DE69434408T2

DE69434408T2 - Recombinante Herstellung aromatischer Polyketiden

Info

Publication number: DE69434408T2
Application number: DE69434408T
Authority: DE
Inventors: Chaitan Stanford Khosla; David A. Hopwood; Suzanne Stanford Ebert-Khosla; Robert Mcdaniel; Hong Fu
Original assignee: JOHN INNES CENTRE; JOHN INNES CT NORWICH; Leland Stanford Junior University
Current assignee: JOHN INNES CENTRE; JOHN INNES CT NORWICH; Leland Stanford Junior University
Priority date: 1993-09-20
Filing date: 1994-09-20
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2014-09-21
Also published as: ES2240259T3; US7312048B2; US5830750A; DK0725778T3; US6969611B2; ATE206164T1; US6214573B1; PT725778E; US5843718A; US6022731A; CA2171629A1; AU7731794A; EP0725778A4; US6399382B1; AU678058B2; DE69434408D1; ES2164713T3; US20020110874A1; DE69428451D1; EP0725778B1

Description

Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Polyketide und Polyketidsynthasen. Insbesondere betrifft die Erfindung die rekombinante Herstellung von Polyketiden unter Verwendung eines neuen Wirts-Vektorsystems.
Hintergrund der Erfindung
Bei Polyketiden handelt es sich um eine große, strukturell verschiedenartige Familie von natürlichen Produkten. Polyketide weisen einen breiten Bereich biologischer Aktivitäten auf, einschließlich antibiotischer und pharmakologischer Eigenschaften. Zum Beispiel sind Polyketide repräsentiert durch Antibiotika wie Tetracycline und Erythromy-cin, antineoplastische Mittel wie Daunomycin, Immunsuppressiva wie FK506 und Rapamycin, und veterinärmedizinische Produkte wie Monensin und Avermectin. Polyketide kommen in den meisten Gruppen von Organismen vor und sind besonders reichlich vorhanden in einer Klasse von Mycelbakterien, den Actinomyceten, die verschiedene Polyketide erzeugen.
Polyketidsynthasen (PKS) sind multifunktionale Enzyme, die mit Fettsäuresynthasen (FAS) verwandt sind. PKS katalysieren die Biosynthese von Polyketiden durch wiederholte (decarboxylative) Claisen-Kondensationen zwischen Acylthioestern, gewöhnlich Acetyl, Propionyl, Malonyl oder Methylmalonyl. Im Anschluss an jede Kondensation führen sie strukturelle Variabilität in das Produkt ein, indem sie den gesamten, einen Teil oder nichts von einem reduktiven Zyklus katalysieren, umfassend eine Ketoreduktion, Dehydratation und Enoylreduktion an der β-Ketogruppe der wachsenden Polyketidkette. Nachdem die Kohlenstoffkette zu einer Länge angewachsen ist, die für jedes spezifische Produkt charakteristisch ist, wird sie von der Synthase durch Thiolyse oder Acyltransfer freigesetzt. So bestehen PKS aus Familien von Enzymen, die zur Herstellung eines gegebenen Polyketids zusammenarbeiten. Die kontrollierte Abweichung in der Kettenlänge, die Wahl der kettenbildenden Einheiten und der reduktive Zyklus, der genetisch in jede PKS programmiert ist, stellen die Faktoren dar, die zu der unter natürlich vorkommenden Polyketiden erkennbaren Variation beitragen.
Es existieren zwei allgemeine Klassen von PKS. Eine Klasse, bekannt als Typ I-PKS, ist vertreten durch die PKS für Makrolide wie Erythromycin. Diese "komplexen" oder "modulären" PKS umfassen Baugruppen aus mehreren großen multifunktionalen Proteinen, die zwischen sich einen Satz separater aktiver Zentren für jeden Schritt des Zusammenbaus und der Modifikation der Kohlenstoffkette tragen (Cortes, J. et al. Nature (1990) 348:176; Donadio, S. et al. Science (1991) 252:675; MacNeil, D.J. et al. Gene (1992) 115:119). Strukturelle Vielfalt tritt in dieser Klasse durch Variationen bei der Anzahl und Art von aktiven Zentren in den PKS auf. Diese Klasse von PKS zeigt eine Eins-zu-Eins-Korrelation zwischen der Anzahl und dem Clustering der aktiven Zentren in der Primärsequenz der PKS und der Struktur des Polyketid-Rückgrats auf.
Die zweite Klasse von PKS, bezeichnet als Typ II-PKS, ist vertreten durch die Synthasen für aromatische Verbindungen. Typ II-PKS weisen einen einzelnen Satz von sich wiederholend verwendeten aktiven Zentren auf (Bibb, M.J. et al. EMBO J. (1989) 8:2727; Sherman, D.H. et al. EMBO J. (1989) 8:2717; Fernandez-Moreno, M.A. et al. J. Biol. Chem. (1992) 267:19278).
Bei Streptomyces handelt es sich um eine Actinomycete, die reichlich aromatische Polyketide erzeugt. In jeder bisher untersuchten aromatischen PKS von Streptomyces erfordert der Zusammenbau der Kohlenstoffkette die Produkte von drei offenen Leserastern (ORF). ORF1 codiert ein aktives Zentrum mit einer Ketosynthase (KS) und einer Acyltransferase (AT); ORF2 codiert ein Protein ähnlich dem ORF1-Produkt, dem aber die KS- und AT-Motive fehlen; und ORF3 codiert ein einzelnes Acyl-Trägerprotein (ACP).
Streptomyces coelicolor erzeugt das blau-pigmentierte Polyketid Actinorhodin. Das Actinorhodin-Gencluster (act) ist kloniert worden (Malpartida, F. und Hopwood, D.A. Na ture (1984) 309:462; Malpartida, F. und Hopwood, D.A. Mol. Gen. Genet. (1986) 205:66) und vollständig sequenziert worden (Fernandez-Moreno, M.A. et al., J. Biol. Chem. (1992) 267:19278; Hallam, S.E. et al. Gene (1988) 74:305; Fernandez-Moreno, M.A. et al. Cell (1991) 66:769; Caballero, J. et al. Mol. Gen. Genet. (1991) 230:401). Das Cluster codiert die oben beschriebenen PKS-Enzyme, eine Cyclase und eine Reihe von Tailoring Enzymes, die an den anschließenden Modifikationsreaktionen beteiligt sind, die zu Actinorhodin führen, als auch Proteine, die am Export des Antibiotikums beteiligt sind, und zumindest ein Protein, das spezifisch die Transkription des Genclusters aktiviert. Weitere Gene, die für die globale Regulierung der antiobiotischen Biosynthese erforderlich sind, ebenso wie zur Bereitstellung von Starter-(Acetyl-CoA)- und Extender-(Malonyl-CoA)-Units für die Polyketid-Biosynthese, sind an anderer Stelle im Genom lokalisiert.
Das act-Gencluster von S. coelicolor ist zur Produktion von Actinorhodin in S. parvulus verwendet worden. Malpartida, F. und Hopwood, D.A. Nature (1984) 309:462, Bartel et al. J. Bacteriol. (1990) 172:4816–4826, erzeugten Aloesaponarin II rekombinant unter Verwendung von S. galilaeus, das mit einem S. coelicolor-act-Gencluster transformiert war, welches aus vier genetischen Loci, nämlich actI, actIII, actIV und actVII, bestand. Hybrid-PKS, einschließlich des Grund-ACP-Gensets, wobei aber die ACP-Gene von Granaticin-, Oxytetracyclin-, Tetracenomycin- und Frenolicin-PKS abgeleitet waren, wurden ebenfalls entworfen, die zum Exprimieren von funktionalen Synthasen fähig sind. Khosla, C. et al. J. Bacteriol. (1993) 175:2197–2204. Hopwood, D.A. et al. Nature (1985) 314:642–644, beschreiben die Herstellung von Hybrid-Polyketiden unter Anwendung rekombinanter Techniken. Sherman, D.H. et al. J. Bacteriol. (1992) 174:6184–6190, berichtet von der Transformation verschiedener S. coelicolor-Mutanten, denen verschiedene Komponenten des act-PKS-Genclusters fehlt, mit den entsprechenden Granaticin-(gra)-Genen von S. violaceoruber in trans.
Bis heute jedoch hat niemand die rekombinante Produktion von Polyketiden unter Verwendung gentechnisch hergestellter Wirtszellen beschrieben, denen im wesentlichen ihre gesamten nativen PKS-Gencluster fehlen.
Zusammenfassung der Erfindung
Mit der vorliegenden Erfindung werden neuartige Polyketide und neuartige Methoden zur wirksamen Herstellung sowohl neuer als auch bekannter Polyketide unter Einsatz einer rekombinanten Technologie bereitgestellt. Insbesondere wird ein neuartiges Wirts-Vektorsystem zur Herstellung von PKS verwendet, welche wiederum die Produktion einer Vielzahl von Polyketiden katalysieren. Diese Polyketide sind als Antiobiotika, antineoplastische Mittel, Immunsuppressiva und für eine breite Vielfalt von weiteren pharmakologischen Anwendungszwecken nützlich.
Demgemäß betrifft in einer Ausführungsform die Erfindung eine gentechnisch hergestellte Zelle, welche ein Polyketidsynthese-(PKS)-Gencluster in seinem nativen, nicht-transformierten Zustand exprimiert, wobei der gentechnisch hergestellten Zelle das gesamte native PKS-Gencluster fehlt.
In einer anderen Ausführungsform richtet sich die Erfindung auf eine gentechnisch hergestellte Zelle, wie oben beschrieben, wobei die Zelle umfasst:

(a) ein Austausch-PKS-Gencluster, welches eine PKS codiert, die zum Katalysieren der Synthese eines Polyketids fähig ist; und
(b) eine oder mehrere Kontrollsequenzen, die operativ an das PKS-Gencluster geknüpft sind, wobei die Gene im Gencluster transkribiert und in die gentechnisch hergestellte Zelle translatiert werden können,

In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist die gentechnisch hergestellte Zelle Streptomyces coelicolor, fehlt der Zelle im wesentlichen das gesamte native Actinorhodin-PKS-Gencluster und umfasst das Austausch-PKS-Gencluster ein erstes Gen, das für ein aktives Zentrum mit einer PKS-Ketosynthase und einer PKS-Acyltransferase codiert (KS/AT), ein zweites Gen, das einen PKS-Kettenlängen-bestimmenden Faktor (CLF) codiert, und ein drittes Gen, das ein PKS-Aycl-Trägerprotein (ACP) codiert.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Methode zum Herstellen eines rekombinanten Polyketids, welche umfasst:

(a) Bereitstellen einer Population von Zellen, wie oben beschrieben; und
(b) Züchten der Population von Zellen unter Bedingungen, bei denen das in der Zelle vorhandene Austausch-PKS-Gencluster exprimiert wird.

Ebenfalls hierin beschrieben wird eine Methode zur Herstellung eines rekombinanten Polyketids unter Verwendung der Zellen der Erfindung, welche umfasst:

a. Einführen eines ersten Abschnitts eines Austausch-PKS-Genclusters in ein Spenderplasmid und Einführen eines zweiten Abschnitts eines Austausch-PKS-Genclusters in ein Empfängerplasmid, wobei die ersten und zweiten Abschnitte gemeinsam ein vollständiges Austausch-PKS-Gencluster codieren, und worin außerdem: i. das Spenderplasmid ein Gen exprimiert, welches einen ersten Selektionsmarker codiert und zur Replikation bei einer ersten, permissiven Temperatur fähig ist und zur Replikation bei einer zweiten, nicht-permissiven Temperatur unfähig ist; ii. das Empfängerplasmid ein Gen exprimiert, welches einen zweiten Selektionsmarker codiert; und iii. das Spenderplasmid Regionen der DNA umfasst, die zu Regionen der DNA im Empfängerplasmid komplementär sind, so dass eine homologe Rekombination zwischen dem ersten Abschnitt des Austausch-PKS-Genclusters und dem zweiten Abschnitt des Austausch-Genclusters erfolgen kann, wodurch ein vollständiges Austausch-Gencluster erzeugt werden kann;
b. Transformieren des Spenderplasmids und des Empfängerplasmids in eine Wirtszelle und Züchten der transformierten Wirtszelle bei der ersten, permissiven Temperatur und unter Bedingungen, die das Wachstum von Wirtszellen ermöglichen, welche die ersten und/oder die zweiten Selektionsmarker exprimieren, um eine erste Population von Zellen zu erzeugen;
c. Züchten der ersten Population von Zellen bei der zweiten, nicht-permissiven Temperatur und unter Bedingungen, welche das Wachstum von Zellen ermöglichen, die die ersten und/oder die zweiten Selektionsmarker exprimieren, um eine zweite Population von Zellen zu erzeugen, welche Wirtszellen umfasst, die ein rekombinantes Plasmid enthalten, dasein vollständiges PKS-Austausch-Gencluster umfasst;
d. Übertragen des rekombinanten Plasmids aus der zweiten Population von Zellen in die gentechnisch hergestellte Zelle nach Anspruch 1, um transformierte gentechnisch hergestellte Zellen zu erzeugen; und
e. Züchten der transformierten gentechnisch hergestellten Zellen unter Bedingungen, bei denen das in den Zellen vorhandene Austausch-PKS-Gencluster exprimiert wird.

Wie hierin beschrieben, kann eine Polyketid-Verbindung folgende Strukturformel (I) aufweisen
worin:
R¹ ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und niederem Alkyl, und R² ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, niederem Alkyl und niederem Alkylester, oder worin R¹ und R² zusammen eine niedere Alkylen-Brücke bilden, die wahlweise substituiert ist mit ein bis vier Hydroxyl- oder niederen Alkylgruppen;
R³ und R⁵ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Halogen, niederem Alkyl, niederem Alkoxy, Amino, mit niederem Alkyl mono- oder disubstituiertem Amino und Nitro;
R⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Halogen, niederem Alkyl, niederem Alkoxy, Amino, mit niederem Alkyl mono- oder disubstituiertem Amino und Nitro;
R⁶ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, niederem Alkyl und -CHR⁷-(CO)R⁸, worin R⁷ und R⁸ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und niederem Alkyl; und
i 1, 2 oder 3 ist.
Andere Polyketide können folgende Strukturen aufweisen:
Eine Polyketid-Verbindung kann durch katalytische Cyclisierung eines Enzymgebundenen Ketids mit folgender Struktur (II) erzeugt werden
worin:
R¹¹ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Methyl, -CH₂(CO)CH₃ und -CH₂(CO)CH₂(CO)CH₃;
R¹² ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -S-E und -CH₂(CO)-S-E, worin E für eine Polyketidsynthase steht, die durch die obigen gentechnisch hergestellten Zellen erzeugt wird; und
eines von R¹³ und R¹⁴ Wasserstoff ist und das andere Hydroxyl ist, oder R¹³ und R¹⁴ zusammen genommen für Carbonyl stehen.
In noch einer anderen Ausführungsform richtet sich die Erfindung auf eine Methode zur Herstellung eines aromatischen Polyketids, welches das Bewirken der Cyclisierung eines Enzym-gebundenen Ketid mit der Struktur (II) umfasst, worin die Cyclisierung durch die Polyketidsynthase ausgelöst wird.
Eine Polyketid-Verbindung kann die Strukturformel (III) aufweisen
worin R² und R⁴ wie oben definiert sind und i 0, 1 oder 2 ist. Eine Polyketid-Verbindung kann die Strukturformel (IV) aufweisen
worin R², R⁴ und i wie oben für die Strukturformel (III) definiert sind. Eine Polyketid-Verbindung kann die Strukturformel (V) aufweisen
worin R², R⁴ und i wie oben für die Strukturformel (III) definiert sind.
Diese und weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden für Fachleute bei üblicher Sachkenntnis im Hinblick auf die hierin gegebene Beschreibung ohne weiteres erkennbar werden.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 zeigt die Gencluster für act-, gra- und tcm-PKS und Cyclasen.
2 zeigt die Strategie zur Herstellung von S. coelicolor CH999. 2A zeigt die Struktur des act-Genclusters, das auf dem CH1-Chromosom von S. coelicolorvorhanden ist. 2B zeigt die Struktur von pLRemEts, und 2C zeigt den Abschnitt des CH999-Chromosoms mit dem deletierten act-Gencluster.
3 zeigt ein Diagramm des Plasmids pRMS.
4 veranschaulicht die Bildung von Aloesaponarin II (2) und seinem carboxylierten Analogon, 3,8-Dihydroxy-1-methylanthrachinon-2-carbonsäure (1) schematisch, wie in Beispiel 3 beschrieben.
5 zeigt die Strukturen von Actinorhodin (3), Granaticin (4), Tetracenomycin (5) und Mutactin (6), auf die in Beispiel 4 Bezug genommen wird.
6 veranschaulicht die Herstellung, über Cyclisierung der Polyketid-Vorläufer, von Aloesaponarin II (2), seines carboxylierten Analogons, 3,8-Dihydroxy-1-methylanthrachinon-2-carbonsäure (1), Tetracenomycin (5) und der neuen Verbindung RM20 (9), wie in Beispiel 4, Teil (A), erläutert.
7 veranschaulicht die Herstellung, über Cyclisierung der Polyketid-Vorläufer, von Frenolicin (7), Nanomycin (8) und Actinorhodin (3), schematisch.
8 veranschaulicht die Herstellung, über Cyclisierung der Polyketid-Vorläufer, der neuartigen Verbindungen RM20 (9), RM18 (10), RM18b (11), SEK4 (12), SEK15 (13), RM20b (14), RM20c (15) und SEK15b (16) schematisch.
9 zeigt das genetische Modell für die 6-Desoxyerythronolid-B-Synthase (DEBS).
10 zeigt die Strategie für die Konstruktion von rekombinanten modulären PKS.
11 zeigt ein Diagramm des Plasmids pCK7.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Durchführung der vorliegenden Erfindung wendet, sofern nicht anders angegeben, herkömmliche Methoden der Chemie, Mikrobiologie, Molekularbiologie, und rekombinante DNA-Techniken innerhalb der Sachkenntnis des Gebiets an. Diese Techniken sind in der Literatur umfassend beschrieben. Siehe z.B. Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Aktuelle Auflage); DNA Cloning: A Practical Appraoch, Bd. I & II (D. Glover, Hrg.); Oligonucleotide Synfhesis (N. Gait, Hrg., Aktuelle Auflage); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, Hrg., Aktuelle Auflage); Transcription and Translation (B. Hames & Higgins, Hrg., Aktuelle Auflage).
Wie in dieser Beschreibung und den Ansprüchen im Anhang verwendet, beinhalten die Singularformen "ein/eine/eines" und „der/die/das" die Pluralformen, sofern nicht der Inhalt eindeutig anderes vorgibt. So beinhaltet die Bezugnahme auf "ein Polyketid" ein Gemisch von Polyketiden, die Bezugnahme auf "eine Polyketidsynthase" Gemische von Polyketidsynthasen, usw.
A. Definitionen
In der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe verwendet, die wie nachstehend angegeben definiert sein sollen.
Mit "Austausch-PKS-Gencluster" ist jegliches Set von PKS-Genen gemeint, das zum Herstellen eines funktionalen PKS fähig ist, wenn unter der Lenkung von ein oder meh reren kompatiblen Kontrollelementen, wie nachstehend definiert, in einer damit transformierten Wirtszelle. Ein funktionales PKS ist ein solches, welches die Synthese eines Polyketids katalysiert. Der Begriff "Austausch-PKS-Gencluster" umfasst ein oder mehrere Gene, die für die verschiedenen Proteine codieren, die zur Katalyse der Produktion eines Polyketids erforderlich sind. Ein "Austausch-PKS-Gencluster" braucht nicht alle der Gene umfassen, die im entsprechenden Cluster in der Natur zu finden sind. Vielmehr braucht das Gencluster lediglich die erforderlichen PKS-Komponenten zu codieren, um die Produktion eines aktiven Polyketids zu katalysieren. Wie weiter unten erläutert, brauchen, wenn das Gencluster beispielsweise acht Gene in seinem nativen Zustand umfasst und lediglich drei dieser Gene zur Bereitstellung eines aktiven Polyketids erforderlich sind, lediglich diese drei Gene vorhanden zu sein. Weiterhin kann das Cluster PKS-Gene enthalten, die von einer einzigen Spezies stammen, oder kann von hybrider Natur sein, wobei beispielsweise ein Gen, das von einem Cluster für die Synthese eines bestimmten Polyketids abstammt, ersetzt ist durch ein entsprechendes Gen von einem Cluster für die Synthese eines anderen Polyketids. Zu Hybrid-Clustern können Gene zählen, die sowohl von Typ I- als auch Typ II-PKS abgeleitet sind. Wie oben erläutert, zählen zu Typ I-PKS mehrere große multifunktionale Proteine, die zwischen sich einen Satz separater aktiver Zentren für jeden Schritt des Zusammenbaus und der Modifikation der Kohlenstoffkette tragen. PKS des Typs II dagegen weisen einen einzelnen Satz von sich wiederholend verwendeten aktiven Zentren auf. Diese Klassifikationen sind wohlbekannt. Siehe z.B. Hopwood, D.A. und Khosla, C. Secondary metabolites: their function and evolution (1992) Wiley Chichester (Ciba Foundation Symposium 171) S. 88–112; Bibb, M.J. et al. EMBO J. (1989) 8:2727; Sherman, D.H. et al. EMBO J (1989) 8:2717; Fernandez-Moreno, M.A. et al. J. Biol. Chem. (1992) 267:19278); Cortes, J. et al. Nature (1990) 348:176; Donadio, S. et al. Science (1991) 252:675; Mac-Neil, D.J. et al. Gene (1992) 115:119. Hybrid-Cluster werden hierin beispielhaft veranschaulicht und sind weiter unten beschrieben. Die im Gencluster enthaltenen Gene brauchen nicht die nativen Gene zu sein, doch können Mutanten oder Analoga davon sein. Mutanten oder Analoga können durch Deletion, Insertion oder Substitution von ein oder mehreren Nukleotiden der Codierungssequenz erhalten werden. Techniken zur Modifikation von Nukleotidsequenzen, wie etwa die positionsgerichtete Mutagenese, sind beschrieben z.B. bei Sambrook et al., supra; DNA Cloning, Bd. I und II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
Ein "Austausch-PKS-Gencluster" kann auch Gene enthalten, die für durch die PKS katalysierte Modifikationen am Kern-Polyketid codieren, einschließlich zum Beispiel von Genen, die für Hydroxylasen, Methylasen oder andere Alkylasen, Oxidasen, Reduktasen, Glykotransferasen, Lyasen, Ester oder Amidsynthasen, und verschiedene Hydrolasen wie Esterasen und Amidasen codieren.
Wie weiter unten erläutert, brauchen die Gene, die im Austausch-Gencluster enthalten sind, nicht auf demselben Plasmid zu liegen oder auf demselben Plasmid vorhanden zu sein und können durch dieselben oder unterschiedliche Kontrollsequenzen kontrolliert werden.
Mit "gentechnisch hergestellte Wirtszelle" ist eine Wirtszelle gemeint, bei der das native PKS-Gencluster unter Anwendung rekombinanter DNA-Techniken deletiert worden ist. Der Begriff umfasst also keine in der Natur vorkommenden Mutationsereignisse. Eine "Wirtszelle" ist eine Zelle, die von einem prokaryontischen Mikroorganismus oder einer eukaryontischen Zelllinie, die als eine unizelluläre Einheit gezüchtet wird, abstammt, die als ein Empfänger für rekombinante Vektoren verwendet werden kann oder worden ist, die die PKS-Gencluster der Erfindung tragen. Der Begriff umfasst die Abkömmlinge der ursprünglichen Zelle, die transfiziert worden ist. Selbstverständlich braucht die Nachkommenschaft einer einzelnen parentalen Zelle nicht notwendigerweise vollkommen identisch hinsichtlich der Morphologie oder dem genomischen oder Gesamt-DNA-Komplement zum ursprünglichen Elter aufgrund von zufälliger oder willkürlicher Mutation zu sein. Die Nachkommenschaft der parentalen Zelle, die ausreichend ähnlich zum Elter ist, um durch die relevante Eigenschaft charakterisiert zu sein, wie z.B. das Vorhandensein einer Nukleotidsequenz, die eine gewünschte PKS codiert, sindvon der Definition umfasst und durch die obigen Begriffe abgedeckt.
Der Begriff "heterolog" weist bei Bezugnahme auf Nukleinsäuresequenzen, wie etwa Codierungssequenzen und Kontrollsequenzen, auf Sequenzen hin, die normalerweise nicht mit einer Region eines rekombinanten Konstrukts verbunden sind und/oder normalerweise nicht mit einer bestimmten Zelle verbunden sind. So ist eine "heterologe" Region eines Nukleinsäure-Konstrukts ein identifizierbares Segment der Nukleinsäure innerhalb von oder gebunden an ein anderes Nukleinsäure-Molekül, das nicht in Verbindung mit dem anderen Molekül in der Natur gefunden wird. Zum Beispiel könnte eine heterologe Region eines Konstrukts eine Codierungssequenz enthalten, die durch Sequenzen flankiert ist, die nicht in Verbindung mit der Codierungssequenz in der Natur gefunden wird. Ein anderes Beispiel einer heterologen Codierungssequenz ist ein Konstrukt, bei dem die Codierungssequenz selbst nicht in der Natur gefunden wird (z.B. synthetische Sequenzen mit vom nativen Gen verschiedenen Codonen). In ähnlicher Weise würde eine Wirtszelle, die mit einem Konstrukt transformiert ist, das normalerweise nicht in der Wirtszelle vorhanden ist, als heterolog für die Zwecke dieser Erfindung betrachtet werden. Eine Allelvariation oder natürlich vorkommende Mutationsereignisse lassen keine heterologe DNA entstehen, wie hierin verwendet.
Eine "Codierungssequenz" oder eine Sequenz, welche eine bestimmte PKS "codiert", stellt eine Nukleinsäuresequenz dar, welche in ein Polypeptid in vitro oder in vivo transkribiert (im Falle von DNA) und translatiert (im Falle von mRNA) wird, wenn unter die Kontrolle geeigneter regulatorischer Sequenzen gebracht. Die Begrenzungen der Codierungssequenz sind durch ein Startcodon am 5'-(Amino)-Terminus und ein Translations-Stoppcodon am 3'-(Carboxy)-Terminus bestimmt. Eine Codierungssequenz kann umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, cDNA von prokaryontischer oder eukaryontischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen von prokaryontischer oder eukaryontischer DNA, und sogar synthetische DNA-Sequenzen. Eine Transkriptionsterminationssequenz wird gewöhnlich 3' zur Codierungssequenz lokalisiert sein.
Eine "Nukleinsäure"-Sequenz kann umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, prokaryontische Sequenzen, eukaryontische mRNA, cDNA von eukaryontischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen von eukaryontischer (z.B. Säuger)-DNA, und sogar synthetische DNA-Sequenzen. Der Begriff umfasst auch Sequenzen, die eines der bekannten Basenanaloga von DNA und RNA umfassen, wie z.B., ohne darauf beschränkt zu sein, 4-Acetylcytosin, 8-Hydroxy-N6-methyladenosin, Aziridinylcytosin, Pseudoisocytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Carobxymethylaminomethyl-2-thiouracil, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methyladenin, 1-Methylpseudouracil, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methyl cytosin, N6-Methyladenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, Beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarbonylmethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure, Oxybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, N-Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin und 2,6-Diaminopurin. Eine Transkriptionsterminationssequenz wird gewöhnlich 3' zur Codierungssequenz lokalisiert sein.
DNA-"Kontrollsequenzen" bezieht sich kollektiv auf Promotorsequenzen, ribosomale Bindungsstellen, Polyadenylierungssignale, Transkriptionsterminationssequenzen, stromaufwärts gelegene regulatorische Domänen, Enhancer und ähnliches, welche kollektiv für die Transkription und Translation einer Codierungssequenz in einer Wirtszelle sorgen. Nicht alle dieser Kontrollsequenzen brauchen immer in einem rekombinanten Vektor vorhanden sein, solange das gewünschte Gen transkribierbar und translatierbar ist.
"Operativ verknüpft" bezieht sich auf eine Anordnung von Elementen, worin die so beschriebenen Komponenten so konfiguriert sind, dass sie ihre übliche Funktion erfüllen. So sind operativ an eine Codierungssequenz geknüpfte Kontrollsequenzen dazu fähig, die Expression der Codierungssequenz zu bewirken. Die Kontrollsequenzen brauchen nicht angrenzend an die Codierungssequenz zu liegen, solange sie dahingehend agieren, die Expression daraus zu steuern. Daher können zum Beispiel intervenierende untranslatierte, jedoch transkribierte Sequenzen zwischen einer Promotorsequenz und der Codierungssequenz vorhanden sein, dabei aber die Promotorsequenz nach wie vor als "operativ geknüpft" an die Codierungssequenz betrachtet werden.
Mit "Selektionsmarker" ist jeglicher genetische Marker gemeint, der zur Auswahl einer Pouplation von Zellen verwendet werden kann, die den Marker in ihrem Genom tragen. Beispiele der Selektionsmarker umfassen: auxotrophe Marker, durch die Zellen anhand ihrer Fähigkeit ausgewählt werden, auf minimalen Medien mit oder ohne Nährstoffe oder Ergänzungsstoffe zu wachsen; z.B. Thymidin, Diaminopimelinsäure oder Biotin; metabolische Marker, anhand derer Zellen auf ihre Fähigkeit ausgewählt werden, auf minimalen Medien zu wachsen, die den entsprechenden Zucker als der einzigen Kohlenstoffquelle enthalten, oder die Fähigkeit von Zellen, gefärbte Kolonien zu bilden, die die entsprechenden Farbstoffe oder chromogenen Substrate enthalten; und Wirkstoff-Resistenzmarker, durch die Zellen anhand ihrer Fähigkeit ausgewählt werden, auf Medien zu wachsen, die einen oder mehrere der entsprechenden Wirkstoffe enthalten, z.B. Tetraycyclin, Ampicillin, Kanamycin, Streptomycin oder Nalidixinsäure.
Die "Rekombination" stellt die Neusortierung von Abschnitten der DNA-Sequenzen zwischen zwei DNA-Molekülen dar. Eine "homologe Rekombination" erfolgt zwischen zwei DNA-Molekülen, die dank homologer oder komplementärer Nukleotidsequenzen, die in jedem DNA-Molekül vorhanden sind, hybridisieren.
Der Begriff "Alkyl", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine verzweigte oder unverzweigte gesättigte Kohlenwasserstoffgruppe von 1 bis 24 Kohlenstoffatomen, wie etwa Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, t-Butyl, Octyl, Decyl, Tetradecyl, Hexadecyl, Eicosyl, Tetracosyl und ähnliches. Hierin bevorzugte Alkylgruppen enthalten 1 bis 12 Kohlenstoffatome. Der Begriff "niederes Alkyl" meint eine Alkylgruppe von ein bis sechs Kohlenstoffatomen, vorzugsweise ein bis vier Kohlenstoffatomen.
Der Begriff "Alkylen", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine difunktionale gesättigte verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffkette, die 1 bis 24 Kohlenstoffatome enthält, und umfasst zum Beispiel Methylen (-CH₂-), Ethylen (-CH₂-CH₂-), Propylen (-CH₂-CH₂-CH₂-), 2-Methylpropylen [-CH₂-CH(CH₃)-CH₂-], Hexylen [-(CH₂)₆-] und ähnliches. "Niederes Alkylen" bezieht sich auf eine Alkylengruppe von 1 bis 6, bevorzugter 1 bis 4, Kohlenstoffatomen.
Der Begriff "Alkoxy", wie hierin verwendet, meint eine Alkylgruppe, die durch eine einzelne, terminale Etherbindung gebunden ist; das heißt, eine "Alkoxy"-Gruppe kann als -OR definiert sein, worin R Alkyl ist, wie oben definiert. Eine "niedere Alkoxy"-Gruppe meint eine Alkoxygruppe, die ein bis sechs, bevorzugter ein bis vier, Kohlenstoffatome enthält.
"Halo" oder "Halogen" bezieht sich auf Fluor, Chlor, Brom oder Iod, und bezieht sich üblicherweise auf eine Halo-Substitution für ein Wasserstoffatom in einer organischen Verbindung. Von den Halos sind Chlor und Fluor generell bevorzugt.
"Optional" oder "wahlweise" bedeutet, dass das anschließend beschriebene Ereignis oder der Umstand erfolgen kann oder auch nicht und dass die Beschreibung Fälle umfasst, bei denen das Ereignis oder der Umstand erfolgt, als auch Fälle, bei denen dies nicht so ist. Zum Beispiel bedeutet der Ausdruck "wahlweise substituiertes Alkylen", dass eine Alkylen-Komponente substituiert sein kann oder auch nicht und dass die Beschreibung sowohl unsubstituiertes Alkylen umfasst als auch ein Alkylen, bei dem eine Substitution vorliegt.
B. Allgemeine Methoden
Im Zentrum der vorliegenden Erfindung steht die Entdeckung eines Wirts-Vektorsystems für die effiziente rekombinante Herstellung sowohl neuer als auch bekannter Polyketide. Insbesondere macht die Erfindung Gebrauch von gentechnisch hergestellten Zellen, deren natürlich vorkommende PKS-Gene im wesentlichen deletiert sind. Diese Wirtszellen können mit rekombinanten Vektoren, die eine Vielzahl von PKS-Genclustern codieren, zur Herstellung von aktiven Polyketiden transformiert werden. Die Erfindung stellt die Herstellung signifikanter Mengen an Produkt in einem geeigneten Stadium des Wachstumszyklus bereit. Die derart erzeugten Polyketide können als Therapeutika zur Behandlung einer Reihe von Störungen in Abhängigkeit vom fraglichen Polyketid-Typ verwendet werden. Zum Beispiel werden mehrere der mittels der vorliegenden Methode erzeugten Polyketide Verwendung als Immunsuppressiva, antineoplastische Mittel, wie auch zur Behandlung von viralen, bakteriellen und parasitären Infektionen finden. Die rekombinante Herstellbarkeit von Polyketiden liefert auch ein leistungsfähiges Werkzeug zur Charakterisierung von PKS und ihres Wirkmechanismus.
Näher dargestellt können die Wirtszellen für die rekombinante Herstellung der vorliegenden Polyketide von jeglichem Organismus abgeleitet werden, der ein rekombinantes PKS-Gencluster beherbergen kann. So können die Wirtszellen der vorliegenden Erfindung von entweder prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen stammen.
Bevorzugte Wirtszellen sind jedoch solche, die aus den Aktinomyceten konstruiert werden, einer Klasse von Mycelbakterien, die eine Reihe von Polyketiden in reichlichem Umfang erzeugen. Eine besonders bevorzugte Gattung zur Verwendung mit dem vorliegenden System ist Streptomyces. So werden zum Beispiel S. ambofaciens, S. avermitilis, S. azureus, S. cinnamonensis, S. coelicolor, S. curacoi, S. erythraeus, S. fradiae, S. galilaeus, S. glaucescens, S. hygroscopicus, S. lividans, S. parvulus, S. peucetius, S. rimosus, S. roseofulvus, S. thermotolerans, S. violaceoruber und andere bequem geeignete Wirtszellen für die vorliegende Erfindung liefern, wobei S. coelicolor bevorzugt ist. (Siehe z.B. Hopwood, D.A. und Sherman, D.H. Ann. Rev. Genef. (1990) 24: 37–66; O'Hagan, D. The Polyketide Metabolites (Ellis Horwood Limited, 1991), für eine Beschreibung der verschiedenen Polyketid-produzierenden Organismen und ihrer natürlichen Produkte.)
Die oben beschriebenen Zellen werden durch Deletieren der natürlich vorkommenden PKS-Gene unter Anwendung standardmäßiger Techniken, wie etwa durch homologe Rekombination, gentechnisch hergestellt. (Siehe z.B. Khosla, C. et al. Molec. Microbiol. (1992) 6:3237). Als Beispiel veranschaulicht ist hierin eine gentechnisch hergestellte S. coelicolor-Wirtszelle. Native Stämme von S. coelicolor erzeugen eine PKS, welche die Biosynthese des aromtischen Polyketids Actinorhodin katalysiert (Struktur 3, 5). Der neue Stamm, S. coelicolor CH999 (2C und beschrieben in den Beispielen), wurde durch Deletieren, über homologe Rekombination, des gesamten natürlichen act-Clusters aus dem Chromosom von S. coelicolor CH1 konstruiert (Khosla, C. Molec. Microbiol. (1992) 6:3237), ein Stamm, dem endogene Plasmide fehlen und der eine stabile Mutation trägt, welche die Biosynthese eines anderen pigmentierten S. coelicolor-Antibiotikums, Undecylprodigiosin, blockiert.
Die oben beschriebenen Wirtszellen können mit ein oder mehreren Vektoren transformiert werden, die gemeinsam einen funktionalen PKS-Satz codieren. Der/Die Vektoren) kann native oder Hybrid-Kombinationen von PKS-Untereinheiten, oder Mutanten davon, enthalten. Wie oben erläutert, braucht das Austausch-Gencluster nicht dem vollständigen nativen Gencluster zu entsprechen, sondern braucht nur die erforderlichen PKS-Komponenten zum Katalysieren der Herstellung eine Polyketids zu codieren. In jedem bisher untersuchten aromatischen Streptomyces-PKS beispielsweise erfordert der Zusammenbau der Kohlenstoffkette die Produkte von drei offenen Leserastern (ORF). ORF1 codiert ein aktives Zentrum (KS/AT) mit einer Ketosynthase (KS) und einer Acyltransferase (AT); wie hierin erläutert, codiert ORF2 einen Kettenlängenbestimmenden Faktor (CLF), ein Protein ähnlich dem ORF1-Produkt, dem aber die KS- und AT-Motive fehlen; und ORF3 codiert ein einzelnes Acyl-Trägerprotein (ACP). Einige Gencluster codieren auch für eine Ketoreduktase (KR) und eine Cyclase, die an der Cyclisierung des im Entstehen begriffenen Polyketid-Rückgrats beteiligt sind. (Siehe 1 für eine schematische Darstellung der drei PKS-Gencluster). Es wurde jedoch festgestellt, dass lediglich KS/AT, CLF und ACP vorhanden sein müssen, um ein identifizierbares Polyketid zu erzeugen. Daher können im Falle der aromatischen PKS, die von Streptomyces abgeleitet sind, diese drei Gene ohne die anderen Komponenten der nativen Cluster in ein oder mehrere rekombinante Vektoren aufgenommen werden, um ein "minimales"Austausch-PKS-Gencluster zu erhalten.
Weiterhin können der oder die rekombinanten Vektoren Gene von einem einzelnen PKS-Gencluster enthalten, oder können Hybrid-Austausch-PKS-Gencluster umfassen, wobei z.B. ein Gen für ein Cluster durch das entsprechende Gen von einem anderen Gencluster ersetzt wird. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass ACPs ohne weiteres unter verschiedenen Synthasen ohne eine Auswirkung auf die Produktstruktur ausgetauscht werden können. Weiterhin kann ein gegebenes KR Polyketidketten von verschiedenen Kettenlängen erkennen und reduzieren. Entsprechend sind diese Gene in den hierin beschriebenen Konstrukten frei austauschbar. Daher sind die Austausch-Cluster der vorliegenden Erfindung von jeglicher Kombination von PKS-Gensets herleitbar, die schließlich auf die Erzeugung eines identifizierbaren Polyketids hinwirken.
Beispiele von Hybrid-Austausch-Clustern umfassen Cluster mit Genen, die von zwei oder mehr des ACT-Genclusters, Frenolicin (fren), Granaticin (gra), Tetracenomycin (tcm), 6-Methylsalicylsäure (6-msas), Oxytetracyclin (otc), Tetracyclin (tet), Erythromycin (ery), Griseusin, Nanaomycin, Medermycin, Daunorubicin, Tylosin, Carbomycin, Spiramycin, Avermectin, Monensin, Nonactin, Curamycin, Rifamycin und Candicidinsynthase-Genclustern, unter anderem, abgeleitet sind. (Für eine Erörterung der verschiedenen PKS, siehe z.B. Hopwood, D. A. und Sherman, D.H. Ann. Rev. Genet. (1990) 24;37–66; O'Hagan, D. The Polyketide Metabolites (Ellis Horwood Limited, 1991).
Genauer gesagt wurde hierin eine Anzahl von Hybrid-Genclustern konstruiert, deren Komponenten von den act, fren, tcm und gra-Genclustern abgeleitet sind, wie in Tabellen 1 und 2 dargestellt. Mehrere der Hybrid-Cluster waren dazu in der Lage, sowohl neue als auch bekannte Polyketide in S. coelicolor CH999 funktionell zu exprimieren (oben beschrieben). Allerdings können auch andere Hybrid-Gencluster, wie oben beschrieben, ohne weiteres erzeugt und unter Verwendung der hierin wiedergegebenen Beschreibung auf die Produktion von identifizierbaren Polyketiden gescreent werden. Zum Beispiel könnte eine Bank von zufallsbedingt klonierten ORF-1- und 2-Homologa aus einer Sammlung von Actinomyceten konstruiert und auf identifizierbare Polyketide gescreent werden. Längere Polyketide könnten ebenfalls durch Austausch z.B. eines act-, gra-, fren- oder tcm-Cyclase-Gens durch ein Homologon von einem PKS-Gencluster cyclisiert werden, welches eine Kette der korrekten Länge erzeugt. Schließlich liegt ein beträchtlicher Grad an Variabilität für Nicht-Acetat-Starter-Units unter bestimmten natürlich vorkommenden aromatischen PKS vor; daher können diese Einheiten auch zum Erhalt neuartiger Polyketide über gentechnische Herstellung verwendet werden.
Außerdem können die rekombinanten Vektoren Gene von einem modulären PKS-Gencluster enthalten. Diese Gencluster sind in weiterer Ausführlichkeit nachstehend beschrieben.
Die rekombinanten Vektoren, welche die oben beschriebenen Gencluster beherbergen, können unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten Techniken in bequemer Weise erzeugt werden. Zum Beispiel können die PKS-Untereinheiten von Interesse von einem Organismus erhalten werden, der dieselben exprimiert, unter Anwendung rekombinanter Methoden, wie etwa dem Screening von cDNA- oder genomischen Banken, die von das Gen exprimierenden Zellen abgeleitet sind, oder durch Ableiten des Gens von einem Vektor, von dem bekannt ist, dass er es enthält. Das Gen kann dann isoliert und mit anderen erwünschten PKS-Untereinheiten unter Anwendung standardmäßiger Techniken kombiniert werden. Ist das fragliche Gen bereits in einem geeigneten Ex pressionsvektor vorhanden, so kann es in situ mit z.B. anderen PKS-Untereinheiten nach Wunsch kombiniert werden. Das Gen von Interesse kann auch synthetisch erzeugt und nicht kloniert werden. Die Nukleotidsequenz kann mit den geeigneten Codonen für die speziell gewünschte Aminosäuresequenz gestaltet werden. Allgemein wird man bevorzugte Codone für den angestrebten Wirt auswählen, in welchem die Sequenz exprimiert werden wird. Die vollständige Sequenz wird aus überlappenden Oligonukleotiden zusammengebaut, wie mittels standardmäßiger Methoden präpariert und zu einer vollständigen Codierungssequenz zusammengesetzt. Siehe z.B. Edge (1981) Nature 292:756; Nambair et al. (1984) Science 223:1299; Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.
Mutationen können an den nativen PKS-Untereinheitssequenzen vorgenommen werden und diese Sequenzen anstelle der nativen Sequenz verwendet werden, solange die Mutanten zum Funktionieren mit anderen PKS-Untereinheiten zur gemeinsamen Katalyse der Synthese eines identifizierbaren Polyketids fähig sind. Solche Mutationen können an den nativen Sequenzen unter Anwendung herkömmlicher Techniken, wie etwa dem Präparieren der synthetischen Oligonukleotide, die die Mutationen enthalten, und dem Inserieren der mutierten Sequenz in das für eine PKS-Untereinheit codierende Gen unter Anwendung eines Restriktionsendonuklease-Verdaus, vorgenommen werden. (Siehe z.B. Kunkel, T.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:448; Geisselsoder et al. BioTechniques (1987) 5:786). Alternativ können die Mutationen unter Verwendung eines fehlgepaarten Primers (allgemein 10 – 20 Nukleotide in der Länge) bewirkt werden, welcher an die native Nukleotidsequenz (generell cDNA entsprechend der RNA-Sequenz) bei einer Temperatur unterhalb der Schmelztemperatur der fehlgepaarten Doppelhelix hybridisiert. Der Primer kann durch Halten der Primerlänge und Basenzusammensetzung innerhalb relativ enger Grenzen und durch Halten der mutierten Base in zentraler Lokalisation spezifisch gemacht werden. Zoller und Smith, Methods Enzymol. (1983) 100:468. Die Primerextension wird unter Verwendung von DNA-Polymerase bewirkt, das Produkt wird kloniert und die Klone, die die mutierte DNA enthalten, welche aus der Abtrennung des Primer-verlängerten Strangs stammt, ausgewählt. Die Auswahl kann unter Verwendung des mutierten Primers als einer Hybridisationssonde erreicht werden. Die Technik ist auch zur Erzeugung mehrfacher Punktmutationen anwendbar. Siehe z.B. Dalbie-McFarland et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79:6409. Die PCR-Mutagenese wird auch zur Bewirkung der gewünschten Mutationen Anwendung finden.
Die Gensequenzen, die gemeinsam ein Austausch-PKS-Gencluster codieren, können in ein oder mehrere Expressionsvektoren unter Anwendung von den Fachleuten des Gebiets bekannten Methoden inseriert werden. Die Expressionsvektoren werden Kontrollsequenzen enthalten, die operativ an die gewünschte PKS-Codierungssequenz geknüpft sind. Geeignete Expressionssysteme zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung umfassen Systeme, die in eukaryontischen und prokaryontischen Wirtszellen wirken. Wie oben erläutert, sind jedoch prokaryontische Systeme bevorzugt, und insbesondere sind Systeme von besonderem Interesse, die mit Streptomyces spp. kompatibel sind. Zu den Kontrollelementen zur Verwendung in diesen Systemen zählen Promotoren, die wahlweise Operatorsequenzen enthalten, und ribosomale Bindungsstellen. Zu besonders nützlichen Promotoren zählen Kontrollsequenzen, die von PKS-Genclustern abstammen, wie etwa ein oder mehrere act-Promotoren. Allerdings werden auch andere bakterielle Promotoren, z.B. solche, die von Zucker-metabolisierenden Enzymen wie Galactose, Lactose (lac) und Maltose abgeleitet sind, bei den vorliegenden Konstrukten Verwendung finden. Zu weiteren Beispielen zählen Promotorsequenzen, die von biosynthetischen Enzymen wie Tryptophan (trp), dem β-Lactamase-(bla)-Promotorsystem, dem Bakteriophagen Lambda PL, und T5 abgeleitet sind. Außerdem sind synthetische Promotoren, wie etwa der tac-Promotor (US-Patent Nr. 4.551.433), die nicht natürlich vorkommen, ebenfalls in bakteriellen Wirtszellen funktional.
Weitere regulatorische Sequenzen können ebenfalls erwünscht sein, die eine Regulierung der Expression der PKS-Austauschsequenzen relativ zum Wachstum der Wirtszelle ermöglichen. Regulatorische Sequenzen sind den Fachleuten des Gebiets bekannt, wobei Beispiele solche umfassen, die die Expression eines Gens als Reaktion auf einen chemischen oder physikalischen Reiz, einschließlich des Vorhandenseins einer regulatorischen Verbindung, zum An- oder Abschalten bringen. Weitere Typen von regulatorischen Elementen können ebenfalls im Vektor vorhanden sein, wie zum Beispiel Enhancer-Sequzenzen.
Selektierbare Marker können ebenfalls in den rekombinanten Expressionsvektoren enthalten sein. Eine Vielfalt von Markern ist bekannt, die bei der Auswahl von transformierten Zelllinien nützlich sind und generell ein Gen umfassen, dessen Expression den transformierten Zellen einen selektierbaren Phänotyp verleiht, wenn die Zellen in einem entsprechenden selektiven Medium gezüchtet werden. Zu solchen Markern zählen zum Beispiel Gene, die dem Plasmid eine antibiotische Resistenz oder Empfindlichkeit verleihen. Alternativ sind mehrere Polyketide natürlich gefärbt, wobei diese Eigenschaft einen eingebauten Marker zur Auswahl von Zellen bietet, die durch die vorliegenden Konstrukte erfolgreich transformiert werden.
Die verschiedenen PKS-Untereinheiten von Interesse können in ein oder mehrere rekombinante Vektoren als einzelne Kassetten mit separaten Kontrollelementen oder unter der Kontrolle z.B. eines einzelnen Promotors kloniert werden. Die PKS-Untereinheiten können flankierende Restriktionsstellen enthalten, um eine einfache Deletion und Insertion anderer PKS-Untereinheiten zu ermöglichen, wodurch Hybrid-PKS erzeugt werden können. Das Design solcher einzigartiger Restriktionsstellen ist den Fachleuten des Gebiets bekannt und kann unter Anwendung der oben beschriebenen Techniken erzielt werden, wie etwa der positionsgerichteten Mutagenese und der PCR.
Unter Anwendung dieser Techniken wurde ein neuartiges Plasmid, pRM5 (3 und Beispiel 2) als ein Shuttle-Vektor für die Produktion der hierin beschriebenen Polyketide konstruiert. Plasmid-pRM5 umfasst die act-Gene, welche die KS/AT (ORF1), CLF (ORF2) und ACP (ORF3)-PKS-Untereinheiten codieren, flankiert durch PacI-, NsiI- und XbaI-Restriktionsstellen. So können analoge PKS-Untereinheiten, codiert durch andere PKS-Gene, ohne weiteres für die bestehenden act-Gene substituiert werden. (Siehe z.B. Beispiel 4, das die Konstruktion von Hybrid-Vektoren unter Verwendung von pRM5 als dem Stamm-Plasmid beschreibt.) Das Shuttle-Plasmid enthält auch das act-KR-Gen (actIII), das Cyclase-Gen (actVII) und ein mutmaßliches Dehydratase-Gen (actIV), ebenso wie ein ColEI-Replikon (um die Transformation von E. coli zu ermöglichen), ein geeignet verkürztes SCP2* (niedere Kopienzahl)-Streptomyces-Replikon und das actII-ORF4-Aktivator-Gen vom act-Cluster, welches die Transkription von act-Promotoren während des Übergangs von der Wachstumsphase zur stationären Phase im vegetativen Mycel hervorruft. pRM5 trägt das divergente actI/actIII-Promotorpaar.
Methoden zur Einführung der rekombinanten Vektoren der vorliegenden Erfindung in geeignete Wirte sind den Fachleuten des Gebiets bekannt und umfassen typischerweise die Verwendung von CaCl₂ oder anderen Agenzien, wie etwa zweiwertige Kationen und DMSO. Die DNA kann auch in die Bakterienzellen durch Elektroporation eingeführt werden. Sind die PKSs einmal exprimiert, so können die Polyketid-erzeugenden Kolonien identifiziert und unter Anwendung bekannter Techniken isoliert werden. Die erzeugten Polyketide können dann weiter charakterisiert werden.
Wie oben erläutert, finden die oben beschriebenen rekombinanten Methoden auch Anwendung in der katalytischen Biosynthese von Polyketiden durch große, modulare PKSs. Zum Beispiel katalysiert 6-Desoxyerythronolid-B-Synthase (DEBS) die Biosynthese des Eryhtromycinaglykons, 5-Desoxyerythronolid B (17). Drei offene Leseraster (eryAI, eryAII und eryAIII) codieren die DEBS-Polypeptide und überspannen 32 kb im ery-Gencluster des Genoms von Saccharopolyspora erythraea. Die Gene sind in sechs sich wiederholenden Einheiten organisiert, wobei jede als ein "Modul" bezeichnet wird. Jedes Modul codiert eine Reihe von aktiven Zentren, welche während der Polyketid-Biosynthese die Kondensation eines zusätzlichen Monomers an die wachsende Kette katalysiert. Jedes Modul enthält eine Acyltransferase (At), β-Ketoacyl-Trägerprotein-Synthase (KS) und Acyl-Trägerprotein (ACP), als auch ein Subset von reduktiven aktiven Zentren (β-Ketoreduktase (KR), Dehydratase (DH), Enoylreduktase (ER)) (9). Die Zahl der reduktiven Stellen innerhalb eines Moduls entspricht dem Umfang der β-Ketoreduktion in jedem Kondensationszyklus. Die am Ende des Moduls codierte Thioesterase (TE) scheint die Lactonbildung zu katalysieren.
Aufgrund der großen Größen von eryAI, eryAII und eryAIII und des Vorhandenseins mehrfacher aktiver Zentren können diese Gene bequemerweise in ein Plasmid kloniert werden, das zur Expression in einer gentechnisch hergestellten Wirtszelle, wie etwa CH999, unter Verwendung einer in vivo-Rekombinationstechnik geeignet ist. Diese Technik, wie in Beispiel 5 beschrieben und in 10 zusammengefasst, nützt Derivate des Plasmids pMAK705 aus (Hamilton et al. (1989) J. Bacteriol. 171:4617), um die in vivo-Rekombination zwischen einem temperaturempfindlichen Spenderplasmid, wel ches fähig zur Replikation bei einer ersten, permissiven Temperatur und unfähig zur Replikation bei einer zweiten, nicht-permissiven Temperatur ist, und einem Empfängerplasmid zu ermöglichen. Die derart klonierten eryA-Gene ergaben pCK7, ein Derivat von pRM5 (McDaniel et al., (1993) Science 262:1546). Ein Kontrollplasmid, pCK7f, wurde so konstruiert, dass es eine Frameshift-Mutation in eryAl trug. pCK7 und pCK7f besitzen ein ColEI-Replikon für die genetische Manipulation in E. coli, ebenso wie ein verkürtes SCP2*-(geringe Kopienzahl)-Streptomyces-Replikon. Diese Plasmide enthalten auch das divergente actI/actIII-Promotorpaar und actII-ORF4, ein Aktivator-Gen, welches zur Transkription von diesen Promotoren erforderlich ist und die Expression während des Übergangs von der Wachstums- zur stationären Phase im vegetativen Mycel aktiviert. Eine hochgradige Expression der PKS-Gene erfolgt beim Einsetzen der stationären Phase des Mycelwachstums; die rekombinanten Stämme erzeugen daher "Reporter"-Polyketide als Sekundärmetaboliten in einer quasi-natürlichen Weise.
Die oben beschriebene Methode zur Erzeugung von Polyketiden, die durch große, modulare PKS synthetisiert werden, kann zur Erzeugung anderer Polyketide als Sekundärmetaboliten verwendet werden, wie etwa Zucker, β-Lactame, Fettsäuren, Aminoglykoside, Terpinoide, nicht-ribosomale Peptide, prostanoide Hormone und ähnliches.
Unter Anwendung der obigen rekombinanten Methoden wurde eine Reihe von Polyketiden erzeugt. Diese Verbindungen weisen die allgemeine Struktur (I) auf
worin R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸ und i wie oben definiert sind. Eine Gruppe dieser Verbindung ist die, bei welcher: R¹ niederes Alkyl, vorzugsweise Methyl ist; R², R³ und R⁵ Wasserstoff sind; R⁶ -CHR⁷-(CO)-R⁸ ist; und i 0 ist. Eine zweite Gruppe dieser Verbindungen ist die, bei welcher: R¹ und R⁶ niederes Alkyl, bevorzugt Methyl sind; R², R³ und R⁵ Wasserstoff sind; und i 0 ist. Eine dritte Gruppe dieser Verbindungen ist die, in welcher: R¹ und R² zur Bildung einer niederen Alkylenbrücke -CHR⁹-CHR¹⁰ miteinander verknüpft sind, worin R⁹ und R¹⁰ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl und niederem Alkyl, z.B. -CH₂-CHOH-; R³ und R⁵ Wasserstoff sind; R⁶ -CHR⁷-(CO)-R⁸ ist, worin R⁸ Wasserstoff oder niederes Alkyl ist, z.B. -CH₂-(CO)-CH₃; und i 0 ist. Zu spezifischen dieser Verbindungen zählen die folgenden Verbindungen 9, 10 und 11, wie folgt.
Weitere neue Polyketide sind solche mit der Struktur
Die Herstellung der Verbindungen 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 und 16 wird durch Cyclisierung eines Enzym-gebundenen Polyketids mit der Struktur (II) bewirkt.
worin R¹¹, R¹², R¹³ und R¹⁶ und E wie hierin an früherer Stelle definiert sind. Zu Beispielen dieser Verbindungen zählen: eine erste Gruppe, worin R¹¹ Methyl ist und R¹² -CH₂(CO)-S-E ist; eine zweite Gruppe, worin R¹¹ -CH₂(CO)CH₃ ist und R¹² -S-E ist; eine dritte Gruppe, worin R¹¹ -CH₂(CO)CH₃ ist und R¹² -CH₂(CO)-S-E ist; und eine vierte Gruppe, worin R¹¹ -CH₂(CO)CH₂(CO)CH₃ ist und R¹² -CH₂(CO)-S-E ist (siehe 8 als Strukturbeispiel).
Die verbliebenen, durch die generische Formel (I) umfassten Strukturen – d.h. andere Strukturen als 9, 10 und 11 – können aus Strukturen 9, 10 oder 11 unter Anwendung routinemäßiger synthetischer organischer Methoden hergestellt werden, die den Fachleuten des Gebiets der organischen Chemie wohlbekannt sind, wie z.B. beschrieben bei H.O. House, Modern Synthetic Reactions, zweite Auflage (Menlo Park, CA: The Benjamin/Cummings Publishing Company, (1972) oder bei J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, 4. Aufl. (New York): Wiley-Interscience, 1992), deren Beschreibungen hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen sind. Typischerweise wird, wie Fachleute des Gebiets erkennen werden, der Einbau von Substituenten an den aromatischen Ringen einfache elektrophile aromatische Additionsreaktionen einbeziehen. Strukturen 12 und 13 können in ähnlicher Weise zur Erzeugung von Polyketiden modifiziert werden.
Außerdem wurden die obigen rekombinanten Methoden zur Erzeugung einer Polyketid-Verbindung mit der allgemeinen Struktur (III) verwendet
der allgemeinen Struktur (IV)
und der allgemeinen Struktur (V)
Besonders bevorzugte Verbindungen der Strukturformeln (III), (IV) und (V) sind solche, worin: R² Wasserstoff ist und i 0 ist.
C. Experimenteller Teil
Nachfolgend stehen Beispiele der spezifischen Ausführungsformen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele dienen lediglich Veranschaulichungszwecken und in keinster Weise der Einschränkung des Rahmens der vorliegenden Erfindung.
Es wurden Anstrengungen unternommen, um die Genauigkeit bezüglich der verwendeten Zahlen (z.B. Mengen, Temperaturen, etc.) zu gewährleisten, doch sollte natürlich eine gewisse experimentelle Fehlerquote und Abweichung einkalkuliert werden.
Materialien und Methoden
Bakterienstämme, Plasmide und Kulturbedingungen. S. coelicolor CH999 wurde als ein Wirt zur Transformation durch alle Plasmide verwendet. Die Konstruktion dieses Stamms ist nachstehend beschrieben. Die DNA-Manipulationen wurden in Escherichia coli MC1061 vorgenommen. Die Plasmide wurden durch E. coli ET12567 (dam dcm hsdS Cm^r) passagiert (MacNeil, D. J. J. Bacteriol. (1988) 170:5607), um unmethylierte DNA vor der Transformation von S. coelicolor zu erzeugen. Die E. coli-Stämme wurden unter standardmäßigen Bedingungen gezüchtet. S. coelicolor-Stämme wurden auf R2YE-Agarplatten gezüchtet (Hopwood, D.A. et al. Genefic manipulation of Streptomyces. A laboratory manual. The John Innes Foundation: Norwich, 1985).
Manipulation von DNA und Organismen. Eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde unter Verwendung der Taq-Polymerase (Perkin Elmer Cetus) unter den vom Enzymhersteller empfohlenen Bedingungen durchgeführt. Standardmäßige in vitro-Techniken wurden für DNA-Manipulationen angewendet (Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (aktuelle Auflage)). E. coli wurde mit einem Bio-Rad E. coli-Pulsiergerät unter Anwendung der von Bio-Rad zur Verfügung gestellten Protokolle transformiert. S. coelicolor wurde mittels standardmäßiger Verfahrensweisen transformiert (Hopwood, D.A. et al. Genefic manipulation of Streptomyces. A laboratory manual. The John Innes Foundation: Norwich, 1985), und die Transformanten wurden unter Verwendung von 2 ml eines 500 mg/ml Thiostrepton-Überzugs ausgewählt.
Konstruktion von Plasmiden, die rekombinante PKS enthalten. Alle Plasmide waren Derivate von pRM5, wie nachstehend beschrieben. fren-PKS-Gene wurden über PCR mit 5'- und 3'-Restriktionsstellen amplifiziert, die die Gene entsprechend der Lokalisation der Klonierungsstellen auf pRM5 flankierten (d.h. PacI-NsiI für ORF1, NsiI-XbaI für ORF2 und XbaI-PstI für ORF3). Im Anschluss an die Subklonierung und Sequenzierung wurden die amplifizierten Fragmente anstelle der entsprechenden Fragmente in pRM5 kloniert, um die Plasmide für die Transformation zu erzeugen.
Herstellung und Reinigung von Polyketiden. Für das Anfangs-Screening wurde alle Stämme bei 30°C als zusammenfließende Rasen von jeweils 10 – 30 Platten, die jeweils etwa 30 ml Agarmedium enthielten, für 6 – 8 Tage gezüchtet. Zusätzliche Platten wurden je nach Bedarf erzeugt, um ausreichend Material für eine vollständige Charakterisierung zu erhalten. CH999 stellte eine negative Kontrolle beim Screening auf potenzielle Polyketide dar. Das Agar wurde fein zerhackt und mit Ethylacetat/1 % Essigsäure oder Ethylacetat:Methanol (4:1)/1 % Essigsäure extrahiert. Der konzentrierte Extrakt wurde dann durch eine Kieselgel-(Baker 40 mm)-Chromatographiesäule in Ethylacetat/1 % Essigsäure gespült. Alternativ wurde der Extrakt auf eine Florisil-Säule (Fisher Scientific) aufgebracht und mit Ethylacetat:Ethanol:Essigsäure (17:2:1) eluiert. Die primäre gelbe Fraktion wurde mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung eines 20–60 % Acetonitril/Wasser/1 % Essigsäure-Gradienten auf einer präparativen Umkehrphasen-(C-18)-Säule (Beckman) weiter gereinigt. Die Extinktion wurde bei 280 nm und 410 nm überwacht. Im allgemeinen betrug die Ausbeute an gereinigtem Produkt aus diesen Stämmen etwa 10 mg/l für Verbindungen 1 und 2 (4), und 5 mg/l für Verbindungen 7 und 8 (7).
SEK4 (12) wurde erzeugt und gereinigt wie folgt. CH999/pSEK4 wurde auf 90 Agarplatten (~ 34 ml/Platte) bei 30°C für 7 Tage gezüchtet. Der Agar wurde zerhackt und mit Ethylacetat/Methanol (4/1) in Gegenwart von 1 % Essigsäure (3 × 1000 ml) extrahiert. Im Anschluss an die Entfernung des Lösungsmittels unter Vakuum wurden 200 ml Ethylacetat, das 1 % Essigsäure enthielt, zugesetzt. Das Präzipitat wurde filtriert und weggestellt, und das Lösungsmittel wurde bis zur Trockenheit eingedampft. Das Produktgemisch wurde auf eine Florisil-Säule (Fisher Scientific) aufgebracht und mit Ethylacetat, das 3 % Essigsäure enthielt, eluiert. Die erste 100 ml-Fraktion wurde abgesammelt und auf 5 ml herunterkonzentriert. 1 ml Methanol wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde bei 4°C über Nacht gehalten. Das Präzipitat wurde mittels Filtration abgesammelt und mit Ethylacetat gewaschen, was 850 mg an reinem Produkt ergab. R_f = 0,48 (Ethylacetat mit 1 % Essigsäure). Die Ergebnisse aus der NMR-Spektroskopie an SEK4 sind in Tabelle 4 berichtet. FAB HRMS (NBA), M + H+, berechnete m/e 319.0818, beobachtete m/e 319.0820.
Um SEK15 (13) und SEK15b (16) zu erzeugen, wurde CH999/pSEK15 auf 90 Agarplatten gezüchtet, und das Produkt wurde in derselben Weise wie SEK4 extrahiert. Das Gemisch wurde auf eine Florisil-Säule (Ethylacetat mit 5 % Essigsäure) aufgebracht, und Fraktionen, die die Hauptprodukte enthielten, wurden kombiniert und bis zur Troc kenheit eingedampft. Die Produkte wurden unter Verwendung einer präparativen C-18-Umkehrphasen-HPLC (Beckman) weiter gereinigt (mobile Phase: Acetonitril/Wasser = 1/10 bis 3/5-Gradient in Gegenwart von 1 % Essigsäure). Die Ausbeute an SEK15 (13) betrug 250 mg. R_f = 0,41 (Ethylacetat mit 1 % Essigsäure). Die Ergebnisse aus der NMR-Spektroskopie von SEK4 sind in Tabelle 4 berichtet. FAB HRMS (NBA), M + H+, berechnete m/e 385.0923, beobachtete m/e 385.0920.
[1,2-¹³C₂]-Acetat-Fütterungsversuche. Zwei 2 l-Kolben, die jeweils 400 ml an modifiziertem NMP-Medium enthielten (Strauch, E. et al. Mol. Microbiol (1991) 5:289) wurden mit Sporen von S. coelicolor CH999/pRM18, CH999/pSEK4 oder CH999/pSEK15 beimpft und in einem Schüttler bei 30°C und 300 UpM inkubiert. Jedem Kolben wurden 50 mg Natrium-[1,2-¹³C₂]-Acetat (Aldrich) nach 72 und 96 Stunden zugegeben. Nach 120 Stunden wurden die Kulturen gepoolt und mit zwei 500-ml-Volumina an Ethylacetat/1 % Essigsäure extrahiert. Die organische Phase wurde rückbehalten und die Reinigung fortgesetzt, wie oben beschrieben. Die¹³C-NMR-Daten ergeben eine Anreicherung von etwa 2 – 3 % für das CH999/pRM18-Produkt; eine Anreicherung von 0,5 – 1 % für SEK4 und eine Anreicherung von 1 – 2 % für SEK15.
NMR-Spektroskopie. Alle Spektren wurden auf Varian XL-400 aufgezeichnet, außer der HETCOR-Analyse von RM18 (10) (8), die auf einem Nicolet NT-360 durchgeführt wurde. Die ¹³C-Spektren waren für eine kontinuierliche Breitband-Protonenentkopplung erforderlich. Für NOE-Studien von RM18 (10) wurde die eindimensionale Differenzmethode angewendet. Alle Verbindungen wurden in DMSO-d₆ (Sigma, 99+ Atom-% D) gelöst und die Spektren intern zum Lösungsmittel in Bezug gesetzt. Die Hydroxylresonanzen wurden durch Zugabe von D₂O (Aldrich, 99 Atom-% D) und Prüfen auf das Verschwinden des Signals identifiziert.
Beispiel 1
Herstellung von S. coelicolor CH999
Eine S. coelicolor-Wirtszelle, die zur Entfernung des nativen act-Genclusters gentechnisch hergestellt und als CH999 bezeichnet wurde, wurde unter Verwendung von S. coelicolor CH1 (Khosla, C. Molec. Microbiol. (1992) 6:3237), unter Anwendung der in
2 dargestellten Strategie konstruiert. (CH1 ist von S. coelicolor B385 hergeleitet (Rudd, B.A.M. Genetics of Pigmented Secondary Metabolites in Streptomyces coelicolor (1978) Ph.D. Thesis, University of East Anglia, Norwich, England). CH1 enthält den act-Gencluster, welcher für Enzyme codiert, die an der Biosynthese und dem Export des Polyketid-Antibiotikums Actinorhodin beteiligt sind. Das Cluster besteht aus den PKS-Genen, flankiert durch mehrere biosynthetische Post-PKS-Gene, einschließlich derer, die an der Cyclisierung, Aromatisierung und dem anschließenden chemischen Tailoring beteiligt sind (2A). Ebenfalls vorhanden sind die Gene, die für die Transkriptionsaktivierung der act-Gene verantwortlich sind. Das act-Gencluster wurde von CH1 unter Anwendung der homologen Rekombination deletiert, wie beschrieben bei Khosla, C. et al. Molec. Microbiol. (1992) 6:3237.
Im Einzelnen wurde Plasmid pLRermEts (2B) mit den folgenden Merkmalen konstruiert: einem ColEI-Replikon von pBR322, dem temperaturempfindlichen Replikon von pSG5 (Muth, G. et al. Mol. Gen. Genet. (1989) 219:341), Ampicillin- und Thiostrepton-Resistenzmarkern und einer Disruptionskassette, einschließlich eines 2 kb-BamHI/XhoI-Fragments vom 5'-Ende des act-Clusters, einem 1,5 kb ermE-Fragment (Khosla, C. et al. Molec. Microbiol. (1992) 6:3237) und einem 1,9 kb SphI/PstI-Fragment vom 3'-Ende des act-Clusters. Das 5'-Fragment erstreckte sich von der BamHI-Stelle 1 (Malpartida, F. und Hopwood, D.A. Nature (1984) 309:462; Malpartida, F und Hopwood, D.A. Mol. Gen. Genet. (1986) 205:66) bis stromabwärts einer XhoI-Stelle. Das 3'-Fragment erstreckte sich von der PstI-Stelle 20 stromaufwärts zur SphI-Stelle 19.2 (Fernandez-Moreno, M.A. et al. J. Biol. Chem. (1992) 267:19278). Die 5'- und 3'-Fragmente (als schraffierte DNA in 2 gezeigt) wurden in derselben relativen Orientierung wie im act-Cluster kloniert. CH1 wurde mit pLRermEts transformiert. Das Plasmid wurde anschließend durch nicht-selektives Abstreichen von Kandidat-Transformanten bei 39°C nachbehandelt. Mehrere Kolonien, die Lincomycin-resistent, Thiostrepton-empfindlich und zur Erzeugung von Actinorhodin unfähig waren, wurden isoliert und mittels Southern-Blotting geprüft. Einer davon wurde als CH999 bezeichnet.
Beispiel 2
Herstellung des rekombinanten Vektors ARMS
pRM5 (3) stellte das zur Exprimierung der PKSs in CH999 verwendete Shuttle-Plasmid dar. Es enthält ein ColEI-Replikon, um die gentechnische Herstellung in E. coli zu ermöglichen, ein entsprechend verkürztes SCP2*-(geringe Kopienzahl)-Streptomyces-Replikon und das actII-ORF4-Aktivator-Gen vom act-Cluster, welches die Transkription von den act-Promotoren während des Übergangs von der Wachstumsphase zur stationären Phase im vegetativen Mycel induziert. Wie in 3 gezeigt, trägt pRM5 das divergente actI/actIII-Promotorpaar, zusammen mit bequem geeigneten Klonierungsstellen, um die Insertion einer Vielzahl gentechnisch hergestellter PKS-Gene stromabwärts beider Promotoren zu erleichtern. pRM5 fehlt der par-Locus von SCP2*; als Folge dessen ist das Plasmid leicht instabil (etwa 2 % Verlust in Abwesenheit von Thiostrepton). Dieses Merkmal wurde absichtlich eingeführt, um eine schnelle Bestätigung dessen zu ermöglichen, dass ein Phänotyp von Interesse eindeutig dem Plasmidgetragenen Mutanten PKS zugeordnet werden konnte. Die rekombinanten PKSs von pRM5 werden etwa am Übergang von der exponentiellen zur stationären Wachstumsphase bei guten Ausbeuten exprimiert.
pRM5 wurde wie folgt konstruiert. Ein 10,5 kb SphI/HindIII-Fragment von plJ903 (das einen Abschnitt des Fertilitätslocus und den Replikationsursprung von SCP2*, ebenso wie den ColEI-Replikationsursprung und das β-Lactamase-Gen von pBR327 enthielt) (Lydiate, D.J. Gene (1985) 35:223) wurde mit einer 1,5 kb-HindIII/SphI tsr-Genkassette zum Erhalt von pRM1 ligiert. pRM5 wurde durch Einführen der folgenden beiden Fragmente zwischen die einzelnen HindIII- und EcoRI-Stellen von pRM1 konstruiert: ein 0,3 kb HindIII/HpaI-(stumpfes)-Fragment, das einen Transkriptionsterminator von Phage fd trug (Khosla, C. et al. Molec. Microbiol. (1992) 6:3237), und ein 10 kb-Fragment vom act-Cluster, das sich von der Ncol-Stelle (1 kb stromaufwärts des actII-ORF4-Aktivator-Gens) (Hallam, S.E. et al., Gene (1988) 74:305; Fernandez-Moreno, M.A. et al. Cell (1991) 66:769; Caballero, J. L. Mol. Gen. Genef. (1991) 230:401) bis zur PstI-Stelle stromabwärts der actI-VII-IV-Gene erstreckte (Fernandez-Moreno, M.A. et al. J. Biol. Chem. (1992) 267:19278).
Zur Erleichterung der Expression jeglichen gewünschten rekombinanten PKS unter der Kontrolle des actI-Promotors (welcher durch das actII-ORF4-Genprodukt aktiviert wird), wurden Restriktionsstellen für PacI, NsiI, XbaI und PstI in die act-DNA in interzistronischen Positionen eingebaut.
In pRM5, ebenso wie in allen hierin beschriebenen PKS-Expressionsplamiden, wurden ORF1, 2 und 3-Allele zwischen diesen Stelle als mit ihren eigenen PBSs konstruierten Kassetten kloniert.
Im Einzelnen sind in den meisten natürlich vorkommenden aromatischen Polyketidsynthase-Genclustern in Actinomyceten ORF1 und ORF2 translational gekoppelt. Um die Konstruktion von rekombinanten PKSs zu erleichtern, wurden die hierin verwendeten ORF1- und ORF2-Allele als unabhängige (ungekoppelte) Kassetten kloniert. Für act-ORF1 wurde die folgende Sequenz in pRM5 eingebaut:
CCACCGGACGAACGCATCGATTAATTAAGGAGGACCATCATG, worin die nicht-unterstrichene Sequenz Stromaufwärts-DNA von der actI-Region entspricht, TTAATTAA die PacI-Erkennungsstelle ist und ATG das Startcodon von act-ORF1 ist. Die folgende Sequenz wurde zwischen act-ORF1 und ORF konstruiert: NTGAATGCATGGAGGAGCCATCATG, worin TGA und ATG die Stopp- und Startcodons von ORF1 bzw. ORF2 sind, ATGCAT die NsiI-Erkennungsstelle ist, und der Austausch von N (A in act-DNA, A oder G in Allelen von anderen PKSs) durch ein C zu einer Translations-Entkopplung führt. Die folgende Sequenz wurde stromabwärts des act-ORF2 eingebaut: TAATCTAGA, worin TAA das Stoppcodon ist und TCTAGA die XbaI-Erkennungsstelle ist. Dies ermöglichte die Fusion von act-ORF1 und ORF2 (wie oben konstruiert) an eine Xbal-Stelle, die stromaufwärts des act-ORF3 eingebaut worden war (Khosla, C. et al. Molec. Microbiol. (1992) 6:3237). Als eine Kontrolle wurde pRM2 identisch zu pRM5 konstruiert, dem aber jegliche eingebaute Sequenzen fehlten. ORF1 und ORF2 in pRM2 sind translational gekoppelt. Der Vergleich der Produktprofile von CH999/pRM2 und CH999/pRM5 ergab, dass die hierin beschriebene Entkopplungsstrategie keinen nachweisbaren Einfluss auf die Produktverteilung oder die Produktmengen zeigte.
Beispiel 3
Polyketide, produziert unter Verwendung von mit pRM5 transformiertem CH999
Plasmid pRM5 wurde in S. coelicolor-CH999 unter Anwendung standardmäßiger Techniken eingeführt. (Siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (aktuelle Auflage). Mit pRM5 transformierte CH999 erzeugten eine große Menge an gelblich-braunem Material. Die beiden am reichlichsten vorhandenen Produkte wurden mittels NMR und Massenspektroskopie als Aloesaponarin II (2) (Bartel, P.L. et al., J. Bacteriol. (1990) 172:4816) und sein carboxyliertes Analogon 3,8-Dihydroxy-1-methylanthrachinon-2-carbonsäure (1) (Cameron, D.W. et al. Liebigs Ann. Chem. (1989) 7:699) charakterisiert (4). Es wird angenommen, dass 2 von 1 durch nicht-enzymatische Decarboxylierung abgeleitet ist (Bartel, P.L. et al. J. Bacteriol (1990) 172:4816). Verbindungen 1 und 2 waren in einem Molverhältnis von etwa 1:5 vorhanden. Etwa 100 mg des Gemischs konnten ohne weiteres aus einem Liter der Kultur ausgereinigt werden. Das CH999/pRM5-Wirts-Vektorsystem funktionierte daher wie erwartet in der Erzeugung ausreichender Mengen eines stabilen, lediglich minimal modifizierten Polyketid-Metaboliten. Die Produktion von 1 und 2 stimmt mit dem vorgeschlagenen Weg der Actinorhodin-Biosynthese überein (Bartel, P.L. et al. J. Bacteriol. (1990) 172:4816). Beide Metaboliten, ähnlich dem Actinorhodin-Rückgrat, stammen von einem 16-Kohlenstoff-Polyketid mit einer einzigen Ketoreduktion bei C-9 ab.
Wurde CH999 mit pSEK4 transformiert, das identisch zu pRM5 war mit Ausnahme der Ersetzung eines 140 bp-SphI/SalI-Fragments innerhalb des act-KR-Gens durch das SphI/SalI-Fragment von pUC19, so erzeugte der resultierende Stamm reichliche Mengen des aromatischen Polyketids SEK4 (12). Die exakte Struktur dieses Produkts ist von Desoxyerythrolaccin geringfügig verschieden (Bartel, P.L. et al. J. Bacteriol. (1990) 172:4816). Allerdings bestätigten isotope Markierungsstudien in vivo unter Verwendung von 1,2-¹³C₂-markiertem Acetat, dass das Polyketid-Rückgrat von 8 Acetaten abgeleitet ist. Darüber hinaus stimmt die aromatische Region des ¹H-Spektrums, ebenso wie das ¹³C-NMR-Spektrum dieses Produkts, mit einer tricyclischen Struktur ähnlich der von 1 überein, wobei ihr aber jegliche Ketoreduktion fehlt (siehe Tabelle 4).
Beispiel 4
Konstruktion und Analyse von Hybrid-Polyketidsynthasen
A. Konstruktion von Hybrid-PKS einschließlich Komponenten von act-, gra- und tcm-PKS
1 zeigt die für die Synthese der Kohlenstoff-Rückgrate von Actinorhodin (3), Granaticin (4) und Tetracenomycin (5) verantwortlichen PKS (Strukturen sind in 5 gezeigt), welche homologe mutmaßliche KS/AT- und ACP-Untereinheiten enthalten, als auch das ORF2-Produkt. Die act- und gra-PKS weisen auch KRs auf, die in der tcm-PKS fehlen. Entsprechende Proteine von jedem Cluster zeigen einen hohen Grad an Sequenzidentität. Die prozentualen Identitäten zwischen den entsprechenden PKS-Proteinen in den drei Clustern sind wie folgt: KS/AT: act/gra 76, act/tcm 64, gra/tcm 70; CLF: act/gra 60, act/tcm 58, gra/tcm 54; ACP: act/gra 60, act/tcm 43, gra/tcm 44. Die act- und gra-PKS synthetisieren identische 16-Kohlenstoff-Rückgrate, die von 8 Acetatresten mit einer Ketoreduktion bei C-9 abgeleitet sind (6). Im Gegensatz dazu und wie ebenfalls in 6 gezeigt, unterscheidet sich das tcm-Polyketid-Rückgrat in der insgesamten Länge der Kohlenstoffkette (20 anstelle von 16 Kohlenstoffen), dem Fehlen jeglicher Ketoreduktion, und der Regiospezifität der ersten Cyclisierung, welche zwischen Kohlenstoffen 9 und 14, anstelle von Kohlenstoffen 7 und 12 für act und gra auftritt.
Bei einem Versuch, neuartige Polyketide zu erzeugen, die in einem Bereich von Eigenschaften abweichen, als auch die Aspekte der Programmierung der aromatischen PKS zu erleuchten, wurde eine systematische Reihe von minimalen PKS-Genclustern unter Verwendung verschiedener Permutationen der ORF1-(das die KS/AT-Untereinheit codiert), ORF2-(das die CLF-Untereinheit codiert) und ORF3-(das die ACP-Untereinheit codiert)-Genprodukte von den act-, gra- und tcm-Genclustern in pRM5 anstelle der existierenden act-Gene kloniert, wie in Tabelle 1 gezeigt. Die resultierenden Plasmide wurden zum Transformieren von CH999 wie oben verwendet.
Die Analyse der Produkte der rekombinanten PKSs, die verschiedene Permutationen unter den KS/AT, ORF2-Produkt und ACP-Untereinheiten der PKSs enthalten (alle Konstrukte enthielten außerdem die act-KR-, Cyclase- und Dehydratase-Gene) zeigten an, dass die Synthasen in drei Kategorien gruppiert werden konnten (Tabelle 1): solche, die keinerlei Polyketid produzierten; solche, die Verbindung 1 produzierten (zusätzlich zu einer geringen Menge von 2); und solche, die ein neuartiges Polyketid 9 produzierten (bezeichnet als RM20) (6). Die Struktur von 9 legt nahe, dass der Polyketid-Rückgrat-Vorläufer dieses Moleküls von 10 Acetatresten mit einer einzelnen Ketoreduktion an der C-9-Position abgeleitet ist.
Um den Einfluss der act-KR auf die Reduktions- und Cyclisierungsmuster einer heterologen Polyketidkette zu untersuchen, wurde auch pSEK15 konstruiert, welche tcm-ORFs 1–3 enthielt, dem aber die acf-KR fehlte. (Die Deletion im act-KR-Gen in diesem Konstrukt war zu der im pSEK4 identisch.) Die Analyse von CH999/pSEK15 ergab das Kettenprodukt aus 20 Kohlenstoffen, SEK15 (13), welches Tetracenomycin C oder seinen Shunt-Produkten ähnelte, doch nicht identisch dazu war. Die NMR-Spektroskopie stimmte auch mit einem völlig unreduzierten Decaketid-Rückgrat überein (siehe Tabelle 4).
Alle act/gra-Hybride erzeugten die Verbindung 1, was mit den identischen Strukturen der angenommenen Actinorhodin- und Granaticin-Polyketide übereinstimmte. In jedem Fall, bei dem ein Produkt von einem tcm/act-Hybrid isoliert konnte, war die Kettenlänge des Polyketids identisch zu der des natürlichen Produkts entsprechend der Quelle von ORF2. Dies impliziert, dass das ORF2-Produkt, und nicht ACP oder KS/AT, die Länge der Kohlenstoffkette kontrolliert. Da weiterhin alle Polyketide, die durch die hierin beschriebenen Hybride erzeugt werden, mit Ausnahme derer, denen die KR fehlt (CH999/pSEK4 und CH999/pSEK15), eine einzige Ketoreduktion vollzogen, kann gefolgert werden, dass: (i) die KR zum Erfolgen der Ketoreduktion sowohl erforderlich als auch ausreichend ist; (ii) diese Reduktion immer an der C-9-Position im endgültigen Polyketid-Rückgrat erfolgt (vom Carboxylende der Kette aus gezählt), und (iii) unreduzierte Polyketide zwar alternative Cyclisierungsmuster in entstehenden Polyketidketten, die eine Ketoreduktion vollzogen haben, annehmen können, doch die Regiochemie der ersten Cyclisierung durch die Position des resultierenden Hydroxyls vorgegeben ist, unabhängig davon, wie diese Cyclisierung im nicht-reduzierten Produkt erfolgt. In anderen Worten könnte die tcm-PKS durch Aufnahme einer Ketoreduktase so konstruiert werden, dass sie eine neue Cyclisierungsspezifität zeigt.
Ein auffälliges Merkmal von RM20 (9) ist das Cyclisierungsmuster auf erste Cyclisierung hin. Die Isolierung von Mutactin (6) von einer actVII-Mutante ließ vermuten, dass das actVII-Produkt und sein tcm-Homologon die Cyclisierung des zweiten Rings in der Biosynthese von Actinorhodin (3) bzw. Tetracenomycin (5) katalysiert (Sherman, D.H. et al. Tetrahedron (1991) 47:6029; Summers, R.G. et al. J. Bacteriol. (1992) 174:1810). Das Cyclisierungsmuster von RM20 (9) ist von dem von 1 und Tetracenomycin F1 trotz des Vorhandenseins des actVII-Gens auf pRM20 (9) verschieden. Es scheint daher so zu sein, dass die act-Cyclase keine längeren Polyketidketten cyclisieren kann.
Unerwarteterweise erzeugte der Stamm, der lediglich die minimale tcm-PKS (CH999/pSEK33) enthielt, zwei Polyketide, SEK15 (13) und SEK15b (16), wie in 8 dargestellt, in annähernd gleichen Mengen. Verbindungen (13) und (16) wurden auch aus CH999/pSEK15 isoliert, wobei allerdings größere Mengen an Verbindung (13) als an Verbindung (16) aus diesem Konstrukt isoliert wurden.
SEK15b ist eine neue Verbindung, deren Struktur durch eine Kombination aus NMR-Spektroskopie, Natrium-[1,2-¹³C₂]-Acetat-Fütterungsversuchen und Massenspektroskopie erleuchtet wurde. Die Ergebnisse aus ¹H- und ¹³C-NMR zeigten auf, dass SEK15b aus einer unreduzierten Anthrachinon-Komponente und einer Pyron-Komponente bestand. Die Natrium-[1,2-¹³C₂]-Acetat-Fütterungsversuche bestätigten, dass die Kohlenstoffkette von SEK15b von 10 Acetateinheiten abgeleitet war. Die aus dem ¹³C-NMR-Spektrum der angereicherten SEK15b-Probe errechneten Kopplungskonstanten erleichterten die Peak-Zuordnung. Die Fast Atom Bombardment-(FAB)-Massenspektroskopie ergab ein Molekulargewicht von 381 (M + H⁺), was mit C₂₀H₁₂O₈ übereinstimmt. Ein Deuterium-Austausch wurde zur Bestätigung des Vorhandenseins jedes Hydroxyls in SEK15b angewendet.
Um die Freiheitsgrade zu identifizieren, die einer entstehenden Polyketidkette zum Cyclisieren in Abwesenheit einer aktiven Cyclase in vivo zur Verfügung standen, wurden durch rekombinantes S. coelicolor-CH999/pRM37 erzeugte Polyketide analysiert (Mc-Daniel et al. (1993) supra). Die durch pRM37 codierten biosynthetischen Enzyme sind die tcm-Ketosynthase/Acyltransferase (KS/AT), der tcm-Kettenlängen-bestimmen-de Faktor (CLF), das tcm-Acyl-Trägerprotein (ACP) und die act-Ketoreduktase (KR).
Zwei neue Verbindungen, RM20b (14) und RM20c (15) (8) wurden im Kulturmedium von CH999/pRM37 entdeckt, die zuvor RM20 (9) ergeben hatten. Die relativen Mengen der drei rückgewonnenen Verbindungen betrugen 3:7:1 (RM20:RM20b:RM20c). Die Strukturen von (14) und (15) wurden durch eine Kombination aus Massenspektroskopie, NMR-Spektroskopie und Isotop-Markierungsexperimenten erhellt. Die ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren ließen vermuten, dass RM20b und RM20c Diastereomere waren, die jeweils eine Pyron-Komponente enthielten. Optische Rotationen ([α])_D ²⁰ wurden mit +210.8° für RM20b (EtOH, 0,55 %) und +78,0° für RM20c (EtOH, 0,33 %) festgestellt. Natrium-[1,2-¹³C₂]-Acetat-Fütterungsversuche bestätigten, dass die Kohlenstoffkette von RM20b (und durch Interferenz RM20c) von 10 Acetateinheiten hergeleitet war. Deuterium-Austauschstudien wurden vorgenommen, um die ¹H-NMR-Peaks entsprechend den potenziellen Hydroxylgruppen sowohl auf RM20b als auch RM20c zu identifizieren. Protonen-Kopplungskonstanten wurden aus den Ergebnissen von ¹H-NMR und eindimensionalen Entkopplungsexperimenten errechnet. Im Einzelnen zeigten die Kopplungsmuster im oberen Feldbereich des Spektrums ein 5-Protonen-Spinsystem von zwei Methylengruppen, die ein zentrales Carbinolmethin-Proton umgaben. Eine hochauflösende Fast Atom Bombardment-(FAB)-Massenspektroskopie ergab Molekulargewichte von 519.0056 (M = Cs⁺) für RM20b und 387.1070 (M + H⁺) für RM20c, was mit C₂₀H₁₈O₈ übereinstimmt (M + C⁺, 519.0056; M + H⁺, 387.1080). Basierend auf diesen Daten wurden die Strukturen (14) und (15) (8) RM20b bzw. RM20c zugeordnet.
Die Daten aus der ¹H- und ¹³C-NMR ergaben, dass die Kopplungskonstanten zwischen H-9 und den geminalen Protonen auf C-8 12,1 bzw. 12,2 und 2,5 bzw. 2,2 Hz für RM20b bzw. RM20c waren. Die Kopplungskonstanten zwischen H-9 und den geminalen Protonen auf C-10 waren 9,6 bzw. 9,7 und 5,7 bzw. 5,8 Hz für RM20b bzw. RM 20c. Diese Werte sind für ein J_a,a (J_9a,8a oder J_9a,10a) und J_a,e (J_9a,8e oder J_9a,10e)-Kopplungsmuster typisch und zeigen eine axiale Position für H-9 sowohl bei RM20b als auch RM20c an. Im Gegensatz dazu waren die chemischen Verschiebungen der C-7-Hydroxyle auf den beiden Molekülen 16,18 und 6,14 ppm für RM20b bzw. RM20c. Die se Werte zeigen eine Wasserstoffbindung zwischen dem C-7-Hydroxyl und einem geeignet positionierten Akzeptoratom bei RM20b, doch nicht bei RM20c an. Die wahrscheinlichsten Kandidat-Akzeptoratome für diese Wasserstoffbindung sind der C-13-Carbonylsauerstoff im konjugierten Pyron-Ringsystem, oder der Brückensauerstoff im isolierten Pyronring. Ersterer erscheint als wahrscheinlich, da eine Unterscheidung zwischen (14) und (15) unmöglich wäre, wenn letzteres der Fall wäre. Weiterhin ergab ein Vergleich der ¹³C-NMR-Spektren von RM20b und RM20c, dass die größten Unterschiede zwischen (14) und (15) in den chemischen Verschiebungen der Kohlenstoffe lagen, die den konjugierten Pyronring ausmachen (+5,9, –6,1, +8,9, –7,8 und +2,0 ppm für C-11, C-12, C-13, C-14 bzw. C-15). Ein derartiges Muster aus abwechselnden Feldaufwärts- und Feldabwärts-Verschiebungen lässt sich durch die Tatsache erklären, dass das C-7-Hydroxyl an das C-13-Carbonyl Wasserstoff-gebunden ist, da die Wasserstoffbindung erwartetermaßen die Elektronendichte um C-11, C-13 und C-15 vermindern würde, doch die Elektronendichte um C-12 und C-14 erhöhen würde. Um die Zuordnung der C-7/C-13-Wasserstoffbindung zu bestätigen, wurden die austauschbaren Protonen RM20b und RM20c durch Deuterium ersetzt (durch Inkubieren in Gegenwart von D₂O), und die Proben wurden mittels ¹³C-NMR analysiert. Der C-13-Peak in RM20b, doch nicht RM20c, vollzog eine Feldaufwärts-Verschiebung (1,7 ppm), was sich durch eine schwächere nicht-kovalente C-7/C-13-Bindung in RM20b erklären lässt, wenn Wasserstoff durch Deuterium ersetzt wird. Um eine Wasserstoffbindung mit dem C-13-Carbonyl zu bilden, muss das C-7-Hydoxyl von RM20b die äquatoriale Position besetzen. Daraus kann gefolgert werden, dass die C-7- und C-9-Hydroxyle auf derselben Seite (syn) des konjugierten Ringsystems im Haupt-Isomer (RM20b) liegen, dagegen auf entgegengesetzten Seiten (anti) im Neben-Isomer (RM20c).
Kein Polyketid konnte in CH999/pRM15, /pRM35 und /pRM36 nachgewiesen werden. Folglich sind lediglich einige ORF1-ORF2-Kombinationen funktionell. Da jede Untereinheit in zumindest einer rekombinanten Synthase funktionell war, stellen Protein-Expressions/Faltprobleme eine unwahrscheinliche Ursache dar. Dagegen stellen eine fehlerhafte oder hemmende Verbindung zwischen den verschiedenen Untereinheiten dieser Enzymkomplexe, oder die Biosynthese von (verkümmerten) kurzen Kettenprodukten, die schnell abgebaut werden, plausible Erklärungen dar.
B. Konstruktion von Hybrid-PKSs einschließlich Komponenten von act- und fren-PKSs
Streptomyces roseofulvus produziert sowohl Frenolicin B (7) (Iwai, Y. et al. J. Antibiot. (1978) 31:959) als auch Nanaomycin A (8) (Tsuzuki, K. et al. J. Antibiot. (1986) 39:1343). Ein 10 kb-DNA-Fragment (hierin bezeichnet als der fren-Locus) wurde aus einer Genombank von S. roseofulvus (Bibb, M.J. et al., vorgelegt) unter Verwendung einer DNA kloniert, die KS/AT- und KR-Komponenten der act-PKS von S. coelicolor A3(2) als einer Sonde codiert (Malpartida, F. et al. Nature (1987) 325:818). (Siehe 7 für Strukturdarstellungen.) Die DNA-Sequenzierung des fren-Locus ergab das Vorhandensein von (unter anderem) Genen mit einem hohen Grad an Identität zu denen, die act, KS/AT, CLF, ACP, KR und Cyclase codieren.
Zur Erzeugung der neuen Polyketide, des ORF1, wurden die 2- und 3-act-Gene, die in pRM5 vorhanden sind, durch die entsprechenden fren-Gene ersetzt, wie in Tabelle 2 gezeigt. S. coelicolor CH999, das wie oben beschrieben konstruiert war, wurde mit diesen Plasmiden transformiert. (Die die act-KR codierenden Gene und die act-Cyclase waren ebenfalls auf jedem dieser genetischen Konstrukte vorhanden.) Basierend auf den Ergebnissen von ähnlichen Experimenten mit act- und tcm-PKSs, wie oben beschrieben, stand zu erwarten, dass die act-KR zum Reduzieren der Produkte aller funktionaler rekombinanter PKSs fähig sein würde, wohingegen die Fähigkeit der act-Cyclase zum Katalysieren der zweiten Cyclisierung von der Kettenlänge des Produkts der fren-PKS abhängen würde.
Die in Tabelle 2 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass die meisten der Transformanten funktionale PKSs exprimierten, wie anhand ihrer Fähigkeit analysiert, aromatische Polyketide zu erzeugen. Die Strukturanalyse der Hauptprodukte ergab, dass die Erzeugerstämme in zwei Kategorien eingeteilt werden konnten: solche, die Verbindung 1 synthetisierten (zusammen mit einer geringen Menge ihres decarboxylierten Nebenprodukts (2), und jene, die ein Gemisch aus Verbindungen 1, 10 und 11 in einem groben Verhältnis von 1:2:2 synthetisierten. (Geringe Mengen von 2 wurden ebenfalls in allen Stämmen, die 1 erzeugten, gefunden.) Verbindungen 1 und 2 waren bereits zuvor als Naturprodukte beobachtet worden und waren die durch eine PKS, die gänzlich aus act-Untereinheiten bestand, erzeugten Metaboliten, wie in Beispiel 3 beschrieben. Ver bindungen 10 und 11 (bezeichnet als RM18 bzw. RM18b) sind neuartige Strukturen, deren chemische Synthese oder Isolierung als Naturprodukte bisher nicht berichtet worden ist.
Die Strukturen von 10 und 11 wurden durch eine Kombination von Massenspektroskopie, NMR-Spektroskopie und Isotop-Markierungsexperimenten geklärt. Die ¹H- und ¹³C-spektralen Zuordnungen sind in Tabelle 3 gezeigt, zusammen mit ¹³C-¹³C-Kopplungskonstanten für 10, wie durch Natrium-[1,2-¹³C₂]-Actat-Fütterungsversuche (unten beschrieben) erhalten. Irrtumsfreie Zuordnungen für Verbindung 10 wurden mit dem 1 D Kern-Overhauser-Effekt (NOE) und heteronuklearen Korrelations-(HETCOR)-Studien im fernen Bereich erhalten. Ein Deuterium-Austausch bestätigte das Vorhandensein von Hydroxylen bei C-15 der Verbindung 10 und C-13 der Verbindung 11. Eine Felddesorptions-Massenspektrometrie (FD-MS) von 2 ergab ein Molekulargewicht von 282, was mit C₁₇H₁₄O₄ übereinstimmt (282.2952).
Frühere Studien zeigten, dass das Polyketid-Rückgrat von 2 (Bartel, P.L. et al. J. Bacteriol. (1990) 172:4816) (und durch Interferenz, 1) von aufeinanderfolgenden Kondensationen von 8 Acetatresten mit einer einzelnen Ketoreduktion bei C-9 hergeleitet ist. Es kann auch argumentiert werden, dass Nanaomycin (8) aus einem identischen Kohlenstoff-Rückgrat entsteht. Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass Nanaomycin ein Produkt der fren-PKS-Gene in S. roseofulvus ist. Die Regiospezifität der ersten Cyclisierung, die zur Bildung von 1 führt, ist durch die Position der Ketoreduktion gelenkt, wohingegen jene der zweiten Cyclisierung durch die act-Cyclase kontrolliert wird (Zhang, H.L. et al. J. Org. Chem. (1990) 55:1682).
Um das Kohlenstoff-Rückgrat von RM18 (10) zu verfolgen, wurden in vivo-Fütterungsversuche unter Verwendung von [1,2-¹³C₂]-Acetat an CH999/pRM18 vorgenommen, gefolgt von einer NMR-Analyse der markierten RM18 (10). Die ¹³C-Kopplungsdaten (in Tabelle 3 zusammengefasst) zeigen, dass das Polyketid-Rückgrat von RM18 (10) von 9 Acetatresten hergeleitet ist, gefolgt von einer terminalen Decarboxylierung (die C-2-¹³C-Resonanz erscheint als ein verstärktes Singulett), welche vermutlich nicht-enzymatisch erfolgt. Weiterhin legt die Abwesenheit einer Hydroxylgruppe an der C-9-Position nahe, dass eine Ketoreduktion bei diesem Kohlenstoff erfolgt. Da diese beiden Merkmale erwartungsgemäß im mutmaßlichen Frenolicin-(7)-Rückgrat auftreten sollten, legen die Ergebnisse nahe, dass, über die Synthese von Nanaomycin hinaus, die fren-PKS-Gene für die Biosynthese von Frenolicin in S. roseofulvus verantwortlich sind. Dies scheint der erste eindeutige Fall einer PKS mit relaxierter Kettenlängen-Spezifität zu sein. Allerdings ist, anders als beim mutmaßlichen Rückgrat des Frenolicin, das C-17-Carbonyl von RM18 (10) nicht reduziert. Dies könnte entweder die Abwesenheit von pRM18 einer spezifischen Ketoreduktase, Dehydratase und einer Enoylreduktase (im fren-Gencluster in S. roseofulvus vorhanden) widerspiegeln, oder es könnte einen unterschiedlichen Ursprung der Kohlenstoffe 15 – 18 in Frenolicin wiederspiegeln.
Die Regiospezifität der ersten Cyclisierung, die zur Bildung von RM18 (10) führt, ist durch die Position der Ketoreduktion begleitet; die zweite Ccyclierung erfolgt jedoch unterschiedlich von der bei 7 oder 1 und ist ähnlich dem Cyclisierungsmuster, das bei RM20 (9) beobachtet wird, einem durch tcm-PKS produzierten Decaketid, wie oben beschrieben. Daher könnte, wie im Falle von RM20 (9), argumentiert werden, dass die act-Cyclase die zweite Cyclisierung des RM18-Vorläufers nicht katalysieren kann, oder dass ihre anschließenden Cyclisierungen, welche vermutlich nicht-enzymatisch erfolgen, durch temporäre Differenzen in der Freisetzung verschiedener Abschnitte der entstehenden Polyketidkette in eine wässrige Umgebung vorgegeben sind. Im Hinblick auf die Fähigkeit von CH999/pRM18 (und CH999/pRM34), 1 zu erzeugen, kann die Möglichkeit ausgeschlossen werden, dass die Cyclase sich nicht mit der fren-PKS (KS/AT, CLF und ACP) verbinden kann. Eine wahrscheinlichere Erklärung ist die, dass die act-Cyclase keine Substrate mit veränderten Kettenlängen erkennen kann. Dies würde auch mit dem mutmaßlichen Biosyntheseschema für RM20 (9) übereinstimmen.
Ein Vergleich der Produktprofile der in Tabelle 2 berichteten Hybrid-Synthasen mit analogen Hybriden zwischen act- und tcm-PKS-Komponenten (Tabelle 1) unterstützt die Hypothese, dass das ORF2-Produkt der Kettenlängen-bestimmende Faktor (CLF) ist. Die Herstellung der Verbindungen 9, 10 und 11 über Cyclisierung der Enzymgebundenen Ketide ist in 8 schematisch dargestellt.
Beispiel 5
Konstruktion und Analyse von modularen Polyketidsynthasen
Expressionsplasmide, die rekombinante modulare DEBS-PKS-Gene enthielten, wurden durch schrittweises Übertragen von DNA von einem temperaturempfindlichen "Spender"-Plasmid, d.h. einem Plasmid, das zur Replikation bei einer ersten, permissiven Temperatur fähig und zur Replikation bei einer zweiten, nicht-permissiven Temperatur unfähig ist, auf einen "Empfänger"-Shuttle-Vektor über ein doppeltes Rekombinationsereignis konstruiert, wie in 10 dargestellt. pCK7 (11), ein Shuttle-Plasmid, das die vollständigen eryA-Gene enthielt, die ursprünglich von pSI (Tuan et al. (1990) Gene 90:21) kloniert wurden, wurde wie folgt konstruiert: ein 25,6 kb-SphI-Fragment von pSI wurde in die SphI-Stelle von pMAK705 inseriert (Hamilton et al. (1989) J. Bacteriol. 171:4617), was pCK6 (Cm^R), ein Spenderplasmid, das enAII, enAIII und das 3'-Ende von eryAI enthielt, ergab. Die Replikation dieses temperaturempfindlichen pSC101-Derivats erfolgt bei 30°C, wird aber bei 44°C zum Stillstand gebracht. Das Empfängerplasmid, pCKS (Ap^R, Tc^R), enthält ein 12,2 kb-eryA-Fragment vom eryAI-Startcodon (Caffrey et al. (1992) FEBS Lett. 304:225) zur KcmI-Stelle nahe dem Beginn von eryAII, ein 1,4 kb-EcoRi – BsmI-pBR322-Fragment, das das Tetracyclin-Resistenz-gen(Tc) codiert, und ein 4,0 kb NotI – EcoRI-Fragment vom Ende von eryAIII. PacI, NdeI und die ribosomalen Bindungsstellen wurden bei dem eryAI-Startcodon in pCKS eingebaut. pCK5 ist ein Derivat von pRMS (McDaniel et al. (1993) supra). Die 5'- und 3'-Regionen von Homologie (10, schraffierte und unschraffierte Bereiche) sind 4,1 kb bzw. 4,0 kb. MC1061-E. coli wurde mit pCKS und pCK6 transformiert (siehe Sambrook et al., supra) und einer Carbenicillin- und Chloramphenicol-Selektion bei 30°C unterzogen.
Die beide Plasmide (Ap^R, Cm^R) beherbergenden Kolonien wurden dann nochmals bei 44°C auf Carbenicillin- und Chloramphenicol-Platten abgestrichen. Duch lediglich ein einziges Rekombinationsereignis zwischen den beiden Plasmiden gebildete Cointegrates waren lebensfähig. Die überlebenden Kolonien wurden bei 30°C unter Carbenicillin-Selektion vermehrt, wobei die Auflösung der Cointegrates über ein zweites Rekombinationsereignis forciert wurde. Um durch pCK7-Rekombinanten anzureichern, wurden die Kolonien nochmals auf Carbenicillin-Platten bei 44°C abgestrichen. Etwa 20 % der resultierenden Kolonien zeigten den gewünschten Phänotyp (Ap^R, Tc^S, Cm^S). Die endgültigen pCK7-Kandidaten wurden über Restriktionskartierung gründlich geprüft. Ein Kon trollplasmid, pCK7f, welches einen Frameshift-Fehler in eryAl enthält, wurde in ähnlicher Weise konstruiert. pCK7 und pCK7f wurden in E. coli-ET12567 transformiert (MacNeil (1988) J. Bacteriol. 170:5607), um unmethylierte Plasmid-DNA zu erzeugen, und anschließend in Streptomyces coelicolor-CH999 unter Anwendung standardmäßiger Protokolle eingebracht (Hopwood et al. (1985) Genetic manipulation of Streptomyces. A laboratory manual. The John Innes Foundation: Norwich).
Auf das Wachstum von CH999/pCK7 auf R2YE-Medium hin, erzeugte der Organismus reichliche Mengen der beiden Polyketide (X). Die Zugabe von Propionat (300 mg/l) zum Wachstumsmedium ergab einen etwa zweifachen Anstieg der Ausbeute des Polyketidprodukts. Die Protonen- und ¹³C-NMR-Spektroskopie, in Verbindung mit Propion-1-¹³C-säure-Fütterungsversuchen, bestätigte das Hauptprodukt als 6dEB (17) (> 40 mg/l). Das Nebenprodukt wurde als 8,8a-Desoxyoleandolid (18) (> 10 mg/l) bestätigt, welches offensichtlich von einer Acetat-Startereinheit anstatt des Propionats im 6dEB-Biosyntheseweg stammt. ¹³C₂-Natriumacetat-Fütterungsversuche bestätigten die Aufnahme von Acetat in (18). Drei hochmolekulare Proteine (> 200 kDa), vermutlich DEBS1, DEBS2 und DEBS3 (Caffrey et al. (1992) FEBS Lett. 304:225) wurden ebenfalls in den Rohextrakten von CH999/pCK7 über die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese beobachtet. Keine Polyketidprodukte von CH999/pCK7f wurden beobachtet.
Folglich werden neuartige Polyketide, als auch Methoden zur rekombinanten Erzeugung der Polyketide, beschrieben. Obschon bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung in einiger Ausführlichkeit beschrieben worden sind, können selbstverständlich offensichtliche Abwandlungen daran vorgenommen werden.
TABELLE 1
TABELLE 2
SEQUENZLISTE

Claims

Gentechnisch hergestellte Zelle, welche Zelle in ihrem nativen, nicht-transformierten Zustand ein Polyketidsynthase-(PKS)-Gencluster exprimiert, welcher gentechnisch hergestellten Zelle das gesamte native PKS-Gencluster fehlt.
Gentechnisch hergestellte Zelle nach Anspruch 1, wobei die Zelle eine Actinomycete ist.
Gentechnisch hergestellte Zelle nach Anspruch 1, wobei die Zelle ein Streptomyces ist.
Gentechnisch hergestellte Zelle nach Anspruch 1, wobei die Zelle ein Streptomyces coelicolor oder Streptomyces lividans ist.
Zelle nach einem der Ansprüche 1–4, die Nukleinsäure-Moleküle enthält, wobei die Moleküle ein aromatisches Polyketidsynthase-(PKS)-Gencluster umfassen, das im Katalysieren der Synthese eines Polyketids funktional ist, wobei das Gencluster ein erstes offenes Leseraster (ORF), das eine PKS-Ketosynthase und eine PKS-Acetyltransferase (KS/AT) codiert, ein zweites ORF, das einen PKS-Kettenlängen-bestimmenden Faktor (CLF) codiert, und ein drittes ORF, das ein PKS-Acyl-Trägerprotein (ACP) codiert, ein oder mehrere Kontrollelemente, die operativ an das PKS-Gencluster geknüpft sind, umfasst, wodurch die ORFs transkribiert und translatiert werden können, um eine funktionale PKS zu erzeugen, worin zumindest eines der ORFs oder Kontrollelemente heterolog zu der Zelle ist.
Zelle nach Anspruch 5, welche außerdem ein viertes ORF, das eine PKS-Ketoreduktase (KR) codiert, oder ein viertes ORF, das KR codiert, und ein fünftes ORF, das eine PKS-Cyclase (CYC) codiert, umfasst.
Zelle nach Anspruch 5 oder 6, worin das Austausch-PKS-Gencluster ein Hybrid-PKS-Gencluster ist und worin die ORFs von mindestens zwei verschiedenen PKS-Gensets stammen.
Zelle nach einem der Ansprüche 5–7, worin das PKS KS/AT ORF ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Actinorhodin-KS/AT ORF, einem Granaticin-KS/AT ORF, einem Tetracenomycin-KS/AT ORF, einem Frenolicin B-KS/AT ORF, einem Oxytetracyclin-KS/AT ORF und einem Griseusin-KS/AT ORF; und/oder das PKS CLF ORF ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Actinorhodin-CLF ORF, einem Granaticin-CLF ORF, einem Tetracenomycin-CLF ORF, einem Frenolicin B-CLF ORF, einem Oxytetracyclin-CLF ORF und einem Griseusin-CLF ORF; und/oder das PKS ACP ORF ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Actinorhodin-ACP-ORF, einem Granaticin-ACP ORF, einem Tetracenomycin-ACP ORF, einem Frenolicin B ACP ORF, einem Oxytetracyclin ACP ORF und einem Griseusin ACP ORF.
Zelle nach einem der Ansprüche 5–8, worin jedes der ersten, zweiten und dritten ORFs in separaten Expressionskassetten enthalten ist.
Methode zur Erzeugung einer funktionalen aromatischen PKS, welches umfasst: (a) Bereitstellen einer Population von Zellen nach einem der Ansprüche 5–9; und (b) Züchten der Population von Zellen unter Bedingungen, bei denen die funktionale PKS produziert wird.
Methode zur Erzeugung eines Polyketids, welche Methode umfasst: (a) Bereitstellen einer Population von Zellen nach einem der Ansprüche 5–9; und (b) Züchten der Population von Zellen unter Bedingungen, bei denen eine funktionale PKS produziert wird und wobei die funktionale PKS die Erzeugung eines Polyketids ergibt.
Zelle nach einem der Ansprüche 1–4, welche außerdem ein rekombinantes Plasmid umfasst, welches enthält: einen Streptomyces-Replikationsursprung; einen Promotor von einem Streptomyces-Polyketidsynthase-(PKS)-Gencluster; und eine Restriktionsenzymstelle, die an den Promotor an einer intercistronischen Lokalisation geknüpft ist, wobei ein offenes Leseraster (ORF), welches eingeführt ist in die Restriktionsenzymstelle, transkribiert und in eine Wirtszelle translatiert werden kann, wobei das rekombinante Plasmid mindestens ein ORF eines aromatischen PKS-Gens, das in diese Restriktionsenzymstelle eingeführt ist, umfasst.
Zelle nach Anspruch 12, worin der Streptomyces-Replikationsursprung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus dem SCP2*-Streptomyces-Replikationsursprung und dem SCP2*-Streptomyces-Replikationsursprung, dem der par-Locus fehlt; und/oder worin der Promotor ein act-PKS-Gencluster-Promotor ist; und/oder worin das Plasmid außerdem ein Aktivator-Gen umfasst.
Zelle nach Anspruch 12 oder 13, worin das ORF von einem Actinorhodin-Gencluster, einem Granaticin-Gencluster, einem Oxytetracyclin-Gencluster, einem Tetracenomycin-Gencluster, einem Frenolicin-Gencluster, einem Tetracyclin-Gencluster, einem Griseusin-Gencluster oder einem Daunorubicin-Gencluster stammt.
Rekombinantes Plasmid, welches umfasst: einen Streptomyces-Replikationsursprung; einen Promotor von einem Streptomyces-Polyketidsynthase-(PKS)-Gencluster; und eine Restriktionsenzymstelle, die an den Promotor an einer intercistronischen Lokalisation geknüpft ist, wobei ein offenes Leseraster (ORF), welches eingeführt ist in die Restriktionsenzymstelle, transkribiert und in eine Wirtszelle translatiert werden kann, wobei das rekombinante Plasmid mindestens ein ORF eines aromatischen PKS-Gens umfasst, das in diese Restriktionsenzymstelle eingeführt ist.
Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 15, wobei der Streptomyces-Replikationsursprung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus dem SCP2*-Streptomyces-Replikationsursprung und dem SCP2*-Streptomyces-Replikationsursprung, dem der par-Locus fehlt; und/oder worin der Promotor ein act-PKS-Gencluster-Promotor ist; und/oder worin das Plasmid außerdem ein Aktivator-Gen umfasst.
Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 15 oder Anspruch 16, wobei das ORF von einem Actinorhodin-Gencluster, einem Granaticin-Gencluster, einem Oxytetracyclin-Gencluster, einem Tetracenomycin-Gencluster, einem Frenolicin-Gencluster, einem Tetracyclin-Gencluster, einem Griseusin-Gencluster oder einem Daunorubicin-Gencluster stammt.
Rekombinantes Plasmid nach einem der Ansprüche 15 bis 17, welches pRM5 ist, das durch die in 3 gezeigte Restriktionskarte charakterisiert ist.