PT725778E - Producao recombinante de novos policetidos - Google Patents

Description

87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ DESCR1CÃO "Produção recombinante do novos policetidos"

Campo Técnico O presente invento refere-se genericamente a policetidos e a policetido-sintases. Em particular, o invento refere-se à produção recombinante de policetidos usando um novo sistema de hospedeiro-vector.

Antecedentes do Invento

Os policetidos são uma família grande e estruturalmente diversa de produtos naturais. Os policetidos possuem uma vasta gama de actividades biológicas, incluindo propriedades antibióticas e farmacológicas. Por exemplo, os policetidos são representados por antibióticos, tais como as tetraciclinas e a eritromicina, por agentes anticancerígenos, incluindo a daunomicina, por imunossupressores, por exemplo, o FK506 e a rapamicina, e por produtos veterinários, tais como a nonensina e a avermectina. Os policetidos ocorrem na maioria dos grupos de organismos e são especialmente abundantes numa classe de bactérias miceliais, as actinomicetes, que produzem vários policetidos.

As policetido-sintases (PKS) são enzimas multifuncionais relacionadas com as sintases de ácidos gordos (FAS). As PKS catalisam a biossíntese de policetidos através de condensações de Claisen (descarboxilativas) repetidas entre aciltioésteres, usualmente de acetilo, propionilo, malonilo ou metilmalonilo. Após cada condensação, introduzem variabilidade estrutural no produto catalisando todo, parte ou nada de um ciclo redutivo compreendendo uma ceto-redução, uma desidratação e uma enoil-redução no grupo β-ceto da cadeia de policetido em crescimento. Após a cadeia de carbonos ter crescido até um comprimento característico de cada produto específico, é libertada da sintase por tiólise ou acil-transferênnia. Assim, as PKS consistem em famílias de enzimas que trabalham em conjunto para produzir um dado policetido. São a variação controlada no comprimento da cadeia, a escolha das unidades de construção da cadeia e o ciclo redutivo, programados geneticamente em cada PKS, que contribuem para a variação observada entre os policetidos de ocorrência natural. 2 87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ

Existem duas classes genéricas de PKS. Uma classe, conhecida como PKS do Tipo I, é representada pelas PKS para macrolidos tais como a eritromicina. Estas PKS "complexas" ou "modulares" incluem montagens de várias proteínas multifuncionais grandes comportando, entre elas, um conjunto de locais activos separados para cada passo da montagem e modificação da cadeia de carbonos (Cortes, J. et al. Nature (1990) 348:176; Donadio, S. et al. Science (1991) 252:675; MacNeil, D.J. et al. Gene (1992) 115:119). A diversidade estrutural ocorre nesta classe devido a variações no número e tipo de locais activos nas PKS. Esta classe de PKS exibe uma correlação um para um entre o número e o agrupamento de locais activos na sequência primária das PKS e a estrutura do esqueleto de policetido. A segunda classe de PKS, designada por PKS do Tipo II, é representada pelas sintases de compostos aromáticos. As PKS do Tipo II têm um único conjunto de locais activos usados iterativamente (Bibb, M.J. et al. EMBO J. (1989) 8:2727; Sherman, D.H. et al. EMBO J. (1989) 8:2717; Fernadez-Moreno, M.A. et al. J. Biol. Chem. (1992) 267:19278). A Streptomyces é um actinomicete que é um produtor abundante de policetidos aromáticos. Em cada PKS aromática de Streptomyces até agora estudada, a montagem da cadeia de carbonos requer os produtos de três estruturas de leitura aberta (ORF, "open reading frames"). A ORF1 codifica uma ceto-sintase (KS) e um local activo de aciltransferase (AT); a ORF2 codifica uma proteína similar ao produto da ORF1 mas sem os motivos KS e AT; e a ORF3 codifica uma proteína transportadora de acilo discreta (ACP). A Streptomyces coelicolor produz o policetido pigmentado de azul, a actinonorodina. O agrupamento de genes da actinonorodina (act) já foi clonado (Malpartida, F. e Hopwood, D.A. Nature (1984) 309:462; Malpartida, F. e Hopwood, D.A. Mol. Gen. Genet. (1986) 205:66) e completamente sequenciado (Fernandez-Moreno, M.A. et al. J. Biol. Chem. (1992) 267:19278: Hallam, S.E. et al. Gene (1988) 74:305; Fernandez-Moreno, M.A. et al. Cell (1991) 66:769; Caballero, J. et al. Mol. Gen. Genet. (1991) 230:401). O agrupamento codifica as enzimas PKS acima descritas, uma ciclase e uma série de enzimas de configuração envolvidas nas reacções de modificação subsequentes que conduzem à actinorodina, bem como proteínas envolvidas na exportação do antibiótico e pelo menos uma proteína que activa 3 87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ especificamente a transcrição do agrupamento de genes. Outros genes requeridos para a regulação global da biossíntese de antibióticos, bem como para o fornecimento de unidades de iniciador (acetil CoA) e de prolongador (malonil-CoA) para a biossíntese de policetido, estão localizadas noutros locais do genoma. O agrupamento de genes act de S. coelicolor tem sido usado para produzir actinorodina em S. parvulus. Malpartida F. e Hopwood, D.A. Nature (1984) 309:462. Bartel et al. J. Bacteriol. (1980) 172:4816-4826. produziram recombinantemente aloessaponarina II usando S. ga/i/eus transformada com um agrupamento de genes act de S. coelicolor consistindo de quatro locais genéticos, act!actlll, act/V e actVII. Foram também desenhados PKS híbridas, incluindo o conjunto do gene act básico, mas com genes ACP derivados de PKS de granaticina, oxitetraciclina, tetracenomicina e frenolicina, que são capazes de expressar sintases funcionais. Khosla, C. et al. J. Bacteriol. (1993) 175:2197-2204. Hopwood, D.A. et al. Nature (1985) 314:642-644. descreve a produção de policetidos híbridos usando técnicas recombinantes. Sherman, D.H. et al. J. Bacteriol. (1992) 174:6184-6190 revela a transformação de vários mutantes de S. coelicolor, com falta de diferentes componentes do agrupamento de genes de PKS act, com os genes da granaticina (gra) correspondentes de S. violaceoruber, em trans. O Pedido de Internacional W093/13663 descreve a recombinação homóloga do gene da eritromicina, tal como reside no cromossoma de S. erythraea, para produzir uma PKS modular modificada.

MacDaniel et al., Science, Dez. 1993, 262. 1546-1550 descreve a introdução de ácido nucleico codificando uma PKS aromática de substituição em células de S. coelicolor com falta do agrupamento de genes nativo da PKS aromática.

Sumário do Invento O presente invento proporciona novos policetidos e novos métodos para produzir, de um modo eficiente, novos e conhecidos policetidos, usando tecnologia recombinante. Em particular, é usado um novo sistema de hospedeiro-vector para produzir PKS modulares que, por sua vez, catalisam a 4 87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ produção de uma variedade de policetidos. Estes policetidos são úteis como antibióticos, como agentes antitumorais, como imunossupressores e para uma ampla variedade de outros propósitos farmacológicos.

Numa concretização, o invento refere-se a células modificadas por engenharia genética possuindo ácido nucleico introduzido codificando uma policetido-sintase (PKS) modular contendo módulos, cada módulo compreendendo pelo menos uma actividade de PKS de aciltransferase (AT), uma actividade de PKS de proteína transportadora de cetoacilo-sintase (KS), e uma actividade de PKS de proteína transportadora de acilo (ACP); estando as sequências de nucleótidos codificando os módulos de PKS introduzidas ligadas operativamente a pelo menos uma sequência de controlo, pelo que as referidas células são capazes de produzir uma PKS modular funcional, em que pelo menos uma das sequências de nucleótidos codificando os módulos para a referida PKS modular funcional ou uma das referidas sequências de controlo é heteróloga em relação à célula hospedeira.

Preferivelmente, a estas células modificadas por engenharia genética faltarão substancialmente todo o agrupamento nativo de genes de PKS.

Em concretizações particularmente preferidas, as células modificadas por engenharia genética são Streptomyces coel/color e as células não contêm substancialmente todo o agrupamento nativo de genes da PKS de actinorodina.

Noutra concretização, o invento refere-se a um método para a produção de um policetido recombinante compreendendo: (a) proporcionar uma população de células conforme acima descrito; e (b) cultivar a população de células sob condições nas quais o agrupamento de genes de PKS de substituição presente nas células é expresso.

Ainda numa outra concretização, o invento refere-se a um método para a produção de um policetido recombinante compreendendo:

87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ a. inserir uma primeira porção de um agrupamento de genes de PKS de substituição num plasmídeo dador e inserir uma segunda porção de um agrupamento de genes de PKS de substituição num plasmídeo receptor, onde a primeira e segunda porções codificam colectivamente um agrupamento completo de genes de PKS de substituição, e ainda onde: i. o plasmídeo dador expressa um gene que codifica um primeiro marcador de selecção e é capaz de replicar a uma primeira temperatura permissiva e incapaz de se replicar a uma segunda temperatura não permissiva; ii. o plasmídeo receptor expressa um gene que codifica um segundo marcador de selecção; e iii. o plasmídeo dador compreende regiões de ADN complementares com as regiões de ADN no plasmídeo receptor, tais que possa ocorrer recombinação homóloga entre a primeira porção do agrupamento de genes de PKS de substituição e a segunda porção do agrupamento de genes de substituição, através da qual pode ser gerado um agrupamento de genes de substituição completo; b. transformar o plasmídeo dador e o plasmídeo receptor numa célula hospedeira e cultivar a célula hospedeira transformada a uma primeira temperatura permissiva e sob condições que permitam o crescimento das células hospedeiras que expressam o primeiro e/ou o segundo marcadores de selecção, para gerar uma primeira população de células; c. cultivar a primeira população de células à segunda temperatura não permissiva e sob condições que permitam o crescimento das células que expressam o primeiro e/ou o segundo marcadores de selecção, para gerar uma segunda população de células que inclui células hospedeiras que contêm um plasmídeo recombinante compreendendo um agrupamento completo de genes de PKS de substituição. d. transferir o plasmídeo recombinante da segunda população de células para as células hospedeiras seleccionadas para expressão do agrupamento de genes de PKS de substituição; e 6 87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ e. cultivar as células transformadas modificadas por engenharia genética, sob condições nas quais o agrupamento de genes de PKS de substituição é expresso.

Breve Descricão das Figuras A Figura 1 mostra os agrupamentos de genes para as PKS e ciclases act, gra e tem. A Figura 2 mostra a estratégia para preparar S. coelicolor CH999. A Figura 2A ilustra a estrutura do agrupamento de genes act presente no cromossoma de S. coelicolor CH1. A Figura 2B mostra a estrutura do pLRemEts e a Figura 2C mostra a porção do cromossoma de CH999 com o agrupamento de genes act delecionado. A Figura 3 é um diagrama do plasmídeo pRM5. A Figura 4 ilustra um modelo para a 6-desoxieritronolido B-sintase (DEBS). A Figura 5 mostra a estratégia para a construção de PKS modulares recombinantes. A Figura 6 é um diagrama do plasmídeo pCK7.

Descricão Detalhada do Invento A prática do presente invento utilizará, a não ser onde se indique de outro modo, métodos convencionais de química, microbiologia, biologia molecular e técnicas de ADN recombinante, dentro dos conhecimentos da arte. Estas técnicas são explicadas em detalhe na literatura. Ver e.g., Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Edição Corrente); DNA Cloning: A Practicaf Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Edição Corrente); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Edição Corrente); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds.. Edição Corrente). 7 07 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ

Tal como utilizadas nas presentes descrição e reivindicações, as formas singulares "um", "uma" e "o", "a", incluem referências plurais a não ser que o conteúdo especifique claramente o contrário. Assim, referências a "um policetido" incluem misturas de policetidos, referências a "uma policetido-sintase" incluem misturas de policetido-sintases, entre outras. A. Definições

Na descrição do presente invento, serão utilizados os termos seguintes, pretendendo-se que estes sejam definidos como a seguir se indica.

Por "agrupamento de genes de PKS de substituição" pretende-se designar qualquer conjunto de genes de PKS capaz de produzir uma PKS funcional quando sob a direcção de um ou mais elementos de controlo compatíveis, como a seguir se definem, numa célula hospedeira com eles transformada. Uma PKS funcional é uma que catalisa a síntese de um policetido. A expressão "agrupamento de genes de PKS de substituição" abrange um ou mais genes codificando as várias proteínas necessárias para catalisar a produção de um policetido. Um "agrupamento de genes de PKS de substituição" não precisa de incluir todos os genes que se encontram na natureza no agrupamento correspondente. Em vez disso, o agrupamento de genes apenas necessita de codificar os componentes de PKS necessários para catalisar a produção de um policetido activo. Assim, como a seguir se explica com maior detalhe, se o agrupamento de genes incluir, por exemplo, oito genes no seu estado nativo e se apenas três destes genes forem necessários para proporcionar um policetido activo, apenas estes três genes necessitam de estar presentes. Adicionalmente, 0 agrupamento pode incluir genes de PKS derivados de uma única espécie, ou pode ser de natureza híbrida, e.g., com um gene derivado de um agrupamento para a síntese de um policetido particular substituído por um gene correspondente de um agrupamento para a síntese de outro policetido. Os agrupamentos híbridos podem incluir genes derivados de ambas as PKS do Tipo 1 e do Tipo II. Como acima se explicou, as PKS do Tipo I incluem várias proteínas multifuncionais grandes comportando, entre elas, um conjunto de locais activos separados para cada passo da montagem e modificação da cadeia de carbonos. Por outro lado, as PKS do Tipo II, possuem um único conjunto de locais activos usados iterativamente. Estas classificações são bem conhecidas. Ver, e.g., Hopwood, D.A. e Khosla, C. Secondary metabolites: their function 8 87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ and evoíution (1992) Wiley Chichester (Ciba Foundation Symposium 171) p 88-112; Bibb, M.J. et al. EMBO J. (1989) 8:2727; Sherman, D.H. et al. EMBO J. (1989) 8:2717, Fernandez-Moreno, M.A. et al. J. BioJ. Chem. (1992) 267:19278; Cortes, J. et al. Nature (1990) 348:176; Donadio, S. et al. Science (1991) 252:675; MacNeil, D.J. et al. Gene (1992) 115:119. Os agrupamentos híbridos são aqui exemplificados e descritos a seguir com maior detalhe. Os genes incluídos no agrupamento de genes não necessitam de ser genes nativos, mas podem ser mutantes ou seus análogos. Os mutantes ou análogos podem ser preparados por deleção, inserção ou substituição de um ou mais nucleótidos da sequência de codificação. Técnicas para modificar sequências de nucleótidos, tais como a mutagénese dirigida a locais, estão descritas em, e.g., Sambrook et al., supra; DNA Cloning, Vols. I e II, supra; Nucieic Acid Hybridization, supra.

Um "agrupamento de genes de PKS de substituição" pode também conter genes codificando modificações ao policetido nuclear catalisado pela PKS, incluindo, por exemp|lo, genes codificando hidroxilases, metilases ou outras alquilases, oxidases, redutases, glicotransferases, ligases, éster ou amida-sintases, e várias hidrolases tais com esterases e amidases.

Tal como a seguir se explica com maior detalhe, os genes incluídos no agrupamento de genes de substituição não necessitam de estar no mesmo plasmídeo ou, se estiverem presentes no mesmo plasmídeo, podem ser controlados pela mesma ou por diferentes sequências de controlo. "Células hospedeiras geneticamente modificadas" incluem células hospedeiras onde o agrupamento nativo de genes de PKS foi delecionado usando técnicas de ADN recombinante. Assim, o termo não deverá abranger eventos mutacionais que ocorrem na natureza. Uma "célula hospedeira" é uma célula derivada de um microrganismo procariótico ou de uma linha de células eucarióticas cultivadas como uma entidade unicelular, que podem ser, ou que foram, usadas como um receptor para vectores recombinantes contendo os agrupamentos de genes de PKS do invento. O termo inclui a progénie da célula original que foi transfectada. Entenda-se que a progénie de uma única célula progenitora pode não ser necessariamente completamente idêntica, em morfologia ou em complemento de ADN genómico ou total, ao progenitor original, devido a mutação acidental ou deliberada. A progénie da célula

87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ progenitora que é suficientemente similar ao progenitor, para ser caracterizado por uma propriedade relevante, tal como a presença de uma sequência de nucleótidos codificando uma PKS desejada, ó incluída na definição e é abrangida pelos termos anteriores. O termo "heteróloga" relacionado com sequências de ácidos nucleicos, tais como sequências de codificação e sequências de controlo, designa sequências que não estão normalmente associadas a uma região de uma construção recombinante, e/ou não estão normalmente associadas a uma célula particular. Assim, uma região "heteróloga" de uma construção de ácido nucleico é um segmento identificável de ácido nucleico dentro ou ligado a outra molécula de ácido nucleico que não se encontra na natureza em associação com a outra molécula. Por exemplo, uma região heteróloga de uma construção pode incluir uma sequência de codificação flanqueada por sequências que não se encontram na natureza em associação com a sequência de codificação. Outro exemplo de uma sequência de codificação heteróloga é uma construção na qual a própria sequência de codificação não se encontra na natureza (e.g., sequências sintéticas possuindo codões diferentes dos do gene nativo). Similarmente, uma célula hospedeira transformada com uma construção que não está normalmente presente na célula hospedeira, será considerada heteróloga para efeitos do presente invento. A variação alélica ou eventos mutacionais de ocorrência natural não dão origem a ADN heterólogo, tal como é aqui utilizado.

Uma "sequência de codificação" ou uma sequência que "codifica" uma PKS particular, é uma sequência de ácido nucleico que é transcrita (no caso do ADN) e traduzida (no caso do ARNm) num polipéptido in vitro ou in vivo, quando colocada sob o controlo de sequências reguladoras apropriadas. Os limites da sequência de codificação são determinados por um codão de iniciação no terminal 5' (amino) e por um codão de paragem da tradução no terminal 3' (carboxi). Uma sequência de codificação pode incluir, mas sem estar a estes limitada, ADNc de ARNm procariótico ou eucariótico, sequências de ADN genómico de ADN procariótico ou eucariótico, e ainda sequências de ADN sintético. Uma sequência de terminação da transcrição estará usualmente localizada a 3' em relação à sequência de codificação.

Uma sequência de "ácido nucleico" pode incluir, mas sem lhes estar limitada, sequências procarióticas, ARNm eucariótico, ADNc de ARNm 87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ 10

eucariótico, sequências de ADN genómico de ADN eucariótico (e.g., de mamífero), e ainda sequências de ADN sintético. O termo engloba também sequências que incluem quaisquer dos análogos de base conhecidos da ADN e de ARN tais como, mas sem estarem lhes estarem limitados, 4-acetilcitosina, p-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinileitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxi-hidroximetiburacilo, 5-fluoro-uracilo, 5-bromo-uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tio-uracilo, 5-carboximetilaminometil-uracilo, di-hidro-uracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudo-uracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tio-uracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'- metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, éster metílico do ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudo-uracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tio-uracilo, 2-tio-uracilo, 4-tio-uracilo, 5-metiluracilo, éster metílico do ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudo-uracilo, queosina, 2-tiocitosina e 2,6-diaminopurina. Um sequência de terminação da transcrição estará normalmente localizada a 3’ em relação à sequência de codificação. "Sequências de controlo" de ADN referem-se colectivamente a sequências promotoras, locais de ligação a ribossomas, sinais de poliadenilação, sequências de terminação da transcrição, domínios reguladores a montante, potenciadores, e outras, que colectivamente proporcionam a transcrição e tradução de uma sequência de codificação numa célula hospedeira. Nem todas estas sequências de controlo necessitam de estar sempre presentes num vector recombinante, desde que o gene desejado seja capaz de ser transcrito e traduzido. "Ligado operativamente" refere-se a um arranjo de elementos no qual os componentes assim descritos estão configurados de modo a desempenhar a sua função usual. Assim, as sequências de controlo ligadas operativamente a uma sequência de codificação são capazes de efectuar a expressão da sequência de codificação. As sequências de controlo não necessitam de estar contíguas à sequência de codificação, desde que funcionem para dirigir a sua expressão. Assim, por exemplo, sequências transcritas ainda não traduzidas intervenientes podem estar presentes entre uma sequência promotora e a sequência de i 11 87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ codificação e a sequência promotora pode ainda ser considerada "ligada operativamente" à sequência de codificação.

Por "marcador de selecção" entende-se qualquer marcador genético que possa ser usado para seleccionar uma população de células que comportam o marcador no seu genoma. Exemplos de marcadores de selecção incluem: marcadores auxotróficos através dos quais as células são seleccionadas pela sua capacidade de crescerem em meios mínimos, com ou sem um nutriente ou suplemento, e.g., timidina, ácido diaminopimélico ou biotina; marcadores metabólicos através dos quais as células são seleccionadas pela sua capacidade de crescerem em meios mínimos contendo o açúcar apropriado como única fonte de carbono ou pela capacidade das células em formar colónias coloridas contendo os pigmentos ou substratos cromogénicos apropriados; e marcadores de resistência a drogas através dos quais as células são seleccionadas pela sua capacidade em crescerem em meios contendo uma ou mais drogas apropriadas, e.g., tetraciclina, ampicilina, canamicina, estreptomicina ou ácido nalidíxico. "Recombinação" é um rearranjo de secções de sequências de ADN entre duas moléculas de ADN. A "recombinação homóloga" ocorre entre duas moléculas de ADN que hibridam em virtude de sequências de nucleótidos homólogas ou complementares presentes em cada molécula de ADN. O termo "alquilo", tal como é aqui utilizado, refere-se a um grupo hidrocarboneto saturado, ramificado ou não ramificado, com 1 a 24 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, t-butilo, octilo, decilo, tetradecilo, hexadecilo, eicosilo, tetracosilo e outros. Os grupos alquilo aqui preferidos contêm 1 a 12 átomos de carbono. O termo "alquilo inferior" designa um grupo alquilo com um a seis átomos de carbono, preferivelmente, um a quatro átomos de carbono. O termo "alquileno", tal como é aqui utilizado, refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto. ramificada ou não ramificada, saturada bifuncional contendo de 1 a 24 átomos de carbono e inclui, por exemplo, metileno (—CH2—), etileno (-CH2-CH2-), propileno (-CH2-CH2-CH2-), 2-metilpropileno l-CH2-CH(CH3)-CH2-], hexileno [—(CH2)6—] e outras. "Alquileno inferior" 12 87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ refere-se a um grupo alquileno com 1 a 6, mais preferivelmente, 1 a 4 átomos de carbono. O termo "alcoxi", tal como é aqui utilizado, refere-se a um grupo alquilo ligado através de uma única ligação éter terminal; isto é, um grupo "alcoxi" pode ser definido como -OR, onde R é um grupo alquilo definido como anteriormente. Um grupo "alcoxi inferior" refere-se a um grupo alcoxi contendo um a seis, mais preferivelmente, um a quatro átomos de carbono. "Halogeno-" ou "halogéneo" designa fluoro, cloro, bromo ou iodo, e usualmente refere-se a uma substituição de um átomo de hidrogénio por halogéneo num composto orgânico. De entre os halogéneos, o fluoro ou o cloro são geralmente preferidos. "Opcional" ou "opcionalmente" significam que o evento ou circunstância subsequentemente descritos podem ou não ocorrer, e que a descrição inclui casos em que o referido evento ou circunstância ocorre e casos em que não. Por exemplo, a frase "alquileno opcionalmente substituído" significa que a porção alquileno pode ou não estar substituída e que a descrição inclui ambos, o alquileno não substituído e o alquileno onde existe substituição. B. Métodos Gerais

Um aspecto central do presente invento é a identificação de um sistema de hospedeiro-vector para a produção recombinante eficiente de policetidos tanto novos como conhecidos. Em particular, o invento utiliza células modificadas por engenharia genética que têm os seus genes de PKS de ocorrência natural substancialmente delecionados. Estas células hospedeiras podem ser transformadas com vectores recombinantes, codificando uma variedade de agrupamentos de genes de PKS, para a produção de policetidos activos. 0 invento proporciona a produção de quantidades significativas de produto numa fase apropriada do ciclo de crescimento. Os policetidos assim produzidos podem ser usados, como agentes terapêuticos, para tratar um certo número de desordens, dependendo do tipo de policetido em questão. Por exemplo, vários dos policetidos produzidos pelo presente método encontrarão utilização como imunossupressores, como agentes antitumorais, bem como para o tratamento de infecções virais, bacterianas e parasíticas. A capacidade para 13 87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ produzir policetidos de modo recombinante proporciona também uma ferramenta poderosa para a caracterização de PKS e dos seus mecanismos de actuação.

Mais particularmente, as células hospedeiras para a produção recombinante destes policetidos podem ser derivadas de qualquer organismo com a capacidade de albergar um agrupamento de genes de PKS recombinante. Assim, as células hospedeiras do presente invento podem ser derivadas de organismos quer procarióticos, quer eucarióticos. Contudo, as células hospedeiras preferidas são as construídas a partir de actinomicetes, uma classe de bactérias miceliais que são produtores abundantes de um certo número de policetidos. Um género particularmente preferido para utilização no presente sistema é o Streptomyces. Assim, por exemplo, S. ambofaciens, S. avermitilis, S. azureus, S. cinnamonensis, S. coelicolor, S. curacoi, S. erythraeus, S. fradie, S. galilaeus, S. glaucescens, S. hygroscopicus, S. lividans, S. parvulus, S. peucetius, S. rimosus, S. roseofulvus, S. thermotolerans, S. violaceoruber, entre outros, proporcionarão células hospedeiras convenientes para este invento, sendo S. coelicolor o preferido. (Ver, e.g., Hopwood, D.A. e Sherman, D.H. Ann. fíev. Genet. (1990) 24:37-66; 0'Hagan, D. The Polyketide Metabolites (Ellis Horwood Limited, 1991) para uma descrição de vários organismos produtores de policetidos e os seus produtos naturais.)

As células acima descritas são geneticamente modificadas delecionando delas os genes de PKS de ocorrência natural, usando técnicas convencionais, tais como a recombinação homóloga. (Ver, e.g., Khosla, C. et al. Molec. Microbiol. (1992) 6:3237). É aqui exemplificada uma célula hospedeira S. coelicolor geneticamente modificada. As estirpes nativas de S. coelicolor produzem uma PKS que catalisa a biossíntese do policetido aromático actinorodina. A nova estirpe, S. coelicolor CH999 (Figura 2C e descrita nos exemplos), foi construída por deleção, via recombinação homóloga, de todo o agrupamento act natural do cromossoma de S. coelicolor CH1 (Khosla, C. Molec. Microbiol. (1992) 6:3237), uma estirpe à qual faltam plasmídeos endógenos e comportando uma mutação estável que bloqueia a biossíntese de outro antibiótico de S. coelicolor pigmentado, a undecilprodigiosina. 14 87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ

As células hospedeiras acima descritas podem ser transformadas com um ou mais vectores codificando colectivamente um conjunto de PKS funcionais. O(s) vector(cs) pode(m) incluir combinações nativas ou híbridas de subunidades de PKS, ou seus mutantes. Como acima explicado, o agrupamento de genes de substituição não necessita de corresponder ao agrupamento de genes nativo completo, mas precisa apenas de codificar os componentes de PKS necessários para catalisar a produção de um policetido.

Adicionalmente, o(s) vector(es) recombinante(s) pode(m) incluir genes de um único agrupamento de genes de PKS, ou pode(m) compreender agrupamentos de genes de PKS de substituição híbridos, e.g., com um gene para um agrupamento substituído pelo gene correspondente de outro agrupamento de genes. Por exemplo, verificou-se que as ACP são facilmente intermutáveis entre diferentes sintases sem efeito na estrutura do produto. Adicionalmente, uma dada KR pode reconhecer e reduzir cadeias de policetido de diferentes comprimentos de cadeia. Deste modo, estes genes são facilmente intermutáveis nas construções aqui descritas. Assim, os agrupamentos de substituição do presente invento podem ser derivados de qualquer combinação de conjuntos de genes de PKS que derradeiramente funcionarão para produzir um policetido identificável.

Os vectores recombinantes, albergando os agrupamentos de genes acima descritos, podem ser convenientemente gerados usando técnicas conhecidas na arte. Por exemplo, as subunidades de PKS de interesse podem ser obtidas a partir de um organismo que as expresse, usando métodos recombinantes, tais como a pesquisa de ADNc ou bibliotecas genómicas, derivadas das células que expressam o gene, ou obtendo o gene a partir de um vector que se sabe que o inclui. O gene pode então ser isolado e combinado com outras subunidades de PKS desejadas, usando técnicas padrão. Se o gene em questão já está presente num vector de expressão adequado, pode ser combinado in situ, e.g., com outras subunidades de PKS, conforme desejado. Em vez de ser clonado, o gene de interesse pode também ser produzido sinteticamente. A sequência de nucleótidos pode ser desenhada com os codões apropriados para a sequência de aminoácidos particular desejada. De um modo geral, serão seleccionados os codões preferidos para o hospedeiro pretendido no qual a sequência será expressa. A sequência completa será montada a partir de oligonucleótidos sobrepostos preparados por métodos padrão e montados para dar uma 15 87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ sequência de codificação completa. Ver, e.g., Edge (1981) Nature 292:756: Nambair et al. (1984) Science 223:1299: Jay et al. (1984) J. Bioí. Chem. 259:6311.

Podem ser feitas mutações às sequências nativas das subunidades de PKS e estes mutantes podem ser usados em vez da sequência nativa, desde que os mutantes sejam capazes de funcionar com outras subunidades de PKS para catalisarem colectivamente a síntese de um policetido identificável. Estas mutações podem ser efectuadas nas sequências nativas usando técnicas convencionais, tais como a preparação de oligonucleótidos sintéticos incluindo as mutações e inserção da sequência mutada no gene codificando uma subunidade de PKS usando a digestão com endonucleases de restrição. (Ver, e.g., Kunkel, T.A. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1985) 82:448: Geisselsoder et al. BioTechniques (1987) 5:786). Alternativamente, as mutações podem ser efectuadas usando um iniciador com erros de emparelhamento ("mismatched") (geralmente com 10-20 nucleótidos de comprimento) que hibrida com a sequência de nucleótidos nativa (geralmente ADNc correspondente à sequência de ARN), a uma temperatura abaixo da temperatura de fusão do duplex com erros de emparelhamento. O iniciador pode ser tornado específico mantendo o comprimento do iniciador e a composição de bases dentro de limites relativamente estreitos e mantendo a base mutante localizada centralmente. Zoller e Smith, Methods EnzymoL (1983) 100:468. O prolongamento do iniciador é efectuado usando ADN-polimerase, o produto é clonado e são seleccionados os clones contendo o ADN mutado, obtidos por segregação da cadeia de iniciador prolongada. A selecção pode ser conseguida usando o iniciador mutante como sonda de hibridação. A técnica é também aplicável para geração de mutações em múltiplos pontos. Ver, e.g., Dalbie-McFarland et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1982) 79:6409. A mutagénese de PCR encontrará também utilização para efectuar as mutações desejadas.

As sequências de genes que codificam colectivamente um agrupamento de genes de PKS de substituição, podem ser inseridas em um ou mais vectores de expressão, usando métodos conhecidos dos peritos na arte. Os vectores de expressão incluirão sequências de controlo ligadas operativamente à sequência de codificação de PKS desejada. Sistemas de expressão adequados para utilização com o presente invento incluem sistemas que funcionam em células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas. Contudo, como anteriormente se 16 87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ explicou, preferem-se os sistemas procarióticos e, em particular, os sistemas compatíveis com Streptomyces spp são de particular interesse. Os elementos de controlo para utilização nestas sistemas incluem promotores, contendo opcionalmente sequências operadoras, e locais de ligação a ribossomas. Promotores particularmente úteis incluem sequências de controlo derivadas de agrupamentos de genes de PKS, tais como um ou mais promotores act. Contudo, outros promotores bacterianos, tais como os derivados de enzimas de metabolização de açúcares, tais como galactose, lactose {lac) e maltose, encontrarão também utilização nas presentes construções. Exemplos adicionais incluem sequências promotoras derivadas de enzimas biossintéticas tais como o triptofano (trp), o sistema promotor de β-lactamase {bla), o bacteriófago lambda PL, e T5. Adicionalmente, os promotores sintéticos, tais como o promotor tac (Patente US N° 4 551 433), que não ocorrem na natureza, funcionam também em células hospedeiras bacterianas.

Podem também ser desejáveis outras sequências reguladoras que permitam a regulação da expressão das sequências de substituição de PKS, em relação ao crescimento das células hospedeiras. As sequências reguladoras são conhecidas dos peritos na arte e exemplos incluem as que provocam a expressão de um gene, que é "ligado" ou "desligado" em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Podem também estar presentes no vector outros tipos de elementos reguladores, por exemplo, potenciadores.

Nos vectores de expressão recombinantes podem também ser incluídos marcadores seleccionáveis. É conhecida uma variedade de marcadores que são úteis na selecção de linhas de células transformadas e que compreendem geralmente um gene cuja expressão confere um fenótipo seleccionável às células transformadas, quando as células são cultivadas num meio selectivo apropriado. Tais marcadores incluem, por exemplo, genes que conferem resistência a antibióticos ou sensibilidade ao plasmídeo. Alternativamente, vários policetidos são naturalmente coloridos e esta característica proporciona um marcador incorporado para a selecção de células transformadas com sucesso pelas presentes construções.

As várias subunidades de PKS de interesse podem ser clonadas, como cassetes individuais, em um ou mais vectores recombinantes, com elementos 17 87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ de controlo separados, ou sob o controlo, e.g., de um único promotor. As subunidades de PKS podem incluir locais de restrição nos flancos para permitir a fácil deleção e inserção de outras subunidades de PKS, de modo que podem ser geradas PKS híbridas. O desenho de tais locais de restrição únicos é conhecido dos peritos na arte e pode ser realizado usando as técnicas acima descritas, tais como mutagénese dirigida a locais e PCR.

Os métodos para a introdução de vectores recombinantes do presente invento em hospedeiros apropriados são conhecidos dos peritos na arte e incluem, tipicamente, a utilização de CaCI2 ou de outros agentes, tais como catiões bivalentes e DMSO. O ADN pode também ser introduzido nas células bacterianas por electroporação. Após a expressão das PKS, as colónias produtoras do policetido podem ser identificadas e isoladas usando técnicas conhecidas. Os policetidos produzidos podem depois ser melhor caracterizados. O presente invento é aqui a seguir descrito mais particularmente por referência à 6-desoxieritronolido B - sintase (DEBS) que catalisa a biossíntese da aglícona de eritromicina, 6-desoxieritronolido B (17). Três estruturas de leitura aberta (eryAI, eryAII e eryAIIÍ) codificam os polipéptidos DEBS e abrangem 32 kb no agrupamento de genes ery do genoma de Saccharopolyspora erythraea. Os genes estão organizados em seis unidades repetidas, cada uma designada por "módulo". Cada módulo codifica um conjunto de locais activos que, durante a biossíntese do policetido, catalisam a condensação de um monómero adicional sobre a cadeia em crescimento. Cada módulo inclui uma aciltransferase (AT), uma sintase de proteína transportadora de β-cetoacilo (KS) e uma proteína transportadora de acilo (ACP), bem como um subconjunto de locais activos redutivos (β-ceto-redutase (KR), desidratase (DH), enoil-redutase (ER)) (Figura 4). O número de locais redutivos dentro de um módulo corresponde à extensão da β-ceto-redução em cada ciclo de condensação. A tioesterase (TE) codificada no final do módulo parece catalisar a formação de lactona.

Devido às grandes dimensões de eryAI, eryAII e eryAIII, e à presença de múltiplos locais activos, estes genes podem ser convenientemente clonados num plasmídeo, adequado para expressão numa célula hospedeira modificada por engenharia genética, tal como o CH999, usando uma técnica de recombinação in vivo. Esta técnica, descrita no Exemplo 3 e resumida na Figura 5, utiliza derivados do plasmídeo pMAK705 (Hamilton et al. (1989) J. Bacteriol. 18 87 1 17 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ 171:4617) para permitir a recombinação in vivo entre um plasmídeo dador sensível à temperatura, que é capaz de replicação a uma primeira temperatura permissiva e incapaz de replicação a uma segunda temperatura não permissiva, e um plasmídeo receptor. Os genes eryA assim clonados resultam no pCK7, um derivado de pRM5 (McDaniel et al. (1993) Science 262:1546). Um plasmídeo de controlo, o pCK7f, foi construído para comportar uma mutação de desvio de enquadramento no eryAI. O pCK7 e o pCK7f possuem um replicão ColEI para manipulação genética em E. coli bem como um replicão de Streptomyces SCP2* truncado (baixo número de cópias). Estes plasmídeos contêm também o par promotor actl/actlll divergente e o act//-ORF4, um gene activador que é requerido para a transcrição a partir destes promotores e que activa a expressão durante a transição da fase de crescimento para a fase estacionária no micélio vegetativo. A expressão de nível elevado dos genes de PKS ocorre no início da fase estacionária do crescimento micelial; deste modo, as estirpes recombinantes produzem policetidos "repórter" como metabolitos secundários de um modo quasi natural. O método acima descrito, para a produção de policetidos sintetizados por PKS grandes, modulares, pode ser usado para produzir outros policetidos como metabolitos secundários, tais como açúcares, β-lactamas, ácidos gordos, aminoglicósidos, terpinóides, péptidos não ribossómicos, hormonas prostanóides entre outros. C. Experimental

Apresentam-se a seguir exemplos de concretizações específicas para realizar o presente invento. Os exemplos são apresentados apenas para efeitos ilustrativos, e não se pretende que limitem de modo algum o âmbito do presente invento.

Foram desenvolvidos esforços para assegurar a exactidão em relação aos números usados (e.g., quantidades, temperaturas, etc.), mas deverão obviamente ser permitidos alguns erros e desvios experimentais. 07 117 ΕΡ 0 725 778/ΡΤ

Materiais e Métodos

Estirpee bacterianas, plasmídeos e condições de cultura. Usou-se S. coelicolor CH999 como hospedeiro para transformação com todos os plasmídeos. Descreve-se a seguir a construção desta estirpe. As manipulações de ADN foram realizadas em Escherichia coli MC1061. Os plasmídeos foram passados em E. coli ET12567 (dam dcm hsdS Cm') (MacNeil, D.J. J. Bacteríol. (1988) 170:5607) para gerar ADN não metilado antes da transformação de S. coelicolor. As estirpes de E. coli foram cultivadas sob condições padrão. As estirpes de 5. coelicolor foram cultivadas em placas de ágar R2YE (Hopwood, D.A. et al. Genetic manipulation of Streptomyces. A Laboratory manual. The John Innes Foundation: Norwich, 1985).

Manipulação de ADN e de organismos. A reacção em cadeia com polimerase (PCR) foi realizada usando polimerase Taq (Perkin Elmer Cetus) sob condições recomendadas pelo fabricante da enzima. Para as manipulações de ADN foram usadas técnicas padrão in vitro (Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Edição Corrente)). A E. coli foi transformada com um dispositivo Bio-rad E. coli Pulsing usando protocolos fornecidos pela Bio-Rad. O S. coelicolor foi transformado por procedimentos padrão (Hopwood, D.A. et al. Genetic manipulation of Streptomyces. A Laboratory manual. The John Innes Foundation: Norwich, 1985) e os transformantes foram seleccionados usando 2 ml de uma sobrecamada de tiostreptona a 500 mg/ml.

Produção e purificação de policetidos. Para uma pesquisa inicial, todas as estirpes foram cultivadas a 30°C como camadas confluentes sobre 10-30 placas contendo, cada uma, aproximadamente 30 ml de meio de ágar, durante 6-8 dias. Foram preparadas placas adicionais, conforme necessário, para obter material suficiente para a caracterização completa. O CH999 foi um controlo negativo, quando se pesquisaram policetidos potenciais. O ágar foi finamente cortado e extractado com acetato de etilo/ácido acético a 1 % ou acetato de etilo:metanol (4:1)/ácido acético a 1%. 0 extracto concentrado foi depois eluído através de uma coluna "flash" de cromatografia em sílica gel (Baker 40 mm) em acetato de etilo/1 % de ácido acético. Alternativamente, aplicou-se o extracto a uma coluna Florisil (Fisher Scientific) e eluiu-se com acetato de etilo:etanol:ácido acético (17:2:1). A fracção amarela primária foi adicionalmente purificada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) usando um gradiente de 20-60% 20 87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ de acetonitrilo/água/1 % de ácido acético numa coluna preparativa de fase inversa (C-18) (Beckman). Monitorizou-se a absorvância a 280 nm e a 410 nm.

Espectroscopia de RMN. Todos os espectros foram registados num Varian XL-400. Os espectros de 13C foram conseguidos com desacoplamento de protões de banda larga contínua. As ressonâncias de hidroxilo foram identificadas adicionando D20 (Aldrich, 99% de D em % atómica) e verificando o desaparecimento do sinal.

Exemplo 1

Produção de 5. coelicolor CH999

Uma célula hospedeira de S. coelicolor, modificada por engenharia genética para remover o agrupamento de genes act nativo, e designada por CH999, foi construída usando S. coelicolor CH1 (Khosla, C. Molec. Microbiol. (1992) 6:3237), usando a estratégia representada na Figura 2. (O CH1 é derivado do S. coelicolor B385 (Rudd, B.A.M. Genetics of Pigmentated Secondary Metabolites in Streptomyces coelicolor (1978), Tese de Ph.D., Universidade de East Anglia, Norwich, Inglaterra.) O CH1 inclui o agrupamento de genes act que codifica as enzimas envolvidas na biossíntese e na exportação do antibiótico policetido actinorodina. O agrupamento é constituído pelos genes de PKS, flanqueados por vários genes biossintéticos post-PKS, incluindo os envolvidos na ciclização, aromatização e configuração química subsequente (Figura 2A). Estão também presentes os genes responsáveis pela activação da transcrição dos genes act. O agrupamento de genes act foi delecionado do CH1 usando recombinação homóloga conforme descrito em Khosla, C. Molec. Microbiol. (1992) 6:3237.

Em particular, o plasmídeo pLRermEts (Figura 2B) foi construído com as características particulares seguintes: um replicão ColEI do pBR322, um replicão sensível à temperatura do pSG5 (Muth, G. et al. Mol. Gen. Genet. (1989) 219:341), marcadores de resistência à ampicilina e à tioestreptona, e uma cassete de disrupção incluindo um fragmento BamHI/Xhol de 2 kb da extremidade 5' do agrupamento act, um fragmento ermE de 1,5 kb (Khosla, C. Molec. Microbiol. (1992) 6:3237) e um fragmento Sphl/Pstl de 1,9 kb da extremidade 3' do agrupamento act. O fragmento 5' prolonga-se desde o local 1 21 87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ

BamHI (Malpartida, F. e Hopwood, D.A. Nature (1984) 309:462; Malpartida, F. e Hopwood, D.A. Mol. Gen. Genet. (1986) 205:66) para jusante até um local Xhol. O fragmento a 3' prolongava-se desde um local 20 Pstl para montante até ao local 19.2 Sphl (Fernandez-Moreno, M.A. et al. J. Biol. Chem. (1992) 267:19278). Os fragmentos 5' e 3' (mostrados como ADN a tracejado na Figura 2) foram clonados com a mesma orientação relativa tal como no agrupamento act. O CH1 foi transformado com pLRermEts. O plasmídeo foi subsequentemente curado dos transformantes candidatos riscagem não selectivo a 39°C. As várias colónias que eram resistentes à lincomicina, sensíveis à tioestreptona e incapazes de produzir actinorodina, foram isoladas e verificadas por transferência de Southern. Um destas foi designada por CH999.

Exemplo 2

Produção do Vector Recombinante pRM5 O pRM5 (Figura 3) foi utilizado na construção do pCK7, um plasmídeo de vaivém usado para expressar PKS modulares em CH999. Este inclui um replicão ColEI para permitir a engenharia genética em E. co/i, um replicão de Streptomyces SCP2* (baixo número de cópias) apropriadamente truncado, e o gene activador acf//-0RF4 do agrupamento act, que induz a transcrição a partir de promotores act durante a transição da fase de crescimento para a fase estacionária no micélio vegetativo. Como se mostra na Figura 3, o pRM5 comporta o par promotor actl/actlll divergente, em conjunto com locais de clonagem convenientes para facilitar a inserção de uma variedade de genes de PKS manipulados a jusante de ambos os promotores. Ao pRM5 falta o par locus de SCP2*; como resultado, o plasmídeo é ligeiramente instável (aproximadamente 2% de perda na ausência de tioestreptona). Esta característica particular foi deliberadamente introduzida de modo a permitir a rápida confirmação de que um fenótipo de interesse pudesse ser atribuído, sem ambiguidade, à PKS mutante transportada pelo plasmídeo. As PKS recombinantes do pRM5 são expressas aproximadamente na transição da fase exponencial para a fase estacionária de crescimento, com bons rendimentos. O pRM5 foi construído como se segue. Um fragmento Sphl/Hindlll de 10,5 kb do plJ903 (contendo um porção do locus de fertilidade e a origem de replicação de SCP2*, bem como a origem de replicação co/EI e o gene da 22 87 1 17 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ β-lactamase de pBR327) (Lydiate, D.J. Gene (1985) 35:223) foi ligado com uma cassete do gene tsr Hindlll/Sphl de 1,5 kb para dar o pRMI. O pRM5 foi cunslruído inserindo os dois fragmentos seguintes entre os locais Hindlll e EcoRI do pRM1: um fragmento Hindlll/Hpal (liso) de 0,3 kb comportando um terminador de transcrição do fago fd (Khosla, C. Mo/ec. MicrobioL (1992) 6:3237), e um fragmento de 10 kb do agrupamento act prolongando-se desde o local Ncol (1 kb a montante do gene activador acf//-ORF4) (Hallam, S.E. et al. Gene (1988) 74:305; Fernandez-Moreno, M.A. et al. Cell (1991) 66:769; Caballero, J.L. Mol. Gen. Genet. (1991) 230:401) até ao local Pstl a jusante dos genes actl-VII-IV (Fernandez-Moreno, M.A. et al. J. Biol. Chem. (1992) 267:19278).

Para facilitar a expressão de qualquer PKS recombinante desejada sob o controlo do promotor actl (que é activado pelo produto do gene actll-ORF4), inseriram-se locais de restrição para Pacl, Nsil, XbaJ e Pstl no ADN de act em posições intercistrónicas.

Exemplo 3

Construção e Análise de Policetido-Sintases Modulares

Os plasmídeos de expressão contendo genes de PKS DEBS modulares recombinantes foram construídos por transferência de ADN de um modo incremental de um plasmídeo "dador" sensível à temperatura, i.e., um plasmídeo capaz de replicação a uma primeira temperatura permissiva e incapaz de replicação a uma segunda temperatura não permissiva, para um vector de vaivém "receptor" através de um evento de recombinação dupla, conforme ilustrado na Figura 5. O pCK7 (Figura 6), um plasmídeo de vaivém contendo os genes eryA completos, que foram originalmente clonados a partir do pS1 (Tuan et al. (1990) Gene 90:21), foi construído como se segue. Inseriu-se um fragmento Sphf de 25,6 kb do pS1 no local Sphl do pMAK705 (Hamilton et al. (1989) J. Bacteríol. 171:4617) para dar o pCK6 (CmR), um plasmídeo dador contendo eryAII, eryAIII e a extremidade 3' de eryAI. A replicação deste derivado pCS101 sensível à temperatura ocorre a 30°C mas é impedida a 44°C. O plasmídeo receptor, o pCK5 (ApR, TcR) inclui um fragmento eryA de 12,2 kb desde o codão de iniciação de eryAI (Caffrey et al. (1992) FEBS Lett. 304:225) até ao local Xcml próximo do início do eryAII, um fragmento EcoRI - Bsml de

87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ 23 23 pBR322 de 1,4 kb codificando o gene de resistência à tetraciclina (Tc) e um fragmento Notl - EcoRI de 4,0 kb a partir da extremidade de eryAIII. Os locais Pacl, o Ndel o os locais da ligação a ribossomas foram introduzidos por manipulação genética no codão de iniciação eryAI no pCK5. O pCK5 é um derivado de pRM5 (McDaniel et al. (1993) supra). As regiões a 5' e a 3' de homologia (Figura 5, áreas a tracejado e não sombreadas) têm respectivamente, 4,1 kb e 4,0 kb. A E. coli MC1061 foi transformada (ver Sambrook et al. supra) com pCK5 e pCK6, e submetida a selecção com carbenicilina e cloranfenicol a 30°C. As colónias albergando ambos os plasmídeos (ApR, CmR) foram então de novo riscadas a 44°C em placas de carbenicilina e cloranfenicol. Apenas eram viáveis os co-integrados formados por um único evento de recombinação entre os dois plasmídeos. As colónias sobreviventes foram propagadas a 30°C sob selecção de carbenicilina, forçando a resolução dos co-integrados através de um segundo evento de recombinação. Para enriquecimento em recombinantes de pCK7, as colónias foram de novo riscadas em placas de carbeniciclina a 44°C. Aproximadamente 20% das colónias resultantes exibiam o fenótipo desejado (ApR, Tcs, Cms). Os candidatos pCK7 finais foram exaustivamente verificados por mapeamento de restrição. Um plasmídeo de controlo, o pCK7f, que contém um erro de desvio de enquadramento em eryAI, foi construído de um modo similar. O pCK7 e o pCK7f foram transformados em E. coli ET12567 (MacNeil (1988) J. Bacteriol. 1 70:5607) para gerar um ADN de plasmídeo não metilado e subsequentemente transferidos para 5. coelicolor CH999 usando protocolos padrão (Hopwood, D.A. et al. (1985) Genetic manipu/ation of Streptomyces. A laboratory manual. The John Innes Foundation: Norwich)

Após crescimento do CH999/pCK7 em meio R2YE, o organismo produziu quantidades abundantes de dois policetidos. A adição de propionato (300 mg/l) ao meio de crescimento resultou num aumento de aproximadamente duas vezes no rendimento de produto policetido. A espectroscopia de RMN do protão e de 13C, conjuntamente com experiências de alimentação com ácido 1-propiónico-13C, confirmaram o produto principal como sendo o 6dEB (17) (>40 mg/l). O produto menos importante foi identificado como sendo o 8,8a-desoxioleandolido (18) (>10 mg/l) que, aparentemente, tem origem numa unidade de iniciador de acetato em vez de propionato na via biossintética do 6dEB. As experiências de alimentação com acetato 13C2 de sódio confirmaram a incorporação do acetato em (18). Três 87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ 24

proteínas de elevado peso molecular (>200 kDa), presumivelmente a DEBS1, a DEBS2 e a DEBS3 (Caffrey et al. (1992) FEBS Lett. 304:225). foram também observadas am extractos em bruto de CH999/pCK7 por electroforese em gel SDS-poliacrilamida. Não foram observados produtos de policetido a partir do CH999/pCK7f.

(Segue Listagem de Sequências)

87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ 25

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE:

(A) NOME: THE LELAND STANFORD JÚNIOR UNIVERSITY (B) RUA: 900 Welch Road, Suite 350 (C) CIDADE: Paio Alto (D) ESTADO: Califórnia (E) PAÍS: Estados Unidos da América (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 94304-1850

(A) NOME: JOHN INNES CENTRE (B) RUA: Colney Lane (C) CIDADE: Norwich (E) PAÍS: Reino Unido

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): NR4 7YH

NOVOS

(ii) TÍTULO DO INVENTO: PRODUÇÃO RECOMBINANTE DE POLICETIDOS (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) FORMA PARA LEITURA EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE SUPORTE: disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (EPO) (v) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: NÚMERO DE PEDIDO: EP 94928169.5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 1

(i) CARACTERÍSTICAS DA SFOIJÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TIPOLOGIA: linear 26 07 117 ΕΡ 0 725 778/ΡΤ (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: CCACCGGACG AACGCATCGA TTAATTAAGG AGGACCATCA TG 42 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TIPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (xii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: NTGAATGCAT GGAGGAGCCA TCATG 25

Lisboa, 19. DEZ. £001

Por THE LELAND STANFORD JÚNIOR UNIVERSITY e JOHN INNES CENTRE - O AGENTE OFICIAL -

Eng.° ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind-Rua das Flores, 74-4.° 1200-195 LISBOA

Claims (40)

1. 87 1 17 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ 1/6 REIVINDICAÇÕES 1. Células possuindo ácido nucleico introduzido codificando uma policetido-sintase (PKS) modular contendo módulos, cada módulo compreendendo pelo menos uma actividade de PKS de aciltransferase (AT), uma actividade de PKS de proteína transportadora de cetoacilo - sintase (KS), e uma actividade de PKS de proteína transportadora de acilo (ACP); as sequências de nucleótidos codificando os módulos de PKS introduzidas estando ligadas operativamente a pelo menos uma sequência de controlo, pelo que as referidas células são capazes de produzir uma PKS modular funcional, em que pelo menos uma das sequências de nucleótidos codificando os módulos para a referida PKS modular funcional ou uma das referidas sequências de controlo é heteróloga em relação à célula hospedeira.
2. 2. Células de acordo com a reivindicação 1, nas quais os módulos da referida PKS modular funcional são derivados de mais do que uma PKS.
3. 3. Células de acordo com a reivindicação 1, nas quais pelo menos uma das sequências de nucleótidos introduzidas codificando os módulos da referida PKS contém uma mutação que altera uma função catalítica no módulo codificado.
4. 4. Células de acordo com a reivindicação 1 capazes de produzirem uma PKS híbrida.
5. 5. Células de acordo com a reivindicação 1, nas quais pelo menos uma das referidas actividades em pelo menos um módulo está substituída por uma actividade de uma PKS diferente.
6. 6. Células de acordo com a reivindicação 1, nas quais pelo menos um módulo de PKS compreende: uma actividade de PKS de ceto-redutase (KR); ou 87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ 2/6 uma actividade de PKS de ceto-redutase (KR) e uma actividade de PKS de desidratase (DH); ou uma actividade de PKS de ceto-redutase (KR) e uma actividade de PKS de desidratase (DH), e uma actividade de PKS de enoil-redutase (ER); e opcionalmente, uma actividade de PKS de tioesterase (TE).
7. 7. Células de acordo com a reivindicação 6, nas quais pelo menos uma das referidas actividades em pelo menos um módulo está delecionada, inserida ou substituída por uma actividade de uma PKS diferente.
8. 8. Células de acordo com a reivindicação 1, nas quais a referida sequência de controlo é heteróloga em relação à célula hospedeira.
9. 9. Células de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, nas quais o referido ácido nucleico introduzido codifica uma PKS modular completa. i
10. 10. Células de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, onde as referidas células foram modificadas de modo lhes faltar substancialmente um agrupamento de genes de PKS normalmente presente nas células hospedeiras não modificadas.
11. 11. Células de acordo com a reivindicação 10, onde as referidas células são actinomicetes.
12. 12. Células de acordo com a reivindicação 11, onde as referidas células são Streptomyces.
13. 13. Células de acordo com a reivindicação 12, onde as referidas células são S. coeiico/or ou S. lividans.
14. 14. Células de acordo com a reivindicação 13, onde as referidas células são S. coelicolor CH999. 87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ 3/6
15. 15. Células de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, nas quais pelo menos um módulo é um módulo de 6-desoxieritronolido B - sintase.
16. 16. Células de acordo com a reivindicação 15, nas quais o referido ácido nucleico introduzido compreende o agrupamento de genes completo da 6-desoxieritronolido B - sintase.
17. 17. Método para produzir uma policetido-sintase (PKS) funcional, método este que compreende a cultura de células de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 sob condições tais que os referidos módulos são expressos.
18. 18. Método para produzir uma policetido-sintase (PKS) funcional, método este que compreende a cultura de células de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 4 ou 5 sob condições tais que os referidos módulos são expressos.
19. 19. PKS modular funcional não nativa produzida pelo método de acordo com a reivindicação 18.
20. 20. Método para produzir um policetido, método este que compreende a cultura de células de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 sob condições tais que os referidos módulos são expressos para produzir a proteína PKS funcional de modo a produzir o referido policetido.
21. 21. Método para produzir um policetido, método este que compreende a cultura de células de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5 sob condições tais que os referidos módulos são expressos para produzir a proteína PKS funcional de modo a produzir o referido policetido.
22. 22. Vector recombinante que codifica uma PKS modular compreendendo módulos, em que cada módulo compreende pelo menos uma actividade de PKS de aciltransferase (AT), uma actividade de PKS de proteína transportadora de cetoacilo - sintase (KS), e uma actividade de PKS de proteína transportadora de acilo (ACP); 87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ 4/6 estando as sequências de nucleótidos codificando os módulos de PKS do referido vector ligadas operativamente a uma ou mais sequências de controlo para produção de cada um dos referidos módulos para produzir uma PKS funcional em que pelo menos uma sequência de controlo é heteróloga em relação a pelo menos uma das referidas sequências de nucleótidos de codificação.
23. 23. Vector de acordo com a reivindicação 22, no qual os módulos são derivados de mais do que uma PKS.
24. 24. Vector de acordo com a reivindicação 22, no qual pelo mesmos uma das referidas sequências de nucleótidos de codificação contém uma mutação que altera uma função catalítica no módulo codificado.
25. 25. Vector de acordo com a reivindicação 22 que compreende uma sequência de nucleótidos codificando uma PKS híbrida.
26. 26. Vector de acordo com a reivindicação 22, no qual pelo menos uma das referidas actividades em pelo menos um dos módulos codificados está substituída por uma actividade de uma PKS diferente.
27. 27. Vector de acordo com a reivindicação 22 que codifica pelo menos um módulo compreendendo: uma actividade de PKS de ceto-redutase (KR); ou uma actividade de PKS de ceto-redutase (KR) e uma actividade de PKS de desidratase (DH); ou uma actividade de PKS de ceto-redutase (KR) e uma actividade de PKS de desidratase (DH), e uma actividade de PKS de enoil-redutase (ER); e opcionalmente, uma actividade de PKS de tioesterase (TE).

    87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ 5/6
28. 28. Vector de acordo com a reivindicação 27 no qual pelo menos uma das referidas actividades em pelo menos um módulo codificado está dclccionada, inserida ou substituída por uma actividade de uma PKS diferente.
29. 29. Vector de acordo com a reivindicação 22 que compreende um agrupamento de genes de PKS modular completo.
30. 30. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 29 no qual pelo menos um módulo é um módulo do agrupamento de genes da 6-desoxieritronolido B - sintase.
31. 31. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 30 que compreende uma sequência de nucleótidos compreendendo pelo menos um promotor de policetido-sintase (PKS).
32. 32. Vector de acordo com a reivindicação 31, no qual o promotor é um promotor do agrupamento de genes de PKS de Streptomyces.
33. 33. Vector de acordo com a reivindicação 32, no qual o promotor de Streptomyces é um promotor do agrupamento de genes act.
34. 34. Vector de acordo com a reivindicação 33, no qual o promotor act é o promotor act/, o promotor actlll ou ambos os promotores act/ e actlll.
35. 35. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 34, no qual o plasmídeo compreende adicionalmente um gene activador.
36. 36. Vector de acordo com a reivindicação 35, no qual o gene activador é um gene activador act.
37. 37. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 36 que oontém adicionalmente uma origem de replicação de Streptomyces.
38. 38. Vector de acordo com a reivindicação 30 que é o pCK7 como se mostra na Figura 6 e se descreve no Exemplo 3. 87 117 ΕΡ Ο 725 778/ΡΤ 6/6
39. 39. Células que foram modificadas para conterem o vector recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 38.
40. 40. Método para produzir uma PKS modular, método este que compreende a cultura das células de acordo com a reivindicação 39 sob condições tais que são produzidos cada um dos referidos módulos. Lisboa, β DEZ. 2UU1 Por THE LELAND STANFORD JÚNIOR UNIVERSITY e JOHN INNES CENTRE - 0 AGENTE OFICIAL - QADJIMQ Eng.° ANTÓNIO JOÂO DA CUNHA FERREIRA Ag. 0|. Pr. Ind. Rua das Flores, 74-4." 1200Ί95 LISBOA