CN110997700A - 用于在杀真菌素链霉菌的基因工程菌株中增强恩拉霉素的生产的组合物和方法 - Google Patents

用于在杀真菌素链霉菌的基因工程菌株中增强恩拉霉素的生产的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本公开描述了用于在杀真菌素链霉菌的遗传工程菌株中增加恩拉霉素生产的组合物和方法。特别地，本公开描述了与来自杀真菌素链霉菌的恩拉霉素(恩拉霉素)生物合成基因簇相关的调控基因orf24和orf18的遗传操作以产生生产更高产量的恩拉霉素的载体构建体和重组菌株。

Description

用于在杀真菌素链霉菌的基因工程菌株中增强恩拉霉素的生 产的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年12月6日提交的美国临时专利号62/430838和于2017年3月30日提交的美国临时专利号62/479087的较早申请日的优先权权益，其各自的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及抗生素生物合成，特别涉及用于增加恩拉霉素生产的组合物和方法。
背景技术
多重耐药性细菌感染的全球出现导致巨大的医疗成本，并已成为公共健康的主要威胁。为了保持领先于抗菌药物抗性的发展，需要鉴定新的抗生素以及以更具成本效益的方式生产这样的抗生素的方法。
发明内容
本公开克服了与杀真菌素链霉菌的野生型菌株的恩拉霉素(enduracidin)(恩拉霉素(enramycin))的有限生产、以及通过常规放射和化学介导的染色体诱变开发的工业菌株的生产限制，以及连续多轮选择用于生产增加水平的期望恩拉霉素肽抗生素的突变体相关的问题。本文公开了与来自杀真菌素链霉菌的恩拉霉素(恩拉霉素)生物合成基因簇相关的调控基因orf24和orf18的遗传操作以产生生产更高产量的该肽抗生素的重组载体和菌株。在野生型生产者杀真菌素链霉菌B-5477(ATCC 21013)和杀真菌素链霉菌BM38-2(ATCCPTA-122342)两者中构建衍生自野生型菌株并且目前用于工业生产恩拉霉素的重组菌株。在野生型生物中，驱动orf24的第二拷贝过表达的质粒pXY152-endorf24的位点特异性整合产生菌株SfpXY152endorf24。将诱变的福斯质粒(fosmid)pXYF24D3整合到野生型染色体中用该基因的破坏拷贝替换了天然orf18并产生了突变体SfpXYF24D3。在商业生产者杀真菌素链霉菌BM38-2(ATCC PTA-122342)中工作，质粒pXY152-endorf24的整合产生了重组菌株杀真菌素链霉菌BM38-2.24/16。为了产生缺乏功能性orf18的BM38-2(ATCC PTA-122342)衍生菌株，构建了质粒pKS-T-orf18pfrd-AmR以缺失orf18及其侧翼区，用阿泊拉霉素抗性标志物替换该区域并产生重组体菌株杀真菌素链霉菌BM38-2.18pfrd-AmR。该遗传操作菌株被证实产生比相应的母体菌株高1.2至4.6倍范围的恩拉霉素的产量。来自重组菌株的升高的恩拉霉素产量提供更具成本效益的恩拉霉素生产。
通过与参考附图一并进行的以下详细描述，本公开的前述和其他特征和优点将变得更加明显。
附图说明
图1提供了恩拉霉素A和B的化学结构。
图2是整合表达质粒pXY152-endorf24的图谱。
图3是基因缺失质粒pXY300-orf18ifd的图谱。
图4是基因缺失质粒pKS-T-orf18ifd的图谱。
图5是基因缺失质粒pKS-T-orf18pfrd-AmR的图谱。
图6是基因缺失质粒pKS-orf18ifd-T-AmR(NS)的图谱。
图7是整合表达质粒pXY152-endorf24-camtsr的图谱。
图8是整合表达质粒pXY152-endorf24-blatsr的图谱。
图9提供了链霉素激活子StrR蛋白(SEQ ID NO:25)与Orf24(SEQ ID NO:26)的比对。
图10A和10B是质粒pKS-T-orf18pfrd-AmR(a)和pXY300-orf18ifd(b)的插入物的图谱。在构建体pXY30-orf18ifd中，缺失了来自核苷酸位置25795至26450(GenBank登录号DQ403252)的orf18的内部序列，并用PacI限制性位点(TTAATTAA，图10B)替换。得到的框内缺失的orf18(GTGTTTAATTAATGA(SEQ ID NO:27))可以翻译成三氨基酸肽(VFN)。通常，由于其不完整性，orf18长度上的任何内部框内缺失都应该导致Orf18的无效功能。
图11 Orf24与来自放线菌的六种功能表征的StrR样途径特异性激活子直系同源蛋白的比对。来自杀真菌素链霉菌恩拉霉素生物合成基因簇的Orf24(GenBank登录号DQ403252；SEQ ID NO:26)；来自灰色链霉菌链霉素生物合成基因簇的StrR(GenBank登录号Y00459；SEQ ID NO:25)；来自Actinoplanes teichomyceticus替考拉宁基因簇的Tei15*(GenBank登录号AJ632270；SEQ ID NO:32)；来自拟无枝酸菌(Amycolatopsis)菌株DSM5908balhimycina生物合成基因簇的Bbr(GenBank登录号Y16952；SEQ ID NO:28)；来自S.kasugaensis kasugamycin基因簇的KasT(GenBank登录号BAF79690；SEQ ID NO:29)；来自S.niveus菌株NCIMB 9219新生霉素生物合成基因簇的NovG(GenBank登录号AF170880，SEQ ID NO:30)；来自S.globisporus C-1027生物合成基因簇的SgcR1(GenBank登录号AY048670；SEQ ID NO:31)。相同的氨基酸(*)，保守的氨基酸(.)和高度保守的氨基酸置换(:)。DNA结合蛋白如StrR的保守螺旋-转角-螺旋(HTH)基序特征以下划线表示。
图12 Orf18(SEQ ID NO:36)与其他功能表征的响应调节子直向同源物的比对。SCO1745/AbrA2:S.coelicolor A3(2)双组分响应调节子(GenBank登录号CAB50960；SEQ IDNO:33)。SCO3226/AbsA2：S.coelicolor A3(2)双组分响应调节子(GenBank登录号AAB08053；SEQ ID NO:34)。SCO3818：S.coelicolor A3(2)双组分系统响应转录调节子(GenBank登录号CAB46941；SEQ ID NO:35)。
序列表
本文和所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码显示，如37C.F.R.1.822中所定义。仅显示了核酸序列的一条链，但互补链理解通过对所展示的链的任何提及而包括。在随附的序列表中：
SEQ ID NO:1和2是用于产生质粒pXY152-endorf24的插入物的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:3是质粒pXY152-endorf24的核酸序列。
SEQ ID NO:4-7是用于产生质粒pXY300-orf18ifd的插入物的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:8是质粒pXY300-orf18ifd的核酸序列。
SEQ ID NO:9和10是用于产生质粒pKS-T-orf18pfrd的oriT片段的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:11是质粒pKS-T-orf18pfrd的核酸序列。
SEQ ID NO:12和13是用于产生质粒pKS-T-orf18pfrd-AmR的amR片段的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:14是质粒pKS-T-orf18pfrd-AmR的核酸序列。
SEQ ID NO:15-18是用于产生质粒pKS-orf18ifd-T-AmR(NS)的oriT和amR片段的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:19是质粒pKS-orf18ifd-T-AmR(NS)的核酸序列。
SEQ ID NO:20是质粒pXY152-endorf24-camtsr的核酸序列。
SEQ ID NO:21和22是用于产生质粒pXY152-endorf24-blatsr的bla片段的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:23是质粒pXY152-endorf24-blatsr的核酸序列。
SEQ ID NO:24是寡核苷酸引物，其对应于阿泊拉霉素抗性基因的区域。
SEQ ID NO:25是链霉素激活子StrR蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26是ORF24编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27是说明orf18中的框内缺失的核酸序列。
SEQ ID NO:28是Bbr插入物的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29是KasT插入物的氨基酸序列。
SEQ ID NO:30是NovG插入物的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31是SgcR1插入物的氨基酸序列。
SEQ ID NO:32是Teil5*插入物的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33是来自S.coelicolor A3(2)(GenBank登录号CAB50960)的响应调节子直系同源物SCO1745/AbrA2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:34是来自S.coelicolor A3(2)(GenBank登录号AAB08053)的响应调节子直系同源物SCO/3226/AbsA2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:35是来自S.coelicolor A3(2)(GenBank登录号CAB46941)响应调节子直系同源物SCO3818的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36是ORF18编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37是orf18的核酸序列。
SEQ ID NO:38是orf24的核酸序列。
SEQ ID NO:39是福斯质粒pXYF148的核酸序列，其中orf24位于核苷酸位置23109至24044)。
SEQ ID NO:40是福斯质粒pXYF24的核酸序列，其中orf18位于核苷酸位置31091-31753)。
具体实施方式
I.介绍
恩拉霉素(Enduracidin)(图1)，也称为恩拉霉素(enramycin)，是由土壤细菌杀真菌素链霉菌B-5477(ATCC 21013)生产的17个氨基酸的脂缩酚肽(lipodepsipeptide)抗生素。从发酵液和菌丝体中主要作为恩拉霉素A和B(区别在于在所附脂链的长度上相差一个碳)的混合物分离肽。在结构上，恩拉霉素通过通过酰胺键与天冬氨酸残基连接的C12或C132Z,4E支链脂肪酸部分，以及许多非蛋白原氨基酸残基，例如enduracididine(End)、4-羟基苯基甘氨酸(Hpg)、3,5-二氯-4-羟基苯基甘氨酸(Dpg)、瓜氨酸(Cit)和鸟氨酸(Orn)的存在而区分(参见图1)。17种氨基酸中的7种具有D构型，6种残基为Hpg或氯化衍生物Dpg。
恩拉霉素(为简单起见，肽以单数形式提及)对广谱革兰氏阳性生物(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VRE))表现出有效的体外和体内抗菌活性。最低抑菌浓度(MIC)低至0.05μg/mL，并且效果是杀细菌作用。从各种病理产品(包括40％MRSA)收集的100株金黄色葡萄球菌的研究建立了0.09至0.56μg/mL的MIC，没有能够在1μg/mL暴露下存活的菌株。为了比较，万古霉素对金黄色葡萄球菌敏感菌株的典型MIC范围为0.5至2μg/mL。此外，恩拉霉素具有优异的毒理学特征。在小鼠、兔、狗和猴的研究中，急性LD50为：静脉注射，30-125mg/kg；腹腔注射，750-910mg/kg；皮下，肌内(im)或口服，>5-10g/kg。在同一项研究中，发现接受恩拉霉素im 6个月的猴子和类似剂量给药12个月的大鼠在注射部位仅有局部炎症。在人类中，将恩拉霉素i.m.施用(每12小时100mg)至20名感染MRSA的住院成年患者。据报道，该肽没有副作用，并且对于治疗由MRSA引起的泌尿道和皮肤感染(但不是慢性骨感染)也非常有效(Peromet等，Chemotherapy19：53-61,1973)。
恩拉霉素通过与细胞外脂质II(细菌细胞壁结构的前体)复合而抑制细菌肽聚糖细胞壁生物合成。脂质II复合的位点不同于万古霉素识别的位点，并且说明了恩拉霉素对万古霉素抗性生物的作用。迄今为止，没有证据表明恩拉霉素与任何临床使用的抗生素的交叉抗性，也没有证据表明发生获得或可转移的抗性。没有任何已知形式的可转移抗性机制，缺乏口服生物利用度，其低毒性和对梭状芽孢杆菌(Clostridium spp.)的优良活性已使恩拉霉素作为一种关键的商业多肽抗生素用作控制梭菌性肠炎的家禽饲料添加剂。
为了获得可以提供商业用途所必需的肽量的生产生物的菌株，Japan TakedaAnimal Health(现为Intervet/Merck Animal Health的一部分)将杀真菌素链霉菌B-5477用于各种传统的菌株改良方法并选择产生更高产量的恩拉霉素的突变体。全球市场上日益增多的恩拉霉素已经驱动努力进一步提高BM38-2(ATCC PTA-122342)中这种抗生素的产量。利用可获得的恩拉霉素生物合成基因簇的基因序列(GenBank登录号DQ403252，通过引用并入本文，在2006年10月3日可在万维网上获得)，BM38-2(ATCC PTA-122342)作为用于与基因簇相关的调控基因的靶向遗传操作的起始菌株并构成本公开的基础。本文公开了orf18的产物对恩拉霉素的生产具有负面作用，并且orf24基因产物对恩拉霉素的生产具有正面作用。利用这些调节作用的源自杀真菌素链霉菌野生型和BM38-2(ATCC PTA-122342)生物两者的重组菌株生产产量提高的恩拉霉素。此外，本文公开了分别基于pBluescriptII KS和pSET152的新的基因置换和整合表达载体。
II.缩略语和术语
a.缩略语
AA：氨基酸
Am：阿泊拉霉素
AMR：阿泊拉霉素抗性标志物
amRp：天然阿泊拉霉素抗性启动子
ATCC：American Type Culture Collection
bla：氨苄青霉素抗性基因
BLAST：Basic Local Alignment Search Tool
cam：氯霉素抗性基因
CFU：菌落形成单位
CTAB：十六烷基三甲基溴化铵
Cit：L-瓜氨酸
DPG：3,5-二氯-L-4-羟基苯基甘氨酸
EDTA：乙二胺四乙酸二钠
End：enduracididine
Enradin：恩拉霉素、恩拉霉素
EPM：恩拉霉素生产培养基
Hpg：D-和L-4-羟基苯基甘氨酸
HPLC：高效液相色谱
HTH：螺旋-转角-螺旋
IM：肌内
ISP2：国际链霉菌项目培养基2
ISP4：国际链霉菌项目培养基4
LB：Luria-Bertani培养基
LD50：致死剂量，LD50代表杀死50％的试验动物群体所需的个体剂量
MAH：Intervet/Merck Animal Health
MeOH：甲醇
MIC：最低抑制浓度，
MRSA：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
nm：纳米
NRPS：非核糖体肽合成酶
ORF：开放阅读框
ORN：D-鸟氨酸
PCP：肽基载体蛋白
PCR：聚合酶链式反应
Pfrd：加上侧翼区缺失
SDS：十二烷基硫酸钠
SNP：单核苷酸多态性
SPD：光谱光电二级管
TFA：三氟乙酸
TSB：胰酶大豆培养基
tsr：硫链丝菌素抗性基因
UV：紫外线
VRE：万古霉素抗性肠球菌
b.条款
除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常见术语的定义可以在由Oxford University Press,1994(ISBN 0-19-854287-9)出版的Benjamin LewinGenes V；由Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)出版的Kendrew等(eds.)The Encyclopedia of Molecular Biology；和由VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN1-56081-569-8)出版的Robert A.Meyers(ed.)Molecular Biology and Biotechnology:aComprehensive Desk Reference。
为了便于审阅本公开的各种实施方式，提供了以下对特定术语的解释：
施用：通过任何途径施用至动物。如本文所用，施用通常是指口服施用。
等位基因变体：多肽的替代形式，其特征在于具有一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加。在一个实例中，变体不改变多肽的生物学功能。
扩增：当用于提及核酸时，增加样品或样本中核酸分子拷贝数的技术。扩增的实例是聚合酶链式反应，其中在允许引物与样品中的核酸模板杂交的条件下，从受试者收集的生物样品与一对寡核苷酸引物接触。引物在合适的条件下延伸，与模板解离，然后再退火，延伸和解离以扩增核酸的拷贝数。可以使用标准技术通过电泳、限制性内切核酸酶切割模式、寡核苷酸杂交或连接和/或核酸测序来表征体外扩增的产物。体外扩增技术的其他实例包括链置换扩增(参见美国专利号5,744,311)；无转录等温扩增(参见美国专利号6,033,881)；修复链反应扩增(参见WO90/01069)；连接酶链反应扩增(参见EP-A-320308)；缺口填充连接酶链反应扩增(参见美国专利号5,427,930)；偶联连接酶检测和PCR(参见美国专利号6,027,889)；和NASBATM RNA无转录扩增(参见美国专利号6,025,134)。
类似物、衍生物或模拟物：类似物是化学结构与母体化合物不同的分子，例如同系物(区别在于化学结构的增量，例如烷基链长度的差异)、分子片段、一个或多个官能团不同的结构、和/或电离的变化。通常利用定量结构活性关系(QSAR)使用例如在Remington(TheScience and Practice of Pharmacology，19th Edition(1995)，第28章)中公开的技术发现结构类似物。当对原始化合物的变化很大，或者组合了许多增量变化时，该化合物不再是类似物。例如，雷莫拉宁(ramoplanin)在本文中不被认为是恩拉霉素的类似物：雷莫拉宁不含有enduracididine氨基酸而包含不同的氨基酸，并且尽管它具有脂质侧链，但链长基本上更短。通过在构成脂缩酚肽的氨基酸上添加或缺失官能团，通过用一个氨基酸置换另一个氨基酸(除了enduracididine氨基酸)或官能团修饰和氨基酸置换的组合，可以制备恩拉霉素的类似物。示例性的恩拉霉素类似物包括四氢恩拉霉素A，四氢恩拉霉素B，脱氯恩拉霉素A和脱氯恩拉霉素B。
衍生物是衍生自基础结构的生物活性分子。模拟物是通过模拟另一分子(例如生物活性分子)的结构来模拟这样的分子的活性的分子。因此，术语“模拟物”表示与活性相关的确定结构。
抗生素：通常由某些真菌、细菌和其他生物产生或衍生的物质，例如恩拉霉素、青霉素或链霉素，其可破坏或抑制其他微生物的生长。
反义、正义和反基因：双链DNA(dsDNA)有两条链，5’→3’链，称为正链，3’→5’链(反向互补)，称为负链。因为RNA聚合酶以5’→3’方向添加核酸，所以DNA的负链充当RNA转录的模板。因此，形成的RNA将具有与负链互补的序列并且与正链相同(除了U置换T)。反义分子是与RNA或正链DNA特异性杂交或特异性互补的分子。正义分子是与DNA的负链特异性杂交或特异性互补的分子。反基因分子是与dsDNA靶标互补的反义或正义分子。在一个实施方式中，反义分子与靶mRNA特异性杂交并抑制靶mRNA的转录。
结合或稳定结合：如果可检测到结合，则分子(例如寡核苷酸或蛋白质)结合或稳定结合靶分子，例如靶核酸或蛋白质。在一个实例中，如果足够量的寡核苷酸形成碱基对或与其靶核酸杂交，则寡核苷酸结合或稳定结合靶核酸以允许检测该结合。可以通过靶标的物理或功能特性检测结合：寡核苷酸复合物。靶标和寡核苷酸之间的结合可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法检测，包括功能和物理结合测定。通过确定结合是否对生物合成过程(例如基因的表达、DNA复制、转录、翻译等)具有可观察的影响，可以在功能上检测结合。
检测DNA或RNA互补链结合的物理方法是本领域公知的，包括例如DNA酶I或化学足迹法、凝胶移位和亲和裂解测定、Northern印迹、斑点印迹和光吸收检测程序的方法。例如，一种广泛使用的方法，因为它是如此简单和可靠，涉及观察含有寡核苷酸(或类似物)和靶核酸的溶液随着温度慢慢增加在220-300nm的光吸收的变化。如果寡核苷酸或类似物已经与其靶标结合，则在特征温度下吸收突然增加，因为寡核苷酸(或类似物)和靶标彼此解离或熔融。
低聚物与其靶核酸之间的结合通常以50％低聚物从其靶标熔融的温度(Tm)为特征。较高的Tm意指相对于具有较低Tm的复合物更强或更稳定的复合物。
蛋白质与其靶蛋白质之间的结合(例如抗体对抗原)通常通过确定结合亲和力来表征。在一个实施方式中，亲和力通过Frankel等,Mol.Immunol.,16:101-106,1979描述的Scatchard方法的修改来计算。在另一个实施方式中，通过特异性结合剂受体解离速率测量结合亲和力。在另一个实施方式中，通过竞争放射免疫测定法测量高结合亲和力。在多个实例中，高结合亲和力为至少约1×10-8M。在其他实施方式中，高结合亲和力为至少约1.5×10-8、至少约2.0×10-8、至少约2.5×10-8、至少约3.0×10-8、至少约3.5×10-8、至少约4.0×10-8、至少约4.5×10-8、或至少约5.0×10-8M。
生物学功能：多肽在其天然存在的细胞中的功能。多肽可具有一种以上的生物学功能。
cDNA(互补DNA)：缺少内部非编码区段(内含子)和转录调控序列的DNA片段。cDNA还可含有负责相应RNA分子中的翻译控制的非翻译区(UTR)。在实验室中通过从细胞提取的信使RNA的逆转录合成cDNA。
保守置换：基本上不改变分子的活性(特异性或结合亲和力)的氨基酸置换。通常，保守氨基酸置换涉及一个氨基酸置换另一个具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的氨基酸。下表显示了示例性保守氨基酸置换：
原残基 保守置换
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln；His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn；Gln
Ile Leu；Val
Leu Ile；Val
Lys Arg；Gln；Glu
Met Leu；Ile
Phe Met；Leu；Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp；Phe
Val Ile；Leu
对照杀真菌素链霉菌菌株：天然存在的野生型菌株杀真菌素链霉菌ATCC 21013。
DNA(脱氧核糖核酸)：包含大多数活生物体的遗传物质(一些病毒具有包含核糖核酸(RNA)的基因)的长链聚合物。DNA聚合物中的重复单元是四种不同的核苷酸，各自包含与磷酸基团连接的脱氧核糖结合的四种碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一种。核苷酸三联体(称为密码子)编码多肽中的各氨基酸。术语密码子也用于DNA序列转录的mRNA中三个核苷酸的相应(和互补)序列。
除非另有说明，否则对DNA分子的任何提及旨在包括该DNA分子的反向互补。除了本文所要求的单链性之外，DNA分子尽管写成仅描绘单链，但包含双链DNA分子的两条链。因此，对编码特定蛋白质或其片段的核酸分子的提及包含正义链及其反向互补。因此，例如，从所公开的核酸分子的反向互补序列产生探针或引物是合适的。
结构域：分子例如蛋白质或核酸的一部分，其在结构上和/或功能上与分子的另一部分不同。
编码：如果多核苷酸在其天然状态下或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，可以转录和/或翻译以产生mRNA和/或多肽或其片段，则称其为“编码”多肽。反义链是这种核酸的互补序列，并且可以从中推导出编码序列。
恩拉霉素：恩拉霉素A和B是在20世纪60年代后期从土壤细菌杀真菌素链霉菌B-5477(ATCC 21013)的发酵中发现的17个氨基酸的脂缩酚肽。A和B肽是在连接的脂链的长度上相差一个碳的同源物。在结构上，恩拉霉素通过C12或C13 2Z,4E支链脂肪酸部分和许多非蛋白原氨基酸残基的存在而区分，例如enduracididine(End)、4-羟基苯甘氨酸(Hpg)、3,5-二氯-4-羟基苯甘氨酸(Dpg)、瓜氨酸(Cit)和鸟氨酸(Orn)。17种氨基酸的7个具有D构型,6种残基为Hpg或氯化类似物Dpg。
多肽的功能片段和变体：包括维持母体多肽的一种或多种功能的那些片段和变体。已经认识到，编码多肽的基因或cDNA可以显著突变而不实质性改变一种或多种多肽的功能。首先，遗传密码是简并的，因此不同的密码子编码相同的氨基酸。其次，即使引入氨基酸置换，突变也可以是保守的，并且对蛋白质的基本功能没有实质性影响。参见StryerBiochemistry 3rd Ed.,(c)1988。第三，可以删除部分多肽链而不损害或消除其所有功能。第四，可以在多肽链中进行插入或添加，例如，添加表位标签，而不损害或消除其功能(Ausubel等，J.Immunol.159(5):2502-12,1997)。可以在不实质性损害多肽的一种或多种功能的情况下进行的其他修饰包括，例如，体内或体外化学和生物化学修饰或掺入不常见的氨基酸。这些修饰包括，例如，乙酰化、羧化、磷酸化、糖基化、泛素化、标记，例如用放射性核素和各种酶修饰，如本领域技术人员将容易理解的。用于标记多肽的多种方法和用于此目的的标记包括放射性同位素，例如32P，与标记的特异性结合配偶体(例如抗体)结合或被结合的配体、荧光团、化学发光剂、酶和抗配体。功能片段和变体可以具有不同的长度。例如，一些片段具有至少10、25、50、75、100、200或甚至更多的氨基酸残基。
有效量：足以在受试者中实现期望效果的特定化合物或组合物的量或浓度。有效量可至少部分地取决于所治疗动物的种类、动物的大小和/或所需效果的性质。
基因簇：一组在染色体上组合在一起的遗传元件，其蛋白质产物具有相关功能，例如形成天然产物的生物合成途径。
异源：在其涉及核酸序列例如编码序列和控制序列时，“异源”表示通常与重组构建体的区域不相关的序列，和/或通常与特定细胞不相关的序列。因此，核酸构建体的“异源”区域是在自然界中未发现与其他分子相关的另一种核酸分子内或与之附着的核酸的可识别区段。例如，构建体的异源区可以包含侧翼为发现与自然界中的编码序列无关的序列的编码序列。异源编码序列的另一个实例是其中编码序列本身未在自然界中被发现的构建体(例如，具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。类似地，出于本公开的目的，用通常不存在于宿主细胞中的构建体转化的宿主细胞将被认为是异源的。
同源氨基酸序列：由与编码区核酸序列的任何部分杂交的核酸序列全部或部分编码的任何多肽。同源氨基酸序列是通过一个或多个保守氨基酸置换而不同于序列表中所示氨基酸序列的序列。这样的序列还包括等位基因变体(如上定义)以及含有保留多肽功能特征的缺失或插入的序列。优选地，这样的序列与任何一种氨基酸序列至少75％、更优选80％、更优选85％、更优选90％、更优选95％、最优选98％相同。
同源氨基酸序列包括与序列表的氨基酸序列相同或基本上相同的序列。“氨基酸序列基本上相同”是指与参考氨基酸序列至少90％、优选95％、更优选97％、最优选99％相同的序列，并且优选与参考序列的区别在于大部分的保守氨基酸置换。与本发明的这个方面一致，具有与序列表的任何一个氨基酸序列同源的序列的多肽包括天然存在的等位基因变体，以及保留本文公开的序列的任何多肽的固有特征的突变体或任何其他非天然存在的变体。可以使用序列分析软件测量同源性，例如Sequence Analysis Software Package ofthe Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,Wl 53705。可以比对氨基酸序列以最大化同一性。也可以人工地将缺口引入序列中以获得最佳比对。一旦建立了最佳比对，通过记录两条序列的氨基酸相同的所有位置相对于位置总数来建立同源性程度。同源多核苷酸序列以类似方式定义。优选地，同源序列是与任何一种编码序列至少45％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或相同。
杂交：寡核苷酸和其他核酸通过互补碱基之间的氢键杂交，包括Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键。通常，核酸由为嘧啶(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))的含氮碱基组成。这些含氮碱基在嘧啶和嘌呤之间形成氢键，并且嘧啶与嘌呤的键合被称为碱基配对。更具体地，A将与T或U氢键合，并且G将与C键合。互补是指在两个不同的核酸序列或相同核酸序列的两个不同区域之间发生的碱基配对。
可特异性杂交和可特异性互补是表示足够程度的互补性，使得在第一核酸(例如寡核苷酸)和DNA或RNA靶标之间发生稳定和特异性结合的术语。第一核酸(例如寡核苷酸)不需要与其靶序列100％互补即可特异性杂交。当存在足够程度的互补性时，第一核酸(例如寡核苷酸)可特异性杂交以避免在期望特异性结合的条件下第一核酸(例如寡核苷酸)与非靶序列非特异性结合。这样的结合称为特异性杂交。
导致特定严格程度的杂交条件将根据所选杂交方法的性质和杂交核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na+浓度)将决定杂交的严格性，尽管洗涤时间也影响严格性。Sambrook等(ed.)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2nd ed.,vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY,1989,第9章和第11章讨论了实现特定严格程度所必需的杂交条件的计算。
以下是示例性的杂交条件组但并不意味着限制。
非常高严格性(检测具有90％序列同一性的序列)
杂交：5×SSC在65ΕC持续16小时
洗涤两次：2×SSC在室温下各15分钟
洗涤两次：0.5×SSC在65ΕC下各20分钟
高严格性(检测具有80％或更高序列同一性的序列)
杂交：5×-6×SSC在65ΕC-70ΕC下持续16-20小时
洗涤两次：2×SSC在室温下各5-20分钟
洗涤两次：1×SSC在55ΕC-70ΕC下各30分钟
低严格性(检测序列同一性超过50％的序列)
杂交：6×SSC在RT至55ΕC下持续16-20小时
洗涤至少两次：2×-3×SSC在室温下各20-30分钟。
分离的：分离的生物组分(例如核酸分子或蛋白质)是基本上与生物体细胞中其他生物组分分离或纯化的组分，其中组分是天然存在的，例如其他染色体和外染色体DNA和RNA、蛋白质和细胞器。关于核酸和/或多肽，该术语可以指不再侧接通常在自然界中位于它们侧翼的序列的核酸或多肽。已经分离的核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸。
突变：引起细胞或生物的遗传物质(通常是DNA或RNA)序列变化的过程。使用本领域中公知的分子生物学技术(例如，位点定向诱变、PCR诱变和其它)可以将突变有意地引入到遗传物质。
非核糖体肽(NRP)：一类次级代谢产物，通常由微生物例如细菌和真菌产生。与在核糖体上合成的多肽不同，这些肽由非核糖体肽合成酶(NRPS)从氨基酸合成。
非核糖体肽骨架组装：非核糖体肽生物合成的第二步，其包括肽序列的酰胺键形成(缩合)。
非核糖体肽合成酶(NRPS)：通过非核糖体机制合成多肽的大的多功能蛋白，通常称为巯基模板(thiotemplate)合成(Kleinkauf and von DoehrenAnn.Rev.Microbiol.41:259-289,1987)。这样的非核糖体多肽可以具有直链、环状或支链环状结构，并且通常含有蛋白质中不存在的氨基酸或通过甲基化或差向异构化修饰的氨基酸。在特定的实例中，NRPS产生二肽。
非核糖体肽定制：非核糖体肽生物合成的第三步。在非核糖体肽中发现了许多新的前体氨基酸，并且这些结构单元中的许多在连接到特定蛋白质或NRPS的PCP结构域时形成或修饰。该合成后修饰可在肽骨架形成酰胺键后发生。示例性修饰包括α-碳差向异构化、N-甲基化、Cys或Ser/Thr残基与噻唑啉和噁唑啉的杂环化，以及侧链卤化或羟基化。其他修饰例如氧化、烷基化、酰化和糖基化可以在从NRPS复合物释放新生肽后发生，并且经常需要完全的生物活性。
非核糖体前体氨基酸生物合成：非核糖体肽生物合成的第一步。非核糖体肽通常具有在核糖体上组装的肽和蛋白质中未发现的氨基酸。这些非蛋白原氨基酸有助于这些肽的多样性，并且通常在它们的生物活性中起作用。这些氨基酸的生物合成可以通过蛋白质结合的中间体或作为游离的可溶性物质发生。
核酸：单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另有限制，否则包括以与天然存在的核苷酸相似的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。
核苷酸：该术语包括但不限于包含与糖连接的碱基例如嘧啶、嘌呤或其合成类似物，或如在肽核酸中的与氨基酸连接的碱基的单体。核苷酸是多核苷酸中的一种单体。核苷酸序列是指多核苷酸中的碱基序列。
寡核苷酸：通过天然磷酸二酯键连接的多个连接的核苷酸，长度为约6至约300个核苷酸。寡核苷酸类似物是指与寡核苷酸功能相似但具有非天然存在部分(portion)的部分(moiteties)。例如，寡核苷酸类似物可含有非天然存在的部分，例如改变的糖部分或糖间键，例如硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸。天然存在的多核苷酸的功能类似物可以与RNA或DNA结合，并且包括肽核酸分子。
特定的寡核苷酸和寡核苷酸类似物可以包括长度最多约200个核苷酸的线性序列，例如至少6个碱基，例如至少8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100或甚至200个碱基长，或约6至约50个碱基，例如约10-25个碱基，例如12、15或20个碱基的序列(例如DNA或RNA)。
开放阅读框(ORF)：编码氨基酸而没有任何内部终止密码子的一系列核苷酸三联体(密码子)。这些序列通常可翻译成肽。例如，ORF，开放阅读框，和恩拉霉素ORF是指从杀真菌素链霉菌分离的恩拉霉素生物合成基因簇中的开放阅读框。该术语还包括与其他恩拉霉素-合成生物中存在的相同的ORF。该术语包括等位基因变体和单核苷酸多态性(SNP)。在某些情况下，术语恩拉霉素ORF与由恩拉霉素ORF编码的多肽同义使用，并且可包括该多肽中的保守置换。具体用法将从上下文中清楚。
已被无效(null)的开放阅读框是通过在编码序列中缺失、插入或突变一个或多个核苷酸而已经没有功能的开放阅读框。
包含减弱的开放阅读框18(orf18)的杀真菌素链霉菌是指通过orf18的遗传修饰，包括下文示例的orf18被无效，和/或通过调控操纵，例如修饰、插入、去除和/或替换编码ORF18的基因的非编码区，导致orf18基因产物表达降低，而相对于野生型杀真菌素链霉菌具有orf18的基因产物的生物功能的降低(例如2倍)或甚至完全丧失的生物体。例如，可以修饰orf18的野生型启动子以显著降低orf18的转录。
包含增强的开放阅读框24(orf24)的杀真菌素链霉菌是指通过orf24的遗传修饰以增强orf24的基因产物的生物功能，和/或通过调控操纵，例如修饰、插入、去除和/或替换编码ORF24的基因的非编码区，导致orf24基因产物表达的增加，而相对于野生型杀真菌素链霉菌具有orf24的基因产物的生物功能的增加(例如2倍或更多)的生物体。例如，orf24的野生型启动子被增强orf24转录的强组成型启动子替换，如下文示例的。
修饰基因：与天然存在的(野生型)基因中发现的相比含有修饰的基因序列。
可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且需要在相同的阅读框中连接两个蛋白质编码区。
直系同源物：如果两条核酸或氨基酸序列具有共同的祖先序列并且当携带该祖先序列的物种分裂成两个物种时分叉，则它们是彼此的直系同源物。直系同源序列也是同源序列。
多肽：其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-光学异构体或D-光学异构体，在一些情况下优选L-异构体。如本文所用的术语多肽或蛋白质包括任何氨基酸序列并包括修饰的序列，例如糖蛋白。术语多肽特别旨在涵盖天然存在的蛋白质(无论是通过核糖体还是非核糖体机制产生)，以及重组或合成产生的蛋白质。
术语多肽片段是指展示至少一个有用表位的多肽的一部分。术语多肽的功能片段是指保留片段衍生自其的多肽的活性(例如生物学活性)或活性的可测量部分的多肽的所有片段。片段例如大小可以从小至能够结合抗体分子的表位的多肽片段变化到能够参与细胞内表型变化的特征诱导或编程的大多肽。
如本文所用的术语“基本上纯化的多肽”是指基本上不含与其天然相关的其他蛋白质、脂质、碳水化合物或其他物质的多肽。在一个实施方式中，多肽至少50％，例如至少80％不含与其天然相关的其他蛋白质、脂质、碳水化合物或其他物质。在另一个实施方式中，多肽至少90％不含与其天然相关的其他蛋白质、脂质、碳水化合物或其他物质。在另一个实施方式中，多肽至少95％不含与其天然相关的其他蛋白质、脂质、碳水化合物或其他物质。
探针和引物：可以基于本公开中提供的核酸分子容易地制备核酸探针和引物。探针包含与可检测标记或报告子连接的分离的核酸。典型的标记包括放射性同位素、酶底物、辅因子、配体、化学发光或荧光剂、半抗原和酶。例如，在Sambrook等(In MolecularCloning:A Laboratory Manual,CSHL,New York,1989)和Ausubel等(In CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publ.Assoc.and Wiley-Intersciences,1992)讨论了用于标记的方法和适合于各种目的的标记的选择指南(在MolecularCloning：ALaboratoryManual，CSHL，NewYork，1989)和Ausubel等。(在CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePubl.Assoc。和Wiley-Intersciences，1992)。
引物是短核酸分子，优选DNA寡核苷酸，长度为10个核苷酸或更长。更优选地，较长的DNA寡核苷酸的长度可为约15、17、20或23个核苷酸或更多。引物可通过核酸杂交与互补的靶DNA链退火以在引物和靶DNA链之间形成杂交体，然后引物通过DNA聚合酶沿靶DNA链延伸。引物对可用于扩增核酸序列，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或本领域已知的其他核酸扩增方法。
制备和使用探针和引物的方法描述于例如Sambrook等(In Molecular Cloning:ALaboratory Manual,CSHL,New York,1989),Ausubel等(In Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publ.Assoc.and Wiley-Intersciences,1998),和Innis等(PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.,SanDiego,CA,1990)。PCR引物对可以衍生自已知序列，例如，通过使用用于该目的的计算机程序，例如Primer(Version 0.5,
Figure BDA0002158001920000211
1991,Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge,MA)。特定探针或引物的特异性随其长度而增加。因此，为了获得更高的特异性，可以选择包含期望的核苷酸序列的至少17、20、23、25、30、35、40、45、50或更多个连续核苷酸的探针和引物。
蛋白质：由基因表达并且包含氨基酸的生物分子。
纯化：术语纯化不需要绝对纯度；相反，它是作为一个相对术语。因此，例如，纯化的蛋白质制剂是其中所提到的蛋白质比在细胞内的天然环境中的蛋白质更纯的蛋白质制剂。
重组体：具有非天然存在的序列或具有通过两个否则是分离的序列区段的人工组合制备的序列的核酸。这种人工组合可以通过化学合成完成，或者更常见地，通过人工操作分离的核酸区段，例如通过基因工程技术。“重组”也用于描述已经被人工操作的核酸分子，但含有与分离基因的生物中发现的相同的控制序列和编码区。
调节抗生素生产：引起抗生素生产的数量、类型或质量的改变，例如增加或减少。本文公开了具有增强的恩拉霉素生产的杀真菌素链霉菌的重组菌株。
序列同一性：两条核酸序列之间或两条氨基酸序列之间的相似性以序列之间共享的序列同一性水平表示。序列同一性通常以同一性百分比表示；百分比越高，两条序列越相似。
比对序列用于比较的方法是本领域公知的。各种程序和比对算法描述于：Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988；Higgins和Sharp,Gene 73:237-244,1988；Higgins和Sharp,CABIOS 5:151-153,1989；Corpet等,Nucleic AcidsResearch 16:10881-10890,1988；Huang,等,Computer Applications in theBiosciences 8:155-165,1992；Pearson等,Methods in Molecular Biology 24:307-331,1994；Tatiana等，(1999),FEMS Microbiol.Lett.,174:247-250,1999。Altschul等提出了序列比对方法和同源性计算的详细考虑(J.Mol.Biol.215:403-410,1990)。
国家生物技术信息中心(NCBI)Basic Local Alignment Search Tool(BLASTTM,Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-410,1990)可从若干来源获得，包括国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和因特网上用于序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx。有关如何使用此程序确定序列同一性的说明请访问Internet上的BLASTTM帮助部分。
对于大于约30个氨基酸的氨基酸序列的比较，使用BLASTTM(Blastp)程序的“Blast2序列”功能，使用默认BLOSUM62矩阵设置为默认参数(打开缺口的成本[默认＝5]；延伸缺口的成本[默认＝2]；错配惩罚[默认＝-3]；配对奖励[默认＝1]；期望值(E)[默认值＝10.0]；字大小[默认＝3]；单行描述数(V)[默认值＝100]；要显示的比对数(B)[默认值＝100])。当比对短肽(少于约30个氨基酸)时，应使用Blast2序列功能进行比对，使用PAM30矩阵设置为默认参数(打开缺口9，延伸缺口1罚分)。当通过该方法评估时，与参考序列具有甚至更大相似性的蛋白质(或核酸)将显示出增加的百分比同一性，例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列同一性。
为了比较核酸序列，使用BLASTTM(Blastn)程序的“Blast 2序列”功能，使用默认BLOSUM62矩阵设置为默认参数(打开缺口的成本[默认＝11]；延长差距的成本[default＝1]；期望值(E)[默认＝10.0]；字大小[default＝11]；单行描述数(V)[默认＝100]；要显示的比对数(B)[默认值]＝100])。当通过该方法评估时，与参考序列具有甚至更大相似性的核酸序列将显示出增加的百分比同一性，例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性。
两个核酸分子密切相关的替代指示是两个分子在严格条件下彼此杂交(参见上文“杂交”)。
然而，由于遗传密码的简并性，不显示高度同一性的核酸序列可编码相似的氨基酸序列。应当理解，可以使用该简并性来产生核酸序列的变化以产生全部编码基本上相同的蛋白质的多个核酸分子。
转染的：将核酸分子引入细胞的过程，例如通过分子生物学技术，产生转染(或转化)的细胞。如本文所用，术语转染包括可以将核酸分子引入这样的细胞的所有技术，包括用病毒载体转导，用质粒载体转染，以及通过电穿孔，脂质转染和粒子枪加速引入DNA。
转化的：转化细胞是通过分子生物学技术引入核酸分子的细胞。该术语包括可以将核酸分子引入这样的细胞的所有技术，包括用病毒载体转染，用质粒载体转化，以及通过电穿孔、脂质转染和粒子枪加速引入裸DNA。
转座子：在两端具有几乎相同的重复序列并且至少含有编码转座酶的基因(在DNA序列中插入转座子所需的酶)的移动遗传元件。转座子可以整合到细胞基因组中的不同位置，或体外分离的质粒、粘粒或福斯质粒DNA模板上。转座子也可含有除需要插入的基因之外的基因。
载体：引入宿主细胞的核酸分子从而产生转染的宿主细胞。重组DNA载体是具有重组DNA的载体。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包含一种或多种可选择的标志物基因和本领域已知的其他遗传元件。病毒载体是具有衍生自一种或多种病毒的至少一些核酸序列的重组DNA载体。质粒是载体。
除非另外说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。除非上下文另有明确说明，否则单数术语“一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数指示物。类似地，除非上下文另有明确说明，否则词语“或”旨在包括“和”。还应理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子量值是近似的，并且为了描述而提供。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或测试，下文描述了合适的方法和材料。术语“包括/包含”表示“含有”。如有冲突，以本说明书(包括术语解释)为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的而不是限制性的。
下面描述用于实施所公开实施方式的合适方法和材料。另外，普通技术人员公知的任何适当的方法或技术可用于实施所公开的实施方式。适用于本发明的一些常规方法和技术描述于例如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989；Sambrook等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,3d ed.,Cold Spring Harbor Press,2001；Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing Associates,1992(and Supplements to 2000)；Ausubel等,Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods fromCurrent Protocols in Molecular Biology,4th ed.,Wiley&Sons,1999；Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1990；Harlow and Lane,Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,1999；和Kieser,T.,Bibb,M.J.,Buttner,M.J.,Chater,K.F.,和Hopwood,D.A.:Practical Streptomyces genetics,John Innes Centre,NorwichResearch Park,Colney,Norwich NR4&UH,England,2000。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的全部内容都通过引用并入本文。如有冲突，将以本说明书(包括术语解释)为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的而不是限制性的。
III.杀真菌素链霉菌的工程化重组表达载体
本文公开了工程化杀真菌素链霉菌表达质粒载体。在一些实施方式中，工程化杀真菌素链霉菌载体包含至少一个选择的杀真菌素链霉菌的开放阅读框。在一些实施方式中，工程化重组杀真菌素链霉菌载体包含在启动子控制下表达的至少一个选择的杀真菌素链霉菌的开放阅读框。在一些实例中，启动子是强组成型链霉菌启动子，当载体在杀真菌素链霉菌菌株中表达时，导致恩拉霉素的生产增强。在一些实施方式中，开放阅读框可操作地连接到异源启动子而不是其自身的天然启动子。例如，它可以与组成型启动子例如强组成型表达启动子或诱导型启动子可操作地连接。在一些实例中，强组成型启动子是来自红霉素生产者的ermE*p。在一些实例中，诱导型启动子是tipA。在一些实例中，P(nitA)-NitR系统(Herai S,Hashimoto Y,Higashibata H,Maseda H,Ikeda H,Omura S,Kobayashi M,Proc Natl Acad Sci U S A.2004.101(39):14031-5)或链霉菌启动子SF14被使用。在一些实例中，阿泊拉霉素抗性基因的天然启动子(amRp)被使用。在一些实例中，PhrdB、Ptcp830、PSF14、PermE*和/或Pneos被使用。
在一些实施方式中，工程化重组载体包含已经被无效的开放阅读框orf24(SEQ IDNO:38)和/或开放阅读框orf18(SEQ ID NO:37)。在一些实例中，通过框内缺失、移码和/或点突变使开放阅读框orf18(SEQ ID NO:37)被无效。
在一些实施方式中，工程化重组载体包含来自杀真菌素链霉菌的恩拉霉素基因簇的开放阅读框orf24。在一些实例中，开放阅读框orf24(SEQ ID NO:38)与异源启动子可操作地连接。例如，它与强组成型启动子如ermE*p相连接。在其他实例中，开放阅读框orf24可操作地连接至启动子tipA、SF14、amRp、PhrdB、Ptcp830、PSF14、PermE*和/或Pneos。
在另一个实施方式中，工程化重组载体包含位于恩拉霉素基因簇的上游区域的开放阅读框orf18。开放阅读框orf18(SEQ ID NO:37)通过插入破坏、框内缺失、移码和/或点突变而被无效。在一些实例中，开放阅读框orf18通过框内缺失例如图9B中所示的框内缺失而被无效。在一个实例中，开放阅读框orf18(SEQ ID NO:37)通过框内缺失而被无效。例如，开放阅读框orf18(SEQ ID NO:37)通过orf18(SEQ ID NO:37)的核酸5至660的框内缺失而被无效。通常，orf18上的任何内部框内缺失由于其不完整而导致Orf18的无效功能。在一些实例中，框内缺失包含orf18(SEQ ID NO:37)中至少3个核酸的缺失，例如至少3个核酸，包括orf18(SEQ ID NO:37)的核酸5至660之间的3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51，54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126，129、132、135、138、141、144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、198、201，204、207、210、213、216、219、221、224、227、230、233、236、239、242、245、248、251、254、257、260、263、266、269、272、275，278、281、284、287、290、293、296、299、302、305、308、311、314、317、320、323、326、329、332、335、338、341、344、347、350，353、356、359、362、365、368、371、374、377、380、383、386、389、392、395、398、401、404、407、410、413、416、419、421、424，427、430、433、436、439、442、445、448、451、454、457、460、463、466、469、472、475、478、481、484、487、490、493、496、499，502、505、508、511、514、517、520、523、526、529、532、535、538、541、544、547、550、553、556、559、562、565、568、571、574，577、580、583、586、589、592、595、598、601、604、607、610、613、616、619、621、624、627、630、633、636、639、642、645、648、651或654个核酸。
在相关的实施方式中，工程化重组质粒载体涉及来自恩拉霉素基因簇的两个或更多个开放阅读框和/或该基因簇侧翼的区域或者来自其他放线菌菌株的两个或更多个开放阅读框和/或该基因簇侧翼的区域。两个或更多个开放阅读框可以与单个启动子连接。或者，它们可以与两个不同的启动子可操作地连接。两个启动子可以是相同类型的启动子。或者，它们可以是两种不同类型的启动子。
在其他实施方式中，可以在杀真菌素链霉菌的工程化菌株中引入或失活可以增加恩拉霉素生产的另外的或替代的开放阅读框。
在一些实例中，重组质粒是pXY152-endorf24(SEQ ID NO:3)。在一些实例中，重组质粒是pXY300-orf18ifd(SEQ ID NO:8)。在一些实例中，重组质粒是pKS-T-orf18ifd(SEQID NO:11)。在一些实例中，重组质粒是pKS-T-orf18pfrd-AmR(SEQ ID NO:14)。在一些实例中，重组质粒是pKS-orf18ifd-T-AmR(NS)(SEQ ID NO:19)。在一些实例中，重组质粒是pXY152-endorf24-camtsr(SEQ ID NO:20)。在一些实例中，重组质粒是pXY152-endorf24-blatsr(SEQ ID NO:23)。
IV.杀真菌素链霉菌的工程化重组菌株
本文公开了与对照菌株(例如野生型杀真菌素链霉菌菌株或工业母体菌株)相比能够生产增加的恩拉霉素的工程化重组杀真菌素链霉菌菌株。在一些实施方式中，工程化的重组杀真菌素链霉菌菌株包含至少一个选择的来自杀真菌素链霉菌的开放阅读框，其被引入到染色体上并在启动子(例如强组成型链霉菌启动子)的控制下表达，导致在工程化菌株中恩拉霉素生产的增加。在一些实施方式中，在杀真菌素链霉菌中引入的开放阅读框的表达由异源启动子而不是其自身的天然启动子驱动。例如，它可以与组成型启动子例如强组成型表达启动子或诱导型启动子可操作地连接。在一些实例中，强组成型启动子是来自红霉素生产者的ermE*p。在一些实例中，诱导型启动子是tipA。在一些实例中，P(nitA)-NitR系统(参见Herai S,Hashimoto Y,Higashibata H,Maseda H,Ikeda H,Omura S,Kobayashi M,Proc Natl Acad Sci U S A.,2004.101(39):14031-5)或链霉菌启动子SF14被使用。在一些实例中，组成型表达启动子是amRp。在一些实例中，PhrdB、Ptcp830、PSF14、PermE*和/或Pneos启动子被使用。
在一些实施方式中，工程化菌株包含来自杀真菌素链霉菌的恩拉霉素基因簇的开放阅读框orf24。在一些实例中，开放阅读框orf24可操作地连接至异源启动子。例如，它与强组成型启动子例如ermE*p连接。在其他实例中，开放阅读框orf24可操作地连接至启动子tipA、SF14、amRp、PhrdB、Ptcp830、PSF14、PermE*和/或Pneos。
在另一个实施方式中，工程化菌株与位于恩拉霉素基因簇的上游区域的开放阅读框orf18相关。开放阅读框orf18通过插入破坏、框内缺失、移码和/或点突变而被无效。在一些实例中，开放阅读框orf18通过框内缺失例如图9B中所示的框内缺失而被无效。在一个实例中，开放阅读框orf18(SEQ ID NO:37)通过框内缺失而被无效。例如，开放阅读框orf18(SEQ ID NO:37)通过(SEQ ID NO:37)的核酸5至660的框内缺失而被无效。通常，orf18上的任何内部框内缺失由于其不完整性都应该导致Orf18的无效功能。
在相关的实施方式中，工程化菌株涉及来自恩拉霉素基因簇的两个或更多个开放阅读框和/或该基因簇侧翼的区域或者来自其他放线菌菌株的两个或更多个开放阅读框和/或该基因簇侧翼的区域。两个或更多个开放阅读框可以与单个启动子连接。或者，它们可以与两个不同的启动子可操作地连接。两个启动子可以是相同类型的启动子。或者，它们可以是两种不同类型的启动子。
在其他实施方式中，可以在杀真菌素链霉菌的工程化菌株中引入或失活可以增加恩拉霉素生产的另外的或替代的开放阅读框。
在一些实施方式中，杀真菌素链霉菌的工程化菌株衍生自野生型母体菌株，例如但不限于杀真菌素链霉菌American Tissue Culture Company(ATCC)21013。在其他实施方式中，杀真菌素链霉菌的工程化菌株衍生自工业母体菌株，例如但不限于BM38-2(ATCCPTA-122342)。在其它实施方式中，杀真菌素链霉菌的工程化菌株衍生自常规突变菌株，例如但不限于杀真菌素链霉菌ATCC 31729、杀真菌素链霉菌ATCC 31730和杀真菌素链霉菌ATCC 31731。
在一些实施方式中，恩拉霉素的生产增加是与对照杀真菌素链霉菌菌株相比恩拉霉素生产至少1.2倍增加，例如至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍增加，包括但不限于1.2至10倍增加，1.2至4.6倍增加，2至5倍增加，例如1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10倍增加。在一些实施方式中，对照杀真菌素链霉菌菌株是野生型杀真菌素链霉菌菌株，包括但不限于杀真菌素链霉菌American TissueCulture Company(ATCC)21013或工业母体菌株，例如但不限于BM38-2(ATCC PTA-122342)或常规突变菌株，例如但不限于杀真菌素链霉菌ATCC 31729、杀真菌素链霉菌ATCC 31730和杀真菌素链霉菌ATCC 31731。在一个实例中，对照是杀真菌素链霉菌ATCC 21013，并且增强的恩拉霉素生产的增加是至少1.2倍增加，例如1.2至4.6倍增加。在一个实例中，对照是杀真菌素链霉菌BM38-2(ATCC PTA-122342)，并且增强的恩拉霉素生产的增加是至少1.2倍增加，例如1.2至4.6倍增加。
V.杀真菌素链霉菌的工程化重组菌株的构建
在实施方式中，杀真菌素链霉菌的重组菌株可通过将包含至少一个恩拉霉素生产增加开放阅读框的重组质粒整合到杀真菌素链霉菌的母体菌株的染色体中。整合的接合载体可以具有或可以被工程化以具有强组成型链霉菌启动子。在一些实施方式中，质粒可以缺少链霉菌复制子，并且可以通过位点特异性单交换同源重组整合到染色体中。在其他实施方式中，质粒可以作为游离质粒存在。在一些实施方式中，可以工程化其中质粒插入物携带部分或完全缺失的感兴趣基因及其侧翼区的接合载体，其可以在双交换同源重组后整合到染色体中以产生框内缺失突变体。
VI.从杀真菌素链霉菌的工程化重组菌株生产恩拉霉素
本公开提供的杀真菌素链霉菌的工程化重组菌株提供生产增加水平的恩拉霉素的方法。本领域的这种技术进步允许与恩拉霉素的生产相关的显著成本节省。在一些实例中，生产恩拉霉素的方法包括在足以生产恩拉霉素的条件下培养所公开的杀真菌素链霉菌的重组菌株。在一些实例中，该方法还包括在培养后从培养基中分离恩拉霉素。在一些实例中，该方法还包括确定所生产的恩拉霉素的抗细菌活性，例如通过HPLC分析或使用金黄色葡萄球菌ATCC 29213或枯草芽孢杆菌ATCC 6633作为指示微生物的生物测定。
在一些实例中，通过利用如前所述的用于生产恩拉霉素的发酵条件从公开的杀真菌素链霉菌菌株生产恩拉霉素(Higashide等，J.Antibiot.21：126-137,1968)。在生产之后，可以纯化和/或分析化合物，包括如实施例1中所述的HPLC分析。生产恩拉霉素并从生长培养基中收获该化合物的方法可以在美国专利4,465,771中找到，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实例中，将公开的杀真菌素链霉菌菌株在胰酶大豆培养基(TSB)中在振荡器上(例如在225rpm和30℃下培养48小时)培养，然后转移至恩拉霉素生产培养基(EPM，下表1)。连续发酵一段时间，例如至少5天和多达11天，包括连续发酵5、6、7、8、9、10或11天。在一些实例中，野生型和衍生菌株生产恩拉霉素在自动发酵罐中进行。
表1.恩拉霉素生产培养基(EPM)组合物(pH6.7)
成分 浓度(％)
可溶性淀粉 1.5
葡萄糖 1.0
玉米粉 2.5
玉米麸粉 2.0
玉米浆 0.25
氯化钠 0.25
NaH2PO4 1.3
KH2PO4 0.05
(NH4)2SO4 0.15
CaCO3 0.5
乳糖 0.5
ZnCl2 0.005
鸡油 0.7
在一些实例中，杀真菌素链霉菌生物质通过在具有监测和控制pH、温度、氧气、通气、搅拌的系统的深槽卫生设计工业发酵罐中的发酵过程生产。例如，杀真菌素链霉菌的每个发酵批次是从储存在安全的位置并保持在低温环境中的生产种子的特征化和受控制的工作种子原液开始的。
在一些实例中，发酵过程在一个或多个阶段中发生，例如在三个阶段之后，并且任选地随后在下游进一步处理：
阶段I：
使用特征化的已建立的工作种子培养物来开始发酵批次。从低温储存中取出一至五瓶冷冻种子小瓶并自然解冻或置于28℃-32℃的水浴中直至内容物解冻。将解冻的培养物无菌转移到保持在室温的无菌水中并轻轻混合以重悬培养物。
阶段II：
将重悬的培养物无菌转移到0.005m3-0.05m3种子培养基中。种子培养基包含葡萄糖(0.1-1.0g/L)、糊精(0.1-3g/L)、玉米浆(0-5.0mL/L)、大豆粉(1-5.0g/L)、硫酸铵(0.1-0-0.5g/L)、磷酸二氢钾(0.13-0.54g/L)、硫酸亚铁(0.00-0.5g/L)、氢氧化钾(0.13mL/L)，碳酸钙(1-2g/L)、硅氧烷基消泡剂(0.1mL/L)、适量水。在125℃-128℃下灭菌30-45分钟，然后冷却至28℃-32℃。使用无菌水将培养基的体积调节至所需的工作体积。将pH调节至6.5-7.0。
种子放大周期的操作参数包括：孵化温度28℃±2℃，内压1.0±0.5kg/cm2，通气速率3±2Nm3/min，搅拌速度约80℃。转速，取决于容器的尺寸和配置。监测pH、氧气消耗和粘度但不控制。培养物在转移到主要生产发酵罐之前生长40-80小时。转移时的粘度应为200-600cps，pH值应≤6.0，氧气消耗量应增加。将种子培养物无菌转移到主发酵培养基中以完成发酵周期。
阶段III：
生产发酵罐培养基(10m3-250m3)组合物包含天然和化学成分，例如玉米粉(13.0-15.0w/v％)、玉米麸粉(3.0-6.0w/v％)、棉籽粉(0.1-0.3w/v％)、玉米浆(0.1-0.6v/v％)、氯化钠(0.3w/v％)、硫酸铵(0.25-0.6w/v％)、乳酸(0-0.5v/v％)、氯化锌(0.01w/v％)、硫酸亚铁(0.0-0.02w/v％)、氢氧化钾(0.20-0.5v/v％)、硫酸钙(0.0-0.5w/v％)、碳酸钙(0.5w/v％)、淀粉酶(0.02-0.06w/v％)、氢氧化钾(0.05v/v％)、植物油(0.5-2.0v/v％)、消泡剂、和适量水。根据列出的顺序添加原料。向原料中加水，然后加热至70-90℃，使酶在温度下分解复合碳水化合物15分钟。加入剩余成分，调节pH值至6.6-6.8，加水适量，在125℃-128℃灭菌25-50分钟，对培养基进行灭菌。将介质冷却至25℃-32℃，并加水至适量的工作体积。
将种子发酵罐中的内容物转移到主发酵培养基中，将发酵罐设置为以下条件：温度28℃±3℃，通气速率20-60Nm3/min，内压0.1-1.0kg/cm2，搅拌速度相当于约1.85kW/m3。根据需要调节通气速率、内部压力和搅拌速率以确保溶解氧不是限制速率决定因素。在整个周期中小心控制泡沫以防止污染或流出。在需氧量增加后开始控制pH值。在整个发酵周期中控制和/或监测以下参数：pH、通气、溶解氧、CO2、粘度、纯度、搅拌速度、内部压力和残余糖。保持pH值为6.8直至细菌生长停止，然后使pH自然变化直至收获。典型的发酵周期为210-300小时。当效价大于5,000μl/L，pH升至7.5或更高，粘度降低，并且需氧停止时，即可收获培养物。
通过将培养物加热至70℃持续30分钟以使细菌失活来收获发酵，然后将收获液冷却至25℃-32℃。
在一些实例中，下游处理包括从生物质中除去水、干燥生物质和将干燥的生物质配制成预混物。
生物材料的保藏
以下生物材料已根据布达佩斯条约的条款保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，并提供以下保藏号：
Figure BDA0002158001920000321
Figure BDA0002158001920000331
上述菌株已经在确保依据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122在本专利申请未决期间专利和商标局长确定有权的人可以获得培养物的条件下保藏。保藏代表保藏菌株的基本上纯的培养物。在其中提交本申请的同族或其后代的国家中，保藏是如外国专利法要求的可获得。然而，应该理解的是，保藏的可获得性并不构成减损由政府行为授予的专利权而实施本发明的许可。
提供以下非限制性示例以说明某些特定特征和/或实施方式。这些实施例不应被解释为将本公开限制于所描述的特定特征或实施方式。
实施例
实施例1
用于增加恩拉霉素生产的材料和方法
该实施例提供增加恩拉霉素生产的代表性方法。
细菌菌株、质粒、福斯质粒和培养条件。
杀真菌素链霉菌B-5477(ATCC 21013)和大肠杆菌S17-1(ATCC 47055)购自ATCC。杀真菌素链霉菌菌株BM38-2(ATCC PTA-122342)和恩拉霉素A和B的标准品由Intervet/Merck Animal Health(MAH)提供。大肠杆菌菌株DH5α(Life Technologies,Inc.)、EPI300(Epicentre)和XL10-Gold(Stratagene)用作大肠杆菌质粒、福斯质粒和大肠杆菌-链霉菌穿梭载体的宿主。质粒pSET152(Bierman等，Gene 116：43-49,1992，其全部内容通过引用并入本文)和pIJ773由Keith Chater教授(JIC，Norwich，UK)提供。携带ermE*p启动子的质粒pWHM860由Bradley Moore教授(UCSD，San Diego)提供。ISP2(DifcoTM ISP Medium2)、ISP4和TSB(BactoTM胰酶大豆培养基)购自VWR。用于PCR和DNA测序的引物由Fisher和Sigma-Aldrich合成。用于生长杀真菌素链霉菌的培养基和培养条件由Higashide等(Journal ofAntibiotics，21：126-137，1968)描述。根据标准方案进行所有大肠杆菌程序。
DNA分离和操作。
为了制备来自杀真菌素链霉菌B-5477、BM38-2(ATCC PTA-122342)的基因组DNA和用于测序、福斯质粒文库构建、亚克隆和PCR的衍生重组体和突变菌株，在补充有5mM MgCl2和0.5％甘氨酸的100mL TSB液体培养基中接种并生长来自个体菌株的新鲜收获的孢子。代表性培养物在500mL Erlenmeyer烧瓶中在225rpm的旋转振荡培养箱中于30℃下进行48至72小时。通过在4000rpm和4℃下离心15分钟收获菌丝体细胞。弃去上清液，用一次10.3％蔗糖，两次10mM Tris-HCl和1mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，pH8.0(TE缓冲液)依次洗涤沉淀。将相当于80μL水体积的湿细胞分配到1.5mL无菌微量离心管中。加入含有200μL 10mMTris-HCl和1mM EDTA，pH8.0和0.3M蔗糖(TES缓冲液)，50μL 0.5M EDTA，50μL溶菌酶(50mg/mL)的300μL裂解溶液后，将试管在37℃下孵育30至60分钟直至溶液变粘。接下来，向每个管中加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)和180μL 10％十二烷基硫酸钠(SDS)。在温和但彻底混合后，将溶液在37℃下孵育90分钟。然后，加入80μL 10％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。彻底混合后，将管在65℃下孵育10分钟。用600μL苯酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)萃取溶液两次。回收上层水相中的基因组DNA，并用0.6体积的异丙醇沉淀。将收获的基因组DNA用70％乙醇洗涤两次。在室温下干燥10分钟后，将基因组DNA溶解在50至100μL无菌水中。通过用HindIII和Sau3AI消化确认基因组DNA制备的高质量，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳显示完全消化并且没有未消化的基因组DNA的降解。用RNase进一步消化合并的基因组DNA以除去RNA污染。用Nanodrop分光光度计测定基因组DNA的纯度和量。进行包括琼脂糖凝胶电泳的一般链霉菌DNA操纵，并使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)从大肠杆菌菌株制备质粒和福斯质粒。限制性内切核酸酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、转座酶、Klenow酶、碱性磷酸酶和连接酶购自Biolabs、Invitrogen、Epicenter和Roche，并根据制造商的推荐使用。使用QIAquickGel Extraction试剂盒纯化DNA片段。
PCR。
菌落PCR如下进行：将来自独立突变候选菌落的孢子接种在TSB液体培养物中。在生长48至72小时后，通过离心收获菌丝体，并用TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA)，pH8.0洗涤两次。菌丝体重悬浮在无菌H2O中，并在含有60μL菌丝体、150pmol各引物、20μl 5×AccuPrime富GC缓冲液A(Invitrogen)和来自Expand长模板PCR系统(Roche)的1μl Polymix(在80℃下加入)的最终体积为100μl的PCR反应混合物中用作模板。PCR如下进行：在95℃下进行1个循环3分钟，在95℃下进行30个循环各1分钟，在55℃下进行1分钟，在72℃下进行2分钟。在72℃下进行一个延伸循环10分钟终止反应。对PCR产物进行凝胶纯化和测序。如上所述类似地进行通用PCR，不同之处在于使用分离的基因组DNA、质粒/福斯质粒DNA作为模板，而不是直接使用从菌丝体菌落释放而未事先纯化的DNA。
构建整合表达质粒pXY152-endorf24
为了异位表达来自杀真菌素链霉菌野生型和BM38-2(ATCC PTA-122342)菌株的恩拉霉素基因簇的推定调控基因orf24，将orf24克隆到从pXY152aR20(Yin等J.NaturalProducts,73:583-589,2010，其全部内容通过引用并入本文)衍生的整合质粒pXY152中，使用正向引物(End24Ndpf：
Figure BDA0002158001920000351
(SEQ ID NO:1，以粗体显示NdeI位点)和反向引物(End24ERpr：
Figure BDA0002158001920000352
(SEQ ID NO:2，以粗体显示EcoRI位点)从杀真菌素链霉菌基因组DNA中PCR扩增orf24。用NdeI和EcoRI消化PCR产物。然后将凝胶纯化的orf24片段与类似地限制性的载体pXY152连接。得到的质粒命名为pXY152-endorf24(图2；SEQ ID NO:3)。通过测序确认orf24插入无误。
用于Orf18的框内缺失的质粒pXY300-orf18ifd的构建
pXY300-orf18ifd是通过克隆orf18侧翼的两个片段而构建并且注定缺失到pXY300中，其是含有用于选择杀真菌素链霉菌的硫链丝菌素抗性基因(tsr)的大肠杆菌链霉菌穿梭偶联温度敏感载体。使用杀真菌素链霉菌基因组DNA作为模板和两组引物通过PCR产生位于orf18侧翼的分别命名为orf18ifdNP和orf18ifdPH的“上游”2kb和“下游”2kb侧翼序列。使用正向和反向引物(Ifdenorf18pf1，
Figure BDA0002158001920000361
(SEQ ID NO:4)，Ifdendorf18pr1，
Figure BDA0002158001920000362
(SEQID NO:5)，以粗体显示HindIII和PacI位点)扩增orf18ifdPH片段。使用正向和反向引物(Ifdendorf18pf2，
Figure BDA0002158001920000363
(SEQID NO:6)，Ifdendorf18pr2，
Figure BDA0002158001920000364
(SEQ ID NO:7)，以粗体显示PacI和NheI位点)扩增orf18ifdNP片段。适当地限制这两个PCR片段并同时与通过用NheI和HindIII消化制备的pXY300载体连接，以得到质粒pXY300-orf18ifd(图3；SEQ ID NO:8)。通过测序确认pXY300-orf18ifd框内缺失插入无误。
用于orf18及其侧翼区的缺失的质粒pKS-T-orf18pfrd-AmR的构建。
使用正向引物(Oritnhexbahd3f，
Figure BDA0002158001920000365
Figure BDA0002158001920000366
(SEQ IDNO:9)以粗体显示HindIII位点)和反向引物(Oriter1pstxhor，
Figure BDA0002158001920000367
Figure BDA0002158001920000368
(SEQ ID NO:10)，以粗体显示XhoI位点)通过PCR从质粒pIJ773扩增oriT片段。将oriT片段用HindIII和XhoI消化、凝胶纯化，然后连接到类似地限制的载体pBluescript II KS衍生物中以得到质粒pKS-T(Alting-Mees and Short,Nucleic acids Research,17:9494,1989)。质粒pXY300-orf18ifd的插入物通过用NheI和HindIII消化切下、凝胶纯化，然后与NheI和HindIII线性化质粒pKS-T连接以得到质粒pKS-T-orf18ifd(图4；SEQ ID NO:11)。使用正向引物(ApraNcoIpf，
Figure BDA0002158001920000371
(SEQ ID NO:12)，以粗体显示NcoI位点)和反向引物(ApraBamHIpr，
Figure BDA0002158001920000372
(SEQ ID NO:13)，以粗体显示BamHI位点)从pIJ773扩增携带aac(3)IV的1kb片段：阿泊拉霉素抗性基因(amR)。用NcoI和BamHI消化片段AmR和质粒pKS-T-orf18ifd制备了用于连接的插入物和载体两者。所得质粒命名为pKS-T-orf18pfrd-AmR(图5；SEQ ID NO:14)。
用于orf18的框内缺失的质粒pKS-T-orf18ifd-AmR(NS)的构建。
pXY300-orf18ifd的插入物通过用NheI和HindIII消化切下、凝胶纯化，然后与SpeI和HindIII线性化载体pBluescriptIIKS连接以产生质粒pKS-orf18ifd。使用正向引物(Oritnhexbahd3f，
Figure BDA0002158001920000373
(SEQ ID NO:15)，以粗体显示HindIII)和反向引物(oriTXhNdSpr，
Figure BDA0002158001920000374
Figure BDA0002158001920000375
(SEQ ID NO:16)，以粗体显示XhoI、NdeI and SpeI位点)通过PCR扩增oriT片段。oriT片段用XhoI和HindIII消化、凝胶纯化，然后与类似地限制的质粒pKS-orf18ifd连接以得到质粒pKS-orf18ifd-T。使用正向引物(ApraNdepf，
Figure BDA0002158001920000376
(SEQ ID NO:17)，以粗体显示NdeI位点)和反向引物(ApraSpeIpr，
Figure BDA0002158001920000377
(SEQ ID NO:18)，以粗体显示SpeI位点)通过PCR从pIJ773扩增携带赋予阿泊拉霉素抗性(AmR)的aac(3)IV基因的1kb片段。通过用NdeI和Spe消化使质粒pKS-orf18ifd-T线性化然后用相似地限制的片段AmR连接以产生质粒pKS-orf18ifd-T-AmR(NS)(图6；SEQ ID NO:19)。
属间(intergeneric)接合，基于pXY300和基于pKS的基因破坏程序。
通过转化将基因破坏质粒单独地引入大肠杆菌S17-1中，然后通过接合转移到杀真菌素链霉菌或其衍生物。简言之，使新鲜收获的杀真菌素链霉菌孢子预发芽，并将大肠杆菌S17-1细胞在37℃下在Terrific培养基中培养过夜。制备发芽孢子悬浮液的系列稀释液，并将100mL每种稀释液与等体积的含有基于pXY300的破坏质粒的大肠杆菌S17-1混合。将溶液涂布在ISP4琼脂平板上，加入10mM MgCl2并在30或37℃下孵育22小时。用含有萘啶酸钠和安普霉素(0.5mg/mL)的3mL软营养琼脂覆盖每个平板，并进一步在30℃孵育约一周。通过划线到补充有萘啶酸钠和阿泊拉霉素(各50μg/mL)的ISP4琼脂平板上，纯化在抗生素选择中存活的分离的外接合物(exoconjugate)。
为了用基于pXY300的质粒进行基因破坏研究，首先在含有阿泊拉霉素(5μg/mL)的TSB液体培养基中于30℃培养外接合物24小时，在那时收获菌丝体、均质化并用于接种补充有阿泊拉霉素(5μg/mL)的TSB液体培养基。在40℃孵育3-6天后，将菌丝体匀浆并铺在含有阿泊拉霉素(50μg/mL)的ISP4琼脂平板上，并在30℃孵育一周。从随机选择的个体存活菌落中分离基因组DNA，并通过PCR或Southern印迹分析以确认已发生单交换或双交换的破坏。对于基于pKS的基因破坏和框内缺失质粒，将外接合物在ISP4琼脂平板上通过连续三轮孵育用于孢子形成而不添加任何抗生素选择以刺激转化为双交换重组体。基于pKS的外接合物未通过40℃温度选择。通过PCR和/或Southern印迹分析确认所有突变体的正确构建。
构建整合表达质粒pXY152-endorf24-camtsr和pXY152-endorf24-blatsr。
为了在携带orf18及其侧翼区缺失的阿泊拉霉素抗性突变体中异位表达orf24，设计了整合表达质粒pXY152-endorf24-blatsr。为了构建该质粒，通过用SacI和NheI消化从质粒pUC57衍生物中切下含有氯霉素抗性基因和硫链丝菌素抗性基因(tsr)的盒(camtsr)。然后将camtsr盒与SacI和NheI线性化的质粒pXY152-endorf24连接以产生新构建体pXY152-endorf24-camtsr(图7；SEQ ID NO:20)。氨苄青霉素抗性基因(bla)使用正向引物(amp2956SwaIpf，
Figure BDA0002158001920000391
(SEQ ID NO:21)，以粗体显示SwaI位点)和反向引物(amp1973SacIpr，
Figure BDA0002158001920000392
(SEQ ID NO:22，以粗体显示SacI位点)从pBluescript KS进行PCR扩增。然后将bla克隆到pXY152-endorf24-camtsr的SacI和SwaI位点以用blatsr替换盒camtsr。得到的结合表达质粒命名为pXY152-endorf24-blatsr(图8；SEQ ID NO:23)。
用于体外转座子突变的Tn5AT盒的构建
该Tn5AT盒被设计用于组合三种遗传元件：转座子Tn5、oriT和aac3(IV)。Tn5被Tn5转座酶(Epicenter)特异性地和独特地识别，并且易于插入到克隆到大肠杆菌质粒和福斯质粒中的高G+C链霉菌DNA中(也在美国专利号8,188,245中提及，其通过引用并入本文)。从大肠杆菌S17-1到链霉菌的DNA的接合转移需要oriT，而aac(3)IV是赋予阿泊拉霉素抗性的大肠杆菌-链霉菌双功能选择标志物。从质粒pIJ773切下oriT和aac3(IV)两者作为XbaI片段，然后克隆到预先用XbaI线性化的转座子供体质粒pMODTM-2(MCS)(Epicenter)中。得到的质粒pXYTn5ATa和pXYTn5ATb的不同之处仅在于XbaI片段的方向，并且用于根据制造商的说明书，通过用PvuII消化制备Tn5AT盒。
体外转座子突变和诱变的福斯质粒pXYF24D3和pXYF148D12的选择
为了产生携带用于基因替换研究的恩拉霉素生物合成簇的区段的随机诱变的福斯质粒文库，进行了福斯质粒pXYF24和pXYF148的体外转座子插入突变研究。两个推定的恩拉霉素生物合成调控基因orf18和orf24分别位于福斯质粒pXYF24和pXYF148的插入物上(GenBank登录号DQ403252)。该体外转座子反应在混合10μl(0.5μg)福斯质粒模板DNA、2μl(20ng)Tn5AT盒式DNA、2μl 10×反应缓冲液、1μL Tn5转座酶和5μl无菌水后在37℃下进行2小时。大肠杆菌感受态细胞EPI300TM-T1R(Epicentre)的转座子反应混合物的转化通过电穿孔进行。在补充有100μg/mL阿泊拉霉素的LB琼脂平板上选择诱变的质粒。将平板在37℃孵育过夜，随机挑取存活的菌落，并在添加100μg/mL阿泊拉霉素的LB液体培养基中生长。将来自这些菌落和对照福斯质粒pXYF24或pXYF148的诱变的福斯质粒DNA用HindIII消化，并在1％琼脂糖凝胶上通过电泳分析。Tn5AT盒含有单个HindIII位点，当筛选福斯质粒插入物上的单个与多个破坏事件时，该位点是有用的。没有HindIII位点存在于pXYF24或pXYF148的福斯质粒插入物中，并且只有一个HindIII位点存在于福斯质粒载体中。因此，用HindIII进行消化容易通过凝胶中两条带的存在而鉴定出具有Tn5AT单插入的福斯质粒。随机选择携带具有单个转座子插入的诱变的福斯质粒的菌落并在LB液体培养基中生长以允许福斯质粒的分离和破坏基因的鉴定。使用对应于阿泊拉霉素抗性基因的区域的引物5’-AAGGAGAAGAGCCTTCAGAAGGAA-3’：(SEQ ID NO:24)通过序列分析进行筛选。以这种方式，发现福斯质粒pXYF24D3和pXYF148D12具有分别插入到核苷酸位置26386处的orf18和核苷酸位置34333的orf24的Tn5AT(GenBank登录号DQ403252)。
野生型杀真菌素链霉菌ATCC21013中orf18和orf24的插入破坏。
通过电穿孔将基因替换质粒pXYF24D3和pXYF148D12分别转化到大肠杆菌S17-1中，然后通过属间接合引入到杀真菌素链霉菌中(Mazodier等,J.Bacteriology 171:3583-3585,1989，其全部内容通过引用并入本文)。在阿泊拉霉素选择中存活的外接合菌落通过连续三轮孢子形成而没有在ISP2琼脂平板上进行抗生素选择以通过双交换同源重组产生稳定的突变菌株。将得到的孢子合并，稀释并涂布在补充有50μg/mL阿泊拉霉素的ISP2琼脂平板上以确认阿泊拉霉素抗性并用于种子培养和恩拉霉素生产发酵。在杀真菌素链霉菌野生型中具有orf18的插入破坏的突变菌株被命名为SfpXYF24D3，在杀真菌素链霉菌野生型中具有orf24的插入破坏的突变菌株被命名为SfpXYF148D12。
在实验室规模和10升发酵罐中生产恩拉霉素。
用于在杀真菌素链霉菌野生型BM38-2(ATCCPTA-122342)和衍生菌株中生产恩拉霉素的实验室摇瓶发酵条件如Higashide等所述(J.Antibiotics,21:126-137,1968)，区别在于在专利(美国专利号4465771)中公开的恩拉霉素生产培养基。对于实验室规模的发酵，使用5mL TSB用新鲜收获的链霉菌孢子接种种子培养物。通常将5至10mL种子培养物在旋转振荡器上以225rpm和30℃孵育48小时，然后转移至50mL恩拉霉素生产培养基中连续发酵10天。在严格控制的条件下由野生型和衍生菌株生产恩拉霉素也在10升自动发酵罐中进行。
表2：杀真菌素链霉菌的野生型、突变体和基因工程菌株中的恩拉霉素产量的比较
Figure BDA0002158001920000411
Figure BDA0002158001920000421
从发酵产物中提取恩拉霉素用于HPLC分析。
为了提取用于恩拉霉素生产的HPLC分析的代谢物，通过离心收集新鲜的菌丝体并用去离子水洗涤并在5倍体积(甲醇水溶液(mL)与湿菌丝体重量(g)的比率)的70％含水甲醇(用1N HCl将pH调节至3.5)中重悬浮。将悬浮液在室温下以200rpm摇动过夜，然后在4000rpm和4℃下离心20分钟。然后将来自每个样品的1.4mL上清液转移到单独的1.5mL微量离心管中，并在室温下以13,000rpm离心10分钟。将过滤液通过0.22μm针筒式滤器，然后通过HPLC进行分析。从10L发酵罐中产生的菌丝体中提取代谢物是以相当于相当于实验室发酵的小规模进行。
HPLC分析和恩拉霉素产量测定。
将如上所述制备的50μL HPLC样品注射到连接到Shimadzu HPLC的Gemini C18柱(5μm，4.6×150mm，Phenomenex，Torrance，CA)。使用含有溶剂A:水+0.1％TFA和溶剂B:乙腈的18分钟的逐步线性梯度实现分离。流速为1mL/分钟，从10％B开始，在10分钟内增加至40％B，然后在8分钟内进一步增加至95％B。用SPD M20A光电二极管阵列检测器扫描200至300nm的UV区域。通过与从70％甲醇中的恩拉霉素标准品的储备溶液构建的标准曲线进行比较来计算恩拉霉素的产量。使用包含2、4、6、8、10和12μg的恩拉霉素的一系列注射以使用在230nm处的恩拉霉素A和B的吸光度面积的总和来构建标准曲线。从标准曲线生成回归方程并用于计算恩拉霉素产量。
评价抗细菌活性。
将金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)用作生物测定中的指示微生物。将细胞用于接种LB培养基，在37℃下生长过夜，然后将100μL的培养物与5mL顶层琼脂(营养琼脂和营养培养基的等体积混合物)混合。将顶层琼脂覆盖在营养琼脂平板上，通过切下琼脂塞来制备适当间隔的孔。恩拉霉素标准品和培养提取物的等分试样以20μg/ml的浓度在50％MeOH中溶解或稀释，并且将100μL各溶液装载到孔中。将板在37℃孵育16小时后，观察并比较抑制区域，并在4℃下拍摄或储存板。
实施例2
野生型杀真菌素链霉菌中orf18和orf24的破坏以及对恩拉霉素生产的影响
该实施例描述野生型杀真菌素链霉菌中orf18和orf24的破坏以及对恩拉霉素生产的影响。
之前已经鉴定并且可从GenBank(登录号DQ403252)获得来自野生型杀真菌素链霉菌ATCC 21013的含有恩拉霉素生物合成基因簇及其侧翼区域的116,000bp DNA序列(美国专利号8,188,245，其全部内容通过引用并入本文)。48个注释orf中有8个推定的调控基因：orf5、orf12、orf18、orf22、orf24、orf41、orf42和orf43。为了破译各基因产物在恩拉霉素生产中的作用，如实施例1中所述，使用转座子介导的阿泊拉霉素抗性标志物的插入来随机突变携带含有这些推定调控基因的恩拉霉素簇的区段的福斯质粒插入物。
随后在携带诱变的福斯质粒的大肠杆菌菌落中筛选阿泊拉霉素抗性和插入位置，鉴定了携带破坏的orf18的pXYF24D3和含有破坏的orf24的pXYF148D12。通过测序确认这些福斯质粒中的每一个中的单个插入突变和插入位点。然后通过接合到杀真菌素链霉菌野生型菌株中而个体地引入这两种诱变的福斯质粒。然后将表现出阿泊拉霉素抗性的外接合物在ISP2琼脂上进行三轮孢子形成而不添加任何抗生素选择以促进单交换同源重组转化为双交换突变。得到的稳定突变菌株SfpXYF24D3和SfpXYF148D12以实验室规模在摇瓶中在恩拉霉素生产培养基(EPM)中发酵。来自10天发酵的菌丝体的70％甲醇萃取的HPLC分析揭示了orf18破坏的菌株SfpXYF24D3的恩拉霉素产量增加1.3倍，并且具有破坏的orf24的SfpXYF148D12菌株的恩拉霉素的生产完全丧失。还评估了菌丝体提取物对金黄色葡萄球菌的活性。orf18破坏株SfpXYF24D3保持活性，而orf24破坏株SfpXYF148D12丧失对金黄色葡萄球菌的活性。
实施例3
重组菌株SfpXY152-endorf24的构建以及对恩拉霉素生产的影响
该实施例描述重组菌株SfpXY152-endorf24的构建以及该菌株生产恩拉霉素的能力。
在突变株SfpXYF148D12中的恩拉霉素生产的损失表示orf24可能的调节作用。使用Orf24蛋白质序列在GenBank数据库进行BLAST搜索揭示了与链霉素生物合成中涉及的途径特异性调节蛋白StrR的高度序列相似性。Orf24和StrR之间的序列比对显示蛋白质具有显著的相似性(54％的氨基酸同一性，图9)。orf24破坏后恩拉霉素生产的丧失和与StrR的相似性表明Orf24可以在恩拉霉素生产中充当途径特异性激活子。
为了探索orf24作为菌株改善的正调节靶标的作用，构建了整合表达质粒pXY152-endorf24(图2)(实施例1)。通过接合将质粒pXY152-endorf24导入野生型杀真菌素链霉菌中，筛选外接合物的阿泊拉霉素抗性表型，从而鉴定出新的重组菌株SfpXY152-endorf24。随机选择并纯化来自该菌株的至少10个独立的外接合菌落。这些菌落菌株携带通过与质粒上的attP位点单交换同源重组而整合到杀真菌素链霉菌染色体上的attB位点的pXY152-endorf24质粒。
为了研究重组菌株产生的代谢物，将来自两个菌落菌株的孢子接种到TSB种子培养物中，然后转移到恩拉霉素生产培养基中进行实验室规模发酵。收获的菌丝体的70％甲醇提取物的HPLC分析揭示了与野生型菌株(30mg/L)相比，重组菌株两者的恩拉霉素的生产增加2倍(60mg/L)。在这些能够过表达orf24的菌落菌株中观察到的恩拉霉素产量提高进一步证明了这种基因在恩拉霉素生产中具有正调节作用，并且该结果与从orf24的破坏获得的导致恩拉霉素生产丧失的结果一致。
实施例4
在杀真菌素链霉菌BM38-2(ATCC PTA-122342)中过表达orf24的菌株BM38-2.24/16的构建以及对恩拉霉素生产的影响
本实施例描述菌株BM38-2.24/16(ATCC保藏号PTA-124006)的构建、在杀真菌素链霉菌BM38-2(ATCC PTA-122342)中过表达orf24和对恩拉霉素生产的影响。
为了进一步探索Orf24的正调节作用，将质粒pXY152-endorf24整合到商业生产菌株杀真菌素链霉菌BM38-2(ATCC PTA-122342)的染色体中，如上文对野生型生物所描述。选择表现出阿泊拉霉素抗性表型的外接合物产生了许多重组菌落菌株，包括杀真菌素链霉菌BM38-2.24/16，能够在实验室中摇瓶培养中生产高达200mg/L的升高的恩拉霉素水平(相对于BM38-2(ATCCPTA-122342)增加3.3倍))。选择杀真菌素链霉菌BM38-2-24/16用于基于初步筛选期间的产量进一步评估恩拉霉素的生产能力。
重组菌株杀真菌素链霉菌BM38-2.24/16在实验室摇瓶培养中的恩拉霉素生产显示出相对于BM38-2(ATCC PTA-122342)的显著改善的明显潜力，并且还观察到变化很大的产量。为了更密切地控制在10天生长期内的培养条件，包括在摇瓶中不容易控制的pH和溶解氧，通过在10L发酵罐中的多次运行评估生产。在这些更严格控制的条件下，产量更一致，三个重复的10L发酵平均为375mg/mL(BM38-2(ATCC PTA-122342)的4.6倍)。在重组菌株杀真菌素链霉菌BM38-2.24/16(ATCC保藏号PTA-124006)中增加的恩拉霉素产量进一步支持Orf24在恩拉霉素生产中的正向上调作用。
实施例5
缺失突变菌株BM38-1.18pfrd-AmR的构建以及对恩拉霉素生产的影响
该实施例描述缺失突变菌株BM38-2.18pfrd-AmR(ATCC保藏号PTA-124007)的构建以及对恩拉霉素生产的影响。
orf18位于恩拉霉素生物合成基因簇的上游区域(GenBank登录号DQ403252)。Orf18似乎在恩拉霉素生产中具有负面作用，因为突变菌株SfpXYF24D3中该基因的插入破坏提高了恩拉霉素的产量。基于这一观察，构建体被设计为缺失单独的orf18以及orf18及其侧翼区域的部分。为此目的，构建质粒pKS-T-orf18pfrd-AmR(图5)。该pKS载体衍生的质粒既不具有链霉菌复制子，也不具有用于整合到链霉菌染色体中的元件。它只可以通过双交换同源重组与宿主染色体中DNA的限定区段交换其插入片段。该质粒的插入图谱如图10所示。orf18及其包含整个orf19的侧翼区域和编码orf17的N端部分的区域在质粒pKS-T-orf18pfrd-AMR中缺失。1kb左臂包含编码orf17的C端部分的区域及其下游区域，并且1kb右臂包含编码N端区域的orf20的部分区段。因此，双交换同源重组后的缺失导致重组菌株，其中整个orf18加上orf19和编码orf17的N端部分的区域被缺失并被阿泊拉霉素抗性基因替换。
将质粒pKS-T-orf18pfrd-AmR接合导入杀真菌素链霉菌BM38-2(ATCC PTA-122342)中，并且在ISP4琼脂平板上促进单和双交换同源重组而没有阿泊拉霉素补充。纯化能够在后续阿泊拉霉素选择中存活的外接合物，并且将该新的重组菌株命名为BM38-2.18pfrd-AmR(ATCC保藏号PTA-124007)。将来自该菌株的孢子接种到TSB培养基中用于种子培养，然后转移到恩拉霉素生产培养基中。发酵10天后，收获菌丝体，加工并通过HPLC分析。相对于母体菌株BM38-2(ATCC PTA-122342)，从这些实验室规模的发酵中观察到恩拉霉素生产增加1.2倍。该产量相对增加与对野生型衍生菌株SfpXYF24D3观察到相似，并且结果暗示在orf18侧翼并且在BM38-2.18pfrd-AmR的构建中受到影响的orf19和orf17对恩拉霉素生产影响很少或没有影响。因此，重组菌株BM38-2.18pfrd-AmR中增加的恩拉霉素生产是由于消除了Orf18的负调节作用。
关于BM38-2(ATCC PTA-122342)中质粒pXY300-orf18ifd的单独orf18的缺失，在用硫链丝菌素抗性标志物正选择外接合物和单/双突变体时遇到困难。因此，使用替代载体pBluescript KS II构建无标志物基因替换递送质粒，例如pKS-T-orf18ifd(图4)或pKS-orf18ifd-T、pKS-orf18ifd-T-AmR(NS)(在载体上携带阿泊拉霉素抗性基因而不是插入orf18，参见图6)。
实施例6
pKS衍生的基因失活载体pKS-T-orf18pfrd-AmR系列的开发
该实施例描述了pKS衍生的基因失活载体pKS-T-orf18pfrd-AmR系列的开发。
开发了具有接合功能而不需要使转化体通过高温选择以消除质粒(如一些其他基因破坏载体所需要的)的一系列pKS衍生的基因失活载体(图4、5和6)。这些pKS衍生的载体携带允许在大肠杆菌中复制的非链霉菌复制子，并可以保持并在链霉菌中用阿泊拉霉素抗性标志物和在大肠杆菌中用氨苄青霉素进行选择。它们在大肠杆菌中生产重组质粒的大量稳定拷贝用于接合，并且它们被设计具有在链霉菌DNA中发现的能够方便地用于将靶DNA组装到质粒中用于插入基因破坏和框内缺失研究的多个罕见且独特的限制性位点，例如PacI，HindIII，NheI和XbaI。
实施例7
pSET152衍生的整合基因表达载体pXY152-endorf24-camtsr和pXY152-endorf24-blatsr的开发
该实施例描述了pSET152衍生的整合基因表达载体pXY152-endorf24-camtsr(SEQID NO:20)和pXY152-endorf24-blatsr(SEQ ID NO:23)的开发。
开发了两种新载体pXY152-endorf24-camtsr(图7)和pXY152-endorf24-blatsr(图8)。它们具有接合和整合功能，像载体pSET152那样，其是最广泛使用的用于链霉菌基因表达和互补的整合载体。这两种载体都携带多个在链霉菌DNA中罕见的限制性位点以方便地克隆和组装表达构建体。载体pXY152-endorf24-camtsr可以维持并在大肠杆菌中用12.5μg/mL的氯霉素以及在链霉菌中用50μg/mL的硫链丝菌素进行选择。载体pXY152-endorf24-blatsr可以维持并在大肠杆菌中用氨苄青霉素和在链霉菌中用硫链丝菌素进行选择。
实施例1-6总结：
链霉菌调节的遗传操纵和用于菌株改善的生物合成基因
在众多天然产物的微生物生产者中，大约75％的已知微生物抗生素是由放线菌生产。链霉菌属是革兰氏阳性丝状土壤细菌，是放线菌科的成员，并且以其生产多种结构多样的、具有药理学和生物学活性的次级代谢物的无与伦比的能力而闻名。由聚酮化合物合成酶(PKS)产生的聚酮化合物和由非核糖体肽合成酶(NRPS)制备的肽天然产物是代表。
对天然产物抗生素生物合成的研究具有一些共同的挑战：首先，如何克服由野生型或基因工程菌株产生的母体或结构修饰的化合物的典型低产量；第二，如何激活从基因组序列中鉴定的许多隐蔽或孤立的次级代谢生物合成途径，从而可以研究产物的生物学功能。过去几十年中天然产物抗生素生物合成研究的进展表明，次级代谢产物的产生受许多途径的调节。例如，前体和结构组装生物合成基因(例如PKS和NRPS)、调控基因和自身抗性基因可以在细菌染色体上成簇。抗生素的产生可以通过途径特异性调控基因来调节，包括激活子和/或阻遏物、多效异位调控基因和双组分调节系统。在任何这些调控基因或系统中发生的突变可以增加、减少或完全消除抗生素的产生。隐蔽的生物合成途径可以通过不可预测的突变激活，导致产生先前未知的产物。
菌株改良可以在抗生素或其他微生物次级代谢物的成本有效的工业规模生产中起重要作用。能够产生增加的特定代谢物产量的突变菌株可以通过随机突变或通过特异性基因的靶向破坏或通过引入消除生物合成途径中的瓶颈的基因来产生。对正和负调控基因以及生物合成基因进行遗传操纵以产生靶向的次级代谢产物的超生产已被证明是放线菌菌株改良的强有力且非常成功的策略。
在本公开中，证实了orf24对恩拉霉素生产的正调节作用和orf18对恩拉霉素生产的负调节作用。orf24的靶向插入失活导致重组菌株SfpXYF148D12中恩拉霉素生产的完全丧失。随后在重组菌株SfpXY152-endorf24和BM38-2.24/16中在强组成型启动子ermE*p的控制下过表达orf24导致恩拉霉素产量增加约2至4.6倍。orf18及其包含整个orf19和orf17的部分的侧翼区域的缺失使恩拉霉素的产量增加1.2倍。这些结果提供了强有力的遗传证据支持orf24和orf18分别作为恩拉霉素生物合成中的正激活子和负阻遏物的作用。
Orf24直系同源物已经从其他抗生素生物合成途径得到功能证实
Orf24蛋白质序列的GenBank数据库BLAST查询显示数百次命中(GenBank登录号DQ403252)。许多显示出非常高的氨基酸相似性(从60％到99％的同一性)并且在氨基糖苷类抗生素链霉素的生物合成中被注释为转录调节子。然而，这组基因中没有一个具有实验验证的功能。对BLAST结果的分析鉴定了与功能表征的Orf24具有较低相似性(超过40％但低于60％的同一性)的多种相关蛋白。这些包括充分表征的蛋白StrR，其与Orf24具有较低但显著的相似性(在311个氨基酸重叠中具有54％的同一性)。StrR已被遗传和生物化学证实在灰色链霉菌中作为链霉素生物合成基因表达的途径特异性正激活子。StrR代表途径特异性激活子的家族，其中少数已通过遗传操作或生化研究表征。图11显示Orf24与六种功能确认的放线菌StrR样蛋白的比对。典型且高度保守的螺旋-转角-螺旋(HTH)DNA结合结构域存在于所有七种蛋白质中，如图11中的下划线所示。Orf24还与控制非核糖体产生的糖肽抗生素替考拉宁的生物合成的途径特异性激活子Teil15*具有显著的序列相似性(54％氨基酸同一性)。Tei15*正向调节替考拉宁簇中至少17个基因的转录。野生型Actinoplanesteichomyceticus产生约100mg/L的替考拉宁，而衍生自母体A.teichomyceticus并携带在不同启动子控制下表达的tei15*的遗传重组菌株在ermE*p启动子的情况下使替考拉宁产量增加至1g/L，并且在天然阿泊拉霉素抗性基因启动子的情况下增加至4g/L。
如图11中所示，Orf24还与来自巴尔霉素糖肽抗生素生物合成簇的Bbr(54％氨基酸同一性)；控制氨基糖苷类抗生素春日霉素生物合成基因表达的KasT(50％氨基酸同一性)；和参与新生霉素生物合成的途径特异性激活子NovG(45％氨基酸同一性)具有显著的序列相似性。该ΔnovG突变体仅产生野生型的2％那么多的新生霉素，而在重组菌株中从多拷贝质粒过表达novG导致了新生霉素生产增加三倍。Orf24也与实验确认参与S.globisporus中抗肿瘤抗生素C-1027的生产的四种调控基因(sgcR1，sgcR2，sgcR3和sgcR)之一的SgcR1具有42％的氨基酸同一性。与野生型菌株相比，S.globisporus SB1022中sgcR1的过表达使C-1027产量增加约7倍。在重组菌株中过表达正调节子sgcR3导致C-1027生产增加30-40％。相反，负调节子sgcR的失活导致C-1027和七烯化合物(heptaene)生产两者增加。此外，在ΔSGCR突变菌株中过表达sgcR1导致C-1027生产的约7倍的增加。sgcR3在C-1027生产的层级调节中通过控制sgcR1和sgcR2来占据更高层次的调节。总之，orf24的破坏和表达效应以及Orf24与其他功能特征性直系同源物的比较表明Orf24在恩拉霉素生产中充当途径特异性正调节子/激活子。
Orf18是推定非典型孤儿反应调节子，与功能确认的直系同源物一致
链霉菌属中抗生素的产生受到复杂遗传网络的严格调节，这些网络限制了许多野生型抗生素生产者产生大规模、成本效益的工业生产所必需的产量的能力。一种重要的调节机制是双组分信号转导系统。双组分系统包括传感器激酶和关联响应调节子。传感器激酶响应于特定的外部环境刺激/信号，例如压力、营养和化学物质等，然后将信号传递给触发并激活靶基因转录的细胞质响应调节子。与传感器激酶不配对的响应调节子被命名为孤儿响应调节子。
双组分系统和孤儿响应调节子存在于链霉菌基因组中，并且可以起到抑制次级代谢产物生成的作用。在来自杀真菌素链霉菌的恩拉霉素基因簇中，orf18编码推定的孤儿响应调节子，其与其他三种特征性链霉菌响应调节子(包括来自S.coelicolor的一种孤儿响应调节子SCO3818)具有低至中等序列相似性(图12)。与其他比对的蛋白质相比，Orf18具有更长的N端序列并且似乎是非典型孤儿响应调节子，因为在Orf18中不存在位置118处的高度保守赖氨酸(相对于共同位置105)并且用苏氨酸替代。赖氨酸被提出是形成磷酸化口袋所需的。
只有少数链霉菌响应调节子已经进行功能表征。S.coelicolor基因组含有一共五个非典型和七个典型孤儿响应调节子。Orf18在与AbsA2重叠的191个氨基酸中具有26％的氨基酸同一性。S.coelicolor中AbsA2的缺失导致两种抗生素即放线紫红素(actinorhodin)和十一烷基灵菌红素(undecylprodigiosin)生产增加。Orf18在与SCO3818重叠的176个氨基酸中显示32％的氨基酸同一性。sco3818的缺失导致放线紫红素生产增加。Orf18在与SCO1745(AbrA2)重叠的166个氨基酸中具有29％的氨基酸同一性。含有AbrA2的响应调节子操纵子的缺失导致重组菌株S.coelicolor M145与野生型生产者相比抗肿瘤抗生素oviedomycin增加100％。观察到的Orf18在恩拉霉素生产中的负调节作用与相关负调节子的证实的活性一致(图12)。此外，注意到Orf18在BLAST搜索中与LuxR转录调节子家族的成员具有最高的蛋白质序列相似性。
在突变体BM38-1.orf18pfrd-AMR中极性效应的缺少
突变体BM38-1.18pfrd-AMR菌株的缺失区包含三个基因：ORF18、编码位于orf18下游的or17的N端部分的区域和位于orf18上游的整个orf19(图5和图10)。预测orf17编码显然不具有与恩拉霉素的生物合成或调节相关的功能的核糖核酸酶。此外，替换orf18及其侧翼区的阿泊拉霉素抗性基因与orf17分开地转录，并且不应产生来自阿泊拉霉素抗性基因启动子的任何通读事件。因此，orf17的部分缺失不应产生极性效应。
orf19以与orf18相同的方向转录和翻译。该基因注释为编码功能未知的蛋白质。携带单独orf18破坏的突变菌株SfpXYF24D3和携带orf18和orf19一起缺失的突变体BM38-1.18pfrd-AmR对恩拉霉素的生产具有类似的增强作用，这暗示orf19在恩拉霉素的生产中没有作用或作用可忽略。基因orf20位于orf19的上游，并在与插入的阿泊拉霉素抗性标志物相同的方向上转录和翻译(图10)。orf20在BM38-1.18pfrd-AmR中仍然完好无损，该产物显然在恩拉霉素生产中没有作用。因此，不认为对orf20表达的任何极性影响是BM38-1.18pfrd-AmR中恩拉霉素生产增加的原因。
实施例7
orf24和/或orf18的进一步应用和操作用于恩拉霉素生产增加的菌株
除了上面提供的实施例之外，还有其他可能的方法来利用orf24和orf18的调节作用来改善恩拉霉素的生产。
i.在替代型、组成型或诱导型过表达启动子下orf24的表达
构建用于在ermE*p(广泛使用的链霉菌强组成型表达启动子)的控制下整合异位表达orf24的pXY152-endorf24(如图2所示)。orf24的过表达也可以由其他组成型或诱导型启动子驱动。该TIPA启动子是硫链丝菌素诱导过表达链霉菌启动子。开发了已成功用于链霉菌基因的过表达的含有多拷贝tipA启动子的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pXY200。对于与本公开相关的应用，tipA启动子可以从pXY200切除并克隆到pXY152中以替换ermE*p并驱动orf24的表达。同样，orf24可以很容易地从pXY152-endorf24转移到pXY200，用于基于质粒的表达。其他启动子选项包括但不限于P(nitA)-NitR系统和链霉菌启动子SF14。最近，整合质粒pKC1139和阿泊拉霉素抗性基因的天然启动子成功地用于表达肽抗生素替考拉宁的高产生的调控基因。调控基因sanG编码用于尼可霉素生产的途径特异性激活子。在五个不同的启动子的控制下表达额外拷贝的sanG(PhrdB、Ptcp830、PSF14、PermE*和Pneos)导致尼可霉素产量分别增加69％、51％、26％、22％和13％(参见Du等,Applied Microbiology andBiotechnology 97:6383-6396,2013)。
ii.具有orf18缺失和orf24过表达的杀真菌素链霉菌双突变体菌株
由于orf18缺失突变体和orf24过表达菌株两者都表现出恩拉霉素生产增加，可以产生含有两者的双突变体，以及是否观察到对该肽抗生素产量的累加效应。可以通过将过表达质粒pXY152-endorf24-blatsr(图8)导入到突变体BM38-2.18pfrd-AmR中来产生双突变体。pXY152-endorf24-blatsr是携带用于在链霉菌中选择的硫链丝菌素抗性基因(tsr)和用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因(bla)的接合整合质粒。因为用于接合的大肠杆菌菌株S17-1天然对氯霉素(cam)具有抗性，在pXY152-endorf24-camtsr(见上文)中的氯霉素抗性标志物已经用氨苄青霉素抗性(bla)替换以选择S17-1转化体。或者，可以通过使用不同的接合大肠杆菌菌株ET12567/pUZ8002将pXY152-endorf24-camtsr和衍生物导入链霉菌中。
使用质粒pXY152-endorf24-blatsr或pXY152-endorf24-camtsr将orf24的第二拷贝引入到orf18缺陷突变体中，可以通过硫链丝菌素抗性选择双突变体。为了在BM38-2(ATCC PTA-122342)中产生无效orf18框内缺失突变体，构建质粒pXY300-orf18ifd(图3)和pKS-orf18ifd-T-AmR(NS)(图6)用于这个目的。pXY300-orf18ifd允许用硫链丝菌素选择orf18框内缺失突变体，而pKS-orf18ifd-T-AmR(NS)使用阿泊拉霉素选择框内缺失突变体。虽然使用硫链丝菌素抗性标志物容易选择野生型杀真菌素链霉菌的突变菌株，但在BM38-2(ATCC PTA-122342)菌株中使用该抗性标志物已经遇到了困难。因此，出于相同的目的构建了两种质粒pXY300-orf18ifd和pKS-orf18ifd-T-AmR(NS)。
鉴于所公开的发明的原理可以应用至许多可能实施方式，应该认识到，所示实施方式仅是本发明的优选实施例，其不应被视为限制本发明的范围。本发明的范围而是由以下权利要求限定。因此，我们要求保护在这些权利要求的范围和精神之内的所有作为本发明。
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Claims (27)

1.一种杀真菌素链霉菌的重组菌株，其包含一种或多种选自以下的修饰基因：增强的开放阅读框24(orf24)、减弱的开放阅读框18(orf18)、以及增强的orf24和减弱的orf18两者；其中通过所述杀真菌素链霉菌的重组菌株获得与通过对照杀真菌素链霉菌菌株获得的相比增加的恩拉霉素生产。
2.根据权利要求1所述的重组菌株，其中所述减弱的orf18因其已被无效而减弱。
3.根据权利要求2所述的重组菌株，其中所述减弱的orf18已经通过选自框内缺失、移码突变、点突变及其任何组合的方法而被无效。
4.根据权利要求3所述的重组菌株，其中所述减弱的orf18已经通过框内缺失而被无效。
5.根据权利要求4所述的重组菌株，其中所述框内缺失具有所述orf18(SEQ ID NO:27)的核苷酸5至660。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组菌株，其中所述增强的orf24与异源启动子可操作地连接。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其中所述异源启动子是强组成型启动子。
8.根据权利要求7所述的重组菌株，其中所述强组成型启动子是ermE*p。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的重组菌株，其中所述增强的ORF24因其已被过表达而增强。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的重组菌株，其中所述杀真菌素链霉菌是杀真菌素链霉菌ATCC 21013。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的重组菌株，其中所述杀真菌素链霉菌是杀真菌素链霉菌ATCC PTA-122342。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的重组菌株，其中通过所述重组菌株生产恩拉霉素比通过所述对照杀真菌素链霉菌生产恩拉霉素高至少1.2倍。
13.根据权利要求12中任一项所述的重组菌株，其中通过所述重组菌株生产恩拉霉素比通过所述对照杀真菌素链霉菌生产恩拉霉素高1.2至4.6倍。
14.根据权利要求1所述的重组菌株，其是BM38-2.24/16(ATCC保藏号PTA-124006)。
15.根据权利要求1所述的重组菌株，其是BM38-2.18pfrd-AmR(ATCC保藏号PTA-124007)。
16.一种产生恩拉霉素的方法，其包括在足以产生恩拉霉素的条件下培养权利要求1-15中任一项所述的杀真菌素链霉菌的重组菌株。
17.根据权利要求16所述的方法，其还包括从培养基中分离所述恩拉霉素。
18.一种破坏载体，其包含已被无效的开放阅读框orf18(SEQ ID NO:37)。
19.根据权利要求18所述的破坏载体，其中所述orf18已经通过选自框内缺失、移码突变、点突变及其任何组合的方法而被无效。
20.根据权利要求19所述的破坏载体，其中所述orf18已经通过框内缺失而被无效。
21.根据权利要求20所述的破坏载体，其中所述框内缺失具有orf18(SEQ ID NO:27)的核苷酸5至660。
22.一种表达载体，其包含增强的开放阅读框orf24(SEQ ID NO:38)。
23.根据权利要求22所述的表达载体，其中所述增强的orf24与异源启动子可操作地连接。
24.根据权利要求23所述的表达载体，其中所述异源启动子是强组成型启动子。
25.根据权利要求24所述的表达载体，其中所述强组成型启动子是ermE*p。
26.根据权利要求22所述的表达载体，其中所述表达载体选自pXY152-endorf24(SEQID NO:3)、pXY152-endorf24-camtsr(SEQ ID NO:20)和pXY152-endorf24-blatsr(SEQ IDNO:23)。
27.根据权利要求18所述的破坏载体，其选自pXY300-orf18ifd(SEQ ID NO:8)、pKS-T-orf18ifd(SEQ ID NO:11)、pKS-T-orf18pfrd-AmR(SEQ ID NO:14)和pKS-orf18ifd-T-AmR(NS)(SEQ ID NO:19)。
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