TW201201700A

TW201201700A - SpnK strains

Info

Publication number: TW201201700A
Application number: TW100116479A
Authority: TW
Inventors: Lei Han
Original assignee: Dow Agrosciences Llc
Priority date: 2010-05-11
Filing date: 2011-05-11
Publication date: 2012-01-16
Also published as: CN103119152B; CN103119152A; AU2011250904A1; US20110281359A1; RU2012153212A; MX2012013099A; RU2580015C2; EP2569414A1; MX342130B; BR112012028860A2; KR20130080007A; JP2013531976A; CA2798886A1; WO2011143291A1; IL222821A0

Description

201201700 六、發明說明：【發明所屬技系餘領域】相關申請案之交互引述本申請案係主張於2〇10年5月11日提出申請之第61/ 333,540號美國暫准專利申請案之利益，其在此完整地併入本案以為參考資料。發明領域本發明係應用干擾基因表現之分子遺傳學技術領域。更具體地’已發現基因之突變作用將產生賜諾殺 (Spinosad)的一品系轉變成產生賜諾特（spinetoram)前驅物的一品系。發明背景如第5,362,634號美國專利中所揭露，發酵產物A83543 係由刺糖多孢菌πί/ίΟΜ)所產生的相關化合物之一家族。該家族的已知成員已被稱為因子或組分’及各被指定一個識別用字母。該等化合物係在下文中稱作斯賓諾辛(spinosyn) A、Β等。斯賓諾辛化合物係適用於防治i知蛛綱動物 '線蟲及昆蟲’尤其鱗翅目與雙翅目（Dipiera)物種，及其等非常環保及具有具吸引力的毒性廓型。天然所產生的斯賓諾辛化合物係由與一種12員的巨環内酯、一種中性糖（鼠李糖）及一種胺醣（福樂胺醣 (forosamine))稠合之一種5,6,5-三環系統所組成（參見Kirst 201201700

等人（1991年）乙文）。若胺醜不存纟，則該等化合物係稱作 A、D等之假配縣；及若中性糖不存在，_等化合物係稱作A、D等之逆式假配酿基。更佳的命名法係將該等假配 _基稱為斯負論辛A 17-Psa、斯賓諾辛〇 17-Psa等，及將逆式假配醣基稱為斯賓諾辛A9-Psa、斯賓諾辛D9_psa等。天然所產生的斯賓諾辛化合物可經由菌種NRRL 18395、18537、18538、18539、18719、18720、18743 及 18823 的發酵作用產生。該等菌種已寄存在美國伊利諾州61604皮奥里亞（Peoria)大學北街1815號之美國農業部農業研究署中西部北區研究中心的菌種保存中心，及成為該中心之一部分。第5,362,634號美國專利及對應的第375316 A1號歐洲專利申請案係有關於斯賓諾辛A、B、C、D、E、F、G、H 及J。據說藉由培養選自NRRL 18395、NRRL 18537、NRRL 18538及NRRL 18539的一種新穎微生物刺糖多孢菌 (•Sacc/zaropo/jAspora sphixsa)品系，而產生該等化合物。 WO 93/09126係有關於斯賓諾辛L、Μ、N、Q ' R、S 及Τ。其中亦論及產生斯賓諾辛J的二種品系：NRRL 18719 與NRRL 18720 ’及產生斯賓諾辛Q、R、S及T的一品系： NRRL 18823。 W0 94/20518與第5,6704,486號美國專利係有關於斯賓諾辛1(：、0、？、1；、\^、\^與丫及其衍生物。亦論及產生斯賓諾辛K的品系NRRL 18743。在生產斯賓諾辛化合物時所面臨的挑戰’係在於需要 201201700 非常大的發酵體積方能產生非常少量的斯賓諾辛。高度期望增加斯賓料的域效率，及藉此增加斯賓諾辛的可利用性及同時降低其成本。 k供用於產生可能具有不同殺蟲活性範圍的新型斯賓 S辛衍生物之種方法之選殖生物合成基因，亦為有利的。新型何生物係適合需要的，因為已知的斯賓諾辛雖然抑制廣泛圍的昆蟲，但其等並非防治所有的害蟲。藉由生物合成斯賓諾辛的中間產物，或藉由在活體内產生其等，行生物或藉由其等在試管巾的化學改質作帛所產生之衍生物，可提供不同的防治模式。提供藉由刺糖多孢菌(&咖《_)的突變品系所合成之新額中間產物亦為麵的，其巾編碼用㈣賓諾辛生物合成作用的酵素之部分的特定基因，已由在試管巾特显性突變的相同基因部分置換，或由來自其他生物之對應的基因部分置拖。【發明内象】發明概要 ^ 八用於將產生賜諾殺諸如斯賓諾辛Α與D的 ⑽系轉變為產生賜諾特前驅物諸如斯賓諾辛；與L的一品包括在啊踢因中產生改造作用，以、土移酶活性。可經由框内刪除、突變、取代、刪除、插入之類堆犬&取代仃5玄改造作用。5玄等框内刪除作用可在 °亥基因的各處，包k。，括5端、3,端之删除作用或一個編碼 &域之刪除作用1框内刪除作用中之—者可包括序列辨 201201700 識編號9。點突變作用可包括但不限於在驗基對528、589、 602、668、721、794、862、895、908、937及 1131 之位置的突變作用。該等突變作用可導致尺基因轉譯作用之改變。該等改變可為胺基酸之改變、取代作用或創建終止密碼子。相較於斯賓講辛Α與D’ §玄專改造作用造成斯賓諾辛 J與L之斯賓諾辛化合物生產作用。本發明的特定方法包括藉由使一個基因失能及同時維持斯賓諾辛J與L的生產作用，而將產生賜諾殺的一品系轉變為產生賜維特前驅物的一品系。正常的^蛋白活性之失此或干擾作用，可藉由框内刪除、突變、取代、刪除、插人之類而發生。其亦可藉㈣於啟動子或核糖體結合位點序列之操作而引發。本發月進步提供產生一種賜諾特前驅物之一種經基因改造的宿主細胞。可藉由改造該辦基因以;肖除3,_〇_甲基轉移酶活性，而產生經基因改造的宿主。可經由框内刪除、突變、取代、刪除、柄入之類進行該改造作用。該等框内刪除作用可包括5’端、+孤丨a 區域之刪除作用。 @之刪除作用或-個_編碼本發明亦提供藉由改— 轉移酶活性而將產生賜諾= 柯基因以消除3，各甲基物的品系之方法1方I °°㈣變為產生賜諾特前驅用、刪除作用及插入作用可包括框内嶋作用、點突變作的框内刪除作用、3,端的4等框内猶作用可包括5’端域的框内刪除作用。心作用及—個編碼區冊1除作用可包括中斷-絲因的 201201700 正常閱讀框之單一或多個核苷酸鹼基刪除作用。插入作用可包括中斷ν«尺基因的正常閱讀框之單一或多個核苷酸鹼基插入作用。點突變作用可發生在鹼基對528、589、602、 668、721、794、862、895、908、937及 1131 之位置。該等點突變作用可造成在基因的活性位點或受質結合位點之胺基酸取代作用。本發明亦包括產生一種賜諾特前驅物之經基因改造的宿主細胞，其中該經基因改造的宿主細胞係通常不產生顯著量的賜諾特前驅物之一原核宿主細胞，其藉由在吵^尺基因中產生一改造作用以消除3，-〇-曱基轉移酶活性。其他實施例包括藉由使一個尺基因失能及同時維持斯賓諾辛j 與L的生產作用，而將產生賜諾殺的一品系轉變為產生賜諾特前驅物的一品系之方法。該等方法可包括框内刪除作用、點突變作用、刪除作用及插入作用。該等框内刪除作用可包括5’端的框内刪除作用、3’端的框内刪除作用及一個 sp«尺編碼區域的框内刪除作用。該等刪除作用可包括中斷基因的正常閱讀框之單一或多個核苷酸驗基刪除作用。插入作用可包括中斷基因的正常閱讀框之單一或多個核苷酸鹼基插入作用。點突變作用可發生在鹼基對 528、589、602、068、721、794、862、895、908、937及 1131之位置。該等點突變作用可造成在印基因的活性位點或叉質結合位點之胺基酸取代作用。使印„尺失能的其他方法’可藉由操作一種核糖體結合位點或藉由操作卬„尺基因的一種啟動子而發生。 201201700 圖式簡單說明第1圖說明尺點突變作用之位置。該突變作用係尺野生型序列（序列辨識編號：17)内的醒目部分。第2圖係描述#；·^、、sp/iL及之物理圖§普。所產生的PCR產物係由染色體圖下方的線所示。第3圖係顯示作為如本發明的一實施例之一種單交換同源重組作用之#从从區域内的框内刪除建構物之整合作用。（星號顯示之不完整的編碼序列）。第4圖說明如本發明的一實施例之造成«尺基因的刪除作用之雙交換突變株。PCR片段的大小與DNA序列顯示基因的框内刪除作用。第5圖係如本發明的一實施例之在«尺内含有一框内安痢黴素(Apramycin)抗性基因卡匣⑺/F)的插入卡匣之一圖。第6圖係描述位於如本發明的一實施例之印„尤編碼序列（序列辨識編號：16)上游之核糖體結合位點（標示為夏因_ 達爾加諾（Shine-Dalgarno))。該序列係該圖中的醒目部分。【實施方式】發明之詳細說明所選殖的刺糖多孢菌 DNA具有眾多用途。所選殖基因可用於增進斯賓諾辛類的產量，及用於產生新型斯賓諾辛。藉由將用於該品系的任何速率限制型酵素之基因的一複製本整合至一特定品系的基因體中，而獲致產量之增進。在其中一特定突變品系中 201201700 的生物合成途徑因缺切需酵由整合所需基因的—氆太“散丨’之清况下’可精 m 復所欲的斯賓諾辛之生產作用二在-生物合成途徑受到中斷之情況，可創 = 的刖驅物品系。更星體从種不同又/、體地，相較於斯賓諾辛A^D的用細財射導致斯㈣辛取的生產作用。可使用所選殖DNA的片段中斷斯賓諾辛生物合成作用中之步驟，而產生新顆的斯賓諾辛。該中斷作用可導致前驅物或“支途”產物(前驅物之天然加工的魅物）之累積用於進行中斷作用之片段，係該等位於一基因内部及呈有㈣基因5,與3’如及自該基因各處遺漏驗基者。使用片段之同源重組事件造成基因的部分複本：-者係失^自 5端所遺漏的驗基，及—者係失去自3，端所遺漏的驗基。在邊片段各端所遺漏的數目必需夠大，藉此一部分複本皆不保有活性。们任在此使用下列疋義，及在證釋申請專利範圍與說明書寺應予乂 “、、。除非另有說明，在此引用的所有美國專利及美國專利巾Μ案係、在此完整地併人本案以為參考資料。

如在此用於本發明的—成分或組分之前之不定冠詞 “一（a)，，祖“wa„、，，一 ^ J 、，係意欲在該成分或組分實例（亦即出現）具限制性。因此“一⑷”或“―㈣，，應被解讀為包個或至少—個’及該成分或組分數，除非該數目顯然是單數。 h括複詞係指存在申請專利範义特徵、整數、步驟或組分，但其並未排除 201201700 存在或添加-或多種其他特徵、整數、步驟、組分或其群 =錢指“包含，，或“包括，，—成分清單之—組成物、一混製程、—方法…物件或_器具並相限於僅僅 ’ Μ可包括其他未明確列出或非其所固有者。如用於此之“或，，係指-種包容性及—種互斥性“或”。例條件係藉由下列任—者滿足：α__) ，，、、k(或不存在），Α為假(或不存在)及Β為真（或存在），及續B二者皆為真（或存在）。子在） 2用於此之“約”―詞係指修飾本發明之—成分或反應勿的量’或用於指該數值量可能發生的變異，例如經由現實世界中用於製造濃縮物或使用溶液之典型_量與液體处里程序’經由該等程序中之無意的錯誤；用於製造該等且成物或進行該等方法之成分的製作、來源或純度之差異 ^類° “約”—詞亦涵蓋由於—特定的起始混合物所造成之成物的不同平衡條件之不同的量。不論是否以“約，，一詞修飾，申請專利範圍包括該等量之當量。如用於此之“發明，，或“本發明，，一詞，係一非限制性詞彙及意欲涵蓋如說明書中所述及在申請專利範圍中再度引述之所有可能變異。如用於此之“多肽，，與‘‘肽，，等詞將以可互換方式使用，及係指藉由一個肽鍵連接在一起之二或多種胺基酸的一聚合物。就一方面而言，該詞亦包括多肽的後表現改質作用，例如醣苷化作用、乙醯化作用、磷酸化作用之類。在該定義内包括例如含有一胺基酸或標記胺基酸的一或多種類似 201201700 物及模擬肽之肽。該等肽可包含L-胺基酸。如用於此之“所感興趣的肽”、“ΡΟΓ、“基因產物”、“標的基因產物”及“標的編碼區域基因產物”等詞，係指由重組方式表現的外來基因所編碼之所欲的異源肽/蛋白產物。所感興趣的肽可包括任一肽/蛋白產物，其包括但不限於蛋白、融合蛋白、酵素、肽、多肽及寡肽。所感興趣的肽之大小係自2至398個胺基酸長。如用於此之“基因建構物”一詞，係指適用於調控一生物的基因型或表現型之一系列的相連核酸。基因建構物的非限制性實例包括但不限於一核酸分子及開放閱讀框、一基因、一表現卡匣、一載體、一質體之類。如用於此之“内源性基因”一詞，係指在一生物的基因體中之天然位置所固有的一基因。如用於此之“外來基因”，係指在宿主生物中正常不會發現之一基因，但藉由基因轉殖而引入宿主生物中。外來基因可包含插入一非天然生物中之天然基因，或包含欲合基因。如用於此之關於一特定生物/基因體内的序列之“異源” 一詞，係顯示源自一外來物種的序列，或者若來自相同物種則藉由蓄意人為干預而大幅改造組成及/或基因座的天然形式。因此，例如異源基因表現作用係指藉由將該基因體置入一種不同生物/基因體中而表現來自一生物/基因體的一基因之方法。如用於此之“重組體”一詞，係指如藉由化學合成作用 201201700 或藉由核酸的分離節段之遺傳工程技術操作之在其他情況下分開的二個序列節段之一人工組合物。“重組體”亦包括一細胞或載體，其已藉由引入一異源核酸或引入自依此方式改造的細胞所衍生之一細胞而改造，但不涵蓋該細胞或載體由於天然發生事件（如自發性突變作用、天然轉形作用、天然轉導作用，天然的轉位作用）之改變，諸如該等毋需蓄意人為干預即發生者。 “經基因工程化”或“經基因改變”一詞，係指一活生物體中的遺傳物質結構之科學改變。其涉及產生與使用重組型DNA。更詳細地，其係用於描述經基因工程化或改造的生物，及與天然存在的生物區別。可藉由技藝中已知的數種技術進行遺傳工程，諸如基因置換作用、基因擴增作用、基因中斷作用、轉染作用、使用質體、病毒或其他載體之轉形作用。一種基因改造生物如基因改造微生物亦通常稱為重組型生物，如重組型微生物。如用於此之當提及一基因時的“被中斷”或“中斷作用’’ 一詞，係指經由遺傳工程或經由改變一基因活性的自然因素而加以操作或改造。該基因活性可能增加或降低。此外，該中斷作用可能廢除蛋白功能。為促進該項降低，可減少該基因的複本數目，諸如例如藉由一基因之表現不足或中斷作用。若一基因的轉錄作用水平係低於野生型基因，則該基因被認為“表現不足”。其可藉由例如北方墨點分析法測量，其係量化mRNA量作為基因表現作用之示值。如用於此，相較於一野生型基因所產生的mRNA量，若所產生 12 201201700 的mRNA量降低至少 1%、2%、5%、l〇〇/0、25%、50%、75%、 100%、200%或甚至超過500%，則一基因係表現不足。任擇地，可使用一種弱啟動子來引導聚核苷酸的表現作用。在另一實施例中，該啟動子可改變位於該基因上游的調控區域及/或核糖體結合位點，而降低表現作用。亦可藉由減少信使RNA的相對半衰期，而降低表現作用。在另一實施例中，藉由採用多肽胺基酸序列中之一或多種降低活性的突變作用，而降低多肽本身的活性。例如，改變多肽對於其對應受質之親和性，可能造成活性降低。同樣地，可降低多肽的相對半衰期。在基因表現作用降低或活性降低二者中之任一情況下’可藉由改變細胞培養基的組成及/或培養所用的方法，而達成降低作用。如用於此之“表現作用降低”或“活性降低”，係指相較於—野生型蛋白、聚核苷酸、基因或在聚核苷酸或多肽降低之前所存在的蛋白活性及/ 或濃度而言，降低至少5%、1〇%、25%、50%、75%、100%、 200°/。或甚至超過5〇〇〇/。。亦可藉由將該蛋白與針對其活性的一種特異性或通用抑制劑接觸，而降低办蛋白的活性。活性降低”、“降低或廢除活性，，等詞在此係以可互換方式使用。表現作用“控制序列，，係集體地指啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄終止序列、上游調控域、增強子之類，其等集體地提供-宿主細胞中之—編碼序列的轉錄作用與轉譯作用。只要所欲基因可被轉錄與轉譯，一重組型載體中並非總是需要存在所有的該等控制序列。 13 201201700 “重組作用”係指二種DNA或RNA分子之間之DNA或 RNA序列區段的重新排列組合。“同源重組作用”係發生在憑藉各DNA分子中所存在的同源或互補核苷酸序列而雜合的二種DNA分子之間。 “嚴格條件”或“在嚴格條件下的雜合作用”等詞，係指一探針將優先與其標的子序列雜合及在較小的程度上或完全不與其他序列雜合之條件。在核酸雜合作用實驗諸如南方與北方雜合作用的上下文中之“嚴格的雜合作用”與“嚴格的雜合作用清洗條件”係具序列依賴性，及在不同的環境參數下不同。有關核酸雜合作用的廣泛指南，可參見美國紐約的埃爾塞維爾（Elsevier)公司出版之Tijssen( 1993年）所著“生物化學與分子生物學之實驗室技術―核酸探針之雜合

作用（Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes)”乙書第I 部第2章之“雜合作用原理與核酸探針分析策略之概述 (Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays)”。一般而言，所選擇的高度嚴格雜合作用與清洗條件，係比特定序列在所界定的離子強度與pH值之熱力學熔點(X)低約5°C。1\„係50%的標的序列與種元全匹配的探針雜合之溫度（在所界定的離子強度與 PH值下）。所選擇的非常嚴格條件係等於一特定探針的丁^。用於在南方或北方墨點的一濾膜上具有超過1〇〇個互補殘基之互補核酸的雜合作用之嚴格雜合條件之一實例，係在42°C及具有1毫克的肝素之50%曱醯胺進行雜合作用過 201201700

夜。高度嚴格清洗條件之一實例，係在〇·15 Μ氣化鈉及於 72°C進行約15分鐘。嚴格清洗條件之一實例係在65°C以 0.2xSSC清洗15分鐘（參見美國紐約冷泉港（c〇ld Spring Harbor Press)出版公司冷泉港實驗室出版之Sambr〇〇k等人 (1989年）的“分子選殖―實驗室手冊（Molecular Cloning--A

Laboratory Manual)”乙書（第二版）第1 _3冊之有關SSC緩衝液之說明）。通常，在高嚴格度清洗之前進行低嚴格度清洗作用’以移除背景探針訊號。用於如超過1〇〇個核苷酸的雙股之中等嚴格度清洗之一實例，係在45°C以lxSSC進行15 分鐘。用於如超過1〇〇個核苷酸的雙股之低嚴格度清洗之一實例，係在40°C以4至6xSSC進行15分鐘。一般而言，在特之的雜合分析中之訊號雜訊比若為一種無關探針所觀察到者的2倍（或更高），則顯示檢測出特異性雜合作用。在嚴格條件下並不彼此雜合之核酸仍實質上相同，若其等所編碼的多肽係實質上相同。其係例如當使用該基因密碼所容許的最大密碼子簡併性創建一核酸複本時發生。本發明亦有關於在嚴格條件下及較佳在高度嚴格條件下，可與本發明的一種聚核苷酸雜合之一種分離的聚核苷酸。如用於此之“雜合，，一詞係用來描述用於雜合作用與清洗之條件，彼此至少約50❶/。、至少約60%、至少約7〇%、佳至少約80%、甚至更佳至少約85%至9〇%、最佳至少％% 同源之核苷酸序列在該等條件下典型地維持彼此雜合。〇在一實施例中，本發明的一核酸係與本申請案中所示 15 201201700 的一核酸序列或其互補體至少4〇%、45%、50%、55%、60%、 65%、70°/。、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95。/〇、96%、97%、98%、99%或以上同源。嚴格的雜合作用條件之另一非限制性實例係在約4 5 r 及6x氣化鈉/檸檬酸鈉（ssc)中進行之雜合作用，接著在 50°C、較佳在55°C、更佳在60°C及甚至更佳在65。(：在 lxSSC、0.1% SDS中進行一或多次清洗。高度嚴格條件可包括使用一種經標記的DNA探針諸如一種經長葉毛地黃配質(DIG)標記的DNA探針，在42。(：培養數日諸如2至4日的期間，接著在室溫及2XSSC、0.1% SDS 中清洗一或多次及在65至68t：及0.5xSSC、0.1% SDS或O.lx SSC、0.1% SDS中清洗一或多次。尤其，高度嚴格條件例如包括在具有或不具有1〇〇微克/毫升的鮭魚精子DNA之一溶液諸如DigEasyHyb溶液（羅氏診斷（Roche Diagnostics GmbH)有限公司）中’或在包含5〇〇/0曱醯胺、5xSSC(15〇mM 氣化鈉、15mM檸檬酸三納）、0.02%十二基硫酸納、ο ι% N-月桂醯基肌胺酸及2%阻斷劑（羅氏診斷有限公司）之一溶液中’在42°C使用一種經DIG標記的DNA探針(如藉由使用一種DIG標記系統製備；德國曼海姆(Mannheim) 68298的羅氏診斷有限公司）培養2小時至4曰，接著在室溫及2xSSc與 0.1% SDS中清洗濾膜二次達5至15分鐘，然後在65至68°c及在0.5xSSC與0.1% SDS或O.lxSSC與〇_i% SDS 中清洗二-欠達15至30分鐘。在一些實施例中，在高度嚴格條件與本發明的一核苦 ⑧ 16 201201700 酸序列雜合之本發明之一種分離的核酸分子，可對應於一種天然存在的核酸分子。如用於此之一種“天然存在的”核酸分子’係指具有自然中所存在的一核苷酸序列（如編碼一種天然的蛋白）之一種RNA或DNA分子。一嫻熟技藝者將瞭解在嚴格與高度嚴格的雜合條件中施用何種條件。有關該等條件之更多的指南係技藝中現成可取得者，例如參見美國紐約冷泉港出版公司出版之 Sambrook等人（1989年）的“分子選殖--實驗室手冊 (Molecular Cloning，A Laboratory Manual)” 乙書；及 Ausubel 等人（編輯）於1995年之“當前分子生物學之操作程序 (Current Protocols in Molecular Biology)，，（美國紐約之約翰烕利父子（John Wiley & Sons)公司）。含有用於斯賓諾辛生物合成酵素的基因之DNA的一選殖片段，將促成用於編碼斯賓諾辛生產作用中的速率限制酵素之基因的複製作用。其可在當所編碼的一活性限制所欲斯賓諾辛的合成作用之任一情況下，用於增加產量。藉由用於編碼將大菌素轉變為泰黴菌的一種速率限制曱基轉移酶之基因複製作用（Baltz等人之1997年乙文），而在弗氏鏈黴菌/raafke)的發酵作用中達成該類型的產量增加。可藉由其中編碼斯賓諾辛生物合成作用的酵素之特定基因已受到中斷之刺糖多孢菌（51·突變品系，而合成特定的中間產物（或其等的天然衍生物）。可藉由經由同源重組作用整合含有標的基因的一内部片段之一種致突變質 17 201201700 體，而產生該等品系。在質體整合作用之際，形成該生物合成基因的二個不完整複本，藉此消除其所編碼的酵素性功能。該酵素的受質或其一些天然衍生物，應在該突變品系發酵時累積。該策略有效地用來產生一種紅黴素鏈黴菌品系，而製造新穎的6_去氧紅黴素衍生物（Weber & McAlpine於1992年乙文）。可經由雙交換同源重組作用，藉由將標的區域與含有介於側臨標的區域的非突變序列之間的新片段之一致突變質體交換’而產生該等品系。雜合基因將產生功能改變之蛋白，其缺乏一活性或進行一種新穎的酵素性轉形作用。一種新型衍生物將在該突變品系發酵時累積。該策略係用於產生一種红徽素键徽菌OSacc/iaropo/jAspora 品系’而製造一種新穎的去水紅黴素衍生物（Donadio等人於 1993年乙文）。選殖斯賓諾辛生物合成基因與相關ORF，及測定各者的DNA序列。所選殖的基因與ORF在下文中稱作ipd、 spnB、spnC、spnD、spnE、spnF、spnG、spnH、spnl、spnJ ' spnK' spnL ' spnM' spnN' spnO' spnP ' spnQ' spnR ' spnS ' ORFL15、ORFL16、ORFR1、ORFR2、刺糖多孢菌(51, •sp/wosa) 忘ίί、刺糖多孢菌（51· >5/7/«〇扣）、刺糖多孢菌（*S. spkosa) ep/ 及刺糖多孢菌（51· Are。刺糠多抱菌產生統稱為 “斯賓諾辛類”之九種密切相關的化合物之一混合物。在該混合物中，稱作賜諾殺(spinsoad)之斯賓諾辛A與D係主要組 ⑧ 18 201201700 分及所具有對抗主要昆蟲標的之活性最高。斯賓諾辛混合物中的二種次要組分即斯賓諾辛J與L，係賜諾特的前驅物及為第二代的斯賓諾辛殺蟲劑。本發明的實施例係有關於經由編碼3’-0-甲基轉移酶的印《尺之操作，將產生賜諾殺的品系直接轉化為產生賜特前驅物的一品系。賜諾殺係由陶氏農業科學(Dow Agr〇Sciences)公司（美國印第安那州印第安那波利斯）所生產的一種殺蟲劑，其主要是由約85%的斯賓諾辛A與約15%的斯賓諾辛〇所組成。如第5,362,634號美國專利中所揭露，斯賓諾辛a與ρ係藉由刺糖多抱菌πΖ·„〇ία)發酵作用所產生的天然產物。賜諾殺係可從陶氏農業科學公司購買之數種殺蟲調配物包括 TRACER™、SUCCESSTM、SPINTOR™及 CONSERVE昆蟲防治產品之一有效成分。例如，TRACER 產品係由約44%至約48%的賜諾殺（重量/體積)所組成，或每加侖約4磅的賜諾殺。已確立粒狀與液狀調配物中的斯賓諾辛化合物用於防治缺I蛛綱動物、線蟲及昆蟲之效用，尤其是鱗翅目（LePic/0Ptera)、缕翅目（rhy_〇ptera)及雙翅目 (D㈣物種。斯賓諾辛八與〇在此亦稱為斯賓諾辛A/De 賜諾特係陶氏農業科學公司所生產之5,6_二氫_3，_乙氧基斯賓諾辛J(主要組分）與3，_乙氧基斯賓諾辛^之一混合物。可藉由將斯賓諾辛J與斯賓諾辛L的一混合物乙氧化，接著進行氫化作用，而製備該混合物。由於甲基在斯賓諾辛L及其3 _乙氧基讨生物的c_5之位阻，斯賓諾辛j及其3，_ 乙氧基的5,6雙鍵係比斯賓諾辛L及其3，_乙氧基衍生物更容 201201700 易氫化。參見第6,001，981號美國專利。斯賓諾辛j與L在此亦稱為斯賓諾辛J/L。最近已3登貫«尺編碼3’-0_甲基轉移酶。參見Kim等人於期刊“X4CS，，第132(9)期第2901-3頁（201〇年）乙文。本案申請者已發現可經由框内雙交換同源重組作用從斯賓諾辛生物合成基因簇移除#/7尺，及對於下游基因少从與的轉錄作用並不具有極性效應。其容許將產生賜諾殺的一品系工程化而得產生賜諾特前驅物的一品系。其亦顯示尺敲除品系已喪失3，-0-甲基轉移酶活性。本發明的實施例可包括在基因中之操作，其係藉由在產生賜諾殺的一品系中移除一或多個密碼子，而導致尺基因的框内刪除作用β 尺基因的框内刪除作用可包括W«火基因的任一部分之任一截斷作用。如本發明之框内刪除作用包括移除蛋白編碼序列的一節段之刪除作用，但在刪除作用之後保有適當閱讀框。本發明的一些實施例可包括“全然刪除”之刪除作用，亦即其等不含有插入該基因或中的外源DNA序列。基因的框内刪除作用可包括移除自1至397個胺基酸。其可包括移除起始密碼子。其可進一步包括移除任一保留域或任一轉錄起始區域。在此使用習用符號來敘述聚核苷酸序列：一單股聚核苦酸序列的左端為5，端；-雙股聚核錢相的左側方向係稱作5,方向。在新生RNA轉錄本自5，至3，添加核皆酸之方向係稱作轉錄作时向。具有與mRN__序列之dna 股係稱作“編碼股，’；具有與該DNA所轉錄的她财序列相 20 ⑧ 201201700 同之DNA股上的序列及位於RNA轉錄本的5’端之5，者係稱作“上游序列；具有與mRNA序列相同之DNA股上的序列及位於編碼RNA轉錄本的3,端之3,者係稱作“下游序列”。本發明的實施例可包括在尤基因中之操作，其係藉由在產生賜諾殺的—品系中移除一或多個密碼子，而導致印”尺基因的5’端之框内刪除作用。該等密碼子可包括ATg 密碼子的第一、第二或第三實例。本發明的附加實施例可包括在基因中之操作，其係藉由在產生賜諾殺的—品系中移除一或多個密碼子，而導致切”欠基因的3’端之框内刪除作用。的他貫她例可包括在尺編碼區域的框内刪除作用中之咖基因操作，其可為單—密碼子或多個密碼子’同時留下該基因之完整*㈣5,端與3,端。结厶位構本發明的附加實施例可包括包含單點或多點突變作用之^^基因操作，其導致過早的轉錄終止作用或在包括但不限於活性㈣及/或在受質結合位關多餘點之胺基酸取代作用。該單點或多點突變作用可發生在sam結合性基序内，導致提前終止作㈣位於活性位點或受質一點中。該單點❹點突變仙村位於科整體咖尺結 =響正補疊而可廢除咖⑼能之_位置。可經由檢測功此多型性或藉由誘突變仙而創建該單點❹點突變作如用於此之“功能多型性”係指一基因的驗基對序列之改變’而產生由該基因所編碼的蛋白活性之^性或定量變 21 201201700 化(如活性特異性之改變；活性水平之改變）。“功能多型性” 一詞係包括突變作用、刪除作用與插入作用。一般而言，可藉由收集含有來自該來源的DNA之一生物試樣，而進行所感興趣的多型性之檢測步驟，然後測定含有所感興趣的多型性之DNA是否存在於該生物試樣中。可使用經一種適宜的可檢測基團標記之一種寡核苷酸探針，及/或藉由一種擴增反應諸如一種聚合酶鏈反應或連接酶鏈反應（然後可使用一種經標記的寡核苷酸探針或其他數種技術來檢測該擴增反應的產物）之方式，測定編碼一特定突變作用之DNA是否存在。此外，檢測步驟可包括檢測該個體就該特定突變作用而言係異型接合抑或同型接合之步驟。已知可用於進行本發明之眾多不同的寡核苷酸探針分析形式。如參見頒證Wahl等人之第4,302,204號美國專利；頒證Falkow等人之第4,358,535號美國專利；頒證Ranki 等人之第4,563,419號美國專利；及頒證Stavrianopoulos等人之第4,994,373號美國專利。可藉由任一適宜方式，進行一種所選擇的核酸序列或標的核酸序列之擴增作用。統見Kwoh等人於期刊“Am. Biotechnol. Lab.”第8期第14-25頁（1990年）乙文。適宜的擴增技術之貫例包括但不限於聚合酶鏈反應、連接酶鏈反應、單股置換擴增作用（統見G. Walker等人於期刊“Proc

Natl. Acad. Sci_ USA”第 89期第 392-396頁（1992年）乙文；G. Walker專人於期刊” Nucleic Acids Res.”第 20期第 1691-1696 頁（1992年）乙文）' 轉錄式擴增作用（參見D Kw〇h等人於期 ⑧ 22 201201700 刊’’Proc. Natl. Acad· Sci. USA ’’第 86期第 1173-1177 頁（1989 年）乙文）、自主序列複製作用（或“3SR”)(參見j. Guatdli等人於期刊“Proc. Natl. Acad. Sci. USA”第 87期第 1874_ 1878頁 (1990年）乙文）、Qp複製酶系統（參見p. Lizardi等人於期刊”

BioTechnology” 第 6期第 1197-1202 頁（1988年）乙文）' 核酸序列式擴增作用（或“NASBA”)(參見R. Lewis於期刊“Genetic Engineering News”第1之⑼期第1頁（！ 992年）乙文）、修復鏈反應（或“RCR”)(參見同上之R. Lewis乙文）及迴力棒DNA擴增作用（或“BDA”)(參見同上之R. Lewis乙文）。一般較佳為聚合酶鏈反應。可依據已知技術進行聚合酶鏈反應（PCR)。如參見第 4,683，195號美國專利；第4,683,202號美國專利；第4,8〇〇159 5虎美國專利，及第4,965，188號美國專利。一般而言，pcr 首先涉及在雜合條件下，以供待檢測之特定序列的各股所用之一種寡核苷酸引子處理一核酸試樣（如在一種耐熱性 DNA聚合酶之存在下），藉此合成各引子的一延伸產物及其係與各核酸股互補，鑑於引子係與特定序列的各股充分互補而足以與其雜合，藉此當自各引子所合成的延伸產物與其互補體分離時，可作為用於合成另-引子的延伸產物之一模板，然後在變性條件下處理該試樣，俾當該序列或待仏測的序列存在時m丨子延伸產物與其等的模板分離。循環地重複該等步驟，直至獲得所欲的擴增程度。可藉由在反應產物中添加可與該反應產物雜合的一種寡核苷酸探針(如本發明的一種寡核苷酸探針），而進行所擴增序列之檢 23 201201700 測作用’該探針具有一種可檢測的標記，然後依據已知技術或藉由在·上直接觀察而檢測該標記。料探針的長度可自5至5GG個㈣酸，難5至25_，更佳5至1()()個或5 至糊«。當職條件料财對偶叙擴增作用時，可藉由與—種對偶特異性探針的雜合作用、藉由限制性核酸内切酶分解刹、藉由變性梯度凝膠上的電泳或其他技術，而區分該等類型。亦可依據已知技術進行連接酶鏈反應(LCR)。如參見r

WeiSS於期刊“Science，，第254期第1292頁（1991年）乙文。一般而° °亥反應係以二對的寡核苷酸探針進行：一對係與待檢測之序列的-股結合；另-對係與待檢測之序列的另一股結合。各對一起係與其所對應之股完全重疊。該反應之進行係首先將待檢測之序列的股變性(如分離），然後在一種对熱性連接酶之存在下，將該等股與二對的寡核苦酸探針反應，藉此將各對的寡核苷酸探針連接在一起，然後將反應產物分離，然後循環地重複該方法直至該序列已擴增至所欲程度。’倾可如上述有關pCR之同樣方式，進行檢測作用。諸如前述之DNA擴增作用技術，可涉及使用—探針、一對探針或二對探針，而該探針係與含有功能多型性的 DNA特異性結合但不與未含有該功能多型性的dna結合。任擇地，該探針或該對探針可與含有與不含有功能多型性的DNA結合，但產生或擴增其中可確定一項可檢測的差異 (如一種較短的產物及其中功能多型性係一種删除突變作 ⑧ 24 201201700 用）之-產物（如一種延長產物）。可依據標準技術，自與啊尺鏈接的一基因中之DNA或與其相關聯之〇Να的已知序列，或自可依據標準技術從該等基因所產生的序列，產生該等探針。將明暸可直接或間接地進行此述的檢測步驟。間接測定對偶類型之其他方式，係包括測量與特定的功能多型性鏈接之多型性標記’如VNTR(可變數目串連重覆序列)所示者。分子生物學包含用於分析核酸與蛋白質序列之種類繁多的技術。多種該等技術與程序形成臨床診斷分析與試驗之基礎。該等技術包括核酸雜合作用分析、限制酶分析、基因序列分析及核酸與蛋白質之分離與純化作用（如參見美國紐約冷泉港的冷泉港實驗室出版公司於1989年出版之 J. Sambrook、E. F. Fritsch及T. Maniatis的”分子選殖.杳心y且•貫驗室手冊（Molecular Cloning: A Laboratory Manual)乙查第一版）。大部分的該等技術係涉及在大量的試樣上進行眾多才气作（如吸量作用、離心作用及電泳）。其等通常複雜及耗時及一般需要南度的精確度。眾多技術因缺|靈敏户：、# " ^ 符異性或再現性應用，而使得其等的應用受到限制。核酸雜合作用分析一般涉及在相對大量的複合非_ @ 核酸申，以過量的探針DNA檢測非常少數的特定標的枝妒 (DNA或RNA)。減少一試樣中的核酸複雜性，係有助於产測複本數目低（即丨〇,〇〇〇至1 〇〇,〇〇〇)的核酸標的^藉由標的核酸序列的擴增作用，在一定程度上達成DNA複雜性之^ 25 201201700 少。（關於SDA擴增作用請參見學術出版社(Academic Press丨於1990年出版之M. A. Innis等人的“PCR操作程序：方法與應用指南（PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press)”乙書；Spargo等人於 1996年之分子與細胞探針(Molecular & Cellular Probes)，，乙書）。其係因為標的核酸之擴增作用而產生相對於非標的序列而言之龐大數量的標的核酸序列，藉此增進後續標的雜合步驟。雜合步驟係涉及在針對標的DNA序列與探針之間發生雜合作用所設定的最佳條件下，將所製備的DNA試樣與— 種特異性報導子探針接觸。雜合作用可依一或多種形式進行。例如，曾在多種濾膜與固態撐體形式中進行多試樣核酸雜合分析（參見美國紐約學術出版社於1985年出版之由 Part專人編輯之“酵素學方法(Methods in Enzymology)’’乙書第100冊第19章第266-308頁之Beltz等人所著乙文）。其中— 形式即所謂“點潰”雜合作用係涉及標的DNA與一濾膜之非共價附著作用’接著涉及與經放射性同位素標記的探針之後續雜合作用《“點潰，，雜合作用在過去2〇年獲得廣泛使用’及在該期間發展出多種版本（參見美國華盛頓特區的 IRL出版社於1985年出版之由Hames與Higgins編輯之“核酸雜合作用---種實用方法（Nucleic Acid Hybridization--^

Practical Approach)” 乙書第 4 章第 73-111 頁之 Anderson 與

Young所著乙文）。例如，已發展出供基因體突變的多重分析所用（頒證Nanibhushan等人之EPA 0228075)及用於檢測重疊性殖株及建構基因體圖譜（頒證Evans之第5,219,726號 26 201201700 美國專利）之點潰方法。用於進行多試樣核酸雜合分析之附加技術，係包括微格式化多重標的分析或矩陣裝置（如DNA晶片）（參見M.

Barinaga於 1991 年期刊“Science”第253期第 1489頁乙文；W. Bains於 1992年期刊 “Bio/Technology” 第 10期第 757-758 頁乙文）。該等方法通常將特定的DNA序列附著至一固態撐體之很小的特定區域’諸如DNA晶片的微孔。該等雜合作用形式係習用的“點潰”與“三明治”雜合系統之微尺度版本。微格式化雜合作用可用於進行“雜合定序”(SBH)(參見 M. Barinaga於 1991 年期刊 “Science” 第 253 期第 1489 頁乙文；W· Bains於 1992年期刊 “Bi〇/Technology” 第 1〇期第 757-758頁乙文）。SBH使用所有可能的η-核苷酸寡聚物(n聚體) 來辨識一未知D Ν Α試樣中之η聚體，其隨後藉由演算法分析進行排比而得DNA序列（參見Drmanac之第5,202,231號美國專利）。有二種進行SBH之形式。第一種形式涉及在一撐體上產生所有可能的η聚體之一陣列，然後與標的序列雜合。第二種形式涉及將標的序列附著至一撐體，及依序以所有可能的η聚體進行探測。Southern(1988年第GB 8810400號英國專利申請案；E. M. Southern等人於1992年期刊“Genomics” 第13期第1008頁乙文)提議使用第一種形式來分析或定序 DNA。Southern使用PCR擴增型基因體DNA辨識出一種已知的單點突變作用。Southern亦述及用於在一固態撐體上合成供SBH所用的一寡核苷酸陣列之一種方法。Drmanac等人 27 201201700 (於1993年期刊“Science”第26〇期第丨649_〖652頁乙文）使用第一種形式來定序數種短型（116個鹼基對)DNA序列。將標的DNA附著至膜撐體(“點潰，，形式）。各濾膜依序與272種經私5己的十聚體與單聚體寡核苷酸雜合。使用廣範圍的嚴格度條件，以達成各η聚體探針的特異性雜合作用。採用自〇。〇至16 C之溫度，清洗時間則自5分鐘至過夜不等。大部分的探針在16°C需要清洗3小時。濾膜必需暴露2至丨8小時，以檢測雜合訊號。一般而言，有多種方法可用於檢測與分析雜合事件。依用於標§己DNA探針的報導子基團（螢光團、酵素、放射性同位素等）而定，檢測與分析係以螢光測定方式、熱量測定方式或藉由自動放射攝影術進行。藉由觀察與測量所釋放出的輻射，諸如螢光輻射或粒子發射，可獲得關於雜合事件之-貝机。即使當檢測方法具有非常高的固有靈敏度時，雜合事件之檢測仍然困難，因為背景中存在非特異性結合的物質。因此，雜合事件之檢測係取決於雜合作用的特異性與靈敏度之程度。就基因分析而言，已發展出試圖增加特異性與靈敏度之數種方法。基因分析之一形式係集中在鑑定單核酸多塑性或 (“SNP”)之分析。有利於使用SNP之因素係其等在人類基因體中的局豐度（尤其相較於短串連重複序列（STR)而言）、其等在基因的編碼或調控區域内之常見位置（其可影響蛋白結構或表現水平）及其專從一世代到下一世代之穩定性 (Landegren 等人於 1998 年期刊 “Gen〇me Research，，第 8 期第 28 ⑧ 201201700 769-776頁乙文）。 SNP係界定為基因體中的任一位置，及其係以二種變異體存在而最常見的變異體之出現係少於99%的時間4NP 若要作為普遍的基因標記之關鍵，係在於能容易、迅速、正確及符合成本效益地進行其等的基因分型。目前有眾多技術可供用於SNP分型（相關綜合評論請參見Landegren等人於期刊“Genome Research”第8期第769-776頁（1998年）乙文），其中所有者皆需要標的擴增作用。其等包括直接定序 (Carothers 等人於 1989年期刊 “Bi〇Techniques，，第 7期第 494- 499頁乙文）、單股構形多型性(〇rita等人於1989年期刊“Pr〇c

Natl. Acad· Sci. USA”第 86期第 2766-2770頁乙文）、對偶基因特異性擴增作用（Newton於1989年期刊“Nucleic Acids Research”第17期第2503-2516頁乙文）、限制性酶切(Day與 Humphries於 1994年期刊 “Analytical Biochemistry” 第 222期第389-395頁乙文)及雜合分析。在其等最基本的形式中，雜合分析係藉由針對匹配與誤配標的辨別短寡核苷酸報導子而發揮作用。已發展出對於基本操作程序之眾多修改。其等包括連接鏈反應（Wu與Wallace於1989年期刊“Gene”第76 期第245-254頁乙文）及微定序（SyVanen於1990年期刊 “Genomics第8期第684-692頁乙文）。其他改進包括使用 TaqDNA聚合酶的5 ’-核酸酶活性(Holland等人於1991年期刊 “Proc. Natl. Acad· Sci. USA” 第 88期第 7276- 7280 頁乙文）、分子信標（Tyagi與Kramer，於1996年期刊“Nature Biotechnology”第14期第303-308頁乙文）、熱變性曲線 29 201201700 (Howell專人於 1999年期刊“Nature Biotechnology”第 17期第 87-88頁乙文）及DNA“晶片”(Wang等人於1998年期刊 “Science” 第 280期第 1077-1082 頁乙文）〇可用於區別SNP之另一個現象係衍生自多標的特異性探針與單一標的之雜合作用的核酸交互作用能或鹼基層φ 能。（參見R. Ornstein等人於期刊“Biopolymers”第17期第 2341-2360頁（1978年）之“用於計算核酸交互作用能之—種最佳化勢函數（An Optimized Potential Function for the Calculation of Nucleic Acid Interaction Energies)” 乙文；j. Norberg與L. Nilsson於期刊 “Biophysical Journal”第 74期第 394-402頁（1998年）乙文；及J. Pieters於期刊“Nucleic Acids Research”第17期第12號第4551-4565頁（1998年）乙文）。該驗基層疊現象係以一獨特形式用於本發明中，以提供高度靈敏的Tm差異而容許直接檢測一核酸試樣中的SNP。曾使用其他方法來區別相關生物體中的核酸序列或進行DNA定序。例如Hogan等人之第5,030,557號美國專利揭露，藉由結合“探針”寡核苷酸之外的“輔助性”寡核苷酸可影響單股標的核酸之二級與三級結構，造成在探針與標的核酸之間展現更高的Tm。然而該應用之方式係侷限於僅將雜合作用能用於改變自行黏合性RNA股的二級與三級結構，若該結構未改變，則會傾向於阻止該探針與標的雜合。關於DNA定序，例如K. Khrapko等人於期刊“Federation of European Biochemical Societies Letters”第 256期第 1，2號第118-122頁（1989年）乙文申揭露連續層疊雜合作用造成雙 ⑧ 30 201201700 股穩定作用。此外，J_ Kieleczawa等人於期刊“Science”第258 期第1787-1791頁（1992年）乙文中揭露六聚體的相連串在啟動DNA合成作用之用途，其中該相連串似乎穩定該啟動作用。同樣地，L_ Kotler等人於期刊“Proc NaU Acad. Sci. US A”第90期第4241_4245頁（1993年）乙文中揭露，藉由使用六聚體與五聚體寡核苦酸模組之在DNA定序反應啟動作用中之序列特異性。進一步，S· Parinov等人於期刊“Nucieic

Acids Research”第 24期第 15號第 2998-3004 頁（1996年）乙文中揭露鹼基層疊寡聚物聯同被動式DNA定序微晶片在DNA 定序之用途。此外，G. Yershov等人於期刊“Proc Natl Acad. Sci. USA”第93期第4913-4918頁（1996年）乙文揭露在一被動式微晶片上的SBH中應用驗基層疊能。在Yersh〇v的實例中’將十^^體DNA探針錫疋至微晶片的表面及聯同附加的短探針而與標的序列雜合’其組合似乎穩定該等探針的結合作用。在該形式中’可針對DNA定序鑑定核酸序列的短節段。Yershov進一步指出在其等的系統中使用更短探針(如五聚體）而增加誤配的去穩定效應。在DNA定序中使用該等短探針，係提供沿著所探測的序列識別所存在的誤配之能力，而非位於探針/標的雜合複合體之一特定位置的單一誤配。就該等目的而言’使用較長探針(如八聚體、十聚體及十三聚體寡聚物）之功能較弱。在核酸分析中曾使用驗基層疊之一個附加的方法論實例，係包括Lane等人之第5,770,365號美國專利，其中揭露使用具有一個單股環與一個雙股區域的一種單分子捕捉探 31 201201700 針而捕捉核酸標的之一種方法，該雙股區域係聯同一結合標的，而藉由層疊能作用於穩定雙股形成作用。依據習用方法，可方便地藉由定點誘突變作用改造核苷酸序列。任擇地，可藉由化學合成作用製備核苷酸序列’ 其包括但不限於使用一種寡核苷酸合成器，其中寡核苷酸係以所欲多肽的胺基酸序列為基礎而設計，及較佳選擇在將產生該重組型多肽之宿主細胞中有利的該等密碼子。亦可藉由所選殖基因的誘突變作用，及以突變基因取代其等在一種產生斯賓諾辛的生物中之未突變對應體，而產生新穎的斯賓諾辛。誘突變作用可涉及，例如：1)將一個KR、DH或ER域刪除或去活化，藉此阻斷該等功能中之一或多者，及該品系所產生之一種斯賓諾辛係具有一内酯核，該内酯核具有在斯賓諾辛A的核中不存在之一雙鍵、一羥基或一酮基（參見Donadio等人於1993年乙文）；2)置換一個AT域，藉此在該内酯核中納入一種不同的羧酸(參見Ruan 等人於1997年乙文）；3)在一個現有的PKS模組中添加一個 KR、DH或ER域，藉此該品系所產生之一種斯賓諾辛係具有一内酯核’該内酯核具有在斯賓諾辛A的核中不存在之一飽和鍵、羥基或雙鍵；或4)添加或減除一個完整的PKS模組’藉此該環狀内酯核具有數量較多或較少的碳原子。可藉由以異源PKS裝載置換斯賓諾辛PKS裝載域，而創建一種雜合PKS。如參見第7,626,010號美國專利。進一步察知斯賓諾辛經由附著至斯賓諾辛内酯主鏈之糖類的改質作用，可包括鼠李糖及/或福樂胺醣基團的改質作用或附著不同 32 ⑧ 201201700 的去氧糖類°西班牙的薩拉斯（Salas)集團顯示可藉由不同的糖分子取代現有的糖分子而產生新穎的聚酮化合物。

Rodriguez ·# 人於 2000 年七月期刊 “j. Mol. Microbiol Biotechnol.”第2(3)期第271-6頁乙文。整個申請案中之實例係有助於說明誘突變作用在產生一種具有改質官能度的斯賓諾辛之用途。來自斯賓諾辛基因簇區域的DNA可作為用於辨識同源序列之雜合探針。因此，在此所選殖的DNA可用於自刺糖多孢菌咖⑽㈣基因庫找到重疊此述區域但亦含有來自刺糖多抱菌（Sacchar〇p〇^sp〇m印以⑽岣基因體的鄰近區域之先前未選殖的DNA之其他質體。此外，來自在此所選殖的區域之DNA可用於辨識其他生物體中之並非一致但類似的序列。雜合探針的長度通常至少約2〇個鹼基，及經標記以容許檢測。在本發明中可針對多種目的使用各種類型的誘突變作用。其等包括但不限於定點誘突變作用、隨機點誘突變作用、同源重組作用、DNA重排或其他遞迴誘突變作用方法、嵌合建構作用、使用含尿嘧啶模板之誘突變作用、寡核苦酸定位誘突變作用、經硫代磷酸鹽改質之DNA誘突變作用、使用缺口型雙股DNA或類似者之誘突變作用，或其任一組合。附加的適宜方法包括單點誤配修復、使用修復缺陷型宿主品系之誘突變作用、限制酶切選擇作用與限制酶切純化作用、刪除誘突變作用、藉由全基因合成之誘突變作用、雙股斷裂修復之類。在本發明中亦涵蓋包括但不限 33 201201700 於涉及嵌合建構物之誘突變作用。在一實施例中，可藉由天然存在分子或經改變或經突變的天然存在分子之已知資訊引導誘突變作用，包括但不限於序列、序列比較、物理性質、晶體結構或類似者。在本文中所見之内容與實例係說明該等程序。附加資訊可參見所引用之下列出版物與參考資料：Ling等人於期刊‘‘Anal Biochem.” 第 254(2)期第 157-178 頁（1997 年）之 “DNA誘突變方法：概述(Approaches to DNA mutagenesis: an overview)’’乙文；Dale等人於期刊“Methods Mol. Biol.” 第57期第369-374頁（1996年）之“使用硫代磷酸鹽方法之寡核苦酸定位隨機誘突變作用（Oligonucleotide directed random mutagenesis using the phosphorothioate method)’，乙文；Smith於期刊 “Ann. Rev. Genet.” 第 19期第 423-462 頁 (1985年）之“試管中之誘突變作用（In vitro mutagenesis)”乙文；Botstein與Shortle於期刊“Science”第229期第 1193-1201 頁（1985年）之“試管中的誘突變作用之策略與應用 (Strategies and applications of in vitro mutagenesis)，，乙文； Carter於期刊 “Biochem. J_” 第 237期第 1-7 頁（1986年）之“定點誘突變作用（Site directed mutagenesis)” 乙文；Kunkel於 “核酸與分子生物學(Nucleic Acids & Molecular Biology)” 乙書（由德國柏林的施普林格（Springer-Verlag)公司出版及由Eckstein，F.與Lilley，D. M. J.編輯)之“寡核苷酸定位誘突變作用之效率（The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis)’’ 乙文（1987年）；Kunkel於期刊“Proc. Natl. Acad. 34 ⑧ 201201700

Sci. USA”第82期第488-492頁（1985年)之“毋需表現型選擇作用之快速與高效的位點特異性誘突變作用（Rapid and efficient site specific mutagenesis without phenotypic selection)’’乙文；Kunkel於期刊“Methods in Enzymol·，，第 154 期第367-382頁（1987年）之“毋需表現型選擇作用之快速與南效的位點特異性誘突變作用（Rapid and efficient site specific mutagenesis without phenotypic selection)，，乙文； Bass等人於期刊“Science”第242期第240-245頁（1988年）之 “具有新的DNA結合特異性之突變株Trp抑制子(Mutant Trp repressors with new DNA binding specificities)”乙文；期刊 “Methods in Enzymol.” 第 100期第 468-500頁（1983年）乙文；期刊 “Methods in Enzymol.”第 154期第 329-350頁（1987年）乙文；Zoller與 Smith於期刊 “Nucleic Acids Res.” 第 10期第 6487-6500頁（1982年）之“使用M13所衍生的載體之寡核苷酸定位誘突變作用：用於在任一DNA片段中產生點突變作用之一種高效與通用程序（Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment)”乙文；Zoller與Smith於期刊“Methods in Enzymol.”第100期第468-500頁（1983年)之“植入M13載體中的DNA片段之寡核苷酸定位誘突變作用 (Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into Ml 3 vectors)”乙文；Zoller 與 Smith於期刊 “Methods in Enzymol.” 第 154期第 329-350 頁（1987年）之“寡 35 201201700 核苷酸定位誘突變作用：使用二種募核苷酸引子與一種單股 DNA 模板之一簡單方法（Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template)” 乙文；Taylor 等人於期刊“Nucl· Acids Res.”第 13 期第 8749-8764 頁（1985 年）之“經硫代磷酸鹽改質的DNA在限制酶反應中製備缺口型 DNA之用途（The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA)” 乙文；Taylor等人於期刊 “Nucl. Acids Res.”第 13期第 8765-8787 頁（1985年)之“使用經硫代磷酸鹽改質的DNA快速產生高頻率的寡核苦酸定位突變作用（The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA)’’ 乙文；Nakamaye 與 Eckstein於期刊 “Nucl_ Acids Res.” 第 14 期第 9679-9698 頁 (1986年)之“硫代磷酸鹽基團對於限制性核酸内切酶Nci I的剪切作用之抑制及其在寡核苷酸定位誘突變作用之應用 (Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis)’’ 乙文；Sayers 等人於期刊 “Nucl. Acids Res.”第 16 期第 791-802 頁（1988 年）之“硫代磷酸鹽式寡核苷酸定位誘突變作用中之Y-T 核酸外切酶（Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis)’’乙文；Sayers 等人於期刊“Nucl. Acids Res.”第 16期第 803-814頁（1988年）之“在溴 36 ⑧ 201201700 化乙錠存在下藉由與限制性核酸内切酶反應之含硫代填酸鹽DNA的股特異性剪切作用（strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide)”乙文；Kramer於期刊“Nucl. Acids Res.”第 12期第 9441-9456頁（1984年）之“寡核苷酸定位突變建構作用之缺口型雙股DNA方法（The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction)’’ 乙文； Kramer 與 Fritz 於期刊 “Methods in Enzymol·，，第 154 期第 350-367頁（1987年）之“經由缺口型雙股DNA的突變作用之寡核苦酸定位建構(Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA)，’乙文；Kramer等人於期刊“Nucl· Acids Res.”第16期第7207頁（1988年)之“用於突變作用的寡核苷酸定位建構之缺口型雙股DNA方法中之改良型試管中酵素反應(Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations)” 乙文；Fritz 等人於期刊“Nucl. Acids Res.”第16期第6987-6999頁（1988年）之“突變作用之寡核苷酸定位建構：毋需試管中酵素反應之一種缺口型雙股 DNA 程序（Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro)” 乙文；Kramer 等人於期刊 “Cell”第38期第879-887頁（1984年）之“單點誤配修復(Point Mismatch Repair)’，乙文；Carter 等人於期刊“Nucl. Acids 37 201201700

Res.”第13期第4431-4443頁（1985年）之“使用M13載體之改良型寡核苦酸定點誘突變作用（Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using Ml3 vectors)”乙文；Carter 於期刊“Methods in Enzymol.” 第 154期第 382-403 頁（1987年）之“使用M13載體之改良型寡核苷酸定位誘突變作用 (Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors)” 乙文；Eghtedarzadeh與Henikoff於期刊 “Nucl. Acids Res.”第14期第5115頁（1986年）之“使用寡核苷酸以產生大型刪除作用（Use of oligonucleotides to generate large deletions)” 乙文；Wells 等人於期刊 “Phil. Trans. R. Soc. Lond.”第A3 Π期第415-4；23頁（1986年）之“氫鍵形成在穩定枯草桿菌蛋白酶的過渡狀態之重要性（Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin)”乙文；Nambiar 等人於期刊 “Science” 第223 期第 1299-1301頁（1984年）之“編碼核糖核酸酶S蛋白的一基因之全合成作用及轉殖作用（Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein)’，乙文；Sakamar 與Khorana於期刊“Nucl. Acids Res.”第 14期第 6361-6372頁 (1988年）之“用於牛桿體外節段烏嘌呤核苷酸結合蛋白（轉導蛋白）的a次單元之一基因的全合成作用與表現作用（Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin))”乙文；Wells等人於期刊“Gene”第34期第 315-323頁（1985年)之“卡匣誘突變作用：用於在所界定的位 38 ⑧ 201201700 點產生多重突變作用之一種高效方法(Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites)’’乙文；Grundstrom 等人於期刊 “Nucl. Acids Res.”第13期第3305_3316頁（1985年）之“藉由微尺度‘散彈槍’基因合成作用之寡核苷酸定位誘突變作用 (Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ‘shot-gun’ gene synthesis)”乙文；1^&11<^。10於期刊“？1'〇〇· Natl. Acad. Sci. USA” 第 83期第 7177-7181 頁（1986年)之“在大腸桿菌質體中之寡核苷酸定位雙股斷裂修復：用於位點特異性誘突變作用之一種方法（Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis)” 乙文；Arnold於期刊 “Current Opinion in Biotechnology” 第 4期第 450-455 頁（1993 年）之“用於不尋常環境之蛋白質工程(Protein engineering for unusual environments)”乙文；Sieber等人於期刊“Nature Biotechnology”第 19期第 456-460頁（2001 年）乙文。W. P. C. Stemmer 於期刊 “Nature” 第 370 期第 389-91 頁（1994 年）乙文；及I· A. Lorimer、I. Pastan於期刊“Nucleic Acids Res.” 第23期第3067-8頁（1995年）乙文。有關上述多種方法之更多細節可參見酵素學方法(Methods in Enzymology)”乙書第 154冊，其亦說明對於以各種誘突變方法排除困難之問題之有用的控制。 “同源性”或“一致性百分比”等詞在此係以可互換方式使用。就本發明之目的而言，在此界定為測定二種胺基酸 39 201201700 序列或二種核酸序列的一致性百分比，該等序列係就最佳化比較之目的予以排比（如可在第一胺基酸或核酸序列的序列中引入間隙，以供與第二胺基酸或核酸序列之最佳化排比）。然後比較位於對應的胺基酸位置或核苷酸位置之胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的一位置係由與第二序列中的對應位置之相同胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則該等分子係在該位置具一致性。二個序列之間的一致性百分比，係該等序列所共享之一致性位置的數目之函數（亦即— 致性—致性位置的數目/位置總數（亦即重疊位置 xioop該二序列較佳具有相同長度。嫻熟技藝者將知悉數種不同的電腦程式可用於測定二種序列之間的同源性。例如’可使用一種數學演算法完成序列之比較’及測定二種序列之間的一致性百分比。在— 個較佳實施例中，使用Needleman與Wunsch演算法(於期刊 “J. Mol. Biol·’’第 48 期第 444-453 頁（1970 年）乙文）測定二種胺基酸序列之間的一致性百分比’已將該演算法納入GCg 軟體包（可在網際網路上自愛塞瑞思（accelrys)公司網站及更具體自http://www.accelrys.com取得）的GAP程式中，其係使用一種布洛索姆(Blossom) 62矩陣或—種pAM25〇矩陣，及間隙權重為16、14、12、10、8、6或4而長度權重為卜2、 3、4、5或6。嫻熟技藝者將明瞭所有該等不同的參數將產生略微不同的結果’但是當使用不同的演算法時，二種序列的整體一致性百分比並無顯著變化。在又一實施例中，使用GCG軟體包（可在網際網路上自 201201700 愛塞瑞思公司網站及更具體自http://www.accelrys. com取得）中的GAP程式測定二種核苷酸序列之間的一致性百分比，使用一種NWSgapdna.CMP矩陣及間隙權重為40、50、 60、70或80及長度權重為1、2、3、4、5或6。在另一實施例中，使用E. Meyers與W· Miller的演算法（於期刊 “CABIOS”第4期第11-Π頁（1989年）乙文）測定二種胺基酸或核苷酸序列之間的一致性百分比，已將該演算法納入使用一種PAM120權重殘基表、間隙長度罰分為12及間隙罰分為4之排比（ALIGN)程式（2·0版）（可在網際網路上自維加 (vega)網站取得，更具體地自ALIGN-IGH蒙彼利埃 (Montpellier)取得’或更具體地自 http://vega.igh.cnrs.fr/bin/ align-guess.cgi 取得）中。可進一步使用本發明的核酸與蛋白質序列作為一種 “查詢序列” ’以在公共資料庫中進行搜尋，例如識別出其他家族成員或相關序列。可使用Altschul等人（1990年)於期刊“J. Mol_ Biol.”第215期第403-10頁乙文所述之BLASTN與 BLASTX程式(2.0版）’進行該等搜尋。可使用BLASTN程式進行基本局部排比搜尋工具(BLAST)之核苷酸搜尋，其中得分為10 0及字長為12，以獲得與本發明的核酸分子同源之核苷酸序列。可使用BLASTX程式進行BLAST之蛋白質搜尋，其中得分為50及字長為3，以獲得與本發明的蛋白質分子同源的胺基酸序列。為獲得供比較目的用之具間隙的排比，可使用如Altschul等人於期刊“Nudeic Acids Res.”第 25(17)期第3389-3402頁（1997年）乙文中所述之具間隙的 41 201201700 BLAST。當使用BLAST與具間隙的BLAST程式時，可使用個別程式（如BLASTX與BLASTN)的預設參數。（可在網際網路上自美國國家生物技術資訊中心（ncbi)網站及更具體自 http://www. ncbi.nlm.nih.gov取得）。本發明的其他實施例可包括在…《尺基因中的操作，其可包括可中斷W«尺的正常閱讀框之單一或多個核苷酸鹼基刪除作用。該等刪除作用可包括自1至1194個核苷酸。該刪除作用影響孕《尺的正常閱讀框，導致產生一種製造賜諾特前驅物的品系。本發明的另一實施例可包括在基因中的操作，其可包括在jp«尺編碼區域内之單一或多個核苷酸插入作用及其中斷的正常閱讀框。該插入作用影響印„尺的正常閱讀框’導致產生一種製造賜諾特前驅物的品系。本發明的附加實施例可包括在基因中的操作，其包括使用反sfl息或sfl息技術’以廢除或顯著干擾印蛋白的生產作用。嫻熟技藝者知道如何達成反訊息與共同抑制效應。例如 ’ J〇rgensen(於期刊“Trends Biotechnol.” 第 8期 (1990年）第 340-344頁乙文）、Niebel等人(於期刊 “Curr. Top. Microbiol. Immunol.” 第 197期（1995年）第 91-103 頁乙文）、 Flavell 等人(於期刊 “Curr. Top. Microbiol. Immunol·’，第 197 期（1995年）第43-46頁乙文）、Palaqui與Vaucheret(於期刊 “Plant. Mol. Biol.” 第 29期（1995 年）第 149-159 頁乙文）、 Vaucheret等人（於期刊 “Mol. Gen. Genet.”第 248期（1995年）第311-317頁乙文）、（168〇1^等人(於期刊“]^〇1.〇611.〇61^.，， ⑧ 42 201201700 第243期（1994年）第613_621頁乙文）曾述及共同抑制性抑制作用之方法。本發明因此進一步提供基因沉默化之方法，藉由在一生物體諸如刺糖多孢菌（《s. sp/wosiZ)中表現在一訊息或反訊息導向序列的5’或3,具有一反向重複之一核酸，其中該訊息或反訊息導向序列係與待壓制的標的基因具有實質的序列一致性，但該反向重複在序列上與標的基因不相關。在另一實施例中，該異源反向重複係側臨一個5,與3,導向序列。基因沉默化建構物可在所選擇的生物體中表現，如一種細菌細胞、真菌細胞、真核細胞如一種植物細胞或哺乳類動物細胞。適用於本發明中之表現載體係包括原核與真核載體 (如質體、噬菌體質體或噬菌體），及包括哺乳類動物載體與植物載體。適宜的原核載體包括諸如但不限於在放線菌屬 (mio—ces)的DNA操作中所常用之該等質體（例如 pSET152、pOJ260、pIJl(H、pJVl、pSG5、pHJL302、pSAM2、 pKC1250)。該等質體係由Kieser等人(2000年之“實用鏈黴菌遺傳學(Practical Streptomyces Genetics)” 乙書）所揭露。其他適宜的載體可包括諸如可在大腸桿菌（五· co/ί)中複製的該等質體(例如pBR322、ColE卜 pSCl(H、PACYC 184、itVX、 pRSET、pBAD(美國加州卡爾斯巴德的英杰(Invitrogene)公司）之類）。該等質體係由Sambrook所揭露（參見冷泉港實驗室（1989年）出版之由Sambrook、Fritsch及Maniatis編輯之“分子選殖：實驗室手冊（Molecular Cloning: A Laboratory 43 201201700

Manual)”第二版）’及該等載體中之多者能以商品取得。桿菌（Sac/Z/ws)質體包括pci94、pC221、pT127之類，及係由 Gryczan所揭露(於美國紐約的學術出版社出版之“桿菌分子生物學（The Molecular Biology 〇f the Bacilli)” 乙書（1982年）第307-329頁）。適宜的鏈黴菌質體包括plil〇1(Kendall等人於1987年期刊‘7.83(^丨〇1.’’第169期第4177-4183頁乙文），及鏈黴菌噬菌體包括但不限於諸如ψ(：3丨(Chater等人於匈牙利布達佩斯的Akademiai Kaido出版社出版之‘‘第六屆國際放線菌目生物學研討會論文集（Sixth Internati〇nai

Symposium on Actinomycetales Bi〇l〇gy)’’（i986年）第 45-54 頁乙文）。John等人(於1986年期刊“Rev· infect_ !^.，，第8期第 693-704頁乙文)與Izaki(於 1978年期刊“jpn. j. Bacteriol.”第 33期第729-742頁乙文）曾評論假單胞菌質體。就研究及研發更適合一特定目的之經基因工程化的生物體而言’抑制特定基因的表現作用係一重要工具。可在相對於其啟動子的反afL息疋向（如參見sheehy等人於期刊 “Proc. Nat’l Acad. Sci. USA” 第 85期第 8805_8808 頁（1988年) 乙文；Smith等人於期刊“Nature”第334期第724-726頁（1988 年）乙文），或在相對於其啟動子的訊息定向（Nap〇H等人於期刊“Plant Cell” 第 2 期第 279-289頁（1990 年）乙文；van der Krol等人於期刊“Plant Cell”第2期第291-299頁（1990年）乙文；第5,034,323號美國專利；第5,231,〇2〇號美國專利；及第5,283，184號美國專利）’藉由引入對應於所感興趣的基因之一轉殖基因’而完成基因沉默化，二者均導致轉殖基因 ⑧ 201201700 以及内源性基因的表現作用降低。曾報導藉由反訊息RNA的小型（20至25個核苷酸）片段之累積作用，達成後轉錄基因沉默化；可自一種RNA模板合成反訊息RNA的小型片段，及代表該方法之特異性與移動性決定因子(Hamilton與Baulcombe於期刊“Science”第286 期第950-952頁（1的9年）乙文）。已經明瞭dsRNA(雙股RNA) 之引入係在多種生物體中導致基因沉默化之一重要成分 (Fire等人於期刊“Nature”第391期第806-811頁（1998年）乙文；Timmons與Fire於期刊 “Nature” 第 395期第 854頁（1998年）乙文；W099/32619 ; Kennerdell與Carthew於期刊“Cell”第 95期第1017-1026頁（1998年）乙文；Ngo等人於期刊“Proc. Nat’l Acad. Sci· USA” 第 95期第 14687-14692 頁（1998年）乙文；Waterhouse等人於期刊“proc· Nat’l Acad· Sci· USA”第 95期第 13959-13964頁（1998年）乙文；W099/53050; Cogoni 與Macino於期刊“Nature”第399期第166_169頁（1999年）乙文；Lohmann等人於期刊“Dev. Biol.”第214期第211-214頁 (1999年）乙文；Sanchez-Alvarado與Newmark於期刊 “proc_

Nat’l Acad. Sci. USA” 第 96 期第 5049-5054 頁（1999 年）乙文）。在細菌中’受抑制的基因不需為一種内源性細菌基因，因為藉由引入轉殖基因，報導子轉殖基因與病毒基因均受到後轉錄基因沉默化(English等人於期刊“Plant Cell” 第8期第179-188頁（1996)乙文；Waterhouse等人同上乙文）。然而’在上述的所有情況下，在所引入的轉殖基因與受抑制基因之間較佳可存在一些序列相似性。 45 201201700 在先前實例中’將CaMV35S啟動子控制下之由—種 ACC氧化酶基因的5’-UTR(“未轉譯區域，’）、編碼區域及 3’-UTR所組成之一訊息轉殖基因引入，而造成丨5〇/。的番祐植株種群中之ACC氧化晦酵素活性降低(Hamilton等人於期刊‘‘Plant J.” 第 15 期第 737-746 頁（1998 年）乙文；w〇 98/53083)。然而，若在建構物中包括該ACC氧化酶的部分 5’-UTR之反向與訊息重複，則在96%的植株中觀察到抑制作用（Hamilton等人同上乙文）。此外，在序列上與該轉殖基因的編碼區域相關但非與該轉殖基因的5’_UTR^關之另一 ACC氧化酶基因之抑制作用受到壓制，顯示轉錄本的任一部分之雙股RNA係以整個RNA轉錄本為降解標的。此外，已藉由將含有病毒或報導子基因的編碼區域之反向重複之建構物引入，或藉由將表現標的基因之編碼區域的訊息與反訊息轉錄本之植株雜交在一起，而發現高頻率與高水平的後轉錄基因沉默化（Waterhouse等人於期刊“Proc. Nat，1

Acad. Sci. USA”第 95期第 13959-13964 頁（1998年）乙文）。藉由在不同的啟動子控制下之訊息與反訊息轉殖基因的表現作用’在相同植物中付到類似的結果(Chuang與Meyerowitz 於期刊 “Proc. Nat’l Acad. Sci· USA” 第 97期第 4985-4990頁 (2000年）乙文）。本發明的其他貫施例可包括在尺基因中的操作’其包括基因沉默化。“基因沉默化，，一語係指藉其減少或衰減一特定基因產物的表現作用之一種方法。可藉由多種途徑進行基因沉默化。除非另有說明，如用於此之基因沉默化 ⑧ 46 201201700 係指RNA干擾(RNAi)所造成之基因產物表現之降低，其係一種經界定但部分經特徵化分析之途徑，藉此小型抑制性 RNA(siRNA)協同宿主蛋白（如RNA誘導型沉默複合體 (RISC))發揮作用’而以一種序列依賴性方式降解信使^^八 (mRNA) 〇可藉由多種方式測量基因沉默化的水平，包括但不限於藉由北方墨點分析法、B-DNA技術、對於轉錄作用靈敏的報導子建構物、表現作用剖析（如DNA晶片）及相關技術測篁轉錄本水平。任擇地，可藉由評估由一特定基因所編碼的蛋白之水平’而測量沉默化水平。其可藉由進行數種研究包括西方(Western)分析、測量具有如螢光性質（如 GFP)或酵素性活性（如驗性磷酸酶)之一報導子蛋白的表現水平或其他數種程序而完成。附加的實施例包括在#«尺基因的活性位點或受質結合位點的早·一或多個胺基酸取代作用’其使得”《尺基因失能及導致斯賓諾辛J/L生產作用。一般而言，該等嫻熟技藝者將明瞭，可在本發明之肽的胺基酸序列進行次要刪除作用或取代作用而不過度損及其活性。因此，含有該等刪除作用或取代作用之蛋白與肽係本發明的另一個方面。在含有胺基酸取代或置換作用之肽中，肽序列中的一或多個胺基酸可由一或多個其他胺基酸置換，其中該置換作用不影響該序列的功能。該等改變可遵循胺基酸之間在物理特性諸如電荷密度、疏水性/親水性、尺寸與構形之已知相似性，藉此胺基酸係由功能性質實質相同的其他胺基酸取代。例如：丙胺酸可由纈胺酸或絲胺酸置換；纈胺酸可由丙胺酸、 47 201201700 白胺酸、曱硫胺酸或異白胺酸置換，較佳由丙胺酸或白胺酸置換；白胺酸可由丙胺酸、纈胺酸或異白胺酸置換，較佳由纈胺酸或異白胺酸(lie)置換；甘胺酸可由脯胺酸或半胱胺酸置換，較佳由脯胺酸置換；脯胺酸可由甘胺酸、半胱胺酸、絲胺酸或曱硫胺酸置換，較佳由甘胺酸、半胱胺酸或絲胺酸置換；半胱胺酸可由甘胺酸、脯胺酸、絲胺酸或曱硫胺酸置換，較佳由脯胺酸或曱硫胺酸置換；曱硫胺酸可由脯胺酸或半胱胺酸置換，較佳由半胱胺酸置換；組胺酸可由苯丙胺酸或麩醯胺（Gin)置換，較佳由苯丙胺酸置換；苯丙胺酸可由組胺酸、酪胺酸或色胺酸置換，較佳由組胺酸或酪胺酸置換；酪胺酸可由組胺酸、苯丙胺酸或色胺酸置換，較佳由苯丙胺酸或色胺酸置換；色胺酸可由苯丙胺酸或酪胺酸置換，較佳由酪胺酸置換；天冬醯胺酸可由麩醯胺(Gin)或絲胺酸置換，較佳由麵醯胺置換；麩醯胺 (KGln)可由組胺酸、離胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸或絲胺酸置換，較佳由天冬醯胺酸或絲胺酸置換；絲胺酸可由麩醯胺(Gin)、蘇胺酸、脯胺酸、半胱胺酸或丙胺酸置換；蘇胺酸可由麩醯胺或絲胺酸置換，較佳由絲胺酸置換；離胺酸可由麩醯胺(Gin)或精胺酸置換；精胺酸可由離胺酸、天門冬胺酸或麩胺酸置換，較佳由離胺酸或天門冬胺酸置換；天門冬胺酸可由離胺酸、精胺酸或麩胺酸置換，較佳由精胺酸或麩胺酸；及麩胺酸可由精胺酸或天門冬胺酸置換，較佳由天門冬胺酸置換。一旦製成之後，可例行篩檢該等改變，俾測定其等對於功能的效應。 48 ⑧ 201201700 本發明的发仙〜包括核糖體結括在〆基时的操作，其列上游之核糖辦处^ )之操作。可操作位於編碼序

Dalgarno))，_ &、。口位點（標示為夏因-達爾加諾（Shine_ 賜諾特前驅基因受到中斷，而導致產生一種製造傳二二:::贿包括影響用於-咖的多種 ,i6,0 ,抑制作用’其可造成產生-種製造賜諾 ” 與-標的相關聯的酵素性活性之方法可包括使用酵素連結分析。的另—實施例係包括用於編碼該#«尺基因的啟】之中斯作用。該中斷作用可經由任—類型的操不限於截斷作用、刪除作用、點突變作用及插入作用α亥等操作可在框内或框外。該等操作產生一種製造賜諾特的品系。在下列非限制性實例中更詳細地說明本發明。第1例：在内產生點突變作用 ”、_由產生Α與D的刺糖多抱菌 spiwosa) 〇口系之隨機誘突變作用（Kieser等人於moo年乙文"在孕^7尺内產生點突變作用。產生斯賓諾辛J與L·而非斯負法辛A與D之突變品系進一步經由尺基因的pcr擴增作用進行特徵分析’接著進行DNA定序。使用防故障 (FailSafe) PCR系統（美國威斯康辛州麥迪遜的埃昆森特 (Epicentre)生物技術公司），以屮„/〇?(序列辨識編號：丨；gg

GAATTCCATATGTCCACAACGCACGAGATCGA) M spnKR 49 201201700 (序列辨識編號：2 ; GCCGCTCGAGCTCGTCCTCCGCGCTG TTCACGTCS)進行基因的PCR擴增作用。所產生的 PCR產物係使用默比爾超潔淨PCR清理型（MoBio Ultraclean PCR Clean-up) DNA純化套組（美國加州索拉納海灘(Solana Beach)的默比爾實驗室（MoBio Laboratories)公司）純化，及使用T4 DNA連接酶（美國加州卡爾斯巴德的英杰生命(Invitrogene Life)公司）選殖至TA選殖載體中。將推測含有PCR產物的細菌菌落分離，及經由限制酶酶切作用確認。如製造廠商的操作程序所述，使用CEQTM DTCS-快速啟動(Quick Start)套組（美國加州帕羅奥圖（ρ&ι〇 Alto)的貝克曼-科爾特(Beckman-Coulter)公司），進行陽性質體殖株之 DNA定序。如製造廠商的操作程序所述，使用波豐瑪 (Performa) DTR凝膠過濾盒（美國馬里蘭州蓋瑟斯堡 (Gaithersburg)的愛吉生物系統(Edge BioSystems)公司），純化δ玄反應。在貝克曼-科爾特（Beckman-Coulter) CEQ™ 2000 XL DNA分析系統上分析序列反應，及使用 SEQUENCHER (美國密西根州安娜堡（Ann Arbor)的基因編碼(Gene Codes Corporation)公司）進行核苷酸特徵分析。定序結果確認在基因序列内的點突變作用之位置。所產生的點突變作用係列於第1表中，及為第丨圖中的陰影部分。可在Burns等人(WO 2003070908)所述之條件下，進行刺糖多孢菌咖⑽⑽)的π从突變品系之發酵作用。可在Baltz等人（第6，143,526號美國專利）所述之條件下，分析發酵液中是否存在斯賓諾辛因子。為確認在 50 ⑧ 201201700 上清液中存在斯賓諾辛因子，發酵液的萃取物在真空離心濃縮機（SpeedVac)中乾燥過夜’接著將殘餘物分溶於水與乙醚之間。在氮氣流下，藉由蒸發作用乾燥乙醚層。然後將試樣溶於丙酮中，及轉移至用於1〇質子1^^/〇1擷取的—個 NMR管中。將NMR廓型與斯賓諾辛標準相比較。NMR結果顯示所存在的J/L超過A/D。相較於產生含有斯賓諾辛八與〇之一種斯賓諾辛混合物之對照組刺糖多孢菌如），含有點突變的品系之發酵作用產生含有斯賓諾辛J與L之一種斯賓諾辛混合物。第1表：在尺内之點突變清單、其等的位置及該等品系在發酵作用期間所產生的斯賓諾辛（spinsoyn)化合物。品系# 所產生的突變作用突變作用位置斯賓諾辛化合物之產生 1 TGG(W)+TGA終止密碼子第528鹼基對斯賓諾辛J與L 2 CGC(R)+TGC(C) 第589鹼基對斯賓諾辛J與L 3. GGT(G)+GAT(D) 第602鹼基對斯賓諾辛J與L 4. GGC(G)->GAC(D) 第668鹼基對斯賓諾辛J與L 5. CTC(L)->TTC(F) 第721鹼基對斯賓諾辛J與L 6. GAC(D)->GGC(G) 第794鹼基對斯賓諾辛J與L 7. CGG(R)-^TGG(W) 第862鹼基對斯賓諾辛J與L 8· GAT(D)->AAT(N) 第895鹼基對斯賓諾辛·!與L 9. ACC(T)今 ATC(I) 第908鹼基對斯賓諾辛J與L 10. CAG(Q)~>TAG終止密碼子第937鹼基對斯賓諾辛J與L 11. TGG(W)4TGA終止密碼子第1131鹼基對斯賓諾辛J與L 對照組野生型對照組不適用斯賓諾辛A與D 第2例 :產生一種5/;«兄刪除突變作用建構·Ψ «火框内刪除載體使用一種產生斯賓諾辛A與D之品系（Hopwood等人於 1985年乙文）的基因體DNA，進行一種具1，595個鹼基對的 DNA片段之PCR擴增作用。該片段跨越屮„尺的起始密碼子 51 201201700 及含有編碼區域而無的5,端（第2圖）。使用防故障 (FailSafe) PCR套組（美國威斯康辛州麥迪遜的埃琵森特生物技術公司）及前置引子# 1 (序列辨識編號：3 ; CGGTGCCCG AATTCCATGACCCG)與反置引子#1(序列辨識編號：4 ; GT GCGTTCTAGACATATGAGCTCCTCATGGCTG)，完成該 PCR反應。完成第二PCR反應及其產生一種丨，951個鹼基對的DNA 片段；該片段含有尺的3’端、完整不變的及的5, 端（第2圖）。使用防故障(FailSafe)PCR套組及前置引子#2(序列辨識編號：5 ; GTGCCATCTAGAGTGGAGGACATATTGC ACCTG)與反置引子#2(序列辨識編號：6; GAATGCGAAGC TTACGATCTCGTCGTCCGTG)，完成該PCR反應。依照製造廠商的說明書’使用QIAquick PCR純化套組（美國加州瓦倫西亞(Valencia)的凱傑(Qiagen)公司）純化PCR產物。該1，595個鹼基對的PCR片段係以五co/?/與那α/酶切。該 1，951驗基對的PCR片段係以Jfta/與酶切。在限制酶酶切作用完成時，使用QIAquick PCR純化套組純化該等片段。使用快速鍵接(FastLink) DNA連接套組（美國威斯康辛州麥迪遜的埃琵森特公司），將經酶切的片段連接而對應質體pOJ260的五coi?/與所W///酶切位點，及轉形至大腸桿菌（五 co/ί) ΤΟΡ10勝任細胞（美國加州卡爾斯巴德的英杰公司）中。挑選菌落及經由限制酶酶切作用與DNA序列分析，@ 篩檢出所欲的連接產物。辨識出陽性殖株，及所選擇的— 殖株係用於刺糖多抱菌职.⑽扣）中的

(S 52 201201700 印《尤之後續框内删除作用。在質體p〇J26〇内之所刪除的 spn尺基因片段之所得序列係示於第2表。第2表：所刪除的尺基因之核苷酸序列排比。 1 40 sp/jAX序列辨識編號：17) ίρ«Α：刪除（序列辨識編號：9) sp«A：(序列辨識編號：17) jpn/r刪除（序列辨識編號：9) ίρ/ιλ：(序列辨識編號：17) •sp/jA：刪除（序列辨識編號：9) 印/1尺(序列辨識編號：17) sp/jA：刪除（序列辨識編號：9) 叹《尺(序列辨識編號：17) sp«A：刪除（序列辨識編號：9) 序列辨識編號：17) spnA：刪除（序列辨識編號：9) ίρ«λ：(序列辨識編號：17) 印《火刪除（序列辨識編號：9) spnA：(序列辨識編號：17) ϊρ«Α：刪除（序列辨識編號：9) sp/iA：{序列辨識編號：17) ίρ«Α：刪除（序列辨識編號：9) 序列辨識編號：17) V«A：刪除（序列辨識編號：9) _尺(序列辨識編號：17) ip«A"刪除（序列辨識編號：9)

(1) ATGTCCACAACGCACGAGATCGAAACCGTGGAACGCATCA (1) ATGTCT......—............-...............-............ 41 80

(41) TCCTCGCCGCCGGATCCAGTGCGGCGAGCCTGGCCGACCT (7)..................................................-............ 81 120

(81) GACCACCGAACTCGGACTCGCCAGGATCGCACCCGTGCTG (7).......................................................... 121 160

(121) ATCGACGAGATCCTCTTCCGCGCGGAACCGGCCCCCGACA (7)—-.............-....................................... 161 200

(161) TCGAACGGACCGAGGTCGCGGTCCAGATCACCCACCGAGG (7)-...............-........................................ 201 240

(201) CGAGACCGTTGACTTCGTCCTGACGCTACAGTCCGGTGAG (7).......................................................... 241 280

(241) CTGATCAAGGCCGAGCAACGACCGGTCGGAGACGTCCCGC (7).........................................-................ 281 320

(281) TGCGGATCGGTTACGAGCTCACCGATCTCATCGCCGAGTT (7).......................................................... 321 360

(321) GTTCGGCCCAGGAGCTCCCAGGGCCGTCGGCGCCCGGAGC ⑺……-................................................... 361 400

(361) ACCAACTTCCTCCGAACCACCACATCCGGTTCGATACCCG (7)—....................................................... 401 440

(401) GTCCGTCGGAACTGTCCGATGGCTTCCAGGCCATCTCCGC (7)……-.............-...................................... 441 480 53 201201700 ipnA：(序列辨識編號： 17) (441) 刪除（序列辨識編號 :9) (7) #17A：(序列辨識編號： 17) (481) ίρ/ιλ·刪除（序列辨識編號 :9) ⑺ ίρηΑ：(序列辨識編號： 17) (521) ϊρηλ"刪除（序列辨識編號 :9) ⑺ ίρηΛ：(序列辨識編號： 17) (561) 刪除（序列辨識編號 :9) (7) spnK(序列辨識編號： 17) (601) jpnA：刪除（序列辨娥編號 :9) ⑺ 序列辨識編號： 17) (641) ϊρυ 刪除（序列辨識編號 :9) (7) (序列辨識編號： 17) (681) spnK刪除（序列辨識編號 ·· 9) (7) jpnA：(序列辨識編號： Π) (721) 刪除（序列辨識編號 :9) (7) ip/J尺(序列辨饿編號： 17) (761) 尺刪除（序列辨識編號 :9) (7) spnA：(序列辨識編號： 17) (801) ίρ/ιΑ"刪除（序列辨識編號 :9) (7) spnK(序列辨锒编號·· 17) (841) 刪除（序列辨識編號 :9) (7) spnK(序列辨識編號： 17) (881) 刪除（序列辨識編號 :9) ⑺ spnfC(序列辨Μ編號： 17) (921) spnA：刪除（序列辨識編號 :9) ⑺

AGTGGTCGCCGGCTGCGGGCACCGACGTCCCGACCTCAAC

481 520 TTGCTCGCCTCCCACTACCGCACGGACAAGTGGGGCGGCC

521 560 TGCACTGGTTCACCCCGCTATACGAGCGACACCTCGGCGA

561 600 GTTCCGTGATCGCCCGGTGCGCATCCTGGAGATCGGTGTC

601 640 GGTGGCTACAACTTCGACGGTGGCGGCGGCGAATCCCTGA

641 680 AGATGTGGAAGCGCTACTTCCACCGCGGCCTCGTGTTCGG

681 720 GATGGACGTTTTCGACAAGTCCTTCCTCGACCAGCAGAGG

721 760 CTCTGCACCGTCCGCGCCGACCAGAGCAAGCCCGAGGAGC

761 800 TGGCCGCCGTTGACGACAAGTACGGACCGTTCGACATCAT

801 840 CATCGACGATGGCAGCCACATCAACGGACACGTGCGCACA

841 880 TCCCTGGAAACGCTGTTCCCCCGGTTGCGCAGCGGTGGCG

881 920 TATACG 丁 GATCGAGGATCTGTGGACGACCTATGCTCCCGG

921 960 ATTCGGCGGGCAGGCGCAGTGCCCGGCCGCACCCGGCACC 961 1000 54 ⑧ 201201700 序列辨識編號：17) ίρ«λ：刪除（序列辨識編號：9) sp«A：(序列辨識編號：17) jp«尺刪除（序列辨識編號：9)

(961) ACGGTCAGCCTGCTCAAGAACCTGTTGGAAGGCGTTCAGC (7)......................................................—- 1001 1040

(1001) ACGAGGAGCAGCCGCATGCGGGCTCGTACGAGCCGAGCTA (7).................-.....................-.................. 1041 1080 序列辨識編號：17) sp/ιλ：刪除（序列辨識編號：9) (1041) (7)

CCTGGAACGCAATTTGGTCGGCCTCCACACCTACCACAAC 1081 1120 印wA：(序列辨識編號：17) ίρηΑ：刪除（序列辨識編號：9) ypn/C(序列辨識編號：17) jpn/：刪除（序列辨識編號：9)

(1081) ATCGCGTTCCTGGAGAAAGGCGTCAACGCCGAAGGCGGCG (7) 1160 1121

(1121) TTCCTGCTTGGGTGCCAAGGAGTCTGGACGACATATTGCA (7)..........-.....................AG AC：TGG ACG ACA I'A I'TGC A 1161 1194

序列辨 SSi編號：17) (1161) CCTGGCCGACGTGAACAGCGCGGAGGACGAGTGA

ίρηΑ：刪除（序歹|J 辨 1线#扁號：9) (27) CCTGGCCGACGTGAACAGCGCGGAGGACGAGTGA 因此，一個ί；?«尺刪除作用將包括下列序列：ATGTCTAG ACTGGACGACATATTGCACCTGGCCGACGTGAACAGCG CGGAGGACGAGTGA(序列辨識編號：9)。將刪除載體接合至刺糖多孢菌 spinosa) ^ 將W«尺框内刪除建構物轉形至大腸桿菌（五c〇/〇接合作用供給者品系ET12567/pUZ8002中。辨識出陽性轉形的品系’及用於接種在一燒瓶的盧里亞(Luria)肉汁培養基(含有適^的抗生素）中及在37C及225 rpm振盪作用下生長過夜。藉由自大腸桿菌（凡c〇/〇供給者品系分離出質體dna及元成限制酶酶切作用，而進行質體一致性之確認。當確認該殖株的保真度正確時，將剩餘的培養物儲存於-8(TC的 20%甘油中，以供進一步使用。 55 201201700 依據Matsushima等人（1994年）乙文中所述之方法，進行帶有框内刪除建構物的大腸桿菌巧細胞與刺糖多孢菌之接合作用。挑選由於在β «尺框内刪除建構物的載體主鏈上存在安痢黴素抗性基因標記而具有安痢黴素抗性之推測性轉接合菌株。確認轉接合菌株及擴增尺區域以測定整合位點單一的初級轉接合菌株在R6培養基上生長，及轉移至增補50微克/毫升的安痢黴素與25微克/毫升的峰啶酮酸之腦心浸液(ΒΗΙ)瓊脂平皿上，以確認抗性表現型。將轉接合菌株的菌絲體自ΒΗΙ平血接種至增補50微克/毫升的安痢黴素之胰蛋白酶大豆肉汁(TSB)培養基中。該培養物係在29°C 及250 rpm的振盪作用下培養72小時。在培養72小時之後採集菌絲體’及依照製造廠商的說明書（美國馬里蘭州蓋瑟斯堡的愛吉生物系統公司）’使用愛吉生物系統公司的基因體 DNA分離套組而分離出基因體DNA。使用從轉接合菌株所分離的基因體DNA作為模板及办《尺刪除驗證1前置（序列辨識編號：7 ; GTTCACGGTGATTCCGGTGACTCG)與如Λ：冊'J除驗證1反置(序歹丨J辨識編號：8 ; ACCTGCACTGCTTCCT GGAGCTTC)引子’進行PCR。此外，使用自刺糖多抱菌似）對照組母株所分離的基因體 DNA及π«尺框内刪除建構物的質體DNA作為供一對照組 PCR反應所用之模板。將PCR擴增作用結果定序。定序資料顯示孕《尺框内刪除建構物係經由單交換同源重組作用整合至區域中（第3圖區域的整合作用在該染色體 56 201201700 内產生«尺、之一完整複本；及一種位於載體主鏈POJ260上游的戴短型_从與一種動豆型及一種位於a玄載體主鏈下游的完整π从與从。雙交換V«尤框内刪除突變株之分離作用將具安病黴素抗性的單交換突變株接帛在缺之安舰素的BHI瓊脂平皿上，及於29。〇培養14日。依據H〇pw〇〇d 等人(1985年）乙文’自平皿採集抱子及儲存於⑽。c的聊。甘油中。將孢子接種至1〇個不具有安痢黴素的新BHI瓊脂平皿上，及於29 C培養平皿14日。重複該步驟三次。使用2〇% 甘油將孢子製備物稀釋至10·6，及將稀釋過的孢子塗在1〇個BHI瓊脂平皿上。於29。〇培養平皿10曰，以長成單菌落。將個別菌落補綴至具有與不具有安痢黴素的新BHI瓊脂平皿上。所有平孤係於29艺培養1〇曰，以長成菌絲體。辨識出在含有50微克/毫升的安痢黴素之Bm瓊脂平皿上不生長的菌落係雙交換突變株的候選者，及挑選供使用pCR的驗證作用之用。雙交換突變株之辨識與驗證經由PCR確認雙交換突變株。在使用防故障(FailSafe) PCR系統之PCR擴增作用中，係使用經設計在與基因内結合之引子、办《尺删除驗證1前置（序列辨識編號： 7)及办《火冊j除驗證1反置(序列辨識編號：8)。經由瓊脂糖凝膠電泳測定PCR產物的大小。辨識出造成基因的刪除作用之雙交換突變株（第4圖），及基於PCr產物的大小而進行挑選。PCR片段的大小與dna序列顯示[基因的框内 57 201201700 刪除作用。雙交換突變株經由搖瓶發酵作用而產生斯賓諾辛雙交換突變株可在Burns等人(WO 2003070908)所述之條件下進行發酵。可在Baltz等人（第6，143,526號美國專利）所述之條件下，分析發酵液中是否存在斯賓諾辛因子。為確認在上清液中存在斯賓諾辛因子，發酵液的萃取物在真空離心濃縮機(SpeedVac)中乾燥過夜，接著將殘餘物分溶於水與乙醚之間。在氮氣流下，藉由蒸發作用乾燥乙醚層。然後將試樣溶於丙酮-d6中，及轉移至用於id質子NMR掏取的一個NMR管中。將NMR廓型與斯賓諾辛標準相比較。雙交換突變株之發酵作用產生斯賓諾辛j與L。NMIU^果顯示所存在的J/L超過A/D。第3例：印/iJiT插入突變作用之產生經由尺基因内的插入型突變作用，產生刺糖多孢菌咖„刪)突變株。建構在啊尺基因内含有一框内安痢黴素抗性基因卡匣及不中斷的上游與下游柳*/與基因側臨序列之一DNA片段（第5圖）。將基因片段植入一質體及轉形至大腸桿菌（五接合作用供給者品系ET12567/pUZ8002中。辨識出陽性轉形品系，及用於接種在一燒瓶的盧里亞(Luria)肉汁培養基 (含有適當的抗生素）中，及在3rc及225啊振盡作用下生長過夜。藉由分離出質體DNA及完成限制酶酶切作用，而進行質體-致性之相。t相含有安痢黴賴入卡昆之質體係正確時，剩餘的培養物係儲存於_8〇它的2〇%甘油中。 58 ⑧ 201201700 依據Matsushima等人於（1994年）乙文中所述之方法，進行大腸桿菌（五_ 供給者細胞與刺糖多孢菌 {Saccharopolyspora 之接合作用。使用安病黴素抗性，挑選安痢黴素基因卡匣自大腸桿菌(五_ co//)之轉移作用及S亥質體後續整合至刺糖多抱菌的基因體中之整合作用。單一的初級轉接合菌株在R6培養基上生長，及轉移至增補50微克/毫升的安痢徽素與25微克/毫升的β奈。定酮酸之腦心浸液(ΒΗΙ)瓊脂平皿上，以確認抗性表現型。將轉接合菌株的菌絲體自ΒΗΙ平血接種至增補50微克/毫升的安病黴素之腺蛋白酶大豆肉汁(TSB)培養基中。該培養物係在29。〇及250 rpm的振盪作用下培養72小時。在培養72小時之後採集菌絲體，及依照製造廠商的說明書（美國馬里蘭州蓋瑟斯堡的愛吉生物系統公司），使用愛吉生物系統公司的基因體 DNA分離套組而分離出基因體DNA。使用從轉接合菌株所分離的基因體DNA作為模板，進行PCR。使用TOPO®選殖技術（美國加州卡爾斯巴德的英杰公司），將所欲的PCR產物植入一質體。將推測含有植入TOPO®載體内的PCR產物之細菌菌落分離，及經由限制酶酶切作用確認。進行陽性質體殖株之DNA定序。定序結果顯示安痢黴素插入卡匣係經由雙交換同源重組作用整合在刺糖多孢菌 OSacc/zizropo/ppora ip/mwa)的尺基因内。所產生的插入作用經由同源重組而中斷尺的轉錄作用，藉此廢除#„尺基因功能。 59 201201700 可在Burns等人(WO 2003070908)所述之條件下，進行刺糖多抱菌（Sacc/zaropo/jAspora尺突變品系之發酵作用。可在Baltz等人（第6，143,526號美國專利）所述之條件下，分析發酵液中是否存在斯賓諾辛因子。為確認在上清液中存在斯賓諾辛因子，發酵液的萃取物在真空離心濃縮機(SpeedVac)中乾燥過夜’接著將殘餘物分溶於水與乙醚之間。在氮氣流下，藉由蒸發作用乾燥乙醚層^然後將 s式樣溶於丙_中-心’及轉移至用於id質子NMR拮員取的一個 NMR管中。將NMR廓型與斯賓諾辛標準相比較。NMR結果顯示所存在的J/L超過A/D。相較於產生一種含有斯賓諾辛a 與D的斯賓諾辛混合物之對照組刺糖多孢菌，含有插入型突變的該等品系之發酵作用產生一種含有斯賓諾辛J與L的斯賓諾辛混合物。第4例·· s/rniiT夏因-逹爾加諾(Shine-Dalgarno)序列之中斷作用位於β«尺上游之夏因-達爾加諾序列受到中斷（第6 圖）’藉此造成mRNA轉譯作用之減少。使用如第2例所述之一類似操作程序，產生含有一已刪除的夏因_達爾加諾（Shine-Dalgarno)序列之刺糖多孢菌的一突變株品系。進行位於 sp«尺夏因-達爾加諾（Shine-Dalgarno)序列的上游與下游之至少1，500個驗基對的二個片段之pcr擴增作用。該等片段不含有下列序列：5’-AGGAGCTC-3,。該二片段係在可用於刺糖多抱菌（Sflcc/mropo/ypora 的接合作用之一質體諸如P〇J260内連接在一起。 60 ⑧ 201201700 將所欲的質體轉形至大腸桿菌（五co/z.)接合作用供給者品系ET12567/pUZ8002中。陽性轉形品系係經由限制酶酶切作用確認。當確認含有該質體的該大腸桿菌（五c〇/z·)品系係正確時，依據Matsushima等人於（1994年）乙文中所述之方法，進行大腸桿菌（五· co/z.)細胞與刺糖多孢菌之接合作用。使用對於一抗生素的抗性，挑選該質體自大腸桿菌⑺：· co/〇供給者細胞之轉移作用及§玄質體後績整合至刺糖多抱菌（心少 Whoja)的基因體中之整合作用。 δ亥資體在刺糖多抱滅（iSacc/zizropo/ppora 染色體内之整合作用’係經由特定基因體DNA區域的PCR擴增作用而進行分子特徵化分析。簡而言之，分離出基因體 DNA，及含有5尸„尺夏因-達爾加諾(Shine_Daigarn〇)序列的插入體進行PCR擴增作用、選殖及序列。定序資料顯示，夏因-達爾加諾（Shine-Dalgarno)刪除建構物係經由單交換同源重組作用而整合至印/火區域中。使用第2例所述之操作程序，獲得含有受中斷的尺夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno)序列之雙交換突變株。辨識出藉由存在於載體主鏈上的標記所挑選之在含有抗生素的 BHI瓊脂平皿上不生長之菌落係雙交換突變株的候選者，及挑選供使用PCR的驗證作用之用。使用經設計在尺與基因内結合之引子。使用ΤΟΡΟ®選殖技術（美國加州卡爾斯巴德的英杰公司），將所產生的PCR產物次選殖至—質體中。將含有植入ΤΟΡΟ®載體内的PCR產物之細菌菌落分 61 201201700 離’及經由限制酶酶切作用確認。進行陽性質體殖株之DN A 疋序疋序結果顯示來自刺糖多抱菌（Sacc/mropo/jAsponj •spzVic^a)的基因體之〒”火夏因_達爾加諾（Shine_Daigarn〇)核苷酸序列被中斷。可在Burns等人(w〇 2〇〇3〇7〇9〇8)所述之條件下進行刺糖多抱菌（tSacc/zaropo/少spz.wosa)的 ίρ/ί尺夏因-達爾加諾（Shine-Dalgarno)突變株品系之發酵作用。可在Baltz等人（第6，143,526號美國專利）所述之條件下，分析發酵液中是否存在斯賓諾辛因子。為確認在上清液中存在斯賓諾辛因子，發酵液的萃取物在真空離心濃縮機(SpeedVac)中乾燥過夜，接著將殘餘物分溶於水與乙醚之間。在氮氣流下，藉由蒸發作用乾燥乙醚層。然後將試樣溶於丙酮-de中，及轉移至用於iD質子NMR擷取的一個 NMR管中。NMR結果顯示所存在的j/l超過A/D。將NMR 廓型與斯賓諾辛標準相比較。相較於產生一種含有斯賓諾辛A與D的斯賓諾辛混合物之對照組刺糖多孢菌 (Sacc^aropo/ppora ipMosa)，含有所刪除的尺夏因·達爾加諾(Shine-Dalgarno)序列突變作用之該等品系的發酵作用係產生一種含有斯賓諾辛J與L的斯賓諾辛混合物。第5例：經由反訊息RNA下調sp/iA"之作用而降低3，·〇·甲基轉移酶表現作用設計一質體’以產生與尺編碼序列互補之asRNΑ(反訊息RNA)。所產生之尺基因表現的下調作用，造成尺活性之降低。進行尺編碼序列的PCR擴增作用及植入一質體諸如 ⑧ 62 201201700 pOJ260中，以用於整合至刺糖多孢菌 spho·^)的染色體中。任擇地，可將π«尺編碼序列植入維持穩定及在刺糖多抱菌（5Vjfcc/^n9/?o/；AS7?<5/-a 的胞質液内複製之一質體。建構所產生的質體，以藉由使用一種強力持續性細菌啟動子表現以的反訊息股而產生·ψ«Λ： asRNA。將該w^/CasRNA質體轉形至大腸桿菌（五· co/z·)接合作用供給者品系ET12567/pUZ8002中。陽性轉形品系係經由限制酶酶切作用確認。當確認含有該質體的該大腸桿菌 (£· co/ί)品系係正確時，依據Matsushima等人（1994年）乙文中所述之方法，進行來自大腸桿菌（£· co/〇供給者細胞的質體與刺糖多抱菌（S^cc/zaropo/yspora ·5ρζ’《〇6·α)之接合作用。使用對於一抗生素的抗性，挑選asRNA質體自大腸桿卤（£· co/z·)至刺糖多孢菌职.⑽似）中之轉移作用，該抗性係編碼在_spW^"asRNA質體上。分離出來自轉接合菌株的基因體DNA及使用作為PCR擴增作用的模板，以確認該質體之存在。可在Burns等人(WO 2003070908)所述之條件下，進行含有W«尺asRNA質體的刺糖多孢菌（&c以品系之發酵作用。可在Bakz等人（第6 143,526號美國專利)所述之條件下，分析發酵液中是否存在斯賓諾辛因子。為確财上清財存在斯㈣辛因子，料液的萃取物在真空離心濃縮機(SpeedVac)中乾燥過夜，接著將殘餘物分溶於水與乙社間。錢氣流下，藉由蒸發仙乾燥乙醚層。然後將試樣溶於丙酮中，及轉移至用於質子 63 201201700 NMR擷取的一個NMR管中。NMR結果顯示所存在的J/L超過A/D。將NMR廓型與斯賓諾辛標準相比較。相較於產生一種含有斯賓諾辛A與D的斯賓諾辛混合物之對照組刺糖多抱菌（Saccharopo 丨yspora spjnosa)，含有 spnK asRNA 質體的品系之發酵作用產生一種含有斯賓諾辛j與L的斯賓諾辛混合物。第6例：產生附加的尤刪除突變作用第6·1例#从5’端刪除載體之建構進行一種產生斯賓諾辛Α與D的品系之基因體dNA (Hopwood等人於1985年乙文)之PCR擴增作用，以產生二個 DNA片段。第一個擴增片段的長度約為1，500個鹼基對，及直接位於ATG起始密碼子的上游。第二個擴增片段的長度約為1，500個鹼基對，及直接位於尺第61鹼基對的下游。使用嫻熟技藝者所知之方法，完成PCR擴增作用。合成寡核苷酸引子，以納入限制酶結合序列.使用將藉由引子所納入的結合序列切開之限制酶，酶切所產生的PCr產物。將該等片段連接在一起，然後連接至質體？〇>[26〇的對應酶切位點中。將所產生的連接產物植入大腸桿菌（£ c〇/〇勝任細胞中。挑選菌落及經由限制酶酶切作用與DNA序列分析，而篩檢出所欲的連接產物。辨識出陽性殖株，及所選擇的殖株係用於刺糖多抱菌中的之後續5’端刪除作用。在質體p〇J26〇内之所刪除的 W«尺基因片段之所得序列係示於第3表。因此一種尺起始密碼子刪除作用將包括下列序列：（序列辨識編號：1〇)。 201201700 第3表：所刪除的π«昃5’端之核苷酸序列排比 1 30 5’端刪除（序列辨識編號：丨〇) 欠與上游序列（序列辨識編號：丨4) •sp/iA： 5’端刪除（序列辨識編號：丨〇) 與上游序列（序列辨識編號：14) sp/?& 5 ’端刪除（序列辨識編號：| 〇) 與上游序列（序列辨識編號：14) 5 ’端刪除（序列辨識編號：1 〇) 與上游序列（序列辨識編號：丨4) jpwA： 5’端刪除（序列辨識編號：1〇) 與上游序列（序列辨識編號：丨4) W«尺5’端刪除（序列辨識編號：1〇) W«尺與上游序列（序列辨識編號：14) 5’端刪除（序列辨識編號：丨〇) W«尺與上游序列（序列辨識編號：14) jp/iA： 5’端刪除（序列辨識編號：1〇) 與上游序列（序列辨識編號：14) 5’端刪除（序列辨識編號：丨0) W«尺與上游序列（序列辨識編號：丨4) 5’端刪除（序列辨識編號：10) 與上游序列（序列辨識編號：丨4) spnK 5’端刪除（序列辨識編號：與上游序列（序列辨識編號：丨4) 印《尺5’端刪除（序列辨識編號：丨0) W«火與上游序列（序列辨識編號：丨4) 5’端刪除（序列辨識編號：丨0) (1) GGAGCTCATCACG-............................ (1) GGAGCTCATCACGATGTCCACAACGCACGA 31 60 (14)......................—-.................. (31) GATCGAAACCGTGGAACGCATCATCCTCGC 61 90

(14) ----------- GCGGCGAGCCTGGCCGA (61) CGCCGGATCCAGTGCGGCC3AGCCTGGCCGA 91 120 (31) CCIGACCACCGAACTCGGACTCGCCAGGAr (91) CCTGACCACCGAACTCGGACTCGCCAGGAT 121 150 (61) CGCACCCGTGCTGATCGACGAGATCCTCTT (121) CGCACCCGTGC「GATCGACGAGATCCTCTT 151 180 (91) CCGCGCGGAACCGGCCCCCGACATCGAACG (151) CCGCGCGGAACCGGCCCCCGACATCGAACG 181 210 (121) GACCGAGGTCGCGGTCCAGATCACCCACCG (181) GACCGAGGTCGCGGTCCAGATCACCCACCG 211 240 (151) AGGCGAGACCGITGACITCGTCCrGACGCT (211) AGGCGAGACCGTTGACTTCGTCCTGACGCT 241 270 (181) ACAGTCCGGTGAGCTGATCAAGGCCGAGCA (241) ACAGTCCGGTGAGCrGATCAAGGCCGAGCA 271 300 (211) ACGACCGGTCGGAGACGTCCCGCTGCGGAT (271) ACGACCGGTCGGAGACGTCCCGCTGCGGAT 301 330 (241) CGGTTACGAGCTCACCGATCTCATCGCCGA (301) CGGTTACGAGCTCACCGATCTCATCGCCGA 331 360 (271) GITGTTCGGCCCAGGAGCrCCCAGGGCCGI (331) GTTGTTCGGCCCAGGAGCTCCCAGGGCCGT 361 390

(301) CGGCGCCCGGAGCACCAACTTCCTCCGAAC 65 201201700 ίρ/ί尺與上游序列（序列辨識編號：14) sp«尺5’端刪除（序列辨識編號：10) 與上游序列（序列辨識編號：丨4) 5’端刪除（序列辨識編號：丨0) 印/ϊ/Τ與上游序列（序列辨識編號：14) •sp/7A： 5 ’端刪除（序列辨識編號：丨0) 與上游序列（序列辨識編號：丨4) #«尺5’端刪除（序列辨識編號：10) 與上游序列（序列辨識編號：14) ίρ/ίΑ： 5 ’端刪除（序列辨識編號：10) 與上游序列（序列辨識編號：丨4) λ： 5 ’端刪除（序列辨識編號：10) ίρ/7尺與上游序列（序列辨識編號：丨4) s/^A： 5’端刪除（序列辨識編號：10) 孕/3尺與上游序列（序列辨識編號：14) •sp/iA： 5’端刪除（序列辨識編號：丨0) 與上游序列（序列辨識編號：丨4) spnA： 5’端刪除（序列辨識編號：丨0) 尺與上游序列（序列辨識編號：14) jpnA： 5’端刪除（序列辨識編號：10) 與上游序列（序列辨識編號：丨4) sp/iA： 5’端刪除（序列辨識編號：10) 與上游序列（序列辨識編號：丨4) ίρηΑ： 5’端刪除（序列辨識編號：10) Μ«尺與上游序列（序列辨識編號：14) ίρηΛ： 5 ’端刪除（序列辨識編號：丨0) (361) CGGCGCCCGGAGCACCAACTTCCTCCGAAC 391 420 (331) CACCACATCCGGTTCGATACCCGGTCCGTC (391) CACCACArCC(i(ri TCGATACCCGG rCCG I'C 421 450 (361) GGAACM Cn CCGATGGCn CCAGGCCATC l*C (421) GGAACTGTCCGATGGCTTCCAGGCCATCTC 451 480 (391) CGCAGTGGTCGCCGGCTGCGGGCACCGACG (451) CGCAG ΓΟΟ rC(3CCG(K； rGCGGGCACCG/\CG 481 510 (421) TCCCGACCTCAACTIGCTCGCCrCCCACTA (481) TCCCGACCTCAACTTGCTCGCCTCCCACTA 511 540 (451) (.CGCACGGACAAGTGGGGCGGCCTGCACTG (511) C:CGCACGGACAAGTGGGGCGGCC rGCACTG 541 570 (481) (KITCACCCCGC rATACGAGCGACACCTCGG (541) GTTCACCCCGCTATACGAGCGACACCTCGG 571 600 (511) CGAGTTCCG 下 GATCGCCCGGTGCGCATCCT (571) CGAG'I' l CCG l (iATCGCCCGG rOCGCA l'CCT 601 630 (541) GGAGATCGGTG I'CGG rGGCTACAAC I TCGA (601) GGAGATCGGTGTCGGTGGCTACAACTTCGA 631 660 (571) CGGTGGCGGCGGCGAATCCCTGAAGATGTG (631) CGGTG(K'GC.CGGCGAATCCCTGAAGATGTG 661 690 (601) GAAGCGCTACTTCCACCGCG(X:CTCG，I、GTT (661) GAAGCCiCTACTTCCACCGCGGCCTCGTGTT 691 720 (631) CGGGATGGACGTTTTCGACAAGTCCTTCCT (691) CGGGATGGACGrrrrCGACAAGTCCT.rCCT 721 750 (661) CGACCAGCAGAGGCrCTGCACCGTCCGCGC (721) CGACCAGCAGAGGCTCTGCACCGTCCGCGC 751 780

(691) CGACCAGAGCAAGCCCGAGGAGCTGGCCGC 66 201201700 與上游序列（序列辨識編號：14) (751) rp/jK 5’端刪除（序列辨識編號：10) (721) sp/iA：與上游序列（序列辨識編號：14) (781) sprtA： 5’端刪除（序列辨識編號：10) (751) •ypwA：與上游序列（序列辨識編號：14) (811) ίρ«Α： 5’端刪除（序列辨識編號：10) (781) 與上游序列（序列辨識編號：丨4) (841) spnA： 5’端刪除（序列辨識編號：10) (811) 與上游序列（序列辨識編號：14) (871) 5’端刪除（序列辨識編號：10) (841) spnA：與上游序列（序列辨識編號：14) (901) sp/jA： 5’端刪除（序列辨識編號：10) (871) •spnA：與上游序列（序列辨識編號：丨4) (931) ίρηΑ： 5’端刪除（序列辨識編號：丨0) (901) 與上游序列（序列辨識編號：14) (961) ίρ«Α： 5’端刪除（序列辨識編號：丨0) (931) spnA：與上游序列（序列辨識編號：丨4) (991) spnA： 5’端刪除（序列辨識編號：丨0) (961) 與上游序列（序列辨識編號：14) (1021) 5’端刪除（序列辨識編號：丨0) (991) 與上游序列（序列辨識編號：丨4) (1051) jpnA： 5’端刪除（序列辨識編號：丨0) (1021) spnA：與上游序列（序列辨識編號：丨4) (1081) 5’端刪除（序列辨識編號：10) (1051) ίρηΛ：與上游序列（序列辨識編號：14) (1111) spnA： 5’端刪除（序列辨識編號：丨0) (1081) CGACCAGAGCAAGCCCGAGGAGCTGGCCGC 781 810 CGTTGACGACAAGTACGGACCGTTCGACAT CGTTGACGACAAGTACGGACCGTTCGACAT 811 840 CATCATCGACGATGGCAGCCACATCAACGG CATCATCGACGATGGCAGCCACATCAACGG 841 870 ACACGTGCGCACATCCCTGGAAACGCTGTT ACACGTGCGCACAI CCCTGGAAACGCTG’n. 871 900 CCCCCGCriTGCGCAGCGGTGGCGl'A'rACG Γ CCCCCGGTTGCGCAGCGGTGGCGTATACGT 901 930 GATCGAGGATCTGTGGACGACCTATGCTCC GAl'CGAGG/Vl'CTGTGGACGACCrArGCTCC 931 960 C G G ΑΊΊ X： G G C G G G C A G G C G C A G1' Ci C C C G (Ϊ C CGGATTCGGCGGGCAGGCGCAGTGCCCGGC 961 990 CGCACCCGGCACCACGGTCAGCCTGCTCAA CGCACCCGGCACCACGGTCAGCCTGCICAA 991 1020 GAACCTGTTGGAAGGCGTTCAGCACGAGGA GAACCTGTTGGAAGGCGTTCAGCACGAGGA 1021 1050 GCAGCCGCATGCGGGCTCGTACGAGCCGAG GCAGCCGCATGCGGGCTCGTACGAGCCGAG 1051 1080 CTACC rGGAACGCAAIT I GG rCGGCCTCCA CTACCTGGAACGCAATTTGGTCGGCCTCCA 1081 1110 CACCTACCACAACATCGCGTTCCTGGAGAA CACCrACCACAACATCGCGTTCCTGGAGAA 1111 1140 AGGCGTCAACGCCGAAGGCGGCGTTCCrGC AGGCGTCAACGCCGAAGGCGGCGTTCCTGC 1141 1170

TTGGGTGCCAAGGAGTCTGGACGACATATT 67 201201700

ίρ/?Λ：與上游序列（序列辨識編號：丨4) (H41) TI GGGTGCCAAGGAGTCTGGACGACATATT 1171 1200 印《尺 5’端刪除（序列辨識編號：,〇) (f f n) GCACCTGGCCGACGTGaacagcgcggagga 與上游序列（序列辨識編號：丨 4) (1171) gcacctggccgacgi-gaacagcgcggagga 1201

5’端刪除（序列辨識編號：丨〇) (Π41) CGAGTGA sp/jAT與上游序列（序列辨識編珑：丨4) (|2〇|) CGAGTGA 將刪除載體接合至刺糖多抱菌β spinosa) ή1 依據Matsushima等人於（1994年）乙文中所述之方法及如第2例所例示，進行帶有尺5,端刪除建構物的大腸桿菌 (五· co")細胞與刺糖多抱菌>5/7，>20似)之接合作用。挑選由於在ί；7«Α： 5,端刪除建構物的載體主鏈上存在安痢黴素抗性基因標記而具有安痢黴素抗性之推測性轉接合菌株。確認轉接合菌株及擴增ίρ«尺區域以測定整合位點單一的初級轉接合菌株在R6培養基上生長，及轉移至增補50微克/毫升的安痢黴素與25微克/毫升的嘹啶酮酸之腦心浸液(ΒΗΙ)瓊脂平皿上，以確認抗性表現型。將轉接合菌株的菌絲體自ΒΗΙ平血接種至增補5〇微克/毫升的安痢黴素之胰蛋白酶大豆肉汁(TSB)培養基中。該培養物係在29°C 及250 rpm的振盪作用下培養72小時。在培養72小時之後採集函絲體’及分離出基因體DNA。使用從轉接合菌株所分離的基因體DNA作為模板，使用設計用來檢測單交換突變株之引子進行PCR。進行PCR擴增產物結果之定序。定序資料顯示5 ’端刪除建構物係經由單交換同源重組作用而 ⑧ 68 201201700 整合至i/m*/尺區域中。雙交換印《尺5’端刪除突變株之分離作用將具安痢黴素抗性的單交換突變株接種在缺乏安痢黴素的ΒΗΙ瓊脂平m上，及於29°C培養14日。依據Hopwood 等人（1985年）乙文，自平皿採集孢子及儲存於_80°c的20% 甘油中。將孢子接種至10個不具有安痢黴素的新BHI瓊脂平孤上，及於29°C培養平皿14日。重複該步驟多次。使用20% 甘油稀釋孢子製備物，及將稀釋過的孢子塗在BHI瓊脂平上。於29°C培養平皿10日’以長成單菌落。將個別菌落補綴至具有與不具有安痢黴素的新BHI瓊脂平皿上。所有平m 係於29°C培養10日，以長成菌絲體。辨識出在含有5〇微克/ 毫升的安痢黴素之BHI瓊脂平孤上不生長的菌落係雙交換突變株的候選者，及挑選供使用PCR的驗證作用之用。雙交換突變株之辨識與驗證經由PCR確認雙交換突變株。在PCR擴增作用中，係使用經設計在與尺基因内結合之引子。經由瓊脂糖凝膠電泳測定PCR產物的大小。辨識出造成尺基因5’端的刪除作用之雙交換突變株’及基於PCR產物的大小而進行挑選° PCR片段的大小與DNA序列顯示ATG起始密碼子與尺基因的5’端之刪除作用。經由搖瓶發酵作用產生斯賓諾辛雙父換突變株可在Burns等人(WO 2003070908)所述之條件下進行發酵。可在Baltz等人（第6，143,526號美國專利）所述之條件下’分析發酵液中是否存在斯賓諾辛因子。雙 69 201201700 交換突變株之發酵作用產生㈣諾辛憤卜第6_2例框内刪除载體之建構使用種產生斯賓諾辛八與D之品系的基因體⑽A (HopwocKi等人於1985年乙文），進行二個應片段的pcR擴

增作用。第-個擴増片段的長度約為Μ咖驗基對及直接位於第-個推測性8.腺*甲硫_依賴型曱基轉㈣域的上游。第二個擴增片段的長度約机5W驗基對，及直接位於第-個推測性S__f硫胺酸㈣型甲基轉_域的下游。使賴熟技藝者所知之方法，完成pCR擴增作用。合成寡核賊引子，以納人限制酶結合序列。使用將藉由引子所納入的結合序列切開之限制酶，酶切所產生的取產物。將該等片段連接在-起，然料接至f體_6〇的對應酶切位點中。將所產生的連接產物植入大腸桿_ ⑽)勝任細胞中。挑選菌落及經由限制_切仙與DNA 序列分析，而篩檢出所欲的連接產物。辨識出陽性殖株，及所選擇的殖株係用於刺糖多孢内之的第-個推測性s_㈣甲硫胺酸依賴型甲基轉移酶域之後續_刪除作用。在㈣p〇遍内之所刪除的_:基因片段之所得序列係示於第4表。因此，一個 #«尺刪除作用將包括序列辨識編號：丨丨之序列。 70 201201700 第4表：所刪除之孕《尺的第一個推測性s-腺苷甲硫胺酸依賴型τι轉移酶核賊序列排比(推測性8_腺苦甲硫胺酸依賴型甲基轉救仏得移鉍係經突出顯示者）。 sp/i尺(序列辨織編珑：丨7) •ipj SAM#丨刪除（序列辨識編貌. sp/ιΛ·(序列辨識編號：17> sp/jA： SAM#1刪除（序列辨識編晚：（1) •τρη尺(序列辨識編號：丨7) ίρ/ιλ： SAM#1刪除（序列辨識編號： 5pwA：(序列辨識編珑：17) spnA： SAM# 1刪除（序列辨識編蜆：丨j) ipnA：(序列辨識編珑：丨7) ip«A： SAM#丨刪除（序列辨識編珑：1! > 序列辨識編號：丨7> spnA： SAM#1刪除（序列辨識編號·：1ι) jp«A：(序列辨識編號：丨7) ί/?ηλ： SAM#1刪除（序列辨識編珑：11) 5/^欠(序列辨識編號：丨7) ipnA： SAM#丨刪除（序列辨識編衆：11) φηΛ：(序列辨識編號：丨7) spnK SAM#1刪除（序列辨識編载：11} •jp/ίΛ：(序列辨識編號：丨7) sp/ιλ： SAM#丨刪除（序列辨饿編號：11) π«Α：(序列辨識編號：17) spnA： SAM#丨刪除（序列辨識編號：1|) 1 30 (1) ATGTCCACAACGCACGAGATCGAAACCGTG (1) ATGTCCACAACGCACGAGATCGAAACCGTG 31 60 (31) GAACGCATCATCCTCGCCGCCGGATCCAGT (31) GAACGCATCATCCTCGCCGCXGGATCCAGT 61 90 (61) GC(JGCGACiCXTGGCXGACCTC3ACCACC:CiAA. (61) GCGGCC.AGCCTGGCCGACCTGACCACCGAA 91 120 (91) CTCGGACTCGCCAGGATCGCACCCGTGCTG (91) CTCGGACTCGCCAGGATCGCACCCGTGCTG 121 150 (121) Atcgacgagatcctcttccgcgcggaaccg (121) ATCGACG AGATCCTCTTCCGCGCGGAACCG 151 180 (151) «CCCCCGACATCGAACGGACCGAGGTCGCG (151) GCCCCCGACATCGAACGGACCGAGGTCGCG 181 210 (181) GTCCAGATCACCCACCGACiGCGAGACCCiTT (181) GTCCAGATCACCCACCGAGGCGAGACCGTT 211 240 (211) GACTTCGTCCTGACGCTACAOTCCGGTGAG (211) GACTTCGTCCTGACGCTACAGTCCGGTGAG 241 270 (241) CTGATCAAGGCCGAGCAACGACCGGTCGGA (241) CTGATCAAGGCCGAGCAACGACCGGTCGGA 271 300 (271) GACGTCCCGCTGCGGATCGGTTACGAGCTC (271) GACGTCCCGCTGCGGATCGC3TTACGAGCTC 301 330 (301) ACCGATCTCATCGCCGAGTTCi'n’CGGCCCA (301) ACCGATCTCATCGCCGAGTTCiTTCGGCCCA 331 360 71 201201700 •spn尺(序列辨識編號 17) (331) ίρηΑ： SAM#丨刪除（序列辨識編號 II) (331) spnfC(序列辨識編號 17) (361) SAM# 1刪除（序列辨識編號 1) (361) spnK(序列辨織編號 17) (391) •spn/i SAM#1刪除（序列辨識編號 11) (391) ίρηΧΧ序列辨織編號 17) (421) SAM#1刪除（序列辨識編號 Π) (421) 序列辨識編號 17) (451) •spnA： SAM#1刪除（序列辨識編號 11) (451) 叹/1尺(序列辨識編號 17) (481) ίρ«Α： SAM#丨刪除（序列辨識編號 Π) (481) 序列辨識編號 17) (511) spnK SAM#1刪除（序列辨饿編號 Π) (5Π) 序列辨識編號 17) (541) ϊρη/C SAM#丨刪除（序列辨識編號 11) (541) 序列辨識編號 17) (571) ip/jA： SAM#丨刪除（序列辨識編號 11) (561) ίρηΑ：(序列辨識煸號 17) (601) SAM#丨刪除（序列辨識編號 Π) (561) ϊρηΑ：(序列辨識煸號 17) (631) ίρηλ： SAM#丨刪除（序列辨饿編號 Π) (571) (序列辨诚'編號 17) (661) SAM#丨刪除（序列辨诚編號1 11) (601) 序列辨诚編號 17) (691) SAM#1刪除（序列辨饿捣號· ⑴ (631) GGAGCTCCCAGGGCCGTCGGCGCCCGGAGC G(iAGCrCCCAGGGCCGTCGGCGCCCGGAGC 361 390 AC'CAACTTCCrCCGAACCACCACAICCGGT ACCAACTTCCTCCGAACCACCACATCCGGT 391 420 TCGATACCCGGTCCGTCGGAACTGTCCGAT TCGATACCCGG rCCGTCGGAAC I G rCCGAT 421 450 GCiCTTCCAGGCCA l CTCCGCAGTGGTCGCC GGCTTCCAGGCCATCTCCGCAGTGGTCGCC 451 480 GGCTGCGGGCACCGACGTCCCGACCTCAAC GGCTGCGGGCACCGACGTCCCGACC I'C'AAC 481 510 Ί TGCTCGCCTCCCACTACCGCACGCiACAAG TTGCTCGCCTCCCACTACCGCACGGACAAG 511 540 TGGGGCGGCCTGCACTGGTTCACCCCGCTA Ί GGGGCGGCC J GCACTGGTTCACCCCGCTA 541 570

TACGAGCGACACCTCGGCGAGTTCCGTGAT TACGAGCGACACC丁CGGCGA.............. 571 600

CGCCCGGTGCGCATCCTGGAGATCGGTGTC 601 630

GGTGGCTACAACTTCGACGGTGGCGGCGGC

............................TGGCGOCGGC 631 660 GAATCCCTGAAGATGTGGAAGCGCTACTTC GAATCCC rGAAGATGTGGAAGCGCTACTI'C 661 690 CACC(K：GGCC'rCGrGr'rCGGGArG(iACGIT CACCGCGGCCTCGTGTTCGGGATGGACGT丁 691 720 TTCGACAAGTCCTTCCTCGACCAGCAGAGG TTC(MCAAGTCCTTCC.I CGACCACiCAGAGCi 721 750 ⑧ 72 201201700 spnK(序列辨識編號: 17) (721) SAM# 1刪除（序列辨識編號: 11) (661) #«尺(序列辨識編號: 17) (751) ίρ/tA： SAM#丨刪除（序列辨識編號 Π) (691) #«/!：(序列辨識編號: 17) (781) SAM#1刪除（序列辨識編號 11) (721) τρη尺(序列辨識編號: 17) (811) spnA： SAM#丨刪除（序列辨識編號 11) (751) spnW序列辨識編號 17) (841) SAM#丨刪除（序列辨識編號 11) (781) jpnAX序列辨識編號 17) (871) sp/i/C SAM#1刪除（序列辨識編號 11) (811) ipnA：(序列辨識編號 17) (901) jp/jK SAM#1刪除（序列辨識編號 11) (841) spnK(序列辨識編號 17) (931) •ypnA： SAM#丨刪除（序列辨識編號 11) (871) sp«A：(序列辨識編號 17) (961) ϊρηΑ： SAM#丨刪除（序列辨識編號 11) (901) spnK(序列辨識編號 17) (991) ipnA： SAM#丨刪除（序列辨識編號 11) (931) spw/q序列辨識編號 17) (1021) sp/iA： SAM#丨刪除（序列辨識編號 11) (961) sp/»A：(序列辨識編號 17) (1051) ίρ/j/f SAM#丨刪除（序列辨識編號 11) (991) ί/7ηΛ：(序列辨識编號 17) (1081) SAM#1刪除（序列辨識编號 11) (1021) CTCTGCACCGTCCGCGCCGACCAGAGCAAG CTCTGCACCGrCCGCGCCGACCAGAGCAAG 751 780 CCCGAGGAGCTGGCCGCCGTTGACGACAAG CCCGAGGAGC丁GGCCGCCGTTGACGACAAG 781 810 TACGGACCGTTCGACATCATCATCGACGAT i'ACGGACCGTTCGACAl'CArCATCGACGAT 811 840 GGCAGCCACATCAACGGACACGTGCGCACA GGCAGCCACATCAACGGACACGTGCGCACA 841 870 TCCCTGGAAACGCTGTTCCCCCGGTTGCGC TCCCTGGAAACGCTGITCCCCCGGrTGCGC 871 900 ACiCGGTGGCGrATACCn'GArCGAGGATCTG AGCGGTGGCGTATACGTGATCGAGGATCTG 90! 930 TGGACGACCTATGCTCCCGGATTCGGCGGG TGGACGACCTATGCTCCCGGATTCGGCGGG 931 960 CAGGCGCAGTGCCCGGCCCjCACCCGGCACC CAGGCGCAGTGCCCGGCCGCACCCGGCACC 961 990 ACGGTCAGCCTGCTCAAGAACCTGTTGGAA ACGGTCAGCC I GCTCAAGAACCTCn'TGGAA 991 1020 GGCGITCAGCACGAGCfAGCAGCCGCATGCG GGCGTTCAGCACGAGGAGCAGCCGCATGCG 1021 1050 GGCTCGTACGAGCCGAGCTACCTGGAACGC GGCTCGTACGAGCCGAOCTACCTGGAACGC 1051 1080 AATTTGGICGGCCICCACACCTACCACAAC AATTTGGTCGGCCTCCACACCTACCACAAC 1081 1110 ATCGCGTTCC 丁 GGAGAAAGGCGTCAACGCC ATCGCGTTCCTGGAGAAAGGCGrCAACGCC 1111 1140 73 201201700

屮〃尺(序列辨識編號:17) (HU) GAAGGCGGCGTTCCTGCTTGGGTGCCAAGO 5/j/iA： SAM# 1 刪除（序列辨織編號：11) (1051) GAAGGCGCiCG'l'TCC'I'GC'I 'rGGGTGCCAAGG 序列辨識編號：丨7) (1丨41) SAM#丨刪除（序列辨識編號：丨丨）（丨〇8 〇 1141 1170

A GTC I G Cl A CCi A C ATA I'TG C ACC I G G CCCr Λ C AGTCTGGACGACATATTGCACCTGGCCGAC 1171 1194 序列辨識編號：|7) (1171) (JTGAACAGCGCGGAGGACGAGTGA ”"欠5八1^#1刪除（序列辨識編號：|1)(|1")(;.|.(;八八(：八(」匚0(:0(;入00八€(;八0'1’0八將·Sp/iA'刪除載體接合至刺糖多抱菌 spinosa) ^}7 依據Matsushima等人於（1994年）乙文中所述之方法及如第2例所例示’進行帶有框内刪除建構物的大腸桿菌 (五.co")細胞與刺糖多抱菌接合作用。挑選由於在吵„尺框内刪除建構物的載體主鏈上存在安痢黴素抗性基因標記而具有安痢黴素抗性之推測性轉接合菌株。確認轉接合菌株及擴增sp«A：區域以測定整合位點單一的初級轉接合菌株在R6培養基上生長，及轉移至增補50微克/毫升的安痢黴素與25微克/毫升的嘹啶酮酸之腦心浸液(BHI)瓊脂平皿上，以確認抗性表現型。將轉接合菌株的菌絲體自BHI平皿接種至增補5〇微克/毫升的安痢黴素之胰蛋白酶大豆肉汁(TSB)培養基中。該培養物係在29χ：及2S0卬m的振盪作用下培養72小時。在培養乃小時之後採集菌絲體’及分離出基因體DNA。使賴轉接合菌株所分離的基因體DNA作為模板，使用設計用來檢測單交換突變株之引子進行PCR。將PCR擴增作用結果定序。定序資料顯示’^:框内刪除建構物係經由單交換同源重組作用而整 ⑧ 74 201201700 合至《5/?«尺區域中。雙交換π«尺框内刪除突變株之分離作用將具安病徽素抗性的單交換突變株接種在缺乏安病黴素的ΒΗΙ瓊脂平皿上，及於29°C培養I4日。依據Hopwood 等人（1985年）乙文，自平皿採集孢子及儲存於的20% 甘油中。將孢子接種至10個不具有安痢黴素的新bhi壤脂平皿上，及於29°C培養平皿14日。重複該步驟多次。使用20% 甘油稀釋孢子製備物，及將稀釋過的孢子塗在BHI璦脂平皿上。於29 C培養平皿1 〇曰，以長成卓菌落。將個別菌落補綴至具有與不具有安痛j黴素的新BHI瓊脂平皿上。所有平jja 係於29°C培養10日，以長成菌絲體。辨識出在含有50微克/ 毫升的安痢黴素之BHI瓊脂平皿上不生長的菌落係雙交換突變株的候選者，及挑選供使用PCR的驗證作用之用。雙交換突變株之辨識與驗證經由PCR確認雙交換突變株。在PCR擴增作用中，係使用經設計在叹>«尺基因内結合之引子。經由瓊脂糖凝膠電泳測定PCR產物的大小。辨識出造成尺基因内的第一個推測性S-腺苷曱硫胺酸依賴型甲基轉移酶域之刪除作用之雙交換突變株’及基於PCR產物的大小而進行挑選。PCR片段的大小與DNA序列顯示在”《尺基因内的第一個推測性S-腺苷甲硫胺酸依賴型甲基轉移酶域之删除作用。經由搖瓶發酵作用產生斯賓諾辛雙交換突變株可在Burns等人(WO 2003070908)所述之條件下進行發酵。可在Baltz等人（第6，143,526號美國專利) 75 201201700 所述之條件下，分析發酵液中是否存在斯賓諾辛因子。雙交換突變株之發酵作用產生斯賓諾辛J與L。第6.3例β«欠框内删除載體之建構使用一種產生斯賓諾辛八與〇之品系的基因體〇1^八 (Hopwood等人於1985年乙文）’進行二個〇>^八片段的pcR擴增作用。第一個擴增片段的長度約個鹼基對，及直接位於第二個推測性S-腺苷曱硫胺酸依賴型曱基轉移酶域的上游》第二個擴增片段的長度約為1500個鹼基對，及直接位於第二個推測性S -腺苷曱硫胺酸依賴型甲基轉移酶域的不游。使用爛熟技藝者所知之方法，完成pCR擴增作用。合成寡核苷酸引子，以納入限制酶結合序列。使用將藉由引子所納入的結合序列切開之限制酶，酶切所產生的pCR 產物。將該等片段連接在一起，然後連接至質體p〇J26〇的對應酶切位點中。將所產生的連接產物植入大腸桿菌⑷ c〇/Z·)勝任細胞中。挑選菌落及經由限制酶酶切作用與1)!^八序列分析’而筛檢出所欲的連接產物。辨識出陽性殖株，及所選擇的殖株係係用於刺糖多抱菌 •spmoia)内之ίρη尺的第一個推測性腺苷甲硫胺酸依賴型甲基轉移酶域之後續框内刪除作用。在質體p〇J26〇内之所刪除的尺基因片段之所得序列係示於第5表。因此，一個刪除作用將包括序列辨識編號：12之序列。 ⑧ 76 201201700 第5表·所冊彳除之的第二個推測性s-腺苷甲硫胺酸依賴型甲基轉移酶域之核苷酸序列排比(推測性8_腺苷曱硫胺酸依賴型甲基轉移酶係經突出顯示者）。 •sp«A：(序列辨識編號 Π) (0 sp/iK SAM#2刪除（序列辨識編號. 12) (1) 序列辨識編號 17) (31) jpnA： SAM#2刪除（序列辨識編號 12) (31) 序列辨識編號 17) (61) ip/;A：SAM#2刪除（序列辨識編號 12) (61) 序列辨識編號 17) (91) SAM#2刪除（序列辨識編號 12) (91) jp/iA序列辨識編號 17) (121) SAM#2刪除（序列辨識编號 12) (121) 序列辨識編號 17) (151) ipnA： SAM#2刪除（序列辨識編號 12) (151) #«尺(序列辨識編號 17) (181) •sp/iA： SAM#2刪除（序列辨識編號 12) (181) ίρηΑ：(序列辨識編號 17) (21D sp/?A： SAM#2刪除（序列辨識编號 12) (211) ipw/T(序列辨識編號 17) (241) spnA： SAM#2刪除（序列辨識編號 12) (241) 印《尺(序列辨識編號 17) (271) spnA： SAM#2刪除（序列辨識编號 12) (271) spnA：(序列辨饿編號 17) (301) spnA：SAM#2刪除（序列辨識編號：12) (301) 1 30 ATG丁 CXACAACGC八CGAGATCGAAACCGTG ATGTCCACAACGCACGAGATCGAAACCXiTG 31 60 GAACOCATCATCCTCGCCGCCGGATCCAGT GAACGCATCATCCTCGCCGCCGGATCCAGT 61 90 GCGGCXiACJCCTGGCCGACCTGACCACCGA 八 GCGOCGAGCCTGGCCGACCTGACCACCGAA 91 120 CTCGGACTCGCCAGGATCGCACCCGTGCTG CTCGGACTCGCCAGGATCGCACCXGTGCTG 121 150 ATCGACGAGATCCTCT 丁 CCGCGCGGAACCG ATCGACGAGATCCTCTTCCGCGCGGAACCG 151 180 GCCCCCGACATCGAACGGACCGAGGTCGCG GCCCCCGACATCGAACGGACCCJAGGTCGCG 181 210 GTCCAGATCACCCACCCiAGCiCGACJACXGTT CiTCCAGATCACCCACCGAGCiCGAGACCGTT 211 240 GACTTCGTCCTGACGCTACAGTCCGGTGAG GACTTCGTCCTGACGCTACAGTCCGGTCAG 241 270 CTGA丁CAAGGCXGAGCAACGACCGGTCGGA CTGATCAAGGCCGAGCAACGACCGGTCGGA 271 300 GACGTCCCGCTGCGGATCGGTTACGAGCTC GACGTCCCGCTGCGGATCGGTTACGAGCTC 301 330 ACCGATCTCATCGCCG 八 CmGTTCCKlCCC 八 ACCGATCTCATCGCCGAGTTGTTCGGCCCA 331 360 77 201201700 sp/i/q序列辨識編號: 17) (331) •spnA： SAM#2刪除（序列辨識編號: 12) (331) 序列辨識編號 17) (361) ip/i/f SAM#2刪除（序列辨識編號· 12) (361) 序列辨識編陇 Π) (391) spnA： SAM#2刪除（序列辨識編號 12) (391) ίρη尺(序列辨識編號 17) (421) jpnA： SAM#2刪除（序列辨識編號: 12) (421) 序列辨識編號 17) (451) SAM#2刪除（序列辨識編號 12) (451) spnfC(序列辨識編號 17) (481) SAM#2刪除（序列辨識編號: 12) (481) 序列辨識編號 17) (511) SAM#2刪除（序列辨識編號: 12) (511) 序列辨識編號 17) (541) ίρ/j/C SAM#2刪除（序列辨識編號 12) (541) spnK(序列辨識煸號: 17) (571) SAM#2刪除（序列辨識編號: 12) (571) spn/C(序列辨識編號: 17) (601) jp/jA： SAM#2刪除（序列辨識編號: 12) (601) ίρηΛ：(序列辨識編號 17) (631) SAM#2刪除（序列辨識編號: 12) (631) •spnA：(序列辨識編號: 17) (661) SAM#2刪除（序列辨識編號: 12) (661) jpnA"(序列辨識編號: 17) (691) ίρ/ι/Τ SAM#2刪除（序列辨識編號: 12) (691)

GGAGCTCCCAGGGCCGTCGGCGCCCGGAGC

GGAGCTCCCAGGGCCGTCGGCGCCCGGAGC 361 390

ACCAACTTCCTCCGAACCACCACArCCGGT

ACCAACTTCCTCCGAACCACCACATCCGGT 391 420

ICGATACCCGGTCCGTCGGAACTGTCCGAT

ICGAI'ACCCGGrCCGTCGGAACIGrCCGAT 421 450

(iGCTTCCA(Xi(:CATC IX'CGCAGTGGTCGCC

(]GCTTCCAGGCCATCTCCGCAGTGGTCGCC 451 480

GGCTGCGGGCACCGACGTCCCGACCTCAAC

(K：iCT(iCGGGCACCGAC(：nCCCGACC'rC/\AC 481 510

'H'GCTCGCCTCCCACTACCGCACGGACAAG

TTGCTCGCCTCCCACTACCGCACGGACAAG 511 540

TGGGGCGGCCTGCACTGGTTCACCCCGCTA

TGGCrGCGGCCrGCACTGGTTCACCCCGCTA 541 570

TACCiAGCGACACCTCGGCGAGTTCCGTCAT

TACGAGCGACACCTCGGCGAGTTCCGTGAT 571 600

CGCCCGGTGCGCATCCTGGAGATCGGTGTC

CGCCCGUTGCGCATCCTGGAGATCGGTCiTC 601 630

GC.rC.GCTACAACTTCGACGGTGGCGGCGGC

GGTGGCTACAACTTCGACGGTGGCGGCGGC 631 660

GAATCCCTGAAGATGTGGAAGCGCTACTTC

GAATCCCTGAAGATGTGGAAGCGCTACTTC 661 690 CACCGCGGCC rCG I G I rCGCiGAi GGACG I Γ

CACCGCGGCCTCGTGTTCGGGATGGACGTT 691 720

TTCGACAAG 丁 CCTTCCTCGACCAGCAGAGG

TICGACAAGrCCITCCTCGACCAGCAGAGG 721 750 ⑧ (721)201201700 spnA：(序列辨識編號：17) •sp«尺SAM#2刪除（序列辨識編號：丨2) 序列辨識編號：17) spnA： SAM#2刪除（序列辨識編號：12) 序列辨識编號：17) SAM#2刪除（序列辨識編號：丨2) jpnA：(序列辨識編號：丨7) SAM#2刪除（序列辨識編號：丨2) ίρη尺(序列辨識編號：17) spnA： SAM#2刪除（序列辨識編號：12) spnK(序列辨識編號:i7) ipnA： SAM#2刪除（序列辨識編號：12) 序列辨識編號：17) jp«A： SAM#2刪除（序列辨識編號：12) •spnA：(序列辨識編號：17) spnA： SAM#2刪除（序列辨識編號：12) sp«A：(序列辨識编號：丨7) ίρ«Α· SAM#2刪除（序列辨識編號：丨2) ί/^Α：(序列辨識編號：17) jpnA： SAM#2刪除（序列辨識編號：12) sp/iA：(序列辨識編號：17) ipwA： SAM#2刪除（序列辨識编號：12) 序列辨識編號：17) ϊρ/ιλ： SAM#2刪除（序列辨識編號：丨2) 序列辨識編號：1 7) SAM#2刪除（序列辨識編號：丨2) (721) (751) (751) (781) (781) (811) (781) (841) (781) (871) (781) (901) (791) (931) (821) (961) (851) (991) (881) (1021) (911) (1051) (941) (1081)

CTCTGCACCGTCCGCGCCGACCAGAGCAAG CTCTOCACCGTCCGCGCCGACCAGAGCAAG 751 780 CCCGAGGAGCTGGCCGCCGTrGACGACAAG CCCGAGGAGCTGGCCGCCGTTGACGACAAG 781 810 TACGGACCGTTCGACATCATCATCGACGAT

811 840 GGCAGCCACATCAACGGACACGTGCGCACA

841 870 TCCCTGGAAACGCTGTTCCCCCGGTTGCGC 871 900 AGCGGTGGCGTATACGTGATCGAGGATCrG ............................CGAGGATCTG 901 930 TGGACGACCTATGCTCCCGGATTCGGCGGG fGGACGACCTATGCTCCCGGATTCGGCGGG 931 960 CAGGCGCAGTGCCCGGCCGCACCCGCiCACC CAGGCGCAGTGCCCGGCCGCACCCGGCACC 961 990 ACGGTCAGCCTGCTCAAGAACCTGTTGGAA ACGG'rCAGCCIGCrCAAGAACCrGTTGGAA 991 1020 GGCGT'rCAGCACGAGGAGCAGCCGCATGCG GGCGTTCAGCACGAGGAGCAGCCGCATGCG 1021 1050 GGCTCGTACGAGCCGAGCTACCTGGAACGC GGCTCGTACGAGCCGAGCTACCTGGAACGC 1051 1080 AATTTGGTCGGCCTCCACACCTACCACAAC AATTTGGTCGGCCTCCACACCTACCACAAC 1081 1110 ATCGCGTTCCTGGAGAAAGGCGTCAACGCC ATC(jCGrrCCTGOAGAAAGGCG1CAACGCC 1111 1140 79 (971) 201201700 ίρ/3&(序列辨識編號：丨7) (1111) SΑΜ#2刪除（序列辨識編號：丨2) (1001) spn/C(序列辨識編號：丨7) (1141) jp/jA： SAM#2刪除（序列辨識編號：丨2) (1031) (序列辨識編號：丨7)(丨丨71) jp/iA： SAM#2刪除（序列辨識編號：丨2) (1061) GAAGGCGGCGTTCCTGCTTGGGTGCCAAGG (jAAGGCGGCG I I'CXri'GCrrGGGl'GCCAAGG 1141 1170 Λ GI'CI'G C. Λ CG A CAIATTG C A CCI'GGCCG Λ C AGTCTGGACGACATATTGCACCTGGCCGAC 1171 1194

GTGAACAGCGCGGAGGACGAGTGA (iTGAACAGCGCGGAGGACGAGTGA 將«尤刪除載體接合至刺糖多抱菌（Sizcc/zaropo/jAspora! spinosa) 47 依據Matsushima等人於（1994年）乙文中所述之方法及如第2例所例示，進行帶有π«火框内刪除建構物的大腸桿菌 (五.co/ί)細胞與刺糖多抱菌sp/wosa)之接合作用。挑選由於在J/7WA：框内刪除建構物的載體主鏈上存在安痢黴素抗性基因標記而具有安痢黴素抗性之推測性轉接合菌株。確認轉接合菌株及擴增#«尺區域以測定整合位點單一的初級轉接合菌株在R6培養基上生長，及轉移至增補50微克/毫升的安痢黴素與25微克/毫升的嘹啶酮酸之腦心浸液(ΒΗΙ)瓊脂平皿上，以確認抗性表現型。將轉接合菌株的菌絲體自ΒΗΙ平m接種至增補5〇微克/毫升的安痢黴素之胰蛋白酶大豆肉汁(TSB)培養基中。該培養物係在29°C 及250 rpm的振盪作用下培養72小時。在培養72小時之後採集菌絲體，及分離出基因體〇]^八。使用從轉接合菌株所分離的基因體DNA作為模板，使用設計用來檢測單交換突變株之引子進行PCR。將PCR擴增作用結果定序。定序資料顯示’ 框内刪除建構物係經由單交換同源重組作用而整 ⑧ 80 201201700 合至S/m尺區域中。雙交換框内刪除突變株之分離作用將具安痢黴素抗性的單交換突變株接種在缺乏安痛j黴素的BHI瓊脂平班上，及於29°C培養14日。依據Hopw〇〇d 等人（1卯5年）乙文’自平皿採集孢子及儲存於-8〇。〇的20% 甘油中。將孢子接種至10個不具有安痢黴素的新BHI瓊脂平孤上’及於29°C培養平皿14日。重複該步驟多次。使用20% 甘油稀釋孢子製備物，及將稀釋過的孢子塗在BHI瓊脂平皿上。於29°C培養平皿1〇日，以長成單菌落。將個別菌落補綴至具有與不具有安痢黴素的新BHI瓊脂平皿上。所有平皿係於29°C培養1〇日，以長成菌絲體。辨識出在含有5〇微克/毫升的安痛Ϊ黴素之BHI瓊脂平jni上不生長的菌落係雙交換突變株的候選者，及挑選供使用PCR的驗證作用之用。雙交換突變株之辨識與驗證經由PCR破認雙交換突變株。在PCR擴增作用中，係使用經δ又a十在基因内結合之引子。經由瓊脂糖凝膠電泳測定PCR產物的大小。辨識出造成在基因内的第二個推測性S -腺苷甲硫胺酸依賴型曱基轉移酶域之刪除作用之雙父換大變株’及基於PCR產物的大小而進行挑選。pCR 片段的大小與DNA序列顯示在基因内的第二個推測性 S-腺苷甲硫胺酸依賴型曱基轉移酶域之刪除作用。經由搖瓶發酵作用產生斯賓諾辛雙交換突變株可在Burns等人(WO 2003070908)所述之條件下進仃發酵。可在Baltz等人(第6，143,526號美國專利） 201201700 所述之條件下’分析發酵液中是轉在斯⑽辛因子。雙交換突變株之發酵作用產生斯賓諾辛1與1^。第6.4例3’端刪除載體之建構使用種產生斯賓諾辛八與〇之品系的基因體DNA (Hopwood等人於1985年乙文），進行二個dna片段的pcR擴增作用。第一個擴增片段的長度約為^00個鹼基對及直接位於-鎌基對1141的上游。第二個擴增片段的長度約為1,500個鹼基對，及直接位於V«尺終止密碼子的下游及包括一部分的使用嫻熟技藝者所知之方法，完成PCR 擴增作用。合成寡核苷酸引子，以納入限制酶結合序列。使用將藉由引子所納入的結合序列切開之限制酶，酶切所產生的PCR產物。將該等片段連接在一起，然後連接至質體POJ260的對應酶切位點中。將所產生的連接產物植入大腸桿菌（五.⑺//)勝任細胞中。挑選菌落及經由限制酶酶切作用與DNA序列分析，而篩檢出所欲的連接產物。辨識出陽性殖株’及所選擇的殖株係用於後刺糖多孢菌 OSacchro/po/ppona ”/⑽扣）内之孕„尺3 ’端的後續删除作用。在質體POJ260内之所刪除的尺基因片段之所得序列係示於第6表。因此，一個[冊彳除作用將包括序列辨識編號：13之序列。 ⑧ 82 201201700 第6表：所刪除的尺基因3,端之核苷酸序列排比。 3’端刪除（序列辨識編號：丨3) 叹/7&與下游序列（序列辨識編號：丨5) (1) ⑴ 3 ’端刪除（序列辨識編號：j3) 叫《尤與下游序列（序列辨識編號：丨5) P6) (26) 叫《尺3’端刪除（序列辨識編號：丨3) V«夂與下游序列（序列辨識編號：丨5) (51) (51) ¥«尺3’端刪除（序列辨識編號13) 印《尺與下游序列（序列辨識編號;丨5) (76) (76) 吵》尺3’端刪除（序列辨織編號丨3) 與下游序列（序列辨識蝙號」5) (101) (101) 叹》尺3’端刪除（序列辨硪蝙戢丨 #«尺與下游序列（序列辨熾蝙號|丨5) (126) (126) 吵《尺3’端刪除（序列辨識蝙坑聊尺與下游序列（序列辨· (151) (151) 树3’端刪除(序列辨與下游序列（序列辨、％ ^ (176) (176) ⑽3’端刪除(序列辨㈣下游序列(序列辨織編號:丨5; (201) (201) _尺3,端刪除（序列辨織禅與下游序列(序列辨織編號;15; (226) (226) 叹们，端刪除（序列辨識 _與下游序列（序列辨 (251) (251) 啊尺3,端刪除（序列辨織啊尺與下游序列（序列辨、 (276) (276) _尺3’端刪除（序列辨識編^) (301) 1 25

ATGTCCACAACGCACGAGATCGAAA

ATGTCCACAACGCACGAGATCGAAA 26 50

CCGTGGAACGCATCATCCTCGCCGC

CCGTGGAACGCATCATCCTCGCCGC 51 75

CGGATCCAGTGCGGCGAGCCTGGCC

CGGATCCAGTGCGGCGAGCCTGGCC 76 100

GACCTGACCACCGAACTCGGACTCG

GACCTGACCACCGAACTCGGACTCG 101 125

CCAGGATCGCACCCGTGCTGATCGA

CCAGGATCGCACCCGTGCTGATCGA 126 150

CGAGATCCTCTTCCGCGCGGAACCG

CGAGATCCTCTTCCGCGCGGAACCG 151 175

GCCCCCGACATCGAACGGACCGAGG

GCCCCCGACATCGAACGGACCGAGG 176 200

TCGCGGTCCAGATCACCCACCGAGG

TCGCGGTCCAGATCACCCACCGAGG 201 225

CGAGACCGTTGACTTCGTCCTGACG

CGAGACCGTTGACT 丁 CGTCCTGACG 226 250

CTACAGTCCGGTGAGCTGATCAAGG

CTACAGTCCGGTGAGCTGATCAAGG 251 275

CCGAGCAACGACCGGTCGGAGACGT

CCGAGCAACGACCGGTCGGAGACGT 276 300

CCCGCTGCGGATCGGTTACGAGCTC

CCCGCTGCGGATCGGTTACGAGCTC 301 325

ACCGATCTCATCGCCGAGTTGTTCG 83 201201700

•sp/iA：與下游序列（序列辨識編號：丨5) (301) ACCGATCTCATCGCCGAGTTGTTCG 326 350 spn尺3,端刪除（序列辨識編號：丨3) (326) GCCCAGGAGCTCCCAGGGCCGTCGG sprt/C與下游序列（序列辨識編號：15) (326) GCCCAGGAGCTCCCAGGGCCG下CGG 351 375 •spw/C 3’端刪除（序列辨識编號：丨3) (351) CGCCCGGAGCACCAACTTCCTCCGA 與下游序列（序列辨識編號：丨5) (351) COCCCGGAGCACCAACTTCCTCCGA 376 400 尺3’端刪除（序列辨識編號：丨3) (376) ACCACCACATCCGGTTCGATACCCG sp/i/C與下游序列（序列辨識編號：丨5) (376) ACCACCACA丁CCGG丁TCGATACCCG 401 425 •spn/C 3，端刪除（序列辨識編號：丨3) (401) GTCCGTCGGAACTGTCCGATGGCTT S/?/7尺與下游序列（序列辨識編號：丨5) (401) GTCCGTCGGAACTGTCCGATGGCTT 426 450 尺3，端刪除（序列辨識編號：丨3) (426) CCAGGCCATCTCCGCAGTGGTCGCC 與下游序列（序列辨識編號：丨5) (426) CCAGGCCATCTCCGCAGTGGTCGCC 451 475 3,端刪除（序列辨識編號：丨3) (451) GGCTGCGGGCACCGACGTCCCGACC J/7/ϊ欠與下游序列（序列辨識編號：丨5) (451) GGCTGCGGGCACCGACGTCCCGACC 476 500 3，端刪除（序列辨識編號：丨3) (476) TCAACTTGCTCGCCTCCCACTACCG yp/ί/Γ與下游序列（序列辨識編號：丨5) (476) TCAACTTGCTCGCCTCCCACTACCG 501 525 •yp/7/C 3’端刪除（序列辨識編號：13) (501) CACGGACAAG丁GGGGCGGCCTGCAC 叹λ尺與下游序列（序列辨識編號：15) (501) CACGGACAAGTGGGGCGGCCTGCAC 526 550 •SP«尺3’端刪除（序列辨識編號：13) (526) TGGTTCACCCCGCTATACGAGCGAC 5/7/7尺與下游序列（序列辨識編號：15) (526) TGGTTCACCCCGCTATACGAGCGAC 551 575 尺3’端刪除（序列辨識編號：13) (551) ACCTCGGCGAGTTCCGTGATCGCCC 以?/?&與下游序列（序列辨識編號：丨5) (551) ACCTCGGCGAGTTCCGTGATCGCCC 576 600 3’端刪除（序列辨識編號：丨3) (576) GGTGCGCATCCTGGAGATCGGTGTC •spn/C與下游序列（序列辨識編號：15) (576) GGTGCGCATCCTGGAGATCGGTGTC 601 625 3’端刪除（序列辨識編號：丨3) (601) GGTGGCTACAACTTCGACGGTGGCG 與下游序列（序列辨識編號：15) (601) GGTGGCTACAACTTCGACGGTGGCG 626 650 3’端刪除（序列辨識编號：13) (626) GCGGCGAATCCCTGAAGATGTOGAA ⑧ 84 201201700 與下游序列（序列辨識蝙號：丨5) 尺3’端刪除（序列辨識蝙號丨3) V«尺與下游序列（序列辨識蝙號丨5) V«尺3,端刪除（序列辨識蝙號丨3) Μ«尺與下游序列（序列辨識蝙號：丨5) 切/7尺3 ’端刪除（序列辨識蝙號：丨3) #«尺與下游序列（序列辨識編號丨5) 印》尺3’端刪除（序列辨識編號：13) 與下游序列（序列辨識蝙號：丨5) #«欠3’端刪除（序列辨識蝙號：丨3) 印《尺與下游序列（序列辨識編號：丨5) 尺3’端刪除（序列辨識編號：丨3) #«Α：與下游序列（序列辨識蝙號：15) #«尺3’端刪除（序列辨識蝙號：丨3) ip/jA：與下游序列（序列辨織編號μ) 叹《/：3’端刪除（序列辨識蝙號：13) 與下游序列（序列辨識蝙號：丨5) 叹》尺3’端刪除（序列辨識編號：13) 與下游序列（序列辨織蝙號：15) 叹《尺3’端刪除（序列辨識編號：13) 印n/C與下游序列（序列辨識編號：15) 印《欠3’端刪除（序列辨識蝙號：13) #«尺與下游序列（序列辨識編號：丨5) ㈣尺3’端刪除（序列辨識編號：13) W«欠與下游序列（序列辨識蝙號：丨5) #«尺3’端刪除（序列辨識編號：13) (626) GCGGCGAATCCCTGAAGATGTGGAA 651 675 (651) GCGCTACTTCCACCGCGGCCTCGTG (651) GCGCTACTTCCACCGCGGCCTCGTG 676 700 (676) TTCGGGATGGACGTTTTCGACAAGT (676) TTCGGGATGGACGTTTTCGACAAGT 701 725 (701) CCTTCCTCGACCAGCAGAGGCTCTG (701) CCTTCCTCGACCAGCAGAGGCTCTG 726 750 (726) CACCGTCCGCGCCGACCAGAGCAAG (726) CACCGTCCGCGCCGACCAGAGCAAG 751 775 (751) CCCGAGGAGCTGGCCGCCGTTGACG (751) CCCGAGGAGCTGGCCGCCGTTGACG 776 800 (776) ACAAGTACGGACCGTTCGACATCAT (776) ACAAGTACGGACCGTTCGACATCAT 801 825 (801) CATCGACGATGGCAGCCACATCAAC (801) CATCGACGATGGCAGCCACATCAAC 826 850 (826) GGACACGTGCGCACATCCCTGGAAA (826) GGACACGTGCGCACATCCCTGGAAA 851 875 (851) CGCTGTTCCCCCGGTTGCGCAGCGG (851) CGCTGTTCCCCCGGTTGCGCAGCGG 876 900 (876) TGGCGTATACGTGATCGAGGATCTG (876) TGGCGTATACGTGATCGAGGATCTG 901 925 (901) TGGACGACCTATGCTCCCGGATTCG (901) TGGACGACCTATGCTCCCGGATTCG 926 950 (926) GCGGGCAGGCGCAGTGCCCGGCCGC (926) GCGGGCAGGCGCAGTGCCCGGCCGC 951 975

(951) ACCCGGCACCACGGTCAGCCTGCTC 85 201201700 (951) (976) (976) (1001) (1001) (1026) (1026) (1051) (1051) (1076) (1076) (1082) (1101) (1082) (1126) (1082) (Π51) (1082) (1176) CAGCGCGGAGGACGAGTGAACAGCA (1087) (1201) 與下游序列（序列辨熾蝙號：丨5) 以^&3’端刪除（序列辨職編號.丨3) ππ/Τ與下游序列（序列辨識蝙號|丨5) 端刪除（序列辨熾蝙號丨3) 以"欠與下游序列（序列辨職蝙號：丨5) #/^3’端刪除（序列辨織蝙號丨3) 與下游序列（序列辨識蝙號：丨5) #«尺3’端刪除（序列辨熾蝙號丨3) 與下游序列（序列辨織蝙號‘丨5) 叫《尺3’端刪除（序列辨識碥號丨3) 與下游序列（序列辨熾蝙號|丨5) 以^尺3’端刪除（序列辨熾蝙號丨3) W-尺與下游序列（序列辨織蝙號;15) 端刪除（序列辨識蝙號i3) 與下游序列（序列辨熾蝙號：15) 端刪除（序列辨識編號：丨3) 與下游序列（序列辨識編號：丨5) ”《尺3’端刪除（序列辨識蝙號：丨3) 與下游序列（序列辨識編號:15) 以^尺3’端刪除（序列辨識編號：丨3) 印n/C與下游序列（序列辨識編號：丨5) *5/7/7尺3’端刪除（序列辨識編號：丨3) #/?Α：與下游序列（序列辨識編號：15) ACCCGGCACCACGGTCAGCCTGCTC 976 1000 AAGAACCTGTTGGAAGGCGTTCAGC AAGAACCTGTTGGAAGGCGTTCAGC 1001 1025 ACGAGGAGCAGCCGCATGCGGGCTC ACGAGGAGCAGCCGCATGCGGGCTC 1026 1050 GTACGAGCCGAGCTACCTGGAACGC GTACGAGCCGAGCTACC TGGAACGC 1051 1075 AATTTGGTCGGCCTCCACACCTACC AATTTGGTCGGCCTCCACACCTACC 1076 1010 ACAACA............................ ACAACATCGCGTTCCTGGAGAAAGG 1101 1125 CGTCAACGCCGAAGGCGGCGTTCCT 1126 1150 GCTTGGGTGCCAAGGAGTCTGGACG 1151 1175 ACATATTGCACCTGGCCGACGTGAA 1176 1200 1201 1225 GAGGGGCGAACACACAGGCATTTCC GAGGGGCGAACACACAGGCATTTCC 1226 1238

(1112) GACCGCGGATCAG (1226) GACCGCGGATCAG 將尺刪除載體接合至刺糖多抱菌 spinosa) 47 依據Matsushima等人於（1994年）乙文中所述之方法及 ⑧ 86 201201700 如第2例所例示，進行帶有印《尺3,端刪除建構物的大腸桿菌 (五· co/z)細胞與刺糖多孢菌（Sacc；?⑽之接合作用。挑選由於在印《尺3’端刪除建構物的載體主鏈上存在安痢黴素抗性基因標記而具有安痢黴素抗性之推測性轉接合菌株。確3忍轉接合菌株及擴增尺區域以測定整合位點卓一的初級轉接合菌株在R6培養基上生長，及轉移至增補5 0微克/毫升的安痢黴素與2 5微克/毫升的嘹啶酮酸之腦心浸液(ΒΗΙ)瓊脂平皿上，以確認抗性表現型。將轉接合菌株的菌絲體自ΒΗΙ平姐接種至增補5〇微克/毫升的安痢黴素之胰蛋白酶大豆肉汁(TSB)培養基中。該培養物係在29。〇及250 rpm的振盪作用下培養72小時。在培養72小時之後採集卤絲體’及分離出基因體DNA。使用從轉接合菌株所分離的基因體DNA作為模板，使用設計用來檢測單交換突變株之引子進行PCR。將PCR擴增作用結果定序。定序資料顯示W «尺3 ’端刪除建構物係經由單交換同源重組作用而整合至區域中。雙交換3’端刪除突變株之分離作用將具安痢黴素抗性的單交換突變株接種在缺乏安痢黴素的ΒΗΙ瓊脂平皿上，及於29。〇培養。依據H〇pw〇〇d 等人（1985年）乙文，自平皿採集孢子及儲存於⑽它的汕％甘油中。將孢子接種至1〇個不具有安痢黴素的新BHI瓊脂平皿上，及於29 C培養平皿14日。重複該步驟多次。使用2〇% 甘油稀釋孢子製備物’及將稀釋過的孢子塗在BHI瓊脂平皿 87 201201700 以長成單_落。將個靡落補綴上。於29°C培養平皿ι〇日至具有與不具有安痢黴素的新BHI瓊脂平皿上。所有平皿係於29°C培養1G日，以長賴絲體。辨識出在含有升的安賴素之BHI瓊脂平对不生長的㈣係雙交換突變株的候選者，及挑選供使用PCR的驗證作用之用。雙交換突變株之辨識與驗證經由PCR確認雙交換突變株。在PCR擴增作用中，係使用經設計在_尺與啊Z基因内結合之引子。經由壤脂糖凝膠電泳測定PCR產物的大小。辨識出造成柯基因3,端的刪除作用之雙交換突變株，及基於PCR產物的大小而進行挑選PCR片^又的大小與DNA序列顯示吵从基因的3，端之刪除作用。經由搖瓶發酵作用產生斯賓諾辛雙父換突變株可在Burns等人(WO 2003070908)所述之條件下進行發酵。可在Baltz等人（第6，143 526號美國專利）所述之條件下’分析發酵液中是否存在斯賓諾辛因子。雙交換突變株之發酵作用產生斯賓諾辛j與L。所弓丨用的所有專利與發表文獻皆在此完整地併入本案以爲參考資料。前述係說明本發明，而不應詮釋為限制本發明。本發明係由下列申請專利範圍所界定，及申請專利範圊的等效物亦包括在其中。 I：圖式簡單說明】第1圖說明點突變作用之位置。該突變作用係野生型序列（序列辨識編號：17)内的醒目部分。 201201700 第2圖係描述^礼/·、尺、之物理圖譜。所產生的PCR產物係由染色體圖下方的線所示。第3圖係顯示作為如本發明的一實施例之一種單交換同源重組作用之區域内的π«尺框内刪除建構物之整合作用。（星號顯示與之不完整的編碼序列）。第4圖說明如本發明的一實施例之造成V«尺基因的刪除作用之雙交換突變株。PCR片段的大小與DNA序列顯示 sp«尺基因的框内删除作用。第5圖係如本發明的一實施例之在π«尺内含有一框内安痢黴素(Apramycin)抗性基因卡匣（<aac(^/F)的插入卡匣之一圖。第6圖係描述位於如本發明的一實施例之π 編碼序列（序列辨識編號：16)上游之核糖體結合位點（標示為夏因-達爾加諾（Shine-Dalgarno))。該序列係該圖中的醒目部分。【主要元件符號說明】 (無） 89 201201700 序列表 <110>陶氏農業科學公司 Han, Lei <120> SPNK 品系（SPNK STRAINS) <130〉 69250 <160> 17 <170>專利申請軟體3.5版 <210〉 1 <211〉 34 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉寡核苷酸引子：spnKF <400〉 1 gggaattcca tatgtccaca acgcacgaga tcga 34 <210〉 2 <211〉 34 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223〉寡核苷酸引子：spnKR <400> 2 gccgctcgag ctcgtcctcc gcgctgttca cgtc 34

<210> 3 <211> 23 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>寡核苷酸引子：前置引子#1 <400> 3 cggtgcccga attccatgac ccg 23 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉寡核苷酸引子：反置引子#1 ' <400〉 4 gtgcgttcta gacatatgag ctcctcatgg ctg 33 <210> 5 <211> 33 1 201201700 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉寡核苷酸引子：前置引子#2 <400〉 5 gtgccatcta gactggacga catattgcac ctg 33 <210〉 6 <211〉 31 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子：反置引子#2 <400〉 6 gaatgcgaag cttacgatct cgtcgtccgt g 31 <210> 7 <211〉 24 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉寡核苷酸引子：spnl(刪除驗證1前置 <400> 7 gttcacggtg attccggtga ctcg 24 <210〉 8 <211〉 24 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223>寡核苷酸引子：spnK刪除驗證1反置 <400〉 8 acctgcactg cttcctggag cttc 24 <210〉 9 <211> 60 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉含有一内部刪除作用之spnK序列 <400〉 9 atgtctagac tggacgacat attgcacctg gccgacgtga acagcgcgga ggacgagtga 60 <210〉 10 2 60 60 序 34A 工 llllDN人 201201700 <211〉 1147 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223〉含有一個5’端刪除作用之spnK序列 <400〉 10 ggagctcatc acggcggcga gcctggccga cctgaccacc gaactcggac tcgccaggat cgcacccgtg ctgatcgacg agatcctctt ccgcgcggaa ccggcccccg acatcgaacg gaccgaggtc gcggtccaga tcacccaccg aggcgagacc gttgacttcg tcctgacgct acagtccggt gagctgatca aggccgagca acgaccggtc ggagacgtcc cgctgcggat cggttacgag ctcaccgatc tcatcgccga gttgttcggc ccaggagctc ccagggccgt cggcgcccgg agcaccaact tcctccgaac caccacatcc ggttcgatac ccggtccgtc ggaactgtcc gatggcttcc aggccatctc cgcagtggtc gccggctgcg ggcaccgacg tcccgacctc aacttgctcg cctcccacta ccgcacggac aagtggggcg gcctgcactg gttcaccccg ctatacgagc gacacctcgg cgagttccgt gatcgcccgg tgcgcatcct . ggagatcggt gtcggtggct acaacttcga cggtggcggc ggcgaatccc tgaagatgtg gaagcgctac ttccaccgcg gcctcgtgtt cgggatggac gttttcgaca agtccttcct cgaccagcag aggctctgca ccgtccgcgc cgaccagagc aagcccgagg agctggccgc cgttgacgac aagtacggac cgttcgacat catcatcgac gatggcagcc acatcaacgg acacgtgcgc acatccctgg aaacgctgtt cccccggttg cgcagcggtg gcgtatacgt gatcgaggat ctgtggacga cctatgctcc cggattcggc gggcaggcgc agtgcccggc cgcacccggc accacggtca gcctgctcaa gaacctgttg gaaggcgttc agcacgagga gcagccgcat gcgggctcgt acgagccgag ctacctggaa cgcaatttgg tcggcctcca cacctaccac aacatcgcgt tcctggagaa aggcgtcaac gccgaaggcg gcgttcctgc ttgggtgcca aggagtctgg acgacatatt gcacctggcc gacgtgaaca gcgcggagga cgagtga <210〉 <211〉 <212〉 <213〉 <220> <223> SpnK的第一個推測性S-腺苷甲硫胺酸依賴型甲基轉移酶域之刪除作用 <400〉11 atgtccacaa cgcacgagat cgaaaccgtg gaacgcatca tcctcgccgc cggatccagt 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1147 3 201201700 gcggcgagcc tggccgacct gaccaccgaa ctcggactcg ccaggatcgc acccgtgctg atcgacgaga tcctcttccg cgcggaaccg gcccccgaca tcgaacggac cgaggtcgcg gtccagatca cccaccgagg cgagaccgtt gacttcgtcc tgacgctaca gtccggtgag ctgatcaagg ccgagcaacg accggtcgga gacgtcccgc tgcggatcgg ttacgagctc accgatctca tcgccgagtt gttcggccca ggagctccca gggccgtcgg cgcccggagc accaacttcc tccgaaccac cacatccggt tcgatacccg gtccgtcgga actgtccgat ggcttccagg ccatctccgc agtggtcgcc ggctgcgggc accgacgtcc cgacctcaac ttgctcgcct cccactaccg cacggacaag tggggcggcc tgcactggtt caccccgcta tacgagcgac acctcggcga tggcggcggc gaatccctga agatgtggaa gcgctacttc caccgcggcc tcgtgttcgg gatggacgtt ttcgacaagt ccttcctcga ccagcagagg ctctgcaccg tccgcgccga ccagagcaag cccgaggagc tggccgccgt tgacgacaag tacggaccgt tcgacatcat catcgacgat ggcagccaca tcaacggaca cgtgcgcaca tccctggaaa cgctgttccc ccggttgcgc agcggtggcg tatacgtgat cgaggatctg tggacgacct atgctcccgg attcggcggg caggcgcagt gcccggccgc acccggcacc acggtcagcc tgctcaagaa cctgttggaa ggcgttcagc acgaggagca gccgcatgcg ggctcgtacg agccgagcta cctggaacgc aatttggtcg gcctccacac ctaccacaac atcgcgttcc tggagaaagg cgtcaacgcc gaaggcggcg ttcctgcttg ggtgccaagg agtctggacg acatattgca cctggccgac gtgaacagcg cggaggacga gtga <210〉 12 <211〉 1084 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> SpnK的第二個推測性S-腺苷甲硫胺酸依賴型甲基轉移酶域之刪除作用 <400〉 12 atgtccacaa cgcacgagat cgaaaccgtg gaacgcatca tcctcgccgc cggatccagt gcggcgagcc tggccgacct gaccaccgaa ctcggactcg ccaggatcgc acccgtgctg atcgacgaga tcctcttccg cgcggaaccg gcccccgaca tcgaacggac cgaggtcgcg gtccagatca cccaccgagg cgagaccgtt gacttcgtcc tgacgctaca gtccggtgag ctgatcaagg ccgagcaacg accggtcgga gacgtcccgc tgcggatcgg ttacgagctc accgatctca tcgccgagtt gttcggccca ggagctccca gggccgtcgg cgcccggagc 120 180 240 300 360 420 480 540 6〇〇 660 720 780 840 9〇〇 960 1020 1080 1134 60 120 180 240 300 360 ⑧ 4 420 201201700 accaacttcc tccgaaccac cacatccggt tcgatacccg gtccgtcgga actgtccgat ggcttccagg ccatctccgc agtggtcgcc ggctgcgggc accgacgtcc cgacctcaac ttgctcgcct cccactaccg cacggacaag tggggcggcc tgcactggtt caccccgcta tacgagcgac acctcggcga gttccgtgat cgcccggtgc gcatcctgga gatcggtgtc ggtggctaca acttcgacgg tggcggcggc gaatccctga agatgtggaa gcgctacttc caccgcggcc tcgtgttcgg gatggacgtt ttcgacaagt ccttcctcga ccagcagagg ctctgcaccg tccgcgccga ccagagcaag cccgaggagc tggccgccgt tgacgacaag cgaggatctg tggacgacct atgctcccgg attcggcggg caggcgcagt gcccggccgc acccggcacc acggtcagcc tgctcaagaa cctgttggaa ggcgttcagc acgaggagca gccgcatgcg ggctcgtacg agccgagcta cctggaacgc aatttggtcg gcctccacac ctaccacaac atcgcgttcc tggagaaagg cgtcaacgcc gaaggcggcg ttcctgcttg ggtgccaagg agtctggacg acatattgca cctggccgac gtgaacagcg cggaggacga gtga <210〉 13 <211〉 1124 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉含有一個3’端刪除作用之spnK核苷酸序列 <400〉 13 atgtccacaa cgcacgagat cgaaaccgtg gaacgcatca tcctcgccgc cggatccagt gcggcgagcc tggccgacct gaccaccgaa ctcggactcg ccaggatcgc acccgtgctg atcgacgaga tcctcttccg cgcggaaccg gcccccgaca tcgaacggac cgaggtcgcg gtccagatca cccaccgagg cgagaccgtt gacttcgtcc tgacgctaca gtccggtgag ctgatcaagg ccgagcaacg accggtcgga gacgtcccgc tgcggatcgg ttacgagctc accgatctca tcgccgagtt gttcggccca ggagctccca gggccgtcgg cgcccggagc accaacttcc tccgaaccac cacatccggt tcgatacccg gtccgtcgga actgtccgat ggcttccagg ccatctccgc agtggtcgcc ggctgcgggc accgacgtcc cgacctcaac ttgctcgcct cccactaccg cacggacaag tggggcggcc tgcactggtt caccccgcta tacgagcgac acctcggcga gttccgtgat cgcccggtgc gcatcctgga gatcggtgtc ggtggctaca acttcgacgg tggcggcggc gaatccctga agatgtggaa gcgctacttc caccgcggcc tcgtgttcgg gatggacgtt ttcgacaagt ccttcctcga ccagcagagg 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1084 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 5 780 201201700 ctctgcaccg tccgcgccga ccagagcaag cccgaggagc tggccgccgt tgacgacaag tacggaccgt tcgacatcat catcgacgat ggcagccaca tcaacggaca cgtgcgcaca tccctggaaa cgctgttccc ccggttgcgc agcggtggcg tatacgtgat cgaggatctg tggacgacct atgctcccgg attcggcggg caggcgcagt gcccggccgc acccggcacc acggtcagcc tgctcaagaa cctgttggaa ggcgttcagc acgaggagca gccgcatgcg ggctcgtacg agccgagcta cctggaacgc aatttggtcg gcctccacac ctaccacaac acagcagagg ggcgaacaca caggcatttc cgaccgcgga tcag

<210〉 14 <211> 1207 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223> spn!(與鄰接的上游序列 <400〉 14 ggagctcatc acgatgtcca caacgcacga gatcgaaacc gtggaacgca tcatcctcgc cgccggatcc agtgcggcga gcctggccga cctgaccacc gaactcggac tcgccaggat cgcacccgtg ctgatcgacg agatcctctt ccgcgcggaa ccggcccccg acatcgaacg gaccgaggtc gcggtccaga tcacccaccg aggcgagacc gttgacttcg tcctgacgct acagtccggt gagctgatca aggccgagca acgaccggtc ggagacgtcc cgctgcggat cggttacgag ctcaccgatc tcatcgccga gttgttcggc ccaggagctc ccagggccgt cggcgcccgg agcaccaact tcctccgaac caccacatcc ggttcgatac ccggtccgtc ggaactgtcc gatggcttcc aggccatctc cgcagtggtc gccggctgcg ggcaccgacg tcccgacctc aacttgctcg cctcccacta ccgcacggac aagtggggcg gcctgcactg gttcaccccg ctatacgagc gacacctcgg cgagttccgt gatcgcccgg tgcgcatcct ggagatcggt gtcggtggct acaacttcga cggtggcggc ggcgaatccc tgaagatgtg gaagcgctac ttccaccgcg gcctcgtgtt cgggatggac gttttcgaca agtccttcct cgaccagcag aggctctgca ccgtccgcgc cgaccagagc aagcccgagg agctggccgc cgttgacgac aagtacggac cgttcgacat catcatcgac gatggcagcc acatcaacgg acacgtgcgc acatccctgg aaacgctgtt cccccggttg cgcagcggtg gcgtatacgt gatcgaggat ctgtggacga cctatgctcc cggattcggc gggcaggcgc agtgcccggc cgcacccggc accacggtca gcctgctcaa gaacctgttg gaaggcgttc agcacgagga 840 900 960 1020 1080 1124 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 6 1080 201201700 gcagccgcat gcgggctcgt acgagccgag ctacctggaa cgcaatttgg tcggcctcca cacctaccac aacatcgcgt tcctggagaa aggcgtcaac gccgaaggcg gcgttcctgc ttgggtgcca aggagtctgg acgacatatt gcacctggcc gacgtgaaca gcgcggagga cgagtga <210〉 15 <211> 1238 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> spnK與鄰接的下游序列 <400〉 15 atgtccacaa cgcacgagat cgaaaccgtg gaacgcatca tcctcgccgc cggatccagt gcggcgagcc tggccgacct gaccaccgaa ctcggactcg ccaggatcgc acccgtgctg atcgacgaga tcctcttccg cgcggaaccg gcccccgaca tcgaacggac cgaggtcgcg gtccagatca cccaccgagg cgagaccgtt gacttcgtcc tgacgctaca gtccggtgag ctgatcaagg ccgagcaacg accggtcgga gacgtcccgc tgcggatcgg ttacgagctc accgatctca tcgccgagtt gttcggccca ggagctccca gggccgtcgg cgcccggagc accaacttcc tccgaaccac cacatccggt tcgatacccg gtccgtcgga actgtccgat ggcttccagg ccatctccgc agtggtcgcc ggctgcgggc accgacgtcc cgacctcaac ttgctcgcct cccactaccg cacggacaag tggggcggcc tgcactggtt caccccgcta tacgagcgac acctcggcga gttccgtgat cgcccggtgc gcatcctgga gatcggtgtc ggtggctaca acttcgacgg tggcggcggc gaatccctga agatgtggaa gcgctacttc caccgcggcc tcgtgttcgg gatggacgtt ttcgacaagt ccttcctcga ccagcagagg ctctgcaccg tccgcgccga ccagagcaag cccgaggagc tggccgccgt tgacgacaag tacggaccgt tcgacatcat catcgacgat ggcagccaca tcaacggaca cgtgcgcaca tccctggaaa cgctgttccc ccggttgcgc agcggtggcg tatacgtgat cgaggatctg tggacgacct atgctcccgg attcggcggg caggcgcagt gcccggccgc acccggcacc acggtcagcc tgctcaagaa cctgttggaa ggcgttcagc acgaggagca gccgcatgcg ggctcgtacg agccgagcta cctggaacgc aatttggtcg gcctccacac ctaccacaac atcgcgttcc tggagaaagg cgtcaacgcc gaaggcggcg ttcctgcttg ggtgccaagg agtctggacg acatattgca cctggccgac gtgaacagcg cggaggacga gtgaacagca :ιΓ gaggggcgaa cacacaggca tttccgaccg cggatcag i 1140 1200 1207 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1238 7 201201700

<210〉 16 <211〉 70 <212> DNA <213〉刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa) <400〉 16 ccgccggcac ggctttcacc cggtcagcca tgaggagctc atcacgatgt ccacaacgca 60 cgagatcgaa 70

<210> 17 <211> 1194 <212〉 DNA <213〉刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa) <400〉 17 atgtccacaa cgcacgagat cgaaaccgtg gaacgcatca tcctcgccgc cggatccagt 60 gcggcgagcc tggccgacct gaccaccgaa ctcggactcg ccaggatcgc acccgtgctg 120 atcgacgaga tcctcttccg cgcggaaccg gcccccgaca tcgaacggac cgaggtcgcg 180 gtccagatca cccaccgagg cgagaccgtt gacttcgtcc tgacgctaca gtccggtgag 240 ctgatcaagg ccgagcaacg accggtcgga gacgtcccgc tgcggatcgg ttacgagctc 300 " accgatctca tcgccgagtt gttcggccca ggagctccca gggccgtcgg cgcccggagc 360 , accaacttcc tccgaaccac cacatccggt tcgatacccg gtccgtcgga actgtccgat 420 ggcttccagg ccatctccgc agtggtcgcc ggctgcgggc accgacgtcc cgacctcaac 480 ttgctcgcct cccactaccg cacggacaag tggggcggcc tgcactggtt caccccgcta 540 tacgagcgac acctcggcga gttccgtgat cgcccggtgc gcatcctgga gatcggtgtc 600 ggtggctaca acttcgacgg tggcggcggc gaatccctga agatgtggaa gcgctacttc 660 caccgcggcc tcgtgttcgg gatggacgtt ttcgacaagt ccttcctcga ccagcagagg 720 ctctgcaccg tccgcgccga ccagagcaag cccgaggagc tggccgccgt tgacgacaag 780 tacggaccgt tcgacatcat catcgacgat ggcagccaca tcaacggaca cgtgcgcaca 840 tccctggaaa cgctgttccc ccggttgcgc agcggtggcg tatacgtgat cgaggatctg 900 tggacgacct atgctcccgg attcggcggg caggcgcagt gcccggccgc acccggcacc 960 acggtcagcc tgctcaagaa cctgttggaa ggcgttcagc acgaggagca gccgcatgcg 1020 ggctcgtacg agccgagcta cctggaacgc aatttggtcg gcctccacac ctaccacaac 1080 atcgcgttcc tggagaaagg cgtcaacgcc gaaggcggcg ttcctgcttg ggtgccaagg 1140 agtctggacg acatattgca cctggccgac gtgaacagcg cggaggacga gtga 1194 ⑧ 8

Claims

201201700 七、申請專利範圍： 1. 一種用於將產生賜諾殺(Spinosad)的一品系轉變為產生賜諾特（spinetoram)前驅物的一品系之方法，其包括在尺基因中產生一改造作用而消除3，_〇_甲基轉移酶活性。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該改造作用係選自於由一種框内刪除作用、一種點突變作用、—種刪除作用及一種插入作用所組成之群組。 3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該框内刪除作用係選自於由一種5,端的框内刪除作用、一種3’端的框内刪除作用及一種spnA：編碼區域的框内刪除作用所組成之群組。 4. 如申請專利範圍第2項之方法’其中該刪除作用係中斷 spniC基因的正常閱讀框之單一或多個核苷酸鹼基刪除作用。 5·如申請專利範圍第2項之方法，其中該插入作用係中斷叩《尺基因的正常閱讀框之單一或多個核苷酸鹼基插入作用。 6. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該點突變作用係造成在叩《尺基因的活性位點或受質結合位點之一胺基酸取代作用。 7. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該點突變作用係發生在選自於由 528、589、602、668、721、794、862、 895、908、937及1131位置所組成之群組之鹼基對位置。 1 201201700 8. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該點突變作用係由化學誘突變作用所造成。 9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中經由使用反訊息技術而使得該Μ«尺基因失能。 10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該改造作用發生在 sp «尺編碼區域内。 11. 一種產生一種賜諾特前驅物之經基因改造的宿主細胞，其中該經基因改造的宿主細胞係通常不產生顯著量的賜諾特前驅物之一原核宿主細胞，其包含在«尺基因中產生一改造作用而消除3’-0-甲基轉移酶活性。 12. —種將產生賜諾殺的一品系轉變為產生賜諾特前驅物的一品系之方法，其包括使一種基因失能及同時維持斯賓諾辛（spinosyn)J與L的生產作用。 13. 如申請專利範圍第12項之方法，其中π«尤基因的失能作用係選自於由一種框内刪除作用、一種點突變作用、一種刪除作用及一種插入作用所組成之群組。 14 ·如申請專利範圍第12項之方法，其中基因的失能作用係藉由一核糖體結合位點之操作造成。 15.如申請專利範圍第14項之方法，其中該核糖體結合位點係一種W«尺夏因-達爾加諾（Shine-Dalgarno)序列。 16 ·如申請專利範圍第12項之方法，其中π«尺基因的失能作用係藉由Μ«尺基因的一啟動子之操作造成。 17.如申請專利範圍第16項之方法，該啟動子係以用於的一啟動子共轉錄。 ⑧ 2 201201700 18. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該框内刪除作用係選自於由一種5’端的框内刪除作用、一種3’端的框内刪除作用及一種«尺編碼區域的框内刪除作用所組成之群組。 19. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該刪除作用係中斷尺基因的正常閱讀框之單一或多個核苷酸鹼基刪除作用。 20. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該點突變作用係造成在«尺基因的活性位點或受質結合位點之一胺基酸取代作用。