KR20130080007A

KR20130080007A - Ｓｐｎｋ 균주

Info

Publication number: KR20130080007A
Application number: KR1020127029403A
Authority: KR
Inventors: 레이 한
Original assignee: 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
Priority date: 2010-05-11
Filing date: 2011-05-11
Publication date: 2013-07-11
Also published as: RU2580015C2; RU2012153212A; US20110281359A1; TW201201700A; EP2569414A1; CA2798886A1; JP2013531976A; MX2012013099A; BR112012028860A2; IL222821A0; MX342130B; CN103119152B; CN103119152A; AU2011250904A1; WO2011143291A1

Abstract

본 발명은 스피노신 생합성 유전자, 상기 생합성 유전자로 형질전환된 스피노신 생산 미생물, 스피노신 살충성 마크롤라이드의 생산을 증가시키기 위해 상기 생합성 유전자를 사용하는 방법, 및 스피노신 생산 미생물에 의해 생산되는 생성물을 변이시키기 위해 상기 유전자 또는 그의 단편을 사용하는 방법을 포함한다. 추가로, 본 발명은 스피노신 A 및 D 생산 균주를, 스피네토람 전구체인 스피노신 J 및 L 생산 균주로 전환시키는 방법 및 그를 위한 조성물을 포함한다.

Description

ＳＰＮＫ 균주{SPNK STRAINS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2010년 5월 11일에 출원된 미국 특허 가출원 제61/333,540호의 이점을 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

본 발명의 기술 분야

본 발명은 유전자의 발현을 파괴하는 분자 유전학 기술 분야를 적용한다. 더욱 구체적으로, spnK 유전자의 돌연변이가 스피노사드 생산 균주를 스피네토람 전구체 생산 균주로 전환시킨다는 것을 발견하게 되었다.

미국 특허 제5,362,634호에 개시된 바와 같이, 발효 생성물 A83543은 사카로폴리스포라 스피노사(Saccharopolyspora spinosa)에 의해 생산되는 관련 화합물 계열이다. 이 계열을 이루는 공지의 구성원들은 인자 또는 성분으로 일컬어지며, 각각 식별 문자 명칭으로 주어진다. 이하 이러한 화합물은 스피노신 A, B 등으로 지칭된다. 스피노신 화합물은 거미류, 선충 및 곤충, 특히 레피도프테라(Lepidoptera) 및 디프테라(Diptera) 종을 방제하는 데 유용하며, 이들은 매우 환경 친화적이며, 흥미를 끄는 독물학적 프로파일을 가지고 있다.

천연적으로 생산된 스피노신 화합물은 12-원 마크로시클릭 락톤, 중성 당 (람노스) 및 아미노 당 (포로스아민)에 융합된 5,6,5-트리시클릭 환 시스템으로 이루어진다 (문헌 [Kirst et al. (1991)] 참조). 아미노 당이 존재하지 않는다면, 화합물은 A, D 등의 슈도애글리콘으로 지칭되며, 중성 당이 존재하지 않는다면 화합물은 A, D 등의 역 슈도애글리콘으로 지칭된다. 더욱 바람직한 명명법은 슈도애글리콘을 스피노신 A 17-Psa, 스피노신 D 17-Psa 등으로 지칭하고, 역 슈도애글리콘을 스피노신 A 9-Psa, 스피노신 D 9-Psa 등으로 지칭하는 것이다.

천연적으로 생산된 스피노신 화합물은 배양물 NRRL 18395, 18537, 18538, 18539, 18719, 18720, 18743 및 18823으로부터의 발효를 통해 생산될 수도 있다. 이러한 배양물은 미국 일리노이주 61604 페오리아 1815 노스 유니버시티 스트리트에 위치한 미국 농무성, 농업 연구부, 중서부 지역 북부 지방 연구소(Midwest Area Northern 영역al Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture)의 보존 균주 콜렉션에 기탁되어 그 일부를 형성한다.

미국 특허 제5,362,634호 및 상응하는 유럽 특허 출원 제375316 A1호는 스피노신 A, B, C, D, E, F, G, H 및 J에 관한 것이다. 이러한 화합물은 NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538, 및 NRRL 18539로부터 선택되는 신규 미생물 사카로폴리스포라 스피노사의 균주를 배양함으로써 생산된다고 한다.

WO 93/09126은 스피노신 L, M, N, Q, R, S 및 T에 관한 것이다. 또한, 2종의 스피노신 J 생산 균주: NRRL 18719 및 NRRL 18720 및 스피노신 Q, R, S 및 T 생산 균주: NRRL 18823이 상기 문헌에서 논의되고 있다.

WO 94/20518 및 미국 특허 제5,6704,486호는 스피노신 K, O, P, U, V, W 및 Y 및 그의 유도체에 관한 것이다. 또한, 스피노신 K-생산 균주 NRRL 18743이 논의되고 있다.

스피노신 화합물 생산에서의 문제는, 극소량의 스피노신을 생산하는 데 극 대량의 발효 부피가 필요하다는 사실에서 비롯된다. 스피노신 생산 효율을 증가시키고 이에 의해 그의 비용을 절감하면서 스피노신의 이용가능성을 증가시키는 것이 매우 요망된다.

또한, 상이한 스펙트럼의 살충 활성을 가질 수 있는 스피노신의 새로운 유도체를 제조하는 방법을 제공하는 클로닝된 생합성 유전자를 제조하는 것이 이로울 것이다. 공지된 스피노신이 광범위한 범위의 곤충을 억제하기는 하지만, 이들은 모든 해충을 방제하지는 않기 때문에, 신규의 유도체가 바람직할 수 있다. 스피노신의 생합성 중간체에 의해, 또는 생체내에서 생산된 그들의 유도체에 의해, 또는 시험관내에서 그들의 화학적 변형으로부터 얻어진 유도체에 의해 상이한 패턴의 방제를 제공할 수 있다.

스피노신 생합성을 위한 효소를 코딩하는 특정 유전자의 일부가, 시험관내에서 특이적으로 돌연변이화된 동일의 유전자의 일부로 치환되어 있거나, 또는 다른 유기체로부터 유래된 유전자의 상응하는 일부로 치환된, S. 스피노사(S. spinosa)의 돌연변이체 균주에 의해 합성된 신규한 중간체를 제공하는 것도 이로울 수 있다.

본 발명의 요약

본 발명은 예컨대, 스피노신 A 및 D와 같은 스피노사드 생산 균주를, 예컨대, 스피노신 J 및 L과 같은 스피네토람 전구체 생산 균주로 전환시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 3'-O-메틸트랜스퍼라제 활성을 제거하기 위해 spnK 유전자를 변형시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 변형은 프레임내 결실, 돌연변이, 치환, 결실, 삽입 등을 통해 이루어질 수 있다. 프레임내 결실은 유전자 전역에서의 5' 말단, 3' 말단의 결실 또는 spnK 코딩 영역의 결실을 포함할 수 있다. 상기와 같은 프레임내 결실은 서열 9를 포함할 수 있다. 점 돌연변이는 염기쌍 528, 589, 602, 668, 721, 794, 862, 895, 908, 937 및 1131 위치에서의 돌연변이를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 돌연변이를 통해 spnK 유전자의 번역을 변이시킬 수 있다. 그러한 변이는 아미노산 변이, 치환, 또는 정지 코돈의 생성일 수 있다. 그러한 변형으로 스피노신 A 및 D와 비교되는 스피노신 J 및 L 스피노신 화합물이 생산된다.

본 발명의 특정 방법은 스피노신 J 및 L 생산은 유지하면서, spnK 유전자를 무능력화시킴으로써 스피노사드 생산 균주를 스피네토람 전구체 생산 균주로 전환시키는 것을 포함한다. 정상적인 spnK 단백질 활성의 무능력화 또는 파괴는 프레임내 결실, 돌연변이, 치환, 결실, 삽입 등에 의해 발생할 수 있다. 이는 또한 프로모터, 또는 리보솜 결합 부위 서열에의 조작에 의해 유발될 수 있다.

본 발명은 추가로 스피네토람 전구체를 생산하는, 유전적으로 변형된 숙주 세포를 제공한다. 상기 유전적으로 변형된 숙주는 3'-O-메틸트랜스퍼라제 활성을 제거하기 위해 spnK 유전자를 변형시킴으로써 생산될 수 있다. 상기 변형은 프레임내 결실, 돌연변이, 치환, 결실, 삽입 등을 통해 이루어질 수 있다. 프레임내 결실은 5' 말단, 3' 말단의 결실 또는 spnK 코딩 영역의 결실을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 3'-O-메틸트랜스퍼라제 활성을 제거하기 위해 spnK 유전자를 변형시킴으로써 스피노사드 생산 균주를 스피네토람 전구체 생산 균주로 전환시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 프레임내 결실, 점 돌연변이, 결실, 및 삽입을 포함할 수 있다. 상기 프레임내 결실은 5' 말단의 프레임내 결실, 3' 말단의 프레임내 결실 및 spnK 코딩 영역의 프레임내 결실을 포함할 수 있다. 결실은 spnK 유전자의 정상적인 리딩 프레임을 파괴시키는 단일 또는 다중 뉴클레오티드 염기 결실을 포함할 수 있다. 삽입은 spnK 유전자의 정상적인 리딩 프레임을 파괴시키는 단일 또는 다중 뉴클레오티드 염기 삽입을 포함할 수 있다. 점 돌연변이는 염기쌍 위치 528, 589, 602, 668, 721, 794, 862, 895, 908, 937 및 1131에서 발생할 수 있다. 이러한 점 돌연변이를 통해 spnK 유전자의 활성 부위 또는 기질 결합 부위에서 아미노산 치환이 이루어질 수 있다.

본 발명은 3'-O-메틸트랜스퍼라제 활성을 제거하기 위해 spnK 유전자를 변형시킴으로써 상당량의 스피네토람 전구체를 정상적으로 생산하지 못하는 원핵 숙주 세포인, 스피네토람 전구체를 생산하는 유전적으로 변형된 숙주 세포를 포함한다. 다른 실시양태는 스피노신 J 및 L 생산은 유지하면서, spnK 유전자를 무능력화시킴으로써 스피노사드 생산 균주를 스피네토람 전구체 생산 균주로 전환시키는 방법을 포함한다. 상기 방법은 프레임내 결실, 점 돌연변이, 결실, 및 삽입을 포함할 수 있다. 상기 프레임내 결실은 5' 말단의 프레임내 결실, 3' 말단의 프레임내 결실 및 spnK 코딩 영역의 프레임내 결실을 포함할 수 있다. 결실은 spnK 유전자의 정상적인 리딩 프레임을 파괴시키는 단일 또는 다중 뉴클레오티드 염기 결실을 포함할 수 있다. 삽입은 spnK 유전자의 정상적인 리딩 프레임을 파괴시키는 단일 또는 다중 뉴클레오티드 염기 삽입을 포함할 수 있다. 점 돌연변이는 염기쌍 위치 528, 589, 602, 668, 721, 794, 862, 895, 908, 937 및 1131에서 발생할 수 있다. 이러한 점 돌연변이를 통해 spnK 유전자의 활성 부위 또는 기질 결합 부위에서 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. spnK를 무능력화시키는 다른 방법은 리보솜 결합 부위의 조작에 의해, 또는 spnK 유전자의 프로모터 조작에 의해 이루어질 수 있다.

도 1은 spnK 점 돌연변이의 위치를 도시한 것이다. 돌연변이는 spnK의 야생형 서열내에서 하이라이트로 강조하여 표시되어 있다 (서열 17).
도 2는 spnJ, spnK, spnL 및 spnM의 물리적 지도를 도시한 것이다. 생산된 PCR 생성물은 염색체 지도 아래에 선으로 표시되어 있다.
도 3은 본 발명의 한 실시양태에 따른 단일 교차 상동 재조합으로서 spnLM 영역내 spnK 프레임내 결실 구성체의 통합을 나타내는 것이다 (별표 표시는 spnJ 및 spnM의 불완전한 코딩 서열을 나타내는 것이다).
도 4는 본 발명의 한 실시양태에 따른, spnK 유전자의 결실을 일으키는 이중 교차 돌연변이체를 도시한 것이다. PCR 단편의 크기 및 DNA 서열이 spnK 유전자의 프레임내 결실을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 한 실시양태에 따른, spnK 내에 프레임내 아프라마이신 내성 유전자 카세트 (aac (3)IV)를 함유하는, 삽입 카세트의 다이어그램이다.
도 6은 본 발명의 한 실시양태에 따른, spnK 코딩 서열의 상류에 위치하는 (샤인-달가르노(Shine-Dalgarno)로 표지된) 리보솜 결합 부위를 도시한 것이다 (서열 16). 상기 서열은 도면에서 하이라이트로 강조하여 표시되어 있다.

본 발명의 상세한 설명

클로닝된 사카로폴리스포라 스피노사 DNA의 용도는 다양하다. 클로닝된 유전자는 스피노신의 수율을 개선시키고, 신규의 스피노신을 생산하는 데 사용될 수 있다. 그에 대한 효소가 어느 것이든 간에 특정 균주에서 속도 제한형인 것인 유전자의 복제 카피를 특정 균주의 게놈 내로 통합시킴으로써 수율이 개선될 수 있다. 특정 돌연변이체 균주에서 필요한 효소가 부족하여 생합성 경로가 차단되는 경우, 원하는 스피노신의 생산은 필요한 유전자의 카피를 통합시킴으로써 복원될 수 있다. 생합성 경로가 파괴된 경우에는 상이한 전구체 균주가 생성될 수 있다. 더욱 구체적으로, spnK 유전자가 파괴되면 스피노신 A 및 D 생산과 비교되는 스피노신 J 및 L의 생산이 이루어질 수 있다.

스피노신의 생합성 단계를 파괴시키는 클로닝된 DNA의 단편을 사용하여 신규한 스피노신을 제조할 수 있다. 이러한 파괴는 전구체 또는 "션트" 생성물 (전구체의 천연적으로 프로세싱된 유도체)을 축적시킬 수도 있다. 파괴를 수행하는 데 유용한 단편들은 유전자 전역에 뿐만 아니라, 유전자의 5' 및 3' 말단, 둘 모두로부터 생략된 염기를 가진 유전자에 대해 내부에 존재하는 것이다. 이러한 단편을 사용하는 상동 재조합에 의해 유전자의 2개의 부분 카피가 생성된다: 하나는 5' 말단으로부터 생략된 염기가 결여된 것이고, 다른 하나는 3' 말단으로부터 생략된 염기가 결여된 것이다. 유전자의 부분 카피 중 어느 것도 활성을 보유하지 않도록, 단편의 각각의 말단에서 생략되는 염기의 개수는 충분히 많아야 한다.

하기 정의가 본원에서 사용되며, 특허청구범위 및 명세서의 해석을 위해 그러한 의미를 가져야 한다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에서 참고로 하는 모든 미국 특허 및 미국 특허 출원은 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다.

본원에서 사용되는 바, 본 발명의 요소 또는 성분 앞의 "하나"(부정 관사 ("a" 및 "an"))라는 것은 요소 또는 성분의 사례수 (즉, 존재수)와 관련하여 비제한적인 것으로 한다. 그러므로, "하나"("a" 또는 "an")라는 것은 하나 또는 1 이상을 포함하는 것으로 판독되어야 하고, 단수 형태의 요소 또는 성분은 또한 그 개수가 단수인 것을 명백하게 의미하지 않는 한, 복수도 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "포함하는(comprising)" 및 "포함하는(including)"이라는 용어는 특허청구범위에서 언급된 것과 같이 언급한 특징, 정수, 단계, 또는 성분이 존재한다는 것을 의미하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 또는 성분 또는 그의 군이 존재하거나 부가되는 것을 제한하는 것은 아니다. 이는 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 물품, 또는 장치가 열거된 요소를 "포함(comprising 또는 including)"하는데, 단지 상기 요소로만 제한되는 것이 아니라, 그에 명확하게 열거되거나 그에 고유한 것인 아닌 다른 것도 포함할 수 있다는 것을 의미하는 것이다. 본원에서 사용되는 바, "또는"은 포괄적 및 배타제 "또는"을 지칭한다. 예를 들어, 조건 A 또는 B는 하기들 중 어느 하나를 만족한다: A는 참이고 (또는 존재하고), B는 거짓 (또는 존재하지 않는 것), A는 거짓이고 (또는 존재하지 않고), B는 참 (또는 존재하는 것), 및 A 및 B, 둘 모두 참 (또는 존재하는 것).

본원에서 사용되는 바, "약"이라는 용어는 본 발명의 성분 또는 반응 물질의 양을 수식하는 것을 의미하거나, 사용되는 상기 용어는 예를 들어, 현실에서 농축물 또는 사용 용액 제조시에 사용되는 전형적인 측정 방법 및 액체 취급 방법을 통해; 상기 방법에서의 우연한 오류를 통해; 조성물을 제조하거나, 방법을 수행하는 데 사용되는 제조법, 공급원, 또는 성분의 순도 상의 차이 등을 통해 발생할 수 있는 수치량의 변동을 의미한다. "약"이라는 용어는 또한 특정의 초기 혼합물로부터 생성된 조성물에 대한 상이한 평형 조건에 기인하여 차이가 나는 양을 포함한다. "약"이라는 용어로 수식되었는지와는 상관없이, 본 특허청구범위는 양에 대한 등가물을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "발명" 또는 "본 발명"이라는 것은 비제한적인 용어이며, 이는 본 명세서에서 기술되고, 특허청구범위에서 언급된 것과 같은 모든 가능한 변형들을 포함하는 것으로 한다.

본원에서 사용되는 바, "폴리펩티드" 및 "펩티드"라는 용어는 상호교환적으로 사용될 것이며, 이는 펩티드 결합에 의해 함께 결합된 2개 이상의 아미노산으로 구성된 중합체를 의미한다. 한 측면에서, 상기 용어는 또한 폴리펩티드의 발현 후의 변형, 예를 들어, 당화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 유사체 또는 표지된 아미노산을 함유하는 펩티드 및 펩티드 유사체(peptidomimetic)도 본 정의에 포함된다. 펩티드는 L-아미노산을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "관심의 대상이 되는 펩티드," "POI," "유전자 생성물," "표적 유전자 생성물," 및 "표적 코딩 영역 유전자 생성물"이라는 용어는 재조합적으로 발현되는 외래 유전자에 의해 코딩된 원하는 이종성 펩티드/단백질 생성물을 의미한다. 관심의 대상이 되는 펩티드로는 단백질, 융합 단백질, 효소, 펩티드, 폴리펩티드, 및 올리고펩티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 펩티드/단백질 생성물을 포함할 수 있다. 관심의 대상이 되는 펩티드의 크기는 길이가 2 내지 398 아미노산 범위이다.

본원에서 사용되는 바, "유전적 구성체"라는 용어는 유기체의 유전자형 또는 표현형을 조정하는 데 유용한 일련의 연속된 핵산을 의미한다. 유전적 구성체의 비제한적인 예로는 핵산 분자, 및 오픈 리딩 프레임, 유전자, 발현 카세트, 벡터, 플라스미드 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 바, "내인성 유전자"라는 용어는 유기체의 게놈 중 그의 그 본연의 위치에 존재하는 고유 유전자를 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "외래 유전자"는 보통은 숙주 유기체 중에서 발견되지는 않지만, 유전자 전달에 의해 숙주 유기체 내로 도입된 유전자를 의미한다. 외래 유전자는 비-고유 유기체 내로 삽입된 고유 유전자, 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 특정 유기체/게놈 내의 서열과 관련하여 "이종성"이라는 용어는 서열이 외래 종으로부터 기원된 것이거나, 또는 같은 종으로부터 유래된 경우에는 인간의 의도적인 개입에 의해 조성 및/또는 게놈 유전자좌에 있어 그의 고유한 형태로부터 실질적으로 변형된 것이라는 것을 나타내는 것이다. 따라서, 예를 들어, 이종성 유전자 발현은 유전자를 다른 유기체/게놈의 게놈 내로 배치함으로써 한 유기체/게놈로부터 유전자를 발현시키는 공정을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "재조합체"라는 용어는 예컨대, 화학적 합성에 의해, 또는 유전자 조작 기법에 의해 단리된 핵산 세그먼트의 조작에 의해 다르게 분리된 두 서열 세그먼트의 인공적 조합물을 의미한다. "재조합체"는 또한 이종성 핵산의 도입에 의해 변형된 세포 또는 벡터, 또는 상기와 같이 변형된 세포로부터 유래된 세포에 관한 언급은 포함하나, 예컨대, 인간의 의도적인 개입없이 발생된 것과 같은 천연적으로 발생된 이벤트 (예컨대, 자발적 돌연변이, 천연 형질전환, 천연 형질도입, 천연 전이)에 의한 세포 또는 벡터의 변경은 포함하지 않는다.

"유전자 조작된" 또는 "유전적으로 변경된"이라는 용어는 살아있는 유기체에서 유전 물질의 구조를 과학적 방식으로 변경시키는 것을 의미한다. 이는 재조합 DNA의 제조 및 사용을 포함한다. 더욱 특히, 천연적으로 발생된 유기체로부터의 유전자 조작된 또는 변형된 유기체를 설명하는 데 사용된다. 유전자 조작은 당업계에 공지된 다수의 기법, 예컨대, 플라스미드, 바이러스, 또는 다른 벡터를 사용하는 유전자 치환, 유전자 증폭, 유전자 파괴, 형질감염, 형질전환에 의해 수행될 수 있다. 유전적으로 변형된 유기체, 예컨대 유전적으로 변형된 미생물 또한 재조합 유기체, 예컨대, 재조합 미생물로서 언급된다.

본원에서 사용되는 바, 유전자 조작을 통해, 또는 유전자의 활성을 바꾸는 천연적인 원인을 통해 조작되거나 변형된 유전자와 관련하여 "파괴된" 또는 "파괴"라는 용어가 사용된다. 상기 유전자 활성은 증가 또는 감소될 수 있다. 추가로, 상기 파괴는 단백질 기능을 폐기시킬 수 있다. 상기와 같은 감소가 원활하게 일어날 수 있도록 하기 위해, 예를 들어, 유전자를 과소발현시키거나, 또는 그를 파괴시킴으로써 유전자의 카피수를 감소시킬 수 있다. 상기 유전자의 전사 수준이 야생형 유전자와 비교하여 감소하였다면, 이때 유전자가 "과소발현되었다"라고 한다. 이는 유전자 발현을 나타내는 지표로서 mRNA의 양을 정량하는 노던 블롯 분석법에 의해 측정될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 야생형 유전자로부터 생성된 mRNA의 양과 비교하여 생성된 mRNA의 양이 적어도 1%, 2%, 5% 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 200% 또는 심지어 500% 초과인 만큼 감소하였다면, 유전자는 과소발현된 것이다. 별법으로, 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하기 위해 약한 프로모터를 사용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 발현을 감소시키기 위해 유전자 상류의 프로모터, 조절 영역 및/또는 리보솜 결합 부위를 변경시킬 수 있다. 발현은 또한 메신저 RNA의 상대적인 반감기를 감소시킴으로써 감소될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 그 자체의 활성은 상기 활성을 감소시키는, 폴리펩티드 아미노산 서열 중의 하나 이상의 돌연변이를 사용함으로써 감소될 수 있다. 예를 들어, 그의 상응하는 기질에 대한 폴리펩티드의 친화도를 변경시키면 활성이 감소될 수 있다. 유사하게, 폴리펩티드의 상대적인 반감기는 감소될 수 있다. 어느 경우든, 유전자 발현이 감소되든 또는 활성이 감소되든 간에, 감소는 세포 배양 배지의 조성 및/또는 배양에 사용되는 방법을 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "발현 감소" 또는 "활성 감소"란 야생형 단백질, 폴리뉴클레오티드, 유전자; 또는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 감소되기 전에 존재한 단백질의 활성 및/또는 농도와 비교하여 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 200% 또는 심지어 500% 초과만큼 감소한 것을 의미한다. SpnK 단백질의 활성은 또한 단백질을 그의 활성에 대한 특이적인 또는 일반 억제제와 접촉시킴으로써 감소될 수 있다. "활성 감소," "활성 감소 또는 폐기"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

"제어 서열"이라는 표현은 총칭하여 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 종결 서열, 상류 조절 도메인, 인핸서 등을 지칭하고, 이는 모두 숙주 세포에서 코딩 서열의 전사 및 번역을 위해 제공된다. 원하는 유전자가 전사 및 번역될 수 있는 한, 상기 제어 서열들 모두가 재조합 벡터 중에 항상 존재할 필요는 없다.

"재조합"은 두 DNA 또는 RNA 분자 간의 DNA 또는 RNA 서열 섹션의 재편성을 의미한다. "상동 재조합"은 각 DNA 분자에 존재하는 상동성 또는 상보적인 뉴클레오티드 서열에 의해 혼성화하는 두 DNA 분자 간에 일어난다.

"엄격한 조건" 또는 "엄격한 조건하에서의 혼성화"라는 용어는 프로브가 그의 표적 서브서열에 차별적으로 혼성화하고, 다른 서열에는 그보다 적게 혼성화하거나, 또는 다른 서열에는 전혀 혼성화하지 않는 조건을 의미한다. 핵산 혼성화 실험, 예컨대, 써던 및 노던 혼성화와 관련하여, "엄격한 혼성화" 및 "엄격한 혼성화 세척 조건"은 서열에 의존하며, 상이한 환경 파라미터하에서는 상이하다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 가이드는 문헌 [Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry 및 Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 Overview of principles of hybridization 및 the strategy of nucleic acid probe assays, Elsevier, New York]에서 살펴볼 수 있다. 일반적으로, 고도로 엄격한 혼성화 및 세척 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특이 서열에 대한 열 용융점 (T_m)보다 약 5℃ 더 낮은 온도로 선택된다. T_m은 (정의된 이온 강도 및 pH하에서) 표적 서열 중 50%가 완벽하게 매치되는 프로브에 혼성화하는 온도이다. 매우 엄격한 조건은 특정 프로브에 대한 T_m과 동일한 온도로 선택된다.

써던 및 노던 블롯에서 필터 상에서의 100개 초과의 상보적인 잔기를 가지는 상보적인 핵산의 혼성화를 위한 엄격한 혼성화 조건의 예는 42℃에서 1 mg의 헤파린과 함께 50% 포름아미드이고, 혼성화는 밤새도록 수행된다. 고도로 엄격한 세척 조건의 예는 72℃에서 약 15분 동안 0.15 M NaCl이다. 엄격한 세척 조건의 예는 65℃에서 15분 동안 0.2 x SSC 세척이다 (SSC 완충액에 대한 설명을 위해 문헌 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual (2nd ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY] 참조). 대개, 고도로 엄격한 세척에 앞서서, 배경 프로브 신호를 제거하기 위해 낮은 엄중도의 세척이 진행된다. 예컨대, 100 초과의 뉴클레오티드로 이루어진 이중체에 대한 중간 정도의 엄중한 세척에 대한 예는 45℃에서 15분 동안 1 x SSC이다. 예컨대, 100 초과의 뉴클레오티드로 이루어진 이중체에 대한 낮은 정도의 엄중한 세척에 대한 예는 40℃에서 15분 동안 4-6 x SSC이다. 일반적으로, 신호 대 잡음비가 특정 혼성화 검정에서 비관련 프로브에 대해 관찰되는 것보다 2x (또는 그 초과)라는 것은 특이적인 혼성화가 검출되었음을 나타낸다. 핵산이 코딩하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다면, 엄격한 조건하에서 서로 혼성화하지 못하는 핵산도 여전히 실질적으로 동일한 것이다. 이는 예컨대, 유전자 코드에 의해 허용되는 최대 코돈 축퇴성을 사용하여 핵산 카피가 형성되는 경우에 발생한다.

본 발명은 또한 엄격한 조건, 바람직하게는, 고도로 엄격한 조건하에서 본 발명의 것과 같은 폴리뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 바, "혼성화하는"이라는 용어는, 서로에 대해 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80%, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 85% 내지 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 상동성인 뉴클레오티드 서열이 서로에 대해 혼성화된 상태로 남아있는, 혼성화 및 세척이 이루어지는 조건을 기술하는 것으로 한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 본 출원에서 제시된 핵산 서열, 또는 그의 보체에 대해 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 상동성이다.

엄격한 혼성화 조건의 또 다른 비제한적인 예는 약 45℃하에 6 x 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC) 중에서 혼성화한 후, 50℃, 바람직하게는, 55℃, 더욱 바람직하게는, 60℃, 및 더욱더 바람직하게는, 65℃하에 1 x SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척하는 것이다.

고도로 엄격한 조건은 표지된 DNA 프로브, 예컨대, 디곡시게닌 (DIG)-표지된 DNA 프로브를 사용하여 42℃에서 7일간의 기간 동안, 예컨대, 2-4일 동안 인큐베이션시킨 후, 실온하에 2 x SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척하고, 65-68℃하에 0.5 x SSC, 0.1% SDS 또는 0.1 x SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척하는 것을 포함할 수 있다. 특히, 고도로 엄격한 조건은 예를 들어, 용액, 예컨대, 100 ㎍/ml 연어 정자 DNA를 함유하거나, 또는 함유하지 않는 DigEasyHyb 용액 (로슈 다이어그나스틱스 게넴베하(Roche Diagnostics GmbH: 독일 68298 만하임)), 또는 50% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 0.02% 도데실황산나트륨, 0.1% N-라우로일사르코신, 및 2% 차단용 시약 (로슈 다이어그나스틱스 게넴베하)을 포함하는 용액 중에서 (예컨대, DIG 표지화 시스템 (로슈 다이어그나스틱스 게넴베하)를 사용하여 제조된) DIG-표지된 DNA 프로브를 사용하여 42℃에서 2 h 내지 4일 동안 인큐베이션시킨 후, 실온하에 2 x SSC 및 0.1% SDS에서 5 내지 15분 동안 2회에 걸쳐 필터를 세척하고, 이어서, 65-68℃하에 0.5 x SSC 및 0.1% SDS 또는 0.1 x SSC 및 0.1% SDS에서 15-30분 동안 2회에 걸쳐 세척하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 고도로 엄격한 조건하에서 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 본 발명의 단리된 핵산 분자는 천연적으로 발생된 핵산 분자에 상응할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "천연적으로 발생된" 핵산 분자는 천연적으로 발생하는 (예컨대, 천연 단백질을 코딩한) 뉴클레오티드 서열을 가지는 RNA 또는 DNA 분자를 의미한다.

당업자는 어떤 조건이 엄격한 및 고도로 엄격한 혼성화 조건에 적용되는지를 알고 있을 것이다. 상기 조건에 관한 추가의 가이던스는 당업계에서 쉽게 이용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ([Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.]; 및 [Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.])).

스피노신 생합성 효소에 대한 유전자를 함유하는, 클로닝된 DNA 단편은 스피노신 생산에서 속도 제한형 효소를 코딩하는 유전자를 복제할 수 있다. 이는 코딩된 활성 중 하나가 원하는 스피노신의 합성을 제한하였을 때와 같은 임의의 환경하에서 수율을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 유형의 수율 증가는 마크로신을 티로신으로 전환시키는 속도 제한형 메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 복제함으로써 스트렙토마이세스 프라디아에(Streptomyces fradiae)의 발효에서 달성되었다 (문헌 [Baltz et al., 1997]).

특정한 중간체 (또는 그의 천연 유도체)는 스피노신 생합성을 위한 효소를 코딩하는 특정 유전자가 파괴된 S. 스피노사의 돌연변이체 균주에 의해 합성될 수 있다. 이러한 균주는 상동 재조합을 통해, 표적 유전자의 내부 단편을 함유하는 돌연변이원성 플라스미드를 통합함으로써 생성될 수 있다. 플라스미드 통합시에, 생합성 유전자의 2개의 불완전 카피가 형성되며, 이에 의해 그 유전자가 코딩하는 효소의 기능은 제거된다. 상기 효소에 대한 기질 또는 그의 일부 천연 유도체는 돌연변이체 균주의 발효시에 축적되어야 한다. 이러한 전?법은 신규한 6-데옥시에리트로마이신 유도체를 생산하는 사카로폴리스포라 에리트라에아(Saccharopolyspora erythraea)의 균주를 발생시키기는 데 효율적으로 사용되었다 (문헌 [Weber & McAlpine, 1992]).

이러한 균주는 이중 교차 상동 재조합을 통해 표적 영역을, 표적 영역 측면에 위치하는 비-돌연변이화된 서열들 사이에 신규의 단편을 함유하는 돌연변이원성 플라스미드로 교환함으로써 생성될 수 있다. 하이브리드 유전자는 활성을 소실하거나 또는 신규한 효소적 형질전환을 수행하는 변경된 기능을 가진 단백질을 생성하게 된다. 돌연변이체 균주의 발효시에 신규의 유도체가 축적될 것이다. 이러한 전략법을 사용하여 신규한 안히드로에리트로마이신 유도체를 생산하는 사카로폴리스포라 에리트라에아의 균주를 발생시켰다 (문헌 [Donadio et al., 1993]).

스피노신 생합성 유전자 및 관련 ORF를 클로닝하고, 각각의 DNA 서열을 결정하였다. 클로닝된 유전자 및 ORF는 이하에서 spnA, spnB, spnC, spnD, spnE, spnF, spnG, spnH, spnI, spnJ, spnK, spnL, spnM, spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR, spnS, ORFL15, ORFL16, ORFR1, ORFR2, S. 스피노사 gtt, S. 스피노사 gdh, S. 스피노사 epi, 및 S. 스피노사 kre로 명명된다.

사카로폴리스포라 스피노사(Saccharopolyspora spinosa)는 "스피노신"이라고 총칭되는, 9개의 밀접한 관계가 있는 화합물로 된 혼합물을 생산한다. 혼합물 내에서 스피노사드로 공지되어 있는 스피노신 A 및 D가 주요 성분이며, 중요한 곤충 표적에 대해 가장 큰 활성을 가진다. 스피노신 혼합물 내에서 두 미량 성분인 스피노신 J 및 L은 차세대 스피노신 살충제인 스피네토람에 대한 전구체이다. 본 발명의 실시양태는 3'-O-메틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 spnK에 대한 조작을 통해 스피노사드 생산 균주를 스피네토람 전구체 생산 균주로 직접적으로 전환시키는 것에 관한 것이다.

스피노사드는 주로는 대략 85% 스피노신 A와 대략 15% 스피노신 D로 구성된 것으로서, 다우 아그로사이언시즈(Dow AgroSciences: 미국 인디아나주 인디아나폴리스)에 의해 생산된 살충제이다. 스피노신 A 및 D는 미국 특허 제5,362,634호에 개시된 바와 같이, 사카로폴리스포라 스피노사의 발효에 의해 생산된 천연 생성물이다. 스피노사드는, 트레이서(TRACER)™, 썩쎄스 (SUCCESS)™, 스핀토어(SPINTOR)™, 및 컨저브(CONSERVE)™ 곤충 방제 제품을 비롯한, 다우 아그로사이언시즈로부터 상업적으로 이용가능한 여러 살충 제제들의 활성 성분이다. 예를 들어, 트레이서 제품은 약 44% (w/v) 내지 약 48% (w/v) 스피노사드, 또는 1 갤런당 약 4 파운드의 스피노사드로 구성되어 있다. 과립형 및 액체 제제 중의 스피노신 화합물의 거미류, 선충, 및 곤충, 특히, 레피도프테라, 티사노프테라(Thysanoptera), 및 디프테라 종 방제에 대한 유용성은 확립되어 있다. 스피노신 A 및 D는 또한 본원에서 스피노신 A/D로도 지칭된다.

스피네토람은 다우 아그로사이언시즈에 의해 생산된 것으로서, 5,6-디히드로-3'-에톡시 스피노신 J (주요 성분) 및 3'-에톡시 스피노신 L의 혼합물이다. 상기 혼합물은 스피노신 J 및 스피노신 L의 혼합물을 에톡실화한 후, 수소화함으로써 제조될 수 있다. 스피노신 L 및 그의 3'-에톡시 유도체 중 C-5에서의 메틸기에 의한 입체 장애로 인해, 스피노신 J 및 그의 3'-에톡시의 5,6 이중 결합이 스피노신 L 및 그의 3'-에톡시 유도체보다 훨씬 더 쉽게 수소화된다. 미국 특허 제6,001,981호를 참조한다. 스피노신 J 및 L 또한 본원에서 스피노신 J/L로도 지칭된다.

spnK가 3'-O-메틸트랜스퍼라제를 코딩한다는 것이 최근에 입증되었다. 문헌 [Kim et al., JACS , 132(9): 2901-3 (2010)]을 참조한다. 출원인들은 하류 유전자 spnL 및 spnM의 전사에는 어떤 극성 효과도 주지 않으면서, 프레임내 이중 교차 상동 재조합을 통해 스피노신 생합성 유전자 클러스터로부터 spnK를 제거할 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 이를 통해 스피노사드 생산 균주를 조작하여 스피네토람 전구체 생산 균주를 생산할 수 있다. 이는 또한 spnK 넉아웃 균주는 3'-O-메틸트랜스퍼라제 활성을 상실하였다는 것을 시사한다.

본 발명의 실시양태는 스피노사드 생산 균주에서 한 코돈 또는 다중 코돈을 제거함으로써 spnK 유전자의 프레임내 결실을 초래하는 spnK 유전자에서의 조작을 포함할 수 있다. spnK 유전자의 프레임내 결실은 spnK 유전자의 임의 부분의 임의 절단을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 프레임내 결실은 단백질 코딩 서열의 세그먼트는 제거하지만, 결실 후 적절한 리딩 프레임은 보유하는 결실을 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태는 "클린 결실"인 결실, 즉, 유전자 or로 삽입된 어떤 외인성 DNA 서열도 함유되어 있지 않은 것인 결실을 포함할 수 있다. spnK 유전자의 프레임내 결실은 1 내지 397 아미노산 중 어디에서든 일어날 수 있는 제거를 포함할 수 있다. 이는 출발 코돈의 제거를 포함할 수 있다. 이는 추가로 임의의 보존된 도메인 또는 임의의 전사 개시 영역의 제거를 포함할 수 있다.

본원에서는 종래 표기법을 사용하여 폴리뉴클레오티드 서열을 기술한다: 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 말단이 5' 말단이고; 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 방향은 5'-방향으로 언급된다. 뉴클레오티드가 초기의 RNA 전사체에 부가되는 5' → 3' 방향은 전사 방향으로 언급된다. mRNA와 같은 서열을 가지는 DNA 가닥은 "코딩 가닥"으로 언급되고; 상기 DNA로부터 전사된 mRNA와 같은 서열을 가지면서, RNA 전사체의 5' 말단에 대해 5'에 위치하는 DNA 가닥 상의 서열은 "상류 서열"로 언급되고; RNA와 같은 서열을 가지면서, 코딩 RNA 전사체의 3' 말단에 대해 3'에 위치하는 DNA 가닥 상의 서열은 "하류 서열"로 언급된다.

본 발명의 실시양태는 스피노사드 생산 균주에서 한 코돈 또는 다중 코돈을 제거함으로써 spnK 유전자의 5' 말단의 프레임내 결실을 초래하는 spnK 유전자에서의 조작을 포함할 수 있다. 이러한 코돈은 ATG 코돈의 제1, 제2, 또는 제3의 인스턴스를 포함할 수 있다.

본 발명의 추가의 실시양태는 스피노사드 생산 균주에서 한 코돈 또는 다중 코돈을 제거함으로써 spnK 유전자의 3' 말단의 프레임내 결실을 초래하는 spnK 유전자에서의 조작을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태는 유전자의 5' 말단 및 3' 말단, 둘 모두는 무손상 상태로 그대로 남겨둔 채, 한 코돈이든 또는 다중 코돈이든, spnK 코딩 영역의 프레임내 결실을 초래하는 spnK 유전자에서의 조작을 포함할 수 있다.

본 발명의 추가의 실시양태는 활성 부위 및/또는 기질 결합 부위를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다중 부위에서의 조기 전사 종결 또는 아미노산 치환(들)을 초래하는 단일 또는 다중 점 돌연변이를 포함하는 spnK 유전자에서의 조작을 포함할 수 있다. 상기 단일 또는 다중 점 돌연변이는 SAM-결합 모티프에서 발생할 수 있으며, 이를 통해 활성 부위 또는 기질 결합 부위에서는 조기 종결이 일어날 수 있다. 상기 단일 또는 다중 점 돌연변이는 또한 전반적인 SpnK 구조에 영향을 미치거나, SpnK 기능을 폐기시킬 수 있는 적절한 폴딩에 영향을 미치는 위치에 존재할 수 있다. 상기 단일 또는 다중 점 돌연변이는 기능적 다형성의 검출을 통해, 또는 돌연변이유발법에 의해 형성될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "기능적 다형성"이란 유전자에 의해 코딩된 단백질의 활성을 정질적으로 또는 정량적으로 변화시키는 (예컨대, 활성 특이성의 변화; 활성 수준의 변화) 유전자 염기쌍 서열의 변이를 의미한다. "기능적 다형성"이라는 용어는 돌연변이, 결실 및 삽입을 포함한다.

일반적으로, 관심의 대상이 되는 다형성을 검출하는 단계는 DNA를 함유하는 생물학적 샘플을 공급원으로부터 수집한 후, 관심의 대상이 되는 다형성을 함유하는 DNA가 생물학적 샘플 중에 존재하는지 여부를 측정함으로써 수행될 수 있다.

특정 돌연변이를 코딩하는 DNA가 존재하는지 여부를 측정하는 것은 적합한 검출가능한 기로 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여, 및/또는 증폭 반응, 예컨대, 중합효소 연쇄 반응 또는 리가제 연쇄 반응 (이어서, 상기 증폭 반응의 생성물은 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 많은 다른 기법에 의해 검출될 수 있다)에 의해 수행될 수 있다. 추가로, 검출 단계는 대상체가 특정 돌연변이에 대해 이형접합성인지 또는 동형접합성인지를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명을 수행하는 데 사용될 수 있는 많은 다른 올리고뉴클레오티드 프로브 검정 포맷이 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,302,204호 (발(Wahl) 등); 미국 특허 제4,358,535호 (팔코우(Falkow) 등); 미국 특허 제4,563,419호 (란키(Ranki) 등); 및 미국 특허 제4,994,373호 (스타브리아노포울로스(Stavrianopoulos) 등)를 참조한다.

임의의 적합한 수단에 의해 선택된 또는 표적 핵산 서열을 증폭시킬 수 있다. 일반적으로는 문헌 [Kwoh et al., Am. Biotechnol. Lab. 8, 14-25 (1990)]을 참조한다. 적합한 증폭 기법의 예로는 중합효소 연쇄 반응, 리가제 연쇄 반응, 가닥 치환 증폭 (일반적으로는 문헌 ([G. Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396 (1992)]; [G. Walker et al., Nucleic Acids Res. 20, 1691-1696 (1992)]) 참조), 전사 기반 증폭 (문헌 [D. Kwoh et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 86, 1173-1177 (1989)] 참조), 자립 서열 복제 (또는 "3SR") (문헌 [J. Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878 (1990)] 참조), Qβ 레플리카제 시스템 (문헌 [P. Lizardi et al., BioTechnology 6, 1197-1202 (1988)] 참조), 핵산 서열 기반 증폭 (또는 "NASBA") (문헌 [R. Lewis, Genetic Engineering News 12 (9), 1 (1992)]), 수복 연쇄 반응 (또는 "RCR") (문헌 [R. Lewis, 상기 문헌 동일] 참조), 및 부메랑 DNA 증폭 (또는 "BDA") (문헌 [R. Lewis, 상기 문헌 동일] 참조)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일반적으로는 중합효소 연쇄 반응이 바람직하다.

공지된 기법에 따라 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행할 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제4,683,195호; 제4,683,202호; 제4,800,159호; 및 제4,965,188호를 참조한다. 일반적으로, PCR은 먼저 혼성화 조건하에서 (예컨대, 열 안정성 DNA 폴리머라제의 존재하에) 핵산 샘플을, 검출하고자 하는 특이 서열의 각 가닥에 대한 한 올리고뉴클레오티드 프라이머로 처리하여 각 핵산 가닥에 상보적인 각 프라이머의 연장 생성물을 합성한 후 (여기서, 프라이머는, 각 프라이머로부터 합성된 연장 생성물이 그의 보체로부터 분리되었을 때 다른 프라이머의 연장 생성물의 합성을 위한 주형으로서의 역할을 할 수 있도록 그와 혼성화되는 특이 서열의 각 가닥에 대해 충분히 상보적이다), 검출하고자 하는 서열 또는 서열들이 존재할 경우, 상기 샘플을 변성 조건하에서 처리하여 그의 주형으로부터 프라이머 연장 생성물을 분리시키는 것을 포함한다. 이러한 단계는 원하는 정도의 증폭을 얻을 때까지 순환적으로 반복된다. 검출가능한 표지를 보유하며, 반응 생성물에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 (예컨대, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브)를 반응 생성물에 첨가한 후, 공지된 기법에 따라, 또는 겔 상에서의 직접적인 시각화에 의해 표지를 검출함으로써 증폭된 서열을 검출할 수 있다. 상기 프로브의 길이는 5 내지 500 뉴클레오티드, 바람직하게는 5 내지 250, 더욱 바람직하게는 5 내지 100, 또는 5 내지 50 핵산일 수 있다. PCR 조건을 통해 모든 대립유전자 유형이 증폭될 수 있을 때, 상기 유형은 대립유전자 특이 프로브와의 혼성화에 의해, 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해, 변성 구배 겔 상에서의 전기영동에 의해 또는 다른 기법에 의해 식별될 수 있다.

리가제 연쇄 반응 (LCR) 또한 공지된 기법에 따라 수행된다. 예컨대, 문헌 [R. Weiss, Science 254, 1292 (1991)]을 참조한다. 일반적으로, 상기 반응은, 한 쌍은 검출하고자 하는 서열 중의 한 가닥에 결합하고; 나머지 한 쌍은 검출하고자 하는 서열 중의 나머지 다른 한 가닥에 결합하는 것인, 두 쌍의 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써 수행된다. 각 쌍은 함께 그가 상응하는 가닥과 완전하게 중첩된다. 상기 반응은 먼저, 검출하고자 하는 서열의 가닥을 변성시킨 후 (예컨대, 분리시킨 후), 열 안정성 리가제의 존재하에 상기 가닥을 두 쌍의 올리고뉴클레오티드 프로브와 함께 반응시켜 올리고뉴클레오티드 프로브의 각 쌍이 함께 결찰되도록 한 후, 이어서, 반응 생성물을 분리시키고, 이어서, 서열이 원하는 정도로 증폭될 때까지 상기 과정을 순환적으로 반복시킴으로써 수행된다. 이어서, PCR에 관하여 상기 기술된 방식과 유사한 방식으로 검출될 수 있다.

예컨대, 상기와 같은 DNA 증폭 기법은, 기능적 다형성을 함유하는 DNA에는 특이적으로 결합하지만, 기능적 다형성을 함유하지 않는 DNA에는 결합하지 않는 것인 하나의 프로브, 한 쌍의 프로브, 또는 두 쌍의 프로브를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 별법으로, 프로브 또는 프로브 쌍은 기능적 다형성을 함유하고, 함유하지 않을 수는 있는 것, 이 2가지가 모두 가능하지만, 검출가능한 차이는 여기서 확인될 수 있는 것 (예를 들어, 더 짧은 생성물, 이 경우, 기능적 다형성은 결실 돌연변이이다)인 생성물 (예를 들어, 연장 생성물)을 생산 또는 증폭시키는 것인 DNA에 결합할 수 있다. 그러한 프로브는 spnK에 연결된 유전자 중, 또는 그에 결합된 공지된 DNA 서열로부터 또는 표준 기법에 따라 상기 유전자로부터 생성될 수 있는 서열로부터 표준 기법에 따라 생성될 수 있다.

본원에 기술된 검출 기법은 직접적으로 또는 간접적으로 수행될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 대립유전자 유형을 간접적으로 측정하는 다른 수단은 VNTR (가변수의 일렬 반복부)에 대해 입증되는 바, 특정 기능적 다형성에 연결된 다형성 마커를 측정하는 것을 포함한다.

분자 생물학은 핵산 및 단백질 서열 분석을 위한 매우 다양한 기법을 포함한다. 다수의 이러한 기법 및 방법들이 임상 진단 검정 및 시험의 기반을 형성한다. 이러한 기법으로는 핵산 혼성화 분석법, 제한 효소 분석법, 유전적 서열 분석법, 및 핵산 및 단백질 분리 및 정제를 포함한다 (예컨대, 문헌 [J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 Ed., Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989] 참조).

이러한 기법들은 대부분 다수의 샘플에 대해 많은 작업 (예컨대, 피펫팅, 원심분리, 및 전기영동)을 수행하는 것을 포함한다. 이는 대개 복잡하고, 많은 시간이 소비되며, 일반적으로는 고도의 정확성을 필요로 한다. 많은 기법들은 감도, 특이성, 또는 재현가능성이 부족하기 때문에 그의 적용에 있어 한계가 있다.

핵산 혼성화 분석은 일반적으로 과량의 프로브 DNA를 사용하여 상대적으로 다수의 복잡한 비-표적 핵산 중에서 극소수의 특이 표적 핵산 (DNA 또는 RNA)을 검출하는 것을 포함한다. 낮은 카피수 (즉, 10,000개 내지 100,000개)의 핵산 표적을 검출하는 데에는 샘플 중 핵산의 복잡성 감소가 도움이 된다. 표적 핵산 서열을 증폭시킴으로써 DNA 복잡성은 어느 정도 감소될 수 있다 (SDA 증폭과 관련하여 문헌 [M. A. Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, 1990, Spargo et al., 1996, Molecular & Cellular Probes] 참조). 그 이유는 표적 핵산이 증폭되면 비-표적 서열에 비하여 표적 핵산 서열의 수는 방대해지게 되고, 이로써 후속의 표적 혼성화 단계가 개선되기 때문이다.

혼성화 단계는 표적 DNA 서열과 프로브 간의 혼성화가 일어나도록 하는 설정된 최적의 조건에서 제조된 DNA 샘플이 특이 리포터 프로브와 접촉하도록 놓는 것을 포함한다. 혼성화는 다수의 포맷 중 어느 하나로 수행될 수 있다. 예를 들어, 다양한 필터 및 고체 지지체 포맷으로 다중 샘플 핵산 혼성화 분석이 수행되어 왔다 (문헌 ([Beltz et al., Methods in Enzymology, Vol. 100], [Part et al., Eds., Academic Press, New York, Chapter 19, pp. 266-308, 1985]) 참조). 소위 "도트 블롯" 혼성화라고 불리는 한 포맷은 표적 DNA를 필터에 비-공유적으로 부착시킨 후, 이어서, 방사성 동위원소 표지된 프로브(들)에 혼성화시키는 것을 포함한다. "도트 블롯" 혼성화는 여러가지 버전이 개발되었던 지난 20년간 광범위하게 사용되었었다 (문헌 [Anderson and Young, in Nucleic Acid Hybridization-A Practical Approach, Hames and Higgins, Eds., IRL Press, Washington, D.C. Chapter 4, pp. 73-111, 1985] 참조). 예를 들어, 도트 블롯 방법은 게놈 돌연변이의 다중 분석을 위해 (EPA 0228075 (나닙허스한(Nanibhushan) 등) 및 중첩 클론 검출 및 게놈 지도 구성을 위해 (미국 특허 제5,219,726호 (에반스(Evans)) 개발되어 왔다.

다중 샘플 핵산 혼성화 분석을 수행하는 추가 기법으로는 마이크로포맷형의 다중 또는 매트릭스 장치 (예컨대, DNA 칩)를 포함한다 (문헌 [M. Barinaga, 253 Science, pp. 1489, 1991; W. Brain, 10 Bio/Technology, pp. 757-758, 1992] 참조). 이 방법에서는 일반적으로 예컨대, DNA 칩의 마이크로 웰과 같이 고체 지지체의 아주 작은 특이 영역에 특이적인 DNA 서열을 부착시킨다. 이런 혼성화 포맷은 종래의 "도트 블롯" 및 "샌드위치" 혼성화 시스템의 미소규모 버전이다.

마이크로포맷형의 혼성화는 "혼성화를 통한 서열 분석" (SBH)을 수행하는 데 사용될 수 있다 (문헌 ([M. Barinaga, 253 Science, pp. 1489, 1991]; [W. Brain, 10 Bio/Technology, pp. 757-758, 1992])). SBH는 모든 가능한 n-뉴클레오티드 올리고머 (n-mer)를 사용하여 미지의 DNA 샘플 중의 n-mer를 확인한 후, 알고리즘 분석에 의해 정렬하여, DNA 서열을 얻는다 (미국 특허 제5,202,231호 (디머낵(Drmanac)) 참조).

SBH를 수행하는 데에는 두 가지 포맷이 있다. 첫번째 포맷은 지지체 상에 모든 가능한 n-mer의 어레이를 만든 후, 표적 서열과 혼성화시키는 것을 포함한다. 두번째 포맷은 표적 서열을 지지체에 부착시킨 후, 연속하여 모든 가능한 n-mer로 프로빙하는 것을 포함한다. 써던(Southern) (문헌 (영국 특허 출원 GB 8810400 (1988); [E. M. Southern et al., 13 Genomics 1008, 1992])은 첫번째 포맷을 이용하여 DNA를 분석하거나, 그의 서열을 분석하는 것을 제안하였다. 써던은 PCR에 의해 증폭된 게놈 DNA를 사용하여 공지된 단일 점 돌연변이를 확인하였다. 또한 써던은 SBH를 위해 고체 지지체 상에 올리고뉴클레오티드 어레이를 합성하는 방법을 기술하였다. 디머낵 등 (문헌 [Drmanac et al., (260 Science 1649-1652, 1993)])은 두번째 포맷을 사용하여 수개의 짧은 (116 bp) DNA 서열의 서열을 분석하였다. 표적 DNA는 막 지지체에 부착되었다 ("도트 블롯" 포맷). 이어서, 각 필터를 표지된 10-mer 및 11-mer 올리고뉴클레오티드 272개로 혼성화시켰다. 광범위한 엄중도 조건을 사용하여 각 n-mer 프로브에 특이적인 혼성화를 달성하였다. 0℃ 내지 16℃의 온도를 사용할 때, 세척 시간은 5분에서부터 밤새도록 수행하는 것과 같이 다양하였다. 대부분의 프로브는 16℃에서 3시간 동안 세척하는 것을 필요로 하였다. 필터는 혼성화 신호를 검출하기 위해 2 내지 18시간 동안 노출시켜야 했다.

일반적으로, 혼성화 이벤트를 검출 및 분석하는 데 다양한 방법이 이용될 수 있다. DNA 프로브를 표지화하는 데 사용되는 리포터 기 (형광단, 효소, 방사성 동위원소 등)에 따라, 검출 및 분석은 형광 측정 방식으로, 열량 측정 방식으로, 또는 자가방사선술에 의해 수행된다. 방출된 방사선, 예컨대, 형광 방사선 또는 입자 방출을 관찰 및 측정함으로써 혼성화 이벤트에 대한 정보를 획득할 수 있다. 심지어 검출 방법이 고유 초고감도를 가진 경우에도, 비특이적으로 결합된 물질이 배경으로 존재하기 때문에 혼성화 이벤트를 검출하는 것은 어렵다. 따라서, 혼성화 이벤트를 검출하는 것은 혼성화가 어느 정도의 특이성 및 감도로 이루어질 수 있는지에 따라 달라진다. 유전적 분석법과 관련하여, 특이성 및 감도를 증가시키기 위한 시도로 수개의 방법이 개발되었다.

유전적 분석법 중의 한 형태로는 단일 핵산 다형성 또는 ("SNP")를 입증하는 데 초점을 맞춘 분석법이 있다. SNP의 사용을 선호하는 인자는 (특히 짧은 일렬 반복부 (STR)와 비교하였을 때) 인간 게놈 중에서의 그의 높은 존재도, (단백질 구조 또는 발현 수준에 영향을 줄 수 있는) 유전자의 코딩 또는 조절 영역 내의 그의 빈번한 위치 및 한 세대에서 다음 세대로 전달되었을 때의 그의 안정성이다 (문헌 [Landegren et al., Genome Research, Vol. 8, pp. 769-776, 1998]).

SNP란 두 변이체에 존재하는 게놈 중 임의 위치로 정의되며, 가장 보편적인 변이체는 그 시점 중 99% 미만으로 존재한다. SNP를 광범위한 유전자 마커로서 사용하기 위해서는 쉽고, 빠르고, 정확하게, 그리고 비용면에서는 효율적으로 그의 유전자형을 판별할 수 있는 것이 중요하다. 현재 SNP의 유형을 판별하는 데 많은 기법들이 이용될 수 있지만 (리뷰를 위해, 문헌 [Landegren et al., Genome Research, Vol. 8, pp. 769-776, (1998)] 참조), 그러한 방법들은 모두 표적을 증폭시키는 것을 필요로 한다. 그러한 방법으로는 직접 서열 분석 (문헌 [Carothers et al., BioTechniques, Vol. 7, pp. 494-499, 1989]), 단일-가닥 구조 다형성 (문헌 [Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86, pp. 2766-2770, 1989]), 대립유전자-특이 증폭 (문헌 [Newton et al., Nucleic Acids Research, Vol. 17, pp. 2503-2516, (1989)]), 제한 분해 (문헌 [Day and Humphries, Analytical Biochemistry, Vol. 222, pp. 389-395, 1994]), 및 혼성화 검정을 포함한다. 그의 가장 기본적인 형태로 혼성화 검정은 매치된 표적 및 미스매치된 표적에 대한 짧은 올리고뉴클레오티드 리포터를 차별화시킴으로써 작용을 한다. 기본 프로토콜에 대해 개조된 많은 방법들이 개발되었다. 이러한 방법으로는 결찰 연쇄 반응 (문헌 [Wu and Wallace, Gene, Vol. 76, pp. 245-254, 1989]) 및 미니 서열 분석 (문헌 [Syvanen et al., Genomics, Vol. 8, pp. 684-692, 1990])을 포함한다. 다른 개선된 방법으로는 Taq DNA 폴리머라제의 5'-뉴클레아제 활성을 사용하는 것 (문헌 [Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, pp. 7276-7280, 1991]), 분자 비콘을 사용하는 것 (문헌 [Tyagi and Kramer, Nature Biotechnology, Vol. 14, pp. 303-308, 1996]), 열 변성 곡선을 사용하는 것 (문헌 [Howell et al., Nature Biotechnology, Vol. 17, pp. 87-88, 1999]) 및 DNA "칩"을 사용하는 것 (문헌 [Wang et al., Science, Vol. 280, pp. 1077-1082, 1998])을 포함한다.

SNP를 식별하는 데 사용될 수 있는 추가의 현상으로는 다중 표적 특이 프로브의 단일 표적에의 혼성화로부터 유도되는 핵산 상호작용 에너지 또는 염기-적층형 에너지이다 (문헌 ([R. Ornstein et al., "An Optimized Potential Function for the Calculation of Nucleic Acid Interaction Energies," Biopolymers, Vol.17, 2341-2360 (1978)]; [J. Norberg and L. Nilsson, Biophysical Journal, Vol. 74, pp. 394-402, (1998)]; 및 [J. Pieters et al., Nucleic Acids Research, Vol. 17, no. 12, pp. 4551-4565 (1989)]) 참조). 이러한 염기-적층 현상은 핵산 샘플 중 SNP가 직접 검출될 수 있도록 고감도의 T_m 차등을 제공하기 위해 본 방법에서 독특한 포맷으로 사용된다.

관련 유기체에서 핵산 서열을 식별하는 데, 또는 DNA 서열을 분석하는 데 추가의 방법이 사용되었다. 예를 들어, 미국 특허 제5,030,557호 (호간(Hogan) 등)에는 단일 가닥의 표적 핵산의 2차 및 3차 구조는 "프로브" 올리고뉴클레오티드 이외에도, 프로브와 표적 핵산 간에 나타나는 T_m이 보다 고온이 되도록 만드는 "헬퍼" 올리고뉴클레오티드의 결합에 의해 영향을 받을 수 있다고 개시되어 있다. 그러나, 상기 출원은 그의 접근법에 있어 변경되지 않은 채로 그대로 유지될 경우, 프로브가 표적에 혼성화하지 못하도록 하는 경향이 있는 것인, 자기-어닐링 RNA 가닥의 2차 및 3차 구조를 변경시키는 데에만 오직 혼성화 에너지를 사용하는 것으로 제한되어 있었다.

DNA 서열 분석과 관련하여, 예를 들어, 문헌 [K. Khrapko et al., Federation of European Biochemical Societies Letters, Vol. 256, no. 1,2, pp. 118-122 (1989)]에는 연속적으로 적층되는 혼성화를 통해 이중체는 안정화된다고 개시되어 있다. 추가로, 문헌 [J. Kieleczawa et al., Science, Vol. 258, pp. 1787-1791 (1992)]에는 연속된 스트링이 프라이밍을 안정화시키는 것으로 보이는 것인, DNA 합성을 프라이밍하기 위해 헥사머의 연속된 스트링을 사용하는 것이 개시되어 있다. 유사하게, 문헌 [L. Kotler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 90, pp. 4241-4245, (1993)]에는 헥사머 및 펜타머 올리고뉴클레오티드 모듈 사용에 의한 DNA 서열 분석 반응의 프라이밍에서의 서열 특이성이 개시되어 있다. 추가로, 문헌 [S. Parinov et al., Nucleic Acids Research, Vol. 24, no. 15, pp. 2998-3004, (1996)]에는 수동적 DNA 서열 분석용의 마이크로칩과 함께 공동으로 DNA 서열 분석을 위해 염기-적층형 올리고머를 사용하는 것이 개시되어 있다. 또한, 문헌 [G. Yershov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, pp. 4913-4918 (1996)]에는 수동적 마이크로칩 상에서의 SBH에서 염기-적층형 에너지를 적용하는 것이 개시되어 있다. 옐쇼프(Yershov)의 예에서, 10-mer DNA 프로브를 마이크로칩의 표면에 부착시키고, 추가의 짧은 프로브와 함께 표적 서열에 혼성화시켰는데, 여기서, 상기와 같은 조합이 프로브의 결합을 안정화시키는 것으로 나타났다. 상기 포맷으로, DNA 서열 분석을 위해 핵산 서열의 짧은 세그먼트를 설명할 수 있다. 옐쇼프는 추가로 보다 짧은 프로브 (예컨대, 5-mers)를 사용하였을 때, 미스매치의 불안정화 효과가 증가되었다고 언급하였다. DNA 서열 분석에 있어 상기와 같이 짧은 프로브를 사용하게 되면, 프로브/표적 혼성화 복합체의 한 특정 위치의 단 하나의 미스매치보다는 프로빙되는 서열을 따라 미스매치들의 존재를 식별할 수 있었다. 보다 긴 프로브 (예컨대, 8-mer, 10-mer, 및 13-mer 올리고)를 사용하는 것은 상기 목적에 있어서 그 기능성은 더 낮았다.

핵산 분석시 염기-적층을 사용하는 방법의 추가적인 예로는 미국 특허 제5,770,365호 (래인(Lane) 등)에 개시된 것인, 에너지를 적층화함으로써 이중체 형성을 안정화시키기 위해 결합 표적과 함께 작용하는 이중 가닥 영역 및 단일 가닥 루프를 가지는 단분자 포획 프로브를 사용하여 핵산 표적을 포획하는 방법을 포함한다.

종래 방법에 따라 부위-지정 돌연변이유발법에 의해 뉴클레오티드 서열을 알맞게 변형시킬 수 있다. 별법으로, 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하는데, 여기서, 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 디자인되는 것, 및 바람직하게는 재조합 폴리펩티드의 제조가 이루어지는 숙주 세포에서 선호되는 코돈을 선택함으로써 진행되는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 화학적 합성법에 의해 뉴클레오티드 서열을 제조할 수 있다.

신규한 스피노신은 또한 클로닝된 유전자의 돌연변이유발법에 의해, 및 스피노신-생산 유기체에서 돌연변이화된 유전자로 돌연변이화되지 않은 그의 대응물 대신 치환하는 것에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이유발법은 예를 들어, 1) KR, DH 또는 ER 도메인을 결실 또는 불활성화시켜 이들 기능 중 하나 이상을 차단시키고, 균주가 스피노신 A의 핵에는 존재하지 않는, 이중 결합, 히드록실 기, 또는 케톤 기를 가진 락톤 핵을 포함하는 스피노신을 생산할 수 있도록 하는 것 (문헌 [Donadio et al., 1993] 참조); 2) AT 도메인을 치환시켜 상이한 카르복실산이 락톤 핵에 도입되도록 하는 것 (문헌 [Ruan et al., 1997] 참조); 3) 현존 PKS 모듈에 KR, DH, 또는 ER 도메인을 부가하여 균주가 스피노신 A의 핵에는 존재하지 않는, 포화 결합, 히드록실 기, 또는 이중 결합을 가진 락톤 핵을 포함하는 스피노신을 생산할 수 있도록 하는 것; 또는 4) 완전한 PKS 모듈을 부가 또는 공제시켜 시클릭 락톤 핵이 더 많거나, 더 적은 탄소 원자수를 가지도록 하는 것을 포함할 수 있다. 하이브리드 PKS는 스피노신 PKS 로딩 도메인을 이종성 PKS 로딩으로 치환함으로써 형성될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제7,626,010호를 참조한다. 스피노신 락톤 골격에 부착된 당의 변형을 통한 스피노신은 람노스 및/또는 포로사민 모이어티의 변형 또는 상이한 데옥시 당의 부착을 포함할 수 있다는 것도 추가로 보고된 바 있다. 스페인의 살라스(Salas) 그룹은 현존하는 당 분자를 상이한 당 분자로 치환시킴으로써 신규한 폴리케티드 화합물을 제조할 수 있다고 입증하였다 (문헌 [ Rodriguez et al. J. Mol. Microbiol Biotechnol. 2000 Jul;2(3):271-6]). 하기의 실시예는 본 출원 전역에 걸쳐 기능성이 변형된 스피노신을 제조하기 위해 돌연변이유발법을 사용하는 것을 설명하는 데 도움이 된다.

스피노신 유전자 클러스터 영역으로부터의 DNA를 상동성 서열을 확인하기 위한 혼성화 프로브로서 사용할 수 있다. 따라서, 본원에서 클로닝된 DNA를 사용하여, 본원에 기술된 영역과 중첩될 뿐만 아니라, 사카로폴리스포라 스피노사의 게놈 중 인접 영역으로부터의 사전에 클로닝되지 않은 DNA를 포함하는 것인, 사카로폴리스포라 스피노사 유전자 라이브러리로부터의 추가의 플라스미드를 위치시킬 수 있다. 추가로, 본원에서 클로닝된 영역으로부터의 DNA를 사용하여 다른 유기체에서의 동일하지는 않지만 유사한 서열을 확인할 수 있다. 혼성화 프로브의 길이는 보통 약 20 염기이며, 이는 검출될 수 있도록 하기 위해 표지된다.

다양한 목적을 위해 본 발명에서는 다양한 유형의 돌연변이유발법이 사용될 수 있다. 상기 돌연변이유발법으로는 부위-지정, 무작위 점 돌연변이유발법, 상동 재조합, DNA 셔플링 또는 다른 반복적 돌연변이유발 방법, 키메라 구성, 우라실 함유 주형을 사용하는 돌연변이유발법, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발법, 포스포로티오에이트-변형 DNA 돌연변이유발법, 갭이 있는 이중체 DNA를 사용하는 돌연변이유발법 등, 또는 그의 임의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가의 적합한 방법으로는 점 미스매치 수복, 수복 결함 숙주 균주를 사용하는 돌연변이유발법, 제한-선별 및 제한-정제, 결실 돌연변이유발법, 전체 유전자 합성에 의해 돌연변이유발법, 이중-가닥 손상 수복 등을 포함한다. 키메라 구성을 포함하나, 이에 한정되지 않는 돌연변이유발법 또한 본 발명에 포함된다. 한 실시양태에서, 돌연변이유발법은 서열, 서열 비교, 물리적 특성, 결정 구조 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 천연적으로 발생된 분자, 또는 변경되거나 돌연변이화된 천연적으로 발생된 분자에 관한 공지된 정보를 지침으로 할 수 있다.

본원에서 살펴볼 수 있는 본문 및 실시예가 이러한 방법을 기술한다. 추가의 정보는 하기 문헌 내에서 인용된 하기 공개 문헌 및 참고 문헌에서 살펴볼 수 있다: 문헌 ([Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997)]; [Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996)]; [Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462(1985)]; [Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229: 1193-1201(1985)]; [Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237: 1-7 (1986)]; [Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin) (1987)]; [Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)]; [Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987)]; [Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988)]; [Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983)]; [Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987)]; [Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982)]; [Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983)]; [Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987)]; [Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985)]; [Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985)]; [Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986)]; [Sayers et al., Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988)]; [Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814]; [Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984)]; [Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987)]; [Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988)]; [Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988)]; [Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887 (1984)]; [Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985)]; [Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987)]; [Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986)]; [Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986)]; [Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984)]; [Sakamar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988)]; [Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985)]; [Grundstrom et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985)]; [Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181 (1986)]; [Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993)]; [Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001). W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994)]; 및 [I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995)]). 다수의 상기 방법에 관한 추가의 상세한 설명은, 각종 돌연변이유발 방법을 사용하여 트러블-슈팅(trouble-shooting) 문제점에 대한 유용한 제어를 기술하는 문헌 [Methods in Enzymology Volume 154]에서 살펴볼 수 있다.

"상동성" 또는 "서열 동일성"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적을 위해, 본원에서는 두 아미노산 서열의 또는 두 핵산 서열의 동일성(%)을 측정하기 위해, 서열들은 최적의 비교 목적으로 정렬되는 것으로 정의된다 (예컨대, 제2 아미노산 서열 또는 핵산 서열과의 최적의 정렬을 위해 제1 아미노산 서열 또는 핵산 서열의 서열에 갭이 도입될 수 있다). 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열에서의 위치를 제2 서열에서 중 상응하는 위치에서의 것과 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 차지한 경우, 이때 상기 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열 간의 동일성(%)은 서열이 공유하고 있는 동일한 위치의 개수에 관한 함수이다 (즉, 동일성(%) = 동일한 위치의 개수/총 위치 개수 (즉, 중첩 위치) x 100). 바람직하게, 두 서열의 길이는 동일하다.

당업자는 두 서열 간의 상동성을 측정하는 데 여러 다른 컴퓨터 프로그램이 이용될 수 있다는 사실을 인지할 것이다. 예를 들어, 두 서열 간의 서열의 비교 및 동일성(%)의 측정은 수학적 알고리즘을 사용함으로써 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 두 아미노산 서열 간의 동일성(%)은 블로섬(Blossom) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 (인터넷 상의 액셀라이스(accelrys) 웹 사이트에서, 더욱 구체적으로 http://www.accelrys.com에서 이용가능한) GCG 소프트웨어 패키지 중 GAP 프로그램 내에 도입된 니들만(Needleman) 및 운쉬(Wunsch) (문헌 [J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)]) 알고리즘을 이용하여 측정한다. 당업자는 이러한 상이한 파라미터들 모두가 약간 상이한 결과를 초래할 수 있지만, 두 서열의 전체 동일성(%)은 상이한 알고리즘을 사용하는 경우에 유의적으로는 변경되지 않는다는 것을 인지할 것이다.

또 다른 실시양태에서, 두 뉴클레오티드 서열 간의 동일성(%)은 NWSgapdna.CMP 매트릭스, 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 (인터넷 상의 액셀라이스 웹 사이트에서, 더욱 구체적으로 http://www.accelrys.com에서 이용가능한) GCG 소프트웨어 패키지 중 GAP 프로그램을 이용하여 측정한다. 또 다른 실시양태에서, 두 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열 간의 동일성(%)은 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 패널티 = 12 및 갭 패널티 = 4를 사용하여, (인터넷 상의 베가(vega) 웹 사이트에서, 더욱 구체적으로 얼라인(ALIGN) - IGH 몽펠리에(Montpellier), 또는 더욱 구체적으로 http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi에서 이용가능한) 얼라인 프로그램 (버전 2.0) 내에 도입된 E. 메이어스(E. Meyers) 및 W. 밀러(W. Miller)의 알고리즘 (문헌 [CABIOS, 4:11-17 (1989)])을 사용하여 측정한다.

본 발명의 핵산 및 단백질 서열은 추가로 예를 들어, 다른 계열의 구성원 또는 관련 서열을 확인하기 위해 공공 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열"로서 사용될 수 있다. 상기 검색은 문헌 [Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 BLASTN 및 BLASTX 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 본 발명의 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득하기 위해 BLASTN 프로그램, 스코어 = 100, 단어 길이 = 12를 이용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위해 BLASTX 프로그램, 스코어 = 50, 단어 길이 = 3을 이용하여 수행될 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, 문헌 [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402]에 기술된 바와 같이 갭트 BALST(Gapped BALST)를 사용할 수 있다. BLAST 및 갭트 BLAST 프로그램을 사용하는 경우, 각 프로그램 (예컨대, BLASTX 및 BLASTN)의 (인터넷 상의 ncbi 웹 사이트에서, 더욱 구체적으로 http://www.ncbi.nlm.nih.gov에서 이용가능한) 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태는 spnK의 정상적인 리딩 프레임을 파괴시킬 수 있는 단일 또는 다중 뉴클레오티드 염기 결실(들)을 포함할 수 있는, spnK 유전자에서의 조작을 포함할 수 있다. 상기 결실은 1 내지 1194 뉴클레오티드 중 어디에서든 포함할 수 있다. 상기 결실은 spnK의 정상적인 리딩 프레임에 영향을 미침으로써 스피네토람 전구체 생산 균주가 생산된다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 spnK의 정상적인 리딩 프레임을 파괴시키는, spnK 코딩 영역 내의 단일 또는 다중 뉴클레오티드 삽입(들)을 포함할 수 있는, spnK 유전자에서의 조작을 포함할 수 있다. 상기 삽입은 spnK의 정상적인 리딩 프레임에 영향을 미침으로써 스피네토람 전구체 생산 균주가 생산된다.

본 발명의 추가의 실시양태는 SpnK 단백질의 생산을 폐기하거나, 유의적으로 간섭하는 안티센스 또는 센스 기술을 사용하는 것을 포함하는, spnK 유전자에서의 조작을 포함할 수 있다. 당업자는 안티센스 및 공동억제 효과를 달성하는 방법에 대해 알고 있을 것이다. 예를 들어, 공동억제 저해 방법은 문헌 ([Jorgensen (Trends Biotechnol. 8 (1990), 340-344)], [Niebel et al., (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91-103)], [Flavell et al., (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 43-46)], [Palaqui and Vaucheret (Plant. Mol. Biol. 29 (1995), 149-159)], [Vaucheret et al., (Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 311-317)], [de Borne et al., (Mol. Gen. Genet. 243 (1994), 613-621)])에 기술되어 있다.

그러므로, 본 발명은 센스 또는 안티센스 표적화 서열은 억제시키고자 하는 표적 유전자에 대해 상당한 서열 동일성을 가지지만, 역위 반복부는 서열상 표적 유전자와는 관련이 없는 것인, 센스 또는 안티센스 표적화 서열에 대해 5' 또는 3'인 역위 반복부를 가지는 핵산을 유기체, 예컨대, S. 스피노사에서 발현시킴으로써 수행되는 유전자 침묵화 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 이종성 역위 반복부는 5' 및 3' 표적화 서열 측면에 위치한다.

유전자 침묵화 구성체는 최상의 유기체, 예컨대, 박테리아 세포, 진균 세포, 진핵 세포, 예컨대, 식물 세포 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 발현 벡터로는 원핵 및 진핵 벡터 (예컨대, 플라스미드, 파지미드, 또는 박테리오파지)를 포함하고, 포유동물 벡터 및 식물 벡터를 포함한다. 적합한 원핵 벡터로는 플라스미드, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 액티노마이세스(Actinomyces)에서의 DNA 조작에 통상 사용되는 것 (예를 들어, pSET152, pOJ260, pIJ101, pJV1, pSG5, pHJL302, pSAM2, pKC1250)을 포함한다. 상기 플라스미드는 문헌 [Kieser et al. ("Practical Streptomyces Genetics," 2000)]에 개시되어 있다. 다른 적합한 벡터로는 플라스미드, 예컨대, E. 콜라이(E. coli)에서 복제가능한 것 (예를 들어, pBR322, ColE1, pSC101, PACYC 184, itVX, pRSET, pBAD (인비트로겐(Invitrogen; 미국 캘리포니아주 칼즈배드) 등)을 포함할 수 있다. 상기 플라스미드는 문헌 [Sambrook (cf. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," second edition, edited by Sambrook, Fritsch, & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989))]에 개시되어 있고, 상기 벡터들 다수는 상업적으로 이용가능하다. 바실러스(Bacillus) 플라스미드로는 pC194, pC221, pT127 등을 포함하고, 이는 문헌 [Gryczan (In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), pp. 307-329)]에 개시되어 있다. 적합한 스트렙토마이세스(Streptomyces) 플라스미드로는 pli101 (문헌 [Kendall et al., J. Bacteriol. 169:4177-4183, 1987])을 포함하고, 스트렙토마이세스 박테리오파지는 예컨대, ψC31 (문헌 [Chater et al., In: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), pp. 45-54])을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 슈도모나스(Pseudomonas) 플라스미드는 문헌 ([John et al. (Rev. Infect. Dis. 8:693-704, 1986)] 및 [Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742, 1978)])에서 리뷰된다.

특정 목적에 대해 더욱 잘 맞는 유전자 조작된 유기체를 개발하고 연구하고자 하는 둘 모두를 위해 특정 유전자의 발현을 억제시키는 것은 중요한 도구가 된다. 유전자 침묵화는 관심의 대상이 되는 유전자에 상응하는 트랜스유전자를 그의 프로모터에 대해 안티센스 배향으로 (예컨대, 문헌 ([Sheehy et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:8805 8808 (1988)]; [Smith et al., Nature 334:724 726 (1988)]) 참조), 또는 그의 프로모터에 대해 센스 배향으로 (문헌 ([Napoli et al., Plant Cell 2:279 289 (1990)]; [van der Krol et al., Plant Cell 2:291 299 (1990)]; 미국 특허 제5,034,323호; 미국 특허 제5,231,020호; 및 미국 특허 제5,283,184호)) 도입하여, 상기 둘 모두를 통해 내인성 유전자 뿐만 아니라, 트랜스유전자의 발현도 감소시킴으로써 달성될 수 있다.

전사 후 유전자 침묵화는, RNA 주형으로부터 합성될 수 있고, 공정의 특이성 및 이동성에 대한 결정 요인을 나타낼 수 있는, 안티센스 RNA의 작은 (20 내지 25개의 뉴클레오티드) 단편의 축적을 통해 달성될 수 있는 것으로 보고되었다 (문헌 [Hamilton & Baulcombe, Science 286:950 952 (1999)]). 다양한 유기체에서 dsRNA (이중-가닥 RNA)를 도입하는 것은 유전자 침묵화를 유도함에 있어 중요한 요소가 된다는 것은 명백화되어 있다 (문헌 ([Fire et al., Nature 391:806 811 (1998)]; [Timmons & Fire, Nature 395:854 (1998)]; W099/32619; [Kennerdell & Carthew, Cell 95: 1017 1026 (1998)]; [Ngo et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95: 14687 14692 (1998)]; [Waterhouse et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95: 13959 13964 (1998)]; WO99/53050; Cogoni & Macino, Nature 399: 166 169 (1999)]; [Lohmann et al., Dev. Biol. 214:211 214 (1999)]; [Sanchez-Alvarado & Newmark, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 96:5049 5054 (1999)])). 박테리아에서, 리포터 트랜스유전자 및 바이러스 유전자, 둘 모두 도입된 트랜스유전자에 의해 전사 후 유전자 침묵화되기 때문에 억제되는 유전자는 내인성 박테리아 유전자일 필요는 없다 (문헌 ([English et al., Plant Cell 8: 179-188 (1996)]; [Waterhouse et al, 상기 문헌 동일]). 그러나, 상기의 모든 경우에서, 도입된 트랜스유전자와 억제되는 유전자 간에 일부 서열이 유사한 것이 바람직할 수 있다.

선행의 예에서, CaMV 35S 프로모터의 제어하에 ACC 옥시다제 유전자의 5'-UTR ("비번역 영역"), 코딩 영역 및 3'-UTR로 구성된 센스 트랜스유전자를 도입하였을 때, 토마토 식물 집단 중 15%에서 ACC 옥시다제 효소 활성이 감소하였다는 결과를 얻었다 (문헌 ([Hamilton et al., Plant J. 15:737 746 (1998)]; WO98/53083)). 그러나, 상기 ACC 옥시다제의 5'-UTR의 일부의 역위 및 센스 반복부가 구성체 중에 포함된 경우에는 식물 중 96%에서 억제가 관찰되었다 (문헌 [Hamilton et al., 상기 문헌 동일]). 추가로, 서열 중 트랜스유전자의 5'-UTR과는 관련이 없지만, 트랜스유전자의 코딩 영역과 관련이 있는 또 다른 ACC 옥시다제 유전자의 억제가 억제되었는데, 이는 임의 부분의 전사체의 이중-가닥 RNA가 분해를 위해 전체 RNA 전사체를 표적한다는 것을 제시한다. 추가로, 바이러스의 코딩 영역의 역위 반복부를 함유하는 구성체 또는 리포터 유전자 중 어느 것의 도입에 의해, 또는 표적 유전자의 코딩 영역의 센스 및 안티센스 전사체를 발현하는 식물들을 함께 교배시킴으로써 고빈도 및 고수준의 전사 후 유전자 침묵화가 관찰되었다 (문헌 [Waterhouse et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95: 13959 13964 (1998)]). 같은 식물에서 상이한 프로모터의 제어하에 센스 및 안티센스 트랜스유전자를 발현시킴으로써 유사한 결과를 얻었다 (문헌 [Chuang & Meyerowitz, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 97:4985 4990 (2000)]).

본 발명의 다른 실시양태는 유전자 침묵화를 포함하는 spnK 유전자에서의 조작을 포함할 수 있다. "유전자 침묵화"라는 어구는 특이 유전자 생성물의 발현이 감소되거나, 약화되도록 하는 방법을 의미한다. 다양한 경로에 의해 유전자 침묵화가 이루어질 수 있다. 달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 본원에서 사용되는 바, 유전자 침묵화란, 그에 의해 소형 억제성 RNA (siRNA)가 숙주 단백질과 함께 작용하게 되는, 비록 부분적으로 특징이 규명된 것이지만 정의된 경로인 RNA 간섭 (RNAi) (예컨대, RNA 유도성 침묵화 복합체, RISC)을 통해 서열에 의존하는 방식으로 메신저 RNA (mRNA)가 분해되도록 함으로써 유전자 생성물 발현을 감소시키는 것을 의미한다. 유전자 침묵화 수준은 노던 블롯 분석법, B-DNA 기법, 전사-감도 리포터 구성체, 발현 프로파일링 (예컨대, DNA 칩), 및 관련 기술에 의해 전사체 수준 측정을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 수단에 의해 측정될 수 있다. 별법으로, 침묵화 수준은 특이 유전자에 의해 코딩되는 단백질 수준을 평가함으로써 측정될 수 있다. 이는 웨스턴 분석법을 비롯한 다수의 연구를 수행하거나, 예컨대, 형광 특성 (예컨대, GFP) 또는 효소적 활성 (예컨대, 알칼리성 포스파타제)을 가지는 리포터 단백질의 발현 수준을 측정함으로써, 또는 수개의 다른 방법에 의해 달성될 수 있다.

추가의 실시양태는 spnK 유전자를 무능력화시키고, 스피노신 J/L이 생산되도록 하는 것인 spnK 유전자의 활성 부위 또는 기질 결합 부위에서의 단일 또는 다중 아미노산 치환(들)을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 펩티드의 활성에는 과도한 부작용은 일으키지 않으면서 그의 아미노산 서열을 최소로 결실 또는 치환시킬 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 상기 결실 또는 치환을 포함하는 단백질 및 펩티드가 본 발명의 추가 측면이 된다. 아미노산의 치환 또는 치환들을 포함하는 펩티드에서, 펩티드 서열 중 하나 이상의 아미노산이 하나 이상의 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있으며, 여기서, 상기 치환은 상기 서열의 기능에 어떤 영향도 미치지 않는다. 상기 변이는 물리적인 특징, 예컨대, 전하 밀도, 소수성/친수성, 크기 및 배열에 있어서 아미노산 간의 공지된 유사성을 통해 유도될 수 있으며, 이로써, 아미노산은 기능적 특성이 본질적으로 동일한 다른 아미노산으로 치환된다. 예를 들어, Ala는 Val 또는 Ser으로 치환될 수 있고; Val은 Ala, Leu, Met, 또는 Ile으로, 바람직하게는 Ala 또는 Leu으로 치환될 수 있고; Leu은 Ala, Val 또는 Ile으로, 바람직하게는 Val 또는 Ile으로 치환될 수 있고; Gly는 Pro 또는 Cys으로, 바람직하게는 Pro으로 치환될 수 있고; Pro은 Gly, Cys, Ser, 또는 Met으로, 바람직하게는 Gly, Cys, 또는 Ser으로 치환될 수 있고; Cys은 Gly, Pro, Ser, 또는 Met으로, 바람직하게는 Pro 또는 Met으로 치환될 수 있고; Met은 Pro 또는 Cys으로, 바람직하게는 Cys으로 치환될 수 있고; His은 Phe 또는 Gln으로, 바람직하게는 Phe로 치환될 수 있고; Phe은 His, Tyr, 또는 Trp으로, 바람직하게는 His 또는 Tyr으로 치환될 수 있고; Tyr은 His, Phe 또는 Trp으로, 바람직하게는 Phe 또는 Trp으로 치환될 수 있고; Trp은 Phe 또는 Tyr으로, 바람직하게는 Tyr으로 치환될 수 있고; Asn은 Gln 또는 Ser으로, 바람직하게는 Gln으로 치환될 수 있고; Gln은 His, Lys, Glu, Asn, 또는 Ser으로, 바람직하게는 Asn 또는 Ser으로 치환될 수 있고; Ser은 Gln, Thr, Pro, Cys 또는 Ala으로 치환될 수 있고; Thr은 Gln 또는 Ser으로, 바람직하게는 Ser으로 치환될 수 있고; Lys은 Gln 또는 Arg으로 치환될 수 있고; Arg은 Lys, Asp 또는 Glu으로, 바람직하게는 Lys 또는 Asp으로 치환될 수 있고; Asp은 Lys, Arg, 또는 Glu으로, 바람직하게는 Arg 또는 Glu으로 치환될 수 있고; Glu은 Arg 또는 Asp로, 바람직하게는 Asp로 치환될 수 있다. 일단 변이되고 나면, 그러한 변이를 통상적으로 스크리닝함으로써 그가 작용에 미치는 효과를 측정할 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태는 리보솜 결합 부위 (RBS)의 조작을 포함하는, spnK 유전자에서의 조작을 포함할 수 있다. spnK 코딩 서열의 상류에 위치하는 (샤인-달가르노로 표지된) 리보솜 결합 부위는 spnK 유전자의 파괴를 통해 스피네토람 전구체 생산 균주가 생산될 수 있도록 조작될 수 있다.

본 발명의 추가의 실시양태는 spnK 유전자에 대한 다중의 신호전달 경로에 영향을 미치는 효소적 억제를 통해 스피네토람 생산 균주가 생산될 수 있도록 하는 것을 포함할 수 있다. 표적과 관련된 효소적 활성을 검출하는 방법은 효소-결합 검정법을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 spnK 유전자를 위해 코딩되는 프로모터 서열의 단절을 포함한다. 그러한 단절은 절단, 결실, 점 돌연변이, 및 삽입을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의 유형의 조작을 통해 이루어질 수 있다. 상기 조작은 프레임내 또는 프레임 밖에서 이루어질 수 있다. 상기 조작을 통해 스피네토람 생산 균주가 생산된다.

본 발명은 하기의 비제한적인 실시예에서 더욱 상세하게 설명된다.

실시예 1: spnK 내의 점 돌연변이 생성

사카로폴리스포라 스피노사 A 및 D 생산 균주의 무작위 돌연변이유발법을 통해 spnK 유전자 내에 점 돌연변이를 생성하였다 (문헌 [Kieser et al., 2000]). spnK 유전자의 PCR 증폭에 이어 DNA 서열 분석을 실시함으로써 스피노신 A 및 D 대신 스피노신 J 및 L을 생산하는 돌연변이체 균주의 특징을 규명하였다. 페일세이프 PCR 시스템(FailSafe PCR System) (에피센터 바이오테크놀로지스(Epicentre Biotechnologies; 미국 위스콘신주 매디슨))을 사용하여 spnKF

및 spnKR

로 spnK 유전자를 PCR 증폭시켰다. 모바이오 울트라클린 PCR 클린-업 DNA 정제용 키트(MoBio Ultraclean PCR Clean-up DNA 정제 Kit) (모바이오 라보라토리즈(MoBio Laboratories; 미국 캘리포니아주 솔라나 비치)를 사용하여 생성된 PCR 생성물을 정제하고, T4 DNA 리가제 (인비트로겐 라이프 테크놀로지스(Invitrogen Life Technologies; 미국 캘리포니아주 칼즈배드)를 사용하여 TA 클로닝 벡터 내로 클로닝하였다. PCR 생성물을 함유하는 것으로 추정된 박테리아 콜로니를 단리시키고, 제한 효소 분해를 통해 확인하였다. CEQ™ DTCS-퀵 스타트 키트(CEQ™ DTCS-Quick Start Kit) (베크만-쿨터(Beckman-Coulter; 미국 캘리포니아주 팔로알토))를 사용하여 제조사의 프로토콜에 의해 기술된 바와 같이 양성 플라스미드 클론의 DNA 서열 분석을 수행하였다. 제조사의 프로토콜에 의해 기술된 바와 같이 퍼포마 DTR 겔 여과 카트리지(Performa DTR Gel Filtration Cartridges) (에지 바이오시스템즈(Edge BioSystems; 미국 메릴랜드주 게이더스버그))를 사용하여 반응물을 정제하였다. 베크만-쿨터 CEQ™ 2000 XL DNA 분석 시스템(Beckman-Coulter CEQ™ 2000 XL DNA Analysis System) 상에서 서열 반응물을 분석하고, 시퀀서(SEQUENCHER) (진 코드스 코포레이션(Gene Codes Corporation; 미국 미시간주 앤아버)를 사용하여 뉴클레오티드의 특징을 규명하였다. 서열 분석을 통해 spnK 유전자 서열내 점 돌연변이의 위치를 확인하였다. 생성된 점 돌연변이는 표 1에 열거되어 있고, 도 1에는 음영 표시되어 있다.

번즈(Burns) 등 (WO 2003070908)에 의해 기술된 조건하에서 사카로폴리스포라 스피노사의 spnK 돌연변이체 균주의 발효를 수행할 수 있었다. 발츠(Baltz) 등 (미국 특허 제6,143,526호)에 의해 기술된 조건하에 스피노신 인자의 존재에 대해 발효 브로쓰를 분석할 수 있었다. 상청액 중 스피노신 인자의 존재를 확인하기 위해, 발효 브로쓰의 추출물을 스피드백(SpeedVac) 중에서 밤새도록 건조시킨 후, 잔류물을 물과 에테르 사이에 나누어 담았다. N₂ 스트림하에서 증발시킴으로써 에테르 층을 건조시켰다. 이어서, 샘플을 아세토-d₆ 중에 용해시키고, 1D 양성자 NMR 획득을 위해 NMR 튜브로 옮겨 놓았다. NMR 프로파일을 스피노신 표준의 것과 비교하였다. NMR 결과는 J/L이 A/D에 비하여 과량으로 존재한다는 것을 나타내었다. 균주를 발효시킨 결과, 스피노신 A 및 D를 함유하는 스피노신 혼합물을 생산하는 방제 사카로폴리스포라 스피노사에 비해, 스피노신 J 및 L를 함유하는 스피노신 혼합물이 생산되었다.

실시예 2: spnK 결실 돌연변이의 생성

spnK 프레임내 결실 벡터의 구성

스피노신 A 및 D 생산 균주의 게놈 DNA를 사용하여 1,595 bp DNA 단편을 PCR 증폭시켰다 (문헌 [Hopwood et al., 1985]). 상기 단편은 spnK의 출발 코돈을 포괄하였고, spnJ의 5' 말단없이 spnJ 코딩 영역을 함유하였다 (도 2). 페일세이프 PCR 키트 (에피센터 바이오테크놀로지스; 미국 위스콘신주 매디슨), 및 정방향 프라이머 #1

및 역방향 프라이머 #1

를 사용하여 PCR 반응을 완료하였다.

제2 PCR 반응을 완료하였을 때, 1,951 bp DNA 단편이 생산되었다; 이 단편은 spnK의 3' 말단, 무손상 spnL 및 spnM의 5' 말단을 함유하였다 (도 2). 페일세이프 PCR 키트, 및 정방향 프라이머 #2

및 역방향 프라이머 #2

를 사용하여 PCR 반응을 완료하였다. 제조사의 설명서에 따라 QIA퀵 PCR 정제용 키트(QIAquick PCR 정제 Kit) (퀴아젠: 미국 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 PCR 생성물을 정제하였다.

EcoRI 및 XbaI로 1,595 bp PCR 단편을 분해하였다. XbaI 및 HindIII으로 1,951 bp PCR 단편을 분해하였다. 제한 효소 분해 완료시, QIA퀵 PCR 정제용 키트를 사용하여 단편을 정제하였다. 패스트링크 DNA 결찰용 키트(FastLink DNA Ligation Kit) (에피센터: 미국 위스콘신주 매디슨)를 사용하여 분해된 단편을 플라스미드 pOJ260의 상응하는 EcoRI 및 HindIII 제한 부위에 결찰시키고, E. 콜라이 TOP 10 적격 세포 (인비트로겐; 미국 캘리포니아주 칼즈배드) 내로 형질전환시켰다. 제한 효소 분해 및 DNA 서열 분석을 통해 콜로니를 원하는 결찰 생성물에 대해 선별하고 스크리닝하였다. 양성 클론을 확인하고, 선별된 클론은 사카로폴리스포라 스피노사 내의 다음 spnK의 프레임내 결실을 위해 사용하였다. 플라스미드 pOJ260 내의, 생성된 결실된 spnK 유전자 단편의 서열은 하기 표 2에 제시되어 있다.

그러므로, spnK 결실은 하기 서열을 포함할 것이다:

spnK 결실 벡터의 사카로폴리스포라 스피노사 내로의 접합

spnK 프레임내 결실 구성체를 E. 콜라이 접합 공여체 균주 ET12567/pUZ8002 내로 형질전환시켰다. 양성적으로 형질전환된 균주를 확인하고, 이를 사용하여 (적절한 항생제를 함유하는) 루리아 브로쓰(Luria Broth) 배지 플라스크에 접종하고 225 rpm에서 진탕시키면서 37℃에서 밤새도록 성장시켰다. 플라스미드 DNA를 단리시키고, E. 콜라이 공여체 균주로부터 제한 효소 분해를 완료함으로써 플라스미드 아이덴티티를 확인하였다. 상기 클론의 정확도가 정확하다는 것을 확인하였을 때, 추가 사용을 위해 남은 배양물을 20% 글리세롤 중에서 -80℃하에 보관하였다.

문헌 [Matsushima et al., (1994)]에 기술된 방법에 따라 spnK 프레임내 결실 구성체를 보유하는 E. 콜라이 세포를 사카로폴리스포라 스피노사와 접합시켰다. spnK 프레임내 결실 구성체의 벡터 골격 상에 아프라마이신 내성 유전자 마커가 존재하는 것에 기인하여, 아프라마이신에 대해 내성을 띠는 추정의 트랜스접합체를 선택하였다.

통합 부위를 결정하기 위한 트랜스접합체의 확인 및 spnK 영역의 증폭

R6 배지 상에서 성장시킨 단일의 일차 트랜스접합체를 50 ㎍/mL의 아프라마이신 및 25 ㎍/mL의 날리딕스산으로 보충된 뇌 심장 삼출액 (BHI) 아가 플레이트 상으로 옮겨 놓고 내성 표현형을 확인하였다. 트랜스접합체의 균사체를 BHI 플레이트로부터, 50 ㎍/mL의 아프라마이신으로 보충된 트립틱 소이 브로쓰(TSB: Tryptic Soy Broth) 배지로 접종하였다. 72시간 동안 250 rpm에서 진탕시키면서 배양물을 29℃에서 인큐베이션시켰다. 72시간 동안의 인큐베이션 후, 균사체를 수거하고, 에지 바이오시스템즈 게놈 DNA 단리용 키트(Edge BioSystem's Genomic DNA Isolation Kit)를 사용하여 제조사 (에지 바이오시스템즈; 미국 메릴랜드주 게이더스버그)의 설명서에 따라 게놈 DNA를 단리시켰다. SpnK Del 발리데이션 1포워드(SpnK Del Validation 1Forward)

및 SpnK Del 발리데이션 1리버스(SpnK Del Validation 1Reverse)

프라이머와 함께, 트랜스접합체로부터 단리된 게놈 DNA를 주형으로 사용함으로써 PCR을 수행하였다. 추가로, 사카로폴리스포라 스피노사 모체 방제 균주로부터 단리된 게놈 DNA, 및 spnK 프레임내 결실 구성체의 플라스미드 DNA를 방제 PCR 반응을 위한 주형으로서 사용하였다. PCR 증폭 결과물을 서열 분석하였다. spnK 프레임내 결실 구성체가 단일 교차 상동 재조합을 통해 spnLM 영역 내로 통합되었다는 것이 서열 분석 데이터를 통해 밝혀졌다 (도 3). spnLM 영역에의 통합으로 염색체 내에서 벡터 골격 pOJ260의 상류에 spnJ, spnK, spnL의 무손상 카피, 절단된 spnM 및 벡터 골격의 하류에 절단된 spnJ, 및 무손상 spnL 및 spnM이 생성되었다.

이중 교차 spnK 프레임내 결실 돌연변이체의 단리

아프라마이신에 대해 내성을 띠는 단일 교차 돌연변이체를 아프라마이신의 부재하에 BHI 아가 플레이트 상에 접종하고, 29℃에서 14일 동안 인큐베이션시켰다. 문헌 [Hopwood et al., (1985)]에 따라 플레이트로부터 포자를 수거하고, 20% 글리세롤 중에서 -80℃하에 보관하였다. 포자를 아프라마이신을 함유하지 않는 10개의 신규의 BHI 아가 플레이트 상에 접종하고, 플레이트를 29℃에서 14일 동안 인큐베이션시켰다. 상기 단계를 3회에 걸쳐 반복하였다. 20% 글리세롤을 사용하여 포자 시료를 10^-6으로 희석시키고, 희석된 포자를 10개의 BHI 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 단일의 콜로니가 발생될 수 있도록 플레이트를 29℃에서 10일 동안 인큐베이션시켰다. 아프라마이신을 함유하는 신규의 BHI 아가 플레이트 및 그를 함유하지 않는 신규의 BHI 아가 플레이트 상에 개개의 콜로니를 패치시켰다. 균사체가 발생될 수 있도록 모든 플레이트를 29℃에서 10일 동안 인큐베이션시켰다. 50 ㎍/mL의 아프라마이신을 함유하는 BHI 아가 플레이트 상에서 성장하지 않는 콜로니를 이중 교차 돌연변이체의 후보물질로서 확인하고, PCR을 사용하여 입증하기 위해 이를 선택하였다.

이중 교차 돌연변이체의 확인 및 입증

PCR을 통해 이중 교차 돌연변이체를 확인하였다. 프라이머, SpnK Del 발리데이션 1포워드 (서열 7) 및 SpnK Del 발리데이션 1리버스(서열 8)을 spnL 및 spnJ 내에서 결합할 수 있도록 디자인하고, 페일세이프 PCR 시스템을 사용하는 PCR 증폭을 위해, spnJ 유전자를 사용하였다. PCR 생성물의 크기는 아가로스 겔 전기영동을 통해 측정하였다. spnK 유전자를 결실시키는 이중 교차 돌연변이체를 확인하고 (도 4), PCR 생성물의 크기에 기초하여 선별하였다. PCR 단편의 크기 및 DNA 서열이 spnK 유전자의 프레임내 결실을 나타낸다.

진탕 플라스크 발효를 통한 이중 교차 돌연변이체의 스피노신 생산

번즈 등 (WO 2003070908)에 의해 기술된 조건하에서 이중 교차 돌연변이체의 발효를 수행할 수 있었다. 발츠 등 (미국 특허 제6,143,526호)에 의해 기술된 조건하에 스피노신 인자의 존재에 대해 발효 브로쓰를 분석할 수 있었다. 상청액 중 스피노신 인자의 존재를 확인하기 위해, 발효 브로쓰의 추출물을 스피드백 중에서 밤새도록 건조시킨 후, 잔류물을 물과 에테르 사이에 나누어 담았다. N₂ 스트림하에서 증발시킴으로써 에테르 층을 건조시켰다. 이어서, 샘플을 아세토-d₆ 중에 용해시키고, 1D 양성자 NMR 획득을 위해 NMR 튜브로 옮겨 놓았다. NMR 프로파일을 스피노신 표준의 것과 비교하였다. 이중 교차 돌연변이체의 발효를 통해 스피노신 J 및 L이 생산되었다. NMR 결과는 J/L이 A/D에 비하여 과량으로 존재한다는 것을 나타내었다.

실시예 3: spnK 삽입 돌연변이의 생성

spnK 유전자내 삽입 돌연변이를 통해 사카로폴리스포라 스피노사 돌연변이체를 생성하였다. spnK 유전자내 프레임내 아프라마이신 내성 유전자 카세트 (aac(3)IV), 및 서열 측면에서 위치하는 단절되지 않은 상류 및 하류 spnJ 및 spnL 유전자를 함유하는 DNA 단편을 구성하였다 (도 5). aac (3)IV 유전자 단편을 플라스미드 내로 클로닝하고, E. 콜라이 접합 공여체 균주 ET12567/pUZ8002 내로 형질전환시켰다. 양성적으로 형질전환된 균주를 확인하고, 이를 사용하여 (적절한 항생제를 함유하는) 루리아 브로쓰 배지 플라스크에 접종하고 225 rpm에서 진탕시키면서 37℃에서 밤새도록 성장시켰다. 플라스미드 DNA를 단리시키고, 제한 효소 분해를 완료함으로써 플라스미드 아이덴티티를 확인하였다. 아프라마이신 삽입 카세트를 함유하는 플라스미드가 정확하다는 것을 확인하였을 때, 남은 배양물을 20% 글리세롤 중에서 -80℃하에 보관하였다.

문헌 [Matsushima et al., (1994)]에 기술된 방법에 따라 E. 콜라이 공여체 세포를 사카로폴리스포라 스피노사와 접합시켰다. E. 콜라이로부터 아프라마이신 유전자 카세트를 옮기고, 이어서, 상기 플라스미드를 사카로폴리스포라 스피노사의 게놈 내로 통합시켜 아프라마이신에 대한 내성을 이용함으로써 선택하였다.

단일의 일차 트랜스접합체를 R6 배지 상에서 성장시키고, 50 ㎍/mL의 아프라마이신 및 25 ㎍/mL의 날리딕스산으로 보충된 뇌 심장 삼출액 (BHI) 아가 플레이트 상으로 옮겨 놓고 내성 표현형을 확인하였다. 트랜스접합체의 균사체를 BHI 플레이트로부터, 50 ㎍/mL의 아프라마이신으로 보충된 트립틱 소이 브로쓰 (TSB) 배지로 접종하였다. 72시간 동안 250 rpm에서 진탕시키면서 배양물을 29℃에서 인큐베이션시켰다. 72시간 동안의 인큐베이션 후, 균사체를 수거하고, 에지 바이오시스템즈 게놈 DNA 단리용 키트를 사용하여 제조사 (에지 바이오시스템즈; 미국 메릴랜드주 게이더스버그)의 설명서에 따라 게놈 DNA를 단리시켰다. 트랜스접합체로부터 단리된 게놈 DNA를 주형으로 사용함으로써 PCR을 수행하였다. TOPO® 클로닝 테크놀로지(TOPO® Cloning Technology: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)를 사용하여 원하는 PCR 생성물을 플라스미드 내로 클로닝하였다. TOPO® 벡터내에 클로닝된, PCR 생성물을 함유하는 것으로 추정된 박테리아 콜로니를 단리시키고, 제한 효소 분해를 통해 확인하였다. 양성 플라스미드 클론의 DNA 서열 분석을 수행하였다. 아프라마이신 삽입 카세트가 이중 교차 상동 재조합을 통해 사카로폴리스포라 스피노사의 spnK 유전자 내에 통합되었다는 것이 서열 분석 결과를 통해 밝혀졌다. 상동 재조합을 통해 생성된 삽입은 spnK의 전사를 파괴시켜 spnK 유전자의 기능을 폐기시켰다.

번즈 등 (WO 2003070908)에 의해 기술된 조건하에서 사카로폴리스포라 스피노사의 spnK 돌연변이체 균주의 발효를 수행할 수 있었다. 발츠 등 (미국 특허 제6,143,526호)에 의해 기술된 조건하에 스피노신 인자의 존재에 대해 발효 브로쓰를 분석할 수 있었다. 상청액 중 스피노신 인자의 존재를 확인하기 위해, 발효 브로쓰의 추출물을 스피드백 중에서 밤새도록 건조시킨 후, 잔류물을 물과 에테르 사이에 나누어 담았다. N₂ 스트림하에서 증발시킴으로써 에테르 층을 건조시켰다. 이어서, 샘플을 아세토-d₆ 중에 용해시키고, 1D 양성자 NMR 획득을 위해 NMR 튜브로 옮겨 놓았다. NMR 프로파일을 스피노신 표준의 것과 비교하였다. NMR 결과는 J/L이 A/D에 비하여 과량으로 존재한다는 것을 나타내었다. 삽입 돌연변이를 함유하는 균주를 발효시킨 결과, 스피노신 A 및 D를 함유하는 스피노신 혼합물을 생산하는 방제 사카로폴리스포라 스피노사에 비해, 스피노신 J 및 L를 함유하는 스피노신 혼합물이 생산되었다.

실시예 4: spnK 샤인 - 달가르노 서열의 파괴

spnK의 상류에 위치하는 샤인-달가르노 서열 (도 6)을 파괴시킨 결과, spnK mRNA의 번역이 감소하였다. 실시예 2에 기술된 것과 유사한 프로토콜을 사용하여 결실된 spnK 샤인-달가르노 서열을 함유하는 사카로폴리스포라 스피노사의 돌연변이체 균주를 생산하였다. spnK 샤인-달가르노 서열의 상류 및 하류에 위치하는 1,500 bp 이상의 두 단편을 PCR 증폭시켰다. 이들 단편은 하기 서열 5'-AGGAGCTC-3'을 함유하지 않았다. 예컨대, 사카로폴리스포라 스피노사와의 접합을 위해 사용될 수 있는 pOJ260와 같은 플라스미드 내에서 두 단편을 함께 결찰시켰다.

원하는 플라스미드를 E. 콜라이 접합 공여체 균주 ET12567/pUZ8002 내로 형질전환시켰다. 제한 효소 분해를 통해 양성적으로 형질전환된 균주를 확인하였다. 플라스미드를 함유하는 E. 콜라이 균주가 정확하다는 것을 확인하였을 때, 문헌 [Matsushima et al., (1994)]에 기술된 방법에 따라 E. 콜라이 세포를 사카로폴리스포라 스피노사와 접합시켰다. E. 콜라이 공여체 세포로부터 플라스미드를 옮기고, 이어서, 상기 플라스미드를 사카로폴리스포라 스피노사의 게놈 내로 통합시켜 항생제에 대한 내성을 이용함으로써 선택하였다.

사카로폴리스포라 스피노사의 염색체내 플라스미드의 통합에 대한 특징은 특이 게놈 DNA 영역의 PCR 증폭을 통해 분자적으로 규명하였다. 간략하면, 게놈 DNA를 단리시키고, spnK 샤인-달가르노 서열을 함유하는 삽입체를 PCR 증폭시키고, 클로닝하고, 서열 분석하였다. spnK 샤인-달가르노 결실 구성체가 단일 교차 상동 재조합을 통해 spnJK 영역 내로 통합되었다는 것이 서열 분석 데이터를 통해 밝혀졌다.

실시예 2에 기술된 것과 유사한 프로토콜을 사용하여 파괴된 spnK 샤인-달가르노 서열을 함유하는 이중 교차 돌연변이체를 수득하였다. 벡터 골격 상에 존재하는 마커에 의해 선별이 되는 것인 항생체를 함유하는 BHI 아가 플레이트 상에서 성장할 수 없는 콜로니를 이중 교차 돌연변이체의 후보물질로서 확인하고, PCR을 사용하여 입증하기 위해 이를 선택하였다. spnK 및 spnJ 유전자 내에 결합하도록 디자인된 프라이머를 사용하였다. TOPO® 클로닝 테크놀로지(미국 캘리포니아주 칼즈배드)를 사용하여 생성된 PCR 생성물을 플라스미드 내로 서브-클로닝하였다. TOPO® 벡터내에 클로닝된, PCR 생성물을 함유하는 박테리아 콜로니를 단리시키고, 제한 효소 분해를 통해 확인하였다. 양성 플라스미드 클론의 DNA 서열 분석을 수행하였다. spnK 샤인-달가르노 뉴클레오티드 서열이 사카로폴리스포라 스피노사의 게놈으로부터 파괴되었다는 것이 서열 분석 결과를 통해 밝혀졌다. 번즈 등 (WO 2003070908)에 의해 기술된 조건하에서 사카로폴리스포라 스피노사의 spnK 샤인-달가르노 돌연변이체 균주의 발효를 수행할 수 있었다. 발츠 등 (미국 특허 제6,143,526호)에 의해 기술된 조건하에 스피노신 인자의 존재에 대해 발효 브로쓰를 분석할 수 있었다. 상청액 중 스피노신 인자의 존재를 확인하기 위해, 발효 브로쓰의 추출물을 스피드백 중에서 밤새도록 건조시킨 후, 잔류물을 물과 에테르 사이에 나누어 담았다. N₂ 스트림하에서 증발시킴으로써 에테르 층을 건조시켰다. 이어서, 샘플을 아세토-d₆ 중에 용해시키고, 1D 양성자 NMR 획득을 위해 NMR 튜브로 옮겨 놓았다. NMR 결과는 J/L이 A/D에 비하여 과량으로 존재한다는 것을 나타내었다. NMR 프로파일을 스피노신 표준의 것과 비교하였다. 결실된 spnK 샤인-달가르노 서열 돌연변이를 함유하는 균주를 발효시킨 결과, 스피노신 A 및 D를 함유하는 스피노신 혼합물을 생산하는 방제 사카로폴리스포라 스피노사에 비해, 스피노신 J 및 L를 함유하는 스피노신 혼합물이 생산되었다.

실시예 5: spnK 의 안티 -센스 RNA 하향 조절을 통한 3'-O- 메틸트랜스퍼라제 발현 감소

spnK 코딩 서열에 상보적인 asRNA (안티-센스 RNA)가 제조될 수 있도록 플라스미드를 디자인하였다. 그 결과, spnK 유전자 발현의 하향 조절을 통해 spnK 활성이 감소되었다.

spnK 코딩 서열을 PCR 증폭시키고, 사카로폴리스포라 스피노사의 염색체 내로의 통합을 위해 플라스미드, 예컨대, pOJ260 내로 클로닝하였다. 별법으로, 사카로폴리스포라 스피노사의 세포질내에서 안정적으로 유지되고 복제되는 플라스미드 내로 spnK 코딩 서열을 클로닝할 수 있었다. 강력한 구성적 박테리아 프로모터를 사용하여 spnK의 안티-센스 가닥을 발현함으로써 spnK asRNA를 생산할 수 있도록 생성된 플라스미드를 구성하였다. 상기 spnK asRNA 플라스미드로 E. 콜라이 접합 공여체 균주 ET12567/pUZ8002 내로 형질전환시켰다. 양성적으로 형질전환된 균주를 제한 효소 분해를 통해 확인하였다. 플라스미드를 함유하는 E. 콜라이 균주가 정확하다는 것을 확인하였을 때, 문헌 [Matsushima et al., (1994)]에 기술된 방법에 따라 E. 콜라이 공여체 세포로부터의 플라스미드를 사카로폴리스포라 스피노사와 접합시켰다. E. 콜라이로부터 사카로폴리스포라 스피노사로 spnK asRNA 플라스미드를 옮기고, 항생제에 대한 내성이 spnK asRNA 플라스미드 상의 것에 코딩되는 것인 항생제에 대한 내성을 이용함으로써 선택하였다. 게놈 DNA를 트랜스접합체로부터 단리시키고, 이를 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용함으로써 플라스미드의 존재를 확인하였다.

번즈 등 (WO 2003070908)에 의해 기술된 조건하에서 spnK asRNA 플라스미드를 함유하는 사카로폴리스포라 스피노사의 균주의 발효를 수행할 수 있었다. 발츠 등 (미국 특허 제6,143,526호)에 의해 기술된 조건하에 스피노신 인자의 존재에 대해 발효 브로쓰를 분석할 수 있었다. 상청액 중 스피노신 인자의 존재를 확인하기 위해, 발효 브로쓰의 추출물을 스피드백 중에서 밤새도록 건조시킨 후, 잔류물을 물과 에테르 사이에 나누어 담았다. N₂ 스트림하에서 증발시킴으로써 에테르 층을 건조시켰다. 이어서, 샘플을 아세토-d₆ 중에 용해시키고, 1D 양성자 NMR 획득을 위해 NMR 튜브로 옮겨 놓았다. NMR 결과는 J/L이 A/D에 비하여 과량으로 존재한다는 것을 나타내었다. NMR 프로파일을 스피노신 표준의 것과 비교하였다. spnK asRNA 플라스미드를 함유하는 균주를 발효시킨 결과, 스피노신 A 및 D를 함유하는 스피노신 혼합물을 생산하는 방제 사카로폴리스포라 스피노사에 비해, 스피노신 J 및 L를 함유하는 스피노신 혼합물이 생산되었다.

실시예 6: 추가의 spnK 결실 돌연변이 생성

실시예 6.1 spnK 5' 말단 결실 벡터의 구성

스피노신 A 및 D 생산 균주의 게놈 DNA를 PCR 증폭시켜 2개의 DNA 단편을 수득하였다 (문헌 [Hopwood et al., 1985]). 제1 증폭된 단편의 길이는 약 1,500 bp이고, ATG 출발 코돈의 바로 상류에 위치하였다. 제2 증폭된 단편의 길이는 약 1,500 bp이고, spnK 염기쌍 61의 바로 하류에 위치하였다. 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 PCR 증폭을 완료하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하여 제한 효소 결합 서열을 혼입시켰다. 프라이머에 의해 혼입된 결합 서열을 절단하는 제한 효소를 사용하여 생성된 PCR 생성물을 분해하였다. 단편을 함께 결찰시킨 후, 플라스미드 pOJ260의 상응하는 제한 부위 내로 결찰시켰다. 생성된 결찰 생성물을 E. 콜라이 적격 세포 내로 클로닝하였다. 제한 효소 분해 및 DNA 서열 분석을 통해 콜로니를 원하는 결찰 생성물에 대해 선별하고 스크리닝하였다. 양성 클론을 확인하고, 선별된 클론은 사카로폴리스포라 스피노사 내의 다음 spnK의 5' 말단 결실을 위해 사용하였다. 플라스미드 pOJ260 내의, 생성된 결실된 spnK 유전자 단편의 서열은 하기 표 3에 제시되어 있다. 그러므로, spnK 출발 코돈 결실은 하기 서열을 포함할 것이다: (서열 10).

문헌 [Matsushima et al., (1994)]에 기술된 방법에 따라 spnK 5' 말단 결실 구성체를 보유하는 E. 콜라이 세포를 사카로폴리스포라 스피노사와 접합시켰는데, 이는 실시예 2에 예시되어 있다. spnK 5' 말단 결실 구성체의 벡터 골격 상에 아프라마이신 내성 유전자 마커가 존재하는 것에 기인하여, 아프라마이신에 대해 내성을 띠는 추정의 트랜스접합체를 선택하였다.

R6 배지 상에서 성장시킨 단일의 일차 트랜스접합체를 50 ㎍/mL의 아프라마이신 및 25 ㎍/mL의 날리딕스산으로 보충된 뇌 심장 삼출액 (BHI) 아가 플레이트 상으로 옮겨 놓고 내성 표현형을 확인하였다. 트랜스접합체의 균사체를 BHI 플레이트로부터, 50 ㎍/mL의 아프라마이신으로 보충된 트립틱 소이 브로쓰(TSB) 배지로 접종하였다. 72시간 동안 250 rpm에서 진탕시키면서 배양물을 29℃에서 인큐베이션시켰다. 72시간 동안의 인큐베이션 후, 균사체를 수거하고, 게놈 DNA를 단리시켰다. 단일 교차 돌연변이체를 검출할 수 있도록 디자인된 프라이머와 함께, 트랜스접합체로부터 단리된 게놈 DNA를 주형으로 사용함으로써 PCR을 수행하였다. PCR 증폭 결과물을 서열 분석하였다. spnK 5' 말단 결실 구성체가 단일 교차 상동 재조합을 통해 spnJK 영역 내로 통합되었다는 것이 서열 분석 데이터를 통해 밝혀졌다.

이중 교차 spnK 5' 말단 결실 돌연변이체의 단리

아프라마이신에 대해 내성을 띠는 단일 교차 돌연변이체를 아프라마이신의 부재하에 BHI 아가 플레이트 상에 접종하고, 29℃에서 14일 동안 인큐베이션시켰다. 문헌 [Hopwood et al., (1985)]에 따라 플레이트로부터 포자를 수거하고, 20% 글리세롤 중에서 -80℃하에 보관하였다. 포자를 아프라마이신을 함유하지 않는 신규의 BHI 아가 플레이트 상에 접종하고, 플레이트를 29℃에서 14일 동안 인큐베이션시켰다. 상기 단계를 다회에 걸쳐 반복하였다. 20% 글리세롤을 사용하여 포자 시료를 희석시키고, 희석된 포자를 BHI 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 단일의 콜로니가 발생될 수 있도록 플레이트를 29℃에서 10일 동안 인큐베이션시켰다. 아프라마이신을 함유하는 신규의 BHI 아가 플레이트 및 그를 함유하지 않는 신규의 BHI 아가 플레이트 상에 개개의 콜로니를 패치시켰다. 균사체가 발생될 수 있도록 모든 플레이트를 29℃에서 10일 동안 인큐베이션시켰다. 50 ㎍/mL의 아프라마이신을 함유하는 BHI 아가 플레이트 상에서 성장하지 않는 콜로니를 이중 교차 돌연변이체의 후보물질로서 확인하고, PCR을 사용하여 입증하기 위해 이를 선택하였다.

이중 교차 돌연변이체의 확인 및 입증

PCR을 통해 이중 교차 돌연변이체를 확인하였다. PCR 증폭을 위해, spnJ 및 spnK 유전자 내에 결합하도록 디자인된 프라이머를 사용하였다. PCR 생성물의 크기는 아가로스 겔 전기영동을 통해 측정하였다. spnK 유전자의 5' 말단을 결실시키는 이중 교차 돌연변이체를 확인하고, PCR 생성물의 크기에 기초하여 선별하였다. PCR 단편의 크기 및 DNA 서열이 spnK 유전자의 ATG 출발 코돈 및 5' 말단의 결실을 나타낸다.

진탕 플라스크 발효를 통한 스피노신 생산

번즈 등 (WO 2003070908)에 의해 기술된 조건하에서 이중 교차 돌연변이체의 발효를 수행할 수 있었다. 발츠 등 (미국 특허 제6,143,526호)에 의해 기술된 조건하에 스피노신 인자의 존재에 대해 발효 브로쓰를 분석할 수 있었다. 이중 교차 돌연변이체의 발효를 통해 스피노신 J 및 L이 생산되었다.

실시예 6.2 spnK 프레임내 결실 벡터의 구성

스피노신 A 및 D 생산 균주의 게놈 DNA를 사용하여 DNA의 두 단편을 PCR 증폭시켰다 (문헌 [Hopwood et al., 1985]). 제1 증폭된 단편의 길이는 약 1,500 bp이고, 제1 추정 S-아데노실메티오닌-의존성 메틸트랜스퍼라제 도메인의 바로 상류에 위치하였다. 제2 증폭된 단편의 길이는 약 1,500 bp이고, 제1 추정 S-아데노실메티오닌-의존성 메틸트랜스퍼라제 도메인의 바로 하류에 위치하였다. 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 PCR 증폭을 완료하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하여 제한 효소 결합 서열을 혼입시켰다. 프라이머에 의해 혼입된 결합 서열을 절단하는 제한 효소를 사용하여 생성된 PCR 생성물을 분해하였다. 단편을 함께 결찰시킨 후, 플라스미드 pOJ260의 상응하는 제한 부위 내로 결찰시켰다. 생성된 결찰 생성물을 E. 콜라이 적격 세포 내로 클로닝하였다. 제한 효소 분해 및 DNA 서열 분석을 통해 콜로니를 원하는 결찰 생성물에 대해 선별하고 스크리닝하였다. 양성 클론을 확인하고, 선별된 클론은 사카로폴리스포라 스피노사 내의 spnK의 제1 추정 S-아데노실메티오닌-의존성 메틸트랜스퍼라제 도메인의 다음 프레임내 결실을 위해 사용하였다. 플라스미드 pOJ260 내의, 생성된 결실된 spnK 유전자 단편의 서열은 하기 표 4에 제시되어 있다. 그러므로, spnK 결실은 하기 서열을 포함할 것이다: 서열 11.

문헌 [Matsushima et al., (1994)]에 기술된 방법에 따라 spnK 프레임내 결실 구성체를 보유하는 E. 콜라이 세포를 사카로폴리스포라 스피노사와 접합시켰는데, 이는 실시예 2에 예시되어 있다. spnK 프레임내 결실 구성체의 벡터 골격 상에 아프라마이신 내성 유전자 마커가 존재하는 것에 기인하여, 아프라마이신에 대해 내성을 띠는 추정의 트랜스접합체를 선택하였다.

R6 배지 상에서 성장시킨 단일의 일차 트랜스접합체를 50 ㎍/mL의 아프라마이신 및 25 ㎍/mL의 날리딕스산으로 보충된 뇌 심장 삼출액 (BHI) 아가 플레이트 상으로 옮겨 놓고 내성 표현형을 확인하였다. 트랜스접합체의 균사체를 BHI 플레이트로부터, 50 ㎍/mL의 아프라마이신으로 보충된 트립틱 소이 브로쓰(TSB) 배지로 접종하였다. 72시간 동안 250 rpm에서 진탕시키면서 배양물을 29℃에서 인큐베이션시켰다. 72시간 동안의 인큐베이션 후, 균사체를 수거하고, 게놈 DNA를 단리시켰다. 단일 교차 돌연변이체를 검출할 수 있도록 디자인된 프라이머와 함께, 트랜스접합체로부터 단리된 게놈 DNA를 주형으로 사용함으로써 PCR을 수행하였다. PCR 증폭 결과물을 서열 분석하였다. spnK 프레임내 결실 구성체가 단일 교차 상동 재조합을 통해 spnK 영역 내로 통합되었다는 것이 서열 분석 데이터를 통해 밝혀졌다.

이중 교차 spnK 프레임내 결실 돌연변이체의 단리

이중 교차 돌연변이체의 확인 및 입증

PCR을 통해 이중 교차 돌연변이체를 확인하였다. PCR 증폭을 위해, spnK 유전자 내에 결합하도록 디자인된 프라이머를 사용하였다. PCR 생성물의 크기는 아가로스 겔 전기영동을 통해 측정하였다. spnK 유전자내 제1 추정 S-아데노실메티오닌-의존성 메틸트랜스퍼라제 도메인을 결실시키는 이중 교차 돌연변이체를 확인하고, PCR 생성물의 크기에 기초하여 선별하였다. PCR 단편의 크기 및 DNA 서열이 spnK 유전자내 제1 추정 S-아데노실메티오닌-의존성 메틸트랜스퍼라제 도메인의 결실을 나타낸다.

진탕 플라스크 발효를 통한 스피노신 생산

실시예 6.3 spnK 프레임내 결실 벡터의 구성

스피노신 A 및 D 생산 균주의 게놈 DNA를 사용하여 DNA의 두 단편을 PCR 증폭시켰다 (문헌 [Hopwood et al., 1985]). 제1 증폭된 단편의 길이는 약 1,500 bp이고, 제2 추정 S-아데노실메티오닌-의존성 메틸트랜스퍼라제 도메인의 바로 상류에 위치하였다. 제2 증폭된 단편의 길이는 약 1,500 bp이고, 제2 추정 S-아데노실메티오닌-의존성 메틸트랜스퍼라제 도메인의 바로 하류에 위치하였다. 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 PCR 증폭을 완료하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하여 제한 효소 결합 서열을 혼입시켰다. 프라이머에 의해 혼입된 결합 서열을 절단하는 제한 효소를 사용하여 생성된 PCR 생성물을 분해하였다. 단편을 함께 결찰시킨 후, 플라스미드 pOJ260의 상응하는 제한 부위 내로 결찰시켰다. 생성된 결찰 생성물을 E. 콜라이 적격 세포 내로 클로닝하였다. 제한 효소 분해 및 DNA 서열 분석을 통해 콜로니를 원하는 결찰 생성물에 대해 선별하고 스크리닝하였다. 양성 클론을 확인하고, 선별된 클론은 사카로폴리스포라 스피노사 내의 spnK의 제2 추정 S-아데노실메티오닌-의존성 메틸트랜스퍼라제 도메인의 다음 프레임내 결실을 위해 사용하였다. 플라스미드 pOJ260 내의, 생성된 결실된 spnK 유전자 단편의 서열은 하기 표 5에 제시되어 있다. 그러므로, spnK 결실은 하기 서열을 포함할 것이다: 서열 12.

이중 교차 spnK 프레임내 결실 돌연변이체의 단리

이중 교차 돌연변이체의 확인 및 입증

PCR을 통해 이중 교차 돌연변이체를 확인하였다. PCR 증폭을 위해, spnK 유전자 내에 결합하도록 디자인된 프라이머를 사용하였다. PCR 생성물의 크기는 아가로스 겔 전기영동을 통해 측정하였다. spnK 유전자내 제2 추정 S-아데노실메티오닌-의존성 메틸트랜스퍼라제 도메인을 결실시키는 이중 교차 돌연변이체를 확인하고, PCR 생성물의 크기에 기초하여 선별하였다. PCR 단편의 크기 및 DNA 서열이 spnK 유전자내 제2 추정 S-아데노실메티오닌-의존성 메틸트랜스퍼라제 도메인의 결실을 나타낸다.

진탕 플라스크 발효를 통한 스피노신 생산

실시예 6.4 spnK 3' 말단 결실 벡터의 구성

스피노신 A 및 D 생산 균주의 게놈 DNA를 사용하여 DNA의 두 단편을 PCR 증폭시켰다 (문헌 [Hopwood et al., 1985]). 제1 증폭된 단편의 길이는 약 1,500 bp이고, spnK 염기쌍 1141의 바로 상류에 위치하였다. 제2 증폭된 단편의 길이는 약 1,500 bp이고, spnK 종결 코돈의 바로 하류에 위치하였고, spnL의 일부를 포함하였다. 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 PCR 증폭을 완료하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하여 제한 효소 결합 서열을 혼입시켰다. 프라이머에 의해 혼입된 결합 서열을 절단하는 제한 효소를 사용하여 생성된 PCR 생성물을 분해하였다. 단편을 함께 결찰시킨 후, 플라스미드 pOJ260의 상응하는 제한 부위 내로 결찰시켰다. 생성된 결찰 생성물을 E. 콜라이 적격 세포 내로 클로닝하였다. 제한 효소 분해 및 DNA 서열 분석을 통해 콜로니를 원하는 결찰 생성물에 대해 선별하고 스크리닝하였다. 양성 클론을 확인하고, 선별된 클론은 사카로폴리스포라 스피노사 내의 다음 spnK의 3' 말단 결실을 위해 사용하였다. 플라스미드 pOJ260 내의, 생성된 결실된 spnK 유전자 단편의 서열은 하기 표 6에 제시되어 있다. 그러므로, spnK 결실은 하기 서열을 포함할 것이다: 서열 13.

문헌 [Matsushima et al., (1994)]에 기술된 방법에 따라 spnK 3' 말단 결실 구성체를 보유하는 E. 콜라이 세포를 사카로폴리스포라 스피노사와 접합시켰는데, 이는 실시예 2에 예시되어 있다. spnK 3' 말단 결실 구성체의 벡터 골격 상에 아프라마이신 내성 유전자 마커가 존재하는 것에 기인하여, 아프라마이신에 대해 내성을 띠는 추정의 트랜스접합체를 선택하였다.

R6 배지 상에서 성장시킨 단일의 일차 트랜스접합체를 50 ㎍/mL의 아프라마이신 및 25 ㎍/mL의 날리딕스산으로 보충된 뇌 심장 삼출액 (BHI) 아가 플레이트 상으로 옮겨 놓고 내성 표현형을 확인하였다. 트랜스접합체의 균사체를 BHI 플레이트로부터, 50 ㎍/mL의 아프라마이신으로 보충된 트립틱 소이 브로쓰(TSB) 배지로 접종하였다. 72시간 동안 250 rpm에서 진탕시키면서 배양물을 29℃에서 인큐베이션시켰다. 72시간 동안의 인큐베이션 후, 균사체를 수거하고, 게놈 DNA를 단리시켰다. 단일 교차 돌연변이체를 검출할 수 있도록 디자인된 프라이머와 함께, 트랜스접합체로부터 단리된 게놈 DNA를 주형으로 사용함으로써 PCR을 수행하였다. PCR 증폭 결과물을 서열 분석하였다. spnK 3' 말단 결실 구성체가 단일 교차 상동 재조합을 통해 spnKL 영역 내로 통합되었다는 것이 서열 분석 데이터를 통해 밝혀졌다.

이중 교차 spnK 3' 말단 결실 돌연변이체의 단리

이중 교차 돌연변이체의 확인 및 입증

PCR을 통해 이중 교차 돌연변이체를 확인하였다. PCR 증폭을 위해, spnK 및 spnL 유전자 내에 결합하도록 디자인된 프라이머를 사용하였다. PCR 생성물의 크기는 아가로스 겔 전기영동을 통해 측정하였다. spnK 유전자의 3' 말단을 결실시키는 이중 교차 돌연변이체를 확인하고, PCR 생성물의 크기에 기초하여 선별하였다. PCR 단편의 크기 및 DNA 서열이 spnK 유전자의 3' 말단의 결실을 나타낸다.

진탕 플라스크 발효를 통한 스피노신 생산

참고된 모든 특허 및 공개 문헌은 그의 전문이 본원에서 참고로 포함된다. 상기는 본 발명의 일례이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되서는 안된다. 본 발명은 하기 특허청구범위에 의해 정의되며, 특허청구범위의 등가물도 그에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> DowAgrosciences Han, Lei <120> SPNK STRAINS <130> 69250 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer: spnKF <400> 1 gggaattcca tatgtccaca acgcacgaga tcga 34 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer: spnKR <400> 2 gccgctcgag ctcgtcctcc gcgctgttca cgtc 34 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer: Forward Primer #1 <400> 3 cggtgcccga attccatgac ccg 23 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer: Reverse Primer #1 <400> 4 gtgcgttcta gacatatgag ctcctcatgg ctg 33 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer: Forward Primer #2 <400> 5 gtgccatcta gactggacga catattgcac ctg 33 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer:Reverse Primer #2 <400> 6 gaatgcgaag cttacgatct 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agcaccaact tcctccgaac caccacatcc ggttcgatac ccggtccgtc 360 ggaactgtcc gatggcttcc aggccatctc cgcagtggtc gccggctgcg ggcaccgacg 420 tcccgacctc aacttgctcg cctcccacta ccgcacggac aagtggggcg gcctgcactg 480 gttcaccccg ctatacgagc gacacctcgg cgagttccgt gatcgcccgg tgcgcatcct 540 ggagatcggt gtcggtggct acaacttcga cggtggcggc ggcgaatccc tgaagatgtg 600 gaagcgctac ttccaccgcg gcctcgtgtt cgggatggac gttttcgaca agtccttcct 660 cgaccagcag aggctctgca ccgtccgcgc cgaccagagc aagcccgagg agctggccgc 720 cgttgacgac aagtacggac cgttcgacat catcatcgac gatggcagcc acatcaacgg 780 acacgtgcgc acatccctgg aaacgctgtt cccccggttg cgcagcggtg gcgtatacgt 840 gatcgaggat ctgtggacga cctatgctcc cggattcggc gggcaggcgc agtgcccggc 900 cgcacccggc accacggtca gcctgctcaa gaacctgttg gaaggcgttc agcacgagga 960 gcagccgcat gcgggctcgt acgagccgag ctacctggaa cgcaatttgg tcggcctcca 1020 cacctaccac aacatcgcgt tcctggagaa aggcgtcaac gccgaaggcg gcgttcctgc 1080 ttgggtgcca aggagtctgg acgacatatt gcacctggcc gacgtgaaca gcgcggagga 1140 cgagtga 1147 <210> 11 <211> 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tacggaccgt tcgacatcat catcgacgat ggcagccaca tcaacggaca cgtgcgcaca 780 tccctggaaa cgctgttccc ccggttgcgc agcggtggcg tatacgtgat cgaggatctg 840 tggacgacct atgctcccgg attcggcggg caggcgcagt gcccggccgc acccggcacc 900 acggtcagcc tgctcaagaa cctgttggaa ggcgttcagc acgaggagca gccgcatgcg 960 ggctcgtacg agccgagcta cctggaacgc aatttggtcg gcctccacac ctaccacaac 1020 atcgcgttcc tggagaaagg cgtcaacgcc gaaggcggcg ttcctgcttg ggtgccaagg 1080 agtctggacg acatattgca cctggccgac gtgaacagcg cggaggacga gtga 1134 <210> 12 <211> 1084 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Deletion of second putative S-adenosylmethionine-dependent methyltransferase domain of spnK <400> 12 atgtccacaa cgcacgagat cgaaaccgtg gaacgcatca tcctcgccgc cggatccagt 60 gcggcgagcc tggccgacct gaccaccgaa ctcggactcg ccaggatcgc acccgtgctg 120 atcgacgaga tcctcttccg cgcggaaccg gcccccgaca tcgaacggac cgaggtcgcg 180 gtccagatca cccaccgagg cgagaccgtt gacttcgtcc tgacgctaca gtccggtgag 240 ctgatcaagg ccgagcaacg accggtcgga gacgtcccgc tgcggatcgg ttacgagctc 300 accgatctca tcgccgagtt gttcggccca ggagctccca gggccgtcgg cgcccggagc 360 accaacttcc tccgaaccac cacatccggt tcgatacccg gtccgtcgga actgtccgat 420 ggcttccagg ccatctccgc agtggtcgcc ggctgcgggc accgacgtcc cgacctcaac 480 ttgctcgcct cccactaccg cacggacaag tggggcggcc tgcactggtt caccccgcta 540 tacgagcgac acctcggcga gttccgtgat cgcccggtgc gcatcctgga gatcggtgtc 600 ggtggctaca acttcgacgg tggcggcggc gaatccctga agatgtggaa gcgctacttc 660 caccgcggcc tcgtgttcgg gatggacgtt ttcgacaagt ccttcctcga ccagcagagg 720 ctctgcaccg tccgcgccga ccagagcaag cccgaggagc tggccgccgt tgacgacaag 780 cgaggatctg tggacgacct atgctcccgg attcggcggg caggcgcagt gcccggccgc 840 acccggcacc acggtcagcc tgctcaagaa cctgttggaa ggcgttcagc acgaggagca 900 gccgcatgcg ggctcgtacg agccgagcta cctggaacgc aatttggtcg gcctccacac 960 ctaccacaac atcgcgttcc tggagaaagg cgtcaacgcc gaaggcggcg ttcctgcttg 1020 ggtgccaagg agtctggacg acatattgca cctggccgac gtgaacagcg cggaggacga 1080 gtga 1084 <210> 13 <211> 1124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spnK nucleotide sequence containing a 3' end deletion <400> 13 atgtccacaa cgcacgagat cgaaaccgtg gaacgcatca tcctcgccgc cggatccagt 60 gcggcgagcc tggccgacct gaccaccgaa ctcggactcg ccaggatcgc acccgtgctg 120 atcgacgaga tcctcttccg cgcggaaccg gcccccgaca tcgaacggac cgaggtcgcg 180 gtccagatca cccaccgagg cgagaccgtt gacttcgtcc tgacgctaca gtccggtgag 240 ctgatcaagg ccgagcaacg accggtcgga gacgtcccgc tgcggatcgg ttacgagctc 300 accgatctca tcgccgagtt gttcggccca ggagctccca gggccgtcgg cgcccggagc 360 accaacttcc tccgaaccac cacatccggt tcgatacccg gtccgtcgga actgtccgat 420 ggcttccagg ccatctccgc agtggtcgcc ggctgcgggc accgacgtcc cgacctcaac 480 ttgctcgcct cccactaccg cacggacaag tggggcggcc tgcactggtt caccccgcta 540 tacgagcgac acctcggcga gttccgtgat cgcccggtgc gcatcctgga gatcggtgtc 600 ggtggctaca acttcgacgg tggcggcggc gaatccctga agatgtggaa gcgctacttc 660 caccgcggcc tcgtgttcgg gatggacgtt ttcgacaagt ccttcctcga ccagcagagg 720 ctctgcaccg tccgcgccga ccagagcaag cccgaggagc tggccgccgt tgacgacaag 780 tacggaccgt tcgacatcat catcgacgat ggcagccaca tcaacggaca cgtgcgcaca 840 tccctggaaa cgctgttccc ccggttgcgc agcggtggcg tatacgtgat cgaggatctg 900 tggacgacct atgctcccgg attcggcggg caggcgcagt gcccggccgc acccggcacc 960 acggtcagcc tgctcaagaa cctgttggaa ggcgttcagc acgaggagca gccgcatgcg 1020 ggctcgtacg agccgagcta cctggaacgc aatttggtcg gcctccacac ctaccacaac 1080 acagcagagg ggcgaacaca caggcatttc cgaccgcgga tcag 1124 <210> 14 <211> 1207 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spnK and adjoining upstream sequence <400> 14 ggagctcatc acgatgtcca caacgcacga gatcgaaacc gtggaacgca tcatcctcgc 60 cgccggatcc agtgcggcga gcctggccga cctgaccacc gaactcggac tcgccaggat 120 cgcacccgtg ctgatcgacg agatcctctt ccgcgcggaa ccggcccccg acatcgaacg 180 gaccgaggtc gcggtccaga tcacccaccg aggcgagacc gttgacttcg tcctgacgct 240 acagtccggt gagctgatca aggccgagca acgaccggtc ggagacgtcc cgctgcggat 300 cggttacgag ctcaccgatc tcatcgccga gttgttcggc ccaggagctc ccagggccgt 360 cggcgcccgg agcaccaact tcctccgaac caccacatcc ggttcgatac ccggtccgtc 420 ggaactgtcc gatggcttcc aggccatctc cgcagtggtc gccggctgcg ggcaccgacg 480 tcccgacctc aacttgctcg cctcccacta ccgcacggac aagtggggcg gcctgcactg 540 gttcaccccg ctatacgagc gacacctcgg cgagttccgt gatcgcccgg tgcgcatcct 600 ggagatcggt gtcggtggct acaacttcga cggtggcggc ggcgaatccc tgaagatgtg 660 gaagcgctac ttccaccgcg gcctcgtgtt cgggatggac gttttcgaca agtccttcct 720 cgaccagcag aggctctgca ccgtccgcgc cgaccagagc aagcccgagg agctggccgc 780 cgttgacgac aagtacggac cgttcgacat catcatcgac gatggcagcc acatcaacgg 840 acacgtgcgc acatccctgg aaacgctgtt cccccggttg cgcagcggtg gcgtatacgt 900 gatcgaggat ctgtggacga cctatgctcc cggattcggc gggcaggcgc agtgcccggc 960 cgcacccggc accacggtca gcctgctcaa gaacctgttg gaaggcgttc agcacgagga 1020 gcagccgcat gcgggctcgt acgagccgag ctacctggaa cgcaatttgg tcggcctcca 1080 cacctaccac aacatcgcgt tcctggagaa aggcgtcaac gccgaaggcg gcgttcctgc 1140 ttgggtgcca aggagtctgg acgacatatt gcacctggcc gacgtgaaca gcgcggagga 1200 cgagtga 1207 <210> 15 <211> 1238 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spnK and adjoining downstream sequence <400> 15 atgtccacaa cgcacgagat cgaaaccgtg gaacgcatca tcctcgccgc cggatccagt 60 gcggcgagcc tggccgacct gaccaccgaa ctcggactcg ccaggatcgc acccgtgctg 120 atcgacgaga tcctcttccg cgcggaaccg gcccccgaca tcgaacggac cgaggtcgcg 180 gtccagatca cccaccgagg cgagaccgtt gacttcgtcc tgacgctaca gtccggtgag 240 ctgatcaagg ccgagcaacg accggtcgga gacgtcccgc tgcggatcgg ttacgagctc 300 accgatctca tcgccgagtt gttcggccca ggagctccca gggccgtcgg cgcccggagc 360 accaacttcc tccgaaccac cacatccggt tcgatacccg gtccgtcgga actgtccgat 420 ggcttccagg ccatctccgc agtggtcgcc ggctgcgggc accgacgtcc cgacctcaac 480 ttgctcgcct cccactaccg cacggacaag tggggcggcc tgcactggtt caccccgcta 540 tacgagcgac acctcggcga gttccgtgat cgcccggtgc gcatcctgga gatcggtgtc 600 ggtggctaca acttcgacgg tggcggcggc gaatccctga agatgtggaa gcgctacttc 660 caccgcggcc tcgtgttcgg gatggacgtt ttcgacaagt ccttcctcga ccagcagagg 720 ctctgcaccg tccgcgccga ccagagcaag cccgaggagc tggccgccgt tgacgacaag 780 tacggaccgt tcgacatcat catcgacgat ggcagccaca tcaacggaca cgtgcgcaca 840 tccctggaaa cgctgttccc ccggttgcgc agcggtggcg tatacgtgat cgaggatctg 900 tggacgacct atgctcccgg attcggcggg caggcgcagt gcccggccgc acccggcacc 960 acggtcagcc tgctcaagaa cctgttggaa ggcgttcagc acgaggagca gccgcatgcg 1020 ggctcgtacg agccgagcta cctggaacgc aatttggtcg gcctccacac ctaccacaac 1080 atcgcgttcc tggagaaagg cgtcaacgcc gaaggcggcg ttcctgcttg ggtgccaagg 1140 agtctggacg acatattgca cctggccgac gtgaacagcg cggaggacga gtgaacagca 1200 gaggggcgaa cacacaggca tttccgaccg cggatcag 1238 <210> 16 <211> 70 <212> DNA <213> Saccharopolyspora spinosa <400> 16 ccgccggcac ggctttcacc cggtcagcca tgaggagctc atcacgatgt ccacaacgca 60 cgagatcgaa 70 <210> 17 <211> 1194 <212> DNA <213> Saccharopolyspora spinosa <400> 17 atgtccacaa cgcacgagat cgaaaccgtg gaacgcatca tcctcgccgc cggatccagt 60 gcggcgagcc tggccgacct gaccaccgaa ctcggactcg ccaggatcgc acccgtgctg 120 atcgacgaga tcctcttccg cgcggaaccg gcccccgaca tcgaacggac cgaggtcgcg 180 gtccagatca cccaccgagg cgagaccgtt gacttcgtcc tgacgctaca gtccggtgag 240 ctgatcaagg ccgagcaacg accggtcgga gacgtcccgc tgcggatcgg ttacgagctc 300 accgatctca tcgccgagtt gttcggccca ggagctccca gggccgtcgg cgcccggagc 360 accaacttcc tccgaaccac cacatccggt tcgatacccg gtccgtcgga actgtccgat 420 ggcttccagg ccatctccgc agtggtcgcc ggctgcgggc accgacgtcc cgacctcaac 480 ttgctcgcct cccactaccg cacggacaag tggggcggcc tgcactggtt caccccgcta 540 tacgagcgac acctcggcga gttccgtgat cgcccggtgc gcatcctgga gatcggtgtc 600 ggtggctaca acttcgacgg tggcggcggc gaatccctga agatgtggaa gcgctacttc 660 caccgcggcc tcgtgttcgg gatggacgtt ttcgacaagt ccttcctcga ccagcagagg 720 ctctgcaccg tccgcgccga ccagagcaag cccgaggagc tggccgccgt tgacgacaag 780 tacggaccgt tcgacatcat catcgacgat ggcagccaca tcaacggaca cgtgcgcaca 840 tccctggaaa cgctgttccc ccggttgcgc agcggtggcg tatacgtgat cgaggatctg 900 tggacgacct atgctcccgg attcggcggg caggcgcagt gcccggccgc acccggcacc 960 acggtcagcc tgctcaagaa cctgttggaa ggcgttcagc acgaggagca gccgcatgcg 1020 ggctcgtacg agccgagcta cctggaacgc aatttggtcg gcctccacac ctaccacaac 1080 atcgcgttcc tggagaaagg cgtcaacgcc gaaggcggcg ttcctgcttg ggtgccaagg 1140 agtctggacg acatattgca cctggccgac gtgaacagcg cggaggacga gtga 1194

Claims

3'-O-메틸트랜스퍼라제 활성을 제거하기 위해 spnK 유전자를 변형시키는 단계를 포함하는, 스피노사드 생산 균주를 스피네토람 전구체 생산 균주로 전환시키는 방법.
제1항에 있어서, 변형이 프레임내 결실, 점 돌연변이, 결실, 및 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제2항에 있어서, 프레임내 결실이 5' 말단의 프레임내 결실, 3' 말단의 프레임내 결실, 및 spnK 코딩 영역의 프레임내 결실로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제2항에 있어서, 결실이 spnK 유전자의 정상적인 리딩 프레임을 파괴시키는 단일 또는 다중 뉴클레오티드 염기 결실인 방법.
제2항에 있어서, 삽입이 spnK 유전자의 정상적인 리딩 프레임을 파괴시키는 단일 또는 다중 뉴클레오티드 염기 삽입인 방법.
제2항에 있어서, 점 돌연변이를 통해 spnK 유전자의 활성 부위 또는 기질 결합 부위에서 아미노산 치환이 이루어지는 방법.
제2항에 있어서, 점 돌연변이가 위치 528, 589, 602, 668, 721, 794, 862, 895, 908, 937 및 1131로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기쌍 위치에서 발생하는 방법.
제2항에 있어서, 점 돌연변이가 화학적 돌연변이유발법으로부터 생성되는 방법.
제1항에 있어서, spnK 유전자가 안티센스 기술의 사용을 통해 무능력화되는 방법.
제1항에 있어서, 변형이 spnK 코딩 영역 내에서 발생하는 방법.
3'-O-메틸트랜스퍼라제 활성을 제거하기 위해 spnK 유전자를 변형시키는 것을 포함함으로써 상당량의 스피네토람 전구체를 정상적으로 생산하지 못하는 원핵 숙주 세포인, 스피네토람 전구체를 생산하는 유전적으로 변형된 숙주 세포.
스피노신 J 및 L 생산은 유지하면서, spnK 유전자를 무능력화시키는 단계를 포함하는, 스피노사드 생산 균주를 스피네토람 전구체 생산 균주로 전환시키는 방법.
제12항에 있어서, spnK 유전자의 무능력화가 프레임내 결실, 점 돌연변이, 결실, 및 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제12항에 있어서, spnK 유전자의 무능력화가 리보솜 결합 부위를 조작함으로써 유발되는 방법.
제14항에 있어서, 리보솜 결합 부위가 spnK 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열인 방법.
제12항에 있어서, spnK 유전자의 무능력화가 spnK 유전자의 프로모터를 조작함으로써 유발되는 방법.
제16항에 있어서, 프로모터가 spnJ에 대한 프로모터와 함께 공동전사되는 방법.
제13항에 있어서, 프레임내 결실이 5' 말단의 프레임내 결실, 3' 말단의 프레임내 결실, 및 spnK 코딩 영역의 프레임내 결실로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제13항에 있어서, 결실이 spnK 유전자의 정상적인 리딩 프레임을 파괴시키는 단일 또는 다중 뉴클레오티드 염기 결실인 방법.
제13항에 있어서, 점 돌연변이를 통해 spnK 유전자의 활성 부위 또는 기질 결합 부위에서 아미노산 치환이 이루어지는 방법.