KR100392551B1

KR100392551B1 - 핵산 증폭방법을 개선시키기 위한 rna폴리머라제의 용도

Info

Publication number: KR100392551B1
Application number: KR1019970700255A
Authority: KR
Inventors: 로이 숙나난
Original assignee: 아크조 노벨 엔브이
Priority date: 1994-07-15
Filing date: 1995-07-13
Publication date: 2003-10-30
Also published as: ES2168380T3; WO1996002668A1; US6025134A; JPH11505402A; AU711115B2; EP0776376B1; DE69524105T2; DK0776376T3; EP0776376A1; JP3881009B2; ATE209258T1; DE69524105D1; AU3336695A; CA2195209C; CA2195209A1; PT776376E

Abstract

본 발명은 특정 핵산 서열 또는 그의 상보 서열을 증폭시키는 방법에서 세포성 RNA을 합성하는 부류의 진핵 또는 원핵 DNA-지향성 RNA 폴리머라제를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특정 핵산 서열을 증폭시키는 신규 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 하나의 반응용기에서 일어날 수 있는 하나 이상의 반응을 포함한다. 한가지 예로서, 제 1 반응에서는, 상기 방법은 DNA 제 1 주형을 사용하는 제 1 RNA 폴리머라제를 제공하여 RNA 제 1 주형을 합성하고, 제 2 반응에서는 다수의 다른 시약이 RNA 제 1 주형을 사용하여 DNA 제 2 주형 및 RNA 제 2 주형을 합성하도록 RNA 제 1 주형 및 다수의 다른 시약을 제공하는 것을 포함한다. 그 후, 시약이 RNA 제 2 주형을 사용하여 DNA 제 3 주형 및 RNA 제 2 주형의 다수의 복제물을 합성하는 싸이클을 연속해서 수행한다. RNA 제 2 주형은 특정 핵산 서열 또는 그의 상보 서열이다. 본 발명은 본 발명의 시약을 함유하는 키트를 포함한다.

Description

핵산 증폭 방법을 개선시키기 위한 RNA 폴리머라제의 용도

샘플중의 핵산의 존재는 그 샘플의 채취원의 질병, 장애 또는 비정상 신체 상태를 나타낼 수 있다. 특정 진단에 의해 핵산이 샘플에 존재하는지의 여부를 결정한다. 이들 진단은 복제물수(copy number) 문제 때문에 핵산의 증폭을 반드시 필요로 한다.

바이러스 또는 세포에는, 예를 들어 일반적으로 특정 유전자에 대하여 하나의 복제물이 있다. 유전자의 특정 핵산을 증폭하지 않고서는, 핵산의 존재를 검출하기란 종종 어렵다.

핵산을 증폭하는 방법은 다수 있다. 이러한 두 방법은 미국 특허 제 5,130,238 호(말렉(Malek) 등) 및 미국 특허 제 5,409,818 호(말렉 등)에 기술된 것이다. 말렉의 증폭 방법은 사용자의 관여 및 조작을 줄인다. 증폭 싸이클은 비교적 일정한 주위온도에서 시약의 연속적인 첨가 없이 일어난다. 주형 핵산 서열은 증폭 과정의 각 싸이클에서 한 기질로부터 하나 보다 많은 생성물을 생성한다. 증폭 과정은 출발 주형으로서 DNA 또는 RNA를 사용한다.

단일가닥 또는 이중가닥의 DNA가 출발 주형일 경우, 말렉의 방법은 증폭 싸이클 전에 열 변성 또는 알칼리 변성을 필요로 한다.

단일가닥의 DNA가 출발 주형일 경우, 제 1 프라이머는 DNA로 하이브리드화된다(hybridize). 그 다음, DNA-지향성 DNA 폴리머라제가 이중가닥의 DNA 생성물을 만든다. 그 다음, 중합 생성물은 단일가닥의 DNA가 싸이클에 도입되기 전에 열 변성 또는 알칼리 변성을 겪는다.

이중가닥의 DNA가 출발 주형일 경우, 이중가닥의 DNA는 먼저 열 변성 또는 알칼리 변성을 겪는다. 그 다음, 제 1 프라이머가 DNA의 한 단일가닥으로 하이브리드화된다. 그 다음, DNA-지향성 DNA 폴리머라제가 이중가닥의 DNA 생성물을 만든다. 그 다음, 중합 생성물은 단일가닥의 DNA가 싸이클에 도입되기 전에 두 번째 열 변성 또는 알칼리 변성을 겪는다.

열 변성은 증폭 싸이클이 등온적이지 않기 때문에 문제가 있다. 알칼리 변성은 증폭 과정에 사용자의 관여와 조작을 필요로 하기 때문에 문제가 있다. 열 변성은 말렉의 방법에서 뿐만아니라, 다른 증폭 방법(예컨대, PCR 및 LCR)에서도 사용할 수 있다.

따라서, (1) 증폭 방법에 필요한 단계 수를 감소시키고, (2) 사용자의 관여 및 조작을 줄이고, (3) 증폭 싸이클에의 도입에 필요한 가열 단계를 제거하고, (4) 가열이 일어나는 온도를 내리기 위하여 핵산 증폭을 개선시킬 필요가 있다.

본 특허원에서, "특정 핵산 서열"이란 용어는 단일가닥 또는 이중가닥의 핵산의 서열, 또는 증폭하고자 하는 서열에 상보적인 서열을 의미한다. "DNA-지향성RNA 폴리머라제"란 분자생물 반응에 사용하기에 적합한 능력을 갖는 폴리머라제를 의미한다. 제 1 RNA 폴리머라제의 한 "단위"란 37℃에서 10분동안 방사성표지된 1나노몰의 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 RNA 제 1 주형내로의 혼입을 촉진하는 RNA 폴리머라제의 양을 의미한다.

발명의 개요

본 발명은 통상의 증폭 방법보다 사용자의 관여 및 조작을 덜 필요로 하므로 핵산의 증폭을 더욱 편리하게 한다. 한 경우에서, 증폭 싸이클로의 도입을 비롯하여 증폭은 비교적 일정한 주위 온도에서 일어난다. 싸이클로의 도입은 일련의 단계를 필요로 하지 않는다.

본 발명은 특정 핵산 서열을 증폭하는 방법에서 세포성 RNA을 합성하는 부류의 진핵 또는 원핵 DNA-지향성 RNA 폴리머라제를 사용하는 것에 관한 것이다. 한 경우에서, 이러한 폴리머라제는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) RNA 폴리머라제이다. 이 사용방법에는 상기 폴리머라제의 저해제의 사용도 포함될 수 있다.

본 발명은 특정 핵산 서열을 증폭하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 이 방법은 하기 두 단계(A) 및 (B)를 포함한다.

단계(A) - 단계(A)에서, DNA 제 1 주형; 세포성 RNA을 합성하는 부류의 진핵 또는 원핵 RNA 폴리머라제인 제 1 RNA 폴리머라제; 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트; 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트; 제 2 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터의 플러스 서열을 갖는 제 1 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 제 2 올리고뉴클레오타이드 프라이머; 상기 프로모터를 인식하는 DNA-지향성 RNA 폴리머라제인 제 2 RNA 폴리머라제; RNA-지향성 DNA 폴리머라제; DNA-지향성 DNA 폴리머라제; 단일가닥 또는 이중가닥의 RNA 또는 DNA를 가수분해하지 않고 RNA-DNA 하이브리드의 RNA를 가수분해하는 리보뉴클레아제를 포함한 시약을 함유하는 하나 이상의 반응 용기를 제공한다. 이 시약들을 다양한 방식으로 혼합하여 하나 이상의 반응 배지를 제공할 수 있다. 이 반응에 단일 반응 용기를 사용할 수도 있다.

이 방법에서, (1) 제 1 RNA 폴리머라제는 DNA 제 1 주형을 사용하여 특정 핵산 서열, 또는 특정 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함하는 RNA 제 1 주형을 합성하고, (2) 제 1 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 RNA 제 1 주형에 하이브리드화되고, (3) RNA-지향성 DNA 폴리머라제는 RNA 제 1 주형을 사용하여, 제 1 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 연장시켜 RNA-DNA 하이브리드 중간생성물을 생성함으로써 DNA 제 2 주형을 합성하고, (4) 리보뉴클레아제는 RNA-DNA 하이브리드 중간생성물의 RNA를 가수분해하고, (5) 제 2 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 DNA 제 2 주형으로 하이브리드화되고, (6) DNA-지향성 DNA 폴리머라제는 제 2 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 DNA 제 2 주형을 사용하여, 제 2 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 작용성 프로모터를 합성하고, (7) 제 2 RNA 폴리머라제는 작용성 프로모터를 인식하고 DNA 제 2 주형을 전사함으로써 RNA 제 2 주형의 복제물을 제공한다.

그 다음, 싸이클이 계속된다. 싸이클에서, (1) 제 2 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 RNA 제 2 주형으로 하이브리드화되고, (2) RNA-지향성 DNA 폴리머라제는 RNA 제 2 주형을 사용하여, 제 2 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 연장시켜 RNA-DNA 하이브리드 중간생성물을 생성함으로써 DNA 제 3 주형을 합성하고, (3) 리보뉴클레아제는 RNA-DNA 하이브리드 중간생성물의 RNA를 가수분해하고, (4) 제 1 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 DNA 제 3 주형으로 하이브리드화되고, (5) DNA-지향성 DNA 폴리머라제는 주형으로서 제 1 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여, DNA 제 3 주형을 연장시킴으로써 제 2 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 작용성 프로모터를 합성하고, (6) 제 2 RNA 폴리머라제는 작용성 프로모터를 인식하고 DNA 제 3 주형을 전사함으로써 RNA 제 2 주형의 복제물을 제공한다.

단계(B) - 단계(B)에서, 특정 핵산 서열, 또는 특정 핵산 서열에 상보적인 서열의 원하는 증폭을 얻기에 충분한 시간동안 조건을 유지시킨다.

다른 경우에서, 이 방법은 세 단계(A) 내지 (C)를 포함한다. 이 방법(단계(A) 내지 (C) 모두)은 하나 이상의 반응 용기에서 일어날 수 있다.

단계(A) - 단계(A)에서는, (i) DNA 제 1 주형, (ii) 진핵 또는 원핵 RNA 폴리머라제인 제 1 RNA 폴리머라제(이때 폴리머라제는 세포성 RNA을 합성하는 군의 것이다) 및 (iii) 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 포함하는 시약을 제공한다. RNA 폴리머라제는 특정 핵산 서열을 포함하는 RNA 제 1 주형을 합성하기 위해 DNA 제 1 주형을 이용한다. DNA 제 1 주형은 이중가닥 DNA 또는 단일가닥 DNA일 수 있다. 제 1 RNA 폴리머라제는 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제일 수 있다. 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제의 농도는 ㎕당 0.04 내지 0.2 단위의 범위일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

단계(B) - 단계(B)에서는, (1) 제 1 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 RNA 제 1 주형으로 하이브리드화되고, (2) RNA-지향성 DNA 폴리머라제는 RNA 제 1 주형을 이용하여 제 1 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 연장에 의해 DNA 제 2 주형을 합성함으로써 RNA-DNA 하이브리드 중간생성물을 형성하고, (3) 리보뉴클레아제는 RNA-DNA 하이브리드 중간생성물의 RNA를 가수분해하고, (4) 제 2 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 DNA 제 2 주형으로 하이브리드화되고, (5) DNA-지향성 DNA 폴리머라제는 제 2 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 DNA 제 2 주형을 사용하여 제 2 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 작용성 프로모터를 합성하고, (6) 제 2 RNA 폴리머라제가 작용성 프로모터를 인식하고 DNA 제 2 주형을 전사함으로써 RNA 제 2 주형을 제공하는 조건하에서, (i) 제 2 RNA 폴리머라제가 인식하는 프로모터의 플러스 서열을 갖는 제 1 올리고뉴클레오타이드 프라이머, (ii) 제 2 올리고뉴클레오타이드 프라이머, (iii) 프로모터를 인식하는 DNA-지향성 RNA 폴리머라제인 제 2 RNA 폴리머라제, (iv) RNA 지향성 DNA 폴리머라제, (v) DNA-지향성 DNA 폴리머라제, (vi) 단일가닥 또는 이중가닥 RNA 또는 DNA를 가수분해하지 않고 RNA-DNA 하이브리드의 RNA를 가수분해하는 리보뉴클레아제, (vii) 리보뉴클레오사이드 및 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 (viii) RNA 제 1 주형을 포함하는 시약을 하나이상의 단계로 제공한다.

그 후, 싸이클이 계속된다. 싸이클에서, (1) 제 2 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 RNA 제 2 주형으로 하이브리드화되고, (2) RNA-지향성 DNA 폴리머라제는 RNA 제 2 주형을 사용하여 제 2 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 연장함으로써 DNA 제 3 주형을 합성하여 RNA-DNA 하이브리드 중간생성물을 형성하고, (3) 리보뉴클레아제는 RNA-DNA 하이브리드 중간생성물의 RNA를 가수분해하고, (4) 제 1 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 DNA 제 3 주형으로 하이브리드화되고, (5) DNA-지향성 DNA 폴리머라제는 주형으로서 제 1 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 DNA 제 3 주형을 연장시킴으로써 제 2 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 작용성 프로모터를 합성하고, (6) 제 2 RNA 폴리머라제는 작용성 프로모터를 인식하고 DNA 제 3 주형을 전사시켜 RNA 제 2 주형의 복제물을 제공한다.

단계(C) - 그 후, 단계(C)에서는 특정 핵산 서열 또는 특정 핵산 서열에 상보적인 서열을 바람직하게 증폭시키는데 충분한 시간동안 조건들을 유지시킨다. 예를 들면 30분 내지 4시간(이에 한정되지 않는다)동안 조건들을 유지시킬 수 있다.

단계(A)에서는, 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트가 또한 제공될 수 있다. 이런 상황에서 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트는 제 2 반응 배지에 첨가될 필요는 없다.

단계(B)에서는 제 1 RNA 폴리머라제의 저해제를 또한 제공할 수 있다. 한 경우에, 저해제는 ㎖ 당 10 내지 100㎍의 범위(이에 한정되지는 않는다)의 농도로 제공되는 리팜피신이다. 다른 경우에는, 제 1 RNA 폴리머라제의 저해제를 사용하기보다는, 단계(A)의 제 1 반응 배지를 약 65℃로 가열시킨 후 단계(B)로 넘어간다.

단계(A) 또는 (B)에서, 알킬화 설폭사이드 및 적합한 담체 단백질을 또한 제공할 수 있다. 알킬 설폭사이드는 디메틸설폭사이드(DMSO)일 수 있고, 담체 단백질은 소의 혈청 알부민(BSA)일 수 있다.

제 1 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 또한 제 2 RNA 폴리머라제의 전사 개시 부위의 플러스 서열을 포함할 수 있다. 전사 개시 부위의 플러스 서열은 프로모터의 플러스 서열에 작동되도록 연결된다. 제 1 RNA 폴리머라제는 이. 콜라이(E. coli) RNA 폴리머라제, 바실러스(Bacillus) 또는 아르캐(Archae) 박테리아의 RNA 폴리머라제와 같은 임의의 원핵 RNA 폴리머라제일 수 있다. 제 1 RNA 폴리머라제는 RNA 폴리머라제 I, RNA 폴리머라제 II 또는 RNA 폴리머라제 III과 같은 임의의 진핵 RNA 폴리머라제일 수 있다. 제 2 RNA 폴리머라제는 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제일 수 있다. 그런 경우에, 전사 개시 부위의 플러스 서열 및 프로모터의 플러스 서열은 함께 하기 뉴클레오타이드 서열이다:

[서열 1]

이 방법은 임의의 제 1 프라이머, 제 2 프라이머, 리보뉴클레오사이드 및 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 소비하거나 싸이클의 임의의 생성물을 축적할 수 있는 반응 배지의 모니터링 단계를 더욱 포함할 수 있다. 모니터링 단계는 (1) 핵산 프로브, 또는 제한 엔도뉴클레아제 및 전자영동 분리를 사용하여 싸이클의 핵산 생성물을 검출하고, (2) RNA 제 2 주형의 축적을 모니터링하고, (3) DNA 제 2 주형의 축적을 모니터링하고, (4) RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 작용성 프로모터를 함유하는 DNA를 모니터링하고, (5) RNA-DNA 하이브리드 중간생성물의 축적을 모니터링하고, (6) 임의의 제 1 프라이머, 제 2 프라이머, 리보뉴클레오사이드 및 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 소비 또는 싸이클의 임의의 생성물의 축적을 모니터링할 수 있고, 상기 값은 특정 핵산 서열의 부재하에서의 제2 반응 배지에서의 생성물의 축적 또는 시약의 소비를 나타낸다.

이 방법에서, 리보뉴클레아제는 에스케리치아 콜라이 리보뉴클레아제 H 또는 송아지의 흉선 리보뉴클레아제 H일 수 있다. 제 1 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 제 2 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 고정화된 지지체에 가역적으로 결합될 수 있다. DNA-지향성 RNA 폴리머라제는 박테리오파지 RNA 폴리머라제, 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제, 박테리오파지 T3 폴리머라제, 박테리오파지 ΦII 폴리머라제, 살모넬라 박테리오파지 sp6 폴리머라제 또는 슈도모나스 박테리오파지 gh-1 폴리머라제일 수 있다. RNA-지향성 DNA 폴리머라제는 조류의 골수아구증 바이러스 폴리머라제 또는 몰로네이(Moloney) 설치류의 백혈병 바이러스 폴리머라제와 같은 레트로바이러스 역전 트랜스크립타제일 수 있다.

한 예에서, DNA-지향성 DNA 폴리머라제는 DNA 엑소뉴클레아제 활성이 없다. 다른 예에서는, 제 2 반응 배지중의 모든 DNA 폴리머라제는 DNA 엑소뉴클레아제 및 DNA 엔도뉴클레아제 활성이 없다. DNA-지향성 DNA 폴리머라제는 조류의 골수아구증 바이러스 폴리머라제, DNA 폴리머라제 α 또는 DNA 폴리머라제 β 또는 송아지의 흉선 DNA 폴리머라제일 수 있다.

본 방법은 싸이클의 DNA 생성물을 클로닝 벡터에 라이게이션한 후 DNA 생성물에 클로닝시키고, 발현 시스템에서 싸이클의 DNA 생성물에 의해 코딩되는 생성물을 발현시키는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명은 핵산 서열을 증폭시키는 키트를 포함한다. 키트는 (a) 세포성 RNA을 합성하는 DNA-지향성 RNA 폴리머라제인 제 1 RNA 폴리머라제, (b) 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트, (c) 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트, (d) 제 2 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터의 플러스 서열을 포함하는 제 1 올리고뉴클레오타이드 프라이머, (e) 제 2 올리고뉴클레오타이드 프라이머, (f) 프로모터를 인식하는 DNA-지향성 RNA 폴리머라제인 제 2 RNA 폴리머라제, (g) RNA-지향성 DNA 폴리머라제, (h) DNA-지향성 DNA 폴리머라제, 및 (i) 단일가닥 또는 이중가닥 RNA 또는 DNA를 가수분해시키지 않고 RNA-DNA 하이브리드의 RNA를 가수분해시키는 리보뉴클레아제를 함유하는 하나 이상의 용기(receptacle)를 포함한다.

키트에서, 제 1 RNA 폴리머라제는 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제일 수 있다. 키트는 또한 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제의 저해제를 함유하는 용기를 포함한다. 한 예에서, 저해제는 리팜피신이다.

키트는 또한 알킬화된 설폭사이드를 함유하는 용기 및 적합한 담체 단백질을 함유하는 용기를 포함할 수 있다.

본 발명은 특정 핵산 서열을 증폭하는 방법을 개선시키기 위한, 세포성 RNA을 합성하는 부류의 DNA-지향성 RNA 폴리머라제의 용도에 관한 것이다.

도면에서는 본 발명의 실시태양을 예시한다.

도 1은 이중가닥 DNA 또는 단일가닥 DNA로 시작되는 핵산 증폭 방법을 일반적으로 나타낸 것이다.

도 2는 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제 및 게놈 DNA를 사용하여 생성시킨 전사물의 RNase A 및 DNase I에 대한 감수성을 보여준다.

도 3A는 리팜피신에 의한 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제의 저해를 나타낸다.

도 3B는 NASBA^TM증폭시 리팜피신의 효과를 나타낸다. I는 에티디움 브로마이드를 함유하는 아가로즈 겔을 나타낸다. II는 노던 블롯 하이브리드화를 나타낸다.

도 4는 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제로부터 생성된 전사물로부터의 특정 증폭의 증거를 보여주며, 여기서 4A는 에티디움 브로마이드를 함유하는 아가로즈 겔의 결과를 보여주며 4B는 노던 블롯 하이브리드화를 보여준다.

도 5는 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제를 사용하여 생성된 전사물로부터의 서열(I) GM-CSF 및 (II) G3PDH의 특정 증폭을 보여준다.

도 6은 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제로부터 생성된 RNA, (I) PL1 및 (II) VD1로부터의 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)의 특정 서열의 NASBA^TM증폭을 보여준다.

도 7은 단일 반응 용기에서 2단계 및 3단계 방법을 사용하여 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제로 전사된 DA의 NASBA^TM증폭을 보여준다.

본 발명은 특정 핵산 서열을 증폭시키기 위한 방법에서, 세포성 RNA을 합성하는 부류의 원핵 또는 진핵 DNA-지향성 RNA 폴리머라제의 용도에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 이러한 폴리머라제는 미국 특허 제 5,409,818 호(말렉 등)에 기술된 증폭 방법에서 사용된다. 또다른 실시태양에서, 이러한 폴리머라제는 미국 특허 제 5,130,238 호(말렉 등)에 기술된 증폭 방법에서 사용된다. 이러한 실시태양에서, 본 발명은 증폭 싸이클에 진입하기 위한 신규한 방법에 관한 것이다. 추가의 실시태양에서, 폴리머라제는 미국 특허 제 4,683,195 호(물리스(Mullis)), 미국 특허제 4,683,202 호(물리스) 및 젠프로브(GenProbe) 미국 특허 제 5,399,491 호(카시안(Kacian) 등)에 기술된 증폭 방법에서 사용된다.

예를 들면, 특정 핵산 서열을 함유하는 것으로 의심되는 또는 함유하는 것으로 알려져 있는 단일가닥 또는 이중가닥 DNA을 함유하는 제 1 반응 배지(DNA 제 1 주형)에 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제 및 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 첨가한다. 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제는 특정 프로모터 서열과는 무관하게 DNA 주형을 비특이적으로 전사시켜(Chamberlin, 1976; Ovchinnikov et al, 1977) RNA 제 1 주형을 제공한다. 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제 홀로 또는 코어 효소를 사용할 수 있으나, 시그마 인자의 부재로 인해 프로모터와 무관한 전사가 증가하므로 코어 효소가 바람직하다.

DNA 제 1 주형의 전사 후에는, 각 DNA 제 1 주형당 하나 이상의 RNA 복제물(RNA 제 1 주형)이 생성된다. RNA 제 1 주형을 획득한 후, 앞서 기술된 바와 같은 제 2 군의 시약을 제공한다.

상기 시약을 제공한 후, 제 1 프라이머가 RNA 제 1 주형으로 하이브리드화되고, RNA-지향성 DNA 폴리머라제가 RNA 제 1 주형을 사용하여 제 1 프라이머를 연장시킴으로써 DNA 제 2 주형을 합성시켜 RNA-DNA 하이브리드 중간생성물을 형성시키게 된다. 리보뉴클레아제는 RNA-DNA 하이브리드의 RNA를 가수분해한다. 제 2 프라이머는 DNA 제 2 주형에 하이브리드를 형성한다. DNA-지향성 DNA 폴리머라제가 제 2 프라이머 및 DNA 제 2 주형을 사용하여 제 2 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 작용성 프로모터를 합성한다. 제 2 RNA 폴리머라제는 작용성 프로모터를 인식하고DNA 제 2 주형을 전사시켜 RNA 제 2 주형의 복제물을 제공한다. 이어서 RNA 제 2 주형이 미국 특허 제 5,130,238 호 및 미국 특허 제 5,409,818 호(말렉)에 기술된 싸이클로 진입하여 그 결과 특정 핵산 서열의 다수의 복제물을 생성하게 된다.

따라서, 본 개선으로 인하여 DNA 가닥을 분리시킬 필요가 없고 DNA 제 1 주형을 제 1 프라이머로 연장시킬 필요가 없다. 특정 핵산을 증폭시키기 전에 DNA 제 1 주형을 별도의 프라이밍 반응에서보다는 단일 전사 반응에서 사용한다.

물질 및 방법

물질

어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)의 DNA 합성기를 사용하여 올리고뉴클레오타이드를 합성시켰다. 올리고뉴클레오타이드 합성에 사용된 컬럼, 포스포아미다이트, 및 시약을 어플라이드 바이오시스템즈 인코포레이티드로부터 구입하였다. 올리고뉴클레오타이드를 폴리아크릴아미드 겔 전기영동시킨 후 DEAE 셀룰로즈 크로마토그래피시켜 정제하였다. 방사선 동위원소 α-³²P-CTP(~3000 Cl/mmol) 및 γ-³²P-ATP(~3000 Cl/mmol)를 아머샴(Amersham)에서 구입하였다. RNase A 및 리팜피신을 시그마(Sigma)에서 구입하였다. DNase I를 프로메가(Promega)에서 구입하였다. 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제를 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim) 및 에피센터 테크놀로지스 인코포레이티드(Epicentre Technologies Inc.)로부터 구입하였다.

DNA의 단리 및 서열 결정

1989년 삼부룩(Sambrook) 등의 방법에 따라 게놈 DNA를 KG-1 및 살모넬라 티피뮤리움 세포로부터 정제하였다. 1990년 붐(Boom) 등의 방법에 따라 전체 핵산을 클라미디아로 감염된 HeLa 세포로부터 단리시켰다.

아가로즈 겔 전기영동 및 노던 블롯 하이브리드화

아가로즈 겔을 제조하고 1989년 삼브룩 등의 방법에 따라서 진행시켰다. 겔은 3% 저용융 아가로즈(NuSieve^TM; FMC) 및 1% 아가로즈 또는 단지 2%의 아가로즈를 1X 트리스-아세테이트 EDTA(TAE)내에 0.2㎍/㎖ 에티디움 브로마이드와 함께 함유하였다. 증폭 반응물의 액적(5㎕)을 분석하였다.

전기영동 후, 증폭된 물질을 일렉트로블롯팅(electroblotting)에 의해 나일론 멤브레인으로 옮겼다(삼브룩 등, 1989). 핵산을 나일론 멤브레인에 고정시키고 문헌[숙나난(Sooknanan) 등 저, 1993]에 기술된 조건을 사용하여 특정 프로브로 하이브리드화시켰다. 프로브를 5' 말단에서³²P로 라벨링하였다(삼브룩 등, 1989). 하이브리드화시킨 후 비특이적으로 결합된 프로브를 세척하여 제거하고 Kodak XAR-5 필름을 사용하여 방사선 자동 사진법을 수행하였다.

TCA 침전

전사 반응물에서 액적(5㎕)을 취하여 삼브룩 등의 방법(1989)에 따라 TCA 침전시켰다. 액체 섬광 계수기에서 방사선 활성을 결정하였다.

실시예 1. 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제를 사용한 시험관내 천연 게놈 DNA의 전사

표준 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제 전사 반응물은 66.67mM의 트리스(pH 8.5), 83.37mM의 KCl, 20mM의 MgCl₂, 각각 3.3 mM의 ATP, CTP, GTP 및 UTP, 각각 1.6mM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 5㎍의 소 혈청 알부민, 16.6mM의 DTT, 7.5단위의 태반 리보뉴클레아제 저해제, 500ng 이하의 이중가닥 DNA 및 1단위의 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제 코어 효소를 최종 부피가 15㎕되도록 포함한다. 반응 혼합물을 40℃에서 30분동안 배양시켰다.

에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제에 의한 DNA 주형의 전사를 입증하기 위해, 전사 반응물의 분취량들을 2㎍의 RNase A(RNA 특이성 뉴클레아제) 또는 2단위의 DNase Ⅰ(DNA 특이성 뉴클레아제)중 하나로 37℃에서 30분 동안 분해시키고, 이어서 에티디움 브로마이드 염색된 아가로즈 겔상에서 분석하였다. 도 2의 레인 A2 및 B2는 사람의 골수양성 세포선 KG-1 및 살모넬라 티피뮤리움에서 각각 단리된 100ng의 천연 DNA로부터의 전사 생성물을 제시한다. 전사 생성물은 RNase A(도 2, 레인 A3 및 B3)에 감수성이지만 DNaseⅠ(도 2, 레인 A4 및 B4)에는 감수성이지 않았고, 이로써 합성된 생성물은 RNA임을 확인하였다. DNase Ⅰ은 예상대로 투입된 DNA 주형을 분해하였다(도 2, 레인 A4 및 B4). 또한, 합성된 대부분의 RNA는 천연 에티디움 브로마이드 염색된 아가로즈 겔상에서 1Kb DNA 분자량 마커 위로 연장된 염색에 의해 표시된 바와 같이 이종성 혼합물로 나타났다.

도 2에서, 하기 레인은 하기 물질을 갖는다:

A - 250ng의 KG-1 게놈 DNA

B - 250ng의 살모넬라 티피뮤리움 게놈 DNA

M - 이중가닥 DNA 분자량 마커

1 - 모의 전사 반응물(효소 없음)

2 - 미처리된 전사 반응물

3 - RNase A 처리된 전사 반응물

4 - DNase Ⅰ 처리된 전사 반응물

실시예 2. NASBA ^TM 가 억제되지 않는 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제의 특이적 억제

에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제는 NASBA^TM의 억제를 방지하기 위해 전사후 불활성화되어야 한다. 1.7pmole의 α-³²P-CTP, 100ng의 천연 게놈 DNA 및 0, 1, 10 또는 100㎍/㎖의 리팜피신을 함유한 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제 반응물을 실시예 1에 기술된 바와 같이 처리하였다.

합성된 RNA 농도는 전사된 물질의 TCA 침전에 의해 측정되었다. 10 및 100㎍/㎖의 리팜피신은 둘다 1 단위의 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제를 억제하기에 충분하였고, 이 결과로 1㎎/㎖의 리팜피신에 비해 2% 미만으로 RNA가 합성되었고, 리팜피신이 존재하지 않은 경우(도 3A) 100%였다.

한편, 10㎍/㎖ 또는 100㎍/㎖ 농도의 리팜피신은 리팜피신이 첨가되지 않은경우(도 3B)에 비해 NASBA^TM반응을 억제하는 것으로 나타났다. 또한 전사 반응물을 65℃에서 2분 이상 동안 항온배양 함으로써 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제를 불활성화할 수 있었다(데이터는 제시되지 않음).

도 3B에서, Ⅰ은 에티디움 브로마이드 함유 아가로즈 겔을 나타내고, Ⅱ는 노던 블롯 하이브리드화(northern blot hybridization)를 나타낸다.

도 3B에서, 하기 레인은 하기 물질을 갖는다;

A - 리팜피신 없음

B - 10㎍/㎖의 리팜피신

C - 100㎍/㎖의 리팜피신

M - 이중가닥 DNA 분자량 마커

1 - 주형이 첨가되지 않음

2, 3 - 주형으로서 10ng의 P1-프라임 게놈 DNA

실시예 3. 이중가닥 DNA 주형으로부터 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제에 의해 전사된 RNA로부터의 특이적 증폭에 대한 입증

10ng의 천연 사람 게놈 DNA를 각각 함유한 6개의 분리된 전사 반응물을 실시예 1에 기술된 바와 같이 처리하였다. 표준화를 위해 반응물을 합하고 6개의 동일한 분량으로 재분할하였다. 이어서 실시예 1에 기술된 바와 같이 두개의 분취량을 각각 2㎍의 RNase A로 분해시키고, 또다른 두개를 2 단위 DNase Ⅰ으로 각각 분해시켰다. 나머지 두 분취량을 뉴클레아제 첨가 없이 다른 것과 마찬가지로 항온배양하였다.

항온배양에 이어서, 시료들을 제단백시키고, 5㎕의 살균수에서 에탄올 침전 후 핵산을 회수하였다. 각각 5㎕의 시료를 GM-CSF 특이적 프라이머 함유된 표준 NASBA^TM반응물에 첨가하였고, 90분 동안 40℃에서 증폭시켰다. 이와 함께, 각각 10ng의 미처리된 천연 HGD를 함유한 한 쌍의 NASBA^TM반응물도 처리하였다.

증폭 반응물의 5㎕ 분취량중 함유된 생성물을 에티디움 브로마이드 염색된 아가로즈 겔 상에서 분석하였고, 이어서 노던 블롯 하이브리드화를 수행하였다. 모든 반응물은 에티디움 브로마이드 염색에 근거한 증폭된 물질들을 함유하였고(도 4a, 레인 1-10), 이로써 증폭 반응이 억제되지 않음을 알 수 있었다. 그러나, 증폭된 GM-CSF 서열에 특이적인 프로브에 의해 하이브리드화된 후, 양성 신호는 단지 미분해된 전사된 물질(도 4b, 레인 5, 6) 및 DNase Ⅰ 분해된 물질(도 4b, 레인 9, 10)로부터 나타났다. 천연 DNA 또는 RNase A 분해된 물질중 하나를 함유한 반응물은 음성이었다(도 4b, 각각 레인 2, 3 및 7, 8). 이들 결과로부터 GM-CSF 특이적 증폭은 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제에 의해 천연 DNA가 전사된 후 생성된 RNA로부터 기원됨을 알 수 있었다.

도 4b에서, 하기 레인은 하기 물질을 갖는다:

1 - 주형이 첨가되지 않음

2, 3 - 주형으로서 10ng의 천연 DNA

4 - 주형이 첨가되지 않음

5, 6 - 주형으로서 미처리된 전사 반응물

7, 8 - 주형으로서 RNase A 처리된 전사 반응물

9, 10 - 주형으로서 DNase Ⅰ 처리된 전사 반응물

실시예 4. 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제에 의한 사람의 게놈 DNA(HGD)의 전사 후 생성되는 RNA로부터의 특이적 서열의 NASBA ^TM 중 증폭

1ng, 10ng 또는 100ng의 HGD를 함유하는 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제 전사 반응을 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다. 전사 후, 적절한 프라이머 혼합물을 직접 전사 반응물에 첨가하여 25㎕의 용적중 0.2μM의 제 1 프라이머(P1), 0.2μM의 제 2 프라이머(P2) 및 15%(v/v)의 DMSO인 최종 농도가 제공되었다. 반응 혼합물을 65℃에서 2분 동안 가열하였고, 이어서 40℃로 옮겼다. 40℃에서 2분 후, 8 단위의 AMV 역전사효소, 0.2 단위의 RNase H, 40 단위의 T7 RNA 폴리머라제 및 100㎍/㎖의 BSA를 함유하는 효소 혼합물을 각각 반응물에 첨가하고, 최종 반응 용적은 H₂O를 이용해 25㎖로 조정하였다. 반응물을 40℃에서 추가로 90분 동안 항온배양하였다.

이와 함께, 1ng, 10ng 및 100ng의 HGD가 변성되었고, P1 프라임화되었다. P1-프라임화된 DNA를 열변성시켜 분리하고, 표준 25㎕ NASBA^TM반응물(40mM 트리스, pH 8.5, 50mM KCl, 12mM MgCl₂, 각각 2mM의 ATP, CTP, GTP 및 UTP, 각각 1mM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 10mM의 DTT, 8 단위의 AMV 역전 트랜스크립타제, 0.2단위의 RNase H, 40 단위의 T7 RNA 폴리머라제 및 100㎍/㎖ BSA)에 첨가하고, 40℃에서 90분 동안 항온배양 하였다. 주형으로서 1ng, 10ng 또는 100ng의 미처리된 천연 HGD를 함유한 3번째 표준 NASBA^TM반응물도 처리하였다.

증폭에 이어서, 각각 5㎕의 분취량의 반응물을 에티디움 브로마이드 염색된 아가로즈 겔 상에서 분석하였고, 노던 블롯 하이브리드화를 수행하였다. GM-CSF 및 G3PDH 서열에 특이적인 프라이머에 대한 결과는 도 5Ⅰ 및 5Ⅱ에 각각 제시된다. 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제로 DNA를 전사한 후 생성되는 RNA로부터 특정 DNA 서열을 증폭시키는 능력은 통상의 P1-프라임화 과정에 비교할 경우 동일하였다(도 5Ⅰ 및 5Ⅱ, 각각 레인 C2-7 및 B2-7). 미처리된 DNA은 프라이머 장치에 대해 특정 증폭을 제공하지 않았다(도 5Ⅰ 및 5Ⅱ, 레인 A2-7).

도 5에서 하기의 레인은 하기의 물질을 갖는다:

A - 미처리된 천연 DNA

B - P1-프라임화 DNA

C - DNA로부터 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제 RNA

1 - 주형이 없음

2, 3 - 100pg DNA

4, 5 - 1ng DNA

6, 7 - 10ng DNA

실시예 5. 클라미디아 트라코마티스 DNA의 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제 전사후에 생성되는 RNA로부터 특정 서열의 NASBA ^TM 중의 증폭; 세균 모델

클라미디아 트라코마티스가 감염된 HeLa 세포로부터 격리된 전체 핵산의 다른 양을 함유하는 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제 전사는 실시예 1에 기술한 바와 같이 수행되었다. 클라미디아 트라코마티스의 잠재 플라즈미드(PL1) 및 MOMP 유전자(VD1)에 특이적인 프라이머를 NASBA^TM으로 시험하였다. 하기의 전사에서, 적합한 프라이머 혼합물을 전사 반응물에 직접 가하여 0.2μM P1, 0.2μM P2의 25㎕ 용적 및 15%(v/v) DMSO에 최종 농축물을 수득하였다. 상기 반응물을 65℃에서 2분동안 가열한 다음 40℃로 옮겼다. 40℃에서 2분 후에, 8단위의 AMV 역전 트랜스크립타제, 0.2단위의 RNase H, 40단위의 T7 RNA 폴리머라제 및 100㎍/ml의 BSA를 함유하는 NASBA^TM효소 혼합물을 각 반응물에 가했다. 최종 반응 용적을 H₂O로 25ml로 조절하고 상기 반응물을 40℃에서 추가로 90분동안 항온배양하였다. 평형 NASBA^TM반응을 유사한 농도의 P1-프라임화 물질 및 순수물질로 수행하였다.

하기의 증폭에서, 각각의 반응물의 5㎕ 분취량을 노던 블롯 하이브리드화에 의해 분석하였다. RNA는 이미 시료에 함유되어 있기 때문에 PL1 및 VD1 프라이머로부터의 특정 증폭을 10pg 및 1pg의 미처리 전체 핵산(순수)으로부터 각각(도 6 I, 레인 A6-7 및 도 6 II, 레인 A6-7) 관찰하였다. 그러나, 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제로 전사후에, PL1 및 VD1 프라이머에 대한 특정 증폭을 DNA에 대한 P1-프라임화 방법이 사용될 때(도 6 I, 레인 B2-3 및 도 6 II, 레인 B4-5) 증폭하는것과 유사한 100fg의 전체 핵산(도 6 I, 레인 C2-3 및 도 6 II, 레인 C4-5)으로부터 얻었다.

도 6에서, 하기의 레인은 하기의 물질을 갖는다.

A - 미처리된 전체 핵산

B - P1-프라임화 DNA

C - DNA로부터 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제 RNA

1 - 주형이 없음

2, 3 - 10fg의 전체 핵산

4, 5 - 100fg의 전체 핵산

6, 7 - 1pg의 전체 핵산

8, 9 - 10pg의 전체 핵산

실시예 6. 2단계에 대한 3단계 방법 및 단일 반응 용기를 사용하여 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제로 전사된 DNA의 NASBA ^TM 중의 직접 증폭

실시예 3은 NASBA^TM중의 DNA로부터 전사가 생성되는 에스케리치아 콜라이 RNA의 증폭에 대한 2개의 별도의 반응용기를 사용하는 3단계 방법을 기술하고 있다. 다른 한편으로, 실시예 4는 단일 반응용기를 사용하여 동일한 임무를 수행하기 위한 3단계 방법을 기술하고 있다.

실시예에서, 단일 반응용기를 사용하는 3단계 방법은 단일 반응용기를 사용하는 2단계 방법으로 대체된다. 즉, 실시예 4에서와 같이 주요 전사반응에 프라이머 혼합물의 첨가대신에 DMSO(최종 20.83%(v/v))를 주요 전사반응에 가하고, 프라이머 1 및 프라이머 2를 효소 혼합물과 혼합한 후에 가한다. 본 실시예에서, 모든 주요 전사반응은 10ng의 HGD를 함유하고, 증폭은 GM-CSF 특정 프라이머를 사용하여 수행하였다.

한쌍의 반응물에서(A세트), 실시예 4에 기술한 3단계 방법을 실시하여 대조하였다. 두번째 한쌍의 반응물에서(B세트), 증폭 반응중의 DMSO의 최종 농도를 18.75%(v/v)로 조절하고 동일한 3단계 방법을 사용하였다.

세번째 한쌍의 반응물에서(C세트), 실시예 1에서 장치한 바와 같이 주요 전사 반응물은 전체 용적 18㎕중에 15%(v/v) DMSO 및 5pmol의 프라이머 1을 추가로 함유하였다. 상기 반응물을 40℃에서 30분동안 항온배양하고, 65℃로 2분동안 가열한 후에 40℃에 놓았다. 그런다음, 15%(v/v) DMSO 및 5pmol의 프라이머 2를 추가로 함유하는 표준 효소 혼합물을 각각의 반응 튜브에 가했다. 증폭을 40℃에서 90분동안 진행하도록 하였다.

네번째 한쌍의 반응물에서(D세트), 실시예 1에 장치된 바와 같이 주요 전사반응은 18㎕의 전체 용적중에 20.83%(v/v) DMSO를 추가로 함유했다. 상기 반응물을 40℃에서 30분동안 항온배양하고, 65℃에서 2분동안 가열한 다음 40℃로 만들었다. 각각의 프라이머 1 및 프라이머 2의 5pmol을 추가로 함유하는 표준 효소 혼합물을 각각의 반응 튜브에 가했다. 증폭을 40℃에서 90분동안 진행하도록 하였다.

각각의 증폭 반응물의 5㎕ 분취량에 함유된 생성물을 노던 블롯 하이브리드화에 의해 에티디움 브로마이드로 염색된 아가로즈 겔상에서 분석하였다. 반응물의다른 세트(A-D)에 대한 결과를 도 7에 도시한다. 대조 3단계 방법 반응은 DMSO농도가 15%(v/v) (도 7, 레인 A2-3)이지만 18.75%(v/v)(도 7, 레인 B2-3)은 아닐때 예상한대로 작동하였다.

2단계 방법(반응 세트 C2-3)의 하나는 주요 전사반응중에 프라이머 1의 존재때문에 거의 또는 전혀 특정 증폭(도 7, 레인 C2-3)이 수득되지 않는다. 두번째 2단계 방법에서 프라이머 1 및 프라이머 2를 주요 전사반응(도 7, 레인 D2-3)중에 20.83%(v/v)의 DMSO농도에도 불구하고 효소 혼합물과 함께 가했다. 즉, 2단계 방법 및 RNA 증폭에 대한 단일 반응 용기중에 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제 전사 프로토콜을 사용하는 NASBA^TM중에서 직접 DNA의 증폭을 수행하는 것이 가능하다. 상기 반응물에 효소 혼합물을 가하기 전에 65℃ 가열단계를 제거하면, 리팜피신(실시예 2 참조)은 효소 혼합물과 함께 가해져야 한다.

도 7에서, 하기의 레인은 하기의 물질을 갖는다:

A - 15% DMSO중에 3단계 단일 반응용기 방법

B - 18.75% DMSO중에 3단계 단일 반응용기 방법

C - 주요 전사반응중에 15% DMSO 및 프라이머 1을 사용하는 2단계 단일 반응용기 방법

D - 주요 전사반응중에 20.83% DMSO를 사용하는 2단계 단일 반응용기 방법

1 - 가해진 주형이 없음

2, 3 - 10ng의 HGD

본 발명의 바람직한 실시태양이 상세하게 기술되고 있지만, 본 발명의 정신이나 첨부된 청구범위의 한계를 벗어남이 없이 본 발명의 변형이 당해 기술분야의 숙련자들에 의해 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다.

Claims

(A)DNA 제 1 주형을, 특정 핵산 서열을 포함하는 RNA 제 1 주형을 합성하도록 하는 조건하에서, 세포성 RNA를 합성하는 부류인 원핵 RNA 폴리머라제 및 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트와 접촉시키는 단계;

(B) 세포성 RNA를 합성하는 부류인 상기 RNA 폴리머라제를 불활성화시키는 단계;

(C) RNA 제 1 주형을 하기 (i) 내지 (viii)과 접촉시키는 단계:

(i) 제 2 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터의 플러스 서열을 포함하는 제 1 올리고뉴클레오타이드 프라이머,

(ii) 제 2 올리고뉴클레오타이드 프라이머,

(iii) 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트,

(iv) 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트,

(v) 상기 프로모터를 인식하는 DNA-지향성 RNA 폴리머라제인 제 2 RNA 폴리머라제,

(vi) RNA-지향성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 효소,

(vii) DNA-지향성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 효소,

(viii) Rnase H 활성을 갖는 효소; 및

(D)생성된 반응 혼합물을, 적당한 조건하에서 상기 특정 핵산 서열 또는 상기 특정 핵산 서열에 상보적인 서열을 원하는 만큼 증폭시키기에 충분한 시간동안유지시키는 단계를 포함하는,

DNA 제 1 주형으로부터 특정 핵산 서열을 증폭시키는 방법.
제 1 항에 있어서,

원핵 RNA 폴리머라제가 에스케리치아 콜라이의 RNA 폴리머라제, 바실러스(Bacillus)의 RNA 폴리머라제 및 아르캐(Archae) 박테리아의 RNA 폴리머라제로 구성된 군에서 선택된 1종인 방법.
제 1 항에 있어서,

단계(A)가 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 제공함을 추가로 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,

단계 (B)가 원핵 RNA 폴리머라제의 저해제를 제공함을 포함하는 방법.
제 4 항에 있어서,

저해제가 리팜피신인 방법.
제 1 항에 있어서,

단계(B)가 단계(C) 전에 시약 및 RNA 제 1 주형을 가열함을 포함하는 방법.
제 6 항에 있어서,

반응 배지를 약 65℃로 가열하는 방법.
제 1 항에 있어서,

알킬화 설폭사이드 및 적합한 담체 단백질을 제공함을 추가로 포함하는 방법.
제 8 항에 있어서,

알킬화 설폭사이드가 디메틸설폭사이드(DMSO)이고, 담체 단백질이 소 혈청 알부민(BSA)인 방법.
제 2 항에 있어서,

원핵 RNA 폴리머라제가 0.04 내지 0.2단위/㎕ 범위의 농도로 제공된 에스케리치아 콜라이의 RNA 폴리머라제인 방법.
제 4 항에 있어서,

저해제를 10 내지 100㎍/㎖ 범위의 농도로 제공하는 방법.
제 1 항에 있어서,

단계(A)에서 DNA 제 1 주형이 이중가닥 DNA인 방법.
제 1 항에 있어서,

단계(A)에서 DNA 제 1 주형이 단일가닥 DNA인 방법.
제 1 항에 있어서,

제 1 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 제 2 RNA 폴리머라제에 대한 전사 개시 부위의 플러스 서열을 추가로 포함하고, 이러한 전사 개시 부위의 플러스 서열이 프로모터의 플러스 서열에 작동적으로(operatively) 연결되어 있는 방법.
제 14 항에 있어서,

제 2 RNA 폴리머라제가 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제이고, 전사 개시 부위의 플러스 서열 및 프로모터의 플러스 서열이 함께 하기 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법:

서열 1
제 1 항에 있어서,

싸이클중 생성물을 축적하기 위해 제 1 프라이머, 제 2 프라이머, 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트가 소비되는 것에 대해 반응 배지를 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 16 항에 있어서,

모니터링 단계가 특정 핵산 서열 또는 이 서열에 상보적인 서열을 검출함을 포함하는 방법.
제 17 항에 있어서,

모니터링 단계가 핵산 프로브를 사용하여 서열을 검출함을 포함하는 방법.
제 17 항에 있어서,

모니터링 단계가 제한 엔도뉴클레아제 및 전기영동 분리법을 이용하여 서열을 검출함을 포함하는 방법.
제 16 항에 있어서,

모니터링 단계가 RNA 제 2 주형의 축적을 모니터링함을 포함하는 방법.
제 16 항에 있어서,

모니터링 단계가 DNA 제 2 주형의 축적을 모니터링함을 포함하는 방법.
제 16 항에 있어서,

모니터링 단계가 제 2 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 작용성 프로모터를 함유하는 DNA를 모니터링함을 포함하는 방법.
제 16 항에 있어서,

모니터링 단계가 RNA-DNA 하이브리드 중간생성물의 축적을 모니터링함을 포함하는 방법.
제 16 항에 있어서,

모니터링 단계가, 제 1 프라이머, 제 2 프라이머, 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 소비 또는 싸이클중 생성물의 축적을, 특정 핵산 서열 및 이 서열에 상보적인 서열의 부재하에 반응 배지에서 상기 시약의 소비 또는 상기 생성물의 축적을 나타내는 값과 비교함을 추가로 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,

단계들에 대해 단일 반응용기를 제공함을 추가로 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,

리보뉴클레아제가 송아지 흉선 리보뉴클레아제 H를 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,

제 1 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 제 2 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 고정된 지지체에 가역적으로 결합시키는 방법.
제 1 항에 있어서,

DNA-지향성 RNA 폴리머라제가 박테리오파지 RNA 폴리머라제인 방법.
제 28 항에 있어서,

DNA-지향성 RNA 폴리머라제가 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제인 방법.
제 28 항에 있어서,

DNA-지향성 RNA 폴리머라제가 박테리오파지 T3 폴리머라제인 방법.
제 28 항에 있어서,

DNA-지향성 RNA 폴리머라제가 박테리오파지 ΦII 폴리머라제인 방법.
제 28 항에 있어서,

DNA-지향성 RNA 폴리머라제가 살모넬라(Salmonella) 박테리오파지 sp6 폴리머라제인 방법.
제 28 항에 있어서,

DNA-지향성 RNA 폴리머라제가 슈도모나스(Pseudomonas) 박테리오파지 gh-1 폴리머라제인 방법.
제 1 항에 있어서,

RNA-지향성 DNA 폴리머라제가 레트로바이러스(retrovirus) 역전 트랜스크립타제인 방법.
제 1 항에 있어서,

레트로바이러스 역전 트랜스크립타제가 조류의 골수아구증 바이러스 폴리머라제인 방법.
제 1 항에 있어서,

레트로바이러스 역전 트랜스크립타제가 몰로네이(Moloney) 설치류의 백혈병 바이러스 폴리머라제인 방법.
제 1 항에 있어서,

레트로바이러스 역전 트랜스크립타제가 에스케리치아 콜라이 리보뉴클레아제 H인 방법.
제 1 항에 있어서,

DNA-지향성 DNA 폴리머라제가 엑소뉴클레아제 활성을 갖지 않는 방법.
제 1 항에 있어서,

반응 배지중의 모든 DNA 폴리머라제가 DNA 엑소뉴클레아제 및 DNA 엔도뉴클레아제 활성을 갖지 않는 방법.
제 1 항에 있어서,

DNA-지향성 DNA 폴리머라제가 조류의 골수아구증 바이러스 폴리머라제인 방법.
제 1 항에 있어서,

DNA-지향성 DNA 폴리머라제가 DNA 폴리머라제 α 또는 DNA 폴리머라제 β인 방법.
제 1 항에 있어서,

DNA-지향성 DNA 폴리머라제가 송아지 흉선 DNA 폴리머라제인 방법.
제 1 항에 있어서,

단계(D)가 조건을 30분 내지 4시간동안 유지시킴을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,

싸이클중 DNA 생성물을 클로닝 벡터로 라이게이션(ligation)시킨 후 클로닝하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,

싸이클중 DNA 생성물에 의해 코딩된 생성물을 발현 시스템에서 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
(a) 세포성 RNA를 합성하는 DNA-지향성 RNA 폴리머라제인 제 1 원핵 RNA 폴리머라제, (b) 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트, (c) 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트, (d) 제 2 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터의 플러스 서열을 포함하는 제 1 올리고뉴클레오타이드 프라이머, (e) 제 2 올리고뉴클레오타이드 프라이머, (f) 상기 프로모터를 인식하는 DNA-지향성 RNA 폴리머라제인 제 2 RNA 폴리머라제, (g) RNA-지향성 DNA 폴리머라제, (h) DNA-지향성 DNA 폴리머라제, 및 (i) 단일가닥 또는 이중가닥 RNA 또는 DNA를 가수분해시키지 않고 RNA-DNA 하이브리드의 RNA를 가수분해시키는 리보뉴클레아제를 함유하는 하나 이상의 용기(receptacle)를 포함하는, 핵산 서열 증폭용 키트.
제 46 항에 있어서,

제 1 RNA 폴리머라제가 에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제인 키트.
제 46 항에 있어서,

에스케리치아 콜라이 RNA 폴리머라제의 저해제를 함유하는 용기를 추가로 포함하는 키트.
제 48 항에 있어서,

저해제가 리팜피신인 키트.
제 46 항에 있어서,

알킬화 설폭사이드를 함유하는 용기 및 적합한 담체 단백질을 함유하는 용기를 추가로 포함하는 키트.