JP4765032B2 - 新規スピノシンを産生するポリケチド合成酵素 - Google Patents

Description

本発明は、新規ハイブリッドポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）、こうしたＰＫＳをコードするＤＮＡ、ハイブリッドポリケチド合成酵素ＤＮＡを組み込むベクター、ハイブリッドポリケチド合成酵素ＤＮＡで形質転換された限定されるものでないが土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）株を挙げることができる宿主生物体、スピノシン産生株により作成される産物を変えるためのハイブリッドポリケチド合成酵素ＤＮＡの使用方法、およびこれらの操作により生成される新規の生物学的に活性の化合物を提供する。

特許文献１に開示されるとおり、醗酵産物Ａ８３５４３は土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）により産生される関連化合物の１ファミリーである。以前に単離されている天然のスピノシン化合物のファミリーが、多様な昆虫防除アッセイにおけるそれらの活性と一緒に特許文献２および特許文献３に記述されている。多数の半合成スピノシン類似物もまた特許文献４に記述されており、ここでスピノシン分子の化学的に接近可能な領域が多様な方法で成功裏に置換された。

このファミリーの既知のメンバーは因子もしくは成分と称されており、そしてそれぞれが識別文字呼称を与えられている。これらの化合物は下でスピノシンＡ、Ｂなどと称する。スピノシン化合物は、クモ形類動物、線虫類および昆虫類、とりわけ鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）および双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）種の防除に有用であり、また、それらは極めて環境に優しく、そして魅力的な毒物学的特徴を有する。商業的製品スピノサッド（Ｓｐｉｎｏｓａｄ）はスピノシンＡおよびＤの混合物である（非特許文献１）。

表１および２は数種の既知のスピノシン化合物の構造を同定する：

天然で産生されるスピノシン化合物は１２員の大環状ラクトンに縮合された５，６，５−三環系、中性糖（ラムノース）およびアミノ糖（ホロサミン）よりなる（非特許文献２を参照されたい）。アミノ糖が存在しない場合、該化合物はＡ、Ｄなどのプソイドアグリコンと称され、また、中性糖が存在しない場合には、該化合物はＡ、Ｄなどの逆プソイドアグリコンと称される。より好ましい一命名法は、プソイドアグリコンをスピノシンＡ １７−Ｐｓａ、スピノシンＤ １７−Ｐｓａなど、また、逆プソイドアグリコンをスピノシンＡ ９−Ｐｓａ、スピノシンＤ ９−Ｐｓａなどと称することである。

天然で産生されるスピノシン化合物は、培養物ＮＲＲＬ １８３９５、１８５３７、１８５３８、１８５３９、１８７１９、１８７２０、１８７４３および１８８２３からの醗酵を介して製造されうる。これらの培養物は寄託されかつ米国農務省農業研究部門中西部地域北部地方研究センター（ｔｈｅ Ｍｉｄｗｅｓｔ Ａｒｅａ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）、１８１５ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、ＩＬ ６１６０４のストック培養物コレクションの一部をなしている。

特許文献１および対応する特許文献５はスピノシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＪを開示する。これらの化合物は、ＮＲＲＬ １８３９５、ＮＲＬ １８５３７、ＮＲＲＬ １８５３８およびＮＲＲＬ １８５３９から選択される新規微生物、土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）のある株を培養することにより産生されるとして開示されている。

特許文献６はスピノシンＬ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴを開示する。その中にはまた２種のスピノシンＪ産生株すなわちＮＲＲＬ １８７１９およびＮＲＲＬ １８７２０、ならびにスピノシンＱ、Ｒ、ＳおよびＴを産生する株すなわちＮＲＲＬ １８８２３もまた開示される。

特許文献７および特許文献８はスピノシンＫ、Ｏ、Ｐ、Ｕ、Ｖ、ＷおよびＹならびにそれらの誘導体を開示する。スピノシンＫ産生株ＮＲＲＬ １８７４３もまた開示される。

特許文献３は、サッカロポリスポラ属（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）種ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ ３０１４１）を培養することにより産生されるスピノシン類似物を開示する。

特許文献９および特許文献１０は、土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）からのスピノシン生合成遺伝子を開示する。

スピノシン生合成に関与する遺伝子の性質は、前駆体取り込みの以前の研究（非特許文献３）と一緒に、ポリケチド（環化されかつ架橋される）を生成させる２−炭素および３−炭素のカルボン酸の段階的縮合によりスピノシンが産生されることを示す。これらの反応の四環性アグリコン産物はラムノシル残基の付加によりプソイドアグリコンに転化され、そして、ジ−Ｎ−メチル化糖ホロサミンの付加により合成が完了する。いくつかの局面において、この過程は、（抗生物質エリスロマイシン、駆虫薬アベルメクチンおよび免疫抑制剤ラパマイシンのような）他のマクロライドが産生される生合成経路に類似である。とりわけ、ポリケチド核は、Ｉ型ポリケチド合成酵素（ｓｐｎ ＰＫＳ）である非常に大きな多機能タンパク質により集成される。このポリペプチド複合体は１個の負荷モジュール（ｌｏａｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ）および１０個の伸長モジュールを含んでなり、各モジュールは、成長するポリケチド鎖への特定のアシル−ＣｏＡ前駆体の付加およびβ−ケトカルボニル基の還元の程度の双方の原因である。各モジュールは該ポリペプチドの特定のドメインにより実施される数種の生化学反応を実施する。全部の伸長モジュールは、前駆体からのアシル基をアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）ドメインに供与するアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメイン、および脱カルボキシル的縮合により新規アシル−ＡＣＰに既存のポリケチド鎖を付加するβ−ケト合成酵素（ＫＳ）ドメインを含有する。付加的なドメインが数種の伸長モジュール中に存在する。すなわち、β−ケト還元酵素（ＫＲ）ドメインはβ−ケト基をヒドロキシルに還元し、脱水素酵素（ＤＨ）ドメインはヒドロキシルを除去して二重結合を残し、また、エノイル還元酵素（ＥＲ）ドメインは二重結合を還元して飽和炭素を残す。ｓｐｎ ＰＫＳの負荷モジュールは、それがバリアントＫＳドメイン（ＫＳｑ）ならびにＡＴおよびＡＣＰドメインを含有するために伸長モジュールと異なる。数種の他のＩ型ＰＫＳ負荷モジュール（しかし全部ででない）中でもまた見出されるＫＳｑドメインは、ＡＣＰに結合したアシル鎖の脱カルボキシル化により、不可欠の開始体（ｓｔａｒｔｅｒ）ユニットを提供すると考えられている（非特許文献４）。末端の伸長モジュールは、ＰＫＳからポリケチド鎖を遊離させるチオエステラーゼ／シクラーゼ（ＴＥ）ドメインを含有する。

スピノシンＰＫＳのＤＮＡ領域は、他のマクロライド産生細菌中のＰＫＳ ＯＲＦに類似の数個のＡＣＰドメインの末端にインフレームの終止コドンをもつ５個のＯＲＦよりなる。該５種のスピノシンＰＫＳ遺伝子は、エリスロマイシンＰＫＳ遺伝子ＡＩとＡＩＩとの間に見出される挿入要素のようないかなる介在する非ＰＫＳ機能も伴わずに頭−尾結合で配置される（非特許文献５）。それらはｓｐｎＡ、ｓｐｎＢ、ｓｐｎＣ、ｓｐｎＤおよびｓｐｎＥと称される。該５種のスピノシンＰＫＳ遺伝子のそれぞれのヌクレオチド配列および対応するポリペプチドは特許文献１０および非特許文献６に同定されている。ＰＫＳ遺伝子の予測される翻訳産物、ならびにドメインおよびモジュールの境界もまたこれらの出典にて同定されている。

それが合成された後に、スピノシンポリケチド前駆体は縮合して大環状ラクトン（下でポリケチド核と称される）を形成する。殺虫活性スピノシンの産生はポリケチド核の付加的なプロセシングを必要とする。最初に、Ｃ３とＣ１４、Ｃ４とＣ１２およびＣ７とＣ１１との間で炭素−炭素架橋が形成されてアグリコン中間体を生成させなければならない。これらの異常な反応についての可能な機構が示唆されている（非特許文献６）が、しかしそれらが起こるために必要とされるポリケチド基質の構造的特徴は知られていない。第二に、トリ−Ｏ−メチルラムノースがＣ９に取り込まれてプソイドアグリコンを生成させなけばならない。ラムノースがアグリコンへのその付加前もしくは後に通常メチル化されるかどうかは知られていないが、しかし土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）は、ラムノース部分がアグリコンに複合化した後にメチル基を付加することが可能である（非特許文献３）。メチル化は特定の順序（２’、その後３’、その後４’）で起こらなければならないか、もしくはそれらの全部が起こらなくてもよいことができ、メチルトランスフェラーゼが非常に特異的な基質要件を有することを示す。第三のプロセシング段階すなわちＣ１７でのホロサミンの付加は最も活性のスピノシンを生じるのに必要とされる。この段階に関与する酵素もまた厳格な基質要件を有する。すなわち、ホロサミニルトランスフェラーゼは基質としてアグリコンを使用しないことができ、また、Ｎ−メチルトランスフェラーゼはホロサミンがプソイドアグリコンに結合された後にそれに作用しないことができる。後の生合成酵素のこの基質特異性は、多様な化学構造をもつ前駆体からの新規の生物学的に活性のスピノシンの産生に対する障壁となりうる。

ある場合には、ポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）遺伝子は新規ポリケチドを提供するという目的を伴って以前に操作されている。エリスロマイシン産生（ｅｒｙ）ＰＫＳのモジュール５中のＫＲドメインの一部をコードするＤＮＡのインフレーム欠失は、エリスロマイシン類似物すなわち５，６−ジデオキシ−３α−ミカロシル−５−オキソエリスロノリドＢおよび５，６−ジデオキシ−５−オキソエリスロノリドＢの形成につながることが示されている（非特許文献５）。同様に、対応するＰＫＳをコードするＤＮＡの遺伝子工作およびサッカロポリスポラ エリトレア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）へのその導入によるｅｒｙ ＰＫＳのモジュール４のＥＲドメイン中の活性部位残基の変更は、６，７−アンヒドロエリスロマイシンＣの産生に至った（非特許文献５）。特許文献１１は、変えられたポリケチドを産生することが可能であるｅｒｙ ＰＫＳ遺伝子の付加的な型の遺伝子操作を記述している。

特許文献１２は、多様な開始体ユニットを取り込んで新規エリスロマイシン類似物を作成するハイブリッドのＩ型ＰＫＳ遺伝子を製造するためのアベルメクチン（ａｖｅ）ＰＫＳからの負荷モジュールでのｅｒｙ ＰＫＳの負荷モジュールの置換を開示する。

しかしながら、ＰＫＳ遺伝子の全部の操作が標的を定められた新規類似物を生じるわけでないこともまた見出されている。Ｄｏｎａｄｉｏら（非特許文献５）がｅｒｙ ＰＫＳのＥＲドメインを不活性化した場合、生じるアンヒドロ誘導体は完全にプロセシングされ得なかった。それはもはやミカロース−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの基質でなかったためである。ポリケチド開始体ユニットの変更は、アミコラトプシス メディテラネイ（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）中でのリファマイシン類似物の完全な伸長および同化（ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）を妨げた（非特許文献７）。殺虫活性のスピノシンを生成させるのに必要とされる包括的な基質特異的プロセシングを考えれば、スピノシンポリケチドの構造を変える遺伝子改変が、有用な生物学的活性をもつ完全にプロセシングされた分子の合成を可能にすることができることは明白なことではない。しかしながら、こうした類似物を作成することができかつそれらが異なる範囲の殺虫活性を有する場合は、既知のスピノシンは全害虫を防除するわけではないため、それらは高度に望ましいであろう。
米国特許第５，３６２，６３４号明細書 米国特許第６，２７４，３５０ Ｂ１号明細書 第ＷＯ ０１／１９８４０号明細書 米国特許第６，００１，９８１号明細書 欧州特許出願第３７５３１６ Ａ１号明細書 第ＷＯ ９３／０９１２６号明細書 第ＷＯ ９４／２０５１８号明細書 米国特許第５，６７０，４８６号明細書 第ＷＯ ９９／４６３８７号明細書 米国特許第６，１４３，５２６号明細書 第ＷＯ ９３／１３６６３号明細書 第ＷＯ ９８／０１５４６号明細書 Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｍａｎｕａｌ、第１１版、ｐ．１２７２ Ｋｉｒｓｔら（１９９１）"Ａ８３５４３Ａ−Ｄ，ｕｎｉｑｕｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｃ ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ．"Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ ３２：４８３９−４８４２ Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎら、１９９１、"Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｃｒｏｌｉｄｅ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ａ ８３５４３ ｂｙ Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ．"Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、ワシントンＤＣ。 Ｂｉｓａｎｇら、１９９９"Ａ ｃｈａｉｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｃｏｍｍｏｎ ｔｏ ｂｏｔｈ ｍｏｄｕｌａｒ ａｎｄ ａｒｏｍａｔｉｃ ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅｓ．"Ｎａｔｕｒｅ ４０１：５０２−５０５ Ｄｏｎａｄｉｏら、１９９３"Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．"Ｉｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：ｂａｓｉｃ ａｎｄ ａｐｐｌｉｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．（Ｂａｌｔｚ，ＲＨ．、Ｈｅｇｅｍａｎ，ＧＤ．とＳｋａｔｒｕｄ，ＰＬ．編）、ｐｐ．２５７−２６５。アメリカ微生物学会（Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）、ワシントンＤＣ Ｗａｌｄｒｏｎら、２００１"Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｉｎｏｓａｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ．"Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：４８７−４９９ Ｈｕｎｚｉｋｅｒら、１９９８"Ｐｒｉｍｅｒ ｕｎｉｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｎ ｒｉｆａｍｙｃｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐｒｉｎｃｉｐａｌｌｙ ｒｅｓｉｄｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｔｅｒ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ．"Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２：１０９２−１０９３

［発明の要約］
その局面の一において、本発明は生物学的に活性のスピノシンを産生させるように土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）中で機能することが可能であるハイブリッドのスピノシンポリケチド合成酵素を提供し、前記ハイブリッドポリケチド合成酵素は、複数の土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）の伸長体（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）モジュールと作動可能に会合した異種負荷モジュールを含んでなる。好ましい態様において、スピノシンの負荷ドメインはエリスロマイシンＰＫＳもしくはアベルメクチンＰＫＳの負荷ドメインで置換される。ａｖｅおよびｅｒｙ負荷ドメインは、それらが多様な開始体ユニットを受容するためにとりわけ興味深い。異種負荷モジュールがラパマイシン（シクロヘキセンカルボン酸）もしくはミクサチアゾール（３−メチル絡酸）の負荷モジュールのような普通ではない開始体ユニットを取り込むハイブリッドＰＫＳ遺伝子もまた有用である。必要とされる前駆体、例えばシクロヘキセンカルボン酸もしくは３−メチル絡酸は培地中に提供しうるか、もしくはそれらが内因性に合成されるようにそれらの生合成酵素をコードする遺伝子を生物体に工作してもよい。

その局面の別のものにおいて、本発明は、生物学的に活性の６−エチルスピノシン化合物、１６−エチルスピノシン化合物、１８−エチルスピノシン化合物もしくは２０−エチルスピノシン化合物を産生するように土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）中で機能することが可能であるハイブリッドスピノシンポリケチド合成酵素を提供し、前記ハイブリッドポリケチド合成酵素は、スピノシンＰＫＳ中のそれぞれモジュール８、３、２もしくは１のＡＴドメインのＤＮＡがエチルマロニル−ＣｏＡを通常に取り込むＡＴドメインのＤＮＡで置換されるように改変されているスピノシンの生合成ＤＮＡにより産生される産物である。好ましい態様において、関連するスピノシンＡＴドメインをコードするＤＮＡは、タイロシンＰＫＳのモジュール５もしくはモネンシンＰＫＳのモジュール５のＡＴドメインをコードするＤＮＡで置換されている。好ましい態様において、ストレプトミセス シナモネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）のクロトニル−ＣｏＡ還元酵素が共発現される。

その局面の別のものにおいて、本発明は、生物学的に活性の１８−メチルスピノシン化合物もしくは２０−メチルスピノシン化合物を産生するように土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）中で機能することが可能であるハイブリッドスピノシンポリケチド合成酵素を提供し、前記ハイブリッドポリケチド合成酵素は、スピノシンＰＫＳ中のそれぞれモジュール２もしくは１のＡＴドメインのＤＮＡがメチルマロニル−ＣｏＡを通常に取り込むＡＴドメインのＤＮＡで置換されるように改変されているスピノシンの生合成ＤＮＡにより産生される産物である。

その局面の別のものにおいて、本発明は、生物学的に活性の１６−デスメチルスピノシン化合物を産生するように土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）中で機能することが可能であるハイブリッドスピノシンポリケチド合成酵素を提供し、前記ハイブリッドポリケチド合成酵素は、スピノシンＰＫＳ中のモジュール３のＡＴドメインのＤＮＡがマロニル−ＣｏＡを通常に取り込むＡＴドメインのＤＮＡで置換されるように改変されているスピノシンの生合成ＤＮＡにより産生される産物である。好ましい一態様において、モジュール３のＡＴドメインはラパマイシンＰＫＳのモジュール２のＡＴドメインをコードするＤＮＡで置換される。

その局面の別のものにおいて、本発明は、スピノシン生合成経路とともにクロトニル−ＣｏＡ還元酵素を共発現するトランスジェニック宿主生物体を培養することを含んでなる、６−エチルスピノシン化合物、２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシン化合物もしくは６−エチル−２１−デスエチル−２１−プロピルスピノシン化合物の製造方法を提供する。好ましい一態様において、宿主生物体は、Ｓ．シナモネンシス（Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）のクロトニル−ＣｏＡ還元酵素をコードするＤＮＡで形質転換される。

その局面の別のものにおいて、本発明は、Ｓ．シナモネンシス（Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）のクロトニル−ＣｏＡ還元酵素をコードするＤＮＡで形質転換されている土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）株を提供する。

その局面の別のものにおいて、本発明は、上述されたところの本発明のハイブリッドスピノシンポリケチド合成酵素をコードするＤＮＡを提供する。

その局面の別のものにおいて、本発明は上述されたところのＤＮＡを含んでなるベクターを提供する。

その局面の別のものにおいて、本発明は上述されたところのＤＮＡを含んでなる宿主生物体を提供する。

その局面のなお別のものにおいて、本発明は、式（Ｉ）

式中、
Ｒ１は水素、メチルもしくはエチルであり；
Ｒ２は水素、メチルもしくはエチルであり；
Ｒ３は、水素、

であり；
Ｒ４はメチルもしくはエチルであり、そのいずれもハロ、ヒドロキシ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキルチオもしくはシアノから選択される１個もしくはそれ以上の基で置換されてよいか；
Ｒ４は、α−分枝状Ｃ_３−Ｃ_５アルキル基、Ｃ_３−Ｃ_８シクロアルキル基もしくはＣ_３−Ｃ_８シクロアルケニル基であり、そのいずれもハロ、ヒドロキシ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキルチオもしくはシアノから選択される１個もしくはそれ以上の基で置換されてよいか；あるいは、
Ｒ４は、飽和または完全にもしくは部分的に不飽和でありかつハロ、ヒドロキシ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキルチオもしくはシアノから選択される１個もしくはそれ以上の基で置換されてよい、ＯもしくはＳを含有する３〜６員の複素環基であり；
Ｒ５は水素もしくはメチルであり；
Ｒ６は水素もしくはメチルであり；
Ｒ７は水素もしくはメチルであり；
Ｒ８は水素、メチルもしくはエチルであり；
Ｒ９は水素、メチルもしくはエチルである、
の化合物；
あるいは、式Ｉの化合物の５，６−ジヒドロ誘導体
（但し：
ａ）Ｒ４がハロ、ヒドロキシ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキルチオもしくはシアノから選択される１個もしくはそれ以上の基で置換されるメチルもしくはエチルであるか；あるいは
ｂ）Ｒ４がα−分枝状Ｃ_３−Ｃ_５アルキル基、Ｃ_３−Ｃ_８シクロアルキル基もしくはＣ_３−Ｃ_８シクロアルケニル基であり、そのいずれもハロ、ヒドロキシ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキルチオもしくはシアノから選択される１個もしくはそれ以上の基で置換されてよいか；あるいは
ｃ）Ｒ４が、飽和または完全にもしくは部分的に不飽和でありかつハロ、ヒドロキシ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキルチオもしくはシアノから選択される１個もしくはそれ以上の基で置換されてよい、ＯもしくはＳを含有する３〜６員の複素環基であるか；あるいは、
ｄ）Ｒ１もしくはＲ２がエチルであるか；あるいは
ｅ）Ｒ８がメチルもしくはエチルであるか；あるいは
ｆ）Ｒ９がメチルもしくはエチルである
を条件とする）
を提供する。

本発明により提供される具体的に説明する化合物を以下の表３に同定する。下で引用される化合物番号は表３中で同定される化合物を指す。

式Ｉの化合物の５，６−ジヒドロ誘導体（例えば表３中の化合物８）は、式ＩＩ：

式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は式Ｉについて定義されるとおりである
の化合物である。

その局面の別のものにおいて、本発明は、
ＮＲＲＬ ３０５３９、
ＮＲＲＬ ３０５４０、
ＮＲＲＬ ３０５４１および
ＮＲＲＬ ３０５４２
から選択される土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）の生物学的に純粋な培養物を提供する。

その局面の別のものにおいて、本発明は、有効量の請求項１記載の化合物を有害生物に送達することを含んでなる有害生物の防除方法を提供する。

その局面の別のものにおいて、本発明は、適切な希釈剤もしくは担体と組合せの有効成分としての有効量の請求項１記載の化合物を含んでなる有害生物防除剤組成物を提供する。
［発明の詳細な説明］
培養物の記述
土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）ＮＲＲＬ １８５３７もしくは土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）ＮＲＲＬ １８５３８に由来しかつ本発明の化合物を産生する新規株を下の表で同定する。該培養物はブダペスト条約の規約に従い米国農務省農業研究部門中西部地域地方センター（ｔｈｅ Ｍｉｄｗｅｓｔ Ａｒｅａ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）、８１５ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、ＩＬ ６１６０４に寄託された。該株は２００１年１月１５日に寄託されかつ下の表４に詳述されるとおり寄託番号を割り当てられた。

培養物の特徴
土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）ＮＲＲＬ １８５３７もしくは土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）ＮＲＲＬ １８５３８に由来しかつ本発明の化合物を産生する新規株は以下の培養物の特徴を有した：
全培養物はＩＳＰ２およびベネットアガー上で良好に増殖し、また、使用した全培地で空中菌糸を生じた。空中芽胞塊は主として白色であった（老化とともに薄桃色を発色する）。基質菌糸体はクリーム色ないし淡黄褐色であり、特有の色素は明らかでなかった。溶解性の褐色色素が培地中に放出された。使用した培地のいずれでも有意差は観察されなかった。
スピノシン経路およびアクセサリー遺伝子の操作
スピノシン生合成経路の操作を助長するためにコスミドｐＲＨＢ９Ａ６およびｐＲＨＢ３Ｅ１１を得、そして米国特許第６，２７４，３５０ Ｂ１号明細書およびＷａｌｄｒｏｎら（２００１）に記述されている。

スピノシンの産生がどのように調節されているかは、スピノシン生合成遺伝子の配列からは直接明らかではない。遺伝子集団の調節に関連する潜在的複雑さを回避するために、多数の異種プロモーターを使用してポリケチド合成酵素部分の全部もしくは一部を駆動した（遺伝子ｓｐｎＡ、ｓｐｎＢ、ｓｐｎＣ、ｓｐｎＤおよびｓｐｎＥ）。以下のプロモーター、すなわち、その同族のアクチベーターａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４（第ＷＯ ９８／０１５４６号明細書、第ＷＯ ９８／０１５７１号明細書、Ｒｏｗｅら １９９８に記述されるところの）と一緒に使用されるＳ．コエリコロール（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のアクチノロジン生合成クラスターからのａｃｔＩプロモーター、および；プリスチナマイシンに対する耐性のプロモーターが、天然のプロオーターとしてスピノシンＰＫＳの産生において少なくとも効率的である（最終産物スピノシンＡ、スピノシンＤ、スピノシンＡ Ｃ１７−プソイドアグリコンおよびスピノシンＤ Ｃ１７−プソイドアグリコンの産生により判断される）ことが見出された。後者はＳ．エリトレア（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）からのポリケチド遺伝子の過剰発現を駆動することが以前に報告されている（Ｂｌａｎｃら １９９５；Ｓａｌａ−Ｂｅｙら １９９５）。それはストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種において生理学的ストレスにより誘導され得るプロモーターである。土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）における異種プロモーターの使用は上述されたものに制限されず、かつ、土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）中で機能することが期待されるとみられる他者を包含し得る。
異種負荷モジュールを使用するハイブリッドスピノシンＰＫＳ
その局面の一において、本発明は生物学的に活性のスピノシンにプロセシングされるポリケチドを生成させるよう土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）中で機能的であるハイブリッドＰＫＳを提供する。生じるポリケチドは天然のスピノシンと同一の長さまで伸長され、そして架橋およびグリコシル化によりプロセシングされて新規殺虫性スピノシンを生成した。好ましくは、ハイブリッドＰＫＳは、異なる開始体ユニットを有するスピノシンポリケチドに至る異種負荷モジュールを伴うｓｐｎ ＰＫＳからの伸長モジュールを含んでなる。異種負荷モジュールの後にｓｐｎ伸長体モジュールを含有するハイブリッドスピノシンＰＫＳ遺伝子は、Ｃ２１に多様な側鎖をもつ新規スピノシンを提供し得る。この側鎖の性質は、該負荷モジュールがポリケチド合成の開始のために選択する開始体ユニットにより決定される。側鎖の変化は生じるスピノシンの物理特性もしくは生物学的活性を変えるかもしれない。負荷モジュールが非天然の酸を包含する多くの異なるカルボン酸を受容するハイブリッドＰＫＳ遺伝子を提供することがとりわけ有用である。こうした遺伝子は多様な開始体ユニットの取り込みにより多くの異なるスピノシンを生成するのに使用し得る。例えば、ｓｐｎ ＰＫＳの負荷モジュールは広範な開始体ユニットを受容することが知られているａｖｅ ＰＫＳの負荷モジュールにより置換し得る（Ｄｕｔｔｏｎら、１９９１）。ｅｒｙ ＰＫＳの負荷モジュールもまた代替の開始体ユニットを受容することが知られている（Ｐａｃｅｙら、１９９８）。従って、こうしたハイブリッドスピノシンＰＫＳ遺伝子を発現する生物体は、生物体に供給されるカルボン酸によりＣ２１の側鎖の性質が決定される新規スピノシンを産生し得る。側鎖は分枝もしくは環を伴う多様な長さのものであり得、かつ／もしくはヘテロ原子を含有し得る。

より好ましくは、ハイブリッドＰＫＳは、ハイブリッド遺伝子の集成を使用して多くの異なるスピノシンを産生し得るように多くの異なるカルボン酸を受容する負荷モジュールを包含する。とりわけ有用な例は、エリスロマイシン（ｅｒｙ）ＰＫＳからの負荷モジュールもしくはアベルメクチン（ａｖｅ）ＰＫＳからの負荷モジュールとともにｓｐｎ伸長モジュールを含有する。
ａ．ｅｒｙ負荷モジュールを使用するハイブリッドスピノシンＰＫＳ
エリスロマイシン生合成クラスターの負荷モジュール（ｅｒｙＡＴ０ＡＣＰ０）はエリスロマイシン分子の開始体へのプロピオニル−ＣｏＡの導入を支配する。生産培地に遊離酸を供給することにより代替の開始体がエリスロマイシン分子中に取り込まれ得ることが以前に示されている（Ｐａｃｅｙら １９９８）。

以下の実施例に示されるとおり、エリスロマイシンの負荷モジュールがスピノシンの負荷モジュールに取って代わったハイブリッドｓｐｎＡ遺伝子の生成は、開始体ユニット中に遊離酸を受容し得るスピノシンＰＫＳに至る。以下の具体的に説明する実施例において、エリスロマイシンの負荷モジュールは、保存された領域中のちょうどＫＳドメイン内のスピノシンＫＳ１の始めまでスプライスされた。新規ドメインもしくはモジュールの結合は、好ましくはドメイン内もしくはそれらの縁近くの保存されたＤＮＡ配列でなされるが；しかしながら、活性のポリケチド合成酵素は、あるいは、ドメイン間領域中のスプライス部位を工作することにより生成し得る（第ＷＯ ９８／０１５４６号明細書）。

ｅｒｙ ｌｏａｄフラグメントを、天然のｓｐｎ ＰＫＳとの相同的組換えを可能にするようにｓｐｎＡの一領域とインフレームでかつその上流にクローン化した。ｅｒｙ ｌｏａｄの上流はａｃｔＩプロモーター（Ｐ_ａｃｔＩ）もしくはプリスチナマイシンに対する耐性のプロモーター（Ｐ_ｐｔｒ）のいずれかであり、それぞれプラスミドｐＬＳＢ６１およびｐＬＳＢ６２を生じさせた。これらのプラスミドはｐＫＣ１１３２に基づき、そして従ってアプラマイシン耐性である。それらはまた放線菌類へのＤＮＡの接合伝達のためのｏｒｉＴも運搬する（Ｂｉｅｒｍａｎら １９９２、Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａら １９９４）。これらの構築物を接合により土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）ＮＲＲＬ １８５３７に形質転換した。外接合体は、適切なプロモーター下にハイブリッドのｅｒｙ／ｓｐｎ ＰＫＳを含有することがＰＣＲ増幅により確認された。

土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）ＮＲＲＬ １８５３７：ｐＬＳＢ６２を土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）１３Ｅと称し、そしてスピノシン産生の分析に使用した。

以下の実施例に示されるとおり、生産培地中で培養した場合に、土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）１３Ｅはおよそ等量で主としてスピノシンＡおよびスピノシンＥを産生した。スピノシンの総収量は野性型スピノシンＡのレベルのおよそ１０〜２５％であると推定され、これはおよそ１０倍のスピノシンＥの収量の増大を表した。この変えられた産物比は、ｓｐｎ負荷モジュールに関してのｅｒｙ負荷モジュールのよりゆるい特異性の反映、もしくはＳ．エリトレア（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）と比較しての土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）の異なる基質供給の反映、または双方の組合せでありうる。ｅｒｙ ｌｏａｄによる酢酸の取り込みは、Ｓ．エリトレア（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）で、エリスロマイシン経路がアップレギュレートされる場合に観察されている（Ｒｏｗｅら １９９８）。株１３Ｅにおける野性型のレベルを上回る、スピノシンＥの収量の増大は、これがスピノシンＥの産生のための好ましい株であるとみられることを意味している。

多数のカルボン酸を土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）１３Ｅに供給し、変えられた開始体ユニットをもつ新規スピノシン類似物の産生に至った。同定された新規スピノシンは、２１−デスエチル−２１−シクロプロピルスピノシンＡおよびＤ（シクロプロパンカルボン酸の取り込みによる）、２１−デスエチル−２１−シクロブチルスピノシンＡおよびＤ（シクロブタンカルボン酸の取り込みによる）ならびに２１−デスエチル−２１−メチルチオメチルスピノシンＡおよびＤ（メチルチオ酢酸から）などであった。該新規類似物は理にかなったクロマトグラフィーの保持時間、特徴的なＵＶ発色団およびＭＳフラグメンテーションパターンを示し、そして予測された構造は正確な質量測定により裏付けられた。単離された２１−シクロプロピルおよび２１−シクロブチル化合物の構造の割り当ては完全なＮＭＲの特徴付けにより確認された。単離された化合物は昆虫防除アッセイで活性であった。

土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）１３Ｅ株の使用はこれらの化合物の製造に制限されない。多数の他のスピノシン類似物が、新規エリスロマイシンを産生するのに使用されるもののような他の酸を供給することにより同定され得ることが期待される（Ｐａｃｅｙら １９９８）。

実施例１ ｐＣＪＲ８１の構築
図１を参照されたい。プラスミドｐＣＪＲ８１はプリスチナマイシンに対する耐性のプロモーター下でのポリケチド遺伝子の発現のためのベクターである。それは以下のとおり構築した：
２種のオーバーラップオリゴを、それらがプライマーおよび鋳型の双方として作用するＰＣＲ反応を実施するために設計した。それらはＡＴＧ開始コドンを組み込むＮｄｅＩ制限部位を導入するよう設計し、その結果、遺伝子をリボソーム結合部位からの至適の間隔を伴いクローン化し得る。さらなるクローン化を助長するためＳｐｅＩ制限部位を組み込んだ。オリゴはＰＲＩＳ１（配列番号１）およびＰＲＩＳ２（配列番号２）である。

プロモーターフラグメントを得るための増幅は、製造元の条件を使用してＰｗｏ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した。１１２ｂｐのフラグメントをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、そしてＳｍａＩで消化しかつ脱リン酸化した商業的に入手可能なｐＵＣ１８にクローン化した。挿入物を含有するプラスミドを配列決定した。正しい配列を含有する１プラスミドをｐＲＩＳ４と称した。

ｐＲＩＳ４からの９４ｂｐの挿入物をＳｐｅＩ／ＮｄｅＩフラグメント（配列番号３）として切り出し、そして、ＳｐｅＩおよびＮｄｅＩで以前に消化していたｐＣＪＲ２４（第ＷＯ ９８／０１５４６号明細書、第ＷＯ ９８／０１５７１号明細書、Ｒｏｗｅら １９９８）にクローン化した。１個の正しいプラスミドをｐＣＪＲ８１と称した。
実施例２ 土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）からの発現のためのプラスミドの構築
図２を参照されたい。プラスミドｐＬＳＢ２およびｐＬＳＢ３を土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）中でのポリケチド遺伝子もしくはアクセサリー遺伝子の発現のため構築した。プラスミドｐＬＳＢ２はａｃｔＩプロモーター（Ｐ_ａｃｔＩ）およびその同族のアクチベーターａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４を含有する。プラスミドｐＬＳＢ３はプリスチナマイシンに対する耐性のプロモーター（Ｐ_ｐｔｒ）を含有する。これらのプラスミドは以下のとおり構築した：
プラスミドｐＫＣ１１３２（Ｂｉｅｒｍａｎら １９９２）は、伝達起点（ｏｒｉＴ）、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および放線菌類双方での選択のためのアプラマイシン耐性マーカーを含有する。それは従って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのＤＮＡ操作に使用可能でありかつ最終のプラスミドが接合により土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）に導入されることを可能にし得る。ｐＫＣ１１３２のポリリンカーを、適切なＥｃｏＲＶ／ＳｐｅＩ／ＮｄｅＩ／ＸｂａＩ制限部位を提供するために２種のオリゴＣＲ３１１（配列番号４）およびＣＲ３１２（配列番号５）のリンカーにより置換した。

プラスミドｐＫＣ１１３２をＰｖｕＩＩで消化しそして末端をエビアルカリホスファターゼで脱リン酸化した。オリゴＣＲ３１１およびＣＲ３１２をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、アニーリングしかつｐＫＣ１１３２＿ＰｖｕＩＩにクローン化してｐＬＳＢ１を生成した。アクチノロジン経路特異的アクチベーターａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４およびａｃｔＩプロモーターを含有するＳｐｅＩ／ＮｄｅＩフラグメントをｐＣＪＲ２４（第ＷＯ ９８／０１５４６号明細書、第ＷＯ ９８／０１５７１号明細書、Ｒｏｗｅら １９９８）から単離し、また、プリスチナマイシンに対する耐性のプロモーターを含有するＳｐｅＩ／ＮｄｅＩフラグメントをｐＣＪＲ８１（上述された、実施例１）から単離した。これらのフラグメントのそれぞれを、ＳｐｅＩおよびＮｄｅＩで消化したｐＬＳＢ１に独立にクローン化して、ｐＬＳＢ２（ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４およびＰ_ａｃｔＩを含有する）ならびにｐＬＳＢ３（Ｐ_ｐｔｒを含有する）を生成した。
実施例３ スピノシンポリケチド合成酵素にエリスロマイシンポリケチド合成酵素の負荷モジュールを組み込むためのベクターの構築
図３を参照されたい。スピノシンポリケチド合成酵素にエリスロマイシンポリケチド合成酵素の負荷モジュールを組み込むためのベクターは、エリスロマイシン負荷モジュール（ＡＴ０ＡＣＰ０）、次いで組込みのための相同性を提供するスピノシンＰＫＳの第一モジュールの一領域を含有する。該ベクターをｐＬＳＢ６２と称し、そして以下のとおり構築した。

エリスロマイシン負荷モジュールは、鋳型としてｐＣＪＲ２６（Ｒｏｗｅら １９９８）ならびにオリゴＳＰ２８（配列番号６）およびＳＰ２９（配列番号７）を使用するＰＣＲにより増幅した。ＳＰ２８はｅｒｙ配列の開始コドンにＮｄｅＩを組み込み、また、ＳＰ２９はＫＳ１ドメインの始めにＮｈｅＩ部位を組み込む。

ＰＣＲフラグメントをリン酸化し、ゲル精製し、そして以前にＳｍａＩで消化しかつ脱リン酸化していたｐＵＣ１８にクローン化した。クローンを挿入物の存在についてスクリーニングしかつ配列決定した。正しい配列を含有する１クローンをｐＬＳＢ４４と称した。それはポリリンカーのＥｃｏＲＩ部位近くにＮｈｅＩ部位をもつ向きの挿入物を含有した。使用したエリスロマイシン負荷モジュールフラグメントのＮｄｅＩ部位からＮｈｅＩ部位までの配列を配列番号８に示す。

プラスミドｐＬＳＢ８（実施例１１に記述される）はｓｐｎＫＳ１にＮｈｅＩ部位で開始するｓｐｎＡの１フラグメントを含有する。エリスロマイシン負荷モジュールを含有するフラグメントをｐＬＳＢ４４からＮｄｅＩ／ＮｈｅＩフラグメントとして切り出し、そしてＮｄｅＩおよびＮｈｅＩで以前に消化したｐＬＳＢ８にクローン化してｐＬＳＢ５６を生じた。ｐＬＳＢ５６に含有されるフラグメントは、組込みが起こるのに十分であるｓｐｎＡに相同な領域を伴い、スピノシンＫＳ１までインフレームでスプライスされるエリスロマイシン負荷モジュールを含有する。

この領域をＮｄｅＩ／ＸｂａＩフラグメントとして取り出し、そしてｐＬＳＢ３にクローン化してｐＬＳＢ６２を生じた。これは、接合により土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）に伝達され得かつアプラマイシン耐性マーカーを使用して選択し得るベクター中でＰ_ｐｔｒ下に新規ｅｒｙ／ｓｐｎハイブリッドフラグメントを配置する。
実施例４ スピノシンＰＫＳのＫＳ１に融合されたエリスロマイシン負荷モジュールを含んでなるハイブリッドポリケチド合成酵素をもつ土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）株の生成
図４を参照されたい。土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）ＮＲＲＬ １８５３７を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１（Ｓｉｍｏｎら、１９８３）からの接合（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａら １９９４）によりｐＬＳＢ６２で形質転換した。形質転換体をアプラマイシン耐性について選択しかつＰＣＲによりスクリーニングした。単一の形質転換体を土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）１３Ｅ株と称した。
実施例５ 土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）醗酵の化学分析
以下のＨＰＬＣ法は、天然のスピノシンおよび新規の非天然の工作されたスピノシンの製造のための醗酵を分析するのに有用である。

２ｍＬエッペンドルフチューブ中で、醗酵ブロスのアリコート（１ｍＬ）を２０％アンモニア溶液（約２０μｌ）の添加によりｐＨ約１０に調節した。酢酸エチル（１ｍＬ）をサンプルに添加し、そしてボルテックスを使用して６０秒間活発に混合した。混合物を微小遠心機中での遠心分離により分離し、そして上層を清浄な２ｍＬエッペンドルフチューブに取り出した。スピード−バック（Ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ）を使用する蒸発により酢酸エチルを除去した。残渣をメタノール（２５０μｌ）に溶解しかつ微小遠心機を使用して澄明にした。分析は以下のＨＰＬＣ系によった：
注入容量：５０μｌ
カラム固定相：１５０×４．６ｍｍカラム、塩基不活性化シリカゲル３μｍ（ハイパーシル（Ｈｙｐｅｒｓｉｌ）Ｃ_１８−ＢＤＳ）。
移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムおよび０．１５％ギ酸を含有する１０％アセトニトリル：９０％水。
移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムおよび０．１５％ギ酸を含有する９０％アセトニトリル：１０％水。
移動相勾配：Ｔ＝０分、１０％Ｂ；Ｔ＝１、１０％Ｂ；Ｔ＝２５、９５％Ｂ；Ｔ＝２９、９５％Ｂ；Ｔ＝２９．５、１０％Ｂ。
流速：１ｍＬ／分。
検出：２５４ｎｍでのＵＶ；ｍ／ｚ範囲１００〜１０００にわたるＭＳ。
実施例６ 土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）１３Ｅの醗酵による代謝物の産生
土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）１３Ｅを凍結栄養増殖ストック（ｆｒｏｚｅｎ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｓｔｏｃｋ）（１：１ ＣＳＭ培養物：低温保存剤、ここで低温保存剤は水中１０％乳糖、２０％グリセロールｗ／ｖである）から培養した。一次前培養物（ｐｒｅ−ｃｕｌｔｕｒｅ）は、２インチ行程で２５０ｒｐｍで振とうされる鋼製ばね付き２５０ｍＬ三角フラスコ中５０ｍＬの培養物中でＣＳＭ培地（トリプシン分解ダイズブロス３０ｇ／ｌ、酵母抽出物３ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム２ｇ／ｌ、ブドウ糖５ｇ／ｌ、麦芽糖４ｇ／ｌ；ＨｏｓｔｅｄとＢａｌｔｚ、１９９６；米国特許第５，３６２，６３４号明細書）中で３０℃、７５％相対湿度で３日間増殖させた。これを使用して、栄養増殖培地（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｕｍ）（ブドウ糖１０ｇ／ｌ、Ｎ−Ｚ−アミンＡ ３０ｇ／ｌ、酵母抽出物３ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム２ｇ／ｌ；ＳｔｒｏｂｅｌとＮａｋａｔｓｕｋａｓａ １９９３；米国特許第５，３６２，６３４号明細書）中の二次前培養物に５％ｖ／ｖで接種し、これを同一条件下でさらなる２日間培養した。二次栄養増殖前培養物を使用して、生産培地（ブドウ糖６７ｇ／ｌ、プロフロー（Ｐｒｏｆｌｏ）綿実粉２５ｇ／ｌ、ペプシン消化乳栄養素２２ｇ／ｌ、コーンスティープリカー１２ｇ／ｌ、オレイン酸メチル４０ｇ／ｌ、炭酸カルシウム５ｇ／ｌ、水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７．０に；ＳｔｒｏｂｅｌとＮａｋａｔｓｕｋａｓａ １９９３）に５％ｖ／ｖで接種した。小スケールの生産培養物を前培養物と同一条件下でしかし７〜１０日間醗酵させた。初期の土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）１３Ｅ生産のため、小スケール培養物をばね付き２５０ｍＬ三角フラスコ中の３０ｍＬの生産培地中で７日間増殖させた。

産生された代謝物の同定のため、醗酵ブロスの１ｍＬアリコートを実施例５に記述されたところのＬＣ−ＭＳにより分析した。真正の標準品および形質転換されない土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）ＮＲＲＬ １８５３７株からの醗酵抽出物との比較により、土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）１３Ｅにより産生された主要化合物はスピノシンＡおよびＥ（およそ等量で産生される）ならびにスピノシンＤ（少量の産物として観察された）と同定された。土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）１３Ｅ株の力価は約１０〜１５ｍｇ／ｌの総スピノシンであった。土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）１３Ｅの産物の比はＮＲＲＬ １８５３７と異なり、スピノシンＥの相対的産生が有意に増大した。
実施例７ 土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）１３Ｅからの新規スピノシンの前駆体に指図される産生（化合物１〜６の製造）。

ｅｒｙ／ｓｐｎハイブリッドＰＫＳを使用して、生産培養物にカルボン酸を供給することにより新規スピノシン代謝物を生成させた。ｅｒｙ負荷モジュールは分子の開始体内に該カルボン酸を取り込んだ。

平行生産フラスコ（ばね付き２５０ｍＬ三角フラスコ中３０ｍＬ）に、上の実施例６に記述されたとおり接種した。２４時間後に、これらのそれぞれに、カルボン酸（水中で作成しかつ水酸化ナトリウムでｐＨを６．５に調節したストック溶液）を２〜６ｍＭの最終濃度で供給した。７日後に、醗酵ブロスの１ｍＬアリコートを実施例５に記述されたところのＬＣ−ＭＳにより分析した。新規のＣ２１修飾スピノシンを生成させるためのシクロブチルカルボン酸、シクロプロピルカルボン酸およびメチルチオ酢酸の取り込みがＵＶおよびＭＳクロマトグラム中の新規ピークの出現により示された（表５）。新規化合物のＭＳスペクトルは［Ｍ＋Ｈ］^＋種およびホロサミンフラグメント（１４２．３）のイオンを生じた。

実施例８ ２１−デスエチル−２１−シクロブチルスピノシンＡおよびＤ（化合物３および４）の産生および単離
土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）１３Ｅの凍結栄養増殖ストックを、ＣＳＭ中の一次栄養前培養物（ばね付き２５０ｍＬ三角フラスコ中でインキュベートされる５０ｍＬ）に接種した。栄養増殖培地（ばね付き２Ｌ三角フラスコ中でインキュベートされる２５０ｍＬ）中の二次前培養物を調製し、そして実施例６に記述されたとおりしかし１インチ行程で３００ｒｐｍでインキュベートした。

１２ないし１４Ｌの生産培地を、０．０１％ｖ／ｖのプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｌ−０１０１（ＢＡＳＦ）消泡剤の添加を伴い実施例６でのとおり調製した。生産培地に５％ｖ／ｖの二次栄養増殖前培養物を接種し、そして３０℃で７〜１０日間、２０Ｌの攪拌されるバイオリアクター中で醗酵させた。気流を０．７５ｖｖｍに設定し、過剰圧を０．５ｂａｒｇもしくはそれより下に設定し、また、溶解酸素圧を空気飽和の３０％もしくはより上に維持するために羽根車尖端速度を０．３９と１．５７ｍｓ^−１の間で制御した。必要とされる場合は追加のプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｌ０１０１（ＢＡＳＦ）を添加して起泡を制御した。シクロブチルカルボン酸を２５時間に５ｍＭの最終濃度までバイオリアクターに添加した。醗酵ブロスを７日後に収集し、そして遠心分離により澄明にして上清および細胞を提供した。等容量のメタノールと徹底的に混合することにより細胞（１Ｌ）を抽出し、その後３０分間静置させた。細胞−メタノールのスラリーを遠心分離しそして上清をデカンテーション分離した。該手順を反復した。醗酵上清（１２Ｌ）は５Ｎ ＮａＯＨの添加によりｐＨ約１０に調節し、そして０．７５容量の酢酸エチルとともに穏やかに８時間攪拌した。上層を吸引により除去しかつ抽出を反復した。酢酸エチルおよびメタノール画分を合わせ、そして溶媒を真空中で除去して黄褐色の油／水性混合物（１Ｌ）を生じた。これを酢酸エチル（２Ｌ）と混合しかつ５０ｍＭ酒石酸の溶液（３×１．５Ｌ）で抽出した。酒石酸抽出液を合わせ、５Ｎ ＮａＯＨでｐＨ約１０に調節し、そして酢酸エチル（３×１．５Ｌ）で抽出した。酢酸エチル抽出液を合わせかつ溶媒を真空中で除去して褐色の油状残渣（７．５ｇ）を残した。残渣を酢酸エチル（５００ｍＬ）に溶解しかつ５０ｍＭ酒石酸（３５０ｍＬ）で３回抽出した。酒石酸画分を合わせ、ｐＨ約１０に調節しかつ酢酸エチル（３×５００ｍＬ）で再抽出した。酢酸エチル画分を合わせかつ溶媒を真空中で除去して褐色油状残渣（０．５ｇ）を生じた。

該油状残渣をメタノール（１．５ｍＬ）に溶解し、そして、２１ｍＬ／分の流速で下述されるところの移動相勾配で溶出する塩基不活性化逆相シリカゲル（ハイパーシル（Ｈｙｐｅｒｓｉｌ）Ｃ_１８−ＢＤＳ、５μｍ；２１×２５０ｍｍ）で、２つの等部分でクロマトグラフィー分離した。
移動相勾配：Ｔ＝０分、１５％Ｂ；Ｔ＝５、３５％Ｂ；Ｔ＝３５、９０％Ｂ；Ｔ＝４５、９５％Ｂ。
移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムおよび０．１５％ギ酸を含有する１０％アセトニトリル／９０％水。
移動相Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウムおよび０．１５％ギ酸を含有する９０％アセトニトリル／１０％水。

画分は３０秒ごとに収集した。２１−デスエチル−２１−シクロブチルスピノシンＡを含有した最初の分画からの画分を合わせ、そして溶媒を真空中で除去した。残渣を、５ｍＬ／分の流速で下述されるところの勾配で溶出する逆相シリカゲル（プロディジー（Ｐｒｏｄｉｇｙ）Ｃ_１８、５μｍ；１０×２５０ｍｍ）でクロマトグラフィー分離した。
Ｔ＝０、５５％Ｂ；Ｔ＝５、７０％Ｂ；Ｔ＝３５、９５％Ｂ；Ｔ＝４５、９５％Ｂ。

画分は３０秒ごとに収集した。２１−デスエチル−２１−シクロブチルスピノシンＡを含有する画分を合わせ、アセトニトリルを真空中で除去し、そしてＣ_１８−ボンドエリュート（ＢｏｎｄＥｌｕｔｅ）カートリッジ（２００ｍｇ）を使用してサンプルを濃縮した。サンプルは重力下に適用し、水（１０ｍＬ）で洗浄しかつメタノール（２×１０ｍＬ）で溶出し、その後溶媒を真空中で除去した。２１−デスエチル−２１−シクロブチルスピノシンＤを含有した最初の粗分画からの画分を合わせ、そして溶媒を真空中で除去した。残渣は、５ｍＬ／分の流速で下述されるところの勾配で溶出する逆相シリカゲル（プロディジー（Ｐｒｏｄｉｇｙ）Ｃ_１８、５μｍ；１０×２５０ｍｍ）でクロマトグラフィー分離した。
Ｔ＝０分、２５％Ｂ；Ｔ＝５、５５％Ｂ；Ｔ＝３５、９５％Ｂ；Ｔ＝４５、９５％Ｂ。

画分は３０秒ごとに収集した。２１−デスエチル−２１−シクロブチルスピノシンＤを含有する画分を合わせ、アセトニトリルを真空中で除去し、そしてＣ_１８−ボンドエリュート（ＢｏｎｄＥｌｕｔｅ）カートリッジ（２００ｍｇ容量）を使用してサンプルを濃縮した。サンプルは重力下に適用し、水（１０ｍＬ）で洗浄しかつメタノール（２×１０ｍＬ）で溶出し、そして溶媒を真空中で除去した。

新規スピノシン類の化学構造は、核磁気共鳴分光法（ＮＲＭ）、質量分析（ＭＳ）、紫外分光法（ＵＶ）、結合型高速液体クロマトグラフィー−質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）を包含する分光学的方法により、また、既知化合物スピノシンＡ、Ｄ、ＥおよびＦのスペクトルデータとの比較により決定した。

２１−デスエチル−２１−シクロブチルスピノシンＡ（化合物３）は以下の特徴を有する：
単離された収量：３．１ｍｇ
分子量：７５７
分子式：Ｃ_４３Ｈ_６７ＮＯ_１０
ＵＶ（ＨＰＬＣ−ＭＳ分析の間のダイオードアレイ検出による）：２４５ｎｍ
電子スプレーＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］^＋のｍ／ｚ＝７５８．５；ｍ／ｚ＝１４２．２にホロサミンの糖フラグメントイオン。
正確なＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］^＋のｍ／ｚ＝７５８．４８３０（７５８．４８３８を必要とする）。

表６はＣＤＣｌ_３中の２１−デスエチル−２１−シクロブチルスピノシンＡの^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲの化学シフトデータを示す。

化学シフトは７．２６ｐｐｍのＣＨＣｌ_３のプロトンに関係づけられる。

２１−デスエチル−２１−シクロブチルスピノシンＤ（化合物４）は以下の特徴を有した：
単離された収量：約１ｍｇ
分子量：７７１
分子式：Ｃ_４４Ｈ_６９ＮＯ_１０
ＵＶ（ＨＰＬＣ−ＭＳ分析の間のダイオードアレイ検出による）：２４５ｎｍ
電子スプレーＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］^＋のｍ／ｚ＝７７２．５；ｍ／ｚ＝１４２．２にホロサミン糖フラグメントイオン。

物質の少ない量が本分子の詳細なＮＭＲ研究を妨げたが、しかし積算データは期待された構造と矛盾しなかった。この分析は２１−デスエチル−２１−シクロブチルスピノシンＡのデータとの比較により補助された。
実施例９ ５，６−ジヒドロ−２１−デスエチル−２１−シクロブチルスピノシンＡ（化合物８）および５，６−ジヒドロ−２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシンＡ（化合物２９）の製造
２ｍＬのトルエンおよび０．５ｍＬのエタノール中の２１−デスエチル−２１−シクロブチルスピノシンＡ（３．１ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ）の溶液を低流の窒素で２０分間パージし、その後２ｍｇのクロロトリス（トリフェニルホスフィン）ロジウムを添加し、そして溶液を６０℃かつ１ａｔｍで１６時間水素化した。冷却および溶媒の除去後にそれぞれ０％、２％、３％、４％および５％ＭｅＯＨを含有するジクロロメタンの５×２５ｍＬ画分で溶出する１０ｃｍ×２ｃｍシリカゲルカラムを使用して残渣をクロマトグラフィー分離した。生成物を含有する画分を合わせかつ濃縮して２．１ｍｇの５，６−ジヒドロ−２１−デスエチル−２１−シクロブチルスピノシンＡを生じた。ＭＳ Ｍ＋ ７６０。

５，６−ジヒドロ−２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシンＡ（化合物２９）は同一の手順を使用して２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシンＡ（化合物２３）から製造した。
実施例１０ ２１−デスエチル−２１−シクロプロピルスピノシンＡおよびＤ（化合物１および２）の製造および単離
土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）１３Ｅの凍結栄養増殖ストックをＣＳＭ（ばね付き２５０ｍＬ三角フラスコ中でインキュベートされる５０ｍＬ）中の一次栄養増殖前培養物に接種した。栄養増殖培地（ばね付き２Ｌ三角フラスコ中でインキュベートされる２５０ｍＬ）中の二次前培養物を実施例８に記述されるとおり調製しかつインキュベートした。

１４リットルの生産培地を、０．０１％ｖ／ｖプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｌ−０１０１（ＢＡＳＦ）消泡剤の添加を伴い実施例６でのとおり調製した。生産培地に５％ｖ／ｖの二次前培養物を接種し、そして２０Ｌの攪拌されるバイオリアクター中で実施例８に記述された条件下で７〜１０日間醗酵させた。シクロプロピルカルボン酸を４５時間に５ｍＭの最終濃度までバイオリアクターに供給した。醗酵ブロスを７日後に収集しかつ実施例８に記述されたとおり抽出した。

油状残渣をメタノール（１．５ｍＬ）に溶解し、そして最初に、実施例８に記述されたとおり粗にクロマトグラフィー分離した。２１−デスエチル−２１−シクロプロピルスピノシンＡを含有した最初の分離からの画分を合わせかつ溶媒を真空中で除去した。残渣は、５ｍＬ／分の流速で下述されるところの勾配で溶出する逆相シリカゲル（プロディジー（Ｐｒｏｄｉｇｙ）Ｃ_１８、５μｍ；１０×２５０ｍｍ）でクロマトグラフィー分離した。
Ｔ＝０分、５５％Ｂ；Ｔ＝７０％Ｂ；Ｔ＝３０、９５％Ｂ；Ｔ＝３５、９５％Ｂ。

画分は３０秒ごとに収集した。２１−デスエチル−２１−シクロプロピルスピノシンＡを含有する画分を合わせ、アセトニトリルを真空中で除去し、そしてサンプルをＣ_１８−ボンドエリュート（ＢｏｎｄＥｌｕｔｅ）カートリッジ（２００ｍｇ）を使用して濃縮した。サンプルは重力下に適用し、水（１０ｍＬ）で洗浄しかつメタノール（２×１０ｍＬ）で溶出し、そしてその後溶媒を真空中で除去した。

２１−デスエチル−２１−シクロプロピルスピノシンＡ（化合物１）は以下の特徴を有する：
単離された収量：約１ｍｇ
分子量：７４３
分子式：Ｃ_４２Ｈ_６５ＮＯ_１０
ＵＶ（ＨＰＬＣ−ＭＳ分析の間のダイオードアレイ検出による）：２４５ｎｍ
電子スプレーＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］^＋のｍ／ｚ＝７４４．５；ｍ／ｚ＝１４２．２にホロサミン糖フラグメントイオン。

表７はＣＤＣｌ_３中での２１−デスエチル−２１−シクロプロピルスピノシンＡの^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルデータを要約する。

化学シフトは７．２６ｐｐｍのＣＨＣｌ_３のプロトンに関係づけられる。
＊これらの割り当ては互換性である。

２１−デスエチル−２１−シクロプロピルスピノシンＤ（化合物２）は以下の特徴を有する：
単離された収量：約０．５ｍｇ
分子量：７５７
分子式：Ｃ_４３Ｈ_６７ＮＯ_１０
ＵＶ（ＨＰＬＣ−ＭＳ分析の間のダイオードアレイ検出による）：２４５ｎｍ
電子スプレーＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］^＋のｍ／ｚ＝７５８．５；ｍ／ｚ＝１４２．２にホロサミン糖フラグメントイオン。

物質の少ない量が本分子の詳細なＮＭＲ研究を妨げたが、しかし積算データは期待された構造と矛盾しなかった。この分析は２１−デスエチル−２１−シクロプロピルスピノシンＡのデータとの比較により補助された。
ｂ．ａｖｅ負荷ドメインを使用するハイブリッドのスピノシンＰＫＳ
アベルメクチン生合成クラスターの負荷モジュール（ａｖｅＡＴ０ＡＣＰ０）は、イソブチリル−ＣｏＡおよび２−メチルブチリル−ＣｏＡ由来のアベルメクチン分子へのＣ−２分枝状開始体ユニットの導入を支配する。アベルメクチンの系の開始体ユニットの特異性を新規ポリケチドに与えるためのエリスロマイシンＰＫＳ経路への本負荷ドメインのスワッピングの前例が存在する（第ＷＯ ９８／０１５４６号明細書、第ＷＯ ９８／０１５７１号明細書、Ｍａｒｓｄｅｎら １９９８）。アベルメクチンの負荷モジュールはまた、その天然の環境でもしくはａｖｅ／ｅｒｙハイブリッド経路の一部としてのいずれかで、広範な遊離酸のＣｏＡ−エステルを生産培地から取り込むことも示されている（Ｐａｃｅｙら １９９８）。文献に記述されているアベルメクチンの負荷モジュールの交換（ｓｗａｐ）は、実際にはアベルメクチンＡＴ０ＡＣＰ０によるエリスロマイシンＡＴ０ＡＣＰ０の置換である。これは開始コドンとＳｐｅＩ部位との間のアベルメクチンＡＴ０の上流のエリスロマイシンＤＮＡ配列の一片に至る。Ｎ末端領域（相同なＡＴドメインの上流）がアベルメクチンの負荷モジュール中でよりもエリスロマイシンのそれにおいてはるかにより大きくかつ該タンパク質の安定性に重要であるとみられるため、ａｖｅ／ｅｒｙ実験でこれを包含した。生じるハイブリッドは生産的であったため、その領域をａｖｅ／ｓｐｎハイブリッドに使用した。実際には生じるハイブリッド遺伝子はｅｒｙ／ａｖｅ／ｓｐｎハイブリッドであるが、しかし、それはアベルメクチン負荷モジュールの特異性をスピノシンＰＫＳに伝達するため、それは、ａｖｅ／ｓｐｎハイブリッド全体（ａｖｅ／ｓｐｎ ｈｙｂｒｉｄ ｔｈｒｏｕｇｈ−ｏｕｔ）と称されている。

アベルメクチン負荷モジュール（ＡＴ０ＡＣＰ０）をｐＩＧ１（第ＷＯ ９８／０１５４６号明細書、第ＷＯ ９８／０１５７１号明細書、Ｍａｒｓｄｅｎら １９９８）からＰ_ａｃｔＩもしくはＰ_ｐｔｒいずれかの制御下にｓｐｎＫＳ１のインフレームかつその上流にクローン化した。ＫＳ１相同領域の始めの縁の同一のスプライス部位を上述されたｅｒｙ ｌｏａｄの実験についてのとおり使用した。組込みのための相同領域はｐＲＨＢ３Ｅ１１から取り込んだ。生じるプラスミドｐＬＳＢ２９（Ｐ_ａｃｔＩの制御下にハイブリッドＰＫＳ領域をもつ）およびｐＬＳＢ３０（Ｐ_ｐｔｒの制御下にハイブリッドＰＫＳ領域をもつ）はｐＫＣ１１３２に基づき、そして従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）双方での選択のためのアプラマイシン耐性マーカーならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）へのＤＮＡの接合伝達のためのｏｒｉＴを含有する（Ｂｉｅｒｍａｎら １９９２、Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａら １９９４）。これらの構築物を接合により土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）ＮＲＲＬ １８５３８に形質転換した。外接合体は、適切なプロモーター下にハイブリッドａｖｅ／ｓｐｎ ＰＫＳ遺伝子を含有することがＰＣＲ分析により確認された。

土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）ＮＲＲＬ １８５３８：ｐＬＳＢ２９を土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）２１Ｋ２と称した。それは、負荷モジュールへの酢酸およびプロピオン酸の取り込みにより主としてスピノシンＥ、ＡおよびＤを産生した。新規天然産物２１−デスエチル−２１−イソプロピルスピノシンＡおよび２１−デスエチル−２１−ｓｅｃ−ブチルスピノシンＡ、ならびに同等のＤ類似物と矛盾しなかった質量をもつ付加的な小さなピークがＬＣ−ＭＳで観察された。これらの少量の産物は開始体へのそれぞれイソ絡酸および２−メチル絡酸の取り込みに由来した。アベルメクチンの生合成それ自身において、ａｖｅ負荷モジュールはこれらの分枝状開始体のみを起用する。しかしながら、ａｖｅ負荷モジュールがエリスロマイシンＰＫＳ中でＫＳ１の上流でスプライスされた場合に、より広範な範囲の産物が観察され、こうしたハイブリッドが酢酸およびプロピオン酸も同様に取り込む可能性があることを示す。われわれは、従って、この工作した土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）株からの期待される範囲の産物を観察した。

単離された２１−デスエチル−２１−イソプロピルスピノシンＡの構造をＮＭＲ特徴付けにより確認した。２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシンＡは、２１−デスエチル−２１−イソプロピルスピノシンＡの生産培養物から少量成分として単離された。おそらく培地から絡酸を採取する負荷モジュールにより作成される２１−ｎ−プロピル類似物もまた完全に特徴付けした。双方は昆虫防除アッセイで活性であった。

アベルメクチンＰＫＳの負荷モジュールの天然の応用可能性のいく分かは、以前にエリスロマイシンの系に伝達されており、従って変えられた開始体ユニットをもつスピノシンを生成するように広範な遊離酸を土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）２１Ｋ２に供給した。どの酸が供給されたかおよび従ってどの化合物が各実験から期待されたかという知識と一緒に、ＵＶ発色団、質量および質量スペクトルのフラグメンテーションに基づき、新規スピノシン化合物が同定された。行われた構造予測を確認するため、新規Ｃ２１開始体基をもつ多数のスピノシンを単離しかつ完全に特徴付けした。

こうして使用し得る遊離酸は、限定されるものでないが以下、すなわちシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニルおよび２−メチルシクロプロピルを包含する環状有機酸；２−フロ酸、３−フロ酸、チオフェンカルボン酸およびメチルチオフェンカルボン酸を包含するヘテロ原子含有環状有機酸；分枝状鎖カルボン酸；ならびにメチルチオ酢酸、クロロ酢酸、シアノ酢酸およびメトキシ酢酸を包含した数種の他の酸を挙げることができる。

こうした供給実験は、Ｃ２１がエチル以外の側鎖、一般にはα−分枝状Ｃ２−Ｃ５アルキル基、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルもしくはシクロアルケニル基（場合によっては例えば１個もしくはそれ以上のヒドロキシ、Ｃ１−４アルキルもしくはアルコキシ基またはハロゲン原子で置換される）、あるいは飽和または完全にもしくは部分的に不飽和の場合によっては置換される（シクロアルキルに関して）ＯもしくはＳを含有する３〜６員の複素環をもつスピノシンの類似物（スピノシンは表１および２ならびに式Ｉに具体的に説明される型の２２員の四環性核をもつマクロライドである）に至る。Ｃ２１置換基の好ましい候補は、ｅｒｙもしくはａｖｅの負荷モジュールにより基質として使用できるカルボン酸ユニットの基である。好ましい基質はシクロブタンカルボン酸およびシクロプロパンカルボン酸を包含する。他の可能性はｎ−絡酸、イソプロピルカルボン酸、２−（Ｓ）−メチル絡酸、２−メチルシクロプロパンカルボン酸、３−フロ酸およびメチルチオ酢酸を包含する。

分枝状鎖の酸、イソプロピルおよび２−メチルブチルカルボン酸の供給は、ａｖｅ ｌｏａｄの正常な特異性により、作成される新規天然産物の収量を変えなかった。これらの産物は土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）２１Ｋ２の全部の健全な培養物中で低収量で観察された。

シクロブチルカルボン酸はａｖｅ負荷モジュールにより受容されてＡおよびＤ類似物ならびにかなりの比率のＡ類似物のＣ１７−プソイドアグリコンを生じた。シクロブチル産物は、供給されたハイブリッドｅｒｙ／ｓｐｎ系でより高レベルで観察された（２１−デスエチル−２１−シクロブチルスピノシンＡが約５〜１０ｍｇ／リットル、２１−デスエチル−２１−シクロブチルスピノシンＤはより低いがしかし有意のレベルで、および２１−デスエチル−２１−シクロブチルスピノシンＡ １７−プソイドアグリコンが約１０〜１５ｍｇ／リットルで）。シクロプロピルカルボン酸の供給もまた成功裏であり、２１−デスエチル−２１−シクロプロピルスピノシンＡおよびＤを生じた。２種のシクロブチル類似物およびシクロプロピルＡ類似物は、ｅｒｙ ｌｏａｄ実験から単離された精製された化合物に同一であることが示された。

メチルチオ酢酸は取り込まれて上のシクロブチル実験のものに匹敵する収量で２１−デスエチル−２１−メチルチオメチルスピノシンＡを生じた。これはｅｒｙ ｌｏａｄ実験からの同一化合物の産生を上回る収量の有意の改善であった。２−フロ酸およびメチルシクロプロピルカルボン酸もまた取り込まれて期待された新規産物を生じた。
実施例１１ アベルメクチンポリケチド合成酵素の負荷モジュールをスピノシンポリケチド合成酵素に組み込むためのベクターの構築
図５を参照されたい。アベルメクチンポリケチド合成酵素の負荷モジュールをスピノシンポリケチド合成酵素に組み込むためのベクターは、アベルメクチンの負荷モジュール（ＡＴ０ＡＣＰ０）、次いで組込みのための相同性を提供するスピノシンＰＫＳの第一モジュールの一領域を含有する。該ベクターをｐＬＳＢ２９と称し、そして以下のとおり構築した：
アベルメクチンの負荷モジュールは以前にエリスロマイシンのモジュール１の上流でプライスされている（第ＷＯ ９８／０１５４６号明細書、第ＷＯ ９８／０１５７１号明細書、Ｍａｒｓｄｅｎら １９９８）。このａｖｅ／ｅｒｙハイブリッド中で、該負荷モジュールは始めにｅｒｙのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、次いでａｖｅ ＰＫＳのＡＴ０ＡＣＰ０を有した。このハイブリッドフラグメントはアベルメクチンの負荷ドメインの特異性を賦与したが、とは言えそれは少量のｅｒｙ配列を包含した。同一フラグメントを本実験で使用し、そしてｅｒｙ／ａｖｅ／ｓｐｎハイブリッドタンパク質に至る。われわれはそれを単純にａｖｅ／ｓｐｎハイブリッドとして記述する。スピノシン経路に賦与されるのがアベルメクチンの負荷ドメインの特異性であるためである。該フラグメントは開始コドンを組み込むＮｄｅＩ部位で始まり、そしてＫＳ１の始めの工作されたＮｈｅＩ部位で終わる。これはスピノシンＫＳ１配列中に１個の保存的アミノ酸変化（Ｉｌｅ−Ｌｅｕ）を導入する。

ＮｈｅＩ部位を導入するために、ＫＳ１の始めからのｓｐｎＡの領域を、鋳型としてｐＲＨＢ３Ｅ１１（米国特許第６，２７４，３５０ Ｂ１号明細書、Ｗａｌｄｒｏｎら ２００１）、ならびにオリゴＳＰ１４（配列番号９）およびＳＰ１５（配列番号１０）を使用するＰＣＲにより増幅した。ＳＰ１４は塩基２４１０７−２４１１２（番号は米国特許第６，２７４，３５０号明細書の配列番号１を指す）にＮｈｅＩ部位を導入する。ＳＰ１５はおよそ１５００ｂｐ下流のＢｓｔＥＩＩ部位（２５６４６−２５６５２）で結合する。その後のクローニング段階のためＮｏｔＩ部位もまたＳＰ１５に組み込んだ。ＰＣＲは標準的条件下でＰｗｏ熱安定性ポリメラーゼを使用して実施した。

ＰＣＲ産物をリン酸化し、ゲル精製し、そして以前にＳｍａＩで消化しかつ脱リン酸化していたｐＵＣ１９にクローン化した。多数の挿入物含有クローンを配列決定した。該ベクター中でＮｈｅＩ部位をＥｃｏＲＩ部位の隣に配置する向きの挿入物を含有する１クローンをｐＬＳＢ５と称した。

組み込みのための十分に大きい相同領域を提供するために、およそ２．６ｋｂｐのフラグメント（ＢｓｔＥＩＩからＮｏｔＩまで）をｐＲＨＢ３Ｅ１１からｐＬＳＢ５にクローン化してｐＬＳＢ８を生じた。

その後、アベルメクチン負荷モジュールをｐＩＧ１（第ＷＯ ９８／０１５４６号明細書、第ＷＯ ９８／０１５７１号明細書、Ｍａｒｓｄｅｎら １９９８）からＮｄｅＩ／ＮｈｅＩフラグメントとしてクローン化し、そして以前にＮｄｅＩおよびＮｈｅＩで消化したｐＬＳＢ８に連結した。ＮｄｅＩ部位からＮｈｅＩ部位までの使用したアベルメクチン負荷モジュールフラグメントのＤＮＡ配列を配列番号１１に示す。生じるプラスミドをｐＬＳＢ１４と称した。

ｐＬＳＢ１４に含有されるフラグメントは、組み込みが起こるのに十分であるｓｐｎＡに相同な領域を伴い、インフレームでスピノシンＫＳ１までスプライスされたアベルメクチン負荷モジュールを含有する。

このフラグメントをその後ＮｄｅＩ／ＸｂａＩフラグメントとして取り出しそしてｐＬＳＢ２にクローン化してｐＬＳＢ２９を生じた。これは、接合により土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）に伝達されかつその後アプラマイシン耐性マーカーを使用して選択し得るベクター中でＰａｃｔＩ下に新規ａｖｅ／ｓｐｎハイブリッドフラグメントを配置する。
実施例１２ スピノシンＰＫＳのＫＳ１に融合したアベルメクチン負荷モジュールを含んでなるハイブリッドポリケチド合成酵素をもつ土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）株の生成
図６を参照されたい。土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）ＮＲＲＬ １８５３８を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１（Ｓｉｍｏｎら、１９８３）からの接合（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａら １９９４）によりｐＬＳＢ２９で形質転換した。形質転換体をアプラマイシンに対する耐性により選択しかつサザンブロット分析によりスクリーニングした。相同的組換えにより該プラスミドが染色体中に組込まれたことを示す正しいハイブリダイゼーションパターンを表す単一形質転換体を土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）２１Ｋ２株と称した。
実施例１３ 土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）２１Ｋ１２の醗酵による代謝物の製造（化合物９〜１２の製造）
土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）２１Ｋ２は、ＣＳＭ培地（ＨｏｓｔｅｄとＢａｌｔｚ １９９６；米国特許第５，３６２，６３４号明細書）に接種するのに使用した凍結栄養増殖ストックから培養した。この前培養物を、１インチ行程で３００ｒｐｍで振とうされるフラスコ中、３０℃の温度で３日間増殖させた。これを使用して５％ｖ／ｖで栄養増殖培地（ＳｔｒｏｂｅｌとＮａｋａｔｓｕｋａｓａ １９９３；米国特許第５，３６２，６３４号明細書）に接種し、そして同一条件下でさらなる２日間培養した。栄養増殖培養物を使用して５％ｖ／ｖで生産培地（ＳｔｒｏｂｅｌとＮａｋａｔｓｕｋａｓａ １９９３）に接種した。小スケールの生産培養物を、前培養物と同一条件下でしかし２インチ行程で２５０ｒｐｍかつ７５％相対湿度で７〜１０日間醗酵させた。初期の小スケール生産培養物はばね付き２５ｍＬ三角フラスコ中の６ｍＬの生産培地中で７日間増殖させた。

産生された代謝物を同定するために、醗酵ブロスの１ｍＬアリコートを実施例５に記述されたところのＬＣ−ＭＳにより分析した。真正の標準品および土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）ＮＲＲＬ １８５３８株からの醗酵抽出物との比較により、土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）２１Ｋ２により産生された主要化合物はスピノシンＡ、ＤおよびＥであった。スピノシンＡが産生された主要成分であり、また、スピノシン類の総収量は約５０ｍｇ／ｌであった。

既知のスピノシンＡ、ＤおよびＥに加え、４種の新規化合物が明らかに存在した。これらの新規化合物についてのクロマトグラフィーの保持時間および質量スペクトルデータ（表８）は、分枝状鎖開始体ユニット（イソプロピルカルボン酸および２−メチル絡酸）の取り込みによるそれらの合成と矛盾しなかった。新規化合物のＭＳスペクトルは［Ｍ＋Ｈ］＋種およびホロサミンフラグメント（１４２．３）のイオンを生じた。イソプロピルカルボン酸供給由来の化合物は２−メチル絡酸由来のものより２〜３倍より高レベル存在した。新規化合物は存在する全スピノシンの５％未満を含んだ。

実施例１４ 土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）２１Ｋ２からの新規スピノシンの前駆体に指図される製造（化合物１〜６および１３〜２０の製造）
ａｖｅ／ｓｐｎハイブリッドＰＫＳを使用して、生産培養物にカルボン酸を供給することにより新規スピノシン代謝物を生成させた。アベルメクチン負荷モジュールは該分子の開始体内に該カルボン酸を取り込んだ。

平行６ｍＬ生産フラスコに上の実施例１３に記述されたとおり接種した。２４時間後にこれらのそれぞれに３ｍＭの最終濃度のカルボン酸（水中で作成しかつ水酸化ナトリウムでｐＨを６．５に調節したストック溶液）を供給した。７日後、醗酵ブロスの１ｍＬアリコートを実施例６および１２に記述されたところのＬＣ−ＭＳにより分析した。シクロブチルカルボン酸、シクロプロピルカルボン酸、２−メチルシクロプロピルカルボン酸、メチルチオ酢酸および３−フロ酸の取り込みは、ＵＶおよびＭＳクロマトグラム中の新規ピークの出現により示されるとおり、新規Ｃ２１修飾スピノシンを提供した（表９）。新規化合物の質量スペクトルは［Ｍ＋Ｈ］^＋種およびホロサミンフラグメント（１４２．３）のイオンを生じた。加えて、シクロブチルおよびシクロプロピルカルボン酸の供給は、対応する１７−プソイドアグリコンの有意の蓄積もまた引き起こした。

２１−シクロブチルおよびシクロプロピル化合物は、ｅｒｙ ｌｏａｄ株、土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）１３Ｅに供給することから単離された化合物に比較して、正しい構造と確認された。
実施例１５ 土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）２１Ｋ２の大スケール醗酵からの新規代謝物の単離
土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）２１Ｋ２の凍結栄養増殖ストックを、ＣＳＭ（ばね付き２５０ｍＬ三角フラスコ中でインキュベートされる５０ｍＬ）中の土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）２１Ｋ２の一次栄養増殖前培養物に接種した。栄養増殖培地（ばね付き２Ｌ三角フラスコ中でインキュベートされる２５０ｍＬ）中の二次前培養物を実施例６に記述されるとおり調製しかつインキュベートした。

１４リットルの生産培地を０．０１％ｖ／ｖプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｌ−０１０１（ＢＡＳＦ）消泡剤の添加を伴い実施例６でのとおり調製した。生産培地に５％ｖ／ｖの二次前培養物を接種し、そして実施例８に記述された条件下で２０Ｌの攪拌されるバイオリアクター中で７〜１０日間醗酵させた。２ｍＭの最終濃度までの２−メチル絡酸を２６および３７．５時間にバイオリアクターに供給し、４ｍＭの総最終濃度に至った。醗酵ブロスを７日後に収集し、そして実施例８に記述されるとおり抽出した。

油状残渣をメタノール（１．５ｍＬ）に溶解し、そして最初に実施例８に記述されるとおりクロマトグラフィー分離した。２１−デスエチル−２１−イソプロピルスピノシンＡを含有した最初の分離からの画分を合わせそして溶媒を真空中で除去した。残渣を、５ｍＬ／分の流速で下述されるところの勾配で溶出する逆相シリカゲル（プロディジー（Ｐｒｏｄｉｇｙ）Ｃ_１８、５μｍ；１０×２５０ｍｍ）でクロマトグラフィー分離した。
Ｔ＝０、５５％Ｂ；Ｔ＝５、７０％Ｂ；Ｔ＝３５、９５％Ｂ；Ｔ＝４５、９５％Ｂ。

画分を３０秒ごとに収集した。２１−デスエチル−２１−イソプロピルスピノシンＡを含有する画分を合わせ、アセトニトリルを真空中で除去し、そしてＣ_１８−ボンドエリュート（ＢｏｎｄＥｌｕｔｅ）カートリッジ（２００ｍｇ）を使用してサンプルを濃縮した。サンプルは重力下に適用し、水（１０ｍＬ）で洗浄しかつメタノール（２×１０ｍＬ）で溶出し、その後溶媒を真空中で除去した。

乾燥したサンプルをメタノール（０．５ｍＬ）に溶解しかつ逆相塩基不活性化シリカゲル（ハイパーシル（ｈｙｐｅｒｓｉｌ）−Ｃ１８−ＢＤＳ；４．６×２５０ｍｍ；５μｍ）でクロマトグラフィー分離した。カラムは酢酸アンモニウム（１０ｍＭ）−メタノール−テトラヒドロフラン（４０：４５：１５）を用い１ｍＬ／分の流速でアイソクラチックに溶出し、そして３種の主要成分をＵＶ検出（２４４ｎｍ）後に収集した。これらの条件下での保持時間は以下のとおりであった：スピノシンＤ：６４．４分、２１−デスエチル−２１−イソプロピルスピノシンＡ：６７．８分、および２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシンＡ：７５．３分。各サンプルを真空中で乾燥して白色固形物を生じ、これをそのＮＭＲおよび質量スペクトルにより同定した。

２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシンＡ（化合物２３）は以下の特徴を有する。
分子量：７４５
分子式：Ｃ_４２Ｈ_６７ＮＯ_１０
ＵＶ（ＨＰＬＣ分析の間のダイオードアレイ検出による）：２４４ｎｍ
電子スプレーＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ＝７４６．５；ｍ／ｚ＝１４２．２にホロサミンの糖フラグメントイオン。

表１０はＣＤＣｌ_３中の２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシンＡの^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲの化学シフトデータを要約する。

化学シフトは７．２６ｐｐｍのＣＨＣｌ_３のプロトンに関係づけられる。

２１−デスエチル−２１−イソプロピルスピノシンＡ（化合物９）は以下の特徴を有する。
分子量：７４５
分子式：Ｃ_４２Ｈ_６７ＮＯ_１０
ＵＶ（ＨＰＬＣ分析の間のダイオードアレイ検出による）：２４４ｎｍ
電子スプレーＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ＝７４６．５；ｍ／ｚ＝１４２．２にホロサミンの糖フラグメントイオン。

表１１はＣＤＣｌ_３中の２１−デスエチル−２１−イソプロピルスピノシンＡの^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲの化学シフトデータを要約する。

化学シフトは７．２６ｐｐｍのＣＨＣｌ_３のプロトン；２Ｄ実験からの１３Ｃデータに関係づけられる。

推定の２１−デスメチル−２１−ｓｅｃ−ブチルスピノシンＡを含有した最初の分画からの画分を合わせ、アセトニトリルを真空中で除去しかつＣ_１８−ボンドエリュート（ＢｏｎｄＥｌｕｔｅ）カートリッジ（２００ｍｇ）を使用して濃縮した。サンプルは重力下に適用し、水（１０ｍＬ）で洗浄しかつメタノール（２×１０ｍＬ）で溶出し、その後溶媒を真空中で除去した。

推定の２１−デスメチル−２１−ｓｅｃ−ブチルスピノシンＡ（化合物１１）は以下の特徴を有する。
分子量：７５９
分子式：Ｃ_４３Ｈ_６９ＮＯ_１０
ＵＶ（ＨＰＬＣ分析の間のダイオードアレイ検出による）：２４４ｎｍ
電子スプレーＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋のｍ／ｚ＝７６０．５；ｍ／ｚ＝１４２．２にホロサミンの糖フラグメントイオン。
Ｓ．シナモネンシス（Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）クロトニル−ＣｏＡ還元酵素の共発現
別の局面において、本発明は、天然のポリケチド合成酵素が新規産物を産生するような変えられた基質供給を提示する工作された土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）宿主を提供する。例えば、スピノシン生合成経路とのＳ．シナモネンシス（Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）クロトニル−ＣｏＡ還元酵素の共発現は、負荷モジュールが付加的にエチルマロニル−ＣｏＡを取り込んで２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシンＡおよびＤを生じ、かつ、モジュール８のＡＴが付加的にエチルマロニル−ＣｏＡを取り込んで６−エチルスピノシンＡを生じる新規産物に至る。加えて、これらのＡＴドメインの双方はエチルマロニル−ＣｏＡを受容して６−エチル−２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシンを生じ得る。

スピノシンの負荷モジュールは、プロピオン酸を取り込むためにメチルマロニル−ＣｏＡを主に脱カルボキシル化するＫＳｑＡＴ０ＡＣＰ０を含んでなる。ＫＳｑを含有する負荷モジュールは一般にそれらを欠くものよりも特異的である。従って、スピノシンの負荷モジュールがときにマロニル−ＣｏＡ（天然に生じる痕跡量のスピノシンＥ）を受容し、そして、ここで開示されるとおり予期しないことにエチルマロニル−ＣｏＡが存在する場合にそれを受容することは興味深くかつ異常である。

この概念を裏付ける証拠については実施例１８および実施例２２にすぐ先行する考察を参照されたい。
異種伸長モジュールを伴うハイブリッドスピノシンＰＫＳ
その別の局面において、本発明は異種ＡＴドメインとともに異種伸長モジュールもしくはスピノシン伸長モジュールを含んでなるハイブリッドスピノシンＰＫＳを提供する。

ＡＴドメインは、成長するポリケチド鎖に取り込まれる伸長体ユニットを選択する。スピノシンの生合成において伸長体は主としてマロニル−ＣｏＡである。しかしながら、モジュール３中のＡＴは本質的にメチルマロニル−ＣｏＡに特異的である。それはときにマロニル−ＣｏＡを取り込み、天然の少量成分としてのスピノシンＦの蓄積につながる。モジュール８中のＡＴは、主としてマロニル−ＣｏＡ（スピノシンＡを生じる）を取り込むがしかしまたかなりの量のメチルマロニル−ＣｏＡ（約１５％のスピノシンＤを生じる）も取り込むゆるやかな特異性を示す。モジュール８のＡＴのアミノ酸配列はメチルマロニル−ＣｏＡの選択と関連する領域中で他のＡＴドメインに類似である。われわれは従って、この位置での主としてマロニル−ＣｏＡの取り込みが、異常にゆるやかな特異性を有するＡＴドメインとともに基質供給の反映であることを示唆する。負荷モジュールのＡＴは主としてメチルマロニル−ＣｏＡに対し選択的であるが、しかし時間の５〜１０％のマロニル−ＣｏＡを取り込む（天然の少量成分スピノシンＥの産生に至る）。

異なるマロニル−ＣｏＡに対し選択的な異種ＡＴドメインでの既存のＡＴドメインの置換は、スピノシンポリケチド上の側鎖を付加、除去もしくは置換することができるＰＫＳに至る。該異種ＡＴドメインが細胞内で容易に利用可能でない伸長体分子を取り込み得る場合は、アクセサリー遺伝子が包含されて補助基質を提供する（Ｓｔａｓｓｉら １９９８）。例えば、土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）のゲノム中にはクロトニル−ＣｏＡ還元酵素をコードする明らかな遺伝子が存在せず（Ｃ．Ｗａｌｄｒｏｎ、未発表の観察結果）、そして従ってエチルマロニル−ＣｏＡの供給がこの生物体中で厳しく制限されることが予期される。

スピノシンポリケチド合成酵素のモジュール３中でＡＴ交換を実施させる系を構築した。モジュール３のＡＴは天然にメチルマロニル−ＣｏＡを取り込みかつスピノシンに１６−メチル分枝を導入する。ＡＴ交換を遂げるための一方法は置換により、それは天然のＰＫＳ中でと同一の転写物をもつ株をもたらすことができる。代替の一方法は単一組込みを介し、これは、スピノシンＰＫＳ遺伝子中に完全なプラスミド配列を配置し、また、組込み部位の下流の遺伝子を駆動させるプロモーターが導入されることを必要とする。

以下の実施例（実施例１６〜１９）は、酵素ＭｓｃＩを使用するフラグメントのサブクローニングを必要とするＡＴドメイン交換実験を記述する。ＭｓｃＩは該部位の周囲の配列によるｄｃｍメチル化により影響を及ぼされる。ＭｓｃＩで消化されることが必要とされるプラスミドは、従って、ｄｃｍ⁻株の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＴ１２５６７により継代されて、ｄｃｍによりメチル化されないＤＮＡを生成する。
Ａ．スピノシンのモジュール３のＡＴの代わりにラパマイシンＰＫＳのモジュール２のＡＴを使用するハイブリッドスピノシンＰＫＳ
単一組込みのアプローチを使用して、モジュール３のＡＴ（メチルマロニル−ＣｏＡ特異的）がラパマイシンのモジュール２のＡＴ（マロニル−ＣｏＡ特異的）により置換されたスピノシンＰＳＫを生成した。生じる株を土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）７Ｄ２３と称した。７Ｄ２３のＰＫＳ遺伝子は、天然のｓｐｎＡプロモーター下にｓｐｎＡ、ｓｐｎＢおよび短縮型ｓｐｎＣ、次いで導入されたプロモーターの制御下のプラスミド配列（アプラマイシン耐性マーカーを包含する）ならびにハイブリッドｓｐｎＣおよびｓｐｎＤおよびｓｐｎＥを含有する。７Ｄ２３中で使用した異種プロモーターはプリスチナマイシンに対する耐性のプロモーターであった。代替のプロモーター、例えばその同族のアクチベーターａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４を伴うａｃｔＩプロモーターもまた使用し得る。

土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）７Ｄ２３は４種の予測されたスピノシン類似物すなわちスピノシンＦ、スピノシンＦ １７−プソイドアグリコン、１６−デスメチルスピノシンＤおよび１６−デスメチルスピノシンＤ １７−プソイドアグリコンを産生した。収量は予期されないことに高く、工作されない株からよりも３倍より低いのみであった（実施例２０内の表１２を参照されたい）。スピノシンＦ化合物は工作されない株での少量成分として以前に同定されているが、しかしＰＫＳ遺伝子のこの操作はそれらの収量の劇的な増大をもたらした。

プソイドアグリコンＦの豊富さは、この新規基質に対するホロサミングリコシルトランスフェラーゼの低下した活性の反映であるかもしれない。最終的なグリコシル化はＣ−１７で起こり、従って隣接するＣ−１６メチル基が基質認識に重要であるかもしれない。
実施例１６ 隣接する制限部位を伴うスピノシンのモジュール３のＡＴを含有するベクターの構築
図７ａおよび７ｂを参照されたい。スピノシンのモジュール３のＡＴドメインを、鋳型としてのｐＲＨＢ３Ｅ１１ならびにプライマーＣＲ３２２（配列番号１２）およびＣＲ３２３（配列番号１３）を使用するＰＣＲにより増幅した。これらのプライマーは、ＡＴドメインに隣接するＭｓｃＩおよびＡｖｒＩＩ部位（配列番号１２および１３のｂｐ３−８）を導入する。９７３ｂｐのＰＣＲ産物をリン酸化し、そして以前にＳｍａＩで消化かつ脱リン酸化していた商業的に入手可能なｐＵＣ１８にクローン化した。挿入物を含有する形質転換体を向きについてスクリーニングしかつ配列決定した。ポリリンカーのＨｉｎｄＩＩＩ部位の隣にＡｖｒＩＩ部位を配置する向きで正しい配列の挿入物を運搬する１形質転換体をｐＡＬＫ６と称した。

スピノシンのモジュール３のＡＴの下流の隣接する領域を、鋳型としてのｐＲＨＢ３Ｅ１１ならびにプライマーＣＲ３２４（配列番号１４）およびＣＲ３３２（配列番号１５）を使用するＰＣＲにより増幅した。プライマーＣＲ３２４はＣＲ３２３と正確に同一の位置にＡｖｒＩＩ部位（配列番号１４のｂｐ３−８）を導入し、また、ＣＲ３３２は該配列中に天然に存在するＰｓｔＩ部位の下流を結合する。１５５７ｂｐのＰＣＲ産物をリン酸化し、そして以前にＳｍａＩで消化かつ脱リン酸化していた商業的に入手可能なｐＵＣ１８にクローン化した。挿入物を含有する形質転換体を向きについてスクリーニングしかつ配列決定した。ポリリンカーのＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接してＡｖｒＩＩ部位を配置する向きで正しい配列の挿入物を運搬する１形質転換体をｐＡＬＫ９と称した。ｐＡＬＫ９をＡｖｒＩＩおよびＰｓｔＩで消化した。１５２５ｂｐのフラグメントをゲル精製し、そしてＡｖｒＩＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＡＬＫ６にクローン化して、プラスミドｐＡＬＫ１１を生じた。

本実験の適するポリリンカーを提供するためｐＡＬＫ１２を構築した。ｐＡＬＫ６をＮｄｅＩおよびＰｓｔＩで消化しかつオリゴＣＲ３２８（配列番号１６）およびＣＲ３２９（配列番号１７）のアニーリングしたリンカーと連結した。このリンカーは、ＮｄｅＩ部位を破壊しかつＸｂａＩ、ＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩ部位を残すように設計した。挿入物を含有するクローンを制限酵素消化により分析し、そして正しいパターンを表す単一クローンをｐＡＬＫ１２と称した。

スピノシンのモジュール３のＡＴの上流の隣接する領域を、鋳型としてのｐＲＨＢ３Ｅ１１ならびにプライマーＣＲ３３０（配列番号１８）およびＣＲ３２１（配列番号１９）を使用するＰＣＲにより増幅した。プライマーＣＲ３３０はｓｐｎＣ遺伝子のＡＴＧ開始コドンにＮｄｅＩ部位（配列番号１８のｂｐ１８−２３）を導入し、また、ＣＲ３２１はＣＲ３２２と正確に同一の位置にＭｓｃＩ部位（配列番号１９のｂｐ３−８）を組み込む。１７２９ｂｐのＰＣＲ産物をリン酸化し、そして以前にＳｍａＩで消化しかつ脱リン酸化していた商業的に入手可能なｐＵＣ１８にクローン化した。挿入物を含有する形質転換体を向きについてスクリーニングしかつ配列決定した。ポリリンカーのＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接してＭｓｃＩ部位を配置する向きで正しい配列の挿入物を運搬する１形質転換体をｐＡＬＫ２３と称した。ｐＡＬＫ１２をＰｓｔＩおよびＸｍｎＩで消化し、そして６０１ｂｐをＰｓｔＩ／ＸｍｎＩで消化したｐＡＬＫ２３にクローン化してｐＡＬＫ２４を生じた。ｐＡＬＫ１１をＰｓｔＩおよびＭｓｃＩで消化し、そして、２４８８ｂｐのフラグメントを、ｐＡＬＫ２４をＰｓｔＩおよびＭｓｃＩで消化することにより生じさせた３７７７ｂｐのバックボーンに連結してｐＡＬＫ２５を生じた。組込みのための十分な相同性を確実にするために、ＰｓｔＩ部位（米国特許第６，２７４，３５０ Ｂ１号明細書中の配列番号１のｂｐ３９６０７−３９６１２）からＭｓｃＩ部位（ｂｐ４１１８９−４１１９４）までのＤＮＡのフラグメントをｐＲＨＢ３Ｅ１１から切り出し、そしてＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＶで以前に消化したｐＡＬＫ２５にクローン化してｐＡＬＫ２６を生じた。

ｐＡＬＫ２６は、モジュール３中のＡＴ交換を伴うスピノシンＰＫＳ遺伝子を生成させる実験での中間体プラスミドである。それは、隣接する制限部位を伴うスピノシンのＡＴ３、開始コドンまでのｓｐｎＣの上流領域、および相同的組換えのための下流の領域を含有した。それはＡＴの縁のＭｓｃＩ部位のすぐ上流の４０７ｂｐのＭｓｃＩ−ＭｓｃＩフラグメントを欠いており、ＡＴ交換を達成した後にそれを挿入しなければならない。
実施例１７ Ｃ−１６デスメチルスピノシンを産生させるようにスピノシン生合成経路を工作するのに使用し得るベクターの構築
図８を参照されたい。プラスミドｐＡＬＫ３９を使用して相同的組換えにより土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）の染色体に組込んだ。それはラパマイシンのＡＴ２をスピノシンのモジュール３中に組み込むよう設計した。こうした工作された土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）株は、Ｃ−１６デスメチルスピノシンおよびこの経路中の中間体を産生した。プラスミドｐＡＬＫ３９は下述されるとおり構築した。

ラパマイシンのモジュール２をｐＣＪＲ２６からＭｓｃＩ／ＡｖｒＩＩフラグメント（配列番号２０を参照されたい）として切り出し、そしてＭｓｃＩおよびＡｖｒＩＩで以前に消化していたｐＡＬＫ２６に連結してｐＡＬＫ２８を生じた。この構築物から欠けている４０７ｂｐのＭｓｃＩフラグメントをその後ｐＡＬＫ２４（実施例１６）から切り出し、そして脱リン酸化しＭｓｃＩで消化したｐＡＬＫ２８に連結した。クローンを該挿入物の向きについてスクリーニングし、そして該挿入物を正しい向きで含有する単一クローンをｐＡＬＫ３２と称した。ｐＡＬＫ３２は、開始コドンのＮｄｅＩ部位およびポリケチド合成酵素配列のすぐ外側の下流のＸｂａＩ部位を伴い、土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）のモジュール３中にｒａｐ ＡＴ２交換を導入するための必要とされるフラグメントを含有する。この領域をＮｄｅＩ／ＸｂａＩフラグメントとして切り出し、そしてｐＬＳＢ３にクローン化してｐＡＬＫ３９を生じた。新規モジュール３のハイブリッドフラグメントは、それにより、接合により土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）に伝達されかつアプラマイシン耐性により選択され得るベクター中でＰ_ｐｔｒ下に配置された。
実施例１８ クロトニル−ＣｏＡ還元酵素を過剰発現することが可能なベクターの構築
図９を参照されたい。基質供給の問題を取り扱うために、ストレプトミセス シナモネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）からのクロトニル−ＣｏＡ還元酵素（ｃｃｒ）遺伝子を過剰発現するｐＡＬＫ２１を構築した。ｐＡＬＫ２１は下述されるとおり構築した。

Ｓ．シナモネンシス（Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）のｃｃｒ遺伝子を、プライマーＣＣＲＭＯＮＦ（配列番号２１）およびＣＣＲＭＯＮＲ（配列番号２２）を使用してＳ．シナモネンシス（Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）ＡＴＣＣ １５４１３から単離したゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。ＣＣＲＭＯＮＦは、該遺伝子の開始コドンのＡＴＧを組み込むＮｄｅＩ部位（配列番号２１のｂｐ７−１２）を導入し、また、ＣＣＲＭＯＮＲは終止コドンの下流にＢａｍＨＩ部位（配列番号２２のｂｐ６−１１）を導入する。ｃｃｒ遺伝子を得るための増幅はＰｗｏ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用して標準的条件下で実施した。フラグメントをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、その後、ＳｍａＩで消化しかつ脱リン酸化した商業的に入手可能なｐＵＣ１８にクローン化した。挿入物を含有するプラスミドを配列決定し、そして正しい配列を含有する１プラスミドをｐＬＳＢ４６と称した。プラスミドｐＬＳＢ４６は、導入したＢａｍＨＩ部位をポリリンカーのＸｂａＩ部位に隣接して配置する向きにＳ．シナモネンシス（Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）のｃｃｒ遺伝子を含有する。配列番号２３は、開始コドンのＮｄｅＩ部位から終止コドン後のＢａｍＨＩ部位までのｃｃｒ遺伝子を示す。

ｃｃｒ遺伝子をＮｄｅＩ／ＸｂａＩフラグメントとして切り出し、そしてＮｄｅＩおよびＸｂａＩで消化した発現ベクターｐＬＳＢ２（実施例２）にクローン化してｐＬＳＢ５９を生じた。プラスミドｐＬＳＢ５９は、ａｃｔＩプロモーターの制御下のｃｃｒ遺伝子およびアクチベーターａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４を含有する。工作したハイブリッドＰＫＳとｃｃｒ遺伝子を共発現させるために、ｃｃｒを含有するフラグメントをａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４アクチベーターおよびａｃｔＩプロモーターと一緒に、ハイブリッドＰＫＳ遺伝子に利用可能な制限部位を有する第二のプロモーター（Ｐ_ｐｔｒ）を含有するベクターに移入した。これは下述するとおり達成した。

プラスミドｐＬＳＢ５９をＮｄｅＩで消化し、そしてＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを使用して末端を埋めた。この平滑端フラグメントを再環化してｐＡＬＫ１９を生じた。該遺伝子およびプロモーターをｐＡＬＫ１９からＳｐｅＩ／ＸｂａＩフラグメントとして切り出し、そしてＳｐｅＩで消化したｐＬＳＢ３（実施例２）にクローン化した。この段階はｃｃｒ遺伝子の末端のＸｂａＩ部位を破壊する。生じるプラスミドをｐＡＬＫ２１と称する。プラスミドｐＡＬＫ２１は従ってＰ_ａｃＩ下にｃｃｒ遺伝子を含有し、唯一のＮｄｅＩおよびＸｂａＩ部位がｐｔｒプロモーターの下流のハイブリッドＰＫＳ遺伝子の導入のため配置される。ｐＡＬＫ２１はアプラマイシン耐性でありかつＤＮＡの接合伝達のためのｏｒｉＴを含有する。
実施例１９ スピノシンのモジュール３のＡＴの代わりにラパマイシンのモジュール２のＡＴを含んでなるハイブリッドポリケチド合成酵素をもつ土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）株の生成
図１１を参照されたい。土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）ＮＲＲＬ １８５３８を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１（Ｓｉｍｏｎら、１９８３）からの接合（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａら １９９４）によりｐＡＬＫ３９で形質転換した。形質転換体をアプラマイシンに対する耐性について選択した。サザンブロット分析により多数の形質転換体をスクリーニングした。該プラスミドが相同的組換えにより染色体中に組込まれたことを示す正しいハイブリッドパターンを表す単一の形質転換体を土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）７Ｄ２３株と称した。

下の実施例２０〜２１は新規スピノシンを産生させるための土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）７Ｄ２３の使用を具体的に説明する。
実施例２０ １６−デスメチルスピノシンの製造および単離（スピノシンＦ、スピノシンＦプソイドアグリコン、ならびに化合物２１および２２の製造）
１６−デスメチルスピノシンＡは多数の土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）株により産生されるスピノシンのファミリーの１つとして以前に同定されており、そしてスピノシンＦと称されている（米国特許第６，２７４，３５０ Ｂ１号明細書）。ここでわれわれは、土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）７Ｄ２３の工作したハイブリッド経路からのスピノシンＦおよび１６−デスメチルスピノシンＤ（化合物２１）の製造を示す。

土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）７Ｄ２３を使用してＣＳＭ培地（ＨｏｓｔｅｄとＢａｌｔｚ １９９６；米国特許第５，３６２，６３４号明細書）に接種した。この前培養物を、２インチ行程で２５０ｒｐｍで振とうされる、通気を補助するための３０ｃｍばね付き２５０ｍＬフラスコ中、７５％相対湿度を伴う３０℃で３日間増殖させた。その後それを使用して、５％ｖ／ｖで栄養増殖培地すなわち２５０ｍＬフラスコ中３×３０ｍＬ培養物（ＳｔｒｏｂｅｌとＮａｋａｔｓｕｋａｓａ １９９３；米国特許第５，３６２，６３４号明細書）に接種し、それを同一条件下でさらなる２日間培養した。栄養増殖培養物を使用して、５％ｖ／ｖで生産培地（ＳｔｒｏｂｅｌとＮａｋａｔｓｕｋａｓａ １９９３）すなわち上述された条件下で増殖させた２５０ｍＬフラスコ中３０×３０ｍＬ培養物に接種した。土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）７Ｄ２３の生産培養物を１０日間増殖させた。

代謝物の同定のために醗酵ブロスの１ｍＬアリコートを実施例５に記述されたところのＬＣ−ＭＳにより分析した。真正の標準品との比較により、スピノシンＦ、１６−デスメチルスピノシンＤおよびそれらの対応するプソイドアグリコンが存在したことが明らかであった（表１２）。

残存する醗酵ブロスを遠心分離により澄明にした。細胞を等容量のメタノールで２回抽出した。上清（７８０ｍＬ）を５Ｎ ＮａＯＨでｐＨ約１０に調節しそして酢酸エチル（３×５００ｍＬ）で２回抽出した。メタノールおよび酢酸エチル抽出液を合わせ、そして溶媒を真空中で除去して油状残渣を生じた。残渣を酢酸エチル（２５０ｍＬ）に溶解しかつ５０ｍＭ酒石酸（３×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた酒石酸抽出液を５Ｎ ＮａＯＨでｐＨ約１０に調節しかつ酢酸エチル（３×３００ｍＬ）で抽出した。抽出液を合わせかつ溶媒を真空中で除去して褐色油状物（２００ｍｇ）を生じた。該油状物をメタノール（１ｍＬ）に溶解し、そしてこの半分を最初に、実施例８に記述されるとおりクロマトグラフィー分離した。

１６−デスメチルスピノシンＤおよびスピノシンＦを含有した最初の分離からの主画分を合わせかつ溶媒を真空中で除去した。残渣を２１ｍＬ／分の流速で下述されるところの勾配で溶出する同一カラムでクロマトグラフィー分離した。
Ｔ＝０分、３５％Ｂ；Ｔ＝３５、５５％Ｂ；Ｔ＝４５、５５％Ｂ。

画分は３０秒ごとに収集した。１６−デスメチルスピノシンＤもしくはスピノシンＦのいずれかを含有する画分を個別に合わせた。その後、画分の合わせた組のそれぞれを以下のとおり処理した。すなわち、アセトニトリルを真空中で除去し、そしてＣ_１８−ボンドエリュート（ＢｏｎｄＥｌｕｔｅ）カートリッジ（２００ｍｇ）を使用してサンプルを濃縮した。サンプルは重力下に適用し、水（１０ｍＬ）で洗浄し、メタノール（２×１０ｍＬ）で溶出しそして溶媒を真空中で除去した。

１６−デスメチルスピノシンＤ（化合物２１）は以下の特徴を有する。
単離された収量：４．８ｍｇ
分子量：７３１
分子式：Ｃ_４１Ｈ_６５ＮＯ_１０
ＵＶ（ＨＰＬＣ分析の間のダイオードアレイ検出による）：２４４ｎｍ
電子スプレーＭＳ：ＭＨ^＋のｍ／ｚ＝７３２．５；ｍ／ｚ＝１４２．４にホロサミンの糖フラグメントイオン。
正確なＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］^＋のｍ／ｚ＝７３２．４６８９（７３２．４６８１を必要とする）。

表１３はＣＤＣｌ_３中での１６−デスメチルスピノシンＤの^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲの化学シフトデータを要約する。

化学シフトは７．２６ｐｐｍのプロトンに関係づけられる。
＊アミノ基のプロトン化を引き起こす痕跡量の酸により見られない。

スピノシンＦは以下の特徴を有する。
単離された収量：５．５ｍｇ
分子量：７１７
分子式：Ｃ_４０Ｈ_６３ＮＯ_１０
ＵＶ（ＨＰＬＣ分析の間のダイオードアレイ検出による）：２４４ｎｍ
電子スプレーＭＳ：ＭＨ^＋のｍ／ｚ＝７１８．５；ｍ／ｚ＝１４２．４にホロサミンの糖フラグメントイオン。
正確なＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ：［ＭＨ］^＋のｍ／ｚ＝７１８．４５３４（７１８．４５２５を必要とする）。

本化合物の積算ＮＭＲデータはその提案された正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）および公表されたデータ（米国特許第５，３６２，６３４号明細書）と一致した。
実施例２１ １６−デスメチルスピノシンＤ １７−プソイドアグリコン（化合物２２）の製造および単離
１６−デスメチルスピノシンＡ １７−プソイドアグリコンは以前に同定され、そしてスピノシンＦ １７−プソイドアグリコンとして知られる。それは土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）株により産生されるスピノシンのファミリーの少量のメンバーの１つとして見出される（米国特許第６，２７４，３５０ Ｂ１号明細書）。土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）７Ｄ２３の工作されたハイブリッド経路からのスピノシンＦ １７−プソイドアグリコンおよび１６−デスメチルスピノシンＤ １７−プソイドアグリコンの製造方法を下述する。

土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）７Ｄ２３の凍結栄養増殖ストックを使用して、ＣＳＭ（ばね付き２５０ｍＬ三角フラスコ中でインキュベートされる５０ｍＬ）中に土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）７Ｄ２３の一次栄養増殖前培養物を接種した。栄養増殖培地（ばね付き２Ｌ三角フラスコ中でインキュベートされる２５０ｍＬ）中の二次前培養物を実施例８に記述されるとおり調製しかつインキュベートした。

０．０１％ｖ／ｖプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｌ−０１０１（ＢＡＳＦ）消泡剤の添加を伴い、４リットルの生産培地を実施例６でのとおり調製した。生産培地に５％ｖ／ｖで二次前培養物を接種し、そして７Ｌの攪拌されるバイオリアクター中、３０℃の温度で７〜１０日間醗酵させた。気流は０．７５ｖｖｍに設定し、また、溶解酸素圧を空気飽和の３０％もしくはそれより上に維持するために羽根車先端速度を０．６８と１．１ｍｓ^−１との間で制御した。

代謝物の同定のために、醗酵ブロスの１ｍＬアリコートを実施例５に記述されるところのＬＣ−ＭＳにより分析した。真正の標準品との比較により、スピノシンＦ、１６−デスメチルスピノシンＤおよびそれらの対応するプソイドアグリコンが存在したことが明らかであった（表１４）。

残存する醗酵ブロスを遠心分離により澄明にした。細胞を等容量のメタノールで２回抽出した。上清（３．２Ｌ）を酢酸エチル（２×１．５Ｌ）で抽出した。メタノールおよび酢酸エチル抽出液を合わせかつ溶媒を真空中で除去した。残余の油状物を酢酸エチル（１Ｌ）に溶解しかつ５０ｍＭ酒石酸（３×５００ｍＬ）で洗浄した。残存する酢酸エチル溶液を真空中で蒸発させた。生じる油状物をクロロホルム中５％メタノールで溶出するフラッシュシリカゲル（６×１３ｃｍ）でクロマトグラフィー分離した。１０ｍＬ容量の画分を収集した。プソイドアグリコンを含有する画分を合わせかつ溶媒を真空中で除去して褐色油状物を生じた。該褐色油状物をメタノール（１．５ｍＬ）に溶解しかつ実施例８に記述されるところの塩基不活性化逆相シリカゲルでクロマトグラフィー分離した。画分を３０秒ごとに収集し、そして関連産物を含有するものを合わせ、アセトニトリルを真空中で除去し、そしてＣ_１８−ボンドエリュート（ＢｏｎｄＥｌｕｔｅ）カートリッジ（２００ｍｇ）を使用してサンプルを濃縮した。サンプルは重力下に適用し、水（１０ｍＬ）で洗浄し、メタノール（２×１０ｍＬ）で溶出し、そして溶媒を真空中で除去した。

１６−デスメチルスピノシンＤ １７−プソイドアグリコン（化合物２２）は以下の特徴を有した：
単離された収量：３．３ｍｇ
分子量：５９０
分子式：Ｃ_３３Ｈ_５０Ｏ_９
ＵＶ（ＨＰＬＣ−ＭＳ分析の間のダイオードアレイ検出による）：２４０ｎｍ
電子スプレーＭＳ：［Ｍ＋Ｎａ］^＋のｍ／ｚ＝６１３．３
正確なＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］^＋のｍ／ｚ＝５９１．３５１７（５９１．３５２８を必要とする）。

表１５はＣＤＣｌ_３中での１６−デスメチルスピノシンＤ １７−プソイドアグリコンの^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルデータを要約する。

ｂ．スピノシンのモジュール３のＡＴの代わりにタイロシンＰＫＳの５ ＡＴモジュールを使用するハイブリッドスピノシンＰＫＳ
類似の方法で、モジュール３のメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインをタイロシンのモジュール５のエチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメイン（配列番号２６）により置換したハイブリッドスピノシンＰＫＳを生成した。該産生株は土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）３６Ｐ４と称した。エチルマロニル−ＣｏＡは土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）中で豊富であることが期待されず、従って、クロトニル−ＣｏＡ還元酵素をコードするＳ．シナモネンシス（Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）遺伝子をａｃｔＩプロモーターの制御下で同一細胞中で発現させた。これはエチルマロニル−ＣｏＡを提供し得る短鎖脂肪酸カルボキシラーゼの基質であるブチリル−ＣｏＡの細胞内貯留を有意に増大させるはずである。土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）３６Ｐ４のＰＫＳは、天然のｓｐｎＡプロモーター下のｓｐｎＡ、ｓｐｎＢおよび短縮型ｓｐｎＣ、次いでアプラマイシン耐性マーカーを包含するプラスミドＤＮＡを含有した。ａｃｔＩプロモーター下のＳ．シナモネンシス（Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）クロトニル−ＣｏＡ還元酵素およびａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４アクチベーターもまた該プラスミド配列内にあった。これにプリスチナマイシンに対する耐性のプロモーターの制御下のハイブリッドｓｐｎＣ（ｓｐｎＣ＊）遺伝子が続いた。当業者は、異種プロモーターが次々に交換（ｓｗａｐ ａｒｏｕｎｄ）し得ること、もしくは実際に多数の他のプロモーターを選ぶことができることを認識するであろう。

土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）３６Ｐ４株は、期待された１６−デスメチル−１６−エチルスピノシンＡおよびＤと矛盾しないＵＶ吸光度、クロマトグラフィー特性、質量およびフラグメンテーションパターンを有した少量成分を産生した。土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）３６Ｐ４からの主要産物はスピノシンＡおよびＤであった。驚くべきことに、株３６Ｐ４の優勢な新規醗酵産物は２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシンＡおよび６−エチルスピノシンＡであった。２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシンＡはスピノシンＤのレベルの１０％以内のレベルで産生された。これらの化合物を単離しかつＭＳおよびＮＭＲにより完全に特徴付けした。われわれは、それらが、クロトニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の導入に由来したエチルマロニル−ＣｏＡの細胞内濃度の増大により作成されたことを示唆する。負荷ＡＴおよびモジュール８のＡＴ双方の低特異性がこの新規基質を取り込ませた。６−エチル−２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシンＡもまた土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）３６Ｐ４により少量因子として作成された。これら３産物はそれぞれＣ１６にメチル基を有し、これはタイロシンのモジュール５のＡＴがこの系においてメチルマロニル−ＣｏＡを主に取り込んだことを意味する。従って、（天然のＡＴ３をもつ）工作されていないスピノシンＰＫＳがｃｃｒ遺伝子の存在下で２１−ｎ−プロピルおよび６−エチルスピノシン化合物を産生するであろうと期待される。
実施例２２ １６−デスメチル−１６−エチルスピノシンを産生するようにスピノシン生合成経路を工作するのに使用し得るベクターの構築
図１０を参照されたい。プラスミドｐＴＢ４は、タイロシンのモジュール４の大部分を包含するタイロシンＰＫＳのＢａｍＨＩフラグメントを含有するｐＵＣ１８に基づくプラスミドである。該挿入物は、寄託された配列ｔｙｌＧ．ｅｍｂｏ、受託番号Ｕ７８２８９のｂｐ２４１２５と２４１３０との間のＢａｍＨＩ部位（ＫＳ４の始めの）およびｂｐ３１５９７と３１６１２との間のＢａｍＨＩ部位（ＫＳ５の始めの）からである。

タイロシンのモジュール５のＡＴを鋳型ｐＴＢ４ならびにプライマーＡＫ１（配列番号２４）およびＡＫ２（配列番号２５）を使用するＰＣＲにより増幅した。プライマーＡＫ１はＡＴドメインの始めにＭｓｃＩ部位（配列番号２４のｂｐ３−８）を導入し、また、プライマーＡＫ２はＡＴドメインの終わりにＡｖｒＩＩ部位（配列番号２５のｂｐ３−８）を導入する。ＰＣＲ反応はＰｗｏ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用する標準的条件下で実施した。フラグメントをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、そしてＳｍａＩで消化しかつ脱リン酸化した商業的に入手可能なｐＵＣ１８にクローン化した。挿入物を含有するプラスミドを挿入物の向きについて分析しかつ配列決定した。正しい配列を含有する１プラスミドを同定しかつｐＡＬＫ１７と称した。それは、ポリリンカーのＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接してＭｓｃＩ部位を配置する向きでＰＣＲフラグメントを含有する。ｔｙｌ ＡＴ５をｐＡＬＫ１７からＭｓｃＩ／ＡｖｒＩＩフラグメントとして切り出し、そしてＭｓｃＩおよびＡｖｒＩＩで消化したｐＡＬＫ２６にクローン化してｐＡＬＫ２７を生じた。この構築物から欠けている４０７ｂｐのＭｓｃＩフラグメントをｐＡＬＫ２４（実施例１６）から切り出しそして脱リン酸化しＭｓｃＩ消化したｐＡＬＫ２７に連結した。該挿入物を正しい向きで含有する単一クローンをｐＡＬＫ３１と称した。ｐＡＬＫ３１は、開始コドンのＮｄｅＩ部位およびポリケチド合成酵素配列のすぐ下流のＸｂａＩ部位とともに、土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）のモジュール３へのｔｙｌ ＡＴ５の交換を導入するのに必要なフラグメントを含有する。このフラグメントをＮｄｅＩ／ＸｂａＩフラグメントとして切り出しそしてｐＡＬＫ２１にクローン化してｐＡＬＫ３６を生じた。これは、ａｃｔＩプロモーターからｃｃｒを共発現しそして接合により土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）中に伝達されかつアプラマイシン耐性について選択し得るベクター中で、Ｐ_ｐｔｒ下に新規モジュール３のハイブリッドフラグメントを配置する。
実施例２３ スピノシンのモジュール３のＡＴの代わりにタイロシンのモジュール５のＡＴを含んでなりかつ適切なエチルマロニル−ＣｏＡ補助基質を提供するハイブリッドポリケチド合成酵素をもつ土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）株の生成
図１２を参照されたい。土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）ＮＲＲＬ １８５３８をｐＡＬＫ３６で形質転換した。形質転換体をアプラマイシンに対する耐性について選択しかつサザンブロット分析によりスクリーニングした。単一の形質転換体を土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）３６Ｐ４株と称した。
実施例２４ 土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）３６Ｐ４からの化合物の製造および単離
土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）３６Ｐ４の凍結栄養増殖ストックをＣＳＭ（ばね付き２５０ｍＬ三角フラスコ中でインキュベートされる５０ｍＬ）中の土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）３６Ｐ４の一次栄養増殖前培養物に接種した。栄養増殖培地（ばね付き２Ｌ三角フラスコ中でインキュベートされる２５０ｍＬ）中の二次前培養物を実施例８に記述されるとおり調製しかつインキュベートした。

０．０１％ｖ／ｖのプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｌ−０１０１（ＢＡＳＦ）消泡剤の添加を伴い、１４リットルの生産培地を実施例６でのとおり調製した。生産培地に５％ｖ／ｖで二次前培養物を接種し、そして２０Ｌの攪拌されるバイオリアクター中、実施例８に記述された条件下で７〜１０日間醗酵させた。

代謝物の同定のため、醗酵ブロスの１ｍＬアリコートを実施例５に記述されるところのＬＣ−ＭＳにより分析した。真正の標準品、および土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）ＮＲＲＬ １８５３８株からの醗酵抽出物との比較により、新規スピノシン代謝物の存在が確かめられた（表１６）。主要新規成分はスピノシンＤと類似のしかし異なる保持時間で溶出し、そして同一の質量を有し；この化合物は下で２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシンＡと同定される。第二の有意の新規成分は後で溶出し、そしてスピノシンＤよりも１４単位より大きな質量を有し；この化合物は下で６−エチルスピノシンＡと同定される。第三の有意のピークはなおより後で溶出し、そしてスピノシンＤよりも２８単位より大きな質量を有し；この化合物は６−エチル−２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシンＡであると考えられる。これらの化合物の全部の質量スペクトルは［Ｍ＋Ｈ］^＋イオンおよびホロサミンフラグメントを表した。加えて数種の他の新規成分が明らかに存在したが、しかし少量で存在した。これらの新規化合物の１つは第一の主要新規成分の後に溶出し、そしてスピノシンＤと同一の質量を有し；この化合物はおそらく１６−デスメチル−１６−エチルスピノシンＡであった。他の少量の新規成分は、スピノシンＤより１４質量単位より大きい［Ｍ＋Ｈ］^＋イオンおよびホロサミンフラグメントと矛盾しない質量を表した。これらの新規少量成分の１つが１６−デスメチル−１６−エチルスピノシンＤであるかもしれない。

残存する醗酵ブロス（１２Ｌ）を遠心分離により澄明にしかつ実施例８に記述されるとおり抽出した。残渣をメタノール（１０ｍＬ）、水（２ｍＬ）およびギ酸（１００μｌ）に溶解した。全サンプルを濾過しかつ重力下でＣ_１８−ボンドエリュート（ＢｏｎｄＥｌｕｔｅ）ＳＰＥカートリッジ（７０ｇ、１５０ｍＬ）に適用した。その後、カートリッジを、フラッシュマスター（ＦｌａｓｈＭａｓｔｅｒ）パーソナル系（ジョーンズ クロマトグラフィー（Ｊｏｎｅｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、英国ウェールズ）を使用して０．１％のギ酸を含有する水中アセトニトリルの増大する１０％段階的勾配（各段階１００ｍＬ）で展開した。カラムは最後にメタノール（２×１００ｍＬ）で洗浄した。７４６ａｍｕもしくはそれ以上の質量をもつスピノシン様分子を含有する画分を合わせかつ溶媒を真空中で除去した。残余の油状物（３ｍＬ）をメタノール（１．５ｍＬ）に溶解した。このサンプルを最初に、２個の等部分で、実施例８に記述されるとおりクロマトグラフィー分離した。

６−エチルスピノシンＡおよび２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシンＤ（ｍ／ｚ＝７６０）を含有した最初の一対の分離からの画分を合わせかつ溶媒を真空中で除去した。残渣をメタノール（１ｍＬ）に溶解し、そして２１ｍＬ／分の流速で下述されるところの勾配で溶出する逆相シリカゲル（ハイパーシル（Ｈｙｐｅｒｓｉｌ）Ｃ_１８−ＢＤＳ、５μｍ；２１×２５０ｍｍ）でクロマトグラフィー分離した。
Ｔ＝０分、４０％Ｂ；Ｔ＝８０、５０％Ｂ。

画分を３０秒ごとに収集した。主として６−エチルスピノシンＡを含有する画分を合わせ、アセトニトリルを真空中で除去し、そしてＣ_１８−ボンドエリュート（ＢｏｎｄＥｌｕｔｅ）カートリッジ（２００ｍｇ）を使用してサンプルを濃縮し、水（１０ｍＬ）で洗浄しかつメタノール（２×１０ｍＬ）で溶出し、そして溶媒を真空中で除去した。主に２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシンＡ（ｍ／ｚ＝７４６）を含有した最初の一対の分離からの画分を合わせかつ溶媒を真空中で除去した。残渣をメタノール：水（７：３、１ｍＬ）に溶解し、そして２１ｍＬ／分で以下の勾配で溶出する同一カラムでクロマトグラフィー分離した。
Ｔ＝０分、４０％Ｂ；Ｔ＝４５、８０％Ｂ。

画分を３０秒ごとに収集した。２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシンＡのみを含有する画分を合わせた。スピノシンＤを含むこの化合物の混合物を含有するサンプルは別個に合わせ、溶媒を真空中で除去し、そして残渣を上述されたとおりもう１回クロマトグラフィー分離した。その後、２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシンＡのみを含有する画分を最初の実験からのものと合わせた。２化合物の混合物を含有する画分を合わせ、そしてもう１回のクロマトグラフィーを実施した。

２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシンＡをのみを含有した３回の実験からの画分を合わせ、アセトニトリルを真空中で除去し、そしてＣ_１８−ボンドエリュート（ＢｏｎｄＥｌｕｔｅ）カートリッジ（２００ｍｇ）を使用してサンプルを濃縮した。サンプルは重力下に適用し、水（１０ｍＬ）で洗浄し、メタノール（２×１０ｍＬ）で溶出しかつ溶媒を真空中で除去した。

６−エチルスピノシンＡ（化合物２４）は以下の特徴を有する。
単離された収量：４．８ｍｇ
分子量：７５９
分子式：Ｃ_４３Ｈ_６９ＮＯ_１０
ＵＶ（ＨＰＬＣ分析の間のダイオードアレイ検出による）：２４４ｎｍ
電子スプレーＭＳ：ＭＨ^＋のｍ／ｚ＝７６０．５；ｍ／ｚ＝１４２．４にホロサミンの糖フラグメントイオン。
正確なＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ：［ＭＮａ］^＋のｍ／ｚ＝７８２．４８１８（７８２．４８１４を必要とする）。

表１７はＣＤＣｌ_３中での６−エチルスピノシンＡの^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲ化学シフトデータを要約する。

化学シフトは７．２６ｐｐｍのＣＨＣｌ_３のプロトンに関係づけられる。

２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシンＤ（化合物２８）は以下の特徴を有する。
単離された収量：約１ｍｇ
分子量：７５９
分子式：Ｃ_４３Ｈ_６９ＮＯ_１０
この化合物は６−エチルスピノシンＡとの４：１の混合物中の少量成分として存在した。これら２化合物の積算ＵＶおよびＭＳデータは識別不可能である。ＮＭＲ法を使用して、混合物のＣＯＳＹスペクトル中で観察された相関から２１−ｎ−プロピルスピン系を割り当て可能であった。メチルＨ２４（δ_Ｈ０．８７、ｄｄ、７．３Ｈｚ、７．３Ｈｚ）はメチレンＨ２３（δ_Ｈ１．２３、ｍ）と相関した。Ｈ２３はメチレンＨ２２（δ_Ｈ１．４３、ｍ）と相関し、これは順にＨ２１（δ_Ｈ４．７３、ｍ）と相関した。Ｈ２１の共鳴は該混合物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトル中で孤立した多重項として見ることができた。

２１−デスエチル−２１−ｎ−プロピルスピノシンＡ（化合物２３）は以下の特徴を有する。
単離された収量：５．１ｍｇ
分子量：７４５
分子式：Ｃ_４２Ｈ_６７ＮＯ_１０
ＵＶ（ＨＰＬＣ分析の間のダイオードアレイ検出による）：２４４ｎｍ
電子スプレーＭＳ：ＭＨ^＋のｍ／ｚ＝７４６．５；ｍ／ｚ＝１４２．４にホロサミンの糖フラグメントイオン。

この化合物の積算ＮＭＲデータは、実施例１５でこの化合物について記述されたものに同一であった。

ｓｐｎ伸長体モジュール内の他のＡＴ（アシルトランスフェラーゼ）ドメインの置換により構築したハイブリッドＰＫＳ遺伝子を使用して、ポリケチド上の他の位置に変えられた側鎖をもつ新規スピノシンを製造し得る。例えば、上述されたものに類似の方法において、Ｃ１８もしくはＣ２０が水素以外の側鎖（一般にメチルもしくはエチル）をもつスピノシンを生じるハイブリッドポリケチド合成酵素を構築し得る。主としてメチルマロニル−ＣｏＡを取り込む天然のＡＴドメイン（ｓｐｎ ＡＴ３のような）は、優先的にマロニル−ＣｏＡ（ラパマイシンＡＴ２のような）もしくはエチルマロニル−ＣｏＡ（タイロシンＡＴ５のような）を取り込む異種ドメインにより置換し得る。しかしながら、当業者は、これらのハイブリッドポリケチド合成酵素のドナードメインもしくはモジュールが多様なＩ型ポリケチド合成酵素クラスターから獲得され得ること、ならびにこれはエリスロマイシン、アベルメクチン、ラパマイシンおよびタイロシンの生合成からのドメインもしくはモジュールにいかなる方法でも制限されないことを認識するであろう。

操作の組合せが生産的生合成経路および２個もしくはそれ以上の新規領域をもつスピノシンに至るはずであることもまた予期される。

付加的な生合成遺伝子が、エチルマロニル−ＣｏＡの供給を増大させるためにｃｃｒ遺伝子のような通常はスピノシンに取り込まれない前駆体の十分な供給を提供することを必要とするかもしれない。この遺伝子改変は、他のｓｐｎ ＡＴドメインで取り込まれる非天然の前駆体を提供することにより新規スピノシン類の産生にもまたつながり得る。他のｓｐｎ ＡＴドメインの置換は、Ｃ６のエチル基、またはＣ１８もしくはＣ２０のメチルもしくはエチル側鎖をもつスピノシン類の合成に至るハイブリッドＰＫＳ遺伝子を生成し得る。各β−ケト基の修飾の程度の原因であるｓｐｎ ＰＫＳドメイン（ＫＲ、ＤＨもしくはＥＲ）もまた、ハイブリッドＰＫＳ遺伝子を生成させるように異種ドメインにより置換されることができ、これは多様な飽和結合、ヒドロキシル基もしくは二重結合をもつスピノシン類をもたらす。

要約すれば、われわれは、本明細書で特許請求されるハイブリッドスピノシンＰＫＳ遺伝子が新規殺虫活性スピノシン類の製造に有用であることを示した。該ハイブリッド遺伝子は他のＩ型ＰＫＳ遺伝子の一部分もしくは複数の部分と組合せたｓｐｎ ＰＫＳ遺伝子由来である。第ＷＯ ９８／０１５４６号明細書“Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ポリケチドおよびそれらの合成）”に記述される戦略を使用して、ＤＮＡが一緒にスプライスされる部位を選択した。該ハイブリッド遺伝子は、アクチノロジンの生合成遺伝子ａｃｔＩ（その同族のアクチベーターをコードするａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４遺伝子と一緒に、第ＷＯ ９８／０１５４６号明細書を参照されたい）もしくはプリスチナマイシン耐性遺伝子ｐｔｒ（Ｂｌａｎｃら、１９９５）からのもののような異種プロモーターに作動可能に連結し得る。ハイブリッドＰＫＳ遺伝子は、生物学的に活性のスピノシンを産生するのに必要とされる非ＰＫＳ機能もまた含有する生物体中で発現される。本発明により提供される改変株を培養して、米国特許第５，３６２，６３４号明細書に開示されるもののような慣習的プロトコルを使用してスピノシン類を提供することができる。

本発明のハイブリッドスピノシンＰＫＳは土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）中でのみならずしかしまた他の宿主生物体、例えばサッカロポリスポラ エリトレア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）中でもまた発現させて殺虫活性スピノシン類を産生させ得ることが企図される。放線菌類の群、好ましくはストレプトミセス菌の群に属する他の原核生物細胞もまた適する宿主生物体である。ストレプトミセス アルブス（Ｓｔｒｅｏｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ）が特定の一例である。
新規スピノシンの有害生物防除活性
本明細書で特許請求される化合物は昆虫およびダニ類の防除に有用である。該化合物類の全部の異性体、ならびに該化合物類およびそれらの異性体のいかなる酸付加塩も包含される。他の修飾スピノシン類を製造するための米国特許第６，００１，９８１号明細書に記述される方法により作成される半合成誘導体もまた包含される。

該化合物は多数の昆虫およびダニに対する活性を示す。より具体的には、該化合物は、シロイチモジヨトウ、タバコガ、コドリンガおよびキャベッジルーパー（ｃａｂｂａｇｅ ｌｏｏｐｅｒ）のような鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）昆虫のメンバーに対する活性を示す。それらはまた鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）（カブトムシおよびゾウムシ）ならびに双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）（ハエ）のメンバーに対する活性も示す。該化合物はまた、カメムシ目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）（半翅類昆虫（ｔｒｕｅ ｂｕｇ））、ヨコバイ亜目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）（アブラムシおよび跳ぶ昆虫類（ｈｏｐｐｅｒ））、アザミウマ目（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）（アザミウマ）、バッタ目（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）（ゴキブリ）、ノミ目（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）（ノミ）、シロアリ目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）（シロアリ）のメンバー、ならびにハチ目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）のアリ科（Ｆｏｒｍｉｃｉｄａｅ）（アリ）のメンバーに対する活性も示す。該化合物はまた、クモ形類動物（Ａｒａｃｈｎｉｄ）のダニ目（Ａｃａｒｉｎａ）のメンバーであるナミハダニに対する活性も示す。

本発明のさらなる一局面は昆虫もしくはダニの阻害方法に向けられる。好ましい一態様において、本発明は有効な昆虫不活性化量の本発明の化合物を植物に適用することを含んでなる感受性昆虫の阻害方法に向けられる。特許請求される化合物は、これもまた本発明の一部である組成物の形態で適用される。これらの組成物は不活性担体中に昆虫もしくはダニを不活性化する量の化合物を含んでなる。有効成分は単一の特許請求される化合物、２種もしくはそれ以上の化合物の混合物、またはそれが産生される醗酵培地の乾燥部分と一緒の化合物のいずれかの混合物として存在してよい。組成物は、農業もしくは害虫防除の技術分野で慣習的であるがしかしかつ本発明の化合物の１種もしくはそれ以上の存在により新規かつ重要である手順および処方に従って製造する。組成物は、水中に分散される濃縮製剤であってよいか、または、さらなる処置を伴わずに使用される粉末、毒餌もしくは顆粒状製剤の形態にあってよい。

本発明の組成物の作用は、他の、例えば殺虫性、ダニ駆除性および／もしくは殺線虫性の有効成分を添加することによりかなり広げることができる。例えば、以下の化合物すなわち有機リン化合物、カルバメート、ピレスロイド、アシル尿素、他の型の昆虫成長調節剤および昆虫ホルモン類似物、ネオニコチノイドおよび他のニコチン酸、マクロライドならびに他の殺虫性、ダニ駆除性、殺陸貝性および殺線虫性の化合物もしくは有効成分の１種もしくはそれ以上を本発明の化合物と適して組合せ得る。“Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ（相乗的殺虫剤混合物）”に関する第ＷＯ ００／５６１５６号明細書は、動物性害虫を防除するためのニコチン性アセチルコリン受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストと組合せのある種の以前に既知のスピノシン化合物の使用を開示する。”Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ（有効成分の組合せ剤）“に関する第ＷＯ ００／３５２８２号明細書は殺真菌活性化合物と組合せのスピノサッドの使用を開示する。”Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ（有効成分の組合せ剤）“に関する第ＷＯ ００／３５２８６号明細書は動物性害虫および真菌を防除するための他の化合物とのスピノサッドの組合せ剤の使用を開示する。“Ｕｓｅ ｏｆ Ｓｐｉｎｏｓｙｎｓ ａｓ Ｓｏｉｌ Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓ（土壌殺虫剤としてのスピノシンの使用）”に関する第ＷＯ ９９／６０８５６号明細書は土壌を介してのもしくは昆虫を防除するための灌漑による種子の処理および植物への適用のためのある種の以前に既知のスピノシンの使用を開示する。”Ｕｓｅ ｏｆ Ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ ｉｎ Ｐｅｓｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ（害虫防除におけるマクロライドの使用）“に関する第ＷＯ ９９／３３３４３号明細書はトランスジェニック作物における害虫防除のためのスピノシンの使用、害虫による攻撃から後に形成される植物繁殖物質および植物器官を保護するためのスピノシンの使用、ならびに木材害虫および軟体動物を防除するためのスピノシンの使用を開示する。式Ｉの化合物はこれらの目的上もまた使用し得る。

本発明の化合物は節足動物、すなわち、動物に対する害虫である、多様なハエおよびハエ幼虫、ノミ、シラミ、ダニ（ｍｉｔｅ）およびダニ（ｔｉｃｋ）を包含する昆虫およびクモ形類動物を防除するための動物の処置にもまた有用である。外寄生虫駆除剤の送達技術は当業者に公知である。一般に、本化合物はスプレー、ディップもしくは粉末により動物の外表面に適用する。該化合物はまたイヤータグ（米国特許第４，２６５，８７６号明細書に開示される送達方法）を使用しても動物に送達し得る。

なお別の態様において、該化合物は蓄牛および他の動物の糞便中の害虫である昆虫およびクモ形類動物を防除するのに使用し得る。本態様において、該化合物は経口で投与され、そして該化合物は消化管を通って移動しかつ糞便中に出現する。糞便中の害虫の防除は動物を該害虫から間接的に保護する。

本発明の化合物は寄生虫例えばシラミを防除するためのヒト医薬としてもまた有用である。該化合物は例えば第ＷＯ ００／０１３４７号明細書に開示されるシラミ防除のための製剤で使用し得る。
実施例２５ 新規の精製されたスピノシンが殺虫性であることの立証
本発明の化合物の生物学的活性は、実験室で飼育した幼虫（平均重量２２ｍｇ）に幼虫あたり１μｇの率で該化合物を適用した局所アッセイにより示された。各化合物を、６匹のタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）幼虫および６匹のシロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）幼虫の背部に沿ってアセトン溶液（１ｍｇ／ｍＬ）で適用した。処置した幼虫はその後、６ウェルプラスチック培養プレート中２１℃、６０％ＲＨで２日間維持した。幼虫にはそれぞれ２日の曝露後間隔の間、養育のため１ｃｍ^３のアガー基材の鱗翅類の餌を供給した。２日の期間の終了時に死亡率パーセントを決定した（表１８）。

式（Ｉ）の化合物は、それもまた殺虫活性を有することが期待される半合成のスピノシン類似物を製造するための米国特許第６，００１，９８１号明細書に開示される方法において中間体として使用し得る。

ｐＣＪＲ８１の構築を示す。 土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）の遺伝子の発現に使用したベクターｐＬＳＢ２およびｐＬＳＢ３の構築を示す。 スピノシン経路にｅｒｙ ｌｏａｄを導入するためのベクターｐＬＳＢ６２の構築を示す。 土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）１３Ｅのハイブリッドｅｒｙ／ｓｐｎ ＰＫＳ経路を示す。 スピノシン経路にａｖｅ ｌｏａｄを導入するためのベクターｐＬＳＢ２９の構築を示す。 土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）２１Ｋ２のハイブリッドａｖｅ／ｓｐｎ ＰＫＳ経路を示す。 モジュール３のＡＴ交換プラスミドを生成させるのに使用した中間体プラスミドｐＡＬＫ２６の構築を示す。 スピノシンのモジュール３にｒａｐＡＴ２を導入するのに使用したベクターｐＡＬＫ３９の構築を示す。 土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）中でＳ．シナモネンシス（Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）のクロトニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子を発現させるよう設計したベクターｐＡＬＫ２１の構築を示す。 スピノシンのモジュール３にｔｙｌＡＴ５を導入するのに使用したベクターｐＡＬＫ３６の構築を示す。 土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）７Ｄ２３株のハイブリッドＰＫＳ経路を示す。 土壌放線菌（Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ）３６Ｐ４株のハイブリッドＰＫＳ経路を示す。

［配列の簡単な説明］
配列番号１はオリゴＰＲＩＳ１である。
配列番号２はオリゴＰＲＩＳ２である。
配列番号３はプリスチナマイシンに対する耐性のプロモーターのＤＮＡ配列である。
配列番号４はオリゴＣＲ３１１である。
配列番号５はオリゴＣＲ３１２である。
配列番号６はオリゴＳＰ２８である。
配列番号７はオリゴＳＰ２９である。
配列番号８は、ｂｐ１−６およびｂｐ１６８０−１６８５に導入された制限酵素部位を伴う、クローニングに使用したｅｒｙ ＰＫＳ負荷モジュールをコードするＤＮＡのフラグメントである。
配列番号９はオリゴＳＰ１４である。
配列番号１０はオリゴＳＰ１５である。
配列番号１１は、ｂｐ１−６およびｂｐ１６８９−１６９４に導入された制限酵素部位を伴う、クローニングに使用したａｖｅ ＰＫＳ負荷モジュールをコードするＤＮＡのフラグメントである。
配列番号１２はオリゴＣＲ３２２である。
配列番号１３はオリゴＣＲ３２３である。
配列番号１４はオリゴＣＲ３２４である。
配列番号１５はオリゴＣＲ３２５である。
配列番号１６はオリゴＣＲ３２８である。
配列番号１７はオリゴＣＲ３２９である。
配列番号１８はオリゴＣＲ３３０である。
配列番号１９はオリゴＣＲ３２１である。
配列番号２０は、ｂｐ１−６およびｂｐ８３２−８３７に導入された制限酵素部位を伴う、クローニングに使用したｒａｐ ＡＴ２をコードするＤＮＡのフラグメントである。
配列番号２１はオリゴＣＣＲＭＯＮＦである。
配列番号２２はオリゴＣＣＲＭＯＮＲである。
配列番号２３は、ｂｐ１−６およびｂｐ１３８９−１３９４に導入された制限部位を伴う、ストレプトミセス シナモネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）のクロトニル−ＣｏＡ還元酵素の発現に使用したＤＮＡ配列である。
配列番号２４はオリゴＡＫ１である。
配列番号２５はオリゴＡＫ２である。
配列番号２６は、ｂｐ１−６およびｂｐ９６７−９７２に導入された制限酵素部位を伴う、クローニングに使用したｔｙｌ ＡＴ５をコードするＤＮＡのフラグメントである。

配列表

Claims (4)

1. 複数の土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）伸長モジュールと作動可能に会合されており配列番号８および配列番号１１からなる群から選択される核酸配列によってコードされている異種負荷モジュールを含んでなる、生物学的に活性のスピノシンを産生するように土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）中で機能することが可能であるハイブリッドスピノシンポリケチド合成酵素をコードするポリヌクレオチド。
2. 配列番号８の負荷モジュールをコードする核酸配列を含んでなる、請求項１記載のハイブリッドスピノシンポリケチド合成酵素をコードするポリヌクレオチド。
3. 配列番号１１の負荷モジュールをコードする核酸配列を含んでなる、請求項１記載のハイブリッドスピノシンポリケチド合成酵素をコードするポリヌクレオチド。
4. ＮＲＲＬ ３０５３９、
   ＮＲＲＬ ３０５４０、
   ＮＲＲＬ ３０５４１、および
   ＮＲＲＬ ３０５４２
   から選択される土壌放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）の生物学的に純粋な培養物。

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