CN103952470B - 高解析度分析核酸以检测序列变异的系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于检验生物样品中具有药物抗性和/或药物敏感性表型的微生物的方法，其中该方法能够检测与已知和/或未知突变相关的抗性和敏感性表型。在一些方面，提供了用于检测药物抗性结核分枝杆菌（MTb）包括多药物抗性MTb的方法，其中药物抗性与一种或多种新型突变相关。还提供了与这样的方法相关的系统、试剂盒和组合物。

Description

高解析度分析核酸以检测序列变异的系统和方法

本申请是2008年3月28日提交的题为“高解析度分析核酸以检测序列变异的系统和方法”的国家申请号为200880018252.X(PCT／US2008／058786)的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请按照35U.S.C.§119(e)要求申请日为2007年3月28日的美国临时申请60／908,604的优先权，其以参考方式全文纳入本文。

技术领域

本发明大体上涉及用于制备和分析生物样品的系统和方法，以检测与目的表型相关的核酸序列变异。在某些实施方式中，提供了用于扩增来自生物样品的微生物的核酸以及检测与药物抗性和／或敏感性相关的序列变异的方法和系统。

背景技术

在科学史上很少有像控制病原微生物所取得的进展这样对人类生活产生如此巨大的影响。直至19世纪末期和20世纪初期Pasteur和Koch的工作才确立微生物作为传染性疾病的诱因并提供了引起理论预防的策略和控制策略。磺胺类药剂是最初被发现抑制微生物感染的一组化合物，虽然对其作用机理知之甚少，但是该发现刺激了大规模寻找更有效的抗生素化合物。1940年Florey和Chain分离出不纯的但是高活性的青霉素制备物，后来青霉素的成功转移科学努力朝向抗生素的探索，这引起约3000种被命名的抗生素的发现。但是，虽然发现新化合物迅速发展，但是只有50种指定的抗生素满足临床用途，甚至更少的被普遍用于治疗微生物疾病。

抗生素对于抵抗微生物感染的最初有效性已经被对各种抗生素呈抗性的微生物菌株的出现所抵销。由于微生物的加速进化适应性、临床上抗生素的加速滥用和病人缺少完成所开剂量方案的服从，所以抗生素抗性被证明是难以克服的。抗性问题使得很多本来能治愈的疾病例如淋病和伤寒症变得难以治疗。此外，微生物对万古霉素(一种最后的广泛有效的抗生素)的抗性在医院正变得越来越多的普遍。

一直在开发新的抗生素化合物以阻挡传染性微生物，对抗生素抗性的机理的理解被证明在开发过程中是有价值的。基因组学的进展使研究人员可以鉴定易于发生抑制或修饰的生化途径，并理论设计靶向这样的途径的药物。很多药物通过与微生物蛋白结合并改变其结构和／或功能而显示出治疗性效应。在这样的情况下，微生物可以以感染药物结合或活性的方式而对靶蛋白进行物理修饰从而发展免疫力。例如，在几种微生物中对抗生素红霉素的抗性来源于50S核糖体亚基的变异，该变异引起核糖体与红霉素亲和力的降低。由于蛋白的结构／功能是由其初级序列决定的，而初级序列又是由编码蛋白的核酸的序列决定的，所以与药物抗性表型相关的核酸序列变异对于药物抗性的诊断指示剂是有用的。

虽然已经建立了鉴定微生物中核酸序列变异的方法，但是现有的方法受到需要预先知道用作诊断指示剂的特定突变或其它变异的要求的限制。结果，已知的筛选程序经常忽视那些与药物抗性或者其它目的特性相关的新发生的和／或未鉴别的序列变异。

因此，本领域需要快速的、承担得起的和可靠的既检测已知的又检测未知的核酸序列变异的方法，所述核酸变异具有诊断应用，包括与众多生物例如酵母、病毒、真菌、细菌、寄生虫甚至人类中的药物敏感性和／或药物抗性模式相关的突变。

发明内容

在一些方面，提供了用于确定微生物对药物的反应性的方法，该方法包括，从病人获得生物样品，样品包含感染性微生物；扩增微生物的一个或多个DNA片段，所述一个或多个片段包括与微生物对目的药物的反应性相关的至少一个多态性；检验一个或多个扩增的DNA片段相对于参考序列的序列变异，其中所述一个或多个扩增的DNA片段中的变异指征微生物对药物的反应性。

在一些优选的实施方式中，使用高解析度熔解曲线分析来检验扩增的DNA的序列变异。在各种实施方式中，熔解曲线分析包括：在存在DNA结合荧光染料时(该染料在存在双链DNA(dsDNA)时相对于存在单链DNA(ssDNA)时发射出实质上不同水平的荧光)，将互补的参考序列例如野生型序列和扩增的DNA(靶DNA)一起孵育。在一些优选的实施方式中，DNA结合染料是dsDNA特异性染料，例如SYBR Green I或SYBR Green II，熔解曲线分析包括：随着以恒定速率缓慢加热检验溶液，监测荧光水平作为时间的函数。有利地，本文所提供方法的熔解曲线分析能够精确地检测靶DNA序列和参考序列之间的单一碱基对错配，和／或两个、三个、四个、五个或更多个碱基的错配。

在一些实施方式中，本文所提供方法的熔解曲线分析中所用的参考序列包括与药物反应性例如药物抗性或药物敏感性相关的至少一个多态性，并且该分析检测DNA片段中的一个或更多个另外的多态性，包括与药物反应性相关的多态性。

在一些实施方式中，提供了用于确定病人是否能够以药物治疗的方法，该方法包括：从病人获得生物样品，所述样品包含结核分支杆菌(Myobacterium tuberculosis)(MTb)；扩增SEQ ID NO：142-204的MTb DNA的一个或多个片段，所述一个或多个片段各包括与MTb对抗生素药物敏感性相关的至少一个多态性；检验一个或多个扩增的DNA片段相对于SEQ ID NO：142-204中的对应序列的序列变异，其中所述一个或多个扩增的DNA片段中的变异指征MTb对所述抗生素药物的敏感性。在一些实施方式中，两个或更多个扩增的DNA片段中的变异指征MTb对抗生素药物的敏感性。

在一些实施方式中，使用SEQ ID NO：11-36的对应引物通过PCT来扩增SEQ ID NO：142-204的MTb DNA。

在各种实施方式中，扩增的MTb DNA包含SEQ ID NO：142-145中的一个或多个，一个或多个扩增的DNA片段中的变异指征MTb对利福平的敏感性；扩增的MTb DNA包含SEQ IDNO：146-151中的一个或多个，一个或多个扩增的DNA片段中的变异指征MTb对吡嗪酰胺的敏感性；扩增的MTbDNA包含SEQ ID NO：152-154中的一个或多个，一个或多个扩增的DNA片段中的变异指征MTb对链霉素的敏感性；扩增的MTb DNA包含SEQ ID NO：155-176中的一个或多个，一个或多个扩增的DNA片段中的变异指征MTb对异烟肼的敏感性；扩增的MTb DNA包含SEQ ID NO：177-198中的一个或多个，一个或多个扩增的DNA片段中的变异指征MTb对乙胺丁醇的敏感性；扩增的MTb DNA包含SEQ ID NO：199-203中的一个或多个，一个或多个扩增的DNA片段中的变异指征MTb对卷曲霉素和紫霉素中的一种或对二者的敏感性；和／或扩增的MTb DNA包含SEQ ID NO：204；扩增的DNA片段中的变异指征MTb对西沙星(oxifloxacin)、莫西沙星(moxifloxican)、加替沙星(gatifloxican)、西他沙星、氧氟沙星、左旋氧氟沙星和司帕沙星中的一个或多个的敏感性。

在另外的方面，提供了用于确定病人是否能够以药物治疗的试剂盒，该试剂盒包括SEQ ID NO：1-136中至少一对引物；与SEQ ID NO：137-204中的扩增子互补的至少一个核苷酸探针；和使用所述至少一对引物扩增来自结核分支杆菌(MTb)感染的病人的生物样品中的DNA的操作指示，和使用所述至少一个核苷酸探针使用高解析度熔解曲线分析来检测扩增的DNA中的序列变异的操作指示。

附图简述

图1：设计重叠引物退火温度和模板变性温度的代表图示。

图2：通过实时PCR获得的常规扩增产物的图示。

图3：显示用与图2所用相同的模板进行的高温PCR扩增。

图4：显示以相同的模板材料使用不同的起始材料浓度的HTPCR扩增。

图5：A-水中和MycoBuffer中结核分支杆菌的CFP32基因的HTPCR产物的比较。B-水中和MycoBuffer中结核分支杆菌的IS6110基因区域的HTPCR产物的比较。C-水中和MycoBuffer中结核分支杆菌的btMTb基因区域的HTPCR产物的比较。D-水中和MycoBuffer中结核分支杆菌的IS6110转座酶靶基因区域的HTPCR产物的比较。E-水中和MycoBuffer中结核分支杆菌的BTTb基因区域的HTPCR产物的比较。

图6：来自利福平抗性筛选的扩增产物的图示代表。A-同质双链和异质双链扩增产物。B-同质和异质双链产物的熔解曲线。C-B中熔解曲线间的差异图。

图7：曲线分析和对照及敏感样品的不同曲线的图示代表。

图8：显示不同核酸的不同荧光曲线的图示代表。

图9：对照、抗性和敏感性样品间不同曲线分析的图示代表。

图10A：来自结核分支杆菌的利福平敏感性和抗性样品的不同曲线分析。B：来自结核分支杆菌的链霉素敏感性和抗性样品的不同曲线分析。

图11：来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的特比萘芬抗性样品的不同曲线分析。

图12：来自人的紫杉烷(Taxane)敏感和抗性样品的不同曲线分析。

图13：来自疟疾感染的氯喹抗性样品的不同曲线分析。

图14：来自HIV的齐多夫定敏感和抗性样品的不同曲线分析。

图15：来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的万古霉素敏感和抗性样品的不同曲线分析。

图16：通过动态波动扩增模拟(dynamic flux amplification simulation)扩增的结核分支杆菌DNA产物的琼脂糖凝胶分析。

图17：通过动态波动扩增方法扩增的鼠伤寒沙门氏菌(S.tymphimurium)DNA扩增产物的实时分析。

本发明说明性方面的详细描述

本文提供了可靠的、低成本的方法，其用于检测与在治疗疾病、疾患或病状中具有诊断应用的一种或多种表型特征相关的核酸序列变异。在其它方面，本文描述的方法可用于检测与微生物对一种或多种药物的反应性相关的核酸序列变异。本文还提供了与本方法相关的组合物、系统和试剂盒。虽然对于各种方法本文描述了本发明的一些方面和优点，但是技术人员将认识到这样的方面和优点也适用于相关的组合物、系统和试剂盒等。

术语“微生物”在本文中是指细菌、真菌、原生动物、寄生虫和／或病毒。在各种优选的实施方式中，微生物是细菌病原体。在一些优选的实施方式中，微生物是结核分支杆菌。但是，虽然对于结核分支杆菌本文描述了本发明的一些方面和优点，但是技术人员将认识到这样的方面和优点也适用于其它的微生物，并适用于众多疾病和病状。本文提供的诊断方法中可用的微生物的非限制性的例子总结于表I，其中还提供了与这些微生物的药物反应性相关的可变序列元件。

本文所称“个体”可以是任何能够作为微生物宿主的生物，包括但不限于实验动物(例如小鼠、大鼠、兔子等)和人。在各种优选的实施方式中，个体为患有传染性疾病的病人。在一些优选的实施方式中，病人患有结核病。

本文所述“生物样品”可包括从个体中取得的任何生物材料，包括但不限于吐出物(例如痰液(sputum))、血液、血细胞(例如淋巴细胞)、组织、活组织检查、培养的细胞、胸膜、腹膜或脑脊髓液、汗液、粪便和尿液。在一些实施方式中，来自个体的生物样品在按照本文提供的方法检验前进行处理，例如培养感染性微生物和／或扩增其遗传材料。

本文所用的术语“药物”可以指任何化合物、药剂、处理形式或其组合。在一些实施方式中，药物是抗生素化合物。

本文所用的术语“靶核酸”是指源自感染性微生物的核酸，以与来自个体的核酸和／或与待处理疾病、疾患或病状无关的外源核酸区别。在一些实施方式中，靶核酸是按照本文所述方法检验的微生物的核酸。

本文所用的术语“参考核酸”是指对应于靶核酸(例如代表基因组DNA的相同部分)的核酸，其与靶核酸的不同之处在于一个或多个序列变异。例如，在一些方面，参考核酸具有野生型微生物(例如，相对于感兴趣药物的反应性来说)的序列。在其它方面，参考核酸具有野生型人类细胞的序列，例如疾病细胞包括人类癌细胞。

本文所用的与核酸相关的术语“序列变异”是指核酸相对于对应核酸的序列(例如代表相同基因或基因组DNA的其它部分的序列)来说序列中的差别。在一些优选的实施方式中，根据本文提供的各种方法检测的序列变异为“单核苷酸多态性”(“SNP”)，其产生于靶核酸和参考核酸之间的单一核苷酸相同性的变异。在其它实施方式中，根据本文提供的各种方法检测的序列变异为“多核苷酸多态性”(“MNP”)。在一些实施方式中，参考核酸对应于非药物抗性表型，根据本文提供的方法通过鉴定来自微生物感染个体的生物样品或疾病细胞例如药物抗性癌细胞的靶核酸和参考核酸之间的序列变异来检测药物抗性表型。

本文所用的术语“反应性”和“药物反应性”是指微生物或疾病细胞例如癌细胞的与药物治疗效果相关的抗性、敏感性、易感性、耐受性和／或其它表型特征，包括非反应性。药物反应性可根据药物对目标微生物或疾病细胞例如癌细胞的效应(例如细菌死亡率或细胞死亡率)直接测定，和／或可根据药物对由微生物引起的传染性疾病的一个或多个方面的效应(例如，预防、改善、缓和和／或消除疾病或疾病的一个或多个症状)而间接测定。在一些优选的方面，本文提供的系统和方法用于检测对一种或多种药物的抗性，其中抗性是指可遗传的(遗传性)抗性。

术语“可变序列元件”是指核酸(例如DNA或RNA)区域，其包含一串毗连的核苷酸-例如2、3、5、10、15、25、50、75、100或更多个连续碱基-其包含至少一个已知与目的表型特征相关的序列变异，所述表型特征例如抗性、敏感性和／或药物反应性的其它方面。不被特定理论所限制，相信与药物反应性例如药物抗性和／或敏感性相关的序列变异可能发生于对决定反应表型起重要作用的核酸区域中，从而包含变异(和周围核苷酸)的可变序列元件实质上更可能包含另外的、未经鉴定的、与反应性(例如抗性或敏感性)表型相关的变异。例如，与药物抗性相关的序列变异经常发生于编码相应蛋白位点的核酸区域，所述蛋白对药物反应性在结构和／或功能上是决定性的，例如药物结合位点。包括已知的变异(和周围核苷酸)的可变序列元件将可能编码蛋白的结构和／或功能相关部分(例如，袋、折叠或其它包含药物结合位点的结构)，可变序列元件中的其它的未鉴定的变异将可能与已知变异一样与相同的表型相关。

因此本文提供了用于检验与已知和／或未知序列变异相关的药物反应性表型的方法。有利地，这样的方法能够检测药物反应性而不需预先知道特定的核酸序列变异，这允许迅速鉴定与药物抗性、药物敏感性和／或其它药物反应性表型相关的新的遗传突变。因此，本文提供的方法可比现有的基于已鉴定的突变的方法达到更高的敏感性和具有更多的诊断应用。

因此，本文提供的可变序列元件包括一个或多个已知与药物抗性表型相关的序列变异，按照本文描述检验这样的可变序列元件允许检测由于已知变异和／或另外的未鉴定的变异而引起的药物抗性表型。优选地，本文提供的可变序列元件的大小为允许高度敏感性并且假阳性低(例如，其大小足够编码被已知变异改变的蛋白部分和结构和／或功能上相关的区域而不包括蛋白的显著不相关部分)。在一些实施方式中，检测本文提供的可变序列元件内的序列变异是药物抗性的指征，其假阳性比率为约小于25％，小于约20％，小于约15％，或更优选为小于约10％、5％或1％。

在各个方面，提供了诊断方法，该方法通过测定微生物对药物的反应性而确定被微生物感染的个体是否能够用该药物治疗。在一些方面，通过从个体获得生物样品并检验该样品中与药物反应性相关的可变序列元件内的一个或多个序列变异而测定反应性。在一些优选方面，可变序列元件与对药物的敏感性相关。

在一些优选方面，提供了检测个体是否被药物抗性Tb感染的方法，其中该方法包括从个体中获得生物样品并检验样品中靶DNA可变序列元件内一个或多个核酸序列变异，所述可变序列元件选自表1中所示的可变序列元件。在一些优选的实施方式中，方法还包括使用表3中所示的引物扩增靶可变序列元件。

在一些优选方面，本文提供的方法包括制备生物样品以有利于检测和／或分析靶核酸的步骤。在一些方面，提供了制备生物样品以进行高解析度序列分析的系统和方法。在一些优选的实施方式中，处理生物样品以通过聚合酶链反应(PCR)或本领域已知的其它方法扩增靶DNA可变序列元件。

PCR扩增通常包括起始变性、退火、聚合和最后的延伸的步骤。PCR扩增通常是在反应室中进行，其中提供了必需的PCR反应物，包括含有靶DNA的生物样品，DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)、核苷三磷酸、与靶DNA杂交并位于扩增的DNA产物(“扩增子”)两翼的第一和第二引物(包含引物对)。PCR仪器通常包括使扩增循环的每个步骤所需要的反应室温度循环的装置，所述温度包括，例如双链DNA“熔解”产生单链DNA；引物与单链DNA模板退火；和扩增的DNA通过聚合酶延伸。

用于扩增特定靶DNA序列的精确条件可根据一些因素而变化，这在技术人员的知识范围内。在一些实施方式中，变性在约90-95℃进行约10-30秒，退火在约45-65℃进行约10-30秒；延伸在约70-75℃进行约10-90秒；最终的延伸在72℃进行约5分钟。在一些实施方式中，反应混合物包含基因组DNA、MgCl₂和其它生理盐(例如MnCl₂)、PCR缓冲液、0.1-1.O mMdNTP、0.04-1.5μM的每个引物、和0.5-5.0单位的热稳定性聚合酶(例如Taq聚合酶)。

本领域已知的其它扩增方法可也使用，包括例如，自主维持序列扩增(3SR)；链替代扩增(SDA)；“支链”DNA扩增(Chiron Corp.)；连接酶链反应(LCR)；QB复制酶扩增(QBR)；连接激活转录(LAT)；基于核酸序列的扩增(NASBA)；修复链反应(RCR)；和循环探针反应(CPR)(参见例如The Genesis Report，DX；Vol.3(4)，pp.2-7(1994年2月)中的综述)。

在一些方面，提供了新型引物用于扩增靶核酸以用于按照本文所提供方法的分析。例如，在各种实施方式中，表2中所示的引物可用于扩增表3中所示的相应的扩增子，其可用于本文描述的各种方法中以用于检测指征药物抗性的序列变异。

在一些方面，使用熔解曲线分析(MCA)根据本文提供的方法检测靶核酸内的序列变异。在各种实施方式中，MCA包括：在染料存在时缓慢加热DNA片段，所述染料允许测定双链DNA(dsDNA)和单链DNA(ssDNA)的相对量作为时间和温度的函数，如在Morrison和Stols，Biochemistry，32：3095-3104(1993)中所描述。合适的染料包括但不限于dsDNA-特异性染料，如溴乙啶、SYBR Green I和SYBR Green II(Molecular Probes，Eugene，Oreg.)、EvaGreen(GENTAUR EUROPE)和ssDNA-特异性染料。在一些优选实施方式中，染料为荧光染料如SYBR Green I，SYBR Green II，Eva Green，LC Green I和LC Green Plus。在各种实施方式中，染料可以是饱和或不饱和的。

在各个方面，在本文提供的方法中用于检测序列变异的MCA包括：在荧光DNA结合染料存在时将含有靶核酸的样品和核苷酸探针一起孵育，并监测杂交程度(由荧光水平指示)作为时间和温度的函数。例如，在一些实施方式中，表3的可变序列元件在生物样品中被扩增，在dsDNA结合染料存在时将扩增的样品和与表3中所示的野生型序列互补的核苷酸探针一起孵育。然后以恒定的速率缓慢加热样品(例如每分钟约0.05至10.0℃)同时测定相对于时间的荧光水平。在各种优选实施方式中，进行平行的对照MCA，其中靶DNA为已知具有表3中所示的野生型序列。在最初的低温度时靶DNA与互补的核苷酸探针杂交形成dsDNA，而当温度升高时，dsDNA变性，将dsDNA转化为ssDNA。dsDNA转化为ssDNA伴随着荧光的变化，这是所用的特定染料的特性。有利地，可通过分析相对于对照样品来说荧光随时间的变化而检测生物样品中的序列变异。

在各种优选实施方式中，在本文提供的方法中使用的MCA允许“高解析度”检测靶序列内的序列变异，其作为荧光数据的一个或多个方面的变化而被检测。在一些优选的实施方式中，根据本文提供的方法的高解析度MCA可分辨样品-探针和对照-探针dsDNA种类之间单个碱基和／或2、3、4、5或更多碱基的差别。

在一些方面，可使用以下方程将荧光数据作为时间的函数绘图，以确定最大荧光、最小荧光、最小荧光的时间和扩增产物的已知浓度的二级速率常数：

其中F是荧光，F_max是最大荧光，F_min是最小荧光，k是二级速率常数，t₀是F_min时的时间，[DNA]是扩增产物的已知浓度。在一些实施方式中，荧光相对于时间的数据的多个变量用于定义作为“MCA指纹”的一组标准，该MCA指纹唯一地(uniquely)鉴定与目标表型例如药物抗性相关的一个或多个序列。例如，在一些实施方式中，药物抗性表型可这样检测：通过使用从生物样品扩增的DNA进行MCA，并与已经建立的MCA指纹比较荧光相对于时间的数据。

在一些优选方面，提供了检验生物样品的药物抗性结核病的方法，该方法包括：使用一个或多个表2所示的相应引物对扩增一个或多个选自表3的可变序列元件，并使用MCA检验样品中所述一个或多个扩增的可变序列元件内的序列变异。在各种实施方式中，相对于对照样品或已知标准品中对应的可变序列元件，检测到生物样品中可变序列元件内的一个或多个变异是药物抗性的指征。

在各种实施方式中，扩增的MTb DNA包含SEQ ID NO：142-145中的一个或多个，一个或多个扩增的DNA片段中的变异指征MTb对利福平的敏感性；扩增的MTb DNA包含SEQ IDNO：146-151中的一个或多个，一个或多个扩增的DNA片段中的变异指征MTb对吡嗪酰胺的敏感性；扩增的MTbDNA包含SEQ ID NO：152-154中的一个或多个，一个或多个扩增的DNA片段中的变异指征MTb对链霉素的敏感性；扩增的MTb DNA包含SEQ ID NO：155-176中的一个或多个，一个或多个扩增的DNA片段中的变异指征MTb对异烟肼的敏感性；扩增的MTb DNA包含SEQ ID NO：177-198中的一个或多个，一个或多个扩增的DNA片段中的变异指征MTb对乙胺丁醇的敏感性；扩增的MTb DNA包含SEQ ID NO：199-203中的一个或多个，一个或多个扩增的DNA片段中的变异指征MTb对卷曲霉素和紫霉素中的一种或对二者的敏感性；和／或扩增的MTb DNA包含SEQ ID NO：204，一个或多个扩增的DNA片段中的变异指征MTb对西沙星、莫西沙星、加替沙星、西他沙星、氧氟沙星、左旋氧氟沙星和司帕沙星中的一个或多个的敏感性。

在一些优选方面，提供了用于检验生物样品的药物抗性HIV的方法，其中该方法包括：使用SEQ ID NO：1和2的对应引物对扩增SEQ ID NO：1的可变序列元件，使用MCA检验样品中扩增的序列内的序列变异，其中相对于对照样品或已知标准品来说，检测到生物样品的扩增子内的一个或多个变异是药物抗性HIV的指征。在一些优选实施方式中，检测到扩增子内一个或多个变异是齐多夫定和／或奈韦拉平(nevirapine)抗性HIV的指征。

在一些优选方面，提供了用于检验生物样品的药物抗性疟疾的方法，其中该方法包括：使用SEQ ID NO：1和2的对应引物对扩增SEQ ID NO：2的可变序列元件，使用MCA检验样品中扩增的序列内的序列变异，其中相对于对照样品或已知标准品来说，检测到生物样品的扩增子内的一个或多个变异是药物抗性疟疾的指征。在一些优选实施方式中，检测到扩增子内一个或多个变异是氯喹抗性疟疾的指征。

在一些优选方面，提供了用于检验生物样品的药物抗性癌细胞的方法，其中该方法包括：使用SEQ ID NO：1和2的对应引物对扩增SEQ ID NO：1的可变序列元件和／或使用引物对SEQ ID NO：3和4扩增SEQ ID NO：2的可变序列元件，使用MCA检验样品中一种或两种扩增的序列内的序列变异，其中相对于对照样品或已知标准品来说，检测到生物样品一种或两种扩增子内的一个或多个变异是药物抗性癌细胞的指征。在一些优选实施方式中，检测到SEQ ID NO：1和／或SEQ ID NO：2的扩增子内一个或多个变异是埃坡霉素和／或紫杉烷抗性癌细胞的指征。

在一些优选方面，提供了用于检验生物样品的药物抗性酿酒酵母的方法，其中该方法包括：使用SEQ ID NO：1和2的对应引物对扩增SEQ ID NO：1的可变序列元件，使用MCA检验样品中扩增的序列内的序列变异，其中相对于对照样品或已知标准品来说，检测到生物样品的扩增子内的一个或多个变异是药物抗性酿酒酵母的指征。在一些优选实施方式中，检测到扩增子内一个或多个变异是特比萘芬抗性酿酒酵母的指征。

在一些优选方面，提供了用于检验生物样品的药物抗性金黄色葡萄球菌的方法，其中该方法包括：使用SEQ ID NO：1和2的对应引物对扩增SEQ IDNO：1的可变序列元件，使用MCA检验样品中扩增的序列内的序列变异，其中相对于对照样品或已知标准品来说，检测到生物样品的扩增子内的一个或多个变异是药物抗性金黄色葡萄球菌的指征。在一些优选实施方式中，检测到扩增子内一个或多个变异是万古霉素和／或β-内酰胺抗性金黄色葡萄球菌的指征。

表1A：与药物抗性相关的MTb核酸区域

MTb-结核分支杆菌

从痰液中分离合适数量的结核分枝杆菌对分子诊断领域而言是一个非常大的挑战。痰液样本中通常含有如此低数量的活的MTb以致分离物必须生长2个月才能保证足够数量的用于分子诊断应用的遗传材料。虽然很多分子诊断技术能够检测非常小数量的起始材料，低至单个拷贝，但是经常难以保证特定的样品事实上含有所需要数量的起始材料。

为了能够在分子诊断程序中使用非常稀少或珍贵的样品，已经应用一种被称为全基因组扩增的技术来富集起始材料以用于下游的分子诊断程序。如此，本文描述的一些方法的实施方式将全基因组扩增方法应用于筛选含有MTb的痰液样品的问题。本文提供的各种方法也可用于检测含有核酸或核酸混合物的样品中一个或多个核酸序列的存在或不存在，或为了分辨这样的样品中两个不同的序列。

在各种实施方式中，提供了改善使用实时PCR、dsDNA结合染料和基于荧光探针的方法检测样品中核酸序列的方法。

在一些实施方式中，提供了制备微生物核酸用于扩增和高解析度分析的方法。微生物，例如结核分枝杆菌(MTb)，可使用常规的样品分离方案分离，可使用熟知的、新型的或待开发的方法提取并扩增微生物的核酸。

在分子富集和扩增后，使用定量方法例如PCR在各个方面筛选核酸中是否存在众多遗传标记中的任何遗传标记。核酸也可被定量以用于下游分析。可使用任何定量方法，包括但不限于qPCR分析、UV分析、凝胶分析和核酸定量试剂盒。在一些实施方式中，进行核酸的最终扩增以扩增核酸及其目的片段，例如药物(例如抗生素)易感性靶标。可使用饱和染料追踪扩增、杂交和核酸的变性。

在一些实施方式中，可在杂交和／或变性过程中使用高解析度监测技术监测扩增的靶核酸，所述技术例如检测与核酸结构和／或构象变化(例如那些伴随杂交和熔解的结构和／或构象变化)相关的荧光变化的技术。对照靶核酸可进行平行的类似监测。在靶核酸(例如药物易感性区域)和对照核酸间检测到的变异可以是对药物的易感性减少(如抗性)的指征，所述药物靶向从靶核酸中形成的基因产物的特定区域。

在各种实施方式中，提供了用于分离、扩增和分析微生物例如MTb的靶核酸的方法，如以下和本说明书所述。在其它实施方式中，靶核酸例如那些表1中所示的，可使用本领域建立的方法从细胞或临床样品中分离。

在一些实施方式中，使用常规活体制备方法例如Petroff方法从痰液样品中分离出分离的MTb，这些方法将少量的MTb生物留在水性悬浮液中。使用商售试剂盒MycoBuffer(RAOGene；Milford，PA)根据生产商的指示从样品中分离核酸，从而从MycoBuffer产品的残余材料中分离至少小数量的MTb DNA。可以分离较大量的DNA。

使用任何抑制或消除非特异性核酸产物形成的DNA扩增方法将使用裂解溶液获得的DNA样品进行初步MTb DNA的筛选。同样，扩增方法可进行延长的时间以解决初级裂解物中通常存在小数量DNA的问题。覆盖这些目的区域的示例性引物如表2所示。

表2：扩增靶区域的示例性引物

MTb一结核分支杆菌

在其它实施方式中，在初步筛选结果之后或者与初步筛选同时进行，将使用裂解溶液获得的DNA样品与那些在全基因组扩增程序中使用的类似的反应成分组合。

但是，可使用其它合适的扩增程序以使DNA样品扩增至合适数量的基因组核酸。全基因组扩增程序可提供DNA样品的分子富集，在16小时的温育时间内提供超过30倍数量的MTb基因组。只在没有足够的模板来获得初步扩增的情况下需要使用全基因组扩增。

然后使用众多纯化DNA方法中任何方法来纯化富集的DNA。例如，能够同时容纳96或更多个样品的过滤板系统可用于纯化富集DNA的样品阵列。富集和纯化的DNA进行MTb或一般分支杆菌特异性PCR扩增方案，确定DNA的数量或浓度。例如，可使用实时定量PCR扩增并确定样品中的MTb DNA的数量。如果不使用全基因组扩增，没必要进行纯化。

调整样品浓度以使富集的MTb DNA与对照DNA匹配，以达到约1：1或另一个预先确定和固定的比率。这允许在接下来的检测步骤中使用接近等量比率的富集的MTb DNA和对照DNA。经浓度校正的富集的MTb DNA与含有核酸靶区域的参考基因序列的对照MTb DNA共同扩增。即，对照MTb DNA含有基因区域(例如序列)，如果该基因区域变异，即指征MTb生物对靶向该基因区域的药物(例如抗生素或抗真菌药物)的减少的易感性(例如抗性)。在表3中提供了由表2所示的引物对扩增的示例性基因区域和对应的药物敏感性。这些区域能够确定结核分枝杆菌感染中的药物抗性或敏感性，以及例如，HIV中齐多夫定敏感性，人类癌症中紫杉烷的敏感性，疟疾中氯喹的敏感性，酿酒酵母中特比萘芬的敏感性和金黄色葡萄球菌中万古霉素的敏感性。

表3：MTb药物敏感性测试的示例性区域

将共同扩增的富集的MTb DNA和对照MTb DNA的序列同时变性，然后退火以产生扩增的对照MTb DNA和富集的MTb DNA的同质双链，也产生对照和富集的MTb DNA的异质双链。在扩增混合物中加入饱和的双链DNA结合染料，例如当与双链核酸相互作用时发射荧光的染料，以从这些同质双链和异质双链中产生高解析度的熔解曲线数据。如此，同质双链和异质双链的退火样品以及对照MTb DNA进行高解析度熔解曲线分析，以荧光或其它检测结合染料的方法检测该熔解曲线分析。

将监测同质双链和异质双链以及对照MTb DNA的高解析度熔解获得的数据输入计算机系统以分析数据。相对于含有共同扩增的同质双链和异质双链的样品，计算不含加入的富集的样品DNA的对照MTb DNA样品数据，进行数学比较。以初始及终止点和温度校正后的数学比较，允许从对照MTbDNA样品数据中减去沿着含有共同扩增产品的样品的熔解曲线的每个数据点。所产生的不变的样品(其具有的序列与对照MTb DNA没有实质上的不同)的图基本上是在零左右具有微小变化的水平线。具有含有碱基对错配的异质双链DNA(例如，对照DNA和富集的样品DNA)的样品的图将在熔解曲线中显示变化，当进行减法运算时将产生与对照和不变序列的水平线明显不同的曲线。

那些熔解曲线图相对于对照样品图有所变化的样品被评定为在药物靶区域(例如核酸靶标)中有变化，微生物可能对针对该遗传区域的药物的作用较少易感(例如抗性)。同样，对于单独的病人或多个病人可在不同的反应室中同时扩增几个药物靶核酸区域。

在各个方面，本文提供的系统和方法能够迅速筛选合适的药物用于治疗MTb的各个病例。使用这样的方法，可向MTb病人开出快速的个体化医药方案，这使每个病人的药物较少，对治疗方案的顺从率较高和／或最终使MDR-MTb产生的速率减小。

II.新型引物

在一些实施方式中，提供了用于改善核酸序列检测的方法，该方法使用合理的寡核苷酸引物设计和合理的靶序列设计的联合以产生对以靶核酸进行引物退火、靶核酸扩增和扩增的靶核酸产物的变性而言均较窄的温度范围。这样，与正常所使用的温度范围相比，缩窄的温度范围可使扩增的靶核酸产物含有较少的非特异性产物。因此，扩增的靶核酸产物对于本文所描述的定量PCR和基因型靶标检测应用而言总体上更为特异和敏感。

寡核苷酸引物的理论设计可包括通过具有需要的熔解温度(Tm)的引物的计算、实验或计算机计算(computation)进行选择。理论设计可包括选择具有合适的CG％的特异引物序列以获得需要的Tm。同样，理论设计可以包括对引物的修饰，其包括核苷酸内修饰、碱基修饰和核苷酸修饰。

在一些实施方式中，提供了用于选择PCR引物的方法，所述引物在靶核酸上位于目标可变序列元件的侧翼。在一些实施方式中，选择这样的引物，其与靶核酸的Tm(引物：靶Tm)在靶核酸的Tm(靶：靶Tm)的窄范围内。用于这样的靶核酸扩增的特定的窄温度范围取决于靶核酸的熔解特征，因此靶核酸的序列被扩增。这样，窄温度范围可用作靶温度范围以鉴定和／或产生当与靶核酸杂交时具有足够高Tm值的特异引物。因此，引物的Tm值可与靶核酸退火和／或变性温度范围重叠(参见图1)。

图1可与图2对照以解释设计引物使其Tm在靶核酸的Tm范围内。图2显示出以引物和靶核酸进行的常规扩增不具有温度重叠(如图1所示)且在扩增、对应于变性、退火和延伸循环过程中需要极端温度变化，以产生扩增产物。这样的极端温度范围允许形成不需要的产物。

在一些实施方式中，提供一种反复性(iterative)设计过程以选择和／或最优化引物以使特异性靶核酸序列被扩增和／或检测。优选地，该反复性方法能够通过使用窄范围的温度条件形成特异性靶核酸，其中靶核酸以及与靶核酸杂交的寡核苷酸引物均处于退火和变性的动态变迁中。这样的退火和变性的动态变迁可导致靶核酸的特异性扩增，而非特异性扩增产物的形成显著减少。

使用这样的选择和／或最优化引物的方法使得能够使用低成本染料取代更昂贵的定制寡核苷酸探针例如那些具有荧光标记的探针，可以允许定量PCR或高解析度变性用于分析靶核酸的序列。同样地，反复性方法可提供在缺乏灵敏的温控装置的情况下发挥作用以形成扩增产品的引物。即，引物可在窄的温度范围内工作以扩增靶核酸，允许核酸扩增(方法)被用于范围广得多的用途中。

本领域已经描述了许多计算已知序列的DNA的理论Tm的方法，包括例如Rychlik和Rhoads描述的方法，Nucleic Acids Res.17：8543-8551(1989)；S ambrook，J等人描述的方法，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；和Breslauer等人描述的方法，Proc Natl AcadSci.83：3746-3750(1986)。

在一些实施方式中，可以通过化学修饰寡核苷酸将引物构建为与靶核酸的Tm处于靶核酸Tm的窄范围内。熟知的寡核苷酸合成化学可用于增加引物的Tm值从而其对应于靶核酸的Tm的温度范围。这样的化学可使用修饰的碱基(例如超级G、A、T、C)、LNA或PNA，或其它这样的寡核苷酸稳定化学。同样，可开发另外的寡核苷酸杂交稳定化学用于这个应用。

例如，以常规磷酸二酯键合化学和LNA化学二者合成的引物已经用于提供具有与靶核酸序列的Tm值接近的Tm的引物。但是，可能的是，一些靶核酸可能具有低于引物Tm的Tm值，可能需要包括杂交去稳定化学以降低引物Tm值从而使引物Tm值处于靶核酸序列的Tm值范围内。

在一些实施方式中，提供了用于改进引物设计以使靶核酸序列特异性扩增的温度范围最小化的方法。这样，以标准反应热循环条件扩增靶核酸以确保靶核酸序列被扩增。使用实时PCR以双链DNA结合染料例如SYBR、LCGreen、LCGreen+、Eva染料等监测扩增。扩增的靶核酸进行熔解曲线分析以确定靶核酸序列的实际Tm值。熔解峰，其可被表示为-dF／dT，是从扩增的靶核酸的熔解中产生的，其范围可与确定的温度范围内的分布曲线相似。在低温度端，扩增的靶核酸模板被部分变性。在最高温度，扩增的靶核酸的全部样品被变性。在扩增程序中对变性靶核酸必要的温度在这个温度分布内。最初，推荐最高温度以确保更完全的变性。然后，可使用分布曲线的最低温度作为设计的引物组的最初Tm，在对引物进行任何反复性改变之前将所述引物组用于扩增中(the lowermost temperature of thedistribution curve can be used as the initial Tm for a set of designedprimers for use in amplification before any iterative changes are made to theprimers)。最初引物可使用的窄温度范围的确认可在渐增的退火温度的系列或平行实验中进行。或者，可向扩增模板中加入个别引物，并且在组合的引物和模板熔解曲线上进行另外的熔解曲线分析。在任何情况下，引物的Tm被设置为与含有靶核酸序列的Tm的温度范围重叠。

来自那些靶核酸被特异性和有效扩增的实验的最高退火温度被认为是确定已存在的引物(例如被测试的引物)的最佳退火温度的温度。然后这些相同的引物或稍微修饰的引物可通过另外的杂交稳定化学重新合成。对引物修饰以朝着需要的方向改变Tm，以使引物Tm与含有靶核酸的Tm的窄温度范围重叠。这可使用在线设计工具来完成，例如可从Integrated DNA Technologies获得的LNA设计工具。这样的设计工具可用于评估将引物的Tm升高以更好地与靶核酸序列的熔解曲线重叠的必需的LNA修饰的数目。

在引物Tm值比靶核酸序列的最高熔解温度高的情况下，可能需要重新设计引物以使其具有较低的Tm。或者，可降低扩增方案(例如PCR)中所使用的二价和／或一价阳离子盐或其它去稳定试剂(例如AgCl、DMSO等)的数量以将这些寡核苷酸与模板的杂交去稳定化。无论如何，在一些情况下可能需要降低引物的Tm。

在一些实施方式中，可制备引物以使靶核酸扩增或富集方案在热循环过程中的最小温度差异下进行。这使得热循环可以在窄温度范围内进行，以促进特异性产物的形成。热循环的一个范围可以是靶核酸Tm的约15℃内，更优选为10℃内，更优选为5℃内，再更优选为2.5℃内，最优选为与靶核酸的Tm实质上相同的Tm。例如，扩增靶核酸的热循环条件跨越靶核酸序列的Tm峰值+／-约5至10℃。这样的窄温度范围使得可以扩增特异靶核酸而不在对应于PCR扩增的正常阶段(变性、退火和延伸)的温度之间进行热循环。同样，使得可以在商售的温度控制装置中进行扩增和富集，所述装置可被设定于选定的温度或在窄温度范围内变化，例如烘箱、加热器等。图3例示了窄温度范围的PCR扩增的图，其具有如图2所示的相同的靶核酸序列，其显示出更特异的产物形成和较少的不需要的产物的形成。

在一些实施方式中，热循环的温度可在窄温度范围内选择以实质上将扩增限制于扩增靶核酸序列。如此，可通过将退火温度调整为基本上与扩增子的熔解峰值的较低温度基线(base)相同来调整热循环条件以扩增靶核酸序列。同样，可通过将退火温度调整为基本上与扩增子的熔解峰值的较高温度基线相同来调整热循环条件以扩增靶核酸序列。

在一些实施方式中，可选择引物的Tm从而靶核酸的扩增可在介于约75至约90℃的温度范围内进行。这样的温度范围，或再窄5至10℃，可用于DNA和／或RNA靶核酸序列的扩增以减少扩增(例如PCR)过程中非特异性产物的形成。

在一些实施方式中，可选择引物的Tm从而扩增在靶核酸序列的Tm范围内的等温扩增条件下进行，以确保合适的产物形成。

在一些实施方式中，本发明包括设计引物组的方法，所述引物组与靶核酸的Tm处于靶核酸序列Tm的窄范围内。如此，引物组可被设计为引物Tm与靶核酸序列Tm的分布曲线重叠。例如，引物组可用于实时PCR检测从而引物Tm与靶核酸序列Tm的分布曲线重叠，因此窄温度范围可用来扩增靶核酸序列。例如，引物可被设计为具有这样的Tm，其在靶核酸Tm的约15℃以内，更优选为10℃以内，更优选为5℃以内，再更优选为2.5℃以内，最优选为与靶核酸的Tm实质上相同。同样，这可以包括与扩增子Tm曲线重叠的引物Tm值。

在一些实施方式中，本发明包括一种用于设计引物的反复性过程。这样的重复性过程包括鉴定最初的靶核酸序列作为靶扩增子，其中靶核酸序列可与特定的生物活性例如可能的药物抗性相关。然后扩增靶核酸序列以产生扩增的产物，使用常规熔解曲线分析确定扩增产物(例如扩增子)的Tm值。然后使用熔解曲线分析确定或计算出用于扩增靶核酸的新的引物或引物组。然后将确定的或计算出的引物设计为具有处于扩增产物的熔解产生的熔解峰范围内的Tm值。然后制备或合成引物以具有设计的引物Tm值。

在一些实施方式中，可以修改扩增靶核酸序列的方案的条件至合适的pH值以增加选择性扩增靶核酸而非其它核酸的特异性。如此，使用合适的pH可增加选择性扩增靶核酸序列的能力。这可包括使用扩增缓冲液，其能激活化学失活的热稳定DNA聚合酶。同样，以选择的扩增缓冲液调节pH可以允许扩增方案在降低的温度下进行，例如那些本文所述的温度范围。

在一些实施方式中，可调节扩增缓冲液的pH从而允许将化学失活的酶转化为激活状态。如此，酶可在稍酸性的条件下激活；但是对于一些酶可使用碱性的pH值。对于酸-激活的酶，标准的基于Tris的PCR缓冲液可具有显著的温度依赖性(例如每摄氏度降低0.028pH单位)。从失活状态完全激活酶(例如化学失活的热稳定性DNA聚合酶)可以需要约小于7的pH，更优选为约小于6.75，最优选为小于6.5。

在一些实施方式中，扩增方案包括使用较低pH的缓冲液从而扩增可在较低激活的温度进行。例如，对于95℃以下每10℃，酶激活温度可降低0.3pH单位。但是，这个方法的限制完全是用于实时检测扩增的模板的染料化学的作用(例如基于荧光的检测在pH7.3以下具有显著降低的荧光)。

在一些实施方式中，可通过改变引物序列的GC％来调节引物Tm。通过改变GC％，引物的Tm可被选择性改变。通常，增加GC％可增加Tm，降低GC％可降低Tm。但是，有这样的情况：需要高GC％将过度增加Tm。在这样的情况下，可使用去稳定剂来实现包括高GC％含量引物或用于高GC％靶核苷酸的用途。去稳定剂可选择性降低扩增程序的温度。去稳定剂的例子包括DMSO、AgCl等。

在一些实施方式中，可调节引物的设计和／或扩增条件从而调节所扩增的靶核酸序列的大小。这可以包括调节引物的设计和／或扩增条件从而扩增子的大小显著大于仅仅的引物组合。这可包括扩增子比引物长1-3个核苷酸，或比引物长2倍，或比引物长5倍，更优选为比引物长10倍。

在一些实施方式中，如本文所述设计的引物可用于扩增程序的阵列，其具有不同浓度的起始材料。即，起始材料可以不同浓度被分区(partitioned)投入阵列，引物可按照本文描述的窄温度范围扩增方案在其中使用。使用引物和具有不同浓度起始材料的阵列的窄温度扩增方案可用于定量起始材料中靶核酸的量。图4显示了使用引物和不同浓度起始材料的阵列的方案从而定量靶材料的数量。

III.靶核酸扩增／富集

在一些实施方式中，本文提供的方法包括扩增或富集靶核酸的步骤。这样的方法可包括与熟知的全基因组扩增和全转录组扩增方法实质上相似的程序。这包括用基因组文库产生步骤然后进行文库的扩增步骤来扩增基因组。同样，文库产生步骤可使用特异性引物或本文描述的特异性引物与DNA聚合酶或逆转录酶的混合物。可设计特异性引物混合物中的引物从而消除自身杂交和／或与混合物中其它引物杂交的能力，但是允许引物有效地和频繁地引导靶核酸序列，其中引物可按照本文所述设计。

在一些实施方式中，提供了用于同时确定个体物种成员相对于物种的整个标准基因组的基因表达图谱的方法。该方法包括将基因组材料的液体样品分布到基材(substrate)反应室阵列中。阵列可含有引物组和用于整个标准基因组中每个靶核酸序列的探针。液体样品可实质上包含该成员的所有遗传材料。每个反应室可包含引物组和针对至少一个靶核酸序列的探针以及聚合酶。该方法还可包括扩增阵列中的液体样品，检测由至少一个探针发出的信号，并根据信号反应鉴定遗传表达图谱。

由于从痰液样品中分离合适数量的微生物例如MTb具有很大的挑战性，所以本文描述的基因组扩增技术可代替传统的培养和纯化方案而使用。虽然很多分子诊断技术能够检测很小数量的起始遗传材料(例如低至单个拷贝的靶核酸序列)，但是经常难以确保特定的样品实际上含有需要的单个拷贝的靶核酸序列。为了能够在分子诊断程序中精确检测非常少或珍贵的样品，已经应用了一种称为全基因组扩增的技术来富集起始材料用于下游分子诊断程序。本文描述的方法将全基因组扩增方法应用于通常含有所述低数量活体生物的痰液样品的MTb筛选的问题。另外，可使用标准程序分离MTb，生长2个月以确保可从样品中获得足够数量的遗传材料以用于分子诊断应用。

使用为了体外富集稀少和珍贵的DNA和／或RNA样品而开发的全基因组扩增技术，已经发展了一种新型遗传材料富集方法以富集含有微生物DNA例如MTb DNA的样品。这项技术能够绕过迄今为止用于增加微生物浓度的常规培养方法，下游分子诊断常常需要增加微生物浓度。这样的全基因组扩增技术使用来自直接裂解的微生物样品的少量基因组DNA。可用商售产品直接裂解含有以Petroff方法分离的活体微生物的样品，将得到的小数量微生物DNA进行全基因组扩增技术以提供用于下游分子诊断应用的扩增子。虽然针对MTb描述了应用全基因组扩增技术的程序，但应该认识到这样的技术可应用于任何微生物。

使用常规的活体微生物制备技术，Petroff方法，分离的MTb从痰液样品中分出来，留下小数量的生物体在水悬浮液中。按照分支杆菌裂解溶液MycoBuffer，(RAOGene；Milford，PA)的生产商的指示，从来自MycoBuffer产品中的残余材料中分离小数量的MTbDNA。使用这种直接裂解的DNA样品并将其与全基因组扩增程序中使用的那些类似的反应成分组合可将样品DNA进行分子富集。这样的程序可以提供增加数量的MTb基因组，例如在小于16小时的温育时间内超过30倍。这个水平的样品富集能够产生足够数量的MTb基因组材料以在少于一天的时间内使用这样富集材料用于下游分子诊断程序，现在的方法则需要超过2个月的时间在诊断测试前培养MTb分离体。

全基因组扩增技术可使用一种或多种DNA聚合酶以通过减少富集所需的时间或通过增加得到的富集材料的数量而改善富集结果。这可用于扩增RNA和／或DNA。同样，扩增技术可单独使用逆转录酶或与DNA聚合酶联合使用以富集裂解材料样品的RNA成分。另外，扩增技术可使用一种或多种不同的靶核酸引物(priming)参数。可被调节的引物参数的例子包括：大小(size)引物；随机引物；随机引物的数量；特异性靶引物；区域特异性引物；及其组合。对这样的引物参数的调整可改善样品的全基因组扩增或特异性区域扩增。此外，扩增技术可使用各种缓冲液混合物以改善样品的富集。此外，扩增技术可使用各种浓度的核酸构建材料，其可来自天然或人工来源。另外，扩增技术可在任何能够保持恒定温度或窄温度范围内的变化温度的设备(例如能够保持设定的温度的设备，不管是稳定的或以具有程序化的温度特征)中进行。反应条件可以包括在富集过程中的在温度范围内的一些温度变化，从而改善富集的遗传材料的数量或指定遗传材料例如靶核酸序列的特定区域的富集。

例如，可使用任何方法分离样品基因组材料，其将微生物(例如MTb)核酸释放进入溶液或固相收集器。可从除了痰液以外的样品中分离样品基因组材料，例如但不限于血液、脑脊髓液、皮肤病灶、器官病灶或从环境样品中分离。可使用与全基因组扩增或巢式PCR类似的富集方法来富集样品基因组材料。这允许使用扩增靶核酸序列的热循环方法并联合特异性引物(例如具有本文所描述的Tm的引物)来扩增靶核酸序列周围的区域。另外，可在基因组宽广(genome wide)巢式PCR类型中使用非特异性引物扩增基因组。

Mycobuffer溶液中的结合分支杆菌核酸样品可从销售商提供的核酸提取方案中或按照任何标准方法制备。核酸可以是来自待富集的微生物样品的DNA或RNA，其中核酸可以是完整的、片段化的或整个生物体核酸的部分。富集混合物可包括合适的DNA和／或RNA聚合酶缓冲液、三磷酸脱氧核苷酸、适合于特定酶的盐和缓冲系统、以及随机寡核苷酸引物。引物长度的例子可包括6个碱基、11个碱基和22个碱基的引物(我们是否应该扩展这个?)。引物可以是磷酸二酯寡核苷酸、LNA寡核苷酸、PNA寡核苷酸或其任何组合；但是，也期望将来的能够产生待检测靶DNA或RNA的扩增或富集的化学在这项技术中正确发挥作用。同样在混合物中可包含单链DNA或RNA结合蛋白以改善富集步骤的总体表现。

示例性扩增技术可按照如下进行：将测试样品靶核酸在合适的聚合缓冲液中与合适的盐、随机寡核苷酸引物(例如，6、11或22碱基，或表2所示的任何引物或任何长度的引物)混合，在足够高的温度使核酸变性以确保变性至少基本上完全，优选完全进行；将变性的样品保持在接近变性条件，或保持于样品的靶核酸序列能够经历去稳定化杂交条件的温度环境；然后将样品充分冷却以允许引物与靶序列退火，其中靶序列包含于全基因组或其片段中；向混合物中加入合适的核酸构建材料，即三磷酸脱氧核苷酸或三磷酸核糖核苷酸，或者可能是能够掺入所形成的产物的非天然或人造核酸碱基；然后混合用于富集目标的合适的酶(例如DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶，其任何组合等)；扩增在窄温度内进行以选择性扩增靶核酸序列。

IV.筛选靶核酸以确定药物抗性

在一些实施方式中，本文描述的扩增的核酸可用于筛选靶核酸序列中是否存在指征药物抗性的核酸序列或核酸序列变化的方法。即，可以通过高解析度变性来筛选扩增的核酸中所选择的核酸序列，从而确定微生物是否对所选药物具有抗药性。如此，核酸的分子诊断可用于检测靶核酸序列中的遗传变化，其中序列的变化可指征微生物对药物的抗性。因此，可分析药物抗性株中已知的遗传序列改变从而确定在基因序列中是否有这样的改变。这样的遗传改变通常是病原体对药物治疗的易感性改变的指征，所述易感性改变通常体现为抗药性。

通常，现有的技术需要预先知道遗传核酸中与药物靶点相关的特定突变(例如核酸是药物靶点或产生作为药物靶点的基因产物)。这种信息用于筛选药物抗性，病原体遗传材料中未经特别检测的任何变化都可能在筛选过程中被忽略。本文描述的方法不需要预先知道特定的变化。所以，研究病原体遗传核酸(例如DNA、RNA等)的一般区域以确定在作为药物的直接靶点或编码药物的直接靶点的序列中是否有任何变化。同样，在病原体的遗传核酸中这样的区域中的遗传材料变化可能导致治疗性药物对个体无效或减低其效力。这项技术允许快速鉴定对药物靶核酸序列的任何遗传变化，可提供能够检测药物靶核酸序列中预期的以及未预期的变化的更高的敏感性。因此，本发明的方法可用于产生任何特定微生物分离体的药物抗性图谱从而确立药物抗性的可能性。

在一些实施方式中，筛选方法包括确定样品是否存在特定微生物。同样，可确定微生物遗传材料的数量。然后将任何阳性样品按照本文处理以扩增遗传材料的数量。这可包括将样品与在扩增靶序列的条件下与靶核酸杂交的引物或引物组混合。同样，可将样品遗传材料与不含有任何遗传变化的正常靶核酸序列或正常序列探针(荧光或非荧光)对照混合，从而产生～1∶1的比率，这接近于等量的测试和对照遗传材料。但是，可以实质上改变这个比例，例如从1∶10至10∶1。

将正常靶核酸序列或正常探针序列(例如对照核酸)与样品遗传材料(例如样品核酸)混合，然后在单一的反应管中扩增。或者在分别的扩增程序后将对照核酸和样品核酸混合。单独的正常靶核酸的对照核酸被同时扩增(但是，为了改进对核酸的各链的区分，可能在同一反应中运行对照和被检测的样品)。然后可以通过对照和样品核酸的高解析度熔解曲线分析来确定对照核酸和样品核酸的变性图谱。在表3中列出了具有对应于药物抗性变化的已知的突变的示例性的正常或野生型核酸区域。

这些测试的变性图谱数据可电子存储。如此，可从以前的分析中找出对照或样品数控据从而用于结果的比较。保存变性图谱数据的能力可以消除运行每个测试样品时总是进行对照反应的需要。将样品的数据与正常靶对照的数据比较，这两组数据间的任何差异或变化作为未知样品的靶区域的变化评分。当样品包含变化时，样品(例如微生物)被分类为对靶向被测试的遗传区域(例如靶核酸序列)的药物具有潜在的抗性。

在一些实施方式中，样品靶核酸(例如DNA或RNA)与对照靶核酸一起制备，从而获得约1∶1比率的样品和对照靶核酸。这可通过混合样品和对照核酸而实现，或以约1∶1比率的起始材料共同扩增样品和对照核酸(例如通过PCR)来实现。这些样品和对照核酸最初在足够高的温度变性以确保样品靶核酸和正常对照靶核酸均变性。然后混合物中的核酸(例如样品和对照)在比其开始变性的熔解温度(例如Tm)低一些的温度退火。例如，退火温度可以是比靶对照核酸的Tm低10℃或更多。然后缓慢加热混合物，监测管中存在的杂交样品和对照核酸的量。监测可通过双链核酸产物的荧光进行，其中荧光通过加入只与双链核酸结合的染料而产生。染料可以饱和模板的量加入。当双链核酸开始变性时失去荧光信号，能够结合于饱和的染料的位点更少。变性程序继续进行直至没有双链核酸存在，荧光接近零。然后将从变性程序获得的荧光数据存储于计算机并与对照变性数据相比较，所述对照变性数据为通过相似的方案只使用对照靶核酸而获得。如此，可以用样品和对照核酸的混合物以及只含有对照核酸的组合物进行高解析度熔解曲线分析，可在两个熔解曲线间进行比较。熔解曲线间的差异可作为样品核酸来自于对与靶核酸或其基因产物相互作用的药物有药物抗性的微生物的指征。

在一些实施方式中，任何可以将杂交样品和对照核酸从变性样品和对照核酸中分辨出来的方案或设备均可使用。从样品和对照核酸的混合物产生的样品变性曲线中获得的变性数据与对照核酸的变性数据比较。对照核酸的变性数据可以是存储的变性数据，或者对照核酸可以变性并在单独的反应室中与实验样品一起监测。将正常对照靶标的熔解图谱与实验样品比较，从而这些熔解图谱中的任何差异可以指征靶区域中变异的存在。当对照为正常对照靶核酸时，序列中的变异可指征微生物对与靶核酸或其基因产物相互作用的药物有抗性。

在一些实施方式中，共同扩增的富集的MTb DNA和对照MTb DNA同时变性，然后退火以产生扩增的对照MTb DNA和富集的MTb DNA的同质双链，也产生对照和富集MTb DNA的异质双链。在扩增混合物中加入饱和双链DNA结合染料，例如当与双链核酸相互作用时发出荧光的染料，从而能够从这些同质双链和异质双链中产生高解析度的熔解曲线数据。如此，同质双链和异质双链的退火样品以及对照MTb DNA进行高解析度熔解曲线分析，分析使用荧光或其它检测结合的染料的方法监测。

从监测同质双链、异质双链以及对照MTb DNA的高解析度熔解中获得的数据被输入计算机系统，从而可应用计算机方法分析数据。然后将不含有加入的富集样品DNA的对照MTb DNA样品数据的数学比较与含有共同扩增的同质双链和异质双链的样品进行计算比较。以温度和初始及终止点校正后的数学比较，允许从对照MTb DNA样品数据中减去沿着含有共同扩增产品的样品的熔解曲线的每个数据点。所产生的不变的样品(其序列与对照MTbDNA没有实质上的不同)的曲线基本上是在零左右具有微小变化的水平线。具有含有错配碱基对的异质双链DNA(例如，具有富集的样品DNA的对照DNA)的样品的图将在熔解曲线中显示变化，当进行减法运算时将产生与对照和不变序列的水平线明显不同的图。

那些熔解曲线图相对于对照样品图有所变化的样品被评定为在药物靶区域(例如核酸靶标)中有变化，微生物可能对针对该遗传区域的药物的作用较少易感(例如抗性)。同样，对于单独的病人或多个病人可在不同的反应室中同时扩增几个药物靶核酸区域。

图6A-6C提供了例证显示确定来自正常靶核酸序列的样品靶核酸序列中是否存在变异的高解析度熔解曲线图谱的方法的结果。变异的存在是微生物对药物例如利福平抗性的指征。更特别地，图6A描述了正常(例如非抗性株核酸)和抗性株的杂交产物，不管是通过PCR扩增或其它的模板富集方法。在混合物中包括了正常模板(例如对照靶核酸)与样品靶核酸以产生杂交的核酸之间的不完配配对。图6B显示两个熔解曲线之间具有稍微区别的熔解曲线，所述区别为对照靶核酸和具有样品靶核酸的混合物的熔解图谱的区别。图6C显示了对照和样品之间的熔解曲线的变异。正常对照靶核酸图谱作为实线样品作图，其与对药物敏感的“正常”微生物核酸没有区别。虚线显示在“正常”和错配样品间有变异的区别，这指示微生物为抗性株。

图7是代表+／-对照核酸，来自抗性株的核酸和来自对药物敏感的株的核酸之间的高解析度溶解曲线分析的图。该图使用自动化曲线变异判定软件(Idaho Technology，LightScanner)，其显示出从敏感样品中区分抗性样品的能力。被软件判定为与阴性对照一样的任何样品为对药物敏感的，判定为与阴性对照不同的任何样品被归类为对药物抗性的。分析包可在任何需要的排列中设置。或者，可以使用任何以图形代表曲线形状之间变异特别是曲线上方区域变异的方法来区分“正常”序列和潜在含有错配的测试序列。此外，可以直接从熔解曲线观测差别而不作进一步分析。

在一些实施方式中，高解析度熔解曲线分析可用于任何遗传测试来检测样品核酸和正常对照核酸之间的变异或相似性。

在一些实施方式中，扩增和／或变性可通过使用各种改变的探针而不是正常序列的探针而用于筛选正常样品。

在一些实施方式中，扩增和／或变性可通过使用正确设计的改变的探针而用于筛选突变的、非正常的靶核酸。

在一些实施方式中，扩增和／变性可用于检测样品间的共性，例如辩论鉴定测试(forensic identification testing)。

在一些实施方式中，扩增和／变性可用于不同样品的流行病学调查。

在一些实施方式中，用于扩增的探针可以是DNA或RNA(例如天然的或合成的或来自扩增来源的)。

在一些实施方式中，扩增和／变性可用于确定野生型序列的存在。

在一些实施方式中，扩增和／变性可用于确定野生型序列的存在从而进一步证明测试样品来自于对那个区域所代表的药物敏感的生物。

在一些实施方式中，扩增可用实时或传统PCR方法进行。同样，可以使用产生足够数量的正常对照和酸和／或靶区域遗传材料以允许使使用合适的检测能力的装置检测的任何扩增方法。

在一些实施方式中，变性或熔解曲线分析检测系统可以是任何高解析度熔解装置或能够产生足够高解析度并具有基本的样品加热和检测能力的合适的适应性装置。

在一些实施方式中，正常核酸和样品核酸可在同一个管中通过PCR扩增。或者，正常和样品核酸可在分开的管中扩增然后在进行高解析度熔解曲线分析之前将其混合。

在一些实施方式中，对照核酸可从贮存溶液中取出，然后与扩增的样品核酸以合适的比率混合以产生相似的结果。

在一些实施方式中，可使用众多的化学方法将用作对照的正常核酸和与样品核酸的混合物区别开，以产生内部对照。这可以包括使用不同的化学方法，例如使用荧光标记的正常对照核酸。如此，只有形成于标记的对照核酸的双链能够产生荧光熔解信号，其对正常对照模板是特异性的。

在一些实施方式中，可以在样品和对照在不同的运行中被扩增和／或变性后(这可以在不同的日期进行)比较样品核酸和对照核酸。

在一些实施方式中，高解析度熔解曲线分析可以在任何能够变性和／或退火核酸并能够检测相对于变性核酸的杂交核酸的数量的装置进行。

在一些实施方式中，足够的设备敏感性允许按照本文描述分析样品而不需要扩增样品核酸。即，设备具有足够的敏感性从而样品核酸是可以检测的而不需要扩增。

在一些实施方式中，样品核酸的分析以高解析度退火进行，当核酸退火时其监测核酸。一部分原因是样品和对照的靶核酸的退火可用作鉴定对照模板和测试样品的工具，而不是只使用熔解曲线分析或变性。

在一些实施方式中，本发明可以研究来自微生物或其它生物样品的DNA和／或RNA的遗传变异。核酸可以是完整的、片段化的或整个生物核酸的部分或核酸的靶区域。引物可从待分析的靶核酸的部分的区域或临近靶核酸的部分选择。引物可以是非荧光的、荧光的，或能够产生静电或电化学信号的。

扩增组合物可包含以下的物质：聚合酶链反应成分，包括逆转录酶，和／或DNA聚合酶；合适的缓冲液、盐和脱氧核苷酸和／或三磷酸脱氧核糖核苷酸，以扩增靶序列；双链DNA荧光结合染料，荧光探针，荧光共振能量转移探针，或能用于检测退火的vs变性的RNA或DNA/RNA同质双链和／或异质双链的形成的其它类似探针；设计为特异性扩增样品核酸和正常对照核酸的靶区域的寡核苷酸引物，其中引物可以是磷酸二酯寡核苷酸、LNA寡核苷酸、PNA寡核苷酸或这些的任何组合。

可用于分析样品核酸的设备可以是任何能够检测DNA／DNA、RNA／RNA或DNA／RNA双链形成和解离的设备，在其它实施方式中，是能够检测DNA／蛋白或RNA／蛋白双链或DNA同质三链／同质四链形成和解离的设备。当靶核酸退火时这样的设备应该能够产生强烈的荧光信号并且当靶核酸变性时监测荧光的变化。设备数据可存储于计算机系统，该计算机系统具有配置用于进行数据分析的软件。同样，设备可配置为进行核酸扩增和杂交／变性。但是，可能在几个不同的设备中进行这些功能而不破坏结果。替代的配置为能够通过紫外光、电化学信号产生、溶液粘性或其它仍未开发出来的技术监测靶序列的退火和变性状态的设备。

从分析扩增和杂交／变性获得的数据可以使用任何配置为确定数据之间变异的软件包进行分析。例如，可从Idaho Technology或Corbett Research获得的和即将可以从Roche Applied Science获得的软件包，其被设计为比较来自那些样品(其中正常目标被杂交)的正常目标的熔解图谱，可被用于鉴定没有改变、微小或大的变异。软件输出的精确的格式是不重要的；但是，软件必须能够简单地鉴定与正常相比具有相对于正常熔解曲线图谱变异的那些样品。

以下用于实施本发明的特定方面的示例性方面只是作为示例性目的提供，不是为了以任何方式限定本发明的范围。

示例性方面

实施例1-结核分支杆菌的药物敏感性区域的扩增和分析

A.结核分支杆菌基因组DNA的全基因组扩增

如果样品DNA数量不足以从药物敏感性区域获得扩增的产物，则可以在扩增特定区域或扩增子之前使用全基因组富集来扩增样品DNA。MycoBuffer样品中的全基因组富集与同样起始拷贝数量但仅悬浮于水的模板DNA平行进行。为了监测结核分支杆菌总的全基因组富集，选择分支杆菌基因组的三个不同的靶区域以评价每个的富集。使用实时PCR检验方法以筛选这些不同靶区域中每个的富集，与未富集的对照样品相比较。X轴上样品线开始上扬的点是样品中起始遗传材料数量的指征，X轴上信号开始变化得越早，起始材料的数量越高。

图5A显示从结核分支杆菌CFP32靶区域获得的结果，其比较了水或MycoBuffer中的与样品混合的22个碱基的随机引物。该图表明MycoBuffer富集的样品上扬较早并指征较高数量的起始材料。

图5B显示从结核分支杆菌IS6110靶区域获得的结果，其比较了水或MycoBuffer中的与样品混合的22个碱基的随机引物。该图再次表明MycoBuffer富集的样品上扬较早并指征较高数量的起始材料。

图5C显示从结核分支杆菌btMTb靶区域获得的结果，其比较了水或MycoBuffer中的与样品混合的22个碱基的随机引物。该图再一次表明MycoBuffer富集的样品上扬较早并指征较高数量的起始材料。

B.样品制备

使用Petroff的痰液样品除菌方法，从人类细胞材料中分离MTb。简单来说，Petroff方法如下：Petroff方法，使用等体积的4％氢氧化钠在摇杯中将痰液匀质15分钟。在Megafuge1.0(Heraeus)以3，000rpm离心15分钟后，以约20ml的无菌蒸馏水将沉淀中和。再次离心样品。将“沉淀”或沉淀的材料转移至微离心管并按照生产商的指示以MycoBuffer(RAOGene，Inc，Milford，PA)裂解。来自此裂解程序的上清液材料含有分支杆菌DNA，将其转移至新的微离心管。

C.样品中结核分枝杆菌DNA的存在的初步筛选

使用荧光MTb筛选(HTPCR方法)通过将以下成分在20μL反应中混合来进行样品中分支杆菌DNA的非定量筛选，产物可通过实时PCR以探针检测，或通过电化学检测或通过凝胶电泳检测，或其它任何合适的方法检测。这里，我们描述以实时PCR检测产物的形成：

混合：

10x FI15缓冲液：(500mM Tris-HCl(pH8.0)；5mg／mL牛血清白蛋白(非乙酰化)；10mM MgCl₂，40％二甲基亚砜)，以1x的终浓度使用。

10x三磷酸脱氧核苷酸，(各2mM)，以1x使用。

10x LC Green I(Idaho Technology，Inc.)，以0.5x使用。

热稳定性DNA聚合酶(Tfi(核酸外切酶-)(Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)，以2.5U／反应使用。

设计为具有与编码PPE家族蛋白的基因重叠的温度的寡核苷酸引物。扩增产物的引物：

FI15-MTb正向：CCGGAAACGTCGGCATCGCAAACTC(SEQ ID NO.205)

FI15-MTb反向：TGCCCGTGTTGTAGAAGCCCGTGTTGAA(SEQ ID NO.206)

PPE家族基因

向反应加入Mycobuffer／DNA样品，

根据以下程序扩增：

95℃变性：1分钟

75℃激活：10分钟

90个以下循环：

85℃，30秒

75℃，30秒，探测荧光

1个熔解循环：

95℃，10秒

60℃，10秒。

升温至90℃与升温一起进行荧光的探测以产生产物的熔解曲线。

最终的产物可能证明可变的熔解图谱，如图8所示。那些扩增特异性产物的反应为测试样品中MTb DNA存在的指征。

D.替代的检测扩增产物的方法

实时PCR检测的替代：电化学检测

使用具有以下附加物的同样的基本引物：

FI15-MTb正向：

生物素-CCGGAAACGTCGGCATCGCAAACTC(SEQ ID NO.205)

FI15-MTb反向：

荧光素-TGCCCGTGTTGTAGAAGCCCGTGTTGAA(SEQ ID NO.206)。

按照上述进行扩增。除去样品并按照生产商(Anzenbio)的指示进行电化学检测。简单来说，置于电化学检测器芯片(Anzenbio)中，温育20分钟。中性抗生物素芯片与正向引物(或反向引物，取决于最终的设计)中的生物素结合，以1x磷酸盐缓冲液+1％Tween20(PBST)洗涤芯片3分钟。加入与辣根过氧化物酶偶联的抗荧光素抗体，温育20分钟。以1XPBST洗涤板2次，加入TMB(电化学检测缓冲液)并温育1分钟。以PSD-8检测器测定信号的形成。超过5个信号被记录为阳性，小于5的信号被记录为阴性。应该包括阴性样品对照和阳性样品对照以确认这些结果。

作为替代的检测，产物可通过凝胶电泳显示，除了那些在阴性对照样品中见到的任何产物形成应该被认为是怀疑MTb阳性。

替代的检测，使用毛细凝胶电泳。与凝胶电泳相同。

替代的检测，HPLC、质谱、光谱、荧光计等。检测样品中扩增的PCR产物的存在可使用任何可获得的技术实现，优选是那些可以按照大小而不仅仅是数量将扩增产物分辨出来的技术。扩增产物的存在，特别是在预期大小范围内的扩增产物的存在，是测试样品中结核分枝杆菌(MTb)的存在的指征。

E.通过全基因组扩增的分子富集

分子富集程序

虽然至今测试的多数样品具有足够的DNA用于直接扩增靶药物敏感区域，但是一些MTb DNA的样品将含有非常小数量的用于MTb药物抗性筛选的DNA。为了克服这个问题，应用了使用改良的全基因组扩增程序的基本技术来富集样品。主要地，样品进行下列程序：

向随机寡核苷酸引物中加入MycoBuffer中的DNA溶液。将溶液变性并冷却至室温(使寡核苷酸遍及MTb的基因组进行随机结合)。然后将溶液与全基因组扩增混合物混合并温育8小时以产生全基因组的富集，平均来说基因组相对于原始样品被富集100倍。

DNA温育溶液为：

1-5μL的DNA

1x的Thermopol缓冲液(New England Biolabs)

100μM随机22聚体引物(终浓度)

总体积为15μL。

在96℃变性2分钟

冷却至室温10分钟

置于冰上

加入35μL的分子富集混合物(全基因组扩增混合物)

成分的终浓度为：

400μM dNTP

1x Thermopol缓冲液

0.35U／μL的BST热稳定性聚合酶(嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophillus))大片段(核酸外切酶)

4％二甲基亚砜

T4基因32蛋白(30ng／μl)

在50℃温育8小时

在80℃温育15分钟

置于4℃直至使用为止。

然后通过改进的过滤结合检验来纯化样品。简单来说，该方法可应用于DNA从溶液中分离的过程中的任何阶段，该方法是一种缓冲和初步交换DNA的快速方法(a quickmethod to buffer and primer exchange the DNA)。我们发现，需要或优选在纯化的较早阶段作用良好的MycoBuffer溶液+结合混合物(Binding Mix)的直接结合。

MycoBuffer中的样品DNA以1∶1与结合混合物(4M盐酸胍，12.5mM Tris-HCl，pH6.8，0.5％NP40去污剂，50％乙醇)。

将样品加入Whatman GF／F1.0μm玻璃纤维过滤器96孔长芯片过滤板，在室温温育2分钟。将过滤板叠于96x2mL废液收集板。

将样品离心(1800rpm，10分钟)或真空过滤(缓慢地)，从离心机或真空系统除去板。

加入200μL洗涤缓冲液I(1.6M盐酸胍，10mM Tris-HCl，pH6.8，0.1％NP40去污剂，70％乙醇)并离心或真空过滤。从离心机或真空系统除去板。

加入400μL洗涤缓冲液II(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH7.5，60％乙醇)并离心或真空过滤。然后以200μL洗涤缓冲液II再洗涤一次。

将收集箱倒空，将整个系统进行真空干燥或空气干燥，在室温持续2个小时或在56℃持续20分钟。

将新的收集板叠于过滤板，向过滤器中加入100μL洗脱缓冲液(不含DNase、RNase的无菌水)。在室温温育样品2分钟，然后离心或真空过滤。

这整个系统是使用这些96孔过滤板的现有方法的改进。

样品DNA存在于洗脱液中。或者，扩增的基因组产物可直接用于进一步的扩增程序而不进行进一步纯化，如果基因组反应物和随机引物不与接下来的特异性扩增相互作用。

该材料用于下游过程。

然后以QPCR评价样品DNA以确定样品中DNA存在的量。这有三个目的：一是为了对样品中MTb的存在进行二级筛选；二是为了确认分子富集；三是为了建立样品中DNA存在量的总体定量。以前开发的该方法被证明在富集样品DNA中具有不超过3倍变化的富集恒定性。我们的方法使用三个基因以确认富集。一个基因结果用作另外的下游过程。

F.含有结核分枝杆菌DNA的样品的实时扩增

将每个样品进行富集样品DNA的实时PCR定量。使用产生荧光的探针系统(5’核酸酶检验，TaqMan)作为信号产生部分。

反应成分如下：

反应混合物：

10x PCR缓冲液(500mM Tris-HCl，pH8.5，5mg／ml BSA(非乙酰化)，40mM MgCl₂，)

10x dNTP，各2mM(，也可以使用4mM dUTP用于清楚污染物的目的)

酶(热稳定性DNA聚合酶)Tfi核酸外切酶+(invitrogen，Carlsbad，CA)

加入寡核苷酸引物(每个样品三个不同的可能的反应)，以0.5μM的终浓度使用引物，以0.2μM的终浓度使用产生荧光的探针。

Pan结核杆菌检验：MTb27.3(保守蛋白)：

CFP32正向：TCGTTCATCACCGATCC(SEQ ID NO.207)

CFP32反向：GTGAGCAGTTCGTTCCA(SEQ ID NO.208)

CFP32TM：荧光素-TCAACGAGACGGGCACGCT-BHQ1(SEQ ID NO.209)

IS6110转座酶：

IS6110正向；TGCGAGCGTAGGCGTC(SEQ ID NO.210)

IS6110反向：GTCCAGCGCCGCTTC(SEQ ID NO.211)

IS6110TM；荧光素-CTGCTACCCACAGCCGGTTAGGT-BHQ1(SEQ ID NO.212)

PPE家族蛋白基因：

BTTb正向：GCCAGCATTGAGGAT(SEQ ID NO.213)

BTTb反向：CAATTCGGGCACCAATAA(SEQ ID NO.214)

BTTb TM；荧光素-TGCGATGCCGACGTTTCCG-BHQ1(SEQ ID NO.215)

IS6110对于定量而言是不可靠的靶标，因为其在MTb基因组中以大于1／基因组而存在。

BTTb和cfp32基因在检验中用于建立富集，二者在循环34的交叉值均具有类似的信号，而未富集的样品对于BTTb来说是“平的”或比富集样品(cfp32)迟100倍(>6个循环)。

每个反应含有加入到最终反应混合物中的1-5μL的纯化的或制备的DNA溶液。必须在反应设定时记录体积信息，因为精确的体积将成为下游过程的数字除数。为了后续混合步骤而确定样品中MTb DNA的相对数量是重要的。

MTb DNA样品和对照的扩增和熔解分析

然后以药物敏感性标记检验来分析富集的样品DNA。该检验基于以下信息：以Watson／Crick碱基配对规则完美匹配的杂交的DNA将产生熔解DNA的特征熔解曲线。当相同的序列与相似的含有沿着长度的1个或多个“错配”的碱基DNA序列杂交时，不再产生特征熔解曲线，而是产生指征错配的DNA链的熔解特性的新的曲线。为了产生错配序列，仅仅使用问题样品的扩增DNA是不够的，还需要包括含有“未修改”DNA的DNA序列的DNA样品。如此，当两个以接近等比例在扩增反应前、反应中或反应末尾混合时，且它们杂交在一起时，相当百分率的杂交模板是“错配”杂交。以致于可以产生指征样品序列中“突变”的百分率的熔解曲线。如果这些被扩增的样品序列被设计为环绕基因的核酸序列(所述基因是其自身或其基因产物是微生物药物的靶点)，那么任何与样品异常的熔解行为将使使用特定药物治疗微生物感染被怀疑，因为生物的DNA将指征，至少暗示该药物将是无效的。这可被潜在用于癌症化疗、病毒药物抗性和抗微生物药物。

进行这个筛选的过程如下所述。使用样品的分子富集之后的来自三个二级筛选MTb的结果，来自Cfp32样品的结果用于计算样品中存在的DNA数量。或者，任何MTb扩增子可用于确定相对于对照DNA来说MTb样品中的DNA的数量，只要扩增子在二者中均存在。此外，可分别检测对照和未知的扩增子以确定对照和测试样品中的相对DNA浓度。我们只使用一个的目的是为了计算的方便。

从Roche LightCycler480设备或实际上从任何实时PCR仪器而来的计算的交叉阙值用于计算加入至筛选反应的“野生型”RPOB(利福平)药物靶点的浓度。对照贮存溶液(主贮存液1∶1，000,000稀释)每4个循环稀释10倍，循环18之后样品交叉基线，在以上例子中CT值为32，即14个循环或5000x稀释(10^3.69)。这可以容易地为使用者做成图表或作为简单的软件，以计算在扩增和／或熔解前待混合的体积。

将样品DNA和等量的PROB“正常、野生型、未突变、非抗性DNA”加入反应中。反应由以下成分组成：

10x PCR缓冲液(500mM Tris-HCl，pH8.5，5mg／ml BSA，30mM MgCl₂，)

10x dNTP混合物(无dUTP)

寡核苷酸，每个0.5μM(最终)

LCGreen+或LCGreen染料(Idaho Technology，Inc)

酶(Tfi(核酸外切酶+))或其它具有校对活性的热稳定聚合酶

分支杆菌RpoB基因，利福平(抗生素)的靶点：

RPOB正向：CAAGGAGTTCTTCGGCACC(SEQ ID NO.13)

RPOB反向：GGACCTCCAGCCCGGCA(SEQ ID NO.14)。

仅有RPOB样品以及1、2或更多“抗性”对照的对照反应可以而且应该在不同的反应中同时进行。我们有两个对照反应，其中我们将等比例的RPOB正常对照和以下的一个混合：1.靶区域中的一个单独点突变，或2.靶区域中的3个碱基的删除。这三个样品确保检验按照预期进行，应包括每个药物靶点的对照并且将实质上具有相似的特点。

按照以下方案在LightCycler480设备上扩增样品：

95℃，10分钟

40个以下循环：

95℃，10秒

57℃，10秒

72℃，40秒

1个熔解循环：

95℃，10秒

50℃，10秒

70℃，30秒

95℃，0秒，荧光探测设定为25-35个探测／摄氏度(高解析度熔解)。然后可使用即将上市的用于LC480设备的高解析度熔解曲线模块分析数据，或使用来自IdahoTechnology，Inc.的LightScanner软件分析数据。两个软件包均允许设定基线样品(阳性对照样品，作为标准)。此外，任何可以在熔解过程中特定温度时测定双链DNA(dsDNA)的设备均可用于产生熔解曲线。缺省的曲线设定通常是足够的，虽然有时必须调整设定以保证对照样品被精确读取。如果对照样品被精确读取，则反应结果可认为是可以接受的且可以进行诊断性读取。因此，对照野生型熔解曲线和来自未知样品的熔解曲线之间的差别可指征点突变或样品间多样性。在这种情况下，对MTb的rpoB区域而言，熔解曲线间的差别是测试样品中利福平抗性DNA的指征，因此可用于诊断样品中利福平抗性MTb的存在。以相似的方式，该技术可用于分析任何存在与表型变化相关的已知突变的DNA区域，特别可用于评价药物抗性或敏感性。

实施例2：人类MTb样品中药物抗性或敏感性的确定

这些实验的目的是证明以前测试并确定含有MTb的临床样品可以被迅速测定其药物抗性或敏感性。探测按照Petroff方法制备的来自MTb病人的不知情的临床样品并重悬于MGIT缓冲液(Becton Dickinson)。使用如表2和3所示的引物对、扩增子和熔解温度测定样品的利福平和链霉素抗性。

MTb测试方案：

使用cfp32Taqman检验运行样品相对于H37RV标准样品以定量样品。

主混合物：1x Kappa，不含Sybr缓冲液(Kappa Biosystems SYBRG1主混合物，不含SYBR)，1μl cfp32寡核苷酸(oligo)，1.75mM MgCl，以水定容至9μl

将每个样品18μl主混合物加至384孔板

加入2μl样品

将板加盖并旋转

在LC480中按照cfp32运行方案运行

在95℃变性10分钟

扩增：95℃，10秒；59℃，40秒(50个循环)

从cfp32检验使用方程C=S*E^N确定样品需要的稀释系数

其中C=10000000，E=标准曲线系数，N=Cp值

在Myco缓冲液中将样品稀释至最低浓度样品

在80bp rpob检验中运行稀释的样品以确定抗性。

主混合物：1x Kappa，不含Sybr，0.5μl80bp Oligo，1x Eva绿染料，以水定容至9μl

将每个样品9μl主混合物加至384孔板

向孔中加入0.5μl H37RV+0.5μl样品

将板加盖并旋转

在LC480中按照rpob运行方案运行

在95℃变性10分钟

扩增：95℃，10秒；

57℃，10秒

72℃，40秒，单次探测

运行样品直至所有的样品达到平台期2或3个循环(约30个循环)

结束扩增程序，所有的样品进行熔解程序。

从LC480除去板并从顶部离心收集任何浓缩物。

熔解程序升温至95℃持续1秒

50℃持续1秒

70℃持续30秒，开始持续收集熔解数据，30个探测／摄氏度

在95℃结束数据收集

在HR-1设备熔解样品

从384孔板中移出样品，移至20μL毛细管

在离心机中短暂旋转标记的毛细管以收集底部的样品

使用HR-1设备对照软件，使用FI LAB MTb Opt熔解程序分别熔解样品

升温速率0.07

在80℃开始探测，目标荧光90％

在96℃结束探测

冷却至40℃

注意：在数据收集前运行两个样品以使设备正确的预热

数据分析

打开HR-1熔解分析工具软件

打开含有数据文件的文件夹并点击“选择目前路径”

选择样品以分析并点击“继续”

在“分析”下选择校正

在熔解开始前调整左侧两个指针至大约1度

在熔解结束后调整左侧两个指针至大约1度

点击OK

在“分析”下选择温度迁移

在样品下选择野生型样品以标准化

调整指针以扩大熔解区域

选择OK

在“分析”下选择不同的图

选择野生型样品以标准化

移动指针以选择目标区域

点击OK

在曲线差异图上高于或低于1.5至2的荧光水平显示峰值的样品被认为是抗性的。

图10显示这个程序的曲线差异图形式的结果，其中使用表2的引物进行扩增和表3的对应的扩增子用于退火和熔解分析。图10A显示4个样品以及对照(wt1)的利福平抗性或敏感性分析。图10B证明鉴定MTb样品中对链霉素抗性的能力。这些数据证明这项技术能够成功地将与药物敏感性相关的DNA区域和含有与药物抗性相关的多态性的区域区分开。以类似的方式，本文公开的方法和试剂可用于测定用于治疗MTb感染的所有一线抗生素的敏感性或抗性。

实施例3：对抗真菌试剂的抗性的确定

真菌和酵母感染引起人类中很大数量的疾病。临床上重要的真菌的一些简单的例子包括：

糠秕马拉色氏霉菌(Malassezia furfur)和韦内斯基外瓶柄霉(Exophialawerneckii)(表面的皮肤)

毛干结节菌(Piedraia hortae)和白吉尔氏毛孢子菌(Trichosporon beigelii)(毛发)

小孢子菌种(Microspomm species)(皮肤和毛发)

表皮癣菌种(Epidermophyton species)(皮肤和指甲)

发癣菌种(Trichophyton species)(皮肤、毛发和指甲)

申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、分子孢子菌种(Cladosporiumspecies)、瓶霉菌种(Phialophora species)和产色芽生菌种(Fonsecaea species)(皮下／淋巴组织-着色芽生菌病)

荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、指状球孢子菌(Coccidioidesimmitis)、镰刀霉菌种(Fusarium species)、青霉菌种(Penicillium species)(系统性呼吸)

皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)(皮下／呼吸)

新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)(呼吸／CNS)

曲霉菌种(Aspergillus species)、毛霉菌种(Mucor species)、假丝酵母种(Candida species)和根霉种(Rhizopus species)(有机会参与身体各个部位)。

此外，真菌经常引起常见的感染例如酵母感染、股癣、运动员足和其它皮肤问题。对抗真菌试剂的抗性将使得治疗无效，所以鉴定合适的药物是有用的。

为了确定对特比萘芬的抗性图谱，使用常见的用于酵母和念珠菌的抗真菌试剂和表2的引物使用实施例2中的方法来扩增表3的对应扩增子。从野生型酿酒酵母中分离的DNA或者含有ERG1基因突变(该突变赋予特比萘芬抗性)的模板用作起始材料，熔解曲线差异分析的结果显示于图11。可容易地区分突变序列和野生型序列。因此，该方法可用于确定真菌感染以及其它病原性感染中的药物抗性或敏感性。

实施例4：人类癌症对化疗紫杉烷的抗性和敏感性图谱的确定

紫杉烷例如紫杉酚、紫杉醇、多西他塞(docetaxel)是有力的化疗试剂，其用于治疗各种癌症。它们的作用机理与埃坡霉素相同，通过结合并稳定细胞中的微管蛋白而作用。这些药物在微管蛋白上的结合位点已经被描述(Rao，S.，Orr，G.A.，Chaudhary，A.G.，Kingston，D.G.，and Horwitz，S.B.(1995)J.Biol.Chem270：20235-20238)，此区域或β微管蛋白的突变可引起对紫杉烷的抗性(表3)。通过标准方法纯化模板DNA并进行实施例2中所述的方法，使用表2引物以扩增表3中的对应区域。使用此方法，从两个独立反应中容易地将带有引起紫杉烷抗性的突变(B-tub R282Q和B-tub T247I)的两个扩增子与野生型DNA(wt1和wt2；图12)区分开来。因此，该方法可用于诊断对化疗试剂的敏感性或抗性以使医生有机会更好地理解癌症的本性以及何种治疗可能是有效的或无效的。

实施例5：

疟疾是由被称为疟原虫的寄生虫引起的传染性疾病。鉴定出四种此种引起人类疟疾的寄生虫，即间日疟原虫(Plasmodium vivax)、镰状疟原虫(P.falciparum)、卵形疟原虫(P.ovale)和三日疟原虫(P. malariae)。每年有3,00,000,000至5,00,000,000人感染。最常见的治疗是氯喹，但是已经出现对氯喹的抗性。现在，世界卫生组织(WHO)使用的检测氯喹抗性突变的方法需要28天。

将实施例2中描述的方法类似地用于确定其分辨氯喹抗性和氯喹敏感性DNA的能力。使用表2中所示的引物扩增表3中所示的扩增子。图13显示此检验的结果，其证明该方法能够相对于正常氯喹敏感区域容易地鉴定出此区域中引起氯喹抗性的突变。因此，该方法可用于检测寄生虫感染的药物敏感性以允许更好的治疗。此外，该检验可在少于一天的时间内进行，其显著快于现在的方法

(http：／／WWW.malariasite.com／MALARIA／DrugResistance.htm)。

实施例6：感染HIV的个体中药物抗性的确定

齐多夫定(INN)或叠氮胸苷(AZT)(也称为ZDV)是抗逆转录病毒药，第一个批准用于治疗HIV。其作用机理为阻断HIV逆转录酶而防止病毒的遗传材料的复制。HIV逆转录酶区域的突变使病毒对这些一线药物具有抗性。

图14显示使用实施例2中的方法进行的2个独立运行以区分野生型和ZDV抗性DNA的熔解曲线差异图。使用表2所示的引物扩增表3所示的区域。此实施例清晰地证明该方法也可用于确定病毒病原体的药物抗性或敏感性。

实施例7：金黄色葡萄球菌感染中的甲氧西林抗性的确定

甲氧西林-抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)感染是由金黄色葡萄球菌引起的，金黄色葡萄球菌常称为“葡萄状球菌”(staph)。几十年前，在医院出现一株葡萄状球菌，其对通常用于治疗它的广谱抗生素呈抗性。被称为甲氧西林-抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)的该菌株是逃过所有的药物(除了最强烈的药物)的第一批微生物之一。MRSA感染可以是致命的。鉴于此，重要的是确定给定的葡萄状球菌感染是不是多药物抗性从而实施正确的治疗。通常，葡萄状球菌从组织或鼻分泌物中收集，但是也可从喉样品或创面分离。使用标准方法从临床样品中提取DNA。

图15证明该方法可区分多药物抗性葡萄状球菌感染和正常葡萄状球菌感染。使用表2所示的引物扩增表3所示的区域，使用实施例2中的方法，该方法可以区分葡萄状球菌DNA的野生型区域和具有引起多药物抗性的单一点突变的区域。

实施例8：通过动态波动扩增评价MTb感染

使用动态波动扩增检测怀疑感染MTb的生物样品中MTb DNA的存在。使用下列程序处理MTb感染为阳性或阴性的人类样品：

寡聚体为FI-15MTb引物(实施例1)

反应条件为：

1：10x FI-15缓冲液(50mM Tris-HCl，8.0；0.25mg／ml天然(非乙酰化BSA)；2mMMgCl₂；4％DMSO；2mM每种dNTP)

2：酶基因-选择(Gene-Choice)HS-Taq聚合酶，虽然其它热稳定性DNA聚合酶也可接受

3：引物，最终0.5μM

4：热循环：90-10秒

74、76、78或80℃-10sec(50+循环)(目前在<1.25小时内进行)

图16显示此反应在不同的热循环温度的结果。在PCR中进行该实验以模拟实验室中的加热器的条件，即当设定为80℃时显示+／-5℃的温度循环。含有下列的每对孔在单一温度进行：使用MTb DNA为阳性的模板的第一个反应，和类似制备的MTb DNA阴性的模板的第二个反应。在所有的温度循环条件，只在所测的MTb阳性样品中出现了预期的150bp扩增产物，在对照样品中无扩增。因此，可使用实地(field)DNA扩增测试来确定人类样品中的MTb感染，仅使用标准的样品收集和制备程序、加热器以扩增特异性产物、以及检测所述产物的手段。这具有允许实地诊断MTb感染而无需将样品送到指定测试中心的潜在可能。此外，其可以迅速给出结果，只需要稍微超过1小时的热循环时间以扩增产物。

实施例9：动态波动扩增以鉴定测试样品中鼠伤寒沙门氏菌的存在

本实施例的目的是证明动态波动扩增可用于扩增来自生物样品的特定区域。因此，这样的反应可在加热器或任何维持温度的装置中进行，而不使用昂贵的PCR仪。如果对温度的维持不是高度精确的且通过加热和关闭状态之间的循环来维持温度，则在温度间具有自然的波动。对于加热器、加热烘箱甚至是冰箱或冷冻箱(虽然是制冷而不是加热)均是这样。

通过标准方法从生物样品分离鼠伤寒沙门氏菌DNA。制备样品或对照DNA(无模板或大肠杆菌模板)混合物并进行如下的条件：

正向引物：caccacgctcaccgatgatgccctgctttg Tm77℃

反向引物：actgggagccattaaccgcatcggtgctg Tm75℃

模板：

actgggagccattaaccgcatcggtgctgtccgcggccagggtgcctgccgccagattggtgattttgctggcgcttccgttacggctggcgctgaatgtgccagaggctgcatcccaaagcagggcatcatcggtgagcgtggtg

Tm=92℃

反应试剂：

10x缓冲液(与以前相同)

dNTP(每种2mM)

3mM MgCl

引物，每种0.5μM

染料：LC Green(Idaho Technology，Inc Salt Lake City，UT)

酶：Tfi(核酸外切酶-)Invitrogen

热循环条件：最初保持79℃15分钟(等同于使用加热器设定为77-78摄氏度)；90个循环：79℃1分钟；76℃1分钟。图17显示在循环62和更高的循环可检测到扩增的特异性产物。只在含有鼠伤寒沙门氏菌DNA的反应中见到扩增，在不含DNA或大肠杆菌DNA的样品中看不到扩增(未显示)。因此，此技术可用于鉴定生物样品中鼠伤寒沙门氏菌的存在，如果样品是非细菌来源的，例如人类痰液样品或拭喉片，则指征细菌感染的存在。有利地，以上方法可扩增DNA而不使用热循环器。可通过任何传统方法检测扩增产物，包括但不限于凝胶分析或电泳、UV检测、荧光检测、金检测、ELISA中捕获杂交物或体外快速诊断检验、通过侧流捕获扩增产物等。在一些实施方式中，可以标记引物，特别是在5’末端或内部标记，以允许检测特异性扩增产物。

参考文献

以下各美国专利和授权前公开均以参考方式引入本文：4,683,195；4,965,188；6,214,587；6,692,918；5,219,727；5,476,774；5,314,809；6,040,166；6,197,563；6,001,611；6,617,137；7,074,600；6,977,148；6,740,745；6,033,881；7,160,998；7,081,226；20070054311；20050233363；20050181394；20040248105；和20070020672。

本说明书所引用的所有出版物和专利申请均为了各种目的以参考方式全文引入，就像每个单独的出版物或专利申请均具体地和单独地指明为了各种目的以参考方式引入本文一样。

虽然已经为了清晰理解的目的通过示例和例子对前述发明做了一些细节性描述，但是在本发明的教导下可进行一些变化和改进而不脱离本质或随附的权利要求的范围，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。

Claims (20)

1.一种核酸序列扩增的动态波动方法，该方法包括：

a.将一对正向和反向寡核苷酸引物与待扩增的靶核酸序列结合；和

b.通过使所述正向和反向寡核苷酸引物对和靶核酸序列在15℃的温度范围以内热循环来扩增所述靶核酸序列，所述温度范围通过所述寡核苷酸引物对的退火曲线(TA)和靶核酸序列的变性曲线(TD)的重叠内所包括的面积限定；

其中所述各正向和反向寡核苷酸引物的熔解温度(Tm)在靶核酸序列的熔解温度的15℃以内，且其中热循环包括：

i.使靶核酸序列变性；和

ii.所述正向和反向寡核苷酸引物退火；和

iii.通过所述正向和反向寡核苷酸引物使靶核酸序列延伸。

2.权利要求1的动态波动方法，其中通过使所述正向和反向寡核苷酸引物对和靶核酸序列在10℃的温度范围内进行热循环来扩增靶核酸序列。

3.权利要求1的动态波动方法，其中通过使所述正向和反向寡核苷酸引物对和靶核酸序列在5℃的温度范围内进行热循环来扩增靶核酸序列。

4.权利要求1的动态波动方法，通过使所述正向和反向寡核苷酸引物对和靶核酸序列在2.5℃的温度范围内进行热循环来扩增靶核酸序列。

5.权利要求1的动态波动方法，其中所述正向和反向寡核苷酸引物的每一个以大约等摩尔浓度存在。

6.一种核酸序列扩增的实时动态波动方法，该方法包括：

a.将一对正向和反向寡核苷酸引物与待扩增的靶核酸序列结合；和

b.通过使所述正向和反向寡核苷酸引物对和靶核酸序列在15℃的温度范围以内热循环来扩增靶核酸序列，所述温度范围通过所述寡核苷酸引物对的退火曲线(TA)和靶核酸序列的变性曲线(TD)的重叠内所包括的面积限定；

其中所述各正向和反向寡核苷酸引物的熔解温度(Tm)在靶核酸序列的熔解温度的15℃以内，且其中热循环包括：

i.使所述靶核酸序列变性；和

ii.所述正向和反向寡核苷酸引物退火；和

iii.通过所述正向和反向寡核苷酸引物使靶核酸序列延伸，

c.在所述扩增步骤中同时检测所扩增的靶核酸序列。

7.权利要求6的核酸序列扩增的实时动态波动方法，其中所述检测通过监测荧光进行。

8.权利要求6的核酸序列扩增的实时动态波动方法，其中所述检测通过监测插入双链DNA的荧光染料的荧光进行。

9.权利要求6的核酸序列扩增的实时动态波动方法，其中所述检测通过监测用荧光报道基因标记的序列特异性寡核苷酸探针的荧光进行。

10.权利要求6的核酸序列扩增的实时动态波动方法，其中通过使所述正向和反向寡核苷酸引物对和靶核酸序列在10℃的温度范围内进行热循环来扩增靶核酸序列。

11.权利要求6的核酸序列扩增的实时动态波动方法，其中通过使所述正向和反向寡核苷酸引物对和靶核酸序列在5℃的温度范围内进行热循环来扩增靶核酸序列。

12.权利要求6的核酸序列扩增的实时动态波动方法，其中通过使所述正向和反向寡核苷酸引物对和靶核酸序列在2.5℃的温度范围内进行热循环来扩增靶核酸序列。

13.权利要求6的核酸序列扩增的实时动态波动方法，其中通过使所述正向和反向寡核苷酸引物对和靶核酸序列在所述靶核酸序列的熔解温度附近的2.5-10℃的温度范围内进行热循环来扩增靶核酸序列。

14.权利要求6的核酸序列扩增的实时动态波动方法，其中所述寡核苷酸引物对之一与靶核酸序列的熔解温度范围差异比所述寡核苷酸引物对的第二个更大。

15.权利要求6的核酸序列扩增的实时动态波动方法，其中所述寡核苷酸引物之一的熔解温度与靶核酸序列的熔解温度相同。

16.权利要求6的核酸序列扩增的实时动态波动方法，其中所述寡核苷酸引物中至少一个的熔解温度在靶核酸序列的熔解温度的10℃以内。

17.权利要求6的核酸序列扩增的实时动态波动方法，其中所述寡核苷酸引物中至少一个的熔解温度在靶核酸序列的熔解温度的5℃以内。

18.权利要求6的核酸序列扩增的实时动态波动方法，其中所述寡核苷酸引物中至少一个的熔解温度在靶核酸序列的熔解温度的2.5℃以内。

19.权利要求6的核酸序列扩增的实时动态波动方法，其中所述寡核苷酸引物对的每一个以大约等摩尔浓度存在。

20.权利要求6的核酸序列扩增的实时动态波动方法，其进一步包括：

调节所述扩增反应的pH以增加相对于其它核酸选择性扩增所述靶核酸的特异性。