás 7,0-re NaOH-val) ⁺ Sheftone H, Sheffield Products ++ Proflo, Traders Protein

A beoltott termelőközeget inkubáljuk 500 ml Erlenmeyer-lombikokban 28-30 °C-on 6-88 napig olyan rázógépen, amely 5,08 cm-es körön kering 250 ford/perc sebességgel.

B) Kevert bioreaktoros fermentálás

Annak érdekében, hogy nagy mennyiségű inokulumot állítsunk elő, 10 ml első fázisú közeget, amelyet az

A) pontban leírt módon készítettünk, használunk 400 ml második fázisú vegetatív közeg beoltására, amelynek az összetétele megegyezik az első fázisú vegetatív közeg összetételével. Ezt a második fázisú közeget egy 2 literes, széles szájú Erlenmeyer-lombikban inkubáljuk körülbelül 48 óra hosszat 30 °C-on olyan rázógépen, amely 5,08 cm-es körön kering 250 ford/perc sebességgel.

Az így készített 2 liter második fázisú vegetatív közeget használjuk fel 80-115 liter steril termelőközeg beoltására, amelyet az A) pontban leírt módon állítottunk elő. További szójababolajat adunk szükség esetén a közeghez a habzás csökkentésére.

A beoltott termelőközeget fermentálni hagyjuk egy 165 literes keverővei ellátott bioreaktorban 5-8 napig 28 °C-on keverés közben. A levegőáramot és a keverési sebességet a kevert reaktorban számítógéppel szabályozzuk annak érdekében, hogy az oldott oxigénszintet 50%-os vagy e feletti levegőtelítettségen tartsuk.

3. példa

Az A83 543A, B, C és D izolálása

A 2. példa szerint készített mintegy 225 literes fermentációs táptalajt szűrjük 1% Hyflo szűrési segédanyag felhasználása mellett és az elkülönített biomasszát körülbelül 50 liter vízzel mossuk. A biomaszszát ezután körülbelül 100 liter metanollal együtt keverjük mintegy 1 óra hosszat és utána szűrjük.

A metanolos szűrletet körülbelül 1 literre betöményítjük. A koncentrátumot háromszor extraháljuk 11 liter dietil-éterrel. Az egyesített éteres kivonatokat körülbelül 200 ml térfogatra betöményítjük.

A koncentrátum egy részét (8 ml-t) szilikagél-oszlopon kromatografáljuk (RP-8 Lobar, B méret, Ε, M. Science).

Ezt a műveletet megismételjük összesen 12 meneten (cikluson) át. Ezt a szerkezeti és kivitelezési módszert fenntartjuk a preparatív kromatográfia kivitelezésére egy úgynevezett „Autoprep” rendszerben, amelyet az alábbiakban ismertetünk.

Egy teljes „Autoprep” HPLC tartalmaz három Rainin Rabbit HPX szivattyút, egy présmoduluszt, egy Gilson Model 20 IB HPLC frakciókollektort, egy ISCO-V⁴ abszorbancia detektort és egy Apple Macintosh Plus számítógépet. A teljes rendszert a Dynamax HPLC Method Manager Manual, Rainin Instrument Company, Inc. kézikönyvében leírt módon lehet elrendezni. Az „Autoprep” HPLC rendszer előnye többek között az, hogy automatikus és így lehetővé teszi a preparatív szétválasztást lényegében azonos körülmények között lényegében azonos eredményekkel. Összegyűjti és egyesíti a megfelelő frakciókat a többszörös menetekből és növeli a kromatográfiás teljesítményt nagy oszlop alkalmazása nélkül.

Két oldószerelegyet (A)-t és (B)-t használunk izotaktikus módszerben 8,0 ml/perc áramlási sebesség mellett.

Oldószerrendszerek

Oldószer	Mennyiség (ml)
A	B
ch3oh	95	100
ch3cn	95	100
h20	10	-

Az alkalmazott izotaktikus elegy 60% B oldószert tartalmaz.

A lefutási idő mindegyik ciklusra 28,0 perc. Az egyes menetek első 16 percének az eluátumait elöntjük. A következő eluátumokat 6 időfrakcióban összegyűjtjük, 2 perc minden frakcióra, amely 16-16 ml.

A 12 ciklusból automatikusan összegyűjtött frakciók 6 végső frakciót eredményeznek (kromatográfiás frakciók).

Az aktív A83 543 vegyületek jelenlétét úgy határozzuk meg, hogy megelemzünk minden egyes végső frakciót szúnyoglárvák elleni hatásuk alapján és analitikai HPLC-vel is.

Az aktív frakciókat ezután aktivitásuk és HPLC profiljuk szerint egyesítjük, majd tovább tisztítjuk, amelyhez ugyanazt az „Autoprep” HPLC-t és oldó22

HU 208 998 Β szer-rendszert használjuk, de jobb rezolválással, 21,4mmx25 cm méretű preparatív oszlopon (Rainin Dynamax), 8 pm-es C-l8 fordított fázisú szilikagéllel töltve és így az A83543 vegyület A, B és C, valamint D komponenseit kapjuk. Az A és D alkotók CH3OH/H₂O-elegyből kikristályosodnak.

Az A83 543C komponens FD-MS értékét az 5. ábra, míg az A83543B FAB-MS értékét a 9. ábra diagramjai szemléltetik.

4. példa

Az A83 543A és D tisztítása liter fermentációs táptalajt készítünk a 2. példában leírt A) pont szerint azzal az eltéréssel, hogy 1. 200 ml termelőközeget használunk 1 literes edényekben; 2. szójababolajat elhagyjuk a termelőközegből; és

3. az inkubálást 30 °C-on végezzük 4-6 napig. A szűrlet, amely 4 pg A83 543A komponenst tartalmaz miként, nem tartalmaz kimutatható mennyiségű A83 543B, C vagy D komponenst és így elönthető.

A biomasszát vízzel mossuk és egy óra hosszat extraháljuk metanollal. A 7 liter kivonat 72 pg A83 543A-t és 7 pg A83 543D-t tartalmaz ml-enként.

A metanolos kivonatot 5 literre beszűkítjük és hozzáadjuk HP-20 gyantához (150 ml, Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Japán) 2 liter vízben. Ezt az elegyet 1 óra hosszat keverjük.

A HP-20 gyantakeveréket ezután egy üvegoszlopba visszük. A kezdetben lejövő folyadék és az eluátum, amely 1:1 tf.arányú metanol/víz eluálószert tartalmazott és mennyisége 1 liter volt, nem volt aktív. A második eluátum, amelyet 7:3 tf.arányú metanol/víz-elegyével kapunk és mennyisége 1 liter, nyomokban tartalmaz A83543A-t. A következő eluátum, amelyhez 1 liter metanolt használunk, tartalmazza az aktív A83 543A és A83 543D komponenseket.

A metanolos eluátumot betöményítjük és 2 hasonló frakcióval egyesítjük más feldolgozásokból, majd az egészet szárazra pároljuk. A maradékot feloldjuk 75 ml 4:1 tf.arányú metanol/THF-elegyben és 10 térfogat acetonitril hozzáadásával kicsapjuk az anyagot. Az elegyet szűrjük és a szűrletet szárazra pároljuk.

A maradékot feloldjuk 25 ml metanolban és rávisszük 5,5x90 cm méretű LH-20 Sephadex oszlopra (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., USA), amelyet metanolban készítettünk, a terméket összegyűjtjük és 125 darab 25 ml-es frakciót megelemzünk az 1. példában leírt HPLC módszer szerint.

A kívánt vegyületeket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, egyesítjük és betöményítjük. A maradékot feloldjuk 10 ml metanolban és rávisszük egy

41,1 mmx25 cm méretű preparatív oszlopra, amelyet 8 pm méretű C-l 8 fordított fázisú szilikagéllel töltünk meg (Rainin Dynamax).

Az oszlopot 37,5:37,5:25 tf.arányú metanol/acetonitril/víz-eleggyel kondicionáljuk. Minta alkalmazása után az oszlopot előhívjuk, amelyhez egy 180 perces lineáris gradienst használunk a következő oldószerekből:

Oldószerrendszer

Oldószer	Mennyiség (ml)
A	B
CH3OH	37,5	45
ch3cn	37,5	45
h2o	25	10

A gradienst 100% A-tól 100% B-ig járatjuk és 25 ml frakciókat gyűjtünk össze.

Az A83543A-t tartalmazó frakciókat egyesítjük és szárazra pároljuk, a maradékot 5 ml terc-BuOH-ban oldjuk és liofilizáljuk. Ily módon 778 mg tiszta A83 543A-t kapunk.

Az A83543A IR-spektrumát CHCl₃-ban az 1. ábra mutatja be. Az A83 543A FD-MS spektrumát a 4. ábra szemlélteti és az A83 543A FAB-MS spektrumát a 8. ábrán láthatjuk [FAB-diszpergáló anyag: ditiotreit/ditioeritrit 5:1 tf.arányú elegy; és az A83 543A EI-NS spektrumát a 10. ábra mutatja.

Az A83543D komponenst tartalmazó frakciókat egyesítjük 6 hasonló elválasztásból származó D-tartalmú frakciókkal, ezeket betöményítjük és a maradékot az előzőekben leírt módon kromatografáljuk ugyanazon oszlop, de különböző oldószerek felhasználása mellett. Az oszlopot 40:40:20 tf.arányú metanol/acetonitril/víz-eleggyel kondicionáljuk. Az oldószerrendszerek, amelyeket az oszlop előhívásához használunk a 180 perces lineáris gradiens műveletben, a következők:

Oldószerrendszer

Oldószer	Mennyiség (%)
A	B
CH3OH	40	95
ch3cn	40	95
h2o	20	10

Az A83 543D-t tartalmazó frakciókat egyesítjük és betöményítjük. A maradékot 5 ml terc-BuOH-ban oldjuk és liofilizáljuk, így 212 mg A83 543D-t kapunk.

Az A83 543D IR-spektrumát CHCl₃-ban a 2. ábra szemlélteti. Az A83 543D FD-MS spektrumát a 6. ábra mutatja.

5. példa

Az A83 543E, F, G, H és J komponensek, valamint a pszeudoaglikon A izolálása 8 liter 2. példában leírt módon előállított fermentációs táptalajt a 4. példában megadott módon kezelünk. Az LH-20 Sephadex oszlopról lejövő frakciókat, amelyek a kívánt vegyületeket tartalmazzák, egyesítjük a hasonló fermentációkból származó megfelelő frakciókkal. Mivel az E, F, G, H, J és a pszeudoaglikon A komponensek nagyon kis mennyiségek23

HU 208 998 Β ben vannak jelen, nagy számú fermentáció szükséges ahhoz, hogy elegendő mennyiségeket kapjunk a további tisztításhoz.

Az ily módon előállított kis mennyiségű, körülbelül

1,6 g szilárd anyagot tartalmazó reakcióterméket egy HPLC oszlopra visszük (Rainin Dynamax), amelyet 8 mikrométer méretű C-18 fordított fázisú szilikagéllel (ODS) töltünk meg. Az oszlopok 75:75:50 tf.arányú CH3OH/CH₃CN/H₂O eleggyel kondicionáljuk és a gradienst 100%-os oldószertől (A) 50%-os oldószerig (B) vezetjük a következő oldószerrendszerekkel:

Oldószerrendszerek

Oldószer	Mennyiség (%)
A	B
CH3OH	75	95
ch3cn	75	95
h20	50	10

ml-es frakciókat szedünk le. A következő frakciókat egyesítjük:

Egyesítés	Frakciók
1	31-44
2	45-63
3	64-69
4	70-80
5	81-130
6	131-160

Az egyesített anyagból 5 részt (100 ml) betöményítünk, a maradékot feloldjuk 1 ml metanolban és rávisszük valamely 21,4 mmx250 mm HPLC oszlopra (Rainin Dynamax), ahogy a 3. példában leírtuk. Az oszlopot a következő összetételű oldószer-rendszerrel kondicionáljuk:

Oldószerrendszerek

Oldószer	Mennyiség (%)
A	B
CH3OH	30	95
CH3CN	30	95
h2o (1 normál NH4OAc, pH=0,5	40	-
H2O	-	10

Az előhíváshoz 120 perces lineáris gradienst használunk 100%-os (A) oldószertől 50%-os (B) oldószerig, mimellett 15 ml-es frakciókat szedünk le

7,5 ml/perc-nél. Az eluálást 50%-os (B)-nél folytatjuk további 60 percig. A következő frakciókat egyesítjük:

Egyesítés	Frakció	Komponens
1	37	F
2	38-40	E
3	52-63	B,G
4	65-70	H,J

Ezeket az összegyűjtött anyagokat egyesítjük más kromatográfiás menetekből kapott anyagokkal, amelyeknél hasonló kiindulási anyagokat használtunk. Az egyesített anyagokat tovább tisztítjuk az előzőekben leírt kromatográfiás oszlopon; HP-20 gyantán sómentesítjük azokat szabványos módszerekkel, majd betöményítjük és liofilizáljuk. Ily módon a következő komponenseket kapjuk:

Komponens	Mennyiség (mg)	Móltömeg+	IR++
E	249	717	13. ábra
F	4	717	14. ábra
G	104	731	15. ábra
H,J	87	717	16. ábra
pszeudo A	288	590	3. ábra

⁺ tömegspektrometria π^- KBr korong

Az A83543A pszeudoaglikon FD-MS és EI-MS spektrumait a 7. és a 11. ábrák szemléltetik.

6. példa

A83 543 előállítása A83 543.3 tenyészettel A) Rázólombikos fermentáció

A 2. példa A) pontjában leírt módszerekkel dolgozunk, a Saccharopolyspora spinosa NRRL 18537 tenyészetet rázólombikban tenyésztettük, de a következő

C) vegetatív tápközeget használtuk, amelynek az öszszetétele a következő:

C) vegetatív tápközeg

Alkotóanyagok	Mennyiség
enzimmel hidrolizált kazein+	30,0 g
élesztőkivonat	3,0 g
MgSO4x7 H2O	0,2 g
glukóz	10,0 g
glicerin	20,0 ml
ionmentesített víz	szükséges mennyiség 1 literre

pH - 6,6, 7,0-re beállítva NaOH-val ⁺NZ Amin A

B) Kevert bioreaktoros fermentálás

A tenyészet cseppfolyós nitrogén-fioláit készítettük el a 2. példa B) pontjában leírt módon. Egy fiolát használtunk az első fázisú vegetatív tenyészet beoltására [50 ml

HU 208 998 Β

C) közeg 250 ml-es lombikban], amelyet körülbelül 4872 óra hosszat inkubáltunk. Az inkubált első fázisú tenyészetet használtuk fel (10 ml inokulum mennyiségben) a második fázisú tenyészet beoltására [400 ml C) közeg 2 literes lombikban], amelyet körülbelül 48 óra hosszat inkubáltunk. Ezután 5 liter inkubált második fázisú tenyészetet használtunk fel 115 liter termelőközeg beoltására, amelynek az összetétele a következő:

II. termelőközeg

Alkotóanyag	Mennyiség (g/Iiter)
glukóz	80
peptonizált tej+	20
CaCO3	5
gyapotmagliszt++	20
metil-oleát	30 ml/liter
csapvíz szükséges mennyiség	1 literre

⁺ peptonizált tej tápanyag, Sheffield Products; további folytonos adagolás, kezdve a negyedik napon, 5 mg/ml naponta használható ++ Proflo (elősterilizálás, pH - 7,0-re beállítva NaOH-val)

A beoltott termelőközeget fermentálni hagyjuk egy 165 literes bioreaktorban keverés közben körülbelül 810 napig vagy hosszabb ideig 30 °C-on. Az oldott oxigénszintet (DO) számítógépes rendszer segítségével körülbelül 50%-os levegőtelítettségen tartjuk, ahogy a

2. példa B) pontjában leírtuk.

7. példa

A83 543 előállítása A83 543.5 tenyészettel

A) Rázólombikos fermentáció

A 2. példa A) pontjában leírt módszerekhez hasonló módon dolgozunk, a Saccharopolyspora spinosa NRRL 18538 tenyészetet rázólombikban tenyésztettük vegetatív B) közeg felhasználása útján.

B) Kevert bioreaktoros fermentáció

A tenyészet cseppfolyós nitrogén-fioláit készítettük el a 2. példa B) pontjában leírt módon. Egy fiolát használtunk az első fázisú vegetatív tenyészet [50 ml B) közeg 250 ml-es lombikban] beoltására, amelyet körülbelül 48-72 óra hosszat tenyésztettünk. Inkubált első fázisú tenyészetet használtunk fel (10 ml inokulum mennyiségben) a második fázisú tenyészet beoltására [400 ml B) közeg 2 literes lombikban], amelyet körülbelül 48 óra hosszat inkubáltunk. Ezután 2 liter inkubált második fázisú tenyészetet használtunk fel 115 liter termelőközeg inkubálására, amelynek az öszszetétele a következő:

III. termelőközeg

Alkotóanyag	Mennyiség (g/liter)
glukóz	80
vegetábilis protein, részben enzimesen hidrolizált+	20

Alkotóanyag	Mennyiség (g/liter)
gyapotmagliszt++	10
CaCO3	5
metil-oleát	30 ml/liter
csapvíz szükséges mennyiség	1 literre

+ Sheftone H ++ Proflo (elősterilizált és pH beállítva 7,0-re NH^jOH-val)

IV. termelőközeg

Alkotóanyag	Mennyiség (%)
glukóz	8
gyapotmagliszt+	3
peptionizált tej++	2
kukoricaáztató folyadék	I
CaCO3 (technikai minőség)	0,5
metil-oleát	3,0
csapvíz szükséges mennyiség	1,0 literre

+ Proflo ++ peptionizált tejtáp (elősterilizálás, pH beállítás 7,0-re NaOH-val).

A beoltott termelőközeget fermentálni hagyjuk egy 165 literes bioreaktorban keverés közben körülbelül 810 napig vagy még hosszabb ideig 30 °C-on. A DO szinteket a 6. példában leírtak szerint szabályozzuk.

8. példa

A83543 előállítása A83 543.4 tenyészettel

A 2. és a 7. példában leírt módon járunk el, a Saccharopolyspora spinosa NRRL 18538 tenyészetet alkalmazzuk, de B) vegetatív közeget és III. termelőközeget használunk.

9. példa

Fermentációs táptalajt készítünk a 8. példában leírt módon. Az A83 543-at a következő módon különítjük el a táptalajtól:

1. Egyenlő mennyiségű acetont adunk a táptalajhoz és az egészet szűrjük kerámiaszűrő vagy szűrési segédanyag segítségével nyomás alkalmazása mellett.

2. A szűrt táptalaj pH-ját 10-re állítjuk be.

3. Etil-acetátot adunk a táptalajhoz a táptalaj 1/4 1/2-ét kitevő mennyiségben.

4. Kinyerjük az etil-acetát kivonatot oly módon, hogy dekantáljuk a nem elegyedő vizes részt, majd az etil-acetát kivonatot 1/2-nyi térfogatra betöményítjük vákuumban.

5. A betöményített etil-acetát-oldatot extraháljuk (1/2 térfogat) 0,1 mólos vizes borkősav-oldattal és utána a fázisokat szétválasztjuk.

6. Az oldható etil-acetátot elkülönítjük a vizes fázistól vákuum alkalmazása mellett bepárlással (körülbelül 5%). A vizes oldatot betöményítjük fordított ozmózisos módszerrel.

HU 208 998 Β

7. A betöményített vizes oldat pH-ját 10-11 értékre állítjuk nátrium-hidroxiddal.

8. A csapadékot szűréssel elkülönítjük, vízzel mossuk és vákuumban szárítjuk. Ily módon A83 543 vegyületet kapunk.

10. példa

A83543A pszeudoaglikon

Az A83 543 vegyület egy mintáját, amely főként A) komponenst (körülbelül 100 mg) tartalmaz, feloldjuk 50 ml metanol, 2 ml víz és 3 ml tömény HCI elegyében. Az oldatot 50 °C-on szárazra pároljuk. A maradékot kétszer kezeljük 200-200 ml dietil-éterrel és az oldhatatlan anyagot elöntjük. Az egyesített éteres oldatokat, amelyek a nyers pszeudoaglikont tartalmazzák, szárazra pároljuk, A maradékot feloldjuk 20 ml metanolban és tisztítjuk, amelyhez AUTOPREP-HPLC rendszert használunk, amelyet a 3. példában ismertettünk. Ily módon 20 mg tiszta A83543A pszeudoaglikont kapunk.

11. példa

A83 543D pszeudoaglikont állítunk elő A83 543Dből a 10. példában leírt módszerhez hasonló módon.

12. példa

A következő készítmények jellegzetes találmány szerinti inszekticid szerek.

A) Vizes szuszpenzió

A83543A	12,5%
„Tergitol TMN-6” (nemionos felületaktív anyag)	1,0%
„Zeosyl 200” (szilícium-dioxid)	1,0%
„AF-100” (szilícium alapú habzásgátló szer)	0,2%
xantán-oldat (2%-os)	10,0%
„Makon 10” (10 mól etilénoxid-nonilfenol felületaktív anyag)	9,0%
csapvíz	66,3%

B) Emulgeálható koncentrátum

A83543D	12,4%
„Exxon 200” (naftalin oldószer)	83,6%
„Toximul H” (nemionos/anionos felületaktív elegy)	2,0%
„Toximuk D” (nemionos/anionos felületaktív elegy)	2,0%

13. példa

A következő példaképpen bemutatott készítmények a formált szerek olyan sorát mutatják be, amelyek a találmányban leírt gyakorlati módszerek szerint használhatók.

A) Táp-előkeverék

A83543A	10%
rizspelyva	85%
könnyű ásványolaj	5%

B) Táp-előkeverék

A83543E	25%
lucernaliszt	60%
porított kréta	5%
melasz	10%

C) Szuszpenzió

A83543A	30%
naftalinszulfonátsó	5%
nemionos felületaktív anyag	5%
gőzölt szilícium-dioxid	1%
VÍZ	59%

D) Csepegtethető oldat

A83543A	20%
nemionos felületaktív anyag	0,8%
propilén-glikol	15%
VÍZ	64,2%

E) Csepegtethető szuszpenzió

A83543B	10%
nemionos felületaktív anyag	1%
könnyű ásványolaj	89%

F) Befecskendezhető oldat

A83543A	15%
propilén-glikol	85%

G) Befecskendezhető szuszpenzió

A83543C	25%
propilén-glikol	15%
VÍZ	60%

H) Befecskendezhető szuszpenzió

A83543D	30%
poli(vinil-pirrolidon)	2%
VÍZ	68%

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (12)

1. Inszekticid és akaricid készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként 1-90 tömeg% mennyiségben legalább egy (1) általános képletű A83 543 vegyületet, amelyben

R jelentése H vagy (a), (b), (c) vagy (d) általános képletű csoport és

R² jelentése (e) általános képletű csoport,

R¹, R³, R⁵ és R⁶ jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport, és

R⁴ jelentése metil- vagy etilcsoport, vagy azoknak a vegyületeknek a fitológiailag elfogad26

HU 208 998 Β ható sóit, amelyekben R jelentése hidrogénatomtól eltérő, tartalmazza egy vagy több fitológiailag elfogadható vivőanyaggal vagy hígítószerrel együtt. (Elsőbbsége: 1989.10. 30.)

2. Inszekticid és akaricid készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként 1-90 tömeg% mennyiségben legalább egy (1) általános képletű A83 543 vegyületet, amelyben

R jelentése H vagy (a), (b) vagy (c) képletű csoport és R² jelentése (e) általános képletű csoport R¹, R³ és R⁶ jelentése metilcsoport, és R⁴ jelentése metil- vagy etilcsoport,

R³ jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport,

R⁴ jelentése etilcsoport, azzal a feltétellel, hogy ha R³ metilcsoport, R (b) vagy (c) képletű csoporttól eltérő, vagy azoknak a vegyületeknek a fitológiailag elfogadható sóit, amelyekben R jelentése eltér hidrogénatomtól, tartalmazza egy vagy több fitológiailag elfogadható vivőanyaggal vagy hígítószerrel együtt. (Elsőbbsége:

1988.12.19.)

3. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként olyan (1) általános képletű A83 543 vegyületet tartalmaz, amelyben R, R¹, R³, R⁴, R⁵ és R⁶ a következő kombinációk egyikében van jelen:

R R¹ R³ R⁴ R⁵ R⁶ (a) Me H Et Me Me (b) Me H Et Me Me (c) Me H Et Me Me (a) Me Me Et Me Me (a) Me H Me Me Me (a) H H Et Me Me (d) Me H Et Me Me (a) Me H Et H Me (a) Me H Et Me H H Me H Et Me Me H Me Me Et Me Me H Me H Me Me Me H H H Et Me Me H Me H Et H Me H Me H Et Me H

vagy e vegyület savaddíciós sóit foglalja magában, amelyben R jelentése eltér hidrogénatomtól. (Elsőbbsége: 1989.10. 30.)

4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként olyan A83 543 vegyületet tartalmaz, amelyben R jelentése (a) csoport, R¹, R⁵ és R⁶ jelentése CH₃ csoport, R³ hidrogénatom és R⁴ jelentése etilcsoport. (Elsőbbsége: 1988.12. 19.)

5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként olyan A83 543 vegyületet tartalmaz, amelyben R jelentése (a) csoport, R¹, R³, R⁵ és R⁶ jelentése CH₃ csoport, és R⁴ jelentése etilcsoport, vagy e vegyület valamely savaddíciós sóját foglalja magában. (Elsőbbsége: 1988. 12.19.)

6. Eljárás rovarok vagy atkák irtására és fejlődésük gátlására, azzal jellemezve, hogy a rovarok vagy atkák előfordulási helyére az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti készítmény hatásos mennyiségét visszük rá 0,01-1 kg/ha hatóanyag-mennyiségben, amely hatóanyagként az 1-5. igénypontokban alkalmazott (1) általános képletű A83 543 vegyületet - a képletben R és R*-R⁴ jelentése az 1-5. igénypontban megadott - vagy fitológiailag elfogadható sóját tartalmazza. (Elsőbbsége: 1989.10. 30.)

7. Eljárás rovarok vagy atkák irtására és fejlődésük gátlására, azzal jellemezve, hogy a rovarok vagy atkák előfordulási helyére a 2., 4. vagy 5. igénypontok bármelyike szerinti készítmény hatásos mennyiségét visszük rá 0,01-1 kg/ha hatóanyag-mennyiségben, amely hatóanyagként a 2., 4. vagy 5. igénypontban alkalmazott (1) általános képletű A83543 vegyületet a képletben R, R¹ és R⁴ jelentése a 2., 4. vagy 5. igénypontban megadott - vagy fitológiailag elfogadható sóját tartalmazza. (Elsőbbsége: 1988.12.19.)

8. Eljárás (1) általános képletű - ahol R, R¹, R³, R⁴, R⁵ és R⁶ jelentése a 2. igénypontban megadott A83 543 vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy a Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395 törzset vagy A83 543-at termelő mutánsát olyan tápközegben tenyésztjük, amely asszimilálható szén-, nitrogén- vagy szervetlen sóforrást tartalmaz, süllyesztett aerob fermentációs körülmények között. (Elsőbbsége:

1988.12.19.)

9. Eljárás (1) általános képletű - ahol R, R¹, R³, R⁴, R⁵ és R⁶ jelentése az 1. igénypontban megadott A83543 vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy a Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 vagy NRRL 18539 törzsek egyikét vagy ezek A83 543-at termelő mutánsát olyan tápközegben tenyésztjük, amely asszimilálható szén-, nitrogén- vagy szervetlen sóforrást tartalmaz, süllyesztett aerob fermentációs körülmények között. (Elsőbbsége: 1989.10. 30.)

10. Eljárás ektoparazita-ellenes készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként 0,00005-95 tömeg% mennyiségben valamely, a 9. igénypont szerint előállított (1) általános képletű A83 543 vegyületet vagy fiziológiailag elfogadható sóját fiziológiailag elfogadható egy vagy több közömbös vivőanyaggal vagy hígítószerrel szokásos dózisformává alakítunk. (Elsőbbsége: 1989.10.30.)

11. Eljárás ektoparazita-ellenes készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként 0,00005-95 tömeg% mennyiségben valamely, a 8. igénypont szerint előállított (1) általános képletű A83 543 vegyületet vagy fiziológiailag elfogadható sóját fiziológiailag elfogadható egy vagy több közömbös vivőanyaggal vagy hígítószerrel szokásos dózisformává alakítunk. (Elsőbbsége: 1988.12.19.)

12. Eljárás Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395 törzs vagy A83 543-at termelő mutánsa biológiailag tiszta tenyészetének előállítására, azzal jellemezve, hogy a fenti törzsek valamelyikét steril körülmények között szaporítjuk. (Elsőbbsége: 1988.12.19.)