JP2021520816A - 循環腫瘍ｄｎａの個別化された検出を用いる癌検出およびモニタリングの方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、乳癌、膀胱癌または大腸癌における単一ヌクレオチドバリアントを検出するための方法を提供する。さらなる方法および組成物、例えば、核酸のクローン集団を含む反応混合物および固体支持体が提供される。例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌の早期再発または転移をモニタリングし、検出する方法であって、乳癌、膀胱癌または大腸癌を治療された患者からの血液または尿のサンプルまたはそのフラクションから単離された核酸に対して多重増幅反応を行うことによってアンプリコンのセットを作成することであって、アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンが、乳癌、膀胱癌または大腸癌と関連付けられた患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットのうちの少なくとも１つの単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座に広がっている、作成することと、患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座を含むアンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定することであって、１個以上の患者固有の単一ヌクレオチドバリアントの検出は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の早期再発または転移の指標である、決定することと、を含む、方法が本明細書で提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月１４日に出願された米国仮出願第６２／６５７，７２７号、２０１８年５月９日に出願された米国仮出願第６２／６６９，３３０号、２０１８年７月３日に出願された米国仮出願第６２／６９３，８４３号、２０１８年８月６日に出願された米国仮出願第６２／７１５，１４３号、２０１８年１０月１６日に出願された米国仮出願第６２／７４６，２１０号、２０１８年１２月１１日に出願された米国仮出願第６２／７７７，９７３号および２０１９年２月１２日に出願された米国仮出願第６２／８０４，５６６号に対する優先権を主張する。上に引用されるこれらの出願はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

癌の早期再発または転移の検出は、従来から、画像診断および組織生検に依存してきた。腫瘍組織の生検は侵襲的であり、転移または手術合併症に潜在的に寄与するリスクを伴うが、画像診断に基づく検出は、早期における再発または転移を検出するのに十分に感受性ではない。癌の再発または転移を検出するためには、より良く、より少ない侵襲性の方法が必要である。

本明細書に記載される本発明の一態様は、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）の早期再発または転移をモニタリングし、検出する方法であって、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）について治療された患者からの血液または尿のサンプルまたはそのフラクションから単離された核酸に対して多重増幅反応を行うことによってアンプリコンのセットを作成することであって、アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンが、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）と関連付けられた患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットのうちの少なくとも１つの単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座に広がっている、作成することと、患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座を含むアンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定することであって、１個以上（または２個以上、または３個以上、または４個以上、または５個以上、または６個以上、または７個以上、または８個以上、または９個以上、または１０個以上）の患者固有の単一ヌクレオチドバリアントの検出は、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）の早期再発または転移の指標である、決定することと、を含む方法に関する。

乳癌、膀胱癌および大腸癌に加え、本明細書に記載される方法は、他の種類の癌、例えば、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌腫、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌腫、脳幹グリオーマ、脳腫瘍（脳幹グリオーマ、中枢神経系非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽細胞腫、上衣腫、髄芽腫、髄様上皮腫、中分化型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉腫瘍および松果体芽細胞腫を含む）、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、原発部位不明癌、カルチノイド腫瘍、原発部位不明癌腫、中枢神経系非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、子宮頸癌、小児癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、膵臓内分泌島細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣芽細胞腫、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、胆嚢癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ（ｓｔｏｍａｃｈ） ｃａｎｃｅｒ）、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質細胞腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛腫瘍、グリオーマ、有毛細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球増加症、喉頭癌、口唇癌、肝臓癌、悪性線維性組織球腫骨癌、髄芽腫、髄様上皮腫、黒色腫、メルケル細胞癌腫、メルケル細胞皮膚癌腫、中皮腫、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、口癌（ｍｏｕｔｈ ｃａｎｃｅｒ）、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性新生物、鼻腔癌、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、口癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫、他の脳脊髄腫瘍、卵巣癌、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、乳頭腫症、副鼻腔癌、副甲状腺癌、骨盤内癌、陰茎癌、咽頭癌、中分化型松果体実質腫瘍、松果体芽細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性肝細胞肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、腎細胞（腎臓）癌、腎細胞癌、気道癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、セザリー症候群、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌腫、頸部扁平上皮癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ（ｇａｓｔｒｉｃ） ｃａｎｃｅｒ）、テント上原始神経外胚葉腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌腫、胸腺腫、甲状腺癌、移行上皮癌、腎盂および尿管の移行上皮癌、絨毛性腫瘍、尿管癌、尿路癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症またはウィルムス腫瘍の早期再発または転移をモニタリングし、検出するためにも使用することができる。

いくつかの実施形態において、血液または尿のサンプルまたはそのフラクションについてのアンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定する前に、核酸が患者の腫瘍から単離され、体細胞変異が、患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットについて、腫瘍において特定され、単一ヌクレオチドバリアント。

いくつかの実施形態において、本方法は、患者から血液または尿サンプルを長期的に集め、配列決定することを含む。

いくつかの実施形態において、少なくとも２個または少なくとも５個のＳＮＶが検出され、少なくとも２個または少なくとも５個のＳＮＶの存在が、乳癌、膀胱癌または大腸癌の早期再発または転移の指標である。

いくつかの実施形態において、乳癌、膀胱癌または大腸癌は、ステージ１またはステージ２の乳癌、膀胱癌または大腸癌である。いくつかの実施形態において、乳癌、膀胱癌または大腸癌は、ステージ３またはステージ４の乳癌、膀胱癌または大腸癌である。

いくつかの実施形態において、個体は、血液または尿サンプルの単離前に手術で治療されている。

いくつかの実施形態において、個体は、血液または尿サンプルの単離前に化学療法で治療されている。

いくつかの実施形態において、個体は、血液または尿サンプルの単離前にアジュバントまたはネオアジュバントで治療されている。

いくつかの実施形態において、個体は、血液または尿サンプルの単離前に放射線療法で治療されている。

いくつかの実施形態において、本方法は、個体に化合物を投与することをさらに含み、この化合物は、決定された単一ヌクレオチドバリアントのうちの１つ以上を有する乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療に特異的に有効であることが知られている。

いくつかの実施形態において、本方法は、配列決定からの単一ヌクレオチドバリアントのそれぞれについてバリアント対立遺伝子頻度を決定することをさらに含む。

いくつかの実施形態において、乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療計画は、バリアント対立遺伝子頻度の決定に基づいて特定される。

いくつかの実施形態において、本方法は、個体に化合物を投与することをさらに含み、この化合物は、単一ヌクレオチドバリアントの１つが、決定されたその他の単一ヌクレオチドバリアントのうちの少なくとも半分よりも大きな可変対立遺伝子頻度を有する乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療に特異的に有効であることが知られている。

いくつかの実施形態において、配列は、複数の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座の高スループットＤＮＡ配列決定によって決定される。

いくつかの実施形態において、本方法は、一連のアンプリコンの複数のコピーの配列に基づき、それぞれのＳＮＶ遺伝子座についてバリアント対立遺伝子頻度を決定することによって、乳癌、膀胱癌または大腸癌におけるクローン単一ヌクレオチドバリアントを検出することをさらに含み、複数の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座の他の単一ヌクレオチドバリアントと比較して相対的に高い対立遺伝子頻度は、乳癌、膀胱癌または大腸癌におけるクローン単一ヌクレオチドバリアントの指標である。

いくつかの実施形態において、本方法は、１つ以上のクローン単一ヌクレオチドバリアントを標的とするが、他の単一ヌクレオチドバリアントを標的としない個体に化合物を投与することをさらに含む。

いくつかの実施形態において、１．０％を超えるバリアント対立遺伝子頻度は、クローン単一ヌクレオチドバリアントの指標である。

いくつかの実施形態において、本方法は、ポリメラーゼ、ヌクレオチド三リン酸、サンプルから作成された核酸ライブラリからの核酸フラグメントと、単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座の１５０塩基対内でそれぞれ結合するプライマーのセットまたは単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座を含む１６０塩基対以下の領域にそれぞれ広がるプライマー対のセットとを組み合わせることによって増幅反応混合物を形成することと、増幅反応混合物を増幅条件に供して、アンプリコンのセットを作成することと、をさらに含む。

いくつかの実施形態において、単一ヌクレオチドバリアントがサンプル中に存在するかどうかを決定することは、少なくとも一部には遺伝子座についてのリード深度に基づいて、単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットのそれぞれで、各対立遺伝子決定についての信頼値を特定することを含む。

いくつかの実施形態において、単一ヌクレオチドバリアントの存在についての信頼値が９０％より大きい場合、単一ヌクレオチドバリアントコールが作られる。

いくつかの実施形態において、単一ヌクレオチドバリアントの存在についての信頼値が９５％より大きい場合、単一ヌクレオチドバリアントコールが作られる。

いくつかの実施形態において、単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットは、乳癌、膀胱癌または大腸癌についてＴＣＧＡおよびＣＯＳＭＩＣデータセットにおいて特定された単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座の全てを含む。

いくつかの実施形態において、単一ヌクレオチド分散部位のセットは、乳癌、膀胱癌または大腸癌についてＴＣＧＡおよびＣＯＳＭＩＣデータセットにおいて特定された単一ヌクレオチド分散部位の全てを含む。

いくつかの実施形態において、本方法は、少なくとも１，０００の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットについてのリードの深度で行われる。

いくつかの実施形態において、単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットは、乳癌、膀胱癌または大腸癌と関連することが知られている２５〜１０００個の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座を含む。

いくつかの実施形態において、サイクルあたりの効率およびエラー率は、単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座の多重増幅反応のそれぞれの増幅反応について決定され、効率およびエラー率を使用して、単一バリアント遺伝子座のセットでの単一ヌクレオチドバリアントがサンプル中に存在するかどうかを決定する。

いくつかの実施形態において、増幅反応はＰＣＲ反応であり、アニーリング温度は、プライマーのセットのプライマーの少なくとも５０％の融点より１〜１５℃高い。

いくつかの実施形態において、増幅反応はＰＣＲ反応であり、ＰＣＲ反応中のアニーリング工程の長さは、１５〜１２０分である。

いくつかの実施形態において、増幅反応はＰＣＲ反応であり、ＰＣＲ反応中のアニーリング工程の長さは、１５〜１２０分である。

いくつかの実施形態において、増幅反応におけるプライマー濃度は、１〜１０ｎＭである。

いくつかの実施形態において、プライマーのセット中のプライマーは、プライマー二量体形成を最小限にするように設計される。

いくつかの実施形態において、増幅反応はＰＣＲ反応であり、アニーリング温度は、プライマーのセットのプライマーの少なくとも５０％の融点より１〜１５℃高く、ＰＣＲ反応中のアニーリング工程の長さは、１５〜１２０分であり、増幅反応におけるプライマー濃度は、１〜１０ｎＭであり、プライマーのセット中のプライマーは、プライマー二量体形成を最小限にするように設計される。

いくつかの実施形態において、多重増幅反応は、制限プライマー条件下で行われる。

本明細書に記載される本発明の別の態様は、ユニバーサルアダプターを含む循環腫瘍核酸フラグメントを含む組成物であって、循環腫瘍核酸は、乳癌、膀胱癌または大腸癌に由来するものであった、組成物に関する。

いくつかの実施形態において、循環腫瘍核酸は、乳癌、膀胱癌または大腸癌を有する個体の血液または尿のサンプルまたはそのフラグメントに由来するものであった。

本明細書に記載される本発明の別の態様は、複数の核酸のクローン集合を含む固体支持体を含む組成物であって、クローン集合が、循環遊離核酸のサンプルから作成されたアンプリコンを含み、循環腫瘍核酸は、乳癌、膀胱癌または大腸癌に由来するものであった、組成物に関する。

いくつかの実施形態において、循環遊離核酸は、乳癌、膀胱癌または大腸癌を有する個体の血液または尿のサンプルまたはそのフラグメントに由来するものであった。

いくつかの実施形態において、異なるクローン集合中の核酸フラグメントが、同じユニバーサルアダプターを含む。

いくつかの実施形態において、核酸のクローン集合は、２名以上の個体からのサンプルのセットからの核酸フラグメントに由来する。

いくつかの実施形態において、核酸フラグメントは、サンプルのセットにおけるサンプルに対応する一連の分子バーコードの１つを含む。

本明細書に記載される本発明のさらなる態様は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の早期再発または転移をモニタリングし、検出する方法であって、乳癌、膀胱癌または大腸癌と診断された患者の腫瘍サンプル中で特定された体細胞変異に基づいて、少なくとも８個または１６個の患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットを選択することと、患者が手術、ファーストライン化学療法および／またはアジュバント療法で治療された後に、患者から１つ以上の血液または尿サンプルを長期的に集めることと、それぞれの血液もしくは尿サンプルまたはそのフラクションから単離された核酸に対して多重増幅反応を行うことによってアンプリコンのセットを作成することであって、アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンが、乳癌、膀胱癌または大腸癌と関連付けられた患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットのうちの少なくとも１つの単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座に広がっている、作成することと、患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座を含むアンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定することであって、血液または尿サンプルからの１個以上（または２個以上、または３個以上、または４個以上、または５個以上、または６個以上、または７個以上、または８個以上、または９個以上、または１０個以上）の患者固有の単一ヌクレオチドバリアントの検出は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の早期再発または転移の指標である、決定することと、を含む方法に関する。

本明細書に記載の本発明のさらなる態様は、乳癌、膀胱癌または大腸癌を治療するための方法であって、乳癌、膀胱癌または大腸癌と診断された患者を手術、ファーストライン化学療法および／またはアジュバント療法で治療することと、患者から１つ以上の血液または尿サンプルを長期的に集めることと、それぞれの血液もしくは尿サンプルまたはそのフラクションから単離された核酸に対して多重増幅反応を行うことによってアンプリコンのセットを作成することであって、アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンが、乳癌、膀胱癌または大腸癌と関連付けられており、患者の腫瘍サンプルにおいて特定された体細胞変異に基づいて選択された、少なくとも８個または１６個の患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットのうちの少なくとも１つの単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座に広がっている、作成することと、患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座を含むアンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定することであって、血液または尿サンプルからの１個以上（または２個以上、または３個以上、または４個以上、または５個以上、または６個以上、または７個以上、または８個以上、または９個以上、または１０個以上）の患者固有の単一ヌクレオチドバリアントの検出は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の早期再発または転移の指標である、決定することと、個体に、血液または尿サンプルから検出された単一ヌクレオチドバリアントのうちの１つ以上を有する乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療に有効であることが知られている化合物を投与することと、を含む方法に関する。

本明細書に記載される本発明のさらなる態様は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療に対する応答をモニタリングするか、または予測する方法であって、乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療を受けている患者から１つ以上の血液または尿サンプルを長期的に集めることと、それぞれの血液もしくは尿サンプルまたはそのフラクションから単離された核酸に対して多重増幅反応を行うことによってアンプリコンのセットを作成することであって、アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンが、乳癌、膀胱癌または大腸癌と関連付けられており、患者の腫瘍サンプルにおいて特定された体細胞変異に基づいて選択された、少なくとも８個または１６個の患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットのうちの少なくとも１つの単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座に広がっている、作成することと、患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座を含むアンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定することであって、血液または尿サンプルからの１個以上（または２個以上、または３個以上、または４個以上、または５個以上、または６個以上、または７個以上、または８個以上、または９個以上、または１０個以上）の患者固有の単一ヌクレオチドバリアントの検出は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療に対する応答不良の指標である、決定することと、を含む方法に関する。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、療法前および／またはネオアジュバント療法中（例えば、サイクル１、サイクル２、サイクル３、サイクル４の後など）の乳癌患者の血漿中のｃｔＤＮＡを検出することを含む。いくつかの実施形態において、治療計画は、ｃｔＤＮＡ濃度決定（例えば、存在／不存在）およびネオアジュバント療法中の減少速度に基づいて定義される。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、癌患者ごとのｃｔＤＮＡの存在およびレベルを評価すること（すなわち、腫瘍内に実際に存在する変異を標的とすること）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、患者の腫瘍（複数可）内に実際に存在する２個以上、４個以上、１０個以上、１６個以上、３２個以上、５０個以上、６４個以上または１００個以上の変異を検出することを含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、（例えば、ネオアジュバント療法および手術の後に）転移性再発を有し得る患者の少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または約１００％が、ベースライン時に検出可能なｃｔＤＮＡを有する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、（例えば、ネオアジュバント療法および手術の後に）転移性再発を有し得る患者の少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または約１００％が、ネオアジュバント療法のサイクル１の後に検出可能なｃｔＤＮＡを有する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、（例えば、ネオアジュバント療法および手術の後に）転移性再発を有し得る患者の少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または約１００％が、ネオアジュバント療法のサイクル２の後に検出可能なｃｔＤＮＡを有する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、（例えば、ネオアジュバント療法および手術の後に）転移性再発を有し得る患者の少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または約１００％が、ネオアジュバント療法の後であり、手術の前に、検出可能なｃｔＤＮＡを有する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、（例えば、ネオアジュバント療法および手術の後に）転移性再発を有し得る患者の少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または約１００％が、手術後に検出可能なｃｔＤＮＡを有する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、（例えば、手術の後に）検出可能なｃｔＤＮＡを有する患者の少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または約１００％が、（例えば、ネオアジュバント療法および手術の後に）さらなる治療再発なく、転移性を有し得る。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ベースラインとサイクル１またはサイクル２などとの間でｃｔＤＮＡが増加しつつある患者の少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または約１００％が、さらなる治療が行われない場合には、手術後に転移性再発を有し得る。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、特定のサブタイプの乳癌を含む、特定のサブタイプの癌の発生、再発または転移を検出することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＨＲ＋／ＨＥＲ２−乳癌（例えば、ホルモン受容体陽性ＥＲα＋および／またはＰＲ＋）を含むＨＲ＋／ＨＥＲ２−腫瘍の発生、再発または転移を検出することを含む。ＨＲ＋腫瘍は、典型的には、攻撃性が低く、５年生存率が９０％を超える良好な予後を有する。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＨＥＲ２＋乳癌（ヒト上皮成長因子受容体２陽性）を含むＨＥＲ２＋腫瘍の発生、再発または転移を検出することを含む。ＨＥＲ２＋腫瘍は、一般的に、ＨＲ＋／ＨＥＲ２−乳癌よりも浸潤性が高く、予後が悪く、再発して転移する可能性が高い。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＨＲ−／ＨＥＲ２−乳癌（ＴＮＢＣ、すなわちトリプルネガティブＢＣ）を含むＨＲ−／ＨＥＲ２−乳癌の発生、再発または転移を検出することを含む。トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）は、ＥＲα、ＰＲまたはＨＥＲ２を発現しない。これらの腫瘍は、最も攻撃性があり、全ての乳癌サブタイプの中で最悪の予後を有する傾向がある。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、癌の早期再発または転移を有する患者の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％において、患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出することが可能である。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＨＥＲ２＋乳癌の早期再発または転移を有する患者の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％において、患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出することが可能である。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、トリプルネガティブ乳癌の早期再発または転移を有する患者の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％において、患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出することが可能である。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＨＲ＋／ＨＥＲ２−乳癌の早期再発または転移を有する患者の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％において、患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出することが可能である。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、画像診断によって検出可能な癌の臨床的再発または転移の少なくとも１００日前、少なくとも１５０日前、少なくとも２００日前、少なくとも２５０日前、または少なくとも３００日前に、および／またはＣＡ１５−３レベルの上昇の少なくとも１００日前、少なくとも１５０日前、少なくとも２００日前、少なくとも２５０日前、または少なくとも３００日前に、癌の早期再発または転移を有する患者において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出することが可能である。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、画像診断によって検出可能なＨＥＲ２＋乳癌の臨床的再発または転移の少なくとも１００日前、少なくとも１５０日前、少なくとも２００日前、少なくとも２５０日前、または少なくとも３００日前に、および／またはＣＡ１５−３レベルの上昇の少なくとも１００日前、少なくとも１５０日前、少なくとも２００日前、少なくとも２５０日前、または少なくとも３００日前に、ＨＥＲ２＋乳癌の早期再発または転移を有する患者において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出することが可能である。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、画像診断によって検出可能なトリプルネガティブ乳癌の臨床的再発または転移の少なくとも１００日前、少なくとも１５０日前、少なくとも２００日前、少なくとも２５０日前、または少なくとも３００日前に、および／またはＣＡ１５−３レベルの上昇の少なくとも１００日前、少なくとも１５０日前、少なくとも２００日前、少なくとも２５０日前、または少なくとも３００日前に、トリプルネガティブ乳癌の早期再発または転移を有する患者において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出することが可能である。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、画像診断によって検出可能なＨＲ＋／ＨＥＲ２−乳癌の臨床的再発または転移の少なくとも１００日前、少なくとも１５０日前、少なくとも２００日前、少なくとも２５０日前、または少なくとも３００日前に、および／またはＣＡ１５−３レベルの上昇の少なくとも１００日前、少なくとも１５０日前、少なくとも２００日前、少なくとも２５０日前、または少なくとも３００日前に、ＨＲ＋／ＨＥＲ２−乳癌の早期再発または転移を有する患者において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出することが可能である。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、癌の早期再発または転移がない患者の少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出しない。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＨＥＲ２＋乳癌の早期再発または転移がない患者の少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出しない。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、トリプルネガティブ乳癌の早期再発または転移がない患者の少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出しない。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＨＲ＋／ＨＥＲ２−乳癌の早期再発または転移がない患者の少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出しない。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、２個以上の患者固有の単一ヌクレオチドバリアントが、所定の信頼閾値（例えば、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８または０．９９）を超えて検出されるときに、癌の早期再発または転移を検出することにおいて少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の特異性を有する。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、２個以上の患者固有の単一ヌクレオチドバリアントが、所定の信頼閾値（例えば、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８または０．９９）を超えて検出されるときに、ＨＥＲ２＋乳癌の早期再発または転移を検出することにおいて少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の特異性を有する。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、２個以上の患者固有の単一ヌクレオチドバリアントが、所定の信頼閾値（例えば、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８または０．９９）を超えて検出されるときに、トリプルネガティブ乳癌の早期再発または転移を検出することにおいて少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の特異性を有する。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、２個以上の患者固有の単一ヌクレオチドバリアントが、所定の信頼閾値（例えば、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８または０．９９）を超えて検出されるときに、ＨＲ＋／ＨＥＲ２−乳癌の早期再発または転移を検出することにおいて少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の特異性を有する。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、筋層浸潤性膀胱癌（ＭＩＢＣ）の早期再発または転移を有する患者の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出する。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、画像診断によって検出可能なＭＩＢＣの臨床的再発または転移の少なくとも１００日前、少なくとも１５０日前、少なくとも２００日前、または少なくとも２５０日前に、癌の早期再発または転移を有する患者において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出する。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＭＩＢＣの早期再発または転移がない患者の少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出しない。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、２個以上の患者固有の単一ヌクレオチドバリアントが、所定の信頼閾値（例えば、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８または０．９９）を超えて検出されるときに、ＭＩＢＣの早期再発または転移を検出することにおいて少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の特異性を有する。

単一ヌクレオチドバリアントに加えて、またはこれに代えて、本明細書に記載される方法は、他のゲノムバリアント（例えば、インデル、多重ヌクレオチドバリアントおよび／または遺伝子融合）の検出にも基づいていてもよい。

したがって、本明細書に記載される本発明のさらなる態様は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の早期再発または転移をモニタリングし、検出する方法であって、乳癌、膀胱癌または大腸癌と診断された患者の腫瘍サンプル中で特定された体細胞変異に基づいて、複数のゲノムバリアント遺伝子座（例えば、ＳＮＶ、インデル、多重ヌクレオチドバリアントおよび遺伝子融合）を選択することと、患者が手術、ファーストライン化学療法および／またはアジュバント療法で治療された後に、患者から１つ以上の血液または尿サンプルを長期的に集めることと、それぞれの血液もしくは尿サンプルまたはそのフラクションから単離された核酸に対して多重増幅反応を行うことによってアンプリコンのセットを作成することであって、アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンが、乳癌、膀胱癌または大腸癌と関連付けられた患者固有のゲノムバリアント遺伝子座のセットのうちの少なくとも１つのゲノムバリアント遺伝子座に広がっている、作成することと、患者固有のゲノムバリアント遺伝子座を含むアンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定することであって、血液または尿サンプルからの１個以上（または２個以上、または３個以上、または４個以上、または５個以上、または６個以上、または７個以上、または８個以上、または９個以上、または１０個以上）の患者固有のゲノムバリアントの検出は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の早期再発または転移の指標である、決定することと、を含む方法に関する。

本明細書に記載の本発明のさらなる態様は、乳癌、膀胱癌または大腸癌を治療するための方法であって、乳癌、膀胱癌または大腸癌と診断された患者を手術、ファーストライン化学療法および／またはアジュバント療法で治療することと、患者から１つ以上の血液または尿サンプルを長期的に集めることと、それぞれの血液もしくは尿サンプルまたはそのフラクションから単離された核酸に対して多重増幅反応を行うことによってアンプリコンのセットを作成することであって、アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンが、乳癌、膀胱癌または大腸癌と関連付けられており、患者の腫瘍サンプルにおいて特定された体細胞変異に基づいて選択された、少なくとも８個または１６個の患者固有のゲノムバリアント遺伝子座のセットのうちの少なくとも１つのゲノムバリアント遺伝子座（例えば、ＳＮＶ、インデル、多重ヌクレオチドバリアントおよび遺伝子融合）に広がっている、作成することと、患者固有のゲノムバリアント遺伝子座を含むアンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定することであって、血液または尿サンプルからの１個以上（または２個以上、または３個以上、または４個以上、または５個以上、または６個以上、または７個以上、または８個以上、または９個以上、または１０個以上）の患者固有のゲノムバリアントの検出は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の早期再発または転移の指標である、決定することと、個体に、血液または尿サンプルから検出されたゲノムバリアントのうちの１つ以上を有する乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療に有効であることが知られている化合物を投与することと、を含む方法に関する。

本明細書に記載される本発明のさらなる態様は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療に対する応答をモニタリングするか、または予測する方法であって、乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療を受けている患者から１つ以上の血液または尿サンプルを長期的に集めることと、それぞれの血液もしくは尿サンプルまたはそのフラクションから単離された核酸に対して多重増幅反応を行うことによってアンプリコンのセットを作成することであって、アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンが、乳癌、膀胱癌または大腸癌と関連付けられており、患者の腫瘍サンプルにおいて特定された体細胞変異に基づいて選択された、少なくとも８個または１６個の患者固有のゲノムバリアント遺伝子座のセットのうちの少なくとも１つのゲノムバリアント遺伝子座（例えば、ＳＮＶ、インデル、多重ヌクレオチドバリアントおよび遺伝子融合）に広がっている、作成することと、患者固有のゲノムバリアント遺伝子座を含むアンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定することであって、血液または尿サンプルからの１個以上（または２個以上、または３個以上、または４個以上、または５個以上、または６個以上、または７個以上、または８個以上、または９個以上、または１０個以上）の患者固有のゲノムバリアントの検出は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療に対する応答不良の指標である、決定することと、を含む方法に関する。

患者固有のゲノムバリアントに加えて、またはこれに代えて、本明細書に記載される方法は、多くの癌患者において再発している、再発癌に関連する変異（例えば、ホットスポット癌変異、薬物耐性マーカー、癌パネル変異）の検出にも基づいていてもよい。

したがって、本明細書に記載される本発明のさらなる態様は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の早期再発または転移をモニタリングし、検出する方法であって、複数の再発癌に関連する変異を選択することと、患者が手術、ファーストライン化学療法および／またはアジュバント療法で治療された後に、患者から１つ以上の血液または尿サンプルを長期的に集めることと、それぞれの血液もしくは尿サンプルまたはそのフラクションから単離された核酸に対して多重増幅反応を行うことによってアンプリコンのセットを作成することであって、アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンが、乳癌、膀胱癌または大腸癌と関連付けられた再発変異のセットのうちの少なくとも１つに広がっている、作成することと、再発癌に関連する変異を含むアンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定することであって、血液または尿サンプルからの１個以上（または２個以上、または３個以上、または４個以上、または５個以上、または６個以上、または７個以上、または８個以上、または９個以上、または１０個以上）の再発癌に関連する変異の検出は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の早期再発または転移の指標である、決定することと、を含む方法に関する。

本明細書に記載の本発明のさらなる態様は、乳癌、膀胱癌または大腸癌を治療するための方法であって、乳癌、膀胱癌または大腸癌と診断された患者を手術、ファーストライン化学療法および／またはアジュバント療法で治療することと、患者から１つ以上の血液または尿サンプルを長期的に集めることと、それぞれの血液もしくは尿サンプルまたはそのフラクションから単離された核酸に対して多重増幅反応を行うことによってアンプリコンのセットを作成することであって、アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンが、乳癌、膀胱癌または大腸癌と関連付けられた少なくとも８個または１６個の再発変異のセットのうちの少なくとも１つの再発癌に関連する変異（例えば、ホットスポット癌変異、薬物耐性マーカー、癌パネル変異）に広がっている、作成することと、再発癌に関連する変異を含むアンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定することであって、血液または尿サンプルからの１個以上（または２個以上、または３個以上、または４個以上、または５個以上、または６個以上、または７個以上、または８個以上、または９個以上、または１０個以上）の再発癌に関連する変異の検出は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の早期再発または転移の指標である、決定することと、個体に、血液または尿サンプルから検出された再発癌に関連する変異のうちの１つ以上を有する乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療に有効であることが知られている化合物を投与することと、を含む方法に関する。

本明細書に記載される本発明のさらなる態様は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療に対する応答をモニタリングするか、または予測する方法であって、乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療を受けている患者から１つ以上の血液または尿サンプルを長期的に集めることと、それぞれの血液もしくは尿サンプルまたはそのフラクションから単離された核酸に対して多重増幅反応を行うことによってアンプリコンのセットを作成することであって、アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンが、乳癌、膀胱癌または大腸癌と関連付けられた少なくとも８個または１６個の再発変異のセットのうちの少なくとも１つの再発癌に関連する変異（例えば、ホットスポット癌変異、薬物耐性マーカー、癌パネル変異）に広がっている、作成することと、再発癌に関連する変異を含むアンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定することであって、血液または尿サンプルからの１個以上（または２個以上、または３個以上、または４個以上、または５個以上、または６個以上、または７個以上、または８個以上、または９個以上、または１０個以上）の再発癌に関連する変異の検出は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療に対する応答不良の指標である、決定することと、を含む方法に関する。

乳癌、膀胱癌または大腸癌と診断された患者の腫瘍サンプルからの体細胞変異を最初に特定することに加えて、またはそれに代えて、本明細書に記載される方法は、血液、血清、血漿、尿、毛髪、涙、唾液、皮膚、指の爪、糞便、胆汁、リンパ液、子宮頸粘液または精液などの患者の他の生体サンプルからの体細胞変異を特定することにも基づいていてもよい。

したがって、本明細書に記載される本発明のさらなる態様は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の早期再発または転移をモニタリングし、検出する方法であって、乳癌、膀胱癌または大腸癌と診断された患者の癌に関連する変異を含む生体サンプル（例えば、血液、血清、血漿、尿、毛髪、涙、唾液、皮膚、指の爪、糞便、胆汁、リンパ液、子宮頸粘液または精液）中で特定された体細胞変異に基づいて、複数のゲノムバリアント遺伝子座（例えば、ＳＮＶ、インデル、多重ヌクレオチドバリアントおよび遺伝子融合）を選択することと、患者が手術、ファーストライン化学療法および／またはアジュバント療法で治療された後に、患者から１つ以上の血液または尿サンプルを長期的に集めることと、それぞれの血液もしくは尿サンプルまたはそのフラクションから単離された核酸に対して多重増幅反応を行うことによってアンプリコンのセットを作成することであって、アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンが、乳癌、膀胱癌または大腸癌と関連付けられた患者固有のゲノムバリアント遺伝子座のうちの少なくとも１つのゲノムバリアント遺伝子座に広がっている、作成することと、患者固有のゲノムバリアント遺伝子座を含むアンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定することであって、血液または尿サンプルからの１個以上（または２個以上、または３個以上、または４個以上、または５個以上、または６個以上、または７個以上、または８個以上、または９個以上、または１０個以上）の患者固有のゲノムバリアントの検出は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の早期再発または転移の指標である、決定することと、を含む方法に関する。

本明細書に記載の本発明のさらなる態様は、乳癌、膀胱癌または大腸癌を治療するための方法であって、乳癌、膀胱癌または大腸癌と診断された患者を手術、ファーストライン化学療法および／またはアジュバント療法で治療することと、患者から１つ以上の血液または尿サンプルを長期的に集めることと、それぞれの血液もしくは尿サンプルまたはそのフラクションから単離された核酸に対して多重増幅反応を行うことによってアンプリコンのセットを作成することであって、アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンが、乳癌、膀胱癌または大腸癌と関連付けられており、癌に関連する変異を含む患者の生体サンプル（例えば、血液、血清、血漿、尿、毛髪、涙、唾液、皮膚、指の爪、糞便、胆汁、リンパ液、子宮頸粘液または精液）において特定された体細胞変異に基づいて選択された、少なくとも８個または１６個の患者固有のゲノムバリアント遺伝子座のセットのうちの少なくとも１つのゲノムバリアント遺伝子座（例えば、ＳＮＶ、インデル、多重ヌクレオチドバリアントおよび遺伝子融合）に広がっている、作成することと、患者固有のゲノムバリアント遺伝子座を含むアンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定することであって、血液または尿サンプルからの１個以上（または２個以上、または３個以上、または４個以上、または５個以上、または６個以上、または７個以上、または８個以上、または９個以上、または１０個以上）の患者固有のゲノムバリアントの検出は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の早期再発または転移の指標である、決定することと、個体に、血液または尿サンプルから検出されたゲノムバリアントのうちの１つ以上を有する乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療に有効であることが知られている化合物を投与することと、を含む方法に関する。

本明細書に記載される本発明のさらなる態様は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療に対する応答をモニタリングするか、または予測する方法であって、乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療を受けている患者から１つ以上の血液または尿サンプルを長期的に集めることと、それぞれの血液もしくは尿サンプルまたはそのフラクションから単離された核酸に対して多重増幅反応を行うことによってアンプリコンのセットを作成することであって、アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンが、乳癌、膀胱癌または大腸癌と関連付けられており、癌に関連する変異を含む患者の生体サンプル（例えば、血液、血清、血漿、尿、毛髪、涙、唾液、皮膚、指の爪、糞便、胆汁、リンパ液、子宮頸粘液または精液）において特定された体細胞変異に基づいて選択された、少なくとも８個または１６個の患者固有のゲノムバリアント遺伝子座のセットのうちの少なくとも１つのゲノムバリアント遺伝子座（例えば、ＳＮＶ、インデル、多重ヌクレオチドバリアントおよび遺伝子融合）に広がっている、作成することと、患者固有のゲノムバリアント遺伝子座を含むアンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定することであって、血液または尿サンプルからの１個以上（または２個以上、または３個以上、または４個以上、または５個以上、または６個以上、または７個以上、または８個以上、または９個以上、または１０個以上）の患者固有のゲノムバリアントの検出は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療に対する応答不良の指標である、決定することと、を含む方法に関する。

開示される発明の他の実施形態、特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。

特許または出願ファイルには、カラーで描かれた少なくとも１つの図面が含まれている。カラーの図面を含む本特許または特許出願公開の複写は、要望および必要な料金の支払いに応じて、庁によって提供されるだろう。

ここに開示される実施形態は、添付の図面を参照しつつさらに説明され、同様の構造は、いくつかの図面全体で同様の数字によって参照される。示される図面は、必ずしも縮尺どおりではなく、その代わりに、ここに開示される実施形態の原理を説明する際に一般的に強調される。

ワークフロー図である。 上側パネル：サンプルあたりのＳＮＶの数、下側パネル：ドライバーカテゴリーによってソートされたワーキングアッセイ。 測定されたｃｆＤＮＡ濃度。各データ点は、血漿サンプルを指す。 以前決定された組織ＶＡＦ測定（ｘ軸）とｍＰＣＲ−ＮＧＳを用いた今回のもの（ｙ軸）との間の良好な相関関係を示すサンプル。各サンプルは、別個の四角で示され、ＶＡＦデータ点は、組織の小区分によって色分けされる。 以前決定された組織ＶＡＦ測定（ｘ軸）とｍＰＣＲ−ＮＧＳを用いた今回のもの（ｙ軸）との間の乏しい相関関係を示すサンプル。各サンプルは、別個の四角で示され、ＶＡＦデータ点は、組織の小区分によって色分けされる。 得られたコールの関数としてのリードヒストグラムの深さ。上側：このアッセイは、予想される血漿ＳＮＶを検出しなかった。下側：このアッセイは、予想される血漿ＳＮＶを検出した。 組織学的種類別の血漿中で検出されたＳＮＶの数。 腫瘍のステージ別の血漿中のＳＮＶ検出（左）およびサンプル検出（右）。 腫瘍のステージおよびＳＮＶクローン性の関数としての血漿ＶＡＦ。 ｃｆＤＮＡインプット量の関数としての各サンプルからの血漿において検出されるＳＮＶの数。 平均腫瘍ＶＡＦの関数としての血漿ＶＡＦ。平均腫瘍ＶＡＦは、各腫瘍から分析される全ての腫瘍の小区分にわたって計算された。 それぞれの検出されたＳＮＶのクローン比率（赤色対青色）および変異体バリアント対立遺伝子頻度（ＭｕｔＶＡＦ）を示す。各サンプルから検出された全ＳＮＶを単一のカラムに配置し、そのサンプルを腫瘍ステージ（ｐＴＮＭステージ）によって分類する。ＳＮＶが検出されないサンプルが含まれる。クローン比率は、ＳＮＶが観測された腫瘍小区分の数と、その腫瘍から分析された小区分の合計数との間の比率として定義される。 それぞれの検出されたＳＮＶのクローン状態（クローンについては青色、サブクローンについては赤色）および変異体バリアント対立遺伝子頻度（ＭｕｔＶＡＦ）を示す。各サンプルから検出された全ＳＮＶを単一のカラムに配置し、そのサンプルを腫瘍ステージ（ｐＴＮＭステージ）によって分類する。ＳＮＶが検出されないサンプルが含まれる。クローン状態は、腫瘍組織からの全エクソーム配列決定データを用いたＰｙＣｌｏｎｅＣｌｕｓｔｅｒによって決定された。 それぞれの検出されたＳＮＶのクローン状態（クローンについては青色、サブクローンについては赤色）および変異体バリアント対立遺伝子頻度（ＭｕｔＶＡＦ）を示し、上側パネルは、クローンＳＮＶのみを示し、下側パネルは、サブクローンＳＮＶのみを示す。各サンプルから検出された全ＳＮＶを単一のカラムに配置し、そのサンプルを腫瘍ステージ（ｐＴＮＭステージ）によって分類する。ＳＮＶが検出されないサンプルが含まれる。クローン状態は、腫瘍組織からの全エクソーム配列決定データを用いたＰｙＣｌｏｎｅＣｌｕｓｔｅｒによって決定された。 組織学的種類および腫瘍の大きさの関数としての血漿中で検出されたＳＮＶの数を示す。組織学的種類および腫瘍のステージは、病理報告によって決定された。各データ点は、大きさごとに色分けされ、赤色は、最大の腫瘍の大きさを示し、青色は、最小の腫瘍の大きさを示す。 全てのサンプルにおけるＤＮＡ濃度、ライブラリ調製物内のゲノムコピー当量、血漿溶血グレードおよびｃＤＮＡプロファイルを示すｃｆＤＮＡ分析の表である。 各サンプルについて血漿中で検出されるＳＮＶの表である。 血漿中で検出されるさらなるＳＮＶの表である。 再発時の血漿サンプルについての検出アッセイおよびそのバックグラウンド対立遺伝子フラクションの一例である（ＬＴＸ１０３）。 臨床プロトコルおよび分子プロトコルの概略図。 試験の概要。 ３６ヶ月間のサーベイランスおよび血漿採取についての患者のまとめ。 手術後のｃｔＤＮＡステータスによって階層化される再発リスク。 術後のｃｔＤＮＡステータスによって階層化される療法後再発リスク。 再発防止におけるアジュバント療法の有効性。 放射線医学およびｃｔＤＮＡに基づく放出までの時間。 再発の早期検出および治療応答の予測。 臨床サンプル採取の概略図。 血漿配列決定ＱＣ。 早期再発検出。 診断時および膀胱切除後の無再発生存率およびｃｔＤＮＡステータス。 ネオアジュバント治療応答。 Ｓｉｇｎａｔｅｒａ（ＲＵＯ）プロセス。 血漿配列決定ＱＣ。 単一ＳＮＶ検出の感度。 予測されるインプット対Ｓｉｇｎａｔｅｒａ（ＲＵＯ）を用いて観測されたＶＡＦ。 実施例６における乳癌試験のための患者のまとめ。 実施例６の試験において分析されたサンプルに関する情報の表である。図３８Ａは、表の第１部である。図３８Ｂは、表の続きである。図３８Ｃは、表の続きである。図３８Ｄは、表の続きである。図３８Ｅは、表の続きである。図３８Ｆは、表の続きである。図３８Ｇは、表の続きである。図３８Ｈは、表の続きである。 実施例６の乳癌試験における患者の人数構成。患者５０名のＷＥＳ生データ（患者３５名のドライバーバリアントを含む）を受領した。さまざまな数のタイムポイント（１〜８の間）での２１８個の血漿サンプルを受領した。１０８個の追加の抽出されたＤＮＡサンプルを受領した。再発ステータスも集められた。６ヶ月の時間間隔を有するアジュバント療法後に血液サンプルを採取した。 実施例６の乳癌試験のためのＷＥＳ分析およびプール設計のまとめ。プールＡは、Ｓｉｇｎａｔｅｒａ法に基づく。プールＢは、２５名の患者を含み、箱ひげ図において、アスタリスクを付けて示されている。プールＢの１９名の患者は、腫瘍純度が低かった。６名の患者は、非常に初期段階のＨＥＲ２−腫瘍を有していた。プールＢは、ドライバーバリアントを含んでいる。 実施例６における乳癌試験のための血漿サンプル。血漿体積の中央値は、４ｍＬであった。ＤＮＡインプット量の中央値は、２６ｎｇであった。ＤＮＡインプット量の中央値は、ＣＲＣおよびＭＩＢＣサンプルよりも低い（それぞれ４５ｎｇおよび６６ｎｇ）。 実施例６の乳癌試験のための種類あたりのプロセスエラー率の中央値およびリードのアッセイ深度の中央値を示す配列決定品質制御。合計で３２６個の血漿配列決定サンプルを処理した。変異コールＦＰ率は、０．２８％であると推定される。 実施例６における乳癌試験のための血漿サンプルの再実行。２１４個の固有の血漿サンプルを含む３１９個の配列決定されるサンプルは、４９名の患者に対して表される。 実施例６における乳癌試験のためのプールＡからの結果。４９名の患者のうち、１１名が、ベースライン陽性であった。３名は、タイムポイントが１つだけである。残りの８名の患者は、全ての時間で陽性のままである。プールＢとドライバーは、同様の結果をもたらした。ドライバー情報：１６個の再発サンプルは、ドライバー変異を有する。１１個の再発サンプルには、ドライバーを用いた少なくとも１つのアッセイを行っている。 ｃｔＤＮＡを検出した１６名の患者のまとめ。 図３８における患者ＣＤ０４７（ＴＮＢＣ）に対応するデータの図による説明。 図３８における患者ＣＤ０３３（ＴＮＢＣ）に対応するデータの図による説明。 図３８における患者ＣＤ０３７（ＨＥＲ２＋）に対応するデータの図による説明。 図３８における患者ＣＤ０４０（ＨＥＲ２＋）に対応するデータの図による説明。 図３８における患者ＣＤ０４８（ＨＥＲ２−）に対応するデータの図による説明。 図３８における患者ＣＤ００５（ＨＥＲ２−）に対応するデータの図による説明。 図３８における患者ＣＤ０３６（ＨＥＲ２−）に対応するデータの図による説明。 図３８における患者ＣＤ０４４（ＨＥＲ２−）に対応するデータの図による説明。 図３８における患者ＣＤ０４９に対応するデータの図による説明。 図３８における患者ＣＤ０２９に対応するデータの図による説明。 図３８における患者ＣＤ０２６に対応するデータの図による説明。 図３８における患者ＣＤ０１７に対応するデータの図による説明。 図３８における患者ＣＤ０３１に対応するデータの図による説明。ＨＷ：ＳＨＣ２、ＰＫＤ１、ＣＯＬＥＣ１２。 図３８における患者ＣＤ０２５に対応するデータの図による説明。この患者において、ｃｔＤＮＡは、ＦＧＦ９の変異について、２つの連続するタイムポイントで観測された。この患者は、近い将来に再発を経験する可能性がある。 患者の募集および臨床サンプルの採取。この試験でモニタリングされた４９名のＢＣ女性について、採取された腫瘍組織および連続血漿サンプルを、Ｓｉｇｎａｔｅｒａ（商標）ＲＵＯワークフローを用い、盲検方法で分析した。ＦＦＰＥ腫瘍組織標本およびマッチングした正常ＤＮＡのペアエンド配列決定によって、エクソーム変化を決定した。ＷＥＳから特定された１６個の体細胞変異を含む患者固有のパネルを設計した。血漿サンプルを、これらの対応する特注のパネルを用いて処理した。２０８個のサンプルをｃｔＤＮＡ検出のために分析した。 ｃｔＤＮＡ分析の概要および結果のまとめ。（Ａ）分析した連続血漿サンプル（ｎ＝２０８）の結果と共に、各患者（ｎ＝４９）の治療レジメンのまとめ。（Ｂ）各乳癌サブタイプにおける全患者、再発数、ｃｔＤＮＡ分析によって検出された割合および日数単位でのリードタイムの中央値を示すまとめの表。（Ｃ）対応のあるウィルコクソンの符号順位検定（ｐ値＜０．００１）を用いた乳癌サブタイプＨＲ＋、ＨＥＲ２＋、ＴＮＢＣによって着色された分子および臨床的再発の比較。 連続血漿サンプルにおけるＣｔＤＮＡ検出は、無再発生存率を予測する。（Ａ）手術後の任意のフォローアップ血漿サンプルにおけるｃｔＤＮＡの検出による、無再発生存率［ＨＲ：３５．８４（７．９６２６〜１６１．３２］ ｐ値＜０．００１。（Ｂ）最初の手術後血漿サンプルにおけるｃｔＤＮＡの検出による、無再発生存率［ＨＲ：１１．７８４（４．２７８４〜３２．４５７］。データは、ｎ＝４９名の患者由来であり、ｐ値＜０．００１である。 （Ａ〜Ｅ）５名の乳癌患者（１パネルあたり１名）について、複数の血漿タイムポイントにわたるｃｔＤＮＡの血漿レベル。原発性腫瘍およびマッチした正常な全エクソーム配列決定は、患者固有の体細胞変異を特定した。分析的に検証されたＳｉｇｎａｔｅｒａ（商標）ＲＵＯワークフローを使用して、各患者固有のアッセイは、大規模並列配列決定を使用して１６個の体細胞ＳＮＶおよびインデルバリアントを標的にするように設計された（１標的あたりの深さの中央値は１００，０００倍を超える）。平均ＶＡＦは濃い青色の円で示され、実線は、経時的な平均ＶＡＦプロファイルを表す。リードタイムは、臨床的再発と分子再発の差によって計算される。ＣＡ１５−３レベルは経時的にグラフ化され、ベースラインレベルは、淡い青色の陰影で示される。（Ｆ）たった１個のタイムポイントを有する患者を除き、全てのｃｔＤＮＡ陽性サンプルについての分子再発および臨床的再発で検出された、ＶＡＦおよび標的数のまとめ。 ４９名の患者固有のパネルについてのＳｉｇｎａｔｅｒａバリアント選択戦略。（上）患者の特注のパネルにおける腫瘍組織ＶＡＦ分布。異なる色は、異なるサブタイプを表す。ＨＥＲ２−（濃い青色）、トリプルネガティブ（橙色）およびＨＥＲ２＋（緑色）。（中央）患者の特注のパネルにおける推定クローンおよびサブクローンバリアントの数。４９個の特注のパネルにおけるクローンバリアント数の中央値は、１６のうち１３である。（下）患者のＷＥＳデータにおける推定クローンおよびサブクローンバリアントの数。 （Ａ〜Ｌ）１２名（１１名が再発し、１名は再発していない）乳癌患者について、複数の血漿タイムポイントにわたるｃｔＤＮＡの血漿レベル。原発性腫瘍およびマッチした正常な全エクソーム配列決定は、患者固有の体細胞変異を特定した。分析的に検証されたＳｉｇｎａｔｅｒａ（商標）ワークフローを使用して、各患者固有のアッセイは、大規模並列配列決定を使用して１６個の体細胞ＳＮＶおよびインデルバリアントを標的にするように設計された（１標的あたりの深さの中央値は１００，０００倍を超える）。平均ＶＡＦは濃い青色の円で示され、実線は、経時的な平均ＶＡＦプロファイルを表す。リードタイムは、臨床的再発と分子再発の差によって計算される。ＣＡ１５−３レベルは経時的にグラフ化され、ベースラインレベルは、淡い青色の陰影で示される。 ＶＡＦおよび変異体数の分布。合計で、ｃｔＤＮＡ陽性血漿サンプルにおいて、２５１個の標的が検出された。検出された標的のＶＡＦは０．０１％〜６４％の範囲であり、中央値は０．８２％であった。各サンプルの変異体ＶＡＦの観測値および総ＤＮＡ分子数を使用し、患者の血漿サンプル中に存在する腫瘍分子の数を計算した。２５１個の陽性標的において検出された変異体分子の数は、１〜６５００変異体分子の範囲であり、中央値は３９個の分子であった。 Ｓｉｇｎａｔｅｒａ品質管理プロセス：品質管理は、ワークフローの全ての工程で行われた。合計で２１５個の血漿サンプルのうち、２０８個は、本願発明者らのサンプルＱＣプロセスに合格し、設計された７８４個の独自のアッセイのうち、本願発明者らのＱＣに合格したのは７６７個であった（全サンプルにわたって、３３２８個のうち合格した合計３２３７個のアッセイに対応する）。Ａ）１ｍＬあたり抽出されたｃｆＤＮＡ。各血漿サンプルから抽出されたｃｆＤＮＡは、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔによって定量化された。定量化されたｃｆＤＮＡ量が５ｎｇ未満のサンプルは、「注意（ＷＡＲＮＩＮＧ）」とフラグ付けされた。１ｍＬあたり抽出されたｃｆＤＮＡは、１〜２１．４ｎｇの範囲であり、中央値は４．７ｎｇであった。Ｂ）ライブラリ調製のＤＮＡインプット量。各血漿サンプルからの６６ｎｇまでのｃｆＤＮＡを、ライブラリ調製プロトコルへのインプットとして使用した。ライブラリＤＮＡインプット量は、１〜６６ｎｇの範囲であり、中央値は２５．０２であった。精製されたライブラリは、次の工程に進む前にＱＣが行われた。Ｃ）配列決定カバレッジ。カバレッジが５０００倍未満のアッセイは、分析から除外された。その後、合格したアッセイが８個に満たないサンプルは、配列決定カバレッジＱＣに不合格であった。カバレッジＱＣに合格したアッセイについてのリード深度の中央値は、１１０，０００倍であった。Ｄ）サンプル一致性。サンプルの完全性を追跡するために、ＳＮＰトレーサーを使用して、患者のサンプル間の一致性を測定した。各血漿サンプルについて、その対応するマッチした正常遺伝子型決定データと比較して、遺伝子型決定一致スコアを計算した。サンプルは、そのＳＮＰの少なくとも８５％が同一の遺伝子型を有しているとき、同じ患者由来であるとみなされる。入れ替えられたと特定された６個の血漿サンプルは、ｃｔＤＮＡ分析から除外された。 分析検証結果。（Ａ）単一標的検出感度。約０．０３％のスパイクイン腫瘍ＤＮＡでの変異検出について、約６０％の分析感度がＳｉｇｎａｔｅｒａを用いて達成された。（Ｂ）少なくとも２個の変異が１６個の標的バリアントのセットから検出される場合のＳｉｇｎａｔｅｒａの推定サンプルレベル感度。 スクリーニングおよび募集の後、患者は、６個の月１回の血液サンプルを用いてフォローアップされた。ＨＥＲ２ステータスは、免疫組織化学アッセイおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイにおける蛍光によって決定された。いずれかのアッセイが陽性である場合、患者は、ＨＥＲ２陽性癌を有するとみなされた。ＮＡＣＴ：ネオアジュバント化学療法、ＡＣＴ：アジュバント化学療法。 実施例９における筋肉浸潤性膀胱癌試験のワークフロー図。 実施例９における筋層浸潤性膀胱癌のための患者のまとめ。図７１Ａは、ＷＥＳからコールされる同義および非同義の変異の率を示す。１名の患者の腫瘍は、高頻度に変異があり、変異負荷は１２６変異／Ｍｂであり、以前に高頻度変異誘発物質と関連付けられているＰＯＬＤ１変異を示した（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｂ．Ｂ．ら、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ １７１、１０４２−１０５６．ｅ１０（２０１７）。図７１Ｂは、膀胱癌に関連する変異シグネチャの相対寄与を示す。図７１Ｃは、膀胱癌（ＴＣＧＡ）において頻繁に変異する遺伝子における変異を示す（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ａ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｓｃｌｅ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｂｌａｄｄｅｒ Ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ １７１，５４０−５５６．ｅ２５（２０１７））。図７１Ｄは、６８個のサンプルの５％より多くで変異したＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）関連遺伝子における有害な変異を示す。図７１Ｅは、有害なＤＤＲ変異の総数を示す。図７１Ｆは、臨床特徴および組織病理学的特徴を示す。図７１Ｇは、まとめられたｃｔＤＮＡステータスを示す。 実施例９における筋層浸潤性膀胱癌試験の臨床プロトコルおよびサンプリング計画を概説する図。 Ｓｉｇｎａｔｅｒａ（商標）ワークフローを概説する図。 実施例９における筋層浸潤性膀胱癌試験に対応する全分析サンプルについてのｃｔＤＮＡ結果の長期的な表示。患者は、ｃｔＤＮＡステータスに基づいて、３つの群に分割される。上側パネルは、膀胱切除（ＣＸ）の前後でｃｔＤＮＡ陽性の患者を示し、中央パネルは、ＣＸの前にのみｃｔＤＮＡ陽性の患者を示し、下側パネルは、ｃｔＤＮＡ陰性患者を示す。水平の線は、各患者の疾患経過を表し、円はｃｔＤＮＡステータスを表し、赤色の円は、少なくとも２個の陽性アッセイを有するサンプルを示す。患者ごとに、治療および画像診断の情報を示す。 実施例９における筋層浸潤性膀胱癌試験のためのｃｔＤＮＡ検出の予後値のグラフ表示。化学療法前（図７５Ａ）、膀胱切除（ＣＸ）前（図７５Ｂ）および膀胱切除（ＣＸ）後（図７５Ｃ）のｃｔＤＮＡステータスによって階層化された、無再発生存率（ＲＦＳ）および全生存率（ＯＳ）の確率を示すカプラン−マイヤー生存率分析。図７５Ｄは、化学療法前、膀胱切除前および膀胱切除後疾患再発およびｃｔＤＮＡステータスと、膀胱切除前の疾患再発およびリンパ節の状態との間の関係を示す。図７５Ｅは、膀胱切除（ＣＸ）前のｃｔＤＮＡステータスと膀胱切除（ＣＸ）時の病理状態との間の関係を示す。統計的有意性の評価は、連続変数に対するウィルコクソンの順位和検定およびカテゴリ変数に対するフィッシャーの正確検定を用いて行われた。 実施例９における筋層浸潤性膀胱癌試験のための個々の疾患経過におけるｃｔＤＮＡ変化を示すグラフ。図７６は、選択した患者からの詳細な疾患経過、適用された治療および関連する長期的なｃｔＤＮＡ分析の表示を示す。ｃｔＤＮＡステータス、適用された治療および画像診断の結果は、レジェンドに従って提示される。ｃｔＤＮＡに基づく再発検出についての良好なリードタイムが示される。 実施例９における筋層浸潤性膀胱癌試験のための分子再発（ｃｔＤＮＡ陽性）と臨床的再発（レントゲン写真による画像診断陽性）との間の時間差を示すグラフ。Ｐ値は、対応のあるウィルコクソンの符号順位検定を用いて計算された。 実施例９における筋層浸潤性膀胱癌試験のための化学療法応答の予測マーカーを示すグラフ。図７８Ａは、疾患再発と化学療法に対する応答との間の関係を示す。図７８Ｂは、それぞれ、化学療法に対する応答およびＥＲＣＣ２変異ステータスによって階層化された全ての患者についての相対的なシグネチャ５の寄与を示す。図７８Ｃは、ＥＲＣＣ２変異ステータスに関連して、治療に応答する患者の分率を示す。図７８Ｄ。ＲＮＡサブタイプの図＿新しい図。図７８Ｅは、全疾患経過を通じてｃｔＤＮＡ陰性である患者、ｃｔＤＮＡレベルがゼロまで下がる患者、ｃｔＤＮＡレベルが陽性のままである患者について、ｃｔＤＮＡと化学療法に対する応答との関連性を示す。図７８Ｆは、化学療法の前、間、後に検出可能なｃｔＤＮＡを有する全ての患者についてのｃｔＤＮＡのレベルを示す。患者は、化学療法に対する応答によってグループ分けされ、再発ステータスが示される。 実施例９における筋層浸潤性膀胱癌試験のためのＥＲＣＣ２ステータスまたは破壊的なＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）変異の数に関連して、患者あたりの特定された変異の総数を示すグラフ。 実施例９における筋層浸潤性膀胱癌試験のための原発性腫瘍と転移性再発との間のゲノム不均一性を示すグラフ。原発性腫瘍の全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）データをｃｔＤＮＡと比較した。高いｃｔＤＮＡバリアント対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）を有する血漿サンプルからのＷＥＳデータは、転移性再発時に検出された。血漿または腫瘍エクソームデータのいずれかで特定された変異を有するゲノム位置が、塩基数について調べられた。血漿または腫瘍エクソームデータにおいて特定され、得られた対立遺伝子頻度が示される。個々の変異は、変異コールの統計的確率（強度）にしたがってカラーコードが付けられる。ベン図は、腫瘍、血漿、または両者において排他的に特定された変異の数を表す。 実施例９における筋層浸潤性膀胱癌試験からの８名の患者に由来する、膀胱切除（ＣＸ）に対して様々な日のバリアント対立遺伝子頻度（ＶＡＦ％）を示すグラフ。 実施例９における筋層浸潤性膀胱癌試験のための超深部配列決定と比較して、ｄｄＰＣＲによって以前分析された１０名の患者由来の血漿におけるｃｔＤＮＡレベルを示すグラフ。 １２５名の患者全員についての臨床パラメータ、組織病理学的パラメータおよび分子パラメータを示すグラフ。図８３Ａは、５個の最も関連性がある大腸癌関連変異シグネチャの相対寄与を示す。図８３Ｂは、ＷＥＳからコールされる同義および非同義の変異の率を示す。図８３Ｃは、大腸癌（ＴＣＧＡ）において頻繁に変異する遺伝子における変異を示すグラフを示す｛Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ，２０１２ ＃５２｝。図８３Ｄは、臨床特徴および組織病理学的特徴を示す。図８３Ｅは、手術前および手術後のｃｔＤＮＡステータスをまとめたグラフを示す。 定義される臨床的な問題に対処するために使用される、患者の登録、サンプル採取および患者サブグループの定義を示す図。略称：ｃｔＤＮＡ、循環腫瘍ＤＮＡ；ＣＴスキャン、コンピュータ断層撮影スキャン；ｐｏｓｔ−ｏｐ、手術後；ＴＴＲ、再発までの時間。 患者サンプルの全エクソーム配列決定のためのワークフローの品質管理（ＱＣ）試験を示すグラフ。７９５個の血漿サンプルのうち７９３個（９９％）がサンプルＱＣプロセスに合格した。１９４個のサンプル（７０名の患者由来）は、血漿サンプルとその対応する組織生検との間の一致性を検査するために、ＳＮＰトレーサーと共に実行される。１９４個全ての血漿サンプルが、一致ＱＣに合格した。図８５Ａは、ライブラリ調製のＤＮＡインプット量を示す。各血漿サンプルからの６６ｎｇまでの無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を、ライブラリ調製プロトコルへのインプットとして使用した。ライブラリＤＮＡインプット量は、１〜６６ｎｇの範囲であり、中央値は４５．６６であった。精製されたライブラリは、次の工程に進む前に品質管理が行われた。１個のサンプルは、ライブラリ調製のＱＣに不合格であった。図８５Ｂは、配列決定カバレッジを示す。カバレッジが５０００倍未満のアッセイは、分析から除外された。その後、合格したアッセイが８個に満たないサンプルは、配列決定カバレッジＱＣに不合格であった。１個のサンプルは、配列決定カバレッジの要件に不合格であった。カバレッジＱＣに合格したアッセイについてのリード深度の中央値は、１０５，０００倍であった。図８５Ｃは、全ての血漿サンプルにおいて測定された配列決定エラー率を示す。平均トランジションエラー率は５ｅ−５であり、平均トランスバージョンエラー率は８ｅ−６である。 それぞれの個々の患者の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の結果および動態を示す。 手術前（ｐｒｅ−ｏｐ）、手術後３０日目およびアジュバント化学療法（ＡＣＴ）の間のｃｔＤＮＡステータスを示す。図８７Ａは、ｃｔＤＮＡの手術前検出を示す。図８７Ｂは、再発率を示す。図８７Ｃは、手術後３０日目のｃｔＤＮＡステータスによって階層化された、９４名のステージＩ〜ＩＩＩの患者についてのＴＴＲのカプラン−マイヤー推定値を示す。図８７Ｄは、再発率および長期的なｃｔＤＮＡステータスによって評価される、ｃｔＤＮＡ陽性患者に対するＡＣＴの効果を示す。図８７Ｅは、ＡＣＴ後の最初の通院時のｃｔＤＮＡステータスによって階層化された再発率を示す。図８７Ｆは、ｃｔＤＮＡステータスおよびＡＣＴ後の最初の通院によって階層化された、５８名のＡＣＴで治療された患者についてのＴＴＲのカプラン−マイヤー推定値を示す。 １２５名のステージｉ〜ＩＩＩのＣＲＣ患者における癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の手術後検出を示す。 再発ステータスおよび疾患ステージによって順序付けられる、３０日目のｃｔＤＮＡ分析に含まれる血漿サンプルのｃｔＤＮＡプロファイリング結果の概略図を示す。ａ（複数可）の付いた患者は、同時期性ＣＲＣを有する。^＊＊印の付いた血漿は、２番目のプールのみ陽性である（ｎ＝１）。 再発ステータスおよび疾患ステージによって順序付けられる、３０日目のｃｔＤＮＡ分析に含まれ、ＡＣＴを受けている血漿サンプルの部分集合のｃｔＤＮＡプロファイリング結果の概略図を示す。ａ（複数可）の付いた患者は、同時期性ＣＲＣを有する。 再発ステータス、手術後のｃｔＤＮＡステータスおよびフォローアップの長さによって順序付けられる、長期的なＡＣＴ後のｃｔＤＮＡ分析に含まれる血漿サンプルのｃｔＤＮＡプロファイリング結果の概略図を示す。ａ（複数可）の付いた患者は、同時期性ＣＲＣを有する（ｎ＝２）。^＊＊印の付いた血漿サンプルは、２番目のプールのみ陽性である（ｎ＝１）。 再発ステータス、手術後のｃｔＤＮＡステータスおよびフォローアップの長さによって順序付けられる、長期的なＡＣＴ後のｃｔＤＮＡ分析に含まれる血漿サンプルのＣＥＡプロファイリング結果の概略図を示す。ａ（複数可）の付いた患者は、同時期性ＣＲＣを有する（ｎ＝２）。^＊＊印の付いた血漿は、２番目のプールのみ陽性である（ｎ＝１）。 （図９３〜Ｄ）ｃｔＤＮＡステータスと根治的治療後の再発との関連性を示すグラフ。図９３Ａは、長期的なｃｔＤＮＡステータスによって階層化された再発率を示す。図９３Ｂは、長期的なｃｔＤＮＡステータスによって階層化された、長期的なサンプルを有する７５名の患者についてのＴＴＲのカプラン−マイヤー推定値を示す。図９３Ｃは、放射線学的再発までの時間とｃｔＤＮＡ再発までの時間を比較するグラフを示す。図９３Ｄは、血漿中のｃｔＤＮＡのバリアント対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）が、放射線学的再発に向かって増加したことを示す。ＡＣＴの前およびＡＣＴ中の初期のタイムポイントは省略されている。 再発患者と再発していない患者からの長期的な血漿サンプルのｃｔＤＮＡプロファイリング結果の概略図。サーベイランス中に血漿サンプルがたった１つだけ陽性である患者は、陽性であると考えられる。 再発患者と再発していない患者からの長期的な血清サンプルのＣＥＡプロファイリング結果の概略図。サーベイランス中に血漿サンプルがたった１つだけ陽性である患者は、陽性であると考えられる。 放射線学的再発までの時間とＣＥＡ再発までの時間を比較するグラフ。 再発患者における発症原因となる変異の検出。図９７Ａは、サーベイランス中に発症原因となる変異が検出されたｃｔＤＮＡ＋再発患者の割合を示す。最初のｃｔＤＮＡ＋サンプル（左のカラム）および全てのｃｔＤＮＡ＋血漿サンプル（右のカラム）。図９７Ｂは、血液中でコールされる発症原因となるバリアントを示す。水平軸および垂直軸の両方で対数目盛りを用いてプロットされた、Ｓｉｇｎａｔｅｒａ ｃｔＤＮＡ＋アッセイを用いて計算された平均血液ＶＡＦと、発症原因となる変異のバリアント対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）との間の相関関係。図９７Ｃは、発症原因となる変異を有する２名の代表的な再発患者の連続的なｃｔＤＮＡプロファイリングを示す。 現在の標準治療と、潜在的なｃｔＤＮＡによって導かれる患者の術後管理との概略的比較。 アジュバント化学療法（ＡＣＴ）によって減少したｃｔＤＮＡを示すグラフ。 ｃｔＤＮＡステータスと根治的治療後の再発との関連性を示すグラフ。図１００Ａは、長期的なｃｔＤＮＡステータスによって階層化された再発率と、長期的なｃｔＤＮＡステータスによって階層化された、長期的なサンプルを有する５８名の患者についてのＴＴＲのカプラン−マイヤー推定値を示す。図１００Ｂは、ＣＥＡ分析によって階層化された再発率と、ＣＥＡ分析によって階層化された、長期的なサンプルを有する５８名の患者についてのＴＴＲのカプラン−マイヤー推定値を示す。

上に特定された図は、説明のために提供され、これに限定されない。

本明細書で提供される方法および組成物は、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）の検出、診断、ステージ決定、スクリーニング、治療および管理を改善する。本明細書で提供される方法は、例示的な実施形態において、循環流体、特に、循環腫瘍ＤＮＡにおいて単一ヌクレオチドバリアント変異（ＳＮＶ）を分析する。本方法は、少しでも有効であれば腫瘍サンプルを利用することが必要とされる複数の試験と比べて、単一の試験において、サブクローン変異だけではなく、腫瘍およびクローンにおいて見出される変異の多くを特定するという利点を提供する。本方法および本組成物は、それ自体で有用な場合があり、または本方法および本組成物は、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）の検出、診断、ステージ決定、スクリーニング、治療および管理のための他の方法と共に使用されるときに有用な場合があり、例えば、これらの他の方法の結果を裏付け、より信頼性が高くおよび／または確定的な結果を提供するのに役立つだろう。

したがって、一実施形態において、個体、例えば、本明細書で提供されるｃｔＤＮＡ ＳＮＶ増幅／配列決定ワークフローを用い、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）を有するか、または有することが疑われる個体からのｃｔＤＮＡサンプルに存在する単一ヌクレオチドバリアントを決定することによって、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）に存在する単一ヌクレオチドバリアントを決定するための方法が本明細書で提供される。

「癌」および「癌性」という用語は、典型的には制御されない細胞増殖を特徴とする、動物における生理学的状態を指すか、またはこれを説明する。「腫瘍」は、１つ以上の癌性細胞を含む。いくつかの主要な種類の癌が存在する。癌腫は、皮膚内、または内臓の輪郭を形成するか、または内臓を覆う組織内で始まる癌である。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、または他の結合組織もしくは支持組織から始まる癌である。白血病は、骨髄などの血液形成組織内で始まり、大量の異常な血球が産生され、血液に入り込む癌である。リンパ腫および多発性骨髄腫は、免疫系の細胞内で始まる癌である。中枢神経系の癌は、脳および脊髄の組織内で始まる癌である。

いくつかの実施形態において、癌は、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌腫、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌腫、膀胱癌、脳幹グリオーマ、脳腫瘍（脳幹グリオーマ、中枢神経系非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽細胞腫、上衣腫、髄芽腫、髄様上皮腫、中分化型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉腫瘍および松果体芽細胞腫を含む）、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、原発部位不明癌、カルチノイド腫瘍、原発部位不明癌腫、中枢神経系非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、子宮頸癌、小児癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、大腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、膵臓内分泌島細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣芽細胞腫、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、胆嚢癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ（ｓｔｏｍａｃｈ） ｃａｎｃｅｒ）、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質細胞腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛腫瘍、グリオーマ、有毛細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球増加症、喉頭癌、口唇癌、肝臓癌、悪性線維性組織球腫骨癌、髄芽腫、髄様上皮腫、黒色腫、メルケル細胞癌腫、メルケル細胞皮膚癌腫、中皮腫、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、口癌（ｍｏｕｔｈ ｃａｎｃｅｒ）、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性新生物、鼻腔癌、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、口癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫、他の脳脊髄腫瘍、卵巣癌、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、乳頭腫症、副鼻腔癌、副甲状腺癌、骨盤内癌、陰茎癌、咽頭癌、中分化型松果体実質腫瘍、松果体芽細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性肝細胞肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、腎細胞（腎臓）癌、腎細胞癌、気道癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、セザリー症候群、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌腫、頸部扁平上皮癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ（ｇａｓｔｒｉｃ） ｃａｎｃｅｒ）、テント上原始神経外胚葉腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌腫、胸腺腫、甲状腺癌、移行上皮癌、腎盂および尿管の移行上皮癌、絨毛性腫瘍、尿管癌、尿路癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症またはウィルムス腫瘍を含む。

別の実施形態において、個体、例えば、癌を有することが疑われる個体からの血液のサンプルまたはそのフラクションにおいて癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）を検出する方法であって、本明細書で提供されるｃｔＤＮＡ ＳＮＶ増幅／配列決定ワークフローを用いてｃｔＤＮＡサンプル中に存在する単一ヌクレオチドバリアントを決定することによって、サンプル中に存在する単一ヌクレオチドバリアントを決定することを含む、方法が本明細書で提供される。複数の単一ヌクレオチド遺伝子座で、サンプル中に範囲の下限で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のＳＮＶ、範囲の上限で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０または５０個のＳＮＶが存在することが、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）の存在の指標である。

別の実施形態において、個体の腫瘍（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）においてクローン単一ヌクレオチドバリアントを検出する方法が本明細書で提供される。本方法は、本明細書で提供されるようなｃｔＤＮＡ ＳＮＶ増幅／配列決定ワークフローを行うことと、一連のアンプリコンの複数のコピーの配列に基づき、それぞれのＳＮＶ遺伝子座のバリアント対立遺伝子頻度を決定すること、を含む。複数の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座の他の単一ヌクレオチドバリアントと比較して相対的に高い対立遺伝子頻度は、腫瘍におけるクローン単一ヌクレオチドバリアントの指標である。バリアント対立遺伝子頻度は、配列決定の技術分野でよく知られている。この実施形態に関する裏付けは、例えば、図１２〜１４に提供される。

特定の実施形態において、本方法は、治療プラン、療法を決定すること、および／または１つ以上のクローン単一ヌクレオチドバリアントを標的とする化合物を個体に投与することをさらに含む。特定の例では、サブクローンおよび／または他のクローンＳＮＶは、療法によって標的とされない。特定の療法および関連する変異は、本明細書の他の章で提供され、当該技術分野で既知である。したがって、特定の例では、本方法は、個体に化合物を投与することをさらに含み、この化合物は、決定された単一ヌクレオチドバリアントのうちの１つ以上を有する癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）の治療に特異的に有効であることが知られている。

この実施形態の特定の態様において、０．２５％、０．５％、０．７５％、１．０％、５％または１０％を超えるバリアント対立遺伝子頻度は、クローン単一ヌクレオチドバリアントの指標である。これらのカットオフは、表形式の図２０Ａ〜２０Ｂのデータによって裏付けられる。

この実施形態の特定の例では、癌は、ステージ１ａ、１ｂまたは２ａの乳癌、膀胱癌または大腸癌である。この実施形態の特定の例では、癌は、ステージ１ａまたは１ｂの乳癌、膀胱癌または大腸癌である。この実施形態の特定の例では、個体は、手術を受けない。この実施形態の特定の例では、個体は、生検を受けない。

この実施形態のいくつかの例では、クローンＳＮＶは、特定されるか、または直接腫瘍試験などの他の試験が、任意のＳＮＶについて、可変対立遺伝子頻度が、決定された他の単一ヌクレオチドバリアントの少なくとも４分の１、３分の１、半分または４分の３より大きい試験で、試験中のＳＮＶがクローンＳＮＶであることを示唆する場合にはさらに特定される。

いくつかの実施形態において、ｃｔＤＮＡにおいてＳＮＶを検出する本明細書の方法は、腫瘍からのＤＮＡの直接分析の代わりに使用されてもよい。本明細書で提供される結果は、クローンＳＮＶである可能性がかなり高いＳＮＶが、より高いＶＡＦを有することを示す（図１２〜１４を参照）。

本明細書で提供される方法の実施形態のいずれかの特定の例では、標的化された増幅が個体からのｃｔＤＮＡで行われる前に、データが、その個体からの腫瘍中に見出されるＳＮＶについて提供される。したがって、これらの実施形態において、ＳＮＶ増幅／配列決定反応は、個体からの１つ以上の腫瘍サンプルに対して行われる。この方法では、本明細書で提供されるｃｔＤＮＡ ＳＮＶ増幅／配列決定反応は、クローンおよびサブクローン変異の液体生検を提供するため、依然として有利である。さらに、本明細書で提供されるように、クローン変異は、あるＳＮＶについて、高いＶＡＦ割合（例えば、個体からのｃｔＤＮＡサンプルにおいて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０％より大きなＶＡＦ）が決定される場合、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）を有する個体において、より明確に特定され得る。

特定の実施形態において、本明細書で提供される方法は、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）を有する個体からの循環遊離核酸からのｃｔＤＮＡをどのようにして単離し、分析するかを決定するために使用することができる。まず、癌が、乳癌、膀胱癌または大腸癌であるかを決定する。癌が乳癌、膀胱癌または大腸癌である場合、個体から循環遊離核酸が単離される。本方法は、いくつかの例では、癌のステージを決定することをさらに含む。

いくつかの方法では、本発明の組成物および／または固体支持体が本明細書で提供される。ユニバーサルアダプターを含む循環腫瘍核酸フラグメントを含む組成物であって、循環腫瘍核酸は、乳癌、膀胱癌または大腸癌に由来するものであった、組成物。

いくつかの実施形態において、ユニバーサルアダプターを含む循環腫瘍核酸フラグメントを含み、循環腫瘍核酸が、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）を有する個体の血液のサンプルまたはそのフラクションに由来するものであった、本発明の組成物が本明細書で提供される。これらの方法は、典型的には、ユニバーサルアダプターを含むｃｔＤＮＡフラグメントの形成を含む。さらに、このような方法は、典型的には、複数の核酸のクローン集合を含み、クローン集合が、循環遊離核酸のサンプルから作成されたアンプリコンを含み、ｃｔＤＮＡである、固体支持体、特に、高スループットスクリーニングのための固体支持体の形成を含む。本明細書で提供される驚くべき結果に基づく例示的な実施形態において、ｃｔＤＮＡは、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）に由来するものであった。

同様に、固体指示体であって、複数の核酸のクローン集合を含み、クローン集合が、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）を有する固体からの血液のサンプルまたはそのフラクションからの循環遊離核酸のサンプルから作成された核酸フラグメントを含む、固体支持体が、本発明の一実施形態として本明細書で提供される。

特定の実施形態において、異なるクローン集合中の核酸フラグメントが、同じユニバーサルアダプターを含む。このような組成物は、典型的には、本発明の方法において、高スループット配列決定反応中に形成される。

核酸のクローン集合は、２名以上の個体からのサンプルのセットからの核酸フラグメントに由来していてもよい。これらの実施形態において、核酸フラグメントは、サンプルのセットにおけるサンプルに対応する一連の分子バーコードの１つを含む。

詳細な分析方法は、本明細書の分析の章において、ＳＮＶ方法１およびＳＮＶ方法２として本明細書で提供される。本明細書で提供されるいずれかの方法は、本明細書で提供される分析工程をさらに含んでいてもよい。したがって、特定の例では、単一ヌクレオチドバリアントがサンプル中に存在するかどうかを決定する方法は、単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットのそれぞれで、各対立遺伝子決定についての信頼値を特定することを含み、少なくとも一部には遺伝子座についてのリード深度に基づいていてもよい。信頼限界は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％または９９％で設定することができる。信頼限界は、異なる種類の変異について、異なるレベルで設定することができる。

本方法は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、１，０００、１０，０００、２５，０００、５０，０００、１００，０００、２５０，０００、５００，０００または１００万の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットについてのリード深度で行うことができる。

特定の実施形態において、本明細書のいずれかの実施形態の方法は、効率および／またはサイクルあたりのエラー率を決定することを含み、単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座の多重増幅反応のそれぞれの増幅反応について決定される。次いで、効率およびエラー率を使用して、単一バリアント遺伝子座のセットでの単一ヌクレオチドバリアントがサンプル中に存在するかどうかを決定してもよい。分析方法で提供されるＳＮＶ方法２に提供されるさらに詳細な分析工程が、特定の実施形態において、同様に含まれてもよい。

例示的な実施形態において、本明細書のいずれかの方法の中で、単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットは、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）についてＴＣＧＡおよびＣＯＳＭＩＣデータセットにおいて特定された単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座の全てを含む。

本明細書のいずれかの方法の特定の実施形態において、単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットは、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）と関連することが知られている単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座を範囲の下限で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００または１０，０００個、範囲の上限で５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１０，０００、２０，０００および２５，０００個含む。

ｃｔＤＮＡ ＳＮＶ増幅／配列決定ワークフローを含む本明細書のＳＮＶを検出するいずれかの方法において、マルチプレックスＰＣＲについての改良された増幅パラメータを使用してもよい。例えば、増幅反応がＰＣＲ反応である場合、アニーリング温度が、範囲の下限でプライマーのセットのうち少なくとも１０、２０、２５、３０、４０、５０、０６、７０、７５、８０、９０、９５または１００％のプライマーの融点よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０℃高く、範囲の上限で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５℃より高い。

特定の実施形態において、増幅反応がＰＣＲ反応である場合、ＰＣＲ反応中のアニーリング工程の長さは、範囲の下限で１０、１５、２０、３０、４５および６０分、範囲の上限で１５、２０、３０、４５、６０、１２０、１８０または２４０分である。特定の実施形態において、増幅（例えばＰＣＲ反応）におけるプライマー濃度は、１〜１０ｎＭである。さらに、例示的な実施形態において、プライマーのセット中のプライマーは、プライマー二量体形成を最小限にするように設計される。

したがって、増幅工程を含む本明細書のいずれかの方法の一例において、増幅反応はＰＣＲ反応であり、アニーリング温度は、プライマーのセットのプライマーの少なくとも９０％の融点より１〜１０℃高く、ＰＣＲ反応中のアニーリング工程の長さは、１５〜６０分であり、増幅反応におけるプライマー濃度は、１〜１０ｎＭであり、プライマーのセット中のプライマーは、プライマー二量体形成を最小限にするように設計される。この例のさらなる態様において、多重増幅反応は、制限プライマー条件下で行われる。

別の実施形態において、個体からの血液のサンプルまたはそのフラクションから、個体、例えば、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）を有することが疑われる個体についての癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）の診断を裏付ける方法であって、本明細書で提供されるｃｔＤＮＡ ＳＮＶ増幅／配列決定ワークフローを行い、１つ以上の単一ヌクレオチドバリアントが、複数の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座に存在するかどうかを決定することを含む、方法が本明細書で提供される。この実施形態において、以下の要素、記述、ガイドラインまたは規則が適用される。単一ヌクレオチドバリアントが存在しないことは、ステージ１ａ、１ｂまたは２ａの腺癌の診断を裏付けるものであり、単一ヌクレオチドバリアントの存在は、扁平上皮癌またはステージ２ｂまたは３ａの腺癌の診断を裏付けるものであり、および／または１０個以上の単一ヌクレオチドバリアントの存在は、扁平上皮癌またはステージ２ｂまたは３の腺癌の診断を裏付けるものである。

これらの結果は、個体からの肺ＡＤＣおよびＳＣＣサンプルのｃｔＤＮＡ ＳＮＶ増幅／配列決定ワークフローを用いた分析を、ＡＤＣ腫瘍中に見出されるＳＮＶを、特に、ステージ２ｂおよび３ａのＡＤＣ腫瘍について、また特に、任意のステージでのＳＣＣ腫瘍について、特定するための貴重な方法として特定する（図１５および図２０Ａ〜Ｂを参照）。

特定の実施形態において、ＳＮＶを検出するための本明細書の方法を使用して、治療レジメンを指示してもよい。ＡＤＣおよびＳＣＣに関連する特定の変異を標的とする療法が利用可能であり、開発中である（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｃａｎｃｅｒ．１４：５３５−５５１（２０１４）。例えば、Ｌ８５８ＲまたはＴ７９０ＭでのＥＧＦＲ変異の検出は、療法を選択するのに有益な場合がある。エルロチニブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、ＡＺＫ９２９１、ＣＯ−１６８６およびＨＭ６１７１３は、特定のＥＧＦＲ変異を標的とする、米国および臨床試験において承認された現行の療法である。別の例では、ＫＲＡＳにおけるＧ１２Ｄ、Ｇ１２ＣまたはＧ１２Ｖ変異を使用して、セルメチニブとドセタキセルの組み合わせの療法を個体に指示してもよい。別の例として、ＢＲＡＦにおけるＶ６００Ｅの変異を使用して、被験体に、ベムラフェニブ、ダブラフェニブおよびトラメチニブの治療を指示してもよい。

本発明の方法で分析されるサンプルは、特定の例示的な実施形態において、血液サンプル、またはそのフラクションである。本明細書で提供される方法は、特定の実施形態において、特に、ＤＮＡフラグメント、特に、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）において見出される腫瘍ＤＮＡフラグメントを増幅させるように適合される。このようなフラグメントは、典型的には、約１６０ヌクレオチド長である。

無細胞核酸（ｃｆＮＡ）、例えば、ｃｆＤＮＡは、アポトーシス、壊死、オートファジーおよびネクロトーシスなどの細胞死の種々の形態を介して循環中に放出され得ることが当該技術分野で知られている。ｃｆＤＮＡは、フラグメント化され、フラグメントのサイズ分布は、１５０〜３５０ｂｐから１００００ｂｐを超えるものまでさまざまである。（Ｋａｌｎｉｎａら、Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１５年１１月７日；２１（４１）：１１６３６−１１６５３を参照）。例えば、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）患者における血漿ＤＮＡフラグメントのサイズ分布は、１００〜２２０ｂｐ長の範囲に広がっており、頻度数におけるピークは約１６６ｂｐであり、フラグメント中の最も高い腫瘍ＤＮＡ濃度は、１５０〜１８０ｂｐ長である（Ｊｉａｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２：Ｅ１３１７−Ｅ１３２５を参照）。

例示的な実施形態において、細胞片および血小板を遠心分離によって除去した後、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を、ＥＤＴＡ−２Ｎａ管を用いて血液から単離する。ＤＮＡを例えばＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）を用いて抽出するまで、血漿サンプルを−８０℃で保存してもよい（例えば、Ｈａｍａｋａｗａら、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１５；１１２：３５２−３５６）。Ｈａｍａｋａｖａらは、全サンプルの抽出された無細胞ＤＮＡの濃度の中央値が、血漿１ｍｌあたり４３．１ｎｇ（範囲９．５〜１３３８ｎｇ／ｍｌ）であり、変異体頻度範囲が０．００１〜７７．８％であり、中央値が０．９０％であることを報告した。

特定の例示的な実施形態において、サンプルは、腫瘍である。本明細書の教示を考えると、腫瘍から核酸を単離する方法およびこのようなＤＮＡサンプルから核酸ライブラリを作成する方法は、当該技術分野で既知である。さらに、本明細書の教示を考えると、当業者は、ｃｔＤＮＡサンプルに加えてＤＮＡが遊離状態で浮遊している他の液体サンプルなどの他のサンプルから、本明細書の方法に適した核酸ライブラリをどのように作成するかを認識するだろう。

本発明の方法は、特定の実施形態において、典型的には、サンプルから核酸ライブラリを作成し、増幅する工程を含む（すなわち、ライブラリ調製）。ライブラリ調製工程中のサンプルからの核酸は、付随したライゲーションアダプター（ライブラリタグまたはライゲーションアダプタータグ（ＬＴ）と呼ばれることが多い）を有していてもよく、ライゲーションアダプターは、ユニバーサルプライミング配列を含み、続いて、ユニバーサル増幅を含む。一実施形態において、このことは、フラグメント化の後に配列決定ライブラリを作成するように設計された標準的なプロトコルを用いて行われてもよい。一実施形態において、ＤＮＡサンプルは、平滑末端であってもよく、次いで、Ａがその３’末端に付加されていてもよい。Ｔオーバーハングを有するＹアダプターを付加し、ライゲーションしてもよい。いくつかの実施形態において、ＡまたはＴオーバーハング以外の他の粘着末端を使用してもよい。いくつかの実施形態において、他のアダプター、例えば、ループ状ライゲーションアダプターを付加してもよい。いくつかの実施形態において、アダプターは、ＰＣＲ増幅のために設計されたタグを有していてもよい。

本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、ｃｔＤＮＡサンプルにおいてＳＮＶを検出することを含む。例示的な実施形態におけるこのような方法は、増幅工程および配列決定工程を含む（本明細書では「ｃｔＤＮＡ ＳＮＶ増幅／配列決定ワークフロー」と呼ばれることがある）。例示的な例では、ｃｔＤＮＡ増幅／配列決定ワークフローは、個体、例えば、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）を有することが疑われる個体からの血液のサンプルまたはそのフラクションから単離された核酸に対して多重増幅反応を行うことによってアンプリコンのセットを作成することであって、アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンが、単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットの少なくとも１つの単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座、例えば、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）と関連することが知られているＳＮＶ遺伝子座に広がる、作成することと、アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定することであって、このセグメントが単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座を含む、決定することと、を含んでいてもよい。この方法で、この例示的な方法は、サンプル中に存在する単一ヌクレオチドバリアントを決定する。

例示的なｃｔＤＮＡ ＳＮＶ増幅／配列決定ワークフローは、より詳細には、サンプルから作成された核酸ライブラリからのポリメラーゼ、ヌクレオチド三リン酸、核酸フラグメントと、単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座からの有効な距離でそれぞれ結合するプライマーのセット、または単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座を含む有効領域にそれぞれ広がるプライマー対のセットとを合わせることによって増幅反応混合物を形成することを含んでいてもよい。単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座は、例示的な実施形態において、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）と関連することが知られているものである。次いで、増幅反応混合物を増幅条件に供して、好ましくは、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）と関連することが知られている、単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットの少なくとも１つの単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座を含むアンプリコンのセットを作成することと、アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定することであって、セグメントが単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座を含む、決定すること。

プライマーの結合の有効距離は、ＳＮＶ遺伝子座の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５または１５０塩基対以内であってもよい。一対のプライマーが広がる有効範囲は、典型的には、ＳＮＶを含み、典型的には１６０塩基対以下であり、１５０、１４０、１３０、１２５、１００、７５、５０または２５塩基対以下であってもよい。他の実施形態において、プライマー対が広がる有効範囲は、ＳＮＶ遺伝子座から範囲の下限で２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、１００、１１０、１２０、１２５、１３０、１４０または１５０ヌクレオチド、範囲の上限で２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、１００、１１０、１２０、１２５、１３０、１４０、または１５０、１６０、１７０、１７５または２００である。

本明細書の方法で使用するためのＳＮＶを検出するためにｃｔＤＮＡ ＳＮＶ増幅／配列決定ワークフローで使用可能な増幅方法に関するさらなる詳細は、本明細書の他の章に提供される。

ＳＮＶコール分析
本明細書で提供される方法を行っている間、核酸配列決定データが、タイル化マルチプレックスＰＣＲによって作成されるアンプリコンについて作成される。このデータを分析して、特定の信頼限界内で、変異（例えば、ＳＮＶ）が標的遺伝子中に存在するかどうかを決定するように使用および／または適合させ得るアルゴリズム設計ツールが利用可能である。

配列決定リードは、社内ツールを使用してデマルチプレックスされ、Ｂｕｒｒｏｗｓ−ＷｈｅｅｌｅｒアラインメントソフトウェアのＢｗａ ｍｅｍ関数（ＢＷＡ、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、ｈｇ１９ゲノムに対するペアマージリードを用い、シングルエンドモードでマッピングされてもよい（Ｌｉ Ｈ．およびＤｕｒｂｉｎ Ｒ．（２０１０）Ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｌｏｎｇ−ｒｅａｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｅｐｕｂ．［ＰＭＩＤ：２００８０５０５］を参照。）増幅統計ＱＣは、全リード、マッピングされたリードの数、標的上のマッピングされたリードの数および計測されたリードの数を分析することによって行うことができる。

特定の実施形態において、核酸配列決定データの検出からＳＮＶを検出する任意の分析方法を、ＳＮＶを検出するか、またはＳＮＶが存在するかどうかを決定する工程を含む本発明に係る本発明の方法と共に使用してもよい。特定の例示的な実施形態において、以下のＳＮＶ方法１を利用する本発明の方法を使用する。他のなおさらなる例示的な実施形態において、ＳＮＶを検出するか、またはＳＮＶがＳＮＶ遺伝子座に存在するかどうかを決定する工程を含む本発明の方法は、以下のＳＮＶ方法２を利用する。

ＳＮＶ方法１：この実施形態に関して、バックグラウンドエラーモデルは、通常の血漿サンプルを用いて構築され、ランに特有のアーチファクトを考慮するために同じ配列決定ランで配列決定された。特定の実施形態において、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、または２５０個より多い通常の血漿サンプルを同じ配列決定ランで分析する。特定の例示的な実施形態において、２０、２５、４０または５０個の通常の血漿サンプルを同じ配列決定ランで分析する。カットオフを超える通常のバリアント対立遺伝子頻度の中央値を有するノイズ位置を除去する。例えば、このカットオフは、特定の実施形態において、０．１％、０．２％、０．２５％、０．５％、１％、２％、５％または１０％より大きい。特定の例示的な実施形態において、０．５％を超える通常のバリアント対立遺伝子頻度の中央値を有するノイズ位置を除去する。ノイズおよび混入を考慮するために、外れ値のサンプルをこのモデルから繰り返し除去した。特定の実施形態において、Ｚスコアが５、６、７、８、９または１０を超えるサンプルは、データ分析から除去する。全てのゲノム遺伝子座のそれぞれの塩基置換について、リード深度で重み付けされた平均および誤差の標準偏差を計算する。少なくとも５個のバリアントリードを有し、バックグラウンドエラーモデルに対するＺスコアが１０である、腫瘍または細胞を含まない血漿サンプルの位置は、例えば、候補変異としてコールすることができる。

ＳＮＶ方法２：この実施形態に関して、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）は、血漿ｃｔＤＮＡデータを用いて決定される。ＰＣＲプロセスは、確率過程としてモデリングされ、トレーニングセットを用いてパラメータを推定し、別個の試験セットについて最終的なＳＮＶコールを作成する。複数のＰＣＲサイクルにわたる誤差の伝播が決定され、バックグラウンドエラーの平均および分散が計算され、例示的な実施形態において、バックグラウンドエラーは、実際の変異とは区別される。

各塩基について、以下のパラメータが推定される。
ｐ＝効率（各リードが各サイクル中に複製される確率）
ｐ_ｅ＝変異型ｅについてのサイクルあたりのエラー率（ｅ型のエラーが起こる確率）
Ｘ_０＝分子の初期数

一連のＰＣＲプロセスにわたってリードが複製されるにつれて、発生するエラーが多くなる。したがって、リードのエラープロファイルは、元のリードからの分離度によって決定される。作成されるまでにｋ回の複製を経た場合、リードを第ｋ世代と呼ぶ。

各塩基について、以下の変数を定義してみよう。
Ｘ_ｉｊ＝ＰＣＲサイクルｊで作成される第ｉ世代のリードの数
Ｙ_ｉｊ＝サイクルｊ終了時の第ｉ世代のリードの総数
Ｘ_ｉｊ ^ｅ＝ＰＣＲサイクルｊで作成される、変異ｅを有する第ｉ世代のリードの数

さらに、正常な分子Ｘ_０に加えて、ＰＣＲプロセス開始時に変異ｅを有するさらなるｆ_ｅＸ_０分子が存在する場合（したがって、ｆｅ／（１＋ｆｅ）は、初期混合物中の変異した分子の分率であろう）。

サイクルｊ−１での第ｉ−１世代のリードの総数を考えると、サイクルｊで作成される第ｉ世代のリードの数は、サンプルサイズがＹ_{ｉ−１，ｊ−１}であり、確率パラメータがｐである二項分布を有する。したがって、Ｅ（Ｘ_ｉｊ，｜Ｙ_{ｉ−１，ｊ−１}，ｐ）＝ｐＹ_{ｉ−１，ｊ−１}およびＶａｒ（Ｘ_ｉｊ，｜Ｙ_{ｉ−１，ｊ−１}，ｐ）＝ｐ（１−ｐ）Ｙ_{ｉ−１，ｊ−１}である。

本願発明者らは、

も有する。したがって、再帰、シミュレーションまたは同様の方法によって、Ｅ（Ｘ_ｉｊ）を決定することができる。同様に、ｐの分布を用いて、Ｖａｒ（Ｘ_ｉｊ）＝Ｅ（Ｖａｒ（Ｘ_ｉｊ，｜ｐ））＋Ｖａｒ（Ｅ（Ｘ_ｉｊ，｜ｐ））を決定することができる。

最後に、Ｅ（Ｘｉ_ｊ ^ｅ｜Ｙ_{ｉ−１，ｊ−１}，ｐ_ｅ）＝ｐ_ｅＹ_{ｉ−１，ｊ−１}およびＶａｒ（Ｘ_ｉｊ ^ｅ｜Ｙ_{ｉ−１，ｊ−１}，ｐ）＝ｐ_ｅ（１−ｐ_ｅ）Ｙ_{ｉ−１，ｊ−１}であり、これらを使用して、Ｅ（Ｘ_ｉｊ ^ｅ）およびＶａｒ（Ｘ_ｉｊ ^ｅ）を計算することができる。

特定の実施形態において、ＳＮＶ方法２は、以下のように行われる。

ａ）トレーニングデータセットを用い、ＰＣＲ効率およびサイクルあたりのエラー率を推定する。

ｂ）工程（ａ）で推定された効率の分布を用い、各塩基での試験データセットについての開始時分子の数を推定する。

ｃ）必要に応じて、工程（ｂ）で推定された開始時分子の数を用いて、試験データセットについての効率の推定値を更新する。

ｄ）工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）で推定された試験セットデータおよびパラメータを用い、（実際の変異分子の初期の割合からなる検索空間について）分子の総数、バックグラウンドエラー分子および実際の変異分子についての平均および分散を推定する。

ｅ）総分子における総エラー分子の数（バックグラウンドエラーおよび実際の変異）に対する分布をフィッティングして、検索空間におけるそれぞれの実際の変異の割合の尤度を計算する。

ｆ）最も可能性の高い実際の変異の割合を決定し、工程（ｅ）からのデータを用いて信頼性を計算する。

信頼性のカットオフを使用して、ＳＮＶ遺伝子座でＳＮＶを特定することができる。例えば、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の信頼性カットオフを使用して、ＳＮＶをコールすることができる。

例示的なＳＮＶ方法２のアルゴリズム
このアルゴリズムは、トレーニングセットを用いて効率およびサイクルあたりのエラー率を推定することから開始する。ｎは、ＰＣＲサイクルの総数を示す。

各塩基ｂでのリードＲ_ｂの数は、（１＋ｐ_ｂ）^ｎＸ_０によって概算することができ、ここで、ｐ_ｂは、塩基ｂでの効率である。（Ｒ_ｂ／Ｘ_０）^１／ｎを使用して、１＋ｐ_ｂを概算することができる。次いで、全てのトレーニングサンプルにわたって、ｐ_ｂの平均および標準偏差を決定して、各塩基についての確率分布のパラメータ（例えば、通常分布、ベータ分布または同様の分布）を推定することができる。

同様に、各塩基ｂでのエラーｅのリードＲ_ｂ ^ｅの数を使用して、ｐ_ｅを推定することができる。全てのトレーニングサンプルにわたってエラー率の平均および標準偏差を決定した後、その確率分布（例えば、通常分布、ベータ分布または同様の分布）を概算し、この平均および標準偏差の値を用い、そのパラメータが推定される。

次に、試験データについて、各塩基での初期の開始時コピーを

であると推定し、ここで、ｆ（．）は、トレーニングセットから推定された分布である。

式中、ｆ（．）は、トレーニングセットから推定された分布である。

したがって、このパラメータを推定し、これを確率過程で使用する。次に、これらの推定値を使用することによって、各サイクルで作成された分子の平均および分散を推定することができる（なお、通常の分子、エラー分子および変異分子について別個にこれを行う）。

最後に、確率法（例えば、最大尤度または同様の方法）を使用することによって、エラー、変異および通常の分子の分布に最も良く適合する最良のｆ_ｅ値を決定することができる。より具体的には、最終的なリードにおける種々のｆ_ｅ値について、全分子に対するエラー分子の予想比率を推定し、これらの値それぞれについての本願発明者らのデータの尤度を決定し、次いで、最大尤度を有する値を選択する。

プライマーテールは、普遍的にタグ化されたライブラリからのフラグメント化されたＤＮＡの検出を改善することができる。ライブラリタグおよびプライマーテールが、相同配列を含有する場合、ハイブリダイゼーションを改善することができ（例えば、融点（Ｔｍ）を下げる）、プライマー標的配列の一部のみがサンプルＤＮＡプライマーフラグメント中にある場合、プライマーを伸長することができる。いくつかの実施形態において、１３個以上の標的特異性塩基対が使用されてもよい。いくつかの実施形態において、１０〜１２個の標的特異性塩基対が使用されてもよい。いくつかの実施形態において、８〜９個の標的特異性塩基対が使用されてもよい。いくつかの実施形態において、６〜７個の標的特異性塩基対が使用されてもよい。

一実施形態において、ライブラリは、サンプル中のＤＮＡフラグメントの末端に、またはサンプルから単離されたＤＮＡから作成されたＤＮＡフラグメントの末端にアダプターをライゲーションすることによって、上のサンプルから作成される。次いで、フラグメントを、例えば、以下の例示的なプロトコルにしたがって、ＰＣＲを使用して増幅することができる。

９５℃で２分間；１５×［９５℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で２０秒間］、６８℃で２分間、４℃で保持。

多くのキットおよび方法は、その後の増幅（例えば、クローン増幅）およびその後の配列決定のためのユニバーサルプライマー結合部位を含む核酸ライブラリの作成についての技術分野で既知である。アダプターのライゲーションを促進しやすくするために、ライブラリの調製および増幅は、末端修復およびアデニル化（すなわち、Ａテーリング）を含んでいてもよい。小さな核酸フラグメント（特に、循環遊離ＤＮＡ）からライブラリを調製するように特に適合されたキットは、本明細書で提供される方法を実施するのに有用な場合がある。例えば、Ｂｉｏｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（）から入手可能なＮＥＸＴｆｌｅｘ Ｃｅｌｌ ＦｒｅｅキットまたはＮａｔｅｒａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｎａｔｅｒａ，Ｉｎｃ．サンカルロス、ＣＡから入手可能）。しかし、このようなキットは、典型的には、本明細書で提供される方法の増幅工程および配列決定工程のためにカスタマイズされたアダプターを含むように改変される。アダプターライゲーションは、ＡＧＩＬＥＮＴ ＳＵＲＥＳＥＬＥＣＴキット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＣＡ）中に見出されるライゲーションキットなどの市販のキットを用いて行うことができる。

次いで、サンプル、特に、本発明の方法のための循環遊離ＤＮＡサンプルから単離されたＤＮＡから作成した核酸ライブラリの標的領域を増幅させる。この増幅のために、一連のプライマーまたはプライマー対は、範囲の下限で５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１２５、１５０、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５，０００または５０，０００プライマー、範囲の上限で１５、２０、２５、５０、１００、１２５、１５０、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、５０，０００、６０，０００、７５，０００または１００，０００プライマーを含んでいてもよく、それぞれが、一連のプライマー結合部位の１つに結合する。

プライマー設計は、Ｐｒｉｍｅｒ３と共に作成されてもよい（Ｕｎｔｅｒｇｒａｓｓｅｒ Ａ、Ｃｕｔｃｕｔａｃｈｅ Ｉ、Ｋｏｒｅｓｓａａｒ Ｔ、Ｙｅ Ｊ、Ｆａｉｒｃｌｏｔｈ ＢＣ、Ｒｅｍｍ Ｍ、Ｒｏｚｅｎ ＳＧ（２０１２）「Ｐｒｉｍｅｒ３ − ｎｅｗ ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ．」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４０（１５）：ｅ１１５およびＫｏｒｅｓｓａａｒ Ｔ，Ｒｅｍｍ Ｍ（２００７）「Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ ｄｅｓｉｇｎ ｐｒｏｇｒａｍ Ｐｒｉｍｅｒ３．」Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３（１０）：１２８９−９１）ソースコードは、ｐｒｉｍｅｒ３．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）。プライマー特異性は、ＢＬＡＳＴによって評価され、これを既存のプライマー設計パイプライン基準に追加してもよい。

プライマー特異性は、ｎｃｂｉ−ｂｌａｓｔ−２．２．２９＋パッケージからのＢＬＡＳＴｎプログラムを用いて決定することができる。タスクオプション「ｂｌａｓｔｎ−ｓｈｏｒｔ」を使用して、ｈｇ１９ヒトゲノムに対するプライマーをマッピングしてもよい。プライマー設計は、プライマーがゲノムに対して１００ヒット未満を有し、トップヒットが、そのゲノムの標的相補性プライマー結合領域であり、他のヒットよりも少なくとも２スコア高い場合に、「特異的」であると決定することができる（スコアは、ＢＬＡＳＴｎプログラムによって定義される）。このことは、そのゲノムに対して固有のヒットを有し、ゲノム全体に多くの他のヒットを有しないように行うことができる。

最終的に選択されたプライマーは、ＩＧＶ（Ｊａｍｅｓ Ｔ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｈｅｌｇａ Ｔｈｏｒｖａｌｄｓｄｏｔｔｉｒ、Ｗｅｎｄｙ Ｗｉｎｃｋｌｅｒ、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｇｕｔｔｍａｎ、Ｅｒｉｃ Ｓ．Ｌａｎｄｅｒ、Ｇａｄ Ｇｅｔｚ、Ｊｉｌｌ Ｐ．Ｍｅｓｉｒｏｖ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９、２４−２６（２０１１））およびＵＣＳＣブラウザ（Ｋｅｎｔ ＷＪ、Ｓｕｇｎｅｔ ＣＷ、Ｆｕｒｅｙ ＴＳ、Ｒｏｓｋｉｎ ＫＭ、Ｐｒｉｎｇｌｅ ＴＨ、Ｚａｈｌｅｒ ＡＭ、Ｈａｕｓｓｌｅｒ Ｄ．Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｂｒｏｗｓｅｒ ａｔ ＵＣＳＣ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００２年６月；１２（６）：９９６−１００６）で、検証のためのベッドファイルおよびカバレッジマップを用いて視覚化することができる。

本発明の方法は、特定の実施形態において、増幅反応混合物を形成することを含む。この反応混合物は、典型的には、サンプルから作成された核酸ライブラリからのポリメラーゼ、ヌクレオチド三リン酸、核酸フラグメントと、ＳＮＶを含む標的領域に特異的な順方向プライマーおよび逆方向プライマーのセットとを合わせることによって作成される。本明細書で提供される反応混合物は、例示的な実施形態において、それ自体が本発明の別個の態様を形成する。

本発明に有用な増幅反応混合物は、核酸増幅、特にＰＣＲ増幅に関する技術分野で既知の構成要素を含む。例えば、反応混合物は、典型的には、ヌクレオチド三リン酸、ポリメラーゼおよびマグネシウムを含む。本発明に有用なポリメラーゼは、増幅反応に使用可能な任意のポリメラーゼ、特に、ＰＣＲ反応に有用なものを含んでいてもよい。特定の実施形態において、ホットスタートＴａｑポリメラーゼは、特に有用である。本明細書で提供される方法を実施するのに有用な増幅反応混合物、例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄマスターミックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、ＣＡ）は、市販されている。

ＰＣＲの増幅（例えば、温度サイクル）条件は、当該技術分野で周知である。本明細書で提供される方法は、標的核酸（例えば、ライブラリからの標的核酸）を増幅させる任意のＰＣＲサイクル条件を含んでいてもよい。非限定的な例示的なサイクル条件は、本明細書の実施例の章で提供される。

ＰＣＲを実施するときに可能な多くのワークフローが存在し、本明細書に開示する方法に典型的ないくつかのワークフローが本明細書で提供される。本明細書で概説される工程は、他の可能な工程を除外することを意味しておらず、本明細書に記載される工程のいずれかが本方法が適切に機能するのに必要であることを暗示するものでもない。多数のパラメータの変動または他の改変は、文献で既知であり、本発明の本質に影響を与えることなく行うことができる。

本明細書で提供される方法の特定の実施形態において、アンプリコン（例えば、アウタープライマー標的アンプリコン）の少なくとも一部、例示的な例では全配列が、決定される。アンプリコンの配列を決定する方法は、当該技術分野で既知である。当該技術分野で既知の配列決定方法のいずれか、例えば、サンガー配列決定は、このような配列の決定に使用することができる。例示的な実施形態において、高スループット次世代配列決定技術（本明細書では、超並列配列決定技術とも呼ばれる）、例えば、限定されないが、ＭＹＳＥＱ（ＩＬＬＵＭＩＮＡ）、ＨＩＳＥＱ（ＩＬＬＵＭＩＮＡ）、ＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）、ＧＥＮＯＭＥ ＡＮＡＬＹＺＥＲ ＩＬＸ（ＩＬＬＵＭＩＮＡ）、ＧＳ ＦＬＥＸ＋（ＲＯＣＨＥ ４５４）で使用されるものを、本明細書で提供される方法によって作られるアンプリコンを配列決定するために使用することができる。

高スループット遺伝子シーケンサは、個体からの特有のサンプルを特定するためのバーコード化（すなわち、特徴的な核酸配列を用いたサンプルタグ化）の使用に合うように修正可能であり、それにより、ＤＮＡシーケンサの１回のランにおいて複数サンプルの同時分析を可能にする。ライブラリ調製（または目的の他の核酸調製）においてゲノムの所与の領域が配列決定される回数（リード数）は、目的のゲノム中のその配列のコピー数（またはｃＤＮＡを含有する調製の場合には発現レベル）に比例するだろう。増幅効率におけるバイアスは、このような定量的な決定において考慮されてもよい。

標的遺伝子
例示的な実施形態における本発明の標的遺伝子は、癌関連遺伝子であり、多くの例示的な実施形態において、癌関連遺伝子である。癌関連遺伝子（例えば、癌関連遺伝子または膀胱癌関連遺伝子または大腸癌関連遺伝子）は、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または大腸癌）のリスクの変化または癌の予後の変化に関連する遺伝子を指す。癌を促進する例示的な癌関連遺伝子としては、癌遺伝子、細胞増殖、浸潤または転移を促進する遺伝子、アポトーシスを阻害する遺伝子、および血管新生促進遺伝子が挙げられる。癌を阻害する癌関連遺伝子としては、限定されないが、腫瘍抑制遺伝子、細胞増殖、浸潤または転移を阻害する遺伝子、アポトーシスを促進する遺伝子、および抗血管新生遺伝子が挙げられる。

変異検出方法の一実施形態は、標的となる遺伝子の領域の選択から始まる。既知の変異を有する領域を使用して、変異を増幅させ、検出するためのｍＰＣＲ−ＮＧＳのためのプライマーを開発する。

本明細書で提供される方法を使用して、実質的に任意の種類の変異、特に、癌に関連することが知られている変異を検出することができ、最も特定的には、本明細書で提供される方法は、癌、特に、乳癌、膀胱癌または大腸癌に関連する変異（特にＳＮＶ）を対象とする。例示的なＳＮＶは、以下の遺伝子のうちの１つ以上であってもよい。ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＡＬＫ、ＭＥＴ、ＲＯＳ１、ＮＴＲＫ１、ＲＥＴ、ＨＥＲ２、ＤＤＲ２、ＰＤＧＦＲＡ、ＫＲＡＳ、ＮＦ１、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＭＥＫ１、ＮＯＴＣＨ１、ＭＬＬ２、ＥＺＨ２、ＴＥＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＳＯＸ２、ＭＹＣ、ＫＥＡＰ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＮＲＧ１、ＴＰ５３、ＬＫＢ１およびＰＴＥＮ、これらは、種々の肺癌サンプルにおいて、変異しているか、またはコピー数が増加しているか、または他の遺伝子に融合しているか、およびこれらの組み合わせであることが特定されている（Ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒｓ：ａ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｓｅｔ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｈｅｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ．２０１４年８月 １４（８）：５３５−５５１）。別の例では、遺伝子のリストは、上に列挙されたものであり、ＳＮＶは、例えば、Ｃｈｅｎらの参考文献で報告されている。

増幅（例えばＰＣＲ）反応混合物：
本発明の方法は、特定の実施形態において、増幅反応混合物を形成することを含む。この反応混合物は、典型的には、サンプルから作成された核酸ライブラリからのポリメラーゼ、ヌクレオチド三リン酸、核酸フラグメントと、一連の順方向の標的特異性アウタープライマーおよび第１鎖逆方向アウターユニバーサルプライマーとを合わせることによって形成される。別の例示的な実施形態は、順方向の標的特異性アウタープライマーの代わりに、順方向の標的特異性インナープライマーと、核酸ライブラリからの核酸フラグメントの代わりに、アウタープライマーを用いる第１のＰＣＲ反応からのアンプリコンとを含む反応混合物である。本明細書で提供される反応混合物は、例示的な実施形態において、それ自体が本発明の別個の態様を形成する。例示的な実施形態において、反応混合物は、ＰＣＲ反応混合物である。ＰＣＲ反応混合物は、典型的には、マグネシウムを含む。

いくつかの実施形態において、反応混合物は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、マグネシウム、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ＴＭＡＣの濃度は、２０〜７０ｍＭ（境界値を含む）である。任意の特定の理論に束縛されることを意味しないが、ＴＭＡＣは、ＤＮＡに結合し、二本鎖を安定化し、プライマー特異性を増加させ、および／または異なるプライマーの融点を等しくすると考えられる。いくつかの実施形態において、ＴＭＡＣは、異なる標的に対する増幅産物の量の均一性を高める。いくつかの実施形態において、マグネシウム（例えば、塩化マグネシウム由来のマグネシウム）の濃度は、１〜８ｍＭである。

多数の標的のマルチプレックスＰＣＲに使用される多数のプライマーは、多くのマグネシウムをキレート化し得る（プライマー中の２個のリン酸基が、１個のマグネシウムをキレート化する）。例えば、プライマー由来のリン酸基の濃度が約９ｍＭであるように十分なプライマーを使用する場合、プライマーは、有効マグネシウム濃度を約４．５ｍＭまで減らし得る。いくつかの実施形態において、高濃度のマグネシウムがＰＣＲのエラー（例えば、非標的遺伝子座の増幅）を引き起こす可能性があるため、ＥＤＴＡを使用して、ポリメラーゼの補因子として利用可能なマグネシウムの量を減らす。いくつかの実施形態において、ＥＤＴＡの濃度は、利用可能なマグネシウムの量を１〜５ｍＭ（例えば、３〜５ｍＭ）まで減らす。

いくつかの実施形態において、ｐＨは、７．５〜８．５、例えば、７．５〜８、８〜８．３または８．３〜８．５（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、Ｔｒｉｓは、例えば、１０〜１００ｍＭ、例えば、１０〜２５ｍＭ、２５〜５０ｍＭ、５０〜７５ｍＭまたは２５〜７５ｍＭの濃度（境界値を含む）で使用される。いくつかの実施形態において、これらの濃度のいずれかのＴｒｉｓは、７．５〜８．５のｐＨで使用される。いくつかの実施形態において、ＫＣｌと（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４の組み合わせ、例えば、５０〜１５０ｍＭのＫＣｌと１０〜９０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４（境界値を含む）が使用される。いくつかの実施形態において、ＫＣｌの濃度は、０〜３０ｍＭ、５０〜１００ｍＭまたは１００〜１５０ｍＭ（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４の濃度は、１０〜５０ｍＭ、５０〜９０ｍＭ、１０〜２０ｍＭ、２０〜４０ｍＭ、４０〜６０ｍＭまたは６０〜８０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、アンモニウム［ＮＨ_４ ^＋］濃度は、０〜１６０ｍＭ、例えば、０〜５０、５０〜１００または１００〜１６０ｍＭ（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、カリウム濃度とアンモニウム濃度の合計（［Ｋ^＋］＋［ＮＨ_４ ^＋］）は、０〜１６０ｍＭ、例えば、０〜２５、２５〜５０、５０〜１５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１２５または１２５〜１６０ｍＭ（境界値を含む）である。［Ｋ^＋］＋［ＮＨ_４ ^＋］＝１２０ｍＭである例示的な緩衝液は、２０ｍＭのＫＣｌと５０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４である。いくつかの実施形態において、緩衝液は、２５〜７５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．２〜８）、０〜５０ｍＭのＫＣｌ、１０〜８０ｍＭの硫酸アンモニウムおよび３〜６ｍＭのマグネシウム（境界値を含む）を含む。いくつかの実施形態において、緩衝液は、２５〜７５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７〜８．５）、３〜６ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０〜５０ｍＭのＫＣｌおよび２０〜８０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４（境界値を含む）を含む。いくつかの実施形態において、１００〜２００単位／ｍＬのポリメラーゼが使用される。いくつかの実施形態において、１００ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、３ｍＭのＭｇＣｌ_２、７．５ｎＭのライブラリ中の各プライマーおよびｐＨ８．１の最終体積２０ｕｌ中の７ｕｌのＤＮＡテンプレートが使用される。

いくつかの実施形態において、クラウディング剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、例えば、ＰＥＧ８，０００）またはグリセロールが使用される。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ８，０００）の量は、０．１〜２０％、例えば、０．５〜１５％、１〜１０％、２〜８％または４〜８％（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、グリセロールの量は、０．１〜２０％、例えば、０．５〜１５％、１〜１０％、２〜８％または４〜８％（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、クラウディング剤は、低ポリメラーゼ濃度および／またはより短いアニーリング時間のいずれかを使用することを可能にする。いくつかの実施形態において、クラウディング剤は、ＤＯＲの均一性を改善し、および／またはドロップアウト（検出されない対立遺伝子）を減らす。ポリメラーゼ。いくつかの実施形態において、プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼ、プルーフリーディング活性を有さない（または無視可能な）ポリメラーゼ、またはプルーフリーディング活性を有するポリメラーゼとプルーフリーディング活性を有さない（または無視可能な）ポリメラーゼの混合物が使用される。いくつかの実施形態において、ホットスタートポリメラーゼ、非ホットスタートポリメラーゼ、またはホットスタートポリメラーゼと非ホットスタートポリメラーゼの混合物が使用される。いくつかの実施形態において、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼが使用される（例えば、ＱＩＡＧＥＮカタログ番号２０３２０３を参照）。いくつかの実施形態において、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼが使用される。いくつかの実施形態において、反応混合物中に過剰なテンプレートが存在する場合、かつ長い産物を増幅する場合に効率的なＰＣＲ増幅を提供する高忠実度ポリメラーゼであるＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼが使用される（Ｔａｋａｒａ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、マウンテンビュー、ＣＡ）。いくつかの実施形態において、ＫＡＰＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼまたはＫＡＰＡ Ｔａｑ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼが使用される。これらは、好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓの単一サブユニット野生型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼに由来する。ＫＡＰＡ ＴａｑおよびＫＡＰＡ Ｔａｑ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、５’−３’ポリメラーゼ活性および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するが、３’から５’方向のエキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性は有しない（例えば、ＫＡＰＡ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳカタログ番号ＢＫ１０００を参照）。いくつかの実施形態において、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼが使用される。このポリメラーゼは、超好熱性古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来の高温安定性ＤＮＡポリメラーゼである。この酵素は、５’→３’方向において、ヌクレオチドから二本鎖ＤＮＡへのテンプレート依存性重合を触媒する。Ｐｆｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、３’→５’エキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性も示し、このポリメラーゼがヌクレオチド組み込みエラーを修正することを可能にする。このポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さない（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＥＰ０５０１を参照）。いくつかの実施形態において、Ｋｌｅｎｔａｑ１が使用される。これは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメント類似体であり、エキソヌクレアーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性を有しない（例えば、ＤＮＡ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，Ｉｎｃ、セントルイス、ミズーリ、カタログ番号１００を参照）。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、ＰＨＵＳＩＯＮ ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＰＨＵＳＩＯＮ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０５３０Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．）またはＰＨＵＳＩＯＮ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０５３５Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．）である。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、Ｑ５（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｍ０４９１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．）またはＱ５（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｍ０４９３Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．）である。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０２０３Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．）である。

いくつかの実施形態において、５〜６００単位／ｍＬ（反応体積１ｍＬあたりの単位数）、例えば、５〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００または５００〜６００単位／ｍＬ（境界値を含む）のポリメラーゼが使用される。

ＰＣＲ方法
いくつかの実施形態において、ホットスタートＰＣＲは、ＰＣＲ熱サイクル前の重合を減らすか、または防止するために使用される。例示的なホットスタートＰＣＲ方法としては、ＤＮＡポリメラーゼの初期抑制、または反応混合物がより高温に達するまでの反応構成要素の反応の物理的な分離を含む。いくつかの実施形態において、マグネシウムの遅延放出が使用される。ＤＮＡポリメラーゼは、活性のためにマグネシウムイオンを必要とするため、マグネシウムは、化学化合物に結合することによって反応から化学的に分離され、高温でのみ溶液中に放出される。いくつかの実施形態において、阻害剤の非共有結合が使用される。この方法では、ペプチド、抗体またはアプタマーは、低温で酵素に非共有結合し、その活性を阻害する。高温でインキュベートした後、阻害剤が放出され、反応が開始する。いくつかの実施形態において、冷温感受性Ｔａｑポリメラーゼ、例えば、低温ではほとんど活性を有しない修飾ＤＮＡポリメラーゼが使用される。いくつかの実施形態において、化学修飾が使用される。この方法では、分子が、ＤＮＡポリメラーゼの活性部位にあるアミノ酸の側鎖に共有結合する。この分子は、反応混合物を高温でインキュベートすることによって、酵素から放出される。分子が放出されると、酵素が活性化される。

いくつかの実施形態において、核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡサンプル）をテンプレートで組み立てるための量は、２０〜５，０００ｎｇ、例えば、２０〜２００、２００〜４００、４００〜６００、６００〜１，０００、１，０００〜１，５００または２，０００〜３，０００ｎｇ（境界値を含む）である。

いくつかの実施形態において、ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｋｉｔが使用される（ＱＩＡＧＥＮカタログ番号２０６１４３）。１００×５０μｌのマルチプレックスＰＣＲ反応について、キットは、２×ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（３ｍＭ ＭｇＣｌ_２の最終濃度を提供する、３×０．８５ｍｌ）、５×Ｑ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１×２．０ｍｌ）およびＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（２×１．７ｍｌ）を含む。ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＭＭ）は、ＫＣｌおよび（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４の組み合わせに加え、テンプレートでのプライマーの局所濃度を増加させるＰＣＲ添加剤Ｆａｃｔｏｒ ＭＰを含む。Ｆａｃｔｏｒ ＭＰは、特異的に結合したプライマーを安定化させ、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによる効率的なプライマー伸長を可能にする。ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの修飾された形態であり、周囲温度でポリメラーゼ活性を有しない。いくつかの実施形態において、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、任意の既存のサーマルサイクラープログラムに組み込むことが可能な、９５℃で１５分間のインキュベーションによって活性化する。

いくつかの実施形態において、１×ＱＩＡＧＥＮ ＭＭ最終濃度（推奨濃度）、７．５ｎＭのライブラリ中の各プライマー、５０ｍＭのＴＭＡＣおよび２０ｕｌの最終体積中の７ｕｌのＤＮＡテンプレートが使用される。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ熱サイクル条件は、９５℃で１０分間（ホットスタート）、９６℃で３０秒間、６５℃で１５分間、７２℃で３０秒間を２０サイクル、その後７２℃で２分間（最終伸長）、次いで４℃で保持を含む。

いくつかの実施形態において、２×ＱＩＡＧＥＮ ＭＭ最終濃度（推奨濃度の２倍）、２ｎＭのライブラリ中の各プライマー、７０ｍＭのＴＭＡＣおよび２０ｕｌの全体積中の７ｕｌのＤＮＡテンプレートが使用される。いくつかの実施形態において、４ｍＭまでのＥＤＴＡも含まれる。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ熱サイクル条件は、９５℃で１０分間（ホットスタート）、９６℃で３０秒間、６５℃で２０、２５、３０、４５、６０、１２０または１８０分間、場合により７２℃で３０秒間を２５サイクル）、その後７２℃で２分間（最終伸長）、次いで４℃で保持を含む。

条件の別の例示的なセットは、セミネスティッドＰＣＲ手法を含む。第１のＰＣＲ反応は、２×ＱＩＡＧＥＮ ＭＭ最終濃度、１．８７５ｎＭのライブラリ中の各プライマー（順方向および逆方向のアウタープライマー）およびＤＮＡテンプレートを含む、２０ｕｌの反応体積を使用する。
熱サイクルパラメータは、９５℃で１０分間、９６℃で３０秒間、６５℃で１分間、５８℃で６分間、６０℃で８分間、６５℃で４分間および７２℃で３０秒間を２５サイクル、次いで７２℃で２分間、次いで４℃で保持を含む。次に、１：２００に希釈された、得られた産物２ｕｌを、第２のＰＣＲ反応のインプットとして使用する。この反応は、１×ＱＩＡＧＥＮ ＭＭ最終濃度、２０ｎＭの各インナー順方向プライマーおよび１ｕＭの逆方向プライマータグを含む、１０ｕｌの反応体積を使用する。熱サイクルパラメータは、９５℃で１０分間、９５℃で３０秒間、６５℃で１分間、６０℃で５分間、６５℃で５分間および７２℃で３０秒間を１５サイクル、次いで７２℃で２分間、次いで４℃で保持を含む。アニーリング温度は、場合により、本明細書で考察されるように、プライマーのいくつかまたは全ての融点より高くてもよい（その全体が本明細書に参考として組み込まれる、２０１５年１０月２０日に出願された米国特許出願第１４／９１８，５４４号を参照）。

融点（Ｔ_ｍ）は、オリゴヌクレオチド（例えばプライマー）およびその完全相補体のＤＮＡ二本鎖の半分（５０％）が解離し、一本鎖ＤＮＡになる温度である。アニーリング温度（Ｔ_Ａ）は、ＰＣＲプロトコルを実行する温度である。従来の方法について、この温度は、通常は、使用するプライマーの最も低いＴ_ｍより５℃低いため、全ての可能な二本鎖に近いものが形成される（その結果、実質的に全てのプライマー分子が、テンプレート核酸に結合する）。これは、高効率ではあるが、より低い温度では、より多くの非特異的反応が生じることが確実である。Ｔ_Ａが低すぎることの結果の１つは、内部の単一塩基ミスマッチまたは部分的アニーリングが許容され得るため、プライマーが真の標的以外の配列にアニーリングし得ることである。本発明のいくつかの実施形態において、Ｔ_ＡはＴ_ｍより高く、所与の瞬間に、標的のわずかな部分のみが、アニーリングされたプライマーを有する（例えば、約１〜５％のみ）。これらが伸長されると、プライマーおよび標的のアニーリングおよび解離の平衡から除去され（伸長は、Ｔ_ｍを７０℃より上まで迅速に増加させるため）、標的の新しい約１〜５％がプライマーを有する。したがって、アニーリングのために反応を長時間行うことによって、サイクルごとにコピーされる標的の約１００％を得ることができる。

種々の実施形態において、アニーリング温度は、非同一プライマーの少なくとも２５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、９５または１００％の融点（例えば、経験的に測定されたか、または計算されたＴ_ｍ）よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３℃から範囲の上限で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３でまたは１５℃高い。種々の実施形態において、アニーリング温度は、非同一プライマーの少なくとも２５、５０、７５、１００、３００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、または全ての融点（例えば、経験的に測定されたか、または計算されたＴ_ｍ）よりも１〜１５℃（例えば、１〜１０、１〜５、１〜３、３〜５、５〜１０、５〜８、８〜１０、１０〜１２または１２〜１５℃（境界値を含む））高い。種々の実施形態において、アニーリング温度は、非同一プライマーの少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％または全ての融点（例えば、経験的に測定されたか、または計算されたＴ_ｍ）よりも１〜１５℃（例えば、１〜１０、１〜５、１〜３、３〜５、３〜８、５〜１０、５〜８、８〜１０、１０〜１２または１２〜１５℃（境界値を含む））高く、アニーリング工程の長さ（ＰＣＲサイクルあたり）は、５〜１８０分間、例えば、１５〜１２０分間、１５〜６０分間、１５〜４５分間または２０〜６０分間（境界値を含む）である。

例示的なマルチプレックスＰＣＲ方法
種々の実施形態において、長いアニーリング時間（本明細書で考察され、実施例１０に例示される通り）および／または低いプライマー濃度を使用する。実際に、特定の実施形態において、制限されたプライマー濃度および／または条件が使用される。種々の実施形態において、アニーリング工程の長さは、範囲の下限で１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または６０分間から、範囲の上限で２０、２５、３０、３５、４０、４５、６０、１２０または１８０分間である。種々の実施形態において、アニーリング工程の長さ（ＰＣＲサイクルあたり）は、３０〜１８０分間である。例えば、アニーリング工程は、３０〜６０分間であってもよく、各プライマーの濃度は、２０、１５、１０または５ｎＭ未満であってもよい。他の実施形態において、プライマー濃度は、範囲の下限で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５ｎＭから、範囲の上限で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５および５０ｎＭである。

高レベルの多重化では、溶液中の多量のプライマーに起因して、溶液が粘性になる場合がある。溶液が粘性すぎる場合、プライマー濃度を、プライマーがテンプレートＤＮＡに結合するのに依然として十分な量まで下げてもよい。種々の実施形態において、１，０００〜１００，０００種類の異なるプライマーが使用され、各プライマーの濃度は、２０ｎＭ未満、例えば１０ｎＭ未満または１〜１０ｎＭ（境界値を含む）である。

コピー数多型（ＣＮＶ）の検出
ＳＮＶおよびインデルに加え、本明細書に記載される早期再発および転移のモニタリングおよび検出の方法も、ＣＮＶの検出から利益を得ることができる。

一態様において、本発明は、一般的に、少なくとも一部には、コピー数多型（例えば、染色体セグメントまたは染色体全体の欠失または重複）の有無を決定する改良された方法に関する。この方法は、特に、関連する染色体セグメントから入手可能なデータが少数であることに起因して、従来の方法を用いて高い特異性および感度で検出することが困難な場合がある小さな欠失または重複を検出するのに有用である。この方法は、改善された分析方法、改善されたバイオアッセイ方法、および改善された分析方法とバイオアッセイ方法の組み合わせを含む。本発明の方法は、試験される細胞または核酸分子のわずかな割合にのみ存在する欠失または重複を検出するのにも使用することができる。このことは、疾患の発生前に（例えば、前癌状態で）、または疾患の早期、例えば、欠失または重複を伴う多数の疾患細胞（例えば癌細胞）が蓄積する前に、欠失または重複を検出することを可能にする。疾患または障害に関連する欠失または重複のさらに正確な検出は、その疾患または障害を診断し、予知し、予防し、遅らせ、安定化させ、または治療するための改善された方法を可能にする。いくつかの欠失または重複は、癌または重篤な知的障害または身体障害と関連することが知られている。

別の態様において、本発明は、一般的に、少なくとも一部には、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）を検出する改善された方法に関する。これらの改善された方法は、改善された分析方法、改善されたバイオアッセイ方法、および改善された分析方法とバイオアッセイ方法の組み合わせを使用する改善された方法を含む。特定の例示的な実施形態において、本方法を使用して、例えば、ＳＮＶが非常に低濃度で（例えば、ＳＮＶ遺伝子座の正常コピーの総数に対して１０％、５％、４％、３％、２．５％、２％、１％、０．５％、０．２５％または０．１％未満で）存在するサンプル（例えば、循環遊離ＤＮＡサンプル）中の癌を検出し、診断し、モニタリングし、またはステージを決定する。すなわち、これらの方法は、特定の例示的な実施形態において、遺伝子座について存在する正常な多型対立遺伝子に対して比較的低い割合の変異またはバリアントが存在するサンプルに特に十分に適している。最後に、コピー数多型を検出するための改善された方法を、単一ヌクレオチドバリアントを検出するための改善された方法と組み合わせた方法が本明細書で提供される。

癌などの疾患の治療の成功は、多くは、早期診断、疾患の正しいステージ決定、有効な治療レジメンの選択、再発を予防または検出するための密接なモニタリングに依存する。癌診断について、組織生検から得られる腫瘍物質の組織学的評価が、最も信頼性の高い方法であると考えられることが多い。しかし、生検に基づくサンプリングの侵襲的性質により、大量スクリーニングおよび定期的なフォローアップには実用的ではない。したがって、本方法は、比較的低コストであり、かつターンアラウンドタイムが速いことが望まれる場合に、非侵襲的に行うことができるという利点を有する。本発明の方法によって使用可能な標的化配列決定は、ショットガン配列決定よりも少ないリード（例えば、４０００万リードではなく、数百リード）を必要とし、それによって、コストを減らす。マルチプレックスＰＣＲおよび使用可能な次世代配列決定は、スループットを増加させ、コストを減らす。

いくつかの例示的な実施形態において、ｃｔＤＮＡにおけるＡＡＩパターンの分析は、腫瘍のクローンアーキテクチャのより詳細な洞察を提供し、その治療応答を予測し、治療戦略を最適化するのに役立つ。したがって、特定の実施形態において、臨床的に発症原因となるＣＮＶおよびＳＮＶを標的とするｍｍＰＣＲ−ＮＧＳパネルが選択される。このようなパネルは、特定の例示的な実施形態において、乳癌、卵巣癌および肺癌において一般的であるように、ＣＮＶが変異負荷の実質的な割合を表す癌を有する患者に特に有用である。

いくつかの実施形態において、本方法は、個体における欠失、重複または単一ヌクレオチドバリアントを検出するために使用される。欠失、重複または単一ヌクレオチドバリアントを有することが疑われる細胞または核酸を含む個体由来のサンプルを分析してもよい。いくつかの実施形態において、サンプルは、欠失、重複または単一ヌクレオチドバリアントを有することが疑われる組織または臓器、例えば、癌性であることが疑われる細胞または塊に由来する。本発明の方法を使用して、欠失、重複または単一ヌクレオチドバリアントを有する細胞と、欠失、重複または単一ヌクレオチドバリアントを有しない細胞とを含む混合物において、１つの細胞または少数の細胞にのみ存在する欠失、重複または単一ヌクレオチドバリアントを検出することができる。いくつかの実施形態において、個体由来の血液サンプルからのｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡが分析される。いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡは、細胞（例えば癌細胞）によって分泌される。いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡは、壊死またはアポトーシスを受けている細胞（例えば癌細胞）によって放出される。本発明の方法を使用して、わずかな割合のｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡ中にのみ存在する欠失、重複または単一ヌクレオチドバリアントを検出することができる。いくつかの実施形態において、胚由来の１つ以上の細胞が試験される。

コピー数多型の有無を決定することに加え、所望な場合に、１つ以上の他の因子を分析してもよい。これらの因子を使用して、診断の精度（例えば、癌の有無または癌のリスク上昇を決定すること、癌を分類すること、または癌のステージを決定すること）または予後の精度を高めることができる。これらの因子は、被験体において有効である可能性が高い特定の療法または治療レジメンを選択するためにも使用することができる。例示的な因子としては、多型または変異の有無、全体または特定のｃｆＤＮＡ、ｃｆＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のレベル変化（増加または減少）、腫瘍画分の変化（増加または減少）、メチル化レベルの変化（増加または減少）、ＤＮＡ完全性の変化（増加または減少）、変化（増加または減少）または代替的なｍＲＮＡスプライシングが挙げられる。

以下の章は、フェージングデータ（例えば、推論または測定されたフェージングデータ）または非フェージングデータを用いて欠失または重複を検出する方法、試験可能なサンプル、サンプル調製、増幅および定量化の方法、遺伝子データをフェージングする方法、検出可能な多型、変異、核酸変化、ｍＲＮＡスプライシングの変化および核酸レベルにおける変化、本方法、他のリスク因子およびスクリーニング方法から得られるデータベース、診断または治療が可能な癌、癌治療、治療を試験するための癌モデル、および治療を処方し、行うための方法を記載する。

フェージングデータを用いて倍数性を決定するための例示的な方法
本発明の方法のいくつかは、一部には、ＣＮＶを検出するためにフェージングデータを用いると、非フェージングデータを用いる場合と比較して、偽陰性率および偽陽性率が減少するという発見に基づく。この改善は、低レベルで存在するＣＮＶを有するサンプルにとって、最大のものである。したがって、フェージングデータは、非フェージングデータを用いる場合（例えば、１つ以上の遺伝子座での対立遺伝子比率を計算するか、または異なる遺伝子座での対立遺伝子比率が、異常な量で同じまたは異なるハプロタイプが存在するようにみえることを示すかどうかを考慮することなく、対立遺伝子比率を集計して、染色体または染色体セグメントにわたる集計値（例えば平均値）を与える方法）と比較して、ＣＮＶ検出の精度を高める。フェージングデータを使用することにより、対立遺伝子比率の測定値と対立遺伝子比率の予測値との間の差が、ノイズに起因するか、またはＣＮＶの存在に起因するかについて、より正確な決定を行うことが可能になる。例えば、ある領域内の遺伝子座の大部分または全てで、対立遺伝子比率の測定値と対立遺伝子比率の予測値との間の差が、サンプルハプロタイプが過剰出現されていることを示す場合、ＣＮＶが存在する可能性が高い。ハプロタイプにおける対立遺伝子間の結合を使用することにより、測定された遺伝子データが、（ランダムノイズではなく）過剰出現しているのと同じハプロタイプに一致するかどうかを決定することができる。これとは対照的に、対立遺伝子比率の測定値と対立遺伝子比率の予測値との間の差が、ノイズ（例えば実験誤差）にのみ起因する場合、いくつかの実施形態において、約半分の時間は、第１のハプロタイプが過剰出現するようにみえ、他方の約半分の時間は、第２のハプロタイプが過剰出現するようにみえる。

いくつかの実施形態において、フェージング遺伝子データを使用して、個体のゲノムにおいて（例えば、１つ以上の細胞のゲノムにおいて、またはｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡにおいて）、第２の相同染色体セグメントと比較して、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現が存在するかどうかを決定する。例示的な過剰出現としては、第１の相同染色体セグメントの重複または第２の相同染色体セグメントの欠失が挙げられる。いくつかの実施形態において、第１の染色体セグメントと相同染色体セグメントが等しい割合で存在するため、過剰出現は存在しない（例えば、二倍体サンプル中の各セグメントの１つのコピー）。いくつかの実施形態において、核酸サンプルにおいて対立遺伝子比率の計算値を、対立遺伝子比率の予測値と比較して、以下にさらに記載するような過剰出現が存在するかどうかを決定する。本明細書において、「第２の相同染色体セグメントと比較した場合の第１の相同染色体セグメント」との句は、染色体セグメントの第１のホモログおよび染色体セグメントの第２のホモログを意味する。

いくつかの実施形態において、本方法は、第１の相同染色体セグメント上の多型遺伝子座のセット中のそれぞれの遺伝子座について、第１の相同染色体セグメント上の遺伝子座に存在する対立遺伝子の同一性を含む、第１の相同染色体セグメントについてのフェージング遺伝子データを得ることと、第２の相同染色体セグメント上の多型遺伝子座のセット中のそれぞれの遺伝子座について、第２の相同染色体セグメント上の遺伝子座に存在する対立遺伝子の同一性を含む、第２の相同染色体セグメントについてのフェージング遺伝子データを得ることと、上述の多型遺伝子座のセット中のそれぞれの遺伝子座にあるそれぞれの対立遺伝子について、個体からの１つ以上の標的細胞および１つ以上の非標的細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡのサンプル中に存在するそれぞれの対立遺伝子の量を含む、測定された遺伝子対立遺伝子データを得ることと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、第１の相同染色体セグメントの過剰出現の程度を示す１つ以上の仮説のセットを列挙することと、上述のそれぞれの仮説について、サンプル中の総ＤＮＡまたはＲＮＡに対する、１つ以上の標的細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡの１つ以上の可能な比率について得られたフェージング遺伝子データから、サンプル中の複数の遺伝子座について予測された遺伝子データを計算することと、それぞれのＤＮＡまたはＲＮＡの可能な比率について、かつ、それぞれの仮説について、サンプルの得られた遺伝子データと、そのＤＮＡまたはＲＮＡの可能な比率について、かつ、その仮説についてのサンプルについて予測される遺伝子データとの間のデータフィッティングを計算する（例えば、コンピュータで計算する）ことと、このデータフィッティングに従い、上述の１つ以上の仮説をランク付けすることと、最も高くランク付けされた仮説を選択することによって、個体からの１つ以上の細胞のゲノム中の第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現の程度を決定することと、を含む。

いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に記載される方法のいずれか、または任意の既知の方法を用いてフェージング遺伝子データを得ることを伴う。いくつかの実施形態において、本方法は、同時に、または任意の順序で連続して、（ｉ）第１の相同染色体セグメント上の多型遺伝子座のセット中のそれぞれの遺伝子座について、第１の相同染色体セグメント上の遺伝子座に存在する対立遺伝子の同一性を含む、第１の相同染色体セグメントについてのフェージング遺伝子データを得ることと、（ｉｉ）第２の相同染色体セグメント上の多型遺伝子座のセット中のそれぞれの遺伝子座について、第２の相同染色体セグメント上の遺伝子座に存在する対立遺伝子の同一性を含む、第２の相同染色体セグメントについてのフェージング遺伝子データを得ることと、（ｉｉｉ）個体からの１つ以上の細胞からのＤＮＡのサンプル中の多型遺伝子座のセット中のそれぞれの遺伝子座についてのそれぞれの対立遺伝子の量を含む、測定された遺伝子対立遺伝子データを得ることと、を伴う。

いくつかの実施形態において、本方法は、サンプルの由来となる少なくとも１つの細胞においてヘテロ接合性である多型遺伝子座のセット中の１つ以上の遺伝子座についての対立遺伝子比率を計算することを伴う。いくつかの実施形態において、特定の遺伝子座についての対立遺伝子比率の計算値は、対立遺伝子の１つの測定量を、その遺伝子座についての全ての対立遺伝子の総測定量によって割り算したものである。いくつかの実施形態において、特定の遺伝子座についての対立遺伝子比率の計算値は、対立遺伝子（例えば、第１の相同染色体セグメント上の対立遺伝子）の１つの測定量を、その遺伝子座についての１つ以上の他の対立遺伝子（例えば、第２の相同染色体セグメント上の対立遺伝子）の測定量によって割り算したものである。対立遺伝子比率の計算値は、本明細書に記載される方法のいずれか、または任意の標準的な方法（例えば、本明細書に記載される対立遺伝子比率の計算値の任意の数学的変換）を用いて計算されてもよい。

いくつかの実施形態において、本方法は、第１の相同染色体セグメントと第２の相同染色体セグメントが同じ割合で存在する場合、ある遺伝子座についての１つ以上の対立遺伝子比率の計算値を、その遺伝子座について予測される対立遺伝子比率と比較することによって、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現が存在するかどうかを決定することを伴う。いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率の予測値は、ある遺伝子座についての可能な複数の対立遺伝子が存在する尤度が等しいと仮定する。ある特定の遺伝子座についての対立遺伝子比率の計算値が、対立遺伝子の１つの測定量をその遺伝子座についての全ての対立遺伝子の総測定量で割り算したものであるいくつかの実施形態において、対応する対立遺伝子比率の予測値は、二対立遺伝子座について０．５であるか、または三対立遺伝子座について１／３である。いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率の予測値は、全ての遺伝子座について同じであり、例えば、全ての遺伝子座について０．５である。いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率の予測値は、ある遺伝子座についての可能な対立遺伝子が存在する尤度、例えば、被験体が属する特定の集合（例えば、被験体の祖先に基づく集合）におけるそれぞれの対立遺伝子の頻度に基づく尤度が異なる場合があると仮定する。このような対立遺伝子頻度は、公的に利用可能である（例えば、ＨａｐＭａｐ Ｐｒｏｊｅｃｔ；Ｐｅｒｌｅｇｅｎ Ｈｕｍａｎ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ；ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＳＮＰ／でウェブ；Ｓｈｅｒｒｙ ＳＴ、Ｗａｒｄ ＭＨ、Ｋｈｏｌｏｄｏｖ Ｍら、ｄｂＳＮＰ：ｔｈｅ ＮＣＢＩ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００１年１月１日；２９（１）：３０８−１１を参照、それぞれ、その全体が参照による本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率の予測値は、第１の相同染色体セグメントの過剰出現の程度を示す特定の仮説について試験される特定の個体について予測される対立遺伝子比率である。例えば、ある特定の個体についての対立遺伝子比率の予測値は、その個体からのフェージング遺伝子データまたは非フェージング遺伝子データ（例えば、非癌性サンプルなどの欠失または重複を有する可能性が低い、その個体からのサンプル）、またはその個体からの１名以上の血縁者からのデータに基づいて決定されてもよい。

いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率の計算値は、（ｉ）第１の相同染色体セグメント上の遺伝子座に存在する対立遺伝子の測定量についての対立遺伝子比率を、その遺伝子座についての全ての対立遺伝子の総測定量で割り算したものが、その遺伝子座についての対立遺伝子比率の予測値より大きい場合、または（ｉｉ）第２の相同染色体セグメント上の遺伝子座に存在する対立遺伝子の測定量についての対立遺伝子比率を、その遺伝子座についての全ての対立遺伝子の総測定量で割り算したものが、その遺伝子座についての対立遺伝子比率の予測値より小さい場合のいずれかの場合、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現の指標である。いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率の計算値は、その遺伝子座についての比率の予測値より顕著に大きいか、または小さい場合にのみ、過剰出現の指標であると考えられる。いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率の計算値は、（ｉ）第１の相同染色体セグメント上の遺伝子座に存在する対立遺伝子の測定量についての対立遺伝子比率を、その遺伝子座についての全ての対立遺伝子の総測定量で割り算したものが、その遺伝子座についての対立遺伝子比率の予測値より小さいか、または等しい場合、または（ｉｉ）第２の相同染色体セグメント上の遺伝子座に存在する対立遺伝子の測定量についての対立遺伝子比率を、その遺伝子座についての全ての対立遺伝子の総測定量で割り算したものが、その遺伝子座についての対立遺伝子比率の予測値より大きいか、または等しい場合のいずれかの場合、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現がないことの指標である。いくつかの実施形態において、対応する比率の予測値に等しい、比率の計算値は、無視される（これらは、過剰出現がないことの指標であるため）。

種々の実施形態において、以下の方法のうち１つ以上を使用して、対立遺伝子比率の計算値のうちの１つ以上を、対応する対立遺伝子比率の予測値と比較する。いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率の計算値が、その差の大きさにかかわらず、特定の遺伝子座についての対立遺伝子比率の予測値を上回るか、または下回るかを決定する。いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率の計算値が、対立遺伝子比率の予測値を上回るか、または下回るかにかかわらず、対立遺伝子比率の計算値と、ある特定の遺伝子座についての対立遺伝子比率の予測値との差の大きさを決定する。いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率の計算値が、対立遺伝子比率の予測値を上回るか、または下回るか、およびある特定の遺伝子座についてのその差の大きさを決定する。いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率の計算値の平均または重み付けされた平均値が、その差の大きさにかかわらず、対立遺伝子比率の予測値の平均または重み付けされた平均値を上回るか、または下回るかを決定する。いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率の計算値の平均または重み付けされた平均値が、対立遺伝子比率の予測値の平均または重み付けされた平均値を上回るか、または下回るかにかかわらず、対立遺伝子比率の計算値の平均または重み付けされた平均値と、対立遺伝子比率の予測値の平均または重み付けされた平均値との差の大きさを決定する。いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率の計算値の平均または重み付けされた平均値が、対立遺伝子比率の予測値の平均または重み付けされた平均値を上回るか、または下回るか、およびその差の大きさを決定する。いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率の計算値と対立遺伝子比率の予測値との差の大きさの平均または重み付けされた平均値を決定する。

いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率の計算値と１つ以上の遺伝子座についての対立遺伝子比率の予測値との差の大きさを使用して、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現が、１つ以上の細胞のゲノム中の第１の相同染色体セグメントの重複または第２の相同染色体セグメントの欠失に起因するものであるかどうかを決定する。

いくつかの実施形態において、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現は、以下の条件のうちの１つ以上が満たされる場合に、存在すると決定される。いくつかの実施形態において、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現の指標である対立遺伝子比率の計算値の数値は、閾値を上回る。いくつかの実施形態において、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現がないことの指標である対立遺伝子比率の計算値の数値は、閾値を下回る。いくつかの実施形態において、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現の指標である対立遺伝子比率の計算値と、対応する対立遺伝子比率の予測値との差の大きさは、閾値を上回る。いくつかの実施形態において、過剰出現の指標である全ての対立遺伝子比率の計算値について、対立遺伝子比率の計算値と対応する対立遺伝子比率の予測値との差の大きさの合計が、閾値を上回る。いくつかの実施形態において、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現がないことの指標である対立遺伝子比率の計算値と、対応する対立遺伝子比率の予測値との差の大きさは、閾値を下回る。いくつかの実施形態において、第１の相同染色体セグメント上に存在する対立遺伝子の測定量についての対立遺伝子比率の計算値の平均または重み付けされた平均値を、その遺伝子座についての全ての対立遺伝子の総測定量で割り算したものが、対立遺伝子比率の予測値の平均または重み付けされた平均値より少なくとも１つの閾値だけ大きい。いくつかの実施形態において、第２の相同染色体セグメント上に存在する対立遺伝子の測定量についての対立遺伝子比率の計算値の平均または重み付けされた平均値を、その遺伝子座についての全ての対立遺伝子の総測定量で割り算したものが、対立遺伝子比率の予測値の平均または重み付けされた平均値より少なくとも１つの閾値だけ小さい。いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率の計算値と、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現について予測される対立遺伝子比率との間のデータフィッティングは、閾値を下回る（良好なデータフィッティングの指標である）。いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率の計算値と、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現がないことについて予測される対立遺伝子比率との間のデータフィッティングは、閾値を上回る（データフィッティング不良の指標である）。

いくつかの実施形態において、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現は、以下の条件のうちの１つ以上が満たされる場合に、存在しないと決定される。いくつかの実施形態において、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現の指標である対立遺伝子比率の計算値の数値は、閾値を下回る。いくつかの実施形態において、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現がないことの指標である対立遺伝子比率の計算値の数値は、閾値を上回る。いくつかの実施形態において、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現の指標である対立遺伝子比率の計算値と、対応する対立遺伝子比率の予測値との差の大きさは、閾値を下回る。いくつかの実施形態において、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現がないことの指標である対立遺伝子比率の計算値と、対応する対立遺伝子比率の予測値との差の大きさは、閾値を上回る。いくつかの実施形態において、第１の相同染色体セグメント上に存在する対立遺伝子の測定量についての対立遺伝子比率の計算値の平均または重み付けされた平均値を、その遺伝子座についての全ての対立遺伝子の総測定量で割り算し、対立遺伝子比率の予測値の平均または重み付けされた平均値を引いたものが、閾値を下回る。いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率の予測値の平均または重み付けされた平均値から、第２の相同染色体セグメント上に存在する対立遺伝子の測定量についての対立遺伝子比率の計算値の平均または重み付けされた平均値を引き算し、その遺伝子座についての全ての対立遺伝子の総測定量で割り算したものが、閾値を下回る。いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率の計算値と、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現について予測される対立遺伝子比率との間のデータフィッティングは、閾値を上回る。いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率の計算値と、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現がないことについて予測される対立遺伝子比率との間のデータフィッティングは、閾値を下回る。いくつかの実施形態において、閾値は、目的のＣＮＶを有することが知られているサンプルおよび／またはＣＮＶを欠くことが知られているサンプルの経験的な試験から決定される。

いくつかの実施形態において、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現が存在するかどうかを決定することは、第１の相同染色体セグメントの過剰出現の程度を示す１つ以上の仮説のセットを列挙することを含む。例示的な仮説では、第１の染色体セグメントと相同な染色体セグメントが等しい割合（二倍体サンプル中の各セグメントの１コピーなど）で存在するため、過剰出現は存在しない。他の例示的な仮説は、１回以上複製される第１の相同染色体セグメント（例えば、第２の相同染色体セグメントのコピー数と比較して、第１の相同染色体セグメントの１、２、３、４、５またはもっと多い過剰なコピー）を含む。別の例示的な仮説は、第２の相同染色体セグメントの欠失を含む。さらに別の例示的な仮説は、第１および第２の相同染色体セグメントの両方の欠失である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの細胞においてヘテロ接合性である遺伝子座についての対立遺伝子比率の予測値は、それぞれの仮説について、その仮説によって示される過剰出現の程度を考慮して、推定される。いくつかの実施形態において、その仮説が正しい尤度は、対立遺伝子比率の計算値と対立遺伝子比率の予測値とを比較することによって計算され、最大の尤度を有する仮説が選択される。

いくつかの実施形態において、試験統計の予測分布（ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）は、各仮説についての対立遺伝子比率の予測値を用いて計算される。いくつかの実施形態において、その仮説が正しい尤度は、対立遺伝子比率の計算値を用いて計算される試験統計と、対立遺伝子比率の予測値を用いて計算される試験統計の予測分布とを比較することによって計算され、最大の尤度を有する仮説が選択される。

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの細胞においてヘテロ接合性である遺伝子座についての対立遺伝子比率の予測値は、第１の相同染色体セグメントについてのフェージング遺伝子データ、第２の相同染色体セグメントについてのフェージング遺伝子データ、およびその仮説によって示される過剰出現の程度を考慮して、推定される。いくつかの実施形態において、その仮説が正しい尤度は、対立遺伝子比率の計算値と対立遺伝子比率の予測値とを比較することによって計算され、最大の尤度を有する仮説が選択される。

混合サンプルの使用
多くの実施形態について、サンプルは、１つ以上の標的細胞および１つ以上の非標的細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡを含む混合サンプルであることが理解されるだろう。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ＣＮＶ（例えば、目的の欠失または重複）を有する細胞であり、非標的細胞は、目的のコピー数多型を有しない細胞である（例えば、目的の欠失または重複を有する細胞と、試験される欠失または重複のいずれも含まない細胞との混合物）。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ある疾患もしくは障害または疾患もしくは障害のリスク上昇に関連する細胞（例えば、癌細胞）であり、非標的細胞は、ある疾患もしくは障害または疾患もしくは障害のリスク上昇に関連しない細胞（例えば、非癌性細胞）である。いくつかの実施形態において、標的細胞は全て同じＣＮＶを有する。いくつかの実施形態において、２つ以上の標的細胞は、異なるＣＮＶを有する。いくつかの実施形態において、標的細胞のうちの１つ以上は、少なくとも１つの他の標的細胞ではみられない、その疾患もしくは障害または疾患もしくは障害のリスク上昇に関連するＣＮＶ、多型または変異を有する。いくつかのそのような実施形態において、サンプルからの全細胞の中で、その疾患もしくは障害または疾患もしくは障害のリスク上昇に関連する細胞の一部は、そのサンプル中のこれらのＣＮＶ、多型または変異の最も頻度が高い部分より大きいか、またはこれに等しいと仮定される。例えば、細胞の６％がＫ−ｒａｓ変異を有し、細胞の８％がＢＲＡＦ変異を有する場合、細胞の少なくとも８％が癌性であると仮定される。

いくつかの実施形態において、サンプル中の総ＤＮＡ（またはＲＮＡ）に対する１つ以上の標的細胞からのＤＮＡ（またはＲＮＡ）の比率が計算される。いくつかの実施形態において、第１の相同染色体セグメントの過剰出現の程度を示す１つ以上の仮説のセットが列挙される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの細胞においてヘテロ接合性である遺伝子座についての対立遺伝子比率の予測値は、ＤＮＡまたはＲＮＡの比率の計算値を考慮して推定され、その仮説によって示される過剰出現の程度が、各仮説について推定される。いくつかの実施形態において、その仮説が正しい尤度は、対立遺伝子比率の計算値と対立遺伝子比率の予測値とを比較することによって計算され、最大の尤度を有する仮説が選択される。

いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率の予測値およびＤＮＡまたはＲＮＡの比率の計算値を用いて計算された試験統計の予測分布が、各仮説について推定される。いくつかの実施形態において、その仮説が正しい尤度は、対立遺伝子比率の計算値およびＤＮＡまたはＲＮＡの比率の計算値を用いて計算される試験統計と、対立遺伝子比率の予測値およびＤＮＡまたはＲＮＡの比率の計算値を用いて計算される試験統計の予測分布とを比較することによって決定され、最大の尤度を有する仮説が選択される。

いくつかの実施形態において、本方法は、第１の相同染色体セグメントの過剰出現の程度を示す１つ以上の仮説のセットを列挙することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、各仮説について、（ｉ）その仮説によって示される過剰出現の程度を考慮した、少なくとも１つの細胞においてヘテロ接合性である遺伝子座についての対立遺伝子比率の予測値、または（ｉｉ）ＤＮＡまたはＲＮＡの１つ以上の可能な比率について、対立遺伝子比率の予測値およびサンプル中の総ＤＮＡまたはＲＮＡに対する１つ以上の標的細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡの可能な比率を用いて計算された試験統計の予測分布のいずれかを推定することを含む。いくつかの実施形態において、データフィッティングは、（ｉ）対立遺伝子比率の計算値を、対立遺伝子比率の予測値、または（ｉｉ）対立遺伝子比率の計算値およびＤＮＡまたはＲＮＡの可能な比率を用いて計算された試験統計のいずれかを、対立遺伝子比率の予測値およびＤＮＡまたはＲＮＡの可能な比率を用いて計算された試験統計の予測分布と比較することによって計算される。いくつかの実施形態において、仮説のうちの１つ以上は、データフィッティングに従ってランク付けされ、最も高くランク付けされた仮説が選択される。いくつかの実施形態において、検索アルゴリズムなどの技術またはアルゴリズムは、データフィッティングを計算する工程、仮説をランク付けする工程、または最も高くランク付けされた仮説を選択する工程のうちの１つ以上のために使用される。いくつかの実施形態において、データフィッティングは、ベータ二項分布に対するフィッティングまたは二項分布に対するフィッティングである。いくつかの実施形態において、この技術またはアルゴリズムは、最大尤度の推定、経験的な最大推定、ベイズ推定、動的推定（例えば、動的ベイズ推定）および期待最大化推定からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本方法は、得られた遺伝子データと遺伝子データの予測値に対して上述の技術またはアルゴリズムを適用することを含む。

いくつかの実施形態において、本方法は、サンプル中の総ＤＮＡまたはＲＮＡに対する１つ以上の標的細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡの比率について、下限から上限までの範囲の可能な比率の分配を作成することを含む。いくつかの実施形態において、第１の相同染色体セグメントの過剰出現の程度を示す１つ以上の仮説のセットが列挙される。いくつかの実施形態において、本方法は、分配におけるＤＮＡまたはＲＮＡの可能な比率のそれぞれについて、また、各仮説について、（ｉ）ＤＮＡまたはＲＮＡの可能な比率およびその仮説によって示される過剰出現の程度を考慮した、少なくとも１つの細胞においてヘテロ接合性である遺伝子座についての対立遺伝子比率の予測値、または（ｉｉ）対立遺伝子比率の予測値およびＤＮＡまたはＲＮＡの可能な比率を用いて計算される試験確率の予測分布のいずれかを推定することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、分配におけるＤＮＡまたはＲＮＡの可能な比率のそれぞれについて、また、各仮説について、（ｉ）対立遺伝子比率の計算値を、対立遺伝子比率の予測値、または（ｉｉ）対立遺伝子比率の計算値およびＤＮＡまたはＲＮＡの可能な比率を用いて計算された試験統計のいずれかを、対立遺伝子比率の予測値およびＤＮＡまたはＲＮＡの可能な比率を用いて計算された試験統計の予測分布と比較することによって、その仮説が正しい尤度が計算される。いくつかの実施形態において、各仮説についての結合確率は、分配における可能な比率それぞれについて、その仮説の確率を合わせることによって決定され、最大の結合確率を有する仮説が選択される。いくつかの実施形態において、各仮説についての結合確率は、特定の可能な比率について、その可能な比率が正しい比率である尤度に基づき、ある仮説の確率を重み付けすることによって決定される。

いくつかの実施形態において、最大尤度の推定、経験的な最大推定、ベイズ推定、動的推定（例えば、動的ベイズ推定）および期待最大化推定からなる群から選択される技術を使用して、サンプル中の総ＤＮＡまたはＲＮＡに対する１つ以上の標的細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡの比率を推定する。いくつかの実施形態において、サンプル中の総ＤＮＡまたはＲＮＡに対する１つ以上の標的細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡの比率は、目的のＣＮＶのうちの２つ以上（または全て）について同じであると仮定される。いくつかの実施形態において、目的のそれぞれのＣＮＶについて、サンプル中の総ＤＮＡまたはＲＮＡに対する１つ以上の標的細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡの比率が計算される。

不完全なフェージングデータを使用するための例示的な方法
多くの実施形態について、不完全なフェージングデータが使用されることを理解されたい。例えば、第１および／または第２の相同染色体セグメント上の遺伝子座のうちの１つ以上について、どの対立遺伝子が存在するかは１００％確実には知られていない場合がある。いくつかの実施形態において、個体の可能なハプロタイプについての事前確率（例えば、集合に基づくハプロタイプ頻度に基づくハプロタイプ）を、各仮説の確率を計算する際に使用する。いくつかの実施形態において、可能なハプロタイプについての事前確率は、遺伝子データをフェージングするための別の方法を用いることによって、または個体のインフォマティクスに基づくフェージングのために使用される集合データを絞り込むために他の被験体（例えば、以前の被験体）からのフェージングデータを用いることによって調整される。

いくつかの実施形態において、フェージング遺伝子データは、フェージング遺伝子データの２つ以上の可能なセットについての確率データを含み、フェージングデータのそれぞれの可能なセットは、第１の相同染色体セグメント上の多型遺伝子座のセット中の各遺伝子座に存在する対立遺伝子の可能な同一性および第２の相同染色体セグメント上の多型遺伝子座のセット中の各遺伝子座に存在する対立遺伝子の可能な同一性を含む。いくつかの実施形態において、仮説のうちの少なくとも１つについての確率は、フェージング遺伝子データの可能なセットそれぞれについて決定される。いくつかの実施形態において、仮説についての結合確率は、フェージング遺伝子データの可能なセットそれぞれについてのその仮説の確率を合わせることによって決定され、最大の結合確率を有する仮説が選択される。

本明細書に開示される方法のいずれかまたは任意の既知の方法を使用して、請求項記載の方法で使用するための不完全なフェージングデータを作成してもよい（例えば、集合に基づくハプロタイプ頻度を用い、最も可能性の高いフェーズを推測する）。いくつかの実施形態において、フェージングデータは、より小さなセグメントのハプロタイプを確率的に組み合わせることによって得られる。例えば、可能なハプロタイプは、第１の領域からの１つのハプロタイプと、同じ染色体からの別の領域からの別のハプロタイプとの可能な組み合わせに基づいて決定されてもよい。異なる領域からの特定のハプロタイプが、同じ染色体上の同じ、より大きなハプロタイプブロックの一部である確率は、例えば、集合に基づくハプロタイプ頻度および／または異なる領域間の既知の組換え率を用いて決定されてもよい。

いくつかの実施形態において、単一仮説否定試験は、ダイソミーの帰無仮説のために使用される。いくつかの実施形態において、ダイソミー仮説の確率が計算され、ダイソミーの仮説は、その確率が所与の閾値を下回る場合（例えば、１，０００分の１未満である場合）、否定される。帰無仮説が否定される場合、このことは、不完全なフェージングデータにおけるエラーに起因するか、またはＣＮＶの存在に起因する可能性がある。いくつかの実施形態において、より正確なフェージングデータが得られる（例えば、バイオインフォマティクスに基づいて推測されるフェージングデータではなく、実際のフェージングデータを得るための本明細書に開示される分子フェージング方法のいずれかからのフェージングデータ）。いくつかの実施形態において、ダイソミー仮説の確率は、このより正確なフェージングデータを用いて再計算され、ダイソミー仮説がそれでも否定されるべきかどうかを決定する。この仮説の否定は、染色体セグメントの重複または欠失が存在することを示す。所望な場合、偽陽性率は、閾値を調整することによって変えることができる。

フェージングデータを用いて倍数性を決定するためのさらなる例示的な実施形態
例示的な実施形態において、個体のサンプル中の染色体セグメントの倍数性を決定する方法が本明細書で提供される。本方法は、染色体セグメント上の多型遺伝子座のセット中のそれぞれの遺伝子座で、サンプル中に存在する各対立遺伝子の量を含む対立遺伝子頻度データを受信する工程と、対立遺伝子頻度データのフェーズを推定することによって、多型遺伝子座のセットについてのフェージング対立遺伝子情報を作成する工程と、対立遺伝子頻度データを用い、異なる倍数性状態についての多型遺伝子座についての対立遺伝子頻度の個々の確率を作成する工程と、個々の確率およびフェージング対立遺伝子情報を用い、多型遺伝子座のセットについての結合確率を作成する工程と、結合確率に基づき、染色体倍数性の指標である最良フィッティングモデルを選択することによって、染色体セグメントの倍数性を決定する工程と、を含む。

本明細書に開示されるように、対立遺伝子頻度データ（本明細書において、測定される遺伝子対立遺伝子データとも呼ばれる）は、当該技術分野で既知の方法によって作成されてもよい。例えば、このデータは、ｑＰＣＲまたはマイクロアレイを使用して作成されてもよい。例示的な一実施形態において、このデータは、核酸配列データ、特に、高スループット核酸配列データを使用して生成される。

特定の例示的な例では、対立遺伝子頻度データは、これを使用して個々の確率を作成する前に、エラーが修正される。具体的な例示的な実施形態において、修正されるエラーは、対立遺伝子増幅効率バイアスを含む。他の実施形態において、修正されるエラーは、周囲コンタミネーションおよび遺伝子型コンタミネーションを含む。いくつかの実施形態において、修正されるエラーとしては、対立遺伝子増幅バイアス、配列決定エラー、周囲コンタミネーションおよび遺伝子型コンタミネーションが挙げられる。

特定の実施形態において、個々の確率は、多型遺伝子座のセットについての異なる倍数性状態および対立遺伝子不均衡フラクションのモデルのセットを用いて作成される。これらの実施形態および他の実施形態において、結合確率は、染色体セグメント上の多型遺伝子座間の結合を考慮することによって作成される。

したがって、これらの実施形態のいくつかを組み合わせた例示的な一実施形態において、個体のサンプル中の染色体倍数性を検出するための方法であって、個体における染色体セグメント上の多型遺伝子座のセットで、対立遺伝子についての核酸配列データを受信する工程と、核酸配列データを用い、遺伝子座のセットで対立遺伝子頻度を検出する工程と、検出された対立遺伝子頻度における対立遺伝子増幅効率バイアスを修正して、多型遺伝子座のセットについて修正された対立遺伝子頻度を作成する工程と、核酸配列データのフェーズを推定することによって、多型遺伝子座のセットについてのフェージング対立遺伝子情報を作成する工程と、修正された対立遺伝子頻度と、多型遺伝子座のセットについての異なる倍数性状態および対立遺伝子不均衡フラクションのモデルのセットとを比較することによって、異なる倍数性状態についての多型遺伝子座についての対立遺伝子頻度の個々の確率を作成する工程と、染色体セグメント上の多型遺伝子座間の結合を考慮した個々の確率を合わせることによって、多型遺伝子座のセットについての結合確率を作成する工程と、結合確率に基づき、染色体異数性の指標である最良フィッティングモデルを選択する工程とを含む、方法が本明細書で提供される。

本明細書に開示されるように、個々の確率は、多型遺伝子座のセットについての異なる倍数性状態および平均対立遺伝子不均衡フラクションのモデルまたは仮説のセットを用いて作成されてもよい。例えば、特に例示的な例では、個々の確率は、染色体セグメントの第１のホモログおよび染色体セグメントの第２のホモログの倍数性状態をモデリングすることによって作成される。モデリングされる倍数性状態は、以下のものを含む。（１）全ての細胞は、染色体セグメントの第１のホモログまたは第２のホモログの欠失または増幅を有しない、（２）少なくともいくつかの細胞は、染色体セグメントの第１のホモログの欠失または第２のホモログの増幅を有する、（３）少なくともいくつかの細胞は、染色体セグメントの第２のホモログの欠失または第１のホモログの増幅を有する。

上のモデルは、モデルを制約するために使用される仮説と称される場合もあることが理解されるだろう。したがって、上に示されたのは、使用可能な３つの仮説である。

モデリングされる平均対立遺伝子不均衡フラクションは、染色体セグメントの実際の平均対立遺伝子不均衡を含む、任意の範囲の平均対立遺伝子不均衡を含んでいてもよい。例えば、特定の例示的な実施形態において、モデリングされる平均対立遺伝子不均衡の範囲は、下限で０、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７５、１、２、２．５、３、４および５％、上限で１、２、２．５、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０ ８０ ９０、９５および９９％であってもよい。この範囲を有するモデリングのための間隔は、使用される計算能力および分析のために許容されている時間に応じて、任意の間隔であってもよい。例えば、０．０１、０．０５、０．０２または０．１の間隔がモデリングされてもよい。

特定の例示的な実施形態において、サンプルは、染色体セグメントについての平均対立遺伝子不均衡が０．４％〜５％である。特定の実施形態において、平均対立遺伝子不均衡は、低い。これらの実施形態において、平均対立遺伝子不均衡は、典型的には、１０％未満である。特定の例示的な実施形態において、対立遺伝子不均衡は、下限で０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７５、１、２、２．５、３、４および５％、上限で１、２、２．５、３、４および５％である。他の例示的な実施形態において、平均対立遺伝子不均衡は、下限で０．４、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０％、上限で０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、３．０、４．０または５．０％である。例えば、サンプルの平均対立遺伝子不均衡は、例示的な例では、０．４５〜２．５％である。別の例では、平均対立遺伝子不均衡は、０．４５、０．５、０．６、０．８、０．８、０．９または１．０％の感度で検出される。すなわち、本試験方法は、ＡＡＩが０．４５、０．５、０．６、０．８、０．８、０．９または１．０％まで下がる染色体異数性を検出することができる。本発明の方法において対立遺伝子不均衡が低い例示的なサンプルにおいて、循環腫瘍ＤＮＡを有する癌を有する個体からの血漿サンプルまたは循環胎児ＤＮＡを有する妊婦由来の血漿サンプルを含む。

ＳＮＶについて、異常ＤＮＡの割合は、典型的には、変異体対立遺伝子頻度（ある遺伝子座での変異体対立遺伝子の数／その遺伝子座での対立遺伝子の総数）を用いて測定されることが理解されるだろう。腫瘍における２つのホモログの量の差が類似しているため、平均対立遺伝子不均衡（ＡＡＩ）によって、ＣＮＶについての異常ＤＮＡの割合（｜（Ｈ１−Ｈ２）｜／（Ｈ１＋Ｈ２）と定義される）を測定し、ここで、Ｈｉは、サンプル中のホモログｉの平均コピー数であり、Ｈｉ／（Ｈ１＋Ｈ２）は、ホモログｉの存在分率、すなわち、ホモログ比率である。最大ホモログ比率は、より豊富なホモログのホモログ比率である。

アッセイドロップアウト率は、全ＳＮＰを用いて推定される、リードを有しないＳＮＰの割合である。単一対立遺伝子ドロップアウト（ＡＤＯ）率は、ヘテロ接合性ＳＮＰのみを用いて推定される、たった１つの対立遺伝子が存在するＳＮＰの割合である。遺伝子型信頼性は、二項分布を、Ｂ対立遺伝子リードであった各ＳＮＰでのリード数に対して、ＳＮＰの焦点領域の倍数性状態を用いてフィッティングすることによって決定され、各遺伝子型の確率を推定することができる。

腫瘍組織サンプルについて、染色体異数性（この段落ではＣＮＶによって例示される）は、対立遺伝子頻度分布間の遷移によって表すことができる。癌患者、癌を有することが疑われる個体、癌を有すると以前診断された個体の血漿サンプルにおいて、またはリスクのある個体または一般的な集合のための癌スクリーニングとして、ＣＮＶは、癌において異数性を示すことが知られている領域において、および／または同じ個体からの腫瘍サンプルもＣＮＶを有する場合に、血漿ＣＮＶを検索する最大尤度アルゴリズムによって特定することができる。例示的な実施形態において、このアルゴリズムは、循環腫瘍ＤＮＡの存在についてサンプルが分析される個体のハプロタイプフェーズ情報を使用して、測定され、修正された試験サンプルの対立遺伝子数を、例えば、結合分布モードを用い、対立遺伝子数の予測値にフィッティングする。このようなハプロタイプフェーズ情報は、大部分が、または少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９％、または全ての正常な細胞ＤＮＡを含む、個体からの任意のサンプル、例えば、限定されないが、バフィーコートサンプル、唾液サンプルまたは皮膚サンプルから、親の遺伝子情報から、またはデノボでのハプロタイプフェージングによって演繹することができ、これらは、種々の方法（例えば、Ｓｎｙｄｅｒ、Ｍ．ら、Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １６、３４４−３５８（２０１５））、例えば、希釈によるハプロタイピング（Ｋａｐｅｒ，Ｆ．ら、Ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ ｈａｐｌｏｔｙｐｉｎｇ ｂｙ ｄｉｌｕｔｉｏｎ，ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０、５５５２−５５５７（２０１３））または長リード配列決定（Ｋｕｌｅｓｈｏｖ，Ｖ．ら、Ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ ｈａｐｌｏｔｙｐｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｌｏｎｇ ｒｅａｄｓ ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３２，２６１−２６６（２０１４））によって達成することができる。このアルゴリズムは、以下の仮説の３つのセットについて、０．０２５％の間隔で、全ての対立遺伝子不均衡比率にわたって、対立遺伝子頻度の予測値をモデリングすることができる。（１）全ての細胞が正常である（対立遺伝子不均衡なし）、（２）いくつか／全ての細胞が、ホモログ１の欠失またはホモログ２の増幅を有する、または（３）いくつか／全ての細胞が、ホモログ２の欠失またはホモログ１の増幅を有する。各仮説の尤度は、全てのヘテロ接合性ＳＮＰでの対立遺伝子頻度の予測値および観測値のベータ二項モデルに基づくベイズ分類器を用い、各ＳＮＰで決定することができ、次いで、複数のＳＮＰにわたる結合尤度を、特定の例示的な実施形態において、本明細書に例示されるように、ＳＮＰ遺伝子座の結合を考慮しつつ、計算することができる。実際に、例示的な実施形態において、上に開示したように得られる正常細胞のハプロタイプフェーズ情報は、測定され、典型的には修正された試験サンプル対立遺伝子数を、結合分布モデルを用い、対立遺伝子数の予測値にフィッティングするためにアルゴリズムによって使用される。次いで、最大尤度仮説を選択することができる。

腫瘍中の平均Ｎ個のコピーを有する染色体領域を考慮し、ｃは、ダイソミー領域における正常細胞と腫瘍細胞の混合物に由来する血漿中のＤＮＡの分率を示す。ＡＡＩは、以下のように計算される。

特定の例示的な例では、対立遺伝子頻度データは、これを使用して個々の確率を作成する前に、エラーについて修正される。異なる種類のエラーおよび／またはバイアスの修正が、本明細書に開示される。具体的な例示的な実施形態において、修正されるエラーは、対立遺伝子増幅効率バイアスである。他の実施形態において、修正されるエラーは、配列決定エラー、周囲コンタミネーションおよび遺伝子型コンタミネーションを含む。いくつかの実施形態において、修正されるエラーとしては、対立遺伝子増幅バイアス、配列決定エラー、周囲コンタミネーションおよび遺伝子型コンタミネーションが挙げられる。

対立遺伝子増幅効率バイアスは、試験中のサンプルを含む実験または研究室での決定の一部として、ある対立遺伝子について決定することができるか、または効率が計算される対立遺伝子を含むサンプルのセットを用い、異なる時間に決定することができることが理解されるだろう。周囲コンタミネーションおよび遺伝子型コンタミネーションは、典型的には、試験中のサンプル分析と同じランで決定される。

特定の実施形態において、周囲コンタミネーションおよび遺伝子型コンタミネーションは、サンプル中のホモ接合性対立遺伝子について決定される。個体からの任意の所与のサンプルについて、ある遺伝子座が集合の中で比較的高いヘテロ接合性を有するために、分析のために選択される場合であっても、サンプル中のいくつかの遺伝子座はヘテロ接合性であり、他方はホモ接合性であることが理解されるだろう。いくつかの実施形態において、ある個体についてヘテロ接合性遺伝子座を用いて染色体セグメントの倍数性を決定することが有利であり、一方、周囲コンタミネーションおよび遺伝子型コンタミネーションは、ホモ接合性遺伝子座を用いて計算することができる。

特定の例示的な例では、上述の選択することは、フェージング対立遺伝子情報とモデルについて作成された推定対立遺伝子頻度との差の大きさを分析することによって行われる。

例示的な例では、対立遺伝子頻度の個々の確率は、多型遺伝子座のセットでの対立遺伝子頻度の予測値および観測値のベータ二項モデルに基づいて作成される。例示的な例では、個々の確率は、ベイズ分類器を用いて作成される。

特定の例示的な実施形態において、核酸配列データは、多重増幅反応を用いて作成される一連のアンプリコンの複数のコピーの高スループットＤＮＡ配列決定を行うことによって作成され、一連のアンプリコンのそれぞれのアンプリコンは、多型遺伝子座のセットの少なくとも１つの多型遺伝子座に広がり、このセットの多型遺伝子座のそれぞれが増幅される。特定の実施形態において、多重増幅反応は、反応の少なくとも１／２について、制限されたプライマー条件で行われる。いくつかの実施形態において、制限されたプライマー濃度は、多重反応のうちの反応の１／１０、１／５、１／４、１／３、１／２、または全てで使用される。ＰＣＲなどの増幅反応において制限されたプライマー条件を達成するために考慮すべき因子が、本明細書で提供される。

特定の実施形態において、本明細書で提供される方法は、複数の染色体にわたる複数の染色体セグメントについて倍数性を検出する。したがって、これらの実施形態における染色体倍数性は、サンプル中の染色体セグメントのセットについて決定される。これらの実施形態について、より多くの多重増幅反応が必要とされる。したがって、これらの実施形態について、多重増幅反応は、例えば、２，５００〜５０，０００の多重反応を含んでいてもよい。特定の実施形態において、以下の範囲の多重反応が行われる。範囲の下限で１００、２００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５０００、５００００から、範囲の上限で２００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５０００、５００００および１００，０００まで。

例示的な実施形態において、多型遺伝子座のセットは、高いヘテロ接合性を示すことが知られている遺伝子座のセットである。しかし、任意の所与の個体について、これらの遺伝子座のいくつかがホモ接合性であることが予想される。特定の例示的な実施形態において、本発明の方法は、ある個体のホモ接合性遺伝子座およびヘテロ接合性遺伝子座の両方についての核酸配列情報を利用する。ある個体のホモ接合性遺伝子座は、例えば、エラー修正のために使用され、一方、ヘテロ接合性遺伝子座は、サンプルの対立遺伝子不均衡の決定に使用される。特定の実施形態において、多型遺伝子座の少なくとも１０％は、個体のヘテロ接合性遺伝子座である。

本明細書に開示されるように、集合中でヘテロ接合性であることが知られている標的ＳＮＰ遺伝子座を分析することが好ましく与えられる。したがって、特定の実施形態において、多型遺伝子座の１０、２０、２５、５０、７５、８０、９０、９５、９９または１００％が、集合中でヘテロ接合性であることが知られている多型遺伝子座が選択される。

本明細書に開示されるように、特定の実施形態において、サンプルは、妊婦由来の血漿サンプルである。

いくつかの例では、本方法は、さらに、既知の平均対立遺伝子不均衡比率を有する対照サンプルに対して本方法を実施することを含む。対照は、例えば、腫瘍からの循環遊離ＤＮＡについて予想されるように、低濃度で存在するサンプル中の対立遺伝子の平均対立遺伝子不均衡を模倣するために、０．４〜１０％の染色体セグメントの異数性の指標である特定の対立遺伝子状態についての平均対立遺伝子不均衡比率を有していてもよい。

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるように、ＰｌａｓｍＡｒｔ対照は、対照として使用される。したがって、特定の態様において、これは、染色体異数性を示すことが知られている核酸サンプルを、個体の血漿中で循環するＤＮＡのフラグメントの大きさを模倣するフラグメントへとフラグメント化することを含む方法によって作成されるサンプルである。特定の態様において、染色体セグメントについての異数性を有さない対照が使用される。

例示的な実施形態において、１つ以上の対照からのデータは、試験サンプルと共に本方法で分析されてもよい。対照は、例えば、染色体異数性を含むことが疑われない個体からの異なるサンプル、またはＣＮＶまたは染色体異数性を含むことが疑われるサンプルを含んでいてもよい。例えば、試験サンプルが、循環遊離腫瘍ＤＮＡを含むことが疑われる腫瘍サンプルである場合、本方法は、その血漿サンプルと共に、その被験体からの腫瘍由来の対照サンプルについても行うことができる。本明細書に開示されるように、対照サンプルは、染色体異数性を示すことが知られているＤＮＡサンプルをフラグメント化することによって調製されてもよい。このようなフラグメント化によって、特に、サンプルが、癌に罹患している個体由来である場合、アポトーシス細胞のＤＮＡ組成物を模倣するＤＮＡサンプルを得ることができる。対照サンプルからのデータは、染色体異数性の検出の信頼性を高めるだろう。

倍数性を決定する方法の特定の実施形態において、サンプルは、癌を有することが疑われる個体からの血漿サンプルである。これらの実施形態において、本方法は、さらに、上述の選択することに基づいて、コピー数多型が個体の腫瘍細胞に存在するかどうかを決定することを含む。これらの実施形態について、サンプルは、個体からの血漿サンプルであってもよい。これらの実施形態において、本方法は、さらに、上述の選択することに基づいて、癌が個体中に存在するかどうかを決定することを含んでいてもよい。

染色体セグメントの倍数性を決定するためのこれらの実施形態は、さらに、単一ヌクレオチドバリアント位置のセットにおいて、単一ヌクレオチドバリアント位置にある単一ヌクレオチドバリアントを検出することを含んでいてもよく、染色体異数性または単一ヌクレオチドバリアントのいずれか、または両者を検出することは、サンプル中の循環腫瘍核酸の存在を示す。

これらの実施形態は、さらに、個体のある腫瘍についての染色体セグメントのハプロタイプ情報を受信することと、このハプロタイプ情報を用いて、多型遺伝子座のセットについての異なる倍数性状態および対立遺伝子不均衡フラクションのモデルのセットを作成することと、を含んでいてもよい。

本明細書に開示されるように、倍数性を決定する方法の特定の実施形態は、さらに、初期または修正された対立遺伝子頻度をモデルのセットと比較する前に、初期または修正された対立遺伝子頻度データから外れ値を除去することを含んでいてもよい。例えば、特定の実施形態において、染色体セグメント上の他の遺伝子座についての平均値よりも少なくとも２または３の標準偏差分、上または下である遺伝子座対立遺伝子頻度は、モデリングのために使用される前に、データから除去される。

本明細書に言及されるように、染色体セグメントの倍数性を決定するためのものを含む、本明細書で提供される実施形態の多くについて、不完全または完全なフェージングデータが好ましく使用されることが理解されるだろう。倍数性を検出するための従来方法を超える改善を与えるいくつかの特徴が本明細書で提供され、これらの特徴の多くの異なる組み合わせを使用してもよいことも理解されるだろう。

特定の実施形態において、本発明の任意の方法を行うためのコンピュータシステムおよびコンピュータ可読媒体が本明細書で提供される。これらは、倍数性を決定する方法を行うためのシステムおよびコンピュータ可読媒体を含む。したがって、システムの実施形態の非限定的な例として、本明細書で提供される方法のいずれかが、本明細書の開示を用い、システムおよびコンピュータ可読媒体を用いて実行可能であることを示すために、別の態様において、個体のサンプル中の染色体倍数性を検出するためのシステムであって、染色体セグメント上の多型遺伝子座のセット中のそれぞれの遺伝子座で、サンプル中に存在する各対立遺伝子の量を含む対立遺伝子頻度データを受信するような構成の入力プロセッサと、対立遺伝子頻度データのフェーズを推定することによって、多型遺伝子座のセットについてのフェージング対立遺伝子情報を作成し、対立遺伝子頻度データを用い、異なる倍数性状態についての多型遺伝子座についての対立遺伝子頻度の個々の確率を作成し、個々の確率およびフェージング対立遺伝子情報を用い、多型遺伝子座のセットについての結合確率を作成するような構成のモデラーと、結合確率に基づき、染色体倍数性の指標である最良フィッティングモデルを選択することによって、染色体セグメントの倍数性を決定する仮説マネージャと、を備える、システムが本明細書で提供される。

このシステムの実施形態の特定の実施形態において、対立遺伝子頻度データは、核酸配列決定システムによって作成されるデータである。特定の実施形態において、このシステムは、さらに、対立遺伝子頻度データ中のエラーを修正するような構成のエラー修正ユニットを備えており、修正された対立遺伝子頻度データは、モデラーによって、個々の確率を作成するために使用される。特定の実施形態において、エラー修正ユニットは、対立遺伝子増幅効率バイアスを修正する。特定の実施形態において、モデラーは、多型遺伝子座のセットについての異なる倍数性状態および対立遺伝子不均衡フラクションのモデルのセットを用い、個々の確率を作成する。モデラーは、特定の例示的な実施形態において、染色体セグメント上の多型遺伝子座間の結合を考慮することによって、結合確率を作成する。

例示的な一実施形態において、個体のサンプル中の染色体倍数性を検出するシステムであって、個体における染色体セグメント上の多型遺伝子座のセットでの対立遺伝子についての核酸配列データを受信し、核酸配列データを用い、遺伝子座のセットでの対立遺伝子頻度を検出するような構成の入力プロセッサと、検出された対立遺伝子頻度中のエラーを修正し、多型遺伝子座のセットについて修正された対立遺伝子頻度を作成するような構成のエラー修正ユニットと、核酸配列データのフェーズを推定することによって、多型遺伝子座のセットについてのフェージング対立遺伝子情報を作成し、フェージングされた対立遺伝子情報を、多型遺伝子座のセットの異なる倍数性状態および対立遺伝子不均衡フラクションのモデルのセットとを比較することによって、異なる倍数性状態についての多型遺伝子座についての対立遺伝子頻度の個々の確率を作成し、染色体セグメント上の多型遺伝子座間の相対距離を考慮した個々の確率を合わせることによって、多型遺伝子座のセットについての結合確率を作成するような構成のモデラーと、結合確率に基づき、染色体異数性の指標である最良フィッティングモデルを選択するような構成の仮説マネージャとを備える、システムが本明細書で提供される。

本明細書で提供される特定の例示的なシステムの実施形態において、多型遺伝子座のセットは、１０００〜５０，０００の多型遺伝子座を含む。本明細書で提供される特定の例示的なシステムの実施形態において、多型遺伝子座のセットは、１００の既知のヘテロ接合性ホットスポット遺伝子座を含む。本明細書で提供される特定の例示的なシステムの実施形態において、多型遺伝子座のセットは、組換えホットスポットの０．５ｋｂにあるか、またはその内部にある１００の遺伝子座を含む。

本明細書で提供される特定の例示的なシステムの実施形態において、最良フィッティングモデルは、染色体セグメントの第１のホモログおよび染色体セグメントの第２のホモログの以下の倍数性状態を分析する。（１）全ての細胞は、染色体セグメントの第１のホモログまたは第２のホモログの欠失または増幅を有しない、（２）いくつかの細胞または全ての細胞は、染色体セグメントの第１のホモログの欠失または第２のホモログの増幅を有する、（３）いくつかの細胞または全ての細胞は、染色体セグメントの第２のホモログの欠失または第１のホモログの増幅を有する。

本明細書で提供される特定の例示的なシステムの実施形態において、修正されるエラーは、対立遺伝子増幅効率バイアス、コンタミネーションおよび／または配列決定エラーを含む。本明細書で提供される特定の例示的なシステムの実施形態において、コンタミネーションは、周囲コンタミネーションおよび遺伝子型コンタミネーションを含む。本明細書で提供される特定の例示的なシステム実施形態において、周囲コンタミネーションおよび遺伝子型コンタミネーションは、ホモ接合性対立遺伝子について決定される。

本明細書で提供される特定の例示的なシステムの実施形態において、仮説マネージャは、そのモデルについて作成されたフェージング対立遺伝子情報と推定対立遺伝子頻度との差の大きさを分析するような構成である。本明細書で提供される特定の例示的なシステムの実施形態において、モデラーは、多型遺伝子座のセットでの対立遺伝子頻度の予測値および観測値のベータ二項モデルに基づき、対立遺伝子頻度の個々の確率を作成する。本明細書で提供される特定の例示的なシステムの実施形態において、モデラーは、ベイズ分類器を用いて個々の確率を作成する。

本明細書で提供される特定の例示的なシステムの実施形態において、核酸配列データは、多重増幅反応を用いて作成される一連のアンプリコンの複数のコピーの高スループットＤＮＡ配列決定を行うことによって作成され、一連のアンプリコンのそれぞれのアンプリコンは、多型遺伝子座のセットの少なくとも１つの多型遺伝子座に広がり、このセットの多型遺伝子座のそれぞれが増幅される。本明細書で提供される特定の例示的なシステムの実施形態において、多重増幅反応は、反応の少なくとも１／２について、制限されたプライマー条件で行われる。本明細書で提供される特定の例示的なシステムの実施形態において、サンプルは、平均対立遺伝子不均衡が０．４％〜５％である。

本明細書で提供される特定の例示的なシステムの実施形態において、サンプルは、癌を有することが疑われる個体からの血漿サンプルであり、仮説マネージャは、さらに、最良フィッティングモデルに基づき、コピー数多型が個体の腫瘍細胞に存在するかどうかを決定するような構成である。

本明細書で提供される特定の例示的なシステムの実施形態において、サンプルは、個体からの血漿サンプルであり、仮説マネージャは、さらに、最良フィッティングモデルに基づき、癌が個体に存在するかどうかを決定するような構成である。これらの実施形態において、仮説マネージャは、さらに、単一ヌクレオチドバリアント位置のセットにおいて、単一ヌクレオチドバリアント位置にある単一ヌクレオチドバリアントを検出するような構成であってもよく、染色体異数性または単一ヌクレオチドバリアントのいずれか、または両者を検出することは、サンプル中の循環腫瘍核酸の存在を示す。

本明細書で提供される特定の例示的なシステムの実施形態において、入力プロセッサは、さらに、個体のある腫瘍についての染色体セグメントのハプロタイプ情報を受信するような構成であり、モデラーは、このハプロタイプ情報を用いて、多型遺伝子座のセットについての異なる倍数性状態および対立遺伝子不均衡フラクションのモデルのセットを作成するような構成である。

本明細書で提供される特定の例示的なシステムの実施形態において、モデラーは、０％〜２５％の範囲の対立遺伝子不均衡フラクションにわたってモデルを作成する。

本明細書で提供されるいずれかの方法は、非一時的コンピュータ可読媒体に保存されるコンピュータ可読コードによって実行されてもよいことが理解されるだろう。したがって、一実施形態において、個体のサンプルにおいて染色体倍数性を検出するための非一時的コンピュータ可読媒体であって、コンピュータ可読コードを含み、処理デバイスによって実行される場合、処理デバイスに、染色体セグメント上の多型遺伝子座のセットにおける各遺伝子座で、サンプル中に存在する各対立遺伝子の量を含む対立遺伝子頻度データを受信させ、対立遺伝子頻度データのフェーズを推定することによって、多型遺伝子座のセットについてのフェージング対立遺伝子情報を作成させ、対立遺伝子頻度データを用い、異なる倍数性状態についての多型遺伝子座についての対立遺伝子頻度の個々の確率を作成させ、個々の確率およびフェージング対立遺伝子情報を用い、多型遺伝子座のセットについての結合確率を作成させ、結合確率に基づき、染色体倍数性の指標である最良フィッティングモデルを選択することによって、染色体セグメントの倍数性を決定させる、非一時的コンピュータ可読媒体が本明細書で提供される。

特定のコンピュータ可読媒体の実施形態において、対立遺伝子頻度データは、核酸配列データから作成される。特定のコンピュータ可読媒体の実施形態は、さらに、対立遺伝子頻度データ中のエラーを修正することと、修正された対立遺伝子頻度データを、個々の確率を作成する工程に使用することとを含む。特定のコンピュータ可読媒体の実施形態において、修正されるエラーは、対立遺伝子増幅効率バイアスである。特定のコンピュータ可読媒体の実施形態において、個々の確率は、多型遺伝子座のセットについての異なる倍数性状態および対立遺伝子不均衡フラクションのモデルのセットを用いて作成される。特定のコンピュータ可読媒体の実施形態において、結合確率は、染色体セグメント上の多型遺伝子座間の結合を考慮することによって作成される。

特定の一実施形態において、個体のサンプルにおいて染色体倍数性を検出するための非一時的コンピュータ可読媒体であって、コンピュータ可読コードを含み、処理デバイスによって実行される場合、処理デバイスに、個体における染色体セグメント上の多型遺伝子座のセットでの対立遺伝子についての核酸配列データを受信させ、核酸配列データを用い、遺伝子座のセットでの対立遺伝子頻度を検出させ、検出された対立遺伝子頻度における対立遺伝子増幅効率バイアスを修正して、多型遺伝子座のセットについて修正された対立遺伝子頻度を作成させ、核酸配列データのフェーズを推定することによって、多型遺伝子座のセットについてのフェージング対立遺伝子情報を作成させ、修正された対立遺伝子頻度と、多型遺伝子座のセットについての異なる倍数性状態および対立遺伝子不均衡フラクションのモデルのセットとを比較することによって、異なる倍数性状態についての多型遺伝子座についての対立遺伝子頻度の個々の確率を作成させ、染色体セグメント上の多型遺伝子座間の結合を考慮した個々の確率を合わせることによって、多型遺伝子座のセットについての結合確率を作成させ、結合確率に基づき、染色体異数性の指標である最良フィッティングモデルを選択させる、非一時的コンピュータ可読媒体が本明細書で提供される。

特定の例示的なコンピュータ可読媒体の実施形態において、上述の選択することは、フェージング対立遺伝子情報とモデルについて作成された推定対立遺伝子頻度との差の大きさを分析することによって行われる。

特定の例示的なコンピュータ可読媒体の実施形態において、対立遺伝子頻度の個々の確率は、多型遺伝子座のセットでの対立遺伝子頻度の予測値および観測値のベータ二項モデルに基づいて作成される。

本明細書で提供されるいずれかの方法の実施形態は、非一時的コンピュータ可読媒体に保存されるコードを実行することによって行われてもよいことが理解されるだろう。

癌を検出するための例示的な実施形態
特定の態様において、本発明は、癌を検出するための方法を提供する。サンプルは、癌を有することが疑われる個体からの腫瘍サンプルまたは液体サンプル、例えば、血漿であってもよいことが理解されるだろう。本方法は、遺伝子変異、例えば、ＳＮＶなどの単一ヌクレオチド変化、またはコピー数の変化、例えば、サンプル中の総ＤＮＡの一部として低レベルのこれらの遺伝子変化を含むサンプル中のＣＮＶを検出するのに特に有効である。したがって、サンプル中の癌からのＤＮＡまたはＲＮＡを検出するための感度は、並外れている。本方法は、この並外れた感度を達成するために、ＣＮＶおよびＳＮＶを検出するための本明細書で提供される改良のいずれかまたは全てを組み合わせてもよい。

したがって、本明細書で提供される特定の実施形態において、循環腫瘍核酸が、個体のサンプル中に存在するかどうかを決定する方法、および非一時的コンピュータ可読媒体であって、コンピュータ可読コードを含み、処理デバイスで実行される場合、処理デバイスに本方法を実施させる、非一時的コンピュータ可読媒体である。本方法は、サンプルを分析して、個体における染色体セグメント上の多型遺伝子座のセットでの倍数性を決定する工程と、倍数性の決定に基づき、多型遺伝子座に存在する平均対立遺伝子不均衡のレベルを決定する工程とを含み、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．７５％、０．８％、０．９％または１％に等しいか、またはこれらより大きい平均対立遺伝子不均衡は、サンプル中の循環腫瘍核酸（例えば、ｃｔＤＮＡ）の存在の指標である。

特定の例示的な実施例において、０．４、０．４５または０．５％を超える平均対立遺伝子不均衡は、ｃｔＤＮＡの存在の指標である。特定の実施形態において、循環腫瘍核酸が存在するかどうかを決定する方法は、さらに、単一ヌクレオチド分散位置のセットにおいて、単一ヌクレオチド分散部位にある単一ヌクレオチドバリアントを検出することを含み、０．５％に等しいか、またはこれより大きい対立遺伝子不均衡を検出すること、または単一ヌクレオチドバリアントを検出すること、またはこの両者は、サンプル中の循環腫瘍核酸の存在の指標である。染色体倍数性またはＣＮＶを検出するために提供される方法のいずれかを使用して、対立遺伝子不均衡（典型的には平均対立遺伝子不均衡として表される）のレベルを決定することができることが理解されるだろう。ＳＮＶを検出するために本明細書で提供される方法のいずれかを使用して、本発明のこの態様のための単一ヌクレオチドを検出することができることが理解されるだろう。

特定の実施形態において、循環腫瘍核酸が存在するかどうかを決定するための方法は、さらに、既知の平均対立遺伝子不均衡比率を有する対照サンプルに対して本方法を行うことを含む。対照は、例えば、個体の腫瘍からのサンプルであってもよい。いくつかの実施形態において、対照は、分析対象のサンプルに対して予測される平均対立遺伝子不均衡を有する。例えば、ＡＡＩは０．５％〜５％、または平均対立遺伝子不均衡比率が０．５％。

特定の実施形態において、循環腫瘍核酸が存在するかどうかを決定するための方法の分析する工程は、癌において異数性を示すことが知られている染色体セグメントのセットを分析することを含む。特定の実施形態において、循環腫瘍核酸が存在するかどうかを決定するための方法の分析する工程は、倍数性について、１，０００〜５０，０００または１００〜１０００の多型遺伝子座を分析することを含む。特定の実施形態において、循環腫瘍核酸が存在するかどうかを決定するための方法の分析する工程は、１００〜１０００の単一ヌクレオチドバリアント部位を分析することを含む。例えば、これらの実施形態において、分析する工程は、マルチプレックスＰＣＲを行い、１０００〜５０，０００多型遺伝子座および１００〜１０００単一ヌクレオチドバリアント部位にわたってアンプリコンを増幅させることを含んでいてもよい。この多重反応は、単一の反応として、または異なる部分集合の多重反応のプールとして設定することができる。本明細書で提供される多重反応方法（例えば、本明細書に開示される大規模マルチプレックスＰＣＲ）は、改良された多重化、したがって、感度レベルを達成するのに役立つように増幅反応を行う例示的なプロセスを提供する。

特定の実施形態において、マルチプレックスＰＣＲ反応は、反応の少なくとも１０％、２０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％についての制限されたプライマー条件で行われる。本明細書で提供される大規模多重反応を行うための改良された条件を使用することができる。

特定の態様において、循環腫瘍核酸が個体のサンプル中に存在するかどうかを決定するための上述の方法、およびその全ての実施形態は、システムを用いて行うことができる。本開示は、上述の方法を行うための特定の機能的特徴および構造的特徴に関する教示を提供する。非限定的な例として、システムは、以下を含む。

サンプルからのデータを分析して、個体における染色体セグメント上の多型遺伝子座のセットでの倍数性を決定するような構成の入力プロセッサと、

倍数性の決定に基づき、多型遺伝子座に存在する対立遺伝子不均衡のレベルを決定するような構成であり、０．５％に等しいか、またはこれより大きい対立遺伝子不均衡が、循環の存在の指標である、モデラー。

単一ヌクレオチドバリアントを検出するための例示的な実施形態
特定の態様において、サンプル中の単一ヌクレオチドバリアントを検出するための方法が本明細書で提供される。本明細書で提供される改良された方法は、サンプル中の０．０１５、０．０１７、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４または０．５％のＳＮＶの検出限界を達成することができる。ＳＮＶを検出するための全ての実施形態は、システムを用いて行うことができる。本開示は、上述の方法を行うための特定の機能的特徴および構造的特徴に関する教示を提供する。さらに、コンピュータ可読コードを含み、処理デバイスによって実行されると、処理デバイスに、本明細書で提供されるＳＮＶを検出するための方法を行わせる、非一時的コンピュータ可読媒体を含む実施形態が本明細書で提供される。

したがって、一実施形態において、単一ヌクレオチドバリアントが、個体からのサンプル中のゲノム位置のセットに存在するかどうかを決定する方法であって、それぞれのゲノム位置について、そのゲノム位置に広がるアンプリコンについての効率およびサイクルあたりのエラー率の推定値を、トレーニングデータセットを用いて作成することと、サンプル中のそれぞれのゲノム位置について、観測されたヌクレオチド同一性情報を受信することと、それぞれのゲノム位置についての増幅効率およびサイクルあたりのエラー率の推定値を独立して用い、それぞれのゲノム位置での観測されたヌクレオチド同一性情報を、異なるバリアントの割合のモデルと比較することによって、それぞれのゲノム位置にある１つ以上の実際の変異から得られる単一ヌクレオチドバリアントの割合の確率のセットを決定することと、それぞれのゲノム位置についての確率のセットから、最も可能性が高い実際のバリアントの割合および信頼性を決定することと、を含む、方法が本明細書で提供される。

単一ヌクレオチドバリアントが存在するかどうかを決定するための方法の例示的な実施形態において、効率およびサイクルあたりのエラー率の推定値は、ゲノム位置に広がるアンプリコンのセットについて作成される。例えば、ゲノム位置に広がる２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００個、またはもっと多くのアンプリコンが含まれていてもよい。

単一ヌクレオチドバリアントが存在するかどうかを決定するための方法の例示的な実施形態において、観測されるヌクレオチド同一性情報は、各ゲノム位置についての総リードの観測数および各ゲノム位置についてのバリアント対立遺伝子リードの観測数を含む。

単一ヌクレオチドバリアントが存在するかどうかを決定するための方法の例示的な実施形態において、サンプルは、血漿サンプルであり、単一ヌクレオチドバリアントは、サンプルの循環腫瘍ＤＮＡ中に存在する。

別の実施形態において、個体からのサンプル中に存在する単一ヌクレオチドバリアントの割合を推定する方法が本明細書で提供される。本方法は、ゲノム位置のセットで、それらのゲノム位置に広がる１つ以上のアンプリコンについての効率およびサイクルあたりのエラー率の推定値を、トレーニングデータセットを用いて作成する工程と、サンプル中のそれぞれのゲノム位置について、観測されたヌクレオチド同一性情報を受信する工程と、アンプリコンの増幅効率およびサイクルあたりのエラー率を用い、実際の変異分子の初期の割合を含む検索空間について、分子の総数、バックグラウンドエラー分子および実際の変異分子についての平均および分散についての平均および分散の推定値を作成する工程と、平均および分散の推定値を用い、分布を、サンプル中の観測されたヌクレオチド同一性情報にフィッティングすることによって最も可能性の高い実際の単一ヌクレオチドバリアントの割合を決定することによって、実際の変異から得られるサンプル中に存在する単一ヌクレオチドバリアントの割合を決定する工程と、を含む。

サンプル中に存在する単一ヌクレオチドバリアントの割合を推定するためのこの方法の例示的な例では、サンプルは、血漿サンプルであり、単一ヌクレオチドバリアントは、サンプルの循環腫瘍ＤＮＡ中に存在する。

本発明のこの実施形態のトレーニングデータセットは、典型的には、１名の健康な個体または好ましくは健康な個体群からのサンプルを含む。特定の例示的な実施形態において、トレーニングデータセットは、同じ日に分析されるか、または１つ以上の試験中のサンプルについて同じランで分析される。例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３６、４８、９６、１００、１９２、２００、２５０、５００、１０００、またはもっと多くの健康な個体の群からのサンプルを使用して、トレーニングデータセットを作成してもよい。さらに多数の健康な個体（例えば、９６名以上）についてデータが利用可能である場合、試験中のサンプルについて本方法を実行する前にランが行われる場合であっても、増幅効率の推定値についての信頼性が増加する。ＰＣＲのエラー率は、エラー率がアンプリコンあたりであるため、ＳＮＶ塩基位置についてだけではなく、ＳＮＶ周囲の全増幅領域について作成された核酸配列情報を使用してもよい。例えば、５０名の個体からのサンプルを用い、ＳＮＶ周囲の２０塩基対アンプリコンを配列決定すると、１０００塩基リードからのエラー頻度データを使用して、エラー頻度率を決定することができる。

典型的には、増幅効率は、増幅するセグメントについての増幅効率の平均および標準偏差を推定し、次いで、これを分布モデル（例えば、二項分布またはベータ二項分布）にフィッティングすることによって推定される。既知のサイクル数を有するＰＣＲについてエラー率が決定され、次いで、サイクルあたりのエラー率が推定される。

特定の例示的な実施形態において、試験データセットの開始時分子を推定することは、さらに、リードの観測数が、リード数の推定値と有意に異なっている場合に、工程（ｂ）で推定される開始時の分子数を用い、試験データセットについての効率の推定値を更新することを含む。次いで、この推定値は、新たな効率および／または開始分子について更新することができる。

分子の総数、バックグラウンドエラー分子および実際の変異分子を推定するために使用される検索空間は、ＳＮＶ塩基であるＳＮＶ位置にある塩基のコピーの下限で０．１％、０．２％、０．２５％、０．５％、１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％または２５％、上限で１％、２％、２．５％、５％、１０％、１２．５％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、９０％または９５％の検索空間を含んでいてもよい。これより低い範囲である、下限で０．１％、０．２％、０．２５％、０．５％または１％、上限で１％、２％、２．５％、５％、１０％、１２．５％または１５％が、血漿サンプルについての例示的な例で使用されてもよく、ここで、本方法は、循環腫瘍ＤＮＡを検出する。腫瘍サンプルには、さらに高い範囲が使用される。

分布は、総分子における総エラー分子の数（バックグラウンドエラーおよび実際の変異）に対してフィッティングされ、検索空間におけるそれぞれの可能な実際の変異について尤度または可能性を計算する。この分布は、二項分布またはベータ二項分布であってもよい。

最も可能性の高い実際の変異は、最も可能性の高い実際の変異の割合を決定し、分布のフィッティングからのデータを用いて信頼性を計算することによって、決定される。例示的な例として、本明細書で提供される臨床的解釈を制限することを意図しないが、平均変異率が高い場合、ＳＮＶの陽性決定を行うのに必要な信頼性の割合は、低くなる。例えば、最も可能性の高い仮説を用いたサンプル中のＳＮＶについての平均変異率が５％であり、信頼性の割合が９９％である場合、陽性ＳＮＶのコールが行われるだろう。他方で、この例示的な例について、最も可能性の高い仮説を用いたサンプル中のＳＮＶについての平均変異率が１％であり、信頼性の割合が５０％である場合、特定の状況において、陽性ＳＮＶのコールは行われないだろう。データの臨床的解釈は、感度、特異性、有病率および代替製品の入手可能性の関数であり得ることが理解されるだろう。

ある例示的な実施形態において、サンプルは、循環ＤＮＡサンプル、例えば、循環腫瘍ＤＮＡサンプルである。

別の実施形態において、個体からの試験サンプル中の１つ以上の単一ヌクレオチドバリアントを検出する方法が本明細書で提供される。本実施形態に係る方法は、以下の工程を含む。

配列決定ランで作成された結果に基づき、単一ヌクレオチドバリアント位置のセットにおけるそれぞれの単一ヌクレオチドバリアント位置について、複数の正常な個体それぞれからの複数の対照サンプルについてのバリアント対立遺伝子頻度の中央値を決定して、閾値を下回る、正常なサンプルにおいてバリアント対立遺伝子頻度の中央値を有する選択された単一ヌクレオチドバリアント位置を特定し、単一ヌクレオチドバリアント位置それぞれについて外れ値サンプルを除去した後、単一ヌクレオチドバリアント位置それぞれについてバックグラウンドエラーを決定する工程と、試験サンプルについての配列決定ランで作成されたデータに基づき、試験サンプルについて選択された単一ヌクレオチドバリアント位置について観測されたリード深度の重み付けされた平均および分散を決定する工程と、コンピュータを用い、統計的に有意なリード深度の重み付けされた平均を有する１つ以上の単一ヌクレオチドバリアント位置を、その位置についてのバックグラウンドエラーと比較して特定することによって、１つ以上の単一ヌクレオチドバリアントを検出する工程。

１つ以上のＳＮＶを検出するためのこの方法の特定の実施形態において、サンプルは、血漿サンプルであり、対照サンプルは、血漿サンプルであり、検出された１つ以上の検出された単一ヌクレオチドバリアントは、サンプルの循環腫瘍ＤＮＡ中に存在する。１つ以上のＳＮＶを検出するためのこの方法の特定の実施形態において、複数の対照サンプルは、少なくとも２５個のサンプルを含む。特定の例示的な実施形態において、複数の対照サンプルは、下限で少なくとも５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００または２５０個のサンプル、上限で１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、２５０、５００および１０００個のサンプルである。

１つ以上のＳＮＶを検出するためのこの方法の特定の実施形態において、外れ値が、高スループット配列決定ランで作成されたデータから除去され、観測されたリード深度の重み付けされた平均を計算し、観測された分散が決定される。１つ以上のＳＮＶを検出するためのこの方法の特定の実施形態において、試験サンプルについてのそれぞれの単一ヌクレオチドバリアント位置についてのリード深度は、少なくとも１００リードである。

１つ以上のＳＮＶを検出するためのこの方法の特定の実施形態において、配列決定ランは、制限されたプライマー反応条件で行われる多重増幅反応を含む。本明細書で提供される多重増幅反応を行うための改善された方法を使用して、例示的な例で、これらの実施形態を行う。

理論に限定されないが、本実施形態の方法は、正常な血漿サンプルを用いたバックグラウンドエラーモデルを利用し、これを試験中のサンプルとして同じ配列決定ランで配列決定し、ランに特有のアーチファクトを考慮する。閾値、例えば、０．１％、０．２％、０．２５％、０．５％、０．７５％および１．０％を超える通常のバリアント対立遺伝子頻度の中央値を有するノイズ位置を除去する。

ノイズおよびコンタミネーションを考慮するために、外れ値のサンプルをこのモデルから繰り返し除去する。全てのゲノム遺伝子座のそれぞれの塩基置換について、リード深度で重み付けされた平均および誤差の標準偏差を計算する。特定の例示的な実施形態において、閾値のリード数（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２５０、５００または１０００個のバリアントリード）を少なくとも有し、特定の実施形態においてバックグラウンドエラーモデルに対するａ１ Ｚスコアが２．５、５、７．５または１０より大きい単一ヌクレオチドバリアント位置を有するサンプル（例えば、腫瘍または細胞を含まない血漿サンプル）は、候補変異として計数される。

特定の実施形態において、範囲の下限で１００、２５０、５００、１，０００、２０００、２５００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５，００００、５０，０００または１００，０００より多く、上限で２０００、２５００、５，０００、７，５００、１０，０００、２５，０００、５０，０００、１００，０００、２５０，０００または５００，０００個のリードのリード深度が、単一ヌクレオチドバリアント位置のセットにおけるそれぞれの単一ヌクレオチドバリアント位置についての配列決定ランで達成される。典型的には、配列決定ランは、高スループット配列決定ランである。試験中のサンプルについて作成された平均または中央値の値は、例示的な実施形態において、リード深度によって重み付けされる。したがって、バリアント対立遺伝子決定が、１０００リードにおいて１個のバリアント対立遺伝子が検出されたサンプル中で実際のものである尤度は、１０，０００リードにおいて１個のバリアント対立遺伝子が検出されたサンプルよりも大きく重み付けされる。バリアント対立遺伝子（すなわち変異）の決定が、１００％の信頼性で行われないため、特定された単一ヌクレオチドバリアントは、候補バリアントまたは候補変異と考えられてもよい。

フェージングデータの分析のための例示的な試験統計
例示的な試験統計は、遺伝的に同一ではない２つ以上の細胞に由来するＤＮＡまたはＲＮＡを含む混合サンプルであることが知られているか、またはそれが疑われるサンプルからのフェージングデータの分析について、以下に記載される。ｆは、目的のＤＮＡまたはＲＮＡの分率、例えば、目的のＣＮＶを含むＤＮＡまたはＲＮＡの分率、または目的の細胞、例えば、癌細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡの分率を示す。癌試験のいくつかの実施形態において、ｆは、癌細胞と正常細胞の混合物中の癌細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡの分率を示すか、またはｆは、癌細胞と正常細胞の混合物における癌細胞の分率を示す。なお、これは、ＤＮＡの２つのコピーが目的のそれぞれの細胞によって与えられると仮定すると、目的の細胞からのＤＮＡの分率を指す。これは、欠失または重複しているセグメントでの目的の細胞からのＤＮＡの分率とは異なる。

各ＳＮＰの可能な対立遺伝子の値は、ＡおよびＢで示される。ＡＡ、ＡＢ、ＢＡおよびＢＢは、全ての可能な順序付き対立遺伝子対を示すために使用される。いくつかの実施形態において、順序付き対立遺伝子ＡＢまたはＢＡを含むＳＮＰが分析される。Ｎ_ｉは、ｉ番目のＳＮＰの配列リード数を示し、Ａ_ｉおよびＢ_ｉは、それぞれ対立遺伝子ＡおよびＢを示すｉ番目のＳＮＰのリード数を示す。以下を仮定する。
Ｎ_ｉ＝Ａ_ｉ＋Ｂ_ｉ

対立遺伝子比率Ｒ_ｉは、以下のように定義される。

Ｔは、標的とされるＳＮＰの数を示す。

一般性を失うことなく、いくつかの実施形態は、単一染色体セグメントに焦点を当てる。さらなる明確性の問題として、本明細書において、「第２の相同染色体セグメントと比較した場合の第１の相同染色体セグメント」との句は、染色体セグメントの第１のホモログおよび染色体セグメントの第２のホモログを意味する。いくつかのこのような実施形態において、標的ＳＮＰの全てが、目的のセグメント染色体に含まれる。他の実施形態において、複数の染色体セグメントは、可能なコピー数多型について分析される。

ＭＡＰ推定
この方法は、標的セグメントの欠失または重複を検出するために、順序付き対立遺伝子対を介したフェージングの知識を活用する。各ＳＮＰｉについて、以下のように定義する。

次いで、以下のように定義する。

種々のコピー数仮説（例えば、ダイソミーの仮説、第１または第２のホモログの欠失、または第１または第２のホモログの重複）でのＸ_ｉおよびＳの分布を以下に記載する。

ダイソミー仮説
標的セグメントが欠失または重複していないという仮説の下、

式中、

一定のリード深度Ｎを仮定すると、以下のパラメータを有する二項分布Ｓを与える。

およびＴ

否定仮説
第１のホモログが欠失する（すなわちＡＢ ＳＮＰがＢになり、ＢＡ ＳＮＰがＡになる）という仮説の下で、Ｒ_ｉは、二項分布を有し、ＡＢ ＳＮＰについてパラメータ

およびＴであり、ＢＡ ＳＮＰについて

およびＴを有する。したがって、

一定のリード深度Ｎを仮定すると、以下のパラメータを有する二項分布Ｓを与える。

およびＴ

第２のホモログが欠失する（すなわちＡＢ ＳＮＰがＡになり、ＢＡ ＳＮＰがＢになる）という仮説の下で、Ｒ_ｉは、二項分布を有し、ＡＢ ＳＮＰについてパラメータ

およびＴであり、ＢＡ ＳＮＰについて

およびＴを有する。したがって、

一定のリード深度Ｎを仮定すると、以下のパラメータを有する二項分布Ｓを与える。

およびＴ

重複仮説
第１のホモログが重複する（すなわちＡＢ ＳＮＰがＡＡＢになり、ＢＡ ＳＮＰがＢＢＡになる）という仮説の下で、Ｒ_ｉは、二項分布を有し、ＡＢ ＳＮＰについてパラメータ

およびＴであり、ＢＡ ＳＮＰについて

およびＴを有する。したがって、

一定のリード深度Ｎを仮定すると、以下のパラメータを有する二項分布Ｓを与える。

およびＴ

第２のホモログが重複する（すなわちＡＢ ＳＮＰがＡＢＢになり、ＢＡ ＳＮＰがＢＡＡになる）という仮説の下で、Ｒ_ｉは、二項分布を有し、ＡＢ ＳＮＰについてパラメータ

およびＴであり、ＢＡ ＳＮＰについて

およびＴを有する。したがって、

一定のリード深度Ｎを仮定すると、以下のパラメータを有する二項分布Ｓを与える。

およびＴ

分類
上の章で示されるように、Ｘ_ｉは、以下を有する、バイナリランダム変数である。

これにより、各仮説の下で試験統計Ｓの確率を計算することができる。測定データを考慮した各仮説の確率を計算することができる。いくつかの実施形態において、最大確率を有する仮説が選択される。所望な場合、Ｓについての分布は、各Ｎ_ｉを一定の到達深さＮで概算することによって、またはリード深度を一定値Ｎに切り捨てることによって単純化することができる。この単純化は、以下を与える。

ｆの値は、測定データを考慮した、ｆの最も可能性の高い値、例えば、アルゴリズム（例えば、検索アルゴリズム）、例えば、最大尤度の推定、経験的な最大推定またはベイズ推定を用いた最良データフィッティングを作成するｆの値を選択することによって、推定することができる。いくつかの実施形態において、複数の染色体セグメントが分析され、ｆの値は、各セグメントについてのデータに基づいて推定される。全ての標的細胞が、これらの重複または欠失を有する場合、これらの異なるセグメントについてのデータに基づくｆの推定値は同様である。いくつかの実施形態において、ｆは、例えば、癌および非癌性ＤＮＡまたはＲＮＡのメチル化（低メチル化または高メチル化）の差に基づき、癌細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡの分率を決定することによって、実験的に測定される。

単一仮説拒否
ダイソミー仮説についてのＳの分布は、ｆに依存しない。したがって、測定データの確率は、ｆを計算することなく、ダイソミー仮説について計算することができる。単一仮説否定試験は、ダイソミーの帰無仮説に使用することができる。いくつかの実施形態において、ダイソミー仮説についてのＳの確率が計算され、ダイソミーの仮説は、その確率が所与の閾値を下回る場合（例えば、１，０００分の１未満である場合）、否定される。このことは、染色体セグメントの重複または欠失が存在することを示す。所望な場合、偽陽性率は、閾値を調整することによって変えることができる。

フェージングデータの分析のための例示的な方法
例示的な方法は、遺伝的に同一ではない２つ以上の細胞に由来するＤＮＡまたはＲＮＡを含む混合サンプルであることが知られているか、またはそれが疑われるサンプルからのデータの分析について、以下に記載される。いくつかの実施形態において、フェージングデータが使用される。いくつかの実施形態において、本方法は、各対立遺伝子比率の計算値について、ある特定の遺伝子座についての対立遺伝子比率の計算値が対立遺伝子比率の予測値を上回るか、または下回るかと、その差の大きさを決定することを伴う。いくつかの実施形態において、尤度分布は、特定の仮説についての遺伝子座での対立遺伝子比率について決定され、対立遺伝子比率の計算値が尤度分布の中心に近いほど、その仮説が正しい可能性が高い。いくつかの実施形態において、本方法は、ある仮説が各遺伝子座について正しい尤度を決定することを伴う。いくつかの実施形態において、本方法は、ある仮説が各遺伝子座について正しい尤度を決定することと、各遺伝子座についてのその仮説の確率を組み合わせることとを伴い、最大の結合確率を有する仮説が選択される。いくつかの実施形態において、本方法は、ある仮説が、各遺伝子座について、また、サンプル中の総ＤＮＡまたはＲＮＡに対する１つ以上の標的細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡのそれぞれの可能な比率について、正しい尤度を決定することを伴う。いくつかの実施形態において、各仮説についての結合確率は、各遺伝子座および各可能な比率についての仮説の確率を合わせることによって決定され、最大の結合確率を有する仮説が選択される。

一実施形態において、以下の仮説が考慮される：Ｈ_１１（全ての細胞が正常である）、Ｈ_１０（ホモログ１のみを有する細胞の存在、したがって、ホモログ２の欠失）、Ｈ_０１（ホモログ２のみを有する細胞の存在、したがって、ホモログ１の欠失）、Ｈ_２１（ホモログ１の重複を有する細胞の存在）、Ｈ_１２（ホモログ２の重複を有する細胞の存在）。癌細胞またはモザイク細胞などの標的細胞の分率ｆ（または標的細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡの分率）について、ヘテロ接合性（ＡＢまたはＢＡ）ＳＮＰについての対立遺伝子比率の予測値は、以下のように見出すことができる。
数式（１）：

バイアス、コンタミネーションおよび配列決定エラーの修正：
ＳＮＰでの観測Ｄ_ｓは、各対立遺伝子が存在する元々のマッピングされたリードの数ｎ_Ａ ^０およびｎ_Ｂ ^０からなる。次いで、ＡおよびＢの対立遺伝子の増幅におけるバイアスの予想値を用い、修正されたリードｎ_Ａおよびｎ_Ｂを見出すことができる。

ｃ_ａは、周囲コンタミネーション（例えば、空気または環境中のＤＮＡからのコンタミネーション）を示し、ｒ（ｃ_ａ）は、周囲汚染物質についての対立遺伝子比率を示す（最初は０．５とみなされる）。さらに、ｃ_ｇは、遺伝子型コンタミネーション率（例えば、別のサンプルからのコンタミネーション）を示し、ｒ（ｃ_ｇ）は、その汚染物質についての対立遺伝子比率である。ｓ_ｅ（Ａ，Ｂ）およびｓ_ｅ（Ｂ，Ａ）は、１つの対立遺伝子を異なる対立遺伝子とコールする配列決定エラーを示す（例えば、Ｂ対立遺伝子が存在する場合に、Ａ対立遺伝子を誤って検出することによる）。

周囲コンタミネーション、遺伝子型コンタミネーションおよび配列決定エラーを修正することによって、所与の対立遺伝子比率の予測値ｒについて、対立遺伝子比率の観測値ｑ（ｒ，ｃ_ａ，ｒ（ｃ_ａ），ｃ_ｇ，ｒ（ｃ_ｇ），ｓ_ｅ（Ａ，Ｂ），ｓ_ｅ（Ｂ，Ａ））を見出すことができる。

汚染物質の遺伝子型は不明であるため、集合頻度を使用して、Ｐ（ｒ（ｃ_ｇ））を見出すことができる。より具体的には、ｐは、対立遺伝子の１つ（参照対立遺伝子と呼ばれる場合がある）についての集合頻度である。次いで、Ｐ（ｒ（ｃ_ｇ）＝０）＝（１−ｐ）^２、Ｐ（ｒ（ｃ_ｇ）＝０）＝２ｐ（１−ｐ）およびＰ（ｒ（ｃｇ）＝０）＝ｐ^２である。ｒ（ｃ_ｇ）にわたる条件付期待値を使用して、Ｅ［ｑ（ｒ，ｃ_ａ，ｒ（ｃ_ａ），ｃ_ｇ，ｒ（ｃ_ｇ），ｓ_ｅ（Ａ，Ｂ），ｓ_ｅ（Ｂ，Ａ））］を決定することができる。なお、周囲コンタミネーションおよび遺伝子型コンタミネーションは、ホモ接合性ＳＮＰを用いて決定され、したがって、欠失または重複の有無によって影響を受けない。さらに、所望な場合、参照染色体を用い、周囲コンタミネーションおよび遺伝子型コンタミネーションを測定することが可能である。

各ＳＮＰでの尤度：
以下の式は、対立遺伝子比率ｒを考慮して、ｎ_Ａおよびｎ_Ｂを観測する確率を与える。
数式（２）：

Ｄ_ｓは、ＳＮＰについてのデータを示す。各仮説ｈε｛Ｈ_１１，Ｈ_０１，Ｈ_１０，Ｈ_２１，Ｈ_１２｝について、数式（１）においてｒ＝ｒ（ＡＢ，ｈ）またはｒ＝ｒ（ＢＡ，ｈ）として、ｒ（ｃ_ｇ）にわたる条件付期待値を見出し、対立遺伝子比率の観測値Ｅ［ｑ（ｒ，ｃ_ａ，ｒ（ｃ_ａ），ｃ_ｇ，ｒ（ｃ_ｇ））］を決定することができる。次いで、数式（２）においてｒ＝Ｅ［ｑ（ｒ，ｃ_ａ，ｒ（ｃ_ａ），ｃ_ｇ，ｒ（ｃ_ｇ），ｓ_ｅ（Ａ，Ｂ），ｓ_ｅ（Ｂ，Ａ））］として、Ｐ（Ｄ_ｓ｜ｈ，ｆ）を決定することができる。

検索アルゴリズム：
いくつかの実施形態において、外れ値であると思われる対立遺伝子比率を有するＳＮＰは、無視される（例えば、平均値よりも少なくとも２または３の標準偏差分、上または下である対立遺伝子比率を有するＳＮＰを無視するか、または除外することによる）。なお、この手法について特定される利点は、より高い割合のモザイク存在下、対立遺伝子比率の可変性を高くし得るため、ＳＮＰがモザイクに起因してトリミングされないことを確実にすることである。

Ｆ＝｛ｆ_１，・・・，ｆ_Ｎ｝は、モザイクの割合についての検索空間を示す（例えば、腫瘍分率）。各ＳＮＰおよびｆε ＦでのＰ（Ｄｓ｜ｈ，ｆ）を決定し、全てのＳＮＰについての尤度を合わせることができる。

このアルゴリズムは、各仮説について、各ｆにわたって行う。検索方法を用い、欠失または重複仮説の信頼性が、欠失がなく、重複がない仮説の信頼性よりも高い場合に、ｆの範囲Ｆ^＊が存在するとき、モザイクが存在すると結論付ける。いくつかの実施形態において、Ｆ^＊におけるＰ（Ｄ_ｓ｜ｈ，ｆ）の最大尤度推定値が決定される。所望な場合、ｆε Ｆ^＊にわたる条件付期待値を決定してもよい。所望な場合、各仮説についての信頼性を決定することができる。

いくつかの実施形態において、ベータ二項分布が、二項分布の代わりに使用される。いくつかの実施形態において、参照染色体または染色体セグメントを使用して、ベータ二項式のサンプル特有のパラメータを決定する。

シミュレーションを用いた理論性能：
所望な場合、所与のリード深度（ＤＯＲ）で、参照リードの数をＳＮＰにランダムに割り当てることによって、アルゴリズムの理論性能を評価することができる。通常の場合、二項確率パラメータについてｐ＝０．５を使用し、欠失または重複について、ｐをそれに応じて修正する。各シミュレーションの例示的な入力パラメータは、以下のとおりである。（１）ＳＮＰの数Ｓ、（２）ＳＮＰあたりの一定ＤＯＲ Ｄ、（３）ｐおよび（４）実験数。

第１のシミュレーション実験：
この実験は、Ｓε｛５００，１０００｝，Ｄε｛５００，１０００｝およびｐε｛０％，１％，２％，３％，４％，５％｝に焦点が当てられた。各設定で、１，０００のシミュレーション実験を行った（したがって、フェーズを伴う２４，０００実験およびフェーズを伴わない２４，０００実験）。二項分布からのリード数をシミュレーションした（所望な場合、他の分布を使用してもよい）。偽陽性率（ｐ＝０％の場合）および偽陰性率（ｐ＞０％の場合）は、フェーズ情報を用い、またはフェーズ情報を用いずに決定した。なお、特にＳ＝１０００、Ｄ＝１０００について、フェーズ情報は非常に有用である。しかし、Ｓ＝５００、Ｄ＝５００について、このアルゴリズムは、試験される条件からのフェーズアウトの有無に拘わらず、最も高い偽陽性率を有する。

フェーズ情報は、特に、低いモザイク割合（≦３％）で有用である。フェーズ情報がなければ、欠失に対する信頼性が、Ｈ_１０およびＨ_０１に対して等しい機会を割り当てることによって決定されるため、ｐ＝１％について高レベルの偽陰性が観測され、１つの仮説に有利な小さな偏差は、他の仮説からの低い尤度を補うのに十分ではない。このことは、重複にも同様に当てはまる。また、このアルゴリズムは、ＳＮＰの数と比較して、リード深度に対してより感度が高いようである。フェーズ情報を用いた結果について、完全なフェーズ情報が、多数の連続ヘテロ接合性ＳＮＰについて利用可能であると仮定する。所望な場合、ハプロタイプ情報は、より小さなセグメントについてのハプロタイプを確率的に合わせることによって得ることができる。

第２のシミュレーション実験：
この実験は、それぞれの設定で、Ｓε｛１００，２００，３００，４００，５００｝、Ｄε｛１０００，２０００，３０００，４０００，５０００｝およびｐε｛０％，１％，１．５％，２％，２．５％，３％｝および１００００のランダム実験に焦点を当てた。偽陽性率（ｐ＝０％の場合）および偽陰性率（ｐ＞０％の場合）は、フェーズ情報を用い、またはフェーズ情報を用いずに決定した。偽陰性率は、ハプロタイプ情報を用い、Ｄ≧３０００およびＮ≧２００について１０％未満であり、一方、Ｄ＝５０００およびＮ≧４００について同じ性能に達する。小さなモザイク割合について、偽陰性率の差は特に目立つものであった。例えば、ｐ＝１％の場合、ハプロタイプデータがなければ、２０％未満の偽陰性率は決して達成されず、一方、Ｎ≧３００およびＤ≧３０００については０％に近い。ｐ＝３％の場合、ハプロタイプデータを用いると０％の偽陰性率が観測され、一方、ハプロタイプデータがなければ、同じ性能に達するのにＮ≧３００およびＤ≧３０００が必要である。

フェージングデータを用いずに欠失および重複を検出するための例示的な方法
いくつかの実施形態において、非フェージング遺伝子データを使用して、個体のゲノムにおいて（例えば、１つ以上の細胞のゲノムにおいて、またはｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡにおいて）、第２の相同染色体セグメントと比較して、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰表現が存在するかどうかを決定する。いくつかの実施形態において、フェージング遺伝子データを使用するが、フェージングは無視される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡのサンプルは、２つ以上の遺伝的に異なる細胞からのｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡを含む固体からのｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡの混合サンプルである。いくつかの実施形態において、本方法は、各遺伝子座について、対立遺伝子比率の計算値と対立遺伝子比率の予測値との差の大きさを利用する。

いくつかの実施形態において、本方法は、各遺伝子座での各対立遺伝子の量を測定することによって、個体からの１つ以上の細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡのサンプル中の染色体または染色体セグメント上の多型遺伝子座のセットでの遺伝子データを得ることを伴う。いくつかの実施形態において、対立遺伝子比率は、サンプルの由来となる少なくとも１つの細胞においてヘテロ接合性である遺伝子座について計算される。いくつかの実施形態において、特定の遺伝子座について対立遺伝子比率の計算値は、対立遺伝子の１つの測定量を、その遺伝子座についての全ての対立遺伝子の総測定量によって割り算したものである。いくつかの実施形態において、特定の遺伝子座について対立遺伝子比率の計算値は、対立遺伝子（例えば、第１の相同染色体セグメント上の対立遺伝子）の１つの測定量を、その遺伝子座についての１つ以上の他の対立遺伝子（例えば、第２の相同染色体セグメント上の対立遺伝子）の測定量によって割り算したものである。対立遺伝子比率の計算値および対立遺伝子比率の予測値は、本明細書に記載される方法のいずれか、または任意の標準的な方法（例えば、本明細書に記載される対立遺伝子比率の計算値または対立遺伝子比率の予測値の任意の数学的変換）を用いて計算されてもよい。

いくつかの実施形態において、試験統計は、各遺伝子座について、対立遺伝子比率の計算値と対立遺伝子比率の予測値との差の大きさに基づいて計算される。いくつかの実施形態において、試験統計Δは、以下の式を用いて計算される。

式中、δ_ｉは、ｉ番目の遺伝子座についての対立遺伝子比率の計算値と対立遺伝子比率の予測値の間の差の大きさであり、
式中、μ_ｉは、δ_ｉの平均値であり、
式中、

は、δ_ｉの標準偏差である。

例えば、対立遺伝子比率の予測値が０．５である場合に、δ_ｉを以下のように定義することができる。

μ_ｉおよびδ_ｉの値は、Ｒ_ｉが二項ランダム変数であるという事実を用いて計算することができる。いくつかの実施形態において、標準偏差は、全ての遺伝子座について同じであると仮定される。いくつかの実施形態において、標準偏差の平均値または重み付けされた平均値、または標準偏差の推定値が、

の値について使用される。いくつかの実施形態において、試験統計は、正規分布を有すると仮定される。例えば、中心極限定理は、遺伝子座の数（例えば、ＳＮＰの数Ｔ）が大きくなるにつれて、Δの分布が正規分布に収束することを示唆する。

いくつかの実施形態において、細胞の１つ以上のゲノム中の染色体または染色体セグメントのコピー数を示す１つ以上の仮説のセットが列挙される。いくつかの実施形態において、試験統計に基づいて最も可能性が高い仮説が選択され、それによって、細胞の１つ以上のゲノム中の染色体または染色体セグメントのコピー数を決定する。いくつかの実施形態において、試験統計が、ある仮説についての試験統計の分布に属する確率が上限閾値を超える場合、その仮説が選択される。試験統計が、ある仮説についての試験統計の分布に属する確率が、下限閾値を下回る場合、その１つ以上の仮説は否定されるか、または試験統計が、ある仮説についての試験統計の分布に属する確率が、下限閾値から上限閾値の間である場合、またはその確率が、十分に高い信頼性で決定されない場合、その仮説は、選択されず、または否定もされない。いくつかの実施形態において、上限および／または下限閾値は、例えば、トレーニングデータからの分布（例えば、既知のコピー数を有するサンプル、例えば、二倍体サンプルまたは特定の欠失または重複を有することが知られているサンプル）からの経験的な分布から決定される。このような経験的な分布を使用して、単一仮説否定試験のための閾値を選択することができる。なお、試験統計Δは、Ｓから独立しているため、所望な場合、どちらも独立して使用することができる。

対立遺伝子分布またはパターンを用いて欠失または重複を検出するための例示的な方法
この章は、第２の相同染色体セグメントと比較して、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現が存在するかどうかを決定する方法を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、（ｉ）個体の１つ以上の細胞（例えば癌細胞）のゲノム中に存在する染色体または染色体セグメントのコピー数を示す複数の仮説、または（ｉｉ）個体の１つ以上の細胞のゲノム中の第２の相同染色体セグメントと比較して、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現の程度を示す複数の仮説を列挙することを伴う。いくつかの実施形態において、本方法は、染色体または染色体セグメント上の複数の多型遺伝子座（例えばＳＮＰ遺伝子座）で個体から遺伝子データを得ることを伴う。いくつかの実施形態において、それぞれの仮説についての個体の予測遺伝子型の確率分布が作成される。いくつかの実施形態において、得られた個体の遺伝子データと個体の予測遺伝子型の確率分布との間のデータフィッティングが計算される。いくつかの実施形態において、１つ以上の仮説は、データフィッティングに従ってランク付けされ、最も高くランク付けされた仮説が選択される。いくつかの実施形態において、検索アルゴリズムなどの技術またはアルゴリズムは、データフィッティングを計算する工程、仮説をランク付けする工程、または最も高くランク付けされた仮説を選択する工程のうちの１つ以上のために使用される。いくつかの実施形態において、データフィッティングは、ベータ二項分布に対するフィッティングまたは二項分布に対するフィッティングである。いくつかの実施形態において、この技術またはアルゴリズムは、最大尤度の推定、経験的な最大推定、ベイズ推定、動的推定（例えば、動的ベイズ推定）および期待最大化推定からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本方法は、得られた遺伝子データと遺伝子データの予測値に対して、上述の技術またはアルゴリズムを適用することを含む。

いくつかの実施形態において、本方法は、（ｉ）個体の１つ以上の細胞（例えば癌細胞）のゲノム中に存在する染色体または染色体セグメントのコピー数を示す複数の仮説、または（ｉｉ）個体の１つ以上の細胞のゲノム中の第２の相同染色体セグメントと比較して、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現の程度を示す複数の仮説を列挙することを伴う。いくつかの実施形態において、本方法は、染色体または染色体セグメント上の複数の多型遺伝子座（例えばＳＮＰ遺伝子座）で個体から遺伝子データを得ることを伴う。いくつかの実施形態において、遺伝子データは、複数の多型遺伝子座についての対立遺伝子数を含む。いくつかの実施形態において、各仮説についての染色体または染色体セグメント上の複数の多型遺伝子座での対立遺伝子数の予測値について、結合分布モデルが作成される。いくつかの実施形態において、仮説のうちの１つ以上の相対確率は、結合分布モデルおよびサンプルについて測定された対立遺伝子数を用いて決定され、最大確率を有する仮説が選択される。

いくつかの実施形態において、対立遺伝子の分布またはパターン（例えば、対立遺伝子比率の計算値のパターン）を使用して、ＣＮＶ（例えば、欠失または重複）の有無を決定する。所望な場合、ＣＮＶの親起源は、このパターンに基づいて決定することができる。

例示的な計数方法／定量方法
いくつかの実施形態において、１つ以上の計数方法（定量方法とも呼ばれる）を使用して、１つ以上のＣＮＳ（例えば、染色体セグメントまたは全染色体の欠失または重複）を検出する。いくつかの実施形態において、１つ以上の計数方法を使用して、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現が、第１の相同染色体セグメントの重複または第２の相同染色体セグメントの欠失に起因するかどうかを決定する。いくつかの実施形態において、１つ以上の計数方法を使用して、重複する染色体セグメントまたは染色体の過剰なコピー数（例えば、１、２、３、４、またはもっと多い過剰なコピーが存在するかどうか）を決定する。いくつかの実施形態において、１つ以上の計数方法を使用して、多くの重複を有し、腫瘍分率が小さいサンプルを、重複が少なく、腫瘍分率が多いサンプルから区別する。例えば、１つ以上の計数方法を使用して、２個の過剰な染色体コピーを有し、腫瘍分率が２０％であるサンプルから、４個の過剰な染色体コピーを有し、腫瘍分率が１０％であるサンプルを区別してもよい。例示的な方法は、例えば、米国公開第２００７／０１８４４６７号、第２０１３／０１７２２１１号および第２０１２／０００３６３７号、米国特許第８，４６７，９７６号、第７，８８８，０１７号、第８，００８，０１８号、第８，２９６，０７６号および第８，１９５，４１５号、２０１４年６月５日に出願された米国出願第６２／００８，２３５号および２０１４年８月４日に出願された米国出願第６２／０３２，７８５号に開示されており、それぞれが、全体として参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態において、計数方法は、１つ以上の所与の染色体または染色体セグメントにマッピングするＤＮＡ配列に基づくリードの数を計数することを含む。いくつかのこのような方法は、特定の染色体または染色体セグメントにマッピングするＤＮＡ配列リードの数についての参照値（カットオフ値）の作成を伴い、過剰な値のリード数は、特定の遺伝子異常の指標である。

いくつかの実施形態において、１つ以上の遺伝子座についての全ての対立遺伝子の総測定量（例えば、多型または非多型遺伝子座の総数）を参照値と比較する。いくつかの実施形態において、参照量は、（ｉ）閾値または（ｉｉ）特定のコピー数仮説についての予測量である。いくつかの実施形態において、参照量（ＣＮＶが存在しない場合）は、欠失または重複を有しないことが知られているか、または予測される１つ以上の染色体または染色体セグメントについての１つ以上の遺伝子座についての全ての対立遺伝子の総測定量である。いくつかの実施形態において、参照量（ＣＮＶが存在する場合）は、欠失または重複を有することが知られているか、または予測される１つ以上の染色体または染色体セグメントについての１つ以上の遺伝子座についての全ての対立遺伝子の総測定量である。いくつかの実施形態において、参照量は、１つ以上の参照染色体または染色体セグメントについての１つ以上の遺伝子座についての全ての対立遺伝子の総測定量である。いくつかの実施形態において、参照量は、２つ以上の異なる染色体、染色体セグメント、または異なるサンプルについて決定される値の平均または中央値である。いくつかの実施形態において、ランダム（例えば、超並列ショットガン配列決定）または標的化配列決定を使用して、１つ以上の多型または非多型遺伝子座の量を決定する。

参照量を利用するいくつかの実施形態において、本方法は、（ａ）目的の染色体または染色体セグメントに対する遺伝物質の量を測定することと、（ｂ）工程（ａ）からの量を参照量と比較することと、（ｃ）この比較に基づき、欠失または重複の有無を特定することと、を含む。

参照染色体または染色体セグメントを利用するいくつかの実施形態において、本方法は、サンプルからのＤＮＡまたはＲＮＡを配列決定して、標的遺伝子座に整列する複数の配列タグを得ることを含む。いくつかの実施形態において、配列タグは、特定の標的遺伝子座に割り当てられるのに十分な長さを有し（例えば、１５〜１００ヌクレオチド長）、標的遺伝子座は、サンプル中に異常な分布を有することが疑われる少なくとも１つの第１の染色体または染色体セグメントと、サンプル中に正常に分布していると推定される少なくとも１つの第２の染色体または染色体セグメントとを含む、複数の異なる染色体または染色体セグメントに由来する。いくつかの実施形態において、複数の配列タグは、それらの対応する標的遺伝子座に割り当てられる。いくつかの実施形態において、第１の染色体または染色体セグメントの標的遺伝子座に割り当てる配列タグの数と、第２の染色体または染色体セグメントの標的遺伝子座に割り当てる配列タグの数を決定する。いくつかの実施形態において、これらの数を比較して、第１の染色体または染色体セグメントの異常分布（例えば、欠失または重複）の有無を決定する。

いくつかの実施形態において、ｆの値（例えば、腫瘍分率）をＣＮＶ決定に使用して、例えば、２つの染色体または染色体セグメントの量の差の観測値と、ｆの値を考慮して特定の種類のＣＮＶについて予測される差とを比較する（例えば、それぞれ、全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１２／０１９００２０号、米国公開第２０１２／０１９００２１号、米国公開第２０１２／０１９０５５７号、米国公開第２０１２／０１９１３５８号を参照）。例えば、ダイソミー参照染色体セグメントと比較した、腫瘍中で重複する染色体セグメントの量の差は、腫瘍分率が増加するにつれて増加する。いくつかの実施形態において、本方法は、目的の染色体または染色体セグメントの相対頻度を、参照染色体または染色体セグメント（例えば、ダイソミーであると予測されるか、または知られている染色体または染色体セグメント）と、ｆの値とを比較して、ＣＮＶの尤度を決定することを含む。例えば、第１の染色体または染色体セグメントと、参照染色体または染色体セグメントの量の差を、種々の可能なＣＮＶについてのｆの値を考慮して予測されるもの（例えば、目的の染色体セグメントの１つまたは２つの過剰なコピー）と比較してもよい。

以下の仮想例は、第１の相同染色体セグメントの重複と第２の相同染色体セグメントの欠失とを区別するための計数方法／定量方法の使用を示す。宿主の正常なダイソミーゲノムがベースラインであると考えると、正常細胞および癌細胞の混合物の分析は、混合物中のベースラインと癌のＤＮＡとの平均差を与える。例えば、サンプル中のＤＮＡの１０％が、アッセイによって標的とされる染色体の領域にわたって欠失を有する細胞に由来する場合を想像する。いくつかの実施形態において、定量手法は、この領域に対応するリードの量が、正常サンプルについて予測される量の９５％であると予測されることを示す。これは、標的領域の欠失を有する腫瘍細胞それぞれにおける２つの標的染色体領域の１つが欠けているため、この領域にマッピングするＤＮＡの総量は、９０％（正常細胞の場合）＋１／２×１０％（腫瘍細胞の場合）＝９５％である。これに代えて、いくつかの実施形態において、対立遺伝子手法は、ヘテロ接合性遺伝子座での対立遺伝子の比率が平均で１９：２０であることを示す。次に、サンプル中のＤＮＡの１０％が、アッセイによって標的とされる染色体の領域の５倍の焦点増幅を有する細胞に由来する場合を想像する。いくつかの実施形態において、定量手法は、この領域に対応するリードの量が、正常サンプルについて予測される量の１２５％であると予測されることを示す。これは、５倍の焦点増幅を有する腫瘍細胞それぞれにおける２つの標的染色体領域の１つが、標的領域にわたって過剰に５倍コピーされるため、この領域にマッピングするＤＮＡの総量は、９０％（正常細胞の場合）＋（２＋５）×１０％（腫瘍細胞の場合）／２＝１２５％である。これに代えて、いくつかの実施形態において、対立遺伝子手法は、ヘテロ接合性遺伝子座での対立遺伝子の比率が平均で２５：２０であることを示す。なお、対立遺伝子手法のみを用いる場合、１０％のｃｆＤＮＡを含むサンプル中の染色体領域にわたる５倍の焦点増幅は、４０％のｃｆＤＮＡを含むサンプル中の同じ領域にわたる欠失と同じであるように見える場合がある。これらの２つの場合では、欠失の場合に過小出現するハプロタイプは、焦点重複を有する場合において、ＣＮＶを含まないハプロタイプであるように見え、欠失の場合において、ＣＮＶを有しないハプロタイプは、焦点重複の場合において、過剰出現するハプロタイプであるように見える。この対立遺伝子手法によって作成される尤度と、定量手法によって作成される尤度とを組み合わせることで、この２つの確率を区別する。

参照サンプルを用いた例示的な計数方法／定量方法
１つ以上の参照サンプルを使用する例示的な定量方法は、２０１４年６月５日に出願された米国出願第６２／００８，２３５号および２０１４年８月４日に出願された米国出願第６２／０３２，７８５号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、１つ以上の染色体または目的の染色体上にＣＮＶを有しない可能性が最も高い１つ以上の参照サンプル（例えば、正常サンプル）は、腫瘍ＤＮＡ分率が最も高いサンプルを選択し、ｚスコアが０に最も近いサンプルを選択し、最も高い信頼性または尤度を有するＣＮＶが無いことに対応する仮説にデータが適合するサンプルを選択し、正常であることが知られているサンプルを選択し、癌を有する尤度が最も低い（例えば、年齢が低い、乳癌についてスクリーニングする場合に男性である、家族歴が無いなどの）個体からのサンプルを選択し、ＤＮＡのインプット量が最も多いサンプルを選択し、信号ノイズ比が最も高いサンプルを選択し、癌を有するという尤度に相関関係があると考えられている他の基準に基づいてサンプルを選択し、または基準のいくつかの組み合わせを用いてサンプルを選択することによって特定される。参照セットが選択されると、これらの場合がダイソミーであると仮定し、ＳＮＰあたりのバイアス、すなわち、実験に特有の増幅および各遺伝子座についての他の処理バイアスを推定することができる。次いで、この実験に特有のバイアスの推定値を使用して、目的の染色体、例えば、染色体２１の遺伝子座の測定におけるバイアスを、適切な場合には他の染色体遺伝子座について、ダイソミーが染色体２１について仮定されていない部分集合の一部ではないサンプルについて修正することができる。バイアスが、未知の倍数性を有するこれらのサンプルにおいて修正されたら、これらのサンプルについてのデータを、同じ方法または異なる方法を用いて２回分析し、個体がトリソミー２１に罹患しているかどうかを決定することができる。例えば、定量方法を、未知の倍数性を有する残りのサンプルに対して使用してもよく、ｚスコアは、染色体２１について修正された遺伝子データの測定値を用いて計算することができる。これに代えて、染色体２１の倍数性状態の予備的な推定の一部として、癌を有することが疑われる個体からのサンプルの腫瘍分率を計算することができる。ダイソミーの場合（ダイソミー仮説）に予測される修正されたリードの割合と、トリソミーの場合（トリソミー仮説）に予測される修正されたリードの割合を、その腫瘍分率を有する場合について計算することができる。これに代えて、腫瘍分率が前もって測定されていない場合、ダイソミー仮説およびトリソミー仮説のセットが、異なる腫瘍分率について作成されてもよい。それぞれの場合について、種々のＤＮＡ遺伝子座の選択および測定において、修正されたリードの割合の予測分布が、所与の予測統計変動を考慮して計算されてもよい。リードの修正された割合の観測値を、修正されたリードの割合の予測分布と比較してもよく、尤度比率を、未知の倍数性を有するサンプルそれぞれについて、ダイソミーおよびトリソミー仮説について計算することができる。最も高い尤度の計算値を有する仮説に関連する倍数性状態を、正しい倍数性状態として選択することができる。

いくつかの実施形態において、癌を有する尤度が十分に低いサンプルの部分集合を選択し、サンプルの対照セットとして機能させてもよい。この部分集合は、固定数であってもよく、または閾値を下回るサンプルのみを選択することに基づき、可変数であってもよい。サンプルの部分集合からの定量データを、組み合わせ、平均を計算し、または重み付け平均を用いて組み合わせてもよく、この重み付けは、正常であるサンプルの尤度に基づく。定量データを使用して、対照サンプルの即時バッチにおいてサンプルの配列決定をする増幅についての遺伝子座あたりのバイアスを決定してもよい。遺伝子座あたりのバイアスは、サンプルの他のバッチからのデータも含んでいてもよい。遺伝子座あたりのバイアスは、他の遺伝子座と比較して、その遺伝子座について観測される相対的な過剰増幅または相対過小増幅を示していてもよく、サンプルの部分集合がＣＮＶを含まないと仮定すると、過剰増幅または過小増幅の任意の観測値が、増幅および／または配列決定または他のバイアスに起因することを示していてもよい。遺伝子座あたりのバイアスは、アンプリコンのＧＣ含有量を考慮してもよい。遺伝子座は、遺伝子座あたりのバイアスを計算する目的のために、遺伝子座群にグループ分けされてもよい。複数の遺伝子座中のそれぞれの遺伝子座について、遺伝子座あたりのバイアスが計算されると、サンプルの部分集合中にはないサンプルのうちの１つ以上についての配列決定データと、場合により、サンプルの部分集合中にあるサンプルのうちの１つ以上が、各遺伝子座についての定量測定を調整して、その遺伝子座でのバイアスの効果を除去することによって修正されてもよい。例えば、患者の部分集合において、ＳＮＰ１が、平均の２倍の大きさのリード深度を有すると観測された場合、調整は、その大きさの半分の数を有するＳＮＰ１からの対応するリード数に置き換えることを伴っていてもよい。問題となっている遺伝子座がＳＮＰである場合、調整は、その遺伝子座での対立遺伝子それぞれに対応するリード数を半分にすることを伴っていてもよい。１つ以上のサンプル中の遺伝子座それぞれについての配列決定データが調整されたら、１つ以上の染色体領域でのＣＮＶの存在を検出する目的のために、ある方法を用いて分析されてもよい。

一例では、サンプルＡは、定量方法を用いて分析される正常細胞と癌性細胞の混合物に由来する増幅ＤＮＡの混合物である。以下は、例示的な可能なデータを示す。染色体２２上のｑアームの領域は、その領域にマッピングするＤＮＡの予測される値の９０％しか有していないことがわかり、ＨＥＲ２遺伝子に対応する焦点領域は、その領域にマッピングするＤＮＡの予測される値の１５０％を有することがわかり、染色体５のｐアームは、マッピングするＤＮＡの予測される値の１０５％を有することがわかっている。医師は、そのサンプルが、染色体２２上のｑアーム上の領域の欠失と、ＨＥＲ２遺伝子の重複を有することを推論し得る。医師は、２２ｑ欠失が乳癌において一般的であるため、また、両染色体上の２２ｑ領域の欠失を有する細胞が、通常は生存しないことから、サンプル中のＤＮＡの約２０％が、２つの染色体のうちの１つの上の２２ｑ欠失を有する細胞に由来することを推論し得る。医師はまた、腫瘍細胞に由来する混合サンプルからのＤＮＡが、ＨＥＲ２領域および２２ｑ領域が均質である遺伝的な腫瘍細胞のセットに由来する場合、その細胞が、ＨＥＲ２領域の５倍重複を含むことを推論し得る。

一例では、サンプルＡは、対立遺伝子方法を用いても分析される。以下は、例示的な可能なデータを示す。染色体２２上のｑアーム上の同じ領域についての２つのハプロタイプは、４：５の比率で存在し、ＨＥＲ２遺伝子に対応する焦点領域における２つのハプロタイプは、１：２の比率で存在し、染色体５のｐアーム中の２つのハプロタイプは、２０：２１の比率で存在する。ゲノムの全ての他のアッセイされた領域は、いずれのハプロタイプも統計的に有意に過剰に含まない。医師は、そのサンプルが、２２ｑ領域、ＨＥＲ２領域および５ｐアーム中のＣＮＶを有する腫瘍からのＤＮＡを含むと推論し得る。２２ｑ欠失が乳癌において非常に一般的であるという知識および／またはゲノムの２２ｑ領域にマッピングするＤＮＡの量の過小出現を示す定量分析に基づき、医師は、２２ｑ欠失を有する腫瘍の存在を推論し得る。ＨＥＲ２増幅が乳癌において非常に一般的であるという知識および／またはゲノムのＨＥＲ２領域にマッピングするＤＮＡの量の過剰出現を示す定量分析に基づき、医師は、ＨＥＲ２増幅を有する腫瘍の存在を推論し得る。

例示的な参照染色体または染色体セグメント
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法のいずれかが、１つ以上の参照染色体または染色体セグメントに対しても行われ、その結果を、目的の１つ以上の染色体または染色体セグメントについての結果と比較する。

いくつかの実施形態において、参照染色体または染色体セグメントは、ＣＮＶが存在しないことが予測される対照として使用される。いくつかの実施形態において、参照は、染色体または染色体セグメント中に欠失または重複を有しないことが知られているか、または予測される１つ以上の異なるサンプルからの同じ染色体または染色体セグメントである。いくつかの実施形態において、参照は、ダイソミーであると予測される試験されるサンプルからの異なる染色体または染色体セグメントである。いくつかの実施形態において、参照は、試験されるのと同じサンプル中の目的の染色体の１つからの異なるセグメントである。例えば、参照は、潜在的な欠失または重複の領域の外側にある１つ以上のセグメントであってもよい。試験されるのと同じ染色体についての参照を有することで、異なる染色体間の変動、例えば、代謝、アポトーシス、ヒストン、不活化および／または染色体間の増幅の差を回避する。試験されるのと同じ染色体上にＣＮＶを含まないセグメントを分析することも使用して、代謝、アポトーシス、ヒストン、不活化および／または染色体間の増幅の差を決定することができ、ＣＮＶが存在しないホモログ間の変動のレベルを、潜在的なＣＮＶからの結果と比較するために決定することを可能にする。いくつかの実施形態において、潜在的なＣＮＶについての対立遺伝子比率の計算値と予測値との差の大きさは、参照についての対応する大きさよりも大きく、それによって、ＣＮＶの存在を確認する。

いくつかの実施形態において、参照染色体または染色体セグメントは、ＣＮＶ（例えば、目的の特定の欠失または重複）が存在することが予想される対照として使用される。いくつかの実施形態において、参照は、染色体または染色体セグメント中に欠失または重複を有することが知られているか、または予測される１つ以上の異なるサンプルからの同じ染色体または染色体セグメントである。いくつかの実施形態において、参照は、ＣＮＶを有することが知られているか、または予測される試験されるサンプルからの異なる染色体または染色体セグメントである。いくつかの実施形態において、潜在的なＣＮＶについての対立遺伝子比率の計算値と予測値との差の大きさは、ＣＮＶについての参照のための対応する大きさと同様であり（例えば、有意に異ならず）、それによって、ＣＮＶの存在を確認する。いくつかの実施形態において、潜在的なＣＮＶについての対立遺伝子比率の計算値と予測値との差の大きさは、ＣＮＶについての参照のための対応する大きさよりも小さく（例えば、有意に小さく）、それによって、ＣＮＶが存在しないことを確認する。いくつかの実施形態において、非癌性細胞の遺伝子型（または非癌性細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、ｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡ）とは異なる、癌細胞の遺伝子型についての１つ以上の遺伝子座（またはｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡなどの癌細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡ）を使用して、腫瘍分率を決定する。腫瘍分率を使用して、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現が、第１の相同染色体セグメントの重複または第２の相同染色体セグメントの欠失に起因するかどうかを決定することができる。腫瘍分率を使用して、重複する染色体セグメントまたは染色体の過剰なコピー数（例えば、１、２、３、４、またはもっと多い過剰なコピーが存在するかどうか）を決定し、例えば、２個の過剰な染色体コピーを有し、腫瘍分率が２０％であるサンプルから、４個の過剰な染色体コピーを有し、腫瘍分率が１０％であるサンプルを区別することもできる。腫瘍分率を使用して、観測されたデータが、可能なＣＮＶについての予測データとどの程度十分に適合するかを決定することもできる。いくつかの実施形態において、ＣＮＶの過剰出現の程度を使用して、個体のための特定の療法または治療レジメンを選択する。例えば、いくつかの治療薬は、染色体セグメントの少なくとも４、６、またはもっと多くのコピーに対してのみ有効である。

いくつかの実施形態において、腫瘍分率を決定するために使用される１つ以上の遺伝子座は、参照染色体または染色体セグメント（例えば、ダイソミーであると知られているか、または予測される染色体または染色体セグメント、一般的に癌細胞において、または有することが知られているか、または有するリスクが上昇している個体の特定の種類の癌においてほとんど重複または欠失しない染色体または染色体セグメント、または異数性の可能性が低い染色体または染色体セグメント（例えば、欠失または重複すると、細胞死を引き起こすと予測されるこのようなセグメント）に対するものである。いくつかの実施形態において、本発明の方法のいずれかを使用して、参照染色体または染色体セグメントが、癌細胞および非癌性細胞の両方においてダイソミーであることを確認する。いくつかの実施形態において、ダイソミーのコールについての信頼性が高い１つ以上の染色体または染色体セグメントが使用される。

腫瘍分率を決定するために使用可能な例示的な遺伝子座としては、個体における非癌性細胞（または非癌性細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡ）中には存在しない、癌細胞（または、癌細胞からのｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡなどのＤＮＡまたはＲＮＡ）中の多型または変異（例えばＳＮＰ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、腫瘍分率は、個体からのサンプル（例えば、血漿サンプルまたは腫瘍検体）中の癌細胞（または癌細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡ）が、非癌性細胞（または、非癌性細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡ）中には存在しない対立遺伝子を有する、これらの多型遺伝子座を特定し、特定された多型遺伝子座のうちの１つ以上での癌細胞に固有の対立遺伝子の量を使用して、サンプル中の腫瘍分率を決定することによって、決定される。いくつかの実施形態において、非癌性細胞は、多型遺伝子座にある第１の対立遺伝子についてホモ接合性であり、癌細胞は、（ｉ）第１の対立遺伝子および第２の対立遺伝子についてヘテロ接合性であるか、または（ｉｉ）多型遺伝子座にある第２の対立遺伝子についてホモ接合性である。いくつかの実施形態において、非癌性細胞は、多型遺伝子座にある第１の対立遺伝子および第２の対立遺伝子についてヘテロ接合性であり、癌細胞は、（ｉ）多型遺伝子座にある第３の対立遺伝子の１つまたは２つのコピーを有する。いくつかの実施形態において、癌細胞は、非癌性細胞中に存在しない対立遺伝子の１つのコピーのみを有すると仮定されるか、または知られている。例えば、非癌性細胞の遺伝子型がＡＡであり、癌細胞がＡＢであり、サンプル中のその遺伝子座での信号の５％がＢ対立遺伝子からのものであり、９５％がＡ対立遺伝子からのものである場合、そのサンプルの腫瘍分率は１０％である。いくつかの実施形態において、癌細胞は、非癌性細胞中に存在しない対立遺伝子の２つのコピーを有すると仮定されるか、または知られている。例えば、非癌性細胞の遺伝子型がＡＡであり、癌細胞がＢＢであり、サンプル中のその遺伝子座での信号の５％がＢ対立遺伝子からのものであり、９５％がＡ対立遺伝子からのものである場合、そのサンプルの腫瘍分率は５％である。いくつかの実施形態において、癌細胞が非癌性細胞中にはない対立遺伝子を有する複数の遺伝子座を分析して、癌細胞中のどの遺伝子座がヘテロ接合性であり、どの遺伝子座がホモ接合性であるかを決定する。例えば、非癌性細胞がＡＡである遺伝子座について、Ｂ対立遺伝子からの信号が、いくつかの遺伝子座で約５％であり、いくつかの遺伝子座で約１０％である場合、癌細胞は、約５％のＢ対立遺伝子を有する遺伝子座ではヘテロ接合性であり、約１０％のＢ対立遺伝子を有する遺伝子座ではホモ接合性であると仮定される（腫瘍分率が約１０％であることを示す）。

腫瘍分率を決定するために使用可能な例示的な遺伝子座としては、癌細胞および非癌性細胞が共通して１つの対立遺伝子を有する遺伝子座が挙げられる（例えば、癌細胞はＡＢであり、非癌性細胞はＢＢであるか、または癌細胞はＢＢであり、非癌性細胞はＡＢである遺伝子座）。混合サンプル（癌細胞および非癌性細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡを含む）中のＡ信号の量、Ｂ信号の量、またはＢ信号に対するＡ信号の比率を、（ｉ）癌細胞のみからのＤＮＡまたはＲＮＡを含むサンプルまたは（ｉｉ）非癌性細胞のみからのＤＮＡまたはＲＮＡを含むサンプルについての対応する値と比較する。この値の差を使用して、混合サンプルの腫瘍分率を決定する。

いくつかの実施形態において、腫瘍分率を決定するために使用可能な遺伝子座は、（ｉ）癌細胞のみからのＤＮＡまたはＲＮＡを含むサンプルおよび／または（ｉｉ）非癌性細胞のみからのＤＮＡまたはＲＮＡを含むサンプルの遺伝子型に基づいて選択される。いくつかの実施形態において、遺伝子座は、混合サンプルの分析に基づいて選択され、例えば、各対立遺伝子の絶対量または相対量が、癌細胞および癌性細胞の両方が特定の遺伝子座で同じ遺伝子型を有する場合に予測される量とは異なる遺伝子座が選択される。例えば、癌細胞および非癌性細胞が同じ遺伝子型を有する場合、遺伝子座は、全ての細胞がＡＡである場合には、０％のＢ信号を生成すると予測されるか、全ての細胞がＡＢである場合には、５０％のＢ信号を生成すると予測されるか、または全ての細胞がＢＢである場合には、１００％のＢ信号を生成すると予測される。Ｂ信号の他の値は、癌細胞および非癌性細胞の遺伝子型がその遺伝子座で異なるため、その遺伝子座を使用して腫瘍分率を決定することができることを示す。

いくつかの実施形態において、１つ以上の遺伝子座にある対立遺伝子に基づいて計算される腫瘍分率を、本明細書に開示される計数方法のうちの１つ以上を用いて計算される腫瘍分率と比較する。

表現型を検出するか、または多重変異を分析するための例示的な方法
いくつかの実施形態において、本方法は、ある疾患もしくは障害（例えば癌）またはある疾患もしくは障害のリスク上昇に関連する変異のセットについて、サンプルを分析することを含む。ある方法の信号ノイズ比を改善し、腫瘍を別個の臨床部分集合に分類するために使用可能な、クラス内の事象（例えば、ＭまたはＣの癌クラス）間に強い相関関係が存在する。例えば、合わせて考慮される１つ以上の染色体または染色体セグメントについてのいくつかの変異（例えば、いくつかのＣＮＶ）についての境界にある結果は、非常に強力な信号であり得る。いくつかの実施形態において、目的の複数の多型または変異（例えば、２、３、４、５、８、１０、１２、１５またはもっと多い）の有無を決定することは、ある疾患もしくは障害（例えば癌）の有無、またはある疾患もしくは障害（例えば癌）のリスク上昇の決定の感度および／または特異性を高める。いくつかの実施形態において、複数の染色体にわたる事象間の相関関係を使用して、これらのそれぞれを個々にみるのと比較すると、より強力に信号を見る。本方法自体の設計を、腫瘍を最適に分類するために最適化することができる。このことは、１つの特定の変異／ＣＮＶに対する感度が最も重要であり得る再発に対する早期検出およびスクリーニングに非常に有用であろう。いくつかの実施形態において、事象は常に相関関係があるものではないが、相関関係がある確率を有する。いくつかの実施形態において、使用される非対角項を有するノイズ共分散行列を有するマトリックス推定組成が使用される。

いくつかの実施形態において、本発明は、個体における表現型（例えば、癌表現型）を検出する方法を特徴とし、表現型は、変異のセットのうちの少なくとも１つの存在によって定義される。いくつかの実施形態において、本方法は、個体からの１つ以上の細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡのサンプルについてのＤＮＡまたはＲＮＡの測定を得ることであって、１つ以上の細胞が、表現型を有することが疑われる、得ることと、ＤＮＡまたはＲＮＡの測定を分析して、変異のセット中のそれぞれの変異について、細胞の少なくとも１つがその変異を有する尤度を決定することと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、（ｉ）変異のうちの少なくとも１つについて、細胞の少なくとも１つがその変異を有する尤度が閾値より大きい、または（ｉｉ）変異のうちの少なくとも１つについて、細胞の少なくとも１つがその変異を有する尤度が閾値より小さく、複数の変異について、細胞の少なくとも１つが、変異のうちの少なくとも１つを有する結合尤度が閾値よりも大きい場合に、個体は表現型を有すると決定することを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は、変異のセット中の変異の部分集合または全てを有する。いくつかの実施形態において、変異の部分集合は、癌または癌のリスク上昇に関連する。いくつかの実施形態において、変異のセットは、癌変異のＭクラス中の変異の部分集合または全てを含む（Ｃｉｒｉｅｌｌｏ、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．４５（１０）：１１２７−１１３３、２０１３、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ．２７６２、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、変異のセットは、癌変異のＣクラス中の変異の部分集合または全てを含む（Ｃｉｒｉｅｌｌｏ、前出）。いくつかの実施形態において、サンプルは、無細胞ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡの測定は、目的の１つ以上の染色体または染色体セグメント上の多型遺伝子座のセットでの測定（例えば、各遺伝子座での各対立遺伝子の量）を含む。

方法の例示的な組み合わせ
結果の精度を高めるために、ＣＮＶの有無を検出する２つ以上の方法（例えば、本発明の方法のいずれか、または任意の既知の方法）が行われる。いくつかの実施形態において、ある疾患もしくは障害の有無またはある疾患もしくは障害のリスク上昇の指標である因子を分析する１つ以上の方法（例えば、本発明の方法のいずれか、または任意の既知の方法）が行われる。

いくつかの実施形態において、標準的な数学技術を使用して、２つ以上の方法間の共分散および／または相関を計算する。標準的な数学技術を使用して、２つ以上の試験に基づく特定の仮説の結合確率も決定してもよい。例示的な技術としては、メタ分析、独自試験のためのフィッシャーの結合確率検定、従属ｐ値と既知の共分散を組み合わせるブラウン法および従属ｐ値と未知の共分散を組み合わせるコスト法が挙げられる。尤度が、尤度が第２の方法について決定される方法に対して直交するか、または無関係の方法で第１の方法によって決定される場合では、尤度を組み合わせることは簡単であり、乗算および正規化によって行うことができ、または以下のような式を使用することによって行うことができる。

Ｒ_結合＝Ｒ_１Ｒ_２／［Ｒ_１Ｒ_２＋（１−Ｒ_１）（１−Ｒ_２）］

Ｒ_結合は、結合尤度であり、Ｒ_１およびＲ_２は、個々の尤度である。例えば、方法１からのトリソミーの尤度が９０％であり、方法２からのトリソミーの尤度が９５％である場合、この２つの方法からの出力を組み合わせることによって、医師は、（０．９０）（０．９５）／［（０．９０）（０．９５）＋（１−０．９０）（１−０．９５）］＝９９．４２％の尤度で、胎児がトリソミーであると結論付けることができる。第１の方法と第２の方法が直交していない場合、すなわち、この２つの方法の間に相関関係がある場合にも、尤度を組み合わせることができる。

複数の因子または変数を分析する例示的な方法は、２０１１年９月２０日に登録された米国特許第８，０２４，１２８号、２００６年７月３１日に出願された米国公開第２００７／００２７６３６号および２００６年１２月６日に出願された米国公開第２００７／０１７８５０１号に開示されており、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる。

種々の実施形態において、特定の仮説または診断の結合確率は、８０、８５、９０、９２、９４、９６、９８、９９または９９．９％より大きいか、またはいくつかの他の閾値より大きい。

検出限界
実施例の章で提供される実験によって示されるように、本明細書で提供される方法は、検出または感度の限界が０．４５％ＡＡＩ（本発明の例示的な方法の異数性の検出限界である）で、サンプルにおいて平均対立遺伝子不均衡を検出することができる。同様に、特定の実施形態において、本明細書で提供される方法は、０．４５、０．５、０．６、０．８、０．８、０．９または１．０％のサンプルにおける平均対立遺伝子不均衡を検出することができる。すなわち、本試験方法は、あるサンプルにおいて、ＡＡＩが０．４５、０．５、０．６、０．８、０．８、０．９または１．０％まで下がる染色体異数性を検出することができる。実施例の章で提供される実験によって示されるように、本明細書で提供される方法は、少なくともいくつかのＳＮＶについて、あるサンプルにおいてＳＮＶの存在を検出することができ、検出または感度の限界は０．２％であり、これは、例示的な一実施形態において、少なくともいくつかのＳＮＶについての検出限界である。同様に、特定の実施形態において、本方法は、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．８、０．８、０．９または１．０％の頻度またはＳＮＶ ＡＡＩで、ＳＮＶを検出することができる。すなわち、本試験方法は、ＳＮＶの染色体遺伝子座での総対立遺伝子数の０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．８、０．８、０．９または１．０％の検出限界まで下がるサンプルにおいて、ＳＮＶを検出することができる。

いくつかの実施形態において、本発明の方法の変異（例えば、ＳＮＶまたはＣＮＶ）の検出限界は、１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１または０．００５％より小さいか、これらに等しい。いくつかの実施形態において、本発明の方法の変異（例えば、ＳＮＶまたはＣＮＶ）の検出限界は、１５〜０．００５％、例えば、１０〜０．００５％、１０〜０．０１％、１０〜０．１％、５〜０．００５％、５〜０．０１％、５〜０．１％、１〜０．００５％、１〜０．０１％、１〜０．１％、０．５〜０．００５％、０．５〜０．０１％、０．５〜０．１％または０．１〜０．０１（境界値を含む）である。

いくつかの実施形態において、検出限界は、サンプル（例えば、ｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡのサンプル）中に遺伝子座を含むＤＮＡまたはＲＮＡの１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１または０．００５％より小さいか、またはこれらに等しい量で存在する変異（例えば、ＳＮＶまたはＣＮＶ）が検出される（または検出することが可能な）値である。例えば、遺伝子座中に変異を有する遺伝子座（例えば、遺伝子座の野生型または非変異態様またはその遺伝子座にある異なる変異の代わりに）を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子の１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１または０．００５％より小さいか、またはこれらに等しい場合に、変異を検出することができる。いくつかの実施形態において、検出限界は、サンプル（例えば、ｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡのサンプル）中のＤＮＡまたはＲＮＡ分子の１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１または０．００５％より小さいか、またはこれらに等しい量で存在する変異（例えば、ＳＮＶまたはＣＮＶ）が検出される（または検出することが可能な）値である。ＣＮＶが欠失であるいくつかの実施形態において、サンプル中に欠失を含んでいてもよく、または含んでいなくてもよい目的の領域を有するＤＮＡまたはＲＮＡ分子の１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１または０．００５％より小さいか、またはこれらに等しい量でのみ存在する場合であっても、欠失を検出することができる。ＣＮＶが欠失であるいくつかの実施形態において、サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡ分子の１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１または０．００５％より小さいか、またはこれらに等しい量でのみ存在する場合であっても、欠失を検出することができる。ＣＮＶが重複であるいくつかの実施形態において、存在する過剰に重複したＲＮＡまたはＤＮＡが、サンプル中でサンプル中で重複していてもよく、または重複していなくてもよい目的の領域を有するＤＮＡまたはＲＮＡ分子の１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１または０．００５％より小さいか、またはこれらに等しい量で存在する場合であっても、重複を検出することができる。ＣＮＶが重複であるいくつかの実施形態において、存在する過剰に重複したＲＮＡまたはＤＮＡが、サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡ分子の１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１または０．００５％より小さいか、またはこれらに等しい量でのみ存在する場合であっても、重複を検出することができる。

例示的なサンプル
本発明の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、サンプルは、欠失または重複を有することが疑われる細胞、例えば、癌性であることが疑われる細胞からの細胞内および／または細胞外遺伝物質を含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、欠失または重複を有する細胞、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むことが疑われる任意の組織または体液（例えば、腫瘍）、または癌細胞、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む他のサンプルを含む。これらの方法の一部として使用される遺伝子測定は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む任意のサンプル、例えば、限定されないが、組織、血液、血清、血漿、尿、毛髪、涙、唾液、皮膚、指の爪、糞便、胆汁、リンパ液、子宮頸粘液、精液、腫瘍、または核酸を含む他の細胞または物質について行われてもよい。サンプルは、任意の細胞型を含んでいてもよく、または任意の細胞型からのＤＮＡまたはＲＮＡを使用してもよい（例えば、癌性であることが疑われる任意の臓器または組織からの細胞、またはニューロン）。いくつかの実施形態において、サンプルは、核および／またはミトコンドリアＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、本明細書で開示される標的個体のいずれかに由来する。いくつかの実施形態において、標的個体のがん患者。

例示的なサンプルとしては、ｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡを含有するものが挙げられる。いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡは、細胞を溶解する工程を必要とせずに、分析に利用可能である。無細胞ＤＮＡは、種々の組織、例えば、液体形態である組織、例えば、血液、血漿、リンパ液、腹水または脳脊髄液から得られてもよい。ある場合に、ｃｆＤＮＡは、胎児細胞に由来するＤＮＡからなる。ある場合に、ｃｆＤＮＡは、細胞物質を除去するために遠心分離された、全血から単離された血漿から単離される。ｃｆＤＮＡは、標的細胞（例えば癌細胞）および非標的細胞（例えば非癌細胞）に由来するＤＮＡの混合物であってもよい。

いくつかの実施形態において、サンプルは、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）の混合物、例えば、癌細胞に由来するＤＮＡ（またはＲＮＡ）と非癌性（すなわち、正常）細胞に由来するＤＮＡ（またはＲＮＡ）の混合物を含むか、または含むことが疑われる。いくつかの実施形態において、サンプル中の細胞の少なくとも０．５、１、３、５、７、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９２、９４、９５、９６、９８、９９または１００％が癌細胞である。いくつかの実施形態において、サンプル中のＤＮＡ（例えばｃｆＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えばｃｆＲＮＡ）の少なくとも０．５、１、３、５、７、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９２、９４、９５、９６、９８、９９または１００％が、癌細胞（複数可）由来である。種々の実施形態において、サンプル中の癌性細胞である細胞の割合は、０．５〜９９％、例えば、１〜９５％、５〜９５％、１０〜９０％、５〜７０％、１０〜７０％、２０〜９０％または２０〜７０％（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、サンプルは、癌細胞が濃縮されているか、または癌細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡが濃縮されている。癌細胞が濃縮されているサンプルのいくつかの実施形態において、濃縮サンプル中の細胞の少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９２、９４、９５、９６、９８、９９または１００％が癌細胞である。癌細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡが濃縮されているサンプルのいくつかの実施形態において、濃縮サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９２、９４、９５、９６、９８、９９または１００％が、癌細胞（複数可）由来である。いくつかの実施形態において、細胞選別（例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ））を用いて、癌細胞を濃縮する（Ｂａｒｔｅｎｅｖａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．、１８３６（１）：１０５−２２、２０１３年８月 ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｃａｎ．２０１３．０２．００４．Ｅｐｕｂ ２０１３年２月２４日、およびＩｂｒａｈｉｍら、Ａｄｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０６：１９−３９、２００７、それぞれ、全体として参照により本明細書に組み込まれる）。

いくつかの実施形態において、サンプルは、胎児細胞が濃縮されている。胎児細胞が濃縮されているサンプルのいくつかの実施形態において、濃縮サンプル中の細胞の少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７％またはもっと多くが、胎児細胞である。いくつかの実施形態において、サンプル中の胎児細胞である細胞の割合は、０．５〜１００％、例えば、１〜９９％、５〜９５％、１０〜９５％、１０〜９５％、２０〜９０％または３０〜７０％（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、サンプルは、胎児ＤＮＡが濃縮されている。胎児ＤＮＡが濃縮されているサンプルのいくつかの実施形態において、濃縮サンプル中のＤＮＡの少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７％またはもっと多くが、胎児ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、サンプル中の胎児ＤＮＡであるＤＮＡの割合は、０．５〜１００％、例えば、１〜９９％、５〜９５％、１０〜９５％、１０〜９５％、２０〜９０％または３０〜７０％（境界値を含む）である。

いくつかの実施形態において、サンプルは、単一細胞を含むか、または単一細胞からのＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、複数の個々の細胞（例えば、同じ被験体または異なる被験体からの少なくとも５、１０、２０、３０、４０または５０個の細胞）を並列に分析する。いくつかの実施形態において、同じ個体由来の複数のサンプルからの細胞を組み合わせ、これらのサンプルを別個に分析する場合と比較して、作業量が減少する。複数サンプルを組み合わせることで、癌について同時に複数組織を試験することも可能になる（これを使用して、癌についてより十分なスクリーニングを提供するか、または癌が他の組織に転移した可能性があるかどうかを決定することができる）。

いくつかの実施形態において、サンプルは、単一の細胞または少数の細胞、例えば、２、３、５、６、７、８、９または１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、１〜１００、１００〜５００または５００〜１，０００個の細胞（境界値を含む）を含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、１〜１０ピコグラム、１０〜１００ピコグラム、１００ピコグラム〜１ナノグラム、１〜１０ナノグラム、１０〜１００ナノグラムまたは１００ナノグラム〜１マイクログラムのＲＮＡおよび／またはＤＮＡ（境界値を含む）を含む。

いくつかの実施形態において、サンプルは、パラフィルムに包埋される。いくつかの実施形態において、サンプルは、ホルムアルデヒドなどの防腐剤で保存され、場合により、パラフィンに封入され、そのうちの少量がＰＣＲに利用可能であるように、ＤＮＡの架橋を引き起こし得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルである。いくつかの実施形態において、サンプルは、新鮮なサンプル（例えば、１日または２日の分析で得られるサンプル）である。いくつかの実施形態において、サンプルは、分析前に凍結される。いくつかの実施形態において、サンプルは、歴史的サンプルである。

これらのサンプルは、本発明の方法のいずれにおいて、使用することができる。

例示的なサンプル調製方法
いくつかの実施形態において、本方法は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを単離または精製することを含む。このような目的を達成するために、当該技術分野で知られているいくつかの標準的な手順が存在する。いくつかの実施形態において、サンプルを遠心分離して、種々の層を分離してもよい。いくつかの実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡは、濾過を用いて単離されてもよい。いくつかの実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡの調製は、増幅、分離、クロマトグラフィーによる精製、液液分離、単離、優先的濃縮、優先的増幅、標的化された増幅、または当該技術分野で知られているか、または本明細書に記載されるいくつかの他の技術のいずれかを伴っていてもよい。ＤＮＡの単離のためのいくつかの実施形態において、ＲＮａｓｅを使用してＲＮＡを分解する。ＲＮＡの単離のためのいくつかの実施形態において、ＤＮａｓｅ（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ製のＤＮａｓｅ Ｉ）を使用してＤＮＡを分解する。いくつかの実施形態において、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造業者のプロトコルに従ってＲＮＡを単離する。いくつかの実施形態において、低分子ＲＮＡは、ｍｉｒＶａｎａ ＰＡＲＩＳキット（Ａｍｂｉｏｎ、オースチン、ＴＸ、ＵＳＡ）を用い、製造業者のプロトコルに従って単離される（Ｇｕら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１２２：６４１−６４９、２０１２、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＲＮＡの濃度および純度は、場合により、Ｎａｎｏｖｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて決定されてもよく、ＲＮＡの完全性は、場合により、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタクララ、ＣＡ、ＵＳＡ）の使用によって測定されてもよい（Ｇｕら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１２２：６４１−６４９、２０１２、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、ＴＲＩＺＯＬまたはＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、保管中のＲＮＡを安定化させる。

いくつかの実施形態において、ユニバーサルタグ付けアダプターが追加され、ライブラリを作成する。ライゲーションの前に、サンプルＤＮＡは、平滑末端化されてもよく、次いで、単一のアデノシン塩基を３’末端に付加する。ライゲーションの前に、ＤＮＡは、制限酵素またはいくつかの他の開裂方法を用いて開裂されてもよい。ライゲーション中に、サンプルフラグメントの３’アデノシンと、アダプターの相補性３’チロシンオーバーハングが、ライゲーション効率を高めることができる。いくつかの実施形態において、アダプターライゲーションは、ＡＧＩＬＥＮＴ ＳＵＲＥＳＥＬＥＣＴキット中に見出されるライゲーションキットを用いて行われる。いくつかの実施形態において、ライブラリは、ユニバーサルプライマーを用いて増幅される。一実施形態において、増幅されるライブラリは、サイズ分離によって、またはＡＧＥＮＣＯＵＲＴ ＡＭＰＵＲＥビーズなどの製品または他の同様の方法を用いることによって、フラクション化される。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ増幅を用いて、標的遺伝子座を増幅する。いくつかの実施形態において、増幅されるＤＮＡは、配列決定される（例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＩＩＧＡＸまたはＨｉＳｅｑシーケンサ）。いくつかの実施形態において、増幅されるＤＮＡは、増幅されるＤＮＡの各末端から配列決定され、配列決定エラーを減らす。増幅されるＤＮＡの一端から配列決定する場合に、特定の塩基における配列エラーが存在する場合、増幅されるＤＮＡの他端から配列決定するときに相補性塩基中に配列エラーがある可能性が低い（増幅されるＤＮＡの同じ末端からの複数回の配列決定と比較して）。

いくつかの実施形態において、全ゲノムアプリケーション（ＷＧＡ）を用いて核酸サンプルを増幅する。ライゲーション媒介ＰＣＲ（ＬＭ−ＰＣＲ）、変性オリゴヌクレオチドプライマーＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）および多重置換増幅（ＭＤＡ）といった、ＷＧＡに利用可能ないくつかの方法が存在する。ＬＭ−ＰＣＲにおいて、アダプターと呼ばれる短いＤＮＡ配列を、ＤＮＡの平滑末端にライゲーションする。これらのアダプターは、ＰＣＲによってＤＮＡを増幅するために使用されるユニバーサル増幅配列を含む。ＤＯＰ−ＰＣＲにおいて、ユニバーサル増幅配列も含むランダムプライマーを、アニーリングおよびＰＣＲの第１ラウンドで使用する。次いで、第２ラウンドのＰＣＲを使用して、さらにユニバーサルプライマー配列を用い、配列を増幅させる。ＭＤＡは、ｐｈｉ−２９ポリメラーゼを使用し、このポリメラーゼは、ＤＮＡを複製し、単一細胞分析に使用されてきた、高度なプロセッシブ非特異性酵素である。いくつかの実施形態において、ＷＧＡは実施されない。

いくつかの実施形態において、選択的な増幅または濃縮を使用して、標的遺伝子座を増幅するか、または濃縮する。いくつかの実施形態において、増幅および／または選択的な濃縮技術は、ＰＣＲ（例えば、ライゲーション媒介ＰＣＲ）、ハイブリダイゼーションによるフラクションの捕捉、分子反転プローブまたは他の環状化プローブを伴っていてもよい。いくつかの実施形態において、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、またはエマルションＰＣＲ、単一対立遺伝子塩基伸長反応の後の質量分析が使用される（Ｈｕｎｇら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ ６２：３０８−３１３、２００９、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、ハイブリッド捕捉プローブを用いたハイブリダイゼーションによる捕捉を使用して、ＤＮＡを優先的に濃縮する。いくつかの実施形態において、増幅または選択的な濃縮のための方法は、標的配列に正しくハイブリダイゼーションすると、ヌクレオチドプローブの３’末端または５’末端が少数のヌクレオチドによって多型対立遺伝子の多型部位から分離されるプローブを用いることを伴っていてもよい。この分離は、対立遺伝子バイアスと呼ばれる１つの対立遺伝子の優先的増幅を減らす。これは、正しくハイブリダイズされたプローブの３’末端または５’末端が、対立遺伝子の多型部位に直接隣接しているか、または非常に近い位置にあるプローブを用いることを伴う方法の改善である。一実施形態において、ハイブリダイズする領域が多型部位を含み得るか、または確実に含むプローブは除外される。ハイブリダイゼーション部位にある多型部位は、一部の対立遺伝子において不均等なハイブリダイゼーションを引き起こし、またはハイブリダイゼーションを完全に阻害する場合があり、特定の対立遺伝子の優先的増幅をもたらす場合がある。これらの実施形態は、各多型遺伝子座でサンプルの元々の対立遺伝子頻度を良好に保存するという点で、標的化された増幅および／または選択的な濃縮を伴う他の方法の改善であり、ここで、サンプルは、単一の個体または個体の混合からの純粋なゲノムサンプルである。

いくつかの実施形態において、ＰＣＲ（ミニＰＣＲと呼ばれる）を使用して、非常に短いアンプリコンを作成する（２０１２年１１月２１日に出願された米国出願第１３／６８３，６０４号、米国公開第２０１３／０１２３１２０号、２０１１年１１月１８日に出願された米国出願第１３／３００，２３５号、２０１１年１１月１８日に出願された米国公開第２０１２／０２７０２１２号および２０１４年５月１６日に出願された米国出願第６１／９９４，７９１号、それぞれが、全体として参照により本明細書に組み込まれる）。ｃｆＤＮＡ（例えば、壊死またはアポトーシスによって放出される癌ｃｆＤＮＡ）は、高度にフラグメント化される。胎児ｃｆＤＮＡの場合、フラグメントサイズは、平均が１６０ｂｐ、標準偏差が１５ｂｐ、最小サイズが約１００ｂｐ、最大サイズが約２２０ｂｐのほぼＧａｕｓｓｉａｎ方法で分布する。ある特定の標的遺伝子座の多型部位は、その遺伝子座に由来する種々のフラグメントの最初から最後までの任意の位置を占めていてもよい。ｃｆＤＮＡフラグメントが短いため、両プライマー部位が存在する尤度、長さＬのフラグメントが順方向および逆方向のプライマー部位の両方を含む尤度は、そのフラグメントの長さに対するアンプリコンの長さの比率である。理想的な条件下で、アンプリコンが４５、５０、５５、６０、６５または７０ｂｐであるアッセイは、利用可能なテンプレートフラグメント分子のそれぞれ７２％、６９％、６６％、６３％、５９％または５６％からの増幅に成功する。癌を有することが疑われる個体のサンプルからのｃｆＤＮＡに対して最も好ましく関連する特定の実施形態において、ｃｆＤＮＡは、８５、８０、７５または７０ｂｐ、特定の好ましい実施形態において７５ｂｐの最大アンプリコン長を与え、融点が５０〜６５℃、特定の好ましい実施形態において５４〜６０．５℃のプライマーを用いて増幅される。アンプリコン長は、順方向および逆方向のプライミング部位の５’末端間の距離である。当該技術分野で知られているものによって典型的に使用されるものよりも短いアンプリコン長は、短い配列リードのみを必要とすることによって、所望な多型遺伝子座のより効率的な測定をもたらし得る。一実施形態において、アンプリコンの実質的なフラクションは、１００ｂｐ未満、９０ｂｐ未満、８０ｂｐ未満、７０ｂｐ未満、６５ｂｐ未満、６０ｂｐ未満、５５ｂｐ未満、５０ｂｐ未満または４５ｂｐ未満である。

いくつかの実施形態において、増幅は、直接多重化ＰＣＲ、連続ＰＣＲ、ネスティッドＰＣＲ、二重ネスティッドＰＣＲ、片側および片側半（ｏｎｅ−ａｎｄ−ａ−ｈａｌｆ ｓｉｄｅｄ）ネスティッドＰＣＲ、完全ネスティッドＰＣＲ、片側完全ネスティッドＰＣＲ、片側ネスティッドＰＣＲ、ヘミネスティッドＰＣＲ、ヘミネスティッドＰＣＲ、三重ヘミネスティッドＰＣＲ、セミネスティッドＰＣＲ、片側セミネスティッドＰＣＲ、逆セミネスティッドＰＣＲ法、または片側ＰＣＲを用いて行われ、これらは、２０１２年１１月２１日に出願された米国出願第１３／６８３，６０４号、米国公開第２０１３／０１２３１２０号、２０１１年１１月１８日に出願された米国出願第１３／３００，２３５号、米国公開第２０１２／０２７０２１２号および２０１４年５月１６日に出願された米国出願第６１／９９４，７９１号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。所望な場合、これらの方法のいずれかをミニＰＣＲに使用してもよい。

所望な場合、ＰＣＲ増幅の伸長工程は、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチドまたは１，０００ヌクレオチドより長いフラグメントからの増幅を減らすために、時間的観点から制限されてもよい。これにより、フラグメント化されたＤＮＡまたはより短いＤＮＡ（例えば、胎児ＤＮＡ、またはアポトーシスまたは壊死を受けた癌細胞からのＤＮＡ）の濃縮をもたらす場合があり、試験性能が向上し得る。

いくつかの実施形態において、マルチプレックスＰＣＲが使用される。いくつかの実施形態において、核酸サンプルにおいて標的遺伝子座を増幅する方法は、（ｉ）核酸サンプルと、少なくとも１００、２００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００または１００，０００個の異なる標的遺伝子座を同時にハイブリダイズするプライマーのライブラリとを接触させ、反応混合物を生成することと、（ｉｉ）この反応混合物をプライマー伸長反応条件（例えばＰＣＲ条件）に供して、標的アンプリコンを含む増幅産物を生成することとを伴う。いくつかの実施形態において、標的遺伝子座の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％が増幅される。種々の実施形態において、増幅産物の６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１、０．５、０．２５、０．１または０．０５％未満が、プライマーダイマーである。いくつかの実施形態において、プライマーは、溶液状態である（例えば、固相ではなく液相に溶解する）。いくつかの実施形態において、プライマーは、溶液状態であり、固体支持体に固定されていない。いくつかの実施形態において、プライマーは、マイクロアレイの一部ではない。いくつかの実施形態において、プライマーは、分子反転プローブ（ＭＩＰ）を含まない。

いくつかの実施形態において、２つ以上（例えば、３または４）の標的アンプリコン（例えば、本明細書に開示されるミニＰＣＲ方法からのアンプリコン）が一緒にライゲーションされ、次いで、ライゲーションされた産物が配列決定される。複数のアンプリコンを単一のライゲーション産物になるように組み合わせることで、その後の配列決定工程の効率が増加する。いくつかの実施形態において、標的アンプリコンは、これらがライゲーションされる前には、長さが１５０、１００、９０、７５または５０塩基対未満である。選択的な濃縮および／または増幅は、それぞれの個々の分子を、異なるタグ、分子バーコード、増幅のためのタグおよび／または配列決定のためのタグを用いてタグ化することを伴っていてもよい。いくつかの実施形態において、増幅産物は、配列決定（例えば、高スループット配列決定）によって、またはアレイ、例えば、ＳＮＰアレイ、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＩＮＦＩＮＩＵＭアレイまたはＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ遺伝子チップへのハイブリダイゼーションによって分析される。いくつかの実施形態において、ナノポア配列決定、例えば、Ｇｅｎｉａによって開発されたナノポア配列決定技術が使用される（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ｇｅｎｉａｃｈｉｐ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙでのワールドワイドウェブを参照）。いくつかの実施形態において、二重配列決定が使用される（Ｓｃｈｍｉｔｔら、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｕｌｔｒａ−ｒａｒｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１０９（３６）：１４５０８−１４５１３、２０１２、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。この手法は、ＤＮＡ二本鎖の２つの鎖それぞれを独立してタグ化し、配列決定することによって、エラーを大きく減らす。この２つの鎖が相補性であるため、真の変異は、両方の鎖の同じ位置に見出される。これとは対照的に、ＰＣＲまたは配列決定のエラーは、１つの鎖にのみ変異を生じるため、技術的エラーとして割り引くことができる。いくつかの実施形態において、本方法は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を、ランダムであるが相補性の二本鎖ヌクレオチド配列（二本鎖タグと呼ばれる）を用いてタグ化することを含む。最初に、一本鎖のランダム化ヌクレオチド配列を１つのアダプター鎖に導入し、次いで、反対側の鎖をＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、相補性の二本鎖タグを得ることによって、二本鎖タグ配列が、標準的な配列決定アダプターに組み込まれる。タグ化されたアダプターを剪断ＤＮＡにライゲーションした後、個々に標識された鎖が、アダプターテール上の非対称プライマー部位からＰＣＲ増幅され、ペアエンド配列決定に供される。いくつかの実施形態において、サンプル（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡサンプル）が、複数のフラクションに、例えば、異なるウェル（例えば、ＷａｆｅｒＧｅｎ ＳｍａｒｔＣｈｉｐのウェル）に分割される。サンプルを異なるフラクション（例えば、少なくとも５、１０、２０、５０、７５、１００、１５０、２００または３００フラクション）に分割することによって、変異を有する分子の割合が、全体的なサンプルよりもウェルのいくつかで高くなるため、分析の感度を上げることができる。いくつかの実施形態において、各フラクションは、５００、４００、２００、１００、５０、２０、１０、５、２個または１個未満のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、各フラクション中の分子は、別個に配列決定される。いくつかの実施形態において、同じバーコード（例えば、ランダムまたは非ヒト配列）を、同じフラクション中の全ての分子に加え（例えば、バーコードを含むプライマーを用いた増幅によって、またはバーコードのライゲーションによって）、異なるバーコードが、異なるフラクション中の分子に加えられる。バーコード化された分子をプールし、一緒に配列決定することができる。いくつかの実施形態において、分子をプールし、配列決定（例えば、ネスティッドＰＣＲを用いることによって）する前に、分子を増幅する。いくつかの実施形態において、１個の順方向プライマーと２個の逆方向プライマー、または２個の順方向プライマーと１個の逆方向プライマーが使用される。

いくつかの実施形態において、サンプル（例えば、ｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡのサンプル）中のＤＮＡまたはＲＮＡ分子の１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１または０．００５％より小さい量で存在する変異（例えば、ＳＮＶまたはＣＮＶ）が、検出される（または検出することが可能である）。いくつかの実施形態において、サンプル（例えば、血液サンプルからのｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡのサンプルなど）中の１，０００、５００、１００、５０、２０、１０、５、４、３または２未満の元々のＤＮＡまたはＲＮＡ分子（増幅前）に存在する変異（例えば、ＳＮＶまたはＣＮＶ）が検出される（または検出することができる）。いくつかの実施形態において、サンプル（例えば、血液サンプルからのｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡのサンプルなど）中のたった１個の元々のＤＮＡまたはＲＮＡ分子（増幅前）に存在する変異（例えば、ＳＮＶまたはＣＮＶ）が検出される（または検出することができる）。

例えば、変異（例えば、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ））の検出限界が０．１％である場合、フラクションを複数のフラクション（例えば、１００ウェル）に分割することによって、０．０１％で存在する変異を検出することができる。ウェルの大部分は、変異のコピーを含まない。変異を有する数少ないウェルについて、変異は、かなり高い割合のリードで存在する。一例では、標的遺伝子座からの２０，０００個のＤＮＡの初期コピーが存在し、これらのコピーのうちの２つが、目的のＳＮＶを含む。サンプルが１００ウェルに分割される場合、９８ウェルはＳＮＶを有し、２ウェルは、０．５％でＳＮＶを有する。各ウェル中のＤＮＡをバーコード化し、増幅し、他のウェルからのＤＮＡと共にプールし、配列決定することができる。ＳＮＶを含まないウェルを使用して、バックグラウンド増幅／配列決定エラー率を測定し、外れ値のウェルからの信号が、ノイズのバックグラウンドレベルを超えているかどうかを決定することができる。

いくつかの実施形態において、増幅産物は、アレイ、例えば、目的の１つ以上の染色体（例えば、染色体１３、１８、２１、Ｘ、Ｙ、またはこれらの任意の組み合わせ）に対するプローブを用いたアレイ（特にマイクロアレイ）を用いて検出される。例えば、市販のＳＮＰ検出マイクロアレイ、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（サンディエゴ、ＣＡ） ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ、ＤＡＳＬ、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ、またはＣｙｔｏＳＮＰ−１２遺伝子型決定アッセイ、またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ製のＳＮＰ検出マイクロアレイ製品、例えば、ＯｎｃｏＳｃａｎマイクロアレイを使用することができることが理解されるだろう。

配列決定することを伴ういくつかの実施形態において、リード深度は、所与の遺伝子座にマッピングする配列決定リードの数である。リード深度は、リード総数にわたって正規化されてもよい。サンプルのリード深度についてのいくつかの実施形態において、リード深度は、標的遺伝子座にわたる平均リード深度である。遺伝子座のリード深度についてのいくつかの実施形態において、リード深度は、その遺伝子座にマッピングするシーケンサによって測定されるリードの数である。一般に、遺伝子座のリード深度が大きいほど、その遺伝子座での対立遺伝子の比率が、元々のＤＮＡサンプルにおける対立遺伝子の比率と近い傾向がある。リード深度は、限定されないが、百分率または割合を含め、種々の異なる方法で表現されてもよい。したがって、例えば、高度に並行なＤＮＡシーケンサ、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨＩＳＥＱは、例えば、１００万個のクローン配列を生成し、１つの遺伝子座の配列決定を３０００回行うと、その遺伝子座でのリード深度は、３，０００リードになる。その遺伝子座でのリードの割合は、３，０００を総リード１００万で割り算したものであり、すなわち、総リードの０．３％である。

いくつかの実施形態において、対立遺伝子データが得られ、対立遺伝子データは、多型遺伝子座の特定の対立遺伝子のコピー数の指標である定量測定値（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、対立遺伝子データは、多型遺伝子座で観測される対立遺伝子それぞれのコピー数の指標である定量測定値（複数可）を含む。典型的には、目的の多型遺伝子座の全ての可能な対立遺伝子について、定量測定値が得られる。例えば、マイクロアレイ、ｑＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、例えば、高スループットＤＮＡ配列決定など、ＳＮＰまたはＳＮＶ遺伝子座について対立遺伝子を決定するための前述の段落で記載された方法のいずれかを使用して、多型遺伝子座の特定の対立遺伝子のコピー数の定量測定値を作成することができる。この定量測定値は、本明細書では、対立遺伝子頻度データまたは遺伝子対立遺伝子データの測定値と呼ばれる。対立遺伝子データを用いる方法は、時に、定量対立遺伝子方法と呼ばれることがある。これは、非多型遺伝子座から、または多型遺伝子座からであるが、対立遺伝子同一性に関するものではない、定量データを排他的に使用する定量方法とは対照的である。対立遺伝子データが、高スループット配列決定を用いて測定される場合、対立遺伝子データは、典型的には、目的の遺伝子座にマッピングする各対立遺伝子のリード数を含む。

いくつかの実施形態において、非対立遺伝子データが得られ、非対立遺伝子データは、特定の遺伝子座のコピー数の指標である定量測定値（複数可）を含む。遺伝子座は、多型または非多型であってもよい。遺伝子座が非多型である場合のいくつかの実施形態において、非対立遺伝子データは、その遺伝子座に存在し得る個々の対立遺伝子の相対量または絶対量に関する情報を含まない。非対立遺伝子データ（すなわち、非多型対立遺伝子からの定量データ、または多型遺伝子からであるが、各フラグメントの対立遺伝子同一性に関するものではない定量データ）のみを使用する方法は、定量方法と呼ばれる。典型的には、目的の多型遺伝子座の全ての可能な対立遺伝子について、定量測定値が得られ、１つの値は、全体で、その遺伝子座にある全ての対立遺伝子についての測定量に関連付けられる。多型遺伝子座についての非対立遺伝子データは、その遺伝子座にある各対立遺伝子についての定量対立遺伝子を合計することによって得られてもよい。対立遺伝子データが、高スループット配列決定を用いて測定される場合、非対立遺伝子データは、典型的には、目的の遺伝子座にマッピングするもののリード数を含む。配列決定測定値は、その遺伝子座に存在するそれぞれの対立遺伝子の相対数および／または絶対数を示すことができ、非対立遺伝子データは、対立遺伝子同一性にかかわらず、その遺伝子座にマッピングするリードの合計を含む。いくつかの実施形態において、配列決定測定値の同じセットを使用して、対立遺伝子データおよび非対立遺伝子データの両方を得ることができる。いくつかの実施形態において、対立遺伝子データを、ある方法の一部として使用して、目的の染色体でのコピー数を決定し、作成した非対立遺伝子データを、異なる方法の一部として使用して、目的の染色体でのコピー数を決定することができる。いくつかの実施形態において、この２つの方法は、統計的に直交しており、これらを組み合わせて、目的の染色体でのコピー数のより正確な決定を与える。

いくつかの実施形態において、遺伝子データを得ることは、（ｉ）実験技術によって、例えば、自動化高スループットＤＮＡシーケンサの使用によって、ＤＮＡ配列情報を取得すること、または（ｉｉ）実験技術によって前もって得ておいた情報を取得することを含み、この情報は、例えば、インターネットを介したコンピュータによって、または配列決定デバイスからの電子送信によって、電気的に送信される。

さらなる例示的なサンプル調製、増幅および定量化の方法は、２０１２年１１月２１日に出願された米国出願第１３／６８３，６０４号（米国公開第２０１３／０１２３１２０号および２０１４年５月１６日に出願された米国出願第６１／９９４，７９１号、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。これらの方法は、本明細書に開示されるサンプルのうちのいずれかの分析に使用することができる。

無細胞ＤＮＡのための例示的な定量化方法
所望な場合、ｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡの量または濃度は、標準的な方法を用いて測定することができる。いくつかの実施形態において、無細胞ミトコンドリアＤＮＡ（ｃｆ ｍＤＮＡ）の量または濃度が決定される。いくつかの実施形態において、核ＤＮＡに由来する無細胞ＤＮＡ（ｃｆ ｎＤＮＡ）の量または濃度が決定される。いくつかの実施形態において、ｃｆ ｍＤＮＡおよびｃｆ ｎＤＮＡの量または濃度が、同時に決定される。

いくつかの実施形態において、ｑＰＣＲを使用して、ｃｆ ｎＤＮＡおよび／またはｃｆ ｍＤＮＡを測定する（Ｋｏｈｌｅｒら、「Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒｓ．」Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ８：１０５、２００９、８：ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７６−４５９８−８−１０５、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、ｃｆ ｎＤＮＡからの１つ以上の遺伝子座（例えば、グリセルアルデヒド−３−ホスファト−デヒドロゲナーゼ、ＧＡＰＤＨ）およびｃｆ ｍＤＮＡからの１つ以上の遺伝子座（ＡＴＰａｓｅ ８およびＭＴＡＴＰ ８）を、マルチプレックスｑｐＣＲを用いて測定することができる。いくつかの実施形態において、蛍光標識ＰＣＲを使用して、ｃｆ ｎＤＮＡおよび／またはｃｆ ｍＤＮＡを測定する（Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂａｃｈら、「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｔｕｍｏｕｒ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｂｅｎｉｇｎ ｂｒｅａｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ．」Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓ ７：２８４８−２８５４、２０１１、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。所望な場合、データの正規分布は、標準的な方法、例えば、シャピロ−ウィルク検定を用いて決定することができる。所望な場合、ｃｆ ｎＤＮＡおよびｍＤＮＡのレベルは、標準的な方法、例えば、マン−ホイットニーのＵ検定を用いて比較することができる。いくつかの実施形態において、ｃｆ ｎＤＮＡおよび／またはｍＤＮＡのレベルを、標準的な方法、例えば、マン−ホイットニーのＵ検定またはクラスカル−ウォリス検定を用いて、他の確立された予後因子と比較する。

例示的なＲＮＡ増幅、定量化および分析方法
以下の例示的な方法のいずれかを使用して、ＲＮＡ（例えば、ｃｆＲＮＡ、細胞ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、コード細胞質ＲＮＡ、非コード細胞質ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはｔＲＮＡ）を増幅し、場合により定量してもよい。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇでのワールドワイドウェブ（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で入手可能なｍｉＲＢａｓｅに列挙されるｍｉＲＮＡ分子のいずれかである。例示的なｍｉＲＮＡ分子としては、ｍｉＲ−５０９、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−１４６ａが挙げられる。

いくつかの実施形態において、逆転写酵素多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＲＴ−ＭＬＰＡ）を用い、ＲＮＡを増幅する。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズプローブの各セットは、ＳＮＰに広がる２個の短い合成オリゴヌクレオチドと、１個の長いオリゴヌクレオチドとからなる（Ｌｉら、Ａｒｃｈ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｂｓｔｅｔ．「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｔｒｉｓｏｍｙ ２１ ｂｙ ＲＴ−ＭＬＰＡ ｗｉｔｈ ａ ｎｅｗ ｓｅｔ ｏｆ ＳＮＰ ｍａｒｋｅｒｓ」、２０１３年７月５日、ＤＯＩ １０．１００７／ｓ００４０４−０１３−２９２６−５、Ｓｃｈｏｕｔｅｎら、「Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ４０ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｂｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：ｅ５７、２００２、Ｄｅｎｇら（２０１１）「Ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｔｒｉｓｏｍｙ ２１ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｂｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｃｌｉｎ，Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ Ｍｅｄ．４９：６４１−６４６、２０１１、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、逆転写酵素ＰＣＲで増幅される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ、例えば、既に記載したようなＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉを用いる１工程リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲを用いて増幅される（Ｌｉら、Ａｒｃｈ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｂｓｔｅｔ．「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｔｒｉｓｏｍｙ ２１ ｂｙ ＲＴ−ＭＬＰＡ ｗｉｔｈ ａ ｎｅｗ ｓｅｔ ｏｆ ＳＮＰ ｍａｒｋｅｒｓ」、２０１３年７月５日、ＤＯＩ １０．１００７／ｓ００４０４−０１３−２９２６−５、Ｌｏら、「Ｐｌａｓｍａ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ＲＮＡ ａｌｌｅｌｉｃ ｒａｔｉｏ ｐｅｒｍｉｔｓ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」、Ｎａｔ Ｍｅｄ １３：２１８−２２３、２００７、Ｔｓｕｉら、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｍｉｃｒｏ−ａｒｒａｙ ｂａｓｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｍＲＮＡ ｉｎ ｍａｔｅｒｎａｌ ｐｌａｓｍａ：ｔｏｗａｒｄｓ ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ４１：４６１−４６７、２００４、Ｇｕら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１２２：６４１−６４９、２０１２、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

いくつかの実施形態において、マイクロアレイを使用して、ＲＮＡを検出する。例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のヒトｍｉＲＮＡマイクロアレイを、製造業者のプロトコルに従って使用することができる。簡単に言うと、単離されたＲＮＡは、脱リン酸化され、ｐＣｐ−Ｃｙ３を用いてライゲーションされる。標識されたＲＮＡを精製し、Ｓａｎｇｅｒ ｍｉＲＢａｓｅ ｒｅｌｅａｓｅ １４．０に基づいて、ヒト成熟ｍｉＲＮＡについてのプローブを含むｍｉＲＮＡアレイにハイブリダイズする。このアレイを洗浄し、マイクロアレイスキャナ（Ｇ２５６５ＢＡ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してスキャンする。各ハイブリダイゼーション信号の強度は、Ａｇｉｌｅｎｔ抽出ソフトウェアｖ９．５．３によって評価される。標識、ハイブリダイゼーションおよびスキャンは、Ａｇｉｌｅｎｔ ｍｉＲＮＡマイクロアレイシステムのプロトコルに従って行われてもよい（Ｇｕら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１２２：６４１−６４９、２０１２、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

いくつかの実施形態において、ＴａｑＭａｎアッセイを使用して、ＲＮＡを検出する。例示的なアッセイは、ＴａｑＭａｎ Ａｒｒａｙ Ｈｕｍａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｐａｎｅｌ ｖ１．０（Ｅａｒｌｙ Ａｃｃｅｓｓ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）であり、１５７のＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイを含み、それぞれの逆転写プライマー、ＰＣＲプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブを含む（Ｃｈｉｍら、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ｍａｔｅｒｎａｌ ｐｌａｓｍａ」、ＣｌｉｎＣｈｅｍ．５４（３）：４８２−９０、２００８、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

所望な場合、１つ以上のｍＲＮＡのｍＲＮＡスプライシングパターンは、標準的な方法を用いて決定することができる（Ｆａｃｋｅｎｔｈａｌ１およびＧｏｄｌｅｙ、Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ＆ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ １：３７−４２、２００８、ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｍｍ．０００３３１、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、高密度マイクロアレイおよび／または高スループットＤＮＡ配列決定を使用して、ｍＲＮＡスプライスバリアントを検出することができる。

いくつかの実施形態において、全トランスクリプトームショットガン配列決定またはアレイを使用して、トランスクリプトームを測定する。

例示的な増幅方法
同じ反応体積（例えば、全ての標的遺伝子座を同時に増幅するサンプルマルチプレックスＰＣＲの一部）における付近または隣接する標的遺伝子座の増幅に起因する干渉を最小化するか、または防ぐ、改善されたＰＣＲ増幅方法も開発された。これらの方法を使用して、付近または隣接する標的遺伝子座を同時に増幅することができ、これは、標的遺伝子座を別個に増幅し、干渉を避けることができるような、付近の標的遺伝子座を異なる反応体積に分割する必要がある方法よりも、迅速であり、安価である。

いくつかの実施形態において、標的遺伝子座の増幅は、低い５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および／または低い鎖置換活性を有するポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）を用いて行われる。いくつかの実施形態において、低レベルの５’→３’エキソヌクレアーゼは、付近のプライマー（例えば、伸長していないプライマー、またはプライマー伸長中に加えられる１つ以上のヌクレオチドを有しているプライマー）の分解を減らすか、または防ぐ。いくつかの実施形態において、低レベルの鎖置換活性は、付近のプライマー（例えば、伸長していないプライマー、またはプライマー伸長中に加えられる１つ以上のヌクレオチドを有しているプライマー）の置換を減らすか、または防ぐ。いくつかの実施形態において、互いに隣接する標的遺伝子座（例えば、標的遺伝子座の間に塩基がない）または付近のもの（例えば、遺伝子座が、５０、４０、３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１塩基以内にある）が増幅される。いくつかの実施形態において、１つの遺伝子座の３’末端は、次の下流の遺伝子座の５’末端の５０、４０、３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１塩基以内である。

いくつかの実施形態において、少なくとも１００、２００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００または１００，０００個の異なる標的遺伝子座が増幅される（例えば、１つの反応体積における同時増幅による）。いくつかの実施形態において、増幅産物の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％が、標的アンプリコンである。種々の実施形態において、標的アンプリコンである増幅産物の量は、５０〜９９．５％、例えば、６０〜９９％、７０〜９８％、８０〜９８％、９０〜９９．５％または９５〜９９．５％（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、例えば、１つの反応体積における同時増幅によって、標的遺伝子座の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％が増幅される（例えば、増幅前の量と比較して、少なくとも５、１０、２０、３０、５０または１００倍に増幅される）。種々の実施形態において、増幅される標的遺伝子座の量（例えば、増幅前の量と比較して、少なくとも５、１０、２０、３０、５０または１００倍に増幅される）は、５０〜９９．５％、例えば、６０〜９９％、７０〜９８％、８０〜９９％、９０〜９９．５％、９５〜９９．９％または９８〜９９．９９％（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、より少ない非標的アンプリコン、例えば、第１のプライマー対からの順方向プライマーおよび第２のプライマー対からの逆方向プライマーから作られる、より少ないアンプリコンが産生される。このような望ましくない非標的アンプリコンは、例えば、第１のプライマー対からの逆方向プライマーおよび／または第２のプライマー対からの順方向プライマーが分解し、および／または置き換わっている場合に、従来の増幅方法を用いて産生する可能性がある。

いくつかの実施形態において、これらの方法は、伸長されるプライマーに結合するポリメラーゼが、このポリメラーゼの低い５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および／または低い鎖置換活性を考慮して、付近のプライマー（例えば、次の下流のプライマー）を分解および／または置き換える確率が低いため、より長い伸長時間を使用することが可能である。種々の実施形態において、ポリメラーゼの伸長率が、伸長されるプライマーに付加されるヌクレオチドの数が、そのプライマー結合部位の３’末端と同じ鎖上の次の下流のプライマー結合部位の５’末端との間のヌクレオチド数の８０、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５または２００％に等しいか、または大きくすることが可能であるような反応条件（例えば、伸長時間および温度）が使用される。

いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡをテンプレートとして用い、ＤＮＡアンプリコンを産生するために使用される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡをテンプレートとして用い、ＲＮＡアンプリコンを産生するために使用される。いくつかの実施形態において、逆転写酵素は、ＲＮＡをテンプレートとして用い、ｃＤＮＡアンプリコンを産生するために使用される。

いくつかの実施形態において、ポリメラーゼの低レベルの５’→３’エキソヌクレアーゼは、同じ条件で同じ量のＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓポリメラーゼの活性の８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、１または０．１％未満である（「Ｔａｑ」ポリメラーゼ、一般的に使用される好熱菌由来のＤＮＡポリメラーゼであり、ＰＤＢ １ＢＧＸ、ＥＣ ２．７．７．７、Ｍｕｒａｌｉら、「Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｂ：ｔｈｅ Ｆａｂ ｉｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ａｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅｌｉｘ−ｃｏｉｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１２５６２−１２５６７、１９９８、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼの低レベルの鎖置換活性は、同じ条件で同じ量のＴａｑポリメラーゼの活性の８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、１または０．１％未満である。

いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、ＰＵＳＨＩＯＮ ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＰＨＵＳＩＯＮ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０５３０Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．）またはＰＨＵＳＩＯＮ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０５３５Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．、ＦｒｅｙおよびＳｕｐｐｍａｎ ＢｉｏＣｈｅｍｉｃａ．２：３４−３５、１９９５、ＣｈｅｓｔｅｒおよびＭａｒｓｈａｋ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０９：２８４−２９０、１９９３、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）である。ＰＨＵＳＩＯＮ ＤＮＡポリメラーゼは、処理能力向上ドメインと融合したＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ様酵素である。ＰＨＵＳＩＯＮ ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’ポリメラーゼ活性と３’→５’エンドヌクレアーゼ活性を有し、平滑末端化した産物を生成する。ＰＨＵＳＩＯＮ ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性と鎖置換活性を欠く。

いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、Ｑ５（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｍ０４９１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．）またはＱ５（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｍ０４９３Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．）である。Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼは、忠実度が高く、熱に安定なＤＮＡポリメラーゼであり、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、処理能力向上Ｓｓｏ７ｄドメインに融合している。Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性と鎖置換活性を欠く。

いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼである（Ｍ０２０３Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．；ＴａｂｏｒおよびＳｔｒｕｈ．（１９８９）．「ＤＮＡ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ」、Ｉｎ Ａｕｓｅｂｅｌら（編集）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．３．５．１０−３．５．１２．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９８９；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．（第２版）、５．４４−５．４７．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’方向へのＤＮＡの合成を触媒し、テンプレートおよびプライマーの存在を必要とする。この酵素は、ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉでみられるよりもかなり活性が高い３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性と鎖置換活性を欠く。

いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＶである（Ｍ０３２７Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．、（Ｂｏｕｄｓｏｃｑら、（２００１）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２９：４６０７−４６１６、２００１、ＭｃＤｏｎａｌｄら（２００６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３４：１１０２−１１１１、２００６、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＶは、種々のＤＮＡテンプレート病変にわたってＤＮＡを効率的に合成する、熱に安定なＹファミリー病変バイパスＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅである。ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｐ．ら（２００６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３４、１１０２−１１１１、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＶは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性と鎖置換活性を欠く。

いくつかの実施形態において、プライマーがＳＮＰを有する領域に結合する場合、プライマーは、異なる効率で異なる対立遺伝子に結合し、増幅してもよく、または１つの対立遺伝子にのみ結合し、増幅してもよい。ヘテロ接合性である被験体について、対立遺伝子の１つが、プライマーによって増幅されなくてもよい。いくつかの実施形態において、プライマーは、各対立遺伝子に対して設計される。例えば、２つの対立遺伝子（例えば、二対立遺伝子ＳＮＰ）が存在する場合、２つのプライマーを使用して、標的遺伝子座の同じ位置に結合してもよい（例えば、「Ａ」対立遺伝子に結合するための順方向プライマーおよび「Ｂ」対立遺伝子に結合するための順方向プライマー）。標準的な方法（例えばｄｂＳＮＰデータベース）を使用して、既知のＳＮＰ、例えば、高いヘテロ接合率を有するＳＮＰホットスポットの位置を決定することができる。

いくつかの実施形態において、アンプリコンは、同様の大きさである。いくつかの実施形態において、標的アンプリコンの長さの範囲は、１００、７５、５０、２５、１５、１０または５ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態（例えば、フラグメント化されたＤＮＡまたはＲＮＡ中の標的遺伝子座の増幅）において、標的アンプリコンの長さは、５０〜１００ヌクレオチド、例えば、６０〜８０ヌクレオチドまたは６０〜７５ヌクレオチド（境界値を含む）である。いくつかの実施形態（例えば、エクソンまたは遺伝子全体の複数の標的遺伝子座の増幅）において、標的アンプリコンの長さは、１００〜５００ヌクレオチド、例えば、１５０〜４５０ヌクレオチド、２００〜４００ヌクレオチド、２００〜３００ヌクレオチドまたは３００〜４００ヌクレオチド（境界値を含む）である。

いくつかの実施形態において、複数の標的遺伝子座は、その反応体積中の増幅されるそれぞれの標的遺伝子座についての順方向および逆方向のプライマーを含むプライマー対を用いて同時に増幅される。いくつかの実施形態において、１ラウンドのＰＣＲは、標的遺伝子座あたり１個のプライマーを用いて行われ、次いで、第２ラウンドのＰＣＲは、標的遺伝子座あたり１個のプライマー対を用いて行われる。例えば、第１ラウンドのＰＣＲは、全てのプライマーが同じ鎖に結合する（例えば、各標的遺伝子座について順方向プライマーを用いる）ように、標的遺伝子座あたり１個のプライマーを用いて行われてもよい。これにより、ＰＣＲは、線形態様で増幅が可能であり、配列または長さの差に起因するアンプリコン間の増幅バイアスを減らすか、または除外する。いくつかの実施形態において、次いで、各標的遺伝子座について、順方向および逆方向のプライマーを用い、アンプリコンが増幅される。

例示的なプライマー設計方法
所望な場合、マルチプレックスＰＣＲは、プライマーダイマーを生成する尤度が低いプライマーを用いて行われてもよい。特に、高度に多重化したＰＣＲは、多くは、プライマーダイマー生成などの生産的ではない副反応から得られる非常に高い割合の産物ＤＮＡを生成し得る。一実施形態において、生産的ではない副反応を引き起こす可能性が最も高い特定のプライマーは、プライマーライブラリから除去され、ゲノムにマッピングする増幅ＤＮＡの割合を大きくするプライマーライブラリを与え得る。問題のあるプライマー、すなわち、ダイマーを安定させる可能性が特に高いプライマーを除去する工程は、予測できないことに、その後の配列決定による分析のための非常に高いＰＣＲ多重化レベルを可能にした。

非マッピングプライマーダイマーまたは他のプライマー妨害産物の量が最小限にされたライブラリのためのプライマーを選択するいくつかの方法が存在する。経験的なデータは、少数の「悪い」プライマーが、多量の非マッピングプライマーダイマー副反応の原因であることを示す。これらの「悪い」プライマーを除去することで、標的遺伝子座へマッピングする配列リードの割合を高めることができる。「悪い」プライマーを特定するための１つの方法は、標的化された増幅によって増幅されたＤＮＡの配列決定データを見ることであり、最も頻繁にみられるこれらのプライマーダイマーが除去され、ゲノムにマッピングされない副産物ＤＮＡを生じる可能性が顕著に低いプライマーライブラリを与えることができる。種々のプライマーの組み合わせの結合エネルギーを計算することができる公的に利用可能なプログラムも存在し、最も高い結合エネルギーを有するものを除去することで、ゲノムにマッピングされない副産物ＤＮＡを生じる可能性が顕著に低いプライマーライブラリも与えるだろう。

プライマーを選択するためのいくつかの実施形態において、候補プライマーの初期ライブラリは、候補標的遺伝子座に対する１つ以上のプライマーまたはプライマー対を設計することによって作成される。候補標的遺伝子座（例えばＳＮＰ）のセットは、標的遺伝子座にとって望ましいパラメータ（例えば、標的集合内のＳＮＰの頻度またはＳＮＰのヘテロ接合率）に関する公的に利用可能な情報に基づいて選択することができる。一実施形態において、ＰＣＲプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３プログラム（ｐｒｉｍｅｒ３．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ：ｌｉｂｐｒｉｍｅｒ３ ｒｅｌｅａｓｅ ２．２．３でのワールドワイドウェブ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を用いて設計されてもよい。所望な場合、特定のアニーリング温度範囲内でアニーリングし、特定の範囲のＧＣ内容物を有し、特定のサイズ範囲を有し、特定のサイズ範囲で標的アンプリコンを産生し、および／または他のパラメータ特徴を有するようなプライマーを設計することができる。候補標的遺伝子座あたり、複数のプライマーまたはプライマー対を用いて開始すると、プライマーまたはプライマー対が標的遺伝子座の大部分または全てについてのライブラリ中に残る尤度が増加する。一実施形態において、選択基準は、標的遺伝子あたり少なくとも１つのプライマーがライブラリ中に残ることを必要とし得る。そうすれば、最終的なプライマーライブラリを使用するとき、標的遺伝子座の大部分または全てが増幅されるだろう。このことは、ゲノム中の多数の位置での欠失または重複についてのスクリーニング、またはある疾患またはある疾患のリスク上昇に関連付けられた多数の配列（例えば、多型または他の変異）についてのスクリーニングなどの用途に望ましい。ライブラリからのプライマー対が、別のプライマー対によって産生される標的アンプリコンと重複する標的アンプリコンを産生する場合、プライマー対の１つが、干渉を防ぐためにライブラリから除去されてもよい。

いくつかの実施形態において、候補プライマーのライブラリからの２つのプライマーの可能な組み合わせの大部分または全てについて、「望ましくなさスコア」（最小の望ましくなさを表す、より高いスコア）が計算される。種々の実施形態において、望ましくなさスコアは、ライブラリ中の候補プライマーの可能な組み合わせの少なくとも８０、９０、９５、９８、９９または９９．５％について計算される。それぞれの望ましくなさスコアは、少なくとも部分的に、２つの候補プライマー間のダイマー生成の尤度に依存する。所望な場合、望ましくなさスコアは、標的遺伝子座のヘテロ接合率、標的遺伝子座のある配列（例えば、多型）に関連付けられた疾患有病率、標的遺伝子座のある配列（例えば、多型）に関連付けられた疾患浸透度、標的遺伝子座に対する候補プライマーの特異性、候補プライマーの大きさ、標的アンプリコンの融点、標的アンプリコンのＧＣ含有率、標的アンプリコンの増幅効率、標的アンプリコンの大きさおよび組換えホットスポットの中心からの距離からなる群から選択される１つ以上の他のパラメータにも基づいていてもよい。いくつかの実施形態において、標的遺伝子座に対する候補プライマーの特異性は、候補プライマーが、増幅するように設計された標的遺伝子座以外の遺伝子座に結合し、増幅することによって、誤ってプライマー結合する尤度を含む。いくつかの実施形態において、誤ってプライマー結合する１つ以上または全ての候補プライマーが、ライブラリから除去される。いくつかの実施形態において、選択する候補プライマーの数を増やすために、誤ってプライマー結合し得る候補プライマーは、ライブラリから除去されない。複数の因子が考慮される場合、望ましくなさスコアは、種々のパラメータの重み付けされた平均に基づいて計算されてもよい。パラメータは、プライマーが使用される特定の用途に対するその重要性に基づいて、異なる重みを割り当てられてもよい。いくつかの実施形態において、最も高い望ましくなさスコアを有するプライマーが、ライブラリから除去される。除去されたプライマーが、１つの標的遺伝子座にハイブリダイズするプライマー対のメンバーである場合、そのプライマー対の他のメンバーは、ライブラリから除去されてもよい。プライマーを除去するプロセスは、所望なように繰り返されてもよい。いくつかの実施形態において、上述の選択方法は、ライブラリ中に残る候補プライマーの組み合わせについての望ましくなさスコアが、全て最小閾値と等しいか、またはそれより小さくなるまで行われる。いくつかの実施形態において、上述の選択方法は、ライブラリ中に残る候補プライマーの数が、所望な数まで減るまで行われる。

種々の実施形態において、望ましくなさスコアが計算された後、第１の最小閾値より大きな望ましくなさスコアを有する２つの候補プライマーの組み合わせの最大数の一部である候補プライマーは、ライブラリから除去される。この工程は、これらの相互作用があまり有意ではないため、第１の最小閾値と等しいか、または下回る相互作用を無視する。除去されたプライマーが、１つの標的遺伝子座にハイブリダイズするプライマー対のメンバーである場合、そのプライマー対の他のメンバーは、ライブラリから除去されてもよい。プライマーを除去するプロセスは、所望なように繰り返されてもよい。いくつかの実施形態において、上述の選択方法は、ライブラリ中に残る候補プライマーの組み合わせについての望ましくなさスコアが、全て第１の最小閾値と等しいか、またはそれより小さくなるまで行われる。ライブラリ中に残る候補プライマーの数が、所望な数よりも多い場合、プライマーの数は、第１の最小閾値をそれより小さな第２の最小閾値まで減らし、プライマーを除去するプロセスを繰り返すことによって減らされてもよい。ライブラリ中に残る候補プライマーの数が、所望な数よりも少ない場合、本方法は、第１の最小閾値をそれより大きな第２の最小閾値まで増加させ、元の候補プライマーライブラリを用いて、プライマーを除去するプロセスを繰り返すことによって続けられてもよく、それにより、より多くの候補プライマーがライブラリ中に残ることを可能にする。いくつかの実施形態において、上述の選択方法は、ライブラリ中に残る候補プライマーの組み合わせについての望ましくなさスコアが、全て第２の最小閾値と等しいか、またはそれより小さくなるまで、またはライブラリ中に残る候補プライマーの数が所望な数まで減るまで、行われる。

所望な場合、別のプライマー対によって産生される標的アンプリコンと重複する標的アンプリコンを産生するプライマー対は、別個の増幅反応に分割されてもよい。複数のＰＣＲ増幅反応は、（重複する標的アンプリコンに起因して、分析からの候補標的遺伝子座を省く代わりに）候補標的遺伝子座の全てを分析することが望ましい用途にとって望ましい場合がある。

これらの選択方法は、プライマーダイマーの望ましい減少を達成するために、ライブラリから除去されなければならない候補プライマーの数を最小限にする。より少ない数の候補プライマーをライブラリから除去することによって、標的遺伝子座のより多く（または全て）を、得られたプライマーライブラリを用いて増幅することができる。

多数のプライマーを多重化することで、含まれ得るアッセイにかなりの制約を課す。意図せずに相互作用するアッセイは、偽の増幅産物を生じる。ミニＰＣＲのサイズ制約は、さらなる制約を引き起こし得る。一実施形態において、非常に多数の潜在的なＳＮＰ標的（約５００から１００万より多くまで）から開始し、各ＳＮＰを増幅するようにプライマーを設計するように企画することが可能である。プライマーを設計することが可能な場合、ＤＮＡ二本鎖生成のための公開されている熱力学的パラメータを用い、全ての可能なプライマー対間の偽のプライマー二本鎖生成の尤度を評価することによって、偽の産物を生成する可能性があるプライマー対を特定するように企画することが可能である。プライマーの相互作用は、この相互作用に関連するスコアリング関数によってランク付けされてもよく、最も悪い相互作用スコアを有するプライマーは、望ましいプライマー数を満たすまで、除外される。ヘテロ接合性である可能性があるＳＮＰが最も有用である場合、アッセイのリストもランク付けし、最もヘテロ接合性に適合するアッセイを選択することが可能である。高い相互作用スコアを有するプライマーが、プライマーダイマーを形成する可能性が最も高いことが実験で検証されている。高度に多重化すると、全ての偽の相互作用を除外することは可能ではないが、反応全体を支配し、意図した標的からの増幅を大きく制限することがあるため、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで最も高い相互作用スコアを有するプライマーまたはプライマー対を除外することが不可欠である。この手順を行い、１０，０００プライマーまで、ある場合には、１０，０００プライマーを超える複数のプライマーセットを作成した。この手順に起因する改善は、かなりのものであり、全てのＰＣＲ産物によって決定されるような標的産物に対して、最も悪いプライマーが除去されなかった反応からの１０％と比較して、８０％より多く、９０％より多く、９５％より多く、９８％より多く、さらに９９％より多くの増幅を可能にする。既に記載したように、部分的なセミネスティッド手法と組み合わせると、アンプリコンの９０％より多く、さらに９５％より多くが、標的配列にマッピングされ得る。

なお、どのＰＣＲプローブがダイマーを形成する可能性が高いかを決定する他の方法が存在する。一実施形態において、最適化されていないプライマーセットを用いて増幅されたＤＮＡのプールの分析は、問題のあるプライマーを決定するのに十分な場合がある。例えば、分析は、配列決定を用いて行われてもよく、最も多く存在するこれらのダイマーは、ダイマーを形成する可能性が最も高いものであると決定され、除去されてもよい。一実施形態において、プライマー設計の方法は、本明細書に記載のミニＰＣＲ方法と組み合わせて使用されてもよい。

プライマーに対するタグの使用は、プライマーダイマー産物の増幅および配列決定を減らし得る。いくつかの実施形態において、プライマーは、タブを含むループ構造を形成する内部領域を含む。特定の実施形態において、プライマーは、標的遺伝子座に特異的な５’領域と、標的遺伝子座に特異的ではなく、ループ構造を形成する内部領域と、標的遺伝子座に特異的な３’領域とを含む。いくつかの実施形態において、ループ領域は、２つの結合領域がテンプレートＤＮＡの連続した領域または隣接領域に結合するように設計されている２つの結合領域間に存在していてもよい。種々の実施形態において、３’領域の長さは、少なくとも７ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、３’領域の長さは、７〜２０ヌクレオチド、例えば、７〜１５ヌクレオチドまたは７〜１０ヌクレオチド（境界値を含む）である。種々の実施形態において、プライマーは、標的遺伝子座に特異的ではない５’領域（例えば、タグまたはユニバーサルプライマー結合部位）の後に、標的遺伝子座に特異的な領域と、標的遺伝子座に特異的ではなく、ループ構造を形成する内部領域と、標的遺伝子座に特異的な３’領域とを含む。タグプライマーを使用して、必要な標的特異性配列を２０未満、１５未満、１２未満、さらに１０未満の塩基対まで短くすることができる。これは、標的配列がプライマー結合部位へとフラグメント化される場合、またはプライマー設計へと設計される場合に、予想外の発見となり得る。この方法の利点は、特定の最大アンプリコン長のために設計可能なアッセイの数を増やすことと、プライマー配列の「無情報」配列決定を短くすることを含む。内部タグ化と組み合わせ使用することも可能である。

一実施形態において、多重標的化ＰＣＲ増幅における非生産的な産物の相対量は、アニーリング温度を上げることによって減らすことができる。標的特異性プライマーと同じタグを用いてライブラリを増幅する場合、アニーリング温度は、タグがプライマー結合に寄与するため、ゲノムＤＮＡと比較して、高くすることができる。いくつかの実施形態において、場合により、より長いアニーリング時間と共に、低いプライマー濃度が使用される。いくつかの実施形態において、アニーリング時間は、３分間より長く、５分間より長く、８分間より長く、１０分間より長く、１５分間より長く、２０分間より長く、３０分間より長く、６０分間より長く、１２０分間より長く、２４０分間より長く、４８０分間より長く、さらに９６０分間より長くてもよい。特定の例示的な実施形態において、より長くアニーリング時間を、低いプライマー濃度と共に使用する。種々の実施形態において、３、５、８、１０または１５分間より長い、通常の伸長時間より長い時間が使用される。いくつかの実施形態において、プライマー濃度は、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ程度の低さ、および１ｎＭ未満である。これにより、驚くべきことに、高度二多重化された反応、例えば、１０００倍反応、２０００倍反応、５０００倍反応、１００００倍反応、２００００倍反応、５００００倍反応およびさらに１０００００倍反応について、安定した性能が得られる。一実施形態において、増幅は、長いアニーリング時間を有する１、２、３、４または５サイクルを使用し、その後、タグ化プライマーを用い、通常のさらに長いアニーリング時間を有するＰＣＲサイクルを使用する。

標的位置を選択するために、候補プライマー対設計のプールから開始し、プライマー対との間の潜在的に有害な副次的相互作用の熱力学的モデルを作成し、次いで、プール中の他の設計と互換性のない設計を除外するモデルを使用してもよい。

一実施形態において、本発明は、標的遺伝子座（例えば、ある疾患もしくは障害またはある疾患もしくは障害（例えば癌）のリスク上昇に関連付けられた多型または変位を含み得る遺伝子座）の数を減らし、および／または検出される疾患負荷を増加させる（例えば、検出される多型または変位の数を増やす）方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、本方法は、疾患または障害（例えば癌）を有する被験体間の各遺伝子座における多型または変位の頻度または再発（例えば、単一ヌクレオチド変動、または欠失、または本明細書に記載する他の変動のいずれか）によって、遺伝子座をランク付けすること（例えば、最高から最低までランク付けすること）を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＲプライマーは、遺伝子座のいくつかまたは全てに対して設計される。プライマーのライブラリのためのＰＣＲプライマーの選択中に、より高い頻度または再発を有する遺伝子座（より高くランク付けされた遺伝子座）に対するプライマーは、より低い頻度または再発を有する遺伝子座（より低くランク付けされた遺伝子座）よりも好ましい。いくつかの実施形態において、このパラメータは、本明細書に記載される望ましくなさスコアの計算におけるパラメータの１つとして含まれる。所望な場合、ライブラリ中の他の設計と不適合なプライマー（例えば、高くランク付けされた遺伝子座に対するプライマー）は、異なるＰＣＲライブラリ／プールに含まれてもよい。いくつかの実施形態では、複数のライブラリ／プール（例えば、２、３、４、５またはもっと多く）は、別個のＰＣＲ反応に使用され、全てのライブラリ／プールによって表される遺伝子座の全て（または大部分）の増幅を可能にする。いくつかの実施形態において、この方法は、プライマーが、集合体において、（例えば、疾患負荷の少なくとも８０、８５、９０、９５または９９％の検出によって）所望な疾患負荷をその疾患または障害のために捕捉しうることを可能にするのに十分なプライマーが１つ以上のライブラリ／プールに含まれるまで続けられる。

例示的なプライマーライブラリ
一態様において、本発明は、プライマー、例えば、本発明の方法のいずれかを用いて候補プライマーのライブラリから選択されるプライマーのライブラリを特徴とする。いくつかの実施形態において、ライブラリは、１つの反応体積において、少なくとも１００、２００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００または１００，０００の異なる標的遺伝子座を同時にハイブリダイズする（または同時にハイブリダイズすることが可能である）か、または同時に増幅する（または同時に増幅することが可能である）プライマーを含む。様々な実施形態において、ライブラリは、１つの反応体積において、１００〜５００、５００〜１，０００、１，０００〜２，０００、２，０００〜５，０００、５，０００〜７，５００、７，５００〜１０，０００、１０，０００〜２０，０００、２０，０００〜２５，０００、２５，０００〜３０，０００、３０，０００〜４０，０００、４０，０００〜５０，０００、５０，０００〜７５，０００または７５，０００〜１００，０００（境界値を含む）の異なる標的遺伝子座を同時に増幅する（または同時に増幅することが可能な）プライマーを含む。種々の実施形態において、ライブラリは、１つの反応体積において、１，０００〜１００，０００の異なる標的遺伝子座、例えば、１，０００〜５０，０００、１，０００〜３０，０００、１，０００〜２０，０００、１，０００〜１０，０００、２，０００〜３０，０００、２，０００〜２０，０００、２，０００〜１０，０００、５，０００〜３０，０００、５，０００〜２０，０００、ｏｒ ５，０００〜１０，０００（境界値を含む）の異なる標的遺伝子座を同時に増幅する（または同時に増幅することが可能な）プライマーを含む。いくつかの実施形態において、ライブラリは、増幅産物の６０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１、０．５、０．２５、０．１または０．５％未満がプライマーダイマーであるように、１つの反応体積において標的遺伝子座を同時に増幅する（または同時に増幅することが可能な）プライマーを含む。種々の実施形態は、プライマーダイマーである増幅産物の量は、０．５〜６０％、例えば、０．１〜４０％、０．１〜２０％、０．２５〜２０％、０．２５〜１０％、０．５〜２０％、０．５〜１０％、１〜２０％または１〜１０％（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、プライマーは、増幅産物の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％が標的アンプリコンであるように、１つの反応体積において標的遺伝子座を同時に増幅する（または同時に増幅することが可能である）。種々の実施形態において、標的アンプリコンである増幅される産物の量は、５０〜９９．５％、例えば、６０〜９９％、７０〜９８％、８０〜９８％、９０〜９９．５％または９５〜９９．５％（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、プライマーは、標的遺伝子座の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％が増幅される（例えば、増幅前の量と比較して少なくとも５、１０、２０、３０、５０または１００倍に増幅される）ように、１つの反応体積において標的遺伝子座を同時に増幅する（または同時に増幅することが可能である）。種々の実施形態において、増幅される標的遺伝子座の量（例えば、増幅前の量と比較して、少なくとも５、１０、２０、３０、５０または１００倍に増幅される）は、５０〜９９．５％、例えば、６０〜９９％、７０〜９８％、８０〜９９％、９０〜９９．５％、９５〜９９．９％または９８〜９９．９９％（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、プライマーのライブラリは、少なくとも１００、２００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００または１００，０００のプライマー対を含み、プライマーの各対が、順方向の試験プライマーおよび逆方向の試験プライマーを含み、試験プライマーの各対が、標的遺伝子座にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、プライマーのライブラリは、それぞれが異なる標的遺伝子座に結合する少なくとも１００、２００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００または１００，０００の個々のプライマーを含み、個々のプライマーは、プライマー対の一部ではない。

種々の実施形態において、各プライマーの濃度は、１００、７５、５０、２５、２０、１０、５、２または１ｎＭ未満であるか、または５００、１００、１０または１ｕＭ未満である。種々の実施形態において、各プライマーの濃度は、１ｕＭ〜１００ｎＭ、例えば、１ｕＭ〜１ｎＭ、１〜７５ｎＭ、２〜５０ｎＭまたは５〜５０ｎＭ（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、プライマーのＧＣ含有量は、３０〜８０％、例えば、４０〜７０％または５０〜６０％（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、プライマーのＧＣ含有量の範囲は、３０、２０、１０または５％未満である。いくつかの実施形態において、プライマーのＧＣ含有量の範囲は、５〜３０％、例えば、５〜２０％または５〜１０％（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、試験プライマーの融点（Ｔ_ｍ）は、４０〜８０℃、例えば、５０〜７０℃、５５〜６５℃または５７〜６０．５℃（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、Ｔ_ｍは、Ｐｒｉｍｅｒ３プログラム（ｌｉｂｐｒｉｍｅｒ３リリース２．２．３）を用い、ビルトインのＳａｎｔａＬｕｃｉａパラメータ（ｐｒｉｍｅｒ３．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔでのワールドワイドウェブ）を用いて計算される。いくつかの実施形態において、プライマーの融点の範囲は、１５、１０、５、３または１℃未満である。いくつかの実施形態において、プライマーの融点の範囲は、１〜１５℃、例えば、１〜１０℃、１〜５℃または１〜３℃（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、プライマーの長さは、１５〜１００ヌクレオチド、例えば、１５〜７５ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、１７〜３５ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチドまたは２０〜６５ヌクレオチド（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、プライマーの長さの範囲は、５０、４０、３０、２０、１０または５ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態において、プライマーの長さの範囲は、５〜５０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜２０ヌクレオチドまたは５〜１０ヌクレオチド（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、標的アンプリコンの長さは、５０〜１００ヌクレオチド、例えば、６０〜８０ヌクレオチドまたは６０〜７５ヌクレオチド（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、標的アンプリコンの長さの範囲は、５０、２５、１５、１０または５ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態において、標的アンプリコンの長さの範囲は、５〜５０ヌクレオチド、例えば、５〜２５ヌクレオチド、５〜１５ヌクレオチドまたは５〜１０ヌクレオチド（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、ライブラリは、マイクロアレイを含まない。いくつかの実施形態において、ライブラリは、マイクロアレイを含む。

いくつかの実施形態において、アダプターまたはプライマーのいくつか（例えば、少なくとも８０、９０または９５％）または全ては、天然に存在するホスホジエステル結合以外の隣接ヌクレオチド間の１つ以上の結合を含む。このような結合の例としては、ホスホラミド、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート結合が挙げられる。いくつかの実施形態において、アダプターまたはプライマーのいくつか（例えば、少なくとも８０、９０または９５％）または全ては、最後の３’ヌクレオチドと２番目から最後の３’ヌクレオチドの間にチホホスフェート（例えば、モノチオホスフェート）を含む。いくつかの実施形態において、アダプターまたはプライマーのいくつか（例えば、少なくとも８０、９０または９５％）または全ては、３’末端にある最後の２、３、４または５ヌクレオチド間にチホホスフェート（例えば、モノチオホスフェート）を含む。いくつかの実施形態において、アダプターまたはプライマーのいくつか（例えば、少なくとも８０、９０または９５％）または全ては、３’末端にある最後の１０ヌクレオチドのうち少なくとも１、２、３、４または５ヌクレオチド間にチホホスフェート（例えば、モノチオホスフェート）を含む。いくつかの実施形態において、このようなプライマーは、開裂または分解される可能性が低い。いくつかの実施形態において、プライマーは、酵素開裂部位（プロテアーゼ開裂部位など）を含まない。

さらなる例示的なマルチプレックスＰＣＲ方法およびライブラリは、２０１２年１１月２１日に出願された米国出願第１３／６８３，６０４号（米国公開第２０１３／０１２３１２０号）および２０１４年５月１６日に出願された米国出願第６１／９９４，７９１号に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これらの方法およびライブラリは、本明細書に開示されるサンプルのいずれかを分析し、本発明の方法のうちのいずれかに使用するために使用することができる。

組み換えの検出のための例示的なプライマーライブラリ
いくつかの実施形態において、プライマーライブラリ中のプライマーは、１つ以上の既知の組換えホットスポットで組換え（例えば、相同ヒト染色体間のクロスオーバー）が起こったか否かを決定するために設計される。染色体間でどのようなクロスオーバーが起こったかを知ることで、より正確なフェージング遺伝子データを個体について決定することができる。組換えホットスポットは、組換え事象が濃縮して起こる傾向がある染色体の局所的な領域である。組換えホットスポットは、組換えの平均頻度より低い「コールドスポット」領域が隣接していることが多い。組み換えホットスポットは、類似の形態を共有する傾向があり、約１〜２ｋｂ長である。ホットスポット分布は、ＧＣ含有量および反復要素分布と正の相関にある。部分的に変性した１３マーモチーフＣＣＮＣＣＮＴＮＮＣＣＮＣは、いくつかのホットスポット活性において、ある役割を果たす。ＰＲＤＭ９と呼ばれるジンクフィンガータンパク質がこのモチーフに結合し、その位置で組換えを開始することが示されている。組換えホットスポットの中心間の平均距離は、約８０ｋｂであると報告されている。いくつかの実施形態において、組換えホットスポットの中心間の距離は、約３ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲である。公的データベースは、多数の既知のヒト組換えホットスポットを含み、例えば、ＨＵＭＨＯＴおよびＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＨａｐＭａｐ Ｐｒｏｊｅｃｔデータベース（例えば、Ｎｉｓｈａｎｔら、「ＨＵＭＨＯＴ：ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｉｏｔｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｈｏｔ ｓｐｏｔｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３４：Ｄ２５−Ｄ２８、２００６、Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ、Ｍａｃｋｉｅｗｉｃｚら、「Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｈｏｔｓｐｏｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ − Ａ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｒｅａｌ Ｄａｔａ」 ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（６）：ｅ６５２７２、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６５２７２、およびｈａｐｍａｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ．ｅｎでのワールドワイドウェブを参照、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

いくつかの実施形態において、プライマーライブラリ内のプライマーは、組換えホットスポット（例えば、既知のヒト組換えホットスポット）でクラスター化される。いくつかの実施形態において、対応するアンプリコンを使用して、組換えホットスポット内または付近の配列を決定し、その特定のホットスポットで組換えが起こったか否か（例えば、アンプリコンの配列が、組換えが起こった場合に予測される配列であるかどうか、または組換えが起こらなかった場合に予測される配列であるかどうか）を決定する。いくつかの実施形態において、プライマーは、組換えホットスポットの一部または全て（および場合により、組換えホットスポットに隣接する配列）を増幅するように設計される。いくつかの実施形態において、長いリード配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａによって開発された、約１０ｋｂまでの配列に対するＭｏｌｅｃｕｌｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いた配列決定）またはペアエンド配列決定を使用して、組換えホットスポットの一部または全てを配列決定する。組換え事象が起こったか否かの知識を使用して、ハプロタイプブロックがホットスポットに隣接するかどうかを決定することができる。所望な場合、特定のハプロタイプブロックの存在は、ハプロタイプブロック内の領域に特異的なプライマーを用いて確認することができる。いくつかの実施形態において、既知の組換えホットスポット間にクロスオーバーが存在しないと仮定される。いくつかの実施形態において、プライマーライブラリ内のプライマーは、染色体の末端で、または末端付近でクラスター化される。例えば、このようなプライマーを使用して、染色体の末端に特定のアームまたはセクションが存在するかどうかを決定することができる。いくつかの実施形態において、プライマーライブラリ内のプライマーは、組換えホットスポットで、またはその末端であり、かつ染色体の末端で、または末端付近でクラスター化される。

いくつかの実施形態において、プライマーライブラリは、組換えホットスポット（例えば、既知のヒト組換えホットスポット）に特異的であり、および／または組換えホットスポット付近の領域（例えば、組換えホットスポットの５’または３’末端の１０、８、５、３、２、１または０．５ｋｂ以内）に特異的な１つ以上のプライマー（例えば、少なくとも５、１０、５０、１００、２００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００または５０，０００の異なるプライマーまたは異なるプライマー対）を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００または１５０の異なるプライマー（またはプライマー対）は、同じ組換えホットスポットに特異的であるか、または同じ組換えホットスポットまたは組換えホットスポット付近の領域に特異的である。いくつかの実施形態において、少なくとも１、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００または１５０の異なるプライマー（またはプライマー対）は、組換えホットスポットの間の領域（例えば、組換えを受ける可能性が低い領域）に特異的であり、これらのプライマーを使用して、ハプロタイプブロックの存在を確認することができる（例えば、組換えが起こったか否かに依存して予測されるもの）。いくつかの実施形態において、プライマーライブラリ中の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％は、組換えホットスポットに特異的であり、および／または組換えホットスポット付近の領域（例えば、組換えホットスポットの５’または３’末端の１０、８、５、３、２、１または０．５ｋｂ以内）に特異的である。いくつかの実施形態では、プライマーライブラリを使用して、組換えが、５、１０、５０、１００、２００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００または５０，０００の異なる組換えホットスポット（例えば、既知のヒト組換えホットスポット）より多く、またはこれに等しい場所で起こったか否かを決定する。いくつかの実施形態において、組換えホットスポットまたは付近の領域に対するプライマーによって標的とされる領域は、ゲノムのその部分に沿ってほぼ均一に広がる。いくつかの実施形態において、少なくとも１、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００または１５０の異なるプライマー（またはプライマー対）は、染色体の末端または末端付近の領域（例えば、染色体の末端から２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０１または０．００１ｍｂ以内の領域）に特異的である。いくつかの実施形態において、プライマーライブラリ中の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％は、染色体または染色体付近の領域（例えば、染色体の末端から２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０１または０．００１ｍｂ以内の領域）に特異的である。いくつかの実施形態において、少なくとも１、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００または１５０の異なるプライマー（またはプライマー対）は、染色体中の潜在的な微小欠失内の領域に特異的である。いくつかの実施形態において、プライマーライブラリ中の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％は、染色体中の潜在的な微小欠失内の領域に特異的である。いくつかの実施形態において、プライマーライブラリ中の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％は、組換えホットスポット、組換えホットスポット付近の領域、染色体の末端または末端付近の領域、または染色体中の潜在的な微小欠失内の領域に特異的である。

例示的なマルチプレックスＰＣＲ方法
一態様において、本発明は、核酸サンプルにおいて標的遺伝子座を増幅する方法であって、（ｉ）核酸サンプルと、少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００または１００，０００の異なる標的遺伝子座に対して同時にハイブリダイゼーションするプライマーのライブラリとを接触させ、反応混合物を精製することと、（ｉｉ）この反応混合物をプライマー伸長反応条件（例えば、ＰＣＲ条件）に供して、標的アンプリコンを含む増幅産物を生成することとを伴う、方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、本方法は、少なくとも１つの標的アンプリコン（例えば、標的アンプリコンの少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％）の有無を決定することも含む。いくつかの実施形態において、本方法は、少なくとも１つの標的アンプリコン（例えば、標的アンプリコンの少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％）の配列を決定することも含む。いくつかの実施形態において、標的遺伝子座の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％が増幅される。いくつかの実施形態において、少なくとも２５、５０、７５、１００、３００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００または１００，０００の異なる標的遺伝子座は、少なくとも５、１０、２０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０、１５０、２００、３００または４００倍に増幅される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５または１００％は、少なくとも５、１０、２０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０、１５０、２００、３００または４００倍に増幅される。種々の実施形態において、増幅産物の６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１、０．５、０．２５、０．１または０．０５％未満が、プライマーダイマーである。いくつかの実施形態において、本方法は、マルチプレックスＰＣＲおよび配列決定（例えば、高スループット配列決定）を伴う。

種々の実施形態において、長いアニーリング時間および／または低いプライマー濃度を使用する。種々の実施形態において、アニーリング工程の長さは、３、５、８、１０、１５、２０、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０または１８０分間より長い。種々の実施形態において、アニーリング工程の長さ（ＰＣＲサイクルあたり）は、５〜 １８０分間、例えば、５〜６０、１０〜６０、５〜３０または１０〜３０分間（境界値を含む）である。種々の実施形態において、アニーリング工程の長さは、５分間より長く（例えば、１０分間または１５分間より長く）、各プライマーの濃度は、２０ｎＭ未満である。種々の実施形態において、アニーリング工程の長さは、５分間より長く（例えば、１０分間または１５分間より長く）、各プライマーの濃度は、１〜２０ｎＭまたは１〜１０ｎＭ（境界値を含む）である。種々の実施形態において、アニーリング工程の長さは、２０分間より長く（例えば、３０、４５、６０または９０分間より長く）、各プライマーの濃度は、１ｎＭ未満である。

高レベルの多重化では、溶液中の多量のプライマーに起因して、溶液が粘性になる場合がある。溶液が粘性すぎる場合、プライマー濃度を、プライマーがテンプレートＤＮＡに結合するのに依然として十分な量まで下げてもよい。種々の実施形態において、６０，０００種類の異なるプライマーが使用され、各プライマーの濃度は、２０ｎＭ未満、例えば１０ｎＭ未満または１〜１０ｎＭ（境界値を含む）である。種々の実施形態において、６０，０００個を超える異なるプライマー（例えば、６０，０００〜１２０，０００個の異なるプライマー）が使用され、各プライマーの濃度は、１０ｎＭ未満、例えば５ｎＭ未満または１〜１０ｎＭ（境界値を含む）である。

アニーリング温度は、場合により、プライマーの一部または全ての融点より高くてもよいことを発見した（プライマーの融点より低いアニーリング温度を使用する他の方法とは対照的に）。融点（Ｔ_ｍ）は、オリゴヌクレオチド（例えばプライマー）およびその完全相補体のＤＮＡ二本鎖の半分（５０％）が解離し、一本鎖ＤＮＡになる温度である。アニーリング温度（Ｔ_Ａ）は、ＰＣＲプロトコルを実行する温度である。従来の方法について、この温度は、通常は、使用するプライマーの最も低いＴ_ｍより５℃低いため、全ての可能な二本鎖に近いものが形成される（その結果、実質的に全てのプライマー分子が、テンプレート核酸に結合する）。これは、高効率ではあるが、より低い温度では、より多くの非特異的反応が生じることが確実である。Ｔ_Ａが低すぎることの結果の１つは、内部の単一塩基ミスマッチまたは部分的アニーリングが許容され得るため、プライマーが真の標的以外の配列にアニーリングし得ることである。本発明のいくつかの実施形態において、Ｔ_ＡはＴ_ｍより高く、所与の瞬間に、標的のわずかな部分のみが、アニーリングされたプライマーを有する（例えば、約１〜５％のみ）。これらが伸長されると、プライマーおよび標的のアニーリングおよび解離の平衡から除去され（伸長は、Ｔ_ｍを７０℃より上まで迅速に増加させるため）、標的の新しい約１〜５％がプライマーを有する。したがって、アニーリングのために反応を長時間行うことによって、サイクルごとにコピーされる標的の約１００％を得ることができる。したがって、最も安定な分子対（プライマーとテンプレートＤＮＡとの間の完全なＤＮＡ対形成）は、優先的に伸長され、正しい標的アンプリコンを生成する。例えば、融点が６３℃より低いプライマーを用い、アニーリング温度を５７℃として、またはアニーリング温度を６３℃として同じ実験を行った。アニーリング温度が５７℃の場合、増幅したＰＣＲ産物についてのマッピングされたリードの割合は、５０％程度の低さであった（増幅産物の約５０％がプライマーダイマーである）。アニーリング温度が６３℃であった場合、プライマーダイマーであった増幅産物の割合は、約２％まで減少した。

種々の実施形態において、アニーリング温度は、非同一プライマーの少なくとも２５、５０、７５、１００、３００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、または全ての融点（例えば、経験的に測定されたか、または計算されたＴ_ｍ）よりも少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１５℃高い。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、非同一プライマーの少なくとも２５、５０、７５、１００、３００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００または全ての融点（例えば、経験的に測定されたか、または計算されたＴ_ｍ）よりも少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１５℃高く、アニーリング工程の長さ（ＰＣＲサイクルあたり）は、１、３、５、８、１０、１５、２０、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０または１８０分間より長い。

種々の実施形態において、アニーリング温度は、非同一プライマーの少なくとも２５、５０、７５、１００、３００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、または全ての融点（例えば、経験的に測定されたか、または計算されたＴ_ｍ）よりも１〜１５℃（例えば、１〜１０、１〜５、１〜３、３〜５、５〜１０、５〜８、８〜１０、１０〜１２または１２〜１５℃（境界値を含む））高い。種々の実施形態において、アニーリング温度は、非同一プライマーの少なくとも２５、５０、７５、１００、３００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、または全ての融点（例えば、経験的に測定されたか、または計算されたＴ_ｍ）よりも１〜１５℃（例えば、１〜１０、１〜５、１〜３、３〜５、５〜１０、５〜８、８〜１０、１０〜１２または１２〜１５℃（境界値を含む））高く、アニーリング工程の長さ（ＰＣＲサイクルあたり）は、５〜１８０分間、例えば、５〜６０、１０〜６０、５〜３０または１０〜３０分間（境界値を含む）である。

いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、プライマーの最も高い融点（例えば、経験的に測定されたか、または計算されたＴ_ｍ）よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１５℃高い。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、プライマーの最も高い融点（例えば、経験的に測定されたか、または計算されたＴ_ｍ）よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１５℃高く、アニーリング工程の長さ（ＰＣＲサイクルあたり）は、１、３、５、８、１０、１５、２０、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０または１８０分間より長い。

いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、プライマーの最も高い融点（例えば、経験的に測定されたか、または計算されたＴ_ｍ）よりも１〜１５℃（例えば、１〜１０、１〜５、１〜３、３〜５、５〜１０、５〜８、８〜１０、１０〜１２または１２〜１５℃（境界値を含む））高い。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、プライマーの最も高い融点（例えば、経験的に測定されたか、または計算されたＴ_ｍ）よりも１〜１５℃（例えば、１〜１０、１〜５、１〜３、３〜５、５〜１０、５〜８、８〜１０、１０〜１２または１２〜１５℃）高く、アニーリング工程の長さ（ＰＣＲサイクルあたり）は、５〜１８０分間、例えば、５〜６０、１０〜６０、５〜３０または１０〜３０分間（境界値を含む）である。

いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、非同一プライマーの少なくとも２５、５０、７５、１００、３００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、または全ての平均融点（例えば、経験的に測定されたか、または計算されたＴ_ｍ）よりも少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１５℃高い。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、非同一プライマーの少なくとも２５、５０、７５、１００、３００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００または全ての平均融点（例えば、経験的に測定されたか、または計算されたＴ_ｍ）よりも少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１５℃高く、アニーリング工程の長さ（ＰＣＲサイクルあたり）は、１、３、５、８、１０、１５、２０、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０または１８０分間より長い。

いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、非同一プライマーの少なくとも２５、５０、７５、１００、３００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、または全ての平均融点（例えば、経験的に測定されたか、または計算されたＴ_ｍ）よりも１〜１５℃（例えば、１〜１０、１〜５、１〜３、３〜５、５〜１０、５〜８、８〜１０、１０〜１２または１２〜１５℃（境界値を含む））高い。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、非同一プライマーの少なくとも２５、５０、７５、１００、３００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、または全ての平均融点（例えば、経験的に測定されたか、または計算されたＴ_ｍ）よりも１〜１５℃（例えば、１〜１０、１〜５、１〜３、３〜５、５〜１０、５〜８、８〜１０、１０〜１２または１２〜１５℃（境界値を含む））高く、アニーリング工程の長さ（ＰＣＲサイクルあたり）は、５〜１８０分間、例えば、５〜６０、１０〜６０、５〜３０または１０〜３０分間（境界値を含む）である。

いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、５０〜７０℃、例えば、５５〜６０、６０〜６５または６５〜７０℃（境界値を含む）である。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、５０〜７０℃、例えば、５５〜６０、６０〜６５または６５〜７０℃（境界値を含む）であり、（ｉ）アニーリング工程の長さ（ＰＣＲサイクルあたり）は、３、５、８、１０、１５、２０、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０または１８０分間より長いか、または（ｉｉ）アニーリング工程の長さ（ＰＣＲサイクルあたり）は、５〜１８０分間、例えば、５〜６０、１０〜６０、５〜３０または１０〜３０分間（境界値を含む）である。

いくつかの実施形態において、以下の条件のうちの１つ以上は、Ｔ_ｍの経験的な測定に使用されるか、またはＴ_ｍの計算のために仮定される。温度６０．０℃、プライマー濃度１００ｎＭおよび／または塩濃度１００ｍＭ。いくつかの実施形態において、他の条件、例えば、ライブラリを用いるマルチプレックスＰＣＲに使用される条件が使用される。いくつかの実施形態において、１００ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、３ｍＭのＭｇＣｌ_２、７．５ｎＭの各プライマーおよび５０ｍＭのｐＨ８．１のＴＭＡＣが使用される。いくつかの実施形態において、Ｔ_ｍは、Ｐｒｉｍｅｒ３プログラム（ｌｉｂｐｒｉｍｅｒ３リリース２．２．３）を用い、ビルトインのＳａｎｔａＬｕｃｉａパラメータ（ｐｒｉｍｅｒ３．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔでのワールドワイドウェブ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を用いて計算される。いくつかの実施形態において、プライマーの融点の計算値は、プライマー分子の半分がアニーリングすると予測される温度である。上述のように、融点の計算値より高い温度であっても、ある割合のプライマーがアニーリングされるため、ＰＣＲ伸長は可能である。いくつかの実施形態において、経験的に測定されたＴ_ｍ（実際のＴ_ｍ）は、ＵＶ分光光度計において、温度調節されたセルを用いることによって決定される。いくつかの実施形態において、温度は、吸収率に対してプロットされ、２つの平坦部を有するＳ字形曲線を生成する。この平坦部の間の途中の吸光度の読みは、Ｔ_ｍに対応する。

いくつかの実施形態において、２６０ｎｍでの吸光度は、ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ２１００ ｐｒ ＵＶ／可視光分光光度計（Ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、温度の関数として測定される（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＴａｋｉｙａら、「Ａｎ ｅｍｐｉｒｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ （Ｔｍ） ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＮＡ／ＤＮＡ ｄｕｐｌｅｘｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ （Ｏｘｆ）；（４８）：１３１−２、２００４を参照）。いくつかの実施形態において、２６０ｎｍでの吸光度は、１分間に２℃ずつ、９５℃から２０℃まで温度を下げることによって測定される。いくつかの実施形態において、プライマーおよびその完全な相補体（例えば、２ｕＭのそれぞれ対を形成するオリゴマー）を混合し、次いで、アニーリングは、サンプルを９５℃まで加熱し、それを５分間維持し、その後、３０分間で室温まで冷却し、サンプルを９６℃で少なくとも６０分間維持することによって行われる。いくつかの実施形態において、融点は、ＳＷＩＦＴ Ｔｍソフトウェアを用いてデータを分析することによって決定される。本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、プライマーを標的遺伝子座のＰＣＲ増幅に使用する前または後に、ライブラリ中のプライマーの少なくとも５０、８０、９０、９２、９４、９６、９８、９９または１００％について、融点を経験的に測定または計算すること（例えば、コンピュータを用いて計算すること）を含む。

いくつかの実施形態において、ライブラリは、マイクロアレイを含む。いくつかの実施形態において、ライブラリは、マイクロアレイを含まない。

いくつかの実施形態において、プライマーの大部分または全てが伸長され、増幅産物を形成する。ＰＣＲ反応で消費される全てのプライマーを含むことで、同じまたは同様の数のプライマー分子が、各標的遺伝子座についての標的アンプリコンに変換されるため、異なる標的遺伝子座の増幅の均一性を高める。いくつかの実施形態において、プライマー分子の少なくとも８０、９０、９２、９４、９６、９８、９９または１００％が伸長され、増幅産物を形成する。いくつかの実施形態において、標的遺伝子の少なくとも８０、９０、９２、９４、９６、９８、９９または１００％について、その標的遺伝子に対するプライマー分子の少なくとも８０、９０、９２、９４、９６、９８、９９または１００％が伸長され、増幅産物を形成する。いくつかの実施形態において、この割合のプライマーが消費されるまで、複数のサイクルが行われる。いくつかの実施形態において、全てまたは実質的に全てのプライマーが消費されるまで、複数のサイクルが行われる。所望な場合、初期のプライマー濃度を下げ、および／または行われるＰＣＲサイクルの数を増やすことによって、さらに高い割合のプライマーを消費することができる。

いくつかの実施形態において、ＰＣＲ方法は、マイクロリットル反応体積を用いて行われてもよく、マイクロ流体用途で使用されるナノリットルまたはピコリットルの反応体積と比較して、特異的なＰＣＲ増幅を達成することがより困難な場合がある（より低い局所濃度のテンプレート核酸に起因する）。いくつかの実施形態において、反応体積は、１〜６０ｕＬ、例えば、５〜５０ｕＬ、１０〜５０ｕＬ、１０〜２０ｕＬ、２０〜３０ｕＬ、３０〜４０ｕＬまたは４０〜５０ｕＬ（境界値を含む）である。

一実施形態において、本明細書に開示される方法は、高効率な高度に多重化された標的化ＰＣＲを使用してＤＮＡを増幅し、その後、高スループット配列決定によって、各標的遺伝子座での対立遺伝子頻度を決定する。得られた配列リードのほとんどが標的遺伝子座に対してマッピングするような方法で１つの反応体積中に約５０個または１００個より多いＰＣＲプライマーを多重化する能力は、新規であり、非自明である。高度に多重化された標的化ＰＣＲを高効率な方法で行うことを可能にする１つの技術は、互いにハイブリダイズする可能性が低いプライマーを設計することを伴う。ＰＣＲプローブは、典型的にはプライマーと呼ばれ、少なくとも３００、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１，０００、少なくとも２，０００、少なくとも５，０００、少なくとも７，５００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも７５，０００または少なくとも１００，０００の潜在的なプライマー対との間の潜在的に有害な相互作用またはプライマーとサンプルＤＮＡとの間の意図していない相互作用の熱力学的モデルを作成し、次いで、このモデルを用いて、プール中の他の設計と不適合な設計を除外することによって選択される。高度に多重化された標的化ＰＣＲを高効率な方法で行うことを可能にする別の技術は、標的化ＰＣＲに対して、部分的または完全なネスティング手法を用いることである。これらの手法の１つまたは組み合わせを用いることで、単一のプールにおいて、少なくとも３００、少なくとも８００、少なくとも１，２００、少なくとも４，０００または少なくとも１０，０００のプライマーの多重化が可能になり、得られた大部分のＤＮＡを含む増幅ＤＮＡは、配列決定されると、標的遺伝子座にマッピングする。これらの手法の１つまたは組み合わせを用いることで、単一のプールにおいて多数のプライマーの多重化が可能になり、得られたＤＮＡは、標的遺伝子座にマッピングする５０％より多く、６０％より多く、６７％より多く、８０％より多く、９０％より多く、９５％より多く、９６％より多く、９７％より多く、９８％より多く、９９％より多く、または９９．５％より多いＤＮＡ分子を含む。

いくつかの実施形態において、標的遺伝物質の検出は、多重化された方法で行われてもよい。並行して行われ得る遺伝子標的配列の数は、１〜１０、１０〜１００、１００〜１０００、１０００〜１万、１万〜１０万、１０万〜１００万または１００万〜１０００万の範囲であってもよい。１プールあたり１００個を超えるプライマーを多重化する従来の試みは、プライマーダイマー形成などの望ましくない副反応を伴う顕著な問題を生じていた。

標的化ＰＣＲ
いくつかの実施形態において、ＰＣＲを使用して、ゲノムの特定の位置を標的とすることができる。血漿サンプルにおいて、元々のＤＮＡは、高度にフラグメント化される（典型的には５００ｂｐ未満、平均長さは２００ｂｐ未満）。ＰＣＲでは、順方向および逆方向のプライマーの両方が同じフラグメントにアニーリングし、増幅が可能である。したがって、フラグメントが短い場合、ＰＣＲアッセイは、同様に相対的に短い領域を増幅しなければならない。ＭＩＰＳと同様に、多型位置がポリメラーゼ結合部位に近すぎる場合、異なる対立遺伝子からの増幅におけるバイアスが生じる場合がある。現在、多型領域（ＳＮＰを含むもの）を標的とするＰＣＲプライマーは、典型的には、プライマーの３’末端が、１つまたは複数の多型塩基のすぐ横に隣接する塩基にハイブリダイズするように設計される。本開示の一実施形態において、順方向および逆方向のＰＣＲプライマー両方の３’末端は、標的対立遺伝子のバリアント位置（多型部位）から離れた１つまたはいくつかの位置である塩基にハイブリダイズするように設計される。多型部位（ＳＮＰまたはその他）と、プライマーの３’末端にハイブリダイズするように設計された塩基との間の塩基数は、１塩基であってもよく、２塩基であってもよく、３塩基であってもよく、４塩基であってもよく、５塩基であってもよく、６塩基であってもよく、７〜１０塩基であってもよく、１１〜１５塩基であってもよく、または１６〜２０塩基であってもよい。順方向および逆方向のプライマーは、多型部位から離れた異なる数の塩基をハイブリダイズするように設計されてもよい。

ＰＣＲアッセイは大量に作成することができるが、異なるＰＣＲアッセイ間の相互作用により、約１００アッセイを超えて多重化することが困難である。種々の複雑な分子手法を使用して、多重化のレベルを上げることができるが、依然として、反応あたり１００、おそらく２００、またはおそらく５００より少ないアッセイに限定されるだろう。大量のＤＮＡを含むサンプルは、複数のサブ反応に分けられ、次いで、配列決定前に再び組み合わせることができる。ＤＮＡの全体サンプルまたはいくつかの部分集合のいずれかが限定されるサンプルについて、サンプルを分けると、統計的ノイズが入り込むだろう。一実施形態において、少量または限定された量のＤＮＡとは、１０ｐｇ未満、１０〜１００ｐｇ、１００ｐｇ〜１ｎｇ、１〜１０ｎｇまたは１０〜１００ｎｇの量を指していてもよい。なお、この方法は、複数のプールに分けることを伴う他の方法によって、入り込んでしまう統計的ノイズに関連する顕著な問題が生じうる少量のＤＮＡに特に有用であるが、この方法は、任意の量のＤＮＡのサンプルで実行する場合にバイアスを最小限にするという利点を依然として提供する。これらの状況では、全体的なサンプル量を増やすために、普遍的な前増幅工程を使用してもよい。理想的には、この前増幅工程は、対立遺伝子分布を著しく変化させないものであるべきである。

一実施形態において、本開示の方法は、例えば、単一細胞または体液からのＤＮＡなどの限定されたサンプルからの配列決定またはいくつかの他の遺伝子決定方法による遺伝子型決定のために、多数の標的遺伝子座、具体的には、１，０００〜５，０００個の遺伝子座、５，０００〜１０，０００個の遺伝子座または１０，０００個より多い遺伝子座に特異的なＰＣＲ産物を作成することができる。現在、５〜１０個より多い標的のマルチプレックスＰＣＲ反応を行うことには、大きな課題があり、プライマー副産物（例えばプライマーダイマー）および他のアーチファクトによって妨害されることが多い。ハイブリダイゼーションプローブを用いるマイクロアレイを用いて標的配列を検出する場合、プライマーダイマーおよび他のアーチファクトは、これらが検出されないため、無視される場合がある。しかし、検出方法として配列決定を用いる場合、配列決定リードの大部分は、このようなアーチファクトを配列決定し、サンプル中の所望な標的配列を配列決定しないだろう。１つの反応体積中、５０または１００を超える反応を多重化し、その後に配列決定するために使用される従来技術で記載される方法は、典型的には、２０％を超える、多くは５０％を超える、多くの場合には８０％を超える、ある場合には９０％を超える標的ではない配列リードが得られる。

一般に、サンプルの複数の（ｎ）個の（５０より多い、１００より多い、５００より多い、または１，０００より多い）標的の標的化配列決定を行うために、サンプルを、１つの個々の標的を増幅するいくつかの数の並行反応に分けることができる。このことは、ＰＣＲマルチウェルプレートで行うことができ、または市販のプラットフォーム、例えば、ＦＬＵＩＤＩＧＭ ＡＣＣＥＳＳ ＡＲＲＡＹ（微小流体チップ中、サンプルあたり４８の反応）またはＲＡＩＮ ＤＡＮＣＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ製のＤＲＯＰＬＥＴ ＰＣＲ（１００〜数千の標的）で行うことができる。残念ながら、これらの分けてプールする方法は、限定された量のＤＮＡを含むサンプルでは、各ウェル中にゲノムの各領域の１つのコピーが存在することを確実にするための、ゲノムの十分なコピーが存在しないことが多いため、問題がある。これは、多型遺伝子座が標的とされ、多型遺伝子座での対立遺伝子の相対的な割合が必要である場合には、分けてプールすることによって入り込む統計的ノイズが、ＤＮＡの元々のサンプル中に存在した対立遺伝子の割合の測定を非常に不正確なものにしてしまうため、特に深刻な問題である。限定された量のＤＮＡしか利用可能ではない場合に適用可能な、多くのＰＣＲ反応を効果的かつ効率的に増幅する方法が本明細書に記載される。一実施形態において、本方法は、単一細胞、体液、ＤＮＡの混合物（例えば、血漿中に見出される遊離浮遊ＤＮＡ）、生検、環境および／または法医学サンプルの分析に適用可能であろう。

一実施形態において、標的化配列決定は、以下の工程のうちの１つ、複数または全てを伴っていてもよい。ａ）ＤＮＡフラグメントの両端にアダプター配列を有するライブラリを作成し、増幅する。ｂ）ライブラリ増幅後に、複数の反応に分ける。ｃ）ＤＮＡフラグメントの両端のアダプター配列を用いてライブラリを作成し、場合により増幅する。ｄ）標的あたり１個の標的特異性の「順方向」プライマーおよび１個のタグ特異性プライマーを用い、選択した標的の１０００〜１０，０００倍の増幅を行う。ｅ）この産物から、「逆方向の」標的特異性プライマーおよび１つ（またはもっと多い）第１ラウンドで標的特異性の順方向プライマーの一部として導入されたユニバーサルタグに特異性のプライマーを用い、第２の増幅を行う。ｆ）限定された数のサイクルのために、選択した標的の１０００倍の前増幅を行う。ｇ）この産物を複数のアリコートに分け、個々の反応において標的のサブプールを増幅する（例えば、５０〜５００倍、これにより、１倍になるまで全ての方法を使用することができる。ｈ）並行サブプール反応の産物をプールする。ｉ）これらの増幅中に、プライマーは、産物を配列決定することができるように、配列決定に適合するタグ（部分または全長）を有していてもよい。

高度に多重化したＰＣＲ
血漿から得られるゲノムＤＮＡなどの核酸サンプルから、数百から数千の標的配列（例えば、ＳＮＰ遺伝子座）にわたる標的化された増幅を可能にする方法が、本明細書で開示される。増幅されるサンプルは、プライマーダイマー産物を比較的含まず、低い標的遺伝子座での対立遺伝子バイアスを有していてもよい。増幅中または増幅後に、産物に、配列決定に適合するアダプターが付加される場合、これらの産物の分析は、配列決定によって行うことができる。

当該技術分野で既知の方法を用いて高度に多重化されたＰＣＲ増幅を行うと、望ましい増幅産物より過剰な、配列決定には適していないプライマーダイマー産物が生成する。これらは、これらの産物を形成するプライマーを除外することによって、またはプライマーのｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの選択を行うことによって、経験的に減らすことができる。しかし、アッセイの数が多ければ多いほど、この問題は困難になる。

１つの解決策は、５０００倍の反応を、いくつかのこれより少ない倍数の増幅（例えば、１００個の５０倍の反応または５０個の１００倍の反応）に分けること、または微小流体を用いること、またはさらにサンプルを個々のＰＣＲ反応に分けることである。しかし、妊婦血漿由来の非侵襲的な産前診断など、サンプルＤＮＡが限定されている場合、サンプルを複数の反応に分けることは妨げとなるため、避けるべきである。

まず、サンプルの血漿ＤＮＡを全体的に増幅し、次いで、サンプルを、反応あたりさらに適度な数の標的配列を含む複数の多重化された標的濃縮反応に分けるための方法が本明細書に記載される。一実施形態において、本開示の方法は、複数の遺伝子座でＤＮＡ混合物を優先的に濃縮するために使用することができ、本方法は、ライブラリ中の分子がＤＮＡフラグメントの両端にライゲーションされたアダプター配列を有するようなＤＮＡの混合物からライブラリを作成し、増幅する工程、増幅したライブラリを複数の反応に分割する工程、１個の標的特異性「順方向」プライマーと１個または複数のアダプター特異性ユニバーサル「逆方向」プライマーを用い、選択された標的の第１ラウンドのマルチプレックス増幅を行う工程のうちの１つ以上を含む。一実施形態において、本開示の方法は、さらに、「逆方向」標的特異性プライマーと、第１ラウンドで標的特異性順方向プライマーの一部として導入されたユニバーサルタグに特異的な１個または複数のプライマーとを用い、第２の増幅を行うことを含む。一実施形態において、本方法は、完全ネスティッド、ヘミネスティッド、セミネスティッド、片側完全ネスティッド、片側ヘミネスティッドまたは片側セミネスティッドＰＣＲ手法を伴っていてもよい。一実施形態において、本開示の方法は、複数の遺伝子座でＤＮＡ混合物を優先的に濃縮するために使用され、本方法は、制限された回数のサイクルについて、選択した標的のマルチプレックス前増幅を行うことと、この産物を複数のアリコートに分割することと、標的のサブプールを個々の反応で増幅することと、並行サブプール反応の産物をプールすることと、を含む。なお、この手法を使用して、５０〜５００遺伝子座について、５００〜５，０００遺伝子座について、５，０００〜５０，０００遺伝子座について、またはさらに５０，０００〜５００，０００遺伝子座について、低レベルの対立遺伝子バイアスを生じる方法で、標的化された増幅を行うことができる。一実施形態において、プライマーは、部分または全長の配列決定に適合するタグを有する。

ワークフローは、（１）ＤＮＡ、例えば、血漿ＤＮＡを抽出すること、（２）フラグメントの両端にあるユニバーサルアダプターを用い、フラグメントライブラリを調製すること、（３）アダプターに特異的なユニバーサルプライマーを用い、ライブラリを増幅すること、（４）増幅したサンプル「ライブラリ」を複数のアリコートに分割すること、（５）アリコートについて、マルチプレックス（例えば、標的あたり１個の標的特異性プライマーとタグ特異性プライマーを用いた約１００反応分、１，０００または１０，０００反応分）増幅を行うこと、（６）１個のサンプルのアリコートをプールすること、（７）サンプルをバーコード化すること、（８）サンプルを混合し、濃度を調整すること、（９）サンプルを配列決定すること、を含んでいてもよい。本ワークフローは、列挙された工程のうちの１つを含む複数のサブ工程を含んでいてもよい（例えば、ライブラリを調製する工程である工程（２）は、３つの酵素工程（平滑末端化、ｄＡテーリングおよびアダプターライゲーション）と３つの精製工程を伴っていてもよい）。ワークフローの工程は、組み合わせ、分割され、または異なる順序でおこなわれてもよい（例えば、バーコード化とサンプルのプール）。

ライブラリの増幅は、短いフラグメントをより効率的に増幅するように偏重される方法で行われてもよい。この方法で、妊婦の循環中で見出される無細胞胎児ＤＮＡ（胎盤由来）として、より短い配列、例えば、モノヌクレオソームＤＮＡフラグメントを優先的に増幅することができる。なお、ＰＣＲアッセイは、タグ、例えば、配列決定タグ（通常、１５〜２５塩基の切断された形態）を有していてもよい。多重化の後、サンプルのＰＣＲ多重化物をプールし、次いで、タグを、タグ特異性ＰＣＲ（ライゲーションによっても行うことが可能）によって完結させる（バーコード化を含む）。また、全配列決定タグは、多重化と同じ反応に加えられてもよい。第１のサイクルにおいて、標的は、標的特異性プライマーを用いて増幅されてもよく、その後、タグ特異性プライマーは、ＳＱアダプター配列を完成させるために引き継がれてもよい。ＰＣＲプライマーは、タグを有していなくてもよい。配列決定タグは、ライゲーションによって増幅産物に付けられてもよい。

一実施形態において、高度なマルチプレックスＰＣＲの後、クローン配列決定による増幅物質の評価は、胎児異数性の検出などの種々の用途に使用されてもよい。従来のマルチプレックスＰＣＲは、５０個までの遺伝子座を同時に評価するのに対し、本明細書に記載される手法を使用して、５０個を超える遺伝子座を同時に、１００個を超える遺伝子座を同時に、５００個を超える遺伝子座を同時に、１，０００個を超える遺伝子座を同時に、５，０００個を超える遺伝子座を同時に、１０，０００個を超える遺伝子座を同時に、５０，０００個を超える遺伝子座を同時に、１００，０００個を超える遺伝子座を同時に、同時評価をすることが可能である。実験は、単一反応において、非侵襲性の産前異数性診断および／または高精度のコピー数コールを行うのに十分に良好な効率および特異性を有しつつ、１０，０００個まで、１０，０００個を含む、１０，０００個を超える別個の遺伝子座を同時に評価することができることが示される。アッセイは、サンプルの全体、例えば、血漿から単離されたｃｆＤＮＡサンプル、そのフラクション、またはｃｆＤＮＡサンプルのさらに処理された誘導体を用い、単一反応で組み合わせられてもよい。サンプル（例えば、ｃｆＤＮＡまたは誘導体）はまた、複数の並列な多重化反応に分割されてもよい。最適なサンプル分割および多重化は、種々の性能仕様の妥協点を探ることによって決定される。材料の量が限られているため、サンプルを複数のフラクションに分割すると、サンプリングノイズ、取り扱い時間が導入され、エラーの可能性が高まる場合がある。逆に、さらに高度な多重化によって、より多くの誤った増幅が起こり、増幅においてより大きな不平等が生じる場合があり、この両者が試験性能を下げる可能性がある。

本明細書に記載される方法の適用における２つの重要な関連する考慮事項は、元々のサンプル（例えば、血漿）の量が限られていることと、対立遺伝子頻度または他の測定値を得るこの材料における元々の分子の数である。元々の分子の数が、特定の値を下回る場合、ランダムサンプリングノイズが顕著になり、試験の制度に影響を及ぼす場合がある。典型的には、標的遺伝子座あたり５００〜１０００個の元々の分子に相当するものを含むサンプルに対して測定が行われる場合、非侵襲性の産前異数性診断を行うのに十分な量のデータを得ることができる。別個の測定の数を増やすいくつかの方法が存在する（例えば、サンプルの体積を増やす）。サンプルに適用される各操作も、潜在的に材料の消失を引き起こす可能性がある。種々の操作によって個こる消失を特徴付け、これを避けること、または必要な場合、試験の性能を低下させ得る消失を避けるために特定の操作の収率を改善することが不可欠である。

一実施形態において、もともと元々のサンプル（例えば、ｃｆＤＮＡサンプル）の全てまたはフラクションを増幅することによって、その後の工程での潜在的な消失を軽減することが可能である。サンプル中の遺伝物質の全てを増幅するための種々の方法が利用可能であり、下流の手順に利用可能な量を増やす。一実施形態において、ライゲーション媒介ＰＣＲ（ＬＭ−ＰＣＲ）のＤＮＡフラグメントは、１個の別個のアダプター、２個の別個のアダプター、または多くの別個のアダプターのいずれかのライゲーションの後、ＰＣＲによって増幅される。一実施形態において、多重置換増幅（ＭＤＡ）のｐｈｉ−２９ポリメラーゼを使用して、全てのＤＮＡを等温増幅する。ＤＯＰ−ＰＣＲおよび変形例において、ランダムプライミングを使用して、元々の物質のＤＮＡを増幅する。各方法は、ゲノムの全ての表される領域にわたる増幅の均一性、元々のＤＮＡの捕捉および増幅の効率およびフラグメントの長さの関数としての増幅性能など、特定の特徴を有する。

一実施形態において、ＬＭ−ＰＣＲを、３’チロシンを有する単一のヘテロ二本鎖アダプターと共に使用してもよい。ヘテロ二本鎖アダプターは、第１ラウンドのＰＣＲ中に元々のＤＮＡフラグメントの５’および３’末端で２つの別個の配列に変換され得る単一アダプター分子の使用を可能にする。一実施形態において、増幅されるライブラリを、サイズ分離によって、またはＡＭＰＵＲＥ、ＴＡＳＳなどの製品または他の同様の方法を用いることによって、フラクション化することが可能である。ライゲーションの前に、サンプルＤＮＡは、平滑末端化されてもよく、次いで、単一のアデノシン塩基を３’末端に付加する。ライゲーションの前に、ＤＮＡは、制限酵素またはいくつかの他の開裂方法を用いて開裂されてもよい。ライゲーション中に、サンプルフラグメントの３’アデノシンと、アダプターの相補性３’チロシンオーバーハングが、ライゲーション効率を高めることができる。ＰＣＲ増幅の伸長工程は、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐまたは約１，０００ｂｐより長いフラグメントからの増幅を減らすために、時間的観点から制限されてもよい。市販のキットによって指定される条件を用いていくつかの反応を実行し、サンプルＤＮＡ分子の１０％より少ないライゲーションが成功した。このための反応条件の一連の最適化は、ライゲーションを約７０％まで改善した。

ミニＰＣＲ
以下のミニＰＣＲ方法は、短い核酸、消化された核酸、またはフラグメント化された核酸、例えば、ｃｆＤＮＡに望ましい。従来のＰＣＲアッセイ設計は、別個の胎児分子の顕著な消失を引き起こすが、消失は、ミニＰＣＲアッセイと呼ばれる非常に短いＰＣＲアッセイを設計することによって、大きく減らすことができる。母親の血清中の胎児ｃｆＤＮＡは、高度にフラグメント化され、フラグメントサイズは、平均が１６０ｂｐ、標準偏差が１５ｂｐ、最小サイズが約１００ｂｐ、最大サイズが約２２０ｂｐのほぼＧａｕｓｓｉａｎ方法で分布する。標的多型に関するフラグメントの開始位置と終了位置の分布は、必ずしもランダムではないが、個々の標的にわたって、また、全体的に全ての標的にわたって広く変動し、ある特定の標的遺伝子座の多型部位は、その遺伝子座に由来する種々のフラグメントの最初から最後までの任意の位置を占めていてもよい。なお、ミニＰＣＲという用語は、さらなる制限または限定なく、通常のＰＣＲを同様に指していてもよい。

ＰＣＲ中に、増幅は、順方向および逆方向のプライマー部位を両方とも含むテンプレートＤＮＡフラグメントからしか起こらない。胎児ｃｆＤＮＡフラグメントが短いため、両プライマー部位が存在する尤度、長さＬの胎児フラグメントが順方向および逆方向のプライマー部位の両方を含む尤度は、そのフラグメントの長さに対するアンプリコンの長さの比率である。理想的な条件下で、アンプリコンが４５、５０、５５、６０、６５または７０ｂｐであるアッセイは、利用可能なテンプレートフラグメント分子のそれぞれ７２％、６９％、６６％、６３％、５９％または５６％からの増幅に成功する。アンプリコンの長さは、順方向および逆方向のプライミング部位の５’末端間の距離である。当該技術分野で知られているものによって典型的に使用されるものよりも短いアンプリコン長は、短い配列リードのみを必要とすることによって、所望な多型遺伝子座のより効率的な測定をもたらし得る。一実施形態において、アンプリコンの実質的なフラクションは、１００ｂｐ未満、９０ｂｐ未満、８０ｂｐ未満、７０ｂｐ未満、６５ｂｐ未満、６０ｂｐ未満、５５ｂｐ未満、５０ｂｐ未満または４５ｂｐ未満であるべきである。

なお、従来技術で既知の方法において、本明細書で記載されるような短いアッセイは、通常避けられる。これらのアッセイが必要とされず、プライマーの長さ、アニーリング特徴および順方向プライマーと逆方向プライマーとの間の距離を制限することによって、プライマー設計にかなりの制約を課すためである。

また、いずれかのプライマーの３’末端が、多型部位のほぼ１〜６塩基内にある場合、偏った増幅の可能性が存在することに留意されたい。初期ポリメラーゼ結合部位でのこの一塩基の差は、１つの対立遺伝子の優先的増幅を引き起こす場合があり、対立遺伝子頻度の観測値を変え、性能を低下させ得る。これらの制約の全ては、特定の遺伝子座を首尾良く増幅するプライマーを特定し、さらに、同じマルチプレックス反応で適合する多数のプライマーセットを設計するのを非常に困難なものにする。一実施形態において、順方向および逆方向のインナープライマーの３’末端は、多型部位から上流のＤＮＡ領域にハイブリダイズするように設計され、少数の塩基によって多型部位から分離する。理想的には、塩基の数は、６〜１０塩基であってもよいが、同様に、４〜１５塩基、３〜２０塩基、２〜３０塩基または１〜６０塩基であってもよく、実質的に同じ末端を達成し得る。

マルチプレックスＰＣＲは、全ての標的が増幅される単一ラウンドのＰＣＲを伴っていてもよく、または１ラウンドのＰＣＲの後、１ラウンド以上のネスティッドＰＣＲまたはネスティッドＰＣＲのいくつかの変形例を伴っていてもよい。ネスティッドＰＣＲは、少なくとも１つの塩基対によって、以前のラウンドで使用されたプライマーに対して内部で結合する１つ以上の新しいプライマーを用いる、その後の１以上のラウンドのＰＣＲ増幅からなる。ネスティッドＰＣＲは、その後の反応において、修正された内部配列を有する従来のものからの増幅産物のみを増幅することによって、誤った増幅標的の数を減らす。誤った増幅標的を減らすことで、特に配列決定において得ることができる有用な測定値の数を改善する。ネスティッドＰＣＲは、典型的には、従来のプライマー結合部位に対して完全に内部にプライマーを設計することを伴い、増幅に必要な最小ＤＮＡセグメントの大きさを必然的に増加させる。ＤＮＡが高度にフラグメント化されるサンプル（例えば、血漿ｃｆＤＮＡ）について、アッセイサイズが大きいほど、測定値を得ることができる別個のｃｆＤＮＡ分子の数が減る。一実施形態において、この影響を相殺するために、第２ラウンドのプライマーの片方または両方が、全アッセイサイズを最小限だけ大きくしつつ、さらなる特異性を達成するために内部に数個の塩基を伸長する第１の結合部位と重複する、部分的なネスティッド手法を使用してもよい。

一実施形態において、ＰＣＲアッセイのマルチプレックスプールは、１つ以上の染色体上の潜在的にヘテロ接合性のＳＮＰまたは他の多型もしくは非多型の遺伝子座を増幅するように設計され、これらのアッセイは、単一反応で使用され、ＤＮＡを増幅する。ＰＣＲアッセイの数は、５０〜２００ＰＣＲアッセイ、２００〜１，０００ＰＣＲアッセイ、１，０００〜５，０００ＰＣＲアッセイまたは５，０００〜２０，０００ＰＣＲアッセイ（それぞれ、５０〜２００反応分、２００〜１，０００反応分、１，０００〜５，０００反応分、５，０００〜２０，０００反応分、２０，０００より多い反応分）であってもよい。一実施形態において、約１０，０００ＰＣＲアッセイ（１０，０００反応分）のマルチプレックスプールは、染色体Ｘ、Ｙ、１３、１８および２１および１または２上の潜在的にヘテロ接合性のＳＮＰを増幅するように設計され、これらのアッセイは、単一反応で使用され、材料の血漿サンプル、絨毛膜絨毛サンプル、羊水穿刺サンプル、単一細胞または少数の細胞、他の体液または組織、癌、または遺伝物質から得られるｃｆＤＮＡを増幅する。各遺伝子座のＳＮＰ頻度は、クローンによって、またはアンプリコンを配列決定するいくつかの他の方法によって決定されてもよい。対立遺伝子頻度分布または全てのアッセイの比率の統計分析を使用して、サンプルが、試験に含まれる染色体のうちの１つ以上のトリソミーを含むかどうかを決定してもよい。別の実施形態において、元々のｃｆＤＮＡサンプルは、２つのサンプルに分割され、並行な５，０００反応分のアッセイが行われる。別の実施形態において、元々のｃｆＤＮＡサンプルは、ｎ個のサンプルに分割され、並行な（約１０，０００／ｎ）反応分のアッセイが行われ、ここで、ｎは、２〜１２または１２〜２４または２４〜４８または４８〜９６である。データは、既に記載されているものと同様の方法で収集され、分析される。なお、この方法は、転座、欠失、重複および他の染色体異常を検出するために、同様に十分に適用可能である。

一実施形態において、標的ゲノムに対して相同性を有さないテールも、プライマーのいずれかの３’または５’末端に付加されてもよい。これらのテールは、その後の操作、手順または測定を容易にする。一実施形態において、テールの配列は、順方向および逆方向の標的特異性プライマーと同じであってもよい。一実施形態において、異なるテールが、順方向および逆方向の標的特異性プライマーのために使用されてもよい。一実施形態において、複数の異なるテールが、異なる遺伝子座または遺伝子座のセットに使用されてもよい。特定のテールは、全ての遺伝子座間で、または遺伝子座の部分集合間で共有されてもよい。例えば、現在の配列決定プラットフォームのいずれかによって必要とされる順方向および逆方向の配列に対応する順方向および逆方向のテールを用いることで、直接的な配列決定の後、増幅を可能にする。一実施形態において、テールは、他の有用な配列を付加するために使用可能な全ての増幅標的の間で、共通のプライミング部位として使用可能である。いくつかの実施形態において、インナープライマーは、標的遺伝子座（例えば、多型遺伝子座）の上流または下流のいずれかにハイブリダイズするように設計された領域を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、プライマーは、分子バーコードを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、プライマーは、ＰＣＲ増幅を可能にするように設計されたユニバーサルプライミング配列を含んでいてもよい。

一実施形態において、１０，０００反応分のＰＣＲアッセイプールは、順方向および逆方向のプライマーが、高スループット配列決定装置（多くは、超並列配列決定装置と呼ばれる）、例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡから入手可能なＨＩＳＥＱ、ＧＡＩＩＸまたはＭＹＳＥＱによって必要とされる必要な順方向および逆方向の配列に対応するテールを有するように作成される。これに加えて、アンプリコンに対してヌクレオチドバーコード配列を付加するために、その後のＰＣＲのプライミング部位として使用可能なさらなる配列が、配列決定テールに対して５’に含まれ、高スループット配列決定装置の単一レーンにおいて複数サンプルのマルチプレックス配列決定を可能にする。

一実施形態において、１０，０００反応分のＰＣＲアッセイプールは、逆方向プライマーが、高スループット配列決定装置によって必要とされる必要な逆方向配列に対応するテールを有するように作成される。第１の１０，０００反応分のアッセイを用いて増幅した後、その後のＰＣＲ増幅は、全ての標的について部分ネスティッド順方向プライマー（例えば、６塩基ネスティッド）と、第１ラウンドに含まれる逆方向配列決定テールに対応する逆方向プライマーとを含む、別の１０，０００反応分のプールを用いて行われてもよい。たった１つの標的特異性プライマーとユニバーサルプライマーを用いる、この後のラウンドの部分ネスティッド増幅は、アッセイの必要なサイズを制限し、サンプリングノイズを減らすが、誤ったアンプリコンの数を大きく減らす。配列決定タグは、付けられたライゲーションアダプターに、および／またはＰＣＲプローブの一部として付加されてもよく、その結果、このタグは、最終的なアンプリコンの一部である。

腫瘍分率は、試験の性能に影響を及ぼす。患者の血漿にみられるＤＮＡの腫瘍分率を濃くするいくつかの方法が存在する。腫瘍分率は、既に記載した、以前に記載したＬＭ−ＰＣＲ方法によって、また、長いフラグメントの標的化した除去によって高めることができる。一実施形態において、標的遺伝子座のマルチプレックスＰＣＲ増幅の前に、さらなるマルチプレックスＰＣＲ反応を行い、その後のマルチプレックスＰＣＲにおいて標的とされる遺伝子座に対応する、長く、さらに大きな材料フラグメントを選択的に除去してもよい。さらなるプライマーは、無細胞胎児ＤＮＡフラグメントの中に存在すると予測されるものよりも多型からの距離が長い部位をアニーリングするように設計される。これらのプライマーは、標的多型遺伝子座のマルチプレックスＰＣＲの前に、１サイクルのマルチプレックスＰＣＲで使用されてもよい。これらの遠位のプライマーは、ＤＮＡの標的片の選択的認識を可能にする分子または部分でタグ化される。一実施形態において、ＤＮＡのこれらの分子は、１サイクルのＰＣＲ後にこれらのプライマーを含む新しく形成した二本鎖ＤＮＡの除去を可能とするビオチン分子を用いて共有結合によって修飾されてもよい。その第１ラウンド中に形成された二本鎖ＤＮＡは、おそらく母体由来である。ハイブリッド材料の除去は、磁気ストレプトアビジンビーズの使用によって達成されてもよい。他にも同様に十分に機能し得る他のタグ化方法が存在する。一実施形態において、サイズ選択方法を使用して、ＤＮＡのより短い鎖（例えば、約８００ｂｐ未満、約５００ｂｐ未満、または約３００ｂｐ未満）について、サンプルを濃縮してもよい。その後、短いフラグメントの増幅を、通常どおりに進めてもよい。

本開示に記載のミニＰＣＲ方法は、単一サンプルから、単一反応において数百から数千、またはさらに数百万の遺伝子座の高度に多重化された増幅および分析を可能にする。同時に、増幅したＤＮＡの検出は、多重化されてもよい。数十から数百のサンプルは、バーコードＰＣＲを使用することによって、１つの配列決定レーンにおいて多重化することができる。この多重化された検出は、４９反応分までを首尾良く試験し、かなり高度な多重化が可能である。実際には、このことにより、単一の配列決定ランにおいて、数百のサンプルを数千のＳＮＰで遺伝子型決定することを可能にする。これらのサンプルについて、本方法は、遺伝子型およびヘテロ接合率の決定と、同時にコピー数の決定を可能にし、その両方が、異数性検出の目的のために使用可能である。変異投薬方法の一部として使用可能である。この方法は、任意の量のＤＮＡまたはＲＮＡについて使用されてもよく、標的領域は、ＳＮＰ、他の多型領域、非多型領域、およびこれらの組み合わせであってもよい。

いくつかの実施形態において、フラグメント化されたＤＮＡのライゲーション媒介ユニバーサルＰＣＲ増幅が使用されてもよい。ライゲーション媒介ユニバーサルＰＣＲ増幅を使用して、血漿ＤＮＡを増幅させてもよく、次いで、これを複数の並行反応に分割してもよい。これを使用して、短いフラグメントを優先的に増幅し、それによって、腫瘍分率を高めてもよい。いくつかの実施形態において、ライゲーションによるフラグメントに対するタグの付加は、より短いフラグメントの検出、プライマーのより短い標的配列特異性部分の使用および／または非特異的な反応を減らす、より高い温度でのアニーリングを可能にする。

本明細書に記載される方法は、ある量のコンタミネーションＤＮＡと混合した標的ＤＮＡのセットが存在するいくつかの目的のために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡおよびコンタミネーションＤＮＡは、遺伝的に関連する個体に由来するものであってもよい。例えば、胎児（標的）における遺伝子異常は、胎児（標的）ＤＮＡを含み、母体の（コンタミネーション）ＤＮＡも含む母体の血漿から検出されてもよい。異常としては、全染色体異常（例えば、異数性）、部分染色体異常（例えば、欠失、重複、逆位、転座）、ポリヌクレオチド多型（例えば、ＳＴＲ）、単一ヌクレオチドバリアント多型および／または他の遺伝子異常または違いが挙げられる。いくつかの実施形態において、標的およびコンタミネーションＤＮＡは、同じ個体に由来していてもよいが、標的およびコンタミネーションＤＮＡは、例えば、癌の場合に、１つ以上の変異によって異なっている。（例えば、Ｈ．Ｍａｍｏｎら、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｐｌａｓｍａ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｏｒ ＤＮＡ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＤＮＡ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５４：９ （２００８）を参照。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、細胞培養物（アポトーシス）の上清に見出されてもよい。いくつかの実施形態において、その後のライブラリ調製、増幅および／または配列決定のために、生体サンプル（例えば血液）におけるアポトーシスを誘発することが可能である。この目的を達成するためのいくつかの実行可能なワークフローおよびプロトコルは、本開示の別の箇所に提示されている。

いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡは、単一細胞に由来していてもよく、標的ゲノムの１個より少ないコピーからなるＤＮＡのサンプルに由来していてもよく、少量のＤＮＡに由来していてもよく、混合起源（例えば、癌患者の血漿および腫瘍、健康なＤＮＡと癌ＤＮＡの混合、移植など）からのＤＮＡに由来していてもよく、他の体液に由来していてもよく、細胞培養物に由来していてもよく、培養物の上清に由来していてもよく、ＤＮＡの法医学サンプルに由来していてもよく、ＤＮＡの古代のサンプル（例えば、コハクに捕捉された昆虫）に由来していてもよく、ＤＮＡの他のサンプルに由来していてもよく、これらの組み合わせであってもよい。

いくつかの実施形態において、短いアンプリコンサイズが使用されてもよい。短いアンプリコンサイズは、フラグメント化されたＤＮＡに特に適している（例えば、ＡＳｉｋｏｒａら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｆｅｔａｌ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｓｈｏｒｔ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｃｏｎｓ．ＣｌｉｎＣｈｅｍ．２０１０ Ｊａｎ；５６（１）：１３６−８を参照）。

短いアンプリコンサイズの使用は、いくつかの顕著な利益をもたらし得る。短いアンプリコンサイズは、最適化された増幅効率をもたらし得る。短いアンプリコンサイズは、典型的には、より短い産物を産生するため、非特異的なプライミングの機会が少ない。産物が短いほど、クラスターが小さくなり得るので、配列決定フローセル上で、より密にクラスター化させることができる。なお、本明細書に記載される方法は、より長いＰＣＲアンプリコンについても同様に十分に機能し得る。アンプリコンの長さは、必要な場合、例えば、さらに大きな配列の伸長物を配列決定するときに、長くなるだろう。ネスティッドＰＣＲプロトコルの最初の工程として１００ｂｐ〜２００ｂｐ長のアッセイを用いた、１４６反応分の標的化された増幅による実験は、単一セルで、陽性結果を有するゲノムＤＮＡに対して実行された。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法を使用して、ＳＮＰ、コピー数、ヌクレオチドメチル化、ｍＲＮＡレベル、他の種類のＲＮＡ発現レベル、他の遺伝的および／またはエピジェネティックな特徴を増幅および／または検出してもよい。本明細書に記載されるミニＰＣＲ方法は、次世代配列決定と共に使用されてもよく、マイクロアレイ、デジタルＰＣＲによる計数、リアルタイムＰＣＲ、質量分光計による分析などの他の下流の方法と共に使用されてもよい。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のミニＰＣＲ増幅方法は、少数集合の正確な定量化のための方法の一部として使用されてもよい。スパイクキャリブレータを使用した絶対的な定量化に使用されてもよい。非常に深い配列決定を介する変異／マイナー対立遺伝子定量化に使用されてもよく、非常に多重化された態様で実行されてもよい。ヒト、動物、植物または他の生物における血縁または祖先の標準的な起源および同一性の検査に使用されてもよい。法医学検査に使用されてもよい。任意の種類の物質、例えば、羊水およびＣＶＳ、精子、受胎産物（ＰＯＣ）に対する、迅速な遺伝子型決定およびコピー数分析（ＣＮ）に使用してもよい。胚から生検採取されたサンプルに対する遺伝子型決定など、単一細胞分析に使用されてもよい。ミニＰＣＲを使用した標的化配列決定によって、迅速な胚分析（１日未満、１日または２日の範囲内の生検）に使用してもよい。

いくつかの実施形態において、ミニＰＣＲ増幅方法は、腫瘍分析に使用することができる。腫瘍生検は、多くは、健康な細胞と腫瘍細胞の混合物である。標的化ＰＣＲは、バックグラウンド配列がほぼない状態でのＳＮＰおよび遺伝子座の深い配列決定を可能にする。腫瘍ＤＮＡに対するコピー数とヘテロ接合性の消失の分析に使用されてもよい。上述の腫瘍ＤＮＡは、腫瘍患者の多くの異なる体液または組織中に存在していてもよい。腫瘍再発の検出および／または腫瘍スクリーニングに使用されてもよい。種子の品質管理検査に使用されてもよい。飼育または漁業の目的で使用されてもよい。なお、これらの方法のいずれも、倍数性コールを目的として非多型遺伝子座を標的とすることに同様に十分に使用されてもよい。

本明細書に開示される方法の基礎となるいくつかの基本的な方法を説明するいくつかの文献としては、以下のものが挙げられる。（１）Ｗａｎｇ ＨＹ、Ｌｕｏ Ｍ、Ｔｅｒｅｓｈｃｈｅｎｋｏ ＩＶ、Ｆｒｉｋｋｅｒ ＤＭ、Ｃｕｉ Ｘ、Ｌｉ ＪＹ、Ｈｕ Ｇ、Ｃｈｕ Ｙ、Ａｚａｒｏ ＭＡ、Ｌｉｎ Ｙ、Ｓｈｅｎ Ｌ、Ｙａｎｇ Ｑ、Ｋａｍｂｏｕｒｉｓ ＭＥ、Ｇａｏ Ｒ、Ｓｈｉｈ Ｗ、Ｌｉ Ｈ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００５ Ｆｅｂ；１５（２）：２７６−８３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、Ｒｏｂｅｒｔ Ｗｏｏｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ０８９０３、ＵＳＡ．（２）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｌｉ Ｈ、Ｗａｎｇ ＨＹ、Ｃｕｉ Ｘ、Ｌｕｏ Ｍ、Ｈｕ Ｇ、Ｇｒｅｅｎａｗａｌｔ ＤＭ、Ｔｅｒｅｓｈｃｈｅｎｋｏ ＩＶ、Ｌｉ ＪＹ、Ｃｈｕ Ｙ、Ｇａｏ Ｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００７；３９６−ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１８０２５６９９．（３）配列決定のための平均９アッセイの多重化を含む方法は、Ｎｅｓｔｅｄ Ｐａｔｃｈ ＰＣＲ ｅｎａｂｌｅｓ ｈｉｇｈｌｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｉｎ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅｓ．Ｖａｒｌｅｙ ＫＥ、Ｍｉｔｒａ ＲＤ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００８年１１月；１８（１１）：１８４４−５０．Ｅｐｕｂ ２００８年１０月１０日に記載される。本明細書に開示される方法は、上述の参考文献よりも大きな桁数の多重化を可能にすることに留意されたい。

例示的なキット
一態様において、本発明は、キット、例えば、本明細書に記載される方法のいずれかを用い、染色体セグメントまたは染色体全体の欠失および／または重複を検出するために核酸サンプル中の標的遺伝子座を増幅するためのキットを特徴とする。いくつかの実施形態において、キットは、本発明のプライマーライブラリのいずれかを含んでいてもよい。一実施形態において、本キットは、複数のインナー順方向プライマーと場合により複数のインナー逆方向プライマーと、場合によりアウター順方向プライマーおよびアウター逆方向プライマーを含み、それぞれのプライマーは、標的染色体または染色体セグメントおよび場合によりさらなる染色体または染色体セグメント上の標的部位（例えば、多型部位）のうちの１つからすぐ上流および／または下流にあるＤＮＡの領域にハイブリダイズするように設計される。いくつかの実施形態において、本キットは、例えば、本明細書に記載される方法のいずれかを用い、１つ以上の染色体セグメントまたは染色体全体の１つ以上の欠失および／または重複を検出するために、標的遺伝子座を増幅するためにプライマーライブラリを用いるための説明書を含む。

特定の実施形態において、本発明のキットは、染色体の異数性およびＣＮＶ決定を検出するためのプライマー対、例えば、染色体の異数性（例えば、ＣＮＶ（ＣｏＮＶＥＲＧｅ）（Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｖａｒｉａｎｔ Ｅｖｅｎｔｓ Ｒｅｖｅａｌｅｄ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ：遺伝子型的に明らかになったコピー数バリアントイベント）および／またはＳＮＶを検出するための大規模多重反応のためのプライマー対を提供する。これらの実施形態において、本キットは、一緒に出荷される、少なくとも１００、２００、２５０、３００、５００、１０００、２０００、２５００、３０００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、２８，０００、５０，０００または７５，０００、最大で２００、２５０、３００、５００、１０００、２０００、２５００、３０００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、２８，０００、５０，０００、７５，０００または１００，０００のプライマー対を含んでいてもよい。プライマー対は、単一の容器、例えば、単一のチューブまたはボックス、または複数のチューブまたはボックスに含まれていてもよい。特定の実施形態において、プライマー対は、商業的な供給業者によって前もって適正な品質にされ、一緒に販売され、他の実施形態において、顧客は、特注の遺伝子標的および／またはプライマーを選択し、商業的な供給業者は、顧客に対し、１つのチューブでも複数のチューブでもなく、プライマープールを製造し、出荷する。特定の例示的な実施形態において、本キットは、ＣＮＶおよびＳＮＶの両方、特に、少なくとも１種類の癌と相関関係があることが知られているＣＮＶおよびＳＮＶを検出するためのプライマーを含む。

本発明のいくつかの実施形態による循環ＤＮＡ検出のためのキットは、循環ＤＮＡのための標準および／または対照を含む。例えば、特定の実施形態において、標準および／または対照は、本明細書で提供される増幅反応を行うために使用されるプライマー（例えば、ＣｏＮＶＥＲＧｅを行うためのプライマー）と共に販売され、場合により出荷され、梱包される。特定の実施形態において、対照は、１個以上の染色体異数性（例えばＣＮＶ）を示すか、および／または１個以上のＳＮＶを含む単離されたゲノムＤＮＡを含め、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を含む。特定の実施形態において、標準および／または対照は、ＰｌａｓｍＡｒｔ標準と呼ばれ、特に、特定の遺伝性疾患において、特定の疾患状態（例えば、癌）で、ＣＮＶを示すことが知られているゲノムの領域に対して配列同一性を有し、血漿中で通常見出されるｃｆＤＮＡフラグメントのサイズ分布を反映するサイズ分布を有するポリヌクレオチドを含む。ＰｌａｓｍＡｒｔ標準を作成するための例示的な方法は、本明細書の実施例で提供される。一般的に、染色体異数性を含むことが知られている供給源からのゲノムＤＮＡが、単離され、フラグメント化され、精製され、大きさが選択される。

したがって、人工ｃｆＤＮＡポリヌクレオチド標準および／または対照は、上にまとめたように調製される単離されたポリヌクレオチドサンプルを、ｉｎ ｖｉｖｏでｃｆＤＮＡについて観測されたものと同様の濃度で、例えば、流体中０．０１％〜２０％、０．１〜１５％または４〜１０％のＤＮＡで、染色体異数性および／またはＳＮＶを示さないことがわかっているＤＮＡサンプルにスパイク化することによって製造される。これらの標準／対照は、アッセイ設計、特性決定、開発および／または検証のための対照として、試験（例えば、ＣＬＩＡ実験室で行われる癌試験）中の品質管理標準として、および／または研究使用のみまたは診断検査キットに含まれる標準として、使用することができる。

例示的な正規化／修正方法
いくつかの実施形態において、異なる遺伝子座、染色体セグメントまたは染色体の測定は、バイアス、例えば、ＧＣ含有量の差に起因するバイアスまたは増幅効率の他の差に起因するバイアスについて調整されるか、または配列決定エラーについて調整される。いくつかの実施形態において、同じ遺伝子座についての異なる対立遺伝子の測定値は、対立遺伝子間の代謝、アポトーシス、ヒストン、不活化および／または増幅の差について調整される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡにおける同じ遺伝子座についての異なる対立遺伝子の測定値は、異なるＲＮＡ対立遺伝子間の転写速度または安定性の差について調整される。

遺伝子データをフェージングするための例示的な方法
いくつかの実施形態において、遺伝子データは、本明細書に記載される方法または遺伝子データをフェージングするための任意の既知の方法を用いてフェージングされる（例えば、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２００９年２月９日に出願されたＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００９／１０５５３１号、２００９年８月４日に出願されたＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１０／０１７２１４号、米国公開第２０１３／０１２３１２０号（２０１２年１１月２１日）、２０１０年１０月７日に出願された米国公開第２０１１／ ００３３８６２号、２０１０年８月１９日に出願された米国公開第２０１１／００３３８６２号、２０１１年２月３日に出願された米国公開第２０１１／０１７８７１９号、２００８年３月１７日に出願された米国特許第８，５１５，６７９号、２００６年１１月２２日に出願された米国公開第２００７／０１８４４６７号、２００８年３月１７日に出願された米国公開第２００８／０２４３３９８号および２０１４年５月１６日に出願された米国出願第６１／９９４，７９１号を参照）。いくつかの実施形態において、フェーズは、目的のＣＮＶを含むことが知られているか、または含むことが疑われる１つ以上の領域について決定される。いくつかの実施形態において、フェーズは、ＣＮＶ領域（複数可）に隣接する１つ以上の領域および／または１つ以上の参照領域についても決定される。一実施形態において、個体の遺伝子データは、例えば、１つ以上の精子または卵子を測定することによって、倍体である個体由来の組織を測定することによって、推論によってフェージングされる。一実施形態において、個体の遺伝子データは、１名以上の一親等の血縁者、例えば、個体の親（例えば、個体の父親からの精子）または兄弟姉妹の遺伝子型データの測定値を用い、推論によってフェージングされる。

一実施形態において、個体の遺伝子データは、例えば、デジタルＰＣＲを用いることによって、希釈によってフェージングされ、ＤＮＡまたはＲＮＡが１個または複数のウェルで希釈される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡは、各ウェル中の各ハプロタイプのほぼ１個以下のコピーが存在すると予想される程度まで希釈され、次いで、１個以上のウェル中のＤＮＡまたはＲＮＡが測定される。いくつかの実施形態において、染色体が密な束である場合、細胞は有糸分裂期に停止され、微小流体を使用して、別個のウェルに別個の染色体を入れる。ＤＮＡまたはＲＮＡが希釈されるため、１個より多いハプロタイプが同じフラクション（またはチューブ）内にある可能性は低い。したがって、チューブ内にＤＮＡの単分子が効果的に存在してもよく、これにより、単一のＤＮＡまたはＲＮＡ分子上のハプロタイプを決定することができる。いくつかの実施形態において、本方法は、フラクションの少なくとも１つが、染色体対からの１個の染色体または１個の染色体セグメントを含むように、ＤＮＡまたはＲＮＡのサンプルを複数のフラクションに分割することと、フラクションの少なくとも１つにおいて、ＤＮＡまたはＲＮＡのサンプルの遺伝子型を決定すること（例えば、２個以上の多型遺伝子座の存在を決定すること）によって、ハプロタイプを決定すること、とを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子型を決定することは、ＳＮＰアレイを配列決定し（例えば、ショットガン配列決定または単分子配列決定）、多型遺伝子座を検出するか、またはマルチプレックスＰＣＲを伴う。いくつかの実施形態では、遺伝子型を決定することは、多型遺伝子座、例えば、少なくとも１００、２００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００または１００，０００個の異なる多型遺伝子座を検出するためのＳＮＰアレイの使用を伴う。いくつかの実施形態において、遺伝子型を決定することは、マルチプレックスＰＣＲの使用を伴う。いくつかの実施形態において、本方法は、フラクション中のサンプルと、少なくとも１００、２００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００または１００，０００個の異なる多型遺伝子座（例えばＳＮＰ）に同時にハイブリダイズするプライマーのライブラリとを接触させ、反応混合物を生成することと、反応混合物をプライマー伸長反応条件に供して、高スループットシーケンサを用いて測定される増幅産物を産生して配列決定データを作成することと、を伴う。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）が配列決定される。ｍＲＮＡはエクソンのみを含むため、ｍＲＮＡを配列決定することで、ゲノム中の大きな距離（例えば、数メガ塩基）にわたって多型遺伝子座（例えばＳＮＰ）について対立遺伝子を決定することができる。いくつかの実施形態において、個体のハプロタイプは、染色体選別によって決定される。例示的な染色体選別方法は、染色体が密な束である場合、有糸分裂期にある細胞を停止させることと、微小流体を使用して、別個のウェルに別個の染色体を入れることと、を含む。別の方法は、ＦＡＣＳを介する単一染色体選別を用い、単一染色体を集めることを伴う。標準的な方法（例えば、配列決定またはアレイ）を使用して、単一染色体上の対立遺伝子を特定して、個体のハプロタイプを決定することができる。

いくつかの実施形態において、個体のハプロタイプは、長いリード配列決定によって、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａによって開発されたＭｏｌｅｃｕｌｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いることによって決定される。いくつかの実施形態において、ライブラリ調製工程は、ＤＮＡをフラグメント（例えば、約１０ｋｂの大きさのフラグメント）に剪断することと、フラグメントを希釈することと、（約３，０００個のフラグメントが単一のウェル内にあるように）フラグメントをウェルに入れることと、ロングレンジＰＣＲによって、各ウェル中のフラグメントを増幅することと、短いフラグメントに切断することと、フラグメントをバーコード化することと、各ウェルからのバーコード化されたフラグメントを一緒にプールして、これらを全て配列決定することと、を伴う。配列決定の後、計算工程は、各ウェルからのリードを、付けられたバーコードに基づいて分離することと、これらをグループ分けしてフラグメントにすることと、重複するヘテロ接合性ＳＮＶにあるフラグメントをハプロタイプブロックにアセンブリすることと、このブロックを、フェージングされた参照パネルに基づき、統計的にフェージングすることと、長いハプロタイプコンフィグを生成することと、を伴う。

いくつかの実施形態において、個体のハプロタイプは、個体の血縁者からのデータを用いて決定される。いくつかの実施形態において、ＳＮＰアレイを使用して、個体および個体の血縁者からのＤＮＡまたはＲＮＡサンプルにおいて、少なくとも１００、２００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００または１００，０００個の異なる多型遺伝子座の存在を決定する。いくつかの実施形態において、本方法は、個体および／または個体の血縁者からのＤＮＡサンプルと、少なくとも１００、２００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００または１００，０００個の異なる多型遺伝子座（例えばＳＮＰ）に同時にハイブリダイズするプライマーのライブラリとを接触させ、反応混合物を生成することと、反応混合物をプライマー伸長反応条件に供して、高スループットシーケンサを用いて測定される増幅産物を産生して配列決定データを作成することと、を伴う。

一実施形態において、個体の遺伝子データは、集合に基づくハプロタイプ頻度を使用するコンピュータプログラムを使用してフェージングして、最も可能性の高いフェーズを推定する（例えば、ＨａｐＭａｐに基づくフェージング）。例えば、倍体データセットは、一般的な集合において既知のハプロタイプブロックを利用する統計的方法を用い、二倍体データから直接的に推測することができる（例えば、公的なＨａｐＭａｐ ＰｒｏｊｅｃｔおよびＰｅｒｌｅｇｅｎ Ｈｕｍａｎ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ Ｐｒｏｊｅｃｔについて作成されたもの）。ハプロタイプブロックは、本質的には、種々の集合で繰り返し発生する、相関関係にある一連の対立遺伝子である。これらのハプロタイプブロックは、古く、一般的であることが多いため、これらを使用して、二倍体遺伝子型からハプロタイプを予測してもよい。この作業を完成させるのに利用可能な公的なアルゴリズムとしては、不完全な系統学による手法、共役事前分布に基づくベイズ手法および集合遺伝学からの事前分布が挙げられる。これらのアルゴリズムのいくつかは、隠れマルコフモデルを使用する。

一実施形態において、個体の遺伝子データは、遺伝子型データからハプロタイプを推定するアルゴリズム、例えば、局在化したハプロタイプクラスタリングを使用するアルゴリズムを使用して、フェージングされる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＢｒｏｗｎｉｎｇおよびＢｒｏｗｎｉｎｇ、「Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ Ｐｈａｓｉｎｇ ａｎｄ Ｍｉｓｓｉｎｇ−Ｄａｔａ Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｗｈｏｌｅ−Ｇｅｎｏｍｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｂｙ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ」 Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．Ｎｏｖ ２００７；８１（５）：１０８４−１０９７を参照）。例示的なプログラムは、Ｂｅａｇｌｅバージョン３．３．２またはバージョン４である（ｈｆａｃｕｌｔｙ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｂｒｏｗｎｉｎｇ／ｂｅａｇｌｅ／ｂｅａｇｌｅ．ｈｔｍｌでワールドワイドウェブで入手可能、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

一実施形態において、個体の遺伝子データは、遺伝子型データからハプロタイプを推定するアルゴリズム、例えば、遺伝子型決定されるマーカーの距離、順序および間隔、欠落データの代入、組換え率の推定、またはこれらの組み合わせを用いた連鎖不均衡の減衰を使用するアルゴリズムを用いてフェージングされる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＳｔｅｐｈｅｎｓおよびＳｃｈｅｅｔ、「Ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｄｅｃａｙ ｏｆ Ｌｉｎｋａｇｅ Ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｉｎ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｉｓｓｉｎｇ−Ｄａｔａ Ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎ」、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７６：４４９−４６２、２００５を参照）。例示的なプログラムは、ＰＨＡＳＥ ｖ．２．１またはｖ２．１．１である（ｓｔｅｐｈｅｎｓｌａｂ．ｕｃｈｉｃａｇｏ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｈｔｍｌでワールドワイドウェブで入手可能、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

一実施形態において、個体の遺伝子データは、集合の遺伝子型データからハプロタイプを推定するアルゴリズム、例えば、隠れマルコフモデルに従って、クラスターメンバーシップが染色体に沿って連続的に変化することを可能にするアルゴリズムを用いて、フェージングされる。この手法は自由度が高く、連鎖不均衡の「ブロック様」パターンと、距離を用いた連鎖不均衡が徐々に低下することの両方について可能である（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＳｃｈｅｅｔおよびＳｔｅｐｈｅｎｓ、「Ａ ｆａｓｔ ａｎｄ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｄａｔａ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｉｎｆｅｒｒｉｎｇ ｍｉｓｓｉｎｇ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｈａｐｌｏｔｙｐｉｃ ｐｈａｓｅ．」Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ、７８：６２９−６４４、２００６を参照）。例示的なプログラムは、ｆａｓｔＰＨＡＳＥである（ｓｔｅｐｈｅｎｓｌａｂ．ｕｃｈｉｃａｇｏ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｈｔｍｌでワールドワイドウェブで入手可能、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

一実施形態において、個体の遺伝子データは、遺伝子型代入方法、例えば、以下の参照データセットのうちの１つ以上を使用する方法を用いて、フェージングされる。ＨａｐＭａｐデータセット、複数のＳＮＰチップ上で遺伝子型決定される対照のデータセットおよび１，０００ Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔからの密に型決定されたサンプル。例示的な手法は、複数の参照パネルにわたって精度を高め、情報を組み合わせた、自由度の高いモデリングフレームワークである（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｗｉｅ、ＤｏｎｎｅｌｌｙおよびＭａｒｃｈｉｎｉ（２００９）、「Ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ．」ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５（６）：ｅ１０００５２９、２００９を参照）。例示的なプログラムは、ＩＭＰＵＴＥまたはＩＭＰＵＴＥバージョン２（ＩＭＰＵＴＥ２としても知られる）である（ｍａｔｈｇｅｎ．ｓｔａｔｓ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｐｕｔｅ／ｉｍｐｕｔｅ＿ｖ２．ｈｔｍｌでワールドワイドウェブで入手可能、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

一実施形態において、個体の遺伝子データは、ハプロタイプを推論するアルゴリズム、例えば、ＰＨＡＳＥ ｖ２．１においてＳｔｅｐｈｅｎｓによって開発されたような、組換えとの結合の遺伝子モデルの下でハプロタイプを推論するアルゴリズムを用いて、フェージングされる。主要なアルゴリズムの改善は、各個体についての候補ハプロタイプのセットを表すためのバイナリツリーの使用に依存する。これらのバイナリツリー表現は、（１）ＰＨＡＳＥ ｖ２．１で行われる冗長操作を回避することによって、ハプロタイプの事後確率の計算を高速化し、（２）バイナリツリーにおける最も合理的な経路（すなわち、ハプロタイプ）のスマートな検索によってハプロタイプ推論問題の指数的態様を克服する（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｅｌａｎｅａｕ、ＣｏｕｌｏｎｇｅｓおよびＺａｇｕｒｙ、「Ｓｈａｐｅ−ＩＴ：ｎｅｗ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ」、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ９：５４０、２００８ ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１０５−９−５４０を参照）。例示的なプログラムは、ＳＨＡＰＥＩＴである（ｍａｔｈｇｅｎ．ｓｔａｔｓ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｓｈａｐｅｉｔ／ｓｈａｐｅｉｔ．ｈｔｍｌでワールドワイドウェブで入手可能、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

一実施形態において、個体の遺伝子データは、集合の遺伝子型データからハプロタイプを推定するアルゴリズム、例えば、より長いハプロタイプについての経験に基づく確率を得るためにハプロタイプフラグメント頻度を使用するアルゴリズムを用いて、フェージングされる。いくつかの実施形態において、このアルゴリズムは、最大の局所的なコヒーレンスを有するようにハプロタイプを再構築する（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｒｏｎｅｎ、ＧｅｅｒｔｓおよびＴｏｉｖｏｎｅｎ、「ＨａｐｌｏＲｅｃ：Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ」、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ７：５４２、２００６を参照）。例示的なプログラムは、ＨａｐｌｏＲｅｃ、例えば、ＨａｐｌｏＲｅｃバージョン２．３である（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ｃｓ．ｈｅｌｓｉｎｋｉ．ｆｉ／ｇｒｏｕｐ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ｈａｐｌｏｔｙｐｉｎｇ．ｈｔｍｌでワールドワイドウェブで入手可能）。

一実施形態において、個体の遺伝子データは、集合の遺伝子型データからハプロタイプを推定するアルゴリズム、例えば、パーティションライゲーション戦略を使用するアルゴリズムおよび期待最大化に基づくアルゴリズムを用い、フェージングされる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｑｉｎ、ＮｉｕおよびＬｉｕ、「Ｐａｒｔｉｔｉｏｎ−Ｌｉｇａｔｉｏｎ−Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ−Ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ」、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．７１（５）：１２４２−１２４７、２００２を参照）。例示的なプログラムは、ＰＬ−ＥＭである（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ｐｅｏｐｌｅ．ｆａｓ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／〜ｊｕｎｌｉｕ／ｐｌｅｍ／ｃｌｉｃｋ．ｈｔｍｌでワールドワイドウェブで入手可能）。

一実施形態において、個体の遺伝子データは、集合の遺伝子型データからハプロタイプを推定するアルゴリズム、例えば、遺伝子型からハプロタイプへのフェージングおよびブロック分割を同時に行うためのアルゴリズムを用いて、フェージングされる。いくつかの実施形態において、期待最大化アルゴリズムが使用される（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＫｉｍｍｅｌおよびＳｈａｍｉｒ、「ＧＥＲＢＩＬ：Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｌｏｃｋ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ （ＰＮＡＳ） １０２：１５８−１６２、２００５を参照）。例示的なプログラムは、ＧＥＲＢＩＬであり、ＧＥＶＡＬＴバージョン２プログラムの一部として入手可能である（ａｃｇｔ．ｃｓ．ｔａｕ．ａｃ．ｉｌ／ｇｅｖａｌｔ／でワールドワイドウェブで入手可能、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

一実施形態において、個体の遺伝子データは、集合の遺伝子型データからハプロタイプを推定するアルゴリズム、例えば、フェーズを指定しない遺伝子型測定を考慮して、ハプロタイプ頻度のＭＬ推定値を計算するためにＥＭアルゴリズムを使用するアルゴリズムを用いて、フェージングされる。このアルゴリズムも、いくつかの遺伝子型測定が欠落する可能性がある（例えば、ＰＣＲの失敗に起因する）。個々のハプロタイプの複数の代入も可能にする（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｌａｙｔｏｎ，Ｄ．（２００２）、「ＳＮＰＨＡＰ：Ａ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｏｆ Ｌａｒｇｅ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ＳＮＰｓ」を参照）。例示的なプログラムは、ＳＮＰＨＡＰである（ｇｅｎｅ．ｃｉｍｒ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌａｙｔｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｓｎｐｈａｐ．ｔｘｔでのワールドワイドウェブで入手可能、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

一実施形態において、個体の遺伝子データは、集合の遺伝子型データからハプロタイプを推定するアルゴリズム、例えば、ＳＮＰの対について集められた遺伝子型統計に基づくハプロタイプ推論のためのアルゴリズムを用いて、フェージングされる。このソフトウェアは、例えば、ＤＮＡアレイから得られた多数の長いゲノム配列の比較的正確なフェージングのために使用することができる。例示的なプログラムは、遺伝子型マトリックスをインプットとして取り込み、対応するハプロタイプマトリックスを出力する（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＢｒｉｎｚａおよびＺｅｌｉｋｏｖｓｋｙ、「２ＳＮＰ：ｓｃａｌａｂｌｅ ｐｈａｓｉｎｇ ｂａｓｅｄ ｏｎ ２−ＳＮＰ ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２２（３）：３７１−３、２００６を参照）。例示的なプログラムは、２ＳＮＰである（ａｌｌａ．ｃｓ．ｇｓｕ．ｅｄｕ／〜ｓｏｆｔｗａｒｅ／２ＳＮＰでのワールドワイドウェブで入手可能、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

種々の実施形態において、個体の遺伝子データは、染色体または染色体セグメント中の異なる位置で染色体が交差する確率に関するデータを使用して、フェージングされ（例えば、ＨａｐＭａｐデータベース中にみられ得るような組換えデータを用いて、任意の間隔で組換えリスクスコアを作成し）、その染色体または染色体セグメント上の多型対立遺伝子間の依存性をモデル化する。いくつかの実施形態において、多型遺伝子座での対立遺伝子数は、配列決定データまたはＳＮＰアレイデータに基づいてコンピュータで計算される。いくつかの実施形態において、それぞれ染色体または染色体セグメントの異なる可能な状態に関する複数の仮説（例えば、個体からの１つ以上の細胞のゲノムにおいて、第２の相同染色体セグメントと比較して、第１の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現、第１の相同染色体セグメントの重複、第２の相同染色体セグメントの欠失、または第１および第２の相同染色体セグメントの等しい出現）が作成され（例えば、コンピュータで作成）、染色体上の多型遺伝子座での対立遺伝子数の予測値についてのモデル（例えば、結合分布モデル）が、それぞれの仮説について構築され（例えば、コンピュータで構築）、結合分布モデルおよび対立遺伝子数を用い、仮説のそれぞれの相対確率が決定され（例えば、コンピュータで決定）、最大確率を有する仮説が選択される。いくつかの実施形態において、対立遺伝子数の結合分布モデルを構築することと、それぞれの仮説の相対確率を決定する工程は、参照染色体の使用を必要としない方法を用いて行われる。

いくつかの実施形態において、個体からのサンプル（例えば、生検、例えば、腫瘍生検、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、または大部分が目的のＣＮＶを有する細胞、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含むか、またはこれらのみを含む可能性が高い別のサンプル）が分析され、目的のＣＮＶ（例えば、欠失または重複）を含むことが知られているか、または疑われる１つ以上の領域についてフェーズを決定する。いくつかの実施形態において、サンプルは、高い腫瘍分率（例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９または１００％）を有する。

いくつかの実施形態において、サンプルは、ハプロタイプ不均衡または任意の異数性を有する。いくつかの実施形態において、サンプルは、２種類のＤＮＡの任意の混合物を含み、この２種類は、異なる比率の２つのハプロタイプを有し、少なくとも１つのハプロタイプを共有している。例えば、腫瘍の場合、正常組織は１：１であり、腫瘍組織は、１：０または１：２、１：３、１：４などである。いくつかの実施形態において、少なくとも１０、１００、５００、１，０００、２，０００、３，０００、５，０００、８，０００または１０，０００個の多型遺伝子座が分析され、遺伝子座の一部または全てでの対立遺伝子のフェーズを決定する。いくつかの実施形態において、サンプルは、異数性（例えば、長時間の細胞培養によって誘導される異数性）になるように処理された細胞または組織に由来する。

いくつかの実施形態において、サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡの大部分の割合または全てが、目的のＣＮＶを有する。いくつかの実施形態において、サンプル中の総ＤＮＡまたはＲＮＡに対する、目的のＣＮＶを含む１つ以上の標的細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡの比率は、少なくとも８０、８５、９０、９５または１００％である。欠失を有するサンプルについて、その欠失を有する細胞（またはＤＮＡもしくはＲＮＡ）について、たった１つのハプロタイプが存在する。この第１のハプロタイプは、標準的な方法を用いて決定され、欠失の領域に存在する対立遺伝子の同一性を決定することができる。欠失を有する細胞（またはＤＮＡもしくはＲＮＡ）のみを含有するサンプルにおいて、これらの細胞中に存在する第１のハプロタイプからの信号のみが存在するだろう。欠失を有しない少量の細胞（またはＤＮＡもしくはＲＮＡ）（例えば、少量の非癌性細胞）も含むサンプルにおいて、これらの細胞（またはＤＮＡもしくはＲＮＡ）における第２のハプロタイプからの弱い信号は、無視することができる。その欠失を欠く個体からの他の細胞、ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する第２のハプロタイプは、推論によって決定することができる。例えば、欠失を有しない個体からの細胞の遺伝子型が（ＡＢ，ＡＢ）であり、その個体についてのフェージングデータが、第１のハプロタイプが（Ａ，Ａ）であることを示す場合、他のハプロタイプは、（Ｂ，Ｂ）であると推論することができる。

欠失を有する細胞（またはＤＮＡもしくはＲＮＡ）と、欠失を有しない欠失を有する細胞（またはＤＮＡもしくはＲＮＡ）が両方とも存在するサンプルについても、フェーズを決定することができる。例えば、ｘ軸が、染色体に沿った個々の遺伝子座の線形位置を表し、ｙ軸が、総（Ａ＋Ｂ）対立遺伝子リードの分率としてのＡ対立遺伝子リードの数を表す、プロットを作成することができる。欠失についてのいくつかの実施形態において、パターンは、個体がヘテロ接合性であるＳＮＰを表す２つの中央のバンドを含む（上側のバンドは、欠失を有しない細胞からのＡＢと、欠失を有する細胞からのＡを表し、下側のバンドは、欠失を有しない細胞からのＡＢと、欠失を有する細胞からのＢを表す）。いくつかの実施形態において、これら２つのバンドの分離は、欠失を有する細胞、ＤＮＡまたはＲＮＡの分率が高くなるにつれて、大きくなる。したがって、Ａ対立遺伝子の同一性を使用して、第１のハプロタイプを決定することができ、Ｂ対立遺伝子の同一性を使用して、第２のハプロタイプを決定することができる。

重複を有するサンプルについて、重複を有する細胞（またはＤＮＡもしくはＲＮＡ）について、ハプロタイプの過剰なコピーが存在する。重複した領域のこのハプロタイプは、標準的な方法を用いて決定され、この重複領域において増加した量で存在する対立遺伝子の同一性を決定することができるか、または重複していない領域のハプロタイプが、標準的な方法を用いて決定され、減少した量で存在する対立遺伝子の同一性を決定することができる。１つのハプロタイプが決定されると、もう一方のハプロタイプは、推論によって決定することができる。

重複を有する細胞（またはＤＮＡもしくはＲＮＡ）と、重複を有しない欠失を有する細胞（またはＤＮＡもしくはＲＮＡ）が両方とも存在するサンプルについても、欠失について上に記載したのと似た方法を用い、フェーズを決定することができる。例えば、ｘ軸が、染色体に沿った個々の遺伝子座の線形位置を表し、ｙ軸が、総（Ａ＋Ｂ）対立遺伝子リードの分率としてのＡ対立遺伝子リードの数を表す、プロットを作成することができる。欠失についてのいくつかの実施形態において、パターンは、個体がヘテロ接合性であるＳＮＰを表す２つの中央のバンドを含む（上側のバンドは、重複を有しない細胞からのＡＢと、重複を有する細胞からのＡＡＢを表し、下側のバンドは、重複を有しない細胞からのＡＢと、重複を有する細胞からのＡＢＢを表す）。いくつかの実施形態において、これら２つのバンドの分離は、重複を有する細胞、ＤＮＡまたはＲＮＡの分率が高くなるにつれて、大きくなる。したがって、Ａ対立遺伝子の同一性を使用して、第１のハプロタイプを決定することができ、Ｂ対立遺伝子の同一性を使用して、第２のハプロタイプを決定することができる。いくつかの実施形態において、１つ以上のＣＮＶ領域のフェーズ（例えば、測定された領域中の多型遺伝子座の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５または１００％のフェーズ）は、癌を有することが知られている個体からのサンプル（例えば、腫瘍生検または血漿サンプル）から決定され、癌の進行をモニタリングする（例えば、癌の寛解または再発をモニタリングする）ために同じ個体からのその後のサンプルの分析に使用される。いくつかの実施形態において、腫瘍分率が高いサンプル（例えば、高い腫瘍負荷を有する個体からの腫瘍生検または血漿サンプル）を使用して、より低い腫瘍分率を有するその後のサンプル（例えば、癌の治療を受けているか、または寛解中の個体からの血漿サンプル）の分析に使用されるフェージングデータを得る。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法のうちの２つ以上を用いて、個体の遺伝子データをフェージングする。いくつかの実施形態において、バイオインフォマティクス方法（例えば、集合に基づくハプロタイプ頻度を用い、最も可能性が高いフェーズを推定する）および分子生物学的方法（例えば、バイオインフォマティクスに基づいて推論されたフェージングデータではなく、実際のフェージングデータを得るための本明細書に開示される分子フェージング方法のいずれか）が使用される。いくつかの実施形態において、他の被験体（例えば、以前の被験体）からのフェージングデータを使用して、集合のデータを絞り込む。例えば、他の被験体からのフェージングデータを集合のデータに加え、別の被験体についての可能なハプロタイプについての事前分布を計算することができる。いくつかの実施形態において、他の被験体（例えば、以前の被験体）からのフェージングデータを使用して、別の被験体についての可能なハプロタイプについての事前分布を計算する。

いくつかの実施形態において、確率データが使用されてもよい。例えば、サンプル中のＤＮＡ分子の出現の確率的性質、および種々の増幅および測定バイアスに起因して、２個の異なる遺伝子座から、または所与の遺伝子座にある異なる対立遺伝子から測定されたＤＮＡ分子の相対数は、必ずしも、混合物または個体における分子の相対数を表すものではない。個体の血漿からのＤＮＡを配列決定することによって、常染色体上の所与の遺伝子座での正常二倍体個体の遺伝子型を決定しようと試みる場合、たった１個の対立遺伝子（ホモ接合性）またはほぼ等しい数の２個の対立遺伝子（ヘテロ接合性）のいずれかを観測することが予測されるだろう。その対立遺伝子で、Ａ対立遺伝子の１０個の分子が観測され、Ｂ対立遺伝子の２個の分子が観測される場合、その個体が、その遺伝子座でホモ接合性であり、Ｂ対立遺伝子の２個の分子がノイズまたはコンタミネーションに起因するものであったか、またはその個体がヘテロ接合性であり、少ない方の数のＢ対立遺伝子の分子は、血漿中のＤＮＡ分子の数におけるランダムな統計的変動、増幅バイアス、コンタミネーションまたは任意の数の他の原因に起因するものであったかは、明らかではないだろう。この場合、その個体がホモ接合性であった確率と、その個体がヘテロ接合性であった対応する確率とを計算することができ、これらの確率的遺伝子型をさらなる計算に使用することができる。

なお、所与の対立遺伝子比率では、その比率が個体におけるＤＮＡ分子の比率を密接に表す尤度は、観測される分子の数が多いほど大きい。例えば、１００個のＡ分子と１００個のＢ分子を測定しようとする場合、実際の比率が５０％である尤度は、１０個のＡ分子と１０個のＢ分子を測定しようとする場合よりもかなり大きい。一実施形態において、データの詳細なモデルと組み合わせたベイズ理論を使用して、観測値を考慮して、特定の仮説が正しい尤度を決定する。例えば、トリソミー個体に対応する仮説と、ダイソミー個体に対応する仮説の２つの仮説を検討する場合、ダイソミー仮説が正しい確率は、２つの対立遺伝子のそれぞれについて１００個の分子が観測される場合の方が、２つの対立遺伝子のそれぞれについて１０個の分子が観測される場合と比較して、かなり高くなるだろう。バイアス、コンタミネーションまたはいくつかの他のノイズ源に起因してデータにノイズが増えるにつれて、または所与の遺伝子座での観測数が小さくなるにつれて、観測されたデータを考慮して、最大尤度仮説が真のものである確率は、低下する。実際には、最大尤度仮説が正しい仮説であると決定され得る信頼性を上げるために、多くの遺伝子座にわたって確率を集計することが可能である。いくつかの実施形態において、確率は、単に組換えを考慮せずに集計される。いくつかの実施形態において、計算は、クロスオーバーを考慮して行われる。

一実施形態において、確率的にフェージングされたデータを、コピー数多型の決定に使用する。いくつかの実施形態において、確率的にフェージングされたデータは、ＨａｐＭａｐデータベースなどのデータソースからの集合に基づくハプロタイプブロック頻度データである。いくつかの実施形態において、確率的にフェージングされたデータは、分子方法、例えば、染色体の個々のセグメントが、反応あたり単一分子まで希釈されるが、統計的ノイズに起因して、ハプロタイプの同一性が絶対的には知ることができないような希釈によるフェージングによって得られるハプロタイプデータである。いくつかの実施形態において、確率的にフェージングされたデータは、分子方法によって得られるハプロタイプデータであり、ハプロタイプの同一性は、高い確実性をもって知ることが可能である。

医師が、個体からの血漿ＤＮＡを測定することによって、個体が体内に特定の染色体セグメントに欠失を有するいくつかの細胞を有するかどうかを決定したいと考えたという仮想の場合を想像されたい。医師は、血漿ＤＮＡの由来となる細胞の全てが二倍体であり、同じ遺伝子型である場合、ヘテロ接合性遺伝子座について、２つの対立遺伝子座のそれぞれについて観測されるＤＮＡの相対的な分子数が、５０％のＡ対立遺伝子と５０％のＢ対立遺伝子を中心とした１つの分布に含まれるという知識を利用することができる。しかし、血漿ＤＮＡの由来となる細胞の一部が、特定の染色体セグメントに欠失を有する場合、ヘテロ接合性遺伝子座について、２つの対立遺伝子座のそれぞれについて観測されるＤＮＡの相対的な分子数が、２つの分布に含まれ、１つは、Ｂ対立遺伝子を含む染色体セグメントが欠失した遺伝子座について５０％のＡ対立遺伝子を超えたところを中心としており、１つは、Ａ対立遺伝子を含む染色体セグメントが欠失した遺伝子座について５０％未満のＡ対立遺伝子のところを中心としていると予想されるだろう。血漿ＤＮＡの由来となる細胞が欠失を含む割合が大きいほど、これらの２つの分布は、５０％からさらに離れるだろう。

この仮説の場合、個体が、個体の体内にある細胞の一部の割合で染色体領域の欠失を有するかどうかを決定したい医師を想像されたい。医師は、個体からの血液をバキュテナーまたは他の種類の血液チューブに抜き取り、血液を遠心分離し、血漿層を単離してもよい。医師は、血漿からＤＮＡを単離し、おそらく、標的化増幅または他の増幅、遺伝子座捕捉技術、サイズ濃縮または他の濃縮技術を用い、標的遺伝子座でＤＮＡを濃縮してもよい。医師は、ＳＮＰのセットで対立遺伝子の数を測定することによって、言い換えると、対立遺伝子頻度データを作成することによって、ｑＰＣＲ、配列決定、マイクロアレイ、またはサンプル中のＤＮＡの量を測定する他の技術などのアッセイを用い、濃縮および／または増幅したＤＮＡを分析してもよい。医師が標的化増幅技術を用いて無細胞血漿ＤＮＡを増幅した場合のデータ分析を検討し、次いで、増幅したＤＮＡを配列決定して、癌の指標である染色体セグメント上でみられる６個のＳＮＰで、以下の例示的な可能なデータを得て、ここで、個体は、これらのＳＮＰでヘテロ接合性であった。
ＳＮＰ１：４６０リードのＡ対立遺伝子、５４０リードのＢ対立遺伝子（４６％Ａ）
ＳＮＰ２：５３０リードのＡ対立遺伝子、４７０リードのＢ対立遺伝子（５３％Ａ）
ＳＮＰ３：４０リードのＡ対立遺伝子、６０リードのＢ対立遺伝子（４０％Ａ）
ＳＮＰ４：４６リードのＡ対立遺伝子、５４リードのＢ対立遺伝子（４６％Ａ）
ＳＮＰ５：５２０リードのＡ対立遺伝子、４８０リードのＢ対立遺伝子（５２％Ａ）
ＳＮＰ６：２００リードのＡ対立遺伝子、２００リードのＢ対立遺伝子（５０％Ａ）

このデータセットから、個体が正常であり、全ての細胞がダイソミーである場合、または個体が癌を有する可能性があり、血漿中にみられる無細胞ＤＮＡに対してＤＮＡが寄与する細胞の一部が、染色体に欠失または重複を有する場合を区別することは困難であろう。例えば、最大尤度を有する２つの仮説は、個体が、この染色体セグメントに欠失を有し、腫瘍分率が６％であり、染色体の欠失したセグメントが、（Ａ，Ｂ，Ａ，Ａ，Ｂ，Ｂ）または（Ａ，Ｂ，Ａ，Ａ，Ｂ，Ａ）の６個のＳＮＰにわたって遺伝子型を有することであってもよい。ＳＮＰのセットにわたる個体の遺伝子型のこの表現において、括弧内の１つめの文字は、ＳＮＰ１についてのハプロタイプの遺伝子型に対応し、２番目はＳＮＰ２に対応する、など。

その染色体セグメントでの個体のハプロタイプを決定する方法を使用しようとする場合、また、２つの染色体の１つについてのハプロタイプが（Ａ，Ｂ，Ａ，Ａ，Ｂ，Ｂ）であることを見出そうとし、これが最大尤度仮説に一致する場合、個体がそのセグメントに欠失を有する尤度の計算値、したがって、癌性細胞または前癌細胞を有する可能性がある尤度の計算値は、かなり大きくなるだろう。一方で、個体がハプロタイプ（Ａ，Ａ，Ａ，Ａ，Ａ，Ａ）を有することがわかった場合、個体がその染色体セグメントに欠失を有する尤度は、かなり小さくなり、おそらく、欠失を有しない仮説の尤度が高くなるだろう（実際の尤度の値は、特に、この系で測定されるノイズなどの他のパラメータに依存するだろう）。

個体のハプロタイプを決定する多くの方法が存在し、その多くは、本文書の別の箇所に記載されている。部分的なリストはここに挙げられているが、網羅的であることを意味していない。１つの方法は、それぞれの染色体領域から約１個の分子が所与の反応体積中に存在するまで、個々のＤＮＡ分子が希釈され、次いで、配列決定などの方法を使用して遺伝子型を測定する、生物学的方法である。別の方法は、種々のハプロタイプに関する集合データをその頻度と組み合わせたものを確率的な方法で使用することができる、情報学に基づく方法である。別の方法は、個体とハプロタイプブロックを共有し、ハプロタイプブロックを推論することが予想される、１名または複数名の関連する個体と共に、個体の二倍体データを測定するものである。別の方法は、高濃度の欠失または重複したセグメントを有する組織サンプルを採取し、対立遺伝子不均衡に基づいてハプロタイプを決定するものであり、例えば、欠失を有する腫瘍組織のサンプルからの遺伝子型測定を使用して、その欠失領域についてのフェージングデータを決定することができ、次いで、このデータを使用して、癌が切除後に再び成長しているかどうかを決定することができる。

実際には、典型的には、２０個より多いＳＮＰ、５０個より多いＳＮＰ、１００個より多いＳＮＰ、５００個より多いＳＮＰ、１，０００個より多いＳＮＰまたは５，０００個より多いＳＮＰが、所与の染色体セグメント上で測定される。

例示的な変異
ある疾患もしくは障害（例えば癌）またはある疾患もしくは障害（例えば癌）のリスク上昇（例えば、通常レベルのリスクより高い）に関連する例示的な変異としては、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）、複数ヌクレオチド変異、欠失（例えば、２００〜３０００万塩基対領域の欠失）、重複またはタンデムリピートが挙げられる。いくつかの実施形態において、変異は、ＤＮＡ、例えば、ｃｆＤＮＡ、無細胞ミトコンドリアＤＮＡ（ｃｆ ｍＤＮＡ）、核ＤＮＡに由来する無細胞ＤＮＡ（ｃｆ ｎＤＮＡ）、細胞ＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡの中にある。いくつかの実施形態において、変異は、ＲＮＡ、例えば、ｃｆＲＮＡ、細胞ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、コード細胞質ＲＮＡ、非コード細胞質ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはｔＲＮＡの中にある。いくつかの実施形態において、変異は、ある疾患または障害（例えば癌）を有する被験体において、その疾患または障害（例えば癌）を有さない被験体よりも高い頻度で存在する。いくつかの実施形態において、変異は、癌の指標である（例えば、原因となる変異）。いくつかの実施形態において、変異は、疾患または障害の原因的役割を有するドライバー変異である。いくつかの実施形態において、変異は、原因となる変異ではない。例えば、いくつかの癌では、複数の変異が蓄積するが、そのうちのいくつかは、原因となる変異ではない。原因とならない変異（例えば、ある疾患または障害を有する被験体において、その疾患または障害を有さない被験体よりも高い頻度で存在するもの）も、その疾患または障害を診断するのに有用であろう。いくつかの実施形態において、変異は、１つ以上のマイクロサテライトでのヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）である。

いくつかの実施形態において、被験体は、被験体が有することが知られている多くの多型または変異のうちの１つをスクリーニングする（例えば、その存在、これらの多型または変異を有する細胞、ＤＮＡまたはＲＮＡの量の変化、または癌の寛解または再発を試験するために）。いくつかの実施形態において、被験体は、被験体がリスクがあることが知られている（例えば、その多型または変異を有する血縁者を有する被験体）多くの多型または変異のうちの１つをスクリーニングする。いくつかの実施形態において、被験体は、ある疾患または障害（例えば癌）と関連する多型または変異のパネルをスクリーニングする（例えば、少なくとも５、１０、５０、１００、２００、３００、５００、７５０、１，０００、１，５００、２，０００または５，０００個の多型または変異）。

癌に関連する多くのコードバリアントは、Ａｂａａｎら、「Ｔｈｅ Ｅｘｏｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮＣＩ−６０ Ｐａｎｅｌ：Ａ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１３年７月１５日、およびｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｒａｎｃｈｅｓ／ｂｔｂ／ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎＮＣＩ６０．ｈｔｍｌでのワールドワイドウェブに記載され、それぞれ、全体として参照により本明細書に組み込まれる。ＮＣＩ−６０ヒト癌細胞株パネルは、肺、結腸、脳、卵巣、乳房、前立腺および腎臓の癌、ならびに白血病および黒色腫を表す６０種類の異なる細胞株からなる。これらの細胞株において特定された遺伝的変異は、正常な集合でみられるＩ型バリアントと、癌に特有のＩＩ型バリアントの２種類からなっていた。

例示的な多型または突然変異（例えば、欠失または重複）は、以下の遺伝子のうちの１つ以上の中にある。ＴＰ５３、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＮＲＡＳ、ＮＦ２、ＦＢＸＷ７、ＥＲＢＢｓ、ＡＴＡＤ５、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＡＬＫ、ｐ５３、ＢＲＣＡ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＳＥＴＤ２、ＬＲＰ１Ｂ、ＰＢＲＭ、ＳＰＴＡ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＧＲＩＮ２Ａ、ＴＲＲＡＰ、ＳＴＡＧ２、ＥＰＨＡ３／５／７、ＰＯＬＥ、ＳＹＮＥ１、Ｃ２０ｏｒｆ８０、ＣＳＭＤ１、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ２。ＦＢＸＷ７、ＫＩＴ、ＭＵＣ４、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＤＤＸ１１、ＤＤＸ１２、ＤＳＰＰ、ＥＰＰＫ１、ＦＡＭ１８６Ａ、ＧＮＡＳ、ＨＲＮＲ、ＫＲＴＡＰ４−１１、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＬＬ３、ＮＲＡＳ、ＲＢ１、ＳＭＡＤ４、ＴＴＮ、ＡＢＣＣ９、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＤＡＭ２９、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＧＡＰ１０、ＡＫＴ１、ＡＭＢＮ、ＡＭＰＤ２、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＡＮＫＲＤ４０、ＡＰＯＢＲ、ＡＲ、ＢＩＲＣ６、ＢＭＰ２、ＢＲＡＴ１、ＢＴＮＬ８、Ｃ１２ｏｒｆ４、Ｃ１ＱＴＮＦ７、Ｃ２０ｏｒｆ１８６、ＣＡＰＲＩＮ２、ＣＢＷＤ１、ＣＣＤＣ３０、ＣＣＤＣ９３、ＣＤ５Ｌ、ＣＤＣ２７、ＣＤＣ４２ＢＰＡ、ＣＤＨ９、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＨＤ８、ＣＨＥＫ２、ＣＨＲＮＡ９、ＣＩＺ１、ＣＬＳＰＮ、ＣＮＴＮ６、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＲＯＣＣ、ＣＴＳＦ、ＣＹＰ１Ａ２、ＤＣＬＫ１、ＤＨＤＤＳ、ＤＨＸ３２、ＤＫＫ２、ＤＬＥＣ１、ＤＮＡＨ１４、ＤＮＡＨ５、ＤＮＡＨ９、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＤＵＳＰ１６、ＤＹＮＣ２Ｈ１、ＥＣＴ２、ＥＦＨＢ、ＲＲＮ３Ｐ２、ＴＲＩＭ４９Ｂ、ＴＵＢＢ８Ｐ５、ＥＰＨＡ７、ＥＲＢＢ３、ＥＲＣＣ６、ＦＡＭ２１Ａ、ＦＡＭ２１Ｃ、ＦＣＧＢＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＧ２、ＦＬＴ１、ＦＯＬＲ２、ＦＲＹＬ、ＦＳＣＢ、ＧＡＢ１、ＧＡＢＲＡ４、ＧＡＢＲＰ、ＧＨ２、ＧＯＬＧＡ６Ｌ１、ＧＰＨＢ５、ＧＰＲ３２、ＧＰＸ５、ＧＴＦ３Ｃ３、ＨＥＣＷ１、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＲＡＳ、ＨＳ３ＳＴ１、ＨＳ６ＳＴ１、ＨＳＰＤ１、ＩＤＨ１、ＪＡＫ２、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＩＡＡ０５２８、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ３８、ＫＲＴＡＰ２１−１、ＫＲＴＡＰ４−５、ＫＲＴＡＰ４−７、ＫＲＴＡＰ５−４、ＫＲＴＡＰ５−５、ＬＡＭＡ４、ＬＡＴＳ１、ＬＭＦ１、ＬＰＡＲ４、ＬＰＰＲ４、ＬＲＲＦＩＰ１、ＬＵＭ、ＬＹＳＴ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＲＣＨ１、ＭＡＲＣＯ、ＭＢ２１Ｄ２、ＭＥＧＦ１０、ＭＭＰ１６、ＭＯＲＣ１、ＭＲＥ１１Ａ、ＭＴＭＲ３、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１７、ＭＵＣ２、ＭＵＣ２０、ＮＢＰＦ１０、ＮＢＰＦ２０、ＮＥＫ１、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＬＲＰ４、ＮＯＴＣＨ２、ＮＲＫ、ＮＵＰ９３、ＯＢＳＣＮ、ＯＲ１１Ｈ１、ＯＲ２Ｂ１１、ＯＲ２Ｍ４、ＯＲ４Ｑ３、ＯＲ５Ｄ１３、ＯＲ８Ｉ２、ＯＸＳＭ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＦ１、ＰＲＧ４、ＰＲＰＦ１９、ＰＴＨ２、ＰＴＰＲＣ、ＰＴＰＲＪ、ＲＡＣ１、ＲＡＤ５０、ＲＢＭ１２、ＲＧＰＤ３、ＲＧＳ２２、ＲＯＲ１、ＲＰ１１−６７１Ｍ２２．１、ＲＰ１３−９９６Ｆ３．４、ＲＰ１Ｌ１、ＲＳＢＮ１Ｌ、ＲＹＲ３、ＳＡＭＤ３、ＳＣＮ３Ａ、ＳＥＣ３１Ａ、ＳＦ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＬＣ２５Ａ２、ＳＬＣ４４Ａ１、ＳＬＣ４Ａ１１、ＳＭＡＤ２、ＳＰＴＡ１、ＳＴ６ＧＡＬ２、ＳＴＫ１１、ＳＺＴ２、ＴＡＦ１Ｌ、ＴＡＸ１ＢＰ１、ＴＢＰ、ＴＧＦＢＩ、ＴＩＦ１、ＴＭＥＭ１４Ｂ、ＴＭＥＭ７４、ＴＰＴＥ、ＴＲＡＰＰＣ８、ＴＲＰＳ１、ＴＸＮＤＣ６、ＵＳＰ３２、ＵＴＰ２０、ＶＡＳＮ、ＶＰＳ７２、ＷＡＳＨ３Ｐ、ＷＷＴＲ１、ＸＰＯ１、ＺＦＨＸ４、ＺＭＩＺ１、ＺＮＦ１６７、ＺＮＦ４３６、ＺＮＦ４９２、ＺＮＦ５９８、ＺＲＳＲ２、ＡＢＬ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＲＡＦ、ＡＲＦＲＰ１、ＡＲＩＤ２、ＡＳＸＬ１、ＡＴＲ、ＡＴＲＸ、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＡＸＬ、ＢＡＰ１、ＢＡＲＤ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ２、ＢＣＬ６、ＢＣＯＲ、ＢＣＯＲＬ１、ＢＬＭ、ＢＲＩＰ１、ＢＴＫ、ＣＡＲＤ１１、ＣＢＦＢ、ＣＢＬ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＣ７３、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＫ８、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＥＢＰＡ、ＣＨＥＫ１、ＣＩＣ、ＣＲＫＬ、ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＣＦ、ＣＴＮＮＡ１、ＤＡＸＸ、ＤＤＲ２、ＤＯＴ１Ｌ、ＥＭＳＹ（Ｃ１１ｏｒｆ３０）、ＥＰ３００、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＲＧ、ＥＳＲ１、ＥＺＨ２、ＦＡＭ１２３Ｂ（ＷＴＸ）、ＦＡＭ４６Ｃ、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＬ、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２３、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ６、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ３、ＦＬＴ４、ＦＯＸＬ２、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、ＧＩＤ４（Ｃ１７ｏｒｆ３９）、ＧＮＡ１１、ＧＮＡ１３、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＰＲ１２４、ＧＳＫ３Ｂ、ＨＧＦ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＫＢＫＥ、ＩＫＺＦ１、ＩＬ７Ｒ、ＩＮＨＢＡ、ＩＲＦ４、ＩＲＳ２、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＪＵＮ、ＫＡＴ６Ａ（ＭＹＳＴ３）、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＲ、ＫＥＡＰ１、ＫＬＨＬ６、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＣＬ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＤ１２、ＭＥＦ２Ｂ、ＭＥＮ１、ＭＥＴ、ＭＩＴＦ、ＭＬＨ１、ＭＬＬ、ＭＬＬ２、ＭＰＬ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＴＯＲ、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＮＦ１、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＫＸ２−１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＰＡＫ３、ＰＡＬＢ２、ＰＡＸ５、ＰＢＲＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＤＫ１、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＲＤＭ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＤＣ、ＰＴＣＨ１、ＰＴＰＮ１１、ＲＡＤ５１、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＥＴ、ＲＩＣＴＯＲ、ＲＮＦ４３、ＲＰＴＯＲ、ＲＵＮＸ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＯＣＳ１、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ２、ＳＰＥＮ、ＳＰＯＰ、ＳＲＣ、ＳＴＡＴ４、ＳＵＦＵ、ＴＥＴ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＯＰ１、ＴＰ５３、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＳＨＲ、ＶＨＬ、ＷＩＳＰ３、ＷＴ１、ＺＮＦ２１７、ＺＮＦ７０３、およびこれらの組み合わせ（Ｓｕら、Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ ２０１１、１３：７４−８４；ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｏｌｄｘ．２０１０．１１．０１０、およびＡｂａａｎら、「Ｔｈｅ Ｅｘｏｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮＣＩ−６０ Ｐａｎｅｌ：Ａ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１３年７月１５日、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、重複は、乳癌に関連付けられた染色体１ｐ（「Ｃｈｒ１ｐ」）の重複である。いくつかの実施形態において、１個以上の多型または変異は、ＢＲＡＦにあり、例えば、Ｖ６００Ｅ変異である。いくつかの実施形態において、１個以上の多型または変異は、Ｋ−ｒａｓにある。いくつかの実施形態において、Ｋ−ｒａｓおよびＡＰＣにおいて、１個以上の多型または変異の組み合わせが存在する。いくつかの実施形態において、Ｋ−ｒａｓおよびｐ５３において、１個以上の多型または変異の組み合わせが存在する。いくつかの実施形態において、ＡＰＣおよびｐ５３において、１個以上の多型または変異の組み合わせが存在する。いくつかの実施形態において、Ｋ−ｒａｓ、ＡＰＣおよびｐ５３において、１個以上の多型または変異の組み合わせが存在する。いくつかの実施形態において、Ｋ−ｒａｓおよびＥＧＦＲにおいて、１個以上の多型または変異の組み合わせが存在する。例示的な多型または変異は、以下のマイクロＲＮＡのうちの１つ以上にある。ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２およびｍｉＲ−２２３（Ｃａｌｉｎら、「Ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．」Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５３：１７９３−８０１、２００５、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

いくつかの実施形態において、欠失は、少なくとも０．０１ｋｂ、０．１ｋｂ、１ｋｂ、１０ｋｂ、１００ｋｂ、１ｍｂ、２ｍｂ、３ｍｂ、５ｍｂ、１０ｍｂ、１５ｍｂ、２０ｍｂ、３０ｍｂまたは４０ｍｂの欠失である。いくつかの実施形態において、欠失は、１ｋｂ〜４０ｍｂ、例えば、１ｋｂ〜１００ｋｂ、１００ｋｂ〜１ｍｂ、１〜５ｍｂ、５〜１０ｍｂ、１０〜１５ｍｂ、１５〜２０ｍｂ、２０〜２５ｍｂ、２５〜３０ｍｂまたは３０〜４０ｍｂ（境界値を含む）の欠失である。

いくつかの実施形態において、重複は、少なくとも０．０１ｋｂ、０．１ｋｂ、１ｋｂ、１０ｋｂ、１００ｋｂ、１ｍｂ、２ｍｂ、３ｍｂ、５ｍｂ、１０ｍｂ、１５ｍｂ、２０ｍｂ、３０ｍｂまたは４０ｍｂの重複である。いくつかの実施形態において、重複は、１ｋｂ〜４０ｍｂ、例えば、１ｋｂ〜１００ｋｂ、１００ｋｂ〜１ｍｂ、１〜５ｍｂ、５〜１０ｍｂ、１０〜１５ｍｂ、１５〜２０ｍｂ、２０〜２５ｍｂ、２５〜３０ｍｂまたは３０〜４０ｍｂ（境界値を含む）の重複である。

いくつかの実施形態において、タンデムリピートは、２〜６０ヌクレオチド、例えば、２〜６、７〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０または５０〜６０ヌクレオチド（境界値を含む）の反復である。いくつかの実施形態において、タンデムリピートは、２ヌクレオチドの反復である（ジヌクレオチドリピート）。いくつかの実施形態において、タンデムリピートは、３ヌクレオチドの反復である（トリヌクレオチドリピート）。

いくつかの実施形態において、多型または変異は、予後因子である。例示的な予後変異としては、Ｋ−ｒａｓ変異、例えば、大腸癌における手術後の疾患再発の指標であるＫ−ｒａｓ変異が挙げられる（Ｒｙａｎら、「Ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ＫＲＡＳ２ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ：ｓｔｒｏｎｇ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｉｎ ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｆｏｌｌｏｗ ｕｐ」、Ｇｕｔ ５２：１０１−１０８、２００３、およびＬｅｃｏｍｔｅ Ｔら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅ−ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＤＮＡ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ」、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １００：５４２−５４８、２００２、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

いくつかの実施形態において、多型または変異は、特定の治療に対する応答の変化（例えば、有効性または副作用の増加または減少）と関係がある。例としては、Ｋ−ｒａｓ変異は、非小細胞肺癌におけるＥＧＦＲに基づく治療に対する応答の減少と関係がある（Ｗａｎｇら、「Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ａ ｐｌａｓｍａ−ｂａｓｅｄ ＫＲＡＳ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ」、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ１６：１３２４−１３３０、２０１０、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

Ｋ−ｒａｓは、多くの癌において活性化される癌遺伝子である。例示的なＫ−ｒａｓ変異は、コドン１２、１３および６１における変異である。Ｋ−ｒａｓ ｃｆＤＮＡ変異は、膵臓癌、肺癌、大腸癌、膀胱癌および胃癌において特定されている（ＦｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒおよびＳｃｈｍｉｄｔ「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ（ＣＮＡｓ） ａｎｄ ｃａｎｅｒ−ａ ｓｕｒｖｅｙ」、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７７５：１８１−２３２、２００７、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

ｐ５３は、多くの癌において変異し、腫瘍の進行に寄与する、腫瘍抑制因子である（ＬｅｖｉｎｅおよびＯｒｅｎ 「Ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ３０ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｐ５３：ｇｒｏｗｉｎｇ ｅｖｅｒ ｍｏｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ」、９：７４９−７５８、２００９、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。多くの異なるコドンが変異を受ける場合がある（例えば、Ｓｅｒ２４９）。ｐ５３ ｃｆＤＮＡ変異は、乳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、大腸癌、腸癌および肝細胞癌において特定されている（ＦｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒおよびＳｃｈｍｉｄｔ 「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ（ＣＮＡｓ） ａｎｄ ｃａｎｅｒ−ａ ｓｕｒｖｅｙ」、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７７５：１８１−２３２、２００７、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

ＢＲＡＦは、Ｒａｓの下流にある癌遺伝子である。ＢＲＡＦ変異は、神経膠腫、黒色腫、甲状腺癌および肺癌において特定されている（Ｄｉａｓ−Ｓａｎｔａｇａｔａら、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｃｏｍｍｏｎ ｉｎ ｐｌｅｏｍｏｒｐｈｉｃ ｘａｎｔｈｏａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ：ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＰＬＯＳ ＯＮＥ ２０１１；６：ｅ１７９４８、２０１１；Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、Ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｂ−ＲＡＦ ＤＮＡ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｂｉｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ １３：２０６８−２０７４、２００７、およびＢｏａｒｄら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＢＲＡＦ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｅｎｒｏｌｌｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ＡＺＤ６２４４（ＡＲＲＹ−１４２８８６） ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐｈａｓｅ ＩＩ ｓｔｕｄｙ．Ｂｒｉｔ Ｊ Ｃａｎｃ ２００９；１０１：１７２４−１７３０、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異は、例えば、黒色腫の腫瘍において発生し、進行期において、さらに一般的である。Ｖ６００Ｅ変異は、ｃｆＤＮＡにおいて検出されている。

ＥＧＦＲは、細胞増殖に寄与し、多くの癌において調節異常が起こる（ＤｏｗｎｗａｒｄＪ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＲＡＳ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ３：１１−２２、２００３、およびＬｅｖｉｎｅおよびＯｒｅｎ 「Ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ３０ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｐ５３：ｇｒｏｗｉｎｇ ｅｖｅｒ ｍｏｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ」、９：７４９−７５８、２００９、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。例示的なＥＧＦＲ変異としては、肺癌患者において特定されたエクソン１８〜２１内の変異が挙げられる。ＥＧＦＲ ｃｆＤＮＡ変異は、肺癌患者において特定されている（Ｊｉａら、「Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ／ｐｌｅｕｒａｌ ｅｆｆｕｓｉｏｎ ｔｏ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ」、Ｊ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１０；１３６：１３４１−１３４７、２０１０、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

乳癌に関連する例示的な多型または変異としては、マイクロサテライトでのＬＯＨ（Ｋｏｈｌｅｒら、「Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒｓ」、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ８：ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７６−４５９８−８−１０５、２００９、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ｐ５３変異（例えば、エクソン５〜８内の変異）（Ｇａｒｃｉａら、Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｇｅｎｅｓ、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ＆ Ｃａｎｃｅｒ ４５：６９２−７０１、２００６、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＨＥＲ２ （Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＨＥＲ２ ＤＮＡ ａｆｔｅｒ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ」、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ３０：２４６３−２４６８、２０１０、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＰＩＫ３ＣＡ、ＭＥＤ１およびＧＡＳ６多型または変異（Ｍｕｒｔａｚａら、「Ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ」、Ｎａｔｕｒｅ ２０１３；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２０６５、２０１３、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が挙げられる。

ｃｆＤＮＡレベルの上昇およびＬＯＨは、全生存率および無疾患生存率の低下と関係がある。ｐ５３変異（エクソン５〜８）は、全生存率の低下と関係がある。循環ＨＥＲ２ ｃｆＤＮＡレベルの低下は、ＨＥＲ２陽性乳癌被験体におけるＨＥＲ２を標的とした治療に対する応答が良くなることと関係がある。ＰＩＫ３ＣＡにおける活性化変異、ＭＥＤ１のトランケーションおよびＧＡＳ６におけるスプライシング変異は、治療に対する耐性を引き起こす。

大腸癌と関連する例示的な多型または変異としては、ｐ５３、ＡＰＣ、Ｋ−ｒａｓ、ならびにチミジル酸シンターゼ変異およびｐ１６遺伝子メチル化が挙げられる（Ｗａｎｇら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＰＣ、Ｋ−ｒａｓ、ａｎｄ ｐ５３ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｓ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ」、Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｓｕｒｇ ２８：７２１−７２６、２００４、Ｒｙａｎら、「Ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ＫＲＡＳ２ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ：ｓｔｒｏｎｇ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｉｎ ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｆｏｌｌｏｗ ｕｐ」、Ｇｕｔ ５２：１０１−１０８、２００３、Ｌｅｃｏｍｔｅら、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅ−ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＤＮＡ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ」、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １００：５４２−５４８、２００２、Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂａｃｈら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｏｆ ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｏｎ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＤＮＡ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １２７：８８１−８８８、２００９、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。血清中のＫ−ｒａｓ変異の手術後の検出は、疾患再発の強力な予測因子である。Ｋ−ｒａｓ変異およびｐ１６遺伝子メチル化の検出は、生存率の低下および疾患再発の増加と関係がある。Ｋ−ｒａｓ、ＡＰＣおよび／またはｐ５３変異の検出は、再発および／または転移と関係がある。ｃｆＤＮＡを用いたチミジル酸シンターゼ（フルオロピリミジンに基づく化学療法の標的）遺伝子における多型（ＬＯＨ、ＳＮＰ、様々な数のタンデムリピートおよび欠失を含む）は、治療応答と関係がある可能性がある。

肺癌（例えば、非小細胞肺癌）と関連する例示的な多型または変異としては、Ｋ−ｒａｓ（例えば、コドン１２内の変異）およびＥＧＦＲ変異が挙げられる。例示的な予後変異としては、全生存率および無憎悪生存率の増加に関連するＥＧＦＲ変異（エクソン１９の欠失またはエクソン２１の変異）および無憎悪生存率の減少に関連するＫ−ｒａｓ変異（コドン１２および１３内）が挙げられる（Ｊｉａｎら、「Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ／ｐｌｅｕｒａｌ ｅｆｆｕｓｉｏｎ ｔｏ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ」、Ｊ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １３６：１３４１−１３４７，２０１０、Ｗａｎｇら、「Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ａ ｐｌａｓｍａ−ｂａｓｅｄ ＫＲＡＳ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ」、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ １６：１３２４−１３３０、２０１０、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。治療に対する応答の指標となる例示的な多型または変異としては、治療に対する応答を改善するＥＧＦＲ変異（エクソン１９の欠失またはエクソン２１の変異）および治療に対する応答を低下させるＫ−ｒａｓ変異（コドン１２および１３）が挙げられる。ＥＦＧＲにおいて耐性を与える変異が特定されている（Ｍｕｒｔａｚａら、「Ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ」、Ｎａｔｕｒｅ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２０６５、２０１３、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

黒色腫（例えば、ブドウ膜黒色腫）に関連する例示的な多型または変異としては、ＧＮＡＱ、ＧＮＡ１１、ＢＲＡＦおよびｐ５３が挙げられる。例示的なＧＮＡＱおよびＧＮＡ１１変異としては、Ｒ１８３およびＱ２０９変異が挙げられる。ＧＮＡＱまたはＧＮＡ１１におけるＱ２０９変異は、骨への転移と関係がある。ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異は、転移／進行期黒色腫を有する患者で検出することができる。ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅは、浸潤性黒色腫の指標である。化学療法後のＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異の存在は、治療への応答がないことと関係がある。

膵臓癌腫に関連する例示的な多型または変異としては、Ｋ−ｒａｓおよびｐ５３（例えば、ｐ５３ Ｓｅｒ２４９）における多型または変異が挙げられる。ｐ５３ Ｓｅｒ２４９は、Ｂ型肝炎感染および肝細胞癌、ならびに卵巣癌および非ホジキンリンパ腫とも関係がある。

サンプル中に低頻度で存在する多型または変異であっても、本発明の方法を用いて検出することができる。例えば、１００万分の１の頻度で存在する多型または変異は、１０００万個の配列決定リードを実施することによって、１０回観測することができる。所望な場合、配列決定リードの数は、所望な感度のレベルに応じて変更されてもよい。いくつかの実施形態において、サンプルを再分析するか、またはある被験体からの別のサンプルを、より多数の配列決定リードを用いて分析して、感度を向上させる。例えば、癌または癌のリスク上昇に関連する多型または変異が検出されないか、または少数（例えば、１、２、３、４または５）しか検出されない場合、そのサンプルを再分析するか、または別のサンプルを試験する。

いくつかの実施形態において、癌または転移癌には、複数の多型または変異が必要である。このような場合、複数の多型または変異のスクリーニングは、癌または転移癌を正確に診断する能力を向上させる。いくつかの実施形態において、被験体が、癌または転移癌に必要な複数の多型または変異の部分集合を有する場合、その被験体を後で再びスクリーニングして、その被験体がさらなる変異を獲得するかどうかを調べることができる。

複数の多型または変異が癌または転移癌に必要であるいくつかの実施形態において、それぞれの多型または変異の頻度を、同様の頻度で発生するかどうかをみるために比較することができる。例えば、２つの変異が癌に必要である（「Ａ」および「Ｂ」と示される）場合、一部の細胞は、どちらも有さず、一部の細胞はＡを有し、一部の細胞はＢを有し、一部の細胞は、ＡとＢを有する。ＡおよびＢが同様の頻度で観測される場合、被験体は、ＡとＢを両方とも有する一部の細胞を有する可能性が高い。ＡおよびＢが同様ではない頻度で観察される場合、被験体は、異なる細胞集合を有する可能性が高い。

複数の多型または変異が癌もしくは転移癌に必要であるいくつかの実施形態において、被験体に存在するこのような多型または変異の数または同一性を使用して、被験体が疾患または障害を有する可能性がどれだけ高いか、またはどれだけ早いかを予測することができる。多型または変異が特定の順序で発生する傾向があるいくつかの実施形態において、被験体が他の多型または変異を獲得したかどうかをみるために周期的に試験されてもよい。

いくつかの実施形態において、複数の多型または変異（例えば、２、３、４、５、８、１０、１２、１５またはもっと多い）の有無を決定することは、ある疾患もしくは障害（例えば癌）の有無、またはある疾患もしくは障害（例えば癌）のリスク上昇の決定の感度および／または特異性を高める。

いくつかの実施形態において、多型（複数可）または変異（複数可）は、直接的に検出される。いくつかの実施形態において、多型（複数可）または変異（複数可）は、その多型または変異に結合する１つ以上の配列（例えば、ＳＮＰなどの多型遺伝子座）の検出によって、間接的に検出される。

例示的な核酸変化
いくつかの実施形態において、ある疾患もしくは障害（例えば癌）またはある疾患もしくは障害（例えば癌）のリスク上昇に関連するＲＮＡまたはＤＮＡの完全性の変化（例えば、フラグメント化されたｃｆＲＮＡまたはｃｆＤＮＡの大きさの変化、またはヌクレオソーム組成の変化）が存在する。いくつかの実施形態において、ある疾患もしくは障害（例えば癌）またはある疾患もしくは障害（例えば癌）のリスク上昇に関連するＲＮＡまたはＤＮＡのメチル化パターンの変化（例えば、腫瘍抑制遺伝子の高メチル化）が存在する。例えば、腫瘍抑制遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧアイランドのメチル化は、局所的な遺伝子サイレンシングの引き金となることが示唆されている。ｐ１６腫瘍抑制遺伝子の異常なメチル化が、肝臓癌、肺癌および乳癌を有する被験体で生じる。他の頻繁にメチル化される腫瘍抑制遺伝子（ＡＰＣ、Ｒａｓ結合ドメインファミリータンパク質１Ａ（ＲＡＳＳＦ１Ａ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ１（ＧＳＴＰ１）およびＤＡＰＫを含む）は、様々な種類の癌、例えば、鼻咽頭癌腫、大腸癌、肺癌、食道癌、前立腺癌、膀胱癌、黒色腫および急性白血病で検出されてきた。特定の腫瘍抑制遺伝子（例えばｐ１６）のメチル化は、癌形成における早期のイベントとして記載されているため、早期の癌スクリーニングに有用である。

いくつかの実施形態において、メチル化感受性制限酵素消化を用いた重亜硫酸塩変換または非重亜硫酸塩に基づく戦略を使用して、メチル化パターンを決定する（Ｈｕｎｇら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ ６２：３０８−３１３、２００９、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。重亜硫酸塩変換では、メチル化されたシトシンはシトシンとして残り、一方、メチル化されていないシトシンはウラシルに変換される。メチル化感受性制限酵素（例えば、ＢｓｔＵＩ）は、特定の認識部位（例えば、ＢｓｔＵＩの場合は５’−ＣＧ Ｖ ＣＧ−３’）で、メチル化されていないＤＮＡ配列を開裂し、一方、メチル化された配列は、反応を受けない。いくつかの実施形態において、反応を受けなかったメチル化配列が検出される。いくつかの実施形態において、ステムループプライマーを使用して、酵素で消化されないメチル化ＤＮＡを一緒に増幅させることなく、制限酵素で消化されたメチル化されていないフラグメントを選択的に増幅する。

ｍＲＮＡスプライシングの例示的な変化
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡスプライシングの変化は、ある疾患もしくは障害（例えば癌）またはある疾患もしくは障害（例えば癌）のリスク上昇に関連する。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡスプライシングの変化は、癌または癌のリスク上昇に関連する以下の核酸のうちの１つ以上において生じる。ＤＮＭＴ３Ｂ、ＢＲＣＡ１、ＫＬＦ６、ＲｏｎまたはＧｅｍｉｎ５。いくつかの実施形態において、検出されたｍＲＮＡスプライスバリアントは、ある疾患または障害（例えば癌）に関連する。いくつかの実施形態において、複数のｍＲＮＡスプライスバリアントは、健康な細胞（例えば、非癌性細胞）によって作られるが、ｍＲＮＡスプライスバリアントの相対量の変化は、ある疾患または障害（例えば癌）に関連する。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡスプライシングの変化は、ｍＲＮＡ配列の変化（例えば、スプライス部位中の変異）、スプライシング因子レベルの変化、利用可能なスプライシング因子の量の変化（例えば、反復に対するスプライシング因子の結合に起因する利用可能なスプライシング因子の量の減少）、スプライシング調節の変化または腫瘍の微小環境に起因する。

スプライシング反応は、スプライセオソームと呼ばれる複数タンパク質／ＲＮＡ複合体によって行われる（Ｆａｃｋｅｎｔｈａｌ１およびＧｏｄｌｅｙ、Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ＆ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ １：３７−４２、２００８、ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｍｍ．０００３３１、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。スプライセオソームは、イントロン−エクソン境界を認識し、２つのエステル交換反応を介して、介在するイントロンを除去し、２つの隣接するエクソンをライゲーションする。この反応の忠実さは、絶妙なものでなければならない。なぜなら、ライゲーションが不正確に起こると、正常なタンパク質コード能力が損なわれる場合があるからである。例えば、エクソンスキッピングが、翻訳中のアミノ酸の同一性および順序を示すトリプレットコドンのリーディングフレームを保存する場合、選択的スプライシングされるｍＲＮＡは、重要なアミノ酸残基を欠くタンパク質を示す場合がある。より一般的に、エクソンスキッピングは、翻訳リーディングフレームを乱し、未成熟終止コドンを生じる。これらのｍＲＮＡは、典型的には、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解として知られるプロセスによって少なくとも９０％が分解され、このような欠陥のあるメッセージが蓄積して、トランケーションされたタンパク質産物を生成する尤度を小さくする。誤ってスプライシングされたｍＲＮＡがこの経路から外れる場合、トランケーションされ、変異され、または不安定なタンパク質が産生する。

選択的スプライシングは、同じゲノムＤＮＡから、いくつかまたは多くの異なる転写物を発現する手段であり、特定のタンパク質について利用可能なエクソンの部分集合を含むことから生じる。１つ以上のエクソンを除外することによって、特定のタンパク質ドメインは、コードされるタンパク質から失われる場合があり、タンパク質機能の消失または増加を引き起こす場合がある。いくつかの種類の選択的スプライシングが記載されている。エクソンスキッピング、代替の５’または３’スプライス部位、相互排他的なエクソン、さらに、かなりまれだが、イントロン保持。他者は、バイオインフォマティクス手法を用い、癌における選択的スプライシングの量を正常細胞と比較し、癌が正常細胞よりも低レベルの選択スプライシングを示すことを決定した。さらに、選択スプライシングイベントの種類の分布は、癌細胞と正常細胞とでは異なっていた。癌細胞は、正常細胞よりも、エクソンスキッピングが少なかったが、より多くの代替の５’または３’スプライス部位選択およびイントロン保持を示した。エクソン化の現象（他の組織によってイントロンとして主に使用される、エクソンとしての配列の使用）を調べると、癌細胞においてエクソン化に関連する遺伝子は、ｍＲＮＡプロセシングと優先的に関連付けられ、このことは、癌細胞と異常なｍＲＮＡスプライス形態の生成との間の直接的なつながりを示している。

ＤＮＡまたはＲＮＡレベルの例示的な変化
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ、ｃｆ ｍＤＮＡ、ｃｆ ｎＤＮＡ、細胞ＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡ）またはＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ、細胞ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、コード細胞質ＲＮＡ、非コード細胞質ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはｔＲＮＡ）のうちの１つ以上の種類の合計量または濃度の変化が存在する。いくつかの実施形態において、１つ以上の特定のＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ、ｃｆ ｍＤＮＡ、ｃｆ ｎＤＮＡ、細胞ＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡ）またはＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ、細胞ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、コード細胞質ＲＮＡ、非コード細胞質ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはｔＲＮＡ）分子の量または濃度の変化が存在する。いくつかの実施形態において、１つの対立遺伝子は、目的の遺伝子座の別の対立遺伝子よりも多く発現される。例示的なｍｉＲＮＡは、遺伝子の発現を調節する短い２０〜２２ヌクレオチドのＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、トランスクリプトームの変化、例えば、１つ以上のＲＮＡ分子の同一性または量の変化が存在する。

いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡの合計量または濃度の変化は、ある疾患もしくは障害（例えば癌）またはある疾患もしくは障害（例えば癌）のリスク上昇に関連する。いくつかの実施形態では、ある種のＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ、ｃｆ ｍＤＮＡ、ｃｆ ｎＤＮＡ、細胞ＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡ）またはＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ、細胞ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、コード細胞質ＲＮＡ、非コード細胞質ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはｔＲＮＡ）の合計濃度は、健康な（例えば、非癌性）被験体のその種類のＤＮＡまたはＲＮＡの合計濃度と比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、またはもっと多く増加する。いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡの合計濃度が７５〜１００ｎｇ／ｍＬ、１００〜１５０ｎｇ／ｍＬ、１５０〜２００ｎｇ／ｍＬ、２００〜３００ｎｇ／ｍＬ、３００〜４００ｎｇ／ｍｇＬ、４００〜６００ｎｇ／ｍＬ、６００〜８００ｎｇ／ｍＬ、８００〜１，０００ｎｇ／ｍＬ（境界値を含む）であること、またはｃｆＤＮＡの合計濃度が１００ｎｇ／ｍＬより高く、例えば、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００ｎｇ／ｍＬより高いことは、癌、癌のリスク上昇、良性ではなく悪性の腫瘍のリスク上昇、癌が寛解に向かう可能性の低下、または癌の予後の悪化の指標である。いくつかの実施形態では、ある疾患もしくは障害（例えば癌）、またはある疾患もしくは障害（例えば癌）のリスク上昇に関連する１つ以上の多型または変異（例えば、欠失または重複）を有するある種のＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ、ｃｆ ｍＤＮＡ、ｃｆ ｎＤＮＡ、細胞ＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡ）またはＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ、細胞ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、コード細胞質ＲＮＡ、非コード細胞質ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはｔＲＮＡ）の量は、この種のＤＮＡまたはＲＮＡの合計量の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０または２５％である。いくつかの実施形態において、ある種のＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ、ｃｆ ｍＤＮＡ、ｃｆ ｎＤＮＡ、細胞ＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡ）またはＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ、細胞ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、コード細胞質ＲＮＡ、非コード細胞質ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはｔＲＮＡ）の合計量の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０または２５％は、ある疾患もしくは障害（例えば癌）、またはある疾患もしくは障害（例えば癌）のリスク上昇に関連する特定の多型または変異（例えば、欠失または重複）を有する。

いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡは、封入される。いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡは、封入されない。

いくつかの実施形態において、総ＤＮＡ中の腫瘍ＤＮＡの分率（例えば、総ｃｆＤＮＡ中の腫瘍ｃｆＤＮＡの分率または総ｃｆＤＮＡ中の特定の変異を有する腫瘍ｃｆＤＮＡの分率）が決定される。いくつかの実施形態において、腫瘍ＤＮＡの分率は、複数の変異について決定されてもよく、変異は、単一ヌクレオチドバリアント、コピー数多型、異なるメチル化、またはこれらの組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態において、腫瘍分率の計算値が最も高い１つの変異または変異のセットについて計算された平均腫瘍分率は、サンプル中の実際の腫瘍分率であるとされる。いくつかの実施形態において、全ての変異について計算された平均腫瘍分率は、サンプル中の実際の腫瘍分率であるとされる。いくつかの実施形態において、この腫瘍分率を使用して、癌のステージを決定する（より高い腫瘍分率は、より進行したステージの癌と関連するため）。いくつかの実施形態において、より大きな腫瘍は、血漿中の腫瘍ＤＮＡの分率と相関関係がある可能性があるため、腫瘍分率を使用して、癌の大きさを決定する。いくつかの実施形態において、血漿サンプル中の腫瘍分率の測定値と所与の変異（複数可）遺伝子型を有する組織の大きさとの間に相関関係がある可能性があるため、腫瘍分率を使用して、単一または複数の変異から影響を受けている腫瘍の割合の大きさを決定する。例えば、所与の変異遺伝子型を有する組織の大きさは、特定の変異に焦点をあてることによって計算され得る腫瘍ＤＮＡの分率と相関関係がある可能性がある。

例示的なデータベース
本発明は、本発明の方法からの１つ以上の結果を含むデータベースも特徴とする。例えば、データベースは、１名以上の被験体についての以下の情報のいずれかを含む記録を含んでいてもよい。特定される任意の多型／変異（例えばＣＮＶ）、多型／変異と、ある疾患もしくは障害またはある疾患もしくは障害のリスク上昇との任意の既知の関連性、コードされたｍＲＮＡまたはタンパク質の発現または活性レベルに対する多型／変異の影響、サンプル中の総ＤＮＡ、ＲＮＡまたは細胞の中で、ある疾患もしくは障害に関連するＤＮＡ、ＲＮＡまたは細胞（例えば、ある疾患または障害に関連する多型／変異を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたは細胞）の分率、多型／変異を特定するために使用されるサンプルの供給源（例えば、血液サンプル、または特定の組織からのサンプル）、疾患細胞の数、後で試験を繰り返して得られた結果（例えば、その疾患または障害の進行または寛解をモニタリングするための試験を繰り返す）、その疾患または障害についての他の試験の結果、被験体が診断された疾患または障害の種類、行われる治療、このような治療に対する応答、このような治療の副作用、症状（例えば、その疾患または障害に関連する症状）、寛解の期間および回数、生存期間（例えば、最初の試験から死亡するまでの期間、または診断から死亡するまでの期間）、死因、およびこれらの組み合わせ。

いくつかの実施形態において、データベースは、１名以上の被験体についての以下の情報のいずれかを含む記録を含む。特定される任意の多型／変異、多型／変異と、癌または癌のリスク上昇との任意の既知の関連性、コードされたｍＲＮＡまたはタンパク質の発現または活性レベルに対する多型／変異の影響、サンプル中の総ＤＮＡ、ＲＮＡまたは細胞の中で、癌性ＤＮＡ、ＲＮＡまたは細胞の分率、多型／変異を特定するために使用されるサンプルの供給源（例えば、血液サンプル、または特定の組織からのサンプル）、癌性細胞の数、腫瘍の大きさ、後で試験を繰り返して得られた結果（例えば、癌の進行または寛解をモニタリングするための試験を繰り返す）、癌についての他の試験の結果、被験体が診断された癌の種類、行われる治療、このような治療に対する応答、このような治療の副作用、症状（例えば、癌に関連する症状）、寛解の期間および回数、生存期間（例えば、最初の試験から死亡するまでの期間、または癌診断から死亡するまでの期間）、死因、およびこれらの組み合わせ。いくつかの実施形態において、治療に対する応答は、以下のいずれかを含む。腫瘍（例えば、良性または癌性腫瘍）の大きさが小さくなるか、または安定化すること、腫瘍の大きさの増加が遅くなるか、または防がれること、腫瘍細胞数が減るか、または安定化すること、腫瘍の消失とその再出減との間の無疾患生存期間が長くなること、腫瘍の初期またはその後の発生が防がれること、腫瘍に関連する有害な症状が減るか、または安定化すること、またはこれらの組み合わせ。いくつかの実施形態において、ある疾患または障害（例えば癌）についての１つ以上の他の試験、例えば、組織サンプルのスクリーニング検査、医学的画像診断または顕微鏡検査の結果が含まれる。

このような一態様において、本発明は、少なくとも５、１０、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、またはもっと多くの記録を含む電子データベースを特徴とする。いくつかの実施形態において、データベースは、少なくとも５、１０、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、またはもっと多くの異なる被験体についての記録を有する。

別の態様において、本発明は、本発明のデータベースと、ユーザインターフェースとを含むコンピュータを特徴とする。いくつかの実施形態において、ユーザインターフェースは、１つ以上の記録に含まれる情報の一部または全てを表示することが可能である。いくつかの実施形態において、ユーザインターフェースは、（ｉ）記録がコンピュータに保存される、多型または変異を含むと特定された１種類以上の癌、（ｉｉ）記録がコンピュータに保存される、特定の種類の癌において特定された１つ以上の多型または変異、（ｉｉｉ）記録がコンピュータに保存される、特定の種類の癌または特定の多型または変異についての予後情報、（ｉｖ）記録がコンピュータに保存される、多型または変異を有する癌に有用な１つ以上の化合物または他の治療、（ｖ）記録がコンピュータに保存される、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現または活性を調節する１つ以上の化合物、および（ｖｉ）記録がコンピュータに保存される、発現または活性が化合物によって調節される１つ以上のｍＲＮＡ分子またはタンパク質を表示することができる。コンピュータの内部構成要素は、典型的には、メモリに接続するプロセッサを含む。外部構成要素は、通常、マスストレージデバイス（例えば、ハードディスクドライブ）、ユーザ入力デバイス（例えば、キーボードおよびマウス）、ディスプレイ（例えば、モニタ）と、場合により、コンピュータシステムを他のコンピュータに接続してデータの共有およびタスクの処理を可能にすることができるネットワークリンクを含む。プログラムは、操作中に、このシステムのメモリにロードされてもよい。

別の態様において、本発明は、本発明の方法のいずれかの１つ以上の工程を含む、コンピュータに実装されたプロセスを特徴とする。

例示的なリスク因子
いくつかの実施形態において、被験体は、ある疾患または障害（例えば癌）の１つ以上のリスク因子についても評価される。例示的なリスク因子としては、その疾患または障害の家族歴、生活習慣（例えば、喫煙および発癌物質への曝露）、１つ以上のホルモンまたは血清タンパク質のレベル（例えば、肝臓癌におけるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、大腸癌における癌胎児性抗原（ＣＥＡ）または前立腺癌における前立腺特異抗原（ＰＳＡ））が挙げられる。いくつかの実施形態において、腫瘍の大きさおよび／または数が測定され、被験体の予後を決定するか、または被験体の治療を選択する際に使用される。

例示的なスクリーニング方法
所望な場合、ある疾患もしくは障害（例えば癌）の有無を確認することができるか、またはある疾患もしくは障害（例えば癌）は、任意の標準的な方法を用いて分類することができる。例えば、ある疾患または障害（例えば癌）は、特定の徴候および症状、腫瘍生検、スクリーニング検査または医学的画像診断（例えば、マンモグラムまたは超音波）を含む、いくつかの方法で検出することができる。可能性のある癌が検出されたら、組織サンプルの顕微鏡検査によって診断されてもよい。いくつかの実施形態において、診断される被験体は、本発明の方法またはその疾患または障害のための既知の検査を用い、複数のタイムポイントで繰り返し検査を受け、その疾患または障害の進行またはその疾患または障害の寛解または再発をモニタリングする。

例示的な癌
治療に対する応答を本発明の方法のいずれかを使用して予測またはモニタリングすることを可能にするために、診断され、予後判断され、安定化され、治療され、予防されることが可能な例示的な癌としては、固形腫瘍、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、生殖細胞腫瘍または胚芽腫が挙げられる。種々の実施形態において、癌は、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌腫、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫（例えば、小児小脳または大脳の星細胞腫）、基底細胞癌腫、胆管癌（例えば、肝外胆管癌）、膀胱癌、骨腫瘍（例えば、骨肉腫または悪性線維性組織球腫）、脳幹グリオーマ、脳癌（例えば、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性グリオーマ、上衣芽細胞腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、または視覚伝導路および視床下部グリオーマ）、膠芽細胞腫、乳癌、気管支腺腫またはカルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（例えば、小児または胃腸管のカルチノイド腫瘍）、癌腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫または悪性グリオーマ（例えば、小児小脳星細胞腫または悪性グリオーマ）、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、線維形成性小細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、ユーイングファミリーの腫瘍中の腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍（例えば、小児頭蓋外胚細胞腫瘍）、性腺外胚細胞腫瘍、眼の癌（例えば、眼内黒色腫または網膜芽細胞腫の眼の癌）、胆嚢癌、胃癌、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、胚細胞腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外または卵巣胚細胞腫瘍）、妊娠性絨毛腫瘍、グリオーマ（例えば、脳幹、小児大脳星細胞腫、または小児視覚伝導路および視床下部グリオーマ）、胃カルチノイド、有毛細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視覚伝導路グリオーマ（例えば、小児視覚伝導路グリオーマ）、島細胞癌腫（例えば、内分泌または膵臓島細胞癌腫）、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、白血病（例えば、急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ性、慢性骨髄性または有毛細胞白血病）、口唇または口腔癌、脂肪肉腫、肝臓癌（例えば、非小細胞または小細胞癌）、肺癌、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連、バーキット、皮膚Ｔ細胞、ホジキン、非ホジキン、または中枢神経系リンパ腫）、マクログロブリン血症（例えば、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫または骨肉腫、髄芽腫（例えば、小児髄芽腫）、黒色腫、メルケル細胞癌腫、中皮腫（例えば、成人または小児の中皮腫）、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、口癌（ｍｏｕｔｈ ｃａｎｃｅｒ）、多発性内分泌腫瘍症候群（例えば、小児多発性内分泌腫瘍症候群）、多発性骨髄腫または形質細胞腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性新生物または骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病（例えば、慢性骨髄性白血病）、骨髄性白血病（例えば、成人急性または小児急性骨髄性白血病）、骨髄増殖性障害（例えば、慢性骨髄増殖性障害）、鼻腔または副鼻腔癌、鼻咽頭癌腫、神経芽細胞腫、口癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口咽頭癌、骨肉腫または骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌（例えば、膵島細胞癌）、副鼻腔または鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星細胞腫、松果体ジャーミノーマ、松果体芽腫またはテント上原始神経外胚葉性腫瘍（例えば、小児松果体芽腫またはテント上原始神経外胚葉性腫瘍）、下垂体腺腫、形質細胞腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、癌、直腸癌、腎細胞癌腫、腎盂または尿管癌（例えば、腎盂または尿管移行上皮癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（例えば、小児横紋筋肉腫）、唾液腺癌、肉腫（例えば、ユーイングファミリーの腫瘍中の腫瘍における肉腫、カポジ、軟組織または子宮肉腫）、セザリー症候群、皮膚癌（例えば、非黒色腫、黒色腫またはメルケル細胞皮膚癌）、小腸癌、扁平上皮癌腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍（例えば、小児テント上原始神経外胚葉性腫瘍）、Ｔ細胞リンパ腫（例えば、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫）、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫（例えば、小児胸腺腫）、胸腺腫または胸腺癌腫、甲状腺癌（例えば、小児甲状腺癌）、絨毛性腫瘍（例えば、妊娠性絨毛腫瘍）、原発部位不明癌腫（例えば、成人または小児の原発部位不明癌腫）、尿道癌（例えば、子宮体癌）、子宮肉腫、膣癌、視覚伝導路または視床下部グリオーマ（例えば、小児視覚伝導路または視床下部グリオーマ）、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、またはウィルムス腫瘍（例えば、小児ウィルムス腫瘍）である。種々の実施形態において、癌は、転移しているか、または転移していない。

癌は、ホルモンが関連する癌またはホルモン依存性癌（例えば、エストロゲンまたはアンドロゲンが関連する癌）であってもよく、そうでなくてもよい。良性腫瘍または悪性腫瘍は、本発明の方法および／または組成物を使用して、診断され、予後判断され、安定化され、治療され、予防されてもよい。

いくつかの実施形態において、被験体は、癌症候群を有する。癌症候群は、１つ以上の遺伝子中の遺伝子変異が、罹患した個体で癌が発症する素因である、遺伝性障害であり、これらの癌の早期発症を引き起こす可能性もある。癌症候群は、癌を発症する生涯リスクが高いだけではなく、複数の独立した原発性腫瘍の発症も示すことが多い。これらの症候群の多くは、腫瘍抑制遺伝子、細胞が癌性化しないように保護することに関与する遺伝子の変異によって引き起こされる。影響を受け得る他の遺伝子は、ＤＮＡ修復遺伝子、癌遺伝子、および血管の産生（血管新生）に関与する遺伝子である。遺伝性癌症候群の一般的な例は、遺伝性乳癌卵巣癌症候群および遺伝性非ポリオーシス結腸癌（リンチ症候群）である。

いくつかの実施形態において、１つ以上の多型または変異ｎ Ｋ−ｒａｓ、ｐ５３、ＢＲＡ、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２を有する被験体は、それぞれ、Ｋ−ｒａｓ、ｐ５３、ＢＲＡ、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２を標的とする治療が行われる。

本発明の方法は、一般的に、任意の細胞、組織または臓器型の悪性または良性の腫瘍の治療に適用することができる。

例示的な治療
所望な場合、ある疾患もしくは障害（例えば癌）、またはある疾患もしくは障害（例えば癌）のリスク上昇を安定化し、治療するか、または予防するための任意の治療を、被験体（例えば、本発明の方法のいずれかを用いて、癌または癌のリスク上昇を有すると特定された被験体）に行うことができる。種々の実施形態において、治療は、ある疾患または障害（例えば癌）のための既知の治療または治療の組み合わせであり、限定されないが、細胞毒性薬、標的療法、免疫療法、ホルモン療法、放射線療法、癌性細胞または癌性になる可能性が高い細胞の手術による除去、幹細胞移植、骨髄移植、光力学療法、緩和治療、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、治療（例えば、予防内服）を使用して、ある疾患または障害（例えば癌）のリスクが上昇した被験体において、ある疾患または障害（例えば癌）を予防し、遅らせ、または重篤度を下げる。いくつかの実施形態において、治療は、手術、ファーストライン化学療法、アジュバント療法またはネオアジュバント療法である。

いくつかの実施形態において、標的療法は、癌の成長および生存に寄与する癌固有の遺伝子、タンパク質、または組織環境を標的とする治療である。この種の治療は、正常細胞への損傷を制限しつつ、癌細胞の成長および広がりを遮断し、通常は、他の癌治療薬よりも副作用が少なくなる。

より成功した手法の１つは、血管新生（腫瘍周囲の新しい血管の成長）を標的とすることであった。標的療法、例えば、ベバシズマブ（アバスチン）、レナリドミド（レブラミド）、ソラフェニブ（ネクサバール）、スニチニブ（スーテント）およびサリドマイド（サロミド）は、血管新生を妨害する。別の例は、ＨＥＲ２を過剰発現する癌（例えば、ある種の乳癌）について、ＨＥＲ２を標的とする治療、例えば、トラスツズマブまたはラパチニブの使用である。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体を使用して、癌細胞の外側にある特異的標的を遮断する。例としては、アレムツズマブ（カンパス−１Ｈ）、ベバシズマブ、セツキシマブ（エルビタックス）、パニツムマブ（ベクティビックス）、ペルツズマブ（オムニターグ）、リツキシマブ（リツキサン）およびトラスツズマブが挙げられる。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体であるトシツモマブ（ベキサール）を使用して、腫瘍に放射線を送達する。いくつかの実施形態において、経口低分子は、癌細胞内部の癌プロセスを阻害する。例としては、ダサチニブ（スプリセル）、エルロチニブ（タルセバ）、ゲフィチニブ（イレッサ）、イマチニブ（グリーベック）、ラパチニブ（タイケルブ）、ニロチニブ（タシグナ）、ソラフェニブ、スニチニブおよびテムシロリムス（トーリセル）が挙げられる。いくつかの実施形態において、プロテアソーム阻害剤（例えば、多発性骨髄腫薬ボルテゾミブ（ベルケイド））は、特殊タンパク質と呼ばれる、細胞内の他のタンパク質を分解する酵素を妨害する。

いくつかの実施形態において、免疫療法は、癌と戦うために身体の自然防御を高めるように設計される。例示的な種類の免疫療法は、免疫システム機能を増強し、標的とし、または回復するために、体内または研究所のいずれかで作られた物質を使用する。

いくつかの実施形態において、ホルモン療法は、体内のホルモンの量を減少させることによって癌を治療する。ある種の乳癌および前立腺癌を含むいくつかの種類の癌は、ホルモンと呼ばれる体内の天然化学物質の存在下でのみ成長し、広がる。種々の実施形態において、ホルモン療法は、前立腺、乳房、甲状腺および生殖系の癌を治療するために使用される。

いくつかの実施形態において、治療は、疾患骨髄が造血幹細胞と呼ばれる高度に専門化した細胞によって置き換えられる幹細胞移植を含む。造血幹細胞は、血液と骨髄の両方にみられる。

いくつかの実施形態において、治療は、光増感剤と呼ばれる特殊な薬物を光と共に用いて癌細胞を死滅させる光力学療法を含む。この薬物は、特定の種類の光によって活性化された後に作用する。

いくつかの実施形態において、治療は、癌性細胞または癌性になる可能性が高い細胞の外科的除去（例えば、腫瘍摘出術または乳房切除）を含む。例えば、乳癌感受性遺伝子変異（ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２遺伝子変異）を有する女性は、卵管卵巣摘出（卵管および卵巣の除去）を減らすリスクおよび／または両側乳房切除術（両方の乳房の除去）を減らすリスクを有する乳癌および卵巣癌のリスクを減らし得る。いくつかの癌を治療することを含め、非常に慎重な手術作業のために、非常に強力で精密な光の束であるレーザを、刃物（メス）の代わりに使用することができる。

癌を遅らせ、停止させ、または除去するための治療（疾患指向治療とも呼ばれる）に加え、癌の治療の重要な部分は、被験体の症状および副作用（例えば、疼痛および吐き気）を緩和することである。緩和ケアまたは支援ケアと呼ばれる手法で、身体的、感情的および社会的な需要を有する被験体をサポートすることを含む。人々は、疾患指向療法と、症状をやわらげるための治療を同時に受けることが多い。

例示的な治療としては、アクチノマイシンＤ、アドセトリス、アドリアマイシン、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリムタ、アムシジン、アムサクリン、アナストロゾール、アレディア、アリミデックス、アロマシン、アスパラギナーゼ、アバスチン、ベバシズマブ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボンドロナット、ボネフォス、ボルテゾミブ、ブシルベックス、ブスルファン、カンプト、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、カソデックス、セツキシマブ、チマックス（ｃｈｉｍａｘ）、クロラムブシル、シメチジン、シスプラチン、クラドリビン、クロドロン酸、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、酢酸シプロテロン、シプロスタット、シタラビン、シトキサン、ダカルボジン（ｄａｃａｒｂｏｚｉｎｅ）、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、デキサメタゾン、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロゲニル、エムシット、エピルビシン、エポシン、エルビタックス、エルロチニブ、エストラシット、エストラムスチン、エトポホス、エトポシド、エボルトラ、エキセメスタン、フェアストン、フェマーラ、フィルグラスチム、フルダラ、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、ゲフィニチブ、ゲムシタビン、ジェムザール、グリーベック、グリベック、ゴナペプチルデポ、ゴセレリン、ハラヴェン、ハーセプチン、ハイカムプチン、ヒドロキシカルバミド、イバンドロン酸、イブリツモマブ、イダルビシン、イフォスフォミド、インターフェロン、イマチニブメシル酸塩、イレッサ、イリノテカン、ジェブタナ、ランビス、ラパチニブ、レトロゾール、リューケラン、リュープロレリン、ロイスタット、ロムスチン、マブキャンパス、マブセラ、メガス、メゲストロール、メトトレキサート、ミトキサントロン、マイトマイシン、ムツラン（ｍｕｔｕｌａｎｅ）、ミレラン、ナベルビン、ニューラスタ、ニューポジェン、ネクサバール、ニペント、ノルバデックスＤ、ノバントロン、オンコビン、パクリタキセル、パミドロン酸、ＰＣＶ、ペメトレキセド、ペントスタチン、パージェタ、プロカルバジン、プロベンジ、プレドニゾロン、プロストラップ、ラルチトレキセド、リツキシマブ、スプリセル、ソラフェニブ、ソルタモックス、ストレプトゾトシン、スチルベストロール、スチムバックス、スニチニブ、スーテント、タブロイド、タガメット、タモフェン、タモキシフェン、タルセバ、タキソール、タキソテール、ウラシル含有テガフール、テモダール、テモゾロミド、サリドマイド、チオプレックス、チオテパ、チオグアニン、トムデックス、トポテカン、トレミフェン、トラスツズマブ、トレチノイン、トレオサルファン、トリエチレンチオホスホラミド、トリプトレリン、チバブ、ウフトラル（ｕｆｔｏｒａｌ）、ベルケイド、ベプシド、ベサノイド、ビンクリスチン、ビノレルビン、ザーコリ、ゼローダ、ヤーボイ、ザクティマ、ザノサー、ザベドス、ゼベリン、ゾラデックス、ゾレドロネート、ゾメタゾレドロン酸およびジチガが挙げられる。

いくつかの実施形態において、癌は乳癌であり、個体に投与される治療または化合物は、以下のうちの１つ以上である。アベマシクリブ、アブラキサン（パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤）、アドトラスツズマブエムタンシン、アフィニトール（エベロリムス）、アナストロゾール、アレディア（パミドロン酸二ナトリウム）、アリミデックス（アナストロゾール）、アロマシン（エキセメスタン）、カペシタビン、シクロホスファミド、ドセタキセル、ドキソルビシン塩酸塩、エレンス（エピルビシン塩酸塩）、エピルビシン塩酸塩、エリブリンメシル酸塩、エベロリムス、エキセメスタン、５−ＦＵ（フルオロウラシル注射液）、フェアストン（トレミフェン）、フェソロデックス（フルベストラント）、フェマーラ（レトロゾール）、フルオロウラシル注射液、フルベストラント、ゲムシタビン塩酸塩、ジェムザール（ゲムシタビン塩酸塩）、ゴセレリン酢酸塩、ハラヴェン（エリブリンメシル酸塩）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、イブランス（パルボシクリブ）、イクサベピロン、イグゼンプラ（イクサベピロン）、カドサイラ（アドトラスツズマブエムタンシン）、キスカリ（リボシクリブ）、ラパチニブトシル酸塩、レトロゾール、リムパーザ（オラパリブ）、酢酸メゲストロール、メトトレキサート、ネラチニブマレイン酸塩、ネルリンクス（ネラチニブマレイン酸塩）、オラパリブ、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤、パルボシクリブ、パミドロン酸二ナトリウム、パージェタ（ペルツズマブ）、ペルツズマブ、リボシクリブ、タモキシフェンクエン酸塩、タキソール（パクリタキセル）、タキソテール（ドセタキセル）、チオテパ、トレミフェン、トラスツズマブ、トレキサール（メトトレキサート）、タイケルブ（ラパチニブトシル酸塩）、ベージニオ（アベマシクリブ）、ビンブラスチン硫酸塩、ゼローダ（カペシタビン）、ゾラデックス（ゴセレリン酢酸塩）、エビスタ（ラロキシフェン塩酸塩）、ラロキシフェン塩酸塩、タモキシフェンクエン酸塩。いくつかの実施形態において、癌は乳癌であり、個体に投与される治療または化合物は、以下から選択される組み合わせである。ドキソルビシン塩酸塩（アドリアマイシン）およびシクロホスファミド；ドキソルビシン塩酸塩（アドリアマイシン）、シクロホスファミドおよびパクリタキセル（タキソール）；ドキソルビシン塩酸塩（アドリアマイシン）、シクロホスファミドおよびフルオロウラシル；メトトレキサート、シクロホスファミドおよびフルオロウラシル；エピルビシン塩酸塩、シクロホスファミドおよびフルオロウラシル；ならびにドキソルビシン塩酸塩（アドリアマイシン）、シクロホスファミドおよびドセタキセル（タキソテール）。

ｍＲＮＡまたはタンパク質の変異体形態（例えば、癌に関連する形態）および野生型形態（例えば、癌に関連しない形態）の両方を発現する被験体について、治療は、好ましくは、野生型形態の発現または活性を阻害するのよりさらに少なくとも２倍、５倍、１０倍または２０倍多く変異体形態の発現または活性を阻害する。複数の治療薬の同時使用または逐次使用は、癌の発生を大幅に減らし、治療に対して耐性となる治療される癌の数を減らし得る。これに加えて、併用療法の一部として使用される治療薬は、癌を治療するために、治療薬を単独で使用する場合に必要な対応する用量よりも低い用量しか必要としないだろう。併用療法における各化合物の用量が低いことは、その化合物からの潜在的な有害な副作用の重篤度を下げる。

いくつかの実施形態において、癌のリスクが上昇していると特定された被験体は、本発明または任意の標準的な方法によって、特定のリスク因子を避けてもよく、または癌の任意のさらなるリスクを減らすために生活習慣を変えてもよい。

いくつかの実施形態において、多型、変異、リスク因子、またはこれらの任意の組み合わせを使用して、被験体の治療レジメンを選択する。いくつかの実施形態において、癌のリスクが高いか、または予後が悪い被験体に対して、用量を増やした治療または回数を増やした治療が選択される。

個々の療法または併用療法に含めるための他の化合物
所望な場合、ある疾患もしくは障害（例えば癌）、またはある疾患もしくは障害（例えば癌）のリスク上昇を安定化し、治療するか、または予防するためのさらなる化合物が、当該技術分野で既知の方法に従って、天然産物または合成（または半合成）の抽出物または化学ライブラリの大きなライブラリから特定されてもよい。当該分野または薬物の発見および開発の分野の当業者は、試験抽出物または化合物の正確な供給源が本発明の方法にとって重要ではないことを理解するだろう。したがって、実質的に、任意の数の化学抽出物または化合物が、特定の種類の癌または特定の被験体に由来する細胞に対する効果についてスクリーニングされてもよく、または癌に関連する分子（例えば、特定の種類の癌において活性または発現が変化することが知られている癌に関連する分子）の活性または発現に対する効果についてスクリーニングされてもよい。粗抽出物が、癌に関連する分子の活性または発現を調節することがわかっている場合、陽性なリード化合物のさらなるフラクション化を行い、当該技術分野で既知の方法を用い、観測された効果の原因となる化学構成物質を単離してもよい。

療法の試験のための例示的なアッセイおよび動物モデル
所望な場合、本明細書に開示される治療のうちの１つ以上は、細胞株（例えば、本発明の方法を用いて、癌または癌のリスク上昇を有すると診断された被験体において特定された変異のうちの１つ以上を有する細胞株）を用い、またはある疾患または障害の動物モデル、例えば、ＳＣＩＤマウスモデルを用い、ある疾患または障害（例えば癌）に対するその効果について試験してもよい（Ｊａｉｎら、Ｔｕｍｏｒ Ｍｏｄｅｌｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｔｅｉｃｈｅｒ編集、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．、ｐｐ．６４７−６７１、２００１、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。これに加えて、ある疾患もしくは障害（例えば癌）、またはある疾患もしくは障害（例えば癌）のリスク上昇を安定化し、治療するか、または予防するための特定の療法の有効性を決定するために使用可能な多くの標準的なアッセイおよび動物モデルが存在する。療法は、標準的なヒト臨床試験において試験することもできる。

特定の被験体に対して好ましい療法の選択のために、化合物を、被験体において変異する１つ以上の遺伝子に対する発現または活性に対して化合物が及ぼす効果について試験することができる。例えば、ある化合物が特定のｍＲＮＡ分子またはタンパク質の発現を調節する能力は、標準的なノーザン、ウエスタンまたはマイクロアレイ分析を用いて検出することができる。いくつかの実施形態において、（ｉ）被験体において（例えば被験体からのサンプルにおいて）正常レベルより高いレベルで発現するか、または正常レベルよりも高い活性レベルを有する癌を促進するｍＲＮＡ分子またはタンパク質の発現または活性を抑制するか、または（ｉｉ）被験体において正常レベルより低いレベルで発現するか、または正常レベルよりも低い活性レベルを有する癌を抑制するｍＲＮＡ分子またはタンパク質の発現または活性を促進する１つ以上の化合物が選択される。（ｉ）被験体における癌に関連する変異を有するｍＲＮＡ分子またはタンパク質の最大数を調節し、（ｉｉ）被験体における癌に関連する変異を有しないｍＲＮＡ分子またはタンパク質の最小数を調節する、個々の治療または併用療法。いくつかの実施形態において、選択された個々の療法または併用療法は、高い薬物有効性を有し、もしあるにしても、有害な副作用はほとんど生じない。

上述の被験体固有の分析の代替として、ＤＮＡチップを使用して、特定の種類の初期または後期の癌（例えば、乳癌細胞）におけるｍＲＮＡ分子の発現を、正常組織における発現と比較することができる（Ｍａｒｒａｃｋら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２、２０６−２０９、２０００、Ｈａｒｋｉｎ、Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．５：５０１−５０７、２０００、Ｐｅｌｉｚｚａｒｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（２２）：４５７７−４５８１、２０００、それぞれ、全体として参照により本明細書に組み込まれる）。この分析に基づき、この腫の癌を有する被験体についての個々の療法または併用療法を選択して、この種の癌において発現が変化したｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を調節することができる。

特定の被験体または被験体群のための療法を選択するために使用されることに加え、発現プロファイリングを使用して、治療中に生じるｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現の変化をモニタリングすることができる。例えば、発現プロファイリングを使用して、癌関連遺伝子の発現が正常レベルに戻ったかどうかを決定することができる。戻っていない場合、対応する癌関連遺伝子の発現レベルに対するその療法の効果を上げるか、または下げるように、その療法における１つ以上の化合物の用量を変更してもよい。これに加えて、この分析を使用して、ある療法が他の遺伝子（例えば、有害な副作用に関連する遺伝子）の発現に影響を与えるかどうかを決定することができる。所望な場合、療法の用量または組成を変更して、望ましくない副作用を防ぐか、または減らすことができる。

例示的な製剤および投与方法
ある疾患もしくは障害（例えば癌）、またはある疾患もしくは障害（例えば癌）のリスク上昇を安定化し、治療するか、または予防するために、当業者に既知の任意野方法を用い、組成物が製剤化され、投与されてもよい（例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，３８９，５７８号および第８，３８９，５５７号を参照）。製剤および投与のための一般的な技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」、２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｄａｖｉｄ Ｔｒｏｙ編集、２００６、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．の中に見出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。液体、スラリー、錠剤、カプセル、丸薬、粉末、顆粒、ゲル、軟膏、座薬、注射剤、吸入剤およびエアロゾルは、そのような製剤の例である。一例として、放出性が改変されたか、または徐放性の経口製剤は、当該技術分野で既知のさらなる方法を用いて調製することができる。例えば、活性成分の好適な徐放性形態は、マトリックス錠剤またはカプセル組成物であってもよい。好適なマトリックス形成材料としては、例えば、ワックス（例えば、カルナウバ、ミツロウ、パラフィンワックス、セレシン、シェラックロウ、脂肪酸および脂肪族アルコール）、油、硬化油または脂肪（例えば、硬化菜種子油、ヒマシ油、牛脂、ヤシ油および大豆油）、ならびにポリマー（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリエチレングリコール）が挙げられる。他の好適なマトリックス錠剤化材料は、微結晶セルロース、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、他の担体を含むもの、および充填剤である。錠剤には、粒状物、コーティングされた粉末またはペレットも含まれている場合がある。錠剤はまた、多層であってもよい。場合により、最終的な錠剤は、コーティングされていてもよく、またはコーティングされていなくてもよい。

このような組成物を投与する典型的な経路としては、限定されないが、経口、舌下、口腔、局所、経皮、吸入、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内注射または注入技術）、直腸、膣および経鼻が挙げられる。好ましい実施形態において、療法は、徐放デバイスを用いて行われる。
本発明の組成物は、組成物の投与時に、その中に含まれる活性成分（複数可）が生体利用可能になるように製剤化される。組成物は、１つ以上の投与単位の形態をとっていてもよい。組成物は、１、２、３、４種類またはさらに多い活性成分を含有していてもよく、場合により、１、２、３、４種類またはさらに多い不活性成分を含有していてもよい。

代替的な実施形態
本明細書に記載される方法のいずれかは、例えば、コンピュータ画面上または印刷した紙の上などの物理的なフォーマットでのデータの出力を含んでいてもよい。本明細書の方法のいずれかは、医師によって作業され得るフォーマットで、作業可能なデータの出力と組み合わせられてもよい。標的個体に関する遺伝子データを決定するための本文書に記載される実施形態のいくつかは、医療従事者によって、潜在的な染色体異常（例えば、欠失または重複）、またはそれを欠くことの通知と組み合わせられてもよい。本明細書に記載される実施形態のいくつかは、作業可能なデータの出力、臨床的な治療をもたらす臨床決定の実施、または何の行動も取らないという臨床決定の実施と組み合わせられてもよい。

いくつかの実施形態において、本発明の任意の方法の結果（例えば、欠失または重複の有無）を開示する報告書を作成するための方法が本明細書で開示される。本発明の方法から得られた結果を用いて報告書を作成してもよく、これを医師に電子的に送信し、出力デバイスで表示し（例えば、デジタル報告書）、または書面による報告書（例えば、報告書の印刷されたハードコピー）が医師に届けられてもよい。これに加えて、記載される方法は、臨床的な治療をもたらす臨床決定の実際の実施、または何の行動も取らないという臨床決定の実施と組み合わせられてもよい。

特定の実施形態において、本発明は、本明細書に開示されるマルチプレックスＰＣＲ方法を用い、同じサンプルからＣＮＶおよびＳＮＶを両方とも検出するための、試薬、キットおよび方法、ならびにこのような方法を行うためのコード化された命令を含むコンピュータシステムおよびコンピュータ媒体を提供する。特定の好ましい実施形態において、サンプルは、循環腫瘍ＤＮＡを含むことが疑われる単一細胞サンプルまたは血漿サンプルである。これらの実施形態は、特に、乳癌、卵巣癌および肺癌などのＣＮＶを示す癌について、本明細書に開示される高感度マルチプレックスＰＣＲ方法を用いて、ＣＮＶおよびＳＮＶについて単一細胞または血漿からのＤＮＡサンプルを調べることによって、ＣＮＶまたはＳＮＶのいずれかのみについて調べる場合と比べて、改良された癌検出を達成することができるという発見を利用したものである。本方法は、ＣＮＶを分析する特定の例示的な実施形態において、５０〜１００，０００、または５０〜１０，０００、または５０〜１，０００のＳＮＰを調べ、ＳＮＶについて、５０〜１０００のＳＮＶ、または５０〜５００のＳＮＶ、または５０〜２５０のＳＮＶを調べる。例えば、ＣＮＶおよびＳＮＶを示すことが知られている癌、例えば、乳癌、肺癌および卵巣癌を含む癌を有することが疑われる被験体の血漿中のＣＮＶおよび／またはＳＮＶを検出するための本明細書で提供される方法は、遺伝子組成という観点で、不均一な癌細胞集合で構成されることが多い腫瘍からＣＮＶおよび／またはＳＮＶを検出するという利点を提供する。したがって、腫瘍の特定の領域のみを分析することに焦点をあてた従来の方法は、腫瘍の他の領域にある細胞に存在するＣＮＶまたはＳＮＶを見落としてしまうことが多い。血漿サンプルは、液体生検として機能し、これを調べ、腫瘍細胞の部分集合にのみ存在するＣＮＶおよび／またはＳＮＶのいずれかを検出することができる。

以下の実施例は、当業者に本明細書で提供される実施形態の使用方法の完全な開示および説明を提供するために示されるのであって、本開示の範囲を限定することを意図したものではなく、以下の実施例が、行われる全ての実験または唯一の実験であることを表すことを意図していない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して精度を保証するように努力がなされてはいるが、ある程度の実験誤差および偏差が考慮されるべきである。別段の指定がない限り、部は体積部であり、温度は摂氏である。記載される方法の変形は、実施例が例示することを意図する基本的態様を変更することなく行うことができることを理解されたい。

実施例１．大腸癌をモニタリングするための個別化された循環腫瘍ＤＮＡ分析
疾患再発の早期検出は、大腸癌（ＣＲＣ）を有する患者において生存率を改善することが示されてきた。手術後の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の検出は、再発のリスクが非常に高いＣＲＣ患者の部分集合を定義する。以前の研究は、ｃｔＤＮＡ分析を行い、スモール遺伝子パネル配列決定またはデジタルドロップレットＰＣＲを用いて、初期ＣＲＣにおける腫瘍負荷をモニタリングした。

この実施例の目的は、患者１名あたり１６個の腫瘍特有の変異を標的とする個別化されたマルチプレックスＰＣＲ ＮＧＳプラットフォームを使用して、手術後に微小残存病変を評価し、ＣＲＣにおける治療応答をモニタリングすることであった。

ステージＩ〜ＩＶのＣＲＣ患者１３０名を治癒目的の手術で治療し、（場合により）アジュバント化学療法が含まれていた（表１を参照のこと）。血漿サンプルを、手術前のベースライン時と、手術後の計画通院（ｓｃｈｅｄｕｌｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｖｉｓｉｔｓ）時に、長期的に採取した（図２０Ａ）。全エクソーム配列決定は、体細胞変異を特定した。Ｓｉｇｎａｔｅｒａの標準的なワークフローに従い、１６個の体細胞単一ヌクレオチドおよびインデルバリアントを標的とする患者固有のマルチプレックスＰＣＲアッセイは、手術前および手術後とアジュバント療法中に採取した血漿サンプルにおける大規模並列配列決定によってアッセイされた（図２０Ｂ）。

図２２は、患者１３０名のうちの１２８名からの８００個を超える血漿サンプルのｃｔＤＮＡプロファイリング結果の概略図を提供する。図２３Ａ〜Ｂは、手術後のｃｔＤＮＡステータスによって階層化される再発リスクを示す。ｃｔＤＮＡステータスは、６週目までとＡＣＴの開始前に採取された最初の術後血液サンプルに基づいて確立された。図２３（Ａ）は、ｃｔＤＮＡステータスによって階層化される無再発生存率のカプランマイヤー分析を示す。イベントがない患者は、フォローアップ終了時に打ち切られた。図２３（Ｂ）は、ｃｔＤＮＡステータスに従って、再発率を示す（打ち切られた患者はいない）。アジュバント化学療法は、５８名の患者に対して行われ、ｃｔＤＮＡ陽性患者の再発率に影響を及ぼした可能性が高い。

図２４（Ａ）は、アジュバント化学療法後のｃｔＤＮＡステータスによって階層化された、アジュバント化学療法の後の再発リスクを示す。アジュバント後のいずれかのタイムポイントが陽性であった場合、患者は、ｃｔＤＮＡ陽性とスコア付けされ、全てのアジュバント後のタイムポイントが陰性であった場合、陰性とスコア付けされた。図２４（Ｂ）は、アジュバント治療中およびアジュバント治療後の代表的な患者のｃｔＤＮＡプロファイリングを示す。

図２５は、アジュバント化学療法で治療する前の手術後のｃｔＤＮＡが陽性の１０名の患者の再発率と、３名の再発していないｃｔＤＮＡ陽性患者のうちの２名について、ｃｔＤＮＡがＡＣＴによってどのように除去されたかを示す。

図２６Ａ〜Ｂは、ｃｔＤＮＡおよびＣＴ画像診断を用いた再発までの時間（ＴＴＲ）の比較を示す。（Ａ）両方のモダリティによって再発が検出された１２名の再発患者についてｃｔＤＮＡおよびＣＴ画像診断を用いたＴＴＲの比較。（Ｂ）１０．２ヶ月のｃｔＤＮＡリードタイムを有する代表的な再発患者の連続的なｃｔＤＮＡプロファイリング。

図２７Ａ〜Ｄは、４名の代表的な患者の連続的なｃｔＤＮＡプロファイリングを示す。

結論として、腫瘍特有の変異を標的とする個別化されたマルチプレックスＰＣＲアッセイの大規模並列配列決定のためのＳｉｇｎａｔｅｒａ ＲＵＯ手法は、ｃｔＤＮＡの検出および定量化のための高感度かつ特異的なプラットフォームである。手術後のｃｔＤＮＡ分析により、ＡＣＴの前および後の両方で、ＣＲＣ患者を、再発リスクが非常に高いか、または非常に低いサブグループに階層化することができる。アジュバント化学療法の前および後の両方。長期的なｃｔＤＮＡ分析により、効率的な手術後の治療モニタリングと再発の早期検出が可能になり、ｃｔＤＮＡ分析は、アジュバントおよびアジュバント後の環境の両方で、治療の決定を導く際に大きな有用性を有する。

実施例２．サーベイランスおよび治療有効性モニタリングのための局所的に進行した膀胱癌患者からの血漿ｃｆＤＮＡの配列決定。
異なる種類の癌に対する研究は、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）レベルを効率的に使用して、ネオアジュバント療法に対する治療応答をモニタリングし、および／または臨床的検出および放射線学的検出よりも早期に疾患の再発を検出することができることを示している。膀胱癌において、以前、血漿中の変異を使用して、治療中の応答をモニタリングし、転移性疾患の初期の徴候を特定した。近年、ＮＳＣＬＣ患者における長期的なｃｔＤＮＡ検出が記載され、個別化された循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）検出アッセイが開発された（Ｓｉｇｎａｔｅｒａ（商標）ＲＵＯ）。

この研究の目的は、原発性腫瘍で特定された患者固有の変異を使用して、転移性再発を検出し、予後を評価し、長期的に採取された血漿サンプル由来のｃｔＤＮＡにおける治療応答をモニタリングすることであった。

臨床プロトコル局所的に進行した筋層浸潤性膀胱癌（ＭＩＢＣ）と診断され、化学療法が計画されている患者は、２０１３〜２０１７年の間に募集される見込みであった。全ての患者は、膀胱切除（ＣＸ）の前にネオアジュバントまたはファーストライン化学療法で治療され、最大２年間のフォローアップを受けた（図２８）。血漿サンプルは、全身治療の前後とＣＸ後の計画通院時に長期的に採取された。

分子プロトコル患者固有の体細胞変異は、腫瘍とマッチした正常サンプルとの全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）によって特定された。個別化されたマルチプレックスＰＣＲアッセイを使用して、長期的に採取した血漿サンプル由来のｃｆＤＮＡを用い、血漿中の患者固有の腫瘍ＤＮＡを検出した。各患者について、１６個の腫瘍特有の標的の配列決定を行い、ｃｔＤＮＡの存在について臨床的に盲検の方法でデータを分析した。少なくとも２つの陽性患者固有の標的がコールされ、適正な信頼性スコアの閾値を満たした場合、また、この場合にのみ、サンプルはｃｔＤＮＡ陽性とみなされた。臨床結果（レントゲン写真による画像診断および治療応答）は、非盲検化され、Ｓｉｇｎａｔｅｒａ血漿コールの結果と直接比較された。

この試験には、合計５０名の患者が含まれていた（表２）。

５ ＨｉＳｅｑ ＰＥ ２ｘ５０ランにわたって、インライン配列決定ＱＣを行った。標的のリード深度あたりの平均およびバックグラウンドエラー率を図２９に示す。

再発の早期検出ＣＸ後の臨床的再発は、患者１０名について診断され、ｃｔＤＮＡは、これらの患者のうちの９名の血漿において特定され、中央値は、臨床的再発の１２８日前であった（表３）。１名の患者については、ＣＸから４ヶ月後の最後の通院サンプルは、まだ分析されていない。

図３０Ａ〜Ｆは、早期再発を検出した６名の患者を示す。ｃｔＤＮＡは、分子再発の時点では０．０２％程度の低いＶＡＦで検出され、臨床的再発前の２６５日までのリードタイムを有していた（図３０Ｄ、３０Ｅおよび３０Ｆ）。ほとんどの患者において、化学療法に対する応答は、ｃｔＤＮＡのＶＡＦの減少に対応していた（表４）。

^ａＣＸの前にファーストライン化学療法を受けた。^ｂＴＵＲ−Ｂの前にＴＵＲ−Ｐを受け、尿道、前立腺部からのＴ１腫瘍。^ｃ化学療法の後に、手術不可能な状態から手術可能な状態への向上によって定義される治療応答（臨床的にアップステージしているにもかかわらず）。ＶＡＦ、バリアント対立遺伝子頻度；ＣＸ、膀胱切除；ＮＤ、検出されず。

図３２Ａ〜Ｂは、ｃｔＤＮＡを用いて治療応答が観測された２名の患者を示す。診断時に最初に検出されたｃｔＤＮＡは、ネオアジュバント療法で低下し、ＣＸ後にも検出されないままであった。

結論として、これらのデータは、ｃｔＤＮＡ分析（例えば、Ｓｉｇｎａｔｅｒａを介する）が、レントゲン写真による画像診断よりも最大２６５日早く、治療応答を知らせ、疾患再発を特定するのに役立ち得ることを示す。生存率分析は、診断時または膀胱切除後にｃｔＤＮＡを有する患者について、有意に低い無再発生存率を特定した。最終的に、ｃｔＤＮＡ分析は、再発の早期検出のための通常のフォローアップに組み込むことができ、その結果、免疫療法などの代替療法を早期に開始できる可能性がある。ｃｔＤＮＡ再発検出によって得られる全生存率における利益は、無作為化臨床試験によって評価すべきである。

実施例３．高感度な患者固有のマルチプレックスＰＣＲ ＮＧＳに基づく非侵襲性の癌再発検出および治療モニタリングアッセイ
循環無細胞ＤＮＡにおける腫瘍変異の特定は、臨床所見の前の癌再発の非侵襲性検出、治癒目的の治療後の微小残存病変の検出および治療に関連する変異の検出のための大きな可能性を有している。現在のバージョンのアッセイによって腫瘍特有のバリアントを検出するための分析検証結果を見直し、報告するために。

Ｓｉｇｎａｔｅｒａ ＲＵＯ。Ｓｉｇｎａｔｅｒａ（商標）（ＲＵＯ）プロセスは、腫瘍とマッチした正常サンプルとの全エクソーム配列決定から体細胞変異を特定し、優先順位を付けることから始まる。次いで、１６個の体細胞単一ヌクレオチドおよびインデルバリアントを標的とする患者固有のマルチプレックスＰＣＲアッセイは、患者の疾患経過全体を通じて採取された血漿サンプルにおける大規模並列配列決定によってアッセイされ、循環腫瘍ＤＮＡを検出し、モニタリングするのに役立つ。

分析検証。現在のバージョンのＳｉｇｎａｔｅｒａ（ＲＵＯ）アッセイの分析検証は、２種類の乳癌細胞株（ＨＣＣ２２１８、ＨＣＣ１３９５）、１種類の肺癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１３９５）およびこれらのマッチした正常相当物（それぞれ、ＨＣＣ２２１８−ＢＬ、ＨＣＣ１３９５−ＢＬおよびＮＣＩ−Ｈ１３９５−ＢＬ）に対して行われた。さまざまな量の腫瘍細胞株ＤＮＡ（０％、０．００５％、０．０１％、０．０３％、０．０５％、０．１％、０．３％、０．５％、１％）をそれぞれのマッチした正常細胞株ＤＮＡにタイトレーションした。マルチプレックスＰＣＲアッセイプライマープール（それぞれ、高信頼率の体細胞変異に対して特異的な１６個のプライマー対アッセイからなる）は、対応する腫瘍細胞株ＤＮＡおよびそのマッチした正常細胞株ＤＮＡからの全エクソームデータを用いて設計された。各反応についてのライブラリ調製への開始時の合計インプット量は、２０Ｋゲノム相当であった。対応する腫瘍ＤＮＡスパイクインサンプルからのＳＮＶおよびインデル標的は、上述のマルチプレックスＰＣＲアッセイプライマープールを用いて増幅された。ｍＰＣＲ産物をバーコード化し、次いで、他のｍＰＣＲバーコード化産物と共にプールし、その後、平均リード深度約１００，０００／アッセイでＩｌｌｕｍｉｎａ Ｐａｉｒｅｄ Ｅｎｄ ｖ２キットを用い、５０サイクルのペアエンドリードを用いたＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００ Ｒａｐｉｄ Ｒｕｎで配列決定した。

図３４は、バックグラウンドトランジションおよびトランスバージョンのエラー率および標的リード深度（ＤＯＲ）あたりの平均が約１００Ｋである（５Ｋリード未満を受け取る任意の標的は、不合格とみなされ、コールのために考慮されなかった）ことを含め、４ ＨｉＳｅｑ ＰＥ ２ｘ５０ランにわたる配列決定ＱＣプロセスチェックを示す。

０．０３％のスパイクイン腫瘍ＤＮＡでのＳＮＶ検出について、約６０％の分析感度がＳｉｇｎａｔｅｒａ（ＲＵＯ）を用いて達成された（表５）。

所与のＳＮＶのセットについて、異なるスパイクイン変異体ＤＮＡ濃度について検出されたバリアント対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）の割合に対する予測されるインプット割合の数が、６個の標的にわたって示されており、０．０３％の腫瘍ＤＮＡ濃度を超える高い感度を示す（図３６）。０．０１％以下のＳＮＶインプットで示される偽陰性（２個未満の変異体コピーから始まる）は、サンプリングに起因する変異体分子の消失を含む（図３６）。

１６個の高信頼率のＳＮＶのセットから少なくとも２個のＳＮＶがコールされる場合に、Ｓｉｇｎａｔｅｒａ（ＲＵＯ）について推定されるサンプルレベル感度が表６に列挙される。

結論として。Ｓｉｇｎａｔｅｒａ ＲＵＯアッセイは、高い感度、高い特異性および低いエラー率を有する特注のマルチプレックスＰＣＲアッセイ（患者の腫瘍から選択される）の超深部の配列決定によって、血漿中の個別化された癌シグネチャの再発を非侵襲的に検出する新規な方法を提供する。分析検証結果に基づき、Ｓｉｇｎａｔｅｒａ ＲＵＯアッセイは、ＳＮＶレベルで、９９．９％の特異性を有し、腫瘍分率が０．０３％より上だと６５％より大きな感度を有し、腫瘍分率が０．１％より上だと１００％の感度を有する。サンプルレベルで、Ｓｉｇｎａｔｅｒａ ＲＵＯアッセイは、腫瘍分率０．０１％で９５％より高い感度を有し、腫瘍分率０．０３％でほぼ１００％の感度を有し、腫瘍分率が０．０５％以上では１００％の感度を有する。これらのデータは、単一分子変異体レベルで高い検出率を示し、これらのデータはまた、より少ない体積の血漿を利用して、高い特異性で同じ単一分子検出を達成し得ることも示唆している。Ｓｉｇｎａｔｅｒａアッセイの性能は、化学療法の治療有効性を決定付ける可能性を示唆している。

実施例４．診断、サーベイランスおよび再発のための膀胱癌における多重の患者固有のｃｔＤＮＡバイオマーカーの長期的な評価。
背景診断時の疾患ステージ決定（ＤＸ）、治療応答および再発モニタリングのためのバイオマーカーとしての循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の使用は、多くの種類の癌において、新しく出現してきた分野である。膀胱癌において、ｃｔＤＮＡの有用性は、有望な結果を示している。ｃｔＤＮＡモニタリングに対する高感度かつ特異的なＮＧＳに基づく手法が、本明細書に開示される。

方法ネオアジュバント化学療法で治療された局所的に進行した筋層浸潤性膀胱癌を有する患者５０名のコホートが含まれる見込みであった。各患者について、腫瘍および生殖細胞系ＤＮＡの長期的な配列決定に基づき、１６個の腫瘍特有の変異のパネルが設計された（Ｓｉｇｎａｔｅｒａ（商標）ＲＵＯ）。全体で、診断時、治療中、膀胱切除（Ｃｘ）時および疾患再発までのモニタリング中、または最大２年間のフォローアップ時に調達された３８６個のタイムポイントから長期的に採取した血漿サンプルから、ｃｔＤＮＡを分析した。ｃｔＤＮＡ分析の結果を、レントゲン写真による画像診断および臨床結果と比較した。長期的に採取された尿サンプルからのｃｔＤＮＡを、治療応答および疾患再発についても分析することができる。

結果ＤＸ時に、血漿ｃｔＤＮＡステータスは、無再発生存率を強く予知するものであった。具体的には、ＤＸ時にｃｔＤＮＡ＋患者の６２％（８／１３）が、ネオアジュバント治療およびＣｘの後に再発した。逆に、ｃｔＤＮＡ−患者はいずれも再発しなかった（０／２２）（対数ランク；ｐ＜０．０００１）。さらに、Ｃｘ後のｃｔＤＮＡの存在と疾患再発との間にも、強い相関関係が観測された。具体的には、Ｃｘ後の再発は、レントゲン写真による画像診断の約１２０日前（０〜２４５日前）にｃｔＤＮＡ＋の患者の１００％（１０／１０）で検出され、一方、ｃｔＤＮＡ−患者の０％（０／３８）が再発した（対数ランク；ｐ＜０．０００１）。

結論ＤＸ時点での膀胱癌におけるｃｔＤＮＡの強力な予知可能性が示され、膀胱癌のステージ決定におけるｃｔＤＮＡの役割を示唆している。さらに、ｃｔＤＮＡは、Ｃｘ後に疾患再発を有する全ての患者において検出されることが示された。ｃｔＤＮＡ分析を、再発の早期検出のための通常のフォローアップに組み込むことにより、代替治療モダリティを早期に開始することが可能になる。

実施例５．残存病変の検出、アジュバント療法の有効性の評価および大腸癌における早期再発検出のための連続的な循環腫瘍ＤＮＡ分析。
背景疾患再発の早期検出は、大腸癌（ＣＲＣ）を有する患者における生存率を改善することが示されている。以前の研究は、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を分析して、スモール遺伝子パネルおよびｄｄＰＣＲを用いて、ＣＲＣにおける腫瘍負荷をモニタリングした。ここで、個別化されたマルチプレックスＰＣＲおよびＮＧＳプラットフォーム（Ｓｉｇｎａｔｅｒａ（商標）ＲＵＯ）を使用して、連続的に採取した血漿サンプル中のｃｔＤＮＡを検出し、ｃｔＤＮＡ検出が、アジュバント化学療法（ＡＣＴ）の前および後の両方で高い再発リスクを有する患者の部分集合を定義した。

方法標準治療に従って治療されたステージＩ〜ＩＶのＣＲＣ患者１３０名のコホートを分析した。各患者について、ＷＥＳから得られた体細胞変異シグネチャを用い、１６個の変異の腫瘍特有のパネルが設計された。手術前後およびＡＣＴ中に採取した血漿サンプル（ｎ＝８２９）を分析した。手術後（ｎ＝９１）およびＡＣＴ後（ｎ＝５８）のｃｔＤＮＡステータスによって階層化された患者について、無再発生存率を計算した。

結果。手術後かつＡＣＴ前のｃｔＤＮＡステータスは、９１名の患者で評価された。再発は、ｃｔＤＮＡ＋の７５％（６／８）について観測され、ｃｔＤＮＡ−患者の１３％（１１／８３）しか観測されなかった。手術後のｃｔＤＮＡ＋患者の３０％（３／１０）について、有効なＡＣＴ治療が観測された。これらの患者は、ＡＣＴ後に連続的に採取した血液サンプルにおいて一貫してｃｔＤＮＡ−であり、フォローアップ終了時に一致して無再発であった。ＡＣＴ後のｃｔＤＮＡステータスは、５８名の患者で評価された。放射線学的に確認された再発は、ｃｔＤＮＡ＋の７７％（１０／１３）について観測され、ｃｔＤＮＡ−患者の４％（２／４５）について観測された。平均して、ｃｔＤＮＡは、標準治療のＣＴ画像診断よりも９．１３ヶ月早く再発を検出した。

結論連続的な手術後ｃｔＤＮＡ分析により、患者を再発リスクが高いかまたは低いサブグループに階層化し、ＡＣＴ治療の有効性を評価し、再発の早期検出を可能にする。重要なことに、ＡＣＴは、手術後のｃｔＤＮＡ＋患者の最大３０％において残存病変を除去することができ、そのため、ｃｔＤＮＡ＋患者のための治療選択肢となり得ることも示す。要約すると、ｃｔＤＮＡ分析は、アジュバントおよびアジュバント後の環境の両方で、治療の決定を導くための大きな可能性を有する。

実施例６．循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の安定した、拡張可能であり、個別化された分析による残存乳癌（ＢＣ）の早期検出は、明らかな転移性再発に先行する。
背景多くのＢＣ患者は、一次治療後に再発するが、明らかになる前に遠隔転移を検出する信頼性の高い検査が存在しない。個別化されたｃｔＤＮＡ分析による再発患者の早期特定が本明細書に示される。この方法は、全ての患者に適用可能であり、典型的には遺伝子パネルによって検出されるホットスポット変異に限定されない。

方法手術およびアジュバント療法の後に、４９名の転移していないＢＣ患者を募集した。血漿サンプル（ｎ＝２０８）を半年ごとに連続的に採取した。分析的に検証されるＳｉｇｎａｔｅｒａ（商標）ワークフローを用い、原発性腫瘍の全エクソームデータから変異シグネチャが決定され、超深部配列決定（平均＞１００，０００倍）によって、高感度の１６個のバリアントを標的とする個別化されたアッセイを設計した。各患者のアッセイを使用して、変異シグネチャが血漿中で検出可能かどうかを決定した。５名を除く全ての患者が化学療法を受け、その他の５名は放射線療法を受けた。

結果１８名中１６名（８９％）の臨床的に再発した患者において、臨床検査および生化学（ＣＡ１５−３）測定によって診断される転移性再発の前に、ｃｔＤＮＡが検出され、フォローアップ全体を通じてｃｔＤＮＡ陽性のままであった。検出されない２名の患者のうち、１名は局所的再発を有し、もう１名は、２個の原発腫瘍を有していた。３３名の再発していない患者は誰も、任意のタイムポイントでｃｔＤＮＡ陽性ではなかった（ｎ＝１４２）。転移性再発は、高精度でＳｉｇｎａｔｅｒａによって予測され、リードタイムは最大２年間であった（中央値＝９．５ヶ月）。これらの結果のまとめは、図３７に提供される。詳細な結果は、図３８〜５９に示される。

結論拡張可能な患者固有のｃｔＤＮＡに基づく検証されたワークフローを使用することで、再発する患者をより早期に特定する。ｃｔＤＮＡ分析による正確かつ早期の予測は、明らかに生命を脅かす転移性の進行を防ぐために、セカンドラインの救済アジュバント療法を必要とする乳癌患者をモニタリングする手段を提供することができる。

本明細書に提示される結果は、本方法が、患者の血液サンプル中の個別化された癌マーカー／循環腫瘍ＤＮＡの検出に基づく乳癌再発の予測において、非常に感度が高いことを示す。例えば、１８の再発症例のうちの１６が正しく予測され、偽陽性は特定されなかった。本方法は、非常に一貫したものでもある。陽性検出が行われると、同じ患者からの連続した血液サンプルは、一貫して陽性のままである。

本方法は、個別化された癌マーカー／循環腫瘍ＤＮＡを検出し、例えば、標準的な方法（例えば画像診断）によって再発が検出される２７〜６１０日前に、再発の予測を行うことができる。再発を検出する時間の中央値は、標準的な方法によって再発が検出される９ヶ月前である。

実施例７．ネオアジュバント療法（ＮＡＴ）に対する応答およびＩ−ＳＰＹ２ ＴＲＩＡＬにおける結果をモニタリングし、予測するための、高リスク初期乳癌患者における個別化された連続的な循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）分析。
背景。ｃｔＤＮＡ分析は、治療に対する応答および耐性をモニタリングするための非侵襲的な手法を与える。ＮＡＴ中の連続的なｃｔＤＮＡ試験は、出現する耐性および疾患の進行の早期指標を提供し得る。この研究において、ｃｔＤＮＡは、Ｉ−ＳＰＹ２ ＴＲＩＡＬ（ＮＣＴ０１０４２３７９）においてＮＡＴおよび根治手術を受けた高リスク初期乳癌患者から分析された。本実施例で集めたデータを使用して、（１）初期治療中のｃｔＤＮＡレベルとｐＣＲ／残存癌負荷／ＤＲＦＳとの関係を決定し、（２）療法に対する腫瘍応答を予測する際のＭＲＩ画像診断に対して、ｃｔＤＮＡの性能を比較し、（３）ＮＡＴの前後のｃｔＤＮＡレベルと、３年間の無イベント生存率（ＥＦＳ）との関係を調べる。

方法。ｃｔＤＮＡ分析は、ネオアジュバント治験薬（ｎ＝５７）、パクリタキセル（Ｔ）と組み合わせたＡＫＴ阻害剤ＭＫ−２２０６（Ｍ）の後、ドキソルビシンおよびシクロホスファミド（ＡＣ）（Ｍ＋Ｔ→ＡＣ）または標準治療（Ｔ→ＡＣ）（ｎ＝２７）に対して無作為化した８４名の高リスクのステージＩＩおよびＩＩＩ乳癌患者で行われた。ＨＥＲ２＋患者は、ＴまたはＭ＋Ｔに加えて、トラスツズマブ（Ｈ）を投与された。

ＮＡＴの前、初期治療（３週間）、レジメンの間（１２週間）およびＮＡＴの後かつ手術前に、連続して血漿を採取した。治療前腫瘍生検に由来する変異プロファイルおよび生殖細胞系ＤＮＡの全エクソーム配列を使用して、患者の腫瘍に対して特異的な１６個のバリアントを標的とする個別化されたアッセイを設計し、血漿中のｃｔＤＮＡを検出した。ｐＣＲを達成しなかった患者の部分集合（ｎ＝１８〜２２）において、残存癌中の変異を、治療前腫瘍でみられるものと比較した。

分析：この分析における８４名の患者のうち、１５〜２５％はＨＲ−ＨＥＲ２−であり、４０〜６０％はＨＲ＋ＨＥＲ２−であり、３５〜３５％はＨＥＲ２＋であった。対照および治療アームにおいて、それぞれ２０〜２５％および３０〜４２％がｐＣＲを達成した。現在、データが収集され、（１）初期治療中のｃｔＤＮＡレベルとｐＣＲ／残存癌負荷／ＤＲＦＳとの関係を決定し、（２）療法に対する腫瘍応答を予測する際のＭＲＩ画像診断に対して、ｃｔＤＮＡの性能を比較し、（３）ＮＡＴの前後のｃｔＤＮＡレベルと、３年間の無イベント生存率（ＥＦＳ）との関係を調べる。

結論この研究は、ＮＡＴに対する応答を連続的にモニタリングするためにｃｔＤＮＡの臨床的意義を評価するためのプラットフォームを提供する。高感度ｃｔＤＮＡ分析による正確かつ早期の応答予測は、患者がｐＣＲを達成する機会を向上させるために、適時に治療の正当な変更を容易にし得る。最後に、個別化されたｃｔＤＮＡ試験は、改善されたＥＦＳのための代替的なエンドポイントとして、ｐＣＲを微調整するための画像診断および腫瘍応答の病理学的評価を補うことができる。

実施例８．循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の拡張可能な個別化された分析による残存乳癌の早期検出は、明らかな転移性再発に先行する。
序論
乳癌は、世界中で最も一般的に診断されている癌の１つであり、女性の癌関連死の２番目の主要因である。非転移性乳癌を有する女性の現在の標準治療は手術であり、多くはその後にアジュバント療法を行い、再発またはさらなる疾患の進行を引き起こし得る微細な残存病変を除去する。残念ながら、治癒目的での治療の後に病気の証拠が存在しない女性の最大３０％が、最終的に、微小転移の結果として転移性乳癌が再発し、死亡する。画像診断および／または生化学的方法論（癌抗原１５−３（ＣＡ１５−３）の血清レベルを含む）、疾患モニタリングのための現在のツールは、微小転移の検出において、感度および精度が限定されている。転移が遅れて検出されることは、多くの患者における不良転帰に関係があり、微小残存病変（ＭＲＤ）のより早期のより高感度の尺度を開発する必要性を強調している。

アポトーシスおよび壊死性癌細胞によって放出される循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は、腫瘍の変異シグネチャを反映することが示されており、異なる種類の癌にわたる腫瘍の進行をモニタリングするための潜在的な非侵襲性バイオマーカーとして出現してきている。乳癌において、手術および／またはアジュバント療法の後に微小残存病変を検出し、転移性疾患をモニタリングするためのｃｔＤＮＡの有用性は、有望な結果を示している。具体的には、血漿ｃｔＤＮＡレベルは、腫瘍負荷の変化と相関関係にあることが示されており、それによって、治療応答の早期の尺度を提供し、手術後に最終的に臨床的再発が起こる患者と起こらない患者を区別することが示されている。複数の研究は、乳癌におけるｃｔＤＮＡ分析の潜在的な使用を示しているが、今日までに、全ての患者において微小残存病変を信頼性高く検出することが可能な、拡張可能な試験は存在しない。

血漿ｃｆＤＮＡ中の単一ヌクレオチドおよびインデルバリアントを調べるための個別化された腫瘍特有の手法は、臨床検出の前に、非小細胞肺癌を有する患者の再発を予測し、このことは、乳癌患者において微小残存病変をモニタリングするのにも適している可能性を示唆している。ここで、この手法の強化された、拡張可能なバージョンを使用して、従来のモニタリング方法と比較して、手術およびアジュバント療法の後の乳癌再発をモニタリングする際の連続的なｃｔＤＮＡ分析の使用を決定しようと試みた。主な目的は、血漿中のｃｔＤＮＡの検出と、原発性乳癌を有する患者における明らかな転移性疾患の臨床検出との間の「リード間隔」を決定することであった。

方法
患者およびサンプル
ＥＢＬＩＳは、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫおよびＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＮＩＨＲ）による資金提供を受けた、複数施設の前向きコホート研究である（ＮＩＨＲ ＲＥＣ番号１３／ＬＯ／１１５２；ＩＲＡＳ：１２６４６２）。全ての患者は、治験に参加する前に書面によるインフォームドコンセントを行った。治験プロトコルは、Ｒｉｖｅｒｓｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ＲＥＣ：１３／ＬＯ／１１５；ＩＲＡＳ：１２６４６２によって承認された。全ての研究および技術スタッフは、患者の結果について盲検であった。

英国にある３施設から合計１９７名の患者を募集した。９名の患者は、治験参加基準を満たしていなかった。そのため、１８８名の患者のコホートに、ｃｔＤＮＡのための月に６回の血液サンプリングと、それに伴う臨床検査と、ＣＡ１５３を含む生化学的測定を行い、フォローアップした（図６０）。適格な患者は１８歳以上であり、転移性疾患の臨床的証拠がなく、そのため、手術およびアジュバント療法の後に疾患がないとみなされた。全員が、この試験に参加してから５年以内にアジュバント化学療法を終了していた。全員が、リスクの低い乳癌を有していた（療法をしない場合の１０年間での死亡リスクが５０％を超え、これは治療をしない場合の１０年間での再発率６５％に対応していた）。

この治験の中間点（２年間）に、中間分析を行い、予測されるイベントの５０％が存在したことに気づいた後、最初の５０名の患者において、原発性腫瘍の全エクソーム分析を行うことを選択した。

血液サンプルをＫ２−ＥＤＴＡチューブに採取した。サンプルを、血液の二重遠心分離（最初に１，０００ｇで１０分間、次いで２０００ｇで血漿を１０分間）によって採取から２時間以内に処理した。血漿を−８０℃で１ｍｌのアリコートに保管した。

Ｓｉｇｎａｔｅｒａ（商標）ＲＵＯプラットフォーム。全ての研究および技術スタッフは、患者の結果について盲検であり、分析は、盲検方法で行われた。サインオフＳＯＰおよび署名をした訓練を受けた担当者が、厳格に制御された半自動化ラボポロセスを行った。全ての試薬および機器は、Ｓｉｇｎａｔｅｒａ（商標）ＲＵＯパイプラインに入る前に制御され、適格であった。このプロセスおよび試薬／機器の情報は、電子的に取り込まれ、整合性チェックを内包したデータベースにアップロードされた。品質管理は、ワークフローの全ての工程で行われた（図６７Ａ〜Ｄ）。ＱＣに合格しなかったサンプルおよびアンプリコンは、分析から除外された。各患者について、４５個のＳＮＰのセットをＷＥＳおよび血漿配列決定で遺伝子型決定し、サンプルの一致性を確保した。ＷＥＳデータを使用して、全４９名の患者の体細胞変異の患者固有のパネルを設計した。合計２１５個の血漿サンプルをｃｔＤＮＡ検出のために分析した。各標的バリアントについて、変異体および参照対立遺伝子のリード深度に基づき、信頼性スコアを計算した。２以上の高い信頼性のバリアントを含む血漿サンプルは、ｃｔＤＮＡ陽性とみなされた。Ｓｉｇｎａｔｅｒａワークフローの工程の詳細は、以下に提供される。

統計分析
全てのデータは、平均、中央値または割合として記述的に示された。試験登録日からの無再発生存率は、カプラン−マイヤーの方法を用いて決定された。コックス比例ハザード回帰を使用して、疾患再発までの時間をモデル化した。全ての確率分析は、Ｓｔａｔａリリース１２．０（Ｓｔａｔａ Ｃｏｒｐ．、カレッジステーション、テキサス、ＵＳＡ）と、Ｒバージョン３．５．１（「ｓｕｒｖｍｉｎｅｒ」パッケージバージョン０．４．２．９９）を用いて作成した生存率プロットを用いて行われた。

欠落した連続データを取り扱うための慎重な戦略が使用された。単一のデータ点が欠落している場合、最後の観測を先に行ったか、または前後のデータが利用可能である場合、これらの２つの値の平均を欠落したデータの推定値として使用した。

全エクソーム配列決定
診断用ＦＦＰＥブロックを目視検査によって検査し、最も大きい残存腫瘍を有するブロックをＤＮＡ単離のために使用した。単一のＨ＆Ｅ組織片を、相談役の組織病理学者（ＤＭ）がレビューし、１ｍｍの組織マイクロアレイコア針を使用して、最少で２領域の腫瘍をマクロ解剖した。ＤＮＡは、Ｇｅｎｅ Ｒｅａｄキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、製造業者の指示に従ってＦＦＰＥ腫瘍コアから抽出され、ＤＮＡ濃度を既に記載したように測定した。

Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑを使用して、各ＦＦＰＥ原発性腫瘍ブロック由来の１〜３領域のコアからの２００〜５００ｎｇのプールされた腫瘍ＤＮＡに対して全エクソーム配列決定を行った（配列決定は、全ての４９個の腫瘍ＤＮＡについて１５０倍、４９のマッチした生殖細胞系サンプルについて５０倍のオンターゲットリード深度で重複しない平均で、Ｎｏｖｏｇｅｎｅによって１サービスあたりの料金として行われた。全ての配列決定データは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｇｅｎｏｍｅ−Ｐｈｅｎｏｍｅ Ａｒｃｈｉｖｅに寄託されている。

特注のパネルデザイン患者固有の体細胞バリアントは、全ての４９名の患者について、原発性腫瘍とマッチした正常ＷＥＳの分析によって特定された。バリアントのクローン性は、バリアントを含む癌細胞の推定割合に基づいて推測された。推測されたクローン性およびバリアントの種類を使用して、各腫瘍について特定された体細胞ＳＮＶおよび短いインデルの優先順位を付けた。標準的なＳｉｇｎａｔｅｒａアッセイ設計パイプラインを使用して、所与のセットのバリアントについてＰＣＲプライマーを作成した。各患者について、特注の患者固有のパネルのために１６個の高くランク付けされた適合するアッセイを選択した。患者固有の１６反応分ＰＣＲアッセイを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから発注した。

ｃｆＤＮＡの抽出および定量化１症例あたり８ｍｌまでの血漿が、この試験のために利用可能であった（範囲１〜８ｍｌ、中央値５ｍＬ）。血漿の全体積をｃｆＤＮＡ抽出に使用した。ｃｆＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出され、５０μＬのＤＮＡ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ）に溶出させた。各ｃｆＤＮＡサンプルをＱｕａｎｔ−ｉＴ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって定量化した。４９名の患者において、ｃｆＤＮＡは、合計２１５個の連続的な血漿サンプルから単離された。

ｃｆＤＮＡライブラリ調製各血漿サンプルからの６６ｎｇ（２０，０００ゲノム相当）までのｃｆＤＮＡを、特注のライブラリ調製へのインプットとして使用した。無細胞ＤＮＡを末端修復し、Ａテーリングし、特注のアダプターを用いてライゲーションした。精製されたライゲーション産物を２０サイクルかけて増幅させ、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ／Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて精製した。

血漿マルチプレックスＰＣＲ ＮＧＳワークフロー各ライブラリのアリコートを、関連する患者固有の１６反応分ＰＣＲ反応へのインプットとして使用した。サンプルをＳｉｇｎａｔｅｒａの腫瘍特有のアッセイを用いて増幅し、バーコード化し、次いで、プールした。配列決定は、アンプリコンあたり１００，０００を超える平均リード深度でＩｌｌｕｍｉｎａ Ｐａｉｒｅｄ Ｅｎｄ ｖ２キットを用い、５０サイクルのペアエンドリードを用いたＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００ Ｒａｐｉｄ Ｒｕｎで行った。

バイオインフォマティクスパイプラインＰｅａｒソフトウェアを用い、全てのペアエンドリードをマージした。順方向および逆方向のリードにマッチしなかったか、または低品質のスコアを有する塩基をフィルタリングで取り除き、配列決定エラーを最小限にした。マージされたリードを、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎバージョン２．３．４を用い、ｈｇ１９参照ゲノムにマッピングした。５，０００未満の高品質リードを有するアンプリコンは、ＱＣに不合格とみなされた。品質管理は、総リード数、マッピングされたリード、オンターゲットリード、失敗した標的の数および平均エラー率を含む、サンプルあたりの広い統計リストを検査する社内プログラムを用いて行われた（図６７Ａ〜Ｄ）。

血漿バリアントのコール陰性対照サンプルの多数のセット（約１０００）を前処理し、バリアント特有のバックグラウンドエラーモデルを構築した。信頼性スコアは、エラーモデルに基づいて、変異体および参照対立遺伝子を用い、各標的バリアントについて計算され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。所定の閾値（０．９７）を超える信頼性スコアを有する少なくとも２個のバリアントを含む血漿サンプルは、ｃｔＤＮＡ陽性と呼ばれる。

分析検証分析検証は、３種類の癌細胞株からのモノヌクレオソームＤＮＡの、それらのマッチした正常相当物（ＡＴＣＣ）へのタイトレーションを用いて行われた。２種類の乳癌細胞株（ＨＣＣ２２１８およびＨＣＣ１３９５）、１種類の肺癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１３９５）およびこれらのマッチした正常Ｂリンパ芽球由来の細胞株（ＨＣＣ２２１８−ＢＬ、ＨＣＣ１３９５−ＢＬおよびＮＣＩ−ＢＬ１３９５）を使用した。各細胞株対について、ＤＮＡをエクソーム配列決定し、標的バリアントを選択し、標準的なＳｉｇｎａｔｅｒａパイプラインを用い、２個のマルチプレックスＰＣＲプライマープールを設計した。正常なモノヌクレオソームＤＮＡへの腫瘍のタイトレーションは、１％、０．５％、０．３％、０．１％、０．０５％、０．０３％、０．０１％、０．００５％、０％の平均ＶＡＦ（ＤＮＡインプットに基づく）で行われた（複製数は、希釈因子と共に２〜９まで増加させた）。腫瘍細胞株における不均一性および異数性の可能性に起因して、個々の標的のＶＡＦは、平均インプットＶＡＦとは異なる場合がある。各タイトレーション工程における各標的の公称ＶＡＦを正確に計算するために、１０％ＶＡＦの混合物を用いて別個の実験を行った。次いで、この実験から観測されたＶＡＦを使用して、インプット補正因子を計算した（観測されたＶＡＦ／１０％）。この補正因子は、一連の希釈で、それぞれの標的に適用された。さらなる陰性サンプルを、１６個のヒト血漿から単離されたｃｆＤＮＡ（それぞれ約８ｍＬ）を用いて実行した。一連のタイトレーションについて、６６ｎｇのｃｆＤＮＡ（２０，０００の倍体ゲノム相当に対応する）を、Ｓｉｇｎａｔｅｒａライブラリ調製へのインプットとして使用した。血漿ｃｆＤＮＡサンプルについて、全ての単離されたＤＮＡ（１３〜５５ｎｇの範囲）をインプットとして使用した。次いで、これらのライブラリをＳｉｇｎａｔｅｒａ血漿ワークフローによって実行し（各タイトレーションサンプルについて２個のプライマープールと、各ｃｆＤＮＡサンプルについて５個のプライマープール）、配列決定し、Ｓｉｇｎａｔｅｒａ分析パイプラインを用いて分析した。図６８Ａは、種々の濃度レベルで、血漿中の標的を検出するための本願発明者らの推定感度を示す。陰性サンプルから９９．６％を超える標的特異性が達成された。特注パネルが１０〜１６クローンバリアントを有すると仮定すると、図６８Ｂで報告されるように、サンプルレベルの感度を導き出すことができる。サンプルレベルの特異性は、９９．８％を超えると推定される。

結果
ここでは、ＥＢＬＩＳ試験に参加した最初の５０名の患者の分析を報告する（図６０）。１つの腫瘍サンプルは、エクソーム配列決定には不十分であったため、４９名の患者について試験を進めた。１８名の患者が再発し、３１名は、報告調査日（２０１８年６月３０日）の時点で無疾患のままである。４９名の患者のうち７名を除く全ての患者は、アントラサイクリン／タキサンレジメンを用いたアジュバントまたはＮＡＣＴ化学療法を受けた（図６９および表Ａ）。４１名の患者は、血液サンプリングの期間全体にわたって、アジュバント内分泌療法を受けていた（表Ｂ１〜Ｂ３）。治験に参加する前に、繰り返しのスキャンを必要としなかったが、３名を除く全ての患者は、診断時、またはこの試験への参加時に画像診断試験を行い、全てが正常範囲内であった（表Ｂ１〜Ｂ３）。

再発していない患者は、再発した患者に対して同じ時間枠で採用された連続患者であり、これらの患者については、エクソームプロファイリングのためにＦＦＰＥ原発性腫瘍ブロックから単離された十分な腫瘍ＤＮＡを有しており、連続的な血液サンプリングで最低２年間フォローアップされた。最適化されたＳｉｇｎａｔｅｒａワークフローを使用し、盲検手法において、連続的な血漿サンプルを分析した。

再発した１８名の患者のうち、１０名はＣＴによって検出され、３名は骨スキャンによって検出され、それぞれ１名がマンモグラフィー、ＭＲＩ、肝酵素の上昇および超音波によって検出された。１名の患者が原因不明で亡くなった。

循環腫瘍ＤＮＡの検出およびリード間隔
全ての患者からＦＦＰＥ腫瘍サンプルを採取した。３９名は、生検前に全身療法を受けていなかった。１０名は、乳癌切除の前にネオアジュバント化学療法（ＮＡＣＴ）を受けていた（図６０および表Ｂ１〜Ｂ３において、血液サンプルのタイミングを含め、全ての全身療法の詳細）。

循環腫瘍ＤＮＡの存在を評価するために、各患者について、各患者の腫瘍の体細胞変異プロファイルから１６個の体細胞ＳＮＶおよびインデルバリアントを標的とする患者固有のアッセイを設計した（図６４Ａ〜Ｃ）。次いで、４９のそれぞれの個別化されたアッセイを、４９名の患者からの２０８個の血漿サンプル（範囲：１〜８個のタイムポイント）のそれぞれに適用した。

循環腫瘍ＤＮＡは、再発した患者の８９％（１８名のうち１６名）で検出された。検出は、それぞれ、ＨＲ＋／ＨＥＲ２−、ＨＥＲ２＋およびトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）において８２％、１００％および１００％であった（図６１ＡおよびＢ）。ｃｔＤＮＡによって検出されなかった２名の再発患者のうち、１名（１０１８）は、３種類の原発癌を有しており、他の１名（１０１９）は、胸骨に小さな局所的再発を有していた（その後に切除された）（図６１Ａ、表Ａ）。特筆すべきことに、１名の患者（１０７２）は、最初は正常な血液プロファイルを有していたが、最後の通院時にｃｔＤＮＡについて陽性であった。この患者は、血液プロファイルの時点では無疾患であったが、この患者は、その後に、調査日の直前に遠隔転移が存在した（図６１Ａおよび図６５Ａ）。臨床的再発の最大２年前までに、再発疾患を検出し、中央値は２６６日であった（８．９ヶ月、図６１Ｂ）。サブタイプによって分けると、リードタイムの中央値は、それぞれ、ＨＲ＋／ＨＥＲ２−、ＨＥＲ２＋およびトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）について３０１、１６４および２５８日であった（図６１ＢおよびＣ）。驚くべきことに、２名のＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２−患者（１０３１および１０５１、図６１Ａ）において、臨床的再発の前にｃｔＤＮＡ陽性であったタイムポイントが最大４個存在し、これはほぼ２年間のリード間隔に翻訳される。

疾患再発が起こらなかった３１名の患者からの１５６個の血漿サンプルのどのサンプルにおいても、ｃｔＤＮＡを検出しなかった（図６１Ａ）。ｃｔＤＮＡの存在は、最初の手術後血漿サンプル中のｃｔＤＮＡの検出（ＨＲ＝１１．８（９５％ＣＩ ４．３〜３２．５））と手術後のフォローアップ血漿サンプル中のｃｔＤＮＡの検出（ＨＲ＝３５．８（９５％ＣＩ ８．０〜１６１．３））の両方によって示される有意に悪い予後と関係があった（図６２Ａ〜Ｂ）。ｃｔＤＮＡ陽性であった全ての患者は、手術から５０ヶ月以内に再発した。

全ての患者について、放射線検査およびスキャン検査は、明らかな再発の日まで遠隔転移について陰性であり、一般的には患者の症状が先行した。患者の多くは、概要説明時に行われたスキャンを補うためのフォローアップスキャンを受けており、これらも陰性であった（表Ｂ１〜Ｂ３）。７名の患者（１００４、１０５５、１０７２、１０９１、３０１８、３０１９、３０４８）は、最初に陽性になったｃｔＤＮＡ試験の４ヶ月以内にスキャンを行い、全て陰性であった。

また、治験期間を通じて、４９名の患者のうち４３名でＣＡ１５−３をモニタリングした。これらの患者のうち３９名は、フォローアップ期間を通じて正常な結果を有していた。再発した１８名の患者のうち１２名は、モニタリング期間を通じて、正常なＣＡ１５−３レベルを有していた。２名の患者（１０５１および１０８８）は、漸進的にＣＡ１５−３が上昇したが、ｃｔＤＮＡは、ＣＡ１５−３よりも感度が高く、それぞれ、ＣＡ１５−３レベルが上昇する２２４日前および２１２日前にｃｔＤＮＡが検出された（図６３Ａおよび図６５Ｂ）。患者１１１１および１０１８は、臨床的再発の前に採取された１個の血液サンプルを有しており、ＣＡ１５−３測定値が上昇していた。患者１１１１は、陽性のｃｔＤＮＡ検査結果を有しているが、患者１０１８は、ｃｔＤＮＡについて陰性と試験された。特筆すべきことに、他の６名の患者（３名が再発し、３名は再発していない）は、時々、ＣＡ１５−３がわずかに上昇した血液サンプルを有していたが、これは変動しており、疾患の進行を反映したものではなかった（表Ｂ１〜Ｂ３）。

循環腫瘍ＤＮＡの特性決定
Ｓｉｇｎａｔｅｒａアッセイは、最も高い尤度の検出を提供する１６個の患者固有の体細胞ＳＮＶおよびインデルバリアントを標的とするように設計される。ｃｔＤＮＡによって検出された１６名の全ての再発した患者を図６３および図６５に示す。８名の再発した患者からの１０個の血漿サンプルは、０．０１〜０．０２％以内で検出されたバリアント対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）を有していた。０．０１％の最も小さいバリアント対立遺伝子頻度は、血漿サンプル中の単一変異体分子の検出に対応する（図６６）。このレベルの感度は、４名の患者１００４、０１０５５、１０７２および１０９６でもみられる（図６３、図６５、表Ｃ）。この試験の９９．５％より高い特異性は、ｃｔＤＮＡが血漿中に存在することを確実にするために、コールアルゴリズムの選択した信頼性閾値を上回る２個以上のバリアントが測定されることを要求することによって達成される。特異性は、再発していない患者の血漿サンプルがどれも陽性とコールされなかったという事実によって強調される。

経時的なｃｔＤＮＡプロファイルの変化という観点で、ｃｔＤＮＡによって検出された１６名の再発のうち、７名の患者は、全ての分析されたタイムポイントで陽性のｃｔＤＮＡ検査結果を有しており、経時的な検出されたバリアントの数およびＶＡＦの割合の両方で増加を示し、最初はｃｔＤＮＡ陰性であった６名の患者は、後に陽性になり、３名の再発した患者は、分析に利用可能な血漿タイムポイントを１個しか有しておらず、全てｃｔＤＮＡ陽性であった（図６３および図６５）。

これらの患者のうち５名は、図６３で強調表示されており、各サブタイプであるＨＲ＋／ＨＥＲ２−（１０３１および１０５１）、ＨＥＲ２＋（１０９６）およびＴＮＢＣ（１０５５および１０７４）のうちの少なくとも１つが表されている。患者１０３１、１０５１、１０５５は、最初はｃｔＤＮＡ陰性であったが、後のタイムポイントでｃｔＤＮＡが検出可能になった（図６３Ａ〜Ｃ）。これらの患者のうち２名は、両者ともＨＲ＋であり（１０３１および１０５１）、ｃｔＤＮＡによって検出される分子再発と、臨床的再発との間に、それぞれ７２１日および６１１日の最大のリードタイムを有していた（図６３Ａ〜Ｂ）。患者１０３１、１０５５、１０７４および１０９６は、０．０１〜０．０２％の範囲でバリアント対立遺伝子頻度が検出され、疾患進行と相関関係にあるＶＡＦの漸進的な上昇を示した（図６３Ｂ〜Ｅ）。全ての患者は、ｃｔＤＮＡが一旦検出されると、フォローアップを通じて陽性のままであった（図６３および図６５）。

概して、疾患の進行は、図６３Ｆに示されるように、バリアント対立遺伝子頻度と、検出されたバリアントの数の両方によってモニタリングすることができる。患者ごとにタイムポイントの数が異なるため、同じ患者からの一連の血漿サンプルにおいて、その差は、最初および最後のタイムポイントによって強調される。バリアント対立遺伝子頻度の中央値は、最初野タイムポイントでの０．０９２％（範囲：０．０１％〜９．２）から３．９％（範囲：０．０５〜６４．４％）まで上昇し、一方、最初のタイムポイントで検出されたバリアント数の中央値は、最後のタイムポイントで１２バリアント（範囲：５〜１５）であるのと比較して、５（範囲：２〜１２）であった。初期のタイムポイントで検出されたバリアントの数が少ないことと、非常に低いコピー数で存在するという事実は、患者の血漿中のｃｔＤＮＡの存在について高感度の試験を行うために、患者の腫瘍に存在する複数の変異を試験する重要性を示している。

考察
この報告は、主要なサブタイプにわたる乳癌患者において微小残存病変をモニタリングする、信頼性が高く、再現性がある方法を記載する。この手法は、腫瘍からのゲノムデータを使用して、患者固有のアッセイを設計する。次いで、血漿ｃｆＤＮＡの配列決定は、標的あたり平均で１００，０００を超えるリードに対して非常に大きな深さで行われ、単一変異分子まで下げた感度の検出を達成する。この新しい革新的な技術は、現代医療における実施にとって、安定かつ拡張性があり、すでに研究用途では製品化されている。このことは、例えば、英国内の全ての癌に２０１８年秋からゲノムプロファイリングを行うという近年の発表を考慮すると、特に時宜にかなったものである。Ｓｉｇｎａｔｅｒａプラットフォームは、微小転移病変を検出する個人に合わせた方法を提供することができ、このことは、遠隔転移で再発した乳癌患者が、１名を除く全てで、明らかな再発の前に陽性の血液検査結果を有しており、ある場合には、ほぼ２年間のリード間隔を示すという本研究の結果によって明らかに裏付けられている。

この技術のプロトタイプを用いた以前の研究は、非小細胞肺癌患者における有望性を示し（Ａｂｂｏｓｈら、２０１７、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ワークフローは、さらに高い感度のｃｔＤＮＡ検出を達成するために、また、より経済的であるために、洗練されてきた。ここで、このシステムの優れた再現性および精度を示す。既知のドライバー遺伝子ではなく、患者に対して固有のＳＮＶに焦点をあてることで、今日まで、乳癌患者においてＭＲＤを検出する、最も正確で感度の高い方法を表す。

初期の癌の管理におけるｃｔＤＮＡ測定の臨床的応用は、まだ非常に議論の多い課題であり、近年のＡＳＣＯおよびＡＣＰの共同の報告は、初期の癌の治療モニタリングまたは早期の残存病変検出において、臨床的有用性の証拠はなく、臨床的妥当性の証拠がほとんどないと結論付けた。この結論は、一部には、全ての以前の研究が、ここで行われたような従来のマーカーとの比較がない状態で行われているという事実に起因するものであろう。

この研究からわかったいくつかの重要な点がある。第１に、現在、画像診断で疾患の証拠がない患者において、高い精度で再発を予測することができる。第２に、現在、ほとんどの患者は、年に１回のマンモグラフィーと、ある場合には、ＣＡ１５−３および肝機能検査を組み合わせることによって、米国および英国の施設でフォローアップされている。検出可能な転移がない状態でＣＡ１５−３が漸進的に上昇した２例を除いて、明らかな転移性再発が起こるまで、本願発明者らのコホートでは全員正常であり、このことは、医師によって使用される現行の手法の限界を示している。再発した患者のうち７名は、ｃｔＤＮＡを最初に検出した頃にスキャンも行っており、全て陰性であった。注目すべきは、何名かの患者が、ＣＡ１５−３が一時的に上昇し、無疾患のままであり、一方、Ｓｉｇｎａｔｅｒａ試験は、一旦検出されると一貫して陽性であり、偽陽性が存在しなかったという観察結果である。第３に、ＮＡＣＴが原発性癌を減少させた（このときエクソーム配列決定が行われた）という事実にもかかわらず、残存癌の変異シグネチャは、これらの患者における残存転移性疾患を反映しており、原発腫瘍変異プロファイルに基づいて設計された、個別化された試験が可能であるだけでなく、有効であることを示唆している。

しかし、血漿にｃｔＤＮＡを流し込むことが要求されているため、この試験は、最初に十分に攻撃性のある疾患を有する者に限定される場合があり、そのため、良好な予後を有することが多い、小さく攻撃性の低い乳癌を有する患者には適用可能ではない場合がある。本願発明者らのアッセイの検出限界が、単一分子まで下がっているため、検出が無いことは、攻撃性の低い腫瘍が、より少ないｃｔＤＮＡ分子を放出し得るという腫瘍生物学に関連している可能性が高い。このことは、ｃｔＤＮＡ陰性でありつつ、局所的に切除可能な疾患を再発した１名の患者（１０１８）によって例示される。さらに、複数の原発性腫瘍を有する患者において、疾患の進行をモニタリングするには、全てをプロファイリングする必要があるだろう。このことは、３個の原発性腫瘍を有していた患者１０１９でみられ、残念ながら、利用可能な組織が限られているために、１個だけがエクソーム配列決定に供された。この場合、疾患再発は、ｃｔＤＮＡによって検出されず、本願発明者らの仮説は、転移が、配列決定された腫瘍に由来するものではなかったということである。最後に、この試験は、元々の腫瘍の再発でない限り、第２の原発性乳癌を検出するのには適していない。このことは、第２の対側原発性癌が通常のマンモグラフィーで発見されたが、血漿は全体を通じてｃｔＤＮＡ陰性のままであった患者１０４４によって例示される（表Ａ）。

ここに記載される分析プラットフォームは、血漿からの追跡可能な標的を特定することを意図していない。腫瘍ＤＮＡ検出に使用するために選択されたＳＮＶの大部分は、各患者に固有であり、癌の進行に寄与することが多いドライバー変異を表すのではなく、腫瘍負荷の反映として選択された。しかし、これはＳｉｇｎａｔｅｒａアッセイの利点でもあり、ドライバー変異は腫瘍の不均一性を変化させることにつながる選択的な利点を与えることが多いため、パッセンジャーおよびクローン変異を選択することは、疾患負荷をモニタリングするのに不可欠である。１６反応分のアッセイは、発症原因となる標的を提供しないが、腫瘍ＷＥＳは、このような標的を提供する場合があり、血漿ライブラリは、追跡可能な変異を特定する他のアッセイも用いて試験されてもよい。

本願発明者らの結果は、例えばＰＩＫ３ＣＡにおいて発症原因となる変異がネオアジュバントおよびアジュバント期間を通じてモニタリングされる他の結果を補完するものである。ドライバー変異を選択することで、ある種の腫瘍の進行をモニタリングすることができる（参考文献）が、全ての患者が、その腫瘍中に同じ標的ドライバー変異を有するわけではないため、全ての患者において早期の転移性再発を検出するのに有用ではないことが研究で示されている（参考文献）。以前の１つの研究において、症例の７８％（５５名のうち４３名）のみが、特定された１つ以上の体細胞変異を有しており、その後、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いてモニタリングされた。また、１０個の乳癌遺伝子において１５０個を超えるホットスポットを標的とする「既製の」乳癌パネル（Ｏｎｃｏｍｉｎｅ（商標）Ｂｒｅａｓｔ ｃｆＤＮＡ Ａｓｓａｙ）も分析し、このパネルは、乳癌患者の７３％だけにおいて、ｃｔＤＮＡを特定した。遺伝子パネルは、全ての乳癌症例の不均一性を表現することができないため、上述の２つの例にみられるように、全ての乳癌患者に対して包含的ではなく、または適用可能ではない。したがって、腫瘍エクソームプロファイリングおよびＳｉｇｎａｔｅｒａの特注の手法の使用は、全ての転移性乳癌患者において、微小残存病変を検出するために使用すべきである。陽性である場合、発症原因となる変異について二次分析を行うべきである。

本願発明者らの研究には、いくつかの重要な結果が存在する。これまでに、標的療法または細胞毒性療法を用いた全身治療は、アジュバント環境で投与された場合にのみ、治療に効くことが示されてきた。明らかな転移性疾患の治療は、治療に効くとしても、まれである（参考文献）。本明細書に記載される手法は、代替法を与え、ｃｔＤＮＡを有する患者をセカンドライン療法で救おうとするものである。別の用途は、特に、その機構が免疫応答を向上させるものである新しい薬物療法の評価を支援することであろう。これまでに、成功の間接的尺度は、進行までの時間が使用されてきた。ＳｉｇｎａｔｅｒａのｃｔＤＮＡ検出方法は、成功の別の尺度（ｃｔＤＮＡの減少または除去）を物差しとして使用することを可能にする。

結論として、Ｓｉｇｎａｔｅｒａプラットフォームは、高感度で乳癌患者においてＭＲＤを検出することができる。このプラットフォームは、従来のフォローアップ手段よりも優れており、精密な医療のために患者をモニタリングするための有望性を示す。このプラットフォームは、初めて、疾患が制御された状態にある患者を安心させる、血液に基づく検査を提供する。

まとめ
多くのＢＣ患者は、一次治療後に再発するが、明らかになる前に遠隔転移を検出する信頼性の高い検査が存在しない。ここでは、拡張可能な個別化された循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）分析による乳癌再発の早期特定を示す。この方法は、全ての患者に適用可能であり、典型的には遺伝子パネルによって検出されるホットスポット変異に限定されない。

手術およびアジュバント療法の後に、４９名の転移していないＢＣ患者を募集した。血漿サンプル（ｎ＝２０８）を半年ごとに連続的に採取した。分析的に検証されるＳｉｇｎａｔｅｒａ（商標）ワークフローを用い、原発性腫瘍の全エクソームデータから変異シグネチャを決定し、超深部配列決定（平均＞１００，０００倍）によって、高感度の１６個のバリアントを標的とする個別化されたアッセイを設計した。患者固有のアッセイを使用して、血漿中のｃｔＤＮＡの存在を検出した。

１８名中１６名（８９％）の臨床的に再発した患者において、臨床検査、放射線画像診断およびＣＡ１５−３測定によって診断される転移性再発の前にｃｔＤＮＡが検出され、フォローアップ全体を通じてｃｔＤＮＡ−陽性のままであった。ｃｔＤＮＡによって検出されない２名の患者のうち、１名は、小さな局所的再発のみを有し（現在は切除されている）、もう１名は、３個の原発性腫瘍を有していた。３１名の再発していない患者は誰も、任意のタイムポイントでｃｔＤＮＡ陽性ではなかった（ｎ＝１５６）。転移性再発は、Ｓｉｇｎａｔｅｒａによって予測され、リードタイムは最大２年間であった（中央値＝８．９ヶ月、ＨＲ：３５．８４（９５％ＣＩ ７．９６２６〜１６１．３２））。

拡張可能な患者固有のｃｔＤＮＡに基づいて検証されたワークフローの使用は、主要な乳癌サブタイプにわたる臨床検出の前に起こる転移性乳癌再発の前に、微小残存病変を検出する。ｃｔＤＮＡ分析による正確かつ早期の予測は、明らかに生命を脅かす転移性再発を防ぐ試みにおいて、セカンドラインの救済アジュバント療法を必要とする乳癌患者をモニタリングする手段を提供することができる。

実施例９．尿路上皮膀胱癌腫患者において連続的な血漿無細胞ＤＮＡを超深部配列決定することによる、転移性再発の早期検出および治療有効性のモニタリング。
序論
膀胱癌は、尿路の最も一般的な悪性腫瘍であり、新しく診断された尿路上皮癌腫を有する患者の約２０〜２５％が、筋層浸潤性膀胱癌（ＭＩＢＣ）を発症し、非ＭＩＢＣ（ＮＭＩＢＣ）と診断された患者の１０〜３０％が、ＭＩＢＣに進行する。ＭＩＢＣを治療する現在の標準的な方法は、根治的な膀胱切除術である。残念ながら、手術時にリンパ節転移陰性の患者の２０％およびリンパ節転移陽性の疾患を有する患者の８０％は、転移性再発を経験し、全生存率（ＯＳ）は、５年間で平均５０％である。

ネオアジュバント療法（ＮＡＣ）は、ＭＩＢＣ患者の生存率を向上させ、ゲムシタビンおよびシスプラチン（ＧＣ）を用いた治療は、ＭＩＢＣの最も一般的に使用されるネオアジュバント化学療法（ＮＡＣ）である。現在、ゲムシタビンおよびシスプラチンを用いた治療は、患者の約４０〜５０％において、有意なダウンステージ（切除術時点でｐＴ＜２ Ｎ０）をもたらす。

膀胱癌を有する患者における転移性再発の早期検出は、生存率を高めるための新しい治療手法を提供し得る。初期のタイムポイントでの膀胱切除後の転移性再発の特定は、再発がレントゲン写真による画像診断によって検出不可能である場合、早期／アジュバント治療から利益を受け得る患者の特定を有意に改善し、この治療群の生存転帰を改善することができる。これに加えて、再発および転移の早期判定は、治療に応答していない患者の不必要かつ潜在的に有害な長期治療を防ぐのに役立たせることができる。

現在、計画的な間隔での標準的なコンピュータ断層撮影（ＣＴ）画像診断を使用して、再発、転移を検出し、治療に対する応答をモニタリングする。画像診断技術は、腫瘍負荷の評価を与えるが、モニタリングの可能性は、測定の最適ではない検出限界および固有の変動によって制限される。したがって、転移性再発および／または進行の早期検出と治療有効性の評価は、依然として主な臨床課題である。

診断時の疾患ステージ決定、腫瘍負荷、転移性再発の早期検出および治療処置応答のバイオマーカーとして循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を使用する完全な可能性は、依然として満たされないままである。近年の有望な研究は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を使用して、転移性疾患における初期肺癌の進化およびサブクローンの発達をモニタリングし得ることを示す（Ａｂｂｏｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ ５４５、４４６−４５１（２０１７）（「Ａｂｂｏｓｈら、２０１７」）、その全体が本明細書に組み込まれる）。膀胱癌において、ｃｔＤＮＡが血漿および尿において検出可能であり、高レベルのｃｔＤＮＡが、後に検出される臨床疾患の進行および転移性疾患と関連していることが示された（Ｂｉｒｋｅｎｋａｍｐ−Ｄｅｍｔｒｏｄｅｒら、Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ．７０、７５−８２（２０１６）、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ．７１、９６１−９６９（２０１７）、Ｂｉｒｋｅｎｋａｍｐ−Ｄｅｍｔｒｏｄｅｒ，Ｋ．ら、Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ．７３、５３５−５４０（２０１８）、Ｐａｔｅｌら、Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７、５５５４（２０１７））。しかし、これらの膀胱癌における以前の研究は、より小さな選択されたコホートに基づいており、本明細書に開示される次世代配列決定（ＮＧＳ）に基づく方法と比較して、比較的制限された感度を有するｄｄＰＣＲアッセイを使用した。

ここでは、膀胱切除前にネオアジュバント化学療法（ｎ＝５６）またはファーストライン化学療法（ｎ＝１２）で治療された６８名の患者の原発性腫瘍とマッチした生殖細胞系ＤＮＡとの全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）を包含する前向き研究からの結果を報告する。各それぞれの患者の腫瘍変異シグネチャに特異的な、感度の高い個別化されたマルチプレックスＰＣＲ ＮＧＳに基づくアッセイが設計され、これを使用して、化学療法の前、間、後に長期的に調達された血漿サンプルにおいて体細胞変異をモニタリングした。この研究の主な目的は、予後、転移性疾患の早期検出のための強力なバイオマーカーとして、また、化学療法応答の予測因子としてのｃｔＤＮＡの使用を可能にするｃｔＤＮＡ検出の方法を開発することであった。

方法
患者および臨床サンプル
ＭＩＢＣと診断され、膀胱切除前にネオアジュバント化学療法を受けている患者と、以前に膀胱切除術を受けたか、または受けていない転移性疾患に起因する化学療法を受けている患者が、２０１３〜２０１７年に、単一の三次医療大学病院（Ａａｒｈｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、デンマーク）で登録された。根治的な膀胱切除術は、患者の基準およびロボットの利用可能性に基づき、開放性膀胱切除術またはロボット支援型として行われた。全ての患者において、大動脈分岐部のレベルまで延長されたリンパ節切除を行った。

患者は、デンマーク国のガイドラインに従って治療された。ネオアジュバント化学療法は、４シリーズのゲムシタビンおよびシスプラチン（ＧＣ）として、３週間間隔で投与された。診断時に転移またはｃＴ４ｂ腫瘍を有する患者は、最大６シリーズのＧＣで治療された。ＣＸ前に投与された化学療法の後の病理学的なダウンステージは、治療後に＜Ｔ１Ｎ０であると定義された。膀胱切除患者は、ｐＴ２Ｎ０と診断された患者について、治療前のＰＥＴ／ＣＴによって、また、膀胱切除後に４、１２、２４ヶ月後の計画通院（ｓｃｈｅｄｕｌｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｓ）で胸部および腹部のＣＴによってレントゲン写真による画像診断で観察され、＞ｐＴ２および／またはＮ＋と診断された患者について、８ヶ月目および１８ヶ月目にさらなる通院で観察された。進行性疾患について治療された患者は、３〜４ヶ月間隔でＣＴを用いて観察された。詳細なフォローアップデータが全ての患者について利用可能であり、臨床エンドポイントは、最後に記録された訪問であるか、または国の個人登録簿から得られた死亡時刻であった。患者は、以下の基準に基づいて、全エクソーム配列決定のために選択された。１）局所的なＭＩＢＣのためのネオアジュバント／ファーストライン化学療法、２）化学療法の前および後、ＣＸの前および後に血漿サンプルが採取された通院の数、３）腫瘍生検の利用可能性。全ての患者は、書面によるインフォームドコンセントを提供し、この試験は、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ（番号１３０２１８３）によって承認された。

サンプル採取およびＤＮＡ抽出
血液、腫瘍生検および長期的に採取された血漿サンプルからの物質を分析した。組織生検は、診断時にＴＵＲ−Ｂから得られた。ＤＮＡは、上述のように、ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ（登録商標）Ｏ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄに包埋された組織（Ｓａｋｕｒａ）からの切片、または癌細胞の割合が高い最も代表的な局部で採取された穿孔物からのホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）切片のいずれかから抽出された。各通院で、またはそれぞれのシリーズの化学療法の前に、４０ｍＬのＥＤＴＡ血液を採取し、すぐに処理した。サンプルを、室温で、３０００ｘｇで１０分間遠心分離し、血漿および軟膜を別個に−８０℃で保管した。生殖細胞系ＤＮＡをバフィーコート白血球から抽出し、濃度をＱＵＢＩＴ（登録商標）蛍光定量によって測定した。血漿を−８０℃で保管した。症例あたり９ｍｌまでの血漿が、この試験のために使用された（範囲４〜９ｍｌ、平均ＸｍＬ）。血漿の全体積を、ＱＩＡＡＭＰ（登録商標）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いるｃｆＤＮＡ抽出に使用し、５０μＬのＤＮＡ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ）に溶出させた。各ｃｆＤＮＡサンプルをＱＵＡＮＴ−ＩＴ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって定量化した。

エクソーム配列決定およびバイオインフォマティクス分析
腫瘍とマッチした生殖細胞系ＤＮＡとのライブラリは、１００〜５００ｎｇのＤＮＡを用いて調製され、ＳＥＱＣＡＰＥＺ（登録商標）ＭｅｄＥｘｏｍｅＶ１＿ｈｇ１９ ｏｒ ＭｅｄＥｘｏｍｅＰｌｕｓＶ１＿ｈｇ１９パネル（Ｒｏｃｈｅ）によって捕捉された。エクソーム配列決定基準、癌腫細胞の割合および組織の種類が示される。

適用されたフィルタを通過する全てのバリアントは、変異シグネチャの活性に関する分析に供された。バリアントを最初にＶＲａｎｇｅｓオブジェクトにロードし、その後、配列構成をＳｏｍａｔｉｃＳｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｒ ｐａｃｋａｇｅを用いて抽出した（Ｏｂｅｎｃｈａｉｎら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０、２０７６−２０７８（２０１４）、Ｇｅｈｒｉｎｇら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３１、３６７３−３６７５（２０１５））。コホートの大きさに起因して、変異シグネチャのｄｅ ｎｏｖｏでの抽出は適用されなかった。本願発明者らのサンプルで特定された変異プロファイルは、その代わりに、ＭｕｔａｔｉｏｎａｌＰａｔｔｅｒｎｓ Ｒ ｐａｃｋａｇｅを用い、既知のＣＯＳＭＩＣシグネチャ上に投影された（ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｏｓｍｉｃ／ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓおよびＢｌｏｋｚｉｊｌら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ．１０、３３（２０１８）を参照）。膀胱癌についてＲｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｃｅｌｌ １７１、５４０−５５６．ｅ２５（２０１７）において特定された変異シグネチャ１、２、５および１３を、分析のために優先順位を付けた。

ＤＮＡ損傷応答に関連する変異
選択したＤＮＡ損傷応答遺伝子は、Ｔｅｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３６１０−３６１８（２０１７）に記載される。これらの遺伝子において特定された変異を、破壊的であるか、または良性であるかについて分析した。全ての機能消失変異は、破壊的であるとされた。ミスセンス変異は、Ｒｅｖａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９、ｅ１１８（２０１１）およびＡｄｚｈｕｂｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７、２４８−２４９（２０１０）に記載されるように、ＰｏｌｙＰｈｅｎ２およびＭｕｔａｔｉｏｎＡｓｓｅｓｓｏｒを用いたさらなる分析に供された。それぞれＰｏｌｙＰｈｅｎ２およびＭｕｔａｔｉｏｎＡｓｓｅｓｓｏｒにおいて、おそらく破壊的である／破壊的である可能性が高い、または中程度／高として特定されるバリアントは、破壊的であるとみなされた。

無細胞ＤＮＡライブラリ調製
無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の調製は、既に記載されている。各血漿サンプルからの６６ｎｇ（２０，０００ゲノム相当）までの無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を、ライブラリ調製へのインプットとして使用した。ｃｆＤＮＡを末端修復し、Ａテーリングし、特注のアダプターを用いてライゲーションした。精製されたライゲーション産物を２０サイクルかけて増幅させ、ＡＭＰＵＲＥ（登録商標）ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ／Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて精製した。

血漿マルチプレックスＰＣＲ次世代配列決定（ＮＧＳ）のワークフロー
各ライブラリのアリコートを、関連する患者固有の１６反応分ＰＣＲ反応へのインプットとして使用した。サンプルをＳＩＧＮＡＴＥＲＡ（登録商標）腫瘍特有のアッセイを用いて増幅し、バーコード化し、次いで、プールした。配列決定は、Ａｂｂｏｓｈら、Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｃｔＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｅｐｉｃｔｓ ｅａｒｌｙ−ｓｔａｇｅ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ５４５、４４６−４５１（２０１７）に記載されるように、アンプリコンあたり１００，０００を超える平均リード深度でＩｌｌｕｍｉｎａ ＰＡＩＲＥＤ ＥＮＤ（登録商標）ｖ２キットを用い、５０サイクルのペアエンドリードを用いたＩｌｌｕｍｉｎａ ＨＩＳＥＱ（登録商標）２５００ Ｒａｐｉｄ Ｒｕｎで行った。

血漿バリアントのコール
陰性対照サンプルの多数のセット（約１０００）を前処理し、バックグラウンドエラーモデルを構築した。変異体および参照対立遺伝子のリード深度を用いる各標的バリアントについて、信頼性スコアは、Ａｂｂｏｓｈら、２０１７に記載されるようなエラーモデルに基づいて計算された。ｃｔＤＮＡ陽性血漿サンプルは、Ａｂｂｏｓｈら、２０１７に記載されるように、所定のアルゴリズム閾値（０．９７）を超える信頼性スコアを有する少なくとも２個のバリアントを含むと定義された。

血漿全エクソーム配列決定
各血漿ライブラリのアリコートをバーコード化し、ＳＥＱＣＡＰ（登録商標）ＥＺ ＭｅｄＥｘｏｍｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔを用いて捕捉した。配列決定は、２００サイクルの単一エンドリードを用い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴＲＵＥＳＥＱ（登録商標）ｖ１キットを用い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨＩＳＥＱ（登録商標）２５００で行われた。データをデマルチプレックスし、アダプターをトリミングし、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（ＢＷＡ−ｍｅｍ）ツールを用い、参照配列としてｈｇ１９を用い、マッピングを行った。重複物は、配列決定データを操作するためのＰｉｃａｒｄツールを用いてマーキングされた。このマッピングから作成されたＢａｍファイルは、ＧＡＴＫベストプラクティスにしたがって処理された（参考文献）。バリアントは、ＭｕＴｅｃｔ２を使用してコールされ、ビルトインフィルタを通過するバリアントを使用して、患者１名あたりの変化を伴うゲノム位置を特定した。その後、患者１名あたり両エクソームにおいてコールされたバリアントを使用して、含まれる位置の全てをＢＡＭ−リードカウントを用いて手動で分析した（参考文献）。２０を超える品質を有する塩基およびリードのみが含まれ、両エクソームにおいて１０未満のリードを有する位置は、比較に含まれなかった。

ＲＮＡ配列決定、データ処理および分析
ＲＮＡ配列決定は、５０〜２５０ｎｇのＲＮＡインプットを用い、ＱＵＡＮＴＳＥＱ（登録商標）３’ ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ（Ｌｅｘｏｇｅｎ）を用いて行われた。ライブラリは、製造業者の推奨に従って作成した。配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮＥＸＴＳＥＱ（登録商標）５００プラットフォームで、７０ｂｐの単一リードとして行われた。配列リードを、遺伝子長を修正せずにＳａｌｍｏｎ（Ｐａｔｒｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４、４１７−４１９（２０１７））を用い、ＧＲＣｈ３８トランスクリプトーム（ｃＤＮＡ＋ｎｃＲＮＡ）に対して整列させ、ＴＰＭ遺伝子発現データは、ｅｄｇｅＲ（ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＯｓｈｌａｃｋ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１１、Ｒ２５（２０１０））を用いて正規化された。サンプルを、ＭＩＢＣコンセンサスサブタイプに従って分離した（準備中の原稿）。

統計分析
生存率分析は、ｓｕｒｖｍｉｎｅｒパッケージおよび生存率を用いて、Ｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓで行われた。統計的有意性の評価は、連続変数に対するウィルコクソンの順位和検定およびカテゴリ変数に対するフィッシャーの正確検定を用いて行われた。

結果
患者の特徴と原発性腫瘍の分析
２０１４〜２０１７年に、Ａａｒｈｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（デンマーク）で、膀胱切除前に化学療法を受けた局所的なＭＩＢＣを有する患者を登録した（図７０）。合計で、６８名の患者が、全て参加基準を満たした（図７０、図７１Ａ〜Ｇおよび以下の表ＩＡを参照）。

腫瘍とマッチした生殖細胞系ＤＮＡとの全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）は、腫瘍サンプルについて１０４Ｘ（３１Ｘ〜２５１Ｘ）の平均標的カバレッジで行われ、患者あたり平均４８８（１１〜３５３６）個の変異を特定する生殖細胞系サンプルについて６６Ｘ（３５Ｘ〜１２０Ｘ）の平均標的カバレッジで行われた。これに加えて、膀胱癌サブタイプ、免疫シグネチャおよび細胞組成を決定するために、４６個の腫瘍のＲＮＡ配列決定を行った。全ての患者についての分子特徴および臨床データのまとめを図７１Ａ〜Ｇに示す。本研究の臨床プロトコルおよびサンプリング計画の概要を図７２に示す。

超深部マルチプレックスＰＣＲに基づく次世代配列決定（ＮＧＳ）によるｃｔＤＮＡモニタリング。
特注のマルチプレックスＰＣＲ ＮＧＳ手法をｃｔＤＮＡ検出に使用した。体細胞ＳＮＶおよび短いインデルを、組織におけるバリアント対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）の観測値および配列構成に基づき、全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）データから優先順位を付けた。独自の患者固有のアッセイを設計し、図７３に概説されるように、１６個の高くランク付けされた体細胞変異について合成した。血漿ｃｆＤＮＡに対してマルチプレックスＰＣＲ ＮＧＳを行った。Ａｂｂｏｓｈら、２０１７に開示されている、以前に開発されたコールアルゴリズムに基づいて、少なくとも２つの標的バリアントを検出した場合にのみ、サンプルはｃｔＤＮＡ陽性とコールされた。サンプルレベルの分析感度（１６個のうち２個以上のバリアントが検出される）は、０．０１％のバリアント対立遺伝子頻度で９５％を超えることが決定された。

この手法を使用して、ｃｔＤＮＡステータスは、本研究に含まれる６８名の患者からの６１８個の血漿サンプルで分析された（図７０）。品質管理は、ワークフロー全体で行われた。ＱＣに失敗したサンプルおよびアンプリコンは、さらなる分析から除外された。各患者について、４５個のＳＮＰのセットを全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）および血漿配列決定で遺伝子型決定し、サンプルの一致性を確保した。標的カバレッジの中央値は、１２０，０００倍であった。

予後および再発検出のためのｃｔＤＮＡ検出
全疾患経過にわたって、ｃｔＤＮＡの有無は、患者の転帰と強く相関関係にあった（図７４、図７５Ａ〜Ｃ）。以下の３個のタイムポイントでのｃｔＤＮＡステータスは、顕著な関心があるものであった。興味深い第１のタイムポイントは、ＮＡＣ投与前のｃｔＤＮＡステータスであり、このタイムポイントは、転帰の強い予後因子であることがわかった。膀胱癌において、第１の介入は、ＴＵＲＢＴ（膀胱腫瘍の経尿道的切除術）であるため、この第１のタイムポイントは、微小残存病変を測定するための代替として役立つことがわかった。驚くべきことに、この第１のタイムポイントでｃｔＤＮＡ陰性の患者の９４％（３４／３６）が、この試験期間中に再発しなかった。これとは対照的に、ＮＡＣの前にこのタイムポイントでｃｔＤＮＡ陽性であった患者の４４％（１１／２５）が、膀胱切除後に再発した。したがって、この初期のタイムポイントでのｃｔＤＮＡの検出は、ＮＡＣおよび膀胱切除（ＣＸ）後の長期的な臨床転帰にとって非常に強い予後因子である。

第２のタイムポイントは、ＮＡＣ後かつ膀胱切除前であり、このタイムポイントでのｃｔＤＮＡステータスも、患者転帰の強い予後因子であった。ｃｔＤＮＡ陰性患者のうち、再発を経験したｃｔＤＮＡ陽性患者の７０％（７／１０）と比較して、患者の７％だけが再発した（４／５５、４名は膀胱切除（ＣＸ）後に陽性であり、再発した）。このタイムポイントでｃｔＤＮＡ陽性の患者の１００％が、膀胱切除で特定された残存Ｔ２＋腫瘍および／またはリンパ節転移を有していたため、膀胱切除（ＣＸ）前のｃｔＤＮＡステータスは、ＣＸ時点の病理と関係があった（図７５Ｂ）。

第３のタイムポイントは、膀胱切除後であった。ＣＸ後のｃｔＤＮＡステータスによって患者を階層化することで、ｃｔＤＮＡ陽性患者の有意に悪い転帰を示した（図７５Ｃ）。ｃｔＤＮＡ陰性患者の大部分である９６％（５０／５２）は再発しなかったが、２／５２名の患者は、ＣＸ後、１．５年を超えて再発した（ｃｔＤＮＡ分析は、再発に近いときに行われていない）。これとは対照的に、ｃｔＤＮＡ陽性患者の９２％（１２／１３）が再発した。特筆すべきことに、１名の患者は、臨床評価前に死亡した（図７５Ｄ）。ＣＸ後のｃｔＤＮＡステータスは、疾患再発の予知性が高く、膀胱切除前のＮステージおよび化学療法に対する応答などの任意の他の予測因子よりも強い予測因子であることがわかった（図７５Ｅ）。

疾患サーベイランスのための連続的なｃｔＤＮＡ測定
ｃｔＤＮＡの連続的な測定が、療法応答のモニタリングおよび再発検出の両方について使用可能であることが本明細書に開示される。本願発明者らの研究において、サーベイランス環境においてｃｔＤＮＡの値を評価するために、患者が無疾患である間に、連続的な血漿タイムポイントを膀胱切除後に採取した。疾患経過中にｃｔＤＮＡの連続的な測定の分析を含む場合、１００％の特異性で９２％の感度を観測した（図７６）。平均で、ｃｔＤＮＡの検出は、レントゲン写真による画像診断による検出の９６日前（０〜２４５日前）に観測された。例えば、患者４２６５について、ＮＡＣ中のｃｔＤＮＡの低下が観測され、次いで、ｃｔＤＮＡは、ＣＸの１３８日後に検出された。一方、臨床的には、再発は、１８６日後に検出された（ＣＸから３２４日後）。同様に、患者４１８９は、ＣＸ前にｃｔＤＮＡ陽性を示し、その後陰性であり、次いで、ＣＸから２７３日後にｃｔＤＮＡが再び検出された。しかし、臨床的再発は、３６９日目、すなわち９６日後に検出された（図７６を参照）。転移性再発を有する１２名の患者について、ｃｔＤＮＡ分析を行い、従来の画像診断に対するリードタイムの中央値が１０３日（範囲；ｐ＝０．０１９）であることがわかった（図７７）。リードタイムは、画像診断と比較して、より頻回の血漿サンプリングの分析によって偏っている場合がある。本願発明者らの分析を、血漿およびレントゲン写真による画像診断を同時に行う患者に限定すると、８名の患者が特定され、そのうち５名が、ｃｔＤＮＡ分析について、再発検出のリードタイムを示した。残りの３名の患者は、同時に再発検出を示し（図７７）、８名の患者全員について得られた平均リードタイムは、１０６日であることがわかった。

療法応答モニタリングのための連続選択ｃｔＤＮＡ測定
膀胱癌は、ＮＡＣで治療されるが、事前の治療に対する応答の臨床的に有用な予測バイオマーカーは、現時点で利用可能なものはなく、ＣＸでの病理学的ダウンステージは、治療有効性の代替として使用される（参考文献）。本願発明者らのシリーズにおいて、疾患再発は、予想どおり化学療法応答と有意に関係がある（図７８Ａ）が、応答を有しない患者の４４％（ｘ／ｙ）のみが、疾患再発が起こり、このことは、病理学的ダウンステージは、治療有効性を評価するのに最適ではなかったことを示している。ここで、ＮＡＣ中のｃｔＤＮＡの連続測定は、レスポンダーと非レスポンダーとの間で非常に異なる分布を示すことがわかった（ｐ＝ｘｘ；図７８Ｆ〜Ｇ）。合計でｃｔＤＮＡ陰性患者の８３％（３４／４１）が、化学療法に対する応答を示し、初期の陽性試験結果からｃｔＤＮＡの除去を示した患者の５３％（９／１７）が応答し、このことは、ｃｔＤＮＡレベルが、治療中および治療後の治療有効性の良好な指標として役立ち得ることを示す。ＮＡＣ後のｃｔＤＮＡ陽性患者は、化学療法に対する応答を示さなかった。概して、ｃｔＤＮＡレベルは、コホートで観測された疾患経過の特徴を反映するものであった（図７８Ｇ）。

治療を受けていない腫瘍における分子特徴の分析は、化学療法に応答する患者において、変異シグネチャ５の有意に高い寄与を示した（ｐ＝０．０１）（図７８Ｂ）。シグネチャ５の高い寄与は、ＥＲＣＣ２変異ステータスと有意に関係があり（図８０）、このことは、既に２２に報告されているように、ＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）の機構と相関関係を示す。しかし、レスポンダーにおけるＥＲＣＣ２変異は、有意に多くはなかった（図７８Ｃ）。概して、ＤＤＲ変異ステータスは、化学療法応答の予測バイオマーカーではなかった（図７８Ｄ）。分子サブタイプによって腫瘍を階層化することによって（図７８Ｅ）、生存率との有意な相関関係を発見した（図７８Ｆ）が、サブタイプは、ＮＡＣに対する応答の予測因子ではなかった（図７８Ｇ）。「浸潤した」と分類される腫瘍は、他のサブタイプと比較して、化学療法に対する応答率が高かったことを示した（図７８Ｇ）。このことは、基底様腫瘍がＮＡＣ治療応答と最も関係があることを強調する初期の報告とは対照的である。

転移性疾患を有する患者からの血漿ｃｔＤＮＡの全エクソーム配列決定。
マルチプレックスＰＣＲ ＮＧＳアッセイにおいて１０％以上の対立遺伝子頻度で測定されたｃｔＤＮＡ標的を用い、血漿サンプルからのｃｆＤＮＡの全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）を行った。３名の患者からの４個のサンプルを、平均標的カバレッジが３０７Ｘ（２７２Ｘ〜３４０Ｘ）になるまで配列決定して、５０８〜１２９４個の変異を特定した。血漿ＷＥＳデータにおいて特定された全ての変異を、原発性腫瘍からの関連するＷＥＳデータと比較して、転移進化中に獲得した変異の変化を評価した（図７９Ａ〜Ｄ）。原発性腫瘍と転移性病変の変異状況の間に高い類似性を発見し、このことは、選択した患者の疾患経過中の限られたクローン進化を示している。平均で、転移の時点で存在するｃｔＤＮＡにおいて６２個の変異を特定し、これらは原発性腫瘍では検出されなかった。興味深いことに、患者４１１９の血漿において、両方ともコドン２１４に影響を与える２個のＣＹＰ２Ｃ１９変異を特定した。得られるアミノ酸は、タンパク質の活性部位へと化合物を導くのに関与する経路に位置している。これらの変異は、化学療法中に発生している可能性があり、この患者で観測された病理学的ダウンステージの欠如を説明し得る。

考察
この報告は、治療の前、間、後のｃｔＤＮＡの検出およびモニタリングに基づいて、転移性疾患の早期検出および改善された治療のための信頼性が高く、再現性がある方法を記載する。治癒目的の手術で治療された患者において、ｃｔＤＮＡの検出は、隠れた癌細胞、したがって、残存する疾患の直接的な証拠として役立つ。

興味深いことに、ｃｔＤＮＡの検出は、画像診断技術による転移性疾患の検出より先に起こることが多いことを本発明で発見した。特に、最終的に転移性膀胱癌を呈した全ての患者が、膀胱切除後にｃｔＤＮＡ陽性であり、画像診断と比較して平均リードタイムが１０３日であることを発見した。したがって、本明細書で提供されるｃｔＤＮＡを分析する方法は、より早期のタイムポイントで転移性再発の治療を開始するための固有の機会を与える。重要なことに、より少ない体積の転移性疾患に対して治療を開始することは、応答率を増加させ、生存率に良い影響を与えるだろう。

この研究は、転移性再発のリスクが低い患者を特定する、信頼性が高く、再現性がある方法も記載する。無疾患を維持している全ての患者が、膀胱切除後にｃｔＤＮＡ陰性であることが本発明でわかった（１００％の特異性）。膀胱切除後の試験の１００％の特異性を使用して、転移性再発のリスクが低い患者を特定することができ、その結果、高価なレントゲン写真による画像診断および関連する患者の不安を伴う継続的なサーベイランスの必要を減らすことができる。したがって、本開示は、従来の方法と比較して、ｃｔＤＮＡステータスと転帰との間の優れた関連性を提供し、それによって、ｃｔＤＮＡ分析を臨床的に影響力のあるものに近づける。

ｃｔＤＮＡの動態が、既に治療中のＮＡＣに応答する患者の特定に役立ち得ることも、本開示の発見であった。ＭＩＢＣ患者は、原発性腫瘍負荷を減らし、膀胱切除前に微小転移を潜在的に根絶するためにＮＡＣを受け、患者の大部分は、ＮＡＣ後に病理学的ダウンステージを経験した。病理学的ダウンステージの欠如、すなわち、膀胱切除時点での残存原発性腫瘍またはリンパ節浸潤、または以前のリンパ節浸潤は、膀胱切除後の疾患再発と関連するリスク因子である。本願発明者らの研究において、ｃｔＤＮＡは、ＮＡＣの前および後の患者の３７％（２５／６８）で検出され、本願発明者らの検出閾値未満にｃｔＤＮＡが低下した患者の５３％は、病理学的ダウンステージを示した。重要なことに、継続的に検出可能なｃｔＤＮＡを有する患者は誰も、病理学的ダウンステージを示さなかった。しかし、疾患再発を起こし、病理学的ダウンステージを有した患者の部分集合、およびその逆の患者の部分集合も観測した。これらの知見は、臨床パラメータおよび組織病理学的パラメータが予後リスク因子として機能するが、患者の病理学に基づくリスクの階層化は、理想的なものではないことを示している。

本明細書の開示は、化学療法の前および後のｃｔＤＮＡステータスが、新しい強力な臨床リスク因子として実施されてもよく、長期にわたるＮＡＣおよび強化されたサーベイランスレジメンから利益を受け得る、早期の転移性播種が起こった患者を選択することに潜在的に役立ち得ることも提供した。ここで、化学療法の前または間にｃｔＤＮＡ陰性の患者は、膀胱切除後に疾患再発を経験せず、一方、化学療法の前または間にｃｔＤＮＡ陽性であった患者の４４％（１１／２５）が、疾患再発を有したことを示した。したがって、ｃｔＤＮＡの存在は、早期のタイムポイントであっても、転移性播種の指標であり、この患者コホートについて現時点で利用可能なリスク因子と比較して、患者の優れたリスク階層化に役立ち得る。このことは、本願発明者らの知る限り、同様のレベルの一貫性は以前に示されていない。初期に検出可能なｃｔＤＮＡを有するが、最終的な疾患再発の証拠がない患者の部分集合は、化学療法または膀胱切除が疾患を効果的に根絶した症例を表し得る。その結果、早期の転移性播種の証拠がなく（ｃｔＤＮＡ陰性）、ＮＡＣ後に病理学的ダウンステージを有した患者は、膀胱温存手法の対象となり得る。

特筆すべきことに、多くの患者にとって、ｃｔＤＮＡ頻度はかなり低く（変異コピーが数少ない）、ＮＧＳに基づく超深部配列決定手法は、これらの稀少なバリアントの信頼性の高い検出が必要とされる。原発性腫瘍のＷＥＳに基づくクローン変異の選択は、血漿ｃｔＤＮＡにおける患者固有の変異の超深部配列決定を行うことを可能にする。以前の研究は、原発性腫瘍と転移との間の遺伝子不均一性を示し、頻繁に変異する遺伝子の遺伝子パネルが必要であり得ることを示している。血漿からのｃｆＤＮＡのＷＥＳを適用することによって、依然として、原発性腫瘍と転移との間の不均一性を観測したが、重要なことに、原発性腫瘍から選択される全てのクローン変異が、転移において検出された。

結論として、本明細書の開示は、膀胱癌患者においてｃｔＤＮＡレベルを検出することは、転移性再発および治療応答の高い予測因子であることを示した。特に、本開示の発明者らは、癌患者の治療応答をモニタリングして、その疾患が制御された状態にある患者を安心させ、従来の方法よりも有意に早期に再発を検出し、生存転帰を向上させ得る、正確かつ信頼性の高い方法を本明細書で提供した。

実施例１０．ステージＩ〜ＩＩＩの大腸癌患者における超深部配列決定による、血漿無細胞ＤＮＡの長期的な分析。
本実施例の目的は、長期的な手術後循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）分析が、疾患の臨床的な証拠がない患者における残存腫瘍負荷の特定およびモニタリングを可能にすることを示すことであった。特に、本実施例は、ｃｔＤＮＡ分析が、ステージＩ〜ＩＩＩの大腸癌患者の個別化され、リスクによって階層化された術後管理を可能にすることを示した。

序論
１年に１３０万件の新たに診断された症例を有し、大腸癌（ＣＲＣ）は、世界で３番目に多い癌であり、癌関連死の２番目の主要因である。手術の改善、スクリーニングの実施および治療レジメンの進化にもかかわらず、ＣＲＣ患者の５年死亡率は依然として約４０％と高く、それによって、大きな地球規模の健康負担を生じている。

ＣＲＣを有する患者の現在の標準治療は、腫瘍の外科的切除の後、選択された患者におけるアジュバント化学療法（ＡＣＴ）を含む。ステージＩＩ患者の大部分は、ＡＣＴで治療されていないが、約１０〜１５％は、手術後に残存病変を有している。これらが特定できれば、ＡＣＴを用いた治療は、再発のリスクを下げる可能性がある。逆に、ステージＩＩＩ患者の大部分は、ＡＣＴを受ける。それにもかかわらず、５０％より多くが既に手術によって治癒している。さらに、ＡＣＴで治療されたステージＩＩＩ患者の約３０％が再発を経験し、さらなる療法の候補となる。したがって、ＡＣＴから利益を受け得る患者の集合を特定するための改良されたツールが非常に必要である。

再発疾患の早期診断は、ＣＲＣにおいて別の重要な臨床的に満たされていない需要である。根治的治療が終了した後、潜在的に治癒目的の手術のために再発を十分に早期に検出するために、再発サーベイランスが推奨される。サーベイランスにもかかわらず、多くの再発イベントが後に検出され、異時性の転移のわずか１０〜２０％が、治癒目的で治療される。したがって、より早期に再発のリスクの高い患者を検出することができるより良いバイオマーカーの必要性が存在し、それによって患者の生存率を向上させるための適切なフォローアップおよび治療戦略を可能にする。

方法
患者
２０１４〜２０１８年にかけて、オーフス大学病院、ランダース病院およびヘアニング病院の外科部門で、ステージＩからＩＩＩのＣＲＣを有する患者を募集した。腫瘍組織は、手術で採取した。血液サンプルは、手術の前に（最大で１４日前、手術前）、手術後３０日目（最大１４日前または後にサンプルを採取できるようにする）、次いで死亡するか、この試験から患者が脱落するか、または３６ヶ月目までのいずれか早く来る日まで、３ヶ月ごとに採取した。７５名の患者は、連続的な血液サンプルを提供し（患者あたり３〜１４個のサンプル）、一方、残りの５０名の患者は、たった２個の血液サンプルを提供した（手術前と手術から３０日後）。患者の特徴と人数構成を以下の表１２．１に示す。

以下の表１２．２に示すように、手術後の臨床介入に関する情報または他の臨床病理学的情報を全ての患者について集めた。この試験の全ての患者は、原発腫瘍の切除を受けた。

全ての患者は、Ｄａｎｉｓｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓを準拠した治療とフォローアップを受けた。この研究は、デンマークの中心地域にあるＣｏｍｍｉｔｔｅｅｓ ｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ（１−１６−０２−４５３−１４）によって承認され、ヘルシンキ宣言に従って実施された。参加者全員が書面によるインフォームドコンセントを提供した。

癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の分析。
ＣＥＡ分析は、Ｃｏｂａｓ ｅ６０１プラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ）で、５００μＬの血清を用い、製造業者の推奨に従って行われた。閾値レベルは、分析する病院の推奨に従って、それぞれ、非喫煙者および喫煙者について、４．０μｇ／Ｌおよび６．０μｇ／Ｌに設定された。サンプル採取前の８週間喫煙しなかった患者は、元喫煙者とみなされた。

組織採取および全エクソーム配列決定。
腫瘍組織を、新鮮な凍結したもの（ｎ＝１０２）またはホルマリン固定されパラフィン包埋された組織（ＦＦＰＥ）（ｎ＝２７）のいずれかの全ての患者から採取した。４名の患者は、同時期性大腸癌（ＣＲＣ）を呈した。これらの患者から、両腫瘍からの組織を採取した。転移性組織は、再発患者３名から採取した。全ての患者にマッチする構成的ＤＮＡは、末梢血白血球から抽出された。

新鮮な凍結したか、またはホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）一次組織サンプルは、病理学的腫瘍細胞率の中央値が５０％（範囲２０〜９０％）であった。（補遺表２）。ＤＮＡは、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）ＤＮＡ精製キット（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるか、またはＱｉＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ ＦＦＰＥ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出された。

全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）を、マッチした腫瘍ＤＮＡおよびバフィーコートＤＮＡで行った。サンプルおよびＷＥＳ情報のまとめは、以下の表１２．５に示される。癌含有量は、抽出に使用される前および使用した後の組織片のＨ＆Ｅ評価によって評価された。同時期性ＣＲＣは、この表でＳ１およびＳ２と示されている。

ライブラリ調製、配列決定およびデータ分析は、Ｌａｍｙら、Ｐａｉｒｅｄ Ｅｘｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｃｌｏｎａｌ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７６（１９）：５８９４−５９０６（２０１６）に記載されるように行われた。

採血および血漿の単離
血液サンプルを、オーフス大学病院でＫ２−ＥＤＴＡ １０ｍｌチューブ（ＢＤ ３６７５２５）に採取した。全てのサンプルを、室温での血液の二重遠心分離（最初に３０００ｇで１０分間、次いで３０００ｇで血漿を１０分間遠心分離）によって、採取から２時間以内に処理した。血漿を５ｍＬのクライオチューブに等分し、−８０℃で保管した。

無細胞ＤＮＡ抽出、定量化およびライブラリ調製。
この研究には、症例あたり１０ｍｌまでの血漿を使用し（範囲２〜１０ｍＬ、中央値８．５ｍＬ）、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、５０μＬのＤＮＡ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ）に溶出させた。各ｃｆＤＮＡサンプルをＱｕａｎｔ−ｉＴ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって定量化した。１２５名の患者において、ｃｆＤＮＡは、合計７９５個の連続的な血漿サンプルから単離された。

各血漿サンプルからの６６ｎｇ（２０，０００ゲノム相当）までのｃｆＤＮＡを、ライブラリ調製へのインプットとして使用した。Ａｂｂｏｓｈら、Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｃｔＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｅｐｉｃｔｓ ｅａｒｌｙ−ｓｔａｇｅ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ５４５（７６５５）：４４６−４５１（２０１７）に記載されるように、ｃｆＤＮＡを末端修復し、Ａテーリングし、特注のアダプターを用いてライゲーションした。精製されたライゲーション産物を２０サイクルかけて増幅させ、Ａｍｐｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ／Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて精製した。

マルチプレックスＰＣＲアッセイの設計
患者固有の体細胞バリアントは、全ての患者について、原発腫瘍とマッチした正常ＷＥＳの分析によって特定された。バリアントのクローン性は、バリアントを含む癌細胞の推定割合に基づいて推測された。なお、バリアント対立遺伝子頻度の分布がかなり平坦であるため、腫瘍細胞の分率が低いサンプルからのクローン性の推測は制限される。組織におけるＶＡＦの観測値およびバリアントの配列構成を使用して、各腫瘍について特定される体細胞ＳＮＶおよび短いインデルを優先順位付けした。Ｓｉｇｎａｔｅｒａアンプリコン設計パイプラインを使用して、所与のセットのバリアントについてＰＣＲプライマー対を作成した。各患者について、特注の患者固有のパネルのために１６個の高くランク付けされた適合するアンプリコンを選択した。ＰＣＲプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから発注された。

血漿のマルチプレックスＰＣＲ次世代配列決定のワークフロー
各ライブラリのアリコートを、関連する患者固有の１６反応分ＰＣＲ反応へのインプットとして使用した。サンプルを患者固有のアッセイを用いて増幅し、バーコード化し、次いで、産物をプールした。配列決定は、アンプリコンあたり１０５，０００を超える平均リード深度でＩｌｌｕｍｉｎａ Ｐａｉｒｅｄ Ｅｎｄ ｖ２キットを用い、５０サイクルのペアエンドリードを用いたＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ（登録商標）２５００ Ｒａｐｉｄ Ｒｕｎで行った。

バイオインフォマティクスパイプライン
Ｚｈａｎｇ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、３０（５）：６１４−６２０（２０１４）に記載されるように、Ｐｅａｒソフトウェアを用い、全てのペアエンドリードをマージした。順方向および逆方向のリードにマッチしなかったか、または低品質のスコアを有する塩基をフィルタリングで取り除き、配列決定エラーを最小限にした。マージされたリードを、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎバージョン２．３．４を用い、ｈｇ１９参照ゲノムにマッピングした（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍ／）。５，０００未満の高品質リードを有するアンプリコンは、配列決定品質管理（ＱＣ）に失敗したとみなされた。ＱＣは、総リード数、マッピングされたリード、オンターゲットリード、失敗した標的の数および平均エラー率を含む、サンプルあたりの広い統計リストを検査する社内プログラムを用いて行われた。

血漿バリアントのコール
陰性対照サンプルの多数のセット（約１０００）を前処理し、バックグラウンドエラーモデルを構築した。変異体および参照対立遺伝子のリード深度を用いる各標的バリアントについて、信頼性スコアは、Ａｂｂｏｓｈら、Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｃｔＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｅｐｉｃｔｓ ｅａｒｌｙ−ｓｔａｇｅ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ５４５（７６５５）：４４６−４５１ （２０１７）に記載されるように、エラーモデルに基づいて計算された。所定のアルゴリズム閾値を超える信頼性スコアを有する少なくとも２個のバリアントを含む血漿サンプルは、Ａｂｂｏｓｈら、２０１７（前出）に記載されるように、ｃｔＤＮＡ陽性と定義された。

統計分析
主な転帰の尺度は、標準的な放射線学的基準によって評価される、再発までの時間（ＴＴＲ）であった。ＴＴＲは、手術日から、記されている最初の放射線学的再発（局所的または遠隔）または大腸癌の結果としての死亡までを測定し、最後のフォローアップ時または大腸癌に無関係な死亡で打ち切られた。カプラン−マイヤー法を用い、生存率の分析を行った。コックス比例ハザード回帰分析を使用して、ＴＴＲに対するｃｔＤＮＡおよびＣＥＡの影響を評価した。多変量解析は、単変量解析において統計的に有意であった臨床パラメータを用いて行われた。全てのＰ値は、両側検定に基づいており、差は、Ｐ≦０．０５で有意であるとみなされた。統計分析は、ＳＴＡＴＡ ＩＣ／１２．１およびＲ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌソフトウェア、バージョン２．４（Ｗｉｎｄｏｗｓ用）を用いて行った。

結果
２０１４〜２０１６年の間に、１３０名のＵＩＣＣステージＩ〜ＩＩＩのＣＲＣ患者が登録された。フォローアップ時に失われた（ｎ＝３）か、またはステージＩＶに再分類されたため、５名の患者が、その後で除外された。腫瘍とマッチした生殖細胞系ＤＮＡとの全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）を使用して、図９０Ａ〜Ｂに示されるように、体細胞変異を特定した。１６個の変異を標的とする腫瘍特有のマルチプレックスＰＣＲアッセイパネルを、各患者について設計した。超深部マルチプレックスＰＣＲに基づくＮＧＳを使用して、１２５名の患者からの７９５個の血漿サンプルにおいて循環腫瘍ＤＮＡを分析し、定量化し、フォローアップの中央値は１２．５ヶ月（範囲１．４〜３８．５ヶ月）であった。この試験のためのワークフローは、図８３Ａ〜Ｅに示される。品質管理は、ワークフローの全ての工程で行われた。カバレッジ品質管理に合格したアッセイのリード深度は、図９１に示すように、１０５，０００倍より大きい。１２５名の患者全員についてのｃｔＤＮＡの結果および動態に関する詳細な情報は、表１２．６に列挙しており、図９２に示される。患者のフォローアップ期間中に、２４名（１９．２％）の患者が、放射線学的再発を経験した。

ｃｔＤＮＡの手術前検出
ベースラインの手術前血漿サンプル（ｎ＝１２２）において、図８７Ａに示されるように、ステージＩ、ＩＩおよびＩＩＩにおいて、それぞれ４０％、９２％および９０％の感度で、サンプルの８９％において、ｃｔＤＮＡを検出した。同じサンプルに対して行われる癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の分析は、図８８に示されるように、癌の４３．３％を検出した。

３０日目の手術後ｃｔＤＮＡステータスが再発を予測する。
残存病変を検出し、将来的な再発を予測する能力を評価するために、手術後に採取した血漿サンプルのｃｔＤＮＡ分析を行った。アジュバント化学療法の開始前、３０日目に採取した血漿は、９４名の患者について利用可能であった。興味深いことに、患者の大部分（８９．４％）は、ｃｔＤＮＡ陰性であり、患者のわずか１０．６％が、図８９に示すように手術後のｃｔＤＮＡについて陽性であった。これらのｃｔＤＮＡ陽性患者は、図８７Ｂに示すように、手術後にｃｔＤＮＡ陰性であった患者（１１．９％、１０／８４）と比較して、有意に高い再発率（７０％、７／１０）を有していた。ｃｔＤＮＡの存在は、図８７Ｃに示すように、ｃｔＤＮＡ陰性患者と比較して、再発までの時間（ＴＴＲ）の顕著な短縮と関係があった（ＨＲ，７．２；９５％ＣＩ，２．７〜１９、Ｐ＜０．００００）。ステージおよびリンパ管浸潤などの既知の予後因子と比較して、多変量ロジスティック回帰モデルにおいて、ｃｔＤＮＡステータスは、以下の表１２．７に示されるように、唯一の有意な予後因子であった。

患者の部分集合をＡＣＴで治療し（ｎ＝５２）、転帰に対するｃｔＤＮＡの予後値を修正することができる。しかし、この部分集合に関しても、ｃｔＤＮＡ陽性は、図９０Ａ〜Ｂに示されるように、高い再発リスクと関係があった（ＨＲ，７．１；９５％ＣＩ，２．２〜２２；Ｐ＝０．０００８）。ｃｔＤＮＡ陰性患者の再発率は、ＡＣＴで治療された（５／４２）か、ＡＣＴで治療されていない（５／４２）かにかかわらず、１１．９％であった。要約すると、手術後３０日目のｃｔＤＮＡステータスは、ＡＣＴで治療された患者であっても、将来の再発の強力な予測因子である。

アジュバント化学療法は、３０日目のｃｔＤＮＡ陽性患者の一部において、ｃｔＤＮＡを除去する。
無作為化された試験は、アジュバント化学療法（ＡＣＴ）が、ステージＩＩＩのＣＲＣの全再発率２１〜２４を減らすことができることを示したが、ＡＣＴが、高リスクｃｔＤＮＡ陽性の一部の中で再発を特異的に防ぐことができるかどうかは、現在は不明である。３０日目にｃｔＤＮＡについて陽性であった１０名の患者は、図８７Ｄに示されるように、全員がその後にＡＣＴで治療された。その後にＡＣＴで治療されたこれらの患者のうち、７０％（ｎ＝７）が再発し、一方、３０％（ｎ＝３）は、フォローアップ期間終了時に、依然として無疾患であった。この治療有効性は、ＡＣＴが、Ｕｐａｄｈｙａｙら、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｅ ｉｎ ｓｔａｇｅ ＩＩＩ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ：ａ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ．７（５）：２４４−２５１（２０１５）、Ａｎｄｒｅら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｗｉｔｈ ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ、ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ，ａｎｄ ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ ａｓ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｓｔａｇｅ ＩＩ ｏｒ ＩＩＩ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ＭＯＳＡＩＣ ｔｒｉａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２７（１９）：３１０９−３１１６（２００９）、Ｇｉｌｌら、Ｐｏｏｌｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ−ｂａｓｅｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｓｔａｇｅ ＩＩ ａｎｄ ＩＩＩ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ：ｗｈｏ ｂｅｎｅｆｉｔｓ ａｎｄ ｂｙ ｈｏｗ ｍｕｃｈ？Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２２（１０）：１７９７−１８０６（２００４）、Ｈａｌｌｅｒら、Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ ｐｌｕｓ ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ａｎｄ ｆｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｓｔａｇｅ ＩＩＩ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２９（１１）：１４６５−１４７１（２０１１）に記載されるように、全てのステージＩＩＩの結腸癌に対して与えられるときに推定されるのと同様である。したがって、図８７Ｄに提示される本明細書で提示される結果は、ＡＣＴが、高リスクｃｔＤＮＡ陽性患者の一部において、残存病変を除去し得ることを示した。

再発しなかった３名の患者のうち２名について、長期的に採取した血漿サンプルが利用可能であった。ＡＣＴが残存病変を除去することと一貫して、これらの患者は、療法中にｃｔＤＮＡの完全な除去を示し、試験期間中はｃｔＤＮＡ陰性のままであった。逆に、利用可能な長期的な血漿を有する６名の再発患者は、ＡＣＴ中はｃｔＤＮＡ陽性のままであるか、またはＡＣＴが終了した直後に再びｃｔＤＮＡ陽性になったかのいずれかである。

長期的なｃｔＤＮＡモニタリングは、ＡＣＴ治療の有効性を測定する。
長期的に採取された血液サンプルは、ＡＣＴ開始前にｃｔＤＮＡ陽性であった８／１０の患者について利用可能であった。これらの長期的に採取された血液サンプルを分析して、治療中のｃｔＤＮＡレベルの変化を観察した。ｃｔＤＮＡステータスは、図８７Ｄに示されるように、患者の５０％（ｎ＝４）で陰性になり、一方、その他の４名の患者において、ｃｔＤＮＡステータスは、治療の間ずっと陽性のままであった。驚くべきことに、ｃｔＤＮＡが除去されなかった４名の患者全て（１００％）が、疾患の再発を経験しており、このことは、残存するｃｔＤＮＡが、ＡＣＴが残存病変を除去することができないと予想したことを示している。治療中にｃｔＤＮＡが除去された４名の患者のうち、２名は、全てのＡＣＴ後サンプルにおいてｃｔＤＮＡ陰性のままであり、一貫して再発していないが、他の２名の患者は、治療から短期間でｃｔＤＮＡ陽性に戻り、最終的には、図８７Ｄに示されるように再発した。

ＡＣＴ後のｃｔＤＮＡ検出は、非常に高い再発リスクを有する患者サブグループを定義する。
アジュバント化学療法（ＡＣＴ）中にｃｔＤＮＡが除去されなかった患者の１００％が、その後に、疾患の再発を経験したため、ＡＣＴ後に採取した最初の血液サンプルのｃｔＤＮＡ分析を使用して、さらなる治療から利益を受け、継続的な残存病変を有する患者のサブグループを特定することができるという仮説を立てた。ＡＣＴ後の血液サンプルを有する５８名の患者のうち、全てのｃｔＤＮＡ陽性患者（７／７）が再発したことがわかった。これと比較して、再発率は、図８７Ｅに示すように、ｃｔＤＮＡ陰性患者について１３．７％（７／５１）であった（フィッシャーの直接確立検定、Ｐ＜０．０００１）。ＡＣＴ後のｃｔＤＮＡステータスは、以下の表１２．８に示されるように、ステージ、リンパ管浸潤、微細な根治切除状況およびＣＥＡなどの他の予測因子と比較して、初期再発の強力な予測因子であり、ｃｔＤＮＡステータスは、図８７Ｆに示されるように、再発までの時間（ＴＴＲ）の非常に有意な予測因子であった（ＨＲ，１８．０；９５％ＣＩ，５．４−５７；Ｐ＜０．００００）。

全てのＡＣＴ後血液サンプルを含む長期的なｃｔＤＮＡ分析は、図９１に示されるように、再発までの時間のさらに強力な予測因子であり（ＨＲ，２９．０；９５％ＣＩ，６．４〜１３０；ｐ＜０．００００）、１３名のｃｔＤＮＡ陽性患者を特定し、その９２．３％（１２／１３）が再発した。長期的な癌胎児性抗原（ＣＥＡ）分析も、図９２に示されるように、再発までの時間の有意な予測因子であったが、多変量調整の後、長期的なｃｔＤＮＡステータスは、以下の表１２．９に示されるように、再発までの時間の唯一の有意な予測因子であった（ＨＲ，２６．９；９５％ＣＩ，５．１１〜１４２；Ｐ＝０．０００１）。

長期的なｃｔＤＮＡ分析は、患者の転帰を予測し、再発の早期検出を可能にした。
長期的に採取された血漿サンプルを用いた、７５名の患者の根治的治療後のサーベイランス中の連続的なｃｔＤＮＡ分析は、８７．５％（１４／１６）の感度および９８．３％（５８／５９）の特異性で、転移性再発を特定した。驚くべきことに、ｃｔＤＮＡ陰性であった患者について再発率がわずか３．３％（２／６０）であったのと比較して、ｃｔＤＮＡ陽性患者の９３．３％（１４／１５）が再発した（フィッシャーの正確検定、Ｐ＜０．０００１）。ｃｔＤＮＡ陽性患者は、図９３Ａ〜Ｂに示されるように、再発（ＴＴＲ）までの時間が著しく短かった（ＨＲ，４４，０；９５％ＣＩ，９．８〜１９０；Ｐ＜０．００００）。７５名全ての患者の疾患経過および長期的なｃｔＤＮＡの結果を図９４に示す。連続的なｃｔＤＮＡ分析は、２つの再発イベントが欠落していた（患者２０および２４、図９４）。しかし、２つの欠落した転移の全エクソーム配列決定は、以下の表１２．１０に示されるように、血漿スクリーニングに使用される変異の存在を確認した。

２名の再発患者について（ＩＤ２０および２４、表１２．１０）、図９０Ａ〜Ｂに示されるように、長期的な分析は、手術後のｃｔＤＮＡを検出しなかった。これら２名の患者について、他の患者と同じ量の血漿を分析した。全ての腫瘍および血漿サンプル中の４５個の共通ＳＮＰに起因して、サンプルの入れ替えの可能性は否定することができ、どのサンプルも入れ替えられていなかったことを確認した。次に、この２名の患者について転移性再発病変の全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）を行い、血漿プロファイリングのために選択した変異が、表１２．９の転移中に存在することを確認した。ＷＥＳを患者７７由来の転移についても行った。この患者について、ｃｔＤＮＡの長期的な分析は、図９０Ａ〜Ｂに示されるように、放射線画像診断によって再発が検出された後になるまでｃｔＤＮＡを検出しなかった。ここでも、ＷＥＳは、血漿プロファイリングのために選択した変異が、転移中に存在することを確認した。結論として、この良くない手術後の知見は、検出限界を下回るｃｔＤＮＡレベルが原因であり、選択したマーカーが無情報であるということではなかった。

この同じ集合の長期的なＣＥＡ分析は、図９５に示されるように、６８．８％（１１／１６）の感度および６４．４％（３８／５９）の特異性で再発を特定した。多変量分析において、ｃｔＤＮＡは、以下の表１２．１１に示されるように、再発までの時間（ＴＴＲ）の唯一の有意な予測因子であった（ＨＲ，４１；９５％ＣＩ，８．５〜１９９；Ｐ＜０．００００）。

転移性再発および検出可能なｃｔＤＮＡを有する患者について、ｃｔＤＮＡ分析が、図９３Ｃに示されるように、標準治療のＣＴ画像診断に対して８．７ヶ月の平均リードタイムを有していることがわかった（ウィルコクソンの符号順位検定：Ｐ＝０．０００９）。一方、図９６に示されるように、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）分析を用いることによってリードタイムを確立することはできなかった。ｃｔＤＮＡ検出から放射線学的再発検出まで、血漿サンプルはｃｔＤＮＡ陽性のままであり、平均ｃｔＤＮＡ ＶＡＦの５０倍の増加が観測され、このことは、図９３Ｄに示されるように、患者が再発の放射線学的検出を待っている間に腫瘍負荷が顕著に増加したことを示している。

ｃｔＤＮＡ分析は、臨床的に発症原因となる変異を明らかにした。
長期的なｃｔＤＮＡ分析が微小転移病変の早期検出を可能にすることを示したので、次に、長期的なｃｔＤＮＡ分析を使用して、転移中に存在する潜在的に発症原因となる変異についての情報を得ることができるかどうかを調べた。

転移性再発を有する１１名の患者を、利用可能な長期的サンプルから特定し、臨床的に発症原因となる変異は、以下の表１２．１２に示されるように、原発性腫瘍の全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）を行うことによって特定された。

概念の証明として、発症原因となる変異を標的とするさらなるマルチプレックスＰＣＲパネルを設計し、長期的なサンプルに適用した。発症原因となる変異は、図９７Ａに示されるように、患者の８２％（９／１１）で検出された。図９７Ｂに示されるように、平均ｃｔＤＮＡ ＶＡＦと発症原因となる変異のＶＡＦとの間に良好な相関関係を観測した。発症原因となるバリアント対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）の長期的な変化は、一般的に、図９７Ｃに示されるように、治療および非常に少ない内部変異の変動に対して良好な相関関係を示した。

考察
本実施例は、ステージＩ〜ＩＩＩのＣＲＣ患者における長期的なｃｔＤＮＡ分析が、臨床的な疾患経過にわたって腫瘍負荷の変化を効果的に検出し、モニタリングすることができることを示した。具体的には、ｃｔＤＮＡが、ｉ）手術前のＣＲＣ検出、ｉｉ）手術前およびＡＣＴ後のリスクの階層化、ｉｉｉ）ＡＣＴの有効性のモニタリング、ｉｖ）臨床的に発症原因となる変異の検出およびｖ）再発の早期検出の安定したバイオマーカーとして役立つことを示した。これらの観察結果は、ＣＲＣ患者の術後管理の将来にとって重要かつ潜在的に革新的な変化を起こす影響を有しており、ｃｔＤＮＡによって導かれる管理の臨床的な利益を調べるための将来的な介入試験の基礎を築いた。

手術前の観点では、手術前のｃｔＤＮＡ測定が疾患検出に適用可能であることを示した。

患者の階層化という観点で、本明細書で使用されるｃｔＤＮＡ分析は、患者を高再発リスク群と低再発リスク群に分割し、アジュバント化学療法（ＡＣＴ）による治療およびさらなるＡＣＴ前治療の決定のための患者の選択に対し、潜在的な影響を及ぼした。以前、ＡＣＴ治療を行うという決定は、ステージ決定および臨床的なリスク因子に基づくものであった。しかし、本明細書における開示は、ｃｔＤＮＡステータスが、ステージ、ＣＥＡおよび他の高リスク特徴よりも強い予後因子であることを示した。したがって、将来的に、ｃｔＤＮＡ陽性であるが、臨床的に低リスク（ステージＩおよびＩＩ）であり、現在は標準治療としてのＡＣＴを受けない患者を、ｃｔＤＮＡ分析に基づいて、ＡＣＴ治療に割り当てることが可能になるだろう。本開示の発明者らは、現在、この設定におけるｃｔＤＮＡに基づく患者の選択の臨床的な利益を評価するための治験を行っている（例えば、ＩＭＰＲＯＶＥ−ＩＴ ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ：ＮＣＴ０３７４８６８０およびＤＹＮＡＭＩＣ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｒｅｇｉｓｔｒｙ：ＡＣＴＲＮ１２６１５０００３８１５８３）。

本開示は、ｃｔＤＮＡ陰性患者が、ＡＣＴが行われたか（１１．９％）または行われていないか（１１．９％）にかかわらず、再発のリスクが低いことも示した。したがって、将来的に、ｃｔＤＮＡ陰性でありながら、臨床的に高リスク（ステージＩＩＩ）の患者に、再発リスクに対する影響を最小限にしつつ、ＡＣＴを行わないでおくことも可能になるだろう。この患者群は、ＡＣＴの代わりに、活発なｃｔＤＮＡに基づくサーベイランスを提供することができ、そのため、手術だけで治癒する多くの患者を、化学療法の毒性を受けずに済ませることができる。さらに、現時点で予後マーカーが存在しないＡＣＴ後の環境において、ｃｔＤＮＡ分析が、残存病変を依然として有している患者を特定することを示す。この集合は、強化された治療処置から利益を受け得る。

本開示は、ＡＣＴの前、間、後の長期的なｃｔＤＮＡモニタリングが、ＡＣＴ有効性の患者レベルの測定を提供することができることも示した。全てのその後のサンプルにおいて、ｃｔＤＮＡが除去され、陰性のままであった患者の３０％は、この試験全体を通じて無疾患のままであった。したがって、本実施例は、ＡＣＴがｃｔＤＮＡ陽性患者において再発リスクを減らし得るという最初の証拠を提供した。本開示は、ｃｔＤＮＡが除去されなかった患者全員が、ＡＣＴ終了から１年以内に再発し、一時的にしか除去されなかった患者も全員再発したことも示した。この試験の設計にｃｔＤＮＡ除去を組み込んださらなる臨床試験は、治療有効性の患者レベルのリアルタイム測定を可能にするだろう。

手術後の観点で、ｃｔＤＮＡモニタリングは、標準治療の放射線画像診断と比較して、再発検出の顕著な改善を示し、８．７ヶ月の有意なリードタイムを示す（Ｐ＜０．００１）。重要なことに、放射線学的検出を待っている間に、ｃｔＤＮＡレベルが平均で５０倍に上昇し、このことは、腫瘍の負荷が、８．７ヶ月のリードタイムの間に顕著に増加したことを示す。現在のガイドラインは、治療目的のＣＲＣ手術の後のサーベイランスを推奨しているが、再発イベントの大部分は、治療的介入の対象になるには、検出されるのが遅すぎる。ｃｔＤＮＡ分析による残存病変の早期検出は、早期の放射線学的検出の機会を提供し得る。残存病変の検出に加えて、ｃｔＤＮＡ分析は、臨床的に発症原因となる変異の特定も可能にした。したがって、ｃｔＤＮＡは、早期検出を可能にし、治療決定を導く可能性を有する。

結論として、本実施例に存在する開示内容は、大腸癌におけるｃｔＤＮＡの潜在的に革新的に変化した臨床用途を提供した。上述のように、ｃｔＤＮＡによって導かれる管理の臨床的な利益を調べるために、さらなる臨床試験が設計されるか、または既に進行中である。本明細書で提供される結果は、個別化されたリスク階層化および治療モニタリングのための循環バイオマーカーの使用によって、正しい治療が、正しい時期に正しい期間、正しい患者に与えられるのを確実にする。

実施例１１．全エクソーム血漿ｃｆＤＮＡプロファイリングは、疾患の進化をモニタリングするための前臨床再発の変異シグネチャを捕捉する。
本実施例の目的は、進行した癌を有する患者または高い循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）負荷を有する患者において変異シグネチャおよびクローン進化を調べるために、血漿無細胞ＤＮＡの全エクソーム配列決定（ｃｆＤＮＡ−ＷＥＳ）の使用を評価することであった。特に、乳癌患者における前臨床転移を検出するためのｃｆＤＮＡ−ＷＥＳプロファイリングの使用を本明細書で示した。

方法
手術およびアジュバント療法の後に、４９名の原発性乳癌患者を募集した。連続的な血漿サンプルを、ＮａｔｅｒａのＳｉｇｎａｔｅｒａワークフローを用いた超深度配列決定によって１６個のバリアントを標的とする患者固有のアッセイを用いるｃｔＤＮＡ分析のために、６ヶ月ごとに採取した。全エクソーム配列決定は、血漿中で特定されたバリアントと腫瘍生検との間の一致性を決定し、疾患進行中の腫瘍の進化を理解するために、臨床的再発の前および臨床的再発の時期付近で、１７名の再発した患者からの血漿ｃｆＤＮＡで行われた。

結果
３名の再発患者からのｃｆＤＮＡ−ＷＥＳの事前分析は、腫瘍生検および血漿において特定された患者固有のバリアント間の高い一致度を示した。３５個のＳｉｇｎａｔｅｒａによって検出されたバリアントのうち３４個が、血漿ＷＥＳによっても特定され、高度に一致するバリアント対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）を示した。ｃｆＤＮＡ−ＷＥＳによって検出されなかった１個のバリアントは、０．２％ＶＡＦでＳｉｇｎａｔｅｒａによって以前検出されたものであった。

結論
本実施例は、血漿ＷＥＳが、原発性乳癌患者において分子残存病変を検出することができることを示した。ＷＥＳ血漿の分析は、癌の進化の証拠を提供する可能性があり、このことは、治療決定を行うのに重要であろう。

実施例１２．リンパ腫における治療応答を評価するための分子バイオマーカーとしての循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の使用。
ここで、バイオ医薬のパイロット研究において、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を有するコホートにおける全体的な臨床応答との相関関係をみるために、個別化された腫瘍特有のマルチプレックスＰＣＲ ＮＧＳに基づく手法（Ｓｉｇｎａｔｅｒａ（商標））が、一連の患者の治療レジメンにわたってｃｔＤＮＡを検出する可能性を評価した。

方法
８名の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（６名はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫であり、２名は濾胞性リンパ腫である）患者（ｐｔ）から採取した血液サンプルは、ｃｔＤＮＡ分析に利用可能であった。患者固有の体細胞バリアントは、原発性腫瘍生検とマッチした正常サンプルとからの全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）データの分析によって特定された。次いで、血漿サンプルを、盲検方法でＳｉｇｎａｔｅｒａワークフローを用い、対応する特注の１６反応分アッセイを用いて分析した。少なくとも２つの患者固有の標的が、適正な信頼性スコアの閾値を満たした場合、サンプルはｃｔＤＮＡ陽性とみなされた。

結果
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）について、中央値が１４．９ｎｇ（範囲２．２５〜６８５ｎｇ）のｃｆＤＮＡが、中央値が２．５ｍＬの血漿から抽出された。ｃｔＤＮＡは、４名の患者から、５個の血漿タイムポイントで検出された。５個のｃｔＤＮＡ＋血漿サンプルのうち、４個の血漿サンプルは、臨床的に進行性の疾患または血液採取時の治療に対する部分的な応答のいずれかと相関関係にあった。どのタイムポイントでもｃｔＤＮＡが検出されない４名の患者は、採血時に臨床的に完全奏功を示した。

結論
拡張可能な患者固有のｃｔＤＮＡモニタリングアッセイは、ベースライン検出、治療モニタリングおよび再発検出に適用することができる。Ｓｉｇｎａｔｅｒａの高感度ｃｔＤＮＡ検出分析は、現在の標準治療と比べて、非侵襲的なモニタリング手段を提供する。

Claims (72)

1. 乳癌、膀胱癌または大腸癌の早期再発または転移をモニタリングし、検出する方法であって、
   乳癌、膀胱癌または大腸癌と診断された患者の腫瘍サンプル中で特定された体細胞変異に基づいて、少なくとも８個または１６個の患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットを選択することと、
   前記患者が手術、ファーストライン化学療法および／またはアジュバント療法で治療された後に、前記患者から１つ以上の血液または尿サンプルを長期的に集めることと、
   それぞれの血液もしくは尿サンプルまたはそのフラクションから単離された核酸に対して多重増幅反応を行うことによってアンプリコンのセットを作成することであって、前記アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンが、前記乳癌、膀胱癌または大腸癌と関連付けられた前記患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットのうちの少なくとも１個の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座に広がっている、作成することと、
   患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座を含む前記アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定することであって、前記血液または尿サンプルからの１個以上の患者固有の単一ヌクレオチドバリアントの検出は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の早期再発または転移の指標である、決定することと、を含む、方法。
2. 乳癌、膀胱癌または大腸癌を治療するための方法であって、
   乳癌、膀胱癌または大腸癌と診断された患者を手術、ファーストライン化学療法および／またはアジュバント療法で治療することと、
   前記患者から１つ以上の血液または尿サンプルを長期的に集めることと、
   それぞれの血液もしくは尿サンプルまたはそのフラクションから単離された核酸に対して多重増幅反応を行うことによってアンプリコンのセットを作成することであって、前記アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンが、前記乳癌、膀胱癌または大腸癌と関連付けられており、前記患者の腫瘍サンプルにおいて特定された体細胞変異に基づいて選択された、少なくとも８個または１６個の患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットのうちの少なくとも１個の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座に広がっている、作成することと、
   患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座を含む前記アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定することであって、前記血液または尿サンプルからの１個以上の患者固有の単一ヌクレオチドバリアントの検出は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の早期再発または転移の指標である、決定することと、
   前記患者に化合物を投与することであって、前記化合物が、前記血液または尿サンプルから検出された前記単一ヌクレオチドバリアントのうちの１個以上を有する乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療に有効であることが知られている、投与することと、を含む、方法。
3. 乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療に対する応答をモニタリングするか、または予測する方法であって、
   乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療を受けている患者から１つ以上の血液または尿サンプルを長期的に集めることと、
   それぞれの血液もしくは尿サンプルまたはそのフラクションから単離された核酸に対して多重増幅反応を行うことによってアンプリコンのセットを作成することであって、前記アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンが、前記乳癌、膀胱癌または大腸癌と関連付けられており、前記患者の腫瘍サンプルにおいて特定された体細胞変異に基づいて選択された、少なくとも８個または１６個の患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットのうちの少なくとも１個の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座に広がっている、作成することと、
   患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座を含む前記アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定することであって、前記血液または尿サンプルからの１個以上の患者固有の単一ヌクレオチドバリアントの検出は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の前記治療に対する応答不良の指標である、決定することと、を含む、方法。
4. 前記癌は乳癌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記癌は膀胱癌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記癌は大腸癌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記治療がネオアジュバント療法である、請求項３に記載の方法。
8. 前記治療がアジュバント療法である、請求項３に記載の方法。
9. 前記患者に化合物を投与することをさらに含み、前記化合物が、前記血液または尿サンプルから検出された前記単一ヌクレオチドバリアントのうちの１個以上を有する乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療に有効であることが知られている、請求項３に記載の方法。
10. 前記方法は、癌の早期再発または転移を有する患者の少なくとも８５％において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記方法は、ＨＥＲ２＋乳癌の早期再発または転移を有する患者の少なくとも９５％において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記方法は、トリプルネガティブ乳癌の早期再発または転移を有する患者の少なくとも９５％において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記方法は、ＨＲ＋／ＨＥＲ２−乳癌の早期再発または転移を有する患者の少なくとも８０％において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記方法は、画像診断によって検出可能な癌の臨床的再発または転移の少なくとも２００日前に、および／またはＣＡ１５−３レベルの上昇の少なくとも少なくとも１００日前に、癌の早期再発または転移を有する患者において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記方法は、画像診断によって検出可能なＨＥＲ２＋乳癌の臨床的再発または転移の少なくとも１５０日前に、および／またはＣＡ１５−３レベルの上昇の少なくとも少なくとも１００日前に、ＨＥＲ２＋乳癌の早期再発または転移を有する患者において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記方法は、画像診断によって検出可能なトリプルネガティブ乳癌の臨床的再発または転移の少なくとも２００日前に、および／またはＣＡ１５−３レベルの上昇の少なくとも少なくとも１００日前に、トリプルネガティブ乳癌の早期再発または転移を有する患者において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記方法は、画像診断によって検出可能なＨＲ＋／ＨＥＲ２−乳癌の臨床的再発または転移の少なくとも２５０日前に、および／またはＣＡ１５−３レベルの上昇の少なくとも少なくとも１００日前に、ＨＲ＋／ＨＥＲ２−乳癌の早期再発または転移を有する患者において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記方法は、癌の早期再発または転移がない患者の少なくとも９９％において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記方法は、ＨＥＲ２＋乳癌の早期再発または転移がない患者の少なくとも９９％において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記方法は、トリプルネガティブ乳癌の早期再発または転移がない患者の少なくとも９９％において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記方法は、ＨＲ＋／ＨＥＲ２−乳癌の早期再発または転移がない患者の少なくとも９９％において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記方法は、２個以上の患者固有の単一ヌクレオチドバリアントが、信頼閾値０．９７を超えて検出されるときに、癌の早期再発または転移を検出することにおいて少なくとも９９．５％の特異性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記方法は、２個以上の患者固有の単一ヌクレオチドバリアントが、信頼閾値０．９７を超えて検出されるときに、ＨＥＲ２＋乳癌の早期再発または転移を検出することにおいて少なくとも９９．５％の特異性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記方法は、２個以上の患者固有の単一ヌクレオチドバリアントが、信頼閾値０．９７を超えて検出されるときに、トリプルネガティブ乳癌の早期再発または転移を検出することにおいて少なくとも９９．５％の特異性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記方法は、２個以上の患者固有の単一ヌクレオチドバリアントが、信頼閾値０．９７を超えて検出されるときに、ＨＲ＋／ＨＥＲ２−乳癌の早期再発または転移を検出することにおいて少なくとも９９．５％の特異性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
26. 乳癌、膀胱癌または大腸癌の早期再発または転移をモニタリングし、検出する方法であって、
    乳癌、膀胱癌または大腸癌を治療された患者からの血液もしくは尿のサンプルまたはそのフラクションから単離された核酸に対して多重増幅反応を行うことによってアンプリコンのセットを作成することであって、前記アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンが、前記乳癌、膀胱癌または大腸癌と関連付けられた患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットのうちの少なくとも１個の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座に広がっている、作成することと、
    患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座を含む前記アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定することであって、１個以上の患者固有の単一ヌクレオチドバリアントの検出は、乳癌、膀胱癌または大腸癌の早期再発または転移の指標である、決定することと、を含む、方法。
27. 前記血液もしくは尿のサンプルまたはそのフラクションについての前記アンプリコンのセットのそれぞれのアンプリコンの少なくとも１つのセグメントの配列を決定する前に、核酸が前記患者の腫瘍から単離され、体細胞変異が、前記患者固有の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットについて前記腫瘍において特定され、前記単一ヌクレオチドバリアント、請求項２６に記載の方法。
28. 前記方法が、前記患者からの血液または尿サンプルを長期的に集め、配列決定することを含む、請求項２６に記載の方法。
29. 少なくとも２個または少なくとも５個のＳＮＶが検出され、前記少なくとも２個または少なくとも５個のＳＮＶの存在が、乳癌、膀胱癌または大腸癌の早期再発または転移の指標である、請求項２６に記載の方法。
30. 前記乳癌、膀胱癌または大腸癌が、ステージ１、１ｂまたは２ａの乳癌、膀胱癌または大腸癌である、請求項２６に記載の方法。
31. 個体が、前記血液または尿サンプルの単離前に手術で治療されている、請求項２６に記載の方法。
32. 個体が、前記血液または尿サンプルの単離前に化学療法で治療されている、請求項２６に記載の方法。
33. 個体が、前記血液または尿サンプルの単離前に放射線療法で治療されている、請求項２６に記載の方法。
34. 個体が、前記血液または尿サンプルの単離前にアジュバント療法で治療されている、請求項２６に記載の方法。
35. 前記癌は乳癌である、請求項２６に記載の方法。
36. 前記癌は膀胱癌である、請求項２６に記載の方法。
37. 前記癌は結腸癌である、請求項２６に記載の方法。
38. 個体に化合物を投与することをさらに含み、前記化合物が、決定された前記単一ヌクレオチドバリアントのうちの１つ以上を有する乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療に特異的に有効であることが知られている、請求項２６に記載の方法。
39. 前記方法が、前記配列決定からの前記単一ヌクレオチドバリアントのそれぞれについてバリアント対立遺伝子頻度を決定することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
40. 乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療計画が、前記バリアント対立遺伝子頻度の決定に基づいて特定される、請求項３９に記載の方法。
41. 個体に化合物を投与することをさらに含み、前記化合物が、前記単一ヌクレオチドバリアントの１つが決定されたその他の単一ヌクレオチドバリアントのうちの少なくとも半分よりも大きな可変対立遺伝子頻度を有する乳癌、膀胱癌または大腸癌の治療に特異的に有効であることが知られている、請求項３９に記載の方法。
42. 前記配列は、複数の前記単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座の高スループットＤＮＡ配列決定によって決定される、請求項２６に記載の方法。
43. 一連のアンプリコンの複数のコピーの配列に基づき、それぞれのＳＮＶ遺伝子座についてバリアント対立遺伝子頻度を決定することによって、前記乳癌、膀胱癌または大腸癌におけるクローン単一ヌクレオチドバリアントを検出することをさらに含み、前記複数の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座の前記その他の単一ヌクレオチドバリアントと比較して相対的に高い対立遺伝子頻度は、前記乳癌、膀胱癌または大腸癌におけるクローン単一ヌクレオチドバリアントの指標である、請求項２６に記載の方法。
44. 前記１つ以上のクローン単一ヌクレオチドバリアントを標的とするが、前記その他の単一ヌクレオチドバリアントを標的としない前記個体に化合物を投与することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
45. １．０％を超えるバリアント対立遺伝子頻度が、クローン単一ヌクレオチドバリアントの指標である、請求項４３に記載の方法。
46. ポリメラーゼ、ヌクレオチド三リン酸、前記サンプルから作成された核酸ライブラリからの核酸フラグメントと、単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座の１５０塩基対内でそれぞれ結合するプライマーのセットまたは単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座を含む１６０塩基対以下の領域にそれぞれ広がるプライマー対のセットとを組み合わせることによって増幅反応混合物を形成することと、前記増幅反応混合物を増幅条件に供して、前記アンプリコンのセットを作成することと、をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
47. ユニバーサルアダプターを含む循環腫瘍核酸フラグメントを含む組成物であって、前記循環腫瘍核酸は、乳癌、膀胱癌または大腸癌に由来するものであった、組成物。
48. 前記循環腫瘍核酸が、乳癌、膀胱癌または大腸癌を有する個体の血液または尿のサンプルまたはそのフラグメントに由来するものであった、請求項４７に記載の組成物。
49. 複数の核酸のクローン集合を含む固体支持体を含む組成物であって、前記クローン集合が、循環遊離核酸のサンプルから作成されたアンプリコンを含み、前記循環腫瘍核酸は、乳癌、膀胱癌または大腸癌に由来するものであった、組成物。
50. 前記循環遊離核酸が、乳癌、膀胱癌または大腸癌を有する個体の血液または尿のサンプルまたはそのフラグメントに由来するものであった、請求項４９に記載の組成物。
51. 異なるクローン集合中の前記核酸フラグメントが、同じユニバーサルアダプターを含む、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
52. 前記核酸のクローン集合は、２名以上の個体からのサンプルのセットからの核酸フラグメントに由来する、請求項５１に記載の組成物。
53. 前記核酸フラグメントは、前記サンプルのセットにおけるサンプルに対応する一連の分子バーコードの１つを含む、請求項５２に記載の組成物。
54. 単一ヌクレオチドバリアントが前記サンプル中に存在するかどうかを決定することは、少なくとも一部には前記遺伝子座についてのリード深度に基づいて、前記単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットのそれぞれで、各対立遺伝子決定についての信頼値を特定することを含む、請求項２６〜４６のいずれか一項に記載の方法。
55. 単一ヌクレオチドバリアントの前記存在についての前記信頼値が９０％より大きい場合、単一ヌクレオチドバリアントコールが作られる、請求項２６〜４６のいずれか一項に記載の方法。
56. 単一ヌクレオチドバリアントの前記存在についての前記信頼値が９５％より大きい場合、単一ヌクレオチドバリアントコールが作られる、請求項２６〜４６のいずれか一項に記載の方法。
57. 前記単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットは、乳癌、膀胱癌または大腸癌についてＴＣＧＡおよびＣＯＳＭＩＣデータセットにおいて特定された前記単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座の全てを含む、請求項２６〜４６のいずれか一項に記載の方法。
58. 前記単一ヌクレオチド分散部位のセットは、乳癌、膀胱癌または大腸癌についてＴＣＧＡおよびＣＯＳＭＩＣデータセットにおいて特定された前記単一ヌクレオチド分散部位の全てを含む、請求項２６〜４６のいずれか一項に記載の方法。
59. 前記方法は、少なくとも１，０００の前記単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットについてのリード深度で行われる、請求項２６〜４６のいずれか一項に記載の方法。
60. 前記単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座のセットは、乳癌、膀胱癌または大腸癌と関連することが知られている２５〜１０００個の単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座を含む、請求項２６〜４６のいずれか一項に記載の方法。
61. サイクルあたりの効率およびエラー率が、前記単一ヌクレオチドバリアント遺伝子座の前記多重増幅反応のそれぞれの増幅反応について決定され、前記効率および前記エラー率を使用して、前記単一バリアント遺伝子座のセットでの単一ヌクレオチドバリアントが前記サンプル中に存在するかどうかを決定する、請求項２６〜４６のいずれか一項に記載の方法。
62. 前記増幅反応はＰＣＲ反応であり、アニーリング温度は、前記プライマーのセットのプライマーの少なくとも５０％の融点より１〜１５℃高い、請求項２６〜４６のいずれか一項に記載の方法。
63. 前記増幅反応はＰＣＲ反応であり、前記ＰＣＲ反応中のアニーリング工程の長さは、１５〜１２０分である、請求項２６〜４６のいずれか一項に記載の方法。
64. 前記増幅反応はＰＣＲ反応であり、前記ＰＣＲ反応中のアニーリング工程の長さは、１５〜１２０分である、請求項２６〜４６のいずれか一項に記載の方法。
65. 前記増幅反応におけるプライマー濃度は、１〜１０ｎＭである、請求項２６〜４６のいずれか一項に記載の方法。
66. 前記プライマーのセット中の前記プライマーは、プライマー二量体形成を最小限にするように設計される、請求項２６〜４６のいずれか一項に記載の方法。
67. 前記増幅反応はＰＣＲ反応であり、アニーリング温度は、前記プライマーのセットのプライマーの少なくとも５０％の融点より１〜１５℃高く、前記ＰＣＲ反応中のアニーリング工程の長さは、１５〜１２０分であり、前記増幅反応におけるプライマー濃度は、１〜１０ｎＭであり、前記プライマーのセット中の前記プライマーは、プライマー二量体形成を最小限にするように設計される、請求項２６〜４６のいずれか一項に記載の方法。
68. 前記多重増幅反応は、制限プライマー条件下で行われる、請求項２６〜４６のいずれか一項に記載の方法。
69. 前記方法は、筋層浸潤性膀胱癌（ＭＩＢＣ）の早期再発または転移を有する患者の少なくとも９０％において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出する、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
70. 前記方法は、画像診断によって検出可能なＭＩＢＣの臨床的再発または転移の少なくとも１００日前に、ＭＩＢＣの早期再発または転移を有する患者において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出する、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
71. 前記方法は、ＭＩＢＣの早期再発または転移がない患者の少なくとも９５％において患者固有の単一ヌクレオチドバリアントを検出しない、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
72. 前記方法は、２個以上の患者固有の単一ヌクレオチドバリアントが、信頼閾値０．９７を超えて検出されるときに、ＭＩＢＣの早期再発または転移を検出することにおいて少なくとも９９．５％の特異性を有する、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。

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