ES2271973T3 - Grupo de genes de la biosintesis de la rifamicina. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE EN PRINCIPIO A UN FRAGMENTO DE ADN QUE SE PUEDE OBTENER A PARTIR DEL GRUPO DE GENES RESPONSABLE DE LA BIOSINTESIS DE RIFAMICINA, EN EL GENOMA DE AMYCOLATOPSIS MEDITERRANEI, Y COMPRENDE AL MENOS UN GEN O UNA PARTE DE UN GEN QUE CODIFICA PARA UN POLIPEPTIDO IMPLICADO DIRECTA O INDIRECTAMENTE EN LA BIOSINTESIS DE RIFAMICINA. SE DESCRIBE ASIMISMO UN PROCEDIMIENTO DE PREPARACION DE DICHO FRAGMENTO DE ADN. LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE ADEMAS A MOLECULAS DE ADN RECOMBINANTES QUE COMPRENDEN UNO DE LOS FRAGMENTOS DE ADN SEGUN LA INVENCION, Y A PLASMIDOS Y VECTORES DERIVADOS DE LOS MISMOS. TAMBIEN SE INCLUYEN ORGANISMOS HUESPED TRANSFORMADOS CON DICHOS PLASMIDOS O DICHO ADN VECTOR.
Description
Grupo de genes de la biosíntesis de la
rifamicina.
Las rifamicinas forman un importante grupo de
antibióticos macrocíclicos (Wehrli, Topics in Current Chemistry
(1971), 72, 21-49). Consisten en un cromóforo
de naftoquinona que se conecta por un largo puente alifático. Las
rifamicinas pertenecen a la clase de antibióticos de ansamicina que
se producen por varias bacterias Gram-positiva del
suelo del grupo de actinomicetos y algunas plantas.
Las ansamicinas se caracterizan por un núcleo
aromático plano conectado por un puente alifático largo que se une
opuesto a las posiciones del núcleo. Dos grupos diferentes de
ansamicinas se pueden distinguir por la estructura de los núcleos
aromáticos. Un grupo tiene un cromóforo naftoquinoide, con los
representativos típicos que son rifamicina, streptovaricina,
tolipomicina y naftomicina. El segundo grupo, el cual tiene un
cromóforo benzoquinoide, se caracteriza por geldanamicina,
maytansinas y ansamitocinas (Ghisalba et al., Biotechnology
of Industrial Antibiotics Vandamme E. J. Ed., Decker Inc. New York,
(1984) 281-327). En contraste con los antibióticos
del tipo macrólido, las ansamicinas contienen en el sistema del
anillo alifático no un enlace lactona sino un enlace amida que forma
la conexión al cromóforo.
El descubrimiento de las rifamicinas producidas
por el microorganismo Streptomyces mediterranei (como se
llamo el organismo en aquel momento, ver abajo) fue descrito por
primera vez en 1959 (Sensi et al., Farmaco Ed. Sci. (1959)
14, 146-147). La extracción con acetato de
etilo de los cultivos acidificados de Streptomyces
mediterranei dio lugar al aislamiento de una mezcla de los
componentes activos antibioticamente, las rifamicinas A, B, C, D y
E. La rifamicina B, componente el más estable, se separó de los
otros componentes y aislado con base en sus propiedades fuertemente
ácidas y facilidad en la formación de la sal.
La rifamicina B tiene la estructura de la
fórmula (1)
La rifamicina B es el principal componente de la
fermentación cuando el barbitúrico se adiciona al medio de
fermentación y/o los mutantes mejorados del productor del
Streptomyces mediterranei se utilizan.
La cepa del productor de rifamicina
originalmente se clasificó como Streptomyces mediterranei
(Sensi et al., Farmaco Ed. Sci. (1959) 14,
146-147). El análisis de la pared celular de
Streptomyces mediterranei por Thiemann et al. revela
más tarde que esta cepa tiene una pared celular típica de
Nocardia, y la cepa se reclasificó como Nocardia
mediterranei (Thieman et al. Arch. Microbiol. (1969),
67 147-151). La Nocardia mediterranei
ha sido reclasificada otra vez con base en los criterios
morfológicos y bioquímicos exactos más recientes. Con base en la
composición exacta de la pared celular, la ausencia del ácido
micólico y la insensibilidad a los fagos Nocardia y
Rhodococcus, la cepa ha sido asignada al nuevo género
Amycolatopsis como Amycolatopsis mediterranei
(Lechevalier et al., Int. J. Syst. Bacteriol. (1986), 36,
29).
Lal et al. (Crit. Rev. Microbiol. (1995),
21, 19-30) ha revisado los métodos para
mejorar la producción de rifamicina por Amycolatopsis
mediterranei. Las rifamicinas tienen una actividad antibiótica
fuerte principalmente contra las bacterias
Gram-positiva tal como micobacteria, neisserias y
staphylococci. El efecto bactericida de las rifamicinas deriva de la
inhibición específica de la polimerasa del ARN del
ADN-dependiente bacteriana, que interrumpe la
biosíntesis del ARN (Wehrli y Staehelin, Bacteriol. Rev. (1971),
35, 290-309). El derivado de la rifamicina B
semisintética, el rifampin (rifampicin) es ampliamente utilizado
clínicamente como antibiótico contra el agente que causa
tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis.
Las ansamicinas naftoquinona del grupo
estreptovaricina y tolipomicina muestran, como la rifamicina, un
efecto antibacteriano por la inhibición del
ARN-polimerasa bacteriana. Por contraste, la
naftomicina tiene un efecto antibacteriano sin la inhibición
ARN-polimerasa bacteriana. Las ansamicinas
benzoquinona no muestran inhibición del
ARN-polimerasa bacteriana, y por consiguiente tienen
solamente actividad antibacteriana relativamente débil, si la hay.
Por otra parte, algunos representantes de esta clase de sustancias
tienen un efecto sobre las células eucariotas. De esa manera, las
propiedades antifúngicas, antiprotozoarios y antitumor han sido
descritas para la geldanamicina. Por otra parte, las propiedades
antimitóticas (antitubilina), antileucémicas y antitumor se
atribuyen a las maitansinas. Algunas rifamicinas también muestran
actividad antitumor y antiviral, pero solamente a altas
concentraciones. De esta manera este efecto biológico parece ser
no-específico.
A pesar de la gran variedad estructural de las
ansamicinas, su biosíntesis parece ocurrir por un camino metabólico
que contiene muchos elementos comunes (Ghisalba et al.
Biotechnology de Industrial Antibiotics Vandamme E. J. Ed., Decker
Inc. New York, (1984) 281-327). El núcleo aromático
para todas las ansamicinas es probablemente construido a partir de
ácido
3-amino-5-hidroxibenzóico.
A partir de esta molécula, la cual probablemente se activa como
coenzima A, el puente alifático total se sintetiza por un
poliquetido sintasa multifuncional. La longitud del puente y el
procedimiento de los grupos ceto, los cuales inicialmente se forman
mediante las etapas de condensación, se controlan por la
poliquetido sintasa. Para construir el puente alifático completo
para las rifamicinas, 10 etapas de condensación, 2 con acetato y 8
con propionato como construcción por bloques, son necesarias. La
secuencia individual de estas etapas de condensación es, así misma
determinada por el poliquetido sintasa. Las comparaciones y los
estudios estructurales con la incorporación del acetato y propionato
radioactivos han mostrado que la secuencia de la incorporación de
acetato y propionato para las diversas ansamicinas ocurre de acuerdo
con un esquema el cual aparece ser idéntico o muy similar en las
primeras etapas de condensación. De esa manera, de un esquema de la
síntesis común de las sintasas de la ansamicina poliquetido (el
esquema de la síntesis de rifamicina), las síntesis de las diversas
ansamicinas pronto o más tarde se separa, de acuerdo con su
diferencia estructural de la estructura de la rifamicina, en el lado
ramificado de la síntesis (Ghisalba et al., Biotechnology de
Industrial Antibiotics Vandamme E. J. Ed., Decker Inc. New York,
(1984) 281-327).
Debido a la gran variedad estructural de las
rifamicinas y su efecto biológico específico e interesante, hay un
gran interés en entender las bases genéticas de su síntesis con el
fin de crear la posibilidad específicamente de influenciarla. Esto
es particularmente deseable porque, según lo explicado arriba, hay
mucho en común entre la síntesis de rifamicinas y la de otras
ansamicinas. Esta semejanza en la biosíntesis, que probablemente
deriva de un origen evolutivo común de su camino metabólico,
naturalmente tiene una base genética.
La base genética de la biosíntesis del
metabolito secundario esencialmente existe en los genes que
codifican para las enzimas biosintéticas individuales, y en los
elementos reguladores que controlan la expresión de los genes de la
biosíntesis. La síntesis del metabolito secundario de los genes de
actinomicetos hasta ahora ha sido encontrada como grupos de genes
adyacentes en todos los sistemas investigados. El tamaño de tales
grupos de genes de antibiótico se extiende desde aproximadamente 10
kilobases (kb) hasta más de 100 kb. Los grupos a menudo contienen
genes reguladores específicos y genes para la resistencia del
organismo productor a su propio antibiótico (Chater, Ciba Found.
Symp. (1992), 171, 144-162).
La invención descrita en esta, ha tenido éxito,
mediante la identificación y clonación de genes de la biosíntesis de
la rifamicina, en crear la base genética para la síntesis por los
métodos genéticos análogos de la rifamicina o ansamicinas novedosas
que combinan los elementos estructurales de la rifamicina con otras
ansamicinas. Esto también crea la base para preparar las colecciones
novedosas de sustancias basadas en el grupo de genes de la
biosíntesis de rifamicina mediante la biosíntesis combinatoria.
Era posible en una primera etapa identificar y
clonar un fragmento de ADN a partir del genoma de A.
mediterranei, que muestra homología con conocidos genes de
poliquetidos sintasa. Después de obtener la información de la
secuencia de este fragmento de ADN que confirma una secuencia
típica para las sintasas del poliquetido esto fue posible por
selección de una genoteca del cósmido de A. mediterranei con
sondas de ADN específicas derivadas de este fragmento en un programa
de selección para más fragmentos de ADN que son implicados en el
grupo de genes de rifamicina. Por consiguiente, el grupo de genes
poliquetido sintasa de rifamicina completo se identificó y se
sometió a una determinación de secuencia (ver SEQ ID NO 3). El grupo
de genes comprende seis marcos de lectura abierta, que se refieren
más abajo como ORF A, B, C, D, E y F y que codifica para las
proteínas y polipéptidos representados en la SEQ ID NOS 4 a 9.
El grupo de genes aislado y caracterizado de
esta manera representa la base, por ejemplo, para la optimización
dirigida de la producción de la rifamicina, ansamicinas o análogos
de estas. Ejemplos de técnicas y las áreas posibles del uso
apropiadas a este respecto son como sigue:
\bullet Sobreexpresión de genes individuales
en cepas productoras con vectores del plásmido o por la
incorporación en el cromosoma.
\bullet Estudio de la expresión y regulación
transcripcional del grupo de genes durante la fermentación con
diversas cepas productoras y optimización de estos a través de
parámetros fisiológicos y condiciones de fermentación
apropiadas.
\newpage
\bullet Identificación de genes reguladores y
de los sitios de enlace del ADN de las proteínas reguladoras
correspondientes en el grupo de genes. La caracterización del efecto
de estos elementos reguladores en la producción de rifamicinas o
ansamicinas; y la influencia de estos por la mutación específica en
estos genes o los sitios de enlace del ADN.
\bullet Duplicación del grupo de genes
completos o partes de estos en las cepas productoras.
Además estas aplicaciones del grupo de genes
para mejorar la producción por fermentación como se describe
anteriormente, esto puede igualmente ser empleado para la
preparación biosintética de análogos de rifamicina novedosos o
ansamicinas novedosas o compuestos similares a ansamicina en las
cuales el puente alifático se conecta a solo un terminal del núcleo
aromático. Las siguientes posibilidades reciben consideración aquí,
por ejemplo:
\bullet Inactivación de etapas individuales en
la biosíntesis, por ejemplo por interrupción génica.
\bullet Mutación de etapas individuales en la
biosíntesis, por ejemplo por reemplazo génico.
\bullet Uso del grupo o fragmentos de estos
como sonda de ADN con el fin de aislar otros microorganismos
naturales que producen los metabolitos similares a la rifamicina o
la ansamicinas.
\bullet Intercambio de elementos individuales
en este grupo de genes por aquellos de otros grupos de genes.
\bullet Uso de poliquetido sintasas modificado
para configurar las bibliotecas de diversos análogos de rifamicina o
ansamicinas, que luego se prueban por su actividad (Jackie &
Khosla, Chemistry & Biology, (1995), 2,
355-362).
\bullet Construcción de cepas de actinomicetos
mutados de los cuales la rifamicina natural o la biosíntesis del
grupo de genes de ansamicina en el cromosoma ha sido parcialmente o
completamente suprimido, y puede así ser utilizado para la expresión
de los grupos de genes modificados genéticamente.
\bullet Intercambio de elementos individuales
dentro del grupo de genes.
La invención se relaciona con un fragmento de
ADN a partir del genoma de Amycolatopsis mediterranei, que
comprende una región de ADN que es implicada directamente o
indirectamente en el grupo de genes responsable para la síntesis de
rifamicina; y la región adyacente de ADNs; y los constituyentes
funcionales o dominios de estos.
Los fragmentos de ADN de acuerdo con la
invención pueden además comprender SECUENCIAS reguladoras tales como
promotores, sitios de enlace represor o activador, genes represores
o activadores, de terminación; o genes estructurales. Igualmente
parte de la invención es cualquier combinación de estos fragmentos
de ADN el uno con el otro o con otros fragmentos de ADN, por ejemplo
combinaciones de promotores, sitios de enlace represor o activador
y/o genes represores o activadores de un grupo de genes de
ansamicina, en particular del grupo de genes de rifamicina, con
genes estructurales extraños o combinaciones de genes estructurales
del grupo de genes de la ansamicina, especialmente el grupo de
genes de rifamicina, con promotores extraños; y combinaciones de
genes estructurales el uno con el otro o con fragmentos de genes que
codifican para los dominios activos enzimáticamente y son de
diversos sistemas de biosíntesis de la ansamicina. Los genes
estructurales extraños, y fragmentos de genes extraños que codifican
para los dominios activos enzimáticamente, código, por ejemplo, para
las proteínas implicadas en la biosíntesis de otras ansamicinas.
Un fragmento de ADN preferido esta directamente
o indirectamente implicado en el grupo de genes responsables de la
síntesis de rifamicina.
El grupo de genes o región de ADN descritas
arriba contiene, por ejemplo, los genes que codifican para las
enzimas individuales implicadas en la biosíntesis de ansamicinas y,
en particular, de rifamicina, y los elementos reguladores que
controlan la expresión de los genes de la biosíntesis. El tamaño de
tal grupos de genes de antibióticos se extiende desde
aproximadamente 10 kilobases (kb) hasta más de 100 kb. Los grupos de
genes normalmente comprenden genes reguladores específicos y genes
de resistencia del organismo productor para su propio antibiótico.
Ejemplos de que se entiende por enzimas o dominios activos
enzimáticamente implicados en esta biosíntesis son aquellas
necesarias para la síntesis, a partir de ácido
3-amino-5-hidrobenzóico,
las ansamicinas tal como rifamicina, por ejemplo poliquetido
sintasas, aciltransferasas, dehidratasas, cetoreductasas, proteínas
portadoras acil o cetoacil sintasas.
De esa manera, la secuencia completa del grupo
de genes mostrada en la SEQ ID NO 3, así como los fragmentos de ADN
que comprenden porciones de secuencias que codifica para un
poliquetido sintasa o un dominio activo enzimáticamente de estos,
son particularmente preferido. Ejemplos de tales fragmentos de ADN
preferidos son, por ejemplo, aquellos que codifican para una o más
de las proteínas y polipéptidos representados en la SEQ ID ID NOS
4, 5, 6, 7, 8 y 9, o derivados funcionales de estos, también que
incluyen secuencias parciales de estos que comprenden, por ejemplo,
15 o más nucleótidos consecutivos. Otras modalidades preferidas se
relacionan con la región de ADNs del grupo de genes de acuerdo con
la invención o los fragmentos de estos, similares a aquellos
presentes en los clones depositados pNE95, pRi44-2 y
pNE112, o derivados de ellos. Adicionalmente fragmentos de ADN
preferidos son aquellos que comprenden porciones de secuencias que
muestra homologías con las secuencias comprendidas por los clones
pNE95, pRi44-2 y/o pNE112 o con SEQ ID ID NOS 1 y/o
3, y por consiguiente puede ser utilizado como sonda de hibridación
dentro de un banco de genes genómicos de una ansamicina-, en
particular, el organismo que produce la rifamicina para encontrar
los constituyentes del grupo de genes correspondiente. El fragmento
de ADN puede además, por ejemplo, comprender exclusivamente el ADN
genómico. Un fragmento de ADN preferido particularmente es uno que
comprende la secuencia de nucleótido representada en la SEQ ID NO 1
o 3, o secuencias parciales de estos, que, por razón de las
homologías, puede ser considerado como equivalente estructural o
funcional para dicha secuencia o secuencia parcial de ellos, y que
por consiguiente son capaces de hibridizar con esta secuencia.
Los fragmentos de ADN de acuerdo con la
invención comprenden, por ejemplo, porciones de secuencia que
comprenden homologías con las enzimas
arriba-descritas, dominios de enzima o fragmentos de
estos.
El termino homologías y equivalentes estructural
y/o funcional se refiere primariamente al ADN y secuencias de
aminoácido con pocas o mínimas diferencias entre las secuencias
relevantes. Estas diferencias pueden tener muy diversas causas. De
esa manera, por ejemplo, esta puede demandar mutaciones o
diferencias cepa-específica que ocurren naturalmente
o son inducidas artificialmente. O las diferencias observadas de la
secuencia inicial se derivan de una modificación dirigida, que puede
ser introducida, por ejemplo, durante una síntesis química.
Las diferencias funcionales pueden ser
consideradas como mínimas si, por ejemplo, la secuencia de
nucleótido que codifica para un polipéptido, o una secuencia de
proteína tiene esencialmente las mismas propiedades características
como la secuencia inicial, tanto en relación a la actividad
enzimática, reactividad inmunológica o, en el caso de una secuencia
de nucleótido, a la regulación del gen.
Las diferencias estructurales pueden ser
consideradas como mínimas siempre y cuando exista un significante
traslapo o semejanza entre las diversas secuencias, o tengan al
menos propiedades físicas similares. La más reciente incluye, por
ejemplo, la movilidad electroforética, similitudes cromatográficas,
coeficientes de sedimentación, propiedades espectrofotométricas
etc.
En el caso de secuencias de nucleótido, el
consenso sería de al menos 70%, pero preferiblemente 80% y muy
particularmente preferiblemente 90% o más. En el caso de la
secuencia del aminoácido, las figuras correspondientes son al menos
50%, pero preferiblemente 60% y de manera particular preferiblemente
70%. El 90% de concordancia es muy particularmente preferido.
La invención adicionalmente se relaciona con un
método para la identificación, aislamiento y clonación de uno de los
fragmentos de ADN descritos arriba. Un método preferido comprende,
por ejemplo, las siguientes etapas:
a) configuración de un banco de genes
genómicos,
b) selección de este banco de genes con la ayuda
de las secuencias de ADN de acuerdo con la invención, y
c) aislamiento de los clones identificados como
positivos.
Un método general para la identificación de
fragmentos de ADN implicados en la biosíntesis de ansamicinas
comprende, por ejemplo, las siguientes etapas
a) La presencia de los fragmentos de ADN que
tienen homología con los genes poliquetido sintasa de acuerdo con la
invención se detecta en las cepas del microorganismo para ser
investigados por un experimento Southern con ADN cromosómico de esta
cepa. El tamaño de tales fragmentos de ADN homólogos se pueden
determinar por la digestión del ADN con una enzima de restricción
apropiada.
b) La producción de un banco de genes del
plásmido que comprende los fragmentos cromosómicos digeridos arriba.
Normalmente, los clones individuales de este banco de genes son
probados una vez más por homología con los genes del poliquetido
sintasa de acuerdo con la invención. Los clones con plásmidos
recombinantes que comprenden los fragmentos que tienen homología con
la sonda del poliquetido entonces normalmente son aislados con base
en esta homología.
a) Análisis de restricción de los plásmidos
recombinantes aislados y verificación de la identidad de estos
fragmentos clonados el uno con el otro.
b) Por un Southern cromosómico con ADN del
microorganismo original y el fragmento aislado de ADN como sonda
puede ser demostrado que el fragmento clonado es un fragmento de ADN
cromosómico original del microorganismo original.
c) Es posible como una opción demostrar una
homología significante del fragmento clonado de ADN con el ADN
cromosómico de otros productores de ansamicina (estreptovaricina,
tolipomicina, geldanamicina, ansamitocina). Esto confirmaría que el
ADN clonado es típico del grupo de genes de la biosíntesis de la
ansamicina y también de esta manera de la biosíntesis de la
rifamicina.
d) La secuenciación del ADN de un fragmento de
restricción interno y la demostración por análisis comparativo de
secuencias que la región clonada es una secuencia de ADN típica del
poliquetido sintasas, codificada para la biosíntesis de los
antibióticos poliquetidos a partir de actinomicetos.
a) Construcción de un banco de genes cósmido a
partir del microorganismo original y análisis de estos por homología
con los fragmentos aislados. Aislamiento de cósmidos que tienen
homología con este fragmento.
b) Demostración por análisis de restricción que
los clones del cósmido aislado comprenden una región de ADN del
microorganismo original que se traslapa con el fragmento
original.
Como se describe arriba, la primera etapa en el
aislamiento de los fragmentos de ADN de acuerdo con la invención es
normalmente la configuración de los bancos de genes genómicos a
partir del organismo de interés, que sintetiza la ansamicina
requerida, especialmente rifamicina.
El ADN genómico se puede obtener de un organismo
huésped de diversas maneras, por ejemplo por extracción de la
fracción nuclear y la purificación del ADN extraído por métodos
conocidos.
La fragmentación, que es necesaria por la
configuración de un banco de genes representativas, del ADN genómico
para ser clonado a un tamaño que es apropiado para la inserción en
un vector de clonación puede tener lugar tanto por cizallamiento
mecánico o bien, preferiblemente, por el corte con apropiadas
enzimas de restricción.
Los vectores de clonación apropiados, que están
ya en el uso rutinario para producir bibliotecas genómicas de genes,
comprenden, por ejemplo, vectores cósmido, vectores plásmido o
vectores fago.
Entonces es posible en un programa de selección
para obtener clones apropiados que comprende el(los)
gen(s) requeridos o fragmento(s) de gen a partir de
las bibliotecas de genes producida de esta manera.
Una posibilidad para la identificación de la
región de ADN requerida consiste en, por ejemplo, utilizar el banco
de genes descrito arriba para transformar las cepas que, porque un
camino sintético bloqueado, no pueden producir las ansamicinas, y la
identificación de aquellos clones que puedan otra vez después de la
transformación producir la ansamicina (revertidos). Los vectores que
dirigen a los revertidos comprenden un fragmento de ADN que se
requiere en la síntesis de la ansamicina.
Otra posibilidad para la identificación de la
región de ADN requerida se basa, por ejemplo, en utilizar apropiadas
moléculas sonda (sonda de ADN) que se obtienen por ejemplo como se
describe anteriormente. Varios métodos estándar están disponibles
para la identificación de clones apropiados, tales como hibridación
diferencial de colonias o hibridación de calvas.
Es posible utilizar como molécula sonda un
fragmento previamente aislado de ADN a partir del mismo o un gen
relacionado estructuralmente o de un grupo de genes que, debido a
las homologías presentes, pueda hibridizar con la sección
correspondiente de la secuencia dentro del gen grupo de genes
requeridos para ser identificado. Preferiblemente utilizando como
molécula sonda para el propósito de la presente invención es un
fragmento de ADN obtenible de un gen o una secuencia de ADN
implicados en la síntesis de poliquetidos tales como ansamicinas o
sorafenos.
Si la secuencia del nucleótido del gen para ser
aislado, o al menos partes de esta secuencia, se conocen, es posible
en una modalidad alternativa para utilizar, basado en esta
información de la secuencia, una secuencia de ADN sintetizada
correspondiente para las hibridaciones o amplificaciones PCR.
Con el fin de facilitar detección del gen
requerido o bien partes de un gen requerido, una de las moléculas
sonda del ADN descritas arriba puede ser marcada con un apropiado
grupo, fácilmente detectable. Un grupo detectable para el propósito
de esta invención significa cualquier material que tiene una
propiedad física o química particular, fácilmente identificable.
Particular mención se puede hacer en este punto
de los grupos activos enzimáticamente tal como enzimas, sustratos de
enzimas, coenzimas e inhibidores de enzimas, adicionalmente agentes
fluorescentes y luminescentes, cromóforos y radioisótopos tal como
3H, 35S, 32P, 125I y 14C. La detección fácil de estos marcadores se
basa, por una parte, en sus propiedades físicas intrínsecas (por
ejemplo marcadores fluorescentes, cromóforos, radioisótopos) o, por
otra parte, en sus propiedades de reacción y de enlace (por ejemplo
enzimas, sustratos, coenzimas, inhibidores). Materiales de estos
tipos ya son ampliamente utilizados en particular en inmunoensayos
y, en más casos, también pueden ser utilizados en la presente
aplicación.
Los métodos generales relacionados con la
hibridación del ADN se describen, por ejemplo, por Maniatis T. et
al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1982).
Aquellos clones dentro de las bibliotecas de
genes previamente descritas que se pueden hibridizar con una
molécula sonda y que pueden ser identificadas por uno de los métodos
de detección arriba mencionados entonces pueden ser además
analizados con el fin de determinar la extensión y naturaleza de la
secuencia codificante en detalle.
Un método alternativo para la identificación de
los genes clonados se basa en la construcción de una genoteca que
consiste de vectores plásmido o de expresión. Esto conlleva, en
analogía a los métodos descritos previamente, el ADN genómico que
comprende el gen requerido que es inicialmente aislado y luego
clonado en un apropiado vector plásmido de expresión. Las
bibliotecas de genes producidas de esta manera luego se pueden
seleccionar por apropiados procedimientos, por ejemplo por el uso de
estudios de complementación, y aquellos clones que comprenden el gen
requerido o bien al menos una parte de este gen como inserto pueden
ser seleccionados.
Es posible de esta manera con la ayuda de los
métodos descritos arriba para aislar un gen, varios genes o un grupo
de genes que codifican para uno o más productos de genes
particulares.
Para una caracterización adicional, la secuencia
de ADNs purificados y aislados de la manera descrita arriba se
sometió a un análisis de restricción y análisis de secuencia.
Para el análisis de secuencias, los fragmentos
previamente aislados de ADN primero son fragmentados utilizando
enzimas de restricción apropiadas, y luego se clonan en vectores de
clonación apropiados. Con el fin de evitar errores en la
secuenciación, es ventajoso secuenciar ambas hebras de ADN
completamente.
Varias alternativas están disponibles para el
análisis del fragmento clonado de ADN en consideración con su
función dentro de la biosíntesis de la ansamicina.
De esa manera, por ejemplo, es posible en los
experimentos de complementación con mutantes defectuosos no solo
para establecer complicidad en principio de un gen o fragmento de
gen en la biosíntesis del metabolito secundario, pero también
verificar específicamente la etapa sintética en la cual dicho
fragmento de ADN es implicado.
En un tipo de análisis alternativo, la evidencia
se obtiene exactamente de manera opuesta. La transferencia de
plásmidos que comprenden las secciones de ADN que tienen homologías
con secciones apropiadas en el genoma resulta en la integración de
dichas secciones de ADN homólogas vía recombinación de homólogos.
Si, como en el presente caso, la sección de ADN homóloga es una
región dentro de un marco de lectura abierto del grupo de genes, la
integración del plásmido resulta en la inactivación de este gen por
la así llamada interrupción génica y, por consiguiente, en una
interrupción en la producción de un metabolito secundario. Se asume
de acuerdo con el conocimiento actual que una región de homólogos
que comprende al menos 100 bp, pero preferiblemente más de 1000 bp,
es suficiente para traer aproximadamente el evento de recombinación
requerido.
Sin embargo, una región de homólogos que
extiende sobre un rango desde 0.3 a 4 kb, pero en particular, se
prefiere sobre un rango desde 1 a 3 kb.
Para preparar los plásmidos apropiados que
tienen suficiente homología para la integración vía recombinación de
homólogos existe preferiblemente la provisión de una etapa de
subclonación en la cual el ADN previamente aislado se digiere, y los
fragmentos de tamaño apropiado se aíslan y clonan subsecuentemente
en un plásmido apropiado. Ejemplos de plásmidos apropiados son los
plásmidos generalmente utilizados para manipulaciones genéticas en
estreptomicetos o E. coli.
Es posible en principio utilizar para la
preparación y multiplicación de las construcciones previamente
descritas todos los vectores de clonación convencionales tales como
vectores plásmido o bacteriófago siempre y cuando ellos tengan
secuencias de replicación y control derivadas de especies
compatibles con la célula huésped.
El vector de clonación usualmente tiene un
origen de replicación más genes específicos que resultan en
características de selección fenotípicas en la célula huésped
transformada, en particular resistencias a antibióticos. Los
vectores transformados se pueden seleccionar con base en estos
marcadores fenotípicos después de la transformación en una célula
huésped.
Los marcadores fenotípicos seleccionables que se
pueden utilizar para el propósito de esta invención comprende, por
ejemplo, sin esto representar una limitación del contenido de la
invención, resistencias al tiostrepton, ampicilina, tetraciclina,
cloramfenicol, higromicina, G418, kanamicina, neomicina y
bleomicina. Otro marcador seleccionable puede ser, por ejemplo,
prototrofia para aminoácidos particulares.
Principalmente preferidos para el propósito de
la presente invención son plásmidos de estreptomicetos y E.
coli, por ejemplo los plásmidos utilizados para el propósito de
la presente invención.
Las células huésped apropiadas primariamente
para la clonación previamente descrita para el propósito de esta
invención son procariotas, que incluyen huéspedes bacterianos tal
como estreptomicetos, actinomicetos, E. coli o
pseudomonas.
\newpage
Huépedes E. coli son particularmente
preferidos, por ejemplo la cepa E. coli HB101 o
X-1 blue MR® (Stratagene) o streptomyces tal como
las cepas libres de plásmido de Streptomyces lividans TK23 y
TK24.
Las células competentes de la cepa E.
coli HB101 se producen por los métodos normalmente utilizados
para la transformación E. coli. El método de transformación
de Hopwood et al. (Genetic manipulation of streptomyces a
laboratory manual. The John Innes Foundation, Norwich (1985)) es
normalmente utilizado para streptomyces.
Después de la transformación y la subsecuente
incubación en un medio apropiado, las colonias resultantes se
sometieron a una selección diferencial por la siembra en placa en un
medio selectivo. Entonces es posible aislar el ADN del plásmido
apropiado de aquellas colonias que contienen plásmidos con
fragmentos de ADN clonado.
El fragmento de ADN de acuerdo con la invención,
que comprende una región de ADN que esta implicada directamente o
indirectamente en la biosíntesis de la ansamicina y puede ser
obtenida de la manera previamente descrita de la biosíntesis del
grupo de genes de la ansamicina, también se puede utilizar como clon
iniciador para la identificación y aislamiento de otra región
adyacente de ADNs traslapando con este a partir de dicho grupo de
genes.
Esto se puede lograr, por ejemplo, realizando un
así llamado paseo cromosómico dentro de una genoteca que consiste de
los fragmentos de ADN con mutuamente traslapando la región de ADNs,
para utilizar el fragmento previamente aislado de ADN o bien, en
particular, las secuencias localizadas en sus márgenes 5' y 3'. Los
procedimientos para el paseo cromosómico se conocen por alguien de
habilidad en este oficio. Los detalles se pueden encontrar, por
ejemplo, en las publicaciones por Smith et al. (Methods
Enzymol (1987), 151, 461-489) y Wahl et
al. (Proc Natl. Acad. Sci, USA (1987), 84,
2160-2164).
El prerrequisito para el paseo cromosómico es la
presencia de clones que tienen fragmentos de ADN coherentes que
siempre y cuando son posible y mutuamente traslapados dentro de una
genoteca, y un clon iniciador apropiado que comprende un fragmento
que se localiza en la adyacencia o bien, preferiblemente, dentro de
la región para ser analizada. Si la localización exacta del clon
iniciador es desconocida, el paseo preferiblemente se realiza en
ambas direcciones.
El inicio real de la etapa de paseo utiliza el
clon iniciador identificado y aislado como sonda en una de las
reacciones de hibridación previamente descritas con el fin de
detectar los clones adyacentes que tengan regiones traslapando con
el clon iniciador. Es posible mediante el análisis de hibridación
establecer que fragmento proyecta más lejos sobre la región
traslapada. Luego este es utilizado como clon inicial para la
segunda etapa del paseo, en este caso hay un establecimiento del
fragmento que se traslapa con dicho segundo clon en la misma
dirección. La progresión continua de esta manera en el cromosoma
resulta en una colección de clones de ADN traslapados que cubren una
gran región de ADN. Estos entonces pueden, cuando sea apropiado
después de una o más etapas de subclonación, ser ligados juntos por
métodos conocidos para dar un fragmento que comprende partes o bien,
preferiblemente todos los constituyentes esencial para la
biosíntesis de la ansamicina.
La reacción de hibridación para establecer los
clones con las regiones marginales traslapadas preferiblemente no
hace uso del fragmento completo muy grande y difícil de manejar
pero, en su lugar, un fragmento parcial de la región marginal
izquierda o derecha, que puede ser obtenida por una etapa de
subclonación. Debido al tamaño más pequeño de dicho fragmento
parcial, la reacción de hibridación da lugar a pocas señales de
hibridación positivas, así que el esfuerzo analítico es claramente
menos que en el uso del fragmento completo. Es adicionalmente
recomendable caracterizar el fragmento parcial en detalle con el fin
de imposibilitar sus cantidades más grandes que comprende de
secuencias repetitivas, que se pueden distribuir sobre el genoma
total y de esta manera impedirían grandemente una secuencia dirigida
de las etapas del paseo.
Puesto que el grupo de genes responsable de la
biosíntesis de la ansamicina cubre una región relativamente grande
del genoma, puede también ser ventajosa realizar una así llamado
paseo de etapa grande o paseo de cósmido. Es posible en estos casos,
utilizando los vectores cósmido que permiten la clonación de los
fragmentos de ADN muy grandes, para cubrir una región de ADN muy
grande, que puede contener hasta 42 kb, en una sola etapa del
paseo.
En una posible modalidad de la presente
invención, por ejemplo, construir un banco de genes cósmido a partir
de estreptomicetos o actinomicetos, el ADN completo se aísla con el
tamaño de los fragmentos de ADN que son del orden
de aproximadamente 100 kb, y posteriormente se digiere parcialmente con las endonucleasas de restricción apropiadas.
de aproximadamente 100 kb, y posteriormente se digiere parcialmente con las endonucleasas de restricción apropiadas.
El ADN digerido luego se extrae en una manera
convencional con el fin de retirar la endonucleasa que está aún
presente, y se precipita y finalmente concentra. El fragmento
resultante concentrado luego se fracciona, por ejemplo por
centrifugación gradiente de densidad, de acuerdo con el tamaño de
los fragmentos individuales. Después de que las fracciones
obtenibles de esta manera han sido dializadas, ellas pueden ser
analizadas sobre un gel de agarosa. Las fracciones que contienen
fragmentos de apropiado tamaño son combinadas y concentradas para un
procedimiento adicional. Los fragmentos para ser considerados como
particularmente apropiados para el propósito de esta invención
tienen un tamaño del orden de 30 kb a 42 kb, pero preferiblemente de
35 kb a 40 kb.
En paralelo con la fragmentación descrita
arriba, o más tarde, por ejemplo un vector cósmido apropiado pWE15®
(Stratagene) se digiere completamente con una apropiada enzima de
restricción, por ejemplo BamHI, para la posterior reacción de
ligasa.
La unión del ADN del cósmido a los fragmentos de
los streptomyces o actinomicetos que han sido fraccionados de
acuerdo con su tamaño se puede realizar utilizando una ligasa del
ADN T4. La mezcla de unión obtenible de esta manera es, después de
un tiempo suficiente de incubación, empacada en los fagos\lambda
por métodos conocidos generalmente.
Las partículas fago resultantes luego se
utilizan para infectar una apropiada cepa huésped. Se prefiere una
cepa recA- E. coli, tal como E. coli HB101 o
X-1 Blue® (Stratagene). La selección de clones
transfectados y el aislamiento del plásmido ADN se puede realizar
por métodos conocidos generalmente.
La selección del banco de genes para los
fragmentos de ADN que son implicados en la biosíntesis de la
ansamicina se realiza, por ejemplo, para utilizar una sonda de
hibridación específica que se asume (por ejemplo con base en la
secuencia de ADN o la homología del ADN o pruebas de complementación
o interrupción génica o la función de estos en otros organismos)
para comprender la región de ADNs a partir del "grupo de genes de
la ansamicina".
Un plásmido que comprende un fragmento adicional
del tamaño requerido o ha sido identificado con base en las
hibridaciones entonces se puede aislar a partir del gel de la manera
previamente descrita. La identidad de este fragmento adicional con
el fragmento requerido del cósmido seleccionado previamente luego
puede ser confirmada por la transferencia e hibridación
Southern.
El análisis de la función de los fragmentos de
ADN aislado de esta manera se puede realizar en un experimento de
interrupción génica como se describe anteriormente.
Otro uso posible de los fragmentos de ADN de
acuerdo con la invención es modificar o inactivar las enzimas o los
dominios implicados en ansamicina y, en particular, la biosíntesis
de la rifamicina, o sintetizar los oligonucleótidos que luego son a
su vez utilizadas para encontrar las secuencias homólogas en la
amplificación PCR.
Además los fragmentos de ADN de acuerdo con la
invención como tal, también reivindicado son su uso en primer lugar
para la producción de la rifamicina, análogos de rifamicina o
precursores de estos, y para la producción biosintética de
ansamicinas novedosas o de precursores de estos. Incluidas a este
respecto son aquellas moléculas en las cuales el puente alifático se
conecta solamente al Terminal con el núcleo aromático.
Los fragmentos de ADN de acuerdo con la
invención permiten, por ejemplo, por combinación con los fragmentos
de ADN a partir de otros caminos biosintéticos o por la inactivación
o modificación de estos, la biosíntesis de los compuestos híbridos
novedosos, particularmente de las ansamicinas novedosas o de los
análogos de rifamicina. Las etapas necesarias para esto son
conocidos generalmente y se describen, por ejemplo, en Hopwood,
Current Opinion in Biotechnol. (1993), 4,
531-537.
La invención adicionalmente se relaciona con el
uso de los fragmentos de ADN de acuerdo con la invención para
realizar la tecnología novedosa de biosíntesis combinatoria para la
producción biosintética de las bibliotecas de poliquetido sintasas
basada en los genes de la biosíntesis de la rifamicina y de la
ansamicina. Si, por ejemplo, varios conjuntos de modificaciones se
producen, es posible de esta manera producir, por medio de la
biosíntesis, una genoteca de poliquetidos, por ejemplo ansamicinas o
análogos de rifamicina, que luego necesita ser probada solamente por
la actividad de los compuestos producidos de esta manera. Las etapas
necesarias para esto se conocen generalmente y se describen, por
ejemplo, en Tsoi y Khosla, Chemistry & Biology (1995), 2,
355-362 y WO-9508548.
Además el fragmento de ADN como tal, también
reivindicado es su uso para la construcción genética de las cepas de
actinomicetos mutados a partir del cual la rifamicina natural o la
biosíntesis del grupo de genes de la ansamicina en el cromosoma ha
sido parcialmente o completamente suprimido, y que puede de esta
manera ser utilizado para la expresión genéticamente modificada de
la biosíntesis de los grupos de genes de la ansamicina o de la
rifamicina.
La invención adicionalmente se relaciona con un
vector híbrido que comprende al menos un fragmento de ADN de acuerdo
con la invención, por ejemplo un sitio de enlace promotor, un
represor o activador, un gen represor o activador, un gen
estructural, de terminación o funcional parte de estos. El vector
híbrido comprende, por ejemplo, una expresión casete que comprende
un fragmento de ADN de acuerdo con la invención que es capaz de
expresar una o más proteínas implicadas en la biosíntesis de la
ansamicina y, en particular en la biosíntesis de la rifamicina, o un
fragmento funcional de estos. La invención igualmente se relaciona
con un organismo huésped que comprende el vector híbrido descrito
arriba.
Los vectores apropiados que representan el punto
inicial de los vectores híbridos de acuerdo con la invención, y
organismos huéspedes apropiados tal como células bacterianas o
levaduras son conocidos generalmente.
El organismo huésped puede ser transformado
generalmente por métodos convencionales tal como por medio de
protoplastos, Ca2+, Cs+, polietilen glicol, electroporación, virus,
vesículas lipídicas o una pistola de partícula. Los fragmentos de
ADN de acuerdo con la invención luego pueden estar presentes ambos
como constituyentes extracromosómico en el organismo huésped e
integrados vía las secciones de secuencia apropiadas dentro del
cromosoma del organismo huésped.
\newpage
La invención igualmente se relaciona con
poliquetido sintasas que comprende los fragmentos de ADN de acuerdo
con la invención, en particular aquellos a partir del
Amycolatopsis mediterranei los cuales son implicados
directamente o indirectamente en la síntesis de rifamicina, y
constituyentes funcionales de estos, por ejemplo dominios activos
enzimáticamente.
La invención adicionalmente se relaciona con una
sonda de hibridación que comprende un fragmento de ADN de acuerdo
con la invención, y para el uso de estos, en particular para la
identificación de los fragmentos de ADN implicados en la biosíntesis
de ansamicinas.
Con el fin de obtener señales sin ambigüedad en
la hibridación, el ADN unido al filtro (por ejemplo hecho de nylon o
nitrocelulosa) normalmente se lava a 55-65ºC en 0.2
x SSC (1 x SSC = cloruro de sodio 0.15 M, citrato de sodio 15
mM).
Técnicas genéticas moleculares generales tal
como aislamiento y purificación de ADN, digestión con restricción
del ADN, electroforesis en gel de agarosa del ADN, unión de los
fragmentos de restricción, cultivo y transformación de E.
coli, aislamiento del plásmido a partir del E. coli, se
realizan según se describe en Maniatis et al., Molecular
Cloning: A laboratory manual, 1 st Edit. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1982).
Condiciones del cultivo y las técnicas genéticas
moleculares con A. mediterranei y otros actinomicetos
son como se describe por Hopwood et al. (Genetic manipulation
of streptomyces a laboratory manual, The John Innes Foundation,
Norwich, 1985). Todos los cultivos líquidos de A.
mediterranei y otros actinomicetos se realizan en frascos
Erlenmeyer a 28ºC en un agitador a 250 rpm.
LB Maniatis et al., Molecular Cloning: A
laboratory manual, 1 st Edit. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor NY (1982)
NL148 Schupp + Divers FEMS Microbiology Lett.
36, 159-162 (1986) (NL148 = NL148G sin
glicina)
R2YE Hopwood et al. (Genetic manipulation
de streptomyces a laboratory manual. The John Innes Foundation,
Norwich, 1985)
\vskip1.000000\baselineskip
TB:
12 g/l triptona Bacto
24 g/l extracto de levaduras Bacto
4 ml/l glicerol
\vskip1.000000\baselineskip
Para obtener ADN genómico del A.
mediterranei, las células de la cepa A. mediterranei
wt3136 (= LBGA 3136, colección de cepas ETH) se cultivaron en medio
NL148 por 48 horas. 1 ml de este cultivo luego se transfiere dentro
de 50 ml del medio NL148 (+ 2.5 g/l glicina) en un frasco Erlenmeyer
de 200 ml, y el cultivo se incuba por 48 h. Las células se retiran
del medio por centrifugación a 3000 g por 10 min. y se resuspenden
en 5 ml de SET (NaCl 75 mM, EDTA 25 mM, Tris 20 mM, pH 7.5). El ADN
de alto peso molecular se extrae por el método de Pospiech y Neumann
(Trends in Genetics (1995), 11, 217-218).
Con el fin de detectar, por una transferencia
Southern, los fragmentos individuales del ADN del A.
mediterranei aislado que tengan homología con genes del
poliquetido sintasa, una sonda de ADN radioactiva se prepara de un
conocido grupo de genes del poliquetido sintasa. Para hacer esto, el
fragmento PvuI 3.8 kb en tamaño se aísla del plásmido recombinante
p98/1 (Schupp et al. J. of Bacteriol. (1995), 177,
3673-3679), que comprende una región de ADN,
aproximadamente 32 kb en tamaño, del poliquetido sintasa para el
antibiótico sorafeno A. Aproximadamente 0.5 \mug del fragmento de
ADN aislado PvuI 3.8 kb se radiomarca con
^{32}P-d-CTP por el sistema
translación de mella del Gibco/BRL (Basle) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
\newpage
Para la transferencia Southern, aproximadamente
2 \mug del ADN genómico aislado anteriormente del A.
mediterranei se digieren completamente con la enzima de
restricción BglII (Böhringer, Mannheim), y los fragmentos
resultantes se fraccionan en un gel de agarosa 0.8%. Una
transferencia Southern con este gel de agarosa y la sonda de ADN
aislado anteriormente (fragmento PvuI 3.8 kb) detecta un fragmento
BglII-cut de ADN que es aproximadamente 13 kb en
tamaño del ADN genómico de A. mediterranei, y que tiene
homología con la sonda de ADN utilizada. Se puede concluir con base
en esta homología que el fragmento de ADN detectado a partir del
A. mediterranei es una región genética que codifica para un
poliquetido sintasa y de esta manera se implica en la síntesis de un
antibiótico poliquetido.
El vector de selección E. coli positivo
pIJ4642 (derivado del pIJ666, Kieser & Melton, Gene (1988), 65,
83-91) desarrollado en el John Innes Centre
(Norwich, UK) se utiliza para producir el banco de genes del
plásmido. Este plásmido primero se corta con BamHI, y los dos
fragmentos resultantes se fraccionan en un gel de agarosa. El más
pequeño de los dos fragmentos es el fragmento relleno del vector y
cuanto más grande es la porción del vector que, en una
misma-unión después de la deleción del fragmento
relleno, forma, debido a las secuencias terminación fd flanqueantes,
a palíndromo perfecto, que significa que el plásmido no se puede
obtener como tal en E. coli. Esta porción del vector 3.8 kb
en tamaño se aísla del gel de agarosa por electroelución según lo
descrito en la página 164-165 de Maniatis et
al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 1 st Edit. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1982).
Para preparar los fragmentos de ADN
BglII-cut a partir del A. mediterranei, se
utiliza, el ADN genómico de alto peso molecular preparado en el
Ejemplo 1. Aproximadamente 10 \mug de este ADN completamente se
digieren con la enzima de restricción BglII y posteriormente se
fracciona en un gel de agarosa 0.8%. Los fragmentos de ADN con un
tamaño de aproximadamente 12-16 kb se cortan del gel
y separan del bloque del gel por electroelución (ver arriba).
Aproximadamente 1 \mug de los fragmentos aislados BglII de esta
manera se ligan a aproximadamente 0.1 \mug de la porción BamHI,
aislada arriba, del vector pIJ4642. La mezcla de unión obtenida de
esta manera luego se transforma en la cepa E. coli HB101
(Stratagene). Aproximadamente 150 colonias transformadas se
seleccionan de la mezcla de transformación sobre agar LB con 30
\mug por ml de cloramfenicol. Estas colonias contienen plásmidos
recombinantes con fragmentos de ADN genómicos BglIIcut del A.
mediterranei en un rango de tamaño de 12-16
kb.
150 clones del plásmido preparados en el Ejemplo
2 son analizados por hibridación de la colonia utilizando un filtro
de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell) según lo descrito en las
páginas 318-319 de Maniatis et al., Molecular
Cloning: A laboratory manual, 1st Edit. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1982). La sonda de ADN
utilizada es el fragmento PvuI 3.8 kb, radiomarcado con
^{32}P-d-CTP y aislado en el
Ejemplo 1, del plásmido p98/1. Los plásmidos se aíslan de 5 clones
del plásmido que muestran una señal de hibridación, y se
caracterizan por dos digestiones de restricción con las enzimas
HindIII o KpnI. La HindIII corta dos veces en la porción del vector
de los clones, 0.3 kb a la derecha e izquierda del sitio de división
BamHI en el cual el ADN del A. mediterranei se ha integrado.
KpnI no corta dentro de la porción del vector pIJ 4642. Este
análisis de restricción muestra que los clones investigados
comprenden ambos fragmentos HindIII idénticos de aproximadamente 14
y 3.1 kb y fragmentos KpnI idéntico de aproximadamente 11.4 kb y 5.7
kb en tamaño. Esto muestra que estos clones comprenden el mismo
fragmento BglII genómico de A. mediterranei, y que el último
tiene un tamaño de aproximadamente 13 kb. Adicionalmente se puede
concluir de este análisis de restricción que este fragmento clonado
BglII no tiene sitio de división interno HindIII, pero tiene 2
sitios de división KpnI que ofrecen un fragmento interno KpnI 5.7 kb
en tamaño.
El plásmido ADN de los 5 clones de arriba con
fragmentos de restricción idénticos adelante se caracteriza por una
transferencia Southern. Para este propósito, los plásmidos se cortan
con HindIII y KpnI, y la sonda de ADN utilizada es el fragmento del
plásmido ^{32}P-radiomarcado 3.8 kb PvuI p98/1
utilizado arriba. Este experimento confirma que los 5 plásmidos
contienen fragmentos de ADN idénticos del A. mediterranei y
que estos tienen significante homología con la sonda del ADN que es
característica de los genes bacterianos del poliquetido sintasa.
Además, la transferencia Southern muestra que el fragmento interno
KpnI 5.7 kb en tamaño igualmente tiene significante homología con la
sonda de ADN utilizada. El plásmido llamado pRi7-3
se selecciona de los 5 plásmidos para un procedimiento
posterior.
posterior.
Para demostrar que el fragmento clonado BglII
aproximadamente 13 kb en tamaño del A. mediterranei es un
fragmento de ADN cromosómico original, otra transferencia Southern
se realiza. El ADN cromosómico del A. mediterranei que se ha
cortado con BglII, KpnI o BamHI se emplea en esta transferencia. Dos
fragmentos BamHI que son aproximadamente 1.8 y 1.9 kb en tamaño y
están presentes en el fragmento 5.7 kb KpnI de
pRi7-3 se utilizan como sonda de ADN radiomarcada.
Este experimento confirma que el fragmento de ADN BglII
aproximadamente 13 kb en tamaño clonado en el plásmido recombinante
pRi7-3 es un fragmento de ADN genómico auténtico del
A. mediterranei. Además, este experimento confirma que el
fragmento clonado comprende un fragmento interno KpnI 5.7 kb en
tamaño y dos fragmentos BamHI aproximadamente 1.8 y 1.9 kb en
tamaño, y que estos fragmentos de ADN son igualmente fragmentos de
ADN genómicos auténticos del A. mediterranei.
La demostración de una significante homología
entre la región de ADN cromosómico clonado de A. mediterranei
y ADN cromosómico de otros actinomicetos que producen ansamicina
toma lugar por un experimento de transferencia Southern. Las
siguientes cepas que producen ansamicina son empleadas para este
propósito (las ansamicinas producidas por la cepas están en
paréntesis): Streptomyces spectabilis (streptovaricins),
Streptomyces tolypophorus (tolypomicinas), Streptomyces
hygroscopicus (geldanamicinas), Nocardia especies
ATCC31281 (ansamitocins). El ADN genómico de estas cepas se aísla
según lo descrito para A. mediterranei en el Ejemplo 1 y se
digieren con la enzima de restricción KpnI, y los fragmentos de
restricción obtenidos de esta manera se fraccionan en un gel de
agarosa para la transferencia Southern. Dos fragmentos BamHI
aproximadamente 1.8 y 1.9 kb en tamaño del A. mediterranei,
que se utilizan en el Ejemplo 3 y se aíslan del plásmido
pRi7-3, se utilizan como sonda radioactiva. Este
experimento muestra que estos cepas que producen ansamicina tienen
una significante homología del ADN con la sonda de ADN utilizada y
de esta manera con la región cromosómica clonada de A.
mediterranei. Debe ser observado a este respecto que la
homología en el caso de productores de ansamicinas con un sistema de
anillo de naftoquinona (estreptovaricina, tolipomicina) es mayor que
en el caso de aquellas con un sistema de anillo benzoquinoide
(geldanamicina, ansamitocin). Este resultado sugiere que la región
de ADN cromosómico clonado del A. mediterranei es típica de
la biosíntesis de los grupos de genes de la ansamicina y,
especialmente, de los grupos de genes para ansamicinas con sistemas
de anillo de naftoquinona, correspondiente al sistema de anillo en
rifamicinas.
Para la secuenciación, el fragmento KpnI 5.7 kb
se aísla del plásmido pRi7-3 (DSM 11114) (Maniatis
et. al. 1992) y se subclona dentro del sitio de división KpnI
del vector pBRKanf4, que es apropiado para la secuenciación del ADN,
suministrando los plásmidos pTS004 y pTS005. El vector pBRKanf4
(derivado del pBRKanf1; Bhat, Gene (1993) 134,
83-87) es apropiado para introducir deleciones
secuenciales de los fragmentos Sau3A en el fragmento clonado
inserto, porque este vector no tiene por si mismo una secuencia de
nucleótido GATC. Además, los fragmentos BamHI 1.9 y 1.8 kb en tamaño
presentes en el fragmento 5.7 kb KpnI se subclonan en el sitio de
división BamHI de pBRKanf4, los plásmidos resultantes pTS006 y
pTS007, y pTS008 y pTS009, respectivamente.
Para preparar los subclones secuencialmente
truncados por los fragmentos Sau3A para la secuenciación del ADN,
los plásmidos pTS004 a pTS009 parcialmente se digieren con Sau3A y
se digieren completamente con XbaI o HindIII (un sitio de división
en la región de clonación múltiple del vector). El ADN obtenido de
esta manera (que consiste del vector linealizado con fragmentos
insertados del ADN truncado por los fragmentos Sau3A) se rellena en
los terminales utilizando polimerasa Klenow (el fragmento de
polimerasa I, ver Maniatis et al. las páginas
113-114), ligado así mismo con ligasa del ADN T4 y
transformado en el DH5\alpha del E. coli. El plásmido ADN
el cual corresponde a los plásmidos pTS004 a pTS009, pero tiene la
región de ADNs, que se truncan de un lado por los fragmentos Sau3A,
de los fragmentos integrados originales del A. mediterranei,
se aísla a partir de los clones transformados individuales obtenidos
de esta manera.
La secuenciación del ADN se realiza con los
plásmidos obtenidos de esta manera y con pTS004 a pTS009 utilizando
el kit de reacción de Perkin-Elmer/Applied
Biosystems con reactivos de terminación marcado de tinta (Kit Nº
402122) y un cebador universal o un cebador T7. Un protocolo del
ciclo secuenciación estándar con un termociclizador (MJ Research ADN
Engine Thermocycler, Model 225) se utiliza, y las reacciones de
secuenciación se analizan por el Applied Biosystems automatic ADN
sequencer (Modell 373 o 377) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Para analizar los resultados, se emplean los siguientes
programas de ordenador (software): Applied Biosystems ADN analysis
software, Unix Solaris CDE software, ADN assembly and analysis
package GAP licensed from R. Staden (Nucleic Acid Research
(1995)23, 1406-1410) y Blast (NCBI).
Los métodos descritos arriba pueden ser
utilizados para la secuencia completamente ambas cadenas de ADN del
fragmento KpnI 5.7 kb de la cepa wt3136 del A. mediterranei.
La secuencia de ADN del fragmento 5.7 kb con una longitud de 5676
pares de bases se representa en la SEQ ID NO 1.
La secuencia de nucleótido del fragmento KpnI
5.7 kb se analiza para utilizar el programa de ordenador
Codonpreference (Genetics Computer Group, University de Wisconsin,
1994). Este análisis muestra que este fragmento es sobre su longitud
completa de una región de proteína-codificada y de
esta manera forma parte de un amplio marco de lectura abierto (ORF).
Los codones utilizados en esta ORF son típicos de los genes
estreptomicetos y actinomicetos. La secuencia de aminoácido derivada
de la secuencia de ADN a partir de esta ORF se representa en la SEQ
ID NO 2.
El Poliquetido sintasas para los antibióticos
macrólidos (tal como eritromicina, rapamicina) son proteínas
multifuncionales muy grandes que comprenden varios dominios activos
enzimáticamente que ahora son caracterizadas (Hopwood und Khosla,
Ciba Foundation Symposium (1992), 171, 88-112;
Donadio y Katz, Gene (1992), 111, 51-60; Schwecke
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1995) 92 (17),
7839-7843). La comparación de la secuencia de
aminoácido representada en la SEQ ID NO 2 con el del poliquetido
sintasa de la eritromicina muy bien-caracterizado,
eryA ORF1 (Donadio, Science, (1991) 252, 675-679,
secuencia de ADN gen/EMBL acceso NO M63676) da los siguientes
resultados:
Región de la SEQ ID NO 2: aminoácidos
2-325: es 40% idéntico al dominio
aciltransferasa del módulo 2 del locus eryA de
Saccharopolyspora erythraea.
Región de la SEQ ID NO 2: aminoácidos
325-470: es 43% idéntico al dominio dehidratasa
del módulo 4 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de la SEQ ID NO 2: aminoácidos
762-940: es 48% idéntico al dominio
ketoreductasa del módulo 2 del eryA locus de
Saccharopolyspora erythraea.
Región de la SEQ ID NO 2: aminoácidos
1024-1109: es 57% idéntico al dominio de la
proteína transportadora del grupo acilo del módulo 2 del locus
eryA de Saccharopolyspora erythraea.
Región de la SEQ ID NO 2: aminoácidos
1126-1584: es 59% idéntico al dominio cetoacil
sintasa del módulo 1 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Las semejanzas muy grandes encontradas en la
secuencia de aminoácido y en el tamaño y la configuración de los
dominios enzimáticos sugieren que la región KpnI clonada 5.7 kb en
tamaño del A. mediterranei codificado por parte de un
poliquetido sintasa que es típico de los poliquetidos del tipo
macrólido.
El vector cósmido empleado es el plásmido pWE15
que puede ser comprado (Stratagene, La Jolla, CA, USA). El pWE15 se
corta completamente con la enzima BamHI (Maniatis et al.
1989) y se precipita con etanol. Para la unión al ADN del cósmido,
el ADN cromosómico del A. mediterranei se aísla según lo
descrito en el Ejemplo 1 y parcialmente se digiere con la enzima de
restricción Sau3A (Böhringer, Mannheim) para formar los fragmentos
de ADN la mayor parte que tienen un tamaño de 20-40
kb. El ADN pretratado de esta manera se fracciona por tamaño del
fragmento mediante centrifugación (83,000 g, 20ºC) en un gradiente
de densidad 10% a 40% de sacarosa por 18 h. El gradiente se
fracciona en alícuotas de 0.5 ml y se dializan, y muestras de 10
\mul se analizan en un gel de agarosa 0.3% con ADN de tamaño
estándar. La fracciones con ADN cromosómico 25-40 kb
en tamaño se combinan, se precipitan con etanol y resuspenden en un
pequeño volumen de agua.
La unión del ADN del cósmido a los fragmentos
Sau3A del A. mediterranei aislados de acuerdo con su tamaño
(ver arriba) toma lugar con la ayuda de una ligasa
T4-ADN. Aproximadamente 3 \mug de cada uno de los
dos materiales iniciales de ADN se emplean en un volumen de reacción
de 20 \mul, y la unión se realiza a 12ºC por 15 h. 4 ml de esta
mezcla de unión se empacan dentro de los fagos lambda utilizando el
kit de empaquetamiento in vitro que puede ser comprado de
Stratagene (La Jolla, CA, USA) (de acuerdo con las instrucciones del
fabricante). Los fagos resultantes se introducen por infección en la
cepa E. coli X- 1BlueMR® (Stratagene). La titulación del
material fago revela aproximadamente 20,000 partículas fago por ml,
el análisis de 12 clones cósmidos muestra que todos los clones
contienen insertos de plásmido ADN 25-40 kb en
tamaño.
Para identificar y clonar la región de ADN
cromosómica del A. mediterranei que es adyacente al fragmento
KpnI 5.7 kb descrita arriba en los ejemplos 3 y 5, en primer lugar
una sonda radioactiva de ADN se prepara a partir del fragmento KpnI
5.7 kb. Esto se hace por radiomarcación aproximadamente 0.5 \mug
del fragmento de ADN aislado con
^{32}P-d-CTP por el sistema de
translación de mella de Gibco/BRL (Basle) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
La infección del E. coli
X-1 Blue MR (Stratagene) con una alícuota de los
fagos lambda empacada in vitro (ver Ejemplo 7) resulta en más
de 2000 clones sobre varias placas LB + ampicilina (50 \mug/ml).
Estos clones se prueban por hibridación de colonias sobre filtros de
nitrocelulosa (ver Ejemplo 3 para el método). La sonda de ADN
utilizada es el fragmento KpnI 5.7 kb de ADN del A.
mediterranei que se radiomarca con
^{32}P-d-CTP y se preparó
arriba.
Se encontraron 5 clones cósmidos que muestran
una señal significante con la sonda de ADN. El plásmido ADN de estos
cósmidos se aísla (Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, 1989), se digieren con KpnI y se analizan en un gel de
agarosa. El análisis revela que todos los 5 plásmidos tienen ADN
cromosómico integrado del A. mediterranei con un tamaño del
orden de aproximadamente 25-35 kb, y todos contienen
el fragmento KpnI 5.7 kb.
Para caracterizar la región de ADN cromosómico
del A. mediterranei que es adyacente al fragmento KpnI
clonado, al plásmido ADN de uno de los 5 clones cósmidos se sometió
a un análisis de restricción. El plásmido del clon cósmido
seleccionado tiene el número pNE112 y así mismo comprende el
fragmento BglII 13 kb descrito en el Ejemplo 3.
La digestión del plásmido pNE112 con las enzimas
de restricción BamHI, BglII, HindIII (singularmente y en
combinación) permite que un mapa de restricción de la región clonada
de A. mediterranei sea preparado, y esto permite que esta
región de aproximadamente 26 kb en tamaño en el cromosoma de A.
mediterranei sea caracterizado. Esta región se caracteriza por
los siguientes sitios de división de restricción con la indicada
distancia en kb a partir de un extremo: BamHI en posición 3.2 kb,
HindIII en posición 6.6 kb, BglII en posición 11.5 kb, BamHI en
posición 16.6 kb, BamHI en posición 17.3 kb, BamHI en posición 21 kb
y BglII en posición 24 kb.
El plásmido ADN pNE112 se divide en fragmentos
directamente utilizando un nebulizador Aero-Mist
(CIS-US Inc., Bedford, MA, USA) bajo una presión de
nitrógeno de 8-12 libras por pulgada cuadrada. Al
azar estos fragmentos de ADN se tratan con polimerasa T4 ADN,
quinasa T4 ADN y polimerasa E. coli ADN en la presencia del 4
dNTPs con el fin de generar extremos romos en los fragmentos de ADN
bicatenario (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,
1989). Los fragmentos luego se fraccionan en 0.8% agarosa de bajo
punto de fusión (FMC SeaPlaque Agarose, Catalogue Nº 50113), y
fragmentos 1.5-2 kb en tamaño se extraen por
extracción de fenol caliente (Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY, 1989). Los fragmentos de ADN obtenidos de
esta manera luego se ligan con la ayuda de ligasa T4 ADN al vector
plásmido pBRKanf4 (ver Ejemplo 5) o pBlueScript KS+ (Stratagene, La
Jolla, CA, USA), cada uno de los cuales se corta una vez con
terminales cuadrados por digestión de restricción apropiada (SmaI
for pBRKanf4 y EcoRV for pBlueScript KS+), y se defosforila en los
terminales por un tratamiento con fosfatasa alcalina (Böhringer,
Mannheim). La mezcla de unión luego se transforma en E. coli
DH5\alpha, y las células se incuba durante la noche en agar LB con
el antibiótico apropiado (kanamicina 40 \mug/ml para pBRKanf4,
ampicilina 100 \mug/ml para pBlueScript KS+). Las colonias
cultivadas se transfieren individualmente en 1.25 ml de medio
líquido TB con antibiótico en placas 96-pozos con
pozos de un volumen de 2 ml, y se incuban a 37ºC durante la noche.
El molde de ADN para la secuenciación se prepara directamente a
partir de estos cultivos por lisis alcalina (Birnboim, Methods in
Enzymology (1983) 100, 243-255). La secuenciación
del ADN toma lugar utilizando el kit de reacción Perkin Elmer/Appied
Biosystems con reactivos de terminación marcador de tinta (Kit Nº
402122) y universal M13 mp18/19 cebadores o cebadores T3, T7, o con
cebadores preparados por nosotros que se unen a las secuencias
internas. Un protocolo del ciclo secuenciación estándar con 20
ciclos se utiliza con un termociclizador (MJ Research ADN Engine
Thermocycler, Model 225). Las reacciones de secuenciación se
precipitan con etanol, se resuspenden en solución reguladora cargada
de formamida y se fraccionan y se analizan por electroforesis
utilizando el secuenciador Applied Biosystems automatic ADN (Model
377) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los archivos
de la secuencia se producen con la ayuda del Software del programa
del ordenador Applied Biosystems ADN Analysis y se transfiere a un
ordenador SUN UltraSpark para análisis posteriores. Los siguientes
programas de ordenador (software) se emplean para el análisis de los
resultados: Montaje de ADN y análisis GAP de empaque (Genetics
Computer Group, University of Wisconsin, R. Staden, Cambridge
University UK) y los cuatro programas: Phred,
Cross-match, Phrad y Consed (P. Green, University de
Washington, B. Ewing y D. Gordon, Washington University in Saint
Louis). Después las secuencias originales han sido conectadas juntas
para dar secuencias coherentes más largas, las secciones de ADN
perdidas son secuenciadas específicamente con la ayuda de nuevos
cebadores (enlace a las secciones secuenciadas), o por secuenciación
alargad o secuenciación de la otra cadena.
Es posible con el método descrito arriba
secuenciar la región de ADN cromosómico total 26 kb en tamaño del
A. mediterranei que es clonado en pNE112. La secuencia de ADN
se representa en la SEQ ID NO 3 en la sección
27801-53789 pares de bases. La secuencia de ADN del
fragmento KpnI 5.7 kb descrito en el Ejemplo 5 esta presente en
pNE112, y se representa en la SEQ ID NO 3 en la región
43093-48768 par de bases.
Para identificar los clones cósmidos que
comprenden los fragmentos cromosómicos de ADN del A.
mediterranei localizados directamente en frente de la región de
pNE11226 kb, el plásmido pNE112 se corta con la enzima de
restricción BamHI, y el fragmento BamHI resultante 3.2 kb en tamaño
se separa del otro fragmento BamHIs en un gel de agarosa y se aísla
del gel. Este fragmento BamHI se localiza en un extremo del ADN
incorporado del A. mediterranei en pNE112 (ver Ejemplo 8) y
puede de esta manera ser utilizado como sonda de ADN para encontrar
los clones cósmidos requeridos. Aproximadamente 0.5 \mug del
fragmento BamHI aislado de ADN 3.2 kb se radiomarca con
^{32}P-dCTP por el sistema translación de mella de
Gibco/BRL (Basel) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
El banco de genes cósmido del A.
mediterranei descrito en el Ejemplo 7 luego se analiza por
hibridación de colonias (Método del Ejemplo 3) utilizando esta sonda
de ADN 3.2 kb para los clones con traslapado. Dos clones cósmidos
con una fuerte señal de hibridación pueden ser identificados de esta
manera y se les dan los números pNE95 y pRi44-2. Es
posible por análisis de restricción y transferencia Southern
confirmar que los plásmidos pNE95 y pRi44-2
comprenden fragmentos cromosómicos de ADN del A. mediterranei
que traslapan con el fragmento BamHI 3.2 kb del pNE112 y juntos
cubren una región cromosómica 35 kb del A. mediterranei que
directamente esta adyacente al fragmento de pNE112 26 kb del A.
mediterranei clonado en pNE112.
La región de ADN clonado cromosómico de A.
mediterranei con los clones cósmidos pNE112, pNE95 y
pRi44-2 se caracteriza realizando un análisis de
restricción. La digestión del plásmido ADN de los tres cósmidos con
las enzimas de restricción EcoRI, BglII y HindIII (individualmente y
en combinación) produce un mapa burdo de restricción de la región
clonada del A. mediterranei. Los traslapados de los tres
plásmidos están en este caso establecidos y confirmados por
transferencia Southern. Esta región cromosómica del A.
mediterranei tiene un tamaño de aproximadamente 61 kb y se
caracteriza por los siguientes sitios de división de restricción con
la distancia indicada en kb de un extremo: EcoRI en posición 7.2 kb,
HindIII en posición 21 kb, BglII en posición 31 kb, HindIII en
posición 42 kb, BglII en posición 47 kb y BglII en posición 59 kb.
En esta región en el cromosoma del A. mediterranei, el
plásmido pRi 44-2 cubre una región de la posición 1
a aproximadamente 37 kb, el plásmido pNE95 cubre una región de
posición aproximada 9 kb-51 kb y el plásmido pNE 112
cubre una región de posición aproximada 35 kb-61
kb.
Determinación de la secuencia de ADN de la
región cromosómica descrita en el Ejemplo 11 del A.
mediterranei (sitio de división EcoRI en la posición 7.2 kb a 51
kb) se realiza con los plásmidos pRi 44-2 y pNE95,
utilizando exactamente el mismo método según lo descrito en el
Ejemplo 9. El análisis de la secuencia de ADN obtenida de esta
manera confirma el mapa burdo de restricción descrito en el Ejemplo
11 y el traslapado de los fragmentos clonados del A.
mediterranei en los plásmidos pNE112, pNE95 y
pRi44-2.
La secuencia de ADN de la región cromosómica de
ADN del A. mediterranei descrita en el Ejemplo 11 del sitio
de división EcoRI en la posición 7.2 kb hasta el extremo en 61 kb se
representa en la SEQ ID NO 3 (longitud 53789 pares de bases).
La secuencia del nucleótido mostrada en la SEQ
ID NO 3 se analiza con el programa de ordenador Codonpreference
(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, 1994). Este
análisis muestra que un muy grande marco de lectura abierto (ORF A)
que codifica para una proteína esta presente en el primer tercio de
la secuencia (posición 1825-15543 incluyendo codón
de terminación en la SEQ ID NO 3). Los codones utilizados en ORF A
son típicos de los genes del actinomicetos con un alto contenido de
G+C.
La comparación de la secuencia de aminoácido de
ORF A (SEQ ID NO 4, tamaño 4572 aminoácidos) con otro poliquetido
sintasas y específicamente con el muy bien caracterizado poliquetido
sintasa del Saccharopolyspora erythraea (Donadio, Science,
(1991) 252, 675-679, secuencia de ADN gen/EMBL
acceso Nº M63676) da los siguientes resultados:
Región de ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos
370-451: es 50% idéntico al dominio de la
proteína transportadora del grupo acilo del módulo 1 del eryA
locus de Saccharopolyspora erythraea.
Región de ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos
469-889: es 65% idéntico al dominio cetoacil
sintasa del módulo 1 del eryA locus de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos
982-1292: es 54% idéntico al dominio
aciltransferasa del módulo 1 del eryA locus de
Saccharopolyspora erythraea.
Región de ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos
1324-1442: es 42% idéntico al dominio
dehidratasa del módulo 4 del eryA locus de
Saccharopolyspora erythraea.
Región de ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos
1664-1840: es 56% idéntico al dominio
cetoreductasa del módulo 1 del eryA locus de
Saccharopolyspora erythraea.
Región de ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos
1929-2000: es 53% idéntico al dominio de la
proteína transportadora del grupo acilo del módulo 1 del eryA
locus de Saccharopolyspora erythraea.
Región de ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos
2032-2453: es 64% idéntico al dominio cetoacil
sintasa del módulo 1 del eryA locus de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos
2554-2865: es 37% idéntico al dominio
aciltransferasa del módulo 1 del eryA locus de
Saccharopolyspora erythraea.
Región de ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos
2918-2991: es 54% idéntico al dominio de la
proteína transportadora del grupo acilo del módulo 1 del eryA
locus de Saccharopolyspora erythraea.
Región de ORF A. SEQ ID NO 4: aminoácidos
3009-3431: es 65% idéntico al dominio cetoacil
sintasa del módulo 1 del eryA locus de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos
3532-3847: es 53% idéntico al dominio
aciltransferasa del módulo 1 del eryA locus de
Saccharopolyspora erythraea.
Región de ORF A, SEQ ID NO 4: aminoácidos
4142-4307: es 43% idéntico al dominio
cetoreductasa del módulo 1 del eryA locus de
Saccharopolyspora erythraea.
Región de ORF A. SEQ ID NO 4: aminoácidos
4405-4490: es 50% idéntico al dominio de la
proteína transportadora del grupo acilo del módulo 1 del eryA
locus de Saccharopolyspora erythraea.
Las grandes semejanzas encontradas en la
secuencia de aminoácido de los dominios enzimáticos sugieren sin
ambigüedad que la región proteína-codificada (ORF A)
de la región cromosómica A. mediterranai representados en la
SEQ ID NO 3 codificada para un poliquetido sintasa (tipo 1) modular
típico. Este poliquetido sintasa del A. mediterranei muy
grande codifica para ORF A comprende tres módulos bioactivos
completos que son cada uno responsable de la condensación de una
unidad C2 en el macrólido del anillo de la molécula y la
modificación correcta de los inicialmente formados
grupos\beta-ceto. Debido a la homología con los
dominios de activación del poliquetido sintasa de la rapamicina, el
primer módulo descrito arriba muy probablemente comprende un dominio
enzimático para la activación de la unidad aromática iniciadora de
la biosíntesis de la rifamicina, ácido
3-amino-5-hidrobenzóico
(Ghisalba et al., Biotechnology de Industrial Antibiotics
Vandamme E. J. Ed., Decker Inc. New York, (1984)
281-327).
La secuencia de nucleótido en la SEQ ID NO 3 se
analiza utilizando el programa de ordenador Codonpreference
(Genetics Computer Group, University de Wisconsin, 1994). Este
análisis muestra que otro amplio marco de lectura abierto (ORF B)
que codifica para una proteína está presente en la región media de
la secuencia (posición 15550-30759 incluyendo codón
de terminación en la SEQ ID NO 3). Los codones utilizados en ORF B
son típicos de los genes de actinomicetos con un alto contenido de
G+C.
La comparación de la secuencia de aminoácido de
ORF B (SEQ ID NO 5, longitud 5069 aminoácidos) con otro poliquetido
sintasas y específicamente con el muy bien caracterizado poliquetido
sintasa de Saccharopolyspora erythraea (Donadio, Science,
(1991) 252, 675-679, secuencia de ADN gen/EMBL
acceso Nº M63676) da los siguientes resultados:
Región de ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos
44-468: es 62% idéntico al dominio cetoacil sintasa
del módulo 1 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos
571-889: es 56% idéntico al dominio aciltransferasa
del módulo 1 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos
921-1055: es 47% idéntico al dominio dehidratasa del
módulo 4 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos
1353-1525: es 49% idéntico al dominio cetoreductasa
del módulo 1 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos
1621-1706: es 53% idéntico al dominio de la proteína
transportadora del grupo acilo del módulo 1 del locus eryA de
Saccharopolyspora erythraea.
Región de ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos
1726-2148: es 62% idéntico al dominio cetoacil
sintasa de módulo 1 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos
2251-2560: es 55% idéntico al dominio
aciltransferasa del módulo 1 del locus eryA de
Saccharopolyspora erythraea.
Región de ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos
2961-3132: es 49% idéntico al dominio cetoreductasa
del módulo 1 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos
3228-3313: es 52% idéntico al dominio de la proteína
transportadora del grupo acilo del módulo 1 del locus eryA de
Saccharopolyspora erythraea.
Región de ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos
3332-3755: es 63% idéntico al dominio cetoacil
sintasa de módulo 1 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos
3857-4173: es 52% idéntico al dominio
aciltransferasa del módulo 1 del locus eryA de
Saccharopolyspora erythraea.
Región de ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos
4664-4799: es 47% idéntico al dominio cetoreductasa
del módulo 1 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF B, SEQ ID NO 5: aminoácidos
4929-5014: es 52% idéntico al dominio de la proteína
transportadora del grupo acilo del módulo 1 del locus eryA de
Saccharopolyspora erythraea.
La secuencia de nucleótido en la SEQ ID NO 3 se
analiza utilizando el programa de ordenador Codonpreference
(Genetics Computer Group, University de Wisconsin, 1994). Este
análisis muestra que un amplio marco de lectura abierto (ORF C) que
codifica para una proteína está presente en la región media de la
secuencia (posición 30895-36060 incluyendo el codón
de terminación en la SEQ ID NO 3). Los codones utilizados en ORF C
son típicos de los genes del actinomicetos con un alto contenido de
G+C.
La comparación de la secuencia de aminoácido de
ORF C (SEQ ID NO 6, longitud 1721 aminoácidos) con otro poliquetido
sintasas y específicamente con el muy bien caracterizado poliquetido
sintasa del Saccharopolyspora erythraea (Donadio, Science,
(1991) 252, 675-679, secuencia de ADN gen/EMBL
acceso Nº M63676) da los siguientes resultados:
Región de ORF C, SEQ ID NO 6: aminoácidos
1-414: es 63% idéntico al dominio cetoacil sintasa
del módulo 1 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF C, SEQ ID NO 6: aminoácidos
514-828: es 54% idéntico al dominio aciltransferasa
del módulo 1 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF C, SEQ ID NO 6: aminoácidos
1290-1399: es 49% idéntico al dominio cetoreductasa
del módulo 1 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF C, SEQ ID NO 6: aminoácidos
1563-1648: es 55% idéntico al dominio de la proteína
transportadora del grupo acilo del módulo 1 del locus eryA de
Saccharopolyspora erythraea.
La secuencia de nucleótido en la SEQ ID NO 3 se
analiza utilizando el programa de ordenador Codonpreference
(Genetics Computer Group, University de Wisconsin, 1994). Este
análisis muestra que un amplio marco de lectura abierto (ORF D) que
codifica para una proteína está presente en la región media de la
secuencia (posición 36259-41325 incluyendo el codón
de terminación en la SEQ ID NO 3). Los codones utilizados en ORF D
son típicos de los genes del actinomicetos con un alto contenido de
G+C.
La comparación de la secuencia de aminoácido de
ORF D (SEQ ID NO 7, longitud 1688 aminoácidos) con otro poliquetido
sintasas y específicamente con el muy bien caracterizado poliquetido
sintasa del Saccharopolyspora erythraea (Donadio, Science,
(1991) 252, 675-679, secuencia de ADN genes/EMBL
acceso Nº M63676) da los siguientes resultados:
Región de ORF D, SEQ ID NO 7: aminoácidos
1-418: es 64% idéntico al dominio cetoacil sintasa
del módulo 1 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF D, SEQ ID NO 7: aminoácidos
524-841: es 54% idéntico al dominio aciltransferasa
del módulo 1 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF D, SEQ ID NO 7: aminoácidos
1260-1432: es 51% idéntico al dominio cetoreductasa
del módulo 1 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF D, SEQ ID NO 7: aminoácidos
1523-1608: es 53% idéntico al dominio de la proteína
transportadora del grupo acilo del módulo 1 del locus eryA de
Saccharopolyspora erythraea.
La secuencia de nucleótido en la SEQ ID NO 3 se
analiza utilizando el programa de ordenador Codonpreference
(Genetics Computer Group, University de Wisconsin, 1994). Este
análisis muestra que un amplio marco de lectura abierto (ORF E) que
codifica para una proteína está presente en la región posterior de
la secuencia (posición 41373-51614 incluyendo el
codón de terminación en la SEQ ID NO 3). Los codones utilizados en
ORF E son típicos de los genes del actinomicetos con un alto
contenido de G+C.
La comparación de la secuencia de aminoácido de
ORF E (SEQ ID NO 8, longitud 3413 aminoácidos) con otro poliquetido
sintasas y específicamente con el muy bien caracterizado poliquetido
sintasa del Saccharopolyspora erythraea (Donadio, Science,
(1991) 252, 675-679, secuencia de ADN gen/EMBL
acceso Nº M63676) da los siguientes resultados:
Región de ORF E, SEQ ID NO 8: aminoácidos
31-451: es 64% idéntico al dominio cetoacil sintasa
del módulo 1 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF E. SEQ ID NO 8: aminoácidos
555-874: es 37% idéntico al dominio aciltransferasa
del módulo 1 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF E, SEQ ID NO 8: aminoácidos
907-1036: es 49% idéntico al dehidratasa dominio del
módulo 4 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF E, SEQ ID NO 8: aminoácidos
1336-1500: es 52% idéntico al dominio cetoreductasa
del módulo 1 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF E, SEQ ID NO 8: aminoácidos
1598-1683: es 51% idéntico al dominio de la proteína
transportadora del grupo acilo del módulo 1 del locus eryA de
Saccharopolyspora erythraea.
Región de ORF E, SEQ ID NO 8: aminoácidos
1702-2124: es 62% idéntico al dominio cetoacil
sintasa del módulo 1 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF E, SEQ ID NO 8: aminoácidos
2229-2543: es 53% idéntico al dominio
aciltransferasa del módulo 1 del locus eryA de
Saccharopolyspora erythraea.
Región de ORF E, SEQ ID NO 8: aminoácidos
2573-2700: es 47% idéntico al dominio dehidratasa
del módulo 4 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF E, SEQ ID NO 8: aminoácidos
3054-3227: es 52% idéntico al dominio cetoreductasa
del módulo 1 del locus eryA de Saccharopolyspora
erythraea.
Región de ORF E, SEQ ID NO 8: aminoácidos
3324-3405: es 51% idéntico al dominio de la proteína
transportadora del grupo acilo del módulo 1 del locus eryA de
Saccharopolyspora erythraea.
La secuencia de nucleótido en la SEQ ID NO 3 se
analiza utilizando el programa de ordenador Codonpreference
(Genetics Computer Group, University de Wisconsin, 1994). Este
análisis muestra que un marco de lectura abierto (ORF F) que
codifica para una proteína está presente en la región posterior de
la secuencia (posición 51713-52393 incluyendo el
codón de terminación en la SEQ ID NO 3). Los codones utilizados en
ORF F son típicos de los genes del actinomicetos con un alto
contenido de G+C.
La comparación de la secuencia de aminoácido de
ORF F (SEQ ID NO 9, longitud 226 aminoácidos) con proteínas del EMBL
databank (Heidelberg) muestra una gran semejanza con el
N-hidroxiarilamina O-aciltransferasa
del Salmonella typhimurium (29% identidad sobre una región de
134 aminoácidos). También hay significante homología con arilamina
aciltransferasas de otros organismos. Se puede concluir de estos
entendimientos que el ORF F encontrado en A. mediterranei en
la SEQ ID No 3 codifica para una arilamina aciltransferasa, y se
puede asumir que esta enzima es responsable del enlace de la cadena
larga acil producida por el poliquetido sintasa al grupo amino sobre
la molécula iniciadora, ácido
3-amino-5-hidrobenzóico.
Esta reacción cerraría el sistema de anillo de la rifamicina
correctamente después de la terminación de las etapas de
condensación por el poliquetido sintasa.
La cinco regiones de la
porteína-codificada (ORF A-E),
descritas en los ejemplos 13-17, de la SEQ ID NO 3
comprende las proteínas con semejanza muy grande (en la secuencia de
aminoácido y la configuración de los dominios enzimáticos) al
poliquetido sintasas para los poliquetidos del tipo macrólido.
Tomadas juntas, estas cinco enzimas multifuncionales comprenden 10
módulos de poliquetido sintasa que son cada uno responsables de una
etapa de condensación en la síntesis del poliquetido. Tales 10
etapas de condensación son igualmente necesarias para la biosíntesis
de la rifamicina (Ghisalba et al., Biotechnology of
Industrial Antibiotics Vandamme E. J. Ed., Decker Inc. New York,
(1984) 281-327). El procedimiento de los grupos ceto
particular requerido por los dominios enzimáticos dentro de los
módulos sustancialmente corresponde a la actividad requerida por la
molécula de rifamicina, si se asume que la síntesis del poliquetido
ocurre "co-linealmente" con la configuración de
los módulos en el grupo de genes de A. mediterranei (esto es
asó para otros antibióticos macrólidos tal como eritromicina y
rapamicina). Puede ser agregado aquí que no es cierto si la
transcripción de los cinco resultados ORFs en cinco proteínas; en
particular, ORF C y ORF D posiblemente podrían traducir a una
proteína grande.
Un dominio enzimático que es muy probablemente
responsable de la activación de la molécula iniciadora, ácido
3-hidroxi-5-aminobenzóico,
de la biosíntesis de la rifamicina se puede encontrar en el N
Terminal de ORF A, el inicio del poliquetido sintasa. Directamente
abajo del grupo de genes poliquetido sintasa de rifamicina descrito
hay un gen (ORF F) que muy probablemente determina una proteína que
cause el cierre del anillo de la molécula de rifamicina después de
la terminación de las etapas de condensación por el poliquetido
sintasa.
Se puede concluir con base en estos
descubrimientos que la región cromosómica del A. mediterranei
descrita en la SEQ ID NO 3 es responsable de las diez etapas de
condensación requeridas para la síntesis del poliquetido de
rifamicina, incluyendo la activación de la molécula iniciadora ácido
3-hidroxi-5-aminobenzóico,
y el terminante cierre del anillo.
Los siguientes microorganismos y plásmidos han
sido depositados en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-38124
Braunschweig, de acuerdo con los requisitos del Budapest Treaty.
| Microorganismo/Plásmido | Fecha del depósito | Número del depósito |
| E. coli con plásmido pRi7-3 | 10.08.96 | DSM 11114 |
| E. coli con plásmido pNE112 | 14.07.97 | DSM 11657 |
| E. coli con plásmido pNE95 | 14.07.97 | DSM 11656 |
| E. coli con plásmido pRi44-2 | 14.07.97 | DSM 11655 |
(1) INFORMACION GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- APLICANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Novartis AG
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Schwarzwaldallee 215
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Basel
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 4058
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: +41 61 324 1111
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: + 41 61 322 75 32
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Grupo de genes de la biosíntesis de larifamicina
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE DE ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- MEDIO TIPO: Floppy disk
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1891 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TYPE: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- STRANDEDNESS: sola
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53789 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleic ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4572 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sola
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5069 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sola
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1721 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sola
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1688 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sola
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3413 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sola
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 226 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sola
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
Claims (17)
1. Un ADN aislado que es
(i) el grupo de genes responsable de la
biosíntesis de la rifamicina en Amycolatopsis mediterranei,
que comprende la SEQ ID NO: 3,
(ii) una porción de ADN de (i) que codifica para
un poliquetido sintasa o uno de sus dominios activos
enzimáticamente,
(iii) una porción de ADN de la SEQ ID NO: 3 que
comprende al menos 15 de sus nucleótidos consecutivos y que pueden
ser utilizados como sonda de hibridación dentro del banco de genes
genómicos de un organismo que produce la rifamicina para encontrar
los constituyentes del grupo de genes correspondiente,
(iv) un ADN que tiene al menos 70% de identidad
del ADN de (ii) y que codifica para un polipéptido que tiene la
misma actividad del poliquetido sintasa como codificado por el ADN
de (ii).
2. Un ADN aislado de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde dicho ADN
(i) comprende una secuencia de nucleótido
seleccionada del grupo que consiste de
- ORF A que consiste de un fragmento de la SEQ
ID NO: 3 a partir de las posiciones del nucleótido 1825 a 15543,
- ORF B que consiste de un fragmento de la SEQ
ID NO: 3 a partir de las posiciones del nucleótido 15550 a
30759,
- ORF C que consiste de un fragmento de la SEQ
ID NO: 3 a partir de las posiciones del nucleótido 30895 a
36060,
- ORF D que consiste de un fragmento de la SEQ
ID NO: 3 a partir de las posiciones del nucleótido 36259 a
41325,
- ORF E que consiste de un fragmento de la SEQ
ID NO: 3 a partir de las posiciones del nucleótido 41373 a 51614,
y,
- ORF F que consiste de un fragmento de la SEQ
ID NO: 3 a partir de las posiciones del nucleótido 51713 a
52393;
o,
(ii) codificar una o más de las proteínas o
polipéptidos de la SEQ ID NOs 4 a 9.
3. Un método de la identificación, el
aislamiento y clonación de un ADN aislado de la reivindicación 1 de
un organismo que sintetiza la rifamicina, dicho método que comprende
las siguientes etapas:
- configuración de un banco de genes genómicos
de dicho organismo que sintetiza la rifamicina;
- selección de este banco de genes con la ayuda
del ADN de la reivindicación 1;
- aislamiento de los clones identificados como
positivos.
4. El uso del ADN de la reivindicación 1 en la
producción de ansamicinas o sus precursores; que incluyen aquellos
en los cuales el puente alifático se conecta solamente en un extremo
a los núcleos aromáticos.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en
donde dicha ansamicina es la rifamicina.
6. El uso del ADN de la reivindicación 1 para
inactivar o modificar los genes de la biosíntesis de la
ansamicina.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en
donde dicha ansamicina es la rifamicina.
8. El uso del ADN de la reivindicación 1 para la
construcción de cepas de actinomicetos mutados a partir de los
cuales la rifamicina natural o la biosíntesis de la ansamicina del
grupo de genes en el cromosoma ha sido suprimida parcialmente o
completamente.
9. El uso del ADN de la reivindicación 1 para el
ensamblaje de una genoteca del poliquetido sintasas.
10. Un poliquetido sintasa a partir del
Amycolatopsis mediterranei el cual esta implicado en la
síntesis de rifamicina o de uno de sus dominios activos
enzimáticamente, en donde dicho poliquetido sintasa se codifica por
un ADN de la reivindicación 1.
11. Uso del poliquetido sintasa de acuerdo con
la reivindicación 10, para la síntesis de las ansamicinas.
12. El uso de la reivindicación 11, para la
síntesis de una genoteca de ansamicinas.
13. Un vector híbrido que comprende el ADN de la
reivindicación 1.
14. Un vector híbrido que comprende un vector de
expresión que comprende el ADN de la reivindicación 1.
15. Un organismo huésped que comprende el vector
híbrido de la reivindicación 14.
16. Una sonda de hibridación que comprende el
ADN de la reivindicación 1.
17. El uso de la sonda de hibridación de acuerdo
con la reivindicación 16 para la identificación de los fragmentos
de ADN implicados en la biosíntesis de ansamicinas.
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|---|---|---|---|
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