JPH05292968A - 核酸増幅のための改善された方法 - Google Patents
核酸増幅のための改善された方法Info
- Publication number
- JPH05292968A JPH05292968A JP4184740A JP18474092A JPH05292968A JP H05292968 A JPH05292968 A JP H05292968A JP 4184740 A JP4184740 A JP 4184740A JP 18474092 A JP18474092 A JP 18474092A JP H05292968 A JPH05292968 A JP H05292968A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amplification
- primer pair
- temperature
- primer
- target
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 159
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 156
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 61
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 58
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 137
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 75
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 56
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 18
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical group [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 claims description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 claims 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 claims 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 abstract description 5
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 251
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 89
- 239000000047 product Substances 0.000 description 73
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 50
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 35
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 35
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 35
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 16
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 11
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 10
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 10
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 241000589596 Thermus Species 0.000 description 5
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 5
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 5
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 4
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxyphosphonamidous acid Chemical compound NP(O)OCCC#N KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 1
- 101100087409 Arabidopsis thaliana RH18 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 101150039033 Eci2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102100021823 Enoyl-CoA delta isomerase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000204666 Thermotoga maritima Species 0.000 description 1
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009102 absorption Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000003508 chemical denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000004374 forensic analysis Methods 0.000 description 1
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 150000005691 triesters Chemical class 0.000 description 1
- 238000007039 two-step reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
及び組成物の提供を目的とする。 【構成】 本発明は増幅反応混合物においてインナー及
びアウタープライマーペアーの両者が存在している簡潔
化した入れ子増幅方法に関する。本方法に従うと、任意
の増幅サイクル中に標的上においてどのプライマーをア
ニール及び伸長せしめるかを制御するため、熱サイクル
プロフィール並びに増幅プライマーの配列、長さ及び濃
度を変える。詳細する方法はPCR増幅に特に適し、そ
して分子生物学、医療診断及び法医学に莫大な用途を有
する。
Description
法及び組成物を提供する。提供するこの新規な方法は従
来の方法よりも向上した標的特異性及び感度を提供し、
そして特にポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による標的
配列の増幅及び検出に有用である。特に本発明に従う
と、熱サイクルプロフィール並びに増幅プライマーの配
列、長さ及び濃度を変えることによって標的に対する特
異性を提供する。本発明の方法は分子生物学、医療診断
及び法医学の分野において莫大な用途を有する。
核酸内の配列の入れ子(nested)増幅に関する方
法を提供する。本方法は:(a)試料を、アウタープラ
イマーペアー及びインナープライマーペアーを含む増幅
反応混合物中に混合する(ここで該アウタープライマー
ペアーは該標的核酸のセグメントを増幅せしめて増幅標
的配列を提供することが可能であり、そして該インナー
プライマーペアーは該標的配列内のサブ配列を増幅せし
めることが可能である);(b)増幅標的配列を提供す
るため、段階(a)の増幅反応混合物を、増幅反応にお
いて、該標的核酸におけるアウタープライマーペアーの
アニール及び伸長のための温度、並びに該アウタープラ
イマーペアーの伸長生成物を変性せしめる温度にて処理
する(ここで該アウタープライマーペアーをアニール及
び伸長するための温度は、該インナープライマーペアー
を該標的核酸にアニール及び伸長せしめるための温度よ
りも高い);そして(c)増幅サブ配列を提供するた
め、段階(b)の混合物を、増幅反応において、該増幅
標的配列におけるインナープライマーペアーのアニール
及び伸長のための温度、並びに該インナープライマーペ
アーの伸長生成物の変性のための温度で処理せしめるこ
とを含んで成る。
の該インナープライマーの伸長生成物を変性するための
温度は該アウタープライマーペアーの伸長生成物を変性
するために適し、そしてこの方法は更に、(d)増幅サ
ブ配列を提供するため、サブ配列を、増幅標的配列にお
けるインナープライマーペアーのアニール及び伸長に適
する温度、並びにインナープライマーペアーの伸長生成
物のみを変性する温度にて増幅せしめることを含んで成
る。ここで該インナープライマーペアーの伸長生成物の
みを変性するための温度は該アウタープライマーペアー
の伸長生成物を変性するための温度よりも低い。
る改善された特異的な方法を提供し、該方法は(a)標
的核酸配列を含む試料を、該標的を特異的に増幅するた
めのプライマーペアーを含む増幅反応混合物の中に混合
せしめ;(b)該標的配列を、該プライマーペアーのT
mより1℃〜10℃高い、該プライマーペアーのアニー
ル及び伸長のための温度で増幅せしめ;そして(c)段
階(b)の増幅反応混合物を該プライマーペアーの効率
的なアニール及び伸長のための温度にて増幅せしめ、増
幅標的配列を提供せしめることを含んで成る。
は、核酸を増幅するための従来の方法よりも高められた
特異性及び感度の利点を有する。本方法は改善された増
幅結果を得るための改良熱サイクル工程の利用に関す
る。本発明の一態様において、本方法は高い特異性のた
めの入れ子プライマーの利用にも関する。本発明は従来
の入れ子プライミング工程の欠点をなくし、そして増幅
副産物、例えばプライマー二量体を引き下げる。この改
良増幅方法は標的特異的増幅化生成物の量の増大によっ
て検出度も高める。
レオチドプローブを用いることにより成し遂げられる。
例えば米国特許明細書第4,358,535号は、試料
(例えば血液、細胞、だ液他)をフィルター上にスポッ
トせしめ、細胞を溶解させ、そして化学変性及び加熱を
介してDNAを固定化せしめることによる病原体の検出
のための方法を開示する。次いで標記DNAプローブを
加え、そしてこの固定化試料DNAとハイブリダイズさ
せる。ハイブリダイゼーションは病原体DNAの存在を
示唆する。
ーゼ連鎖反応(PCR)の発明により大いに高まった。
PCRは核酸を増幅するための方法であり、そして特定
の核酸セグメントの大量のコピー数を作成するための、
2種類のオリゴヌクレオチドプライマー、重合のための
試薬、標的核酸鋳型、並びに核酸の変性及びこのプライ
マーのアニールと伸長の連続サイクルの利用を包含す
る。この方法により、1コピーのゲノムDNAのセグメ
ントは、非常に高い特異性及び精度を伴って1000万
倍以上に増幅されうる。PCR方法は米国特許明細書第
4,683,202号に開示され、そしてPCR生成物
の検出のための方法は特に米国特許明細書第4,68
3,195号に詳細されている。
要である。この検出感度は入手できる検出すべき増幅生
成物の量に限定される。微量配列、例えばAIDS陽性
ではあるがそれ以外は健康である個体のAIDSウィル
ス核酸、又は発癌を示す微量の遺伝子の転写は、検出す
るのに非常に困難であり、また常用の分析技術において
見落されることがありうる。法医学的試料はしばしば微
量の核酸又は部分分解したDNAを含んで成る。
列に対する非標的配列の割合が高いことがあるためであ
る。標的と非標的DNAとの間の区別及び標的配列のみ
の増幅の能力は感度の改善のための重要な観点である。
反応がより特異的になるほど、生産される特異的な標的
配列の相対量は高まり、従ってこの生成物の検出がより
容易になる。特異性の増大は同様に感度も高める。
の米国特許明細書第4,683,195号に詳細され、
これは一本のコピー遺伝子の増幅においてPCR感度を
高めるための入れ子プライマーの利用を説明している。
この方法は、PCRの後にこの反応混合物を10倍に希
釈せしめて第1プライマーペアーの濃度を低め、次いで
第2プライマーペアーをこの反応混合物に導入せしめ、
そしてPCR熱サイクルを反復することを必要とする。
この方法に従い、この第2プライマーは第1PCR生成
物のサブセグメントを増幅せしめるために、この第1プ
ライマーペアーに内在するようデザインされている。こ
の方法は特異的な増幅を高める、即ち、非特異的なバッ
クグランド増幅生成物を少なくし、従って感度を高め
る。このような非特異的増幅生成物は、フランキングプ
ライマーとの偶発的な部分相同性によって生ずるもので
はあるが、それらが増幅し続けるためにこの入れ子プラ
イマーと十分な相同性をも有することはあまりない。
第1プライマーペアーの存在及び第1PCR混合物の希
釈に続く酵素を含む更なる試薬の必要性を有し、その結
果複数の欠点を有する。入れ子プライマー方法の欠点は
試料の希釈段階の際の交差汚染の可能性である。PCR
方法の有する莫大な増幅の可能性に基づき、事前の増幅
に由来する高いDNAレベルの陽性コントロール鋳型又
は標的を有する試料からの少量のレベルのDNAキャリ
ーオーバーは、故意に鋳型DNAを加えていない場合で
さえもPCR生成物をもたらしうる。最小の交差汚染を
伴ってPCRを実施するための特別なる方法及び予備注
意は、Nature 339 , 237-238(1989) 及びPCRプロト
コール:A Guide to Methods and Applications, Acade
mic Press, Inc., San Diego, California(1990)に詳細
されている。
成物検出方法を含む。例えば、Nature 324 , 163-166
(1986) は、ヒトゲノムDNAにおける一塩基置換に基
づく対立遺伝子配列のバリエーションの検出方法を詳細
している。この文献は、対立遺伝子特異性オリゴヌクレ
オチド(ASO)プローブであって、このプローブと完
璧に対合する配列のみとアニールし合うものを開示して
いる(単一の誤対合はハイブリダイゼーションを阻止す
るのに十分である)。このASOプローブは対象の対立
遺伝子配列を含む標的セグメントの増幅に関連して利用
される。
ている。Proc.Natl.Acad.Sci.USA86, 2423-2437(1989)
は、内部プライマーがその後の捕獲及び検出のために標
識された改良入れ子プライミング方法を詳細している。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA87, 4580-4584(1990) は、対立
遺伝子特異的検出のための「ヘミネスチング(hemi
nesting)方法」を開示している。この方法はP
CR生成物の1:50希釈を伴う、一般的なプライマー
ペアーを利用する増幅を必要としている。この生成物を
次に三種の入れ子プライマー(例えば上流に2つそして
下流に1つ)を用いて再増幅せしめる。任意の特定の対
立遺伝子に関して、1種の入れ子プライマーのみが伸長
すべき標的と十分に相補性である。PCR生成物の長さ
及びサイズにおいて相違するこれらのプライマーは対立
遺伝子状態の測定を可能とする。
(1989) は鎌状赤血球貧血の診断のための対立遺伝子特
異的増幅のための方法を詳細する。この方法に関して、
3種のプライマーが増幅反応において含まれている。即
ち、2種の対立遺伝子特異的プライマーであって一方は
鎌状赤血球対立遺伝子に特異的であり、そして他方は正
常対立遺伝子に特異的であるもの、及びいづれもの対立
遺伝子を増幅させるための第3のプライマーである。緊
張条件のもと、この対立遺伝子特異的プライマーは相補
標的上においてのみ伸長されるであろう。従って、1種
のプライマーペアーのみが任意の特定標的のためのPC
Rにおいて機能するであろう。Proc.Natl.Acad.Sci.USA
86, 6215-6219(1989) も対立遺伝子特異的増幅を詳細
している。非入れ子方法において、選択増幅によって複
数の特定対立遺伝子を区別するためにプライマー配列を
改質せしめている。
び感度の両者を高める簡潔な方法が必要とされている。
処理段階を少なくし、且つ交差汚染及びその結果として
の不正確な結果の可能性を最小にもする改善された方法
が所望されている。
善された方法を提供する。本方法は従来の方法よりも改
善された特異性及び感度を提供する。本発明に従い、改
善結果を提供するために増幅反応の熱サイクル条件を改
良した。増幅プライマーの配列、長さ及び/又は濃度も
改良した。更にある態様において、増幅中の温度サイク
ル条件を改良したとき、2種のプライマーのみを必要と
された。しかしながら一般に、該方法は2種より多くの
増幅プライマーが増幅反応混合物に含まれていることを
条件とする。本発明の方法は従来の入れ子増幅方法より
もより少ない段階を有し、従って従来の入れ子プライミ
ング方法よりも速く且つ簡単である。
応において第1及び第2プライマーが存在するPCRを
基礎とする増幅技術に特に適する。本発明に従い、改善
された入れ子増幅のため、該第1及び第2プライマーに
より生ずる増幅生成物とハイブリダイズすることができ
る第3プライマーをこの増幅反応において含ませてい
る。この改良入れ子プライミング方法は、増幅反応混合
物中の各プライマーの固有の性質を利用して、どのプラ
イマーをそれぞれの熱サイクルの際に伸長するかをコン
トロールしている。この方法はあらゆる特定の標的配列
の増幅のために適する。臨床的な立場において、この方
法は従来の入れ子増幅方法の多数の段階を減らすことに
より、迅速さ、簡潔さ、そして試料間の交差汚染の低い
可能性を提供している。
を特徴とするあらゆる核酸増幅方法における利用に適す
る。本明細書において紹介する本発明の方法はPCRを
基礎とする方法であるが、本発明はPCR増幅に限られ
ることはない。PCRは本発明に関連する技術において
広く実用されており、従って便宜上一般的なPCR方法
を簡潔に説明する。
書第4,683,195号及び第4,683,302号
に開示されている。熱安定性酵素を利用するPCRによ
る核酸の増幅及び検出のため方法は米国特許明細書第
4,965,188号に開示されている。
繰り返しサイクル、増幅すべきDNAセグメントとフラ
ンクする配列への2種のオリゴヌクレオチドプライマー
のアニール、そしてDNAポリメラーゼによるこのアニ
ールしたプライマーの伸長を含んでいる。これらのプラ
イマーは標的配列の対応鎖にハイブリダイズし、そして
ポリメラーゼによるDNA合成がこれらのプライマーの
間の領域にわたって効率的にこのDNAセグメントの量
を2倍化せしめるようこれらは位置する。更に、この伸
長生成物はプライマーと相補性であり、従ってこれらと
結合することができるため、各連続サイクルは実質的に
先行サイクルにおいて合成されたDNAの量を2倍化せ
しめる。このことは特定の標的フラグメントを1サイク
ル当り約2n の率にて(ここで「n」はサイクル数であ
る)対数的に増加させる。
のコピーを増やすための任意の試験管内手段を意味す
る。このような方法にはポリメラーゼ(PCR)、DN
Aリガーゼ、(LCR)、Qβ RNAレプリカーゼ及
びRNA転写ベース(TAS及び3SR)増幅系が含ま
れるが、それらに限定されない。
に意味する「増幅」なる語は、核酸の選ばれた配列の数
の直線的及び対数的増大の両方を説明するために本明細
書で用いている。
増幅せしめるために用いる種々の試薬を含んで成る水溶
液を意味する。これらは酵素、水性緩衝液、塩類、増幅
プライマー、標的核酸及びヌクレオシド3リン酸を含
む。含有物に依存して、この混合物は完全又は不完全増
幅反応混合物のいづれかとなりうる。本明細書に詳細の
この系は当業者によって通常利用されるものである。こ
れらは他の者により既に詳細されている。
い。その他の系が開発されれば、それらの系は本発明の
実施によって有利となりうる。近年の増幅系の概要は B
io/Technology 8, 290-293(1990) に公開されてい
る。PCRの他に、リガーゼ連鎖反応(LCR)が代り
となる熱サイクル増幅方法である。PCR/LCRを組
合せた方法は本発明と一緒に利用するのに適する。この
リガーゼ連鎖反応の概要は、リガーゼを基礎とする増幅
系に詳しくない者のために、そして本発明の広さを理解
してもらうために便宜上以降に提供する。
35に詳細されている。この方法は標的核酸にアニール
するオリゴヌクレオチドセグメントを連結するためのリ
ガーゼの利用を含んでいる。LCRはもとの標的分子の
増幅をもたらし、そして生成物DNAの数百万コピーを
提供することができる。従って、LCRは二本鎖DNA
における量の増大をもたらす。本検出方法はLCR及び
PCRに適用できる。LCRは生成物DNAを検出する
ためのオリゴヌクレオチドプローブを必要とする。
リメラーゼが好ましいが、それらは本発明の本質的な観
点ではない。熱安定性ポリメラーゼであるTaqポリメ
ラーゼは高温で活性である。Taqの調製方法は米国特
許明細書第4,889,818号に開始されている。T
aqポリメラーゼは組換え生成物又はサーマス アクア
ティカス(Thermus aquaticus)から
精製されたものとして市販されている。しかしながら、
サーマス種もしくは非サーマス種(例えばサーマス サ
ーモフィラス(Thermus thermophil
ous)もしくはサーモトガ マリチマ(Thermo
toga maritima)から単離した熱安定性D
NAポリメラーゼ、同様に非熱安定性DNAポリメラー
ゼ、例えばT4 DNAポリメラーゼ、T7 DNAポ
リメラーゼ、E.コリ(E.coli)DNAポリメラ
ーゼI、又はE.コリのクレノウフラグメントもPCR
において利用できる。伸長工程において利用されるヌク
レオシド−5′−3リン酸、典型的にはdATP,dC
TP,dGTP及びdTTP又は伸長反応の際に総濃度
において典型的に400μM〜4.0mMの範囲で存在し
うるが、好ましくはその濃度は500μM〜1.5μM
である。
a の両方の酵素として調製されうる。62kDa の酵素は
94kDa の酵素のN末端領域のタンパク質分解切断の結
果としてのプロセスを受けた型である。この酵素のいづ
れの型もPCRにおける重合試薬として機能するであろ
う。このN末端欠失の他に、個々のアミノ酸を酸化、還
元もしくはその他の誘導化により改質せしめるか、又は
活性を保持するフラグメントを得るためにこのタンパク
質を切断せしめることがある。
ラーゼ活性を破壊せしめることなく、翻訳の際のこの配
列に組込まれるアミノ酸の欠失、付加又は変更によるそ
の一次構造自体の改質を行うことができる。このような
置換又はその他の変更は本発明の方法に有用なタンパク
質をもたらしうる。
3′へのエキソヌクレアーゼ活性を欠いている熱安定性
DNAポリメラーゼが適切である。アウタープライマー
の伸長の最中、同一の鋳型鎖と相補性であり、その標的
と瞬間的にアニールするインナープライマーは、野生型
DNAポリメラーゼの5′から3′へのエキソヌクレア
ーゼ活性によって分解する可能性がある。このような分
解の全体的な作用はインナープライマーの濃度を低下さ
せるであろう。本発明に関して、このインナープライマ
ーは過剰量において存在する。従って、5′から3′へ
のエキソヌクレアーゼ活性を欠く酵素の利用は本発明の
実施のためには本質的でない。しかしながら、5′から
3′へのエキソヌクレアーゼ活性を有さない又は低い活
性を有する熱安定性DNAポリメラーゼの利用は開示す
る増幅の方法の実施の好ましい方法を提供する。このよ
うなポリメラーゼは周知であり、且つ市販されている。
なる語は、2個以上、好ましくは3個より多く、そして
通常は10個より多くのデオキシリボヌクレオシド又は
リボヌクレオシドを含んで成る分子として定義する。そ
の正確なサイズは多数の要因に依存し、言い換えるなら
オリゴヌクレオチドの最終機能又は利用に依存するであ
ろう。このオリゴヌクレオチドは合成又はクローニング
により得られうる。
は、精製制限消化において天然的に生ずるもの又は合成
的に製造したものであろうと関係なく、核酸鎖に相補性
のプライマー伸長生成物の合成が開始される条件(即
ち、適切な緩衝液〔「緩衝」はpH、イオン強度、補助因
子、他を含む〕中における種々のヌクレオシド3リン酸
及びDNAポリメラーゼの存在下、且つ適切な温度の条
件)に入れた場合、合成の開始の箇所として働くことが
できるオリゴヌクレオチドを意味する。
ル」なる語は選ばれた「n回」のPCRサイクルのため
に選ばれる温度パラメーターに関する。この熱サイクル
プロフィールは少なくとも2種類の温度、即ち、試料鋳
型及びその後の生成物の変性に適当な高い変性温度、並
びにプライマーのアニール及びポリメラーゼ伸長のため
に適当な低い温度を含んでいる。従って本発明におい
て、特定の熱サイクルパラメーターはプライマーのアニ
ール及び生成物の変性をコントロールするために選ば
れ、これによって鋳型の接近性及びプライマー伸長を制
御する。
は増幅反応の特異性を決定する。本発明において利用す
るプライマーは一般にオリゴヌクレオチド、通常は数個
のヌクレオチドにおける長さのデオキキシヌクレオチド
であってポリメラーゼ連鎖反応による鋳型特異的手段に
おいて伸長されうるものである。このプライマーは重合
のための試薬の存在下において伸長生成物の合成を開始
せしめるのに十分な長さであり、そして典型的には10
〜30個のヌクレオチドを含むが、しかしその正確な数
は本方法の有効な用途にとって重要ではない。
安定なハイブリド複合体を形成せしめるのに一般に低め
の温度を必要とする短めのプライマーを、熱サイクルの
際のアニール温度を操作を介してこの増幅反応の感度及
び特異性を究極的に高める入れ子プライマーの増幅段階
の開始を促進せしめるために提供する。ここで用いてい
る短いプライマーは、標的DNAとアニールしていると
き、アウタープライマーをフランクさせる場合よりも熱
的に不安定であることを特徴とする。関連して、短いプ
ライマーは一般に8〜18個のヌクレオチドである。本
発明の他の観点において、10〜30個のヌクレオチド
の相同性プライマー領域に20〜100個のヌクレオチ
ドの付加された、非相補性尾部を含む長いプライマーが
提供される。この非相補性領域は熱安定性の高い伸長生
成物を提供するのに有用であり、これは増幅鋳型として
働くためにはその後の変性に関して高い温度を必要とす
る。
, 3185-3191(1981) に詳細のトリエステル方法を用い
て調製できうる。他方、例えばシアノエチルホスホラミ
ジト化学を用いるDNA合成装置における自動合成が好
ましい。
鎖と「実質的に」相補性であるよう選ぶ。プライマー伸
長を行うため、このプライマーはこの反応条件のもとで
核酸鋳型とアニールするために十分に相補性でなくては
ならない。プライマー伸長を行うためにこのプライマー
の全てのヌクレオチドがこの鋳型とアニールしなくては
ならないことはない。例えば本発明の一態様において、
非相補性ヌクレオチドフラグメント又は尾部がプライマ
ーの5′末端に付いており、そしてこのプライマー配列
の残り部分がこの鋳型と相補性である。他方、非相補性
塩基をこのプライマーの中に分散させることもでき、こ
の場合このプライマー配列はこの鋳型とハイブリダイゼ
ーションが生じ、且つ相補DNA鎖の合成が可能となる
よう十分に相補性であることを条件とする。
プライマー配列及び増幅特異性を決定する。例えば、不
変領域に対するプライマーは遺伝子配列のクラスを増幅
せしめ、そして可変領域に相補性のプライマーはより高
い生成物特異性を提供する。
る。本発明の一態様において、アウタープライマーは一
般のプライマーとして働き、そして(複数の)インナー
プライマーは対立遺伝子特異性でありうる。本方法に従
い、このアウタープライマーはPCR生成物を作り、そ
してこれはその後第2の小さなPCR生成物を作るため
の鋳型として働きうる。従って、アウタープライマーに
より特定される大きめの一般的なPCR生成物の検出
は、内部陽性コントロールを提供する。この対立遺伝子
特異的増幅生成物は試験官を開封することなく同一の反
応容器中で生ずる。この利点は更に微量物質、例えばA
IDSウィルス核酸の存在について同時に数千種の試料
をスクリーンする臨床試験において、又は法医学分析に
おいて試料が貴重であるかもしくは犯罪の証拠を提供
し、且つその試料の量が非常に限られている場合に特に
有用である。
いる酵素と混和性の緩衝液の中において標的核酸を必要
とする。この標的核酸は組織、体液、排せつ物、喀痰、
だ液、植物細胞、細菌培養物等を含む生物材料の任意の
起源から単離されうる。
列は該増幅系の成分と接しなくてはならない。一般に、
この接近は粗生物試料から核酸を単離せしめることによ
って確実となる。生物試料から核酸を抽出する種々の方
法が当業界に知られている。例えば、Molecular Clonin
g :A Laboratory Manual(New York, Cold Spring Harb
or Laboratory, 1982), Nucleic Acid Hybridization:
A Practical Approach(Eds.Hames and Higgins, IRL Pr
ess, 1985)又はPCRプロトコール、章18-20(Innis
ら、Ed., Academic Press, 1990)を参照のこと。
り、最も通常にはゲノムDNAである。しかしながら、
本発明はその他の核酸、例えばメッセンジャーRNA、
リボソームRNA、ウィルスRNA又はクローン化DN
Aによって実施することもできる。適切な核酸試料は本
発明に利用するための一本鎖もしくは二本鎖DNA又は
RNAを含む。当業者は、核酸の性質に関係なく、この
核酸は利用する方法を適切且つよく知られた改良を行う
ことによって簡単に増幅できることを知っている。
酵素を伴う自動化プロセスとして最も通常的に行われて
いる。このプロセスにおいて、この反応混合物は変性を
及ぼす温度範囲、プライマーのアニールの温度範囲及び
伸長の温度範囲にわたってサイクルされる。一般に、こ
のアニールと伸長の温度範囲は重複しており、従ってP
CRは変性段階とアニール/伸長段階を含んで成るツー
ステップサイクル反応として通常行なわれる。熱安定性
酵素を用いて利用するのに特に合わせてある装置はヨー
ロッパ特許公開236,069号により完璧に詳細さ
れ、そして市販されている。
対象のオリゴヌクレオチド配列、即ち「標的核酸」を含
む又は含むと予想される試料を用意する。この標的はR
NAもしくはDNA又はRNA/DNAハイブリドであ
りうる。この標的は一本鎖でも二本鎖でもよい。標的の
準備は特定の増幅プロセスが満足される適切な方法にお
いて行われる。例えば、該標的核酸が一本鎖の例えばm
RNAである場合のPCR方法において、この標的を増
幅する前にまずcDNAへと逆転写せしめる。
法によって成し遂げられうる。このような手段には、例
えばドットプロット又は電気泳動方式におけるアイソト
ープもしくは非アイソトープ的標識プローブとのハイブ
リダイゼーションを含むが、それらに限定されない。検
出方式系は捕獲段階、例えば固相支持体及びアビジン−
ビオチン標識系を含みうる。ヨーロッパ特許公開第23
7,362号には、「リバース」ドットプロットと称さ
れているPCRを基礎とする検出方法が詳細され、これ
においては増幅DNAの代りにプローブが膜に結合され
ている。この方法に従うと、プローブよりもむしろ標的
をハイブリダイゼーションのために標識する。
列とハイブリダイズしたかを調べるための多数の方法が
存在する。典型的には、このプローブが検出可能な方法
において標識する。この標的DNA(即ち、PCR反応
緩衝液中の増幅DNA)は固相支持体と結合しており、
そしてハイブリダイゼーションが生じたかの検出はこの
固相支持体上に標識物が存在しているかを調べることを
含む。しかしながらこの方法は変えることができ、そし
てこの標的が標識され且つこのプローブがこの固相支持
体に結合している場合が考えられる。
く、核酸を標識するための多数の方法が当業界に知ら
れ、そしてそれらは本発明の目的に適する。適切な標識
は螢光、放射活性、比色、X線回折又は吸収、磁性、酵
素活性等により検出できるシグナルを提出しうる。適切
な標識物には螢光団、発色団、放射性アイソトープ(特
に32P及び 125I)、電子密度物質、酵素及び特定の結
合パートナーを有するリガンドが含まれる。酵素は一般
にその活性により検出される。例えば西洋ワサビペルオ
キシダーゼ(HRP)はジアミノベンジジンを青色の色
素へと変換させうるその能力によって検出されうる。H
RPを基礎とする検出はテトラメチル−ベンジジン(T
MB)を利用することが好ましい。
エチジウムの存在下において増幅が生ずることを利用す
る均一アッセイ系において、この増幅混合物の螢光は該
標的が増幅され、そしてこの反応混合物中に存在する二
本鎖DNAの量が増加するに従って強くなる。本発明は
このような均一アッセイ方法に関連して利用するのに特
に適する。組合せ方法は実施例2において説明し、そし
てこれは従来の核酸の増幅及び検出の方法よりも優れた
利点を提供する。
たら、その反応容器を開ける必要のない標的の存在の検
出のための手段を授ける。本発明は入れ子増幅のための
反応容器を開けることを伴わない方法を提供する。従っ
て本発明に関し、この組合せ方法は、入れ子プライミン
グの高められた感度及び特異性、並びに均一アッセイ系
の検出の容易さを有する。反応容器を開けることなく、
70,000個の細胞において1コピーほどの微量な配
列が、標的検出のために通常必要とされる更なる処理又
は操作を伴うことなく検出されうる。本発明によって交
差汚染の可能性は大いに小さくなった。他の態様におい
て、分光螢光計の利用が生じる生成物の量の定量を可能
にする。従って、均一アッセイにおいて利用した場合、
本発明は例えば感染症の進行又は治療養生法に対する応
答をモニターするための定量分析を可能にする。
R反応混合物に加えた後にDNAポリメラーゼを加える
ことが好ましいが、これは本質的なことではない。他
方、例えば酵素及びプライマーを最後に加える、又はP
CR緩衝液もしくは鋳型を含む緩衝液を最後に加えるこ
とがある。プライマー及び鋳型の両者が存在し、そして
酵素が所望のプライマー/鋳型基質と結合して伸長化を
行える時点迄、重合に本質的な成分の少なくとも1種類
が含まれていないことが所望される。「ホットスター
ト」と称する本方法は、特異性を高め且つ「プライマー
二量体」の形成を最小にせしめる。
イマー及びそれらに相補性の配列より成る二本鎖のPC
R生成物を意味する。プライマー二量体の合成は一方の
プライマーを鋳型として用いて他方のプライマーを伸長
することにより得られる。プライマー二量体は標的の非
存在下において生ずることができ、そしてプライマー濃
度に比例すると思われる。「プライマー二量体」の初期
形成は低温度(即ち室温)で起こりうる。従って「ホッ
トスタート」は熱的プロフィールのこの段階を少なくす
る。一担形成されたなら、このPCR副産物は非常に効
率的に増幅し、そして特異的な鋳型を微量又は全く含ま
ない反応系において検出される。微量鋳型反応系におい
て、このプライマー二量体は該プライマー及び酵素に対
する標的フラグメントと競合でき、そして有効な標的増
幅を妨害しうる。
体を少なくし、従ってPCR特異性を高めるために働
く。米国特許明細書第4,683,195号は入れ子プ
ライマー方法が2種類のプライマーペアーを必要とする
ことを詳細している。この方法に従うと、第1の「アウ
ター」プライマーペアーを標的配列の増幅のために用
い、そして第2の「インナー」プライマーペアーをこの
第1増幅反応により形成されるPCR生成物のサブセグ
メントを増幅するために用いる。この明細書に詳細の方
法に従うと、反応混合物を10倍に希釈してPCR後の
第1プライマーペアーの濃度を下げ、次いで第2プライ
マーペアーをこの反応混合物に導入する。この方法は多
数の更なる段階であって、PCRの停止、反応試験管の
開封、アウタープライマーの濃度を下げるための反応液
の希釈、第2プライマーペアーの添加、その結果として
の緩衝条件の調整、更なる酵素の添加、そして第2熱サ
ークル反応を含む段階を必要とする。これらの段階は本
発明により削減される。
し、ここで全てのアウター及びインナープライマーは最
初の反応混合物中に存在し、そして熱サイクラーは、イ
ンナープライマーではなくアウタープライマーがまず増
幅され、その後アウタープライマーでなくインナープラ
イマーが増幅されるようにプログラムされ、最初のPC
R生成物内の標的サブ配列が増幅されるようになってい
る。本発明の実施例は、本発明に従って調製したプライ
マーが所望の結果と一致してこの増幅反応にドロップイ
ン(参加する)又はドロップアウト(離脱する)するよ
うに作ったことを例示するために提供する。複数の態様
において、最初のフランキングの一構成員、即ち、アウ
タープライマーペアーも、インナー又は第2プライマー
として機能しうる。従って、3種類のプライマーのみが
利用される。他方、インナー及びアウタープライマーペ
アーの両者を含んで成る4種のそれぞれのプライマーが
利用されうる。4種のプライマーを用いる場合、このイ
ンナープライマーの一方又は両者ともに「ドロップイ
ン」するように作られている。
一構成員に内在する第3プライマーを、特定の標的セグ
メントを増幅するためのPCR反応に含ませる。PCR
反応における温度が上昇するに従い、この第3プライマ
ーはもはや安定的に該標的鋳型とアニールしないが、フ
ランキングプライマーは未だ安定的にアニールする点が
到達される。従って、この第3プライマーはアウタープ
ライマーのフランキングの最適アニール温度よりも低い
PCRのための最適なるアニール温度を有する。この性
質はより短い長さ及び/又はより低いGC含有によりこ
の第3プライマーに授けられうる。増幅反応中のアニー
ル温度の調整は、任意の特定のアニール/伸長のサイク
ルの際にどのプライマーをポリメラーゼによって伸長さ
せるかを決定する。
にフランクするプライマーは低濃度で存在している。最
初のn回のPCRサイクルに関して、各PCRサイクル
の伸長段階の際の温度を十分に高く(例えば約65℃
に)維持し、短いインナープライマーが特異的にアニー
ルして増幅を開始せしめることを防止する。アウタープ
ライマーは十分にアニールし、従ってPCRが高い伸長
温度にて正常に進行するようにする。増幅がプラトーに
なる前、一定のアウタープライマーの供給がほとんど使
い尽くされたら、このアニール温度を例えば約42℃迄
低下させる。この温度にて、この第3プライマーは「ド
ロップイン」し、そして残りのサイクルにわたって該標
的の増幅を進行せしめる。この方法を図1において図解
し、本明細書では「ドロップイン」PCRと称する。図
に関して、該アウタープライマーペアーはプライマー
「A」及び「C」であり、該インナーペアーはプライマ
ー「B」及び「C」であり、そして「B」は第3プライ
マーである。
1)は任意の特定のプライマー/鋳型二本鎖のためのPC
Rについての最適アニール温度の評価についての方法を
提供している。最も関係のある熱力学的データは Proc.
Natl. Acad. Sci. 83, 3746-3750 (1986)に開示され、
同様に Nuc, Acids Res. 6 , 3543-3557 (1979)はTm
を評価するための例示的な実験式を詳細している。Tm
は一般にPCRのための最適アニール温度よりも若干高
いが、Tmの計算は本発明の実施のための適切な温度を
実験的に決めるための当業者の指標を提供する。
定量の末梢血液中のHIVプロウィルスDNAに関し
て、試料中に存在する標的の量は1000倍に迄相違し
うる。ドロップインPCRはこのような分析に特に適
し、その理由はこの増幅における一定のアウタープライ
マー濃度の効果にある。特定の試料において標的の量が
高い場合、PCRははやくプラトーに達するがそれは完
全とはならない。もし試料中における標的の量が低い場
合、増幅は続く。従って、一定のアウタープライマー濃
度を利用することにより、種々の反応はこの熱サイクル
状態が移り変って入れ子プライマーが「ドロップイン」
することが可能となる前にほぼ同一の一定増幅状態とな
る。その結果、入れ子増幅結果における試料間差の影響
はなくなる。
おいて、低濃度の1種類のフランキングプライマーの必
要性がなくなる。この方法に従うと、高い変性温度及び
高いアニール温度は、インナープライマーではなくアウ
タープライマーが伸長することを可能にする。フランキ
ングプライマーはGCに富んだ尾部を伴って合成せしめ
る。2サイクルの増幅の後、PCR生成物の中にこの非
相補性のプライマー尾部配列が一体化されるため、この
GC尾部はPCR生成物の変性に必要とされる温度を高
める。その理由はATペアーと比較してのGCペアーの
高い熱安定性による。入れ子PCR生成物及びフランキ
ングPCR生成物の変性温度における結果の相違は、尾
部のついたアウタープライマーからの増幅を効果的に停
止せしめることに利用する。
られ、そして所望する場合に該入れ子プライマーからの
合成が開始するようにアニール温度を操作することによ
ってこの入れ子プライマーが「ドロップイン」するよう
になった後、この変性温度を低める、即ち96°から8
6℃に下げる。低い温度ではアウタープライマーPCR
生成物は完全に変性しなく、従って鋳型として働くこと
ができない。しかしながら、この低い変性温度は入れ子
PCR生成物の増幅を十分に可能にする。この態様を以
下に概略する。n回のサイクルの後、このアニール温度
を低め、インナープライマーをアニールさせる。n+x
回のサイクルの後、この変性温度を低め、初期PCR生
成物が変性してアウタープライマーのための鋳型として
働くことを防止する。「ドロップイン/ドロップアウ
ト」PCRと呼ぶこの手法は実施例1及び2に詳細の通
り、1種類の内在型プライマーのみを用いて行うことが
できる。これらの態様において、1種類のフランキング
プライマーはインナー及びアウタープライマーの両方と
して働くことができ、そしてこれはサイクル反応の熱プ
ロフィールの移り変わりに影響されない。ドロップイン
/ドロップアウトPCRを図2において図解する。
反応混合物並びに関連の熱サイクルのプログラムについ
ての適切な変性及びアニール温度を決定するための実験
的な手段を容易に利用することができる。該ドロップイ
ン/ドロップアウトPCR方法は、PCR効率を最高に
するのに好ましい高濃度である全てのプライマーを含み
ながらこの反応中の任意のサイクルにてどの特定のプラ
イマーペアーを伸長するかをコントロールする方法を提
供する。入れ子プライマー増幅についての本方法のこの
態様は実施例1及び2に示す。
プライマーが低濃度で存在することを必要とする。一般
に、増幅プライマーは100μLの反応液当り1〜10
0pmole の濃度で存在する。ドロップインPCRに関し
て、上記のプライマーの適切な濃度は第2及び第3プラ
イマー(即ちインナープライマーペアー)の濃度の1%
〜50%の範囲にある。増幅が進むに従い、第1プライ
マーの量はその他のプライマーに関連して制限される。
従って、このアニール温度が第3のプライマーのTmに
迄下がった場合、インナープライマーのアニール及び伸
長が有利となり、そして小さいプライマーPCR生成物
が生じ始める。
ロフィールにおける変化は増幅の特異性を高める。PC
Rを進めるに従い、非特異的プライマーは非標的、即ち
バックグランド生成物の生成をもたらしうる。非標的鋳
型を用いる熱サイクルがなされると、この鋳型はその後
のサイクルにおいて増幅され続けるであろう。アウター
プライマーは増幅した非標的鋳型とアニールするが、イ
ンナープライマーはしない。熱サイクルプロフィールに
おける各移り変わりは非標的鋳型分子の集団における移
り変わりをもたらしうる。従って、サイクルパラメータ
ーにおける各移り変わりに伴い、従来の熱サイクルの際
で考えられる非標的増幅は減少し、その結果標的特異性
は高まる。
なサイクルの数は経験的に決定され、そしてそれは試
料、特に標的の複雑度並びに標的及びバックグランド核
酸の相対量に依存して変化する。アウタープライマーが
伸長される高いアニール温度で必要とするサイクルの数
は1回以上でありうる。例えば高いアニール温度で1−
30サイクルを含むことが所望されることがあり、そし
てサイクルの特定の回数はアッセイの特性、即ち、試
料、標的、プライマー及び必要とする特定の結果に従っ
て決定される。
クル数にわたってアウタープライマーを用いて第1PC
R標的を増幅することが所望されうる。均一アッセイを
用いることにより、増幅生成物の存在のアッセイはこの
反応容器を開けることなく螢光によって容易に測定され
うる。このアウタープライマー存在していることが分っ
ている対象の領域、例えば特定の遺伝子セグメントの増
幅に適する。例えばアウタープライマーペアーによる遺
伝子マーカーの増幅は、その増幅が行なわれたことを示
唆する内部陽性コントロールを提供する。
え、そしてインナー標的又は特異的プライマーを利用す
る。螢光の更なる増強により測定されるPCR生成物の
更なる増加は特定の標的配列の存在を示唆する。ところ
で、アウタープライマーペアー増幅生成物の検出は本発
明の本質的な観点ではない。第1(アウター)プライマ
ーペアーによる増幅は、第2(インナー)プライマーペ
アーによる増幅のための更なる鋳型を提供する標的分子
数の増大のために働く。
る第2サイクル段階(高温変性、低温アニール)は内部
型プライマーを用いる増幅の開始のために働き、そして
第3サイクル段階(低温変性、低温アニール)のための
標的を提供する。この第3サイクル段階の間、この低い
変性温度はインナープライマーの増幅を進行させながら
アウタープライマーの増幅を有効に低める。高温変性及
び低温アニールでの増幅はアウターPCR生成物をイン
ナーPCR鋳型に変換せしめる。実際、1〜10サイク
ルがこの反応の第2段階に関しては十分であるが、より
多くのサイクル数が特定の標的に所望される場合があ
る。
ためのアニール温度はオリゴヌクレオチドのGC含有%
の関数となる。本発明の実施例により提供される教示を
利用することにより、任意の特定の標的及びプライマー
に適切なアニール温度は当業者によって容易に決定され
るであろう。低温アニールと高温アニールサイクルのア
ニール温度の相違は少なくとも1℃、そして好ましくは
3℃〜30℃である。同様に、プライマー伸長温度も本
明細書及び記載の文献も利用することによって当業者に
より容易に決定されるであろう。
は、標的及び試料の複雑度、GC含有率、並びにプライ
マー配列に依存して最大20℃、最小1℃でありうる。
低変性温度への移り変わりは非標的増幅DNAの変性を
防ぐ。この核酸は標的でないため、変性を防ぐための最
適温度を推測するためにその長さ及び%GC含有率を決
定することはできない。従って、この変性温度は本明細
書及び本実施例を利用することにより経験的に決定す
る。PCR Technology, Stockton Press (1989) はDNA
サブセグメント又は大きめの核酸配列内のドメインのT
mにおけるヌクレオチド配列の効果を詳細している。例
えば、GC100%の約40個のヌクレオチドを含んで
成る尾部付きプライマーは、長さにおいて500塩基対
の増幅配列の完全な変性のために必要とされる温度を変
えるのに十分である。好ましくは、フランキングプライ
マーの5′末端に付加されたG−C尾部は長さにおいて
10〜100個のヌクレオチドである。
グプライマーは高い生成物特異性のために必要とはされ
ない。インナープライマーペアーのみを用いるドロップ
イン増幅に関するプロトコールに従い、標準のPCR条
件を利用する増幅の結果と比べて予測できないほど優れ
た結果が得られた。実施例2は本発明のこの態様を説明
する。
ール温度を用いて少なくとも1回の熱サイクルに試料を
かけることによって増幅特異性が高められることはわっ
ていなかった。このサイクルプロフィールはその後調整
され、そしてアニール温度は適当なTm値に迄低められ
ている。従って、本発明の一態様において、プライマー
のアニール及び伸長のためのこの温度は特定のプライマ
ーペアーに関する推定Tmよりも1°〜10℃高い。こ
の温度での増幅の効率は非常に悪いが、生ずる任意のプ
ライマー伸長は標的特異性である。従って、この高めの
温度サイクルの間、この試料は特定の標的配列に富むよ
うになり、そして任意のサイクルの回数、即ち1〜15
回は、生成物特異性を高める。次にアニール化温度を下
げて増幅効率を高め、そして検出可能な量のPCR生成
物が得られる。
有用である。例えば、70,000個の細胞当りに1コ
ピーとして存在するAIDSウィルス核酸の検出は本方
法により向上し、そして実施例1に例示する。同様に、
一塩基対の変異の存在を検出するための対立遺伝子特異
的増幅も高温アニールサイクルの付加によって向上し
た。
幅特異性に関するキットを提供することで商業化されう
る。このキットは特定の標的又は対立遺伝子のためのイ
ンナー及びアウタープライマーペアーを含むであろう。
このキットは増幅のための任意の以下の薬剤、例えばD
NAポリメラーゼ、緩衝剤、dNTP及び陽性コントロ
ール鋳型も含みうる。
高いバックグランドの存在下における微量標的の検出 70,000個のヒト細胞由来のDNAのバックグラン
ドにおいて一本のコピー配列を増幅するためにドロップ
イン/ドロップアウト増幅方法を利用した。本明細書に
簡単に詳細したプライマー「ドロップイン/ドロップア
ウト」方法である改良入れ子プライマー方法を、PCR
特異性を高めるためにデザインした。このアッセイは以
下の通りに行った。PCR反応容器1〜8に、50mMの
KCL;10mMのトリスHCL,pH8.3;2.5mMの
MgCl2 ;600mMの全dNTP;1.25ユニット
のTaq DNAポリメラーゼ(PECI);1.27
μMの臭化エチジウム;0.5μgのヒト細胞系DN
A;プライマーペアーRH171(配列番号1)及びR
H176(配列番号2)(各プライマーは0.2μ
M);並びに入れ子RH182(配列番号3)(これも
0.2μM)をそれぞれ含む50マイクロリゥターの溶
液を分注した。蒸発を防ぐため、8種の溶液を保護する
ために鉱油を一滴用いた。本プライマーを用いて作る増
幅PCR生成物のために必要な変性温度を高めるプライ
マーRH176(配列番号2)は、GCに富む(標的配
列に)非相同性の5′「尾部」を保有する。
温度のサイクルを開始する前にこの3種のプライマーを
含ませた。反応5−8は、熱サイクルを開始する前にそ
れらが72℃の温度に平衡化する迄、この3種のプライ
マーの添加を待った。従がって、反応液5−8は前記し
た「ホットスタート」されるものである。反応液2−4
及び6−8は、標的、陽性コントロールDNA(PEC
Iより購入)であってRH171(配列番号1)、RH
182(配列番号3)及びRH176(配列番号2)の
3′領域が相同性であるHIV配列を含むものも含んで
いる。このDNAを希釈し、各反応液が平均して4コピ
ーのこのHIV配列を含むようにした。このコピーの平
均数は小さいため、一定の反応における実際のコピー数
はかなり変わりうる。反応液1と5にはHIV DNA
を加えていないため、これらの反応は陰性コントロール
として働く。
mer Cetus DNA熱サイクラーを用い、以下
の熱サイクルにかけた:96℃での変性、1分間の保
持、64℃でのアニール、1分間の保持。このプロフィ
ールを29サイクル反復し、その間、フランキングプラ
イマーペアーRH171(配列番号1)とRH176
(配列番号2)は効率的にアニールし、そしてそれらは
増幅に利用されたが、しかし64℃で効率的にアニール
しない入れ子プライマーRH182(配列番号3)は効
率的な増幅において利用されなかった。次いで96℃で
の変性、1分間の保持、52℃でのアニール、1分間の
保持を行った。このプロフィールを2サイクル反復し、
その間、3種全てのプライマーは効率的にアニールし、
そしてそれらはこの増幅系において伸長され、従ってR
H171(配列番号1)とRH176(配列番号2)又
はRH171(配列番号1)とRH182(配列番号
3)のいづれかを利用した生成物が作られた。第3の入
れ子プライマーの利用は生成物の特異性を高めるため、
RH171(配列番号1)及びRH182(配列番号
3)を利用して作られる生成物はよりHIV特異性の傾
向にある。これらのサイクルの後、86℃での変性、1
分間の保持、52℃でのアニール、1分間の保持を行っ
た。このプロフィールを18回反復し、その間、GCに
富むプライマーRH176(配列番号2)を含むHIV
特異性及び非特異性両者の生成物は86℃で効率的に変
性せず、従って効率的に増幅しなかったが、入れ子プラ
イマーRH182(配列番号3)及びRH171(配列
番号1)を用いて作った増幅HIV配列は効率的に変性
且つ増幅した。
によって分析し、そして写真撮影した(図3参照)。反
応2−4及び5−8は、ゲル上の予測バンドとしての予
測サイズ(約200bp) の生成物を含むことが示され
た。陰性コントロールの反応1と5はこのような生成物
を含まなかった。しかしながら、「ホットスタート」さ
れていない反応2−4は、予測サイズ以外のDNAフラ
グメントを含むことが見受けられた。このような他のD
NAフラグメントは反応1においても見られ、それらが
HIV配列に由来しないことを示唆する。このような他
のDNAフラグメントは反応5−8において見られず、
「ホットスタート」の利用がこれらの反応の特異性を高
めたことを示唆する。
てを前記の「ホットスタート」として行った。陰性コン
トロールDNAを、1〜8で番号付けした8種の反応液
に希釈し、それぞれがHIV標的分子の半分を平均して
含むようにした。この分子は分割することができないた
め、このことはいくつかの反応液は標的分子を含み、そ
していくつかは含まないことを意味する。もしこの実験
を何回も繰り返したなら、標的を含む反応液の画分はか
なり変化しうるが、しかしそれらを半分に平均化する。
標的分子を含むものはほとんど一本の標的分子を含む傾
向にある。これらの反応が終了したら、8種の全てをゲ
ル電気泳動により分析して写真撮影した(図4)。結果
は、この8種の反応のうちの2種、番号1と8が、ゲル
上の予測バンドとして予測のサイズ(約200bp) を、
プライマーに相当するバンド以外のその他のバンドが見
受けられない状態で示した。反応2−6は、おそらく特
異的なHIV鋳型配列が存在していないことに基づき、
上記のバンド又は任意のその他のDNAフラグメントを
示さなかった。
高められた特異性の実証 熱サイクルパラメーターが増幅特異性に予測の効果を有
するかを実証するための方法において、実施例1に詳細
の実験を繰り返した。
が、但し各反応混合物においては〜20コピーのHIV
プラスミドが存在し、そして各反応には入れ子プライマ
ーRH182(配列番号3)を含ませなかった。図5に
おいて、上記のプライマーをプライマーBとして表示
し、もしこの反応混合物に含ませたフランキングプライ
マーRH176(配列番号2)及びRH171(配列番
号1)はそれぞれプライマーA及びプライマーCとして
表示した。これら9種の反応を「AとC」反応と本明細
書では称する。同様の方法、但しプライマーRH182
(配列番号3)及びRH171(配列番号1)のみを含
ませて、9つのその他の反応液を用意した。これらの反
応は「BとC」反応と称する。
が、但し3種の全てのプライマー、RH176(配列番
号2)、RH182(配列番号3)及びRH171(配
列番号1)を利用した。これらの反応を「A,BとC」
反応と称する。
スタート」を利用して開始した。「AとC」、「Bと
C」及び「A,BとC」のグループのそれぞれの3つの
反応液を、DNA合成を開始するようプライマー「B」
が「ドロップイン」することを防ぐ条件を利用して増幅
させた。これらは96℃の変性温度と64℃のアニール
温度にて49サイクルを利用する熱サイクルにおいて増
幅させた。このアニール温度はプライマーB(RH18
2〔配列番号3〕)の計算Tm値よりも高かった。予測
通り、プライマーBのみが存在している「残された」プ
ライマーである「BとC」グループにおいて、検出可能
なPCR生成物は図5において示す電気泳動ゲル上に見
られなかった(3つの増幅物のアリコートを電気泳動ゲ
ルに流している。)AとC、又はA,BとCが存在して
いる場合、観察される生成物はプライマーA及びCの結
合したHIV配列について予測されるサイズの生成物並
びにその他の非特異的生成物であった。
反応液を、GCに富む非相補性5′「尾部」を含むプラ
イマー「A」(RH176〔配列番号2〕)から合成さ
れるDNAの変性及び増幅を防ぐ条件を用いて増幅させ
た。これらの条件は49サイクルにわたる86℃の変性
温度と52℃のアニール温度である。このアニール温度
はプライマーB(RH182〔配列番号3〕)のアニー
ルと伸長を可能とする十分に低い温度であった。予測通
り、これらの条件のもとで増幅せしめた「AとC」反応
液のゲル電気泳動において増幅生成物は見られなかっ
た。しかしながら、プライマーBとCが結合したHIV
配列に相当するサイズの増幅生成物、並びに更なる非特
異的DNA生成物が増幅「BとC」及び「A,BとC」
において見られた(図5参照)。
反応液を図2に図解する「ドロップイン/ドロップアウ
ト」増幅の可能な条件のもとで増幅させた。この条件
は、96℃の変性と64℃のアニールを利用する29回
のサイクル、96℃の変性と52℃のアニールを利用す
る2回のサイクル及び86℃の変性と52℃のアニール
を利用する18回のサイクルである。最初の2種類の熱
サイクル段階のみが有効な増幅プライマーとしてのプラ
イマーAの利用を可能とした。これらの31サイクルは
試料中に存在するわずかのHIV標的分子もゲル電気泳
動及び臭化エチジウム染色によって検出できるように増
幅するには十分でなかった。従って、予測通り、プライ
マーAとCのみによってはPCR生成物は形成されなか
った。更に予測通り、3種の全てのプライマーを用いる
完全な「ドロップイン/ドロップアウト」プロトコール
は生成物の最大の収量を伴って最も特異的な増幅を示し
た(図5)。ゲル電気泳動に基づいて見られる唯一のそ
の他の大きなバンドは長めのプライマーA(RH176
〔配列番号2〕)による。
増大がプライマーBとCのみを用いる増幅条件のもとで
も見られた。前記した通り、このことはプライマーBの
Tmよりも高いアニール温度での29回のサイクルの際
の、効率は低いが特異性の高い増幅に基づく。低アニー
ル温度での更なる20回のサイクルは、この効率は低い
が特異的に作られた生成物を十分に増幅せしめる。
ウト」方法の図解。
ップアウト方法を用いたPCR増幅の結果を示す図面代
用写真である。
ためのドロップイン/ドロップアウトPCR方法の結果
を示す図面代用写真である。
高められた特異性を示す図面代用写真である。
ウト」方法の図解。
ップアウト方法を用いたPCR増幅の結果を示す電気泳
動の図面代用写真である。
ためのドロップイン/ドロップアウトPCR方法の結果
を示す電気泳動の図面代用写真である。
高められた特異性を示す電気泳動の図面代用写真であ
る。
Claims (20)
- 【請求項1】 試料中の標的核酸内における配列の入れ
子(nested)増幅のための方法であって、以下の
段階; (a)アウタープライマーペアー及びインナープライマ
ーペアーを含む増幅反応混合物中に前記の試料を混合せ
しめ(ここで該アウタープライマーペアーは増幅標的配
列を提供せしめるために前記の標的核酸のセグメントを
増幅することができ、そして該インナープライマーペア
ーは前記の標的配列内におけるサブ配列を増幅すること
ができる); (b)増幅標的配列を提供するため、段階(a)の増幅
反応混合物を、前記の標的配列上における前記のアウタ
ープライマーペアーをアニール及び伸長せしめるための
温度、並びに該アウタープライマーペアーの伸長生成物
を変性せしめるための温度での増幅反応において処理し
(この該アウタープライマーペアーをアニール及び伸長
せしめるための前記の温度は、前記の標的核酸に前記の
インナープライマーペアーをアニール及び伸長せしめる
ための温度よりも高い)、そして (c)増幅サブ配列を提供するため、段階(b)の混合
物を、前記の増幅標的配列上における前記のインナープ
ライマーペアーをアニール及び伸長せしめる前記した温
度、並びに該インナープライマーペアーの伸長生成物を
変性せしめる温度での増幅反応において処理すること、
を含んで成る方法。 - 【請求項2】 前記の増幅反応混合物が3種類のプライ
マーであって、ここで第1のプライマーは前記のアウタ
ープライマーペアーの構成員であり、第2のプライマー
は前記のアウタープライマーペアーと前記のインナープ
ライマーペアーの構成員であり、そして第3のプライマ
ーペアーは前記のインナープライマーペアーの構成員で
あるプライマーを含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 請求項1又は2に記載の方法であって、
前記の段階(b)の後、前記のアウタープライマーペア
ーをアニール及び伸長せしめるための前記の温度を、前
記のインナープライマーペアーを前記の段階(c)にて
アニール及び伸長せしめるための前記の温度を提供する
ために低める方法。 - 【請求項4】 請求項1〜3のいづれか1項に記載の方
法であって、前記のインナープライマーペアーをアニー
ル及び伸長せしめるための前記の温度が前記のアウター
プライマーペアーをアニール及び伸長せしめるための前
記の適切な温度よりも1°〜30℃低い方法。 - 【請求項5】 請求項2〜4のいづれか1項に記載の方
法であって、前記の段階(a)にて、前記の第1のプラ
イマーが一定の温度で前記の増幅反応混合物中に存在し
ている方法。 - 【請求項6】 前記の一定濃度が、前記の増幅反応混合
物中の前記の第2及び第3のプライマーの温度の1%〜
50%である、請求項5に記載の方法。 - 【請求項7】 前記の段階(c)での前記のインナープ
ライマーペアーの伸長生成物の変性のための前記の温度
が、前記のアウタープライマーペアーの伸長生成物を変
性せしめるために適する、請求項1〜6のいづれか1項
に記載の方法であって、更に以下の段階: (d)増幅サブ配列を提供するため、前記のサブ配列
を、前記の増幅標的配列において前記のインナープライ
マーペアーをアニール及び伸長せしめるための適切な温
度、並びに該インナープライマーペアーの伸長生成物の
みを変性せしめるため温度で増幅せしめる(ここで該イ
ンナープライマーペアーの伸長生成物のみを変性せしめ
るための該温度は該アウタープライマーペアーの伸長生
成物を変性せしめるための該温度よりも低い)ことを含
んで成る方法。 - 【請求項8】 前記の段階(d)での前記のインナープ
ライマーペアーの伸長生成物のみを変性せしめるための
前記の温度が、前記のアウタープライマーペアーの伸長
生成物を変性せしめるための温度よりも1°〜20℃低
い、請求項7に記載の方法。 - 【請求項9】 前記の第1のプライマーが5′G・C尾
部を含んで成る、請求項7又は8に記載の方法。 - 【請求項10】 増幅が生じたかを調べることを更に含
んで成る、請求項1〜9のいづれか1項に記載の方法。 - 【請求項11】 前記の増幅反応混合物が検出可能なD
NA結合性試薬を含んで成る、請求項10に記載の方
法。 - 【請求項12】 前記のDNA結合性試薬が臭化エチジ
ウムである、請求項11に記載の方法。 - 【請求項13】 前記の段階(b)の後、且つ段階
(c)の前に増幅が生じているかを調べることを含んで
成る、請求項11に記載の方法。 - 【請求項14】 前記の標的核酸が細胞70,000個
当りに1コピーにて存在する、請求項1〜13のいづれ
か1項に記載の方法。 - 【請求項15】 前記の標的核酸が感染性の因子であ
る、請求項1〜14のいづれか1項に記載の方法。 - 【請求項16】 前記の標的核酸が遺伝子マーカーであ
り、そして前記のアウタープライマーペアーが存在して
いることが分っている配列とハイブリダイズする、請求
項1〜13のいづれか1項に記載の方法。 - 【請求項17】 前記のインナープライマーペアーが対
立遺伝子特異的配列にハイブリダイズする、請求項16
に記載の方法。 - 【請求項18】 前記の対立遺伝子特異的配列が特定の
疾患の指標であるか、又は組織もしくは血液の判定に有
用である、請求項17に記載の方法。 - 【請求項19】 PCRにおいて特異性の改善された方
法であって、以下の段階: (a)標的核酸配列を含む試料を、該標的を特異的に増
幅せしめるためのプライマーペアーを含む増幅反応混合
物中に混合せしめ; (b)前記のプライマーペアーについてのTm値よりも
1°〜10℃高い、該プライマーペアーのアニール及び
伸長のための温度にて前記の標的配列を増幅せしめ;そ
して (c)増幅標的配列を提供するため、段階(b)の増幅
反応混合物を、前記のプライマーペアーの効率的なアニ
ール及び伸長のための温度で増幅せしめること、を含ん
で成る方法。 - 【請求項20】 増幅が生じているかを調べることを更
に含んで成る、請求項19に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US71857691A | 1991-06-20 | 1991-06-20 | |
US718576 | 1991-06-20 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH05292968A true JPH05292968A (ja) | 1993-11-09 |
JPH0681600B2 JPH0681600B2 (ja) | 1994-10-19 |
Family
ID=24886600
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP4184740A Expired - Lifetime JPH0681600B2 (ja) | 1991-06-20 | 1992-06-19 | 核酸増幅のための改善された方法 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5314809A (ja) |
EP (1) | EP0519338B1 (ja) |
JP (1) | JPH0681600B2 (ja) |
CA (1) | CA2071594C (ja) |
DE (1) | DE69213112T2 (ja) |
DK (1) | DK0519338T3 (ja) |
ES (1) | ES2091976T3 (ja) |
GR (1) | GR3021832T3 (ja) |
IE (1) | IE922008A1 (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004508053A (ja) * | 2000-09-05 | 2004-03-18 | バイオチップ テクノロジーズ ゲーエムベーハー | 並行増幅によるdna配列の特異的決定方法 |
JP2004528029A (ja) * | 2001-03-02 | 2004-09-16 | ユニバーシティ オブ ピッツバーグ オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション | Pcr法 |
WO2007074894A1 (ja) * | 2005-12-28 | 2007-07-05 | School Corporation, Azabu Veterinary Medicine Educational Institution | 標的配列の特異的高感度増幅法 |
WO2010082640A1 (ja) | 2009-01-15 | 2010-07-22 | 北海道三井化学株式会社 | 耐熱性dnaポリメラーゼを含む酵素調製物およびその製造方法、並びに検出対象生物の検出方法 |
WO2019022132A1 (ja) * | 2017-07-26 | 2019-01-31 | 積水メディカル株式会社 | 変異遺伝子検出方法 |
Families Citing this family (148)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5856088A (en) * | 1989-07-11 | 1999-01-05 | Gen-Probe Incorporated | Detection of human immunodeficiency virus type 1 |
US6589734B1 (en) | 1989-07-11 | 2003-07-08 | Gen-Probe Incorporated | Detection of HIV |
EP0530009B1 (en) * | 1991-08-27 | 1999-01-13 | Zeneca Limited | Method of characterising genomic DNA |
US5853989A (en) * | 1991-08-27 | 1998-12-29 | Zeneca Limited | Method of characterisation of genomic DNA |
US5830642A (en) * | 1992-04-03 | 1998-11-03 | Amersham Life Science, Inc. | Electrophoresis of nucleic acid fragments |
US5565339A (en) * | 1992-10-08 | 1996-10-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Compositions and methods for inhibiting dimerization of primers during storage of polymerase chain reaction reagents |
AU686616B2 (en) * | 1993-03-26 | 1998-02-12 | Gen-Probe Incorporated | Detection of human immunodeficiency virus type 1 |
WO1995003430A1 (en) * | 1993-07-23 | 1995-02-02 | Gen-Probe Incorporated | Methods for enhancing nucleic acid amplification |
US5556773A (en) * | 1993-08-06 | 1996-09-17 | Yourno; Joseph | Method and apparatus for nested polymerase chain reaction (PCR) with single closed reaction tubes |
US6028190A (en) | 1994-02-01 | 2000-02-22 | The Regents Of The University Of California | Probes labeled with energy transfer coupled dyes |
US5869255A (en) | 1994-02-01 | 1999-02-09 | The Regents Of The University Of California | Probes labeled with energy transfer couples dyes exemplified with DNA fragment analysis |
EP1146049B1 (de) * | 1994-02-11 | 2005-08-17 | Qiagen GmbH | Verfahren zur Trennung von Doppelstrang/Einzelstrangnukleinsäurestrukturen |
US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
US6406855B1 (en) | 1994-02-17 | 2002-06-18 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for polypeptide engineering |
US6165793A (en) * | 1996-03-25 | 2000-12-26 | Maxygen, Inc. | Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination |
US6395547B1 (en) | 1994-02-17 | 2002-05-28 | Maxygen, Inc. | Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination |
US6335160B1 (en) | 1995-02-17 | 2002-01-01 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for polypeptide engineering |
US6995017B1 (en) | 1994-02-17 | 2006-02-07 | Maxygen, Inc. | Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination |
US6117679A (en) | 1994-02-17 | 2000-09-12 | Maxygen, Inc. | Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination |
US5559013A (en) * | 1994-06-22 | 1996-09-24 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Method of amplification using intermediate renaturation step |
EP0777749B1 (en) * | 1994-08-19 | 2002-10-30 | PE Corporation (NY) | Coupled amplification and ligation method |
US20030104361A1 (en) * | 1997-09-29 | 2003-06-05 | Susan Weininger | Method of detection of nucleic acids with a specific sequence composition |
US5871902A (en) * | 1994-12-09 | 1999-02-16 | The Gene Pool, Inc. | Sequence-specific detection of nucleic acid hybrids using a DNA-binding molecule or assembly capable of discriminating perfect hybrids from non-perfect hybrids |
JP4040087B2 (ja) * | 1995-05-05 | 2008-01-30 | アプレラ コーポレイション | Pcr増幅とハイブリダイゼーションプロービングアッセイとを組み合わせた方法およびそのための試薬 |
ATE215993T1 (de) * | 1995-05-19 | 2002-04-15 | Abbott Lab | Nachweis von nukleinsäuren mit breitem dynamikbereich unter verwendung von aggregat- primer-reihen |
US5882857A (en) * | 1995-06-07 | 1999-03-16 | Behringwerke Ag | Internal positive controls for nucleic acid amplification |
AT402203B (de) | 1995-06-13 | 1997-03-25 | Himmler Gottfried Dipl Ing Dr | Verfahren zur transkriptionsfreien amplifizierung von nucleinsäuren |
US6852487B1 (en) * | 1996-02-09 | 2005-02-08 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays |
US20020150921A1 (en) * | 1996-02-09 | 2002-10-17 | Francis Barany | Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays |
US6506602B1 (en) | 1996-03-25 | 2003-01-14 | Maxygen, Inc. | Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination |
CA2255774C (en) | 1996-05-29 | 2008-03-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions |
US20070009930A1 (en) * | 1996-12-18 | 2007-01-11 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for polypeptide engineering |
US6333179B1 (en) | 1997-06-20 | 2001-12-25 | Affymetrix, Inc. | Methods and compositions for multiplex amplification of nucleic acids |
US6207425B1 (en) * | 1997-09-11 | 2001-03-27 | City Of Hope | Bidirectional PCR amplification of specific alleles |
US6103468A (en) * | 1997-10-07 | 2000-08-15 | Labatt Brewing Company Limited | Rapid two-stage polymerase chain reaction method for detection of lactic acid bacteria in beer |
CA2313380C (en) * | 1997-12-08 | 2008-12-30 | California Institute Of Technology | Method for creating polynucleotide and polypeptide sequences |
WO1999034014A2 (en) * | 1997-12-23 | 1999-07-08 | Roche Diagnostics Gmbh | A method for the determination of a nucleic acid |
JP3784162B2 (ja) * | 1998-01-14 | 2006-06-07 | 株式会社日立製作所 | Dna断片分析法 |
US6365408B1 (en) | 1998-06-19 | 2002-04-02 | Maxygen, Inc. | Methods of evolving a polynucleotides by mutagenesis and recombination |
US7014994B1 (en) | 1999-03-19 | 2006-03-21 | Cornell Research Foundation,Inc. | Coupled polymerase chain reaction-restriction-endonuclease digestion-ligase detection reaction process |
US6506594B1 (en) * | 1999-03-19 | 2003-01-14 | Cornell Res Foundation Inc | Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays |
CA2364572A1 (en) * | 1999-04-12 | 2000-10-19 | Genentech, Inc. | Pcr-based cloning method |
US6232104B1 (en) * | 1999-08-17 | 2001-05-15 | Dade Behring Inc. | Detection of differences in nucleic acids by inhibition of spontaneous DNA branch migration |
US7585632B2 (en) * | 1999-10-29 | 2009-09-08 | Hologic, Inc. | Compositions and methods for the detection of a nucleic acid using a cleavage reaction |
US7582420B2 (en) | 2001-07-12 | 2009-09-01 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
US8076063B2 (en) * | 2000-02-07 | 2011-12-13 | Illumina, Inc. | Multiplexed methylation detection methods |
US7955794B2 (en) | 2000-09-21 | 2011-06-07 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
DE60136166D1 (de) * | 2000-02-07 | 2008-11-27 | Illumina Inc | Nukleinsäure-nachweisverfahren mit universellem priming |
AU2001293366A1 (en) * | 2000-04-14 | 2001-10-30 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method of designing addressable array for detection of nucleic acid sequence differences using ligase detection reaction |
US6887664B2 (en) * | 2000-06-06 | 2005-05-03 | Applera Corporation | Asynchronous primed PCR |
EP1176212A1 (en) * | 2000-07-24 | 2002-01-30 | Centre National de Genotype | Method for haplotyping by mass spectrometry |
EP1352089B1 (en) | 2000-08-25 | 2006-12-06 | Lovelace Respiratory Research Institute | Nested methylation-specific polymerase chain reaction cancer detection method |
ZA200303132B (en) * | 2000-10-20 | 2004-09-23 | Expression Diagnostics Inc | Leukocyte expression profiling. |
ES2183695B1 (es) * | 2000-10-31 | 2004-02-16 | Ivia | Metodo y mezcla de reaccion para la amplificacion enzimatica simultanea, coordinada y cooperativa de secuencias diana de acidos nucleicos. |
AU2007221860B2 (en) * | 2001-03-02 | 2012-03-15 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | PCR method |
ES2189631B1 (es) * | 2001-03-12 | 2005-01-01 | BIOTOOLS BIOTECHNOLOGICAL & MEDICAL LABORATORIES, S.A. | Metodo para la amplificacion de adn mediante semi-nested pcr en un solo paso y su empleo en la identificacion de especies de plasmodium. |
US7235358B2 (en) | 2001-06-08 | 2007-06-26 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
US6905827B2 (en) * | 2001-06-08 | 2005-06-14 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases |
US7026121B1 (en) | 2001-06-08 | 2006-04-11 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
US20050208491A1 (en) * | 2002-02-08 | 2005-09-22 | Rudolf Zirwes | Specific multiplex analysis of nucleic acids |
WO2003072054A2 (en) * | 2002-02-25 | 2003-09-04 | Cabot Corporation | Custom ligand design for biomolecular filtration and purification for bioseperation |
US7179639B2 (en) * | 2002-03-05 | 2007-02-20 | Raveendran Pottathil | Thermal strip thermocycler |
AU2003240795A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-12 | Invitrogen Corporation | Nested pcr employing degradable primers |
US20040259105A1 (en) * | 2002-10-03 | 2004-12-23 | Jian-Bing Fan | Multiplex nucleic acid analysis using archived or fixed samples |
WO2004040019A1 (ja) | 2002-10-29 | 2004-05-13 | Riken | 核酸の増幅法 |
CA2510166A1 (en) * | 2002-12-20 | 2004-09-30 | Caliper Life Sciences, Inc. | Single molecule amplification and detection of dna |
WO2004094986A2 (en) * | 2003-04-16 | 2004-11-04 | Handylab, Inc. | System and method for electrochemical detection of biological compounds |
US7892745B2 (en) * | 2003-04-24 | 2011-02-22 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
WO2005038039A2 (en) * | 2003-10-13 | 2005-04-28 | Genaco Biomedical Products, Inc. | Method for multiplex primer based amplification of nucleic acids |
US7824857B2 (en) * | 2003-12-02 | 2010-11-02 | Musc Foundation For Research Development | Methods and compositions for diagnosing epithelial cell cancer |
JP4395363B2 (ja) * | 2003-12-16 | 2010-01-06 | 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社 | 核酸検出方法 |
TW200525026A (en) | 2003-12-25 | 2005-08-01 | Riken | Method of amplifying nucleic acid and method of detecting mutated nucleic acid using the same |
US20060141487A1 (en) * | 2004-01-26 | 2006-06-29 | Applera Corporation | Methods, compositions, and kits for amplifying and sequencing polynucleotides |
WO2005084254A2 (en) * | 2004-02-27 | 2005-09-15 | Musc Foundation For Research Development | Enhanced detection of rna using a panel of truncated gene-specific primers for reverse transcription |
US7695941B2 (en) * | 2005-06-16 | 2010-04-13 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Multiplexed polymerase chain reaction for genetic sequence analysis |
JP2008510454A (ja) | 2004-07-09 | 2008-04-10 | ユニバーシティ オブ ピッツバーグ オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション | 肺癌および乳癌におけるマーカーの同定 |
WO2006029184A2 (en) * | 2004-09-08 | 2006-03-16 | Expression Diagnostics, Inc. | Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders |
JP2008515393A (ja) * | 2004-09-20 | 2008-05-15 | ユニバーシティ オブ ピッツバーグ オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション | 複数モードの多重化反応消去方法 |
US20060188910A1 (en) * | 2005-02-18 | 2006-08-24 | Applera Corporation | Compositions, methods, and kits for analyzing DNA methylation |
EP1902142B1 (en) | 2005-04-14 | 2010-01-06 | Applied Biosystems, LLC | 3'modified oligonucleotides containing pseudoisocytosine nucleobase derivatives and applications thereof as primers or probes |
EP1885889A4 (en) * | 2005-05-11 | 2010-01-20 | Expression Diagnostics Inc | METHOD FOR MONITORING THE OPERATING STATUS OF TRANSPLANTS OVER GENLISTS |
JP2008543288A (ja) * | 2005-06-09 | 2008-12-04 | エポック バイオサイエンシズ インコーポレーティッド | プライマーに基づく改善された増幅法 |
US11111544B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
CA2648580A1 (en) * | 2006-04-07 | 2008-05-02 | Xdx, Inc. | Steroid responsive nucleic acid expression and prediction of disease activity |
US8232091B2 (en) * | 2006-05-17 | 2012-07-31 | California Institute Of Technology | Thermal cycling system |
US8119352B2 (en) * | 2006-06-20 | 2012-02-21 | Cepheld | Multi-stage amplification reactions by control of sequence replication times |
WO2008021431A2 (en) * | 2006-08-14 | 2008-02-21 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders |
US20080311628A1 (en) * | 2006-10-03 | 2008-12-18 | Ghc Technologies, Inc. | Methods and compositions for rapid amplification and capture of nucleic acid sequences |
US8962293B2 (en) | 2006-10-18 | 2015-02-24 | Roche Molecular Systems, Inc. | DNA polymerases and related methods |
EP2102367A2 (en) * | 2006-11-09 | 2009-09-23 | XDX, Inc. | Methods for diagnosing and monitoring the status of systemic lupus erythematosus |
US9938641B2 (en) * | 2006-12-18 | 2018-04-10 | Fluidigm Corporation | Selection of aptamers based on geometry |
CN103952470B (zh) * | 2007-03-28 | 2017-11-10 | 信号诊断公司 | 高解析度分析核酸以检测序列变异的系统和方法 |
EP2171099A1 (en) * | 2007-06-20 | 2010-04-07 | Taag-Genetics SA | Nested multiplex amplification method for identification of multiple biological entities |
EP2195453A4 (en) * | 2007-09-20 | 2011-02-02 | Molecular Plant Breeding Nominees Ltd | METHOD FOR AMPLIFYING NUCLEIC ACID |
JP2009178159A (ja) * | 2007-11-05 | 2009-08-13 | Hitachi Plant Technologies Ltd | 核酸配列の検出方法及び核酸配列検出基板 |
WO2009098079A1 (en) | 2008-02-06 | 2009-08-13 | Ludwig-Maximilians-Universität München | Thermo-optical characterisation of nucleic acid molecules |
EP2163239A1 (de) | 2008-05-27 | 2010-03-17 | Qiagen GmbH | Produkte, die Biopartikel enthalten, Verfahren zu ihrer Herstellung |
WO2010001924A1 (ja) | 2008-07-02 | 2010-01-07 | ニプロ株式会社 | 結核菌におけるイソニアジド感受性を検出するための方法および試験片 |
BRPI0913659A2 (pt) | 2008-07-02 | 2015-12-15 | Nat Ct For Global Health & Medicine | método, tira de teste e kit para detectar da sensibilidade à isoniazida em mycobacterium tuberculosis. |
US9492797B2 (en) | 2008-09-23 | 2016-11-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System for detection of spaced droplets |
US11130128B2 (en) | 2008-09-23 | 2021-09-28 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Detection method for a target nucleic acid |
US9194861B2 (en) * | 2009-09-02 | 2015-11-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Method of mixing fluids by coalescence of multiple emulsions |
US10512910B2 (en) | 2008-09-23 | 2019-12-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet-based analysis method |
US8951939B2 (en) | 2011-07-12 | 2015-02-10 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital assays with multiplexed detection of two or more targets in the same optical channel |
US8633015B2 (en) * | 2008-09-23 | 2014-01-21 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Flow-based thermocycling system with thermoelectric cooler |
US9132394B2 (en) | 2008-09-23 | 2015-09-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System for detection of spaced droplets |
US8709762B2 (en) | 2010-03-02 | 2014-04-29 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System for hot-start amplification via a multiple emulsion |
US12090480B2 (en) | 2008-09-23 | 2024-09-17 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Partition-based method of analysis |
US9399215B2 (en) | 2012-04-13 | 2016-07-26 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Sample holder with a well having a wicking promoter |
US9417190B2 (en) | 2008-09-23 | 2016-08-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Calibrations and controls for droplet-based assays |
US9156010B2 (en) | 2008-09-23 | 2015-10-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet-based assay system |
US9764322B2 (en) | 2008-09-23 | 2017-09-19 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System for generating droplets with pressure monitoring |
US10669574B2 (en) | 2008-11-18 | 2020-06-02 | XCR Diagnostics, Inc. | DNA amplification technology |
WO2010104798A1 (en) * | 2009-03-08 | 2010-09-16 | Ibis Biosciences, Inc. | Bioagent detection methods |
CN202830041U (zh) * | 2009-04-03 | 2013-03-27 | Illumina公司 | 用于加热生物样本的设备 |
EP2438184B1 (en) * | 2009-06-02 | 2014-06-04 | Monoquant PTY LTD | A method of nucleic acid amplification |
EP2264184A1 (de) | 2009-06-22 | 2010-12-22 | Qiagen GmbH | Verfahren zur Amplifikation von DNA unter Verwendung von Tetraethylenglykol, Kit-of-parts dafür und dessen Verwendung |
CN201837588U (zh) * | 2009-09-09 | 2011-05-18 | 海利克斯公司 | 用于多个反应的光学系统 |
AU2010307991A1 (en) * | 2009-10-13 | 2012-05-10 | Syntezza Molecular Detection Israel Ltd. | Methods and compositions for amplifying target sequences from nucleic acid samples |
US8771951B2 (en) * | 2009-11-16 | 2014-07-08 | Genomics Usa, Inc. | Methods for PCR and HLA typing using raw blood |
US9416419B2 (en) | 2009-11-16 | 2016-08-16 | Michael E. Hogan | Methods for PCR and HLA typing using unpurified samples |
US8399198B2 (en) * | 2010-03-02 | 2013-03-19 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Assays with droplets transformed into capsules |
EP2550528B1 (en) | 2010-03-25 | 2019-09-11 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet generation for droplet-based assays |
JP2013524169A (ja) | 2010-03-25 | 2013-06-17 | クァンタライフ・インコーポレーテッド | 液滴によるアッセイ用の検出システム |
EP2556170A4 (en) | 2010-03-25 | 2014-01-01 | Quantalife Inc | TRAPPING TRANSPORT AND DETECTION SYSTEM |
CN102985560A (zh) * | 2010-03-30 | 2013-03-20 | 莫诺匡特私人有限公司 | 调控寡核苷酸功能性的方法 |
US20190323076A1 (en) * | 2010-05-18 | 2019-10-24 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
US20190010543A1 (en) | 2010-05-18 | 2019-01-10 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
US11939634B2 (en) | 2010-05-18 | 2024-03-26 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
US11408031B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-08-09 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal paternity testing |
CA3215088A1 (en) | 2010-11-01 | 2012-05-10 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System for forming emulsions |
JP6153874B2 (ja) | 2011-02-09 | 2017-06-28 | ナテラ, インコーポレイテッド | 非侵襲的出生前倍数性呼び出しのための方法 |
US12097495B2 (en) | 2011-02-18 | 2024-09-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for detecting genetic material |
AU2012231098B2 (en) | 2011-03-18 | 2016-09-29 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Multiplexed digital assays with combinatorial use of signals |
EP3789498A1 (en) | 2011-04-25 | 2021-03-10 | Bio-rad Laboratories, Inc. | Methods for nucleic acid analysis |
EP2737089B1 (en) | 2011-07-29 | 2017-09-06 | Bio-rad Laboratories, Inc. | Library characterization by digital assay |
EP3544015A1 (en) | 2012-02-03 | 2019-09-25 | California Institute of Technology | Signal encoding and decoding in multiplexed biochemical assays |
EP3901243A1 (en) | 2012-08-03 | 2021-10-27 | California Institute of Technology | Multiplexing and quantification in pcr with reduced hardware and requirements |
US20140100126A1 (en) | 2012-08-17 | 2014-04-10 | Natera, Inc. | Method for Non-Invasive Prenatal Testing Using Parental Mosaicism Data |
AU2014331828B2 (en) | 2013-10-09 | 2020-05-14 | Fluoresentric, Inc. | Multiplex probes |
US10221448B2 (en) | 2015-03-06 | 2019-03-05 | Pillar Biosciences Inc. | Selective amplification of overlapping amplicons |
WO2016144619A1 (en) | 2015-03-06 | 2016-09-15 | Pillar Biosciences Inc. | Selective amplification of overlapping amplicons |
EP3294906B1 (en) | 2015-05-11 | 2024-07-10 | Natera, Inc. | Methods for determining ploidy |
CN109642252A (zh) * | 2016-06-17 | 2019-04-16 | 加州理工学院 | 核酸反应及相关方法和组合物 |
US12084720B2 (en) | 2017-12-14 | 2024-09-10 | Natera, Inc. | Assessing graft suitability for transplantation |
JP2021520816A (ja) | 2018-04-14 | 2021-08-26 | ナテラ, インコーポレイテッド | 循環腫瘍dnaの個別化された検出を用いる癌検出およびモニタリングの方法 |
US20230040046A1 (en) * | 2020-01-10 | 2023-02-09 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Compositions, kits, and methods for performing rapid polymerase chain reactions |
US20230366038A1 (en) * | 2022-05-16 | 2023-11-16 | Bioo Scientific Corporation | Compositions and methods relating to loop mediated isothermal amplification (lamp) |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4358535A (en) | 1980-12-08 | 1982-11-09 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Specific DNA probes in diagnostic microbiology |
US4582789A (en) * | 1984-03-21 | 1986-04-15 | Cetus Corporation | Process for labeling nucleic acids using psoralen derivatives |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
CA1339653C (en) | 1986-02-25 | 1998-02-03 | Larry J. Johnson | Appartus and method for performing automated amplification of nucleic acid sequences and assays using heating and cooling steps |
CA1284931C (en) | 1986-03-13 | 1991-06-18 | Henry A. Erlich | Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids |
US4889818A (en) | 1986-08-22 | 1989-12-26 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
AU3539089A (en) | 1988-04-08 | 1989-11-03 | Salk Institute For Biological Studies, The | Ligase-based amplification method |
-
1992
- 1992-06-12 EP EP92109886A patent/EP0519338B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-12 DK DK92109886.9T patent/DK0519338T3/da active
- 1992-06-12 DE DE69213112T patent/DE69213112T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-12 ES ES92109886T patent/ES2091976T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-18 CA CA002071594A patent/CA2071594C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-06-19 JP JP4184740A patent/JPH0681600B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-01 IE IE200892A patent/IE922008A1/en not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-03-10 US US08/033,072 patent/US5314809A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-11-28 GR GR960403224T patent/GR3021832T3/el unknown
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004508053A (ja) * | 2000-09-05 | 2004-03-18 | バイオチップ テクノロジーズ ゲーエムベーハー | 並行増幅によるdna配列の特異的決定方法 |
JP2004528029A (ja) * | 2001-03-02 | 2004-09-16 | ユニバーシティ オブ ピッツバーグ オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション | Pcr法 |
WO2007074894A1 (ja) * | 2005-12-28 | 2007-07-05 | School Corporation, Azabu Veterinary Medicine Educational Institution | 標的配列の特異的高感度増幅法 |
JP5025489B2 (ja) * | 2005-12-28 | 2012-09-12 | 学校法人麻布獣医学園 | 標的配列の特異的高感度増幅法 |
WO2010082640A1 (ja) | 2009-01-15 | 2010-07-22 | 北海道三井化学株式会社 | 耐熱性dnaポリメラーゼを含む酵素調製物およびその製造方法、並びに検出対象生物の検出方法 |
US9243272B2 (en) | 2009-01-15 | 2016-01-26 | Hokkaido Mitsui Chemicals Inc. | Enzyme preparation containing thermostable DNA polymerase, method for producing same, and method for detecting subject organism to be detected |
US10501813B2 (en) | 2009-01-15 | 2019-12-10 | Hokkaido Mitsui Chemicals Inc. | Enzyme preparation containing thermostable DNA polymerase, method for producing same, and method for detecting subject organism to be detected |
WO2019022132A1 (ja) * | 2017-07-26 | 2019-01-31 | 積水メディカル株式会社 | 変異遺伝子検出方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GR3021832T3 (en) | 1997-02-28 |
CA2071594C (en) | 2003-06-17 |
EP0519338B1 (en) | 1996-08-28 |
EP0519338A1 (en) | 1992-12-23 |
US5314809A (en) | 1994-05-24 |
DE69213112D1 (de) | 1996-10-02 |
IE922008A1 (en) | 1992-12-30 |
DE69213112T2 (de) | 1997-04-03 |
JPH0681600B2 (ja) | 1994-10-19 |
DK0519338T3 (da) | 1996-10-28 |
CA2071594A1 (en) | 1992-12-21 |
ES2091976T3 (es) | 1996-11-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPH05292968A (ja) | 核酸増幅のための改善された方法 | |
CA1340807C (en) | Nucleic acid amplification process | |
EP1453979B1 (en) | Multiplex pcr | |
JP2703183B2 (ja) | 複数標的の同時増幅 | |
US7914986B2 (en) | Detection of amplicon contamination during PCR exhibiting two different annealing temperatures | |
JP2846018B2 (ja) | 核酸配列の増幅および検出 | |
EP1712618B1 (en) | Method of amplifying nucleic acid and method of detecting mutated nucleic acid using the same | |
JP5945271B2 (ja) | ニッキング酵素を用いたヘリカーゼ依存性等温増幅 | |
JP4718493B2 (ja) | 核酸増幅中のプライマー凝集体形成を減少させるためのdUTPに基づく組成物 | |
JP5938348B2 (ja) | 反応特異性の増加のための非標準塩基を含む増幅プライマー | |
JP2000505312A (ja) | 標的核酸配列増幅 | |
JPH0358785A (ja) | 核酸増幅反応の汚染を制御する方法 | |
JPH05184397A (ja) | 核酸増幅および検出のための均質的方法 | |
US5569582A (en) | Rapid amplification and detection of nucleic acids | |
WO2010001969A1 (ja) | 標的核酸配列の増幅方法、それを用いた変異の検出方法、および、それに用いる試薬 | |
EP0632134B1 (en) | Reagents and methods for coupled high temperature reverse transcription and polymerase chain reaction | |
JP3909010B2 (ja) | 高度ダイナミックレンジを有する定量的多重pcr | |
RU2729983C2 (ru) | Способ амплификации днк на основе внедрения в цепь | |
EP0585660B1 (en) | Exonuclease decontamination method | |
KR102106040B1 (ko) | 자가혈당측정기를 활용한 표적핵산 검출방법 | |
WO2016019455A1 (en) | Site-specific endonuclease guided rolling circle amplification | |
US9523120B2 (en) | Method of amplifying a nucleic acid | |
JP2928992B2 (ja) | Dna及び/又はrnaを特異的に増幅し検出する方法 | |
Sorscher | DNA amplification techniques: An overview | |
Saunders et al. | DNA amplification: general concepts and methods |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081019 Year of fee payment: 14 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081019 Year of fee payment: 14 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091019 Year of fee payment: 15 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091019 Year of fee payment: 15 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101019 Year of fee payment: 16 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101019 Year of fee payment: 16 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111019 Year of fee payment: 17 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111019 Year of fee payment: 17 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121019 Year of fee payment: 18 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121019 Year of fee payment: 18 |