KR20010021933A - 신규한 폴리케타이드의 제조방법 - Google Patents

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KR20010021933A
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Abstract

숙주세포 또는 무세포 추출물 중에서 효율적인 시스템으로 신규한 폴리케타이드를 생산하는 변형된 PKS 유전자 클러스터가 설명된다. 이 신규한 폴리케타이드는 보통, 변형된 PKS 클러스터에 의해 프로세싱된 화학식 (1) 또는 (2)의 디케타이드를 인코포레이션함으로써 얻어진다.
화학식 1
또는
화학식 2
식 중, A는 디케타이드를 활성화하는 부분이고, R1과 R2중 적어도 한가지는 디케타이드에서 자연적으로 발생하는 것 이외의 치환기임
또한 폴리케타이드 글리코실화시켜 항생제를 얻을 수도 있다.

Description

신규한 폴리케타이드의 제조방법{METHOD TO PRODUCE NOVEL POLYKETIDES}
연방 후원 연구하에 진행된 발명에 대한 권리 진술
본 발명은 국가보건기구 (National Institutes of Health)로부터 미국 정부 지원하에 이루어졌다 (GM22172 및 CA66736-01). 미 정부는 본 발명에 대해 일정 지분을 갖는다.
모듈 폴리케타이드 합성은 광범위 항생제 에리쓰로마이신의 부모 마크로락톤인 β-데옥시에리쓰로놀라이드 B (6-dEB)를 생산하는 데옥시에리쓰로놀라이드 B 신쎄이즈 (DEBS: deoxyerythronolide B synthase)의 조직화에 의해 대표된다. DEBS는 각각 약 10개의 서로 다른 활성부위를 함유하는 세개의 큰 폴리펩타이드로 이루어진다. 도 1은 세개의 유전자인 eryAI, eryAII 및 eryAIII에 의해 코딩되는 세가지 DEBS 모듈의 특성을 다이아그램으로 나타낸 도면이다.
신규한 폴리케타이드를 생산하기 위해 유전적으로 PKS를 조작하기 위한 여러가지 전략이 제시되어 왔다. 새로운 폴리케타이드는 모듈 결실을 통해 생산되어 왔다 (Kao, C.M. 외, J. Am. CHem. Soc. (1995) 117:9105-9106; Kao, C.M. 외, J. Am. Chem. Soc. (1996) 118-9184-9185). 신규한 폴리케타이드를 제공하기 위해 보고된 또 다른 방법은 또한 환원 대역중에서의 기능 돌연변이의 손실 (Donadio, S. 외, Science (1991) 252: 675-679; Donadio, S. 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:7119-7123; Bedford, D. 외, Chem. Biol. (1996) 3:827-831)과 스타터 또는 익스텐더 유닛 특이성을 변경시키기 위한 아실 트래ㅌ스퍼라제 영역의 치환 (Oliynyk, M. 외, Chem. Biol. (1996) 3:833-839; Kuhstoss, S. 외, Gene (1996) 183:231-236), 및 기존의 모듈 내에 새로운 촉매활성을 도입하기 위해 기능 돌연변이를 획득시키는 방법이 보고된 바 있다 (McDanie, R. 외, J. Am. Chem. Soc. (1997) 인쇄중). 이러한 보고내용에서는, 폴리케타이드 경로 중의 다운스트림 효소가 비-자연적인 중간체로 프로세싱되는 것으로 나타났다. 그러나, 신규 폴리펩타이드를 생산하는 이들 방법은 클로닝 및 DNA 서열결정에 많은 투자가 요구되고, 이용가능한 시스템이, 유전자 치환 기술이 개발된 프로듀서 생명체, 대사적으로 접근가능한 CoA 티오에스테르로부터만 유도될 수 있는 프라이머 및 익스텐더 유닛으로 한정되며, 오직 한정된 조촉매적 기능만이 사용가능하다는 단점을 갖는다.
특히 DEBS 시스템은 아세틸 및 부티릴-CoA (Wiesmann, KEH 외, Chem. Biol. (1995) 2:583-589; Pieper, R. 외, J. Am. Chem. Soc. (1995) 117:11373-11374)와 그의 대응 디케타이드의 N-아세틸시스테아민 (NAC)티오에스테르 (Pieper, R. 외, Nature (1995) 378:263-266)와 같은 비-자연적인 프라이머 유닛도 받아들이는 것으로 나타났다. 그러나, 이러한 비자연적인 기질을 이용할 수 있다 해도, 천연의 스타터 유닛으로부터의 경쟁은 수율을 심각하게 저하시켰다. 설사 스타터 유닛이 인공적으로 공급되지 않는다 해도, 이들은 DEBS 시스템에 의해 사용되는 메틸말로닐 익스텐더 유닛의 탈카르복실화로부터 고유하게 생산될 수 있다 (Pieper, R. 외, Biochemistry (1996) 35:2054-2060; Pieper, R. 외, Biochemistry (1997) 36:1846-1851).
따라서, 천연의 스타터 유닛을 사용할 수 없는 모듈 폴리케타이드 합성 시스템의 돌연변이 형태를 제공하는 것이 유리할 것이다. 이러한 시스템은 NAC 티오에스테르 또는 다른 적절한 티오에스테르로서 적절한 디케타이드를 공급함으로써 신규한 폴리케타이드를 유도할 수 있다. 돌연변이는 과거 천연물질로부터 경쟁을 제거하기 위해 수행되었다 (Daum. S.J. 외, Ann. Rev. Microbiol. (1979) 33:241-265). 아버멕틴을 생산하는 유기체의 무작위적으로 생산된 돌연변이 균주를 이용하여 신규한 아버멕틴 유도체가 합성된 바 있다 (Dutton, C.J> 외, Tetrahedron Letters (1994) 35:327-330; Dutton, C.J. 외, J. Antibiot. (1991) 44:357-365). 이 전략은 그러나 돌연변이와 기질의 인코포레이션 두가지 모두에서 비효율적이기 때문에 일반적으로 적용할 수는 없다.
따라서, 천연 산물의 경쟁적인 생산을 억제함으로써 신규한 폴리케타이드를 제공하가 위한 보다 효율적인 시스템이 필요한 실정이다.
본 발명은 천연의 제 1 모듈 개시자 유닛 (first module starter unit)은 이용하지 못하는 변형된 모듈 폴리케타이드 신쎄이즈 (PKS: polyketides synthases)를 이용하여 신규한 폴리케타이드를 합성하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 DEBS 모듈 PKS를 도식적으로 나타낸 도면이다.
도 2A ~ 2C는 모듈 1 중의 케토신쎄이즈 (KS)가 해제된 변형된 DEBS 구축물의 생산을 나타낸 도면이다.
도 3은 6-dEB 유도체로부터 에리쓰로마이신-D 유도체로의 프로세싱을 나타낸 도면이다.
발명을 수행하기 위한 방식
본 발명은 천연 출발물질의 로딩기능이 해제된 모듈 PKS 시스템 및 그의 대응 유전자를 제공한다. 특히 바람직한 구체예에서, 모듈 I의 케토신쎄이즈 (KS: ketosynthase)를 불활성화시켜 천연 스타터 유닛으로부터의 경쟁을 방지한다. PKS를 해제시키는 이와 유사한 또 다른 접근방식은 모듈 I의 아실 트랜스퍼라제 (AT) 또는 아릴 담체 단백질 (ACP: aryl carrier protein)을 불활성화시키는 것을 포함한다.
본 발명의 PKS는 2개 이상의 모듈을 함유하여야 하나, 부가적인 모듈을 함유할 수 있으며, 실제로, 완전한 신쎄이즈 시스템을 나타낸다. 비록 DEBS PKS 시스템을 사용하여 본 발명을 설명하지만, 아버멕틴, 라파마이신 등을 생성시키는 모듈 PKS와 같은 다른 모듈 PKS도 이용가능하다. 공지의 부위 특이적인 돌연변이 기술을 이용하여 적절한 돌연변이체를 도입할 수 있다.
효모 및 세균과 같은 기타 미생물도 이용가능하다. 세균, 효모, 또는 심지어 일반적으로는 폴리케타이드를 생산하지 않는 포유류 세포나 곤충세포와 같은 숙주 세포를 사용할 경우, PKS 효소의 후번역 프로세싱을 제공하도록 숙주를 변형시키는 것이 필요할 수 있다. 특히, 기능적이기 위해서는, ACP 활성을 포스포판테테이닐화(phosphopantetheinylation)되어야 한다. 아포-ACP로부터 그의 활성형으로의 이러한 변환은 집합적으로 홀로-ACP 신쎄이즈 또는 PTTase라고 칭해지는 효소들에 의해 수행된다. 지방산 신쎄이즈 경로에서 기능하는 이러한 효소들의 형태는 PKS 클러스터에서 홀로-ACP 기능을 제공하는데 효과적이지 않은 것으로 나타났다. 따라서, 예컨대 스트렙토마이세스 이외의 전세포에서 폴리케타이드 합성이 수행되는 경우, 적절합 신쎄이즈를 재조합 시스템내로 도입하여야만 한다. 만약 무세포 시스템에서 합성이 수행되면, 홀로-ACP 신쎄이즈가 존재하는 조건 하에서, 사용된 PKS 효소가 이용되었어야만 한다.
따라서 스트렙토마이세스 숙주, 특히 그 자신의 PKC가 결실되도록 변형된 스트렙토마이세스 숙주, 또는 필요한 경우 적절한 PTTase를 생산하도록 변형된 다른 세포들과 같은 적당한 숙주중에서 신규한 폴리케타이드를 합성할 수 있다. 대응 PKS 단백질을 재조합적으로 생산하고 이들을 분비시키거나 또는 이들을 함유하는 세포를 용해시키는 방식에 의해 무세포 시스템을 이용하여 폴리케타이를 합성할 수도 있다. 전형적인 무세포 시스템은 적절한 기능성 PKS, NADPH 및 적절한 완충액과 폴리케타이드의 촉매적 합성에 필요한 기질을 포함할 것이다. 익스텐더 유닛의 신규한 폴리케타이드 티오에스테르를 생산하기 위해디케타이드의 티오에스테르가 함께 사용된다.
변형된 PKS 클러스터의 결과로서 생산된 신규한 폴리케타이드는 마감된 폴리케타이드 중의 스타터 유닛의 잔기에 대응하는 치환기가 서로 다를 것이다. 또한, 디케타이드 중간체가 변형된 PKS 클러스터에 공급되기 때문에, 스타터 유닛에 바로 인접하여 삽입된 익스텐더 유닛의 특성 역시 변할 수 있다. 따라서, 본 발명의 신규한 폴리케타이드를 제조하는데 사용된 디케타이드는 다음 화학식을 갖는다.
또는
식 중, A는 디케타이드를 활성화시키는 부분으로서, 전형적으로는 후술하는 N-아세틸 시스테아민 티오에스테르와 같은 설프히드릴이고, R1과 R2중 적어도 하나는 변형된 PKS 클러스터에 의해 정상적으로 프로세싱된 디케타이드에서 자연적으로 발생되지 않는 치환기이다. 일반적으로 R1은 치환, 또는 비치환된, 포화 또는 불포화 히드로카르빌 부분 (1-15C)으로서, 특히 N, O 또는 S와 같은 하나 또는 두개의 이종원자를 임의로 함유하는 상기 히드로카르빌은 치환 또는 비치환된 포화 또는 불포화 히드로카르빌 부분 (1-4C)이거나 또는 OR, SR, 또는 NHR이고 여기서 R은 치환, 또는 비치환의 포화 또는 불포화 1-4C 히드로카르빌이다. 그러나, R1과 R2는 두가지 모두 메틸일 수 없고, 만약 R2가 메틸이면, R1은 에틸일 수 없다.
전형적인 치환기에는 할로, OR3, SR3, NR2, -OOCR3, -NHOCR3, R3CO-, R3COO- 및 R3CONH- (여기서 R3는 독립적으로 H 또는 저급 알킬 (4-4C)임)가 포함된다.
본 발명은 또한 상기 화학식 (1) 또는 (2)의 디케타이드를 인코포레이션함으로써 초래된 폴리케타이드 및 그의 글리코실화 형태에 관한 것이기도 하다.
다음의 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 본 발명이 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 직접적인 변형으로 인해 시스템이 그의 자연적인 출발물질을 이용하지 못하게 만드는, 변형된 모듈 폴리케타이드 신쎄이즈 시스템을 이용하여 신규한 폴리케타이드를 제공하는 방법에 관한 것이다. 이어서 스타터 모듈을 무효화하고 다양한 적절한 디케타이드 기질을 공급함으로써 신규한 폴리케타이드를 합성할 수 있다.
따라서, 한가지 측면에서, 본 발명은 자연적인 스타터 유닛을 이용할 수 없도록 변형된 모듈 PKS에 의해 기질이 산물 폴리케타이드로 변환되는 조건 하에서, 적어도 2개의 모듈을 함유하는 상기 모듈 PKS에 티오에스테르 디케타이드 기질을 공급하는 것을 포함하는 신규한 폴리케타이드의 제조방법에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 발명은 초기의 2 탄소 유닛을 공급하는 천연 스타터 기질의 이용이 해제된 변형된 모듈 PKS, 및 이러한 해제된 PKS를 함유하도록 변형된 적절한 세포에 지향된 것이다. 본 발명은 또한 변형된 PKS의 생산을 위한 재조합 물질과 이 시스템에 의해 생산된 신규한 폴리케타이드에 관한 것이다.
제조예 A
출발물질
천연의 PKS 유전자 클러스터가 제거되도록 조작된 스트렙토마이세스 코엘리컬러 (Streptomyces coelicolor CH999)를 WO95/08548에 설명된 바와 같이 구축한다. 상기 공개문헌에는 CH999 중에서 PKS 유전자를 발현하는데 사용되는 셔틀 플라스미드인 pRM5도 설명되어 있다. DEBS 모듈 시스템 전체를 함유하는 플라스미드 pCK7은 이하에서도 설명한다.
실시예 1
DEBS 1+2+TE의 제조
DEBS 1+2+TE라 명명된, 모듈 1과 2 및 티오에스터라제 (TE) 활성만을 함유하는 변형된 DEBS PKS 시스템을 부위 지향된 돌연변이 처리하여 시그너춰 서열 cys-ser-ser-ser-leu 중의 시스테인 잔기를 알라닌으로 치환함으로써 모듈 1 ㅏㄴ 를 불활성화시켰다. pKAO179라 명명된 얻어진 발현 플라스미드는 천연산물, 즉, 프로피오닐-CoA, 메틸말로닐-CoA 및 NADPH을 합성하기 위한 표준 반응 조건 하에서 불활성인 2-모듈 PKS를 코딩한다. 이 구축물의 상세사항은 Kao, C.M.외, Biochemistry (1996) 35:12363-12368에 제시되어 있다. 디케타이드 티오에스테르 (2S, 3R)-2-메틸-3-히드록시-펜타노일-N-아세틸시스테아민 티오에스테르, 및 메틸말로닐-CoA, 및 NADPH가 제공되는 경우, 후술하는 트리케타이드 생성물이 얻어진다.
트리케타이드 생성물은 PKS가 무세포 시스템 중에서 인큐베이션되거나 또는 변형된 발현 플라스미드를 함유하는 CH99의 활발하게 성장하는 배양체와 유사한 적절한 티오케타이드 티오에스테르를 제공함으로써 생체내에서 복제될 수 있을 때 생성된다.
SMM 배지 (5% PEG-800, 0.06% MgSO4, 0.2% (NH4)2SO4, 25mM TES, pH 7.02, 25mM KH2PO4, 1.6% 글루코스, 0.5% 카사미노산, 미량원소) 200ml에 포자를 접종함으로써 S. coelicolor CH999/pKAO179의 배양체를 수립한다. 이 배양체를 325 rpm에서 진탕시키면서 30℃에서 인큐베이션시킨다. 메틸설폭사이드 1ml 중 (2S, 3R)-2-메틸-3-히드록시펜타노일 N-아세틸시스테아민 티오에스테르 (100 mg) 및 4-펜티노인 (15mg)의 용액을 상기 배양체에 3회에 걸쳐 첨가한다: 즉, 50시간 후 (400 ml); 62시간 후 (300ml); 및 86 시간 후 (300ml). 총 144시간 후, 배양체를 원심분리하여 균사를 얻는다. 발효 브로쓰를 NaCl로 포화시킨 다음 에틸 아세테이트로 추출한다 (5x100ml). 결합된 유기 추출물을 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 다음 농축시켰다. 실리카겔 크로마토그래피 처리하여 (2R,3S,4S,5R)-2,4-디메틸-3,5-디히드록시-n-헵타노인산-δ-락톤을 얻었다.
실시예 2
DEBS 클러스터로부터 폴리케타이드의 제조
actI 프로모터 조절 하에 ery AI, ery AII (DEBS 2) 및 eryAIII (DEBS 3 유전자)를 함유하는 플라스미드 pCK7에 eryAI (DEBS 1 유전자)의 활성부위 변이된 모듈 1KS 영역을 제공한다. 이 플라스미드 pJRJ2로부터의 발현에 의해 적절히 변형된 완전한 길이의 PKS 시스템이 얻어진다 (Kao, C.M.외, Science (1994) 265:409-512). pJRJ2를 CH999로 형질전환시키고 R2YE 배지에서 생육시켰다. 검색가능한 6DEB-유사 산물은 발생하지 않았다.
보다 구체적으로, 0.3 mg/ml 소듐 프로피오네이트를 함유하는 R2YE 한천 플레이트 상에서 30℃에서 CH999/pJRJ2 로온 (lawns)을 배양하였다. 3일 후, 각각의 한천 플레이트에 9:1 물:DMSO 중 20mM 기질 용액 1.5mL를 오버레이하였다. 다시 4일 후, 한천 배지 (300ml)를 균질화하고 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 용매를 황산 마그네슘을 이용하여 건조 및 농축시켰다. 농축된 추출물을 실리카 겔 크로마토그래피 (헥산 중 에틸 아세테이트 구배)에 의해 정제하여 생성물을 얻었다.
그러나, 도 2에 도시한 (천연 디케타이드의 NAC 티오에스테르) Cane 외, J. Am. Chem. Soc. (1993) 115:522-526; Cane, D.E.외, J. Antibiot. (1995) 48:647-651의 방법으로 제조한 기질 2를 시스템에 첨가하자, 정상적인 생성물인 6 DEB가 대량으로 생산되었다. 100 mg의 기질 2를 상기한 바와 같은 페트리 플레이트 상에 배양된 소규모 배양체 (300ml)에 투여하자, 30mg의 6 dEB가 생산되었다. 18% 수율.
실시예 3
신규한 폴리케타이드의 제조
도 2A에 화학식 3, 4, 및 5로 표시된 구조를 갖는 디케타이드들을 실시예 2의 조건 하에서 CH999/pJRJ2의 배양배지에 투여하였다. 알돌 반응에서 프로피온알데하이드를 각각 발레랄데하이드와 페닐아세트알데하이드로 대체한 것을 제외하고 기질 2에 대해 설명된 바와 같이 기질 3과 4를 제조하였다. 기질 5의 제조는 Yue, S. 등 J. Am. Chem. Soc. (1987) 109:1253-1255에 설명되어 있다. 기질 3 및 4는 각각 55mg/L의 생성물 6과 22mg/L의 생성물 7을 제공하였다. 기질 5는 예기치않은 생성물인 16원 락톤 8을 25 mg/L 생산하였다.
실시예 4
부가적인 신규한 폴리케타이드
실시예 2의 조건 하에서 CH999/pJRJ2의 배양체에 도 2B 및 2C에서 화합물 9-18로 표시된 디케타이드들을 투여하였다. 생성물은 도 2B 및 2C에서 화합물 19-28로 표시된 것들이다.
실시예 5
입체적 요구성
화합물 2를 도 2A에 나타낸 화학식 2의 구조를 갖는 3가지 부분입체이성체 형태로 대체한 것을 제외하고 실시예 2에 제시된 것과 동일한 시스템을 이용하자, 각각의 경우의 폴리케타이드의 합성이 검색되지 않았다. 마찬가지로, 2-위치에서 화합물 12를 그의 에난시오머로 대체하자, 폴리케타이드 합성이 검색되지 않았다.
실시예 6
폴리케타이드 생성물의 프로세싱
DEBS의 "다운스트림" 모듈에 의한 비자연적인 중간체의 성공적인 프로세싱은 에리쓰로마이신 생합성 경로 중 후-PKS 효소 역시 비자연적인 기질을 허용할 것인지 아닌지를 결정하는 실험을 촉발시켰다. 자연적인 프로듀서 유기체인 사카로폴리스포라 에리쓰레아 (Saccharopolyspora erythrea)에 있어서, 6dEB는 몇가지 효소-촉매된 형질전환을 수행한다. C6에서의 산화 및 C3과 C5에서의 글리코실화는 에리쓰로마이신 D (도 3의 화학식 9)를 제공하고 후속적인 형질전환은 에리쓰로마이신 A, B, 및 C를 제공한다. S. erythrea 변이주 (A34)(Weber, J.M. 외, J. Bactiol. (1985) 164:425-433)는 6dEB를 합성할 수 없다. 이 균주는 R2YE 플레이트상에서 배양시 에리쓰로마이신을 생산하지 않는다 (에리쓰로마이신-감수성 박테리아 Bacillus cereus의 성장을 억제하는 추출물의 능력에 의해 판단되는 바와 같음). 그러나, 6dEB (이것은 항균 활성을 갖지 않음)를 배지에 첨가하자, 추출물이 강력항 항균활성을 나타내었다.
이 균주에 의한 변환에 대해 6dEB 유도체 6 및 7의 샘플을 분석하였다. 부분적으로 정제된 추출물들은 B. cereus 성장을 입증하였으며, 도 3의 화학식 10 (6으로부터)과 화학식 11 (7로부터)으로서 추출물의 주요 성분을 동정하는데 질량 분광광도계를 이용하였다.
보다 구체적으로, 정제된 6과 7 (50% 수성 에탄올 7.5 ml에 용해된 5mg)을 R2YE 플레이트 (200mL 매질/실험) 상에 놓고 건조시켰다. 이어서 S. erythrea A34를 가하여 로온을 형성하였다. 배양 7일 후, 배지를 균질화시키고 98.5:1.5 에틸 아세테이트:트리에틸아민으로 3회 추출하였다. 각각의 실험으로부터 수집된 추출물을 황산마그네슘을 이용하여 건조시킨 다음 농축하였다. 추출물을 실리카겔 크로마토그래피 (클로로포름 중 메탄올과 트리에틸아민 구배)에 의해 부분적으로 정제하였다. 부분적으로 정제된 추출물을 TLC 및 질량 분광광도계에 의해 시험하였다. 항균 활성 분석을 위해, 필터 디스크를 에리쓰로마이신 D, 10과 11 및 6-dEB 동족체 첨가 없이 배양된 S. erythrea A34로부터의 농축 추출물의 400μM 에탄올 용액에 침지시켰다. 디스크를 건조시키고 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)의 갓 플레이팅시킨 로온 상에 깔았다. 37℃에서 12시간 인큐베이션시킨 후, 대조군 추출물을 제외하고 모든 화합물에 있어서 세균 성장이 명백히 억제되었다.

Claims (13)

  1. 적어도 2개의 모듈을 함유하는 변형된 기능성 모듈 폴리케타이드 신쎄이즈 (PKS)로서, 상기 PKS는 상기 모듈 PKS에 대한 천연의 스타터 유닛을 이용하지 못하도록 변형된 것이고, 모듈 1의 케토신쎄이즈 (KS) 촉매 대역이 불활성화된 것이 특징인 변형된 기능성 모듈 폴리케타이드 신쎄이즈.
  2. 제 1항에 있어서 완전한 PKS인 변형된 PKS.
  3. 변형된 PKS를 코딩하는 PKS 유전자 클러스터로서 상기 변형된 PKS가 상기 모듈 PKS에 대한 천연의 스타터 유닛을 이용하지 못하도록 변형된 것이고, 모듈 1의 케토신쎄이즈 (KS) 촉매 대역이 불활성화된 것이 특징인 PKS 유전자 클러스터.
  4. 제 3항에 있어서, 완전한 PKS를 코딩하는 유전자 클러스터.
  5. 제 3항에 따른 유전자 클러스터를 함유하고 생성된 PKS의 ACP 대역을 포스포판테테이닐화시키는데 효과적인 홀로-ACP 신쎄이즈의 생성을 위한 재조합 발현 시스템을 임의로 포함하는 것이 특징인 재조합 숙주 세포.
  6. 제 1항에 따른 변형된 PKS에 대한 티오에스테르 디케타이드 기질을 제공하는 단계를 포함하는 것이 특징인 폴리케타이드의 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서, 숙주 세포 중에서 수행되는 것이 특징인 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 무세포 시스템 중에서 수행되는 것이 특징인 방법.
  9. 제 6항의 방법으로 생산된 폴리케타이드 생성물을 폴리케타이드를 글리코실화시키는 효소로 처리하는 것을 포함하는 항생제의 제조방법.
  10. 도 2A의 화학식 6~8 또는 도 2B 및 2C의 화학식 19~28에 도시된 구조를 갖는 신규한 폴리케타이드.
  11. 제 10항의 폴리케타이드의 글리코실화 형태인 신규한 항생제.
  12. 다음 화학식 1 또는 2의 디케타이드로부터 제 6항의 방법에 의해 얻을 수 있는 신규한 폴리케타이드:
    화학식 1
    또는
    화학식 2
    식 중, A는 디케타이드를 활성화시키는 부분;
    R1과 R2중 적어도 하나는 변형된 PKS 클러스터에 의해 정상적으로 프로세싱된 디케타이드에서 자연적으로 발생되지 않는 치환기이고; R1은 치환, 또는 비치환된, 포화 또는 불포화 히드로카르빌 부분 (1-15C)으로서, 상기 히드로카르빌은 임의로 1개 또는 2개의 이종원자를 함유하고, R2는 치환 또는 비치환된 포화 또는 불포화 히드로카르빌 부분 (1-4C)이거나 또는 OR, SR, 또는 NHR이고 여기서 R은 치환, 또는 비치환의 포화 또는 불포화 1-4C 히드로카르빌이며, 단, R1과 R2는 두가지 모두 메틸일 수 없고, 만약 R2가 메틸이면, R1은 에틸일 수 없다.
  13. 제 12항의 신규한 폴리케타이드의 글리코실화 형태인 신규한 항생제.
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