JP2003204784A6 - 新規ポリケチドの組換え産生 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、新規ポリケチド、ならびに組換え技術を用いて新しいポリケチドおよび公知のポリケチドの両方を効果的に生産することを課題とする。
【解決手段】モジュールポリケチドシンターゼ(PKS)の複数のモジュールをコードする核酸を導入されている細胞であって、各モジュールが、少なくともPKSアシルトランスフェラーゼ(AT)活性、PKSケトアシルキャリアタンパク質シンターゼ(KS)活性、およびPKSアシルキャリアタンパク質(ACP)活性を含み、該導入されたPKSモジュールをコードするヌクレオチド配列が少なくとも1つの制御配列に作動可能に連結され、これによって該細胞が機能性モジュールPKSを産生し、ここで、該機能性モジュールPKSに対する該モジュールをコードするヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つまたは該制御配列の少なくとも1つが、該宿主細胞に対して異種である、細胞。
【解決手段】モジュールポリケチドシンターゼ(PKS)の複数のモジュールをコードする核酸を導入されている細胞であって、各モジュールが、少なくともPKSアシルトランスフェラーゼ(AT)活性、PKSケトアシルキャリアタンパク質シンターゼ(KS)活性、およびPKSアシルキャリアタンパク質(ACP)活性を含み、該導入されたPKSモジュールをコードするヌクレオチド配列が少なくとも1つの制御配列に作動可能に連結され、これによって該細胞が機能性モジュールPKSを産生し、ここで、該機能性モジュールPKSに対する該モジュールをコードするヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つまたは該制御配列の少なくとも1つが、該宿主細胞に対して異種である、細胞。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
(関連出願の相互参照)本出願は、1993年12月8日に提出された米国特許出願第08/164,301号の一部継続出願であり、米国特許出願第08/164,301号は、1993年9月20日に提出された米国特許出願第08/123,732号の一部継続出願(この出願から、米国特許法第120条に基づいて優先権が主張される)であり、これらの開示の全体は本明細書中で参考として援用されている。
【0002】
【従来の技術】
(技術分野)本発明は、一般に、ポリケチドおよびポリケチドシンターゼに関する。さらに特定すると、本発明は、新規な宿主−ベクター系を用いる、ポリケチドの組換え生産に関する。
【0003】
(発明の背景)ポリケチドは、天然生成物の大きな、構造的に多様なファミリーである。ポリケチドは、抗生物質的特性および薬理学的特性を含む広範な生物学的活性を有する。例えば、ポリケチドは、テトラサイクリンおよびエリスロマイシンのような抗生物質、ダウノマイシン(daunomycin)を含む抗ガン剤、免疫抑制剤(例えば、FK506およびラパマイシン(rapamycin))、ならびに獣医学用の生成物(例えば、モネンシン(monensin)およびアベルメクチン(avermectin))により代表される。ポリケチドは、微生物の殆どの種類に存在し、そして菌糸型細菌の1クラスである放線菌に特に豊富である。この放線菌は、種々のポリケチドを産生する。
【0004】
ポリケチドシンターゼ(PKS)は、脂肪酸シンターゼ(FAS)に関連する多機能の酵素である。PKSは、アシルチオエステル(通常、アセチル、プロピオニル、マロニルまたはメチルマロニル)の間のクライゼン縮合の繰り返し(脱カルボキシ化)を介して、ポリケチドの生合成を触媒する。各縮合に続いて、これらは、成長するポリケチド鎖のβ−ケト基におけるケト還元、脱水、およびエノイル還元を含む還元回路の全て、または一部を触媒するか、あるいは全く触媒しないことにより、産生物に構造的変化を導入する。炭素鎖は各特定の産生物の特徴的な長さまで成長した後、これは、チオリシスまたはアシル転移により、シンターゼから放出される。それゆえ、PKSは、所定のポリケチドを産生するために共に働く酵素のファミリーから構成される。天然に生じるポリケチドに見られる変化に寄与するのは、各PKSに遺伝的にプログラム化された、鎖長、鎖構成単位の選択、および還元回路の制御された変化である。
【0005】
2つのPKSの一般的クラスが存在する。1クラスは、タイプI PKSとして知られ、エリスロマイシンのようなマクロライドのためのPKSにより代表される。これらの「複合体」または「モジュール(modular)」PKSは、いくかの多機能の大型タンパク質のアセンブリを含み、これらの大型タンパク質の間には、炭素鎖のアセンブリおよび修飾の各工程のための別々の活性部位のセットを有する(Cortes,J.ら、Nature(1990)348:176;Donadio,S.ら、Science(1991)252:675;MacNeil,D.J.ら、Gene(1992)115:119)。構造的多様性は、これらのPKS中の活性部位の数およびタイプの変化からこのクラスに生じる。このクラスのPKSは、PKSの1次配列中の活性部位の数およびクラスタリングとポリケチド骨格との間において、一対一の相互関係を示す。
【0006】
第2のクラスのPKSは、タイプII PKSと呼ばれ、芳香族化合物のためのシンターゼにより代表される。タイプII PKSは、単一のセットの反復して使用される活性部位を有する(Bibb,M.J.ら、EMBO J.(1989)8:2727;Sherman,D.H.ら、EMBOJ.(1989)8:2717;Fernandez−Moreno,M.A.ら、J.Biol.Chem.(1992)267:19278)。
【0007】
Streptomycesは、芳香族ポリケチドの大量生産者である放線菌である。現在までに研究された各Streptomyces芳香族PKSでは、炭素鎖アセンブリは、3つのオープンリーディングフレーム(ORF)の産生物を必要とする。ORF1は、ケトシンターゼ(KS)およびアシルトランスフェラーゼ(AT)の活性部位をコードする;ORF2は、ORF1の産生物と類似したタンパク質をコードするが、KSおよびATモチーフを欠く;そしてORF3は、別のアシルキャリアタンパク質(ACP)をコードする。
【0008】
Streptomyces coelicolorは、ブルーに着色したポリケチドであるアクチノロジン(actinorhodin)を産生する。アクチノロジン遺伝子クラスター(act)は、クローン化され(Malpartida,F.およびHopwood,D.A. Nature(1984)309:462;Malpartida,F.およびHopwood,D.A.Mol.Gen.Genet.(1986)205:66)、そして完全に配列決定された(Fernandez−Moreno,M.A.ら、J.Biol.Chem.(1992)267:19278;Hallam,S.E.ら、Gene(1988)74:305;Fernandez−Moreno,M.A.ら、Cell(1991)66:769;Caballero,J.ら、Mol.Gen.Genet.(1991)230:401)。このクラスターは、上記のPKS酵素、シクラーゼ(cyclase)およびアクチノロジンを導く連続する修飾反応に関わる一連の調整酵素、ならびにこの抗生物質の搬出に関わるタンパク質およびこの遺伝子クラスターの転写を特異的に活性化させる少なくとも1つのタンパク質をコードする。抗生物質の生合成の全体的な制御、ならびにポリケチド生合成の出発物質(アセチルCoA)および延長物質(マロニルCoA)単位の供給のために必要とされる他の遺伝子は、ゲノム中の他の部位に位置する。
【0009】
S.coelicolor由来のact遺伝子クラスターは、S.parvulusでアクチノロジンを産生するために使用されている。Malpartida,F.およびHopwood,D.A. Nature(1984)309:462)。Bartelら(J.Bacteriol.(1990)172:4816−4826)は、4つの遺伝子座actI、actIII、actIVおよびactVIIからなるS.coelicolor act遺伝子クラスターで形質転換されたS.galilaeusを用いて、アロエサポナリン(aloesaponarin)を組換えにより産生した。基本act遺伝子を含むが、グラナチシン(granaticin)、オキシテトラサイクリン、テトラセノマイシン(tetracenomycin)およびフレノリシン(frenolicin)のPKS由来のACP遺伝子を有するハイブリッドPKSもまた、設計され、これらは、機能性のシンターゼを発現し得る。Khosla,Cら、J.Bacteriol.(1993)175:2197−2204。Hopwood,D.A.ら(Nature (1985)314:642−644)は、組換え技術を用いるハイブリッドポリケチドの産生を記載している。Sherman,D.H.ら(J.Bacteriol.(1992)174:6184−6190)は、トランスで、S.violaceoruber由来の対応するグラナチシン(gra)遺伝子を用いる、act PKS遺伝子クラスターの異なる成分を欠いている種々のS.coelicolor変異体の形質転換を報告している。
【0010】
しかし、現在までは、実質的にネイティブな天然PKS遺伝子クラスター全てを欠く、遺伝子操作した宿主細胞を用いるポリケチドの組換え産生は記載されていない。
【0011】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規ポリケチド、ならびに組換え技術を用いて新しいポリケチドおよび公知のポリケチドの両方を効果的に生産することを課題とする。
【0012】
【課題を解決するための手段】
1つの局面において、本発明は、ポリケチドシンターゼ(PKS)遺伝子クラスターをそのネイティブな、非形質転換の状態で発現する遺伝子操作した細胞であって、この遺伝子操作した細胞は、実質的に全ネイティブなPKS遺伝子クラスターを欠く細胞に関する。
【0013】
好ましい実施形態において、本発明は、原核細胞である、上記遺伝子操作した細胞である。
【0014】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、放線菌である、上記遺伝子操作した細胞である。
【0015】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、Streptomyces属の放線菌である、上記遺伝子操作した細胞である。
【0016】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、Streptomyces coelicolorである、上記遺伝子操作した細胞である。
【0017】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、全ネイティブなアクチノロジンPKS遺伝子クラスターを実質的に欠く、上記遺伝子操作した細胞である。
【0018】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、CH999株に等価である、上記遺伝子操作した細胞である。
【0019】
好ましい実施形態において、本発明は、上記のいずれかの遺伝子操作した細胞であって、以下:
(a)ポリケチドの合成を触媒し得るPKSをコードする置換PKS遺伝子クラスター;および(b)このPKS遺伝子クラスターに作動可能に連結される1つまたはそれ以上の制御配列であって、これにより、この遺伝子クラスター中のこの遺伝子がこの遺伝子操作した細胞中で転写かつ翻訳され得る、制御配列、を含み、但し、この置換PKS遺伝子クラスターが全PKS遺伝子セットを含むとき、少なくとも1つのPKS遺伝子または制御成分はこの細胞とは異種である細胞である。
【0020】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記置換PKS遺伝子クラスターが、PKSケトシンターゼおよびPKSアシルトランスフェラーゼの活性部位(KS/AT)をコードする第1の遺伝子、PKS鎖長決定因子(CLF)をコードする第2の遺伝子、ならびにPKSアシルキャリアタンパク質(ACP)をコードする第3の遺伝子を含む、上記遺伝子操作した細胞である。
【0021】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記置換PKS遺伝子クラスターが、さらにPKSケトレダクターゼ(KR)をコードする第4の遺伝子を含む、上記遺伝子操作した細胞である。
【0022】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記置換PKS遺伝子クラスターが、さらにPKSシクラーゼ(CYC)をコードする第5の遺伝子を含む、上記遺伝子操作した細胞である。
【0023】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記置換PKS遺伝子クラスターが、さらにPKSデヒドラターゼをコードする第6の遺伝子を含む、上記遺伝子操作した細胞である。
【0024】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記PKS KS/AT遺伝子が、アクチノロジンKS/AT遺伝子、グラナチシンKS/AT遺伝子、テトラセノマイシンKS/AT遺伝子、フレノリシンB KS/AT遺伝子、オキシテトラサイクリン KS/AT遺伝子、およびグリセウシン KS/AT遺伝子からなる群より選択されるPKS KS/AT遺伝子に由来する、上記遺伝子操作した細胞である。
【0025】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記PKS CLF遺伝子が、アクチノロジンCLF遺伝子、グラナチシンCLF遺伝子、テトラセノマイシンCLF遺伝子、フレノリシンB CLF遺伝子、オキシテトラサイクリンCLF遺伝子、およびグリセウシンCLF遺伝子からなる群より選択されるPKS CLF遺伝子に由来する、上記遺伝子操作した細胞である。
【0026】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記PKS ACP遺伝子が、アクチノロジンACP遺伝子、グラナチシンACP遺伝子、テトラセノマイシンACP遺伝子、フレノリシンB ACP遺伝子、オキシテトラサイクリンACP遺伝子、およびグリセウシンACP遺伝子からなる群より選択されるPKS ACP遺伝子に由来する、上記遺伝子操作した細胞である。
【0027】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記PKS KR遺伝子が、アクチノロジンKR遺伝子、グラナチシンKR遺伝子、テトラセノマイシンKR遺伝子、フレノリシンB KR遺伝子、オキシテトラサイクリンKR遺伝子、およびグリセウシンKR遺伝子からなる群より選択されるPKS KR遺伝子に由来する、上記遺伝子操作した細胞である。
【0028】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記第1、第2および第3の遺伝子のそれぞれが、別の発現カセットに含まれる、上記遺伝子操作した細胞である。
【0029】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記別の発現カセットが、単一のベクターに存在する、上記遺伝子操作した細胞である。
【0030】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記別の発現カセットが、2つまたはそれ以上のベクターに存在する、上記遺伝子操作した細胞である。
【0031】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記置換遺伝子クラスターが、PKSアシルトランスフェラーゼ(AT)をコードする第1の遺伝子、PKSケトアシルキャリアタンパク質シンターゼ(KS)をコードする第2の遺伝子、PKSアシルキャリアタンパク質(ACP)をコードする第3の遺伝子、PKSケトレダクターゼ(KR)をコードする第4の遺伝子、PKSデヒドラターゼ(DH)をコードする第5の遺伝子、PKSエノイルレダクターゼ(ER)をコードする第6の遺伝子、およびチオエステラーゼ(TE)をコードする第7の遺伝子を含む、上記遺伝子操作した細胞である。
【0032】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記遺伝子が、6−デオキシエリスロノリドBシンターゼ遺伝子クラスターに由来する、上記遺伝子操作した細胞である。
【0033】
1つの局面において、本発明は、組換えポリケチドを産生する方法であって、以下:
(a)上記いずれかの細胞の集団を提供する工程;および(b)この細胞に存在する置換PKS遺伝子クラスターが発現される条件下で、この細胞の集団を培養する工程、を包含する方法に関する。
【0034】
1つの局面において、本発明は、組換えポリケチドを産生する方法であって、以下:
a.置換PKS遺伝子クラスターの第1の部分をドナープラスミドに挿入し、そして置換PKS遺伝子クラスターの第2の部分を受容体プラスミドに挿入する工程であって、ここで、この第1および第2の部分は、完全な置換PKS遺伝子クラスターを集合的にコードし、さらにここで:
i.このドナープラスミドは、第1の選択マーカーをコードし、第1の許容温度で複製し得、そして第2の非許容温度で複製し得ない遺伝子を発現する;
ii.この受容体プラスミドは、第2の選択マーカーをコードする遺伝子を発現する;および
iii.このドナープラスミドは、相同組換えがこの置換PKS遺伝子クラスターのこの第1の部分とこの置換PKS遺伝子クラスターのこの第2の部分との間に起こり得るように、この受容体プラスミド中のDNA領域と相補的なDNAの領域を含み、これにより、完全な置換遺伝子クラスターが生成され得る、工程;
b.このドナープラスミドおよびこの受容体プラスミドを宿主細胞に形質転換させ、そしてこの第1の許容温度ならびにこの第1および/またはこの第2の選択マーカーを発現する宿主細胞を増殖させる条件下で、この形質転換された宿主細胞を培養して、細胞の第1の集団を生成する工程;
c.第2の非許容温度ならびにこの第1および/またはこの第2の選択マーカーを発現する細胞を増殖させる条件下で、細胞のこの第1の集団を培養して、細胞の第2の集団を生じる工程であって、この細胞は、完全なPKS置換遺伝子クラスターを含む組換えプラスミドを含む宿主細胞を包含する、工程;
d.細胞のこの第2の集団由来の組換えプラスミドを、上記遺伝子操作した細胞に移入して、形質転換された、遺伝子操作した細胞を生成する工程;および
e.この形質転換された、遺伝子操作した細胞を、この細胞中に存在するこの置換PKS遺伝子クラスターが発現される条件下で培養する工程、
を包含する方法に関する。
【0035】
好ましい実施形態において、本発明は、工程(c)の後、さらに上記第1の許容温度および上記第1の選択マーカーを発現する細胞を増殖させる条件下で、細胞の上記第2の集団を培養する工程を包含する、上記方法である。
【0036】
好ましい実施形態において、本発明は、上記置換PKS遺伝子クラスターの上記第1および第2の部分が、6−デオキシエリスロノリドBシンターゼ遺伝子クラスターに由来する、上記方法である。
【0037】
好ましい実施形態において、本発明は、上記の方法のいずれかにより産生されるポリケチドである。
【0038】
1つの局面において、本発明は、組換えベクターであって、以下:
(a)モジュール置換PKS遺伝子クラスターを含むDNA配列;および(b)このDNA配列に作動可能に連結される制御要素であって、これにより、このDNA配列は宿主細胞で転写かつ翻訳され得、そして少なくとも1つのこの制御要素はこのヌクレオチド配列とは異種である、制御要素、を含む、組換えベクターに関する。
【0039】
好ましい実施形態において、本発明は、上記置換遺伝子クラスターが、6−デオキシエリスロノリドBシンターゼ遺伝子クラスターである、上記組換えベクターである。
【0040】
1つの局面において、本発明は、プラスミドpCK7に関する。
【0041】
好ましい実施形態において、本発明は、上記のベクターのいずれかで形質転換された宿主細胞である。
【0042】
1つの局面において、本発明は、以下の構造式:
【0043】
【化1】
【0044】
を有するポリケチド化合物に関し、ここで、R1は、水素および低級アルキルからなる群より選択され、そしてR2は、水素、低級アルキル、および低級アルキルエステルからなる群より選択され、あるいはR1およびR2は、任意に1個〜4個のヒドロキシル基または低級アルキル基で置換される低級アルキレン架橋を一緒に形成する;R3およびR5は、独立して、水素、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルモノ−またはジ−置換のアミノ、およびニトロからなる群より選択される;R4は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルモノ−またはジ−置換のアミノ、およびニトロからなる群より選択される;R6は、ハロゲン、低級アルキル、および−CHR7−(CO)R8からなる群より選択され、ここで、R7およびR8は、独立して、水素および低級アルキルからなる群より選択される;そしてiは、1、2、または3である、ポリケチド化合物である。
【0045】
好ましい実施形態において、本発明は、R1が低級アルキルであり;R2、R3、およびR5が水素であり;R6
が−CHR7−(CO)−R8であり;そしてiが0である、上記化合物である。
【0046】
好ましい実施形態において、本発明は、R1がメチルであり、そしてR6が−CH2−(CO)−CH3である、上記化合物である。
【0047】
好ましい実施形態において、本発明は、R1およびR6が低級アルキルであり;R2、R3、およびR5が水素であり;そしてiが0である、上記化合物である。
【0048】
好ましい実施形態において、本発明は、R1およびR6がメチルである、上記化合物である。
【0049】
好ましい実施形態において、本発明は、R1およびR2が、一緒に連結して、低級アルキレン架橋−CHR9−CHR10を形成し、ここで、R9およびR1 0は、独立して、水素、ヒドロキシル、および低級アルキルからなる群より選択される、上記化合物である。
【0050】
好ましい実施形態において、本発明は、R1およびR2が、一緒に連結して、低級アルキレン架橋−CH2−CHOH−を形成する、上記化合物である。
【0051】
好ましい実施形態において、本発明は、R3およびR5が水素であり;そしてiが0である、上記化合物である。
【0052】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、R6が−CHR7−(CO)−R8であり、ここで、R8は水素または低級アルキルである、上記化合物である。
【0053】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、R6が−CH2−(CO)−CH3である、上記化合物である。
【0054】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、R6が低級アルキルである、上記化合物である。
【0055】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、R6がメチルである、上記化合物である。
【0056】
1つの局面において、本発明は、以下の構造式:
【0057】
【化2】
【0058】
を有するポリケチド化合物に関する。
【0059】
1つの局面において、本発明は、以下の構造式:
【0060】
【化3】
【0061】
を有するポリケチド化合物に関する。
【0062】
1つの局面において、本発明は、以下の構造:
【0063】
【化4】
【0064】
を有する酵素結合ケチドの触媒環化により形成されるポリケチド化合物に関し、ここで、R11は、メチル、−CH2(CO)CH3および−CH2(CO)CH2(CO)CH3からなる群より選択される;R12は−S−Eおよび−CH2(CO)−S−Eからなる群より選択される;そしてEは、上記遺伝子操作した細胞により産生されるポリケチドシンターゼを表し、R13とR14とのうちの一方が水素であり、そして他方がヒドロキシルであるか、またはR13とR14とが一緒になって、カルボニルを表す、ポリケチド化合物である。
【0065】
好ましい実施形態において、本発明は、R11がメチルであり、そしてR12が−CH2(CO)−S−Eである、上記化合物である。
【0066】
好ましい実施形態において、本発明は、R11が−CH2(CO)CH3であり、そしてR12が−S−Eである、上記化合物である。
【0067】
好ましい実施形態において、本発明は、R11が−CH2(CO)CH3であり、そしてR12が−CH2(CO)−S−Eである、上記化合物である。
【0068】
好ましい実施形態において、本発明は、R11が−CH2(CO)CH2(CO)CH3であり、そしてR12が−CH2(CO)−S−Eである、上記化合物である。
【0069】
好ましい実施形態において、本発明は、R13とR14とのうちの一方が水素であり、そして他方がヒドロキシルである、上記化合物である。
【0070】
好ましい実施形態において、本発明は、R13とR14とが一緒になって、カルボキシル部分を形成する、上記化合物である。
【0071】
1つの局面において、本発明は、以下の構造式:
【0072】
【化5】
【0073】
を有するポリケチド化合物に関し、ここで、R2部分は、独立して、水素、低級アルキル、および低級アルキルエステルからなる群より選択される;R4は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルモノ−またはジ−置換のアミノ、およびニトロからなる群より選択される;そしてiは、0、1または2である、ポリケチド化合物である。
【0074】
好ましい実施形態において、本発明は、R2が水素であり、そしてiが0である、上記化合物である。
【0075】
1つの局面において、本発明は、以下の構造式:
【0076】
【化6】
【0077】
を有するポリケチド化合物に関し、ここで、R2部分は、独立して、水素、低級アルキル、および低級アルキルエステルからなる群より選択される;R4は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルモノ−またはジ−置換のアミノ、およびニトロからなる群より選択される;そしてiは、0、1または2である、ポリケチド化合物である。
【0078】
好ましい実施形態において、本発明は、R2が水素であり、そしてiが0である、上記化合物である。
【0079】
1つの局面において、本発明は、以下の構造式:
【0080】
【化7】
【0081】
を有するポリケチド化合物に関し、ここで、R2部分は、独立して、水素、低級アルキル、および低級アルキルエステルからなる群より選択される;R4は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルモノ−またはジ−置換のアミノ、およびニトロからなる群より選択される;そしてiは、0、1または2である、ポリケチド化合物である。
【0082】
好ましい実施形態において、本発明は、R2が水素であり、そしてiが0である、上記化合物である。
【0083】
1つの局面において、本発明は、以下の構造式:
【0084】
【化8】
【0085】
を有するポリケチド化合物に関する。
【0086】
1つの局面において、本発明は、以下の構造式:
【0087】
【化9】
【0088】
を有するポリケチド化合物に関する。
【0089】
1つの局面において、本発明は、以下の構造式:
【0090】
【化10】
【0091】
を有するポリケチド化合物に関する。
【0092】
1つの局面において、本発明は、芳香族ポリケチドを生産する方法であって、以下の構造:
【0093】
【化11】
【0094】
を有する酵素結合ケチドの環化を行う工程を包含する方法に関し、ここで、R11は、メチル、−CH2(CO)CH3および−CH2(CO)CH2(CO)CH3からなる群より選択される;R12は、−S−Eおよび−CH2(CO)−S−Eからなる群より選択される;そしてEは、上記遺伝子操作した細胞により産生されるポリケチドシンターゼを表し、R13とR14とのうちの一方が水素であり、そして他方がヒドロキシルであるか、またはR13とR14とが一緒になって、カルボニルを表し、ここで環化はこのポリケチドシンターゼにより誘導される、方法である。
【0095】
好ましい実施形態において、本発明は、R11がメチルであり、そしてR12が−CH2(CO)−S−Eである、上記方法である。
【0096】
好ましい実施形態において、本発明は、R11が−CH2(CO)CH3であり、そしてR12が−S−Eである、上記方法である。
【0097】
好ましい実施形態において、本発明は、R11が−CH2(CO)CH3であり、そしてR12が−CH2(CO)−S−Eである、上記方法である。
【0098】
好ましい実施形態において、本発明は、R11が−CH2(CO)CH2(CO)CH3であり、そしてR12が−CH2(CO)−S−Eである、上記方法である。
【0099】
好ましい実施形態において、本発明は、R13とR14とのうちの一方が水素であり、そして他方がヒドロキシルである、上記方法である。
【0100】
好ましい実施形態において、本発明は、R13とR14とが一緒になって、カルボキシル部分を形成する、上記方法である。
【0101】
【発明の実施の形態】
(発明の要旨)本発明は、新規ポリケチド、ならびに組換え技術を用いて新しいポリケチドおよび公知のポリケチドの両方を効果的に産生する新規な方法を提供する。さらに特定すると、新規な宿主−ベクター系を用いて、種々のポリケチドの産生を触媒するPKSもまた作製する。このようなポリケチドは、抗生物質、抗腫瘍剤、免疫抑制剤として、および広範な他の薬理学的目的に有用である。
【0102】
従って、1つの実施態様においては、本発明は、ポリケチドシンターゼ(PKS)遺伝子クラスターをそのネイティブの非形質転換の状態で発現する、遺伝子操作した細胞に関し、この遺伝子操作した細胞は、実質的にネイティブなPKS遺伝子クラスター全てを欠いている。
【0103】
他の実施態様においては、本発明は、上記遺伝子操作した細胞に関し、ここで、この細胞は、(a)ポリケチドの合成を触媒し得るPKSをコードする、置換PKS遺伝子クラスター;および(b)このPKS遺伝子クラスターと作動可能に連結される1つまたはそれ以上の制御配列であって、これにより、この遺伝子クラスター中の遺伝子は、この遺伝子操作した細胞内で転写および翻訳され得る、制御配列、但し、この置換PKS遺伝子クラスターが全PKS遺伝子セットを含むときには、少なくとも1つのPKS遺伝子または制御要素は、この細胞とは異種である。
【0104】
特に好ましい実施態様においては、遺伝子操作される細胞は、Streptomyces coelicolorであり、この細胞は、実質的にネイティブなアクチノロジンPKS遺伝子クラスター全体を欠き、そして置換PKS遺伝子クラスターは、PKSケトシンターゼおよびPKSアシルトランスフェラーゼの活性部位(KS/AT)をコードする第1の遺伝子、PKS鎖長決定因子(CLF)をコードする第2の遺伝子、およびPKSアシルキャリアタンパク質(ACP)をコードする第3の遺伝子を含む。
【0105】
他の実施態様においては、本発明は、組換えポリケチドを産生するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する:
(a)上記の細胞の集団を提供する工程;および(b)この細胞に存在する置換PKS遺伝子クラスターが発現される条件下で、細胞の集団を培養する工程。
【0106】
さらに他の実施態様においては、本発明は、組換えポリケチドを産生するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する:
a.置換PKS遺伝子クラスターの第1の部分をドナープラスミドに挿入し、そして置換PKS遺伝子クラスターの第2の部分を受容体プラスミドに挿入する工程であって、ここで、この第1および第2の部分は、完全な置換PKS遺伝子クラスターを集合的にコードし、さらにここで:
i.このドナープラスミドは、第1の選択マーカーをコードし、第1の許容温度で複製し得、そして第2の非許容温度で複製し得ない遺伝子を発現する;
ii.この受容体プラスミドは、第2の選択マーカーをコードする遺伝子を発現する;そして
iii.このドナープラスミドは、相同組換えが置換PKS遺伝子クラスターの第1の部分と置換遺伝子クラスターの第2の部分との間に起こり得るように、受容体プラスミド中のDNA領域と相補的なDNAの領域を含み、これにより、完全な置換遺伝子クラスターが産生され得る、工程;
b.このドナープラスミドおよび受容体プラスミドを宿主細胞に形質転換させ、そして第1の許容温度ならびに第1および/または第2の選択マーカーを発現する宿主細胞を成長させる条件下で、形質転換された宿主細胞を培養して、細胞の第1の集団を産生する工程;
c.第2の非許容温度ならびに第1および/または第2の選択マーカーを発現する宿主細胞を成長させる条件下で、この細胞の第1の集団を培養して、細胞の第2の集団を産生する工程であって、この細胞は、完全なPKS置換遺伝子クラスターを含む組換えプラスミドを含有する宿主細胞を包含する、工程;
d.細胞の第2の集団由来の組換えプラスミドを、請求項1の遺伝子操作した細胞に移入して、形質転換され、遺伝子操作した細胞を産生する工程;および
e.この形質転換され、遺伝子操作した細胞を、細胞中に存在する置換PKS遺伝子クラスターが発現される条件下で培養する工程。
【0107】
さらに他の実施態様においては、本発明は、構造式(I)を有するポリケチド化合物に関する:
【0108】
【化12】
【0109】
ここで、R1は、水素および低級アルキルからなる群より選択され、そしてR2は、水素、低級アルキルおよび低級アルキルエステルからなる群より選択され、あるいはR1およびR2は、1個〜4個のヒドロキシル基または低級アルキル基で任意に置換される低級アルキレン架橋を一緒に形成する;R3およびR5は、独立して、水素、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルモノ−またはジ−置換のアミノおよびニトロからなる群より選択される;R4は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルモノ−またはジ−置換のアミノおよびニトロからなる群より選択される;R6は、水素、低級アルキル、および−CHR7−(CO)R8からなる群より選択され、ここで、R7およびR8は、独立して、水素および低級アルキルからなる群より選択される;そしてiは、1、2、または3である。
【0110】
他の実施態様においては、本発明は、以下の構造を有する新規ポリケチドに関する:
【0111】
【化13】
【0112】
【化14】
【0113】
他の実施態様においては、本発明は、構造(II)を有する酵素結合ケチドの触媒環化により形成される化合物ポリケチドに関する:
【0114】
【化15】
【0115】
ここで、R11は、メチル、−CH2(CO)CH3および−CH2(CO)CH2(CO)CH3からなる群より選択される;R12は、−S−Eおよび−CH2(CO)−S−Eからなる群より選択され、ここで、Eは、上記遺伝子操作した細胞により産生されるポリケチドシンターゼを表す;そして、R13およびR14の一方は、水素であり、そして他方は、ヒドロキシルであり、またはR13およびR14は共に、カルボニルを表す。
【0116】
さらに他の実施態様においては、本発明は、芳香族ポリケチドを生成する方法に関し、この方法は、構造(II)を有する酵素結合ケチドの環化を行う工程を包含し、ここで、環化はポリケチドシンターゼにより誘導される。
【0117】
さらなる実施態様においては、本発明は、構造式(III)を有するポリケチド化合物に関する:
【0118】
【化16】
【0119】
ここで、R2およびR4は、上記で定義されたものと同じであり、そしてiは、0、1または2である。
【0120】
他の実施態様においては、本発明は、構造式(IV)を有するポリケチド化合物に関する:
【0121】
【化17】
【0122】
ここで、R2、R4およびiは、構造式(III)についての上記定義と同じである。
【0123】
さらに他の実施態様においては、本発明は、構造式(V)を有するポリケチド化合物に関する:
【0124】
【化18】
【0125】
ここで、R2、R4およびiは、構造式(III)について上記で定義されたものと同じである。
【0126】
本発明のこれらおよび他の実施態様は、本明細書中の開示を考慮すると、当業者が容易に行い得るであろう。
【0127】
(発明の詳細な説明)本発明の実施は、他に指示がない限り、化学、微生物学、分子生物学および組換えDNA技術の当該分野内で慣用の方法を利用する。このような技術は、文献に十分に開示されている。例えば、Sambrookら、MolecularCloning:A Laboratory Manual(最新版);DNACloning:A Practical Approach,第IおよびII巻(D.Glover編);Oligonucleotide Synthesis(N.Gait編、最新版);Nucleic Acid Hybridization(B.HamesおよびS.Higgins編、最新版);Transcription and Translation(B.HamesおよびS.Higgins編、最新版)を参照のこと。
【0128】
前出または後出とは関係なく、本明細書中で引用されている全ての出版物、特許および特許出願は、その全体が本明細書中で参考として援用されている。
【0129】
本明細書および添付の請求の範囲で用いられるように、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈にて他に明らかに指示がない限り、複数形を包含する。それゆえ、例えば、「ポリケチド(a polyketide)」との表示は、ポリケチドの混合物を包含し、「ポリケチドシンターゼ(a polyketide synthase)」との表示は、ポリケチドシンターゼの混合物を包含する。
【0130】
(A.定義)本発明を記載する際に、次の用語が使用され、そして以下に示すように定義されることが意図される。
【0131】
「置換PKS遺伝子クラスター」とは、それと共に形質転換された宿主細胞において、以下に定義される1つまたはそれ以上の適合性制御要素の支配下にある場合に、機能性PKSを産生し得るPKS遺伝子のあらゆるセットを意味する。機能性PKSは、ポリケチドの合成を触媒するものである。用語「置換PKS遺伝子クラスター」とは、1つまたはそれ以上の、ポリケチドの産生を触媒するために必要とされる種々のタンパク質をコードする遺伝子を含む。「置換PKS遺伝子クラスター」は、対応する天然クラスターに見出される全ての遺伝子を包含する必要はない。むしろ、この遺伝子クラスターは、活性ポリケチドの産生を触媒するために必要なPKS成分をコードすることのみが必要である。それゆえ、以下にさらに説明されるように、この遺伝子クラスターが、例えば、ネイティブ状態で8個の遺伝子を包含し、そしてこれらの遺伝子のうち3個のみが活性ポリケチドを提供するのに必要ならば、これらの3個の遺伝子のみの存在が必要である。さらに、このクラスターは、単一種由来のPKS遺伝子を包含し得るか、または事実上、例えば、他のポリケチドの合成のためのクラスター由来の対応する遺伝子で置換される、特定のポリケチドの合成のためのクラスター由来の遺伝子を有するハイブリッドであり得る。ハイブリッドクラスターは、タイプI PKSおよびタイプII PKSの両方に由来する遺伝子を包含し得る。上記のように、タイプI PKSは、いくかの大型の多機能タンパク質を包含し、これらの間には、炭素鎖のアセンブリおよび修飾の各工程のための別々の活性部位のセットを有する。他方、タイプII PKSは、反復して使用される活性部位の単一のセットを有する。これらの分類は周知である。例えば、Hopwood,D.A.およびKhosla,C.Secondary metabolites:their function and evolution(1992)Wiley Chichester(Ciba Foundation Symposium 171)88−112頁;Bibb,M.J.ら、EMBO J.(1989)8:2727;Sherman,D.H.ら、EMBO J.(1989)8:2717;Fernandez−Moreno,M.A.ら、J.Biol.Chem.(1992)267:19278);Cortes,J.ら、Nature(1990)348:176;Donadio,S.ら、Science(1991)252:675;MacNeil,D.J.ら、Gene(1992)115:119。ハイブリッドクラスターは、ここで例示され、そして以下にさらに記載される。遺伝子クラスターに含まれる遺伝子はネイティブな遺伝子である必要はないが、これらの変異体またはアナログであり得る。変異体またはアナログは、コーディング配列の1つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置換により調製され得る。ヌクレオチド配列を改変する技術(例えば、部位特異的変異誘発)は、例えば、Sambrookら、前出;DNACloning,第IおよびII巻、前出;Nucleic Acid Hybridization, 前出に記載されている。
【0132】
「置換PKS遺伝子クラスター」はまた、PKSにより触媒されるコアポリケチドへの改変をコードする遺伝子を含有し得、これらの遺伝子には、例えば、ヒドロキシラーゼ、メチラーゼまたは他のアルキラーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、グリコトランスフェラーゼ、リアーゼ、エステルシンターゼまたはアミドシンターゼ、および種々のヒドロラーゼ(例えば、エステラーゼおよびアミダーゼ)をコードする遺伝子が挙げられる。
【0133】
以下にさらに説明されるように、置換遺伝子クラスターに含まれる遺伝子は、同じプラスミドに存在する必要がないか、または同じプラスミドに存在するならば、同じまたは異なる制御配列により制御され得る。
【0134】
「遺伝子操作した宿主細胞」とは、ネイティブなPKS遺伝子クラスターが組換えDNA技術を用いることによって欠失した宿主細胞を意味する。それゆえ、この用語は、自然に起こる変異事象を包含しない。「宿主細胞」は、単細胞統一体として培養される原核微生物または真核細胞株由来の細胞であり、これは、本発明のPKS遺伝子クラスターを持つ組換えベクターの受容体として使用され得るか、または使用されてきた。この用語は、トランスフェクトされたもとの細胞の子孫を包含する。単一の親細胞の子孫は、偶発的または故意の変異のため、その形態学またはゲノムDNAもしくは全DNA補体が、必ずしも元の親細胞と完全に同一であり得ないことが理解される。関連の特性(例えば、所望のPKSをコードするヌクレオチド配列の存在)により特徴づけられる親細胞と十分に類似するこの親細胞の子孫は、この定義に含まれ、そして上記用語によりカバーされる。
【0135】
用語「異種の」は、これがコーディング配列および制御配列のような核酸配列に関する場合には、通常なら組換え構築物の領域と会合しない配列、および/または、通常なら特定の細胞と会合しない配列を示す。それゆえ、核酸構築物の「異種の」領域は、他の分子と天然に会合している状態で見出されていない他の核酸分子内で、あるいは結合されている核酸の同定可能なセグメントである。例えば、構築物の異種の領域は、コーディング配列と天然に会合している状態で見出されていない配列により隣接されるコーディング配列を包含し得る。異種のコーディング配列の他の例は、このコーディング配列自体(例えば、ネイティブな遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列)が自然には見出されない構築物である。同様に、宿主細胞に通常存在しない構築物で形質転換された宿主細胞は、本発明の目的のための異種であると考えられる。本明細書中で使用されるように、アレル変異または天然に起こる変異事象は、異種DNAを生成しない。
【0136】
「コーディング配列」または特定のPKSを「コードする」配列は、インビトロまたはインビボで、適切な調節配列の制御下に置かれるときに、ポリペプチドに転写され(DNAの場合)、そして翻訳される(mRNAの場合)核酸配列である。コーディング配列の境界は、5’(アミノ)末端の開始コドンおよび3’(カルボキシ)末端の翻訳終止コドンにより決定される。コーディング配列は、原核mRNAまたは真核mRNA由来のcDNA、原核DNAまたは真核DNA由来のゲノムDNA配列、および合成DNA配列さえを包含し得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、コーディング配列の3’に位置する。
【0137】
「核酸」配列は、原核配列、真核mRNA、真核mRNA由来のcDNA、真核(例えば、哺乳類)DNA由来のゲノムDNA配列、および合成DNA配列さえ包含し得るが、これらに限定されない。この用語はまた、任意のDNAおよびRNAの既知の塩基アナログを含む配列を包含する。これらの塩基アナログには、例えば、4−アセチルシトシン、8−ヒドロキシ−N6−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、5−(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6−イソペンテニルアデニン、1−メチルアデニン、1−メチルプソイドウラシル、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N6−メチルアデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、β−D−マンノシルキューオシン(β−D−mannosylqueosine)、5’−メトキシカルボニルメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン(queosine)、2−チオシトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、N−ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、2−チオシトシン、および2,6−ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、コーディング配列の3’に位置する。
【0138】
DNA「制御配列」とは、プロモーター配列、リボゾーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、エンハンサーなどを集合的に意味し、これらは、宿主細胞において、コーディング配列の転写および翻訳を集合的に提供する。所望の遺伝子が転写かつ翻訳され得る限り、これらの制御配列の全ては必ずしも組換えベクターに存在する必要がない。
【0139】
「作動可能に連結される」とは、要素の配置を意味し、ここで、このように記載される成分がこれらの通常の機能を果たすように配置される。それゆえ、コーディング配列に作動可能に連結される制御配列は、このコーディング配列の発現を行い得る。制御配列は、これらがその発現に直接作用する限り、コーディング配列と隣接する必要はない。それゆえ、例えば、翻訳されていないが転写はされた介在配列がプロモーター配列とコーディング配列との間に存在し得、そしてプロモーター配列はなお、コーディング配列に「作動可能に連結されている」と考えられ得る。
【0140】
「選択マーカー」とは、マーカーをそのゲノムに持つ細胞の集団を選択するために使用され得る任意の遺伝的マーカーを意味する。選択マーカーの例には、栄養要求性マーカー(このマーカーにより、細胞が、栄養分または補充物(例えば、チミジン、ジアミノピメリン酸またはビオチン)を有するかまたは有しない最少培地で成長する能力により選択される);代謝マーカー(このマーカーにより、細胞が、唯一の炭素源として適切な糖を含有する最少培地で成長するその能力、あるいは適切な染料または染色基質を含有する染色コロニーを形成する細胞の能力により選択される);および薬物耐性マーカー(このマーカーにより、細胞が、1種またはそれ以上の適切な薬物(例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ストレプトマイシンまたはナリジキシン酸)を含有する培地で成長するこの能力により選択される)が挙げられる。
【0141】
「組換え」とは、2つのDNA分子の間のDNA配列の区分の再組立である。「相同組換え」は、各DNA分子に存在する相同または相補的ヌクレオチド配列によってハイブリダイズする2つのDNA分子の間に起こる。
【0142】
本明細書中で使用される用語「アルキル」とは、1個〜24個の炭素原子の分枝状または非分枝状の飽和炭化水素基(例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、t−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラエイコシルなど)を意味する。本明細書中の好ましいアルキル基は、1個〜12個の炭素原子を含有する。用語「低級アルキル」とは、1個〜6個の炭素原子、好ましくは1個〜4個の炭素原子のアルキル基を意図する。
【0143】
本明細書中で使用される用語「アルキレン」とは、1個〜24個の炭素原子を含有する二官能性の飽和の分枝状または非分枝状の炭化水素鎖を意味し、これには、例えば、メチレン(−CH2−)、エチレン(−CH2−CH2−)、プロピレン(−CH2−CH2−CH2−)、2−メチルプロピレン[−CH2−CH(CH)3−CH2−]、へキシレン[−(CH2)6−]などが挙げられる。「低級アルキレン」とは、1個〜6個、より好ましくは1個〜4個の炭素原子のアルキレン基を意味する。
【0144】
本明細書中で使用される用語「アルコキシ」とは、単一の末端エーテル結合を介して結合したアルキル基を意図する;すなわち、「アルコキシ」基は、−ORとして定義され得、ここで、Rは先に定義されたアルキルである。「低級アルコキシ」基とは、1個〜6個、より好ましくは1個〜4個の炭素原子を含有するアルコキシ基を意図する。
【0145】
「ハロ」または「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意図し、そして通常、有機化合物中の水素原子のハロ置換に関する。ハロのうち、クロロおよびフルオロが一般に好ましい。
【0146】
「任意の」または「任意に」とは、次に記載される事象または情況が起こり得るかまたは起こり得ないこと、および本明細書は上記事象または情況が起こる例および起こらない例を含むことを意味する。例えば、表現「任意に置換されるアルキレン」とは、アルキレン部分が置換され得るかまたは置換され得ないこと、および本明細書は未置換のアルキレンおよび置換を有するアルキレンの両方を包含することを意味する。
【0147】
(B.一般的方法)本発明の中核は、新規および公知のポリケチドの両方の効果的組換え産生のための宿主−ベクター系の発見である。特に、本発明は、天然に生じるPKS遺伝子が実質的に欠失した、遺伝子操作した細胞を利用する。これらの宿主細胞は、活性ポリケチドの産生のために、種々のPKS遺伝子クラスターをコードする組換えベクターで形質転換され得る。本発明は、成長周期の適切な段階で大量の産生物の産生を提供する。このように産生されたポリケチドは、問題のポリケチドのタイプに依存して、治療剤として多くの疾患を治療するために使用され得る。例えば、本方法によって産生されたいくつかのポリケチドは、免疫抑制剤、抗腫瘍剤として、ならびにウイルス、細菌および寄生虫感染の治療のための使用が見出される。ポリケチドを組換えによって産生する能力もまた、PKSおよびそれらの作用のメカニズムを特徴づける強力な道具を提供する。
【0148】
より特定すると、対象のポリケチドの組換え産生のための宿主細胞は、組換えPKS遺伝子クラスターの宿主となる能力を有するいずれの生物にも由来し得る。それゆえ、本発明の宿主細胞は、原核生物または真核生物のいずれにも由来し得る。しかし、好ましい宿主細胞は、多くのポリケチドの大量生産者である菌糸型細菌の1クラスである放線菌から構築されるものである。本発明の系と共に使用のための特に好ましい属は、Streptomycesである。それゆえ、例えば、S.ambofaciens、S.avermitilis、S.azureus、S.cinnamonensis、S.coelicolor、S.curacoi、S.erythraeus、S.fradiae、S.galilaeus、S.glaucescens、S.hygroscopicus、S.lividans、S.parvulus、S.peucetius、S.rimosus、S.roseofulvus、S.thermotolerans、S.violaceoruber他は、本発明に都合の良い宿主細胞を提供し、中でも、S.coelicolorが好ましい。(例えば、Hopwood,D.A.およびSherman,D.H.Ann.Rev.Genet.(1990)24:37−66;O’Hagan,D.The Polyketide Metabolites(Ellis Horwood Limited,1991)の種々のポリケチド産生生物およびこれらの天然産生物に関する記載を参照せよ)。
【0149】
上記の細胞は、標準の技術(例えば、相同組換えにより)を用いて、この細胞由来の天然に生じるPKS遺伝子を欠失させることにより、遺伝子操作される。(例えば、Khosla,C.ら、Molec.Microbiol.(1992)6:3237を参照せよ)。本明細書中で例示されるのは、遺伝子操作したS.coelicolor宿主細胞である。S.coelicolorのネイティブ株は、芳香族ポリケチドアクチノロジン(構造3、図5)の生合成を触媒するPKSを産生する。新規な株であるS.coelicolor CH999(図2C、そして実施例に記載されている)は、相同組換えによってS.coelicolor CH1の染色体由来の天然actクラスター全てを欠失させることにより構築された(Khosla,C.Molec.Microbiol.(1992)6:3237)。この株は、内因性プラスミドを欠き、そして他の着色されたS.coelicolor抗生物質であるウンデシルプロジギオシン(undecylprodigiosin)の生合成をブロックする安定な変異を有している。
【0150】
上記の宿主細胞は、1つまたはそれ以上のベクターで形質転換され得、これにより、機能的なPKSセットを集合的にコードする。このベクターは、PKSのサブユニットのネイティブまたはハイブリッドの組み合わせまたはその変異体を包含し得る。先に説明されたように、置換遺伝子クラスターは、完全なネイティブ遺伝子クラスターに一致する必要はなく、ポリケチドの産生を触媒する必要なPKS成分をコードすることのみが必要である。例えば、現在までに研究された各Streptomyces芳香族PKSでは、炭素鎖アセンブリは、3つのオープンリーディングフレーム(ORF)の生成物を必要とする。ORF1は、ケトシンターゼ(KS)およびアシルトランスフェラーゼ(AT)の活性部位(KS/AT)をコードする;本明細書中で明らかにされるように、ORF2は、鎖長決定因子(CLF)(ORF1生成物と類似したタンパク質)をコードするが、KSおよびATのモチーフを欠く;そしてORF3は、別のアシルキャリアタンパク質(ACP)をコードする。いくかの遺伝子クラスターはまた、発生期のポリケチド骨格の環化に関与するケトレダクターゼ(KR)およびシクラーゼをコードする。(図1の3つのPKS遺伝子クラスターの概略的図を参照せよ)。しかし、同定可能なポリケチドを産生するためには、KS/AT、CLF、およびACPのみが存在する必要があることが見出された。それゆえ、Streptomyces由来の芳香族PKSの場合、これらの3つの遺伝子は、ネイティブなクラスターの他の成分無しで、1つまたはそれ以上の組換えベクターに含まれて、「最小」の置換PKS遺伝子クラスターを構成し得る。
【0151】
さらに、組換えベクターは、単一のPKS遺伝子クラスター由来の遺伝子を含み得るか、またはハイブリッド置換PKS遺伝子クラスターを含有し得、例えば、このクラスターは、1つのクラスターに対する遺伝子が他の遺伝子クラスター由来の対応する遺伝子で置換されている。例えば、ACPは、産生物の構造に影響することなく、異なるシンターゼの間で容易に互いに交換し得ることが見出された。さらに、所定のKRは、異なる鎖長のポリケチド鎖を認識し、そして還元させ得る。従って、これらの遺伝子は、本明細書中に記載される構築物において自由に交換され得る。それゆえ、本発明の置換クラスターは、同定可能なポリケチドを産生するために最終的に機能するPKS遺伝子セットの任意の組み合わせに由来し得る。
【0152】
ハイブリッド置換クラスターの例には、2つまたはそれ以上のact遺伝子クラスター、フレノリシン(fren)、グラナチシン(gra)、テトラセノマイシン(tcm)、6−メチルサリチル酸(6−msas)、オキシテトラサイクリン(otc)、テトラサイクリン(tet)、エリスロマイシン(ery)、グリセウシン(griseusin)、ナナオマイシン(nanaomycin)、メデルマイシン(medermycin)、ダウノルビシン(daunorubicin)、チロシン(tylosin)、カルボマイシン(carbomycin)、スピラマイシン(spiramycin)、アベルメクチン(avermectin)、モネンシン(monensin)、ノナクチン(nonactin)、クラマイシン(curamycin)、リファマイシン(rifamycin)およびカンジシジン(candicidin)シンターゼ遺伝子クラスター他に由来する遺伝子を有するクラスターが挙げられる。(種々のPKSの議論については、例えば、Hopwood,D.A.およびSherman,D.H.Ann.Rev.Genet.(1990)24:37−66;O’Hagan,D.The Polyketide Metabolites(Ellis Horwood Limited,1991)を参照せよ)。
【0153】
より特定すれば、多くのハイブリッド遺伝子クラスターが本明細書で構築され、これらは、表1および2に示されるように、act、fren、tcmおよびgra遺伝子クラスター由来の成分を有する。いくつかのハイブリッドクラスターは、S.coelicolorCH999中で、新規および公知の両ポリケチドを機能的に発現し得た(上記)。しかし、上記のように、他のハイブリッド遺伝子クラスターは、同定可能なポリケチドの産生のために、本明細書の開示を用いて容易に産生されおよびスクリーニングされ得る。例えば、放線菌類(actinomycetes)のコレクションから、ランダムにクローン化されたORF1および2ホモログのライブラリーが構築され得、そして同定可能なポリケチドについてスクリーニングされ得た。より長いポリケチドもまた、正確な長さの鎖を産生するPKS遺伝子クラスター由来のホモログで、例えば、act、gra、frenまたはtcmシクラーゼ遺伝子を置き換えることにより環状化され得た。最後に、天然に生じる特定の芳香族PKS類の間には、非酢酸塩のスターター単位についてかなりの程度の変動が存在する;従って、これらの単位もまた、遺伝子工学により新規なポリケチドを得るために使用され得る。
【0154】
さらに、組換えベクターは、モジュールのPKS遺伝子クラスター由来の遺伝子を含み得る。そのような遺伝子クラスターをさらに詳細に以下に記載する。
【0155】
上記の遺伝子クラスターを有する組換えベクターは、当該分野で公知の技術を用いて都合よく生成され得る。例えば、目的のPKSサブユニットは、PKSサブユニットを発現する生物から、組換え法を用いて、例えばこの遺伝子を発現する細胞由来のcDNAまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、またはこの遺伝子を含むことが知られているベクターからこの遺伝子を得ることにより得られ得る。次いで遺伝子は、標準の技術を用いて、単離されそしてその他の所望のPKSサブユニットと組み合わされ得る。問題の遺伝子がすでに、適切な発現ベクター中に存在する場合、それは、例えば、その他のPKSサブユニットとインサイチュで所望のように組み合わされ得る。目的の遺伝子はまた、クローン化よりもむしろ合成的に産生され得る。ヌクレオチド配列は、所望の特定のアミノ酸配列に対する適切なコドンを用いて設計され得る。一般に、その配列が発現される目的の宿主に好適なコドンが選択される。標準的な方法により調製された重複するオリゴヌクレオチドから完全な配列がアセンブルされ、そして完全なコーディング配列にアセンブルされる。例えば、Edge(1981)Nature 292:756;Nambairら、(1984)Science223:1299;Jayら、(1984)J.Biol.Chem.259:6311を参照のこと。
【0156】
ネイティブのPKSサブユニット配列に対して変異が作成され得、そしてそのような変異体は、この変異体がその他のPKSサブユニットとともに機能し得、同定可能なポリケチドの合成を集合的に触媒し得る限り、ネイティブの配列の代わりに使用され得る。そのような変異は、例えば、変異を有する合成オリゴヌクレオチドを調製し、そして制限エンドヌクレアーゼ消化を用いてPKSサブユニットをコードする遺伝子中に変異した配列を挿入することによる従来技術を用いてネイティブな配列に作成され得る。(例えば、Kunkel,T.A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82:448;Geisselsoderら、BioTechniques(1987)5:786を参照)。あるいは、変異は、ミスマッチプライマー(一般に長さ10〜20のヌクレオチド)を用いてなされ得、このプライマーは、ミスマッチした二本鎖の融解温度以下の温度で、ネイティブなヌクレオチド配列(一般にRNA配列に対応するcDNA)にハイブリダイズする。このプライマーは、プライマーの長さおよび塩基組成を比較的狭い限度内に保つことにより、および変異体塩基を中心に位置させることにより特異的に作製し得る。ZollerおよびSmith、MethodsEnzymol.(1983)100:468。プライマー伸長は、DNAポリメラーゼを用いて行われ、生成物はクローン化され、そしてプライマーが伸長した鎖の分離から得た変異DNAを含むクローンが選択される。選択は、ハイブリダイゼーションプローブとして変異体プライマーを用いてなされ得る。この技術はまた、複数の点変異を生成するために適用し得る。例えば、Dalbie−McFarlandら、Proc.Natl.Acad.SciUSA(1982)79:6409を参照。PCR変異誘発もまた、所望の変異を行うための使用を見い出すであろう。
【0157】
置換PKS遺伝子クラスターを集合的にコードする遺伝子配列は、当業者に公知の方法を用いて1つまたはそれ以上の発現ベクター中に挿入され得る。発現ベクターは、所望のPKSコーディング配列に作動可能に連結された制御配列を含む。本発明に使用するための適切な発現系は、真核生物宿主細胞および原核生物宿主細胞において機能する系を含む。しかし、上記で説明したように、原核生物系が好適であり、そして特に、Streptomycesspp.と適合する系が特に重要である。そのような系で使用するための制御要素は、任意にオペレーター配列を含むプロモーター、およびリボソーム結合部位を含む。特に有用なプロモーターは、1つまたはそれ以上のactプロモーターのような、PKS遺伝子クラスター由来の制御配列を含む。しかし、ガラクトース、ラクトース(lac)およびマルトースのような糖代謝酵素由来のプロモーターのような、その他の細菌プロモーターもまた、本発明の構築物における使用を見い出す。さらなる例は、トリプトファン(trp)、βラクタマーゼ(bla)プロモーター系、バクテリオファージλPL、およびT5のような生合成酵素由来のプロモーター配列を含む。さらに、tacプロモーター(米国特許第4,551,433号)のような、合成のプロモーターもまた、天然には生じないが、細菌宿主細胞で機能する。
【0158】
他の調節配列もまた所望され得、この配列は宿主細胞の成長に相関してPKS置換配列の発現の調節を可能にする。調節配列は当業者に公知であり、そしてこの例としては、遺伝子の発現を、化学的または物理的刺激(調節化合物の存在を含む)に応答して開始(turnon)または停止(turnoff)させる調節配列を含む。その他のタイプの調節要素(例えば、エンハンサー配列)もまたベクター中に存在し得る。
【0159】
選択マーカーもまた、組換え発現ベクター中に含まれ得る。形質転換細胞株の選択において有用であり、そして一般に、細胞が適切な選択培地中で生長するとき、その発現が形質転換細胞上の選択可能な表現型を与える遺伝子を含む種々のマーカーが公知である。そのようなマーカーは、例えば、プラスミドに抗生物質の耐性または感受性を付与する遺伝子を含む。あるいは、いくつかのポリケチドは、本来着色されており、この特徴は、本発明の構築物により首尾良く形質転換された細胞を選択するための生来の(built−in)マーカーを提供する。
【0160】
目的の種々のPKSサブユニットが、別の制御要素とともに、または例えば単一プロモーターの制御下で1個のカセットとして、1つまたはそれ以上の組換えベクター中にクローン化され得る。PKSサブユニットは、隣接する制限部位を含んで、その他のPKSサブユニットの容易な欠失および挿入を可能にし、その結果、ハイブリッドPKSが生成され得る。そのようなユニークな制限部位の設計は当業者に公知であり、そして部位特異的変異誘発およびPCRのような、上記に記載の技術を用いて達成され得る。
【0161】
これらの技術を用いて、本明細書に記載のポリケチドの産生のためのシャトルベクターとして、新規プラスミドpRM5(図3および実施例2)が構築された。プラスミドpRM5は、PacI、NsiIおよびXbaI制限部位が隣接する、KS/AT(ORF1)、CLF(ORF2)およびACP(ORF3)PKSサブユニットをコードするact遺伝子を含む。従って、その他のPKS遺伝子によりコードされる類似の(anologous)PKSサブユニットは、存在するact遺伝子を容易に置換し得る。(例えば、親プラスミドとしてpRM5を用いるハイブリッドベクターの構築を記載する実施例4参照)。シャトルプラスミドはまた、actKR遺伝子(actIII)、シクラーゼ遺伝子(actVII)、および推定のデヒドラターゼ遺伝子(actIV)、ならびにColEIレプリコン(E.coliの形質転換を可能にする)、適切な短縮型(truncated)SCP2*(低コピー数)Streptomycesレプリコン、およびactクラスター由来のactII−ORF4アクティベーター遺伝子(栄養菌糸において成長期から定常期への移行の間にactプロモーターからの転写を誘導する)を含む。pRM5は、多様なactI/actIIIプロモーターペアを有する。
【0162】
本発明の組換えベクターを適切な宿主中に導入する方法は、当業者に公知であり、そして代表的には、CaCl2または2価のカチオンおよびDMSOのようなその他の薬剤の使用を包含する。DNAはまた、エレクトロポーレーションにより細菌細胞中に導入され得る。一旦PKSが発現されると、ポリケチド産生コロニーが同定され得、そして公知の技術を用いて単離され得る。次いで産生されたポリケチドがさらに特徴づけられ得る。
【0163】
上記で説明したように、上記の組換え法はまた、大きなモジュールPKSによるポリケチドの触媒的生合成に有用性を見い出す。例えば、6−デオキシエリスロノライドBシンターゼ(DEBS)は、エリスロマイシンアグリコンである6−デオキシエリスロノライドB(17)の生合成を触媒する。3つのオープンリーディングフレーム(eryAI、eryAII、およびeryAIII)がDEBSポリペプチドをコードし、そしてSaccharopolysporaerythraeaゲノムのeryクラスター中で32kbにわたっている。この遺伝子は、それぞれが「モジュール」と称される、6つの繰り返し単位で組織されている。各モジュールは、1セットの活性部位をコードし、この活性部位は、ポリケチド生合成の間に、付加モノマーの成長鎖上への縮合を触媒する。各モジュールは、アシルトランスフェラーゼ(AT)、β−ケトアシルキャリアタンパク質シンターゼ(KS)、およびアシルキャリアタンパク質(ACP)、ならびに還元活性部位のサブセット(β−ケトレダクターゼ(KR)、デヒドラターゼ(DH)、エノイルレダクターゼ(ER))(図9)を含む。モジュール内の還元部位の数は、各縮合サイクルにおけるβケト還元の程度に対応する。モジュールの末端でコードされるチオエステラーゼ(TE)は、ラクトン形成を触媒するようである。
【0164】
eryAI、eryAIIおよびeryAIIIの大きなサイズ、および複数の活性部位の存在のために、これらの遺伝子は、インビボ組換え技術を用いて、CH999のような、遺伝子操作した宿主細胞中での発現に適切なプラスミド中に便利にクローン化され得る。実施例5に記載され、そして図10に要約されたこの技術は、プラスミドpMAK705の誘導体(Hamiltonら、(1989)J.Bacteriol.171:4617)を利用し、温度感受性ドナープラスミド(第1の許容温度で複製し得、そして第2の非許容温度で複製し得ない)と、受容体プラスミドとの間のインビボ組換えを可能にする。このようにクローン化されたeryA遺伝子は、pRM5(McDanielら、(1993)Science262:1546)の誘導体pCK7を与える。コントロールプラスミドpCK7fを構築してeryAI中にフレームシフト変異をもたらした。pCK7およびpCK7fは、E.coliにおける遺伝子操作のためのColEIレプリコンならびに短縮型SCP2*(低コピー数)Streptomycesレプリコンを有する。これらのプラスミドはまた、多様なactI/actIIIプロモーターペアおよびactII−ORF4(これらプロモーターからの転写に必要であり、そして栄養菌糸において成長期から定常期への移行の間に発現を活性化するアクティベーター遺伝子)を含む。PKS遺伝子の高レベル発現は、菌糸成長の定常期の開始の際に起こる;従って、組換え株は、あたかも天然のように、2次代謝物として「レポーター」ポリケチドを産生する。
【0165】
大きな、モジュールPKSにより合成されるポリケチドの上記の産生方法を用いて、糖類、βラクタム、脂肪酸、アミノグリコシド、テルペノイド、非リボソームペプチド、プロスタノイドホルモンなどのような2次代謝物として他のポリケチドが産生され得る。
【0166】
上記の組換え法を用いて、多くのポリケチドが産生された。これらの化合物は、以下の一般構造(I)を有する
【0167】
【化19】
【0168】
ここでR1、R2
、R3、R4、R5、R6、R7、R8およびiは、上記で規定された通りである。このような化合物の1つの群はここで:R1は、低級アルキル、好ましくはメチルであり;R2、R3、およびR6は水素であり;R6は、−CHR7−(CO)−R8であり;そしてiは0である。このような化合物の第2番の群はここで:R1およびR6は、低級アルキル、好ましくはメチルであり;R2、R3、およびR5は、水素であり;そしてiは0である。このような化合物のさらに第3の群はここで:R1およびR2は、一緒に連結して低級アルキレン架橋−CHR9−CHR10を形成し、ここでR9およびR10は、独立して、水素、ヒドロキシルおよび低級アルキル(例えば、−CH2−CHOH−)からなる群より選択され;R3およびR5は水素であり;R6は、−CHR7−(CO)−R8、ここで、R8は、水素または低級アルキル(例えば、−CH2−(CO)−CH3)であり;そしてiは0である。そのような化合物の特定の例は、次のような以下の化合物9、10および11を含む:
【0169】
【化20】
【0170】
本発明の範囲内の他の新規なポリケチドは以下の構造を有する:
【0171】
【化21】
【0172】
【化22】
【0173】
化合物9、10、11、12、13、14、15および16の調製は、構造(II)を有する酵素結合ポリケチドの環化により行われる:
【0174】
【化23】
【0175】
ここで、R11、R12、R13およびR14およびEは、先に定義されるものと同じである。このような化合物の例には:R11がメチルであり、そしてR1 2が−CH2(CO)−S−Eである第1群;R11が−CH2(CO)CH3であり、そしてR12が−S−Eである第2群; R11が−CH2(CO)CH3であり、そしてR12が−CH2(CO)−S−Eである第3群;ならびにR11が−CH2(CO)CH2(CO)CH3であり、そしてR12が−CH2(CO)−S−Eである第4群が挙げられる(図8の構造の具体例を参照せよ)。
【0176】
一般式(I)に含まれる残りの構造、すなわち、9、10および11以外の構造は、有機化学分野の当業者に周知の慣用の有機合成方法を用いて、構造9、10または11から調製され得る。これらの方法は、例えば、H.O.HouseによるModern Synthetic Reactions,第2版(Menlo Park,CA:The Benjamin/Cummings Publishing Company,1972)、またはJ.March,Advanced Organic Chemistry:Reaction,Mechanisms and Structure 第4版(New York:Wiley−Interscience,1992)に記載され、これらの開示は、本明細書中で参考として援用されている。代表的には、当業者に理解されるように、芳香族環への置換基の取り込みには、簡単な求電子性芳香族付加反応が含まれる。構造12および13は同様の方法で改変されて、ポリケチドを産生し得る。これらのポリケチドもまた、本発明の範囲内にあると意図される。
【0177】
さらに、上記組換え方法を用いて、以下の一般式を有するポリケチド化合物が産生された:一般式(III)
【0178】
【化24】
【0179】
一般式(IV)
【0180】
【化25】
【0181】
および一般式(V)
【0182】
【化26】
【0183】
構造式(III)、(IV)および(V)の特に好ましい化合物は、R2が水素であり、そしてiが0であるものである。
【0184】
C.実験
以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の実施例である。これらの実施例は、例示の目的のためだけに提供され、どのような場合においても本発範囲を限定することを意図していない。
【0185】
使用される数字(例えば、量、温度など)の正確さを確実にするために努力したが、いくつかの実験誤差および偏差は、当然許容されるべきである。
【0186】
(材料および方法)
(細菌株、プラスミド、および培養条件)S.coelicolor CH999を、全てのプラスミドによる形質転換のための宿主として使用した。この株の構築を以下に説明する。DNA操作を、Escherichia coliMC1061において行った。プラスミドを、E.coli ET12567(dam dcm hsdS Cmr)(MacNeil,D.J.J.Bacteriol.(1988)170:5607)に通して、S.coelicolorの形質転換の前にメチル化されていないDNAを生成した。E.coli株を標準条件下で成長させた。S.coelicolor株をR2YE寒天プレート上で成長させた(Hopwood,D.A.ら、Genetic manipulation of Streptomyces.A laboratorymanual.The John Innes Foundation:Norwich,1985)。
【0187】
DNAおよび微生物の操作。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を、酵素製造者によって推薦された条件下でTaqポリメラーゼ(Perkin ElmerCetus)を用いて行った。標準のインビトロ技術を、DNA操作のために使用した(Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(最新版))。E.coliを、Bio−Rad E.coliパルス装置でBio−Rad.により提供されたプロトコールを用いて形質転換させた。S.coelicolorを、標準の手順により形質転換させ(Hopwood,D.A.ら、Genetic manpulation of Streptomyces.A laboratory manual.The John Innes Foundation:Norwich,1985)、そして形質転換体を、500mg/mlチオストレプトンオーバーレイ2mlを用いて選択した。
【0188】
組換えPKSを含有するプラスミドの構築。全てのプラスミドは、以下に記載するpRM5の誘導体である。fren PKS遺伝子を、この遺伝子に隣接する5’および3’制限部位を用いてPCRにより、pRM5のクローニング部位の位置(すなわち、ORF1に対するPacI−NsiI、ORF2に対するNsiI−XbaI、およびORF3に対するXbaI−PstI)に従って増幅させた。サブクローニングおよび配列決定に続いて、増幅させたフラグメントをpRM5中の対応するフラグメントの位置にクローン化して、形質転換のためのプラスミドを生成した。
【0189】
ポリケチドの産生および精製。最初のスクリーニングのために、全ての株を、それぞれ約30mlの寒天培地を含有する10〜30プレート上でコンフルエントローンとして、30℃で6〜8日間成長させた。完全な特徴付けのための十分な材料を得ることが必要とされるので、さらなるプレートを作製した。CH999は、潜在的なポリケチドをスクリーニングする場合のネガティブコントロールであった。寒天を細かく切り、そして酢酸エチル/1%酢酸または酢酸エチル:メタノール(4:1)/1%酢酸で抽出した。次いで、濃縮した抽出物を、シリカゲル(Baker 40mm)クロマトグラフィーカラムを通して、酢酸エチル/1%酢酸でフラッシュした。あるいは、抽出物をFlorisilカラム(Fisher Scientific)にかけ、そして酢酸エチル:エタノール:酢酸(17:2:1)で溶出した。初めの黄色画分を、調製用の逆相(C−18)カラム(Beckman)でアセトニトリル/水/1%酢酸の20〜60%グラジエントを用いる高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によりさらに精製した。280nmおよび410nmでの吸収をモニターした。一般に、これらの株からの精製産物の収率は、化合物1および2(図4)については約10mg/lであり、そして化合物7および8(図7)については5mg/lであった。
【0190】
SEK4(12)を、以下のように産生および精製した。CH999/pSEK4を、90寒天プレート(約34ml/プレート)上で30℃で7日間成長させた。この寒天を細切し、そして1%酢酸の存在下で酢酸エチル/メタノール(4/1)(3×1000ml)で抽出した。減圧下での溶媒の除去に続いて、1%酢酸を含有する酢酸エチル200mlを加えた。沈澱物を濾過して廃棄し、そして溶媒を乾燥するまで蒸発させた。生成物の混合物を、Florisilカラム(Fisher Scientific)にかけ、そして3%酢酸を含有する酢酸エチルで溶出した。初めの100ml画分を収集し、そして5mlまで濃縮した。メタノール1mlを加え、そして混合物を4℃で一晩保持した。沈殿物を濾過により収集し、そして酢酸エチルで洗浄して、純粋な生成物850mgを得た。Rf=0.48(1%酢酸の酢酸エチル)。SEK4に関するNMR分析の結果を表4に示す。FAB HRMS(NBA)、M+H+、計算値m/e 319.0818、実測値m/e 319.0820。
【0191】
SEK15(13)およびSEK15b(16)を産生するために、CH999/pSEK15を90寒天プレート上で成長させ、そして産生物をSEK4と同様の方法で抽出した。混合物をFlorisilカラム(5%酢酸を有する酢酸エチル)にかけ、主要産物を含有する画分を合わせ、そして乾燥するまで蒸発させた。産生物を、調製用のC−18逆相HPLC(Beckman)(移動相:1%酢酸の存在下のアセトニトリル/水=1/10〜3/5のグラジエント)を用いてさらに精製した。SEK15(13)の収量は250mgであった。Rf=0.41(1%酢酸の酢酸エチル)。SEK4に関するNMR分析の結果を表4に示す。FAB HRMS(NBA)、M+H+、計算値m/e 385.0923、実測値m/e 385.0920。
【0192】
[1,2−13C2]アセテート供給実験。それぞれ改変NMP培地(Strauch,E.ら、Mol.Microbiol.(1991)5:289)400mlを含有する2つの2リットルのフラスコに、S.coelicolorCH999/pRM18、CH999/pSEK4またはCH999/pSEK15の胞子を接種し、そして振とう培養装置において30℃で300rpmでインキュベートした。各フラスコに、[1,2−13C2]酢酸ナトリウム(Aldrich)50mgを72時間および96時間の時点で加えた。120時間後、培養物をプールし、そして2回の500ml容量の酢酸エチル/1%酢酸で抽出した。有機相を保持し、そして上記のように精製した。13C NMRデータは、CH999/pRM18産物について約2〜3%の増加;SEK4について0.5〜1%の増加およびSEK15について1〜2%の増加を示す。
【0193】
NMRスペクトル分析。RM18(10)(図8)のHETCOR分析をNicolet NT−360で行った以外は,全てのスペクトルをVarianXL−400で記録した。13Cスペクトルを、連続的ブロードバンドプロトンデカップリングで得た。RM18(10)のNOEの研究のために、一次元の差をとる方法(one−dimensional difference method)を利用した。全ての化合物をDMSO−d6(Sigma、99+原子%D)に溶解させ、そしてスペクトルを溶媒を内部標準として対照した。ヒドロキシル共鳴を、D2O(Aldrich、99原子%D)を添加し、そしてシグナルの消失を検査することにより同定した。
【0194】
【実施例】
(実施例1:S.coelicolorCH999の生産)S.coelicolor宿主細胞を遺伝子操作してネイティブなact遺伝子クラスターを除去し、そしてCH999と呼ばれる宿主細胞を、図2に示した戦略を用い、S.coelicolorCH1(Khosla,C.Molec.Microbiol.(1992)6:3237)を用いて構築した。(CH1は、S.coelicolorB385(Rudd,B.A.M.GeneticsofPigmentedSecondaryMetabolitesinStreptomycescoelicolor(1978)博士論文,UniversityofEastAnglia,Norwich,England)から得た)。CH1は、ポリケチド抗生物質アクチノロジンの生合成および分泌(export)に関与する酵素をコードするact遺伝子クラスターを含む。このクラスターは、いくつかのPKS生合成後の遺伝子(環化、芳香族化、および引き続く化学的改変(図2A)に関与する遺伝子を含む)が隣接するPKS遺伝子から構成される。act遺伝子の転写活性化を行う遺伝子もまた存在する。act遺伝子クラスターは、Khosla,C.ら、Molec.Microbiol.(1992)6:3237に記載されるような相同組換えを用いてCH1から欠失された。
【0195】
特に、プラスミドpLRermETs(図2B)は、次の特徴を有して構築された:pBR322由来のColEIレプリコン、pSG5由来の温度感受性レプリコン(Muth,Gら、Mol.Gen.Genet.(1989)219:341)、アンピシリンおよびチオストレプトン耐性マーカー、ならびにactクラスターの5’末端由来の2kbBamHI/XhoIフラグメント、1.5kbermEフラグメント(Khosla,C.ら、Molec.Microbiol.(1992)6:3237)、およびactクラスターの3’末端由来の1.9kbSphI/PstIフラグメントを含む分離カセット。5’フラグメントは、BamHI部位1(Malpartida,F.およびHopwood,D.A.Nature(1984)309:462;Malpartida,F.およびHopwood,D.A.Mol.Gen.Genet.(1986)205:66)から下流のXhoI部位にまでわたった。3’フラグメントは、PstI部位20から上流にSphI部位19.2にまでわたった(Fernandez−Moreno,M.A.ら、J.Biol.Chem.(1992)267:19278)。5’および3’フラグメント(図2で斜線で示されるDNA)は、actクラスターにおけるように、同じ相対方向にクローン化された。CH1は、pLRermEtsで形質転換された。このプラスミドは、引き続いて、39℃で非選択的に画線することによって候補形質転換体で保存された。リンコマイシン耐性、チオストレプトン感受性であり、かつアクチノロジンを産生し得ないいくつかのコロニーを単離し、そしてサザンブロッティングによりチェックした。それらの1つをCH999と称した。
【0196】
(実施例2:組換えベクターpRM5の生産)pRM5(図3)は、CH999でPKSを発現するために用いたシャトルプラスミドであった。それは、E.coliにおいて遺伝子操作を可能にするColEIレプリコン、適切な短縮型のSCP2*(低コピー数)Streptomycesレプリコン、および栄養菌糸で増殖期から定常期への移行の間にactプロモーターからの転写を誘導する、actクラスター由来のactII−ORF4アクチベーター遺伝子を含む。図3に示されるように、pRM5は、多様なactI/actIIIプロモーターペアを有し、同時に、両プロモーターの下流に種々の加工されたPKS遺伝子の挿入を容易にするために便利なクローニング部位を有する。pRM5は、SCP2*のpar遺伝子座を欠いている;その結果このプラスミドは、わずかに不安定である(チオストレプトンの非存在下で約2%が損失)。この特徴は、目的の表現型が、このプラスミド由来の変異体PKSに明確に割り当てられ得ることを、迅速に確認するために、故意に導入された。pRM5由来の組換えPKSは、ほぼ、対数増殖期から定常増殖期への移行期に、良好な収率で発現される。
【0197】
pRM5は以下のように構築された。pIJ903由来の10.5kbのSphI/HindIIIフラグメント(SCP2*の稔性遺伝子座の部分および複数起点、ならびにcolEI複製起点およびpBR327由来のβラクタマーゼ遺伝子を含む)(Lydiate、D.J.Gene(1985)35:223)を、1.5kbのHindIII/SphItsr遺伝子カセットと連結しpRM1を得た。pRM5は、pRM1のユニークなHindIIIとEcoRI部位との間に以下の2つのフラグメントを挿入することにより構築された:ファージfd由来の転写ターミネーター(Khosla,C.ら、Molec.Microbiol.(1992)6:3237)を有する0.3kbのHindIII/HpaI(平滑)フラグメント、およびNcoI部位(actII−ORF4アクチベーター遺伝子の1kb上流)(Hallam,S.E.ら、Gene(1988)74:305;Fernandez−Moreno,M.A.ら、Cell(1991)66:769;Caballero,J.L.Mol.Gen.Genet.(1991)230:401)からactI−VII−IV遺伝子(Fernandez−Moreno,M.A.らJ.Biol.Chem.(1992)267:19278)の下流のPstI部位まで伸びるactクラスター由来の10kbフラグメント。
【0198】
actIプロモーター(これはactII−ORF4遺伝子産物により活性化される)の制御下にある任意の所望の組換え体PKSの発現を促進するために、PacI、NsiI、XbaI、およびPstIに対する制限部位を、シストロン間の位置で、actDNA中に設けた。pRM5、および本明細書に記載のすべてのその他のPKS発現プラスミドでは、ORF1、2、および3対立遺伝子が、それら自身のRBSを用いて加工されたカセットとしてこれら部位の間にクローン化された。
【0199】
特に、放線菌においては、大部分の天然に存在する芳香族ポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターでは、ORF1とORF2とは、翻訳共役される。組換えPKSの構築を容易にするために、本明細書で用いられるORF1およびORF2対立遺伝子は、独立の(共役していない)カセットとしてクローン化された。actORF1については、以下の配列がpRM5中に設けられた:CCACCGGACGAACGCATCGATTAATTAAGGAGGACCATCATG、ここで下線の配列は、actI領域から上流のDNAに対応し、TTAATTAAは、PacI認識部位であり、そしてATGは、actIORF1の開始コドンである。以下の配列が、actORF1とORF2との間に設けられた:NTGAATGCATGGAGGAGCCATCATG、ここでTGAおよびATGは、それぞれ、ORF1およびORF2の停止および開始コドンである。ATGCATは、NsiI認識部位であり、そしてN(actDNAではA、その他のPKS由来の対立遺伝子ではAまたはG)のCによる置換は、翻訳脱共役(translational decoupling)を生じる。以下の配列を、actORF2の下流に設けた:TAATCTAGA、ここでTAAは停止コドン、そしてTCTAGAはXbaI認識部位である。これにより、actORF3の上流に設けられたXbaI部位(Khosla,C.ら、Molec.Microbiol.(1992)6:3237)へのactORF1およびORF2(上記のように設けられた)の融合を可能にした。コントロールとして、pRM5と同一であるが、設けられた任意の配列を欠いているpRM2が構築された。pRM2におけるORF1とORF2とは翻訳共役する。CH999/pRM2およびCH999/pRM5の生成物プロフィールの比較は、本明細書に記載された脱共役戦略が生成物分布または生成物レベルに対し検出可能な影響がなかったことを示した。
【0200】
(実施例3:pRM5で形質転換されたCH999を用いて産生されたポリケチド)プラスミドpRM5を、標準の技術を用いてS.coelicolorCH999中に導入した。(例えば、Sambrookら、MolecularCloning:ALaboratoryManual(最新版)を参照)。pRM5で形質転換されたCH999は、大量の黄褐色物質を産生した。2種の最も豊富な産物を、NMRおよび質量スペクトル分析により、アロエサポナリンII(2)(Bartel,P.L.らJ.Bacteriol.(1990)172:4816)およびそのカルボキシル化アナログ、3,8−ジヒドロキシ−1−メチルアントラキノン−2−カルボン酸(1)(Cameron,D.W.らLiebigsAnn.Chem.(1989)7:699)(図4)と特徴付けた。2は非酵素的な脱カルボキシル化(Bartel,P.L.らJ.Bacteriol.(1990)172:4816)により1から得られると推定される。化合物1および2は、約1:5のモル比で存在した。約100mgの混合物が、1リットルの培養から容易に精製され得た。従って、CH999/pRM5宿主ベクター系は、予期されたように機能し、顕著な量の安定な、最小限に改変されただけのポリケチド代謝物を産生した。1および2の生産は、アクチノロジン生合成の提案された経路(Bartel,P.L.らJ.Bacteriol.(1990)172:4816)と一致している。両代謝物は、アクチノロジン骨格のように、C−9における単一のケト還元を有する16炭素のポリケチドに由来する。
【0201】
CH999を、pSEK4(actKR遺伝子内の140bp SphI/SalIフラグメントを、pUC19由来のSphI/SalIフラグメントにより置換したことを除いてpRM5と同一)で形質転換したとき、得られる株は、大量の芳香族ポリケチドSEK4(12)を産生した。この産物の正確な構造は、デスオキシエリスロラクシン(Bartel,P.L.らJ.Bacteriol.(1990)172:4816)とはわずかに異なる。しかし、1,2−13C2−標識アセテートを用いるインビボのアイソトープ標識研究により、ポリケチド骨格が8アセテートに由来することが確認された。さらに、この産物の1Hスペクトルおよび13CNMRスペクトルの芳香族領域は、1に類似の3環(tricyclic)構造と一致するが、任意のケト還元を欠いている(表4参照)。
【0202】
(実施例4:ハイブリッドポリケチドシンターゼの構築と分析)
(A.act、gra、およびtcmPKS由来の成分を含むハイブリッドPKSの構築)図1は、相同な推定のKS/ATおよびACPサブユニット、ならびにORF2産物を含む、アクチノロジン(3)、グラナチシン(4)、およびテトラセノマイシン(5)(図5に示された構造)の炭素鎖骨格を合成するためのPKSを示す。actPKSおよびgraPKSはまたKRを有するが、tcmPKSでは欠いている。各クラスター由来の対応するタンパク質は、高い程度の配列同一性を示す。3つのクラスターにおける対応するPKSタンパク質間の同一性百分率は、以下のようである:KS/AT:act/gra76、act/tcm64、gra/tcm70;CLF:act/gra60、act/tcm58、gra/tcm54;ACP:act/gra60、act/tcm43、gra/tcm44。actPKSおよびgraPKSは、C−9でケト還元された8アセテート残基(図6)由来の同一の16個の炭素の骨格を合成する。対照的に、図6中でまた示されるように、tcmポリケチド骨格は、全体の炭素鎖長が異なり(16炭素の代わりに20炭素)、ケト還元されておらず、そして第1の環化の位置特異性は、actおよびgraでは炭素7と12と間である代わりに炭素9と14との間で起こる。
【0203】
特性の範囲が異なる新規ポリケチドを生成し、そして芳香族PKSをプログラミングする局面を解明する試みにおいて、表1で示されたように、系統的な、最小のPKS遺伝子クラスターのシリーズを、act、gra、およびtcm遺伝子クラスター由来の、ORF1(KS/ATサブユニットをコードする)、ORF2(CLFサブユニットをコードする)、およびORF3(ACPサブユニットをコードする)遺伝子産物の種々の並べ換えを用いて、存在するact遺伝子の代わりにpRM5中にクローン化した。得られるプラスミドを、上記のように、CH999を形質転換するために用いた。
【0204】
KS/AT、ORF2産物、およびPKSのACPサブユニットの間の種々の並べ換えを含む組換えPKS(すべての構築物はまた、actKR、シクラーゼ、およびデヒドラターゼ遺伝子を含む)の産物の分析は、シンターゼが3つのカテゴリー:ポリケチドを産生しないグループ;化合物1を産生するグループ(少量の2に加えて);および新規ポリケチド9(RM20と称される)(図6)を産生するグループに、分けられ得る(表1)ことを示した。9の構造は、この分子のポリケチド骨格前駆体がC−9位置に1ヶ所ケト還元を有する10個のアセテート残基に由来することを示唆する。
【0205】
異種のポリケチド鎖の還元および環化パターンに対するactKRの影響を調査するために、pSEK15もまた構築した。これは、tcmORF1〜3を含むが、actKRは欠いていた。(この構築物のactKR遺伝子における欠失は、pSEK4における欠失と同一であった。)CH999/pSEK15の分析は、20炭素鎖の産物SEK15(13)は、テトラセノマイシンCまたはその短絡(shunt)産物と同一ではないが、類似していた。NMRスペクトル分析もまた、完全に非還元のデカケチド骨格と一致した(表4参照)。
【0206】
すべてのact/graハイブリッドは、推定されるアクチノロジンおよびグラナチシンポリケチドの同一の構造と一致して、化合物1を産生した。各場合において、tcm/actハイブリッドから産物が単離され得る場合、ポリケチドの鎖長は、ORF2の供給源に対応する天然産物の鎖長と同一であった。このことは、ACPまたはKS/ATではなくORF2産物が、炭素鎖長を制御することを示唆する。さらに、本明細書に記載されるハイブリッド(KRを欠いているもの(CH999/pSEK4およびCH999/pSEK15)を除く)により産生されるすべてのポリケチドが、1ヶ所、ケト還元されたので、(i)KRは、ケト還元が起こるために必要でありかつ十分である;(ii)この還元は、常に、最終ポリケチド骨格中のC−9位置(鎖のカルボキシ末端から数えて)で起こる;および(iii)非還元のポリケチドは、ケト還元された未完成ポリケチド鎖においていく通りかの環化パターンで環化され得るが、第1環化の位置化学(regiochemistry)は、非還元産物においてこの環化がいかにして起こるかにかかわらず、得られるヒドロキシルの位置により指定されることが結論され得る。換言すれば、tcmPKSは、ケトレダクターゼを含むことにより、新規な環化特異性を示すように加工され得る。
【0207】
RM20(9)の顕著な特徴は、第1環化後の環化のパターンである。actVII変異体由来のムタクチン(6)の単離は、actVII産物およびそのtcm同族体が、アクチノロジン(3)およびテトラセノマイシン(5)それぞれの生合成において第2の環の環化を触媒することを示唆した(Sherman,D.H.らTetrahedron(1991)47:6029;Summers,R.G.らJ.Bacteriol.(1992)174:1810)。RM20(9)の環化パターンは、pRM20(9)上のactVII遺伝子の存在にかかわらず、1およびテトラセノマイシンF1の環化パターンと異なる。従って、actシクラーゼは、より長いポリケチド鎖を環化し得ないようである。
【0208】
予期せぬことに、最小のtcmPKSを単独で含む株(CH999/pSEK33)は、図8で示されるような、2つのポリケチドSEK15(13)およびSEK15b(16)を、ほぼ等しい量で産生した。しかし、化合物(13)および(16)はまたCH999/pSEK15からも単離され、化合物(16)の量より多い量の化合物(13)が、この構築物から単離された。
【0209】
SEK15bは新規化合物であり、その構造は、NMRスペクトル分析、[1,2−13C2]酢酸ナトリウム供給実験および質量スペクトル分析の組み合わせにより解明された。1Hおよび13CNMRの結果は、SEK15bは、非還元のアントラキノン部分およびピロン部分から構成されていることを示した。[1,2−13C2]酢酸ナトリウム供給実験は、SEK15bの炭素鎖が10アセテート単位に由来することを証明した。SEK15bに富んだ試料の13CNMRスペクトルから計算されたカップリング定数は、ピーク帰属を容易にした。高速原子衝撃(FAB)質量スペクトル分析は、C20H12O8と一致した381(M+H+)の分子量を与えた。重水素交換を用いてSEK15b中の各ヒドロキシルの存在を確認した。
【0210】
活性シクラーゼの非存在下で環化するための未完成ポリケチド鎖に対してインビボで利用可能な自由度を同定するために、組換え体S.coelicolorCH999/pRM37により産生されたポリケチド(McDanielら(1993)、上述)を分析した。pRM37によりコードされた生合成酵素は、tcmケトシンターゼ/アシルトランスフェラーゼ(KS/AT)、tcm鎖長決定因子(CLF)、tcmアシルキャリアプロテイン(ACP)、およびactケトレダクターゼ(KR)である。
【0211】
2つの新規化合物RM20b(14)およびRM20c(15)(図8)が、先にRM20(9)を生じたCH999/pRM37の培養培地中で発見された。回収された3つの化合物の相対量は、3:7:1(RM20:RM20b:RM20c)であった。(14)および(15)の構造は、質量スペクトル分析、NMRスペクトル分析、およびアイソトープ標識実験の組み合わせにより解明された。1Hおよび13CNMRスペクトルは、RM20bおよびRM20cがそれぞれピロン部分を含むジアステレオマーであることを示唆した。旋光度[α]D 20は、RM20bについては+210.8゜(EtOH、0.55%)、そしてRM20cについては+78.0゜(EtOH、0.33%)であることが見出された。[1,2−13C2]酢酸ナトリウム供給実験によって、RM20b(そして推論によってRM20c)の炭素鎖が、10個のアセテート単位に由来することが確認された。重水素交換研究を、RM20bおよびRM20cの両方の上の可能なヒドロキシル基に対応する1HNMRピークを同定するために実施した。プロトンカップリング定数は、1HNMRおよび1次元デカップリング実験の結果から計算された。特に、スペクトルの高磁場領域におけるカップリングパターンは、中央のカルビノールのメチンプロトンを取り囲む2つのメチレン基の5−プロトンスピン系を示した。高分解能高速原子衝撃(FAB)質量スペクトル分析は、RM20bについて(519.0056)(M=Cs+)、そしてRM20cについて387.1070(M+H+)の分子量を与え、それは、C20H18O8(M+Cs+、519.0056;M+H+、387.1080)と一致する。これらのデータに基づき、構造(14)および(15)(図8)を、それぞれ、RM20bおよびRM20cに割り当てた。
【0212】
1Hおよび13CNMRからのデータは、H−9とC−8上のジェミカルプロトンとの間のカップリング定数は、RM20bまたはRM20cについて、それぞれ12.1または12.2、および2.5または2.2Hzであることを示した。H−9とC−10上のジェミカルプロトンとの間のカップリング定数は、Rm20bまたはRM20cについて、それぞれ9.6または9.7、および5.7または5.8Hzであった。これらの値は、Ja,a(J9a,8aまたはJ9a,10a)およびJa,e(J9a,8eまたはJ9a,10e)カップリングパターンに典型的であり、そしてRM20bまたはRm20cの両方においてH−9がアキシアル位置であることを示す。対照的に、2つの分子上のC−7ヒドロキシルの化学シフトは、RM20bおよびRM20cについて、それぞれ16.18および6.14ppmであった。これらの値は、RM20bにおいて、C−7ヒドロキシルと適切に位置するアクセプター原子との間に水素結合が存在し、RM20cには存在しないことを示す。そのような水素結合のための最も可能性の高い候補アクセプター原子は、共役ピロン環系におけるC−13カルボニル酸素、または孤立したピロン環中の架橋酸素である。後者の場合、(14)と(15)との間を区別することが不可能であるので、前者でありそうである。さらに、RM20bおよびRM20cの13CNMRスペクトルの比較によって、(14)および(15)間の最も大きな差異は、共役ピロン環を構成する炭素の化学シフトにあることが明らかとなった(C−11、C−12、C−13、C−14、およびC−15のそれぞれについて、+5.9、−6.1、+8.9、−7.8、および+2.0ppm)。高磁場および低磁場シフトが交互するこのようなパターンは、C−7ヒドロキシルが、C−13カルボニルに水素結合するという事実により説明され得る。何故なら、水素結合は、C−11、C−13、およびC−15の周囲の電子密度を減少させるが、C−12およびC−14の周囲の電子密度を増加させると予想され得るからである。C−7/C−13水素結合の帰属を確認するために、RM20bおよびRM20cの交換可能なプロトンを、重水素で置換し(D2Oの存在下でインキュベートすることにより)、そして試料を13CNMRにより分析した。RM20b中のC−13ピークが、高磁場シフト(1.7ppm)し、RM20cではしなかったことは、水素が重水素で置換された場合のRM20bにおけるより弱いC−7/C−13非共有結合により説明され得る。C−13カルボニルと水素結合を形成するために、RM20bのC−7ヒドロキシルはエカトリアル位置を占めなければならない。従って、C−7およびC−9ヒドロキシルは、主要な異性体(RM20b)中で共役環系の同一面(syn)上にあり、その一方、それらは少ない方の異性体(RM20c)中では、反対側(anti)にあると推断され得る。
【0213】
CH999/pRM15、/pRM35、および/pRM36中でポリケチドは検出され得なかった。従って、いくつかのORF1−ORF2組み合わせのみが機能的である。各サブユニットは、少なくとも1つの組換えシンターゼにおいて機能的であったので、タンパク質発現/折り畳み問題は起こりそうもない。代わりに、これらの酵素複合物の異なるサブユニットの間の不完全または抑制の会合、あるいは迅速に分解される(失敗した)短鎖産生物の生合成は、ふさわしい説明である。
【0214】
(B.actおよびfren PKS由来の成分を含むハイブリッドPKSの構築)Streptomyces roseofulvusは、フレノリシンB(7)(Iwai,Yら、J.Antibiot.(1978)31:959)およびナナオマイシンA(8)(Tsuzuki,K.ら、J.Antibiot.(1986)39:1343)の両方を産生する。10kb DNAフラグメント(以下、fren座と呼ぶ)を、S.roseofulvusのゲノムライブラリー(Bibb,M.J.ら、前出)から、S.coelicolor A3(2)のact PKSのKS/ATおよびKR成分をコードするDNAをプローブとして用いてクローン化した(Malpartida,F.ら、Nature(1987))325:818)。(図7の構造図を参照せよ)。fren座のDNA配列決定は、act KS/AT、CLF、ACP、KR、およびシクラーゼをコードするものと高度の同一性を有する遺伝子の存在を(とりわけ)示した。
【0215】
新規ポリケチドを産生するために、pRM5に存在するORF1、2、および3act遺伝子を、表2に示されるように、対応するfren遺伝子で置換した。上記のように構築したS.coelilcolor CH999を、これらのプラスミドで形質転換した。(act KRおよびactシクラーゼをコードする遺伝子もまた、これらの遺伝的構築物のそれぞれに存在した。)上記のようにactおよびtcm PKSを用いる同様の実験からの結果に基づいて、actKRは全ての機能性組換えPKSの産生物を還元させ得るのに対して、第2の環化を触媒するactシクラーゼの能力は、fren PKSの産生物の鎖長に依存することが予想された。
【0216】
表2にまとめた結果は、殆どの形質転換体が、芳香族ポリケチドを産生するそれらの能力によりアッセイされたように、機能性PKSを発現したことを示す。主産生物の構造的分析は、産生株が2つのカテゴリ:化合物1(より少量のその脱カルボキシル化副生成物(2)と共に)を合成した株、および化合物1、10、および11の混合物(約1:2:2の比)を合成した株に分類され得ることを示した。(少量の2もまた、1を産生する全ての株に見出された)。化合物1および2は、天然産生物として以前から分かっており、実施例3に記載されるように、全体的にactサブユニットからなるPKSによって産生された代謝物であった。化合物10および11(それぞれ、RM18およびRM18bと称される)は、新規な構造であり、これらの化学合成または天然産生物としての単離は以前に報告されていなかった。
【0217】
10および11の構造を、質量スペクトル分析、NMRスペクトル分析、およびアイソトープ標識実験の組み合わせにより明らかにした。1Hおよび13Cスペクトル帰属を、10についての[1,2−13C2]酢酸ナトリウム供給実験(以下に記載される)により得られる13C−13Cカップリング定数と共に表3に示す。化合物10の明らかな帰属を、1D核オーヴァーハウザー効果(NOE)およびロングレンジヘテロ核相互作用(HETCOR)研究を用いて樹立した。重水素交換により、化合物10のC−15および化合物11のC−13でのヒドロキシルの存在が確認された。2の電界脱離(field desorption)質量分析(FD−MS)により、C17H14O4(282.2952)と一致する282の分子量を示した。
【0218】
先の研究は、2(および、推論による1)のポリケチド骨格(Bartel,P.L.ら、J.Bacteriol.(1990)172:4816)が8個のアセテート残基の繰り返し縮合とC−9での1回のケト還元から誘導されることを示した。また、ナナオマイシン(8)が同一の炭素鎖骨格に由来することも主張され得る。従って、ナナオマイシンがS.roseofulvus中のfren PKS遺伝子の産生物であることは非常に可能性が高い。1の形成を導く第1の環化の位置特異性は、ケト還元の位置により導かれ、これに対して、第2の環化の位置特異性は、actシクラーゼにより制御される(Zhang,H.L.ら、J.Org.Chem.(1990)55:1682)。
【0219】
RM18(10)炭素鎖骨格を追跡するために、[1,2−13C2]アセテートを用いるインビボ供給実験を、CH999/pRM18において行い、続いて、標識RM18(10)のNMR分析を行った。13Cカップリングデータ(表3にまとめた)は、RM18(10)のポリケチド骨格が9個のアセテート残基から誘導され、続いて、恐らく非酵素的に起こる、末端の脱カルボキシル化(C−213C共鳴が強められたシングレットとして現れる)により誘導されることを示す。さらに、C−9位のヒドロキシル基の非存在は、ケト還元がこの炭素で起こることを示唆する。これらの2つの特徴が推定のフレノリシン(7)骨格に存在すると予想されるので、これらの結果は、ナナオマイシンを合成することに加え、fren PKS遺伝子がS.roseofulvusでフレノリシンの生合成に寄与することを示唆する。これは、鎖長特異性がゆるやかなPKSの初めてのはっきりした例であるようである。しかし、フレノリシンの推定の骨格とは異なり、RM18(10)のC−17カルボニルは還元されない。これは、pRM18由来の特異的ケトレダクターゼ、デヒドラターゼ、およびエノイルレダクターゼ(S.roseofulvus中のfren遺伝子クラスターに存在する)の非存在を反映し得るか、またはフレノリシン中の炭素15〜18の異なる起源を反映し得る。
【0220】
RM18(10)の形成を導く第1の環化の位置特異性は、ケト還元の位置により導かれる;しかし、第2の環化は、7または1とは異なって起こり、そしてRM20(9)(先に記載される、tcm PKSにより産生されるデカケチド)に見られる環化パターンと類似する。従って、RM20(9)の場合のように、actシクラーゼはRM18前駆体の第2の環化を触媒し得ないこと、およびこの続いて起こる環化(恐らく非酵素的に起こる)は、水性環境への未完成のポリケチド鎖の異なる部分の放出の時間的差により制御されることが主張される。1を産生するCH999/pRM18(およびCH999/pRM34)の能力を考慮すると、シクラーゼがfren PKS(KS/AT、CLF、およびACP)と共同で働き(associate with)得ないという可能性は排除され得る。より適切な解釈は、actシクラーゼが鎖長の異なる基質を認識し得ないことである。これはまた、推定のRM20(9)の生合成スキームと一致する。
【0221】
表2に報告されたハイブリッドシンターゼの産生物のプロフィールとactおよびtcm PKS成分の間の類似のハイブリッドとの比較(表1)は、ORF2産生物が鎖長決定因子(CLF)であるという仮説を支持する。酵素結合ケチドの環化による化合物9、10および11の調製を、図8に概略的に例示する。
【0222】
(実施例5:モジュールポリケチドシンターゼの構築および分析)組換えモジュールDEBS PKS遺伝子を含む発現プラスミドは、図10に示すように、温度感受性「ドナー」プラスミド(すなわち、第1の許容温度で複製し得、そして第2の非許容温度で複製し得ないプラスミド)由来の増加するDNAを、二重組換えを行うことによって「受容体」シャトルベクターに移入することにより構築された。完全なeryA遺伝子を含むシャトルプラスミドであるpCK7(図11)(これは、pS1から初めにクローン化された(Tuanら(1990)Gene90:21))を、以下のように構築した。pS1由来の25.6kb SphIフラグメントを、pMAK705(Hamiltonら、(1989)J.Bacteriol.171:4617)のSphI部位に挿入して、eryAII、eryAIII、およびeryAIの3’末端を含むドナープラスミドであるpCK6(CmR)を得た。この温度感受性pSC101誘導体の複製が30℃で起こるが、44℃で終止する。受容体プラスミドであるpCK5(ApR、TcR)は、eryAI開始コドン(Caffreyら、(1992)FEBS Lett.304:225)からeryAIIの始端に近接するXcmI部位までの12.2kb eryAフラグメント、テトラサイクリン耐性遺伝子(Tc)をコードする1.4kb EcoRI−BsmI pBR322フラグメント、およびeryAIIIの終端由来の4.0kb NotI−EcoRIフラグメントを含む。PacI、Ndel、およびリボソーム結合部位を、pCK5中のeryAI開始コドンで設計した。pCK5は、pRM5の誘導体である(McDanielら、(1993)、前出)。5’および3’相同領域(図10、縞模様区域および白抜き区域)は、それぞれ4.1kbおよび4.0kbである。MC1061 E.coliを、pCK5およびpCK6で形質転換し(Sambrookら、前出を参照せよ)、そして30℃でカルベニシリンおよびクロラムフェニコール選択に供した。次いで、両方のプラスミド(ApR、CmR)を有するコロニーを、カルベニシリンおよびクロラムフェニコールプレートにて44℃で再度画線した。この2つのプラスミドの間の単一の組換え事象により形成された同時組込みだけが見られた。生存コロニーを、カルベニシリンの選択下で30℃で繁殖させ、第2の組換え事象を通して同時組込みの分解(resolution)を強制した。pCK7組換え体を増やすために、コロニーを、カルベニシリンプレートにおいて44℃で再度画線した。得られたコロニーの約20%は、所望の表現型(ApR、TcS、CmS)を示した。最後のpCK7候補物を、制限マッピングにより徹底的に検査した。対照プラスミドである、eryAIでフレームシフト誤差を含むpCK7fを、同様の方法で構築した。pCK7およびpCK7fを、E.coli ET12567(MacNeil(1988)J.Bacteriol.170:5607)に形質転換させて、メチル化されていないプラスミドDNAを生成し、続いて、標準プロトコールを用いてStreptomyces coelicolor CH999に移入した(Hopwoodら、(1985)Genetic manipulation of Streptomyces.A laboratory manual.The John Innes Foundation:Norwich)。
【0223】
R2YE培地でのCH999/pCK7の成長に伴い、微生物は、2つのポリケチド(図X)を大量に産生した。この成長培地にプロピオネート(300mg/L)を添加することにより、ポリケチド産生物の収率が約2倍増加した。プロピオン酸−1−13C供給実験と共に、プロトンおよび13CNMRスペクトル分析により、6dEB(17)としての主産生物が確認された(>40mg/L)。少量の産生物を、8,8a−デオキシオレアンドリド(18)として同定し(>10mg/L)、これは、6dEB生合成経路中のプロピオネートに代わるアセテート開始ユニットに由来するようである。13C2酢酸ナトリウム供給実験により、(18)へのアセテートの組込みが確認された。DEBS1、DEBS2、およびDEBS3であると推定される3つの高分子量タンパク質(>200kDa)(Caffreyら、(1992)FEBS Lett.304:225)もまた、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、CH999/pCK7の粗抽出物中に確認された。CH999/pCK7fからは、ポリケチド産生物が確認されなかった。
【0224】
それゆえ、新規ポリケチド、およびポリケチドを組換えに産生する方法が開示されている。本発明の好ましい実施態様がやや詳細に記載されているが、明らかな改変は、添付の請求の範囲により定義される本発明の精神および範囲から逸脱するこく行われることが理解される。
【0225】
【表1】
【0226】
【表2】
【0227】
【表3】
【0228】
【表4】
【0229】
【発明の効果】
本発明は、新規ポリケチド、ならびに組換え技術を用いて新しいポリケチドおよび公知のポリケチドの両方を効果的に生産する。特に、種々のポリケチドの産生を順番に触媒するポリケチドシンターゼを産生するために使用される新規な宿主−ベクター系を得る。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、act、gra、およびtcm PKSおよびシクラーゼの遺伝子クラスターを示す。
【図2】図2は、S.coelicolor CH999を作製するためのストラテジーを示す。図2Aは、S.coelicolor CH1染色体に存在するact遺伝子クラスターの構造を示す。図2Bは、pLRemEtsの構造を示し、そして図2Cは、act遺伝子クラスターが欠失したCH999染色体の部分を示す。
【図3】図3は、プラスミドpRM5の図である。
【図4】図4は、実施例3に記載されているアロエサポナリンII(2)およびそのカルボキシル化アナログである3,8−ジヒドロキシ−1−メチルアントラキノン−2−カルボン酸(1)の形成を概略的に例示する。
【図5】図5は、実施例4で言及されているアクチノロジン(3)、グラナチシン(4)、テトラセノマイシン(5)およびムタクチン(mutactin)(6)の構造を示す。
【図6】図6は、ポリケチド前駆体の環化による、実施例4のA部分に記載されているアロエサポナリンII(2)、そのカルボキシル化アナログである3,8−ジヒドロキシ−1−メチルアントラキノン−2−カルボン酸(1)、テトラセノマイシン(5)および新規化合物RM20(9)の調製を概略的に示す。
【図7】図7は、ポリケチド前駆体の環化による、フレノリシン(7)、ナノマイシン(nanomycin)(8)およびアクチノロジン(3)の調製を概略的に示す。
【図8A】図8Aは、ポリケチド前駆体の環化による、新規化合物RM20(9)、RM18(10)、RM18b(11)、SEK4(12)、SEK15(13)、RM20b(14)、RM20c(15)およびSEK15b(16)の調製を概略的に示す。
【図8B】図8Bは、ポリケチド前駆体の環化による、新規化合物RM20(9)、RM18(10)、RM18b(11)、SEK4(12)、SEK15(13)、RM20b(14)、RM20c(15)およびSEK15b(16)の調製を概略的に示す。
【図8C】図8Cは、ポリケチド前駆体の環化による、新規化合物RM20(9)、RM18(10)、RM18b(11)、SEK4(12)、SEK15(13)、RM20b(14)、RM20c(15)およびSEK15b(16)の調製を概略的に示す。
【図9】図9は、6−デオキシエリスロノリドBシンターゼ(DEBS)の遺伝子モデルを示す。
【図10】図10は、組換えモジュールPKSの構築のためのストラテジーを示す。
【図11】図11は、プラスミドpCK7の図である。
【発明の属する技術分野】
(関連出願の相互参照)本出願は、1993年12月8日に提出された米国特許出願第08/164,301号の一部継続出願であり、米国特許出願第08/164,301号は、1993年9月20日に提出された米国特許出願第08/123,732号の一部継続出願(この出願から、米国特許法第120条に基づいて優先権が主張される)であり、これらの開示の全体は本明細書中で参考として援用されている。
【0002】
【従来の技術】
(技術分野)本発明は、一般に、ポリケチドおよびポリケチドシンターゼに関する。さらに特定すると、本発明は、新規な宿主−ベクター系を用いる、ポリケチドの組換え生産に関する。
【0003】
(発明の背景)ポリケチドは、天然生成物の大きな、構造的に多様なファミリーである。ポリケチドは、抗生物質的特性および薬理学的特性を含む広範な生物学的活性を有する。例えば、ポリケチドは、テトラサイクリンおよびエリスロマイシンのような抗生物質、ダウノマイシン(daunomycin)を含む抗ガン剤、免疫抑制剤(例えば、FK506およびラパマイシン(rapamycin))、ならびに獣医学用の生成物(例えば、モネンシン(monensin)およびアベルメクチン(avermectin))により代表される。ポリケチドは、微生物の殆どの種類に存在し、そして菌糸型細菌の1クラスである放線菌に特に豊富である。この放線菌は、種々のポリケチドを産生する。
【0004】
ポリケチドシンターゼ(PKS)は、脂肪酸シンターゼ(FAS)に関連する多機能の酵素である。PKSは、アシルチオエステル(通常、アセチル、プロピオニル、マロニルまたはメチルマロニル)の間のクライゼン縮合の繰り返し(脱カルボキシ化)を介して、ポリケチドの生合成を触媒する。各縮合に続いて、これらは、成長するポリケチド鎖のβ−ケト基におけるケト還元、脱水、およびエノイル還元を含む還元回路の全て、または一部を触媒するか、あるいは全く触媒しないことにより、産生物に構造的変化を導入する。炭素鎖は各特定の産生物の特徴的な長さまで成長した後、これは、チオリシスまたはアシル転移により、シンターゼから放出される。それゆえ、PKSは、所定のポリケチドを産生するために共に働く酵素のファミリーから構成される。天然に生じるポリケチドに見られる変化に寄与するのは、各PKSに遺伝的にプログラム化された、鎖長、鎖構成単位の選択、および還元回路の制御された変化である。
【0005】
2つのPKSの一般的クラスが存在する。1クラスは、タイプI PKSとして知られ、エリスロマイシンのようなマクロライドのためのPKSにより代表される。これらの「複合体」または「モジュール(modular)」PKSは、いくかの多機能の大型タンパク質のアセンブリを含み、これらの大型タンパク質の間には、炭素鎖のアセンブリおよび修飾の各工程のための別々の活性部位のセットを有する(Cortes,J.ら、Nature(1990)348:176;Donadio,S.ら、Science(1991)252:675;MacNeil,D.J.ら、Gene(1992)115:119)。構造的多様性は、これらのPKS中の活性部位の数およびタイプの変化からこのクラスに生じる。このクラスのPKSは、PKSの1次配列中の活性部位の数およびクラスタリングとポリケチド骨格との間において、一対一の相互関係を示す。
【0006】
第2のクラスのPKSは、タイプII PKSと呼ばれ、芳香族化合物のためのシンターゼにより代表される。タイプII PKSは、単一のセットの反復して使用される活性部位を有する(Bibb,M.J.ら、EMBO J.(1989)8:2727;Sherman,D.H.ら、EMBOJ.(1989)8:2717;Fernandez−Moreno,M.A.ら、J.Biol.Chem.(1992)267:19278)。
【0007】
Streptomycesは、芳香族ポリケチドの大量生産者である放線菌である。現在までに研究された各Streptomyces芳香族PKSでは、炭素鎖アセンブリは、3つのオープンリーディングフレーム(ORF)の産生物を必要とする。ORF1は、ケトシンターゼ(KS)およびアシルトランスフェラーゼ(AT)の活性部位をコードする;ORF2は、ORF1の産生物と類似したタンパク質をコードするが、KSおよびATモチーフを欠く;そしてORF3は、別のアシルキャリアタンパク質(ACP)をコードする。
【0008】
Streptomyces coelicolorは、ブルーに着色したポリケチドであるアクチノロジン(actinorhodin)を産生する。アクチノロジン遺伝子クラスター(act)は、クローン化され(Malpartida,F.およびHopwood,D.A. Nature(1984)309:462;Malpartida,F.およびHopwood,D.A.Mol.Gen.Genet.(1986)205:66)、そして完全に配列決定された(Fernandez−Moreno,M.A.ら、J.Biol.Chem.(1992)267:19278;Hallam,S.E.ら、Gene(1988)74:305;Fernandez−Moreno,M.A.ら、Cell(1991)66:769;Caballero,J.ら、Mol.Gen.Genet.(1991)230:401)。このクラスターは、上記のPKS酵素、シクラーゼ(cyclase)およびアクチノロジンを導く連続する修飾反応に関わる一連の調整酵素、ならびにこの抗生物質の搬出に関わるタンパク質およびこの遺伝子クラスターの転写を特異的に活性化させる少なくとも1つのタンパク質をコードする。抗生物質の生合成の全体的な制御、ならびにポリケチド生合成の出発物質(アセチルCoA)および延長物質(マロニルCoA)単位の供給のために必要とされる他の遺伝子は、ゲノム中の他の部位に位置する。
【0009】
S.coelicolor由来のact遺伝子クラスターは、S.parvulusでアクチノロジンを産生するために使用されている。Malpartida,F.およびHopwood,D.A. Nature(1984)309:462)。Bartelら(J.Bacteriol.(1990)172:4816−4826)は、4つの遺伝子座actI、actIII、actIVおよびactVIIからなるS.coelicolor act遺伝子クラスターで形質転換されたS.galilaeusを用いて、アロエサポナリン(aloesaponarin)を組換えにより産生した。基本act遺伝子を含むが、グラナチシン(granaticin)、オキシテトラサイクリン、テトラセノマイシン(tetracenomycin)およびフレノリシン(frenolicin)のPKS由来のACP遺伝子を有するハイブリッドPKSもまた、設計され、これらは、機能性のシンターゼを発現し得る。Khosla,Cら、J.Bacteriol.(1993)175:2197−2204。Hopwood,D.A.ら(Nature (1985)314:642−644)は、組換え技術を用いるハイブリッドポリケチドの産生を記載している。Sherman,D.H.ら(J.Bacteriol.(1992)174:6184−6190)は、トランスで、S.violaceoruber由来の対応するグラナチシン(gra)遺伝子を用いる、act PKS遺伝子クラスターの異なる成分を欠いている種々のS.coelicolor変異体の形質転換を報告している。
【0010】
しかし、現在までは、実質的にネイティブな天然PKS遺伝子クラスター全てを欠く、遺伝子操作した宿主細胞を用いるポリケチドの組換え産生は記載されていない。
【0011】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規ポリケチド、ならびに組換え技術を用いて新しいポリケチドおよび公知のポリケチドの両方を効果的に生産することを課題とする。
【0012】
【課題を解決するための手段】
1つの局面において、本発明は、ポリケチドシンターゼ(PKS)遺伝子クラスターをそのネイティブな、非形質転換の状態で発現する遺伝子操作した細胞であって、この遺伝子操作した細胞は、実質的に全ネイティブなPKS遺伝子クラスターを欠く細胞に関する。
【0013】
好ましい実施形態において、本発明は、原核細胞である、上記遺伝子操作した細胞である。
【0014】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、放線菌である、上記遺伝子操作した細胞である。
【0015】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、Streptomyces属の放線菌である、上記遺伝子操作した細胞である。
【0016】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、Streptomyces coelicolorである、上記遺伝子操作した細胞である。
【0017】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、全ネイティブなアクチノロジンPKS遺伝子クラスターを実質的に欠く、上記遺伝子操作した細胞である。
【0018】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、CH999株に等価である、上記遺伝子操作した細胞である。
【0019】
好ましい実施形態において、本発明は、上記のいずれかの遺伝子操作した細胞であって、以下:
(a)ポリケチドの合成を触媒し得るPKSをコードする置換PKS遺伝子クラスター;および(b)このPKS遺伝子クラスターに作動可能に連結される1つまたはそれ以上の制御配列であって、これにより、この遺伝子クラスター中のこの遺伝子がこの遺伝子操作した細胞中で転写かつ翻訳され得る、制御配列、を含み、但し、この置換PKS遺伝子クラスターが全PKS遺伝子セットを含むとき、少なくとも1つのPKS遺伝子または制御成分はこの細胞とは異種である細胞である。
【0020】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記置換PKS遺伝子クラスターが、PKSケトシンターゼおよびPKSアシルトランスフェラーゼの活性部位(KS/AT)をコードする第1の遺伝子、PKS鎖長決定因子(CLF)をコードする第2の遺伝子、ならびにPKSアシルキャリアタンパク質(ACP)をコードする第3の遺伝子を含む、上記遺伝子操作した細胞である。
【0021】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記置換PKS遺伝子クラスターが、さらにPKSケトレダクターゼ(KR)をコードする第4の遺伝子を含む、上記遺伝子操作した細胞である。
【0022】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記置換PKS遺伝子クラスターが、さらにPKSシクラーゼ(CYC)をコードする第5の遺伝子を含む、上記遺伝子操作した細胞である。
【0023】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記置換PKS遺伝子クラスターが、さらにPKSデヒドラターゼをコードする第6の遺伝子を含む、上記遺伝子操作した細胞である。
【0024】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記PKS KS/AT遺伝子が、アクチノロジンKS/AT遺伝子、グラナチシンKS/AT遺伝子、テトラセノマイシンKS/AT遺伝子、フレノリシンB KS/AT遺伝子、オキシテトラサイクリン KS/AT遺伝子、およびグリセウシン KS/AT遺伝子からなる群より選択されるPKS KS/AT遺伝子に由来する、上記遺伝子操作した細胞である。
【0025】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記PKS CLF遺伝子が、アクチノロジンCLF遺伝子、グラナチシンCLF遺伝子、テトラセノマイシンCLF遺伝子、フレノリシンB CLF遺伝子、オキシテトラサイクリンCLF遺伝子、およびグリセウシンCLF遺伝子からなる群より選択されるPKS CLF遺伝子に由来する、上記遺伝子操作した細胞である。
【0026】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記PKS ACP遺伝子が、アクチノロジンACP遺伝子、グラナチシンACP遺伝子、テトラセノマイシンACP遺伝子、フレノリシンB ACP遺伝子、オキシテトラサイクリンACP遺伝子、およびグリセウシンACP遺伝子からなる群より選択されるPKS ACP遺伝子に由来する、上記遺伝子操作した細胞である。
【0027】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記PKS KR遺伝子が、アクチノロジンKR遺伝子、グラナチシンKR遺伝子、テトラセノマイシンKR遺伝子、フレノリシンB KR遺伝子、オキシテトラサイクリンKR遺伝子、およびグリセウシンKR遺伝子からなる群より選択されるPKS KR遺伝子に由来する、上記遺伝子操作した細胞である。
【0028】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記第1、第2および第3の遺伝子のそれぞれが、別の発現カセットに含まれる、上記遺伝子操作した細胞である。
【0029】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記別の発現カセットが、単一のベクターに存在する、上記遺伝子操作した細胞である。
【0030】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記別の発現カセットが、2つまたはそれ以上のベクターに存在する、上記遺伝子操作した細胞である。
【0031】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記置換遺伝子クラスターが、PKSアシルトランスフェラーゼ(AT)をコードする第1の遺伝子、PKSケトアシルキャリアタンパク質シンターゼ(KS)をコードする第2の遺伝子、PKSアシルキャリアタンパク質(ACP)をコードする第3の遺伝子、PKSケトレダクターゼ(KR)をコードする第4の遺伝子、PKSデヒドラターゼ(DH)をコードする第5の遺伝子、PKSエノイルレダクターゼ(ER)をコードする第6の遺伝子、およびチオエステラーゼ(TE)をコードする第7の遺伝子を含む、上記遺伝子操作した細胞である。
【0032】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、上記遺伝子が、6−デオキシエリスロノリドBシンターゼ遺伝子クラスターに由来する、上記遺伝子操作した細胞である。
【0033】
1つの局面において、本発明は、組換えポリケチドを産生する方法であって、以下:
(a)上記いずれかの細胞の集団を提供する工程;および(b)この細胞に存在する置換PKS遺伝子クラスターが発現される条件下で、この細胞の集団を培養する工程、を包含する方法に関する。
【0034】
1つの局面において、本発明は、組換えポリケチドを産生する方法であって、以下:
a.置換PKS遺伝子クラスターの第1の部分をドナープラスミドに挿入し、そして置換PKS遺伝子クラスターの第2の部分を受容体プラスミドに挿入する工程であって、ここで、この第1および第2の部分は、完全な置換PKS遺伝子クラスターを集合的にコードし、さらにここで:
i.このドナープラスミドは、第1の選択マーカーをコードし、第1の許容温度で複製し得、そして第2の非許容温度で複製し得ない遺伝子を発現する;
ii.この受容体プラスミドは、第2の選択マーカーをコードする遺伝子を発現する;および
iii.このドナープラスミドは、相同組換えがこの置換PKS遺伝子クラスターのこの第1の部分とこの置換PKS遺伝子クラスターのこの第2の部分との間に起こり得るように、この受容体プラスミド中のDNA領域と相補的なDNAの領域を含み、これにより、完全な置換遺伝子クラスターが生成され得る、工程;
b.このドナープラスミドおよびこの受容体プラスミドを宿主細胞に形質転換させ、そしてこの第1の許容温度ならびにこの第1および/またはこの第2の選択マーカーを発現する宿主細胞を増殖させる条件下で、この形質転換された宿主細胞を培養して、細胞の第1の集団を生成する工程;
c.第2の非許容温度ならびにこの第1および/またはこの第2の選択マーカーを発現する細胞を増殖させる条件下で、細胞のこの第1の集団を培養して、細胞の第2の集団を生じる工程であって、この細胞は、完全なPKS置換遺伝子クラスターを含む組換えプラスミドを含む宿主細胞を包含する、工程;
d.細胞のこの第2の集団由来の組換えプラスミドを、上記遺伝子操作した細胞に移入して、形質転換された、遺伝子操作した細胞を生成する工程;および
e.この形質転換された、遺伝子操作した細胞を、この細胞中に存在するこの置換PKS遺伝子クラスターが発現される条件下で培養する工程、
を包含する方法に関する。
【0035】
好ましい実施形態において、本発明は、工程(c)の後、さらに上記第1の許容温度および上記第1の選択マーカーを発現する細胞を増殖させる条件下で、細胞の上記第2の集団を培養する工程を包含する、上記方法である。
【0036】
好ましい実施形態において、本発明は、上記置換PKS遺伝子クラスターの上記第1および第2の部分が、6−デオキシエリスロノリドBシンターゼ遺伝子クラスターに由来する、上記方法である。
【0037】
好ましい実施形態において、本発明は、上記の方法のいずれかにより産生されるポリケチドである。
【0038】
1つの局面において、本発明は、組換えベクターであって、以下:
(a)モジュール置換PKS遺伝子クラスターを含むDNA配列;および(b)このDNA配列に作動可能に連結される制御要素であって、これにより、このDNA配列は宿主細胞で転写かつ翻訳され得、そして少なくとも1つのこの制御要素はこのヌクレオチド配列とは異種である、制御要素、を含む、組換えベクターに関する。
【0039】
好ましい実施形態において、本発明は、上記置換遺伝子クラスターが、6−デオキシエリスロノリドBシンターゼ遺伝子クラスターである、上記組換えベクターである。
【0040】
1つの局面において、本発明は、プラスミドpCK7に関する。
【0041】
好ましい実施形態において、本発明は、上記のベクターのいずれかで形質転換された宿主細胞である。
【0042】
1つの局面において、本発明は、以下の構造式:
【0043】
【化1】
【0044】
を有するポリケチド化合物に関し、ここで、R1は、水素および低級アルキルからなる群より選択され、そしてR2は、水素、低級アルキル、および低級アルキルエステルからなる群より選択され、あるいはR1およびR2は、任意に1個〜4個のヒドロキシル基または低級アルキル基で置換される低級アルキレン架橋を一緒に形成する;R3およびR5は、独立して、水素、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルモノ−またはジ−置換のアミノ、およびニトロからなる群より選択される;R4は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルモノ−またはジ−置換のアミノ、およびニトロからなる群より選択される;R6は、ハロゲン、低級アルキル、および−CHR7−(CO)R8からなる群より選択され、ここで、R7およびR8は、独立して、水素および低級アルキルからなる群より選択される;そしてiは、1、2、または3である、ポリケチド化合物である。
【0045】
好ましい実施形態において、本発明は、R1が低級アルキルであり;R2、R3、およびR5が水素であり;R6
が−CHR7−(CO)−R8であり;そしてiが0である、上記化合物である。
【0046】
好ましい実施形態において、本発明は、R1がメチルであり、そしてR6が−CH2−(CO)−CH3である、上記化合物である。
【0047】
好ましい実施形態において、本発明は、R1およびR6が低級アルキルであり;R2、R3、およびR5が水素であり;そしてiが0である、上記化合物である。
【0048】
好ましい実施形態において、本発明は、R1およびR6がメチルである、上記化合物である。
【0049】
好ましい実施形態において、本発明は、R1およびR2が、一緒に連結して、低級アルキレン架橋−CHR9−CHR10を形成し、ここで、R9およびR1 0は、独立して、水素、ヒドロキシル、および低級アルキルからなる群より選択される、上記化合物である。
【0050】
好ましい実施形態において、本発明は、R1およびR2が、一緒に連結して、低級アルキレン架橋−CH2−CHOH−を形成する、上記化合物である。
【0051】
好ましい実施形態において、本発明は、R3およびR5が水素であり;そしてiが0である、上記化合物である。
【0052】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、R6が−CHR7−(CO)−R8であり、ここで、R8は水素または低級アルキルである、上記化合物である。
【0053】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、R6が−CH2−(CO)−CH3である、上記化合物である。
【0054】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、R6が低級アルキルである、上記化合物である。
【0055】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、R6がメチルである、上記化合物である。
【0056】
1つの局面において、本発明は、以下の構造式:
【0057】
【化2】
【0058】
を有するポリケチド化合物に関する。
【0059】
1つの局面において、本発明は、以下の構造式:
【0060】
【化3】
【0061】
を有するポリケチド化合物に関する。
【0062】
1つの局面において、本発明は、以下の構造:
【0063】
【化4】
【0064】
を有する酵素結合ケチドの触媒環化により形成されるポリケチド化合物に関し、ここで、R11は、メチル、−CH2(CO)CH3および−CH2(CO)CH2(CO)CH3からなる群より選択される;R12は−S−Eおよび−CH2(CO)−S−Eからなる群より選択される;そしてEは、上記遺伝子操作した細胞により産生されるポリケチドシンターゼを表し、R13とR14とのうちの一方が水素であり、そして他方がヒドロキシルであるか、またはR13とR14とが一緒になって、カルボニルを表す、ポリケチド化合物である。
【0065】
好ましい実施形態において、本発明は、R11がメチルであり、そしてR12が−CH2(CO)−S−Eである、上記化合物である。
【0066】
好ましい実施形態において、本発明は、R11が−CH2(CO)CH3であり、そしてR12が−S−Eである、上記化合物である。
【0067】
好ましい実施形態において、本発明は、R11が−CH2(CO)CH3であり、そしてR12が−CH2(CO)−S−Eである、上記化合物である。
【0068】
好ましい実施形態において、本発明は、R11が−CH2(CO)CH2(CO)CH3であり、そしてR12が−CH2(CO)−S−Eである、上記化合物である。
【0069】
好ましい実施形態において、本発明は、R13とR14とのうちの一方が水素であり、そして他方がヒドロキシルである、上記化合物である。
【0070】
好ましい実施形態において、本発明は、R13とR14とが一緒になって、カルボキシル部分を形成する、上記化合物である。
【0071】
1つの局面において、本発明は、以下の構造式:
【0072】
【化5】
【0073】
を有するポリケチド化合物に関し、ここで、R2部分は、独立して、水素、低級アルキル、および低級アルキルエステルからなる群より選択される;R4は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルモノ−またはジ−置換のアミノ、およびニトロからなる群より選択される;そしてiは、0、1または2である、ポリケチド化合物である。
【0074】
好ましい実施形態において、本発明は、R2が水素であり、そしてiが0である、上記化合物である。
【0075】
1つの局面において、本発明は、以下の構造式:
【0076】
【化6】
【0077】
を有するポリケチド化合物に関し、ここで、R2部分は、独立して、水素、低級アルキル、および低級アルキルエステルからなる群より選択される;R4は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルモノ−またはジ−置換のアミノ、およびニトロからなる群より選択される;そしてiは、0、1または2である、ポリケチド化合物である。
【0078】
好ましい実施形態において、本発明は、R2が水素であり、そしてiが0である、上記化合物である。
【0079】
1つの局面において、本発明は、以下の構造式:
【0080】
【化7】
【0081】
を有するポリケチド化合物に関し、ここで、R2部分は、独立して、水素、低級アルキル、および低級アルキルエステルからなる群より選択される;R4は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルモノ−またはジ−置換のアミノ、およびニトロからなる群より選択される;そしてiは、0、1または2である、ポリケチド化合物である。
【0082】
好ましい実施形態において、本発明は、R2が水素であり、そしてiが0である、上記化合物である。
【0083】
1つの局面において、本発明は、以下の構造式:
【0084】
【化8】
【0085】
を有するポリケチド化合物に関する。
【0086】
1つの局面において、本発明は、以下の構造式:
【0087】
【化9】
【0088】
を有するポリケチド化合物に関する。
【0089】
1つの局面において、本発明は、以下の構造式:
【0090】
【化10】
【0091】
を有するポリケチド化合物に関する。
【0092】
1つの局面において、本発明は、芳香族ポリケチドを生産する方法であって、以下の構造:
【0093】
【化11】
【0094】
を有する酵素結合ケチドの環化を行う工程を包含する方法に関し、ここで、R11は、メチル、−CH2(CO)CH3および−CH2(CO)CH2(CO)CH3からなる群より選択される;R12は、−S−Eおよび−CH2(CO)−S−Eからなる群より選択される;そしてEは、上記遺伝子操作した細胞により産生されるポリケチドシンターゼを表し、R13とR14とのうちの一方が水素であり、そして他方がヒドロキシルであるか、またはR13とR14とが一緒になって、カルボニルを表し、ここで環化はこのポリケチドシンターゼにより誘導される、方法である。
【0095】
好ましい実施形態において、本発明は、R11がメチルであり、そしてR12が−CH2(CO)−S−Eである、上記方法である。
【0096】
好ましい実施形態において、本発明は、R11が−CH2(CO)CH3であり、そしてR12が−S−Eである、上記方法である。
【0097】
好ましい実施形態において、本発明は、R11が−CH2(CO)CH3であり、そしてR12が−CH2(CO)−S−Eである、上記方法である。
【0098】
好ましい実施形態において、本発明は、R11が−CH2(CO)CH2(CO)CH3であり、そしてR12が−CH2(CO)−S−Eである、上記方法である。
【0099】
好ましい実施形態において、本発明は、R13とR14とのうちの一方が水素であり、そして他方がヒドロキシルである、上記方法である。
【0100】
好ましい実施形態において、本発明は、R13とR14とが一緒になって、カルボキシル部分を形成する、上記方法である。
【0101】
【発明の実施の形態】
(発明の要旨)本発明は、新規ポリケチド、ならびに組換え技術を用いて新しいポリケチドおよび公知のポリケチドの両方を効果的に産生する新規な方法を提供する。さらに特定すると、新規な宿主−ベクター系を用いて、種々のポリケチドの産生を触媒するPKSもまた作製する。このようなポリケチドは、抗生物質、抗腫瘍剤、免疫抑制剤として、および広範な他の薬理学的目的に有用である。
【0102】
従って、1つの実施態様においては、本発明は、ポリケチドシンターゼ(PKS)遺伝子クラスターをそのネイティブの非形質転換の状態で発現する、遺伝子操作した細胞に関し、この遺伝子操作した細胞は、実質的にネイティブなPKS遺伝子クラスター全てを欠いている。
【0103】
他の実施態様においては、本発明は、上記遺伝子操作した細胞に関し、ここで、この細胞は、(a)ポリケチドの合成を触媒し得るPKSをコードする、置換PKS遺伝子クラスター;および(b)このPKS遺伝子クラスターと作動可能に連結される1つまたはそれ以上の制御配列であって、これにより、この遺伝子クラスター中の遺伝子は、この遺伝子操作した細胞内で転写および翻訳され得る、制御配列、但し、この置換PKS遺伝子クラスターが全PKS遺伝子セットを含むときには、少なくとも1つのPKS遺伝子または制御要素は、この細胞とは異種である。
【0104】
特に好ましい実施態様においては、遺伝子操作される細胞は、Streptomyces coelicolorであり、この細胞は、実質的にネイティブなアクチノロジンPKS遺伝子クラスター全体を欠き、そして置換PKS遺伝子クラスターは、PKSケトシンターゼおよびPKSアシルトランスフェラーゼの活性部位(KS/AT)をコードする第1の遺伝子、PKS鎖長決定因子(CLF)をコードする第2の遺伝子、およびPKSアシルキャリアタンパク質(ACP)をコードする第3の遺伝子を含む。
【0105】
他の実施態様においては、本発明は、組換えポリケチドを産生するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する:
(a)上記の細胞の集団を提供する工程;および(b)この細胞に存在する置換PKS遺伝子クラスターが発現される条件下で、細胞の集団を培養する工程。
【0106】
さらに他の実施態様においては、本発明は、組換えポリケチドを産生するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する:
a.置換PKS遺伝子クラスターの第1の部分をドナープラスミドに挿入し、そして置換PKS遺伝子クラスターの第2の部分を受容体プラスミドに挿入する工程であって、ここで、この第1および第2の部分は、完全な置換PKS遺伝子クラスターを集合的にコードし、さらにここで:
i.このドナープラスミドは、第1の選択マーカーをコードし、第1の許容温度で複製し得、そして第2の非許容温度で複製し得ない遺伝子を発現する;
ii.この受容体プラスミドは、第2の選択マーカーをコードする遺伝子を発現する;そして
iii.このドナープラスミドは、相同組換えが置換PKS遺伝子クラスターの第1の部分と置換遺伝子クラスターの第2の部分との間に起こり得るように、受容体プラスミド中のDNA領域と相補的なDNAの領域を含み、これにより、完全な置換遺伝子クラスターが産生され得る、工程;
b.このドナープラスミドおよび受容体プラスミドを宿主細胞に形質転換させ、そして第1の許容温度ならびに第1および/または第2の選択マーカーを発現する宿主細胞を成長させる条件下で、形質転換された宿主細胞を培養して、細胞の第1の集団を産生する工程;
c.第2の非許容温度ならびに第1および/または第2の選択マーカーを発現する宿主細胞を成長させる条件下で、この細胞の第1の集団を培養して、細胞の第2の集団を産生する工程であって、この細胞は、完全なPKS置換遺伝子クラスターを含む組換えプラスミドを含有する宿主細胞を包含する、工程;
d.細胞の第2の集団由来の組換えプラスミドを、請求項1の遺伝子操作した細胞に移入して、形質転換され、遺伝子操作した細胞を産生する工程;および
e.この形質転換され、遺伝子操作した細胞を、細胞中に存在する置換PKS遺伝子クラスターが発現される条件下で培養する工程。
【0107】
さらに他の実施態様においては、本発明は、構造式(I)を有するポリケチド化合物に関する:
【0108】
【化12】
【0109】
ここで、R1は、水素および低級アルキルからなる群より選択され、そしてR2は、水素、低級アルキルおよび低級アルキルエステルからなる群より選択され、あるいはR1およびR2は、1個〜4個のヒドロキシル基または低級アルキル基で任意に置換される低級アルキレン架橋を一緒に形成する;R3およびR5は、独立して、水素、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルモノ−またはジ−置換のアミノおよびニトロからなる群より選択される;R4は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、低級アルキルモノ−またはジ−置換のアミノおよびニトロからなる群より選択される;R6は、水素、低級アルキル、および−CHR7−(CO)R8からなる群より選択され、ここで、R7およびR8は、独立して、水素および低級アルキルからなる群より選択される;そしてiは、1、2、または3である。
【0110】
他の実施態様においては、本発明は、以下の構造を有する新規ポリケチドに関する:
【0111】
【化13】
【0112】
【化14】
【0113】
他の実施態様においては、本発明は、構造(II)を有する酵素結合ケチドの触媒環化により形成される化合物ポリケチドに関する:
【0114】
【化15】
【0115】
ここで、R11は、メチル、−CH2(CO)CH3および−CH2(CO)CH2(CO)CH3からなる群より選択される;R12は、−S−Eおよび−CH2(CO)−S−Eからなる群より選択され、ここで、Eは、上記遺伝子操作した細胞により産生されるポリケチドシンターゼを表す;そして、R13およびR14の一方は、水素であり、そして他方は、ヒドロキシルであり、またはR13およびR14は共に、カルボニルを表す。
【0116】
さらに他の実施態様においては、本発明は、芳香族ポリケチドを生成する方法に関し、この方法は、構造(II)を有する酵素結合ケチドの環化を行う工程を包含し、ここで、環化はポリケチドシンターゼにより誘導される。
【0117】
さらなる実施態様においては、本発明は、構造式(III)を有するポリケチド化合物に関する:
【0118】
【化16】
【0119】
ここで、R2およびR4は、上記で定義されたものと同じであり、そしてiは、0、1または2である。
【0120】
他の実施態様においては、本発明は、構造式(IV)を有するポリケチド化合物に関する:
【0121】
【化17】
【0122】
ここで、R2、R4およびiは、構造式(III)についての上記定義と同じである。
【0123】
さらに他の実施態様においては、本発明は、構造式(V)を有するポリケチド化合物に関する:
【0124】
【化18】
【0125】
ここで、R2、R4およびiは、構造式(III)について上記で定義されたものと同じである。
【0126】
本発明のこれらおよび他の実施態様は、本明細書中の開示を考慮すると、当業者が容易に行い得るであろう。
【0127】
(発明の詳細な説明)本発明の実施は、他に指示がない限り、化学、微生物学、分子生物学および組換えDNA技術の当該分野内で慣用の方法を利用する。このような技術は、文献に十分に開示されている。例えば、Sambrookら、MolecularCloning:A Laboratory Manual(最新版);DNACloning:A Practical Approach,第IおよびII巻(D.Glover編);Oligonucleotide Synthesis(N.Gait編、最新版);Nucleic Acid Hybridization(B.HamesおよびS.Higgins編、最新版);Transcription and Translation(B.HamesおよびS.Higgins編、最新版)を参照のこと。
【0128】
前出または後出とは関係なく、本明細書中で引用されている全ての出版物、特許および特許出願は、その全体が本明細書中で参考として援用されている。
【0129】
本明細書および添付の請求の範囲で用いられるように、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈にて他に明らかに指示がない限り、複数形を包含する。それゆえ、例えば、「ポリケチド(a polyketide)」との表示は、ポリケチドの混合物を包含し、「ポリケチドシンターゼ(a polyketide synthase)」との表示は、ポリケチドシンターゼの混合物を包含する。
【0130】
(A.定義)本発明を記載する際に、次の用語が使用され、そして以下に示すように定義されることが意図される。
【0131】
「置換PKS遺伝子クラスター」とは、それと共に形質転換された宿主細胞において、以下に定義される1つまたはそれ以上の適合性制御要素の支配下にある場合に、機能性PKSを産生し得るPKS遺伝子のあらゆるセットを意味する。機能性PKSは、ポリケチドの合成を触媒するものである。用語「置換PKS遺伝子クラスター」とは、1つまたはそれ以上の、ポリケチドの産生を触媒するために必要とされる種々のタンパク質をコードする遺伝子を含む。「置換PKS遺伝子クラスター」は、対応する天然クラスターに見出される全ての遺伝子を包含する必要はない。むしろ、この遺伝子クラスターは、活性ポリケチドの産生を触媒するために必要なPKS成分をコードすることのみが必要である。それゆえ、以下にさらに説明されるように、この遺伝子クラスターが、例えば、ネイティブ状態で8個の遺伝子を包含し、そしてこれらの遺伝子のうち3個のみが活性ポリケチドを提供するのに必要ならば、これらの3個の遺伝子のみの存在が必要である。さらに、このクラスターは、単一種由来のPKS遺伝子を包含し得るか、または事実上、例えば、他のポリケチドの合成のためのクラスター由来の対応する遺伝子で置換される、特定のポリケチドの合成のためのクラスター由来の遺伝子を有するハイブリッドであり得る。ハイブリッドクラスターは、タイプI PKSおよびタイプII PKSの両方に由来する遺伝子を包含し得る。上記のように、タイプI PKSは、いくかの大型の多機能タンパク質を包含し、これらの間には、炭素鎖のアセンブリおよび修飾の各工程のための別々の活性部位のセットを有する。他方、タイプII PKSは、反復して使用される活性部位の単一のセットを有する。これらの分類は周知である。例えば、Hopwood,D.A.およびKhosla,C.Secondary metabolites:their function and evolution(1992)Wiley Chichester(Ciba Foundation Symposium 171)88−112頁;Bibb,M.J.ら、EMBO J.(1989)8:2727;Sherman,D.H.ら、EMBO J.(1989)8:2717;Fernandez−Moreno,M.A.ら、J.Biol.Chem.(1992)267:19278);Cortes,J.ら、Nature(1990)348:176;Donadio,S.ら、Science(1991)252:675;MacNeil,D.J.ら、Gene(1992)115:119。ハイブリッドクラスターは、ここで例示され、そして以下にさらに記載される。遺伝子クラスターに含まれる遺伝子はネイティブな遺伝子である必要はないが、これらの変異体またはアナログであり得る。変異体またはアナログは、コーディング配列の1つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置換により調製され得る。ヌクレオチド配列を改変する技術(例えば、部位特異的変異誘発)は、例えば、Sambrookら、前出;DNACloning,第IおよびII巻、前出;Nucleic Acid Hybridization, 前出に記載されている。
【0132】
「置換PKS遺伝子クラスター」はまた、PKSにより触媒されるコアポリケチドへの改変をコードする遺伝子を含有し得、これらの遺伝子には、例えば、ヒドロキシラーゼ、メチラーゼまたは他のアルキラーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、グリコトランスフェラーゼ、リアーゼ、エステルシンターゼまたはアミドシンターゼ、および種々のヒドロラーゼ(例えば、エステラーゼおよびアミダーゼ)をコードする遺伝子が挙げられる。
【0133】
以下にさらに説明されるように、置換遺伝子クラスターに含まれる遺伝子は、同じプラスミドに存在する必要がないか、または同じプラスミドに存在するならば、同じまたは異なる制御配列により制御され得る。
【0134】
「遺伝子操作した宿主細胞」とは、ネイティブなPKS遺伝子クラスターが組換えDNA技術を用いることによって欠失した宿主細胞を意味する。それゆえ、この用語は、自然に起こる変異事象を包含しない。「宿主細胞」は、単細胞統一体として培養される原核微生物または真核細胞株由来の細胞であり、これは、本発明のPKS遺伝子クラスターを持つ組換えベクターの受容体として使用され得るか、または使用されてきた。この用語は、トランスフェクトされたもとの細胞の子孫を包含する。単一の親細胞の子孫は、偶発的または故意の変異のため、その形態学またはゲノムDNAもしくは全DNA補体が、必ずしも元の親細胞と完全に同一であり得ないことが理解される。関連の特性(例えば、所望のPKSをコードするヌクレオチド配列の存在)により特徴づけられる親細胞と十分に類似するこの親細胞の子孫は、この定義に含まれ、そして上記用語によりカバーされる。
【0135】
用語「異種の」は、これがコーディング配列および制御配列のような核酸配列に関する場合には、通常なら組換え構築物の領域と会合しない配列、および/または、通常なら特定の細胞と会合しない配列を示す。それゆえ、核酸構築物の「異種の」領域は、他の分子と天然に会合している状態で見出されていない他の核酸分子内で、あるいは結合されている核酸の同定可能なセグメントである。例えば、構築物の異種の領域は、コーディング配列と天然に会合している状態で見出されていない配列により隣接されるコーディング配列を包含し得る。異種のコーディング配列の他の例は、このコーディング配列自体(例えば、ネイティブな遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列)が自然には見出されない構築物である。同様に、宿主細胞に通常存在しない構築物で形質転換された宿主細胞は、本発明の目的のための異種であると考えられる。本明細書中で使用されるように、アレル変異または天然に起こる変異事象は、異種DNAを生成しない。
【0136】
「コーディング配列」または特定のPKSを「コードする」配列は、インビトロまたはインビボで、適切な調節配列の制御下に置かれるときに、ポリペプチドに転写され(DNAの場合)、そして翻訳される(mRNAの場合)核酸配列である。コーディング配列の境界は、5’(アミノ)末端の開始コドンおよび3’(カルボキシ)末端の翻訳終止コドンにより決定される。コーディング配列は、原核mRNAまたは真核mRNA由来のcDNA、原核DNAまたは真核DNA由来のゲノムDNA配列、および合成DNA配列さえを包含し得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、コーディング配列の3’に位置する。
【0137】
「核酸」配列は、原核配列、真核mRNA、真核mRNA由来のcDNA、真核(例えば、哺乳類)DNA由来のゲノムDNA配列、および合成DNA配列さえ包含し得るが、これらに限定されない。この用語はまた、任意のDNAおよびRNAの既知の塩基アナログを含む配列を包含する。これらの塩基アナログには、例えば、4−アセチルシトシン、8−ヒドロキシ−N6−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、5−(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6−イソペンテニルアデニン、1−メチルアデニン、1−メチルプソイドウラシル、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N6−メチルアデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、β−D−マンノシルキューオシン(β−D−mannosylqueosine)、5’−メトキシカルボニルメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン(queosine)、2−チオシトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、N−ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、2−チオシトシン、および2,6−ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、コーディング配列の3’に位置する。
【0138】
DNA「制御配列」とは、プロモーター配列、リボゾーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、エンハンサーなどを集合的に意味し、これらは、宿主細胞において、コーディング配列の転写および翻訳を集合的に提供する。所望の遺伝子が転写かつ翻訳され得る限り、これらの制御配列の全ては必ずしも組換えベクターに存在する必要がない。
【0139】
「作動可能に連結される」とは、要素の配置を意味し、ここで、このように記載される成分がこれらの通常の機能を果たすように配置される。それゆえ、コーディング配列に作動可能に連結される制御配列は、このコーディング配列の発現を行い得る。制御配列は、これらがその発現に直接作用する限り、コーディング配列と隣接する必要はない。それゆえ、例えば、翻訳されていないが転写はされた介在配列がプロモーター配列とコーディング配列との間に存在し得、そしてプロモーター配列はなお、コーディング配列に「作動可能に連結されている」と考えられ得る。
【0140】
「選択マーカー」とは、マーカーをそのゲノムに持つ細胞の集団を選択するために使用され得る任意の遺伝的マーカーを意味する。選択マーカーの例には、栄養要求性マーカー(このマーカーにより、細胞が、栄養分または補充物(例えば、チミジン、ジアミノピメリン酸またはビオチン)を有するかまたは有しない最少培地で成長する能力により選択される);代謝マーカー(このマーカーにより、細胞が、唯一の炭素源として適切な糖を含有する最少培地で成長するその能力、あるいは適切な染料または染色基質を含有する染色コロニーを形成する細胞の能力により選択される);および薬物耐性マーカー(このマーカーにより、細胞が、1種またはそれ以上の適切な薬物(例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ストレプトマイシンまたはナリジキシン酸)を含有する培地で成長するこの能力により選択される)が挙げられる。
【0141】
「組換え」とは、2つのDNA分子の間のDNA配列の区分の再組立である。「相同組換え」は、各DNA分子に存在する相同または相補的ヌクレオチド配列によってハイブリダイズする2つのDNA分子の間に起こる。
【0142】
本明細書中で使用される用語「アルキル」とは、1個〜24個の炭素原子の分枝状または非分枝状の飽和炭化水素基(例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、t−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラエイコシルなど)を意味する。本明細書中の好ましいアルキル基は、1個〜12個の炭素原子を含有する。用語「低級アルキル」とは、1個〜6個の炭素原子、好ましくは1個〜4個の炭素原子のアルキル基を意図する。
【0143】
本明細書中で使用される用語「アルキレン」とは、1個〜24個の炭素原子を含有する二官能性の飽和の分枝状または非分枝状の炭化水素鎖を意味し、これには、例えば、メチレン(−CH2−)、エチレン(−CH2−CH2−)、プロピレン(−CH2−CH2−CH2−)、2−メチルプロピレン[−CH2−CH(CH)3−CH2−]、へキシレン[−(CH2)6−]などが挙げられる。「低級アルキレン」とは、1個〜6個、より好ましくは1個〜4個の炭素原子のアルキレン基を意味する。
【0144】
本明細書中で使用される用語「アルコキシ」とは、単一の末端エーテル結合を介して結合したアルキル基を意図する;すなわち、「アルコキシ」基は、−ORとして定義され得、ここで、Rは先に定義されたアルキルである。「低級アルコキシ」基とは、1個〜6個、より好ましくは1個〜4個の炭素原子を含有するアルコキシ基を意図する。
【0145】
「ハロ」または「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意図し、そして通常、有機化合物中の水素原子のハロ置換に関する。ハロのうち、クロロおよびフルオロが一般に好ましい。
【0146】
「任意の」または「任意に」とは、次に記載される事象または情況が起こり得るかまたは起こり得ないこと、および本明細書は上記事象または情況が起こる例および起こらない例を含むことを意味する。例えば、表現「任意に置換されるアルキレン」とは、アルキレン部分が置換され得るかまたは置換され得ないこと、および本明細書は未置換のアルキレンおよび置換を有するアルキレンの両方を包含することを意味する。
【0147】
(B.一般的方法)本発明の中核は、新規および公知のポリケチドの両方の効果的組換え産生のための宿主−ベクター系の発見である。特に、本発明は、天然に生じるPKS遺伝子が実質的に欠失した、遺伝子操作した細胞を利用する。これらの宿主細胞は、活性ポリケチドの産生のために、種々のPKS遺伝子クラスターをコードする組換えベクターで形質転換され得る。本発明は、成長周期の適切な段階で大量の産生物の産生を提供する。このように産生されたポリケチドは、問題のポリケチドのタイプに依存して、治療剤として多くの疾患を治療するために使用され得る。例えば、本方法によって産生されたいくつかのポリケチドは、免疫抑制剤、抗腫瘍剤として、ならびにウイルス、細菌および寄生虫感染の治療のための使用が見出される。ポリケチドを組換えによって産生する能力もまた、PKSおよびそれらの作用のメカニズムを特徴づける強力な道具を提供する。
【0148】
より特定すると、対象のポリケチドの組換え産生のための宿主細胞は、組換えPKS遺伝子クラスターの宿主となる能力を有するいずれの生物にも由来し得る。それゆえ、本発明の宿主細胞は、原核生物または真核生物のいずれにも由来し得る。しかし、好ましい宿主細胞は、多くのポリケチドの大量生産者である菌糸型細菌の1クラスである放線菌から構築されるものである。本発明の系と共に使用のための特に好ましい属は、Streptomycesである。それゆえ、例えば、S.ambofaciens、S.avermitilis、S.azureus、S.cinnamonensis、S.coelicolor、S.curacoi、S.erythraeus、S.fradiae、S.galilaeus、S.glaucescens、S.hygroscopicus、S.lividans、S.parvulus、S.peucetius、S.rimosus、S.roseofulvus、S.thermotolerans、S.violaceoruber他は、本発明に都合の良い宿主細胞を提供し、中でも、S.coelicolorが好ましい。(例えば、Hopwood,D.A.およびSherman,D.H.Ann.Rev.Genet.(1990)24:37−66;O’Hagan,D.The Polyketide Metabolites(Ellis Horwood Limited,1991)の種々のポリケチド産生生物およびこれらの天然産生物に関する記載を参照せよ)。
【0149】
上記の細胞は、標準の技術(例えば、相同組換えにより)を用いて、この細胞由来の天然に生じるPKS遺伝子を欠失させることにより、遺伝子操作される。(例えば、Khosla,C.ら、Molec.Microbiol.(1992)6:3237を参照せよ)。本明細書中で例示されるのは、遺伝子操作したS.coelicolor宿主細胞である。S.coelicolorのネイティブ株は、芳香族ポリケチドアクチノロジン(構造3、図5)の生合成を触媒するPKSを産生する。新規な株であるS.coelicolor CH999(図2C、そして実施例に記載されている)は、相同組換えによってS.coelicolor CH1の染色体由来の天然actクラスター全てを欠失させることにより構築された(Khosla,C.Molec.Microbiol.(1992)6:3237)。この株は、内因性プラスミドを欠き、そして他の着色されたS.coelicolor抗生物質であるウンデシルプロジギオシン(undecylprodigiosin)の生合成をブロックする安定な変異を有している。
【0150】
上記の宿主細胞は、1つまたはそれ以上のベクターで形質転換され得、これにより、機能的なPKSセットを集合的にコードする。このベクターは、PKSのサブユニットのネイティブまたはハイブリッドの組み合わせまたはその変異体を包含し得る。先に説明されたように、置換遺伝子クラスターは、完全なネイティブ遺伝子クラスターに一致する必要はなく、ポリケチドの産生を触媒する必要なPKS成分をコードすることのみが必要である。例えば、現在までに研究された各Streptomyces芳香族PKSでは、炭素鎖アセンブリは、3つのオープンリーディングフレーム(ORF)の生成物を必要とする。ORF1は、ケトシンターゼ(KS)およびアシルトランスフェラーゼ(AT)の活性部位(KS/AT)をコードする;本明細書中で明らかにされるように、ORF2は、鎖長決定因子(CLF)(ORF1生成物と類似したタンパク質)をコードするが、KSおよびATのモチーフを欠く;そしてORF3は、別のアシルキャリアタンパク質(ACP)をコードする。いくかの遺伝子クラスターはまた、発生期のポリケチド骨格の環化に関与するケトレダクターゼ(KR)およびシクラーゼをコードする。(図1の3つのPKS遺伝子クラスターの概略的図を参照せよ)。しかし、同定可能なポリケチドを産生するためには、KS/AT、CLF、およびACPのみが存在する必要があることが見出された。それゆえ、Streptomyces由来の芳香族PKSの場合、これらの3つの遺伝子は、ネイティブなクラスターの他の成分無しで、1つまたはそれ以上の組換えベクターに含まれて、「最小」の置換PKS遺伝子クラスターを構成し得る。
【0151】
さらに、組換えベクターは、単一のPKS遺伝子クラスター由来の遺伝子を含み得るか、またはハイブリッド置換PKS遺伝子クラスターを含有し得、例えば、このクラスターは、1つのクラスターに対する遺伝子が他の遺伝子クラスター由来の対応する遺伝子で置換されている。例えば、ACPは、産生物の構造に影響することなく、異なるシンターゼの間で容易に互いに交換し得ることが見出された。さらに、所定のKRは、異なる鎖長のポリケチド鎖を認識し、そして還元させ得る。従って、これらの遺伝子は、本明細書中に記載される構築物において自由に交換され得る。それゆえ、本発明の置換クラスターは、同定可能なポリケチドを産生するために最終的に機能するPKS遺伝子セットの任意の組み合わせに由来し得る。
【0152】
ハイブリッド置換クラスターの例には、2つまたはそれ以上のact遺伝子クラスター、フレノリシン(fren)、グラナチシン(gra)、テトラセノマイシン(tcm)、6−メチルサリチル酸(6−msas)、オキシテトラサイクリン(otc)、テトラサイクリン(tet)、エリスロマイシン(ery)、グリセウシン(griseusin)、ナナオマイシン(nanaomycin)、メデルマイシン(medermycin)、ダウノルビシン(daunorubicin)、チロシン(tylosin)、カルボマイシン(carbomycin)、スピラマイシン(spiramycin)、アベルメクチン(avermectin)、モネンシン(monensin)、ノナクチン(nonactin)、クラマイシン(curamycin)、リファマイシン(rifamycin)およびカンジシジン(candicidin)シンターゼ遺伝子クラスター他に由来する遺伝子を有するクラスターが挙げられる。(種々のPKSの議論については、例えば、Hopwood,D.A.およびSherman,D.H.Ann.Rev.Genet.(1990)24:37−66;O’Hagan,D.The Polyketide Metabolites(Ellis Horwood Limited,1991)を参照せよ)。
【0153】
より特定すれば、多くのハイブリッド遺伝子クラスターが本明細書で構築され、これらは、表1および2に示されるように、act、fren、tcmおよびgra遺伝子クラスター由来の成分を有する。いくつかのハイブリッドクラスターは、S.coelicolorCH999中で、新規および公知の両ポリケチドを機能的に発現し得た(上記)。しかし、上記のように、他のハイブリッド遺伝子クラスターは、同定可能なポリケチドの産生のために、本明細書の開示を用いて容易に産生されおよびスクリーニングされ得る。例えば、放線菌類(actinomycetes)のコレクションから、ランダムにクローン化されたORF1および2ホモログのライブラリーが構築され得、そして同定可能なポリケチドについてスクリーニングされ得た。より長いポリケチドもまた、正確な長さの鎖を産生するPKS遺伝子クラスター由来のホモログで、例えば、act、gra、frenまたはtcmシクラーゼ遺伝子を置き換えることにより環状化され得た。最後に、天然に生じる特定の芳香族PKS類の間には、非酢酸塩のスターター単位についてかなりの程度の変動が存在する;従って、これらの単位もまた、遺伝子工学により新規なポリケチドを得るために使用され得る。
【0154】
さらに、組換えベクターは、モジュールのPKS遺伝子クラスター由来の遺伝子を含み得る。そのような遺伝子クラスターをさらに詳細に以下に記載する。
【0155】
上記の遺伝子クラスターを有する組換えベクターは、当該分野で公知の技術を用いて都合よく生成され得る。例えば、目的のPKSサブユニットは、PKSサブユニットを発現する生物から、組換え法を用いて、例えばこの遺伝子を発現する細胞由来のcDNAまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、またはこの遺伝子を含むことが知られているベクターからこの遺伝子を得ることにより得られ得る。次いで遺伝子は、標準の技術を用いて、単離されそしてその他の所望のPKSサブユニットと組み合わされ得る。問題の遺伝子がすでに、適切な発現ベクター中に存在する場合、それは、例えば、その他のPKSサブユニットとインサイチュで所望のように組み合わされ得る。目的の遺伝子はまた、クローン化よりもむしろ合成的に産生され得る。ヌクレオチド配列は、所望の特定のアミノ酸配列に対する適切なコドンを用いて設計され得る。一般に、その配列が発現される目的の宿主に好適なコドンが選択される。標準的な方法により調製された重複するオリゴヌクレオチドから完全な配列がアセンブルされ、そして完全なコーディング配列にアセンブルされる。例えば、Edge(1981)Nature 292:756;Nambairら、(1984)Science223:1299;Jayら、(1984)J.Biol.Chem.259:6311を参照のこと。
【0156】
ネイティブのPKSサブユニット配列に対して変異が作成され得、そしてそのような変異体は、この変異体がその他のPKSサブユニットとともに機能し得、同定可能なポリケチドの合成を集合的に触媒し得る限り、ネイティブの配列の代わりに使用され得る。そのような変異は、例えば、変異を有する合成オリゴヌクレオチドを調製し、そして制限エンドヌクレアーゼ消化を用いてPKSサブユニットをコードする遺伝子中に変異した配列を挿入することによる従来技術を用いてネイティブな配列に作成され得る。(例えば、Kunkel,T.A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82:448;Geisselsoderら、BioTechniques(1987)5:786を参照)。あるいは、変異は、ミスマッチプライマー(一般に長さ10〜20のヌクレオチド)を用いてなされ得、このプライマーは、ミスマッチした二本鎖の融解温度以下の温度で、ネイティブなヌクレオチド配列(一般にRNA配列に対応するcDNA)にハイブリダイズする。このプライマーは、プライマーの長さおよび塩基組成を比較的狭い限度内に保つことにより、および変異体塩基を中心に位置させることにより特異的に作製し得る。ZollerおよびSmith、MethodsEnzymol.(1983)100:468。プライマー伸長は、DNAポリメラーゼを用いて行われ、生成物はクローン化され、そしてプライマーが伸長した鎖の分離から得た変異DNAを含むクローンが選択される。選択は、ハイブリダイゼーションプローブとして変異体プライマーを用いてなされ得る。この技術はまた、複数の点変異を生成するために適用し得る。例えば、Dalbie−McFarlandら、Proc.Natl.Acad.SciUSA(1982)79:6409を参照。PCR変異誘発もまた、所望の変異を行うための使用を見い出すであろう。
【0157】
置換PKS遺伝子クラスターを集合的にコードする遺伝子配列は、当業者に公知の方法を用いて1つまたはそれ以上の発現ベクター中に挿入され得る。発現ベクターは、所望のPKSコーディング配列に作動可能に連結された制御配列を含む。本発明に使用するための適切な発現系は、真核生物宿主細胞および原核生物宿主細胞において機能する系を含む。しかし、上記で説明したように、原核生物系が好適であり、そして特に、Streptomycesspp.と適合する系が特に重要である。そのような系で使用するための制御要素は、任意にオペレーター配列を含むプロモーター、およびリボソーム結合部位を含む。特に有用なプロモーターは、1つまたはそれ以上のactプロモーターのような、PKS遺伝子クラスター由来の制御配列を含む。しかし、ガラクトース、ラクトース(lac)およびマルトースのような糖代謝酵素由来のプロモーターのような、その他の細菌プロモーターもまた、本発明の構築物における使用を見い出す。さらなる例は、トリプトファン(trp)、βラクタマーゼ(bla)プロモーター系、バクテリオファージλPL、およびT5のような生合成酵素由来のプロモーター配列を含む。さらに、tacプロモーター(米国特許第4,551,433号)のような、合成のプロモーターもまた、天然には生じないが、細菌宿主細胞で機能する。
【0158】
他の調節配列もまた所望され得、この配列は宿主細胞の成長に相関してPKS置換配列の発現の調節を可能にする。調節配列は当業者に公知であり、そしてこの例としては、遺伝子の発現を、化学的または物理的刺激(調節化合物の存在を含む)に応答して開始(turnon)または停止(turnoff)させる調節配列を含む。その他のタイプの調節要素(例えば、エンハンサー配列)もまたベクター中に存在し得る。
【0159】
選択マーカーもまた、組換え発現ベクター中に含まれ得る。形質転換細胞株の選択において有用であり、そして一般に、細胞が適切な選択培地中で生長するとき、その発現が形質転換細胞上の選択可能な表現型を与える遺伝子を含む種々のマーカーが公知である。そのようなマーカーは、例えば、プラスミドに抗生物質の耐性または感受性を付与する遺伝子を含む。あるいは、いくつかのポリケチドは、本来着色されており、この特徴は、本発明の構築物により首尾良く形質転換された細胞を選択するための生来の(built−in)マーカーを提供する。
【0160】
目的の種々のPKSサブユニットが、別の制御要素とともに、または例えば単一プロモーターの制御下で1個のカセットとして、1つまたはそれ以上の組換えベクター中にクローン化され得る。PKSサブユニットは、隣接する制限部位を含んで、その他のPKSサブユニットの容易な欠失および挿入を可能にし、その結果、ハイブリッドPKSが生成され得る。そのようなユニークな制限部位の設計は当業者に公知であり、そして部位特異的変異誘発およびPCRのような、上記に記載の技術を用いて達成され得る。
【0161】
これらの技術を用いて、本明細書に記載のポリケチドの産生のためのシャトルベクターとして、新規プラスミドpRM5(図3および実施例2)が構築された。プラスミドpRM5は、PacI、NsiIおよびXbaI制限部位が隣接する、KS/AT(ORF1)、CLF(ORF2)およびACP(ORF3)PKSサブユニットをコードするact遺伝子を含む。従って、その他のPKS遺伝子によりコードされる類似の(anologous)PKSサブユニットは、存在するact遺伝子を容易に置換し得る。(例えば、親プラスミドとしてpRM5を用いるハイブリッドベクターの構築を記載する実施例4参照)。シャトルプラスミドはまた、actKR遺伝子(actIII)、シクラーゼ遺伝子(actVII)、および推定のデヒドラターゼ遺伝子(actIV)、ならびにColEIレプリコン(E.coliの形質転換を可能にする)、適切な短縮型(truncated)SCP2*(低コピー数)Streptomycesレプリコン、およびactクラスター由来のactII−ORF4アクティベーター遺伝子(栄養菌糸において成長期から定常期への移行の間にactプロモーターからの転写を誘導する)を含む。pRM5は、多様なactI/actIIIプロモーターペアを有する。
【0162】
本発明の組換えベクターを適切な宿主中に導入する方法は、当業者に公知であり、そして代表的には、CaCl2または2価のカチオンおよびDMSOのようなその他の薬剤の使用を包含する。DNAはまた、エレクトロポーレーションにより細菌細胞中に導入され得る。一旦PKSが発現されると、ポリケチド産生コロニーが同定され得、そして公知の技術を用いて単離され得る。次いで産生されたポリケチドがさらに特徴づけられ得る。
【0163】
上記で説明したように、上記の組換え法はまた、大きなモジュールPKSによるポリケチドの触媒的生合成に有用性を見い出す。例えば、6−デオキシエリスロノライドBシンターゼ(DEBS)は、エリスロマイシンアグリコンである6−デオキシエリスロノライドB(17)の生合成を触媒する。3つのオープンリーディングフレーム(eryAI、eryAII、およびeryAIII)がDEBSポリペプチドをコードし、そしてSaccharopolysporaerythraeaゲノムのeryクラスター中で32kbにわたっている。この遺伝子は、それぞれが「モジュール」と称される、6つの繰り返し単位で組織されている。各モジュールは、1セットの活性部位をコードし、この活性部位は、ポリケチド生合成の間に、付加モノマーの成長鎖上への縮合を触媒する。各モジュールは、アシルトランスフェラーゼ(AT)、β−ケトアシルキャリアタンパク質シンターゼ(KS)、およびアシルキャリアタンパク質(ACP)、ならびに還元活性部位のサブセット(β−ケトレダクターゼ(KR)、デヒドラターゼ(DH)、エノイルレダクターゼ(ER))(図9)を含む。モジュール内の還元部位の数は、各縮合サイクルにおけるβケト還元の程度に対応する。モジュールの末端でコードされるチオエステラーゼ(TE)は、ラクトン形成を触媒するようである。
【0164】
eryAI、eryAIIおよびeryAIIIの大きなサイズ、および複数の活性部位の存在のために、これらの遺伝子は、インビボ組換え技術を用いて、CH999のような、遺伝子操作した宿主細胞中での発現に適切なプラスミド中に便利にクローン化され得る。実施例5に記載され、そして図10に要約されたこの技術は、プラスミドpMAK705の誘導体(Hamiltonら、(1989)J.Bacteriol.171:4617)を利用し、温度感受性ドナープラスミド(第1の許容温度で複製し得、そして第2の非許容温度で複製し得ない)と、受容体プラスミドとの間のインビボ組換えを可能にする。このようにクローン化されたeryA遺伝子は、pRM5(McDanielら、(1993)Science262:1546)の誘導体pCK7を与える。コントロールプラスミドpCK7fを構築してeryAI中にフレームシフト変異をもたらした。pCK7およびpCK7fは、E.coliにおける遺伝子操作のためのColEIレプリコンならびに短縮型SCP2*(低コピー数)Streptomycesレプリコンを有する。これらのプラスミドはまた、多様なactI/actIIIプロモーターペアおよびactII−ORF4(これらプロモーターからの転写に必要であり、そして栄養菌糸において成長期から定常期への移行の間に発現を活性化するアクティベーター遺伝子)を含む。PKS遺伝子の高レベル発現は、菌糸成長の定常期の開始の際に起こる;従って、組換え株は、あたかも天然のように、2次代謝物として「レポーター」ポリケチドを産生する。
【0165】
大きな、モジュールPKSにより合成されるポリケチドの上記の産生方法を用いて、糖類、βラクタム、脂肪酸、アミノグリコシド、テルペノイド、非リボソームペプチド、プロスタノイドホルモンなどのような2次代謝物として他のポリケチドが産生され得る。
【0166】
上記の組換え法を用いて、多くのポリケチドが産生された。これらの化合物は、以下の一般構造(I)を有する
【0167】
【化19】
【0168】
ここでR1、R2
、R3、R4、R5、R6、R7、R8およびiは、上記で規定された通りである。このような化合物の1つの群はここで:R1は、低級アルキル、好ましくはメチルであり;R2、R3、およびR6は水素であり;R6は、−CHR7−(CO)−R8であり;そしてiは0である。このような化合物の第2番の群はここで:R1およびR6は、低級アルキル、好ましくはメチルであり;R2、R3、およびR5は、水素であり;そしてiは0である。このような化合物のさらに第3の群はここで:R1およびR2は、一緒に連結して低級アルキレン架橋−CHR9−CHR10を形成し、ここでR9およびR10は、独立して、水素、ヒドロキシルおよび低級アルキル(例えば、−CH2−CHOH−)からなる群より選択され;R3およびR5は水素であり;R6は、−CHR7−(CO)−R8、ここで、R8は、水素または低級アルキル(例えば、−CH2−(CO)−CH3)であり;そしてiは0である。そのような化合物の特定の例は、次のような以下の化合物9、10および11を含む:
【0169】
【化20】
【0170】
本発明の範囲内の他の新規なポリケチドは以下の構造を有する:
【0171】
【化21】
【0172】
【化22】
【0173】
化合物9、10、11、12、13、14、15および16の調製は、構造(II)を有する酵素結合ポリケチドの環化により行われる:
【0174】
【化23】
【0175】
ここで、R11、R12、R13およびR14およびEは、先に定義されるものと同じである。このような化合物の例には:R11がメチルであり、そしてR1 2が−CH2(CO)−S−Eである第1群;R11が−CH2(CO)CH3であり、そしてR12が−S−Eである第2群; R11が−CH2(CO)CH3であり、そしてR12が−CH2(CO)−S−Eである第3群;ならびにR11が−CH2(CO)CH2(CO)CH3であり、そしてR12が−CH2(CO)−S−Eである第4群が挙げられる(図8の構造の具体例を参照せよ)。
【0176】
一般式(I)に含まれる残りの構造、すなわち、9、10および11以外の構造は、有機化学分野の当業者に周知の慣用の有機合成方法を用いて、構造9、10または11から調製され得る。これらの方法は、例えば、H.O.HouseによるModern Synthetic Reactions,第2版(Menlo Park,CA:The Benjamin/Cummings Publishing Company,1972)、またはJ.March,Advanced Organic Chemistry:Reaction,Mechanisms and Structure 第4版(New York:Wiley−Interscience,1992)に記載され、これらの開示は、本明細書中で参考として援用されている。代表的には、当業者に理解されるように、芳香族環への置換基の取り込みには、簡単な求電子性芳香族付加反応が含まれる。構造12および13は同様の方法で改変されて、ポリケチドを産生し得る。これらのポリケチドもまた、本発明の範囲内にあると意図される。
【0177】
さらに、上記組換え方法を用いて、以下の一般式を有するポリケチド化合物が産生された:一般式(III)
【0178】
【化24】
【0179】
一般式(IV)
【0180】
【化25】
【0181】
および一般式(V)
【0182】
【化26】
【0183】
構造式(III)、(IV)および(V)の特に好ましい化合物は、R2が水素であり、そしてiが0であるものである。
【0184】
C.実験
以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の実施例である。これらの実施例は、例示の目的のためだけに提供され、どのような場合においても本発範囲を限定することを意図していない。
【0185】
使用される数字(例えば、量、温度など)の正確さを確実にするために努力したが、いくつかの実験誤差および偏差は、当然許容されるべきである。
【0186】
(材料および方法)
(細菌株、プラスミド、および培養条件)S.coelicolor CH999を、全てのプラスミドによる形質転換のための宿主として使用した。この株の構築を以下に説明する。DNA操作を、Escherichia coliMC1061において行った。プラスミドを、E.coli ET12567(dam dcm hsdS Cmr)(MacNeil,D.J.J.Bacteriol.(1988)170:5607)に通して、S.coelicolorの形質転換の前にメチル化されていないDNAを生成した。E.coli株を標準条件下で成長させた。S.coelicolor株をR2YE寒天プレート上で成長させた(Hopwood,D.A.ら、Genetic manipulation of Streptomyces.A laboratorymanual.The John Innes Foundation:Norwich,1985)。
【0187】
DNAおよび微生物の操作。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を、酵素製造者によって推薦された条件下でTaqポリメラーゼ(Perkin ElmerCetus)を用いて行った。標準のインビトロ技術を、DNA操作のために使用した(Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(最新版))。E.coliを、Bio−Rad E.coliパルス装置でBio−Rad.により提供されたプロトコールを用いて形質転換させた。S.coelicolorを、標準の手順により形質転換させ(Hopwood,D.A.ら、Genetic manpulation of Streptomyces.A laboratory manual.The John Innes Foundation:Norwich,1985)、そして形質転換体を、500mg/mlチオストレプトンオーバーレイ2mlを用いて選択した。
【0188】
組換えPKSを含有するプラスミドの構築。全てのプラスミドは、以下に記載するpRM5の誘導体である。fren PKS遺伝子を、この遺伝子に隣接する5’および3’制限部位を用いてPCRにより、pRM5のクローニング部位の位置(すなわち、ORF1に対するPacI−NsiI、ORF2に対するNsiI−XbaI、およびORF3に対するXbaI−PstI)に従って増幅させた。サブクローニングおよび配列決定に続いて、増幅させたフラグメントをpRM5中の対応するフラグメントの位置にクローン化して、形質転換のためのプラスミドを生成した。
【0189】
ポリケチドの産生および精製。最初のスクリーニングのために、全ての株を、それぞれ約30mlの寒天培地を含有する10〜30プレート上でコンフルエントローンとして、30℃で6〜8日間成長させた。完全な特徴付けのための十分な材料を得ることが必要とされるので、さらなるプレートを作製した。CH999は、潜在的なポリケチドをスクリーニングする場合のネガティブコントロールであった。寒天を細かく切り、そして酢酸エチル/1%酢酸または酢酸エチル:メタノール(4:1)/1%酢酸で抽出した。次いで、濃縮した抽出物を、シリカゲル(Baker 40mm)クロマトグラフィーカラムを通して、酢酸エチル/1%酢酸でフラッシュした。あるいは、抽出物をFlorisilカラム(Fisher Scientific)にかけ、そして酢酸エチル:エタノール:酢酸(17:2:1)で溶出した。初めの黄色画分を、調製用の逆相(C−18)カラム(Beckman)でアセトニトリル/水/1%酢酸の20〜60%グラジエントを用いる高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によりさらに精製した。280nmおよび410nmでの吸収をモニターした。一般に、これらの株からの精製産物の収率は、化合物1および2(図4)については約10mg/lであり、そして化合物7および8(図7)については5mg/lであった。
【0190】
SEK4(12)を、以下のように産生および精製した。CH999/pSEK4を、90寒天プレート(約34ml/プレート)上で30℃で7日間成長させた。この寒天を細切し、そして1%酢酸の存在下で酢酸エチル/メタノール(4/1)(3×1000ml)で抽出した。減圧下での溶媒の除去に続いて、1%酢酸を含有する酢酸エチル200mlを加えた。沈澱物を濾過して廃棄し、そして溶媒を乾燥するまで蒸発させた。生成物の混合物を、Florisilカラム(Fisher Scientific)にかけ、そして3%酢酸を含有する酢酸エチルで溶出した。初めの100ml画分を収集し、そして5mlまで濃縮した。メタノール1mlを加え、そして混合物を4℃で一晩保持した。沈殿物を濾過により収集し、そして酢酸エチルで洗浄して、純粋な生成物850mgを得た。Rf=0.48(1%酢酸の酢酸エチル)。SEK4に関するNMR分析の結果を表4に示す。FAB HRMS(NBA)、M+H+、計算値m/e 319.0818、実測値m/e 319.0820。
【0191】
SEK15(13)およびSEK15b(16)を産生するために、CH999/pSEK15を90寒天プレート上で成長させ、そして産生物をSEK4と同様の方法で抽出した。混合物をFlorisilカラム(5%酢酸を有する酢酸エチル)にかけ、主要産物を含有する画分を合わせ、そして乾燥するまで蒸発させた。産生物を、調製用のC−18逆相HPLC(Beckman)(移動相:1%酢酸の存在下のアセトニトリル/水=1/10〜3/5のグラジエント)を用いてさらに精製した。SEK15(13)の収量は250mgであった。Rf=0.41(1%酢酸の酢酸エチル)。SEK4に関するNMR分析の結果を表4に示す。FAB HRMS(NBA)、M+H+、計算値m/e 385.0923、実測値m/e 385.0920。
【0192】
[1,2−13C2]アセテート供給実験。それぞれ改変NMP培地(Strauch,E.ら、Mol.Microbiol.(1991)5:289)400mlを含有する2つの2リットルのフラスコに、S.coelicolorCH999/pRM18、CH999/pSEK4またはCH999/pSEK15の胞子を接種し、そして振とう培養装置において30℃で300rpmでインキュベートした。各フラスコに、[1,2−13C2]酢酸ナトリウム(Aldrich)50mgを72時間および96時間の時点で加えた。120時間後、培養物をプールし、そして2回の500ml容量の酢酸エチル/1%酢酸で抽出した。有機相を保持し、そして上記のように精製した。13C NMRデータは、CH999/pRM18産物について約2〜3%の増加;SEK4について0.5〜1%の増加およびSEK15について1〜2%の増加を示す。
【0193】
NMRスペクトル分析。RM18(10)(図8)のHETCOR分析をNicolet NT−360で行った以外は,全てのスペクトルをVarianXL−400で記録した。13Cスペクトルを、連続的ブロードバンドプロトンデカップリングで得た。RM18(10)のNOEの研究のために、一次元の差をとる方法(one−dimensional difference method)を利用した。全ての化合物をDMSO−d6(Sigma、99+原子%D)に溶解させ、そしてスペクトルを溶媒を内部標準として対照した。ヒドロキシル共鳴を、D2O(Aldrich、99原子%D)を添加し、そしてシグナルの消失を検査することにより同定した。
【0194】
【実施例】
(実施例1:S.coelicolorCH999の生産)S.coelicolor宿主細胞を遺伝子操作してネイティブなact遺伝子クラスターを除去し、そしてCH999と呼ばれる宿主細胞を、図2に示した戦略を用い、S.coelicolorCH1(Khosla,C.Molec.Microbiol.(1992)6:3237)を用いて構築した。(CH1は、S.coelicolorB385(Rudd,B.A.M.GeneticsofPigmentedSecondaryMetabolitesinStreptomycescoelicolor(1978)博士論文,UniversityofEastAnglia,Norwich,England)から得た)。CH1は、ポリケチド抗生物質アクチノロジンの生合成および分泌(export)に関与する酵素をコードするact遺伝子クラスターを含む。このクラスターは、いくつかのPKS生合成後の遺伝子(環化、芳香族化、および引き続く化学的改変(図2A)に関与する遺伝子を含む)が隣接するPKS遺伝子から構成される。act遺伝子の転写活性化を行う遺伝子もまた存在する。act遺伝子クラスターは、Khosla,C.ら、Molec.Microbiol.(1992)6:3237に記載されるような相同組換えを用いてCH1から欠失された。
【0195】
特に、プラスミドpLRermETs(図2B)は、次の特徴を有して構築された:pBR322由来のColEIレプリコン、pSG5由来の温度感受性レプリコン(Muth,Gら、Mol.Gen.Genet.(1989)219:341)、アンピシリンおよびチオストレプトン耐性マーカー、ならびにactクラスターの5’末端由来の2kbBamHI/XhoIフラグメント、1.5kbermEフラグメント(Khosla,C.ら、Molec.Microbiol.(1992)6:3237)、およびactクラスターの3’末端由来の1.9kbSphI/PstIフラグメントを含む分離カセット。5’フラグメントは、BamHI部位1(Malpartida,F.およびHopwood,D.A.Nature(1984)309:462;Malpartida,F.およびHopwood,D.A.Mol.Gen.Genet.(1986)205:66)から下流のXhoI部位にまでわたった。3’フラグメントは、PstI部位20から上流にSphI部位19.2にまでわたった(Fernandez−Moreno,M.A.ら、J.Biol.Chem.(1992)267:19278)。5’および3’フラグメント(図2で斜線で示されるDNA)は、actクラスターにおけるように、同じ相対方向にクローン化された。CH1は、pLRermEtsで形質転換された。このプラスミドは、引き続いて、39℃で非選択的に画線することによって候補形質転換体で保存された。リンコマイシン耐性、チオストレプトン感受性であり、かつアクチノロジンを産生し得ないいくつかのコロニーを単離し、そしてサザンブロッティングによりチェックした。それらの1つをCH999と称した。
【0196】
(実施例2:組換えベクターpRM5の生産)pRM5(図3)は、CH999でPKSを発現するために用いたシャトルプラスミドであった。それは、E.coliにおいて遺伝子操作を可能にするColEIレプリコン、適切な短縮型のSCP2*(低コピー数)Streptomycesレプリコン、および栄養菌糸で増殖期から定常期への移行の間にactプロモーターからの転写を誘導する、actクラスター由来のactII−ORF4アクチベーター遺伝子を含む。図3に示されるように、pRM5は、多様なactI/actIIIプロモーターペアを有し、同時に、両プロモーターの下流に種々の加工されたPKS遺伝子の挿入を容易にするために便利なクローニング部位を有する。pRM5は、SCP2*のpar遺伝子座を欠いている;その結果このプラスミドは、わずかに不安定である(チオストレプトンの非存在下で約2%が損失)。この特徴は、目的の表現型が、このプラスミド由来の変異体PKSに明確に割り当てられ得ることを、迅速に確認するために、故意に導入された。pRM5由来の組換えPKSは、ほぼ、対数増殖期から定常増殖期への移行期に、良好な収率で発現される。
【0197】
pRM5は以下のように構築された。pIJ903由来の10.5kbのSphI/HindIIIフラグメント(SCP2*の稔性遺伝子座の部分および複数起点、ならびにcolEI複製起点およびpBR327由来のβラクタマーゼ遺伝子を含む)(Lydiate、D.J.Gene(1985)35:223)を、1.5kbのHindIII/SphItsr遺伝子カセットと連結しpRM1を得た。pRM5は、pRM1のユニークなHindIIIとEcoRI部位との間に以下の2つのフラグメントを挿入することにより構築された:ファージfd由来の転写ターミネーター(Khosla,C.ら、Molec.Microbiol.(1992)6:3237)を有する0.3kbのHindIII/HpaI(平滑)フラグメント、およびNcoI部位(actII−ORF4アクチベーター遺伝子の1kb上流)(Hallam,S.E.ら、Gene(1988)74:305;Fernandez−Moreno,M.A.ら、Cell(1991)66:769;Caballero,J.L.Mol.Gen.Genet.(1991)230:401)からactI−VII−IV遺伝子(Fernandez−Moreno,M.A.らJ.Biol.Chem.(1992)267:19278)の下流のPstI部位まで伸びるactクラスター由来の10kbフラグメント。
【0198】
actIプロモーター(これはactII−ORF4遺伝子産物により活性化される)の制御下にある任意の所望の組換え体PKSの発現を促進するために、PacI、NsiI、XbaI、およびPstIに対する制限部位を、シストロン間の位置で、actDNA中に設けた。pRM5、および本明細書に記載のすべてのその他のPKS発現プラスミドでは、ORF1、2、および3対立遺伝子が、それら自身のRBSを用いて加工されたカセットとしてこれら部位の間にクローン化された。
【0199】
特に、放線菌においては、大部分の天然に存在する芳香族ポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターでは、ORF1とORF2とは、翻訳共役される。組換えPKSの構築を容易にするために、本明細書で用いられるORF1およびORF2対立遺伝子は、独立の(共役していない)カセットとしてクローン化された。actORF1については、以下の配列がpRM5中に設けられた:CCACCGGACGAACGCATCGATTAATTAAGGAGGACCATCATG、ここで下線の配列は、actI領域から上流のDNAに対応し、TTAATTAAは、PacI認識部位であり、そしてATGは、actIORF1の開始コドンである。以下の配列が、actORF1とORF2との間に設けられた:NTGAATGCATGGAGGAGCCATCATG、ここでTGAおよびATGは、それぞれ、ORF1およびORF2の停止および開始コドンである。ATGCATは、NsiI認識部位であり、そしてN(actDNAではA、その他のPKS由来の対立遺伝子ではAまたはG)のCによる置換は、翻訳脱共役(translational decoupling)を生じる。以下の配列を、actORF2の下流に設けた:TAATCTAGA、ここでTAAは停止コドン、そしてTCTAGAはXbaI認識部位である。これにより、actORF3の上流に設けられたXbaI部位(Khosla,C.ら、Molec.Microbiol.(1992)6:3237)へのactORF1およびORF2(上記のように設けられた)の融合を可能にした。コントロールとして、pRM5と同一であるが、設けられた任意の配列を欠いているpRM2が構築された。pRM2におけるORF1とORF2とは翻訳共役する。CH999/pRM2およびCH999/pRM5の生成物プロフィールの比較は、本明細書に記載された脱共役戦略が生成物分布または生成物レベルに対し検出可能な影響がなかったことを示した。
【0200】
(実施例3:pRM5で形質転換されたCH999を用いて産生されたポリケチド)プラスミドpRM5を、標準の技術を用いてS.coelicolorCH999中に導入した。(例えば、Sambrookら、MolecularCloning:ALaboratoryManual(最新版)を参照)。pRM5で形質転換されたCH999は、大量の黄褐色物質を産生した。2種の最も豊富な産物を、NMRおよび質量スペクトル分析により、アロエサポナリンII(2)(Bartel,P.L.らJ.Bacteriol.(1990)172:4816)およびそのカルボキシル化アナログ、3,8−ジヒドロキシ−1−メチルアントラキノン−2−カルボン酸(1)(Cameron,D.W.らLiebigsAnn.Chem.(1989)7:699)(図4)と特徴付けた。2は非酵素的な脱カルボキシル化(Bartel,P.L.らJ.Bacteriol.(1990)172:4816)により1から得られると推定される。化合物1および2は、約1:5のモル比で存在した。約100mgの混合物が、1リットルの培養から容易に精製され得た。従って、CH999/pRM5宿主ベクター系は、予期されたように機能し、顕著な量の安定な、最小限に改変されただけのポリケチド代謝物を産生した。1および2の生産は、アクチノロジン生合成の提案された経路(Bartel,P.L.らJ.Bacteriol.(1990)172:4816)と一致している。両代謝物は、アクチノロジン骨格のように、C−9における単一のケト還元を有する16炭素のポリケチドに由来する。
【0201】
CH999を、pSEK4(actKR遺伝子内の140bp SphI/SalIフラグメントを、pUC19由来のSphI/SalIフラグメントにより置換したことを除いてpRM5と同一)で形質転換したとき、得られる株は、大量の芳香族ポリケチドSEK4(12)を産生した。この産物の正確な構造は、デスオキシエリスロラクシン(Bartel,P.L.らJ.Bacteriol.(1990)172:4816)とはわずかに異なる。しかし、1,2−13C2−標識アセテートを用いるインビボのアイソトープ標識研究により、ポリケチド骨格が8アセテートに由来することが確認された。さらに、この産物の1Hスペクトルおよび13CNMRスペクトルの芳香族領域は、1に類似の3環(tricyclic)構造と一致するが、任意のケト還元を欠いている(表4参照)。
【0202】
(実施例4:ハイブリッドポリケチドシンターゼの構築と分析)
(A.act、gra、およびtcmPKS由来の成分を含むハイブリッドPKSの構築)図1は、相同な推定のKS/ATおよびACPサブユニット、ならびにORF2産物を含む、アクチノロジン(3)、グラナチシン(4)、およびテトラセノマイシン(5)(図5に示された構造)の炭素鎖骨格を合成するためのPKSを示す。actPKSおよびgraPKSはまたKRを有するが、tcmPKSでは欠いている。各クラスター由来の対応するタンパク質は、高い程度の配列同一性を示す。3つのクラスターにおける対応するPKSタンパク質間の同一性百分率は、以下のようである:KS/AT:act/gra76、act/tcm64、gra/tcm70;CLF:act/gra60、act/tcm58、gra/tcm54;ACP:act/gra60、act/tcm43、gra/tcm44。actPKSおよびgraPKSは、C−9でケト還元された8アセテート残基(図6)由来の同一の16個の炭素の骨格を合成する。対照的に、図6中でまた示されるように、tcmポリケチド骨格は、全体の炭素鎖長が異なり(16炭素の代わりに20炭素)、ケト還元されておらず、そして第1の環化の位置特異性は、actおよびgraでは炭素7と12と間である代わりに炭素9と14との間で起こる。
【0203】
特性の範囲が異なる新規ポリケチドを生成し、そして芳香族PKSをプログラミングする局面を解明する試みにおいて、表1で示されたように、系統的な、最小のPKS遺伝子クラスターのシリーズを、act、gra、およびtcm遺伝子クラスター由来の、ORF1(KS/ATサブユニットをコードする)、ORF2(CLFサブユニットをコードする)、およびORF3(ACPサブユニットをコードする)遺伝子産物の種々の並べ換えを用いて、存在するact遺伝子の代わりにpRM5中にクローン化した。得られるプラスミドを、上記のように、CH999を形質転換するために用いた。
【0204】
KS/AT、ORF2産物、およびPKSのACPサブユニットの間の種々の並べ換えを含む組換えPKS(すべての構築物はまた、actKR、シクラーゼ、およびデヒドラターゼ遺伝子を含む)の産物の分析は、シンターゼが3つのカテゴリー:ポリケチドを産生しないグループ;化合物1を産生するグループ(少量の2に加えて);および新規ポリケチド9(RM20と称される)(図6)を産生するグループに、分けられ得る(表1)ことを示した。9の構造は、この分子のポリケチド骨格前駆体がC−9位置に1ヶ所ケト還元を有する10個のアセテート残基に由来することを示唆する。
【0205】
異種のポリケチド鎖の還元および環化パターンに対するactKRの影響を調査するために、pSEK15もまた構築した。これは、tcmORF1〜3を含むが、actKRは欠いていた。(この構築物のactKR遺伝子における欠失は、pSEK4における欠失と同一であった。)CH999/pSEK15の分析は、20炭素鎖の産物SEK15(13)は、テトラセノマイシンCまたはその短絡(shunt)産物と同一ではないが、類似していた。NMRスペクトル分析もまた、完全に非還元のデカケチド骨格と一致した(表4参照)。
【0206】
すべてのact/graハイブリッドは、推定されるアクチノロジンおよびグラナチシンポリケチドの同一の構造と一致して、化合物1を産生した。各場合において、tcm/actハイブリッドから産物が単離され得る場合、ポリケチドの鎖長は、ORF2の供給源に対応する天然産物の鎖長と同一であった。このことは、ACPまたはKS/ATではなくORF2産物が、炭素鎖長を制御することを示唆する。さらに、本明細書に記載されるハイブリッド(KRを欠いているもの(CH999/pSEK4およびCH999/pSEK15)を除く)により産生されるすべてのポリケチドが、1ヶ所、ケト還元されたので、(i)KRは、ケト還元が起こるために必要でありかつ十分である;(ii)この還元は、常に、最終ポリケチド骨格中のC−9位置(鎖のカルボキシ末端から数えて)で起こる;および(iii)非還元のポリケチドは、ケト還元された未完成ポリケチド鎖においていく通りかの環化パターンで環化され得るが、第1環化の位置化学(regiochemistry)は、非還元産物においてこの環化がいかにして起こるかにかかわらず、得られるヒドロキシルの位置により指定されることが結論され得る。換言すれば、tcmPKSは、ケトレダクターゼを含むことにより、新規な環化特異性を示すように加工され得る。
【0207】
RM20(9)の顕著な特徴は、第1環化後の環化のパターンである。actVII変異体由来のムタクチン(6)の単離は、actVII産物およびそのtcm同族体が、アクチノロジン(3)およびテトラセノマイシン(5)それぞれの生合成において第2の環の環化を触媒することを示唆した(Sherman,D.H.らTetrahedron(1991)47:6029;Summers,R.G.らJ.Bacteriol.(1992)174:1810)。RM20(9)の環化パターンは、pRM20(9)上のactVII遺伝子の存在にかかわらず、1およびテトラセノマイシンF1の環化パターンと異なる。従って、actシクラーゼは、より長いポリケチド鎖を環化し得ないようである。
【0208】
予期せぬことに、最小のtcmPKSを単独で含む株(CH999/pSEK33)は、図8で示されるような、2つのポリケチドSEK15(13)およびSEK15b(16)を、ほぼ等しい量で産生した。しかし、化合物(13)および(16)はまたCH999/pSEK15からも単離され、化合物(16)の量より多い量の化合物(13)が、この構築物から単離された。
【0209】
SEK15bは新規化合物であり、その構造は、NMRスペクトル分析、[1,2−13C2]酢酸ナトリウム供給実験および質量スペクトル分析の組み合わせにより解明された。1Hおよび13CNMRの結果は、SEK15bは、非還元のアントラキノン部分およびピロン部分から構成されていることを示した。[1,2−13C2]酢酸ナトリウム供給実験は、SEK15bの炭素鎖が10アセテート単位に由来することを証明した。SEK15bに富んだ試料の13CNMRスペクトルから計算されたカップリング定数は、ピーク帰属を容易にした。高速原子衝撃(FAB)質量スペクトル分析は、C20H12O8と一致した381(M+H+)の分子量を与えた。重水素交換を用いてSEK15b中の各ヒドロキシルの存在を確認した。
【0210】
活性シクラーゼの非存在下で環化するための未完成ポリケチド鎖に対してインビボで利用可能な自由度を同定するために、組換え体S.coelicolorCH999/pRM37により産生されたポリケチド(McDanielら(1993)、上述)を分析した。pRM37によりコードされた生合成酵素は、tcmケトシンターゼ/アシルトランスフェラーゼ(KS/AT)、tcm鎖長決定因子(CLF)、tcmアシルキャリアプロテイン(ACP)、およびactケトレダクターゼ(KR)である。
【0211】
2つの新規化合物RM20b(14)およびRM20c(15)(図8)が、先にRM20(9)を生じたCH999/pRM37の培養培地中で発見された。回収された3つの化合物の相対量は、3:7:1(RM20:RM20b:RM20c)であった。(14)および(15)の構造は、質量スペクトル分析、NMRスペクトル分析、およびアイソトープ標識実験の組み合わせにより解明された。1Hおよび13CNMRスペクトルは、RM20bおよびRM20cがそれぞれピロン部分を含むジアステレオマーであることを示唆した。旋光度[α]D 20は、RM20bについては+210.8゜(EtOH、0.55%)、そしてRM20cについては+78.0゜(EtOH、0.33%)であることが見出された。[1,2−13C2]酢酸ナトリウム供給実験によって、RM20b(そして推論によってRM20c)の炭素鎖が、10個のアセテート単位に由来することが確認された。重水素交換研究を、RM20bおよびRM20cの両方の上の可能なヒドロキシル基に対応する1HNMRピークを同定するために実施した。プロトンカップリング定数は、1HNMRおよび1次元デカップリング実験の結果から計算された。特に、スペクトルの高磁場領域におけるカップリングパターンは、中央のカルビノールのメチンプロトンを取り囲む2つのメチレン基の5−プロトンスピン系を示した。高分解能高速原子衝撃(FAB)質量スペクトル分析は、RM20bについて(519.0056)(M=Cs+)、そしてRM20cについて387.1070(M+H+)の分子量を与え、それは、C20H18O8(M+Cs+、519.0056;M+H+、387.1080)と一致する。これらのデータに基づき、構造(14)および(15)(図8)を、それぞれ、RM20bおよびRM20cに割り当てた。
【0212】
1Hおよび13CNMRからのデータは、H−9とC−8上のジェミカルプロトンとの間のカップリング定数は、RM20bまたはRM20cについて、それぞれ12.1または12.2、および2.5または2.2Hzであることを示した。H−9とC−10上のジェミカルプロトンとの間のカップリング定数は、Rm20bまたはRM20cについて、それぞれ9.6または9.7、および5.7または5.8Hzであった。これらの値は、Ja,a(J9a,8aまたはJ9a,10a)およびJa,e(J9a,8eまたはJ9a,10e)カップリングパターンに典型的であり、そしてRM20bまたはRm20cの両方においてH−9がアキシアル位置であることを示す。対照的に、2つの分子上のC−7ヒドロキシルの化学シフトは、RM20bおよびRM20cについて、それぞれ16.18および6.14ppmであった。これらの値は、RM20bにおいて、C−7ヒドロキシルと適切に位置するアクセプター原子との間に水素結合が存在し、RM20cには存在しないことを示す。そのような水素結合のための最も可能性の高い候補アクセプター原子は、共役ピロン環系におけるC−13カルボニル酸素、または孤立したピロン環中の架橋酸素である。後者の場合、(14)と(15)との間を区別することが不可能であるので、前者でありそうである。さらに、RM20bおよびRM20cの13CNMRスペクトルの比較によって、(14)および(15)間の最も大きな差異は、共役ピロン環を構成する炭素の化学シフトにあることが明らかとなった(C−11、C−12、C−13、C−14、およびC−15のそれぞれについて、+5.9、−6.1、+8.9、−7.8、および+2.0ppm)。高磁場および低磁場シフトが交互するこのようなパターンは、C−7ヒドロキシルが、C−13カルボニルに水素結合するという事実により説明され得る。何故なら、水素結合は、C−11、C−13、およびC−15の周囲の電子密度を減少させるが、C−12およびC−14の周囲の電子密度を増加させると予想され得るからである。C−7/C−13水素結合の帰属を確認するために、RM20bおよびRM20cの交換可能なプロトンを、重水素で置換し(D2Oの存在下でインキュベートすることにより)、そして試料を13CNMRにより分析した。RM20b中のC−13ピークが、高磁場シフト(1.7ppm)し、RM20cではしなかったことは、水素が重水素で置換された場合のRM20bにおけるより弱いC−7/C−13非共有結合により説明され得る。C−13カルボニルと水素結合を形成するために、RM20bのC−7ヒドロキシルはエカトリアル位置を占めなければならない。従って、C−7およびC−9ヒドロキシルは、主要な異性体(RM20b)中で共役環系の同一面(syn)上にあり、その一方、それらは少ない方の異性体(RM20c)中では、反対側(anti)にあると推断され得る。
【0213】
CH999/pRM15、/pRM35、および/pRM36中でポリケチドは検出され得なかった。従って、いくつかのORF1−ORF2組み合わせのみが機能的である。各サブユニットは、少なくとも1つの組換えシンターゼにおいて機能的であったので、タンパク質発現/折り畳み問題は起こりそうもない。代わりに、これらの酵素複合物の異なるサブユニットの間の不完全または抑制の会合、あるいは迅速に分解される(失敗した)短鎖産生物の生合成は、ふさわしい説明である。
【0214】
(B.actおよびfren PKS由来の成分を含むハイブリッドPKSの構築)Streptomyces roseofulvusは、フレノリシンB(7)(Iwai,Yら、J.Antibiot.(1978)31:959)およびナナオマイシンA(8)(Tsuzuki,K.ら、J.Antibiot.(1986)39:1343)の両方を産生する。10kb DNAフラグメント(以下、fren座と呼ぶ)を、S.roseofulvusのゲノムライブラリー(Bibb,M.J.ら、前出)から、S.coelicolor A3(2)のact PKSのKS/ATおよびKR成分をコードするDNAをプローブとして用いてクローン化した(Malpartida,F.ら、Nature(1987))325:818)。(図7の構造図を参照せよ)。fren座のDNA配列決定は、act KS/AT、CLF、ACP、KR、およびシクラーゼをコードするものと高度の同一性を有する遺伝子の存在を(とりわけ)示した。
【0215】
新規ポリケチドを産生するために、pRM5に存在するORF1、2、および3act遺伝子を、表2に示されるように、対応するfren遺伝子で置換した。上記のように構築したS.coelilcolor CH999を、これらのプラスミドで形質転換した。(act KRおよびactシクラーゼをコードする遺伝子もまた、これらの遺伝的構築物のそれぞれに存在した。)上記のようにactおよびtcm PKSを用いる同様の実験からの結果に基づいて、actKRは全ての機能性組換えPKSの産生物を還元させ得るのに対して、第2の環化を触媒するactシクラーゼの能力は、fren PKSの産生物の鎖長に依存することが予想された。
【0216】
表2にまとめた結果は、殆どの形質転換体が、芳香族ポリケチドを産生するそれらの能力によりアッセイされたように、機能性PKSを発現したことを示す。主産生物の構造的分析は、産生株が2つのカテゴリ:化合物1(より少量のその脱カルボキシル化副生成物(2)と共に)を合成した株、および化合物1、10、および11の混合物(約1:2:2の比)を合成した株に分類され得ることを示した。(少量の2もまた、1を産生する全ての株に見出された)。化合物1および2は、天然産生物として以前から分かっており、実施例3に記載されるように、全体的にactサブユニットからなるPKSによって産生された代謝物であった。化合物10および11(それぞれ、RM18およびRM18bと称される)は、新規な構造であり、これらの化学合成または天然産生物としての単離は以前に報告されていなかった。
【0217】
10および11の構造を、質量スペクトル分析、NMRスペクトル分析、およびアイソトープ標識実験の組み合わせにより明らかにした。1Hおよび13Cスペクトル帰属を、10についての[1,2−13C2]酢酸ナトリウム供給実験(以下に記載される)により得られる13C−13Cカップリング定数と共に表3に示す。化合物10の明らかな帰属を、1D核オーヴァーハウザー効果(NOE)およびロングレンジヘテロ核相互作用(HETCOR)研究を用いて樹立した。重水素交換により、化合物10のC−15および化合物11のC−13でのヒドロキシルの存在が確認された。2の電界脱離(field desorption)質量分析(FD−MS)により、C17H14O4(282.2952)と一致する282の分子量を示した。
【0218】
先の研究は、2(および、推論による1)のポリケチド骨格(Bartel,P.L.ら、J.Bacteriol.(1990)172:4816)が8個のアセテート残基の繰り返し縮合とC−9での1回のケト還元から誘導されることを示した。また、ナナオマイシン(8)が同一の炭素鎖骨格に由来することも主張され得る。従って、ナナオマイシンがS.roseofulvus中のfren PKS遺伝子の産生物であることは非常に可能性が高い。1の形成を導く第1の環化の位置特異性は、ケト還元の位置により導かれ、これに対して、第2の環化の位置特異性は、actシクラーゼにより制御される(Zhang,H.L.ら、J.Org.Chem.(1990)55:1682)。
【0219】
RM18(10)炭素鎖骨格を追跡するために、[1,2−13C2]アセテートを用いるインビボ供給実験を、CH999/pRM18において行い、続いて、標識RM18(10)のNMR分析を行った。13Cカップリングデータ(表3にまとめた)は、RM18(10)のポリケチド骨格が9個のアセテート残基から誘導され、続いて、恐らく非酵素的に起こる、末端の脱カルボキシル化(C−213C共鳴が強められたシングレットとして現れる)により誘導されることを示す。さらに、C−9位のヒドロキシル基の非存在は、ケト還元がこの炭素で起こることを示唆する。これらの2つの特徴が推定のフレノリシン(7)骨格に存在すると予想されるので、これらの結果は、ナナオマイシンを合成することに加え、fren PKS遺伝子がS.roseofulvusでフレノリシンの生合成に寄与することを示唆する。これは、鎖長特異性がゆるやかなPKSの初めてのはっきりした例であるようである。しかし、フレノリシンの推定の骨格とは異なり、RM18(10)のC−17カルボニルは還元されない。これは、pRM18由来の特異的ケトレダクターゼ、デヒドラターゼ、およびエノイルレダクターゼ(S.roseofulvus中のfren遺伝子クラスターに存在する)の非存在を反映し得るか、またはフレノリシン中の炭素15〜18の異なる起源を反映し得る。
【0220】
RM18(10)の形成を導く第1の環化の位置特異性は、ケト還元の位置により導かれる;しかし、第2の環化は、7または1とは異なって起こり、そしてRM20(9)(先に記載される、tcm PKSにより産生されるデカケチド)に見られる環化パターンと類似する。従って、RM20(9)の場合のように、actシクラーゼはRM18前駆体の第2の環化を触媒し得ないこと、およびこの続いて起こる環化(恐らく非酵素的に起こる)は、水性環境への未完成のポリケチド鎖の異なる部分の放出の時間的差により制御されることが主張される。1を産生するCH999/pRM18(およびCH999/pRM34)の能力を考慮すると、シクラーゼがfren PKS(KS/AT、CLF、およびACP)と共同で働き(associate with)得ないという可能性は排除され得る。より適切な解釈は、actシクラーゼが鎖長の異なる基質を認識し得ないことである。これはまた、推定のRM20(9)の生合成スキームと一致する。
【0221】
表2に報告されたハイブリッドシンターゼの産生物のプロフィールとactおよびtcm PKS成分の間の類似のハイブリッドとの比較(表1)は、ORF2産生物が鎖長決定因子(CLF)であるという仮説を支持する。酵素結合ケチドの環化による化合物9、10および11の調製を、図8に概略的に例示する。
【0222】
(実施例5:モジュールポリケチドシンターゼの構築および分析)組換えモジュールDEBS PKS遺伝子を含む発現プラスミドは、図10に示すように、温度感受性「ドナー」プラスミド(すなわち、第1の許容温度で複製し得、そして第2の非許容温度で複製し得ないプラスミド)由来の増加するDNAを、二重組換えを行うことによって「受容体」シャトルベクターに移入することにより構築された。完全なeryA遺伝子を含むシャトルプラスミドであるpCK7(図11)(これは、pS1から初めにクローン化された(Tuanら(1990)Gene90:21))を、以下のように構築した。pS1由来の25.6kb SphIフラグメントを、pMAK705(Hamiltonら、(1989)J.Bacteriol.171:4617)のSphI部位に挿入して、eryAII、eryAIII、およびeryAIの3’末端を含むドナープラスミドであるpCK6(CmR)を得た。この温度感受性pSC101誘導体の複製が30℃で起こるが、44℃で終止する。受容体プラスミドであるpCK5(ApR、TcR)は、eryAI開始コドン(Caffreyら、(1992)FEBS Lett.304:225)からeryAIIの始端に近接するXcmI部位までの12.2kb eryAフラグメント、テトラサイクリン耐性遺伝子(Tc)をコードする1.4kb EcoRI−BsmI pBR322フラグメント、およびeryAIIIの終端由来の4.0kb NotI−EcoRIフラグメントを含む。PacI、Ndel、およびリボソーム結合部位を、pCK5中のeryAI開始コドンで設計した。pCK5は、pRM5の誘導体である(McDanielら、(1993)、前出)。5’および3’相同領域(図10、縞模様区域および白抜き区域)は、それぞれ4.1kbおよび4.0kbである。MC1061 E.coliを、pCK5およびpCK6で形質転換し(Sambrookら、前出を参照せよ)、そして30℃でカルベニシリンおよびクロラムフェニコール選択に供した。次いで、両方のプラスミド(ApR、CmR)を有するコロニーを、カルベニシリンおよびクロラムフェニコールプレートにて44℃で再度画線した。この2つのプラスミドの間の単一の組換え事象により形成された同時組込みだけが見られた。生存コロニーを、カルベニシリンの選択下で30℃で繁殖させ、第2の組換え事象を通して同時組込みの分解(resolution)を強制した。pCK7組換え体を増やすために、コロニーを、カルベニシリンプレートにおいて44℃で再度画線した。得られたコロニーの約20%は、所望の表現型(ApR、TcS、CmS)を示した。最後のpCK7候補物を、制限マッピングにより徹底的に検査した。対照プラスミドである、eryAIでフレームシフト誤差を含むpCK7fを、同様の方法で構築した。pCK7およびpCK7fを、E.coli ET12567(MacNeil(1988)J.Bacteriol.170:5607)に形質転換させて、メチル化されていないプラスミドDNAを生成し、続いて、標準プロトコールを用いてStreptomyces coelicolor CH999に移入した(Hopwoodら、(1985)Genetic manipulation of Streptomyces.A laboratory manual.The John Innes Foundation:Norwich)。
【0223】
R2YE培地でのCH999/pCK7の成長に伴い、微生物は、2つのポリケチド(図X)を大量に産生した。この成長培地にプロピオネート(300mg/L)を添加することにより、ポリケチド産生物の収率が約2倍増加した。プロピオン酸−1−13C供給実験と共に、プロトンおよび13CNMRスペクトル分析により、6dEB(17)としての主産生物が確認された(>40mg/L)。少量の産生物を、8,8a−デオキシオレアンドリド(18)として同定し(>10mg/L)、これは、6dEB生合成経路中のプロピオネートに代わるアセテート開始ユニットに由来するようである。13C2酢酸ナトリウム供給実験により、(18)へのアセテートの組込みが確認された。DEBS1、DEBS2、およびDEBS3であると推定される3つの高分子量タンパク質(>200kDa)(Caffreyら、(1992)FEBS Lett.304:225)もまた、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、CH999/pCK7の粗抽出物中に確認された。CH999/pCK7fからは、ポリケチド産生物が確認されなかった。
【0224】
それゆえ、新規ポリケチド、およびポリケチドを組換えに産生する方法が開示されている。本発明の好ましい実施態様がやや詳細に記載されているが、明らかな改変は、添付の請求の範囲により定義される本発明の精神および範囲から逸脱するこく行われることが理解される。
【0225】
【表1】
【0226】
【表2】
【0227】
【表3】
【0228】
【表4】
【0229】
【発明の効果】
本発明は、新規ポリケチド、ならびに組換え技術を用いて新しいポリケチドおよび公知のポリケチドの両方を効果的に生産する。特に、種々のポリケチドの産生を順番に触媒するポリケチドシンターゼを産生するために使用される新規な宿主−ベクター系を得る。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、act、gra、およびtcm PKSおよびシクラーゼの遺伝子クラスターを示す。
【図2】図2は、S.coelicolor CH999を作製するためのストラテジーを示す。図2Aは、S.coelicolor CH1染色体に存在するact遺伝子クラスターの構造を示す。図2Bは、pLRemEtsの構造を示し、そして図2Cは、act遺伝子クラスターが欠失したCH999染色体の部分を示す。
【図3】図3は、プラスミドpRM5の図である。
【図4】図4は、実施例3に記載されているアロエサポナリンII(2)およびそのカルボキシル化アナログである3,8−ジヒドロキシ−1−メチルアントラキノン−2−カルボン酸(1)の形成を概略的に例示する。
【図5】図5は、実施例4で言及されているアクチノロジン(3)、グラナチシン(4)、テトラセノマイシン(5)およびムタクチン(mutactin)(6)の構造を示す。
【図6】図6は、ポリケチド前駆体の環化による、実施例4のA部分に記載されているアロエサポナリンII(2)、そのカルボキシル化アナログである3,8−ジヒドロキシ−1−メチルアントラキノン−2−カルボン酸(1)、テトラセノマイシン(5)および新規化合物RM20(9)の調製を概略的に示す。
【図7】図7は、ポリケチド前駆体の環化による、フレノリシン(7)、ナノマイシン(nanomycin)(8)およびアクチノロジン(3)の調製を概略的に示す。
【図8A】図8Aは、ポリケチド前駆体の環化による、新規化合物RM20(9)、RM18(10)、RM18b(11)、SEK4(12)、SEK15(13)、RM20b(14)、RM20c(15)およびSEK15b(16)の調製を概略的に示す。
【図8B】図8Bは、ポリケチド前駆体の環化による、新規化合物RM20(9)、RM18(10)、RM18b(11)、SEK4(12)、SEK15(13)、RM20b(14)、RM20c(15)およびSEK15b(16)の調製を概略的に示す。
【図8C】図8Cは、ポリケチド前駆体の環化による、新規化合物RM20(9)、RM18(10)、RM18b(11)、SEK4(12)、SEK15(13)、RM20b(14)、RM20c(15)およびSEK15b(16)の調製を概略的に示す。
【図9】図9は、6−デオキシエリスロノリドBシンターゼ(DEBS)の遺伝子モデルを示す。
【図10】図10は、組換えモジュールPKSの構築のためのストラテジーを示す。
【図11】図11は、プラスミドpCK7の図である。
Claims (1)
- モジュールポリケチドシンターゼ(PKS)の複数のモジュールをコードする核酸を導入されている細胞であって、各モジュールが、少なくともPKSアシルトランスフェラーゼ(AT)活性、PKSケトアシルキャリアタンパク質シンターゼ(KS)活性、およびPKSアシルキャリアタンパク質(ACP)活性を含み、
該導入されたPKSモジュールをコードするヌクレオチド配列が少なくとも1つの制御配列に作動可能に連結され、これによって該細胞が機能性モジュールPKSを産生し、
ここで、該機能性モジュールPKSに対する該モジュールをコードするヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つまたは該制御配列の少なくとも1つが、該宿主細胞に対して異種である、細胞。
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