JPH0576399A - イン ビトロで複製可能な核酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 in vitroで複製可能な核酸の製造方法、複製
反応による核酸の増幅および検出方法ならびにこれらの
方法の適用に適している試薬を提供すること。 【構成】 一本鎖核酸Ａを準備し、核酸Ａの一部分と相
補的な部分および複製開始部位を含むプライマーＰ１と
核酸Ａとをハイブリダイズし、モノヌクレオシド三リン
酸を使用してポリメラーゼによりプライマーＰ１を伸長
して核酸Ｂを形成し、核酸ＡおよびＢのハイブリッドか
らＡを除去し、核酸Ｂの一部分と相補的な領域および複
製開始部位を含有するプライマーＰ２と核酸Ｂとをハイ
ブリダイズし、モノヌクレオシド三リン酸を使用してポ
リメラーゼによりプライマーＰ２を伸長して核酸Ｃを形
成することを特徴とするin vitroで複製可能である核酸
の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、in vitroで複製可能な
核酸の製造方法、複製反応による核酸の増幅および検出
方法ならびにこれらの方法の用途に適している試薬に関
する。

【０００２】

【従来の技術】最近、核酸の増幅は多くの研究の課題と
なってきた。この理由は、おそらく、核酸が天然では純
粋な形態でほとんど存在せず、通常、混合物として存在
するためである。特に、臨床診断学、食物診断学および
生物工学におけるような試料中の核酸の検出に基づく試
験に関し、前工程で検出されるべき核酸を増幅し、次い
で、所望により慣用の方法によってそれらを検出するの
が必要であることが判明した。核酸のin vivo増幅に関
してさえ、前in vitro増幅工程を有するのが好都合であ
る。

【０００３】核酸増幅方法は複製方法と転写方法に分け
ることができる。転写に基づく方法では、増幅生成物は
ＲＮＡである。このような方法は、例えば欧州特許出願
公開ＥＰ−Ａ−０３２９８２２号公報に開示されてい
る。該転写方法の欠点は核酸の増幅の後に続く反応にお
けるＲＮＡの不安定性である。さらに、あらゆる場合
に、例えば増幅生成物が直接クローン化される場合に必
要であるような別の反応工程においてＲＮＡを使用する
のが可能ではない。

【０００４】国際公開ＷＯ８７／０６２７０号公報に
は、ＲＮＡファージのゲノム配列の複製に基づいた核酸
の検出方法が開示されている。しかし、この方法は検出
されるべき核酸の増幅には基づいておらず、それと特異
的にハイブリダイズする核酸の増幅に基づいている。し
たがって、この方法は核酸の検出に適用可能なだけであ
り、さらにバックグラウンドに関する相当の問題点を有
する。

【０００５】国際公開ＷＯ９０／１００６４号公報に
は、制限酵素による検出されるべき一本鎖核酸の分裂、
およびファージφ２９由来のｏｒｉ配列を含有する核酸
を使用してこの方法で形成されるフラグメントの結紮に
基づいている複製可能な核酸の製造方法が開示されてい
る。この方法の欠点は、複製可能な核酸の製造のために
少なくとも２つの酵素、すなわち制限酵素およびリガー
ゼが必要であるということである。該反応はＲＮＡが出
発物質である場合により一層複雑になる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は特に簡
単な複製可能な核酸の製造方法を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、 ａ）一本鎖核酸Ａを準備し、 ｂ）核酸Ａの一部分と相補的な部分および複製開始部位
を含むプライマーＰ１と核酸Ａとをハイブリダイズさ
せ、 ｃ）モノヌクレオシド三リン酸(mononucleoside tripho
sphate)を使用してポリメラーゼによりプライマーＰ１
を伸長して核酸Ｂを形成させ、 ｄ）核酸ＡおよびＢの核酸ハイブリッドから核酸Ａを除
去し、 ｅ）核酸Ｂの一部分と相補的な領域および複製開始部位
を含有するプライマーＰ２と核酸Ｂとをハイブリダイズ
させ、 ｆ）モノヌクレオシド三リン酸を使用してポリメラーゼ
によりプライマーＰ２を伸長して核酸Ｃを形成させるこ
とを特徴とするin vitroで複製可能である核酸の製造方
法を提供するものである。

【０００８】本発明はこの方法を使用する核酸またはそ
の一部分の増幅方法および該増幅方法を含む核酸の検出
方法を提供するものでもある。さらに、本発明はin vit
roで複製可能である核酸の製造用および核酸の検出用試
薬キットを提供するものでもある。

【０００９】以下に、１つまたはいくつかのヌクレオチ
ドの塩基対がワトソン−クリック則に一致していないが
他の核酸とハイブリダイズすることができる核酸を他の
核酸と実質的に相補的である核酸と称する。

【００１０】他の核酸と実質的に相同であると称される
核酸は、ヌクレオチド配列が１つまたはいくつかのヌク
レオチドによって他の核酸のヌクレオチド配列とは異な
るが他の核酸と相補的であるヌクレオチド配列とハイブ
リダイズし得る核酸である。

【００１１】本発明の方法において、核酸Ａとして全て
のタイプの核酸は使用し得る。これらは共に天然または
合成起源の一本鎖もしくは二本鎖形態のＲＮＡおよびＤ
ＮＡを含む。それらは真核生物(例えば、ウイルス、細
胞)からだけではなく、原核生物(例えば、ファージ、細
菌)からも得ることができる。核酸が二本鎖形態で存在
する場合、それらは一本鎖に転換されなければならな
い。これは慣用手段によって、例えば加熱または適切な
試薬の助けをかりて行われ得る。

【００１２】核酸の起源は重要なものではない。好まし
くは、溶液および懸濁液中の固相に固定された核酸、ま
たは細胞、細胞スミア、固定細胞もしくは組織片を含有
する培地中の核酸、あるいは単離された染色体上の核酸
を使用し得る。溶液中の核酸の使用が特に好ましい。例
えば、ウイルスＤＮＡ、細菌ＲＮＡまたは細胞ゲノムＤ
ＮＡである。以下、一本鎖核酸Ａが存在する培地を試料
培地と記す。この培地は核酸Ａとは別の他の成分、特に
複製可能な核酸への取込みおよび／または増幅の予定の
ない核酸も含有し得る。

【００１３】以下、鋳型核酸は核酸合成工程において新
しく形成された核酸上に伝達されるヌクレオチド配列情
報を含有する核酸と解される。これらの鋳型核酸のうち
の１つは本発明の方法の基礎を形成する核酸Ａである。

【００１４】複製可能な核酸は、複製システムの添加の
後に増加(増幅)され得、かつ少なくとも１つのｏｒｉ領
域を含有する核酸と解される。

【００１５】本発明では、複製システムのｏｒｉ領域は
１つの酵素だけを必要とする反応を介して取込まれる。
該方法を行うために核酸Ａにつき少なくとも２つの出発
分子が必要である。以下、これらをプライマーと記す。
以下、１つのプライマーは核酸Ａの一部分と相補的であ
る一部分を有し、その結果、核酸Ａと特異的にハイブリ
ダイズし得る核酸、特にオリゴヌクレオチドと解され
る。さらに、該プライマーは核酸Ａと相補的ではない他
のヌクレオチド配列を含有する。これらは複製システム
のｏｒｉ配列を含む。さらに、プライマーは別のヌクレ
オチド、例えば制限酵素に関する分裂部位を表すものを
含み得る。

【００１６】プライマーのヌクレオチド配列は、それら
の３'末端が核酸Ａ上でお互いに１〜２００００、特に
好ましくは１００〜８０００ヌクレオチド離れているよ
うに選択される。

【００１７】ｏｒｉ(複製起源)配列は、例えばビー・レ
ヴィン(Ｂ.Ｌewin)［遺伝子 IV(Ｇenes IV)、パブリッ
シャー・ジョーン・ウィリィ(Ｐublisher Ｊohn Ｗile
y)１９９０］に開示されているもののような複製開始部
位である。複製システムはこれらのｏｒｉ配列の各々に
属する。複製システムは核酸の複製のために必要な試薬
と解される。これは、特に、複製酵素、好ましくはＤＮ
Ａポリメラーゼ、および所望によりコファクターからな
る。例えば、ファージＰＲＤ１、φ１５、Ｍ２９、Ｎ
ｆ、ＧＡ−１、Ｃｐ１およびφ２９由来ならびにアデノ
ウイルスのような真核生物由来の複製システムが知られ
ている。バシラス・サチリス(Ｂacillus subtilis)φ２
９の複製システムが好ましい。この場合、ＤＮＡポリメ
ラーゼｐ２および複製開始蛋白ｐ３が特に好都合である
のが判明した。

【００１８】本発明によると、プライマーは核酸Ａの一
部分と相補的である部分に加えて複製開始部位を含有す
るプライマーＰ１として使用される。本発明によると、
プライマーは核酸Ａの一部分と実質的に相同である一部
分および複製開始部位を含有するプライマーＰ２として
使用される。核酸Ａと相補的または相同性である部分は
プライマーの３'末端領域にあるが、複製開始部位はプ
ライマーの５'領域にあるのが好ましい。以下、核酸Ａ
の一部分と相補的または相同性であるプライマーの部分
をプライマーの鋳型特異的配列と記す。この配列は６〜
５０ヌクレオチド長さであるのが好ましい。かくして、
国際公開ＷＯ９０／１００６４号公報における方法と違
って、簡単な方法で特定の核酸Ａまたはその一部分を複
製可能な核酸に特異的に転換することが可能である。ｏ
ｒｉ配列は例えば好ましいφ２９システムにおいて２８
０ヌクレオチド長さまでであり、好ましくは１２〜８０
ヌクレオチド長さである。複製システムφ２９および関
連ｏｒｉ配列のさらなる詳述のために以下の文献を充分
に詳細に引用する。

【００１９】ＤＮＡ複製および突然変異誘発(ＤＮＡ Ｒ
eplication and Ｍutagenesis)、モーゼス(Ｍoses)、サ
マーズ(Ｓummers)編、ＡＳＭ、ワシントン・ディーシ
ー、１９８８、プロシーディングス・オブ・ナショナル
・アカデミィ・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ(Ｐr
oc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)８２、６４０４(１９８
５)、Ｎucl.Ａcids Ｒes.１６／１３、５８９５(１９８
８)、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.)２６４／１５、８９３５(１９８
９)、国際公開ＷＯ９０／１００６４号公報、ビオシミ
カ・エト・ビオフィジカ・アクタ(Ｂiochem.Ｂiophys.
Ａcta)９５、４１９。プライマーは一本鎖であるのが好
ましい。

【００２０】反応は、核酸Ａとプライマーとのハイブリ
ダイゼーションならびに鋳型としての核酸Ａの上でポリ
メラーゼおよびモノデオキシリボヌクレオシド三リン酸
(ｄＮＴＰ)によるその伸長によって開始される。ポリメ
ラーゼとしてＤＮＡポリメラーゼ(ＤＮＡＰ)を使用す
る。核酸ＡがＤＮＡまたはＲＮＡのいずれとして存在す
るかによって、例えばコーンバーグ(Ｋornberg)ポリメ
ラーゼ、クレノウ(Ｋlenow)ポリメラーゼ、Ｔ３−、Ｔ
４−もしくはＴ７−ＤＮＡポリメラーゼまたはＴａｑポ
リメラーゼのようなＤＮＡ依存性ポリメラーゼ、あるい
は逆トランスクリプターゼ(例えば、鳥類の骨髄芽球症
またはモロニーマウス白血病ウイルス由来)のようなＲ
ＮＡ依存性ポリメラーゼを使用する。この反応におい
て、５'末端にｏｒｉ配列を有し、かつ３'末端で核酸Ａ
と実質的に相補的である核酸鎖Ｂを形成する。

【００２１】次に、核酸ＡおよびＢから形成された核酸
ハイブリッドから核酸Ａを除去する。これは、例えば、
この二本鎖を変性することによって、または核酸Ａの分
解によって行われ得る。

【００２２】その後、核酸Ｂを、該鎖Ｂの新しく形成さ
れた部分と実質的に相補的である第２プライマーＰ２と
ハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼおよびモノヌ
クレオシド三リン酸を使用して工程ｃ）と同様に該プラ
イマーＰ２を鋳型核酸としての核酸Ｂ上で伸長させて核
酸Ｃを形成する。この核酸鎖Ｃは、その５'末端および
３'末端にｏｒｉ配列を有する。かくして、この方法で
鎖Ｂおよび鎖Ｃから形成された核酸ハイブリッドの１つ
の末端は、二本鎖ｏｒｉ配列を有し、したがってそのま
ま複製され得る。

【００２３】本発明の方法は、所定の順序で行われるの
が好ましい。しかし、工程ａ）〜ｆ）の順序は、ある程
度まで変えられる。例えば、特に、プライマーどうしの
ハイブリダイゼーションを不可能にし得る場合、例えば
プライマーが３'相補的ヌクレオチドを有しない場合、
反応開始と同時に両プライマーを添加するのが可能であ
る。さらに、この方法は、核酸Ａと相補的な鎖が試料中
に一本鎖の形態で存在した場合に好ましく、さらに複製
可能な核酸の製造のために使用されることを意図する。

【００２４】ＤＮＡポリメラーゼとして、熱安定性ＤＮ
Ａポリメラーゼも使用され得る。熱変性(例えば工程
ｄ）において可能である)の後にポリメラーゼのさらな
る添加は必要ではない。しかし、鎖Ｂの合成の後の変性
は、他の試薬(例えば、アルカリまたはカオトロピック
塩による)を使用して行うこともできる。

【００２５】核酸Ａに加えて、原則的に、複製可能な核
酸の製造のための同一試料培地中、異なるヌクレオチド
配列、好ましくは核酸Ａと相補的である鎖を有する別の
核酸またはその部分を使用することが可能である。予め
必要な条件は、対応するプライマーが各核酸一本鎖につ
いて存在することである。

【００２６】詳細には説明されない個々の反応工程の詳
細な説明は、主に、分子生物学上の標準的な研究から知
られている処置工程または試薬である。これに関して
は、核酸ハイブリダイゼイション(Ｎucleic acid hybri
dization)［ヘイムズ(Ｈames)、ヒギンズ(Ｈiggins)
編、ＩＲＬプレス、１９８６］、分子生物学における慣
用プロトコール(Ｃurrent Ｐrotocols in Ｍolecular
Ｂiology)［アウスベル(Ａusubel)ら編、ウィリィ・ア
ンド・サン(Ｗiley ＆ Ｓon)、１９８７］および分子ク
ローニング(Ｍolecular Ｃloning)［サムブルーク(Ｓam
brook)ら編、ＣＳＨ、１９８９］に開示されている詳細
な説明を個々に引用する。これらは、特に、標識ヌクレ
オシド三リン酸の製造、修飾または非修飾オリゴヌクレ
オチドの化学および酵素合成、制限酵素による核酸の分
裂、特異性が達成され得るハイブリダイゼーション条件
の選択、ならびにポリメラーゼを使用し、かつ所望によ
りいわゆるプライマーを使用するヌクレオシド三リン酸
からの核酸の形成のための公知の方法を含む。

【００２７】本発明は、in vitroで複製可能である核酸
の製造のための上記方法を利用する核酸Ａまたはその一
部分の増幅方法を提供するものである。これについて、
核酸の製造方法に次いで、順に複製可能である核酸にさ
れるこれらの核酸を複製する。記載のように、本発明の
製造方法の生成物は、１つの末端に二本鎖ｏｒｉ配列を
有する核酸ハイブリッドである。該鎖のうちの１つ(鎖
Ｃ)は、両端にｏｒｉ配列を結合する。

【００２８】この鎖は、二本鎖ｏｒｉ配列での複製開始
によって、同一の長さの対向鎖Ｄの合成のための鋳型と
しての役割をする。φ２９システムの場合、ｐ２は、Ｂ
−Ｃハイブリッドの二本鎖ｏｒｉ末端で３'−Ｔに対向
するｐ３−ＡＭＰ分子の取込みによって始まり、鎖Ｃを
置き換えつつ相補鎖を合成する。この反応後に存在する
二本鎖分子は、その両端が起源特異的である線状レプリ
コンに対応する。次の複製反応によって、使用したポリ
メラーゼのプロセッシビティ(processivity)および割合
に依存する該分子の増幅を行う。

【００２９】これについて、鎖の酵素的分離からなるin
vitro複製反応によって、適切な条件下で適切なコファ
クターを使用して核酸ＢおよびＣから形成された複合体
を、相補的な核酸を形成することが可能な複製システム
と反応させて、それらの各末端に１つのｏｒｉ配列を有
する核酸を形成する。次いで、この核酸を順に複製のた
めに準備する。

【００３０】複製システムの好ましい蛋白は核酸プライ
マーのさらなる添加を必要としないＤＮＡポリメラーゼ
活性を有するものである。in vitroで複製反応を開始し
得る酵素は、ファージφ２９の酵素ｐ２ならびにφ２９
ｏｒｉ配列を使用する場合のｐ３およびｄＡＴＰであ
る。この酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ活性および鎖巻戻
し活性を有する。増幅反応の間に該鎖が酵素的に分離さ
れるので、個々の増幅工程の間に別々の変性工程を行う
必要がない。かくして、本発明の方法は、連続的かつ迅
速に進行し得るという利点を有する。さらに、反応温度
が大きく変化せず、かつさらなる試薬を添加せずに進行
し得る。新しく形成されたコピーは複製反応において何
度も使用され得るので、これは、理想的には、新しく形
成された核酸ＣおよびＤを指数的に増加させる。形成さ
れた核酸ＣおよびＤはｏｒｉ配列に加えて核酸Ａまたは
その一部分と実質的に相補的または相同である少なくと
も１つのヌクレオチド配列を含有する。

【００３１】所望の数の核酸ＣおよびＤを形成させた
後、反応を停止することができる。これは、停止試薬、
例えばＥＤＴＡの添加によって行われるのが好ましい。
核酸を製造するのに必要な反応時間は、従来技術の方法
と比較すると本発明の方法によって非常に短縮される。
公知の方法の場合、必要な時間は、とりわけ形成される
核酸の長さに依存する。複製可能な核酸の増幅について
のさらに詳細な説明については、国際公開ＷＯ９０／１
００６４号公報を引用する。

【００３２】核酸ＣおよびＤまたはそれらから形成され
る複合体はさらなる反応に加わることができる。例え
ば、それらから形成される二本鎖は制限酵素によって分
裂され得る。この場合、複製可能な核酸の製造方法にお
いてそれらの二本鎖領域における制限酵素に関する分裂
部位を有するプライマーを使用するのが好ましい。

【００３３】該プライマーは、Ｍ１３万能配列決定プラ
イマーおよび／またはＭ１３万能逆配列決定プライマー
とのハイブリダイゼーションのための配列も含むことが
できる。

【００３４】核酸ＣおよびＤは、該核酸ＣおよびＤを簡
単に検出するために放射性または非放射性標識を導入す
るための反応に加わることができる。

【００３５】公知の方法、例えばゲルクロマトグラフィ
ーを使用して、所望の数の核酸ＣおよびＤが形成された
かを測定することができる。

【００３６】本発明の方法は、種々の長所を有する。反
応シーケンス(reaction sequence)はある１つの温度で
行われることができ、例えばファージφ２９の複製シス
テムを使用する場合には変性のために高温は必要ではな
い。in vitro複製は１９ｋｂまでの長いＤＮＡフラグメ
ント(φ２９ＤＮＡ)および７ｋｂまでの異種ＤＮＡ(Ｍ
１３ゲノム)によって作用する。これに比べて、欧州特
許出願公開ＥＰ−Ａ−０２０１１８４号公報に従って増
幅され得る配列の最大サイズは３〜４ｋｂである。

【００３７】増幅速度が理論的に速いかまたは他の標的
増幅方法によるよりも核酸の増幅が速い。該方法は、例
えば細胞スミア中、固定細胞もしくは組織片中または単
離染色体上で、３０〜３７℃で行われ得るので、in sit
uハイブリダイセーション実験における増幅に適用可能
である。比較的短いプライマーは、オリゴヌクレオチド
とほぼ同様に簡単に組織中に拡散する。

【００３８】本発明の方法の長所は、複複製が複合体全
体の二次構造に依存しないという点である。したがっ
て、長い核酸を製造するのも可能である。さらに、ｄＮ
ＴＰｓおよびＮＴＰｓを使用しなくてもよく、ｄＮＴＰ
ｓの使用は充分である。

【００３９】鋳型特異的領域と複製システムに対して特
異的な領域との間のプライマーに制限酵素分裂部位を導
入することによって、形成される生成物は、例えば、直
接クローン化され得るか、あるいはプローブとしてアダ
プター配列から自由に分裂され得る。転写増幅法からの
生成物を使用して、これは不可能である。

【００４０】本発明の核酸増幅方法は、非常に時間節約
でありかつ非常に敏感である。理論的な増幅速度２⁶⁹²
を有するφ２９in vitro複製システムを使用する１００
個のヌクレオチドからなる核酸Ａの一部分について必要
な時間は、プライマーハイブリダイゼーション、伸長お
よび複製を含んで約１時間までであり、従来技術の方法
は、最も望ましい場合でこのために２〜４時間を必要と
するであろう。本発明の方法は、好ましくはまず工程ａ
〜ｆの成分、次いでin vitro複製のための成分の連続添
加によって、１つの容器反応として行われるのが好まし
い。

【００４１】増幅反応において形成される核酸Ｃおよび
Ｄは、同一の長さのものが好ましい。これは、相同性の
核酸群が、例えばハイブリダイゼーションにおいて、そ
れらの検出のためのより均一な条件を可能にするので好
都合である。

【００４２】核酸Ｂ、ＣおよびＤはＤＮＡである。この
長所は、それらから形成された核酸ＣおよびＤが別々の
反応工程を介在せずに同一反応において核酸ＤおよびＣ
の形成のための鋳型として再度使用され得るということ
である。新しく形成された核酸ＣおよびＤは既に複製シ
ステムに対して特異的な２つの配列を有するので、プラ
イマーのさらなる添加は余分である。

【００４３】本発明の増幅方法は、核酸Ａもしくはその
一部分またはそれらと相補的である核酸の多数のコピー
の製造のために使用され得る。これは、分子生物学的お
よび遺伝子学的研究において、臨床診断学および生物工
学において、ならびにレア遺伝子(rare genes)の構造お
よび機能の研究のために特に重要である。

【００４４】本発明は、上記核酸増幅方法を含む核酸Ａ
の検出方法を提供するものである。

【００４５】これについて、検出されるべき核酸を含む
と仮定される試料に上記核酸製造方法を課し、核酸Ａに
関して上記したと同一の方法で検出されるべき核酸を処
理する。

【００４６】次いで、修飾または非修飾ヌクレオシド三
リン酸を使用して、核酸Ｂ、ＣおよびＤを製造し得る。
修飾ヌクレオシド三リン酸を使用するのが好ましい。こ
のような修飾ヌクレオシド三リン酸は公知である。修飾
は、例えば、放射性基、蛍光性基、着色性基、免疫反応
性基、生物特異的に結合可能な基または化学反応性基に
よってヌクレオシド三リン酸の１つまたはいくつかの基
を置換することからなる。適切な免疫反応性基は、例え
ばジゴキシゲニンのようなハプテンまたはスルホン酸残
基である。生物特異的に結合可能な基は例えばビオチン
のようなビタミン類であり、化学反応性基は例えば、お
そらく架橋によってヌクレオシド三リン酸に結合される
さらなるアミノ基またはスルフヒドリル基である。核酸
Ａの存在または量を検出するために修飾ヌクレオシド三
リン酸を使用する場合、未反応ヌクレオシド三リン酸を
分離した後に取込まれた修飾によって、核酸Ｂ、Ｃおよ
びＤまたはＣおよびＤだけの量および存在が簡単に測定
される。invitro複製の間に標識化だけが生じるのが特
に好ましい。この場合、核酸ＣおよびＤは検出可能に標
識される。既に修飾されたヌクレオチドの一体化を含む
方法は、この場合に通常の次なる検出可能に標識された
核酸プローブとのハイブリダイゼーション工程または伸
長反応が必要ではないので、特に好都合である。

【００４７】修飾ヌクレオチドリン酸を取り込む核酸の
検出方法は、例えば、ハプテン標識化の場合は欧州特許
出願公開ＥＰ−Ａ−０３２４４６８号公報によって、ビ
オチン標識化の場合はドイツ特許出願公開ＤＥ−Ａ−２
９１５０８２号公報によって知られている。

【００４８】これについて、ハイブリダイズされた核酸
は、モレキュラーシーブ、または核酸の基、例えばｐ３
を認識および結合する親和性物質上で未反応成分と分離
されるのが好ましい。結果として、標識の量が測定され
る。

【００４９】しかし、特に非修飾ヌクレオシド三リン酸
を使用する場合、少なくともそれらの一部分と実質的に
相補的である修飾核酸とのハイブリダイゼーションによ
って形成された核酸ＣまたはＤを検出することも可能で
ある。これらの核酸は、検出可能であるかまたは検出可
能にされる。このような方法も公知である。このような
方法は、例えば米国特許ＵＳ−Ａ−４３５８５３５号明
細書および欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０１９２１６８
号公報に開示されている。

【００５０】複製反応において、検出可能に修飾され、
かくして、標識されたモノデオキシリボヌクレオシド三
リン酸を使用する場合、特に好ましい核酸Ａの検出方法
が生じ、複製後、形成された核酸を、通常、オリゴヌク
レオチドである核酸Ａに関する鋳型特異的核酸プローブ
とハイブリダイズし、その結果、該プローブは１つまた
はいくつかの固定可能な基を含有する。その後、検出可
能に標識されたコピーおよび固定可能なプローブのハイ
ブリッドを固定可能な基を特異的に結合することができ
る固相に接触させる。次いで、固相を液相から分離し、
所望により洗浄し、結合された検出可能な標識を測定す
る。さらに詳しくは、ドイツ特許出願公開ＤＥ−Ａ−４
０４１６０８号公報を引用する。この方法の長所は、過
剰の非ハイブリダイズプローブの完全かつ時間消費の分
離が絶対的に必要というわけではないことである。

【００５１】この方法は、コピーが、プローブとの反応
前に例えばアルカリによって非熱的に変性され、次い
で、該プローブが変性条件を排除する試薬(例えば、酸)
およびハイブリダイゼーションを助ける試薬(例えば、
ホルムアミド)を含有する溶液に一本鎖形態で添加され
る場合に特に好ましい。

【００５２】修飾ヌクレオシド三リン酸を取込むのが可
能であるので、本発明の核酸増幅方法は、修飾核酸、特
に修飾ＤＮＡの製造方法として非常に適している。この
ような修飾核酸は、ＤＮＡ診断学において、いわゆるプ
ローブとして使用される。修飾が検出可能な基または検
出可能な基に転換され得る基である場合、例えば米国特
許ＵＳ−Ａ−４３５８３５号明細書における検出プロー
ブとして使用され得る核酸が得られる。修飾が結合可能
な基、例えば免疫反応性基またはビオチンである場合、
欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−００９７３７３号公報に開
示されているような核酸が得られる。それらは、例えば
欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０１３９４８９号公報に開
示される方法における捕捉(capture)プローブとして使
用され得る。

【００５３】本発明の核酸検出方法は、核酸またはその
一部分の増幅方法の長所に増幅の間の標識の長所を兼ね
合わせている。この方法を使用して、ＤＮＡおよびＲＮ
Ａを検出するのが可能である。ＲＮＡの場合、この場合
に特に高い感度および短い反応時間が期待されるので、
ｒＲＮＡの検出が好ましい。これによって、例えば種を
分析することができるであろう。この種の分析は、毒素
原または病原性因子のような細菌に対して特異的な遺伝
子を使用しても可能である。

【００５４】本発明の方法は、突然変異誘発アダプタ
ー、またはハイブリダイジング一本鎖領域において少な
くとも１つのミス対合を有するプライマーを介する突然
変異誘発のため、あるいはハイブリダイジング一本鎖領
域において少なくとも１つのミス対合を有するプライマ
ーを介する突然変異体の検出のためにも使用され得る。

【００５５】本発明の核酸の製造方法の好ましい具体例
は、核酸ＡおよびＢの複合体から核酸ＣまたはＤを形成
するためのファージφ２９の複製システムのin vitro利
用によって可能となる。この複製システムは、例えばビ
オシミカ・エト・ビオフィジカ・アクタ(Ｂiochim.Ｂio
phys.Ａct)９５１(１９８８)４１７−４２４に開示され
ている。

【００５６】本発明の方法の具体例において、核酸を含
有する試料はアルカリで変性される。その後、酸性溶液
中、プライマー１および所望によりプライマー２の添加
によって中和し、次いで、ポリメラーゼをモノヌクレオ
チドと一緒に添加する。インキュベーションの後、再
度、アルカリで変性し、酸性溶液で中和し、ポリメラー
ゼ／ヌクレオチド混合物を添加し、インキュベートす
る。このインキュベートの後、複製システムの添加によ
って増幅反応を開始し得る。プライマーの伸長反応前な
らびに翻訳開始反応の第１および第２伸長反応の前に２
〜１５分間予備ハイブリダイゼーションを行うことが可
能である。この変形の長所は、全て等温反応であるとい
うことである。しかし、行われるべきピペッティング工
程の数が増加する。

【００５７】本発明の増幅方法の反応工程は、非熱変性
によって２５〜４５℃の温度で、あるいは熱変性によっ
て２５〜９８℃の温度で行われる。該温度は、ポリメラ
ーゼの最適温度に対して特に適応させられるべきである
(例えば、クレノウについては３７℃またはＴａｑポリ
メラーゼについては７０℃)。

【００５８】以下の条件は、工程ａ〜ｆを行うのに好都
合であることが判明した。 容量：２０〜５０マイクロリットル；緩衝物質：好まし
くはＴris−ＨＣl、pＨ７.２〜８.６(２０℃で)、使用
するポリメラーゼに依存する；塩：好ましくはＭgＣ
l₂、１.５mＭ〜１５mＭ(使用するポリメラーゼに依存す
る)；ＫＣl：Ｔａｑ−ＤＮＡＰを使用する場合、０〜１
００mＭ、好ましくは２０〜１００mＭ；助剤：使用され
るポリメラーゼによって、例えばＢＳＡ、ジチオトレイ
トールまたはジチオエリスリトールが添加され、通常、
これは当業者に公知である。(クレノウの場合：ジチオ
エリスリトール、５０μＭ〜２００μＭ、ＢＳＡ、０.
１〜０.４mg／容量)；

【００５９】ヌクレオシド三リン酸：全量をそのまま使
用するか、あるいは、まず翻訳開始分子の製造に必要な
量を添加し、次いで、複製反応を開始する前に、残りを
添加する。これは、増幅生成物を標識化しようとする場
合に特に好都合である。 濃度：２５〜５００μＭ； ポリメラーゼ：１〜１０Ｕ(ポリメラーゼに依存する)； インキュベーション：出発反応の一工程当たり１〜３０
分(鋳型核酸および使用したポリメラーゼに依存する)。

【００６０】複製：容量２０〜２００マイクロリット
ル；ｐ３：２０〜４００ng；ｐ２：２〜３００ng；緩衝
液：Ｔris(pＨ７.５)、２０〜１００mＭ；塩：ＭgＣ
l₂：２〜１５mＭ、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄：０〜５０mＭ、助
剤：スペルミジン１〜５mＭ。インキュベーション時間
１５分(非常に短い領域について)〜９０分(長い領域に
ついて)。ヌクレオチド：前記のとおりであるが、他
に、例えば、³²Ｐ−ｄＮＴＰｓ、ビオチン−ｄＮＴＰｓ
またはジゴキシン−またはジゴキシゲニン−ｄＮＴＰ
ｓ。

【００６１】５０〜５００mＭ ＮaＣlまたはＫＣlの添
加は反応を促進し得る。所定の値はガイダンスのために
与えられる。もちろん、当業者はそれらを変えることが
できる。

【００６２】本発明の方法は、理論的には、検出工程ま
で成分を分離せずに一溶液中で完全に行われ得る。過剰
の標識化剤の分離だけが必要である。

【００６３】「図１」は、本発明の複製可能な核酸の製
造方法の反応工程の線図を示し、核酸の増幅のためのさ
らなる工程も示す。

【００６４】

【実施例】以下の実施例において、本発明をさらに詳細
に説明する。

【００６５】実施例１ Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）特異的配列を増幅する。こ
のために核酸Ａとして組換えＨＢＶ−ＤＮＡを使用する
(例えば、欧州特許公告ＥＰ−Ｂ−００１３８２８号公
報参照)。１２７８〜１２９７および１４０３〜１４２
２の間のＨＢＶ特異的標的配列を有するプライマーを使
用して、ヌクレオチド位置１２７８〜１５７１の間の領
域を増幅する。３'−５'方向で、プライマー１は、この
５９ｎｔの右側φ２９ｏｒｉ配列(３'−５'方向)に隣接
する１４０３〜１４２２からのＨＢＶ特異的配列からな
る。３'−５'方向で、プライマー２は、４６ｎｔの左側
φ２９ｏｒｉ配列(３'−５'方向)が後に続くＨＢＶから
のヌクレオチド位置１２９７〜１２７８を有する。

【００６６】９５℃で２分間、ＨＢＶ核酸(０.５μg〜
０.５fg)を変性させる。２０マイクロリットルの反応容
量中で所定の最終濃度が達成されるように、氷上で、５
０mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ７.２)；１０mＭ ＭgＣl₂、０.
１mＭジチオエリスリトール；０.２mg／ミリリットルの
ウシ血清アルブミン；２５０nＭプライマー１；２５μ
Ｍ ｄＡＴＰ、２５μＭ ｄＣＴＰ、２５μＭ ｄＧＴ
Ｐ、２５μＭ ｄＴＴＰおよび２Ｕ Ｋlenow−ＤＮＡポ
リメラーゼを添加する。３７℃で１５分間、該混合物を
インキュベートする。その後、変性のために、再度、９
５℃で２分間加熱する。５０mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ７.
２)；１０mＭ ＭgＣl₂；０.１mＭジチオエリスリトー
ル；０.２mg／ミリリットルのウシ血清アルブミン；２
５μＭ ｄＡＴＰ；２５μＭ ｄＣＴＰ；２５μＭ ｄＧ
ＴＰ；２５μＭ ｄＴＴＰ ５マイクロリットル中、２Ｕ
Ｋlenowおよび同量のプライマー２を添加し、再度、３
７℃で１５分間、インキュベートする。

【００６７】複製を開始するため［例えば、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂiol.Ｃhe
m.)、１９８９、２６４／１５、８９３５−８９４
０］、５０mＭ Ｔris-ＨＣｌ；１０mＭ ＭgＣl₂；２mＭ
ジチオトレイトール；２mＭスペルミジン；４０mＭ (Ｎ
Ｈ₄)₂ＳＯ₄；２７５μＭ ｄＡＴＰ；２７５μＭ ｄＣＴ
Ｐ；２７５μＭ ｄＧＴＰ；２７５μＭ ｄＴＴＰ ２５
マイクロリットル中、φ２９のターミナル蛋白ｐ３ １
５０ngおよびφ２９ＤＮＡポリメラーゼ(ｐ２)８０ngを
添加し(最終容量５０マイクロリットル)、３７℃で３０
分間、インキュベートする。該反応を１０mＭ ＥＤＴＡ
および０.１％ＳＤＳで停止させる。該反応生成物を、
０.８％アガロースゲル中で分離させ、ＵＶ光中、臭化
エチジウムインターカレーションによって可視化する。

【００６８】実施例２ 実施例１において使用した組換えＨＢＶプラスミドの同
一領域を増幅する。９５℃で２分間、ＨＢＶプラスミド
(０.５μg〜０.５fg)を変性させる。氷上で、５０mＭ
Ｔris−ＨＣl(pＨ８.３)；１.５mＭ ＭgＣl₂、５０mＭ
ＫＣl；１００μg／ミリリットルのゼラチン；２５０n
Ｍプライマー１；２５０nＭプライマー２；１５０μＭ
ｄＡＴＰ；１５０μＭ ｄＣＴＰ；１５０μＭ ｄＧＴ
Ｐ；１５０μＭ ｄＴＴＰおよび２.５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ
ポリメラーゼを添加して、最終容量２５マイクロリット
ル中で所定最終濃度が得られる。７０℃で１０分間イン
キュベートし、再度、９５℃で２分間、変性させ、次い
で、７０℃で該インキュベーション工程を再度行う。そ
の後、該混合物を３０℃に冷却する。複製を開始するた
めに、５０mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ７.０)；１８.５mＭ
ＭgＣl₂；２mＭスペルミジン；２０mＭ (ＮＨ₄)₂ＳＯ₄
２５マイクロリットル中、φ２９からのターミナル蛋白
(ｐ３)１５０ngおよびφ２９ ＤＮＡポリメラーゼ(ｐ
２)８０ngを添加し、３０℃で３０分間インキュベート
する。１０mＭ ＥＤＴＡおよび０.１％ＳＤＳで反応を
停止させる。実施例１におけると同一の方法で増幅生成
物を検出する。

【００６９】略語の語彙 Ａ 試料中の複製されるべき核酸 Ｐ１ プライマー１ Ｐ２ プライマー２ Ｂ 核酸Ａと少なくとも部分的に相補的である
核酸 Ｃ 核酸Ｂと少なくとも部分的に相補的である
核酸 Ｄ 核酸Ｃと相補的な核酸 ｏｒｉ 複製起源、複製開始部位 ＤＮＡ Ｐ ＤＮＡポリメラーゼ ｄＮＴＰ モノデオキシリボヌクレオシド三リン酸 ｐ２、ｐ３ ファージφ２９の複製システムの蛋白。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の複製可能な核酸の製造方法の反応工
程および核酸の増幅のためのさらなるの工程を示す線
図。

【符号の説明】

Ａ 試料中の複製されるべき核酸 Ｂ 核酸Ａと少なくとも部分的に相補的である
核酸 Ｃ 核酸Ｂと少なくとも部分的に相補的である
核酸 Ｄ 核酸Ｃと相補的な核酸 ｏｒｉ 複製起源、複製開始部位 ＤＮＡ Ｐ ＤＮＡポリメラーゼ ｄＮＴＰ モノデオキシリボヌクレオシド三リン酸 ｐ２、ｐ３ ファージφ２９の複製システムの蛋白

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クリストフ・ケスラー ドイツ連邦共和国デー−8021ドルフエン、 シユロスベルクヴエーク11番

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）一本鎖核酸Ａを準備し、 ｂ）核酸Ａの一部分と相補的な部分および複製開始部位
   を含むプライマーＰ１と核酸Ａとをハイブリダイズさ
   せ、 ｃ）モノヌクレオシド三リン酸を使用してポリメラーゼ
   によりプライマーＰ１を伸長して核酸Ｂを形成させ、 ｄ）核酸ＡおよびＢの核酸ハイブリッドから核酸Ａを除
   去し、 ｅ）核酸Ｂの一部分と相補的な領域および複製開始部位
   を含有するプライマーＰ２と核酸Ｂとをハイブリダイズ
   させ、 ｆ）モノヌクレオシド三リン酸を使用してポリメラーゼ
   によりプライマーＰ２を伸長して核酸Ｃを形成させるこ
   とを特徴とするin vitroで複製可能である核酸の製造方
   法。
2. 【請求項２】 プライマー１の伸長前に、核酸Ａを含有
   する試料にプライマー２を添加する請求項１記載の製造
   方法。
3. 【請求項３】 ａ）一本鎖核酸Ａを準備し、 ｂ）核酸Ａの一部分と相補的な部分および複製開始部位
   を含むプライマーＰ１と核酸Ａとをハイブリダイズさ
   せ、 ｃ）モノヌクレオシド三リン酸を使用してポリメラーゼ
   によりプライマーＰ１を伸長して核酸Ｂを形成させ、 ｄ）核酸ＡおよびＢの核酸ハイブリッドから核酸Ａを除
   去し、 ｅ）核酸Ｂの一部分と相補的な領域および複製開始部位
   を含有するプライマーＰ２と核酸Ｂとをハイブリダイズ
   させ、 ｆ）モノヌクレオシド三リン酸を使用してポリメラーゼ
   によりプライマーＰ２を伸長して核酸Ｃを形成させ、 ｇ）in vitroで複製させることを特徴とする核酸Ａまた
   はその一部分の増幅方法。
4. 【請求項４】 ａ）請求項１記載の方法に従って複製可
   能な核酸を製造し、 ｂ）in vitroで複製させ、 ｃ）複製によって形成された核酸を検出することを特徴
   とする核酸Ａの検出方法。
5. 【請求項５】 ２つの分離容器中に各々、核酸Ａに対し
   て鋳型特異性であるヌクレオチド配列を含有し、かつ各
   々、さらに複製開始部位を含む２つのプライマーＰ１お
   よびＰ２、 モノデオキシリボヌクレオシド三リン酸を使用して核酸
   とハイブリダイズされるプライマーを伸長するのが可能
   なポリメラーゼ、 モノデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含有すること
   を特徴とする鋳型核酸Ａからin vitroで複製可能である
   核酸の製造用試薬キット。
6. 【請求項６】 分離容器中に各々、核酸Ａに対して鋳型
   特異性であるヌクレオチド配列を含有し、かつ各々、さ
   らに複製開始部位を含む２つのプライマーＰ１およびＰ
   ２、 モノデオキシリボヌクレオシド三リン酸を使用して核酸
   とハイブリダイズされるプライマーを伸長するのが可能
   なポリメラーゼ、 in vitro複製システム、 モノデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含有すること
   を特徴とする核酸Ａまたはその一部分の増幅用試薬キッ
   ト。
7. 【請求項７】 分離容器中に各々、核酸Ａに対して鋳型
   特異性であるヌクレオチド配列を含有し、かつ各々、さ
   らに複製開始部位を含む２つのプライマーＰ１およびＰ
   ２、 モノデオキシリボヌクレオシド三リン酸を使用して核酸
   とハイブリダイズされるプライマーを伸長するのが可能
   なポリメラーゼ、 in vitro複製システム、 モノデオキシリボヌクレオシド三リン酸、 核酸Ａに対して特異的である固定可能に標識された核酸
   プローブを含有することを特徴とする核酸Ａの検出用試
   薬キット。
8. 【請求項８】 モノデオキシリボヌクレオシド三リン酸
   の少なくとも１つが検出可能に標識される請求項５〜７
   のいずれか１項記載の試薬キット。