JP3097893B2 - 標的ｒｎａ分子の増幅方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、分子生物学の分野に関
し、特使リボ核酸（ＲＮＡ）配列の複写および増幅のた
めに有用な方法および試薬を提供するものである。別な
面において、本発明は、先行する逆転写反応にて生じた
核酸により夾雑する逆転写反応物、均質逆転写／増幅反
応物または増幅反応物の滅菌方法を提供する。更に別の
面では、本発明は試料中の標的ＲＮＡの逆転写方法を提
供する。

【０００２】関連技術の記述および本発明のおいて使用
される用語に説明については、項温度逆転写方法を提供
する関連出願、すなわち国際特許出願公開ＷＯ９１／０
９９４４が参考となる。

【０００３】本発明に関連して、Ｔａｑポリメラーゼ
は、２価金属イオンとしてＭｇ^２＋を使用してｃＤＮＡ
を非効率的に合成することが報告されている（Ｊｏｎｅ
ｓおよびＦｏｕｌｋｅｓ、１９８９，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．１７６：８３８７−８３８８）。Ｔｓｅお
よびＦｏｒｇｅｔ、１９９０，Ｇｅｎｅ ８８：２９３
−２９６；およびＳｈａｆｆｅｒ等、１９９０、Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９０：２９２−２９６は、Ｔａ
ｑポリメラーゼおよびＭｇ^２＋イオンを使用するＲＮＡ
の増幅方法を記述している。しかしながら、この方法
は、非効率的でかつ低感度である。例えば、Ｔｓｅおよ
びＦｏｒｇｅｔは、豊富に発現されたｍＲＮＡ標的を使
用して、エチジウムブロマイド−染色ゲル可視化のため
に充分なＰＣＲ生成物を生じさせるために全ＲＮＡを４
μｇ必要とすることを示した。加うるに、ＤＮＡテンプ
レート（先行する反応由来、またはプラスミドＤＮＡ夾
雑物由来のＰＣＲ生成物）からの擬陽性シグナルは、厳
密には除去されなかった。

【０００４】本発明は、この要求に向けられるもので、
熱活性ＤＮＡポリメラーゼによる高温度ｃＤＮＡ合成の
ための改良された方法および試薬、特には改良された緩
衝溶液系を提供するものである。本発明の試薬は、熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼを使用する１酵素、１チューブ
の結合逆転写／増幅アッセイのために特に好適である。

【０００５】一側面において、本発明は試料中の標的Ｒ
ＮＡ分子の増幅方法であって： （ａ）前記試料を、４種すべてのデオキシリボヌクレオ
シド三リン酸の存在下、２価陽イオンを含む適切な緩衝
溶液中の、第１および第２のプライマーならびに熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼを含む反応混合物中において、前
記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが前記第１のプライマー
の伸長生成物の合成を開始して前記標的ＲＮＡに相補的
なｃＤＮＡ分子を与えるために充分な温度にて処理し、
ここにおいて前記第１のプライマーは、前記標的ＲＮＡ
に対して、それにハイブリダイズして前記標的ＲＮＡに
相補的なｃＤＮＡ分子の合成を開始するに充分に相補的
であり、前記第２のプライマーは、前記ｃＤＮＡにハイ
ブリダイズし伸長生成物の合成を開始するに充分に前記
標的ＲＮＡに対し相同的であり； （ｂ）前記反応混合物を、単鎖ｃＤＮＡを与えるために
適切な温度にて処理し； （ｃ）前記反応混合物を、前記熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼが前記第２のプライマーの伸長生成物の合成を開始
して二重鎖ｃＤＮＡ分子を与えるために適切な温度にて
処理し；および （ｄ）工程（ｃ）の二重鎖ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖
反応により増幅する、工程を含む増幅方法を提供する。
前記工程（ａ）および（ｄ）の前記適切な緩衝溶液は、
前記２価陽イオンを結合する緩衝剤を更に含有し、前記
２価陽イオンは好ましくはＭｎ^２＋であり、前記緩衝剤
の２０℃かつ０．１Ｍのイオン強度における２価陽イオ
ン結合反応のＫ_Ｍは、１０および１０^６の間、好ましく
は１０^２および１０^４の間、より好ましくは１０^２．５
および１０^３．５の間である。前記緩衝剤は、好ましく
は水素イオン緩衝作用を与える両性イオン性化合物であ
り、前記緩衝溶液の２０℃かつ０．１Ｍのイオン強度に
おけるｐＫａは、７および９の間、好ましくは７．５お
よび８．５の間である。好ましい実施態様において、前
記緩衝溶液は、更にＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチ
ル）グリシンまたはＮ［トリス（ヒドロキシメチル）メ
チル］グリシンを含んでなり、更に好ましくは、前記緩
衝溶液は、更に酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸ア
ンモニウムおよび酢酸リチウムからなる群から選択され
る酢酸塩を含んでなる。最も好ましい実施態様におい
て、緩衝溶液は酢酸マンガン（Ｍｎ（ＯＡｃ）_２または
Ｍｎ（ＣＨ_３ＣＯ_２）_２とも記される）、ビシン−ＫＯ
Ｈ（ビシンはＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グ
リシンである）および酢酸カリウム（ＫＯＡｃまたはＫ
ＣＨ_３ＣＯ_２とも記される）を含んでなる。前記熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくはＴｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼまたはＴｈｅｒ
ｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラー
ゼ、最も好ましくは組換えＴｔｈＤＮＡポリメラーゼで
ある。好ましい実施態様において、工程（ａ）の温度
は、４０℃および８０℃の間である。

【０００６】本発明は、先行する逆転写、増幅、および
／または均質逆転写／増幅反応から生じる核酸により夾
雑する逆転写反応物、増幅反応物、および均質逆転写／
増幅反応物の滅菌方法をも提供するものである。例え
ば、本発明は、慣用および非慣用のヌクレオシド三リン
酸を逆転写反応混合物に混合し、該慣用および非慣用の
ヌクレオチドが取り込まれたｃＤＮＡを生成させた結果
として、先行する逆転写反応により生成する核酸で夾雑
する逆転写反応物の滅菌方法であって、前記非慣用ヌク
レオチドの共有結合を加水分解することにより夾雑核酸
を分解することを含んでなる方法を提供する。

【０００７】別の面において、本発明は、慣用および非
慣用のヌクレオシド三リン酸を均質逆転写／増幅反応混
合物に混合し、該慣用および非慣用のヌクレオチドが取
り込まれたｃＤＮＡを生成させた結果として、先行する
均質逆転写／増幅反応により生成する核酸で夾雑する逆
転写反応物の滅菌方法であって、前記非慣用ヌクレオチ
ドの共有結合を加水分解することにより夾雑増幅生成物
を分解することを含んでなる方法を提供する。

【０００８】一実施態様においてこの方法は、標的核酸
配列を含む水溶液中で、夾雑核酸生成物をウラシル−Ｄ
ＮＡグリコシラーゼにより分解することを含んでなり；
更に、該グリコシラーゼを標的核酸配列の存在下で不活
性化し（例えば加熱による）；ならびに標的配列を熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼにより逆転写および増幅するこ
とを含んでなる。該夾雑生成物の分解は、該生成物が、
核酸逆転写／増幅反応系に接触する間に行われうる。従
って、逆転写／増幅用試料を調製し、該試料を本発明方
法により処理して先行する逆転写、増幅、および／また
は均質逆転写／増幅反応により生じた夾雑核酸を分解
し、次いで工程間で反応体積または組成を調節する必要
なしに試料中の標的核酸を増幅することができる。

【０００９】別の側面において、本発明は、マンガンイ
オン濃度を緩衝する金属緩衝溶液、および好ましい実施
態様においてｐＨおよびマンガンイオン濃度の両者を緩
衝する金属緩衝溶液を含んでなる試薬を提供する。該緩
衝溶液は、本発明の方法における使用可能なマンガンお
よびｄＮＴＰ濃度範囲を有意に拡大し、これをもってア
ッセイの強健性を増大し、かつ試料調製において導入さ
れるマンガンキレート剤による問題を低減する。該緩衝
溶液は、本発明の滅菌方法におけるより高いｄＵＴＰ濃
度の使用を可能とし、このことはある種の標的における
ｄＵＴＰ取り込みを増強し、また該２価金属イオン濃度
を低減し、反応混合物のイオン強度を低下させることに
よって滅菌の効率を増大させる。該緩衝溶液は、Ｍｎ
^２＋触媒ＲＮＡ加水分解をも低減し、このことは希少な
および／またはより長い標的の逆転写のためにより長い
逆転写時間を可能とする。更に、本発明の緩衝溶液およ
び試薬（例えばｄＮＴＰ）は、緩和された濃度許容性の
ために調製することが容易であり、また改良された保存
および安定性の特性を与える。而して本発明は、均質逆
転写／増幅反応遂行のための緩衝溶液であって、２価陽
イオン、１価陽イオンおよび緩衝剤を含有し、該２価陽
イオンが好ましくはＭｎ^２＋であり、該緩衝剤が前記２
価陽イオンと結合するキレート化剤であり、前記緩衝溶
液の２０℃、かつ０．１Ｍのイオン強度における前記２
価陽イオン結合反応のＫ_Ｍが、１０および１０^６の間、
好ましくは１０^２および１０^４の間、より好ましくは１
０^２．５および１０^３．５の間であることを特徴とする
緩衝溶液を提供する。好ましい緩衝溶液において、前記
緩衝剤は水素イオン緩衝作用を与える両性化合物であ
り、ここにおいて前記緩衝溶液の２０℃かつ０．１Ｍの
イオン強度におけるｐＫａは、７および９の間、好まし
くは７．５および８．５の間である。本発明の好ましい
実施態様において、該緩衝溶液は、酢酸マンガン、ビシ
ン−ＫＯＨおよび酢酸カリウムを含む。本発明は、試料
中の標的ＲＮＡ分子の逆転写方法であって：前記試料
を、前記標的ＲＮＡに対してそれにハイブリダイズして
前記標的ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ分子の合成を開始す
るに充分に相補的なプライマー、熱活性ＤＮＡポリメラ
ーゼ、４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸、およ
びＭｎ^２＋を含む適切な緩衝溶液を含んでなる反応混合
物中で、前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが前記プライ
マーの伸長生成物の合成を開始して前記標的ＲＮＡに相
補的なｃＤＮＡ分子を与えるために充分な温度にて処理
する工程を工程を含み；前記緩衝溶液が前記Ｍｎ^２＋を
結合する緩衝剤を更に含有し、前記緩衝剤の２０℃かつ
０．１Ｍのイオン強度における２価陽イオン結合反応の
Ｋ_Ｍが、１０および１０^６の間、好ましくは１０^２およ
び１０^４の間、より好ましくは１０^２．５および１０
^３．５の間であることを特徴とする試料中の標的ＲＮＡ
分子の逆転写方法を提供するものである。

【００１０】本発明の背景の詳細な記述については、こ
こに参考として取り入れるＷＯ９１／０９９４４を引用
する。

【００１１】以下の図面は、本発明を理解するために役
立つであろう。図１は、例７に記述される伸長反応の結
果を表すものであって、異なる緩衝溶液条件を使用する
マンガン濃度の範囲に亘って反応効率をアッセイしたも
のである。

【００１２】図２は、例９に記述されるＲＴ／ＰＣＲの
結果を示すものであって、ｄＮＴＰ濃度の使用可能な範
囲について、異なる緩衝溶液条件を使用してアッセイし
たものである。

【００１３】本発明は、ＲＮＡの効率的な逆転写および
増幅のための改良された方法に関する。従って、例えば
該方法は、逆転写および増幅工程の間で、反応成分を修
飾するために反応容器を開く必要が除かれる結合１チュ
ーブ処理法に対して提供される。このようにして、先行
する反応に由来する逆転写または増幅生成物によるＲＮ
Ａ逆転写／増幅アッセイの持ち越し夾雑物の影響が最小
になる。

【００１４】本発明の方法は、ＲＮＡテンプレートを該
ＲＮＡテンプレートにハイブリダイズするために充分に
相補的なプライマーおよび熱活性ＤＮＡポリメラーゼと
共に含む試料を、４種すべてのデオキシリボヌクレオシ
ド三リン酸の存在下、マンガンイオン濃度、および好ま
しい実施態様においてはｐＨとマンガンイオン濃度との
両者を緩衝する金属緩衝剤を含む適切な緩衝溶液中で処
理することを含んでなり、該反応は、前記プライマーが
前記ＲＮＡテンプレートにハイブリダイズし、かつ、前
記熱活性ＤＮＡポリメラーゼが前記デオキシリボヌクレ
オシド三リン酸のポリマー化反応に触媒作用して、前記
ＤＮＡテンプレートの配列に相補的なｃＤＮＡ配列を形
成するために充分な温度にて遂行される。本発明によれ
ば、ＤＮＡポリメラーゼは、熱活性であると共に熱安定
性であり得る。

【００１５】別の面において、ＲＮＡテンプレートにア
ニール化するに好適なプライマーは、ＰＣＲによる増幅
のためにも適しているであろう。ＰＣＲのためには、逆
転写されたｃＤＮＡに相補的な第２のプライマーが伸長
生成物のための部位を与える。

【００１６】熱活性ＤＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ分
子の増幅において、第１の伸長反応はＲＮＡテンプレー
トを使用する逆転写反応であり、ＤＮＡ鎖が生成され
る。該ＤＮＡテンプレートを使用する第２の伸長反応
は、二重鎖ＤＮＡ分子を生成する。従って、ＲＮＡテン
プレートからの熱活性ＤＮＡポリメラーゼによる相補的
ＤＮＡ鎖の合成は、増幅のための出発物質を与える。

【００１７】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、結合され
た１酵素逆転写／増幅反応において、使用されうる。該
方法は、非均質および均質ＲＴ／ＰＣＲアッセイの両者
に対して提供される。ここにおいて使用される「均質」
なる用語は、ＲＮＡ標的の逆転写および増幅のための２
工程１添加反応を指す。均質とは、逆転写工程に続いて
反応容器を開放する必要、または増幅工程の前に反応成
分を調節する必要がないことを意味する。非均質ＲＴ／
ＰＣＲ反応においては、逆転写に続いて増幅反応の前
に、酵素、プライマー、２価陽イオン、塩類、ｐＨまた
はｄＮＴＰを含むいずれかの反応成分が調節され、添加
され、あるいは希釈される。

【００１８】「均質逆転写／増幅反応混合物」なる用語
は、標的ＲＮＡを逆転写および増幅するために使用され
る種々の試薬を含む水溶液を指す。これらは、酵素、水
性緩衝剤、塩類、オリゴヌクレオチドプライマー類、標
的核酸およびヌクレオシド三リン酸を含む。状況に依存
して、該混合物は完全または不完全な均質逆転写／増幅
反応混合物のいずれかであり得る。

【００１９】本発明は、試料中のＲＮＡ標的分子検出の
ための単純化され、改良された方法にも関連する。これ
らの方法は、逆転写、第２のｃＤＮＡ鎖合成、および所
望により増幅について触媒作用する熱安定性ＤＮＡポリ
メラーゼを採用する。先行技術の方法は、各工程につい
て異なる酵素を使用するために必要となる２組のインキ
ュベーション条件を必要とした。本発明の方法は、従来
のＲＮＡクローニングおよび診断方法よりも少ない工程
による、有意に増強された特異性を持ったＲＮＡ転写お
よび増幅法を提供する。これらの方法は、研究室あるい
は臨床分析のためのキットにおける使用に適用可能であ
る。

【００２０】「逆転写反応混合物」なる用語は、標的Ｒ
ＮＡの逆転写のために使用される種々の試薬を含む水溶
液を指す。これらは、酵素、水性緩衝剤、塩類、オリゴ
ヌクレオチドプライマー、標的核酸、およびヌクレオシ
ド三リン酸を含む。状況に依存して、該混合物は完全ま
たは不完全逆転写反応混合物のいずれであってもよい。

【００２１】ｃＤＮＡ生成物の増幅のためには、多くの
方法が当業者に利用可能である。ここにおいて使用され
るように、「増幅反応系」なる用語は核酸の標的配列の
複写物を増幅するためのいずれかのインビトロ手段を指
す。そのような方法は、限定されるものではないが、ポ
リメラーゼ（ＰＣＲ）、ＤＮＡリガーゼ（ＬＣＲ）、Ｑ
βＲＮＡレプリカーゼおよびＲＮＡ転写（ＴＡＳおよび
３ＳＲ）に基づく増幅系を含む。しかしながら、ここで
記述される均質ＲＴ／ＰＣＲ法は、３ＳＲ等の多工程、
多酵素増幅法に対して、１種のポリメラーゼ酵素のみを
使用するという重要な優位点を有している。

【００２２】実際に、いくつかの異なった核酸に基づく
増幅系は、２価金属イオン（例えばＭｎ^２＋）最適条件
のかなりの拡大、ならびにＲＮＡテンプレート−支配合
成およびＤＮＡテンプレート−支配合成についての明ら
かに異なる二重の最適条件の驚くべき拡大によって利益
を得る。これらすべての系は、１サイクルまたは反応の
１部により合成される生成物が、引き続くサイクルまた
は反応の引き続く部分のテンプレートとして働くことに
おいて、ＰＣＲ工程に基づく。リガーゼ連鎖反応（ここ
に参考として取り入れるＬＣＲ，ＷｕおよびＷａｌｌｅ
ｎｃｅ，１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０−６
６９およびＢａｒａｎｙ，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９−１９
３）においては、ＤＮＡの所望の分節をＤＮＡリガーゼ
を用いてＭｇ２＋および必要な共因子の存在下で増幅す
るために、４種のオリゴヌクレオチドが使用される。厳
密なアニール化温度および熱活性かつ熱耐性ＤＮＡリガ
ーゼの使用は、この工程の感度および対立遺伝子変位の
差異の識別能力を有意に改良する。天然の好熱性ＤＮＡ
リガーゼ（例えば、ここに参考として取り入れるＴａｋ
ａｈａｓｈｉ，ＹａｍａｇｕｃｈｉおよびＵｃｈｉｄ
ａ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１０
０４１−１００４７）あるいは、組換え親熱性ＤＮＡリ
ガーゼ（例えばここに参考として取り入れるＢａｒａｎ
ｙおよびＧｅｌｆａｎｄ，１９９１，Ｇｅｎｅ １０
９：１−１１）のいずれを使用するにしても、本発明の
緩衝溶液および緩衝剤は、金属イオン最適条件を拡大
し、ＲＮＡテンプレート−支配リゲーションおよびＤＮ
Ａテンプレート−支配リゲーションの両者を促進し、２
価金属イオンの存在下、上昇温度下でのＲＮＡテンプレ
ートの安定性を向上するために有用である。

【００２３】同様に２種以上の酵素を使用するＰＣＲお
よびＬＣＲから誘導される核酸増幅工程（ここに参考と
して取り入れる、ポリメラーゼ・リガーゼ連鎖反応、Ｂ
ａｒａｎｙ，１９９１，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎ
ｄ Ａｐｐｌｉｃ．１：５−１６；またはＧａｐ−ＬＣ
Ｒ，ＰＣＴ特許公開ＷＯ９０／０１０６９；またはリペ
アー連鎖反応、ヨーロッパ特許公開ＥＰ−Ａ−４３９，
１８２）は、ＲＮＡテンプレート−支配合成およびＤＮ
Ａテンプレート−支配合成の両者に対しての２価陽イオ
ン最適条件の拡大、ならびに２価陽イオンの存在下での
上昇温度におけるＲＮＡテンプレートの安定性の増加の
ために本発明の緩衝溶液および緩衝剤から利益を得るで
あろう。このことは、工程内で使用され、異なる核酸と
相互作用する酵素が、通常異なる２価金属イオン最適条
件を有する場合に特に有利である。

【００２４】同様に複数の酵素を使用する等温核酸増幅
工程（ここに参考として取り入れる３ＳＲ、Ｋｗｏｈ
ら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：１１７３−１１７７、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９
９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８７：１８７４−１８７８、ＰＣＴ特許公開ＷＯ９２
／０８８０Ａ；ＮＡＳＢＡ、米国特許５，１３０，２３
８）は、ＲＮＡテンプレート−支配合成およびＤＮＡテ
ンプレート−支配合成の両者に対しての２価陽イオン最
適条件の拡大から利益を得るであろう。このことは、工
程内で使用され、異なる核酸と相互作用する酵素が、通
常異なる２価金属イオン最適条件を有する場合に特に有
利である。上述の等温増幅系は、いずれも中温性または
非熱活性および熱感受性核酸結合酵素を使用する。類似
する熱活性かつ熱耐性酵素に基づく等温増幅系（例え
ば、［１］Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
ＤＮＡポリメラーゼによるＡＭＶまたはＭｏＭｕＬＶ逆
転写酵素の置換、［２］Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ ＲＮａｓｅ［ＩｔａｙａおよびＫｏｎｄ
ｏ，１９９１，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４
４４３−４４４９］によるＥ．Ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ
の置換、ならびに［３］Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓファージφＹＳ４０［Ｓａｓａｋｉおよび
Ｏｓｈｉｍａ，１９７５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１５：１４
４９−１４５３］ＲＮＡポリメラーゼによるバクテリオ
ファージＴ３、Ｔ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ
の置換）は、上述の理由に加えて、２価陽イオンの存在
下での上昇温度におけるＲＮＡテンプレートの安定性の
増加および本発明の緩衝溶液および緩衝剤から利益を得
るであろう。

【００２５】本発明は、特定の増幅系に限定されるもの
ではない。他の系が開発されれば、それらは本発明を実
施することにより利益を得るであろう。増幅系に関する
最近の調査は、ここに参考として取り入れるＡｂｒａｍ
ｓｏｎおよびＭｙｅｒｓ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
４：４１−４７にて刊行されている。

【００２６】「増幅反応混合物」なる用語は、標的核酸
の増幅のために使用される種々の試薬を含む水溶液を指
す。これらは、酵素、水性緩衝剤、塩類、増幅プライマ
ー、標的核酸、およびヌクレオシド三リン酸を含む。状
況に依存して、該混合物は完全または増幅反応混合物の
いずれであってもよい。本発明の好ましい実施態様にお
いて、増幅系はＰＣＲであり、増幅反応混合物はＰＣＲ
混合物である。

【００２７】「緩衝溶液」なる用語は、緩衝剤または緩
衝剤混合物、および場合により２価陽イオンおよび１価
陽イオンを含む溶液を指す。

【００２８】本発明は、多くの供給源に由来するＲＮＡ
を逆転写し、増幅するために好適である。ＲＮＡテンプ
レートは、ウイルスまたは細菌性核酸調製物等の微生物
由来の核酸調製物中に含まれてよい。該調製物は、細胞
残渣および他の成分、精製全ＲＮＡ、または精製ｍＲＮ
Ａを含んでよい。該ＲＮＡテンプレートは、試料中の異
種的ＲＮＡ分子の母集団または特定の標的ＲＮＡ分子で
あってよい。

【００２９】この方法において使用するために好適なＲ
ＮＡは、特定の標的ＲＮＡを含むことが予想される生物
学的試料中に含まれてよい。生物学的試料は、例えば血
液試料または生検組織試料等のＲＮＡが該試料の小部分
である異種的試料であってよい。従って、この方法は、
臨床検査および診断のために有用である。ＲＮＡは、特
定の疾患または感染物質を示すものであり得る。

【００３０】ＲＮＡは、ＷＯ９１／０９９４４に引用さ
れているような種々の方法のいずれにより調製されても
よい。

【００３１】合成オリゴヌクレオチドは、ここに参考と
して取り入れるＭａｔｔｅｕｃｃｉらの、１９８１，
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５−３１
９１のトリエステル法を使用して調製されうる。他の方
法としては、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ８７００ ＤＮ
Ａ合成装置等によるシアノエチルホスホラミダイト化学
を使用する自動合成が好ましい。

【００３２】プライマー伸長を起こさせるためには、こ
のプライマーがＲＮＡテンプレートにアニールしなけれ
ばならない。逆転写を起こすためには、プライマーのす
べてのヌクレオチドがテンプレートにアニールする必要
はない。プライマー配列は、テンプレートの正確な配列
を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド
断片をプライマーの５’末端に連結し、プライマー配列
の残る部分をＲＮＡに相補的としてもよい。他の方法と
して、プライマー配列がＲＮＡテンプレートとハイブリ
ダイズするために充分に相補的であって、かつ相補ＤＮ
Ａ鎖の合成を可能とする限り、プライマー中に非相補的
塩基を分散させてもよい。

【００３３】ｃＤＮＡ調製の従来方法においては、プレ
アニール化工程を必要とした。プライマーをＲＮＡにハ
イブリダイズさせるために、ＲＮＡテンプレートの２次
および３次構造の不安定化が必要とされるであろう。一
般医、アニール化は種々の方法により実施され、アニー
ル化緩衝溶液の存在下で定型的に行われる。Ｍａｎｉａ
ｔｉｓらの、１９８２，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａ
ｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋは、アニール化緩衝溶液の例を提供する。ア
ニール化法は、限定されるものではないが、ＲＮＡ／プ
ライマー混合物を高温で短時間インキュベートし、次い
で段階的に冷却するか、または該混合物をドライアイス
／エタノール浴中で急速に凍結することを含む。逆転写
のために従来使用されていた低温度において、鎖内２次
構造相互作用がｃＤＮＡ合成またはプライマーのアニー
ル化と干渉することを防止するために、ある研究者はメ
チル水銀水酸化物等の化学変性剤にて処理することによ
り、ＲＮＡテンプレートを修飾している（Ｂａｉｌｙお
よびＤａｖｉｄｓｏｎ、１９７６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．７０：７５）。しかしながら、そのような変性
剤は、一般に極めて毒性で発ガン性の化合物であって、
酵素阻害を防止するためにも注意深く除去しなければな
らない。

【００３４】プライマーは逆転写を起こすためにテンプ
レートにアニール化しなければならないが、別個のアニ
ール化工程は必要ではない。熱活性逆転写酵素活性は、
厳密なアニール化のために好ましい高温度でも非可逆的
変性を受けないため、ポリメラーゼ添加に先立って、変
性テンプレートの急速冷凍または段階的冷却の必要差異
がない。従来の方法では、加熱され変性されたＲＮＡ
は、酵素活性に適合した条件を与える温度、通常３７−
４２℃まで低下させる間にアニール化したプライマー−
テンプレート構造を維持するように冷却する必要があっ
た。ＲＮＡの高温度逆転写方法は、プレ−アニール化工
程および化学変性剤の使用の必要性を除去した（例えば
例１〜４参照）。本発明は、ＲＮＡの２次および３次構
造を不安定化する改良方法を提供する。熱安定性ＤＮＡ
ポリメラーゼによる逆転写のための温度は、ＲＮＡの２
次および３次構造を更に不安定化し、かつ二重鎖ＲＮＡ
標的の変性作用もする。

【００３５】本発明は、アニール化プライマー−ＲＮＡ
テンプレートの逆転写が、熱活性かつ熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼにより触媒作用される方法を提供する。ここ
において使用されるように、「熱安定性ポリメラーゼ」
なる用語は、熱安定性または耐熱性であって、デオキシ
リボヌクレオチドのポリマー化に触媒作用して核酸鎖に
相補的なプライマー伸長生成物を形成する酵素を指す。
ここで有用な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ増
幅に際して、単鎖核酸の不安定化または二重鎖核酸の変
性に必要な時間、昇温下に付しても非可逆的に不活性化
されることがない。非可逆的不活性化とは、酵素活性の
実質的損失をいう。好ましくは熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼは、ポリマー化条件の約９０〜１００℃にて非可逆
的に変性されない。

【００３６】本発明の別の面において、高温度逆転写の
ためのＤＮＡポリメラーゼが熱活性であることは不可欠
なことである。ここにおぃて使用されるように、「熱活
性ポリメラーゼ」なる用語は、６０℃以上の温度でデオ
キシリボヌクレオチドのポリマー化に効率的に触媒作用
して核酸テンプレート鎖に相補的なプライマー伸長物を
形成することができる酵素を指す。本発明によれば、逆
転写のための熱活性ＤＮＡポリメラーゼは、５０℃以上
で最大活性を有する。該熱活性ＤＮＡポリメラーゼは、
ＲＮＡ不安定化およびプライマーアニール化の条件下、
５０〜８０℃の温度で不可逆的に変性されない。

【００３７】示される例において、熱活性ＤＮＡポリメ
ラーゼは、熱安定性でもある：しかしながら、熱活性で
非熱安定性酵素も、本発明の実施に好適である。ＲＮＡ
からのｃＤＮＡの調製は、上昇温度における反復する変
性サイクルを含まないため、該方法で有用な酵素が熱活
性であることに加えて熱安定性である必要はない。しか
しながら本発明の一実施態様において、均質ＲＴ／ＰＣ
Ｒ法が示される。ＲＴおよびＰＣＲ工程の間で反応成分
が調整されないので熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが好ま
しい。

【００３８】加熱条件は、緩衝溶液、塩濃度、および変
性される核酸に依存するであろう。当然のことながら、
ｍＲＮＡの逆転写についてテンプレート分子は一般に単
鎖であり、従って高温度の変性工程が不要であることは
認識されるであろう。しかしながら、二重鎖ＲＮＡも、
最初の変性または鎖分離工程に続く逆転写／増幅方法の
ための好適なテンプレートを与える。本発明は、二重鎖
ＲＮＡの熱変性に必要な高温度においてＲＮＡの分解を
低減し、これによって二重鎖ＲＮＡテンプレートからの
逆転写／増幅反応の効率を改善する緩衝溶液を提供す
る。本発明の緩衝溶液は、完全反応混合物の大雑把なか
なり高温度での処理が、ＲＮＡの２次および３次構造を
逆転写反応のプライマーアニール化工程の直前に不安定
化することを許容する（例１２）。二重鎖ＲＮＡテンプ
レートは、例えばレオウイルス、ブルータングウイル
ス、コロラドチック熱ウイルス、および酵母殺因子等を
含んでよい。

【００３９】ＲＮＡ不安定化の温度は、典型的には５０
〜８０℃の範囲である。プライマー伸長の第１のサイク
ルは、上述した変性および増幅に適した二重鎖テンプレ
ートを与える。核酸変性の温度は、典型的には約９０〜
約１００℃の範囲であり、変性が起こるに充分な時間は
核酸長、塩基成分、試料中に存在する単鎖配列間の相補
性に依存するが、典型的には約１０秒から４分間であ
る。

【００４０】熱安定性または熱活性ＤＮＡポリメラーゼ
は、好ましくは約４０℃以上、例えば６０−８０℃の温
度で至適活性を有する。４２℃よりかなりな高温度で
は、熱安定性または熱活性ＤＮＡポリメラーゼ以外のＤ
ＮＡおよびＲＮＡ−依存ポリメラーゼは、不活性化す
る。ここに参考として取り入れるＳｈｉｍｏｍａｖｅお
よびＳａｌｖａｔｏ、１９８９、Ｇｅｎｅ Ａｎａｌ．
Ｔｅｃｈｎ．６：２５−２８は、ＡＭＶ−ＲＴは、４２
℃において最大活性を有することを記述している。５０
℃において該酵素は５０％の活性を有し、５５℃におい
てはＡＭＶ−ＲＴは活性最大水準の僅かに１０％を保持
するにすぎない。従って、ＡＭＶ−ＲＴはＲＮＡテンプ
レートを使用する高温度ボリマー化反応を触媒するには
不適当である。本願方法は、熱活性ＤＮＡポリメラーゼ
による効率的な高温度逆転写方法を提供する。

【００４１】プライマーのテンプレートに対するハイブ
リッド化は、組成およびプライマーの長さに加えて塩濃
度に依存する。熱安定性または熱活性ポリメラーゼを使
用する場合には、ハイブリッド化は高温度（例えば４５
−７０℃）にて起こり得て、これは選択性の増大および
／またはプライミングの高い厳密性のために好適であ
る。ポリメラーゼ酵素についての高温度の至適性は、プ
ライマーハイブリッド化工程での選択性のためにＲＮＡ
逆転写および引き続く増幅がより高い特異性を持って進
むことを可能とする。好ましくはＲＮＡ逆転写の至適温
度は、約５５−７５℃、更に好ましくは６０−７０℃の
範囲である。

【００４２】本発明は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに
より触媒作用を受ける向上したプライマー−指向特異性
をもったＲＮＡテンプレートの逆転写方法を提供する。
開示される方法は、ＲＮＡの逆転写の従来方法に対し、
改良されている。これらの方法は、ＲＮＡ／ｃＤＮＡハ
イブリッド中間体分子和介してＲＮＡ断片の増幅を与え
る。該ハイブリッド分子は、ＰＣＲによる増幅のために
好適なテンプレートである。従って逆転写および増幅反
応が結合される。従来のＲＮＡ増幅法は、増幅反応開始
に先行してＲＮＡ／プライマー混合物を逆転写酵素の存
在下で３７−４２℃においてインキュベートすることを
必要とした。本発明によれば、ＲＮＡ増幅のためのすべ
ての酵素的工程は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによる
触媒作用によっている。ＴａｑおよびＴｔｈＤＮＡポリ
メラーゼの商業的入手可能性、ＴｔｈＤＮＡポリメラー
ゼ調製のための開示された方法、およびＴｔｈＤＮＡポ
リメラーゼ逆転写／ＤＮＡ増幅キット（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）の商業的入手可能
性によって、ＰＣＲにもたらされる優位点は、ここに開
示される方法によって、ＲＮＡの逆転写、ＲＮＡ検出、
ｃＤＮＡ調製および結合逆転写／ｃＤＮＡ増幅に対して
適用可能である。

【００４３】ＰＣＲによるＤＮＡ増幅方法は周知であ
り、ここに参考として取り入れる米国特許４，６８３，
１９５、４，６８３，２０２および４，９６５，１８８
号に記述されている。本発明により提供される優位点の
理解を容易にするために、ＰＣＲの要約を示す。ＰＣＲ
は、増幅されるべき二重鎖標的核酸配列にハイブリッド
する２種類のプライマーを必要とする。ＰＣＲにおい
て、二重鎖標的配列は変性され、該変性標的の核鎖に１
個のプライマーがアニール化する。プライマーは標的核
酸に、他方から離れた部位において、一方のプライマー
の伸長生成物がその相補体から分離された場合に他方の
プライマーとハイブリッド可能であるような配向をもっ
てアニール化する。一旦プライマーが標的配列にハイブ
リッドすると、該プライマーはＤＮＡポリメラーゼの作
用により伸長される。次いで伸長生成物は、標的核酸か
ら変性され、該工程が反復される。

【００４４】この工程の引き続くサイクルにおいて、先
のサイクルにおいて生成された伸長生成物は、ＤＮＡ合
成のテンプレートとして機能する。第２のサイクルから
始めて、増幅生成物は指数的速度で蓄積され始める。増
幅生成物は、個別の二重鎖ＤＮＡ分子であり、場合によ
り第２のプライマーに相補的な配列が続いた第１のプラ
イマーの配列を含む第１の鎖、および第１の鎖に相補的
な第２の鎖を含んでなる。

【００４５】ＰＣＲ法により可能な膨大な増幅によっ
て、高いＤＮＡ水準をもった試料、正の対照テンプレー
ト、または先行する増幅に由来する少量のＤＮＡの持ち
越しが、意図的に添加したテンプレートＤＮＡが存在し
ない場合にもＰＣＲ生成物を生じうる。可能であるなら
ば、すべての反応混合物は、ＰＣＲ生成物の分析および
試料調製から隔離された領域にて調製される。ＲＮＡ／
ＤＮＡ調製、反応物の混合、および試料の調製において
専用または使い捨ての容器、溶液およびピペット（好ま
しくはポジティブディスプレースメントピペット）の使
用は、交差夾雑を最小化するであろう。ここに参考とし
て取り入れるＨｉｇｕｃｈｉおよびＫｗｏｋ，１９８
９，Ｎａｔｕｒｅ，３３９：２３７−２３８、およびＩ
ｎｎｉｓら、編、１９９０、「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｓ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ中のＫｗ
ｏｋおよびＯｒｒｅｇｏ参照。

【００４６】核酸増幅の交差夾雑を最小化する特定の方
法が、ここに参考として取り入れるＰＣＴ特許公開ＷＯ
９２／０１８１４および米国特許５，０３５，９９６に
記述されている。該方法は、ｄＵＴＰ等の非慣用ヌクレ
オチド塩基を増幅生成物に導入し、持ち越し生成物を酵
素的および／または物理化学的処理に付して生成物ＤＮ
Ａを次の増幅についてテンプレートとして機能し得ない
ようにすることを含む。例えば、ウラシル−Ｎ−グリコ
シラーゼまたはＵＮＧとしても知られているウラシルＤ
ＮＡグリコシラーゼは、ウラシル塩基を含むＰＣＲ生成
物からウラシル残基を除去するであろう。該酵素処理
は、夾雑するＰＣＲ生成物を分解し、増幅反応物を“滅
菌”する作用をする。

【００４７】核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチ
ドを指す場合に「非慣用」なる用語は、特定のポリヌク
レオチド中に天然に生じる慣用の塩基、ヌクレオシドま
たはヌクレオチド（例えばＤＮＡ［ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、
ｄＴ］またはＲＮＡ［Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ］）の修飾物、誘
導体または類似体を指す。ウラシルは、ＲＮＡ（すなわ
ちリボヌクレオチド中のリボースに共有結合する）にお
いて慣用の塩基であるが、ＤＮＡ（すなわちデオキシリ
ボヌクレオチド中のデオキシリボースに共有結合する）
においては非慣用の塩基である。結合ＲＴ／ＰＣＲ反応
において、ＲＴ工程の前の反応物を、滅菌して先の逆転
写および／または増幅反応の核酸生成物を除去しておく
ことが望ましい。逆転写後、かつＰＣＲ前の滅菌は、夾
雑生成物に加えて、ｄＵＴＰを含む非夾雑ｃＤＮＡ生成
物の分解ももたらす。ｄＴＴＰの存在下、かつｄＵＴＰ
の非存在下でのｃＤＮＡ合成は、非実用的である。ｄＵ
ＴＰを引き続くＰＣＲ生成物に効率的に取り込むために
は、逆転写工程に由来する持ち越しとしてのｄＴＴＰを
希釈するために、大過剰量のｄＵＴＰが必要であろう。
更に、このことは、ｄＵＴＰ添加のためにチューブの開
封を必要とする。従って、ＵＮＧ滅菌の有効性が損なわ
れる。

【００４８】本発明は、ＲＴ／ＰＣＲ反応物の滅菌方法
を提供するものである。例４は、本発明のこの側面を例
示する。非慣用ヌクレオシドが増幅生成物に取り込まれ
た場合に、通常の力価測定実験は、反応条件を至適化す
るために有用であり、ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−５
４０，６９３は、非慣用ヌクレオチドの取り込みに関し
て指針を与える。変化するパラメータは、限定されるも
のではないが、２価陽イオン濃度、ｐＨ範囲、ＤＮＡポ
リメラーゼ濃度、非慣用ヌクレオシド濃度、非慣用ヌク
レオシドが挿入されるべき天然ヌクレオシドの添加、各
サイクルの時間および温度を含む。

【００４９】一般に、トリス緩衝溶液中でＭｇＣｌ_２を
使用するＰＣＲにおいてｄＮＴＰ濃度は、各ｄＮＴＰに
つぃて２０−２００μＭの範囲である。ｄＵＴＰの取り
込みのためには、上昇させたヌクレオチド濃度において
増幅効率が改善される。例４において、ＰＣＲ中のｄＵ
ＴＰ濃度は、２００μＭであり、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰお
よびｄＡＴＰも同じ濃度で存在するが、これは本質的で
はない。ｄＵＴＰまたはｄＮＴＰ濃度を増大させた場
合、ＭｇＣｌ_２およびＭｎＣｌ_２濃度も付随して増大さ
せられる。例４において、ＰＣＲはｄＧＴＰ、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＵＴＰおよびｄＣＴＰをそれぞれ２００μＭ、な
らびに２ｍＭのＭｇＣｌ_２を含み、効率的増幅を与えて
いる。

【００５０】熱安定性ポリメラーゼを使用する逆転写の
ためには、Ｍｎ^２＋が２価陽イオンとして好ましく、典
型的には例えば塩化マンガン（ＭｎＣｌ_２）、酢酸マン
ガン（Ｍｎ（ＯＡＣ）_２）または硫酸マンガン（ＭｎＳ
Ｏ_４）等の塩として含まれる。ＭｎＣｌ_２が、１０ｍＭ
トリス緩衝溶液を含む反応物に含まれる場合に、ＭｎＣ
ｌ_２は一般に０．５−７．０ｍＭの濃度で存在し、ｄＧ
ＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰおよびｄＣＴＰをそれぞれ２
００μＭ使用する場合、０．８−１．４ｍＭが好まし
く、１．２ｍＭＭｎＣｌ_２が最も好ましい。本発明は、
２価陽イオン濃度の使用可能な範囲を拡大する方法およ
び試薬を提供する。本発明の一実施態様において、Ｍｎ
（ＯＡｃ）_２、ビシン−ＫＯＨおよびＫＯＡｃを含む反
応用緩衝溶液を、ＭｎＣｌ_２、トリス、ＫＣｌ緩衝溶液
に代えて使用した。例８は、Ｍｎ（ＯＡｃ）_２として供
給されるＭｎ^２＋が１．２〜２．５ｍＭの範囲の濃度で
使用されるビシン／アセテート緩衝溶液の使用を記述
し；例１０に記述されるＲＴ／ＰＣＲにおいては、３．
６ｍＭおよび３．５ｍＭの濃度が使用されている。

【００５１】非慣用ヌクレオチドおよび２価陽イオンの
至適濃度は、全ｄＮＴＰ濃度、ならびに存在する特定の
プライマー、テンプレート、緩衝溶液、塩類、およびポ
リメラーゼに依存して上述の増幅反応と同様に逆転写反
応でも変化しうる。例は、逆転写反応において高濃度の
ｄＮＴＰを許容し、これによって新たに合成されるｃＤ
ＮＡへのｄＵＴＰ取り込みを増大するビシン／アセテー
ト緩衝溶液の使用を記述する。

【００５２】例３に記述される本発明の一実施態様にお
いては、ＲＴおよびＰＣＲ工程の両者について、トリス
−ＨＣｌ緩衝溶液中の２価陽イオンとしてＭｎＣｌ_２を
使用する結合ＲＴ／ＰＣＲに対して２工程１添加方法が
提供される。この方法において、逆転写に次いでＰＣＲ
工程の前に緩衝溶液の調整が行われない。従って、ｄＴ
ＴＰまたはｄＵＴＰ（２００μＭを使用）のいずれを取
り込む場合にも、ＰＣＲの際にＭｎＣｌ_２の濃度が１．
２ｍＭに維持された場合に起こりうる増幅効率の低下を
さけるために、より低濃度のＭｎＣｌ_２が使用される。

【００５３】増幅およびＲＴ／ＰＣＲ結果の分析に次い
で、ＲＴ／ＰＣＲ生成物は不本意に他の反応中に夾雑物
として導入されうる。引き続くＲＴ、ＲＴ／ＰＣＲ、ま
たは増幅反応に先だって、該反応物は、先行するＲＴ／
ＰＣＲの際に取り入れられた非慣用ヌクレオチドに対し
て特異的なＤＮＡグリコシラーゼにより処理される。こ
うして標的核酸を含む引き続くＲＴ、ＲＴ／ＰＣＲまた
は増幅反応混合物中に夾雑物として存在するいずれの先
行するＲＴ／ＰＣＲ生成物も加水分解される。

【００５４】従って、実際上ＲＴ／ＰＣＲに先行して滅
菌処理が行われ、生成物ＤＮＡを含むｄＵＭＰの持ち越
しが除去される。例えば、逆転写反応物の高温度（６０
−７０℃）インキュベーションに先行して、ＲＴ反応物
の体積μｌあたり、０．０１−０．０５単位のＵＮＧが
添加され、室温にて１−１０分間インキュベートされ
る。他の方法として、インキュベーションは５０℃にて
２分間行われる。引き続く高温度（６０−７０℃）ＲＴ
および９５℃の変性工程は、新たに合成されるｃＤＮＡ
およびＰＣＲ生成物が分解されないようにＵＮＧの不活
性化を行う。ＵＮＧは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎ
ｏｒｗａｌｋ，ＣＴから商業的に入手可能である。ＥＰ
−Ａ−５４０，６９３は、組換え手段によるＵＮＧの製
造方法、およびＤＮＡ試料の変性温度以上での加熱後に
は活性を再度獲得することがない熱変位性ＵＮＧ誘導体
が記述されている。そのような誘導体は、本発明の実施
のために好適であろう。

【００５５】増幅の標的は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッ
ド分子であり得る。該標的は、単鎖または二重鎖核酸で
あり得る。上述のＰＣＲ法は、二重鎖標的を仮定して記
述したが、これは必要条件ではない。単鎖ＤＮＡ標的の
第１の増幅サイクルの後、該反応物は、単鎖標的および
新たに合成された相補鎖からなる二重鎖ＤＮＡ分子を含
む。同様に、ＲＮＡ／ｃＤＮＡ標的の第１の増幅サイク
ルに次いで、該反応混合物は二重鎖ｃＤＮＡ分子を含
む。この点において、増幅の引き続くサイクルは、上述
したように進行する。本発明の方法において、増幅の標
的は単鎖ＲＮＡであり、第１の増幅サイクルは、逆転写
工程である。別の方法として、出発のテンプレートが二
重鎖ＲＮＡである場合には、最初の高温度変性工程が単
鎖ＲＮＡテンプレートの調製のために使用される。

【００５６】ここにおいて使用されるように「ｃＤＮ
Ａ」なる用語は、リボ核酸鎖（ＲＮＡ）をテンプレート
として合成される相補的なＤＮＡ分子を指す。ＲＮＡ
は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはウイルスＲ
ＮＡ等のＲＮＡの別の形態であってもよい。ｃＤＮＡ
は、単鎖、二重鎖またはＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド
のように相補的ＲＮＡと水素結合するものでもよい。

【００５７】本発明の方法は、所望の最終生成物が従来
方法よりも高い特異性を持って生成される所望のＲＮＡ
テンプレートからｃＤＮＡを得る方法を提供する。更
に、本発明ではｃＤＮＡ合成がＰＣＲによる増幅と結合
される。これらの方法は、熱活性ＤＮＡポリメラーゼの
従来知られていなかった性質を取り入れるものである。
開示される実施態様において、ＴａｑおよびＴｔｈＤＮ
Ａポリメラーゼを逆転写に使用する方法が提供される。
これらの実施態様は、本発明を限定するものと解釈され
るべきではない。

【００５８】熱安定性ポリメラーゼは、多くの供給元か
ら入手可能である。酵素は、天然または組換えタンパク
質であってよい。好ましい熱安定性酵素は、Ｔｈｅｒｍ
ｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから精製されるＴｈｅｒ
ｍｕｓ ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラーゼで
ある（ここに参考として取り入れるＰＣＴ特許出願公開
ＷＯ９１／０９９５０参照）。別の方法として、Ｔｔｈ
ＤＮＡポリメラーゼは、組換え宿主細胞から生成され、
該宿主細胞は、ＷＯ９１／０９９４４二記述されている
ように、下記プライマーを使用して調製されうる：

【００５９】

【００６０】組換えＴｔｈポリメラーゼは、ｒＴｔｈＤ
ＮＡポリメラーゼと記される。ＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼもまた本発明の実施に好適である。ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼは、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉ
ｎｃ．により開発および製造され、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴから市販されている組換
え製品またはＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓから
天然ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとして生成されたものが
商業的に入手可能である。ここにおいて使用されるよう
に、組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼはｒＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼと記されてよく、また天然ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼは、ｎＴａｑＤＮＡポリメラーゼとして記さ
れてもよい。更に、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔ
ｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬから“Ｈｏｔ Ｔｕｂ”Ｄ
ＮＡポリメラーゼとして入手可能なＴ．ｆｌａｖｕｓ
（Ｔｆｌ）ＤＮＡポリメラーゼが好適であり得る。逆転
写および核酸増幅へのＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの使用
の詳細については、ＷＯ９１／０９９４４に見いだされ
るであろう。

【００６１】プライマーは、その５’末端またはその近
傍に位置する便利な制限酵素認識配列を伴って設計され
うる。ｃＤＮＡ転写物の形成において、プライマーの
３’末端が標的配列に水素結合している限り、得られた
二重鎖ｃＤＮＡ分子は特定の制限酵素認識配列を含むで
あろう。ｃＤＮＡをテンプレートとして使用して増幅
後、該制限部位は例えばクローニング等の別の処理を容
易にするために使用されうる。

【００６２】熱活性または熱安定性ＤＮＡによるＲＮＡ
の逆転写の後、該ＲＮＡは、ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリ
ッドから熱変性またはアルカリ、熱または酵素処理等の
多くの既知の手段により除去されうる。酵素処理は、例
えばＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅＨで処
理することを含んでよい。ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ／Ｄ
ＮＡ二重鎖中のＲＮＡ鎖に特異的である。Ｔｔｈおよび
Ｔａｑに伴われるＲＮａｓｅＨおよび５’−＞３’ヌク
レアーゼ活性は、ｃＤＮＡ配列増幅のためのプライマー
伸長に加えて、ＲＮＡテンプレートの加水分解および第
２のＤＮＡ鎖合成を容易にする。別法としては、外部的
ＲＮａｓｅＨを商業的に入手可能な供給元から添加して
もよい。

【００６３】熱安定性ポリメラーゼのＲＮａｓｅＨ活性
は、試料中のＲＮＡとＤＮＡとを識別する手段を提供す
る。このことは、類似する二重ＤＮＡの存在下でＲＮＡ
を検出するために特に有用である。ＤＮＡが例えばプロ
ウイルスＨＩＶのＤＮＡ等、イントロンを含まない場合
には、増幅ＲＮＡとＤＮＡとは大きさにおいて区別不可
能である。しかしながら、逆転写の後、熱安定性ＲＮａ
ｓｅＨ活性は、ＲＮＡ／ｃＤＮＡ二重鎖の変性の必要性
を取り除く。従って、ゲノムまたはプロウイルスＤＮＡ
の存在下で、ＲＮＡテンプレートのみが第１のＰＣＲサ
イクルにおいて増幅される。

【００６４】類似するＲＮＡおよびＤＮＡテンプレート
の間を識別する好ましい方法において、増幅プライマー
は、低い鎖分離温度によるＰＣＲ生成物の合成を支配す
るために使用される。例えば、下記プライマー対はＨＩ
ＶＲＮＡを検出するために、９４℃よりも十分に低い温
度で変性するＦＣＲ生成物を生じる：

【００６５】

【００６６】ＰＣＲのための典型的変性温度は、９４−
９６℃である。低下された温度においては二重鎖ＤＮＡ
（すなわち予想される夾雑物）は変性せず、従って増幅
されない。ＰＣＲ生成物の変性温度に影響を与える方法
は、ここに参考として取り入れるヨーロッパ特許出願Ｅ
Ｐ−Ａ−５１９，３３８に詳細に記述されている。

【００６７】別の方法において、非慣用ヌクレオチド
は、ＰＣＲ生成物の変性温度に影響を与えるために有用
である。例えば、ヒドロキシメチルｄＵＴＰ（Ｈｍｄｕ
ｔｐ）は、ＳＰ０１ファージＤＮＡ中にチミンに代えて
５’ヒドロキシメチルウラシル（ＨｍＵｒａ）として天
然に生じる（Ｋａｌｌｅｎら、１９６２，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．５：２４８−２５０、ならびにＬｅｖｙおよ
びＴｅｅｂｏｒ、１９９１，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１９（１２）：３３３７、両者をここに参考として
取り入れる）。ＨｍＵｒａを含むゲノムは、対応するチ
ミンを含むＤＮＡより１０℃低い温度で融解する。Ｈｍ
ｄＵＴＰのｃＤＮＡへの取り込みは、逆転写生成物およ
びＰＣＲ二重鎖ＤＮＡ生成物の両者の変性温度を、類似
するチミン含有ＤＮＡの変性温度に比べて効果的に低下
させる。ＤＮＡ生成物のＴｍに効果を及ぼしうる他の修
飾ヌクレオチド三リン酸（例えば、ｃ７ｄＧＴＰ、７−
デアザ−２’デオキシグアノシン５’−三リン酸または
α−ホスホロチオエートｄＮＴＰ）は、類似するＲＮＡ
およびＤＮＡテンプレートを区別するために好適であ
る。

【００６８】ＲＮＡテンプレート鎖の除去または融解の
後、残るｃＤＮＡ鎖は、自己相補鎖のポリマー化のため
のテンプレートとして機能し、更なる増幅、検出または
他の操作に好適な二重鎖ｃＤＮＡ分子を与える。第２鎖
の合成もプライマーを必要とする。配列特異的プライマ
ーを第２鎖合成を開始するために反応混合物中に導入し
うる。別法として、二重鎖アダプターリンカーをｃＤＮ
Ａに連結してもよく、あるいはｃＤＮＡをターミナルト
ランスフェラーゼ型活性によりテイリングしてもよい。
第２鎖プライマーは、特定のｃＤＮＡ配列よりむしろ尾
部にハイブリッドすることを必要とする（例えば前述の
Ｉｎｎｉｓらの文献中のＦｒｏｈｍａｎ参照）。開示さ
れる方法の実施において、特定のｃＤＮＡ分子の合成の
ための第１のプライマーの組、および所望のｃＤＮＡ分
節の増幅のための第２の帰巣するプライマーの組の使用
が望ましい。これらのすべての反応は、同じＤＮＡポリ
メラーゼによって触媒作用を受ける。

【００６９】本発明によれば、逆転写のためにプライマ
ー−テンプレート混合物が適当なポリマー化条件で熱活
性または熱安定性ポリメラーゼと共にインキュベートさ
れる。これらの条件は、４種すべてのデオキシリボヌク
レオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）ならびに緩衝剤、２価陽
イオン、および１価陽イオンを含む緩衝溶液を含んでな
る反応混合物によって与えられる。

【００７０】ＤＮＡポリメラーゼは、触媒活性のために
２価陽イオンを必要とする。ここに参考として取り入れ
るＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９８９，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
６：４０７６−４０８０は、ＤＮＡ配列決定法において
Ｍｇ^２＋をＭｎ^２＋に置換可能であることを報告してい
る。これらの方法ではＤＮＡテンプレートおよびＴ７Ｄ
ＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼＩが必要で
ある。

【００７１】Ｍｎ^２＋、Ｍｇ^２＋またはＣｏ^２＋のいず
れもがＴａｑ、ＴｔｈおよびＴｍａＤＮＡポリメラーゼ
を活性化しうる：しかしながら、Ｍｎ^２＋が本願方法で
は好ましい。本願の開示される実施態様においては、Ｒ
ＮＡからの核酸の逆転写のためにＭｎ^２＋を含む緩衝溶
液が与えられる。これらの緩衝溶液は、従来の逆転写緩
衝溶液より改良されており、増加したｃＤＮＡ収率をも
たらす。特に、ＲＮＡ増幅のためにＴｔｈＤＮＡポリメ
ラーゼおよびＭｎＣｌ_２またはＭｎ（ＯＡｃ）_２を使用
する本願方法の実施においては、ＭｇＣｌ_２および標準
ＰＣＲ条件に比べて少なくとも１０^６倍の感度の上昇が
もたらされた。ＲＮＡテンプレート依存ＤＮＡ合成を活
性化することは可能であるが、混合２価陽イオン緩衝溶
液（例えばＭｎ^２＋およびＭｇ^２＋）は、感度および効
率を低下するため好ましくない。

【００７２】２価陽イオンは、ＭｇＣｌ_２、Ｍｇ（ＯＡ
ｃ）_２、ＭｇＳＯ_４、ＭｎＣｌ_２、Ｍｎ（ＯＡｃ）_２、
またはＭｎＳＯ_４等の塩の形態で供給される。トリス−
ＨＣｌ緩衝溶液において使用可能な陽イオン濃度は、Ｍ
ｎＣｌ_２について０．５−７ｍＭ、好ましくは０．５と
２ｍＭとの間であり、ＭｇＣｌ_２については０．５−１
０ｍＭである。ビシン／ＫＯＡｃ緩衝溶液において使用
可能な陽イオン濃度は、Ｍｎ（ＯＡｃ）_２について１−
２０ｍＭ、好ましくは２−５ｍＭである。

【００７３】好ましくは、１価陽イオンが、カリウム、
ナトリウム、アンモニウム、またはリチウムの塩化物ま
たは酢酸塩により供給される。ＫＣｌについては、至適
濃度は反応に使用するポリメラーゼに依存して変化する
が、１−２００ｍＭの濃度、好ましくは４０−１００ｍ
Ｍの濃度である。ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを使用する
場合、至適逆転写酵素活性は、５０および７５ｍＭＫＣ
ｌの間で観察される。しかしながら、ＫＣｌ濃度を１０
０ｍＭまで増大した場合、向上したＲＴ／ＰＣＲが観察
される。ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラ
ーゼ等のＴａｑＤＮＡポリメラーゼについては、５０ｍ
ＭＫＣｌが好ましい。ＫＯＡｃについては、ＴｔｈＤＮ
Ａポリメラーゼを使用する場合に、８５ｍＭ−１１５ｍ
Ｍの濃度において至適逆転写酵素活性が観察された。

【００７４】デオキシリボヌクレオチド三リン酸は、ジ
ナトリウムまたはリチウムの塩として、ｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰおよびｄＴＴＰの塩溶液とし
て添加される。本願方法において、それぞれ１μＭ〜２
ｍＭの範囲の最終濃度が好適であり、１００−６００μ
Ｍが好ましいが、ヌクレオチドの至適濃度は、逆転写反
応において全ｄＮＴＰおよび２価金属イオン濃度、なら
びに緩衝溶液、塩類、特定のプライマーおよびテンプレ
ートに依存して変化しうる。例えば１５００ｂｐ以上の
より長い生成物のためには、トリスーＨＣｌ緩衝溶液を
使用する場合、各５００μＭのｄＮＴＰおよび２ｍＭの
ＭｎＣｌ_２が好ましい。

【００７５】好適な緩衝剤は、水素イオンの緩衝作用、
および好ましくは第５節に記載したようにｐＨとマンガ
ンイオン濃度との両者を緩衝する両性イオン化合物であ
る。特に好ましい緩衝剤は、ビシン−ＫＯＨであり、好
ましくはｐＨ８．３であるが、ｐＨは７．８−８．７の
範囲であってよい。ビシンは、ｐＨ緩衝剤および金属緩
衝剤の両者として作用する。

【００７６】付加的に、０．５ｍＭ未満のＥＤＴＡが逆
転写反応混合物中に存在してもよい。Ｔｗｅｅｎ−２０
^ＴＭおよびＮｏｎｉｄｅｔ^ＴＭＰ−４０等の洗浄剤が酵
素希釈緩衝溶液中に存在する。非イオン性洗浄剤の最終
濃度は、約０．１％またはそれ未満が適切であり、しか
しながら０．０１−０．０５％が好ましく、ポリメラー
ゼ活性にも干渉しないであろう。同様にグリセロールが
酵素調製物にしばしば存在し、一般に反応混合物中で１
−２０％に希釈される。蒸発防止のために鉱油のオーバ
ーレイが添加されうるが、ＴＣ９６００サーマルサイク
ラ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃ
Ｔ）を使用する場合、またはここに参考として取り入れ
るＰＣＴ特許公開ＷＯ９１／１２３４２およびＣｈｏｕ
ら、１９９２，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０：１
７１７−１７２３に記述されているように、Ａｍｐｌｉ
ｗａｘ^ＴＭＰＣＲＧｅｍ１００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ
ｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を使用する場合には必要
ではない。

【００７７】本発明の一実施態様において、均質ＲＴ／
ＰＣＲが提供される。この２工程、１添加方法は、初期
試薬添加後にチューブを開く必要がない。従って、ＲＴ
およびＰＣＲ工程の間で汚染する機会が除かれる。しか
しながら工程間で反応試薬を変更する機会が失われ、従
って、２つの反応は、ＲＴおよびＰＣＲ工程の両者に対
して至適ではない同一の反応試薬条件下で行われる必要
がある。反応条件の調節は、２つの反応工程の別個の要
求に適合させる必要がある。例えば、至適ＲＴ活性のた
めに要求される高い酵素濃度のために、短い標的を増幅
する場合には、ＰＣＲサーマルサイクラにて１０−３０
秒間の短い伸長サイクルが好ましいが、伸長サイクルの
時間は、使用するサーマルサイクラに依存する。例え
ば、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ
が販売するＴＣ４８０サーマルサイクラを使用する場合
には、１分間が好ましい。

【００７８】同様に、均質ＲＴ／ＰＣＲアッセイにおい
ては、ＲＴおよびＰＣＲ工程の間に緩衝溶液調整が無い
ため、個々の工程が機能するようにそれぞれのＲＴおよ
びＰＣＲの至適条件の中間的マグネシウム濃度が必要と
される。例７に示されるように、至適濃度は、ＤＮＡ標
的のＰＣＲ反応の方がＲＮＡ標的のＲＴ反応よりも低
い。ＤＮＡテンプレート上で至適合成を与えるマンガン
濃度は、約０．６ｍＭ（８００μＭの全ｄＮＴＰ、トリ
ス緩衝溶液）であることが見いだされ、また酵素につぃ
ては、ＲＮＡテンプレート上での最大逆転写酵素活性が
約１．４ｍＭのマンガン（８００μＭの全ｄＮＴＰ、ト
リス緩衝溶液）にて得られた。例３に記述される均質反
応については、ＭｎＣｌ_２濃度は、好ましくは１．０ｍ
Ｍ以下、最も好ましくは０．８ｍＭである。好ましい濃
度は、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼにＲＴ／ＰＣＲを行う
条件を与えるが、これらの条件は、逆転写およびＤＮＡ
増幅の両者に対して準至適なものである。更に、ｄＵＴ
Ｐの存在下でのＲＴ工程の効率は、本発明の滅菌方法と
同様に、より高濃度のＭｎＣｌ_２において改良される
が、ＰＣＲ工程はより低効率である。従って、０．８ｍ
ＭのＭｍＣｌ_２が最も好ましく使用され、また生成物
は、エチジウム染色ゲルより高感度の検出方法、すなわ
ちプローブハイブリダイゼージョンまたは標識の取り込
み、あるいは他の核酸検出法により検出される。

【００７９】２つの工程のための異なった至適反応好件
の問題を解く一方法は、ＰＣＴ特許公開ＷＯ９１／１２
３４２に記述されるように反応チューブ内において試薬
を分離するために、高融点ワックス（７２℃）を使用す
ることを含む。高融点ワックスは、ＥＧＴＡおよびＭｇ
Ｃｌ_２溶液をＲ青反応からワックス層により分離し、２
つの個々の反応がそれら自体の最適条件にて起こること
を本質的に可能とする。ＲＴ工程は、ワックスの融点よ
り低い温度で行われ、しかしてワックス層はそのまま維
持され、ＲＴ工程は至適濃度のマンガンを使用して行わ
れる。ＲＴ工程完了後、ワックスはＰＣＲの最初の高温
度変性工程の間に融解し、かくしてＥＧＴＡを放出して
マンガンを優先的にキレートし、マグネシウムに基づく
ＤＮＡ増幅を可能とする。この技術の修飾は、ＥＧＴＡ
およびマグネシウムの同じ高融点ワックスのビーズ中へ
のマイクロカプセル化を含む。

【００８０】本発明によれば、緩衝剤がキレート剤とし
て作用する金属緩衝溶液を使用する。そのような緩衝溶
液は、マンガンに結合し、従ってより高いＭｎ^２＋濃度
の使用を可能とする。該金属緩衝溶液は、添加された広
範囲のＭｎ^２＋に亘って利用可能なＭｎ^２＋濃度を一定
水準に維持しうる。本発明の方法で有用であり得る金属
緩衝剤は、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシメチル）グリ
シン（ビシン）、Ｎ［トリス（ヒドロキシメチル）メチ
ル］グリシン（トリシン）、酢酸塩、グルタミン酸塩、
アスパラギン酸塩、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノジ酢酸
（ＨＩＭＤＡ）、クエン酸塩およびイソクエン酸塩を含
む。例示した緩衝剤の一つと同様な金属結合およびｐＨ
緩衝能力を与える緩衝剤の組み合わせも好適であり得
る。ここにおいて使用されるように「緩衝剤」なる用語
は、そのような緩衝剤の組み合わせも包含することを意
味する。場合により、同様な緩衝効果は、緩衝剤の濃度
を変更することによって達成されうる。例えば例１３
は、マンガンの範囲の拡大のために上昇させたトリス濃
度の使用が記述されている。

【００８１】キレート剤として作用する金属緩衝剤は、
逆転写反応のおいて金属イオンと錯体を形成する。キレ
ート剤の金属に対する親和性を表すキレート剤−金属錯
体の安定性は、「金属−緩衝剤結合定数」または「安定
常数」Ｋ_Ｍとして表される。安定常数が広範囲であるこ
とから、金属緩衝剤のＫ_Ｍの対数（底は１０、Ｌｏｇと
記される）がより一般的に引用される。安定常数Ｋ
_Ｍは、ここに参考として取り入れるＧｏｏｄら、１９６
６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５：４６７−４７７、
ならびにＰｅｒｒｉｎおよびＤｅｍｐｓｅｙ、１９７
４，“Ｂｕｆｆｅｒｓｆｏｒ ｐＨ ａｎｄ Ｍｅｔａ
ｌ Ｉｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ”，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎ
ｄ Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの第７章に記述されて
いる。本発明の方法で使用するマンガンに結合する適当
な金属緩衝剤は、１と６の間のＬｏｇＫ_Ｍ（２０℃、イ
オン強度０．１Ｍ）を有する（すなわち１０＜Ｋ_Ｍ＜１
０^６）。好ましくは、ＬｏｇＫ_Ｍは２と４の間であり、
最も好ましくは２．５と３．５との間である。種々のキ
レート剤の安定定数の資料は、ここに参考として取り入
れるＭａｒｔｅｌｌおよびＳｍｉｔｈ，１９７４，“Ｃ
ｒｉｔｉｃａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｎｓｔａｎ
ｔｓ”，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，Ｖｏｌｌ；ＭａｒｔｅｌｌおよびＳｍｉｔｈ，１９
７７，“Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｃｏ
ｎｓｔａｎｔｓ”，Ｖｏｌ ３，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１６０−１６２頁；ならびに
ＳｉｌｌｅｎおよびＭａｒｔｅｌｌ１９６４，“Ｓｔａ
ｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｎｓｔａｎｔｓｏｆ Ｍｅｔａｌ−
Ｉｏｎｓ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ”Ｓｐｅｃ．Ｐｕｂｌ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．ｎ１７，ｐ４５８，Ｌｏｎｄｏｎに
与えられている。

【００８２】好ましい金属緩衝剤は、本発明の方法で要
求されるｐＨ範囲において水素イオン緩衝剤としても働
きうる。前出のＧｏｏｄらの文献は、金属陽イオンおよ
び水素イオンの両者に働く緩衝剤の種類を記述してい
る。緩衝剤の酸解離定数Ｋａは、前出のＧｏｏｄら、１
９６６およびＰｅｒｒｉｎおよびＤｅｍｐｓｅｙ、１９
７４に記述されている。緩衝剤は、ＬｏｇＫａとして定
義して２０℃かつ０．１Ｍのイオン強度において７およ
び９の間、好ましくは７．５および８．５の間のＫａを
有する。

【００８３】本発明の方法で有用な緩衝剤は、Ｎ，Ｎ−
ビス（２−ヒドロキシメチル）グリシン（ビシン）、お
よびＮ［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン
（トリシン）である。両者は、両イオン性脂肪族アミ
ン；更に特定的にはＭｎ^２＋結合力を与えるカルボキシ
ル基で置換されたグリシンである。ビシン、トリシンお
よびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリ
ス）の性質は、下記に示され、また前出のＧｏｏｄら、
１９６６に見いだされ、これは更に構造式を与える。す
べての値は、２０℃および０．１Ｍのイオン強度での値
である。

【００８４】

【００８５】ビシンおよびトリシンの温度に対する酸結
合定数の変化（デルタｐＫａ）は、トリス−ＨＣｌより
も有意に低い。トリシンおよびビシンは、トリスで見い
だされるｐＨの大きい温度依存性をも低減する。

【００８６】トリシンおよびビシン緩衝剤は、ＤＮＡポ
リメラーゼ取り込みアッセイにおける使用可能なＭｎ
^２＋濃度範囲も拡大する。トリシンおよびビシンの濃度
が増加するに従って、増加したＭｎ^２＋濃度におけるＤ
ＮＡポリメラーゼ活性の減少は、顕著ではなく、また至
適Ｍｎ^２＋濃度はより高濃度側に移行する。例７に示さ
れるように、５０ｍＭのビシン−ＫＯＨ緩衝溶液（ｐＨ
>８．３）中でＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを使用して、
０．４ｍＭ〜２．３ｍＭのマンガン濃度は、良好なＤＮ
Ａテンプレート上への取り込みを与えた。ＲＮＡテンプ
レートを使用すると、１ｍＭ程度の低いＭｎ２＋濃度で
は、最大活性の約４０％が観察された。活性は、マンガ
ン濃度が１．０ｍＭから６ｍＭまで増大するに従って増
大し、約６および１２．５ｍＭの間でプラトーに達する
ことが観察された。より高いＭｎ^２＋濃度では活性が徐
々に減少し、２０ｍＭでは最大活性地の４８％が観察さ
れた。

【００８７】結合ＲＴ／ＰＣＲにおいて、ＤＮＡ増幅工
程については低い遊離のマンガンイオン濃度が必要とさ
れ、しかしながら逆転写工程については高い遊離のマン
ガンイオン濃度が必要とされる。ＤＮＡ増幅においては
遊離のマンガンイオンのほとんどを錯合し、ＲＴ反応に
おいては充分な遊離のマンガンを与えることにより全許
容マンガン濃度を拡大する本発明のトリシンおよびビシ
ン緩衝溶液の二重効果は、ＲＴ／ＰＣＲに重要な改善を
与える。二重の範囲の拡大は、金属緩衝剤に関する一般
理論および文献からは予想できず、このことは全く驚く
べき結果である。

【００８８】試料調製により持ち込まれるｄＮＴＰ、プ
ライマー、核酸、タンパク質、ＥＤＴＡおよび他の多く
の物質等、反応成分はマンガンにキレートする能力を有
しており、従って、マンガンの厳密な濃度調節は極めて
困難である。これらの成分は個々の研究者によって注意
深く調整されうるが、診断および応用研究のためのこれ
らの試薬の大規模製造には厳しい制約がおかれる。金属
緩衝剤トリシンおよびビシンの使用は、至適Ｍｎ^２＋濃
度を上方に移行するのみならず、Ｍｎ^２＋濃度およびｄ
ＮＴＰ濃度の使用可能な範囲を拡大する。より高いマン
ガン濃度およびより広い範囲の濃度の使用が可能である
ことは、試薬製造の問題および反応中のマンガン濃度の
厳密な調節の問題を緩和する。

【００８９】トリスの金属結合定数（ＬｏｇＫ_Ｍ）は無
視できるものと考えられているが（前出のＧｏｏｄら、
１９６６）、ＲＴ／ＰＣＲ中のトリス−ＨＣｌ濃度の１
０ｍＭから１００ｍＭへの増大は、ＲＮＡ標的上のＭｎ
^２＋濃度範囲を拡大し得る。トリス緩衝溶液は、無視で
きる程度にＭｎ^２＋（および他のほとんどの金属）に結
合すると考えられていたが、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９７
９，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４ｂ：５
３−６８は、「２５０ｍＭにおけるＭｎ−トリス錯体の
解離定数は高いが、１００ｍＭトリスおよび２ｍＭＭｎ
^２＋溶液においては金属イオンのほぼ２９％はキレート
化している」ことを示した。例１３は、ＰＣＲ生成物が
観察されるマンガン濃度範囲のかなりな拡大を与えるＲ
Ｔ／ＰＣＲにおける１００ｍＭトリスの使用を記述す
る。拡大される量は驚くべきものであり、金属緩衝剤お
よびトリスの背景となる一般理論および文献からは予想
し得なかったことである。

【００９０】ビシンおよびトリシン緩衝溶液は、好まし
くは、ＫＣｌまたはＫＯＡｃのいずれかを１価陽イオン
として含む。ビシン／ＫＯＡｃ緩衝溶液は、ビシン／Ｋ
Ｃｌ緩衝溶液よりも僅かに低いイオン強度を存し、この
ことは高Ｇ＋Ｃ含有量を有するテンプレートにおいて２
次構造を不安定化する助けになる。反応に添加されるＫ
ＯＡｃのｐＨは、金属緩衝剤およびｐＨ緩衝剤の両者と
して作用するビシンが、反応のｐＨを適切に緩衝するた
め臨界的ではない。生成物は、ＫＯＡｃをｐＨ７．０と
９．４との間で使用して観察され至適条件はｐＨ７．５
であった。５０ｍＭビシン（ｐＨ８．３）、１００ｍＭ
ＫＯＡｃ（ｐＨ７．５）および２．５ｍＭＭｎ（ＯＡ
ｃ）_２の溶液の最終的ｐＨは、７．９７である。

【００９１】ビシン緩衝溶液は、長期間保存可能であ
る。例えば、４℃において４７日間保存した５００ｍＭ
ビシン、８００ｍＭＫＣｌ、および２１ｍＭＭｇＣｌ_２
の１０Ｘ溶液を希釈した緩衝溶液を使用したＲＴ／ＰＣ
Ｒにて形成された生成物は、新たに調製した緩衝溶液を
しようしたＲＴ／ＰＣＲの生成物と同等であった。ビシ
ンは、金属イオンの溶解性を維持し；好適なビシン／Ｋ
ＯＡｃ／Ｍｎ（ＯＡｃ）_２緩衝溶液をＲＴ／ＰＣＲに使
用することの更なる利点は、Ｍｎ（ＯＡｃ）_２が、Ｍｎ
Ｃｌ_２に比べてより低い溶解性を有していたであろうこ
とである。従って、ＲＴ／ＰＣＲに有害なマンガン水酸
化物および酸化物の沈殿を防止しうる。

【００９２】本発明の滅菌方法は、ＲＴ／ＰＣＲがｄＵ
ＴＰの存在下で行われることで特定される。ウラシルＮ
−ゲリコシラーゼ（ＵＮＧ）滅菌の最大効率は、ｄＵＭ
Ｐが夾雑テンプレート中にｄＴＭＰの代わりに取り込ま
れた場合に達成される。ｄＵＭＰの取り込みを最大にす
るためには、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼは、ｄＴＴＰが
存在する場合に逆転写に際してｄＵＴＰを約２倍程度差
別するため、ＲＴ／ＰＣＴに対するｄＴＴＰの添加量を
最小化することが望ましい。ｄＮＴＰはＭｎ^２＋に結合
するため、遊離のＭｎ^２＋濃度は、ｄＮＴＰ濃度に直接
に関連する。遊離のＭｎ^２＋濃度の緩衝は、ｄＮＴＰに
よる更なるＭｎ^２＋の結合を補うため、使用可能なＭｎ
^２＋濃度範囲を増大するビシン／ＫＯＡｃ緩衝溶液は、
所定のＭＮ^２＋濃度において使用されるｄＮＴＰの増大
した濃度を許容する。ビシン／ＫＯＡｃ緩衝溶液は、全
ｄＮＴＰ濃度の増大を許容するのみならず、ＲＴ／ＰＣ
Ｒに際して使用されるｄＵＴＰのより高い相対濃度も許
容し、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼによる逆転写工程に
おけるｄＵＴＰの取り込み水準を増大させる。このこと
は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようにアデニン
残基の割合が大きいＲＮＡ標的において特に有利であ
る。

【００９３】本発明のビシンおよびトリシン緩衝溶液の
更なる優位点は、それらが滅菌方法の効率を増大するこ
とである。２価金属陽イオンおよび高いイオン強度はＵ
ＮＧを阻害することが知られている（ここに参考として
取り入れるＬｉｎｄａｈｌら、１９７７，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２５２（１０）：３２８６−３２９４、
ＫｒｏｋａｎおよびＷｉｔｔｅｒ，１９８１，Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１１）：２５９９−２６
１３、ならびにＣａｒａｄｏｎｎａおよびＣｈｅｎｇ，
１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（６）：２
２９３−２３００）。好適な緩衝剤は、遊離の金属イオ
ン濃度および全イオン強度の両者を低減し、これによっ
て、ＵＮＧに対する緩衝剤の阻害効果を最小化し、かつ
反応混合物の滅菌効率を改善する。

【００９４】金属イオン触媒によるＲＮＡテンプレート
の加水分解は、ＲＴ反応の効率を低減し、逆転写されう
るテンプレートの長さを制限する。テンプレート加水分
解の問題は、本願方法のＲＴ工程での高温度により悪化
される。ＲＮＡテンプレートの加水分解を最小化するト
リス緩衝溶液中のＭｎＣｌ_２を使用する方法および反応
条件は、例において与えられ、またここに参考として取
り入れるＭｙｅｒｓおよびＧｅｆａｎｄ，１９９１，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：７６６１−７６６６に
議論されている。好適なビシン／ＫＯＡｃ緩衝溶液は、
マンガンと錯体形成し、より少量の金属触媒ＲＮＡ加水
分解が、昇温下で起こるにすぎない。更に、これらの緩
衝溶液を使用した場合には、ＲＮＡの１５秒間、９５℃
でのプレインキュベーションを含んで全長の標識ＲＮＡ
の付加的損失はあってもほとんど起こらない。該好適緩
衝溶液は、ＲＴ工程における効率増大のための逆転写反
応時間の増大を許容し、また逆転写に先行して高度の２
次構造を開放すべくＲＮＡを変性するための、あるいは
二重鎖ＲＮＡが増幅されるべき場合に、逆転写のために
単鎖テンプレートを与えるべくテンプレートを変性する
ための高温でのプレインキュベーションを含むことを許
容する。更に、低減されたＲＮＡ加水分解は、ＲＮＡテ
ンプレートが逆転写の完了前に分解される機会を減少さ
せ、これによってＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを使用する
長い（＞２ｋｂ）ｃＤＮＡの合成を容易にする。

【００９５】本願方法は、試料中にＲＮＡが存在するこ
とのみを必要とする。例においては、バクテリオファー
ジＴ７プロモータを含むプラスミドを使用して調製され
た合成ＲＮＡが、本発明の方法によって逆転写され、増
幅される。他の例において、全細胞ＲＮＡの異種的群
が、特定のｍＲＮＡの逆転写および増幅のために使用さ
れる。本発明の実施のためには、試料中に存在するＲＮ
Ａの量は、一般的に０．１ｐｇ〜１μｇの範囲内であ
る。必要量および結果は、試料ＲＮＡの複雑さ、および
使用する検出の形式に依存して変化するであろう。高温
度逆転写反応の特異性故に、標的ＲＮＡ分子１〜１０^８
個が、マイクログラム量またはそれ以上のＰＣＲ生成物
を与えるために充分である。いくつかの開示する例にお
いて、増幅生成物は、５％の全反応混合物のゲル電気泳
動後、エチジウムブロマイド染色によって可視化され
た。従って、必要とされる増幅標的の量は、生成物の別
のアッセイ手段が使用される場合に実質的に低減され
る。例えば、電気泳動されたＰＣＲ生成物の検出に好適
な同位体標識ＤＮＡプローブは、検出感度を増大し、従
って、増幅生成物の検出に必要な増幅量またはサイクル
数を減少する（例えば試料中に標的ＲＮＡを１〜１０^８
分子）。

【００９６】好ましくは、２０μｌの１０ｍＭトリス−
ＨＣｌ逆転写反応物中に存在するＲＮＡの量は、１０ｐ
ｇ〜５００ｎｇであり、最も好ましくは、０．１〜３０
０ｎｇである。試料が３００ｎｇ以上のＲＮＡを含む場
合には、ＲＮＡテンプレートからの全長ｃＤＮＡ生成物
の転写を確実に行うため、付加的な酵素を含むことが好
ましいであろう。しかしながら、逆転写反応がＰＣＲと
結合される場合には、ＰＣＲ反応における高い酵素濃度
の効果が考慮されなければならない。例えば、ＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼが熱活性ポリメラーゼとして使用され
る場合には、高い酵素濃度は、非特異的ＰＣＲ生成物お
よび低減した収率をもたらしうる（ここに参考として取
り入れる「ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｅｒｌｉｃ
ｈ編、１９８９，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ ＰｒｅｓｓのＳａ
ｉｋｉ参照）。高い酵素濃度から生じうる問題は、逆転
写反応と増幅反応との間で熱活性ＤＮＡポリメラーゼを
不活性化することにより容易に回避される。不活性化
は、ｃＤＮＡ合成反応混合物を９９℃にて３〜１０分間
インキュベートすることにより達成される。次いで適切
な量の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを反応混合物中に添
加し、通常通りＰＣＲを行う。この方法は、２つの反応
のそれぞれについて異なる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
が使用される場合にも好適である（ＷＯ９１／０９９４
４の例ＶＩＩ参照）。

【００９７】ここに記述されるビシン緩衝溶液の優位点
は、より大量のＲＮＡが、逆転写反応物中に存在しうる
ことである。ビシン緩衝溶液およびｄＴＴＰを使用する
場合に、５０μｌの反応物に対して、好ましいＲＮＡの
量は、１μｇまでである。好ましい範囲において、１〜
１０単位の熱活性ＤＮＡポリメラーゼが、完全長ｃＤＮ
Ａ生成物を与えるためには十分である。完全長ｃＤＮＡ
を優勢に得るために、テンプレートに対する酵素の比
は、好ましくは０．５より大である。

【００９８】 ，ＴｔｈまたはＴａ
ｑＤＮＡポリメラーゼを使用するＲＴ／ＰＣＲ法の優位
点は、効率的逆転写および増幅のためにＤＮＡポリメラ
ーゼのより低いモル濃度が必要とされることである。例
えば、各単位の活性は１．０ＰｍｏｌｅのＥ．Ｃｏｌｉ
ＤＮＡポリメラーゼを要求するが、これに対し、僅かに
０．０４３ｐｍｏｌｅのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ま
たは約２０〜２５倍少量のタンパク質を必要とするのみ
である。例３は、約１５ｎＭのＤＮＡポリメラーゼ濃度
に対応する２０μｌの反応物中で５単位のＴｔｈＤＮＡ
ポリメラーゼを使用する均質ＲＴ／ＰＣＲを記述してい
る。好ましいビシンおよびトリシン緩衝溶液を使用し
て、ＤＮＡポリメラーゼの量は、更に低減されうる。例
８、１０および１２は、約６ｎＭのＤＮＡポリメラーゼ
濃度に対応する１００μｌの反応物中で１０単位のｒＴ
ｔｈＤＮＡポリメラーゼを使用する均質ＲＴ／ＰＣＲを
記述している。更にここに記述される１酵素ＲＴ／ＰＣ
Ｒは、３ＳＲ等の多酵素増幅系に比べて、かなり少量の
全タンパク質が反応物中に必要となる（前出のＫｗｏｈ
ら、前出のＧｕａｔｅｌｌｉおよびＰＣＴ特許公開ＷＯ
９２／０８８０Ａ）。４０ｎｇ（１０単位）のｒＴｔｈ
ＤＮＡポリメラーゼを含む１００μｌのＲＴ／ＰＣＲ反
応が例示されているが、これに対して１００μｌの３Ｓ
Ｒ反応は、１．４４μｇの酵素（０．６μｇのＡＭＶ−
ＲＴ、０．８３μｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、および
０．０１μｇのＥ．ｃｏｌｉＲＮａｓｅＨ）を含み、あ
るいは３６倍多いタンパク質を含む。均質ＲＴ／ＰＣＲ
における全タンパク質量の低減および１酵素のみの使用
は、試薬製造および品質管理の問題をかなり単純化す
る。

【００９９】一旦ＲＮＡを含む試料が調製され、適当な
プライマーおよび塩類が添加されると、該反応物は、熱
活性ＤＮＡポリメラーゼと共に１−６０分間インキュベ
ートされる。しかしながら、通常２〜３０分間の反応時
間が好適である。標的分子が長い場合、または標的ＲＮ
Ａに対する全ＲＮＡの比が高い場合、例えば、１００コ
ピーの標的ＲＮＡが２５０ｎｇの全ＲＮＡ中に存在する
場合には、１０−３０分間のインキュベーション時間が
好ましい。

【０１００】プライマーおよびＲＮＡテンプレートの両
者を逆転写反応混合物に添加した後に、熱活性ＤＮＡポ
リメラーゼを添加することが必須ではないが好ましい。
別法として、例えば酵素およびプライマーを最後に添加
するか、あるいはＭｎＣｌ_２またはテンプレートおよび
ＭｎＣｌ_２が最後に添加される。一般的に、ポリマー化
活性に必須の少なくとも１成分は、プライマーおよびテ
ンプレートが共に存在し、酵素が所望のプライマー／テ
ンプレート基質に結合し、伸長しうる時点まで存在させ
ないことが好ましい（ここに参考として取り入れるヨー
ロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−５１５，５０６）。

【０１０１】本発明方法の実施において、反応混合物は
４０℃より高温度、好ましくは５５−７５℃にてインキ
ュベートされる。この温度にて、プライマー−テンプレ
ートアニール化の特異性は、底温度でのアニール化特異
性よりも向上し、また熱活性酵素は、昇温下でより高い
活性を有する。上昇された温度は、分解された元々の核
酸による、および誤ったプライマー−テンプレートハイ
ブリッド形成による非特異的プライミングを減少させ
る。

【０１０２】逆転写に引き続いて、ＲＮＡテンプレート
は分解されるが、別法として変性されて過剰の単鎖ＤＮ
Ａ分子を生じる連続転写のためのテンプレートを提供す
る。この過剰の単鎖ＤＮＡは、標準的プローブハイブリ
ッド技術により検出可能である。従って、本発明は、標
的分節の直接検出法を提供する。得られた核酸生成物
は、種々の電気泳動的またはクロマト的手段により検出
可能である。放射標識三リン酸塩の使用は、反応の程度
および形成される生成物の大きさを監視するために有用
であるが、このことは本発明の要素として本質的ではな
い。

【０１０３】逆転写反応生成物は、ＰＣＲによる増幅の
ためのテンプレートとして好適である。本発明の一実施
態様において、高温度逆転写インキュベーションに続い
て、該逆転写反応物はＰＣＲ緩衝条件に調節され、増幅
反応が第２のプライマーの添加に続いて開始される。Ｐ
ＣＲ緩衝溶液は、適切な緩衝能力、ｐＨ、１価陽イオン
濃度を維持し、酵素濃度およびｄＮＴＰを各ｄＮＴＰが
２０−２００μＭの範囲となるように希釈すべく添加さ
れる。ＭｇＣｌ_２は１−３ｍＭの最終濃度に添加され
る。好ましくは、ｄＮＴＰの濃度は逆転写およびＰＣＲ
反応の両者について平衡する。Ｍｎ^２＋は高濃度で存在
する場合にＰＣＲ増幅を損なうため、本発明の好ましい
実施態様においてはＭｎ^２＋はＰＣＲ増幅に先立ってキ
レート化される。高濃度のＭｎ^２＋の存在は、増幅に際
しての正確さをも低減するが、Ｍｎ^２＋のキレート化は
この問題をも回避する。従って、好ましい実施態様にお
いては、逆転写反応に次いでＭｎ^２＋をキレート化する
ためにＭｎ^２＋のモル濃度の１−３倍の濃度でＥＧＴＡ
が添加される。Ｍｇ^２＋およびＭｎ^２＋の存在下におい
て、ＥＧＴＡは優先的にＭｎ^２＋に結合する。ここに記
述されるように、低いｄＮＴＰおよびＭｇ^２＋は、増幅
に際してＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの信頼性を増大す
る。酵素の安定性を増すために、グリセロールおよび非
イオン性洗浄剤（例えばＴｗｅｅｎ−２０）を、それぞ
れ最終濃度１−２０％、および０．０１−０．０５％ま
で添加してもよい。

【０１０４】別の好ましい実施態様において、ＰＣＲに
先行してＭｎ^２＋はキレート化されなぃ。上述したよう
にＭｇ^２＋が好ましいが、ＰＣＲはＭｇ^２＋に代えてＭ
ｎ^２＋を使用しうる。特に、例えば大規模な診断的スク
リーニングへの応用について、増幅に際しての信頼性お
よび起こリうるテンプレートの加水分解の低い水準等の
リスクは、均質ＲＴ／ＰＣＲ法が提供する絶大な優位点
から見て容易に耐えうる。２工程単一添加方法は、試料
処理を最小化し、交差夾雑の可能性を低減する。ＭｎＣ
ｌ_２は、ＰＣＲ効率に影響するため、至適濃度は使用さ
れる特定の反応成分：プライマー、標的濃度、ｄＮＴＰ
濃度、緩衝溶液、塩類等について標準法により滴定する
ことが好ましい。本発明の好ましい実施態様において、
Ｍｎ（ＯＡｃ）_２を含むビシン／ＫＯＡｃ緩衝溶液が使
用され、これは広範囲のＭｎ^２＋およびｄＮＴＰ濃度を
許容する。

【０１０５】ここに提供される方法は、特に分子生物学
および医療診断の分野で多くの応用を有する。記述され
る逆転写酵素活性は、ＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡ
転写物を与える。ＲＮＡ分子からのＤＮＡ分節の調製お
よび増幅方法は、ＲＮＡ分子が全ＲＮＡ母集団の一員で
ある場合、または生物学的試料中に少量存在する場合に
好適である。試料中に存在する特定のＲＮＡ分子の検出
は、ここに記述される方法において使用される熱活性ま
たは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによってかなり容易と
される。特異性の絶大なる向上は、希少な標的を検出す
るための「帰巣ＰＣＲ」の必要性を取り除く。特定のＲ
ＮＡ分子、またはＲＮＡ分子の全母集団が、ここに記述
されるように熱活性または熱安定性酵素を使用して増幅
され、定量され、単離され、また所望によりクローン化
され、配列決定される。

【０１０６】本発明の方法および組成物は、ＲＮＡをＤ
ＮＡ生成物に逆転写する従来方法に対して大いなる改良
である。ＲＮＡテンプレートから出発した場合、これら
の方法は向上した特異性を有し、ＰＣＲ増幅のためのテ
ンプレートを従来利用可能であった方法より効率的に提
供する。本発明は、感染症、遺伝子疾患または細胞性疾
患等に伴う特定のリボ核酸配列を検出し、または特徴づ
けるためのより特異的な、従ってより正確な手段を提供
する。

【０１０７】当業者は本発明の組成物がキット中に組み
入れ得ることを認識するであろう。而して本発明は、水
素緩衝作用および好ましくは２価陽イオン濃度の緩衝を
も与える両イオン性化合物である好適な緩衝剤を含む緩
衝溶液、および熱活性ＤＮＡポリメラーゼを、好ましく
はＲＮＡの逆転写のための使用方法を記述した指示書と
共に含むキットに関する。一実施態様において、そのよ
うなキットは試料中の少なくとも１つの特定の標的ＲＮ
Ａ配列の検出に関するものであり得る。そのようなキッ
トは、上述の要素に加えて、特定の標的ＲＮＡ配列に対
しハイブリダイズするに充分に相補的な配列を含むプラ
イマーを含んでなる。試料中の少なくとも１つの特定Ｒ
ＮＡ配列の増幅および検出のための診断キットは、第２
のｃＤＮＡ鎖合成を開始させるために合成されるｃＤＮ
Ａの第１鎖に対してハイブリッドするに充分な程度にＲ
ＮＡ標的と同等である配列を有するプライマーを含んで
よい。キットは、上述の成分に加えて、４種のデオキシ
リボヌクレオチド三リン酸、ここに記述される適当な緩
衝剤、オリゴ（ｄＴ）、ＲＮａｓｅＨ、クローニングの
ためのリンカー、ならびに１種以上の制限酵素を含んで
もよい。

【０１０８】例示のために提供される以下の例は、本願
に開示される発明をなんら制限して解釈されることを意
図するものではない。これらの例において使用される材
料および方法の更なる詳細は、ＷＯ９１／０９９４４に
見いだされるであろう。特に、ＷＯ９１／０９９４４
は、合成テンプレートｐＡＷ１０６ならびにプライマー
ＤＭ１５６（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９）、ＤＭ１５１
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０）、ＤＭ１５２（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．１１）、ＴＭ０１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
１２）の詳細な情報を提供し、ここにおいてこれらのプ
ライマーの配列は以下の通りである：

【０１０９】

【０１１０】例１ 結合ＲＴ／ＰＣＲ反応におけるＴａｑポリメラーゼとＴ
ｔｈポリメラーゼとの比較

【０１１１】ＷＯ９１／０９９４４の例ＶＩＩに記載の
ｃＲＮＡ標準の使用は、反応混合物中に存在する標的分
子の数が既知であるため、ＲＴ／ＰＣＲ効率についての
実験条件の効果の直接分析に便利である。特に、結合Ｒ
Ｔ／ＰＣＲにおけるＴｔｈおよびＴａｑポリメラーゼの
効率を比較した。

【０１１２】ＲＴ反応物（２０μｌ）は、１０ｍＭのト
リス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３；９０ｍＭのＫＣｌ（Ｔａｑ
を含む反応物については４０ｍＭ）；１．０ｍＭのＭｎ
Ｃｌ_２；各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、およびｄＴＴＰ；１５ｐｍｏｌｅのＤＭ１５２（Ｓ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１）および５単位のＴｔｈまたは
ＴａｑポリメラーゼならびにｐＡＷ１０９ｃＲＮＡの１
０^６、１０^５または１０^４コピーを含む。６個の反応物
に７５μｌの鉱油を被せ、７０℃にて１５分間インキュ
ベートした。

【０１１３】逆転写反応に続いて、１０ｍＭのトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１００ｍＭのＫＣｌ（Ｔａｑを
含む反応物には５０ｍＭ）、１．８８ｍＭのＭｇＣ
ｌ_２、０．７５ｍＭのＥＧＴＡ、５％グリセロール［ｖ
／ｖ］、および１５ｐｍｏｌのプライマーＤＭ１５２を
含む８０μｌの溶液を添加した。次いで、試料（１００
μｌ）をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，
ＣＴのサーマルサイクラにて以下のように増幅した：１
サイクルについて９５℃にて２分間；９５にて１分間お
よび６０℃にて１分間を３５サイクル；ならびに６０℃
にて７分間を１サイクル。ＰＣＲ増幅物の分別量（５μ
ｌ）を、エチジウムブロマイドにより染色される２％
（ｗ／ｖ）ＮｕＳｉｅｖｅ（登録商標）１％（ｗ／ｖ）
Ｓｅａｋｅｍ（登録商標）アガロース上の電気泳動にて
分析した。

【０１１４】結果 ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼは、標的ｃＲＮＡの１０^４
コピーから出発してエチジウムブロマイド染色ゲル電気
泳動にて見える３０８ｂｐ生成物を生じた。Ｔａｑポリ
メラーゼについては、標的の１０^４および１０^５コピー
では生成物が観察されなかったが、エチジウムブロマイ
ド染色でなくしてハイブリッド技術を使用すれば、より
低い検出限界が予想された。これらの結果は、同様な反
応条件下での結合逆転写ＰＣＲ増幅においては、Ｔｔｈ
ＤＮＡポリメラーゼが類似するＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼよりも約１００倍高感度を与えることを示している。

【０１１５】例２ 好ましい非均質逆転写／ＰＣＲプロトコール Ａ．逆転写反応

【０１１６】０．５ｍｌのマイクロ遠心チューブに、
９．４μｌの滅菌蒸留水；２μｌの１０ＸｒＴｔｈＲＴ
緩衝溶液；２μｌのＭｎＣｌ_２（１０ｍＭ）；それぞれ
０．４μｌのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣ
ＴＰ（それぞれ１０ｍＭ）；２μｌのｒＴｔｈＤＮＡポ
リメラーゼ、２．５Ｕ／μｌ；１μｌのプライマーＤＭ
１５２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１）（１５μＭ）（ま
たは別法として下流側プライマー）；ならびに２μｌの
正の対照ＲＮＡまたは２５０ｎｇ以下の全ＲＮＡを含む
実験試料をあわせる。

【０１１７】この実施態様において、正の対照ＲＮＡ
は、ＤＭ１５２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１）のテンプ
レートとして作用する。対照ＲＮＡ濃度は、好ましくは
〜１０^４コピー／２０μｌである。例えば対照ＲＮＡ
は、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１ｍＭの
ＥＤＴＡおよび１０ｍＭのＮａＣｌ中の３０μｌ／ｍｌ
のＥ．ｃｏｌｉｒＲＮＡに含まれるｐＡＷ１０９からの
転写物であってよい。

【０１１８】全逆転写反応物の体積は試料あたり２０μ
ｌであるべきであった。蒸発または環流を低減するため
に、混合物を５０−１００μｌの鉱油で覆った。Ｐｅｒ
ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴのサーマル
サイクラ内のチューブをソークファイルを使用して７０
℃にて５−１５分間インキュベートした。該チューブを
氷上に置いて必要となるまで反応を停止した。

【０１１９】Ｂ．ＰＣＲ反応 各試料について、最小８０μｌのＰＣＲマスターミクス
を次の通り調製する：８μｌの１０Ｘキレート緩衝溶
液；６−１０μｌの２５ｍＭＭｇＣｌ_２；１μｌのプラ
イマーＤＭ１５１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０）（１５
μＭ）または実験的上流側プライマーならびに滅菌蒸留
水。水、ＭｇＣｌ_２および上流側プライマーの体積の任
意の組み合わせが、マスターミクスの全体積が試料あた
り８０μｌである限り使用できる。

【０１２０】至適ＭｇＣｌ_２濃度は、全ｄＮＴＰ濃度、
ならびに使用するプライマーおよびテンプレートに依存
して変化しうる。ほとんどの場合において、反応混合物
中の１．５−２．５ｍＭの範囲のＭｇＣｌ_２最終濃度
は、良好な結果を与えるであろう。使用されるテンプレ
ートが正の対照ｐＡＷ１０９ＲＮＡである場合に、６μ
ｌの２５ｍＭＭｇＣｌ_２保存溶液が、最終１．５ｍＭＭ
ｇＣｌ_２濃度のために好ましい。

【０１２１】８０μｌのＰＣＲマスターミクスを各逆転
写反応チューブ内に調合する。試料の持ち越しを避ける
ために添加の間にピペットチップを交換する。チューブ
をマイクロ遠心機にて〜３０秒間遠心する。

【０１２２】ｐＡＷ１０９ＲＮＡ正対照の増幅のため
に、サーマルサイクラ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｎｏ
ｒｗａｌｋ，ＣＴ）を次のように４つの結合ファイルに
ついてプログラムした： ステップサイクル：９５℃にて２分間を１サイクル ステップサイクル：９５℃にて１分間および６０℃にて
１分間を３５サイクル ステップサイクル：６０℃にて７分間を１サイクル ソーク： ４℃ ＰＣＲ増幅試料は、次の分析まで冷凍保存可能である。

【０１２３】アニール−伸長温度のための６０℃の選択
は、正の対照ｃＤＮＡ増幅のために最適である。他のプ
ライマー−テンプレート対については、アニール−伸長
温度を低下または上昇させる必要があるであろう。より
高いアニール−伸長温度は、一般に改善された生成物特
異性を与えるであろう（ここに参考として取り入れるＳ
ａｉｋｉらの、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４
８７−４９１参照）。至適条件は、最大の特異性および
生成物の収率に達するまで５℃またはそれ以下の増加量
毎に試験することによって経験的に決定することができ
る。

【０１２４】ＰＣＲ増幅のための至適塩化マグネシウム
濃度は、各プライマーの組について１．５から２．５ｍ
Ｍまでの濃度を試験することによって、経験的に決定す
ることができる。過少量のまたは過大量の塩化マグネシ
ウムは、増幅効率に影響するであろう。塩化マグネシウ
ム濃度を試料ＲＮＡ、ｄＮＴＰ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡ
濃度の実質的変化と並行して調製することが好ましい。

【０１２５】多量の２次構造を含むことが既知であるテ
ンプレートについては、“ホットスタート”プロトコー
ルが好ましいであろう。逆転写反応のために２種の反応
混合物が調製される。ミクスＡ：９．４μｌの滅菌蒸留
水；２μｌの１０ＸｒＴｔｈ逆転写緩衝溶液；１μｌの
“下流側プライマー”；２μｌの試料ＲＮＡ（＜２５０
ｎｇの全ＲＮＡ）。ミクスＢ：２μｌの１０ｍＭＭｎＣ
ｌ_２溶液；０．４μｌｄＧＴＰ；０．４μｌのｄＡＴ
Ｐ；０．４μｌのｄＣＴＰ；０．４μｌのｄＴＴＰ（各
々１０ｍＭ）；２μｌのｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ。

【０１２６】両反応混合物を室温にて調製する。ミクス
Ａを７０℃にて５分間インキュベートし、反応ミクスＢ
を添加し（ミクスＡを７０℃に保ったまま）、７０℃に
て５−１５分間、上記“逆転写反応”の節に記載される
ようにインキュベートする。上記のようにＰＣＲ反応を
行う。

【０１２７】Ｃ．試薬 好ましいプロトコールは、以下の試薬を使用する。 ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ ２．５単位／μｌ プライマーＤＭ１５２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１） １５μＭ プライマーＤＭ１５１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０） １５μＭ 正の対照ＲＮＡ ５ｘ１０^３コピー／μｌ ｄＡＴＰ １０ｍＭ ｄＧＴＰ １０ｍＭ ｄＣＴＰ １０ｍＭ ｄＴＴＰ １０ｍＭ １０ｘｒＴｔｈ逆転写ＲＴ緩衝溶液 １００ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．３，９００ｍＭＫＣｌ １０ｘキレート緩衝溶液 ５０％グリセロール（ｖ／ｖ） １００ｍＭトリス−ＨＣｌ， ｐＨ８．３，１ＭＫＣｌ ７．５ｍＭＥＧＴＡ， ０．５％Ｔｗｅｅｎ２０ ＭｎＣｌ_２溶液 １０ｍＭ ＭｇＣｌ_２溶液 ２５ｍＭ

【０１２８】これらの成分は、高温度逆転写用キットと
して組み合わされてもよい。該キットの変形は、開示さ
れる発明の範囲内である。例えば、ＭｎＣｌ_２は、逆転
写反応緩衝溶液に含まれてもよく、またＭｇＣｌ_２は、
キレート緩衝溶液に含まれてもよい。しかしながら、反
応の至適化のためには、ＭｎＣｌ_２およびＭｇＣｌ
_２は、別個の試薬として提供される。正の対照の使用
は、必須ではないが発明の商業的態様として好ましい。

【０１２９】例３ 均質ＲＴ／ＰＣＲアッセイ この方法は、２工程単一添加逆転写／ＰＣＲ増幅反応の
方法を提供する。ＴＣ９６００サーマルサイクラ（Ｐｅ
ｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を使用
し、装置を起動し、反応混合物調製前にカバーを余熱し
た。反応を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌ
ｋ，ＣＴから商業的に入手可能な０．２ｍｌＭｉｃｒｏ
Ａｍｐ（登録商標）チューブ内で行った。各反応物は、
６．４μｌの滅菌蒸留水；２μｌの１０ｘＲＴ緩衝溶液
（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，９００ｍＭ
ＫＣｌ）；１．６μｌの１０ｍＭＭｎＣｌ_２；２μｌの
１０ｘｄＮＴＰ−Ｔ（Ｈ_２ＯｐＨ７．０中、ｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ各２ｍＭ）；２μｌの２ｍＭｄＴＴ
Ｐ；１μｌのプライマーＤＭ１５２（ＳＥＱ ＩＤＮ
ｏ．１１）（１５μＭ）；１μｌのプライマーＤＭ１５
１（１５μＭ）；および２μｌのｒＴｔｈＤＮＡポリメ
ラーゼ（２．５単位／μｌ）を含む。２０ｘ反応混合物
を調製し（全体積３６０μｌ）、１８μｌの混合物を、
下記テンプレートを含む１６本のチューブに分取した。
使用したテンプレートは、ＡＷ１０９ｃＲＮＡである。
チューブ番号１−３および９−１１のそれぞれは、２μ
ｌ中に１０^４コピーのテンプレートを含んでいた。チュ
ーブ番号４−６および１２−１４のそれぞれは、２μｌ
中に１０^２コピーを含んでいた。チューブ番号７、８、
１５および１６は、負の対照として２μｌの３０ｎｇ／
μｌｒＲＮＡのみを含んでいた。

【０１３０】チューブ番号１−８は、−ＲＴ対照として
ＲＴ反応の間氷上に維持した。チューブ番号９−１６
を、ＴＣ９６００サーマルサイクラ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）に設置し、７０℃に
て１５分間の１サイクルについて加熱し、次いで９５℃
に加熱し、この間にチューブ番号１−８をＰＣＲ工程の
ためにサーマルサイクラに設置した。すべてのチューブ
を以下のサイクルにかけた： ７５秒間９５℃にて１サイクル ３０秒間９５℃、２０秒間６０℃にて３５サイクル ２分間６０℃にて１サイクル

【０１３１】結果 次いで各反応物５μｌを、２％ＮｕＳｉｅｖｅ１％アガ
ロースゲル上で分析し、エチジウムブロマイドにて染色
し、写真を撮った。予想される大きさの生成物は、−Ｒ
Ｔ対照（チューブ番号１−８）または“負の標的対照”
（チューブ番号１５および１６）では見られなかった。
予想される大きさの生成物は、レーン９−１１（１０^４
コピーの標的）では容易に見られ、また予想通りより低
い強度ではあるがレーン１２−１４（１０^２コピーの標
的）にも存在した。

【０１３２】例４ 高温逆転写および増幅におけるＰＣＲ持ち越し防止とし
てのｄＵＴＰおよびウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（Ｕ
ＮＧ）の使用 この例は、持ち越し夾雑を最小化するための非慣用ヌク
レオチドの取り込みを例示する。反応混合物を、同じ非
慣用ヌクレオチドを含む先行するアッセイからの夾雑生
成物を分解するために、逆転写に先行してＵＮＧにて処
理した。ＵＮＧ処理は次の通りである：２０μｌのＲＴ
反応あたり、０．５単位のＵＮＧ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−
Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．により開発製造され、Ｐｅ
ｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴから商業的
に入手できる）。該反応物を室温にて１０分間インキュ
ベートし、次いで７０℃にて１５分間加熱してグリコシ
ラーゼを不活性化し、逆転写を可能とした。該実験は、
示された特定の標的、プライマー、および反応条件に対
する至適濃度の決定のためのＭｎＣｌ_２濃度の測定も例
示する。ｃＤＮＡは、次いでＰＣＲにより増幅された。

【０１３３】８ｘＲＴ反応混合物を、以下を含んで調製
した：４８μｌの滅菌ＤＥＰＣ処理蒸留水；１６μｌの
１０ｘＲＴ緩衝溶液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
８．３；９００ｍＭＫＣｌ）；それぞれ２ｍＭのｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰを含む１６μｌ
のｄＮＴＰ混合物；１６μｌづつの、ＤＭ１５２（ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．１１）（１．５μＭ）およびＤＭ１５
１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０）（１．５μＭ）；１６
μｌのＡＷ１０９ｃＲＮＡテンプレート（５ｘ１０^３コ
ピー／μｌ）；ならびに１６μｌのｒＴｔｈＤＮＡポリ
メラーゼ（２．５単位／μｌ）。最終体積は、１４４μ
ｌであった（１８μｌ／反応）。７ｘＰＣＲマスターミ
クスを、以下を含んで調製した：２９７μｌの滅菌ＤＥ
ＰＣ処理蒸留水；５６μｌの１０ｘＰＣＲ緩衝溶液（１
００ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．３；１ＭＫＣｌ；
７．５ｍＭＥＧＴＡ；５０％グリセロール［ｖ／
ｖ］）；１４０μｌの１０ｍＭＭｇＣｌ_２；それぞれ２
ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰを
含む５６μｌのｄＮＴＰ混合物；それぞれ５．６μｌづ
つの、ＤＭ１５２およびＤＭ１５１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．１１および１０）（１５μＭ）。最終体積は５６０
μｌであった。反応あたり８０μｌ。

【０１３４】１８μｌのＲＴ混合物を６本の滅菌マイク
ロ遠心チューブに分取し、２μｌのＭｎＣｌ_２を、次の
最終ＭｎＣｌ_２濃度となるように添加した：チューブ番
号１および２（１．２ｍＭのＭｎＣｌ_２）；チューブ番
号３および４（１．０ｍＭのＭｎＣｌ_２）；チューブ番
号５および６（０．８ｍＭのＭｎＣｌ_２）。各チューブ
に鉱油のオーバーレイ（７５μｌ）を加え、該反応物を
水浴中で７０℃にて１５分間インキュベートした。７０
℃でのインキュベーションに次いで、それぞれに８０μ
ｌのＰＣＲマスターミクスを添加した。反応チューブを
次の熱サイクルにかけた：９５℃にて２分間を１サイク
ル；９５℃にて１分間および６０℃にて１分間を３５サ
イクル；６０℃にて７分間を１サイクル；および４℃に
浸す。

【０１３５】結果 各反応混合物の５μｌを２％ＮｕＳｉｅｖｅ１％アガロ
ースゲル上で電気泳動にかけた。ゲルを染色し、写真を
撮った。予想される大きさのＰＣＲ生成物が、３種すべ
てのＭｎＣｌ_２濃度の試料にて明確に見られた。生成物
の収率は、ＭｎＣｌ_２濃度の上昇と共に増大した。

【０１３６】例５ 均質ＲＴ／ＰＣＲアッセイの滅菌方法 この例は、先行する反応において生じた核酸により夾雑
する均質ＲＴ／ＰＣＲ反応物の滅菌方法を例示する。反
応混合物は、逆転写の前にＵＮＧにて処理された。

【０１３７】非慣用ヌクレオチドｄＵＴＰをＲＴ／ＰＣ
Ｒ反応の間に取り込んだ。続いて、引き続く反応物中に
夾雑物として存在するいずれの生成物ＤＮＡも、ＵＮＧ
を使用して加水分解されうる。

【０１３８】０．２ｍｌのＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商
標）チューブに、５．５μｌの滅菌蒸留水；２μｌの１
０ｘＲＴ緩衝溶液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ
８．３；９００ｍＭＫＣｌ）；２μｌの８ｍＭＭｎＣｌ
_２；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＵＴＰを
それぞれ２ｍＭ含む２μｌのｄＮＴＰ混合物；２μｌの
ＤＭ１５２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１）（１．５μ
Ｍ）およびＤＭ１５１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０）
（１．５μＭ）；２μ１のＡＷ１０９ｃＲＮＡテンプレ
ート（５ｘ１０３コピー／μｌ）；０．５μｌのＵＮＧ
（１単位／μｌ）；および２μｌのｒＴｔｈ（２．５単
位／μｌ）をあわせた。該反応物を室温にて１０分間イ
ンキュベートし、次いで７０℃にて１５分間加熱して、
逆転写に先立ってグリコシラーゼを不活性化した。次い
でｃＤＮＡをＰＣＲにて増幅した。

【０１３９】この例において、正の対照ＲＮＡは、ＤＭ
１５２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１）のためのテンプレ
ートとして作用し、またＤＭ１５１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．１０）は上流側プライマーである。全反応体積は、
２０μｌ／試料である。チューブをサーマルサイクラ
（例えばＴＣ９６００サーマルサイクラ［Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ］）にて以下のよう
にインキュベートした： ７０℃にて１５分間を１サイクル ９５℃にて１５秒間および６０℃にて２０秒間を２サイ
クル ９０℃にて１５秒間および６０℃にて２０秒間を３３サ
イクル ６０℃にて４分間を１サイクル 至適マンガン濃度は、特定の試料、標的、プライマー、
反応混合物中のｄＮＴＰ濃度等に依存して変化しうる。

【０１４０】例６ 付加的テンプレート核酸 付加的ＲＮＡおよびＤＮＡテンプレートを使用する実験
を、以下の例に記述する。 Ｉ．ｐＴＭ３ プラスミドｐＴＭ３は、約７００ヌクレオチドのｐＡＷ
１０９ＤＮＡを伴う７８２１濡暮れを地度の環状単鎖Ｄ
ＮＡである。これは、ｐＡＷ１０９ｃＲＮＡと同じ配列
およびプライマー結合部位を有するＤＮＡテンプレート
を与える。プライマーＭＴ２４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
１３）を使用して転写すると、最初の２５３ヌクレオチ
ドは、ｐＡＷ１０９ｃＲＮＡと同じである。その領域を
越えると、ＤＮＡはＧ＋Ｃリッチになり、ＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼの遺伝子を含むＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａ
ｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡを含有する。ｐＴＭ３プラスミ
ドは、この分野で周知の技術を使用する以下のプロトコ
ールを用いて構築された（ここに参考として取り入れる
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）。

【０１４１】挿入物を、上述のｐＡＷ１０９ＤＮＡをＢ
ａｍＨＩにて線状化することにより調製した。リンカー
アダプタＭＴ２０（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４）および
ＭＴ２１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５）を、線形化ｐＡ
Ｗ１ｇ９ＤＮＡにアニール化し、連結した。これらのリ
ンカーは、ＢａｍＨＩ部位にアニール化する。該断片
を、ＥｃｏＲＩにて消化し、得られた７０６ｂｐ断片を
ゲルにて精製した。

【０１４２】発現ベクトルｐＬＳＧ１は、ここに参考と
して取り入れる米国特許４，８８９，８１８に記述され
ており、ＴａｑＤＮＡボリメラーゼをコードする遺伝子
を含んでいる。該プラスミドｐＬＳＧ１をＥｃｏＲＩを
用いて線状とし、過剰量のゲル精製した断片と混合し、
該断片に連結した。得られたプラスミドにてＤＧ９８を
形質転換し、ヘルパーファージを用いて単鎖ＤＮＡを単
離した（米国特許４，８８９，８１８および５，０７
９，３５２ならびにＬａｗｙｅｒら、１９９３の前出文
献に記述されている）。

【０１４３】上記反応において使用されたオリゴヌクレ
オチド配列は、下記に示される：

【０１４４】ＩＩ．ＨＣＶ ＨＣＶＲＮＡ転写物は、ここに参考として取り入れるＹ
ｏｕｎｇら、１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．３１：８８２−８８６に記述されているようにし
て作成された。ｃＤＮＡクローンは、それにおいてｐＨ
ＣＶ１．１Ａと命名されている。ＨＣＶテンプレートの
増幅に好適なプライマーは、ＫＹ７８（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１６：５，−ＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴ
ＣＡＧＧＣＡＧＴ−３’）およびＫＹ９０（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．１７：５’−ＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡ
ＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴ−３’）である。ＫＹ７８（ＳＥ
ＱＩＤ Ｎｏ．１６）およびＫＹ９０（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１７）は、５’末端がビオチン化されており、ま
たＫＹ８０（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７）はＫＹ９０
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７）のビオチン化されない形
態である。

【０１４５】ＩＩＩ．ＨＩＶ テンプレートはＨＩＶ−１と同じプライマー結合領域を
有して設計され、またプライマー結合部位が両端に位置
する内部領域は、同じ塩基組成を保ちながら、対応する
ＨＩＶ−１配列とは固有の配列特異性のプローブにて検
出可能とするに充分に異なるヌクレオチド配列をもって
設計される。ＨＩＶテンプレート増幅のために好適なプ
ライマーは、前述のＳＫ４３１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
６）およびＳＫ４６２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）のビ
オチン化誘導体である。

【０１４６】テンプレートは、３’末端の相補部分の８
塩基が重複する２個のオリゴヌクレオチドのアニール化
および伸長によって作成した。構成するオリゴヌクレオ
チドは、上述のオリゴヌクレオチドのいずれの合成方法
によっても合成されうる。第１のオリゴヌクレオチドＳ
Ｋ５５０（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８）は、ＳａｌＩリ
ンカーおよびＳＫ４６２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）の
プライマー結合領域を含む。第２のオリゴヌクレオチド
ＳＫ５５１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１９）は、ＳＫ４３
１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６）のプライマー結合領域を
含む。対照テンプレートの合成は、この分野で周知の方
法を使用して行われる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９
の前出文献）。

【０１４７】アニール化および伸長反応のための反応混
合物は、次の通りである： ７μｌの１０ｘポリメラーゼ緩衝溶液（１００ｍＭのト
リス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５００ｍＭの塩化ナトリウ
ム（ＮａＣｌ）、１００ｍＭの酢酸マグネシウム［Ｍｇ
（ＯＡｃ）_２］） ５０ｐｍｏｌｅのＳＫ５５０（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１
８） ５０ｐｍｏｌｅのＳＫ５５１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１
９） それぞれ１５μｌのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＴＴＰ（１０ｍＭの保存溶液） １μｌのクレナウ断片（５Ｕ） ７０μｌまでＨ_２Ｏ

【０１４８】２種のオリゴヌクレオチドを混合し、氷上
に１０分間保持して各オリゴヌクレオチドの３’末端を
アニール化させた。伸長反応を室温にて３０分間、次い
で３７℃にて１０分間行わせた。伸長に続いて、反応混
合物を７２℃に１０分間維持してポリメラーゼを不活性
化した。伸長生成物を二重配列のＳＫ５５０（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．１８）末端を切断するＳａｌＩにて消化
し、またＳＫ５５１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１９）末端
は平滑のままとした。得られた断片を、転写ベクトルｐ
ＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）
（ポリＡを伴う）のＳａｌＩおよびＳｍａＩ部位にクロ
ーン化し、プラスミドｐＮＡＳ−２を生じた。

【０１４９】単離および精製に続いて、ｐＮＡＳ−２を
ＥｃｏＲＩによる消化にて線状化し、ＳＰ６ＲＮＡポリ
メラーゼを用いてインビトロにて転写した。残渣ＤＮＡ
を除去するために、ＲＮＡをＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓ
ｅにて消化し、オリゴーｄＴカラムを通した。

【０１５０】上記反応にて使用したヌクレオチド配列
は、下記に示される：

【０１５１】例７ マンガン濃度範囲 ビシンまたはトリス緩衝溶液のいずれかにおいてＲＮＡ
およびＤＮＡテンプレートを使用する伸長反応を、各反
応における使用可能なＭｎ^２＋濃度範囲を決定するため
に行った。ＤＮＡテンプレートを用いた伸長反応、およ
びＲＮＡテンプレートを用いた伸長反応のための一連の
Ｍｎ^２＋濃度を使用した。すべての反応を、全体積２０
μｌ中において、６０℃にて１０分間行った。反応条件
は以下の通りである：

【０１５２】ＲＮＡテンプレート、ビシン緩衝溶液 ３ｘ１０^１１コピーのｐＡＷ１０９ｃＲＮＡ ０．１２５μＭのＭＴ２４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１
３） 各３００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ ５０ｍＭのビシン−ＫＯＨ（ｐＨ８．３） １００ｍＭのＫＯＡｃ（ｐＨ７．５） Ｍｎ（ＯＡｃ）_２（示される１−２０ｍＭ、１−６ｍ
Ｍ） ５ＵのｒＴｔｈ^＊ＤＮＡポリメラーゼＲＮＡテンプレート、トリス緩衝溶液 ３ｘ１０^１１コピーのｐＡＷ１０９ｃＲＮＡ ０．１２５μＭのＭＴ２４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１
３） 各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ １０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３） ９０ｍＭのＫＣｌ ＭｎＣｌ_２（０．４−２．５ｍＭ） ５ＵのｒＴｔｈ^＊ＤＮＡポリメラーゼ

【０１５３】ＤＮＡテンプレート、ビシン緩衝溶液 １．５ｘ１０^１１コピーのｐＴＭ３ｓｓＤＮＡ ０．０６２５μＭのＭＴ２４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１
３） 各３００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ ５０ｍＭのビシン−ＫＯＨ（ｐＨ８．３） １００ｍＭのＫＯＡｃ（ｐＨ７．５） Ｍｎ（ＯＡｃ）_２（１−５ｍＭ） ０．１５ＵのｒＴｔｈ^＊ＤＮＡポリメラーゼＤＮＡテンプレート、トリス緩衝溶液 １．５ｘ１０^１１コピーのｐＴＭ３ｓｓＤＮＡ ０．０６２５μＭのＭＴ２４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１
３） 各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ １０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３） ９０ｍＭのＫＣｌ ＭｎＣｌ_２（０．４−２．５ｍＭ） ５ＵのｒＴｔｈ^＊ＤＮＡポリメラーゼ^＊ Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．によ
り開発および製造され、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎ
ｏｒｗａｌｋ，ＣＴから商業的に入手可能である。

【０１５４】取り込まれたｄＮＭＰを、ここに参考とし
て取り入れる前出のＭｙｅｒｓおよびＧｅｌｆａｎｄ、
１９９１に記載されているようにアッセイした。結果を
図１に示す。取り込まれたｄＮＭＰの量は、各反応の最
大取り込み量の百分率として表されている。各反応につ
いての最大取り込み量は以下の通りである：

【０１５５】トリス緩衝溶液を使用して、ＤＮＡテンプ
レートにより至適合成を与えるマンガン濃度は、約０．
６ｍＭであることが見いだされ、またＲＮＡテンプレー
トを用いて約１．４ｍＭのマンガンで、酵素が最大逆転
写活性を持つことが見いだされた。ビシン緩衝溶液を置
換すると、各反応についての至適Ｍｎ^２＋濃度は、増加
し、かつ拡大された。ビシン緩衝溶液を使用して、ＤＮ
Ａテンプレートでの最大合成は、１．５ｍＭマンガンに
移行し、ＲＮＡテンプレートでの合成量の増大は６ｍＭ
マンガンまで見られた。ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの
ＲＮＡテンプレートに対する逆転写酵素活性およびＤＮ
Ａテンプレートに対するＤＮＡポリメラーゼ活性につい
て、Ｍｎ^２＋の至適条件は、ビシン緩衝溶液を使用した
場合にそれぞれの反応によって異なるが、均質ＲＴ／Ｐ
ＣＲについて約３．２ｍＭの単一Ｍｎ^２＋濃度は、少な
くとも上記例３に記載のトリス緩衝溶液を使用するＲＴ
／ＰＣＲ条件と同程度に有効であると思われる。しかし
ながら、各反応の使用可能なマンガン濃度範囲は、かな
り拡大される。このことは、金属緩衝剤の一般論および
文献からは二面的範囲の拡大を予想することは出来ず、
驚くべき結果である。

【０１５６】例８ ＨＩＶテンプレート、トリシンおよびビシン緩衝溶液を
使用するＲＴ／ＰＣＲ 一連のＭｎＣｌ_２濃度の力価測定を、トリシンおよびビ
シン緩衝溶液の両者においてＨＩＶテンプレートを用
い、ＲＴ／ＰＣＲにて使用した。反応は、基本的には下
記例１０に記載されているようにして１００μｌの全反
応体積にて行った。特定の反応条件は下記の通りであ
る： ２００コピーのＨＩＶｃＲＮＡ（ｐＮＡＳ−２） １μｇのポリｒＡ １３％グリセロール 各１５０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ ２００μＭのｄＵＴＰ 各０．２０μＭのＳＫ４３１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
６）、ＳＫ４６２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５） ２単位のＵＮＧ^＊ １０単位のｒＴｔｈ^＊ＤＮＡポリメラーゼ ６５ｍＭのＫＣｌ ５０ｍＭのトリシン−ＫＯＨ（ｐＨ８．３）またはビシ
ン−ＫＯＨ（ｐＨ８．３） ＭｎＣｌ_２（１．０、１．２、１．５、１．７５、２．
０、２．５ｍＭ）^＊ Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．によ
り開発および製造され、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎ
ｏｒｗａｌｋ，ＣＴから商業的に入手可能である。

【０１５７】ＨＩＶＲＮＡ標的中のアデニンの高い割
合、および逆転写に際してＴｔｈＤＮＡポリメラーゼが
ｄＵＴＰを取り込むことによる効率低下のために、反応
緩衝溶液は２００μＭのｄＵＴＰに加えて１５０μＭの
ｄＴＴＰを含む。熱サイクルの様式は、逆転写工程を７
０℃にて１５分間行ったことを除いて、例１０に記載の
ものと基本的に同じであった。増幅生成物は、例１０に
記載のように、ゲル電気泳動にて分析された。標的は、
ビシンおよびトリシンの両緩衝溶液において、１．０−
２．５ｍＭのＭｎ^２＋濃度範囲で逆転写され、増幅され
ることが見いだされ、また１．２−２．０ｍＭのＭｎ
^２＋濃度範囲でより高水準の生成物形成が見られた。

【０１５８】例９ 増大したｄＮＴＰ耐性 ビシン／ＫＯＡｃ／Ｍｎ（ＯＡｃ）_２緩衝溶液を使用し
て、ｄＮＴＰ濃度耐性の増大を評価するために、ＨＣＶ
ｃＲＮＡ標的（ｐＨＣＶ１．１Ａ）のＲＴ／ＰＣＲ増幅
を、ビシンおよびトリス緩衝溶液を使用し、異なるｄＮ
ＴＰ濃度にて行った。反応をここに記述する修飾を除い
て基本的に下記例１０に記載されるように行った

【０１５９】ＨＣＶｃＲＮＡ標的は、前述の例６に記載
されている。反応は、以下の条件の元で１００μｌの体
積で行われた： ３００コピーのＨＣＶｃＲＮＡ ＫＹ７８（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６）、ＫＹ７８（Ｓ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６）のそれぞれを０．１５μＭ １μｇのポリｒＡ ８％のグリセロール １０単位のｒＴｔｈ^＊ＤＮＡポリメラーゼ ２単位のＵＮＧ^＊ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ（各１００μ
Ｍ−５００μＭ） ５０ｍＭのビシン−ＫＯＨ（ｐＨ８．３）またはトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ８．３） １００ｍＭのＫＯＡｃ（ｐＨ７．５）または９０ｍＭの
ＫＣｌ ２．５ｍＭのＭｎ（ＯＡｃ）_２または０．９ｍＭののＭ
ｎＣｌ_２ ^＊ Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．によ
り開発および製造され、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎ
ｏｒｗａｌｋ，ＣＴから商業的に入手可能である。

【０１６０】熱サイクルのパラメータは、逆転写を７０
℃にて２５分間行い、また４０回の増幅サイクルを行っ
たことを除いて、下記例１０に記載のものと基本的に同
様である。増幅生成物は、例１０に記述されるようにゲ
ル電気泳動により分析された。結果を図２に示す。ビシ
ン／ＫＯＡｃ／Ｍｎ（ＯＡｃ）_２緩衝溶液を使用しての
増幅生成物の形成は各ｄＮＴＰの１００−５００μＭの
ｄＮＴＰ濃度範囲に亘って観察された。対照的に、トリ
ス／ＫＣｌ／ＭｎＣｌ_２緩衝溶液を使用すると２００μ
Ｍの各ｄＮＴＰ濃度においてのみ、有意な水準の増幅生
成物が形成された。

【０１６１】例１０ ＨＣＶおよびＨＩＶテンプレートを使用する均質ＲＴ／
ＰＣＲ Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）検出のためのＲＴ／ＰＣＲ
増幅に基づくアッセイは、ここに参考として取り入れる
ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−５２９，４９３およびＹ
ｏｕｎｇら、１９９３の前出文献に記述されている。Ｅ
Ｐ−Ａ−５２９，４９３は、マイクロウエルプレート検
出様式を使用する増幅生成物の検出を記述している。同
様なアッセイは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の検
出にも有用である。本発明の均質ＲＴ／ＰＣＲ法は、下
記のプロトコールを使用してＨＩＶおよびＨＣＶウイル
ステンプレートを増幅するために有用である。ビシン／
ＫＯＡｃ／Ｍｎ（ＯＡｃ）_２およびトリス／ＫＣｌ／Ｍ
ｎＣｌ_２緩衝溶液の両者を使用した均質反応が、以下に
記述される：ビシン／ＫＯＡｃ／Ｍｎ（ＯＡｃ）_２緩衝
溶液の使用が好ましい。試料テンプレートは、臨床的試
料または例６に記述されるＨＩＶおよびＨＣＶテンプレ
ートのいずれであってもよい。臨床的試料の調製のため
に好適な方法は、上記に引用したＨＣＶアッセイの参考
文献に記述されている。

【０１６２】ＨＩＶテンプレートのＲＴ／ＰＣＲ増幅の
ために好ましいプライマーは、ＳＫ４３１（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．６）およびＳＫ４６２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．５）のビオチン化誘導体である。ＨＣＶテンプレー
トのＲＴ／ＰＣＲ増幅のために好ましいプライマーは、
ＫＹ７８（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６）およびＫＹ９０
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７）である。

【０１６３】ビシン−ＫＯＨ（ｐＨ８．３）、ＫＯＡｃ
（ｐＨ７．５）およびＭｎ（ＯＡｃ）_２を１００μｌ全
反応体積にて使用するＨＩＶおよびＨＣＶＲＴ／ＰＣＲ
のための反応条件は、以下の通りである。ＨＩＶ反応条
件は、ｄＵＭＰの取り込みを促進するための増大したｄ
ＵＴＰ濃度の使用を例示している。

【０１６４】全反応体積１００μｌ中のトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ８．３）、ＫＣｌ、ＭｎＣｌ_２のための反応条
件：

【０１６５】反応は、ＴＣ９６００サーマルサイクラ
（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）
にて行われた。該サーマルサイクラは、ＨＩＶテンプレ
ートの増幅のために以下の温度様式を与えるようにプロ
グラムされた：ＵＮＧ滅菌のために５０℃にて２分間；
逆転写工程のために６０℃にて３０分間；（９５℃にて
１０秒間、５５℃にて１０秒間、７２℃にて１０秒間）
を４サイクル；２４サイクル（マイクロウエルプレート
アッセイ）、または３６サイクル（アガロースゲルアッ
セイ）の（９０℃にて１０秒間、６０℃にて１０秒間、
７２℃にて１０秒間）；ならびに７２℃にて保持。

【０１６６】該サーマルサイクラは、ＨＣＶテンプレー
トの増幅のために以下の温度様式を与えるようにプログ
ラムされた：ＵＮＧ滅菌のために５０℃にて２分間；逆
転写工程のために６０℃にて３０分間；２サイクルの、
９５℃にて１５秒間、６０℃にて２０秒間；３８サイク
ルの、９０℃にて１５秒間、６０℃にて２０秒間；６０
℃にて４分間；ならびに７２℃にて保持。

【０１６７】増幅生成物は、アガロースゲル電気泳動に
続く可視化、またはマイクロウエルプレートアッセイの
いずれかにより分析された。アガロースゲル分析のため
に、５μｌの各反応物を、２μｌの負荷緩衝溶液（３０
％しょ糖、０．１％ブロモフェノールブルー、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ）に添加し、エチジウムブロマイド（１００ｍ
ｌのアガロースあたり１０μｇ）をアガロースに添加し
た１ｘトリス−ボレートＥＤＴＡ中での４％（３％Ｎｕ
Ｓｉｅｖｅ、１％アガロース）アガロースゲル電気泳動
により分析した。電気泳動は、１２５Ｖにて３０分間で
ある。

【０１６８】ＨＣＶのマイクロウエルプレート分析は、
ＥＰ−Ａ−５２９，４９３および一般的に米国特許５，
２３２，８２９に記述されている。ＨＩＶ増幅生成物の
マイクロウエルプレート分析は、ＨＣＶについて記述さ
れるあと同様であるが、ここに参考として取り入れるＪ
ａｃｋｓｏｎらの、１９９１，ＡＩＤＳ ５：１４６３
−１４６７に記述されているＨＩＶ特異的プローブを使
用する。

【０１６９】例１１ ＲＮＡ安定性 異なる緩衝条件を使用してＲＮＡの安定性をアッセイす
るために、逆転写反応のものと同様であるが合成が起こ
らないようにポリメラーゼを除いた反応混合物中で、昇
温下にてインキュベートした。反応混合物（各２０μｌ
の体積）は次を含んでいた： １００ｎｇ［^３３Ｐ］標識ｐＡＷ１０９ｃＲＮＡ １．５μＭＫＹ８０（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７） 各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および
ｄＵＴＰ ２μｌのｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ保存用緩衝溶液
（５単位のポリメラーゼに相当）

【０１７０】緩衝条件は、下記緩衝剤を上記試薬に添加
することによって変化させた。すべての反応物を、比較
のために４℃にて２５分間インキュベートした試料１を
除いて、７０℃にて２５分間インキュベートした。回収
された完全長ＲＮＡの量は、ゲル電気泳動に続く、Ａｍ
ｂｉｓ４０００放射分析造影装置（Ａｍｂｉｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して測定し
た。すべての値は、試料２の結果を１００％として正準
化してある。ビシン−ＫＯＨおよびトリス−ＨＣｌはｐ
Ｈ８．３にて添加され；ＫＯＡｃはｐＨ７．５である。

【０１７１】

【０１７２】ＲＮＡの加水分解に触媒作用するマンガン
の添加は、試料２および３を比較して分かるように高温
度にてＲＮＡの分解を増大する。２．５ｍＭＭｎ（ＯＡ
ｃ）_２；１００ｍＭＫＯＡｃ；５０ｍＭビシン−ＫＯＨ
を含む緩衝溶液の添加は、ＲＮＡ分解をかなり低減す
る。試料３、４、５および６の比較は、観察されるＲＮ
Ａ分解量を低減するためには、緩衝溶液のすべての成分
が存在しなければならないことを示している。試料６−
９を試料１２と比べて分かるように、ＭＭｎ（ＯＡｃ）
_２／ＫＯＡｃ／ビシン−ＫＯＨ緩衝溶液は、ＭｎＣｌ_２
／ＫＣｌ／トリス−ＨＣｌ緩衝溶液よりもＲＮＡ分解量
を低減した。

【０１７３】高温でのプレインキュベーションは、逆転
写に先立ってＲＮＡを変性することにより、高度の２次
構造を有する標的に加えて二重鎖ＲＮＡ標的の増幅を容
易にするであろう。ＭＭｎ（ＯＡｃ）_２／ＫＯＡｃ／ビ
シン−ＫＯＨ緩衝溶液におけるＲＮＡの安定性に対する
高温プレインキュベーションの効果を評価するために、
ＲＮＡを逆転写反応のものと同様であるが合成が起こら
ないようにポリメラーゼを除いた反応混合物中で、昇温
下にてインキュベートした。反応混合物（各２０μｌの
体積）は次を含んでいた： ２５０ｎｇ［^３３Ｐ］標識ｐＡＷ１０９ｃＲＮＡ １．５μＭＤＭ１５１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０） 各３００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および
ｄＵＴＰ ５０ｍＭのビシン−ＫＯＨ（ｐＨ８．３） １００ｍＭＫＯＡｃ（ｐＨ７．５） ２．５ｍＭＭｎ（ＯＡｃ）_２ ２μｌのｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ保存用緩衝溶液
（５単位のポリメラーゼに相当）

【０１７４】反応混合物を、下記の温度にてインキュベ
ートし、完全長ＲＮＡの最終量を、ゲル電気泳動に続
く、Ａｍｂｉｓ４０００放射分析造影装置（Ａｍｂｉ
ｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して
測定した。インキュベーションを３個一組で行い、残留
する未分解ＲＮＡの平均量を４℃、２５分間のインキュ
ベーション後に残留した量に対して正準化してある。１
群の３個の反応インキュベーションから回収される量の
平均標準偏差は、１１％であった。

【０１７５】

【０１７６】６０℃にて２５分間のインキュベーション
は、前述の例に記載した逆転写の条件と対比できる。Ｒ
ＮＡの１５秒間、９５℃のプレインキュベーションを含
んだ場合には、完全長標識ＲＮＡの検出可能な更なる損
失は無かった。

【０１７７】例１２ ＨＣＶテンプレートを使用するＲＴ／ＰＣＲにたいする
マンガン濃度の効果 ＲＴ／ＰＣＲ反応を、ビシン／ＫＯＡｃ／Ｍｎ（ＯＡ
ｃ）_２およびトリス／ＫＣｌ／ＭｎＣｌ_２緩衝溶液の両
者を使用してマンガン濃度の範囲に亘って行った。１０
０μｌの全反応体積におけるＨＣＶＲＴ／ＰＣＲの反応
条件は下記の通りである。 １００コピーのＨＣＶｃＲＮＡ ２００μＭのｄＡＴＰ ２００μＭのｄＣＴＰ ２００μＭのｄＧＴＰ ２００μＭのｄＴＴＰ １５ｐｍｏｌ／ｒｘｎのＫＹ７８（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．１６） １５ｐｍｏｌ／ｒｘｎのＫＹ９０（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．１７） ２単位のＵＮＧ^＊ １０単位のｒＴｔｈ^＊ＤＮＡポリメラーゼ ８％のグリセロール ５０ｍＭのビシン−ＫＯＨ（ｐＨ８．３）または１０ｍ
Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３） １００ｍＭのＫＯＡｃ（ｐＨ７．５）または９０ｍＭの
ＫＣｌ Ｍｎ（ＯＡｃ）_２またはＭｎＣｌ_２ ^＊ Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．によ
り開発および製造され、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎ
ｏｒｗａｌｋ，ＣＴから商業的に入手可能である。

【０１７８】使用したマンガン濃度は、１．５、２．
０、２．５、３．０、３．５および４．０ｍＭのＭｎ
（ＯＡｃ）_２および０．７、０．８、０．８５、０．
９、０．９５および１．０ｍＭのＭｎＣｌ_２であった。
反応はＴＣ９６００サーマルサイクラ（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）にて行われた。該
サーマルサイクラは、逆転写を７０℃にて２５分間行
い、次いで９５℃にて１分間インキュベートすることを
除いて例１０に記載されている温度様式でプログラムさ
れた。増幅生成物は、例１０に記載されているのと同様
にアガロースゲル電気泳動に続いて可視化することによ
って分析された。

【０１７９】増幅生成物は、ビシン／ＫＯＡｃ／Ｍｎ
（ＯＡｃ）_２緩衝溶液を使用してＭｎ（ＯＡｃ）_２濃度
の２．０−４．０ｍＭの範囲で観察された。また、増幅
生成物は、トリス／ＫＣｌ／ＭｎＣｌ_２緩衝溶液を使用
してＭｎＣｌ_２濃度の０．８−１．０ｍＭの範囲で観察
された。これらの反応条件で、ビシン／ＫＯＡｃ／Ｍｎ
（ＯＡｃ）_２緩衝溶液を使用した場合には、トリス／Ｋ
Ｃｌ／ＭｎＣｌ_２緩衝溶液の場合に比べて１０倍以上の
マンガン濃度範囲に亘って観察された。

【０１８０】例１３ 高いトリス濃度を使用するＲＴ／ＰＣＲ ＲＴ／ＰＣＲ増幅反応を、２種類のトリス濃度をもった
トリス／ＫＣｌ／ＭｎＣｌ_２緩衝溶液を使用してマンガ
ン濃度範囲に亘って行った。１００μｌの全反応体積に
おけるＨＣＶＲＴ／ＰＣＲの反応条件は下記の通りであ
る。 ５００コピーのＨＣＶｃＲＮＡ ２００μＭのｄＡＴＰ ２００μＭのｄＣＴＰ ２００μＭのｄＧＴＰ ２００μＭのｄＴＴＰ １５ｐｍｏｌ／ｒｘｎのＫＹ７８（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．１６） １５ｐｍｏｌ／ｒｘｎのＫＹ９０（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．１７） ２単位のＵＮＧ^＊ １０単位のｒＴｔｈ^＊ＤＮＡポリメラーゼ ８％のグリセロール １０ｍＭのトリス−ＫＣｌ（ｐＨ８．３）または１００
ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３） ９０ｍＭのＫＣｌまたは４５ｍＭのＫＣｌ ＭｎＣｌ_２ ^＊ Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．によ
り開発および製造され、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎ
ｏｒｗａｌｋ，ＣＴから商業的に入手可能である。

【０１８１】使用したマンガン濃度は、各トリス濃度に
ついて０．７、０．８、１．０、１．２および１．３ｍ
ＭのＭｎＣｌ_２であった。反応はＴＣ９６００サーマル
サイクラ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌ
ｋ，ＣＴ）にて行われた。該サーマルサイクラは、逆転
写を７０℃にて２５分間行い、次いで９５℃にて１分間
インキュベートを行うことを除いて例１０に記載されて
いる温度様式でプログラムされた。増幅生成物は、例１
０に記載されているのと同様にアガロースゲル電気泳動
に続いて可視化することによって分析された。

【０１８２】増幅生成物は、１００ｍＭのトリス緩衝溶
液を使用した場合にＭｎＣｌ_２濃度の０．７−１．２ｍ
Ｍの範囲で観察された。また、増幅生成物は、１０ｍＭ
のトリス緩衝溶液を使用した場合にＭｎＣｌ_２濃度の
０．８−１．０ｍＭの範囲で観察された。これらの反応
条件で、生成物はトリス／ＫＣｌ／ＭｎＣｌ_２緩衝溶液
中のトリス濃度が１０ｍＭから１００ｍＭに増大した場
合により広いマンガン濃度範囲に亘って観察された。

【０１８３】本発明を詳細に記述したが、変更および修
飾を、特許請求の範囲の精神および範囲内で行うことが
出来ることは理解されるであろう

【０１８４】

【配列表】

【０１８５】

【０１８６】

【０１８７】

【０１８８】

【０１８９】

【０１９０】

【０１９１】

【０１９２】

【０１９３】

【０１９４】

【０１９５】

【０１９６】

【０１９７】

【０１９８】

【０１９９】

【０２００】

【０２０１】

【０２０２】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、例７に記述される伸長反応の結果を
表すものであって、異なる緩衝溶液条件を使用するマン
ガン濃度の範囲に亘って反応効率をアッセイした結果の
グラフである。

【図２】 図２は、クロマトグラフを示す写真であっ
て、例９に記述されるＲＴ／ＰＣＲの結果を示す図であ
り、ｄＮＴＰ濃度の使用可能な範囲について、異なる緩
衝溶液条件を使用してアッセイした電気泳動パターンで
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 トーマス ダブリュ．マイヤーズ アメリカ合衆国カリフォルニア州アラメ ダ，ファーンサイド ブールバード 2910 (72)発明者 クリストファー，エル．シギュア アメリカ合衆国カリフォルニア州アンテ ィオック，ブライドル コート 4825 (56)参考文献 特表 平５−505105（ＪＰ，Ａ) 国際公開92／1814（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (35)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中の標的ＲＮＡ分子の増幅方法であ
   って、 （ａ）前記試料を、４種すべてのデオキシリボヌクレオ
   シド三リン酸の存在下、２価陽イオンを含む適切な緩衝
   系中、第１および第２のプライマーならびに熱安定性Ｄ
   ＮＡポリメラーゼを含む反応混合物中において、前記熱
   安定性ＤＮＡポリメラーゼが前記第１のプライマーの伸
   長生成物の合成を開始して前記標的ＲＮＡに相補的なｃ
   ＤＮＡ分子を生成するために充分な温度にて処理し、こ
   こにおいて前記第１のプライマーは、前記標的ＲＮＡに
   対して、それにハイブリダイズして前記標的ＲＮＡに相
   補的なｃＤＮＡ分子の合成を開始するに充分に相補的で
   あり、前記第２のプライマーは、前記ｃＤＮＡにハイブ
   リダイズし伸長生成物の合成を開始するに充分に前記標
   的ＲＮＡに対し相同的であり； （ｂ）前記反応混合物を、単鎖ｃＤＮＡを生成するため
   に適切な温度にて処理し； （ｃ）前記反応混合物を、前記熱安定性ＤＮＡポリメラ
   ーゼが前記第２のプライマーの伸長生成物の合成を開始
   して二重鎖ｃＤＮＡ分子を与えるために適切な温度にて
   処理し；そして （ｄ）工程（ｃ）の二重鎖ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖
   反応により増幅する、工程を含んでなり、 前記工程（ａ）および（ｄ）において使用する緩衝系が
   前記２価陽イオンを結合する緩衝剤を更に含有し、前記
   緩衝剤の２０℃かつ０．１Ｍのイオン強度における２価
   陽イオン結合反応のＫ_M が１０および１０⁶ の間にある
   ことを特徴とする試料中の標的ＲＮＡ分子の増幅方法。
2. 【請求項２】 前記緩衝剤が水素イオン緩衝作用を与え
   る両性イオン性化合物であり、前記緩衝剤の２０℃かつ
   ０．１Ｍのイオン強度におけるｐＫａが７および９の間
   にある請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記緩衝系が、更にＮ，Ｎ−ビス（２−
   ヒドロキシエチル）グリシンまたはＮ〔トリス（ヒドロ
   キシメチル）メチル〕グリシンを含んでなる請求項１ま
   たは２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記緩衝系が、更に酢酸ナトリウム、酢
   酸カリウム、酢酸アンモニウムおよび酢酸リチウムから
   なる群から選択される酢酸塩を含んでなる請求項１〜３
   のいずれか１項に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、Th
   ermus aquaticus DNA ポリメラーゼまたはThermus ther
   mophilus DNAポリメラーゼである請求項１〜４のいずれ
   か１項に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記ＤＮＡポリメラーゼが、組換えTth
   DNA ポリメラーゼである請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 工程（ａ）の温度が、４０℃および８０
   ℃の間である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方
   法。
8. 【請求項８】 慣用および非慣用のヌクレオシド三リン
   酸を逆転写反応混合物に混合し、該慣用および非慣用の
   ヌクレオチドが取り込まれたｃＤＮＡを生成させた結果
   として、先行する逆転写反応により生成する核酸が夾雑
   する逆転写反応物、逆転写／増幅反応物または増幅反応
   物からの夾雑物除去方法であって、該方法は前記非慣用
   ヌクレオチドの共有結合を加水分解することにより夾雑
   核酸を分解することを含んでなり、前記逆転写反応混合
   物は更にThermus thermophilusDNAポリメラーゼ、２価
   陽イオンおよび緩衝系を含み、前記緩衝系は前記２価陽
   イオンと結合する緩衝剤を含み、前記緩衝剤の２０℃、
   かつ０．１Ｍのイオン強度における前記２価陽イオン結
   合反応のＫ_M が１０および１０⁶ の間にあることを特徴
   とする反応物からの夾雑物の除去方法。
9. 【請求項９】 前記先行する逆転写反応物が均質逆転写
   ／増幅反応物である請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記緩衝剤が水素イオン緩衝作用を与
    える両性イオン性化合物であり、前記緩衝剤の２０℃か
    つ０．１Ｍのイオン強度におけるｐＫａが７および９の
    間にある請求項８または９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記緩衝系が、更にＮ，Ｎ−ビス（２
    −ヒドロキシエチル）グリシンまたはＮ〔トリス（ヒド
    ロキシメチル）メチル〕グリシンを含んでなる請求項８
    〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記緩衝系が、更に酢酸ナトリウム、
    酢酸カリウム、酢酸アンモニウムおよび酢酸リチウムか
    らなる群から選択される酢酸塩を含んでなる請求項１〜
    １１のいずれか１項に記載の方法。
13. 【請求項１３】 均質逆転写／増幅反応遂行のための緩
    衝剤組成物であって、２価陽イオン、１価陽イオンおよ
    び緩衝剤を含有し、該緩衝剤が前記２価陽イオンと結合
    するキレート化剤であり、前記緩衝剤の２０℃、かつ
    ０．１Ｍのイオン強度における前記２価陽イオン結合反
    応のＫ_M が１０および１０⁶ の間にあることを特徴とす
    る緩衝剤組成物。
14. 【請求項１４】 前記緩衝剤が水素イオン緩衝作用を与
    える両性イオン性化合物であり、前記緩衝剤の２０℃か
    つ０．１Ｍのイオン強度におけるｐＫａが７および９の
    間にある請求項１３に記載の緩衝剤組成物。
15. 【請求項１５】 前記緩衝剤が、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒ
    ドロキシエチル）グリシンまたはＮ〔トリス（ヒドロキ
    シメチル）メチル〕グリシンである請求項１３または１
    ４に記載の緩衝剤組成物。
16. 【請求項１６】 前記２価陽イオンが、酢酸マンガン、
    塩化マンガンまたは硫酸マンガンにより供給され、前記
    １価陽イオンが酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸ア
    ンモニウムまたは酢酸リチウムからなる群から選択され
    る酢酸塩により供給される請求項１３〜１５のいずれか
    １項に記載の緩衝剤組成物。
17. 【請求項１７】 前記２価陽イオンが１．２および５mM
    の間の濃度をもって、酢酸マンガンにより供給される請
    求項１３〜１６のいずれか１項に記載の緩衝剤組成物。
18. 【請求項１８】 該１価陽イオンが酢酸カリウムにより
    供給される請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の緩
    衝剤組成物。
19. 【請求項１９】 試料中の標的ＲＮＡ分子の逆転写方法
    であって： 前記試料を、前記標的ＲＮＡに対してそれにハイブリダ
    イズして前記標的ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ分子の合成
    を開始するに充分に相補的なプライマー、熱安定性ＤＮ
    Ａポリメラーゼ、４種のデオキシリボヌクレオシド三リ
    ン酸、および２価陽イオンを含む適切な緩衝系を含んで
    なる反応混合物中で、前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
    が前記プライマーの伸長生成物の合成を開始して前記標
    的ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ分子を与えるために充分な
    温度にて処理する工程を含み； 前記緩衝系が前記２価陽イオンを結合する緩衝剤を更に
    含有し、前記緩衝剤の２０℃かつ０．１Ｍのイオン強度
    における２価陽イオン結合反応のＫ_M が１０および１０
    ⁶ の間にあることを特徴とする試料中の標的ＲＮＡ分子
    の逆転写方法。
20. 【請求項２０】 前記緩衝剤が水素イオン緩衝作用を与
    える両性イオン性化合物であり、前記緩衝剤の２０℃か
    つ０．１Ｍのイオン強度におけるｐＫａが７および９の
    間にある請求項１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記緩衝系が、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒ
    ドロキシエチル）グリシンまたはＮ〔トリス（ヒドロキ
    シメチル）メチル〕グリシンを更に含有する請求項１９
    または２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記緩衝系が、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒ
    ドロキシエチル）グリシンまたはＮ〔トリス（ヒドロキ
    シメチル）メチル〕グリシンを更に含有し、かつ前記緩
    衝系が、更に酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アン
    モニウムおよび酢酸リチウムからなる群から選択される
    酢酸塩を含んでなる請求項１９〜２１のいずれか１項に
    記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記熱活性ＤＮＡポリメラーゼが、Th
    ermus aquaticus DNA ポリメラーゼまたはThermus ther
    mophilus DNAポリメラーゼである請求項１９〜２２のい
    ずれか１項に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記ＤＮＡポリメラーゼが、組換えTt
    h DNA ポリメラーゼである請求項２３に記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記反応混合物の前記温度が４０℃お
    よび８０℃の間である請求項２３または２４に記載の方
    法。
26. 【請求項２６】 逆転写反応遂行のための緩衝剤組成物
    であって、２価陽イオン、１価陽イオンおよび緩衝剤を
    含有し、該緩衝剤が前記２価陽イオンと結合するキレー
    ト化剤であり、前記緩衝剤の２０℃、かつ０．１Ｍのイ
    オン強度における前記２価陽イオン結合反応のＫ_M が１
    ０および１０⁶ の間にあることを特徴とする緩衝剤組成
    物。
27. 【請求項２７】 請求項１３〜１８に記載の緩衝剤組成
    物および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなるキッ
    ト。
28. 【請求項２８】 前記２価陽イオンがＭｎ²⁺である、請
    求項１〜１２および１９〜２５のいずれか１項に記載の
    方法。
29. 【請求項２９】 前記緩衝剤の２０℃かつ０．１Ｍのイ
    オン強度における２価陽イオン結合反応のＫ_M が１０²
    および１０⁴ の間にある、請求項１〜１２および１９〜
    ２５のいずれか１項に記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記緩衝剤の２価陽イオン結合反応の
    Ｋ_M が１０^2.5 および１０^3.5 の間にある、請求項２９
    に記載の方法。
31. 【請求項３１】 前記緩衝剤の２０℃かつ０．１Ｍのイ
    オン強度におけるｐＫａが７．５および８．５の間にあ
    る、請求項２〜７、１０〜１２および２０〜２５のいず
    れか１項に記載の方法。
32. 【請求項３２】 前記２価陽イオンがＭｎ²⁺である、請
    求項１３〜１８および２６のいずれか１項に記載の緩衝
    剤組成物。
33. 【請求項３３】 前記緩衝剤の２０℃かつ０．１Ｍのイ
    オン強度における２価陽イオン結合反応のＫ_M が１０²
    および１０⁴ の間にある、請求項１３〜１８および２６
    のいずれか１項に記載の緩衝剤組成物。
34. 【請求項３４】 前記緩衝剤の２価陽イオン結合反応の
    Ｋ_M が１０^2.5 および１０^3.5 の間にある、請求項３３
    に記載の緩衝剤組成物。
35. 【請求項３５】 前記緩衝剤の２０℃かつ０．１Ｍのイ
    オン強度におけるｐＫａが７．５および８．５の間にあ
    る、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の緩衝剤組
    成物。