JPH05292968A - 核酸増幅のための改善された方法 - Google Patents
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
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-
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は核酸の増幅のための改善された方法
及び組成物の提供を目的とする。 【構成】 本発明は増幅反応混合物においてインナー及
びアウタープライマーペアーの両者が存在している簡潔
化した入れ子増幅方法に関する。本方法に従うと、任意
の増幅サイクル中に標的上においてどのプライマーをア
ニール及び伸長せしめるかを制御するため、熱サイクル
プロフィール並びに増幅プライマーの配列、長さ及び濃
度を変える。詳細する方法はＰＣＲ増幅に特に適し、そ
して分子生物学、医療診断及び法医学に莫大な用途を有
する。
及び組成物の提供を目的とする。 【構成】 本発明は増幅反応混合物においてインナー及
びアウタープライマーペアーの両者が存在している簡潔
化した入れ子増幅方法に関する。本方法に従うと、任意
の増幅サイクル中に標的上においてどのプライマーをア
ニール及び伸長せしめるかを制御するため、熱サイクル
プロフィール並びに増幅プライマーの配列、長さ及び濃
度を変える。詳細する方法はＰＣＲ増幅に特に適し、そ
して分子生物学、医療診断及び法医学に莫大な用途を有
する。
Description
【０００１】本発明は核酸の増幅のための改善された方
法及び組成物を提供する。提供するこの新規な方法は従
来の方法よりも向上した標的特異性及び感度を提供し、
そして特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による標的
配列の増幅及び検出に有用である。特に本発明に従う
と、熱サイクルプロフィール並びに増幅プライマーの配
列、長さ及び濃度を変えることによって標的に対する特
異性を提供する。本発明の方法は分子生物学、医療診断
及び法医学の分野において莫大な用途を有する。
法及び組成物を提供する。提供するこの新規な方法は従
来の方法よりも向上した標的特異性及び感度を提供し、
そして特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による標的
配列の増幅及び検出に有用である。特に本発明に従う
と、熱サイクルプロフィール並びに増幅プライマーの配
列、長さ及び濃度を変えることによって標的に対する特
異性を提供する。本発明の方法は分子生物学、医療診断
及び法医学の分野において莫大な用途を有する。
【０００２】ある観点において、本発明は試料中の標的
核酸内の配列の入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）増幅に関する方
法を提供する。本方法は：（ａ）試料を、アウタープラ
イマーペアー及びインナープライマーペアーを含む増幅
反応混合物中に混合する（ここで該アウタープライマー
ペアーは該標的核酸のセグメントを増幅せしめて増幅標
的配列を提供することが可能であり、そして該インナー
プライマーペアーは該標的配列内のサブ配列を増幅せし
めることが可能である）；（ｂ）増幅標的配列を提供す
るため、段階（ａ）の増幅反応混合物を、増幅反応にお
いて、該標的核酸におけるアウタープライマーペアーの
アニール及び伸長のための温度、並びに該アウタープラ
イマーペアーの伸長生成物を変性せしめる温度にて処理
する（ここで該アウタープライマーペアーをアニール及
び伸長するための温度は、該インナープライマーペアー
を該標的核酸にアニール及び伸長せしめるための温度よ
りも高い）；そして（ｃ）増幅サブ配列を提供するた
め、段階（ｂ）の混合物を、増幅反応において、該増幅
標的配列におけるインナープライマーペアーのアニール
及び伸長のための温度、並びに該インナープライマーペ
アーの伸長生成物の変性のための温度で処理せしめるこ
とを含んで成る。
核酸内の配列の入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）増幅に関する方
法を提供する。本方法は：（ａ）試料を、アウタープラ
イマーペアー及びインナープライマーペアーを含む増幅
反応混合物中に混合する（ここで該アウタープライマー
ペアーは該標的核酸のセグメントを増幅せしめて増幅標
的配列を提供することが可能であり、そして該インナー
プライマーペアーは該標的配列内のサブ配列を増幅せし
めることが可能である）；（ｂ）増幅標的配列を提供す
るため、段階（ａ）の増幅反応混合物を、増幅反応にお
いて、該標的核酸におけるアウタープライマーペアーの
アニール及び伸長のための温度、並びに該アウタープラ
イマーペアーの伸長生成物を変性せしめる温度にて処理
する（ここで該アウタープライマーペアーをアニール及
び伸長するための温度は、該インナープライマーペアー
を該標的核酸にアニール及び伸長せしめるための温度よ
りも高い）；そして（ｃ）増幅サブ配列を提供するた
め、段階（ｂ）の混合物を、増幅反応において、該増幅
標的配列におけるインナープライマーペアーのアニール
及び伸長のための温度、並びに該インナープライマーペ
アーの伸長生成物の変性のための温度で処理せしめるこ
とを含んで成る。
【０００３】本方法の他の態様において、段階（ｃ）で
の該インナープライマーの伸長生成物を変性するための
温度は該アウタープライマーペアーの伸長生成物を変性
するために適し、そしてこの方法は更に、（ｄ）増幅サ
ブ配列を提供するため、サブ配列を、増幅標的配列にお
けるインナープライマーペアーのアニール及び伸長に適
する温度、並びにインナープライマーペアーの伸長生成
物のみを変性する温度にて増幅せしめることを含んで成
る。ここで該インナープライマーペアーの伸長生成物の
みを変性するための温度は該アウタープライマーペアー
の伸長生成物を変性するための温度よりも低い。
の該インナープライマーの伸長生成物を変性するための
温度は該アウタープライマーペアーの伸長生成物を変性
するために適し、そしてこの方法は更に、（ｄ）増幅サ
ブ配列を提供するため、サブ配列を、増幅標的配列にお
けるインナープライマーペアーのアニール及び伸長に適
する温度、並びにインナープライマーペアーの伸長生成
物のみを変性する温度にて増幅せしめることを含んで成
る。ここで該インナープライマーペアーの伸長生成物の
みを変性するための温度は該アウタープライマーペアー
の伸長生成物を変性するための温度よりも低い。
【０００４】他の態様において、本発明はＰＣＲにおけ
る改善された特異的な方法を提供し、該方法は（ａ）標
的核酸配列を含む試料を、該標的を特異的に増幅するた
めのプライマーペアーを含む増幅反応混合物の中に混合
せしめ；（ｂ）該標的配列を、該プライマーペアーのＴ
ｍより１℃〜１０℃高い、該プライマーペアーのアニー
ル及び伸長のための温度で増幅せしめ；そして（ｃ）段
階（ｂ）の増幅反応混合物を該プライマーペアーの効率
的なアニール及び伸長のための温度にて増幅せしめ、増
幅標的配列を提供せしめることを含んで成る。
る改善された特異的な方法を提供し、該方法は（ａ）標
的核酸配列を含む試料を、該標的を特異的に増幅するた
めのプライマーペアーを含む増幅反応混合物の中に混合
せしめ；（ｂ）該標的配列を、該プライマーペアーのＴ
ｍより１℃〜１０℃高い、該プライマーペアーのアニー
ル及び伸長のための温度で増幅せしめ；そして（ｃ）段
階（ｂ）の増幅反応混合物を該プライマーペアーの効率
的なアニール及び伸長のための温度にて増幅せしめ、増
幅標的配列を提供せしめることを含んで成る。
【０００５】ここで開示する核酸増幅方法及び組成物
は、核酸を増幅するための従来の方法よりも高められた
特異性及び感度の利点を有する。本方法は改善された増
幅結果を得るための改良熱サイクル工程の利用に関す
る。本発明の一態様において、本方法は高い特異性のた
めの入れ子プライマーの利用にも関する。本発明は従来
の入れ子プライミング工程の欠点をなくし、そして増幅
副産物、例えばプライマー二量体を引き下げる。この改
良増幅方法は標的特異的増幅化生成物の量の増大によっ
て検出度も高める。
は、核酸を増幅するための従来の方法よりも高められた
特異性及び感度の利点を有する。本方法は改善された増
幅結果を得るための改良熱サイクル工程の利用に関す
る。本発明の一態様において、本方法は高い特異性のた
めの入れ子プライマーの利用にも関する。本発明は従来
の入れ子プライミング工程の欠点をなくし、そして増幅
副産物、例えばプライマー二量体を引き下げる。この改
良増幅方法は標的特異的増幅化生成物の量の増大によっ
て検出度も高める。
【０００６】核酸検出のための方法は一般にオリゴヌク
レオチドプローブを用いることにより成し遂げられる。
例えば米国特許明細書第４，３５８，５３５号は、試料
（例えば血液、細胞、だ液他）をフィルター上にスポッ
トせしめ、細胞を溶解させ、そして化学変性及び加熱を
介してＤＮＡを固定化せしめることによる病原体の検出
のための方法を開示する。次いで標記ＤＮＡプローブを
加え、そしてこの固定化試料ＤＮＡとハイブリダイズさ
せる。ハイブリダイゼーションは病原体ＤＮＡの存在を
示唆する。
レオチドプローブを用いることにより成し遂げられる。
例えば米国特許明細書第４，３５８，５３５号は、試料
（例えば血液、細胞、だ液他）をフィルター上にスポッ
トせしめ、細胞を溶解させ、そして化学変性及び加熱を
介してＤＮＡを固定化せしめることによる病原体の検出
のための方法を開示する。次いで標記ＤＮＡプローブを
加え、そしてこの固定化試料ＤＮＡとハイブリダイズさ
せる。ハイブリダイゼーションは病原体ＤＮＡの存在を
示唆する。
【０００７】核酸検出方法の感度及び特異性はポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の発明により大いに高まった。
ＰＣＲは核酸を増幅するための方法であり、そして特定
の核酸セグメントの大量のコピー数を作成するための、
２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、重合のための
試薬、標的核酸鋳型、並びに核酸の変性及びこのプライ
マーのアニールと伸長の連続サイクルの利用を包含す
る。この方法により、１コピーのゲノムＤＮＡのセグメ
ントは、非常に高い特異性及び精度を伴って１０００万
倍以上に増幅されうる。ＰＣＲ方法は米国特許明細書第
４，６８３，２０２号に開示され、そしてＰＣＲ生成物
の検出のための方法は特に米国特許明細書第４，６８
３，１９５号に詳細されている。
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の発明により大いに高まった。
ＰＣＲは核酸を増幅するための方法であり、そして特定
の核酸セグメントの大量のコピー数を作成するための、
２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、重合のための
試薬、標的核酸鋳型、並びに核酸の変性及びこのプライ
マーのアニールと伸長の連続サイクルの利用を包含す
る。この方法により、１コピーのゲノムＤＮＡのセグメ
ントは、非常に高い特異性及び精度を伴って１０００万
倍以上に増幅されうる。ＰＣＲ方法は米国特許明細書第
４，６８３，２０２号に開示され、そしてＰＣＲ生成物
の検出のための方法は特に米国特許明細書第４，６８
３，１９５号に詳細されている。
【０００８】感度はこの増幅標的が微量配列の場合に重
要である。この検出感度は入手できる検出すべき増幅生
成物の量に限定される。微量配列、例えばＡＩＤＳ陽性
ではあるがそれ以外は健康である個体のＡＩＤＳウィル
ス核酸、又は発癌を示す微量の遺伝子の転写は、検出す
るのに非常に困難であり、また常用の分析技術において
見落されることがありうる。法医学的試料はしばしば微
量の核酸又は部分分解したＤＮＡを含んで成る。
要である。この検出感度は入手できる検出すべき増幅生
成物の量に限定される。微量配列、例えばＡＩＤＳ陽性
ではあるがそれ以外は健康である個体のＡＩＤＳウィル
ス核酸、又は発癌を示す微量の遺伝子の転写は、検出す
るのに非常に困難であり、また常用の分析技術において
見落されることがありうる。法医学的試料はしばしば微
量の核酸又は部分分解したＤＮＡを含んで成る。
【０００９】微量配列の検出における困難性は、標的配
列に対する非標的配列の割合が高いことがあるためであ
る。標的と非標的ＤＮＡとの間の区別及び標的配列のみ
の増幅の能力は感度の改善のための重要な観点である。
反応がより特異的になるほど、生産される特異的な標的
配列の相対量は高まり、従ってこの生成物の検出がより
容易になる。特異性の増大は同様に感度も高める。
列に対する非標的配列の割合が高いことがあるためであ
る。標的と非標的ＤＮＡとの間の区別及び標的配列のみ
の増幅の能力は感度の改善のための重要な観点である。
反応がより特異的になるほど、生産される特異的な標的
配列の相対量は高まり、従ってこの生成物の検出がより
容易になる。特異性の増大は同様に感度も高める。
【００１０】改善された感度及び特異性の必要性は上記
の米国特許明細書第４，６８３，１９５号に詳細され、
これは一本のコピー遺伝子の増幅においてＰＣＲ感度を
高めるための入れ子プライマーの利用を説明している。
この方法は、ＰＣＲの後にこの反応混合物を１０倍に希
釈せしめて第１プライマーペアーの濃度を低め、次いで
第２プライマーペアーをこの反応混合物に導入せしめ、
そしてＰＣＲ熱サイクルを反復することを必要とする。
この方法に従い、この第２プライマーは第１ＰＣＲ生成
物のサブセグメントを増幅せしめるために、この第１プ
ライマーペアーに内在するようデザインされている。こ
の方法は特異的な増幅を高める、即ち、非特異的なバッ
クグランド増幅生成物を少なくし、従って感度を高め
る。このような非特異的増幅生成物は、フランキングプ
ライマーとの偶発的な部分相同性によって生ずるもので
はあるが、それらが増幅し続けるためにこの入れ子プラ
イマーと十分な相同性をも有することはあまりない。
の米国特許明細書第４，６８３，１９５号に詳細され、
これは一本のコピー遺伝子の増幅においてＰＣＲ感度を
高めるための入れ子プライマーの利用を説明している。
この方法は、ＰＣＲの後にこの反応混合物を１０倍に希
釈せしめて第１プライマーペアーの濃度を低め、次いで
第２プライマーペアーをこの反応混合物に導入せしめ、
そしてＰＣＲ熱サイクルを反復することを必要とする。
この方法に従い、この第２プライマーは第１ＰＣＲ生成
物のサブセグメントを増幅せしめるために、この第１プ
ライマーペアーに内在するようデザインされている。こ
の方法は特異的な増幅を高める、即ち、非特異的なバッ
クグランド増幅生成物を少なくし、従って感度を高め
る。このような非特異的増幅生成物は、フランキングプ
ライマーとの偶発的な部分相同性によって生ずるもので
はあるが、それらが増幅し続けるためにこの入れ子プラ
イマーと十分な相同性をも有することはあまりない。
【００１１】ツーステップ反応は、第２ＰＣＲにおける
第１プライマーペアーの存在及び第１ＰＣＲ混合物の希
釈に続く酵素を含む更なる試薬の必要性を有し、その結
果複数の欠点を有する。入れ子プライマー方法の欠点は
試料の希釈段階の際の交差汚染の可能性である。ＰＣＲ
方法の有する莫大な増幅の可能性に基づき、事前の増幅
に由来する高いＤＮＡレベルの陽性コントロール鋳型又
は標的を有する試料からの少量のレベルのＤＮＡキャリ
ーオーバーは、故意に鋳型ＤＮＡを加えていない場合で
さえもＰＣＲ生成物をもたらしうる。最小の交差汚染を
伴ってＰＣＲを実施するための特別なる方法及び予備注
意は、Nature 339 , 237-238(1989) 及びＰＣＲプロト
コール：A Guide to Methods and Applications, Acade
mic Press, Inc., San Diego, California(1990)に詳細
されている。
第１プライマーペアーの存在及び第１ＰＣＲ混合物の希
釈に続く酵素を含む更なる試薬の必要性を有し、その結
果複数の欠点を有する。入れ子プライマー方法の欠点は
試料の希釈段階の際の交差汚染の可能性である。ＰＣＲ
方法の有する莫大な増幅の可能性に基づき、事前の増幅
に由来する高いＤＮＡレベルの陽性コントロール鋳型又
は標的を有する試料からの少量のレベルのＤＮＡキャリ
ーオーバーは、故意に鋳型ＤＮＡを加えていない場合で
さえもＰＣＲ生成物をもたらしうる。最小の交差汚染を
伴ってＰＣＲを実施するための特別なる方法及び予備注
意は、Nature 339 , 237-238(1989) 及びＰＣＲプロト
コール：A Guide to Methods and Applications, Acade
mic Press, Inc., San Diego, California(1990)に詳細
されている。
【００１２】一般に、特異性を高める他の方法は改質生
成物検出方法を含む。例えば、Nature 324 , 163-166
(1986) は、ヒトゲノムＤＮＡにおける一塩基置換に基
づく対立遺伝子配列のバリエーションの検出方法を詳細
している。この文献は、対立遺伝子特異性オリゴヌクレ
オチド（ＡＳＯ）プローブであって、このプローブと完
璧に対合する配列のみとアニールし合うものを開示して
いる（単一の誤対合はハイブリダイゼーションを阻止す
るのに十分である）。このＡＳＯプローブは対象の対立
遺伝子配列を含む標的セグメントの増幅に関連して利用
される。
成物検出方法を含む。例えば、Nature 324 , 163-166
(1986) は、ヒトゲノムＤＮＡにおける一塩基置換に基
づく対立遺伝子配列のバリエーションの検出方法を詳細
している。この文献は、対立遺伝子特異性オリゴヌクレ
オチド（ＡＳＯ）プローブであって、このプローブと完
璧に対合する配列のみとアニールし合うものを開示して
いる（単一の誤対合はハイブリダイゼーションを阻止す
るのに十分である）。このＡＳＯプローブは対象の対立
遺伝子配列を含む標的セグメントの増幅に関連して利用
される。
【００１３】上述した入れ子方法の改良が既に開示され
ている。Proc.Natl.Acad.Sci.USA86, 2423-2437(1989)
は、内部プライマーがその後の捕獲及び検出のために標
識された改良入れ子プライミング方法を詳細している。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA87, 4580-4584(1990) は、対立
遺伝子特異的検出のための「ヘミネスチング（ｈｅｍｉ
ｎｅｓｔｉｎｇ）方法」を開示している。この方法はＰ
ＣＲ生成物の１：５０希釈を伴う、一般的なプライマー
ペアーを利用する増幅を必要としている。この生成物を
次に三種の入れ子プライマー（例えば上流に２つそして
下流に１つ）を用いて再増幅せしめる。任意の特定の対
立遺伝子に関して、１種の入れ子プライマーのみが伸長
すべき標的と十分に相補性である。ＰＣＲ生成物の長さ
及びサイズにおいて相違するこれらのプライマーは対立
遺伝子状態の測定を可能とする。
ている。Proc.Natl.Acad.Sci.USA86, 2423-2437(1989)
は、内部プライマーがその後の捕獲及び検出のために標
識された改良入れ子プライミング方法を詳細している。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA87, 4580-4584(1990) は、対立
遺伝子特異的検出のための「ヘミネスチング（ｈｅｍｉ
ｎｅｓｔｉｎｇ）方法」を開示している。この方法はＰ
ＣＲ生成物の１：５０希釈を伴う、一般的なプライマー
ペアーを利用する増幅を必要としている。この生成物を
次に三種の入れ子プライマー（例えば上流に２つそして
下流に１つ）を用いて再増幅せしめる。任意の特定の対
立遺伝子に関して、１種の入れ子プライマーのみが伸長
すべき標的と十分に相補性である。ＰＣＲ生成物の長さ
及びサイズにおいて相違するこれらのプライマーは対立
遺伝子状態の測定を可能とする。
【００１４】Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86, 2757-2760
(1989) は鎌状赤血球貧血の診断のための対立遺伝子特
異的増幅のための方法を詳細する。この方法に関して、
３種のプライマーが増幅反応において含まれている。即
ち、２種の対立遺伝子特異的プライマーであって一方は
鎌状赤血球対立遺伝子に特異的であり、そして他方は正
常対立遺伝子に特異的であるもの、及びいづれもの対立
遺伝子を増幅させるための第３のプライマーである。緊
張条件のもと、この対立遺伝子特異的プライマーは相補
標的上においてのみ伸長されるであろう。従って、１種
のプライマーペアーのみが任意の特定標的のためのＰＣ
Ｒにおいて機能するであろう。Proc.Natl.Acad.Sci.USA
86, 6215-6219(1989) も対立遺伝子特異的増幅を詳細
している。非入れ子方法において、選択増幅によって複
数の特定対立遺伝子を区別するためにプライマー配列を
改質せしめている。
(1989) は鎌状赤血球貧血の診断のための対立遺伝子特
異的増幅のための方法を詳細する。この方法に関して、
３種のプライマーが増幅反応において含まれている。即
ち、２種の対立遺伝子特異的プライマーであって一方は
鎌状赤血球対立遺伝子に特異的であり、そして他方は正
常対立遺伝子に特異的であるもの、及びいづれもの対立
遺伝子を増幅させるための第３のプライマーである。緊
張条件のもと、この対立遺伝子特異的プライマーは相補
標的上においてのみ伸長されるであろう。従って、１種
のプライマーペアーのみが任意の特定標的のためのＰＣ
Ｒにおいて機能するであろう。Proc.Natl.Acad.Sci.USA
86, 6215-6219(1989) も対立遺伝子特異的増幅を詳細
している。非入れ子方法において、選択増幅によって複
数の特定対立遺伝子を区別するためにプライマー配列を
改質せしめている。
【００１５】従って、入れ子プライマー増幅の特異性及
び感度の両者を高める簡潔な方法が必要とされている。
処理段階を少なくし、且つ交差汚染及びその結果として
の不正確な結果の可能性を最小にもする改善された方法
が所望されている。
び感度の両者を高める簡潔な方法が必要とされている。
処理段階を少なくし、且つ交差汚染及びその結果として
の不正確な結果の可能性を最小にもする改善された方法
が所望されている。
【００１６】本発明は入れ子プライマー増幅のための改
善された方法を提供する。本方法は従来の方法よりも改
善された特異性及び感度を提供する。本発明に従い、改
善結果を提供するために増幅反応の熱サイクル条件を改
良した。増幅プライマーの配列、長さ及び／又は濃度も
改良した。更にある態様において、増幅中の温度サイク
ル条件を改良したとき、２種のプライマーのみを必要と
された。しかしながら一般に、該方法は２種より多くの
増幅プライマーが増幅反応混合物に含まれていることを
条件とする。本発明の方法は従来の入れ子増幅方法より
もより少ない段階を有し、従って従来の入れ子プライミ
ング方法よりも速く且つ簡単である。
善された方法を提供する。本方法は従来の方法よりも改
善された特異性及び感度を提供する。本発明に従い、改
善結果を提供するために増幅反応の熱サイクル条件を改
良した。増幅プライマーの配列、長さ及び／又は濃度も
改良した。更にある態様において、増幅中の温度サイク
ル条件を改良したとき、２種のプライマーのみを必要と
された。しかしながら一般に、該方法は２種より多くの
増幅プライマーが増幅反応混合物に含まれていることを
条件とする。本発明の方法は従来の入れ子増幅方法より
もより少ない段階を有し、従って従来の入れ子プライミ
ング方法よりも速く且つ簡単である。
【００１７】本方法は、標的核酸を増幅させるための反
応において第１及び第２プライマーが存在するＰＣＲを
基礎とする増幅技術に特に適する。本発明に従い、改善
された入れ子増幅のため、該第１及び第２プライマーに
より生ずる増幅生成物とハイブリダイズすることができ
る第３プライマーをこの増幅反応において含ませてい
る。この改良入れ子プライミング方法は、増幅反応混合
物中の各プライマーの固有の性質を利用して、どのプラ
イマーをそれぞれの熱サイクルの際に伸長するかをコン
トロールしている。この方法はあらゆる特定の標的配列
の増幅のために適する。臨床的な立場において、この方
法は従来の入れ子増幅方法の多数の段階を減らすことに
より、迅速さ、簡潔さ、そして試料間の交差汚染の低い
可能性を提供している。
応において第１及び第２プライマーが存在するＰＣＲを
基礎とする増幅技術に特に適する。本発明に従い、改善
された入れ子増幅のため、該第１及び第２プライマーに
より生ずる増幅生成物とハイブリダイズすることができ
る第３プライマーをこの増幅反応において含ませてい
る。この改良入れ子プライミング方法は、増幅反応混合
物中の各プライマーの固有の性質を利用して、どのプラ
イマーをそれぞれの熱サイクルの際に伸長するかをコン
トロールしている。この方法はあらゆる特定の標的配列
の増幅のために適する。臨床的な立場において、この方
法は従来の入れ子増幅方法の多数の段階を減らすことに
より、迅速さ、簡潔さ、そして試料間の交差汚染の低い
可能性を提供している。
【００１８】本方法は、プライマー伸長及び熱サイクル
を特徴とするあらゆる核酸増幅方法における利用に適す
る。本明細書において紹介する本発明の方法はＰＣＲを
基礎とする方法であるが、本発明はＰＣＲ増幅に限られ
ることはない。ＰＣＲは本発明に関連する技術において
広く実用されており、従って便宜上一般的なＰＣＲ方法
を簡潔に説明する。
を特徴とするあらゆる核酸増幅方法における利用に適す
る。本明細書において紹介する本発明の方法はＰＣＲを
基礎とする方法であるが、本発明はＰＣＲ増幅に限られ
ることはない。ＰＣＲは本発明に関連する技術において
広く実用されており、従って便宜上一般的なＰＣＲ方法
を簡潔に説明する。
【００１９】ＰＣＲによるＤＮＡの増幅は米国特許明細
書第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，３０２号
に開示されている。熱安定性酵素を利用するＰＣＲによ
る核酸の増幅及び検出のため方法は米国特許明細書第
４，９６５，１８８号に開示されている。
書第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，３０２号
に開示されている。熱安定性酵素を利用するＰＣＲによ
る核酸の増幅及び検出のため方法は米国特許明細書第
４，９６５，１８８号に開示されている。
【００２０】ＤＮＡのＰＣＲ増幅は、ＤＮＡの熱変性の
繰り返しサイクル、増幅すべきＤＮＡセグメントとフラ
ンクする配列への２種のオリゴヌクレオチドプライマー
のアニール、そしてＤＮＡポリメラーゼによるこのアニ
ールしたプライマーの伸長を含んでいる。これらのプラ
イマーは標的配列の対応鎖にハイブリダイズし、そして
ポリメラーゼによるＤＮＡ合成がこれらのプライマーの
間の領域にわたって効率的にこのＤＮＡセグメントの量
を２倍化せしめるようこれらは位置する。更に、この伸
長生成物はプライマーと相補性であり、従ってこれらと
結合することができるため、各連続サイクルは実質的に
先行サイクルにおいて合成されたＤＮＡの量を２倍化せ
しめる。このことは特定の標的フラグメントを１サイク
ル当り約２n の率にて（ここで「ｎ」はサイクル数であ
る）対数的に増加させる。
繰り返しサイクル、増幅すべきＤＮＡセグメントとフラ
ンクする配列への２種のオリゴヌクレオチドプライマー
のアニール、そしてＤＮＡポリメラーゼによるこのアニ
ールしたプライマーの伸長を含んでいる。これらのプラ
イマーは標的配列の対応鎖にハイブリダイズし、そして
ポリメラーゼによるＤＮＡ合成がこれらのプライマーの
間の領域にわたって効率的にこのＤＮＡセグメントの量
を２倍化せしめるようこれらは位置する。更に、この伸
長生成物はプライマーと相補性であり、従ってこれらと
結合することができるため、各連続サイクルは実質的に
先行サイクルにおいて合成されたＤＮＡの量を２倍化せ
しめる。このことは特定の標的フラグメントを１サイク
ル当り約２n の率にて（ここで「ｎ」はサイクル数であ
る）対数的に増加させる。
【００２１】「増幅反応系」なる語は、核酸の標的配列
のコピーを増やすための任意の試験管内手段を意味す
る。このような方法にはポリメラーゼ（ＰＣＲ）、ＤＮ
Ａリガーゼ、（ＬＣＲ）、Ｑβ ＲＮＡレプリカーゼ及
びＲＮＡ転写ベース（ＴＡＳ及び３ＳＲ）増幅系が含ま
れるが、それらに限定されない。
のコピーを増やすための任意の試験管内手段を意味す
る。このような方法にはポリメラーゼ（ＰＣＲ）、ＤＮ
Ａリガーゼ、（ＬＣＲ）、Ｑβ ＲＮＡレプリカーゼ及
びＲＮＡ転写ベース（ＴＡＳ及び３ＳＲ）増幅系が含ま
れるが、それらに限定されない。
【００２２】標的核酸における「対数的」増大を一般的
に意味する「増幅」なる語は、核酸の選ばれた配列の数
の直線的及び対数的増大の両方を説明するために本明細
書で用いている。
に意味する「増幅」なる語は、核酸の選ばれた配列の数
の直線的及び対数的増大の両方を説明するために本明細
書で用いている。
【００２３】「増幅反応混合物」なる語は、標的核酸を
増幅せしめるために用いる種々の試薬を含んで成る水溶
液を意味する。これらは酵素、水性緩衝液、塩類、増幅
プライマー、標的核酸及びヌクレオシド３リン酸を含
む。含有物に依存して、この混合物は完全又は不完全増
幅反応混合物のいづれかとなりうる。本明細書に詳細の
この系は当業者によって通常利用されるものである。こ
れらは他の者により既に詳細されている。
増幅せしめるために用いる種々の試薬を含んで成る水溶
液を意味する。これらは酵素、水性緩衝液、塩類、増幅
プライマー、標的核酸及びヌクレオシド３リン酸を含
む。含有物に依存して、この混合物は完全又は不完全増
幅反応混合物のいづれかとなりうる。本明細書に詳細の
この系は当業者によって通常利用されるものである。こ
れらは他の者により既に詳細されている。
【００２４】本発明は任意の特定の増幅系に限定されな
い。その他の系が開発されれば、それらの系は本発明の
実施によって有利となりうる。近年の増幅系の概要は B
io／Technology ８, 290-293(1990) に公開されてい
る。ＰＣＲの他に、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）が代り
となる熱サイクル増幅方法である。ＰＣＲ／ＬＣＲを組
合せた方法は本発明と一緒に利用するのに適する。この
リガーゼ連鎖反応の概要は、リガーゼを基礎とする増幅
系に詳しくない者のために、そして本発明の広さを理解
してもらうために便宜上以降に提供する。
い。その他の系が開発されれば、それらの系は本発明の
実施によって有利となりうる。近年の増幅系の概要は B
io／Technology ８, 290-293(1990) に公開されてい
る。ＰＣＲの他に、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）が代り
となる熱サイクル増幅方法である。ＰＣＲ／ＬＣＲを組
合せた方法は本発明と一緒に利用するのに適する。この
リガーゼ連鎖反応の概要は、リガーゼを基礎とする増幅
系に詳しくない者のために、そして本発明の広さを理解
してもらうために便宜上以降に提供する。
【００２５】ＬＣＲはＰＣＴ特許公報ＷＯ８９／０９８
３５に詳細されている。この方法は標的核酸にアニール
するオリゴヌクレオチドセグメントを連結するためのリ
ガーゼの利用を含んでいる。ＬＣＲはもとの標的分子の
増幅をもたらし、そして生成物ＤＮＡの数百万コピーを
提供することができる。従って、ＬＣＲは二本鎖ＤＮＡ
における量の増大をもたらす。本検出方法はＬＣＲ及び
ＰＣＲに適用できる。ＬＣＲは生成物ＤＮＡを検出する
ためのオリゴヌクレオチドプローブを必要とする。
３５に詳細されている。この方法は標的核酸にアニール
するオリゴヌクレオチドセグメントを連結するためのリ
ガーゼの利用を含んでいる。ＬＣＲはもとの標的分子の
増幅をもたらし、そして生成物ＤＮＡの数百万コピーを
提供することができる。従って、ＬＣＲは二本鎖ＤＮＡ
における量の増大をもたらす。本検出方法はＬＣＲ及び
ＰＣＲに適用できる。ＬＣＲは生成物ＤＮＡを検出する
ためのオリゴヌクレオチドプローブを必要とする。
【００２６】開示する態様において、Ｔａｑ ＤＮＡポ
リメラーゼが好ましいが、それらは本発明の本質的な観
点ではない。熱安定性ポリメラーゼであるＴａｑポリメ
ラーゼは高温で活性である。Ｔａｑの調製方法は米国特
許明細書第４，８８９，８１８号に開始されている。Ｔ
ａｑポリメラーゼは組換え生成物又はサーマス アクア
ティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から
精製されたものとして市販されている。しかしながら、
サーマス種もしくは非サーマス種（例えばサーマス サ
ーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｏｕｓ）もしくはサーモトガ マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏ
ｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）から単離した熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、同様に非熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼ、例えばＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ、又はＥ．コリのクレノウフラグメントもＰＣＲ
において利用できる。伸長工程において利用されるヌク
レオシド−５′−３リン酸、典型的にはｄＡＴＰ，ｄＣ
ＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ又は伸長反応の際に総濃度
において典型的に４００μＭ〜４．０mMの範囲で存在し
うるが、好ましくはその濃度は５００μＭ〜１．５μＭ
である。
リメラーゼが好ましいが、それらは本発明の本質的な観
点ではない。熱安定性ポリメラーゼであるＴａｑポリメ
ラーゼは高温で活性である。Ｔａｑの調製方法は米国特
許明細書第４，８８９，８１８号に開始されている。Ｔ
ａｑポリメラーゼは組換え生成物又はサーマス アクア
ティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から
精製されたものとして市販されている。しかしながら、
サーマス種もしくは非サーマス種（例えばサーマス サ
ーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｏｕｓ）もしくはサーモトガ マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏ
ｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）から単離した熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、同様に非熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼ、例えばＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ、又はＥ．コリのクレノウフラグメントもＰＣＲ
において利用できる。伸長工程において利用されるヌク
レオシド−５′−３リン酸、典型的にはｄＡＴＰ，ｄＣ
ＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ又は伸長反応の際に総濃度
において典型的に４００μＭ〜４．０mMの範囲で存在し
うるが、好ましくはその濃度は５００μＭ〜１．５μＭ
である。
【００２７】Ｔａｑポリメラーゼは９４kDa 及び６２kD
a の両方の酵素として調製されうる。６２kDa の酵素は
９４kDa の酵素のＮ末端領域のタンパク質分解切断の結
果としてのプロセスを受けた型である。この酵素のいづ
れの型もＰＣＲにおける重合試薬として機能するであろ
う。このＮ末端欠失の他に、個々のアミノ酸を酸化、還
元もしくはその他の誘導化により改質せしめるか、又は
活性を保持するフラグメントを得るためにこのタンパク
質を切断せしめることがある。
a の両方の酵素として調製されうる。６２kDa の酵素は
９４kDa の酵素のＮ末端領域のタンパク質分解切断の結
果としてのプロセスを受けた型である。この酵素のいづ
れの型もＰＣＲにおける重合試薬として機能するであろ
う。このＮ末端欠失の他に、個々のアミノ酸を酸化、還
元もしくはその他の誘導化により改質せしめるか、又は
活性を保持するフラグメントを得るためにこのタンパク
質を切断せしめることがある。
【００２８】従って、該タンパク質の高温ＤＮＡポリメ
ラーゼ活性を破壊せしめることなく、翻訳の際のこの配
列に組込まれるアミノ酸の欠失、付加又は変更によるそ
の一次構造自体の改質を行うことができる。このような
置換又はその他の変更は本発明の方法に有用なタンパク
質をもたらしうる。
ラーゼ活性を破壊せしめることなく、翻訳の際のこの配
列に組込まれるアミノ酸の欠失、付加又は変更によるそ
の一次構造自体の改質を行うことができる。このような
置換又はその他の変更は本発明の方法に有用なタンパク
質をもたらしうる。
【００２９】本発明の１つの観点において、５′から
３′へのエキソヌクレアーゼ活性を欠いている熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼが適切である。アウタープライマー
の伸長の最中、同一の鋳型鎖と相補性であり、その標的
と瞬間的にアニールするインナープライマーは、野生型
ＤＮＡポリメラーゼの５′から３′へのエキソヌクレア
ーゼ活性によって分解する可能性がある。このような分
解の全体的な作用はインナープライマーの濃度を低下さ
せるであろう。本発明に関して、このインナープライマ
ーは過剰量において存在する。従って、５′から３′へ
のエキソヌクレアーゼ活性を欠く酵素の利用は本発明の
実施のためには本質的でない。しかしながら、５′から
３′へのエキソヌクレアーゼ活性を有さない又は低い活
性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの利用は開示す
る増幅の方法の実施の好ましい方法を提供する。このよ
うなポリメラーゼは周知であり、且つ市販されている。
３′へのエキソヌクレアーゼ活性を欠いている熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼが適切である。アウタープライマー
の伸長の最中、同一の鋳型鎖と相補性であり、その標的
と瞬間的にアニールするインナープライマーは、野生型
ＤＮＡポリメラーゼの５′から３′へのエキソヌクレア
ーゼ活性によって分解する可能性がある。このような分
解の全体的な作用はインナープライマーの濃度を低下さ
せるであろう。本発明に関して、このインナープライマ
ーは過剰量において存在する。従って、５′から３′へ
のエキソヌクレアーゼ活性を欠く酵素の利用は本発明の
実施のためには本質的でない。しかしながら、５′から
３′へのエキソヌクレアーゼ活性を有さない又は低い活
性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの利用は開示す
る増幅の方法の実施の好ましい方法を提供する。このよ
うなポリメラーゼは周知であり、且つ市販されている。
【００３０】本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」
なる語は、２個以上、好ましくは３個より多く、そして
通常は１０個より多くのデオキシリボヌクレオシド又は
リボヌクレオシドを含んで成る分子として定義する。そ
の正確なサイズは多数の要因に依存し、言い換えるなら
オリゴヌクレオチドの最終機能又は利用に依存するであ
ろう。このオリゴヌクレオチドは合成又はクローニング
により得られうる。
なる語は、２個以上、好ましくは３個より多く、そして
通常は１０個より多くのデオキシリボヌクレオシド又は
リボヌクレオシドを含んで成る分子として定義する。そ
の正確なサイズは多数の要因に依存し、言い換えるなら
オリゴヌクレオチドの最終機能又は利用に依存するであ
ろう。このオリゴヌクレオチドは合成又はクローニング
により得られうる。
【００３１】本明細書で用いる「プライマー」なる語
は、精製制限消化において天然的に生ずるもの又は合成
的に製造したものであろうと関係なく、核酸鎖に相補性
のプライマー伸長生成物の合成が開始される条件（即
ち、適切な緩衝液〔「緩衝」はpH、イオン強度、補助因
子、他を含む〕中における種々のヌクレオシド３リン酸
及びＤＮＡポリメラーゼの存在下、且つ適切な温度の条
件）に入れた場合、合成の開始の箇所として働くことが
できるオリゴヌクレオチドを意味する。
は、精製制限消化において天然的に生ずるもの又は合成
的に製造したものであろうと関係なく、核酸鎖に相補性
のプライマー伸長生成物の合成が開始される条件（即
ち、適切な緩衝液〔「緩衝」はpH、イオン強度、補助因
子、他を含む〕中における種々のヌクレオシド３リン酸
及びＤＮＡポリメラーゼの存在下、且つ適切な温度の条
件）に入れた場合、合成の開始の箇所として働くことが
できるオリゴヌクレオチドを意味する。
【００３２】本明細書で用いる「熱サイクルプロフィー
ル」なる語は選ばれた「ｎ回」のＰＣＲサイクルのため
に選ばれる温度パラメーターに関する。この熱サイクル
プロフィールは少なくとも２種類の温度、即ち、試料鋳
型及びその後の生成物の変性に適当な高い変性温度、並
びにプライマーのアニール及びポリメラーゼ伸長のため
に適当な低い温度を含んでいる。従って本発明におい
て、特定の熱サイクルパラメーターはプライマーのアニ
ール及び生成物の変性をコントロールするために選ば
れ、これによって鋳型の接近性及びプライマー伸長を制
御する。
ル」なる語は選ばれた「ｎ回」のＰＣＲサイクルのため
に選ばれる温度パラメーターに関する。この熱サイクル
プロフィールは少なくとも２種類の温度、即ち、試料鋳
型及びその後の生成物の変性に適当な高い変性温度、並
びにプライマーのアニール及びポリメラーゼ伸長のため
に適当な低い温度を含んでいる。従って本発明におい
て、特定の熱サイクルパラメーターはプライマーのアニ
ール及び生成物の変性をコントロールするために選ば
れ、これによって鋳型の接近性及びプライマー伸長を制
御する。
【００３３】ＰＣＲにおいて利用するプライマーの選択
は増幅反応の特異性を決定する。本発明において利用す
るプライマーは一般にオリゴヌクレオチド、通常は数個
のヌクレオチドにおける長さのデオキキシヌクレオチド
であってポリメラーゼ連鎖反応による鋳型特異的手段に
おいて伸長されうるものである。このプライマーは重合
のための試薬の存在下において伸長生成物の合成を開始
せしめるのに十分な長さであり、そして典型的には１０
〜３０個のヌクレオチドを含むが、しかしその正確な数
は本方法の有効な用途にとって重要ではない。
は増幅反応の特異性を決定する。本発明において利用す
るプライマーは一般にオリゴヌクレオチド、通常は数個
のヌクレオチドにおける長さのデオキキシヌクレオチド
であってポリメラーゼ連鎖反応による鋳型特異的手段に
おいて伸長されうるものである。このプライマーは重合
のための試薬の存在下において伸長生成物の合成を開始
せしめるのに十分な長さであり、そして典型的には１０
〜３０個のヌクレオチドを含むが、しかしその正確な数
は本方法の有効な用途にとって重要ではない。
【００３４】本発明の一態様において、鋳型との十分に
安定なハイブリド複合体を形成せしめるのに一般に低め
の温度を必要とする短めのプライマーを、熱サイクルの
際のアニール温度を操作を介してこの増幅反応の感度及
び特異性を究極的に高める入れ子プライマーの増幅段階
の開始を促進せしめるために提供する。ここで用いてい
る短いプライマーは、標的ＤＮＡとアニールしていると
き、アウタープライマーをフランクさせる場合よりも熱
的に不安定であることを特徴とする。関連して、短いプ
ライマーは一般に８〜１８個のヌクレオチドである。本
発明の他の観点において、１０〜３０個のヌクレオチド
の相同性プライマー領域に２０〜１００個のヌクレオチ
ドの付加された、非相補性尾部を含む長いプライマーが
提供される。この非相補性領域は熱安定性の高い伸長生
成物を提供するのに有用であり、これは増幅鋳型として
働くためにはその後の変性に関して高い温度を必要とす
る。
安定なハイブリド複合体を形成せしめるのに一般に低め
の温度を必要とする短めのプライマーを、熱サイクルの
際のアニール温度を操作を介してこの増幅反応の感度及
び特異性を究極的に高める入れ子プライマーの増幅段階
の開始を促進せしめるために提供する。ここで用いてい
る短いプライマーは、標的ＤＮＡとアニールしていると
き、アウタープライマーをフランクさせる場合よりも熱
的に不安定であることを特徴とする。関連して、短いプ
ライマーは一般に８〜１８個のヌクレオチドである。本
発明の他の観点において、１０〜３０個のヌクレオチド
の相同性プライマー領域に２０〜１００個のヌクレオチ
ドの付加された、非相補性尾部を含む長いプライマーが
提供される。この非相補性領域は熱安定性の高い伸長生
成物を提供するのに有用であり、これは増幅鋳型として
働くためにはその後の変性に関して高い温度を必要とす
る。
【００３５】合成ヌクレオチドはJ.Am.Chem.Soc. 103
, 3185-3191(1981) に詳細のトリエステル方法を用い
て調製できうる。他方、例えばシアノエチルホスホラミ
ジト化学を用いるＤＮＡ合成装置における自動合成が好
ましい。
, 3185-3191(1981) に詳細のトリエステル方法を用い
て調製できうる。他方、例えばシアノエチルホスホラミ
ジト化学を用いるＤＮＡ合成装置における自動合成が好
ましい。
【００３６】プライマーは、特定な配列を有する鋳型の
鎖と「実質的に」相補性であるよう選ぶ。プライマー伸
長を行うため、このプライマーはこの反応条件のもとで
核酸鋳型とアニールするために十分に相補性でなくては
ならない。プライマー伸長を行うためにこのプライマー
の全てのヌクレオチドがこの鋳型とアニールしなくては
ならないことはない。例えば本発明の一態様において、
非相補性ヌクレオチドフラグメント又は尾部がプライマ
ーの５′末端に付いており、そしてこのプライマー配列
の残り部分がこの鋳型と相補性である。他方、非相補性
塩基をこのプライマーの中に分散させることもでき、こ
の場合このプライマー配列はこの鋳型とハイブリダイゼ
ーションが生じ、且つ相補ＤＮＡ鎖の合成が可能となる
よう十分に相補性であることを条件とする。
鎖と「実質的に」相補性であるよう選ぶ。プライマー伸
長を行うため、このプライマーはこの反応条件のもとで
核酸鋳型とアニールするために十分に相補性でなくては
ならない。プライマー伸長を行うためにこのプライマー
の全てのヌクレオチドがこの鋳型とアニールしなくては
ならないことはない。例えば本発明の一態様において、
非相補性ヌクレオチドフラグメント又は尾部がプライマ
ーの５′末端に付いており、そしてこのプライマー配列
の残り部分がこの鋳型と相補性である。他方、非相補性
塩基をこのプライマーの中に分散させることもでき、こ
の場合このプライマー配列はこの鋳型とハイブリダイゼ
ーションが生じ、且つ相補ＤＮＡ鎖の合成が可能となる
よう十分に相補性であることを条件とする。
【００３７】増幅すべき特定の核酸標的領域の選択は、
プライマー配列及び増幅特異性を決定する。例えば、不
変領域に対するプライマーは遺伝子配列のクラスを増幅
せしめ、そして可変領域に相補性のプライマーはより高
い生成物特異性を提供する。
プライマー配列及び増幅特異性を決定する。例えば、不
変領域に対するプライマーは遺伝子配列のクラスを増幅
せしめ、そして可変領域に相補性のプライマーはより高
い生成物特異性を提供する。
【００３８】本発明は対立遺伝子特異的増幅に特に適す
る。本発明の一態様において、アウタープライマーは一
般のプライマーとして働き、そして（複数の）インナー
プライマーは対立遺伝子特異性でありうる。本方法に従
い、このアウタープライマーはＰＣＲ生成物を作り、そ
してこれはその後第２の小さなＰＣＲ生成物を作るため
の鋳型として働きうる。従って、アウタープライマーに
より特定される大きめの一般的なＰＣＲ生成物の検出
は、内部陽性コントロールを提供する。この対立遺伝子
特異的増幅生成物は試験官を開封することなく同一の反
応容器中で生ずる。この利点は更に微量物質、例えばＡ
ＩＤＳウィルス核酸の存在について同時に数千種の試料
をスクリーンする臨床試験において、又は法医学分析に
おいて試料が貴重であるかもしくは犯罪の証拠を提供
し、且つその試料の量が非常に限られている場合に特に
有用である。
る。本発明の一態様において、アウタープライマーは一
般のプライマーとして働き、そして（複数の）インナー
プライマーは対立遺伝子特異性でありうる。本方法に従
い、このアウタープライマーはＰＣＲ生成物を作り、そ
してこれはその後第２の小さなＰＣＲ生成物を作るため
の鋳型として働きうる。従って、アウタープライマーに
より特定される大きめの一般的なＰＣＲ生成物の検出
は、内部陽性コントロールを提供する。この対立遺伝子
特異的増幅生成物は試験官を開封することなく同一の反
応容器中で生ずる。この利点は更に微量物質、例えばＡ
ＩＤＳウィルス核酸の存在について同時に数千種の試料
をスクリーンする臨床試験において、又は法医学分析に
おいて試料が貴重であるかもしくは犯罪の証拠を提供
し、且つその試料の量が非常に限られている場合に特に
有用である。
【００３９】増幅系、例えばＰＣＲは、標的の増幅に用
いる酵素と混和性の緩衝液の中において標的核酸を必要
とする。この標的核酸は組織、体液、排せつ物、喀痰、
だ液、植物細胞、細菌培養物等を含む生物材料の任意の
起源から単離されうる。
いる酵素と混和性の緩衝液の中において標的核酸を必要
とする。この標的核酸は組織、体液、排せつ物、喀痰、
だ液、植物細胞、細菌培養物等を含む生物材料の任意の
起源から単離されうる。
【００４０】試料中の標的核酸を増幅するため、この配
列は該増幅系の成分と接しなくてはならない。一般に、
この接近は粗生物試料から核酸を単離せしめることによ
って確実となる。生物試料から核酸を抽出する種々の方
法が当業界に知られている。例えば、Molecular Clonin
g ：A Laboratory Manual(New York, Cold Spring Harb
or Laboratory, 1982), Nucleic Acid Hybridization：
A Practical Approach(Eds.Hames and Higgins, IRL Pr
ess, 1985)又はＰＣＲプロトコール、章18-20(Innis
ら、Ed., Academic Press, 1990)を参照のこと。
列は該増幅系の成分と接しなくてはならない。一般に、
この接近は粗生物試料から核酸を単離せしめることによ
って確実となる。生物試料から核酸を抽出する種々の方
法が当業界に知られている。例えば、Molecular Clonin
g ：A Laboratory Manual(New York, Cold Spring Harb
or Laboratory, 1982), Nucleic Acid Hybridization：
A Practical Approach(Eds.Hames and Higgins, IRL Pr
ess, 1985)又はＰＣＲプロトコール、章18-20(Innis
ら、Ed., Academic Press, 1990)を参照のこと。
【００４１】一般に、試料中の核酸はＤＮＡの配列であ
り、最も通常にはゲノムＤＮＡである。しかしながら、
本発明はその他の核酸、例えばメッセンジャーＲＮＡ、
リボソームＲＮＡ、ウィルスＲＮＡ又はクローン化ＤＮ
Ａによって実施することもできる。適切な核酸試料は本
発明に利用するための一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ又は
ＲＮＡを含む。当業者は、核酸の性質に関係なく、この
核酸は利用する方法を適切且つよく知られた改良を行う
ことによって簡単に増幅できることを知っている。
り、最も通常にはゲノムＤＮＡである。しかしながら、
本発明はその他の核酸、例えばメッセンジャーＲＮＡ、
リボソームＲＮＡ、ウィルスＲＮＡ又はクローン化ＤＮ
Ａによって実施することもできる。適切な核酸試料は本
発明に利用するための一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ又は
ＲＮＡを含む。当業者は、核酸の性質に関係なく、この
核酸は利用する方法を適切且つよく知られた改良を行う
ことによって簡単に増幅できることを知っている。
【００４２】当業者が知るには、ＰＣＲ方法は熱安定性
酵素を伴う自動化プロセスとして最も通常的に行われて
いる。このプロセスにおいて、この反応混合物は変性を
及ぼす温度範囲、プライマーのアニールの温度範囲及び
伸長の温度範囲にわたってサイクルされる。一般に、こ
のアニールと伸長の温度範囲は重複しており、従ってＰ
ＣＲは変性段階とアニール／伸長段階を含んで成るツー
ステップサイクル反応として通常行なわれる。熱安定性
酵素を用いて利用するのに特に合わせてある装置はヨー
ロッパ特許公開２３６，０６９号により完璧に詳細さ
れ、そして市販されている。
酵素を伴う自動化プロセスとして最も通常的に行われて
いる。このプロセスにおいて、この反応混合物は変性を
及ぼす温度範囲、プライマーのアニールの温度範囲及び
伸長の温度範囲にわたってサイクルされる。一般に、こ
のアニールと伸長の温度範囲は重複しており、従ってＰ
ＣＲは変性段階とアニール／伸長段階を含んで成るツー
ステップサイクル反応として通常行なわれる。熱安定性
酵素を用いて利用するのに特に合わせてある装置はヨー
ロッパ特許公開２３６，０６９号により完璧に詳細さ
れ、そして市販されている。
【００４３】本明細書で詳細する方法において、特定の
対象のオリゴヌクレオチド配列、即ち「標的核酸」を含
む又は含むと予想される試料を用意する。この標的はＲ
ＮＡもしくはＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリドであ
りうる。この標的は一本鎖でも二本鎖でもよい。標的の
準備は特定の増幅プロセスが満足される適切な方法にお
いて行われる。例えば、該標的核酸が一本鎖の例えばｍ
ＲＮＡである場合のＰＣＲ方法において、この標的を増
幅する前にまずｃＤＮＡへと逆転写せしめる。
対象のオリゴヌクレオチド配列、即ち「標的核酸」を含
む又は含むと予想される試料を用意する。この標的はＲ
ＮＡもしくはＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリドであ
りうる。この標的は一本鎖でも二本鎖でもよい。標的の
準備は特定の増幅プロセスが満足される適切な方法にお
いて行われる。例えば、該標的核酸が一本鎖の例えばｍ
ＲＮＡである場合のＰＣＲ方法において、この標的を増
幅する前にまずｃＤＮＡへと逆転写せしめる。
【００４４】増幅生成物の検出は多数の知られている方
法によって成し遂げられうる。このような手段には、例
えばドットプロット又は電気泳動方式におけるアイソト
ープもしくは非アイソトープ的標識プローブとのハイブ
リダイゼーションを含むが、それらに限定されない。検
出方式系は捕獲段階、例えば固相支持体及びアビジン−
ビオチン標識系を含みうる。ヨーロッパ特許公開第２３
７，３６２号には、「リバース」ドットプロットと称さ
れているＰＣＲを基礎とする検出方法が詳細され、これ
においては増幅ＤＮＡの代りにプローブが膜に結合され
ている。この方法に従うと、プローブよりもむしろ標的
をハイブリダイゼーションのために標識する。
法によって成し遂げられうる。このような手段には、例
えばドットプロット又は電気泳動方式におけるアイソト
ープもしくは非アイソトープ的標識プローブとのハイブ
リダイゼーションを含むが、それらに限定されない。検
出方式系は捕獲段階、例えば固相支持体及びアビジン−
ビオチン標識系を含みうる。ヨーロッパ特許公開第２３
７，３６２号には、「リバース」ドットプロットと称さ
れているＰＣＲを基礎とする検出方法が詳細され、これ
においては増幅ＤＮＡの代りにプローブが膜に結合され
ている。この方法に従うと、プローブよりもむしろ標的
をハイブリダイゼーションのために標識する。
【００４５】プローブが試料中に含まれているＤＮＡ配
列とハイブリダイズしたかを調べるための多数の方法が
存在する。典型的には、このプローブが検出可能な方法
において標識する。この標的ＤＮＡ（即ち、ＰＣＲ反応
緩衝液中の増幅ＤＮＡ）は固相支持体と結合しており、
そしてハイブリダイゼーションが生じたかの検出はこの
固相支持体上に標識物が存在しているかを調べることを
含む。しかしながらこの方法は変えることができ、そし
てこの標的が標識され且つこのプローブがこの固相支持
体に結合している場合が考えられる。
列とハイブリダイズしたかを調べるための多数の方法が
存在する。典型的には、このプローブが検出可能な方法
において標識する。この標的ＤＮＡ（即ち、ＰＣＲ反応
緩衝液中の増幅ＤＮＡ）は固相支持体と結合しており、
そしてハイブリダイゼーションが生じたかの検出はこの
固相支持体上に標識物が存在しているかを調べることを
含む。しかしながらこの方法は変えることができ、そし
てこの標的が標識され且つこのプローブがこの固相支持
体に結合している場合が考えられる。
【００４６】プローブであるか標的であるかは関係な
く、核酸を標識するための多数の方法が当業界に知ら
れ、そしてそれらは本発明の目的に適する。適切な標識
は螢光、放射活性、比色、Ｘ線回折又は吸収、磁性、酵
素活性等により検出できるシグナルを提出しうる。適切
な標識物には螢光団、発色団、放射性アイソトープ（特
に32Ｐ及び 125Ｉ）、電子密度物質、酵素及び特定の結
合パートナーを有するリガンドが含まれる。酵素は一般
にその活性により検出される。例えば西洋ワサビペルオ
キシダーゼ（ＨＲＰ）はジアミノベンジジンを青色の色
素へと変換させうるその能力によって検出されうる。Ｈ
ＲＰを基礎とする検出はテトラメチル−ベンジジン（Ｔ
ＭＢ）を利用することが好ましい。
く、核酸を標識するための多数の方法が当業界に知ら
れ、そしてそれらは本発明の目的に適する。適切な標識
は螢光、放射活性、比色、Ｘ線回折又は吸収、磁性、酵
素活性等により検出できるシグナルを提出しうる。適切
な標識物には螢光団、発色団、放射性アイソトープ（特
に32Ｐ及び 125Ｉ）、電子密度物質、酵素及び特定の結
合パートナーを有するリガンドが含まれる。酵素は一般
にその活性により検出される。例えば西洋ワサビペルオ
キシダーゼ（ＨＲＰ）はジアミノベンジジンを青色の色
素へと変換させうるその能力によって検出されうる。Ｈ
ＲＰを基礎とする検出はテトラメチル−ベンジジン（Ｔ
ＭＢ）を利用することが好ましい。
【００４７】検出可能なＤＮＡ結合性試薬、例えば臭化
エチジウムの存在下において増幅が生ずることを利用す
る均一アッセイ系において、この増幅混合物の螢光は該
標的が増幅され、そしてこの反応混合物中に存在する二
本鎖ＤＮＡの量が増加するに従って強くなる。本発明は
このような均一アッセイ方法に関連して利用するのに特
に適する。組合せ方法は実施例２において説明し、そし
てこれは従来の核酸の増幅及び検出の方法よりも優れた
利点を提供する。
エチジウムの存在下において増幅が生ずることを利用す
る均一アッセイ系において、この増幅混合物の螢光は該
標的が増幅され、そしてこの反応混合物中に存在する二
本鎖ＤＮＡの量が増加するに従って強くなる。本発明は
このような均一アッセイ方法に関連して利用するのに特
に適する。組合せ方法は実施例２において説明し、そし
てこれは従来の核酸の増幅及び検出の方法よりも優れた
利点を提供する。
【００４８】均一アッセイ方法は一度反応を開始せしめ
たら、その反応容器を開ける必要のない標的の存在の検
出のための手段を授ける。本発明は入れ子増幅のための
反応容器を開けることを伴わない方法を提供する。従っ
て本発明に関し、この組合せ方法は、入れ子プライミン
グの高められた感度及び特異性、並びに均一アッセイ系
の検出の容易さを有する。反応容器を開けることなく、
７０，０００個の細胞において１コピーほどの微量な配
列が、標的検出のために通常必要とされる更なる処理又
は操作を伴うことなく検出されうる。本発明によって交
差汚染の可能性は大いに小さくなった。他の態様におい
て、分光螢光計の利用が生じる生成物の量の定量を可能
にする。従って、均一アッセイにおいて利用した場合、
本発明は例えば感染症の進行又は治療養生法に対する応
答をモニターするための定量分析を可能にする。
たら、その反応容器を開ける必要のない標的の存在の検
出のための手段を授ける。本発明は入れ子増幅のための
反応容器を開けることを伴わない方法を提供する。従っ
て本発明に関し、この組合せ方法は、入れ子プライミン
グの高められた感度及び特異性、並びに均一アッセイ系
の検出の容易さを有する。反応容器を開けることなく、
７０，０００個の細胞において１コピーほどの微量な配
列が、標的検出のために通常必要とされる更なる処理又
は操作を伴うことなく検出されうる。本発明によって交
差汚染の可能性は大いに小さくなった。他の態様におい
て、分光螢光計の利用が生じる生成物の量の定量を可能
にする。従って、均一アッセイにおいて利用した場合、
本発明は例えば感染症の進行又は治療養生法に対する応
答をモニターするための定量分析を可能にする。
【００４９】一般に、プライマー及び鋳型の両者をＰＣ
Ｒ反応混合物に加えた後にＤＮＡポリメラーゼを加える
ことが好ましいが、これは本質的なことではない。他
方、例えば酵素及びプライマーを最後に加える、又はＰ
ＣＲ緩衝液もしくは鋳型を含む緩衝液を最後に加えるこ
とがある。プライマー及び鋳型の両者が存在し、そして
酵素が所望のプライマー／鋳型基質と結合して伸長化を
行える時点迄、重合に本質的な成分の少なくとも１種類
が含まれていないことが所望される。「ホットスター
ト」と称する本方法は、特異性を高め且つ「プライマー
二量体」の形成を最小にせしめる。
Ｒ反応混合物に加えた後にＤＮＡポリメラーゼを加える
ことが好ましいが、これは本質的なことではない。他
方、例えば酵素及びプライマーを最後に加える、又はＰ
ＣＲ緩衝液もしくは鋳型を含む緩衝液を最後に加えるこ
とがある。プライマー及び鋳型の両者が存在し、そして
酵素が所望のプライマー／鋳型基質と結合して伸長化を
行える時点迄、重合に本質的な成分の少なくとも１種類
が含まれていないことが所望される。「ホットスター
ト」と称する本方法は、特異性を高め且つ「プライマー
二量体」の形成を最小にせしめる。
【００５０】「プライマー二量体」は２本のＰＣＲプラ
イマー及びそれらに相補性の配列より成る二本鎖のＰＣ
Ｒ生成物を意味する。プライマー二量体の合成は一方の
プライマーを鋳型として用いて他方のプライマーを伸長
することにより得られる。プライマー二量体は標的の非
存在下において生ずることができ、そしてプライマー濃
度に比例すると思われる。「プライマー二量体」の初期
形成は低温度（即ち室温）で起こりうる。従って「ホッ
トスタート」は熱的プロフィールのこの段階を少なくす
る。一担形成されたなら、このＰＣＲ副産物は非常に効
率的に増幅し、そして特異的な鋳型を微量又は全く含ま
ない反応系において検出される。微量鋳型反応系におい
て、このプライマー二量体は該プライマー及び酵素に対
する標的フラグメントと競合でき、そして有効な標的増
幅を妨害しうる。
イマー及びそれらに相補性の配列より成る二本鎖のＰＣ
Ｒ生成物を意味する。プライマー二量体の合成は一方の
プライマーを鋳型として用いて他方のプライマーを伸長
することにより得られる。プライマー二量体は標的の非
存在下において生ずることができ、そしてプライマー濃
度に比例すると思われる。「プライマー二量体」の初期
形成は低温度（即ち室温）で起こりうる。従って「ホッ
トスタート」は熱的プロフィールのこの段階を少なくす
る。一担形成されたなら、このＰＣＲ副産物は非常に効
率的に増幅し、そして特異的な鋳型を微量又は全く含ま
ない反応系において検出される。微量鋳型反応系におい
て、このプライマー二量体は該プライマー及び酵素に対
する標的フラグメントと競合でき、そして有効な標的増
幅を妨害しうる。
【００５１】入れ子プライマーの利用はプライマー二量
体を少なくし、従ってＰＣＲ特異性を高めるために働
く。米国特許明細書第４，６８３，１９５号は入れ子プ
ライマー方法が２種類のプライマーペアーを必要とする
ことを詳細している。この方法に従うと、第１の「アウ
ター」プライマーペアーを標的配列の増幅のために用
い、そして第２の「インナー」プライマーペアーをこの
第１増幅反応により形成されるＰＣＲ生成物のサブセグ
メントを増幅するために用いる。この明細書に詳細の方
法に従うと、反応混合物を１０倍に希釈してＰＣＲ後の
第１プライマーペアーの濃度を下げ、次いで第２プライ
マーペアーをこの反応混合物に導入する。この方法は多
数の更なる段階であって、ＰＣＲの停止、反応試験管の
開封、アウタープライマーの濃度を下げるための反応液
の希釈、第２プライマーペアーの添加、その結果として
の緩衝条件の調整、更なる酵素の添加、そして第２熱サ
ークル反応を含む段階を必要とする。これらの段階は本
発明により削減される。
体を少なくし、従ってＰＣＲ特異性を高めるために働
く。米国特許明細書第４，６８３，１９５号は入れ子プ
ライマー方法が２種類のプライマーペアーを必要とする
ことを詳細している。この方法に従うと、第１の「アウ
ター」プライマーペアーを標的配列の増幅のために用
い、そして第２の「インナー」プライマーペアーをこの
第１増幅反応により形成されるＰＣＲ生成物のサブセグ
メントを増幅するために用いる。この明細書に詳細の方
法に従うと、反応混合物を１０倍に希釈してＰＣＲ後の
第１プライマーペアーの濃度を下げ、次いで第２プライ
マーペアーをこの反応混合物に導入する。この方法は多
数の更なる段階であって、ＰＣＲの停止、反応試験管の
開封、アウタープライマーの濃度を下げるための反応液
の希釈、第２プライマーペアーの添加、その結果として
の緩衝条件の調整、更なる酵素の添加、そして第２熱サ
ークル反応を含む段階を必要とする。これらの段階は本
発明により削減される。
【００５２】本発明は入れ子増幅方法及び組成物を提供
し、ここで全てのアウター及びインナープライマーは最
初の反応混合物中に存在し、そして熱サイクラーは、イ
ンナープライマーではなくアウタープライマーがまず増
幅され、その後アウタープライマーでなくインナープラ
イマーが増幅されるようにプログラムされ、最初のＰＣ
Ｒ生成物内の標的サブ配列が増幅されるようになってい
る。本発明の実施例は、本発明に従って調製したプライ
マーが所望の結果と一致してこの増幅反応にドロップイ
ン（参加する）又はドロップアウト（離脱する）するよ
うに作ったことを例示するために提供する。複数の態様
において、最初のフランキングの一構成員、即ち、アウ
タープライマーペアーも、インナー又は第２プライマー
として機能しうる。従って、３種類のプライマーのみが
利用される。他方、インナー及びアウタープライマーペ
アーの両者を含んで成る４種のそれぞれのプライマーが
利用されうる。４種のプライマーを用いる場合、このイ
ンナープライマーの一方又は両者ともに「ドロップイ
ン」するように作られている。
し、ここで全てのアウター及びインナープライマーは最
初の反応混合物中に存在し、そして熱サイクラーは、イ
ンナープライマーではなくアウタープライマーがまず増
幅され、その後アウタープライマーでなくインナープラ
イマーが増幅されるようにプログラムされ、最初のＰＣ
Ｒ生成物内の標的サブ配列が増幅されるようになってい
る。本発明の実施例は、本発明に従って調製したプライ
マーが所望の結果と一致してこの増幅反応にドロップイ
ン（参加する）又はドロップアウト（離脱する）するよ
うに作ったことを例示するために提供する。複数の態様
において、最初のフランキングの一構成員、即ち、アウ
タープライマーペアーも、インナー又は第２プライマー
として機能しうる。従って、３種類のプライマーのみが
利用される。他方、インナー及びアウタープライマーペ
アーの両者を含んで成る４種のそれぞれのプライマーが
利用されうる。４種のプライマーを用いる場合、このイ
ンナープライマーの一方又は両者ともに「ドロップイ
ン」するように作られている。
【００５３】本発明に従うと、該アウタープライマーの
一構成員に内在する第３プライマーを、特定の標的セグ
メントを増幅するためのＰＣＲ反応に含ませる。ＰＣＲ
反応における温度が上昇するに従い、この第３プライマ
ーはもはや安定的に該標的鋳型とアニールしないが、フ
ランキングプライマーは未だ安定的にアニールする点が
到達される。従って、この第３プライマーはアウタープ
ライマーのフランキングの最適アニール温度よりも低い
ＰＣＲのための最適なるアニール温度を有する。この性
質はより短い長さ及び／又はより低いＧＣ含有によりこ
の第３プライマーに授けられうる。増幅反応中のアニー
ル温度の調整は、任意の特定のアニール／伸長のサイク
ルの際にどのプライマーをポリメラーゼによって伸長さ
せるかを決定する。
一構成員に内在する第３プライマーを、特定の標的セグ
メントを増幅するためのＰＣＲ反応に含ませる。ＰＣＲ
反応における温度が上昇するに従い、この第３プライマ
ーはもはや安定的に該標的鋳型とアニールしないが、フ
ランキングプライマーは未だ安定的にアニールする点が
到達される。従って、この第３プライマーはアウタープ
ライマーのフランキングの最適アニール温度よりも低い
ＰＣＲのための最適なるアニール温度を有する。この性
質はより短い長さ及び／又はより低いＧＣ含有によりこ
の第３プライマーに授けられうる。増幅反応中のアニー
ル温度の調整は、任意の特定のアニール／伸長のサイク
ルの際にどのプライマーをポリメラーゼによって伸長さ
せるかを決定する。
【００５４】本発明の一態様において、第３プライマー
にフランクするプライマーは低濃度で存在している。最
初のｎ回のＰＣＲサイクルに関して、各ＰＣＲサイクル
の伸長段階の際の温度を十分に高く（例えば約６５℃
に）維持し、短いインナープライマーが特異的にアニー
ルして増幅を開始せしめることを防止する。アウタープ
ライマーは十分にアニールし、従ってＰＣＲが高い伸長
温度にて正常に進行するようにする。増幅がプラトーに
なる前、一定のアウタープライマーの供給がほとんど使
い尽くされたら、このアニール温度を例えば約４２℃迄
低下させる。この温度にて、この第３プライマーは「ド
ロップイン」し、そして残りのサイクルにわたって該標
的の増幅を進行せしめる。この方法を図１において図解
し、本明細書では「ドロップイン」ＰＣＲと称する。図
に関して、該アウタープライマーペアーはプライマー
「Ａ」及び「Ｃ」であり、該インナーペアーはプライマ
ー「Ｂ」及び「Ｃ」であり、そして「Ｂ」は第３プライ
マーである。
にフランクするプライマーは低濃度で存在している。最
初のｎ回のＰＣＲサイクルに関して、各ＰＣＲサイクル
の伸長段階の際の温度を十分に高く（例えば約６５℃
に）維持し、短いインナープライマーが特異的にアニー
ルして増幅を開始せしめることを防止する。アウタープ
ライマーは十分にアニールし、従ってＰＣＲが高い伸長
温度にて正常に進行するようにする。増幅がプラトーに
なる前、一定のアウタープライマーの供給がほとんど使
い尽くされたら、このアニール温度を例えば約４２℃迄
低下させる。この温度にて、この第３プライマーは「ド
ロップイン」し、そして残りのサイクルにわたって該標
的の増幅を進行せしめる。この方法を図１において図解
し、本明細書では「ドロップイン」ＰＣＲと称する。図
に関して、該アウタープライマーペアーはプライマー
「Ａ」及び「Ｃ」であり、該インナーペアーはプライマ
ー「Ｂ」及び「Ｃ」であり、そして「Ｂ」は第３プライ
マーである。
【００５５】DNA and Cell Biology 10, 233-238 (199
1)は任意の特定のプライマー／鋳型二本鎖のためのＰＣ
Ｒについての最適アニール温度の評価についての方法を
提供している。最も関係のある熱力学的データは Proc.
Natl. Acad. Sci. 83, 3746-3750 (1986)に開示され、
同様に Nuc, Acids Res. 6 , 3543-3557 (1979)はＴｍ
を評価するための例示的な実験式を詳細している。Ｔｍ
は一般にＰＣＲのための最適アニール温度よりも若干高
いが、Ｔｍの計算は本発明の実施のための適切な温度を
実験的に決めるための当業者の指標を提供する。
1)は任意の特定のプライマー／鋳型二本鎖のためのＰＣ
Ｒについての最適アニール温度の評価についての方法を
提供している。最も関係のある熱力学的データは Proc.
Natl. Acad. Sci. 83, 3746-3750 (1986)に開示され、
同様に Nuc, Acids Res. 6 , 3543-3557 (1979)はＴｍ
を評価するための例示的な実験式を詳細している。Ｔｍ
は一般にＰＣＲのための最適アニール温度よりも若干高
いが、Ｔｍの計算は本発明の実施のための適切な温度を
実験的に決めるための当業者の指標を提供する。
【００５６】ある標的、例えばＨＩＶ感染個体由来の一
定量の末梢血液中のＨＩＶプロウィルスＤＮＡに関し
て、試料中に存在する標的の量は１０００倍に迄相違し
うる。ドロップインＰＣＲはこのような分析に特に適
し、その理由はこの増幅における一定のアウタープライ
マー濃度の効果にある。特定の試料において標的の量が
高い場合、ＰＣＲははやくプラトーに達するがそれは完
全とはならない。もし試料中における標的の量が低い場
合、増幅は続く。従って、一定のアウタープライマー濃
度を利用することにより、種々の反応はこの熱サイクル
状態が移り変って入れ子プライマーが「ドロップイン」
することが可能となる前にほぼ同一の一定増幅状態とな
る。その結果、入れ子増幅結果における試料間差の影響
はなくなる。
定量の末梢血液中のＨＩＶプロウィルスＤＮＡに関し
て、試料中に存在する標的の量は１０００倍に迄相違し
うる。ドロップインＰＣＲはこのような分析に特に適
し、その理由はこの増幅における一定のアウタープライ
マー濃度の効果にある。特定の試料において標的の量が
高い場合、ＰＣＲははやくプラトーに達するがそれは完
全とはならない。もし試料中における標的の量が低い場
合、増幅は続く。従って、一定のアウタープライマー濃
度を利用することにより、種々の反応はこの熱サイクル
状態が移り変って入れ子プライマーが「ドロップイン」
することが可能となる前にほぼ同一の一定増幅状態とな
る。その結果、入れ子増幅結果における試料間差の影響
はなくなる。
【００５７】入れ子プライマー増幅に関する他の態様に
おいて、低濃度の１種類のフランキングプライマーの必
要性がなくなる。この方法に従うと、高い変性温度及び
高いアニール温度は、インナープライマーではなくアウ
タープライマーが伸長することを可能にする。フランキ
ングプライマーはＧＣに富んだ尾部を伴って合成せしめ
る。２サイクルの増幅の後、ＰＣＲ生成物の中にこの非
相補性のプライマー尾部配列が一体化されるため、この
ＧＣ尾部はＰＣＲ生成物の変性に必要とされる温度を高
める。その理由はＡＴペアーと比較してのＧＣペアーの
高い熱安定性による。入れ子ＰＣＲ生成物及びフランキ
ングＰＣＲ生成物の変性温度における結果の相違は、尾
部のついたアウタープライマーからの増幅を効果的に停
止せしめることに利用する。
おいて、低濃度の１種類のフランキングプライマーの必
要性がなくなる。この方法に従うと、高い変性温度及び
高いアニール温度は、インナープライマーではなくアウ
タープライマーが伸長することを可能にする。フランキ
ングプライマーはＧＣに富んだ尾部を伴って合成せしめ
る。２サイクルの増幅の後、ＰＣＲ生成物の中にこの非
相補性のプライマー尾部配列が一体化されるため、この
ＧＣ尾部はＰＣＲ生成物の変性に必要とされる温度を高
める。その理由はＡＴペアーと比較してのＧＣペアーの
高い熱安定性による。入れ子ＰＣＲ生成物及びフランキ
ングＰＣＲ生成物の変性温度における結果の相違は、尾
部のついたアウタープライマーからの増幅を効果的に停
止せしめることに利用する。
【００５８】アウタープライマーからＰＣＲ生成物が作
られ、そして所望する場合に該入れ子プライマーからの
合成が開始するようにアニール温度を操作することによ
ってこの入れ子プライマーが「ドロップイン」するよう
になった後、この変性温度を低める、即ち９６°から８
６℃に下げる。低い温度ではアウタープライマーＰＣＲ
生成物は完全に変性しなく、従って鋳型として働くこと
ができない。しかしながら、この低い変性温度は入れ子
ＰＣＲ生成物の増幅を十分に可能にする。この態様を以
下に概略する。ｎ回のサイクルの後、このアニール温度
を低め、インナープライマーをアニールさせる。ｎ＋ｘ
回のサイクルの後、この変性温度を低め、初期ＰＣＲ生
成物が変性してアウタープライマーのための鋳型として
働くことを防止する。「ドロップイン／ドロップアウ
ト」ＰＣＲと呼ぶこの手法は実施例１及び２に詳細の通
り、１種類の内在型プライマーのみを用いて行うことが
できる。これらの態様において、１種類のフランキング
プライマーはインナー及びアウタープライマーの両方と
して働くことができ、そしてこれはサイクル反応の熱プ
ロフィールの移り変わりに影響されない。ドロップイン
／ドロップアウトＰＣＲを図２において図解する。
られ、そして所望する場合に該入れ子プライマーからの
合成が開始するようにアニール温度を操作することによ
ってこの入れ子プライマーが「ドロップイン」するよう
になった後、この変性温度を低める、即ち９６°から８
６℃に下げる。低い温度ではアウタープライマーＰＣＲ
生成物は完全に変性しなく、従って鋳型として働くこと
ができない。しかしながら、この低い変性温度は入れ子
ＰＣＲ生成物の増幅を十分に可能にする。この態様を以
下に概略する。ｎ回のサイクルの後、このアニール温度
を低め、インナープライマーをアニールさせる。ｎ＋ｘ
回のサイクルの後、この変性温度を低め、初期ＰＣＲ生
成物が変性してアウタープライマーのための鋳型として
働くことを防止する。「ドロップイン／ドロップアウ
ト」ＰＣＲと呼ぶこの手法は実施例１及び２に詳細の通
り、１種類の内在型プライマーのみを用いて行うことが
できる。これらの態様において、１種類のフランキング
プライマーはインナー及びアウタープライマーの両方と
して働くことができ、そしてこれはサイクル反応の熱プ
ロフィールの移り変わりに影響されない。ドロップイン
／ドロップアウトＰＣＲを図２において図解する。
【００５９】当業界の通常に技術者は任意の特定の増幅
反応混合物並びに関連の熱サイクルのプログラムについ
ての適切な変性及びアニール温度を決定するための実験
的な手段を容易に利用することができる。該ドロップイ
ン／ドロップアウトＰＣＲ方法は、ＰＣＲ効率を最高に
するのに好ましい高濃度である全てのプライマーを含み
ながらこの反応中の任意のサイクルにてどの特定のプラ
イマーペアーを伸長するかをコントロールする方法を提
供する。入れ子プライマー増幅についての本方法のこの
態様は実施例１及び２に示す。
反応混合物並びに関連の熱サイクルのプログラムについ
ての適切な変性及びアニール温度を決定するための実験
的な手段を容易に利用することができる。該ドロップイ
ン／ドロップアウトＰＣＲ方法は、ＰＣＲ効率を最高に
するのに好ましい高濃度である全てのプライマーを含み
ながらこの反応中の任意のサイクルにてどの特定のプラ
イマーペアーを伸長するかをコントロールする方法を提
供する。入れ子プライマー増幅についての本方法のこの
態様は実施例１及び２に示す。
【００６０】該ドロップインＰＣＲ方法は第１アウター
プライマーが低濃度で存在することを必要とする。一般
に、増幅プライマーは１００μＬの反応液当り１〜１０
０pmole の濃度で存在する。ドロップインＰＣＲに関し
て、上記のプライマーの適切な濃度は第２及び第３プラ
イマー（即ちインナープライマーペアー）の濃度の１％
〜５０％の範囲にある。増幅が進むに従い、第１プライ
マーの量はその他のプライマーに関連して制限される。
従って、このアニール温度が第３のプライマーのＴｍに
迄下がった場合、インナープライマーのアニール及び伸
長が有利となり、そして小さいプライマーＰＣＲ生成物
が生じ始める。
プライマーが低濃度で存在することを必要とする。一般
に、増幅プライマーは１００μＬの反応液当り１〜１０
０pmole の濃度で存在する。ドロップインＰＣＲに関し
て、上記のプライマーの適切な濃度は第２及び第３プラ
イマー（即ちインナープライマーペアー）の濃度の１％
〜５０％の範囲にある。増幅が進むに従い、第１プライ
マーの量はその他のプライマーに関連して制限される。
従って、このアニール温度が第３のプライマーのＴｍに
迄下がった場合、インナープライマーのアニール及び伸
長が有利となり、そして小さいプライマーＰＣＲ生成物
が生じ始める。
【００６１】本発明に従うと、ＰＣＲ中の熱サイクルプ
ロフィールにおける変化は増幅の特異性を高める。ＰＣ
Ｒを進めるに従い、非特異的プライマーは非標的、即ち
バックグランド生成物の生成をもたらしうる。非標的鋳
型を用いる熱サイクルがなされると、この鋳型はその後
のサイクルにおいて増幅され続けるであろう。アウター
プライマーは増幅した非標的鋳型とアニールするが、イ
ンナープライマーはしない。熱サイクルプロフィールに
おける各移り変わりは非標的鋳型分子の集団における移
り変わりをもたらしうる。従って、サイクルパラメータ
ーにおける各移り変わりに伴い、従来の熱サイクルの際
で考えられる非標的増幅は減少し、その結果標的特異性
は高まる。
ロフィールにおける変化は増幅の特異性を高める。ＰＣ
Ｒを進めるに従い、非特異的プライマーは非標的、即ち
バックグランド生成物の生成をもたらしうる。非標的鋳
型を用いる熱サイクルがなされると、この鋳型はその後
のサイクルにおいて増幅され続けるであろう。アウター
プライマーは増幅した非標的鋳型とアニールするが、イ
ンナープライマーはしない。熱サイクルプロフィールに
おける各移り変わりは非標的鋳型分子の集団における移
り変わりをもたらしうる。従って、サイクルパラメータ
ーにおける各移り変わりに伴い、従来の熱サイクルの際
で考えられる非標的増幅は減少し、その結果標的特異性
は高まる。
【００６２】各熱サイクルプロフィール又は段階に必要
なサイクルの数は経験的に決定され、そしてそれは試
料、特に標的の複雑度並びに標的及びバックグランド核
酸の相対量に依存して変化する。アウタープライマーが
伸長される高いアニール温度で必要とするサイクルの数
は１回以上でありうる。例えば高いアニール温度で１−
３０サイクルを含むことが所望されることがあり、そし
てサイクルの特定の回数はアッセイの特性、即ち、試
料、標的、プライマー及び必要とする特定の結果に従っ
て決定される。
なサイクルの数は経験的に決定され、そしてそれは試
料、特に標的の複雑度並びに標的及びバックグランド核
酸の相対量に依存して変化する。アウタープライマーが
伸長される高いアニール温度で必要とするサイクルの数
は１回以上でありうる。例えば高いアニール温度で１−
３０サイクルを含むことが所望されることがあり、そし
てサイクルの特定の回数はアッセイの特性、即ち、試
料、標的、プライマー及び必要とする特定の結果に従っ
て決定される。
【００６３】検出できるシグナルを得るのに十分なサイ
クル数にわたってアウタープライマーを用いて第１ＰＣ
Ｒ標的を増幅することが所望されうる。均一アッセイを
用いることにより、増幅生成物の存在のアッセイはこの
反応容器を開けることなく螢光によって容易に測定され
うる。このアウタープライマー存在していることが分っ
ている対象の領域、例えば特定の遺伝子セグメントの増
幅に適する。例えばアウタープライマーペアーによる遺
伝子マーカーの増幅は、その増幅が行なわれたことを示
唆する内部陽性コントロールを提供する。
クル数にわたってアウタープライマーを用いて第１ＰＣ
Ｒ標的を増幅することが所望されうる。均一アッセイを
用いることにより、増幅生成物の存在のアッセイはこの
反応容器を開けることなく螢光によって容易に測定され
うる。このアウタープライマー存在していることが分っ
ている対象の領域、例えば特定の遺伝子セグメントの増
幅に適する。例えばアウタープライマーペアーによる遺
伝子マーカーの増幅は、その増幅が行なわれたことを示
唆する内部陽性コントロールを提供する。
【００６４】その後、該熱サイクルプロフィールを変
え、そしてインナー標的又は特異的プライマーを利用す
る。螢光の更なる増強により測定されるＰＣＲ生成物の
更なる増加は特定の標的配列の存在を示唆する。ところ
で、アウタープライマーペアー増幅生成物の検出は本発
明の本質的な観点ではない。第１（アウター）プライマ
ーペアーによる増幅は、第２（インナー）プライマーペ
アーによる増幅のための更なる鋳型を提供する標的分子
数の増大のために働く。
え、そしてインナー標的又は特異的プライマーを利用す
る。螢光の更なる増強により測定されるＰＣＲ生成物の
更なる増加は特定の標的配列の存在を示唆する。ところ
で、アウタープライマーペアー増幅生成物の検出は本発
明の本質的な観点ではない。第１（アウター）プライマ
ーペアーによる増幅は、第２（インナー）プライマーペ
アーによる増幅のための更なる鋳型を提供する標的分子
数の増大のために働く。
【００６５】ドロップイン／ドロップアウト方法におけ
る第２サイクル段階（高温変性、低温アニール）は内部
型プライマーを用いる増幅の開始のために働き、そして
第３サイクル段階（低温変性、低温アニール）のための
標的を提供する。この第３サイクル段階の間、この低い
変性温度はインナープライマーの増幅を進行させながら
アウタープライマーの増幅を有効に低める。高温変性及
び低温アニールでの増幅はアウターＰＣＲ生成物をイン
ナーＰＣＲ鋳型に変換せしめる。実際、１〜１０サイク
ルがこの反応の第２段階に関しては十分であるが、より
多くのサイクル数が特定の標的に所望される場合があ
る。
る第２サイクル段階（高温変性、低温アニール）は内部
型プライマーを用いる増幅の開始のために働き、そして
第３サイクル段階（低温変性、低温アニール）のための
標的を提供する。この第３サイクル段階の間、この低い
変性温度はインナープライマーの増幅を進行させながら
アウタープライマーの増幅を有効に低める。高温変性及
び低温アニールでの増幅はアウターＰＣＲ生成物をイン
ナーＰＣＲ鋳型に変換せしめる。実際、１〜１０サイク
ルがこの反応の第２段階に関しては十分であるが、より
多くのサイクル数が特定の標的に所望される場合があ
る。
【００６６】ＰＣＲにおける任意の特定のプライマーの
ためのアニール温度はオリゴヌクレオチドのＧＣ含有％
の関数となる。本発明の実施例により提供される教示を
利用することにより、任意の特定の標的及びプライマー
に適切なアニール温度は当業者によって容易に決定され
るであろう。低温アニールと高温アニールサイクルのア
ニール温度の相違は少なくとも１℃、そして好ましくは
３℃〜３０℃である。同様に、プライマー伸長温度も本
明細書及び記載の文献も利用することによって当業者に
より容易に決定されるであろう。
ためのアニール温度はオリゴヌクレオチドのＧＣ含有％
の関数となる。本発明の実施例により提供される教示を
利用することにより、任意の特定の標的及びプライマー
に適切なアニール温度は当業者によって容易に決定され
るであろう。低温アニールと高温アニールサイクルのア
ニール温度の相違は少なくとも１℃、そして好ましくは
３℃〜３０℃である。同様に、プライマー伸長温度も本
明細書及び記載の文献も利用することによって当業者に
より容易に決定されるであろう。
【００６７】高温変性から低温変性のバリエーション
は、標的及び試料の複雑度、ＧＣ含有率、並びにプライ
マー配列に依存して最大２０℃、最小１℃でありうる。
低変性温度への移り変わりは非標的増幅ＤＮＡの変性を
防ぐ。この核酸は標的でないため、変性を防ぐための最
適温度を推測するためにその長さ及び％ＧＣ含有率を決
定することはできない。従って、この変性温度は本明細
書及び本実施例を利用することにより経験的に決定す
る。PCR Technology, Stockton Press (1989) はＤＮＡ
サブセグメント又は大きめの核酸配列内のドメインのＴ
ｍにおけるヌクレオチド配列の効果を詳細している。例
えば、ＧＣ１００％の約４０個のヌクレオチドを含んで
成る尾部付きプライマーは、長さにおいて５００塩基対
の増幅配列の完全な変性のために必要とされる温度を変
えるのに十分である。好ましくは、フランキングプライ
マーの５′末端に付加されたＧ−Ｃ尾部は長さにおいて
１０〜１００個のヌクレオチドである。
は、標的及び試料の複雑度、ＧＣ含有率、並びにプライ
マー配列に依存して最大２０℃、最小１℃でありうる。
低変性温度への移り変わりは非標的増幅ＤＮＡの変性を
防ぐ。この核酸は標的でないため、変性を防ぐための最
適温度を推測するためにその長さ及び％ＧＣ含有率を決
定することはできない。従って、この変性温度は本明細
書及び本実施例を利用することにより経験的に決定す
る。PCR Technology, Stockton Press (1989) はＤＮＡ
サブセグメント又は大きめの核酸配列内のドメインのＴ
ｍにおけるヌクレオチド配列の効果を詳細している。例
えば、ＧＣ１００％の約４０個のヌクレオチドを含んで
成る尾部付きプライマーは、長さにおいて５００塩基対
の増幅配列の完全な変性のために必要とされる温度を変
えるのに十分である。好ましくは、フランキングプライ
マーの５′末端に付加されたＧ−Ｃ尾部は長さにおいて
１０〜１００個のヌクレオチドである。
【００６８】本発明の更なる態様において、フランキン
グプライマーは高い生成物特異性のために必要とはされ
ない。インナープライマーペアーのみを用いるドロップ
イン増幅に関するプロトコールに従い、標準のＰＣＲ条
件を利用する増幅の結果と比べて予測できないほど優れ
た結果が得られた。実施例２は本発明のこの態様を説明
する。
グプライマーは高い生成物特異性のために必要とはされ
ない。インナープライマーペアーのみを用いるドロップ
イン増幅に関するプロトコールに従い、標準のＰＣＲ条
件を利用する増幅の結果と比べて予測できないほど優れ
た結果が得られた。実施例２は本発明のこの態様を説明
する。
【００６９】本発明がなされる前は、Ｔｍより高いアニ
ール温度を用いて少なくとも１回の熱サイクルに試料を
かけることによって増幅特異性が高められることはわっ
ていなかった。このサイクルプロフィールはその後調整
され、そしてアニール温度は適当なＴｍ値に迄低められ
ている。従って、本発明の一態様において、プライマー
のアニール及び伸長のためのこの温度は特定のプライマ
ーペアーに関する推定Ｔｍよりも１°〜１０℃高い。こ
の温度での増幅の効率は非常に悪いが、生ずる任意のプ
ライマー伸長は標的特異性である。従って、この高めの
温度サイクルの間、この試料は特定の標的配列に富むよ
うになり、そして任意のサイクルの回数、即ち１〜１５
回は、生成物特異性を高める。次にアニール化温度を下
げて増幅効率を高め、そして検出可能な量のＰＣＲ生成
物が得られる。
ール温度を用いて少なくとも１回の熱サイクルに試料を
かけることによって増幅特異性が高められることはわっ
ていなかった。このサイクルプロフィールはその後調整
され、そしてアニール温度は適当なＴｍ値に迄低められ
ている。従って、本発明の一態様において、プライマー
のアニール及び伸長のためのこの温度は特定のプライマ
ーペアーに関する推定Ｔｍよりも１°〜１０℃高い。こ
の温度での増幅の効率は非常に悪いが、生ずる任意のプ
ライマー伸長は標的特異性である。従って、この高めの
温度サイクルの間、この試料は特定の標的配列に富むよ
うになり、そして任意のサイクルの回数、即ち１〜１５
回は、生成物特異性を高める。次にアニール化温度を下
げて増幅効率を高め、そして検出可能な量のＰＣＲ生成
物が得られる。
【００７０】本方法は感度及び特異性を高めるのに特に
有用である。例えば、７０，０００個の細胞当りに１コ
ピーとして存在するＡＩＤＳウィルス核酸の検出は本方
法により向上し、そして実施例１に例示する。同様に、
一塩基対の変異の存在を検出するための対立遺伝子特異
的増幅も高温アニールサイクルの付加によって向上し
た。
有用である。例えば、７０，０００個の細胞当りに１コ
ピーとして存在するＡＩＤＳウィルス核酸の検出は本方
法により向上し、そして実施例１に例示する。同様に、
一塩基対の変異の存在を検出するための対立遺伝子特異
的増幅も高温アニールサイクルの付加によって向上し
た。
【００７１】他の態様において、本発明は高められた増
幅特異性に関するキットを提供することで商業化されう
る。このキットは特定の標的又は対立遺伝子のためのイ
ンナー及びアウタープライマーペアーを含むであろう。
このキットは増幅のための任意の以下の薬剤、例えばＤ
ＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、ｄＮＴＰ及び陽性コントロ
ール鋳型も含みうる。
幅特異性に関するキットを提供することで商業化されう
る。このキットは特定の標的又は対立遺伝子のためのイ
ンナー及びアウタープライマーペアーを含むであろう。
このキットは増幅のための任意の以下の薬剤、例えばＤ
ＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、ｄＮＴＰ及び陽性コントロ
ール鋳型も含みうる。
【００７２】
【実施例】実施例１ ドロップイン／ドロップアウトＰＣＲ：二本鎖ＤＮＡの
高いバックグランドの存在下における微量標的の検出 ７０，０００個のヒト細胞由来のＤＮＡのバックグラン
ドにおいて一本のコピー配列を増幅するためにドロップ
イン／ドロップアウト増幅方法を利用した。本明細書に
簡単に詳細したプライマー「ドロップイン／ドロップア
ウト」方法である改良入れ子プライマー方法を、ＰＣＲ
特異性を高めるためにデザインした。このアッセイは以
下の通りに行った。ＰＣＲ反応容器１〜８に、５０mMの
ＫＣＬ；１０mMのトリスＨＣＬ，pH８．３；２．５mMの
ＭｇＣｌ2 ；６００mMの全ｄＮＴＰ；１．２５ユニット
のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＥＣＩ）；１．２７
μＭの臭化エチジウム；０．５μｇのヒト細胞系ＤＮ
Ａ；プライマーペアーＲＨ１７１（配列番号１）及びＲ
Ｈ１７６（配列番号２）（各プライマーは０．２μ
Ｍ）；並びに入れ子ＲＨ１８２（配列番号３）（これも
０．２μＭ）をそれぞれ含む５０マイクロリゥターの溶
液を分注した。蒸発を防ぐため、８種の溶液を保護する
ために鉱油を一滴用いた。本プライマーを用いて作る増
幅ＰＣＲ生成物のために必要な変性温度を高めるプライ
マーＲＨ１７６（配列番号２）は、ＧＣに富む（標的配
列に）非相同性の５′「尾部」を保有する。
高いバックグランドの存在下における微量標的の検出 ７０，０００個のヒト細胞由来のＤＮＡのバックグラン
ドにおいて一本のコピー配列を増幅するためにドロップ
イン／ドロップアウト増幅方法を利用した。本明細書に
簡単に詳細したプライマー「ドロップイン／ドロップア
ウト」方法である改良入れ子プライマー方法を、ＰＣＲ
特異性を高めるためにデザインした。このアッセイは以
下の通りに行った。ＰＣＲ反応容器１〜８に、５０mMの
ＫＣＬ；１０mMのトリスＨＣＬ，pH８．３；２．５mMの
ＭｇＣｌ2 ；６００mMの全ｄＮＴＰ；１．２５ユニット
のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＥＣＩ）；１．２７
μＭの臭化エチジウム；０．５μｇのヒト細胞系ＤＮ
Ａ；プライマーペアーＲＨ１７１（配列番号１）及びＲ
Ｈ１７６（配列番号２）（各プライマーは０．２μ
Ｍ）；並びに入れ子ＲＨ１８２（配列番号３）（これも
０．２μＭ）をそれぞれ含む５０マイクロリゥターの溶
液を分注した。蒸発を防ぐため、８種の溶液を保護する
ために鉱油を一滴用いた。本プライマーを用いて作る増
幅ＰＣＲ生成物のために必要な変性温度を高めるプライ
マーＲＨ１７６（配列番号２）は、ＧＣに富む（標的配
列に）非相同性の５′「尾部」を保有する。
【００７３】反応液１−４は室温の溶液で作り、そして
温度のサイクルを開始する前にこの３種のプライマーを
含ませた。反応５−８は、熱サイクルを開始する前にそ
れらが７２℃の温度に平衡化する迄、この３種のプライ
マーの添加を待った。従がって、反応液５−８は前記し
た「ホットスタート」されるものである。反応液２−４
及び６−８は、標的、陽性コントロールＤＮＡ（ＰＥＣ
Ｉより購入）であってＲＨ１７１（配列番号１）、ＲＨ
１８２（配列番号３）及びＲＨ１７６（配列番号２）の
３′領域が相同性であるＨＩＶ配列を含むものも含んで
いる。このＤＮＡを希釈し、各反応液が平均して４コピ
ーのこのＨＩＶ配列を含むようにした。このコピーの平
均数は小さいため、一定の反応における実際のコピー数
はかなり変わりうる。反応液１と５にはＨＩＶ ＤＮＡ
を加えていないため、これらの反応は陰性コントロール
として働く。
温度のサイクルを開始する前にこの３種のプライマーを
含ませた。反応５−８は、熱サイクルを開始する前にそ
れらが７２℃の温度に平衡化する迄、この３種のプライ
マーの添加を待った。従がって、反応液５−８は前記し
た「ホットスタート」されるものである。反応液２−４
及び６−８は、標的、陽性コントロールＤＮＡ（ＰＥＣ
Ｉより購入）であってＲＨ１７１（配列番号１）、ＲＨ
１８２（配列番号３）及びＲＨ１７６（配列番号２）の
３′領域が相同性であるＨＩＶ配列を含むものも含んで
いる。このＤＮＡを希釈し、各反応液が平均して４コピ
ーのこのＨＩＶ配列を含むようにした。このコピーの平
均数は小さいため、一定の反応における実際のコピー数
はかなり変わりうる。反応液１と５にはＨＩＶ ＤＮＡ
を加えていないため、これらの反応は陰性コントロール
として働く。
【００７４】全ての８種の反応液をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ＤＮＡ熱サイクラーを用い、以下
の熱サイクルにかけた：９６℃での変性、１分間の保
持、６４℃でのアニール、１分間の保持。このプロフィ
ールを２９サイクル反復し、その間、フランキングプラ
イマーペアーＲＨ１７１（配列番号１）とＲＨ１７６
（配列番号２）は効率的にアニールし、そしてそれらは
増幅に利用されたが、しかし６４℃で効率的にアニール
しない入れ子プライマーＲＨ１８２（配列番号３）は効
率的な増幅において利用されなかった。次いで９６℃で
の変性、１分間の保持、５２℃でのアニール、１分間の
保持を行った。このプロフィールを２サイクル反復し、
その間、３種全てのプライマーは効率的にアニールし、
そしてそれらはこの増幅系において伸長され、従ってＲ
Ｈ１７１（配列番号１）とＲＨ１７６（配列番号２）又
はＲＨ１７１（配列番号１）とＲＨ１８２（配列番号
３）のいづれかを利用した生成物が作られた。第３の入
れ子プライマーの利用は生成物の特異性を高めるため、
ＲＨ１７１（配列番号１）及びＲＨ１８２（配列番号
３）を利用して作られる生成物はよりＨＩＶ特異性の傾
向にある。これらのサイクルの後、８６℃での変性、１
分間の保持、５２℃でのアニール、１分間の保持を行っ
た。このプロフィールを１８回反復し、その間、ＧＣに
富むプライマーＲＨ１７６（配列番号２）を含むＨＩＶ
特異性及び非特異性両者の生成物は８６℃で効率的に変
性せず、従って効率的に増幅しなかったが、入れ子プラ
イマーＲＨ１８２（配列番号３）及びＲＨ１７１（配列
番号１）を用いて作った増幅ＨＩＶ配列は効率的に変性
且つ増幅した。
ｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ＤＮＡ熱サイクラーを用い、以下
の熱サイクルにかけた：９６℃での変性、１分間の保
持、６４℃でのアニール、１分間の保持。このプロフィ
ールを２９サイクル反復し、その間、フランキングプラ
イマーペアーＲＨ１７１（配列番号１）とＲＨ１７６
（配列番号２）は効率的にアニールし、そしてそれらは
増幅に利用されたが、しかし６４℃で効率的にアニール
しない入れ子プライマーＲＨ１８２（配列番号３）は効
率的な増幅において利用されなかった。次いで９６℃で
の変性、１分間の保持、５２℃でのアニール、１分間の
保持を行った。このプロフィールを２サイクル反復し、
その間、３種全てのプライマーは効率的にアニールし、
そしてそれらはこの増幅系において伸長され、従ってＲ
Ｈ１７１（配列番号１）とＲＨ１７６（配列番号２）又
はＲＨ１７１（配列番号１）とＲＨ１８２（配列番号
３）のいづれかを利用した生成物が作られた。第３の入
れ子プライマーの利用は生成物の特異性を高めるため、
ＲＨ１７１（配列番号１）及びＲＨ１８２（配列番号
３）を利用して作られる生成物はよりＨＩＶ特異性の傾
向にある。これらのサイクルの後、８６℃での変性、１
分間の保持、５２℃でのアニール、１分間の保持を行っ
た。このプロフィールを１８回反復し、その間、ＧＣに
富むプライマーＲＨ１７６（配列番号２）を含むＨＩＶ
特異性及び非特異性両者の生成物は８６℃で効率的に変
性せず、従って効率的に増幅しなかったが、入れ子プラ
イマーＲＨ１８２（配列番号３）及びＲＨ１７１（配列
番号１）を用いて作った増幅ＨＩＶ配列は効率的に変性
且つ増幅した。
【００７５】８種の反応全てが終了したらゲル電気泳動
によって分析し、そして写真撮影した（図３参照）。反
応２−４及び５−８は、ゲル上の予測バンドとしての予
測サイズ（約２００bp) の生成物を含むことが示され
た。陰性コントロールの反応１と５はこのような生成物
を含まなかった。しかしながら、「ホットスタート」さ
れていない反応２−４は、予測サイズ以外のＤＮＡフラ
グメントを含むことが見受けられた。このような他のＤ
ＮＡフラグメントは反応１においても見られ、それらが
ＨＩＶ配列に由来しないことを示唆する。このような他
のＤＮＡフラグメントは反応５−８において見られず、
「ホットスタート」の利用がこれらの反応の特異性を高
めたことを示唆する。
によって分析し、そして写真撮影した（図３参照）。反
応２−４及び５−８は、ゲル上の予測バンドとしての予
測サイズ（約２００bp) の生成物を含むことが示され
た。陰性コントロールの反応１と５はこのような生成物
を含まなかった。しかしながら、「ホットスタート」さ
れていない反応２−４は、予測サイズ以外のＤＮＡフラ
グメントを含むことが見受けられた。このような他のＤ
ＮＡフラグメントは反応１においても見られ、それらが
ＨＩＶ配列に由来しないことを示唆する。このような他
のＤＮＡフラグメントは反応５−８において見られず、
「ホットスタート」の利用がこれらの反応の特異性を高
めたことを示唆する。
【００７６】８種の更なる反応を、前記の通り、但し全
てを前記の「ホットスタート」として行った。陰性コン
トロールＤＮＡを、１〜８で番号付けした８種の反応液
に希釈し、それぞれがＨＩＶ標的分子の半分を平均して
含むようにした。この分子は分割することができないた
め、このことはいくつかの反応液は標的分子を含み、そ
していくつかは含まないことを意味する。もしこの実験
を何回も繰り返したなら、標的を含む反応液の画分はか
なり変化しうるが、しかしそれらを半分に平均化する。
標的分子を含むものはほとんど一本の標的分子を含む傾
向にある。これらの反応が終了したら、８種の全てをゲ
ル電気泳動により分析して写真撮影した（図４）。結果
は、この８種の反応のうちの２種、番号１と８が、ゲル
上の予測バンドとして予測のサイズ（約２００bp) を、
プライマーに相当するバンド以外のその他のバンドが見
受けられない状態で示した。反応２−６は、おそらく特
異的なＨＩＶ鋳型配列が存在していないことに基づき、
上記のバンド又は任意のその他のＤＮＡフラグメントを
示さなかった。
てを前記の「ホットスタート」として行った。陰性コン
トロールＤＮＡを、１〜８で番号付けした８種の反応液
に希釈し、それぞれがＨＩＶ標的分子の半分を平均して
含むようにした。この分子は分割することができないた
め、このことはいくつかの反応液は標的分子を含み、そ
していくつかは含まないことを意味する。もしこの実験
を何回も繰り返したなら、標的を含む反応液の画分はか
なり変化しうるが、しかしそれらを半分に平均化する。
標的分子を含むものはほとんど一本の標的分子を含む傾
向にある。これらの反応が終了したら、８種の全てをゲ
ル電気泳動により分析して写真撮影した（図４）。結果
は、この８種の反応のうちの２種、番号１と８が、ゲル
上の予測バンドとして予測のサイズ（約２００bp) を、
プライマーに相当するバンド以外のその他のバンドが見
受けられない状態で示した。反応２−６は、おそらく特
異的なＨＩＶ鋳型配列が存在していないことに基づき、
上記のバンド又は任意のその他のＤＮＡフラグメントを
示さなかった。
【００７７】実施例２ 「ドロップイン／ドロップアウト」プロトコールによる
高められた特異性の実証 熱サイクルパラメーターが増幅特異性に予測の効果を有
するかを実証するための方法において、実施例１に詳細
の実験を繰り返した。
高められた特異性の実証 熱サイクルパラメーターが増幅特異性に予測の効果を有
するかを実証するための方法において、実施例１に詳細
の実験を繰り返した。
【００７８】実施例１のように９つの反応液を用意した
が、但し各反応混合物においては〜２０コピーのＨＩＶ
プラスミドが存在し、そして各反応には入れ子プライマ
ーＲＨ１８２（配列番号３）を含ませなかった。図５に
おいて、上記のプライマーをプライマーＢとして表示
し、もしこの反応混合物に含ませたフランキングプライ
マーＲＨ１７６（配列番号２）及びＲＨ１７１（配列番
号１）はそれぞれプライマーＡ及びプライマーＣとして
表示した。これら９種の反応を「ＡとＣ」反応と本明細
書では称する。同様の方法、但しプライマーＲＨ１８２
（配列番号３）及びＲＨ１７１（配列番号１）のみを含
ませて、９つのその他の反応液を用意した。これらの反
応は「ＢとＣ」反応と称する。
が、但し各反応混合物においては〜２０コピーのＨＩＶ
プラスミドが存在し、そして各反応には入れ子プライマ
ーＲＨ１８２（配列番号３）を含ませなかった。図５に
おいて、上記のプライマーをプライマーＢとして表示
し、もしこの反応混合物に含ませたフランキングプライ
マーＲＨ１７６（配列番号２）及びＲＨ１７１（配列番
号１）はそれぞれプライマーＡ及びプライマーＣとして
表示した。これら９種の反応を「ＡとＣ」反応と本明細
書では称する。同様の方法、但しプライマーＲＨ１８２
（配列番号３）及びＲＨ１７１（配列番号１）のみを含
ませて、９つのその他の反応液を用意した。これらの反
応は「ＢとＣ」反応と称する。
【００７９】更なる９つの反応を同様の方法で用意した
が、但し３種の全てのプライマー、ＲＨ１７６（配列番
号２）、ＲＨ１８２（配列番号３）及びＲＨ１７１（配
列番号１）を利用した。これらの反応を「Ａ，ＢとＣ」
反応と称する。
が、但し３種の全てのプライマー、ＲＨ１７６（配列番
号２）、ＲＨ１８２（配列番号３）及びＲＨ１７１（配
列番号１）を利用した。これらの反応を「Ａ，ＢとＣ」
反応と称する。
【００８０】全ての反応を、実施例１に詳細の「ホット
スタート」を利用して開始した。「ＡとＣ」、「Ｂと
Ｃ」及び「Ａ，ＢとＣ」のグループのそれぞれの３つの
反応液を、ＤＮＡ合成を開始するようプライマー「Ｂ」
が「ドロップイン」することを防ぐ条件を利用して増幅
させた。これらは９６℃の変性温度と６４℃のアニール
温度にて４９サイクルを利用する熱サイクルにおいて増
幅させた。このアニール温度はプライマーＢ（ＲＨ１８
２〔配列番号３〕）の計算Ｔｍ値よりも高かった。予測
通り、プライマーＢのみが存在している「残された」プ
ライマーである「ＢとＣ」グループにおいて、検出可能
なＰＣＲ生成物は図５において示す電気泳動ゲル上に見
られなかった（３つの増幅物のアリコートを電気泳動ゲ
ルに流している。）ＡとＣ、又はＡ，ＢとＣが存在して
いる場合、観察される生成物はプライマーＡ及びＣの結
合したＨＩＶ配列について予測されるサイズの生成物並
びにその他の非特異的生成物であった。
スタート」を利用して開始した。「ＡとＣ」、「Ｂと
Ｃ」及び「Ａ，ＢとＣ」のグループのそれぞれの３つの
反応液を、ＤＮＡ合成を開始するようプライマー「Ｂ」
が「ドロップイン」することを防ぐ条件を利用して増幅
させた。これらは９６℃の変性温度と６４℃のアニール
温度にて４９サイクルを利用する熱サイクルにおいて増
幅させた。このアニール温度はプライマーＢ（ＲＨ１８
２〔配列番号３〕）の計算Ｔｍ値よりも高かった。予測
通り、プライマーＢのみが存在している「残された」プ
ライマーである「ＢとＣ」グループにおいて、検出可能
なＰＣＲ生成物は図５において示す電気泳動ゲル上に見
られなかった（３つの増幅物のアリコートを電気泳動ゲ
ルに流している。）ＡとＣ、又はＡ，ＢとＣが存在して
いる場合、観察される生成物はプライマーＡ及びＣの結
合したＨＩＶ配列について予測されるサイズの生成物並
びにその他の非特異的生成物であった。
【００８１】更に３つのグループそれぞれからの３つの
反応液を、ＧＣに富む非相補性５′「尾部」を含むプラ
イマー「Ａ」（ＲＨ１７６〔配列番号２〕）から合成さ
れるＤＮＡの変性及び増幅を防ぐ条件を用いて増幅させ
た。これらの条件は４９サイクルにわたる８６℃の変性
温度と５２℃のアニール温度である。このアニール温度
はプライマーＢ（ＲＨ１８２〔配列番号３〕）のアニー
ルと伸長を可能とする十分に低い温度であった。予測通
り、これらの条件のもとで増幅せしめた「ＡとＣ」反応
液のゲル電気泳動において増幅生成物は見られなかっ
た。しかしながら、プライマーＢとＣが結合したＨＩＶ
配列に相当するサイズの増幅生成物、並びに更なる非特
異的ＤＮＡ生成物が増幅「ＢとＣ」及び「Ａ，ＢとＣ」
において見られた（図５参照）。
反応液を、ＧＣに富む非相補性５′「尾部」を含むプラ
イマー「Ａ」（ＲＨ１７６〔配列番号２〕）から合成さ
れるＤＮＡの変性及び増幅を防ぐ条件を用いて増幅させ
た。これらの条件は４９サイクルにわたる８６℃の変性
温度と５２℃のアニール温度である。このアニール温度
はプライマーＢ（ＲＨ１８２〔配列番号３〕）のアニー
ルと伸長を可能とする十分に低い温度であった。予測通
り、これらの条件のもとで増幅せしめた「ＡとＣ」反応
液のゲル電気泳動において増幅生成物は見られなかっ
た。しかしながら、プライマーＢとＣが結合したＨＩＶ
配列に相当するサイズの増幅生成物、並びに更なる非特
異的ＤＮＡ生成物が増幅「ＢとＣ」及び「Ａ，ＢとＣ」
において見られた（図５参照）。
【００８２】最後に、３つのグループそれぞれの３つの
反応液を図２に図解する「ドロップイン／ドロップアウ
ト」増幅の可能な条件のもとで増幅させた。この条件
は、９６℃の変性と６４℃のアニールを利用する２９回
のサイクル、９６℃の変性と５２℃のアニールを利用す
る２回のサイクル及び８６℃の変性と５２℃のアニール
を利用する１８回のサイクルである。最初の２種類の熱
サイクル段階のみが有効な増幅プライマーとしてのプラ
イマーＡの利用を可能とした。これらの３１サイクルは
試料中に存在するわずかのＨＩＶ標的分子もゲル電気泳
動及び臭化エチジウム染色によって検出できるように増
幅するには十分でなかった。従って、予測通り、プライ
マーＡとＣのみによってはＰＣＲ生成物は形成されなか
った。更に予測通り、３種の全てのプライマーを用いる
完全な「ドロップイン／ドロップアウト」プロトコール
は生成物の最大の収量を伴って最も特異的な増幅を示し
た（図５）。ゲル電気泳動に基づいて見られる唯一のそ
の他の大きなバンドは長めのプライマーＡ（ＲＨ１７６
〔配列番号２〕）による。
反応液を図２に図解する「ドロップイン／ドロップアウ
ト」増幅の可能な条件のもとで増幅させた。この条件
は、９６℃の変性と６４℃のアニールを利用する２９回
のサイクル、９６℃の変性と５２℃のアニールを利用す
る２回のサイクル及び８６℃の変性と５２℃のアニール
を利用する１８回のサイクルである。最初の２種類の熱
サイクル段階のみが有効な増幅プライマーとしてのプラ
イマーＡの利用を可能とした。これらの３１サイクルは
試料中に存在するわずかのＨＩＶ標的分子もゲル電気泳
動及び臭化エチジウム染色によって検出できるように増
幅するには十分でなかった。従って、予測通り、プライ
マーＡとＣのみによってはＰＣＲ生成物は形成されなか
った。更に予測通り、３種の全てのプライマーを用いる
完全な「ドロップイン／ドロップアウト」プロトコール
は生成物の最大の収量を伴って最も特異的な増幅を示し
た（図５）。ゲル電気泳動に基づいて見られる唯一のそ
の他の大きなバンドは長めのプライマーＡ（ＲＨ１７６
〔配列番号２〕）による。
【００８３】驚くべきことに、特異性及び収率における
増大がプライマーＢとＣのみを用いる増幅条件のもとで
も見られた。前記した通り、このことはプライマーＢの
Ｔｍよりも高いアニール温度での２９回のサイクルの際
の、効率は低いが特異性の高い増幅に基づく。低アニー
ル温度での更なる２０回のサイクルは、この効率は低い
が特異的に作られた生成物を十分に増幅せしめる。
増大がプライマーＢとＣのみを用いる増幅条件のもとで
も見られた。前記した通り、このことはプライマーＢの
Ｔｍよりも高いアニール温度での２９回のサイクルの際
の、効率は低いが特異性の高い増幅に基づく。低アニー
ル温度での更なる２０回のサイクルは、この効率は低い
が特異的に作られた生成物を十分に増幅せしめる。
【図１】「ドロップイン」ＰＣＲの図解。
【図２】実施例１に詳細の「ドロップイン／ドロップア
ウト」方法の図解。
ウト」方法の図解。
【図３】ＨＩＶ核酸の検出のためのドロップイン／ドロ
ップアウト方法を用いたＰＣＲ増幅の結果を示す図面代
用写真である。
ップアウト方法を用いたＰＣＲ増幅の結果を示す図面代
用写真である。
【図４】試料中のＨＩＶ ＤＮＡの１コピーを検出する
ためのドロップイン／ドロップアウトＰＣＲ方法の結果
を示す図面代用写真である。
ためのドロップイン／ドロップアウトＰＣＲ方法の結果
を示す図面代用写真である。
【図５】本発明及び実施例２に詳細の通りに提供される
高められた特異性を示す図面代用写真である。
高められた特異性を示す図面代用写真である。
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２６塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖型 分子の型：その他の核酸 CCAGGCCAGA TGAGAGAACC AAGGGG 配列番号：２ 配列の長さ：５２塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖型 分子の型：その他の核酸 GCGGGCAGGG CGGCGGGGGC GGGGCCGAAC CGGTCTACAT AGTCTCTAAA GG 配列番号：３ 配列の長さ：１７塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖型 分子の型：その他の核酸 GGTCCCTGTC TTATGTC
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年３月１５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】「ドロップイン」ＰＣＲの図解。
【図２】実施例１に詳細の「ドロップイン／ドロップア
ウト」方法の図解。
ウト」方法の図解。
【図３】ＨＩＶ核酸の検出のためのドロップイン／ドロ
ップアウト方法を用いたＰＣＲ増幅の結果を示す電気泳
動の図面代用写真である。
ップアウト方法を用いたＰＣＲ増幅の結果を示す電気泳
動の図面代用写真である。
【図４】試料中のＨＩＶ ＤＮＡの１コピーを検出する
ためのドロップイン／ドロップアウトＰＣＲ方法の結果
を示す電気泳動の図面代用写真である。
ためのドロップイン／ドロップアウトＰＣＲ方法の結果
を示す電気泳動の図面代用写真である。
【図５】本発明及び実施例２に詳細の通りに提供される
高められた特異性を示す電気泳動の図面代用写真であ
る。
高められた特異性を示す電気泳動の図面代用写真であ
る。
フロントページの続き (72)発明者 ラッセル ジー．ヒグチ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94177, サンフランシスコ，メルローズ アベニュ 552
Claims (20)
- 【請求項１】 試料中の標的核酸内における配列の入れ
子（ｎｅｓｔｅｄ）増幅のための方法であって、以下の
段階； （ａ）アウタープライマーペアー及びインナープライマ
ーペアーを含む増幅反応混合物中に前記の試料を混合せ
しめ（ここで該アウタープライマーペアーは増幅標的配
列を提供せしめるために前記の標的核酸のセグメントを
増幅することができ、そして該インナープライマーペア
ーは前記の標的配列内におけるサブ配列を増幅すること
ができる）； （ｂ）増幅標的配列を提供するため、段階（ａ）の増幅
反応混合物を、前記の標的配列上における前記のアウタ
ープライマーペアーをアニール及び伸長せしめるための
温度、並びに該アウタープライマーペアーの伸長生成物
を変性せしめるための温度での増幅反応において処理し
（この該アウタープライマーペアーをアニール及び伸長
せしめるための前記の温度は、前記の標的核酸に前記の
インナープライマーペアーをアニール及び伸長せしめる
ための温度よりも高い）、そして （ｃ）増幅サブ配列を提供するため、段階（ｂ）の混合
物を、前記の増幅標的配列上における前記のインナープ
ライマーペアーをアニール及び伸長せしめる前記した温
度、並びに該インナープライマーペアーの伸長生成物を
変性せしめる温度での増幅反応において処理すること、
を含んで成る方法。 - 【請求項２】 前記の増幅反応混合物が３種類のプライ
マーであって、ここで第１のプライマーは前記のアウタ
ープライマーペアーの構成員であり、第２のプライマー
は前記のアウタープライマーペアーと前記のインナープ
ライマーペアーの構成員であり、そして第３のプライマ
ーペアーは前記のインナープライマーペアーの構成員で
あるプライマーを含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載の方法であって、
前記の段階（ｂ）の後、前記のアウタープライマーペア
ーをアニール及び伸長せしめるための前記の温度を、前
記のインナープライマーペアーを前記の段階（ｃ）にて
アニール及び伸長せしめるための前記の温度を提供する
ために低める方法。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいづれか１項に記載の方
法であって、前記のインナープライマーペアーをアニー
ル及び伸長せしめるための前記の温度が前記のアウター
プライマーペアーをアニール及び伸長せしめるための前
記の適切な温度よりも１°〜３０℃低い方法。 - 【請求項５】 請求項２〜４のいづれか１項に記載の方
法であって、前記の段階（ａ）にて、前記の第１のプラ
イマーが一定の温度で前記の増幅反応混合物中に存在し
ている方法。 - 【請求項６】 前記の一定濃度が、前記の増幅反応混合
物中の前記の第２及び第３のプライマーの温度の１％〜
５０％である、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 前記の段階（ｃ）での前記のインナープ
ライマーペアーの伸長生成物の変性のための前記の温度
が、前記のアウタープライマーペアーの伸長生成物を変
性せしめるために適する、請求項１〜６のいづれか１項
に記載の方法であって、更に以下の段階： （ｄ）増幅サブ配列を提供するため、前記のサブ配列
を、前記の増幅標的配列において前記のインナープライ
マーペアーをアニール及び伸長せしめるための適切な温
度、並びに該インナープライマーペアーの伸長生成物の
みを変性せしめるため温度で増幅せしめる（ここで該イ
ンナープライマーペアーの伸長生成物のみを変性せしめ
るための該温度は該アウタープライマーペアーの伸長生
成物を変性せしめるための該温度よりも低い）ことを含
んで成る方法。 - 【請求項８】 前記の段階（ｄ）での前記のインナープ
ライマーペアーの伸長生成物のみを変性せしめるための
前記の温度が、前記のアウタープライマーペアーの伸長
生成物を変性せしめるための温度よりも１°〜２０℃低
い、請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 前記の第１のプライマーが５′Ｇ・Ｃ尾
部を含んで成る、請求項７又は８に記載の方法。 - 【請求項１０】 増幅が生じたかを調べることを更に含
んで成る、請求項１〜９のいづれか１項に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記の増幅反応混合物が検出可能なＤ
ＮＡ結合性試薬を含んで成る、請求項１０に記載の方
法。 - 【請求項１２】 前記のＤＮＡ結合性試薬が臭化エチジ
ウムである、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記の段階（ｂ）の後、且つ段階
（ｃ）の前に増幅が生じているかを調べることを含んで
成る、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記の標的核酸が細胞７０，０００個
当りに１コピーにて存在する、請求項１〜１３のいづれ
か１項に記載の方法。 - 【請求項１５】 前記の標的核酸が感染性の因子であ
る、請求項１〜１４のいづれか１項に記載の方法。 - 【請求項１６】 前記の標的核酸が遺伝子マーカーであ
り、そして前記のアウタープライマーペアーが存在して
いることが分っている配列とハイブリダイズする、請求
項１〜１３のいづれか１項に記載の方法。 - 【請求項１７】 前記のインナープライマーペアーが対
立遺伝子特異的配列にハイブリダイズする、請求項１６
に記載の方法。 - 【請求項１８】 前記の対立遺伝子特異的配列が特定の
疾患の指標であるか、又は組織もしくは血液の判定に有
用である、請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 ＰＣＲにおいて特異性の改善された方
法であって、以下の段階： （ａ）標的核酸配列を含む試料を、該標的を特異的に増
幅せしめるためのプライマーペアーを含む増幅反応混合
物中に混合せしめ； （ｂ）前記のプライマーペアーについてのＴｍ値よりも
１°〜１０℃高い、該プライマーペアーのアニール及び
伸長のための温度にて前記の標的配列を増幅せしめ；そ
して （ｃ）増幅標的配列を提供するため、段階（ｂ）の増幅
反応混合物を、前記のプライマーペアーの効率的なアニ
ール及び伸長のための温度で増幅せしめること、を含ん
で成る方法。 - 【請求項２０】 増幅が生じているかを調べることを更
に含んで成る、請求項１９に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US71857691A | 1991-06-20 | 1991-06-20 | |
| US718576 | 1991-06-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05292968A true JPH05292968A (ja) | 1993-11-09 |
| JPH0681600B2 JPH0681600B2 (ja) | 1994-10-19 |
Family
ID=24886600
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4184740A Expired - Lifetime JPH0681600B2 (ja) | 1991-06-20 | 1992-06-19 | 核酸増幅のための改善された方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5314809A (ja) |
| EP (1) | EP0519338B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0681600B2 (ja) |
| CA (1) | CA2071594C (ja) |
| DE (1) | DE69213112T2 (ja) |
| DK (1) | DK0519338T3 (ja) |
| ES (1) | ES2091976T3 (ja) |
| GR (1) | GR3021832T3 (ja) |
| IE (1) | IE922008A1 (ja) |
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| US5853989A (en) * | 1991-08-27 | 1998-12-29 | Zeneca Limited | Method of characterisation of genomic DNA |
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| WO1995003430A1 (en) * | 1993-07-23 | 1995-02-02 | Gen-Probe Incorporated | Methods for enhancing nucleic acid amplification |
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