WO2019022132A1 - 変異遺伝子検出方法 - Google Patents

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WO2019022132A1
WO2019022132A1 PCT/JP2018/027878 JP2018027878W WO2019022132A1 WO 2019022132 A1 WO2019022132 A1 WO 2019022132A1 JP 2018027878 W JP2018027878 W JP 2018027878W WO 2019022132 A1 WO2019022132 A1 WO 2019022132A1
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primer set
primer
amplification
allele
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海老沼　宏幸
百合子 塚本
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積水メディカル株式会社
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention provides a method for sensitively detecting and quantifying a low frequency mutation gene (mutant allele) contained in a nucleic acid sample containing a wild type allele (wild type allele). About.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • point mutation single nucleotide mutation
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • TKIs tyrosine kinase inhibitors
  • a point mutation at codon 790 of exon 20 (T790M, 2369C-> T) is known as a resistance mutation of first and second generation TKIs such as gefitinib and afatinib.
  • the third generation TKI (Ocimertinib), which responds to the T790M mutation, has been clinically applied, but testing of the T790M mutation is required as an application condition for patients with TKI resistance and recurrence of lung cancer. There is.
  • collection of tissue samples by frequent Re biopsy and examination of the samples are required.
  • Non-patent document 1 As a method of detecting EGFR gene mutation, real-time PCR method (Non-patent document 1), ASP-PCR method using allele specific primer (Allele Specific Primer; ASP) and dissociation curve analysis by Q probe were combined
  • the MBP-QP method (Non-Patent Document 2) has been reported.
  • the sensitivity of detection by these methods is about 0.1 to 1%, which is sufficient for detection from tissue samples that have already been confirmed to contain cancer cells, but not for detection of low frequency mutations in patients with relapse. It seems to be enough.
  • the above-mentioned ASP-PCR method is a simple and relatively sensitive method for detecting gene mutations (especially point mutations) such as EGFR and RAS, but this method builds a highly sensitive mutation detection system. In order to achieve this, it is essential to improve the specificity of ASP.
  • ASP is designed such that any one of the 1 to 3 bases at the 3 'end corresponds to a mutant nucleotide of gene polymorphism such as single nucleotide polymorphism, and further, complementary to a target nucleic acid in a place other than the polymorphism site
  • mismatch the affinity is weakened as compared to the perfect match primer, which may result in a decrease in amplification efficiency.
  • ASP for detecting a single base mutation is effective to shorten the primer length.
  • ASP when performing amplification with ASP having a short primer length, it is necessary to lower the annealing temperature of PCR, but this may cause the occurrence of nonspecific amplification.
  • Such nonspecific amplification is particularly likely to occur when multiple mutations are simultaneously amplified using a plurality of primers in one reaction system (multiplex PCR).
  • Nested PCR is known as a method for reducing nonspecific amplification.
  • this method after performing a first amplification reaction with a first primer set sandwiching a target sequence, 1/20 to 1/50 of this first reaction solution is used as a template for a second amplification reaction.
  • This is a method of amplifying a target sequence with a second primer set designed inside the primer set. This method takes advantage of the fact that even if nonspecific products are amplified due to mispriming with the first primer set, it is unlikely that the same nonspecific region will be amplified with the second primer set. Thus, the region containing the target sequence can be efficiently increased.
  • the PCR reaction is performed twice, the operation is complicated and takes time.
  • reaction solution is used as a template for the second PCR reaction after the first PCR reaction, it is necessary to open the lid of the reaction solution containing a large amount of amplification products, and contamination of the amplification products to the measurement environment (mutual Contamination) is a concern.
  • the present invention relates to a mutant gene (mutant allele) which is contained at low frequency in a nucleic acid sample containing a wild-type allele (wild-type allele). It is an object of the present invention to provide a method of highly sensitively detecting and quantifying.
  • the present inventors attempted to carry out nested PCR in a homogeneous reaction system, and include a first primer set designed to flank the mutation site of a gene of interest and an ASP corresponding to the mutation.
  • One reaction system mixed with the second primer set contains a competitor nucleic acid that suppresses the amplification reaction from the wild-type allele of the gene, a specific primer concentration condition is selected, and optionally, the first and the second
  • a specific primer concentration condition is selected, and optionally, the first and the second
  • the present invention provides the following [1] to [8].
  • nucleic acid amplification reaction solution in which a primer set and a second primer set containing one or more allele specific primers selectively amplified from a nucleic acid containing the mutation coexist (a) In the presence of a competitor nucleic acid having the sequence of a wild-type allele of the gene under conditions where the nucleic acid amplification reaction by the second primer set does not occur, and hybridizing to all or part of the polymorphic site And a step of amplifying a nucleic acid containing a mutant allele by a nucleic acid amplification reaction with a first primer set to obtain an amplification product, (b) reducing the concentration of the primers of the first primer set relative to the concentration of the second primer set to obtain an amplification reaction in obtaining the amplification product of step (a), (c) A nucleic acid sample is selectively amplified by selectively amplifying a nucleic acid containing a mutant allele by a nucleic acid amplification reaction under the condition that at least
  • Methods for detecting contained gene mutations [2] The method according to [1] above, wherein the condition under which the nucleic acid amplification reaction by the second primer set does not occur is a temperature condition under which the allele specific primer does not anneal to the nucleic acid containing the mutation. [3] The method according to [1] or [2] above, wherein a primer which is not allele specific primers of the second primer set is designed in common with one of the primers of the first primer set. [4] In the first primer set, the concentration of the primer in the same direction as the allele-specific primer of the second primer set is 1/100 to 1/20 of the concentration of the other primer. The method according to any one of [3].
  • nucleic acid amplification reaction solution in which a primer set and a second primer set containing one or more allele specific primers that selectively amplify from a nucleic acid containing the mutation coexist
  • a primer set and a second primer set containing one or more allele specific primers that selectively amplify from a nucleic acid containing the mutation coexist
  • a step of amplifying a nucleic acid containing a mutant allele by a nucleic acid amplification reaction with a first primer set to obtain an amplification product in obtaining the amplification product of step (a), it was generated reflecting the DNA amount of the mutant allele contained in the nucleic acid sample before the nucleic acid amplification reaction by the first primer set reached the saturation phase
  • the mutation allele contained in the nucleic acid sample is quantified by selectively amplifying the nucleic acid containing the mutation allele by the nucleic acid
  • a mutation can be detected and quantified with high sensitivity even when wild-type alleles corresponding to a mutant gene (eg, T790M) are abundantly mixed in a sample. , It enables clinical application by risk judgment and monitoring of tolerance of the first and second generation TKI.
  • concentration of the forward primer for 1st PCR and carrying out PCR amplification is shown.
  • [A] The amplification curve at the time of carrying out PCR amplification from Mutant 0.05ng by ASP-PCR method is shown.
  • [D] shows an amplification curve of 30 cycles of the second PCR reaction when PCR amplification is carried out from 0.05 ng of Mutant using forward primers (0.025 ⁇ M) for the first PCR.
  • [E] An amplification curve of 55 cycles of the first PCR reaction when PCR amplification is carried out from 0.015 ng of Mutant using the forward primer (0.025 ⁇ M) for the first PCR.
  • [F] An amplification curve of 30 cycles of the second PCR reaction when PCR amplification is carried out from 0.015 ng of Mutant using the forward primer (0.025 ⁇ M) for the first PCR.
  • [F] The correlation between the RFU value and the T790M mutant allele ratio in the 30th cycle of the second PCR reaction of the above [E] is shown.
  • [G] shows an amplification curve of 32 cycles of the first PCR reaction.
  • [H] An amplification curve of 30 cycles of the second PCR reaction is shown after 32 cycles of the first PCR reaction of the above [G].
  • [I] shows the correlation between the RFU value and the T790M mutant allele ratio in the 30th cycle of the second PCR reaction of the above [H].
  • [J] The amplification curve of the first PCR reaction 25 cycles is shown.
  • [K] An amplification curve of 30 cycles of the second PCR reaction is shown after 25 cycles of the first PCR reaction of the above [J].
  • [L] shows the correlation between the RFU value and the T790M mutant allele ratio during 30 cycles of the second PCR reaction of [K] above.
  • [M] shows an amplification curve of the first PCR reaction 25 cycles.
  • [N] An amplification curve of 37 cycles of the second PCR reaction is shown after 25 cycles of the first PCR reaction of the above [M].
  • [O] The correlation between the RFU value and the T790M mutant allele ratio at the 37th cycle of the second PCR reaction of the above [N] is shown.
  • [P] shows an amplification curve of 15 cycles of the first PCR reaction.
  • [Q] An amplification curve of 47 cycles of the second PCR reaction is shown after 15 cycles of the first PCR reaction of the above [P].
  • [R] shows the correlation between the RFU value and the T790M mutant allele ratio in the 47th cycle of the second PCR reaction of the above [Q].
  • [A] The amplification product elution peak after the first PCR reaction 15 cycles and the second PCR reaction 47 cycles is shown.
  • [B] Shows the correlation between the elution product elution peak area of the above [A] and the T790M mutant allele ratio.
  • [C] The amplification product elution peak after 25 cycles of the first PCR reaction and 37 cycles of the second PCR reaction is shown.
  • [D] shows the correlation between the elution product elution peak area of the above [C] and the T790M mutant allele ratio.
  • [E] The amplification product elution peak after 32 cycles of the first PCR reaction and 30 cycles of the second PCR reaction is shown.
  • [F] The correlation between the elution product elution peak area of the above [E] and the T790M mutant allele ratio is shown.
  • [G] shows amplification product elution peaks after 35 cycles of the first PCR reaction and 27 cycles of the second PCR reaction.
  • [H] shows the correlation between the elution product elution peak area of the above [G] and the T790M mutant allele ratio.
  • a primer that is not allele specific primer (ASP) of the second primer set can also be designed in common with one primer of the first primer set (hereinafter, the commonly designed primers are Sometimes referred to as "common primer”. That is, the common primer plays a role in both the first primer set and the second primer set. In this case, the concentration of the common primer is preferably adjusted to the concentration of the second primer set.
  • ASP allele specific primer
  • the lowest Tm value of the first primer set is the highest Tm value of the second primer set in order to prevent the second primer set coexisting during the first PCR reaction. It is preferable to design so as to be 10 ° C. or more higher than low values, and to make the amplification reaction temperature difference 10 ° C. or more. In the present invention, in order to prevent the second primer set coexisting at the time of the first PCR reaction, it is preferable to adopt conditions under which the nucleic acid amplification reaction by the second primer set does not occur.
  • the concentration of each primer of the first primer set is preferably set to 1/100 to 1/20 of the concentration of ASP of the second primer set.
  • the concentration of each primer of the first primer set is preferably within 100 times, 20 times, or 10 times of the other, and the concentration of each primer of the second primer set is preferably one Preferably, it is within 100 times, 20 times, or 10 times of.
  • the concentration of the primers is 1/100 to 1/20 of the concentration of the common primers.
  • the concentration of the primer in the same direction as that of the second primer set in the first primer set is preferably 0.010 to 0.100 ⁇ M, 0.020 to 0.050 ⁇ M, or 0.025 to 0.040 ⁇ M.
  • the detection region including the mutation site of the mutant gene is selectively selected.
  • Any conditions for amplification can be adopted without particular limitation, but at least the second primer before the nucleic acid amplification reaction by the first primer set passes the exponential phase and reaches the saturation phase. It is preferable to perform the nucleic acid amplification reaction while changing the conditions under which the set acts (for example, lowering the amplification reaction temperature).
  • the number of cycles of the nucleic acid amplification reaction with the first primer set is 15 to 32, 16 to 31, 17 to 30, 18 to 29, 19 to 28, 20 to 27
  • a nucleic acid amplification reaction reaches a saturation phase means a situation corresponding to at least one of the following (1) or (2): (1) Nth time The amount of amplification product after the cycle nucleic acid amplification reaction is 1.3 times or less compared to the amount of amplification product after the N-1th cycle nucleic acid amplification reaction; (2) cycle of the nucleic acid amplification reaction When a point of inflection appears in a curve plotted with the number as the x-axis and the amount of amplification product after the nucleic acid amplification reaction in the relevant cycle as the y-axis (when the second derivative becomes positive).
  • the chain length of the first amplification product is preferably 250 bp or less and 50 bp or more.
  • the length of the first amplification product is preferably 120 bp or less and 50 bp or more.
  • the competitor nucleic acid is a peptide nucleic acid (PNA), a locked nucleic acid (LNA), and an oligonucleotide having a modification such as phosphorylation at the 3 'end such that DNA synthesis reaction by DNA polymerase does not occur from the 3' end.
  • the concentration of the competitor nucleic acid is preferably a concentration which suppresses the amplification of the wild-type allele not to be detected and does not inhibit the amplification of the mutant gene to be detected in the amplification by the first primer set.
  • the concentration of the competitor nucleic acid is 0.01 to 1.00 ⁇ M, 0.01 to 0.75 ⁇ M, 0.02 to 0.50 ⁇ M, 0.03 to 0.30 ⁇ M, 0.04 to 0.25 ⁇ M, 0.05 to 0.20 ⁇ M, 0.06 to 0.17 ⁇ M, 0.07 to 0.14. It is preferably ⁇ M, 0.08 to 0.13 ⁇ M, and 0.09 to 0.11 ⁇ M.
  • the sequence of the competitor nucleic acid is at least 10 nucleotides, preferably 10-30 nucleotides, 11-29 nucleotides, 12-28 nucleotides, 13 including the polymorphic site of the wild type allele of the gene whose mutation is to be detected.
  • nucleotides 14-26 nucleotides, 15-25 nucleotides, 16-24 nucleotides, 17-23 nucleotides, 18-22 nucleotides, or 19-21 nucleotides or alternatively 10 nucleotides, 11 nucleotides, 12 nucleotides, 13 nucleotides, 14 nucleotides Nucleotide, 15 nucleotides, 16 nucleotides, 17 nucleotides, 18 nucleotides, 19 nucleotides, 20 nucleotides, 21 nucleotides, 22 nucleotides, 22 nucleotides, 23 nucleotides, 24 nucleotides, 25 nucleotides, 26 nucleotides, 27 nucleotides, 27 nucleotides, 28 nucleotides, 29 nucleotides, or 30 nucleotides Array and complete Match it is preferable to.
  • the sequence of the competitor nucleic acid may be any sequence of double strands of the DNA of the gene whose mutation is to be detected.
  • the length of the competitor nucleic acid is preferably 10 to 40 nucleotides, 11 to 39 nucleotides, 12 to 38 nucleotides, 13 to 37 nucleotides, 14 to 36 nucleotides, 15 to 35 nucleotides, 16 to 34 nucleotides, 17 -33 nucleotides, 18-32 nucleotides, 19-31 nucleotides, 20-30 nucleotides, 21-29 nucleotides, 22-28 nucleotides, 23-27 nucleotides, 24-26 nucleotides, 25-25 nucleotides, 26-34 nucleotides, 27 -33 nucleotides, 28-32 nucleotides, or 29-31 nucleotides, or 10 nucleotides, 11 nucleotides, 12 nucleotides
  • the position of the polymorphic site in the competitor nucleic acid may be anywhere as long as all or part of the polymorphic site is contained in the sequence of the competitor nucleic acid.
  • the polymorphic sites correspond to nucleotides between 1/10 and 9/10 of the full length from the 5 'side. Is preferred.
  • the polymorphic site is 5 'to the full length 2/10 to 8/10 of the nucleotide, 3/10 to 7/10 of the nucleotide, or 4/10 to 6/10 It is preferred to correspond to the nucleotides between them.
  • a method of detecting or quantifying an amplification product by the second primer set a method of measuring the generated fluorescence intensity using an intercalator such as SYBR (registered trademark) Green is preferable, but a more preferable method Preferred is a method of separating amplification products by ion exchange chromatography and comparing the presence or absence of the peak and comparison of the peak area.
  • the peak of the amplification product is usually detected by absorbance measurement at 260 nm, by using an ASP labeled with a fluorescent dye at the 5 'end, the amplification product can be detected by a fluorescence detector, so it is non-non-ASP. It is useful to distinguish from specific amplification products.
  • Alexa Fluor (trademark) series, Cy (trademark) series, ATTO series, DY series, DyLight (trademark) series, FAM, TAMRA etc. are mentioned, for example.
  • the nucleic acid sample a sample in which a wild type allele and a mutant allele are mixed is preferable, and in particular, a sample in which a mutant allele is suspected to be mixed or mixed at a low frequency with respect to the wild type allele is preferable.
  • low frequency means that the mixing ratio (% of mu / wild) of wild-type allele DNA (wild) to mutant allele DNA (mu) in the sample is 0.001 to 0.01%, 0.001 to 0.02%, 0.001 to 0.05%, 0.001 to 0.1%, 0.001 to 0.2%, 0.001 to 0.5%, 0.001 to 1%, 0.001 to 2%, 0.001 to 5%, 0.001 to 10%, 0.002 to 0.01%, 0.002 to 0.00 0.02%, 0.002 to 0.05%, 0.002 to 0.1%, 0.002 to 0.2%, 0.002 to 0.5%, 0.002 to 1%, 0.002 to 2%, 0.002 to 5%, 0.002 to 10%, 0.005 to 0.01%, 0.005 to 0.02%, 0.005 to 0.05%, 0.005 to 0.1%, 0.005 to 0.2%, 0.005 to 0.5%, 0.005 to 1%, 0.005 to 2%, 0.005 to 0.5%, 0.005 to
  • the sample is preferably a biological sample derived from cancer tissue of a cancer patient who has been sensitive to a tyrosine kinase inhibitor (TKI).
  • TKI tyrosine kinase inhibitor
  • “high sensitivity” means that the concentration of the DNA of the mutant allele in the sample is 0.0001 to 0.001 ng / ⁇ L, 0.0001 to 0.003 ng / ⁇ L, 0.0001 to 0.01 ng / ⁇ L, 0.0001 to 0.03 ng.
  • ⁇ L 0.0001 to 0.1 ng / ⁇ L, 0.0001 to 0.3 ng / ⁇ L, 0.0001 to 1 ng / ⁇ L, 0.0003 to 0.001 ng / ⁇ L, 0.0003 to 0.003 ng / ⁇ L, 0.0003 to 0.01 ng / ⁇ L, 0.0003 to 0.03 ng / ⁇ L 0.0003 to 0.1 ng / ⁇ L, 0.0003 to 0.3 ng / ⁇ L, 0.0003 to 1 ng / ⁇ L, 0.001 to 0.003 ng / ⁇ L, 0.001 to 0.01 ng / ⁇ L, 0.001 to 0.03 ng / ⁇ L, 0.001 to 0.1 ng / ⁇ L, 0.001 ⁇ 0.3 ng / ⁇ L, 0.001 to 1 ng / ⁇ L, 0.003 to 0.01 ng / ⁇ L, 0.001 to 0.03 ng / ⁇ L
  • a point mutation (T790M, 2369C-> T) at codon 790 of exon 20 of the EGFR gene is preferable.
  • the sequences around codon 790 of exon 20 of the EGFR gene are shown in SEQ ID NO: 1 (wild-type) and SEQ ID NO: 2 (mutant).
  • a polymerase chain reaction method is preferable as a nucleic acid amplification reaction.
  • the base of the second nucleotide from the 3 'end corresponds to the base of the mutant nucleotide of the mutation
  • the base of the third nucleotide from the 3' end corresponds to the target nucleic acid
  • the third nucleotide base from the 3 'end thereof corresponds to the base of the mutant nucleotide of the mutation, and the second nucleotide from the 3' end.
  • the first primer set and the second primer set coexist, all the primers contained in the first primer set and the second primer set are in a single continuous liquid phase ( That is, it means that it is present in the nucleic acid amplification reaction solution).
  • conditions under which the nucleic acid amplification reaction by the second primer set does not occur include 1 to 19 ° C. higher, 2 to 18 ° C. higher, or 3 to 17 ° C. higher than the melting temperature (Tm) of the allele specific primer. 4 to 16 ° C. high, 5 to 15 ° C. high, 6 to 14 ° C. high, 7 to 13 ° C. high, 8 to 12 ° C. high, or 9 to 11 ° C. high temperature conditions, or 1 ° C.
  • a site containing a single nucleotide polymorphism is preferable.
  • alleles with mutations are called mutant alleles and alleles without mutations are called wild-type alleles.
  • a wild-type allele means an allele having no mutation to be detected at the mutation site of the gene mutation to be detected.
  • an allele in which the amino acid at codon 790 of exon 20 of the EGFR gene is T is preferable.
  • a mutant allele means an allele having a mutation to be detected at a mutation site of a gene mutation to be detected.
  • an allele in which the amino acid at codon 790 of exon 20 of the EGFR gene is M is preferable.
  • the amplification product by the second primer set is separated by ion exchange chromatography, the elution time is x-axis, the amount of eluted DNA is y-
  • shaft is preferable.
  • the peak area of the amplification product is surrounded by, for example, a straight line connecting minimum points on both sides of the peak (minimum points when no minimum point is present) as a baseline, and the curve and the baseline The area of the region can be determined as the peak area.
  • the absolute amount of the mutant allele contained in the nucleic acid sample of interest by using a nucleic acid sample containing a known amount of the mutant allele as a control sample and comparing with the peak area of the amplification product obtained for the control sample Can be quantified.
  • the DNA extracted and purified from the NCI-H1975 cell line is used as the DNA having the T790M mutation of exon 20 of the human EGFR gene, and the DNA extracted and purified from the K562 cell line is used as the DNA not having the mutation.
  • the range of concentrations of the first primer set that would ensure the performance of the measurement system designed according to the present invention was evaluated.
  • the first primer set (SEQ ID NOS: 3 and 4) used for the first PCR reaction is set in the region flanking the T790M mutation, and the reverse primer among them is the second primer set (SEQ ID NOS: 4 and 5) with the reverse primer. Designed as a common primer.
  • the forward primer of the second primer set is an allele-specific primer corresponding to the T790M (2369C-> T) mutation
  • the base of the second nucleotide from the 3 'end thereof is the base of the mutant nucleotide of the mutation (T
  • the base of the third nucleotide from the 3 'end has a base (T) not complementary to the base of the corresponding nucleotide of the target nucleic acid
  • the bases of the other nucleotides correspond to the corresponding nucleotides of the target nucleic acid Complementary to the base of
  • the strand length of the amplification product obtained with the combination of the primer of SEQ ID NO: 3 and the primer of SEQ ID NO: 4 is 79 bp
  • the strand length of the amplification product obtained with the primer of SEQ ID NO: 4 and the primer of SEQ ID NO: 5 is 65 bp.
  • SEQ ID NO: 4 first and second reverse primers
  • PNA was applied as a competitor nucleic acid having a sequence complementary to the codon 790 wild-type sequence.
  • the synthesis of PNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 was commissioned to a competition nucleic acid synthesis trust company (Panagene).
  • the DNA (mutant; mu) extracted from the NCI-H1975 cell line and the DNA (wild) extracted from the K562 cell line are mixed at each ratio so that the total concentration is 30 ng / ⁇ L.
  • the mixture ratio (% of mu / wild) was prepared by mixing wild-derived DNA and mutant-derived DNA such that the ratio was 0.01%, 0% (control).
  • reaction solution containing the following reagents was prepared, and amplification was performed using a thermal cycler apparatus CFX96 (Bio-Rad).
  • the amplification curve of the 2nd PCR reaction (mixing ratio 0.01%) at the time of performing an amplification reaction by reducing the density
  • concentration of the 1st forward primer which is the same direction as the allele specific primer of a 2nd primer set is shown in FIG.
  • the reverse primer concentration for the first PCR is 0.5 ⁇ M
  • the forward primer concentration for the first PCR is in the range of 0.005 to 0.025 ⁇ M, that is, in the first primer set, the concentration of primers in the same direction as ASP in the second primer set
  • amplification during the second PCR reaction was observed.
  • amplification was possible even in the case of 0.01% where the mixed ratio of mutant genes is very low.
  • the measurement sensitivity of the measurement system designed according to the present invention does not include the forward primer for the first PCR Compared to the prior art ASP-PCR method.
  • DNA (Mutant) extracted from NCI-H1975 cell strain was prepared and used at a concentration of 0.01 ng / ⁇ L and 0.003 ng / ⁇ L.
  • reaction solution containing the following reagents was prepared, and amplification was performed using a thermal cycler apparatus CFX96 (Bio-Rad).
  • Example 2 It carried out on the same conditions as Example 1.
  • the amplification curves when the amplification reaction by the ASP-PCR method without using the first PCR forward primer is performed are shown in FIGS. 2 [A] and [B].
  • the amount of DNA was 0.05 ng / reaction [A]
  • amplification was observed in all 10 out of 10 measurements, but the number of cycles of rising of the amplification curve was largely dispersed in 45 to 60 cycles.
  • 0.015 ng / reaction [B] where the amount of DNA is small [B]
  • no amplification was observed 6 times out of 10 times.
  • the cycle number of the rising of the amplification curve was variable even in the 4 times in which amplification was observed, and the reproducibility was poor.
  • the concentration of the first PCR forward primer to be 0.025 ⁇ M, which is 1/20 of the first PCR reverse primer the amplification curves of the first reaction and the second reaction when the amplification reaction is performed are shown in FIG. It is shown in [C] to [F].
  • the amount of DNA is 0.05 ng / reaction ([C] and [D])
  • amplification is observed in all 10 of 10 measurements, and the number of cycles of rising of the amplification curve is also uniform, enabling reproducible reproduction. Indicates that there is.
  • 0.015 ng / reaction ([E] and [F]) in which the amount of DNA is small [E] and [F]
  • amplification was observed in all 10 of 10 measurements.
  • the number of rising cycles of the amplification curve slightly varies from 35 to 40 cycles in the first PCR reaction and 15 to 20 cycles in the second PCR reaction, it has been confirmed that even a small amount of DNA of the mutant gene can be reliably amplified.
  • the concentration of the first PCR forward primer is intentionally decreased, and in the first primer set, the primers having the same orientation as the ASP of the second primer set It was shown that setting the concentration to 1/100 to 1/20 of the other improves the measurement sensitivity and reproducibility of the ASP-PCR method.
  • the DNA extracted and purified from the NCI-H1975 cell line as the DNA having the T790M mutation of exon 20 of the human EGFR gene, and the DNA extracted and purified from the K562 cell line as the DNA without the mutation described above The specificity and measurement sensitivity of the measurement system designed according to the invention were evaluated.
  • DNA (mutant; mu) extracted from NCI-H1975 cell line and DNA (wild) extracted from K562 cell line are mixed at each ratio so that the total concentration is 30 ng / ⁇ L. Prepared. The mixture ratio (% of mu / wild) was adjusted to 0.1%, 0.03%, 0.01%, 0% (control) by mixing wild-derived DNA and mutant-derived DNA. In addition, DNA (mutant; mu) extracted from the NCI-H1975 cell line was prepared to be 0.003 ng / ⁇ L, and a mixture ratio (% of mu / wild) was 100%.
  • the elution peak detected when the PCR amplification product obtained under the above conditions was separated by ion exchange chromatography is shown in FIG.
  • wild-derived DNA was used as a template
  • mutant-derived DNA 100% was used as a template
  • main elution peak was observed around 6.3 minutes, which is a PCR amplification product.
  • the same clear elution peak could be confirmed even when the mixing ratio of Mutant-derived DNA was 0.01%.
  • the DNA extracted and purified from the NCI-H1975 cell line as the DNA having the T790M mutation of exon 20 of the human EGFR gene, and the DNA extracted and purified from the K562 cell line as the DNA without the mutation described above The quantitativeness of the measurement system designed according to the invention was evaluated.
  • DNA (mutant; mu) extracted from NCI-H1975 cell line and DNA (wild) extracted from K562 cell line are mixed at each ratio so that the total concentration is 10 ng / ⁇ L.
  • the mixture ratio (% of mu / wild) was 10%, 3%, 1%, 0.3%, 0.1%, 0%, respectively, mixed with wild-derived DNA and mutant-derived DNA.
  • the amplification reaction When the amplification reaction is performed by appropriately combining the cycle numbers of the first PCR reaction and the second PCR reaction, the correlation between the amplification curve of the second PCR and the final relative fluorescence intensity (PFU) value and the percentage (%) of the mutant allele It is shown in FIG. 4 [A] to [R].
  • the amount of amplification product generated in the first PCR reaction usually does not reflect the percentage (%) of gene mutation contained in the nucleic acid sample when the amplification reaction reaches saturation, so the amplification generated in the second PCR reaction It is believed that the product also does not reflect the rate of genetic variation in the nucleic acid sample.
  • the amplification curve of the second PCR reaction is the percentage of gene mutations contained in the nucleic acid sample (% It can be seen that it does not reflect at all.
  • the cycle number of the first PCR reaction to 35 as in [D] to [F]
  • the conditions for the amplification reaction of the first PCR do not reach the saturation phase, and the following conditions for the second PCR reaction It was shown that an amplification curve of the amplification product reflecting the amount of gene mutation contained in the nucleic acid sample by the primers was obtained.
  • the cycle number of the first PCR reaction in the range of 32 to 15, and additionally setting the cycle number of the second PCR reaction to 30 or more, it is included in the nucleic acid sample obtained in the first PCR reaction
  • the amplification reaction is continued while maintaining the specificity of the second PCR reaction using ASP, and the PFU value and the percentage of mutant allele in the final cycle of the second PCR reaction (% A more accurate correlation was found in the relationship with) ([G] to [R]).
  • the amplification reaction is performed by combining the number of cycles of the first PCR reaction and the second PCR reaction to be 62, and the eluted product is separated and detected by ion exchange chromatography (the main elution peak is indicated by an arrow).
  • the main elution peak is indicated by an arrow.
  • the correlation between the area of the main elution peak and the percentage (%) of the mutant allele is shown in FIGS. 5 [B], [D], and [5].
  • Example 4 under the combined conditions of the cycle number where good results were obtained with the correlation between the fluorescence intensity after the second PCR reaction and the ratio (%) of the mutant allele, an amplification product derived from the mutant allele at around 6.3 minutes In [A] to [F], the area of the elution peak and the percentage (%) of the mutant allele are well correlated. Under the 35 cycle conditions of the first PCR reaction for which sufficient quantitativeness was not obtained in Example 4, although quantitativeness of the elution peak was observed, sufficient results were not obtained for the proportion of the mutant allele.
  • the second primer set is continuously applied to the amplification product generated reflecting the DNA amount of the mutant gene contained in the nucleic acid sample.
  • the mutant gene is selectively amplified by a nucleic acid amplification reaction using ASP under operating conditions, the amplification products are separated by ion exchange chromatography, and peak areas of the amplification products are compared to obtain the mutant alleles. It was shown that the quantitative nature of the percentage was secured.
  • the method for detecting a mutant gene of the present invention is a method for producing a companion diagnostic agent and system for predicting the sensitivity of a tyrosine kinase inhibitor against epidermal growth factor receptor in cancer patients, and a diagnostic agent that is the basis of other personalized medicine and It can be used for system production.

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Abstract

本発明は、野生型対立遺伝子(野生型アレル(wild-type allele))を含む核酸試料において、低頻度で含まれる突然変異遺伝子(変異アレル(mutant allele))を、高感度に検出する方法、さらには定量する方法を提供することを目的とする。 興味の対象となる遺伝子の変異部位を挟むように設計された第1 のプライマーセットと当該変異に対応するASP を含む第2 のプライマーセットを混合した一つの反応系で、当該遺伝子の野生型対立遺伝子からの増幅反応を抑制する競合核酸を含み、特定のプライマー濃度条件を選択し、かつ、第1 及び第2 のプライマーセットによるPCR 反応のサイクル数を制御することで、低頻度の突然変異遺伝子から増幅産物を得ることが可能であり、また定量性も確保できる。

Description

変異遺伝子検出方法
　本発明は、野生型対立遺伝子(野生型アレル(wild-type allele))を含む核酸試料において、低頻度で含まれる突然変異遺伝子(変異アレル(mutant allele))を高感度に検出及び定量する方法に関する。
　遺伝子変異には、遺伝的に受け継がれる生殖細胞変異と後天的に一つ一つの細胞内で引き起こされる体細胞変異がある。生殖細胞変異である特定の遺伝子の一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphism;SNP)や代表的な体細胞変異である点変異(一塩基変異)が、各種疾病に関連していることが報告されており、近年それらの塩基配列を検出することが、特定の薬剤の効果が期待される患者の選別に利用されている。
　例えば、肺癌の治療薬であるチロシンキナーゼ阻害剤(TKI)の薬効判断の基礎として、上皮成長因子受容体(EGFR)の遺伝子変異検査が行われている。この検査は、微量な癌組織検体を用いて行われること、及び、正常組織及び癌組織由来の野生型対立遺伝子が混在することから、高感度かつ高い特異性を有することが求められる。
　EGFR遺伝子変異の中で、特にエクソン20のコドン790の点変異(T790M、2369C->T)は、ゲフィチニブやアファチニブなどの第1世代および第2世代TKIの耐性変異として知られている。近年、このT790M変異に対して奏効する第3世代のTKI(オシメルチニブ)が臨床応用されたが、肺癌のTKI耐性及び再発が認められた患者への適用条件として、T790M変異の検査が求められている。さらに、T790M変異によるTKI耐性及び肺癌の再発の兆候を見落とさない為に、頻回のRe biopsy実施による組織検体の採取とその検体での検査が求められることになるが、侵襲性の高いRe biopsyは患者への負担も大きく、実施できない場合もある。そこで、近年、血漿中に流れ出る癌組織由来のCell free DNAからT790M変異が検出された場合もオシメルチニブを処方することが可能になった。しかしながら、この血漿中Cell free DNAは微量であり、組織検体からの検出において必要とされる以上に、高感度な変異検出方法が必要とされる。加えて、肺癌の再発をモニタリングする為、T790M変異の量の変化を把握できる定量方法が所望される。
　EGFRの遺伝子変異を検出する方法として、リアルタイムPCR法(非特許文献1)や、アレル特異的プライマー(Allele Specific Primer;ASP)を用いたASP-PCR法とQプローブによる解離曲線解析とを組み合わせたMBP-QP法(非特許文献2)が報告されている。これらの方法による検出感度は0.1～1%程度で、がん細胞を含むことが既に確認された組織検体からの検出には十分な感度であるが、再発患者における低頻度変異の検出には不十分とみられる。近年、これらの検出方法よりも100倍以上高感度で、且つ定量が可能なデジタルPCR法が登場しており、この方法を用いるとTKI未治療患者から変異が検出されるなど、既存の検出方法では検出不可能であった変異を検出できることが報告されている(非特許文献3)。このような低頻度のT790M変異が検出された場合にも第1、2世代TKIの耐性となっているのか、第3世代TKIが奏効するのかなど、突然変異遺伝子の割合と薬剤応答の関係性を評価すべきとする考えが広く受け入れられている。この関係性が明確になれば、耐性突然変異遺伝子の割合に応じて、適切な薬剤選択が可能となる。しかし、高感度に定量が可能なデジタルPCR法は操作が煩雑で、また、高価な専用装置が必要である。
　前述したASP-PCR法は、EGFRやRASなどの遺伝子変異(特に、点変異)を検出するために、簡便で比較的高感度な手法であるが、この方法で高感度な変異検出系を構築するには、ASPの特異性向上が不可欠である。ASPは、一般に、3’末端1～3塩基のいずれかが一塩基多型などの遺伝子多型の変異型ヌクレオチドに対応するように設計され、さらに、多型部位以外の場所に標的核酸と相補でない塩基配列(ミスマッチ)を人為的に加えることで特異性を確保するように設計される(特許文献1、特許文献2、及び出願人の本件出願優先日における未公開特許出願(PCT/JP2017/12820))。しかしながら、ミスマッチを人為的に加えたASPでは、完全マッチのプライマーと比較して親和性が弱くなるので、増幅効率の低下を招くことがある。
　一塩基変異を検出するためのASPは一塩基の違いによって特異性を確保するため、プライマー長を短くすることが有効である。一方で、プライマー長の短いASPで増幅を行う場合、PCRのアニーリング温度を下げる必要があるが、これによって非特異増幅の発生が懸念される。このような非特異増幅は、1つの反応系で複数のプライマーを用いて複数変異を同時に増幅する場合は(マルチプレックスPCR)、特に発生しやすい。
　非特異増幅を低減させる手法として、Nested PCRが知られている。この方法は標的配列を挟む第1のプライマーセットにより第1の増幅反応を実施した後、この第1の反応溶液の1/20～1/50を第2の増幅反応の鋳型として、第1のプライマーセットよりも内側に設計した第2のプライマーセットにより、目的の配列を増幅する手法である。この方法は第1のプライマーセットによるミスプライミングが原因で非特異的な産物が増幅された場合でも、第2のプライマーセットで同じ非特異的な領域が増幅される可能性は低いことを利用して、標的配列を含む領域を効率的に増やすことができる。しかし、PCR反応を2回実施するため、操作が煩雑で時間もかかる。また、第1のPCR反応後、その反応溶液を第2のPCR反応の鋳型として用いるため、多量の増幅産物を含む反応溶液のふたを開ける必要があり、測定環境への増幅産物の汚染(相互汚染)が懸念される。
特開2005-160430号公報 特許第3937136号
Biomed Res Int. 2013;2013:385087. J Thorac Oncol. 2011 Oct;6(10):1639-48. Clin Cancer Res. 2015 Aug 1;21(15):3552-60.
　本発明は、前記従来の課題を解決するために、野生型対立遺伝子(野生型アレル(wild-type allele))を含む核酸試料において、低頻度で含まれる突然変異遺伝子(変異アレル(mutant allele))を、高感度に検出する方法、さらには定量する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、Nested PCRをホモジニアスな反応系で実施することを試み、興味の対象となる遺伝子の変異部位を挟むように設計された第1のプライマーセットと当該変異に対応するASPを含む第2のプライマーセットを混合した一つの反応系で、当該遺伝子の野生型対立遺伝子からの増幅反応を抑制する競合核酸を含み、特定のプライマー濃度条件を選択し、かつ、随意により第1及び第2のプライマーセットによるPCR反応のサイクル数を制御することで、低頻度の突然変異遺伝子から高感度に増幅産物を得ることが可能であり、また定量性も確保できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち本発明は、次の[1]～[8]を提供するものである。
　[1]核酸試料中に含まれる遺伝子変異を、DNAポリメラーゼを用いた核酸増幅反応による増幅産物の有無で検出する方法であって、当該遺伝子の多型部位を挟むように設計された第1のプライマーセットと、当該変異を含む核酸から選択的に増幅するアレル特異的プライマーを1つ以上含む第2のプライマーセットが共存する核酸増幅反応液中において、
　(a) 第2のプライマーセットによる核酸増幅反応が起きない条件下にて、当該遺伝子の野生型アレルの配列を有し、当該多型部位の全部又は一部にハイブリダイゼーションする競合核酸の存在下で、第1のプライマーセットによる核酸増幅反応により、変異アレルを含む核酸を増幅させ、増幅産物を得る工程を含み、
　(b) 工程(a)の増幅産物を得る際に、第1のプライマーセットのプライマーの濃度を、第2のプライマーセットの濃度と比較して、減少させて増幅反応させる工程を含み、
　(c) 工程(a)で得られた増幅産物に対して、少なくとも第2のプライマーセットが作用する条件で核酸増幅反応により変異アレルを含む核酸を選択的に増幅させることで、核酸試料中に含まれる遺伝子変異を検出する方法。
　[2]前記の第2のプライマーセットによる核酸増幅反応が起きない条件が、当該アレル特異的プライマーが当該変異を含む核酸にアニールしない温度条件である、上記[1]に記載の方法。
　[3]第2のプライマーセットのアレル特異的プライマーでないプライマーが、第1のプライマーセットの一方のプライマーと共通して設計される、上記[1]又は[2]に記載の方法。
　[4]第1のプライマーセットにおいて、第2のプライマーセットのアレル特異的プライマーと同じ向きのプライマーの濃度が、他方のプライマーの濃度の1/100～1/20である、上記[1]～[3]のいずれかに記載の方法。
　[5]第2のプライマーセットによる増幅産物の有無を、イオン交換クロマトグラフィーにより分離された増幅産物のピークの有無により検出する工程を含む、上記[1]～[4]のいずれかに記載の方法。
　[6]核酸試料中に含まれる変異アレルを、DNAポリメラーゼを用いた核酸増幅反応による増幅産物を用いて定量する方法であって、当該遺伝子の多型部位を挟むように設計された第1のプライマーセットと、当該変異を含む核酸から選択的に増幅するアレル特異的プライマーを1つ以上含む第2のプライマーセットが共存する核酸増幅反応液中において、
　(a) 第2のプライマーセットによる核酸増幅反応が起きない条件下にて、当該遺伝子の野生型アレルの配列を有し、当該多型部位の全部又は一部にハイブリダイゼーションする競合核酸の存在下で、第1のプライマーセットによる核酸増幅反応により、変異アレルを含む核酸を増幅させ、増幅産物を得る工程を含み、
　(b) 工程(a)の増幅産物を得る際に、第1のプライマーセットによる核酸増幅反応が飽和期に到達する前に、核酸試料中に含まれる変異アレルのDNA量を反映して生成した増幅産物に対して、継続して少なくとも第2のプライマーセットが作用する条件で核酸増幅反応により、変異アレルを含む核酸を選択的に増幅させることで、核酸試料中に含まれる変異アレルを定量する方法。
　[7]第1のプライマーセットによる核酸増幅反応のサイクル数を15～32回に設定し、さらに第2のプライマーセットによる核酸増幅反応のサイクル数を30～60回に設定し、2つの反応を組み合わせて連続で行う、上記[6]に記載の方法。
　[8]第2のプライマーセットによる増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、当該増幅産物のピーク面積から、その核酸試料中に含まれる変異アレルを定量する、上記[6]又は[7]に記載の方法。
　本発明によれば、低頻度で含まれる突然変異遺伝子を特異的に、かつ迅速に検出及び定量することが可能になる。例えば、肺癌患者におけるEGFR遺伝子変異検出のように、突然変異遺伝子(例えば、T790M)に対応する野生型対立遺伝子が、試料中に多量に混在する場合でも、高感度に変異を検出及び定量できることで、第1、第2世代TKIの耐性のリスク判断やモニタリングによる臨床への応用を可能とする。
第1PCR用のフォワードプライマーの濃度を変えてPCR増幅した場合の第2PCR反応30サイクルの増幅曲線を示す。 [A]ASP-PCR法によるMutant 0.05ngからPCR増幅した場合の増幅曲線を示す。[B]ASP-PCR法によるMutant 0.015ngからPCR増幅した場合の増幅曲線を示す。[C]第1PCR用のフォワードプライマー(0.025μM)を用いてMutant 0.05ngからPCR増幅した場合の第1PCR反応55サイクルの増幅曲線を示す。[D]第1PCR用のフォワードプライマー(0.025μM)を用いてMutant 0.05ngからPCR増幅した場合の第2PCR反応30サイクルの増幅曲線を示す。[E]第1PCR用のフォワードプライマー(0.025μM)を用いてMutant 0.015ngからPCR増幅した場合の第1PCR反応55サイクルの増幅曲線を示す。[F]第1PCR用のフォワードプライマー(0.025μM)を用いてMutant 0.015ngからPCR増幅した場合の第2PCR反応30サイクルの増幅曲線を示す。 第1PCR反応55サイクル、第2PCR反応30サイクル後の増幅産物のイオン交換クロマトグラフィーによる溶出ピークを示す。 [A]第1PCR反応55サイクルの増幅曲線を示す。[B]上記[A]の第1PCR反応55サイクル後、第2PCR反応30サイクルの増幅曲線を示す。[C]上記[B]の第2PCR反応30サイクル時のRFU値とT790M変異アレル割合の相関性を示す。[D]第1PCR反応35サイクルの増幅曲線を示す。[E]上記[D]の第1PCR反応35サイクル後、第2PCR反応30サイクルの増幅曲線を示す。[F]上記[E]の第2PCR反応30サイクル時のRFU値とT790M変異アレル割合の相関性を示す。[G]第1PCR反応32サイクルの増幅曲線を示す。[H]上記[G]の第1PCR反応32サイクル後、第2PCR反応30サイクルの増幅曲線を示す。[I]上記[H]の第2PCR反応30サイクル時のRFU値とT790M変異アレル割合の相関性を示す。[J]第1PCR反応25サイクルの増幅曲線を示す。[K]上記[J]の第1PCR反応25サイクル後、第2PCR反応30サイクルの増幅曲線を示す。[L]上記[K]の第2PCR反応30サイクル時のRFU値とT790M変異アレル割合の相関性を示す。[M]第1PCR反応25サイクルの増幅曲線を示す。[N]上記[M]の第1PCR反応25サイクル後、第2PCR反応37サイクルの増幅曲線を示す。[O]上記[N]の第2PCR反応37サイクル時のRFU値とT790M変異アレル割合の相関性を示す。[P]第1PCR反応15サイクルの増幅曲線を示す。[Q]上記[P]の第1PCR反応15サイクル後、第2PCR反応47サイクルの増幅曲線を示す。[R]上記[Q]の第2PCR反応47サイクル時のRFU値とT790M変異アレル割合の相関性を示す。 [A]第1PCR反応15サイクル、第2PCR反応47サイクル後の増幅産物溶出ピークを示す。[B]上記[A]の増幅産物溶出ピーク面積とT790M変異アレル割合の相関性を示す。[C]第1PCR反応25サイクル、第2PCR反応37サイクル後の増幅産物溶出ピークを示す。[D]上記[C]の増幅産物溶出ピーク面積とT790M変異アレル割合の相関性を示す。[E]第1PCR反応32サイクル、第2PCR反応30サイクル後の増幅産物溶出ピークを示す。[F]上記[E]の増幅産物溶出ピーク面積とT790M変異アレル割合の相関性を示す。[G]第1PCR反応35サイクル、第2PCR反応27サイクル後の増幅産物溶出ピークを示す。[H]上記[G]の増幅産物溶出ピーク面積とT790M変異アレル割合の相関性を示す。
　以下に、発明を実施するための一形態を説明するが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる様態で実施しうる。
　本発明において、第2のプライマーセットのアレル特異的プライマー(ASP)でないプライマーは、第1のプライマーセットの一方のプライマーと共通して設計することもできる(以下、共通して設計するプライマーを「共通プライマー(common primer)」と呼ぶことがある)。即ち、共通プライマーは、第1のプライマーセットと第2のプライマーセットの両方において役割を果たす。この場合、共通プライマーの濃度は、第2のプライマーセットの濃度に合わせることが好ましい。
　本発明において、第1PCR反応時に共存している第2のプライマーセットが働かないようにする為に、第1のプライマーセットのTm値の最も低い値が、第2のプライマーセットのTm値の最も低い値と比較して10℃以上高くなるように設計し、かつ、増幅反応温度の差を10℃以上とすることが好ましい。本発明において、第1PCR反応時に共存している第2のプライマーセットが働かないようにする為に、第2のプライマーセットによる核酸増幅反応が起きない条件を採用することが好ましい。
　本発明において、第1のプライマーセットの各プライマーの濃度を、第2のプライマーセットのASPの濃度の1/100～1/20にすることが好ましい。この場合、第1のプライマーセットの各プライマーの濃度は、一方が他方の100倍、20倍、又は10倍以内であることが好ましく、第2のプライマーセットの各プライマーの濃度は、一方が他方の100倍、20倍、又は10倍以内であることが好ましい。また、第2のプライマーセットのASPでないプライマーを、第1のプライマーセットの一方のプライマーと共通して設計する場合には、第1のプライマーセットにおいて、第2のプライマーセットのASPと同じ向きのプライマーの濃度を、共通プライマーの濃度の1/100～1/20にすることが好ましい。
本発明において、第1のプライマーセットにおける、第2のプライマーセットのASPと同じ向きのプライマーの濃度としては、0.010～0.100μM、0.020～0.050μM、又は0.025～0.040μMであることが好ましい。
　本発明において、突然変異遺伝子の定量(野生型対立遺伝子に対する比率の測定及び/又は突然変異遺伝子のコピー数の測定)を行うためには、突然変異遺伝子の変異部位を含む検出領域を選択的に増幅させる条件であれば特に制限なく採用できるが、第1のプライマーセットによる核酸増幅反応が対数期(exponential phase)を経過して飽和期(saturation phase)に到達する前に、少なくとも第2のプライマーセットが作用する条件に変更して(例えば、増幅反応温度を低下させて)核酸増幅反応を行うことが好ましい。好適には、第1のプライマーセットによる核酸増幅反応のサイクル数を15～32回、16回～31回、17回～30回、18回～29回、19回～28回、20回～27回、21回～26回、22回～25回、又は23回～24回、あるいは、15回、16回、17回、18回、19回、20回、21回、22回、23回、24回、25回、26回、27回、28回、29回、30回、31回、又は32回に設定し、さらに第2のプライマーセットによる核酸増幅反応のサイクル数を30回～60回、31回～59回、32回～58回、33回～57回、34回～56回、35回～55回、36回～54回、37回～53回、38回～52回、39回～51回、40回～50回、41回～49回、42回～48回、43回～47回、又は44回～46回、あるいは、30回、31回、32回、33回、34回、35回、36回、37回、38回、39回、40回、41回、42回、43回、44回、45回、46回、47回、48回、49回、50回、51回、52回、53回、54回、55回、56回、57回、58回、59回、又は60回に設定し、2つの反応を組み合わせて連続で行うことが挙げられる。
　本明細書において、「核酸増幅反応が飽和期に到達する」と言うときは、以下の(1)又は(2)の何れか少なくとも一つの場合に該当する状況を意味する: (1)N回目のサイクルの核酸増幅反応後における増幅産物の量が、N-1回目のサイクルの核酸増幅反応後における増幅産物の量と比較して1.3倍以下になった場合; (2) 核酸増幅反応のサイクル数をx-軸、当該サイクルの核酸増幅反応後における増幅産物の量をy-軸としてプロットした曲線に変曲点が現れた場合(二回微分が正となった場合)。
　本発明において、第1の増幅産物の鎖長は250bp以下かつ50bp以上であることが好ましい。本発明において、血中のcell free DNAを検出する場合、第1の増幅産物の鎖長は120bp以下かつ50bp以上であることが好ましい。
　本発明において、競合核酸にはペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)、及び3’末端からDNAポリメラーゼによるDNA合成反応が起こらないように3’末端をリン酸化などの修飾を施したオリゴヌクレオチドを含む。また、競合核酸の濃度は、第1のプライマーセットによる増幅において、検出対象でない野生型対立遺伝子の増幅を抑制し、検出対象である突然変異遺伝子の増幅を阻害しない濃度であることが好ましい。より具体的には、競合核酸の濃度は、0.01～1.00μM、0.01～0.75μM、0.02～0.50μM、0.03～0.30μM、0.04～0.25μM、0.05～0.20μM、0.06～0.17μM、0.07～0.14μM、0.08～0.13μM、0.09～0.11μMであることが好ましい。
　本発明において、競合核酸の配列は、変異を検出しようとする遺伝子の野生型アレルの多型部位を含む少なくとも10ヌクレオチド、好ましくは、10～30ヌクレオチド、11～29ヌクレオチド、12～28ヌクレオチド、13～27ヌクレオチド、14～26ヌクレオチド、15～25ヌクレオチド、16～24ヌクレオチド、17～23ヌクレオチド、18～22ヌクレオチド、又は19～21ヌクレオチド、あるいは、10ヌクレオチド、11ヌクレオチド、12ヌクレオチド、13ヌクレオチド、14ヌクレオチド、15ヌクレオチド、16ヌクレオチド、17ヌクレオチド、18ヌクレオチド、19ヌクレオチド、20ヌクレオチド、21ヌクレオチド、22ヌクレオチド、23ヌクレオチド、24ヌクレオチド、25ヌクレオチド、26ヌクレオチド、27ヌクレオチド、28ヌクレオチド、29ヌクレオチド、又は30ヌクレオチド配列と完全に一致することが好ましい。本発明において、競合核酸の配列は、変異を検出しようとする遺伝子のDNAの二本鎖のうち、いずれの鎖の配列を採用しても良い。本発明において、競合核酸の長さは、好ましくは、10～40ヌクレオチド、11～39ヌクレオチド、12～38ヌクレオチド、13～37ヌクレオチド、14～36ヌクレオチド、15～35ヌクレオチド、16～34ヌクレオチド、17～33ヌクレオチド、18～32ヌクレオチド、19～31ヌクレオチド、20～30ヌクレオチド、21～29ヌクレオチド、22～28ヌクレオチド、23～27ヌクレオチド、24～26ヌクレオチド、25～25ヌクレオチド、26～34ヌクレオチド、27～33ヌクレオチド、28～32ヌクレオチド、若しくは29～31ヌクレオチド、又は、10ヌクレオチド、11ヌクレオチド、12ヌクレオチド、13ヌクレオチド、14ヌクレオチド、15ヌクレオチド、16ヌクレオチド、17ヌクレオチド、18ヌクレオチド、19ヌクレオチド、20ヌクレオチド、21ヌクレオチド、22ヌクレオチド、23ヌクレオチド、24ヌクレオチド、25ヌクレオチド、26ヌクレオチド、27ヌクレオチド、28ヌクレオチド、29ヌクレオチド、30ヌクレオチド、31ヌクレオチド、32ヌクレオチド、33ヌクレオチド、34ヌクレオチド、35ヌクレオチド、36ヌクレオチド、37ヌクレオチド、38ヌクレオチド、39ヌクレオチド、40ヌクレオチド、41ヌクレオチド、42ヌクレオチド、43ヌクレオチド、44ヌクレオチド、45ヌクレオチド、46ヌクレオチド、47ヌクレオチド、48ヌクレオチド、49ヌクレオチド、若しくは50ヌクレオチドである。本発明において、競合核酸における多型部位の位置は、当該多型部位の全部又は一部が当該競合核酸の配列に含まれる位置であれば、どこであっても構わない。当該多型部位の全部が当該競合核酸の配列に含まれる場合には、一態様においては、当該多型部位は5'側から全長の1/10から9/10の間のヌクレオチドに対応することが好ましい。この場合、例えば、長さが49ヌクレオチドの競合核酸については、多型部位は、4.9（＝49×1/10）から44.1の間のヌクレオチド、即ち、5番目から44番目のヌクレオチドに対応することが好ましい。別の態様においては、当該多型部位は5'側から全長の2/10から8/10の間のヌクレオチド、3/10から7/10の間のヌクレオチド、又は4/10から6/10の間のヌクレオチドに対応することが好ましい。
　本発明において、第2のプライマーセットによる増幅産物を検出又は定量する方法としては、SYBR(登録商標) Green等のインターカレーターを用いて、生じた蛍光強度を測定する方法が好ましいが、さらに好ましい方法としては、増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、そのピークの存在の有無及びピーク面積の比較により行う方法が好ましい。増幅産物のピークは、通常260nmにおける吸光度測定で検出されるが、5’末端に蛍光色素を標識したASPを用いることで、その増幅産物は蛍光検出器で検出可能となるので、ASP以外の非特異増幅産物と区別する場合は有用である。その際に用いられる蛍光色素としては、例えば、Alexa Fluor(登録商標)シリーズ、Cy(登録商標)シリーズ、ATTOシリーズ、DYシリーズ、DyLight(登録商標)シリーズ、FAM、TAMRAなどが挙げられる。
　本発明において、核酸試料としては、野生型アレルと変異アレルが混在する試料が好ましく、特に、野生型アレルに対して変異アレルが低頻度で混在する又は混在することが疑われる試料が好ましい。本明細書において、「低頻度」とは、試料中の野生型アレルのDNA(wild)と変異アレルのDNA(mu)の混合比(mu/wildの%)が、0.001～0.01％、0.001～0.02％、0.001～0.05％、0.001～0.1％、0.001～0.2％、0.001～0.5％、0.001～1％、0.001～2％、0.001～5％、0.001～10％、0.002～0.01％、0.002～0.02％、0.002～0.05％、0.002～0.1％、0.002～0.2％、0.002～0.5％、0.002～1％、0.002～2％、0.002～5％、0.002～10％、0.005～0.01％、0.005～0.02％、0.005～0.05％、0.005～0.1％、0.005～0.2％、0.005～0.5％、0.005～1％、0.005～2％、0.005～5％、0.005～10％、0.01～0.01％、0.01～0.02％、0.01～0.05％、0.01～0.1％、0.01～0.2％、0.01～0.5％、0.01～1％、0.01～2％、0.01～5％、若しくは0.01～10％、又は、0.001％、0.002％、0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、5％、若しくは10％であることを意味する。試料としては、チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)に対して感受性であったことがある癌患者の癌組織由来の生体試料が好ましい。また、本明細書において、「高感度」とは、試料中の変異アレルのDNAの濃度が、0.0001～0.001ng/μL、0.0001～0.003ng/μL、0.0001～0.01ng/μL、0.0001～0.03ng/μL、0.0001～0.1ng/μL、0.0001～0.3ng/μL、0.0001～1ng/μL、0.0003～0.001ng/μL、0.0003～0.003ng/μL、0.0003～0.01ng/μL、0.0003～0.03ng/μL、0.0003～0.1ng/μL、0.0003～0.3ng/μL、0.0003～1ng/μL、0.001～0.003ng/μL、0.001～0.01ng/μL、0.001～0.03ng/μL、0.001～0.1ng/μL、0.001～0.3ng/μL、0.001～1ng/μL、0.003～0.01ng/μL、0.003～0.03ng/μL、0.003～0.1ng/μL、0.003～0.3ng/μL、0.003～1ng/μL、0.01～0.03ng/μL、0.01～0.1ng/μL、0.01～0.3ng/μL、0.01～1ng/μL、0.03～0.1ng/μL、0.03～0.3ng/μL、若しくは0.03～1ng/μL、又は、0.0001ng/μL、0.0003ng/μL、0.001ng/μL、0.003ng/μL、0.01ng/μL、0.03ng/μL、0.1ng/μL、0.3ng/μL、若しくは1ng/μLの場合に、核酸試料中に含まれる遺伝子変異を検出できることを意味する。
　本発明において、遺伝子変異としては、EGFR遺伝子のエクソン20のコドン790の点変異(T790M、2369C->T)が好ましい。EGFR遺伝子のエクソン20のコドン790の周囲の配列を配列番号1(野生型)及び配列番号2(変異型)に示す。
（ＥＧＦＲ遺伝子のＴ７９０Ｍ野生配列[ＡＣＧ]フラグメント）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
（ＥＧＦＲ遺伝子のＴ７９０Ｍ変異配列[ＡＴＧ]フラグメント）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　本発明において、核酸増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応法が好ましい。
　本発明において、アレル特異的プライマーとしては、その3’末端より2番目のヌクレオチドの塩基が当該変異の変異型ヌクレオチドの塩基に対応し、3’末端より3番目のヌクレオチドの塩基が標的核酸の対応するヌクレオチドの塩基と相補でない塩基を有し、かつ、その他のヌクレオチドの塩基が当該標的核酸の対応するヌクレオチドの塩基と相補的であるプライマーが好ましい。また、本発明の別の態様においては、アレル特異的プライマーは、その3’末端より3番目のヌクレオチドの塩基が当該変異の変異型ヌクレオチドの塩基に対応し、3’末端より2番目のヌクレオチドの塩基が標的核酸の対応するヌクレオチドの塩基と相補でない塩基を有し、かつ、その他のヌクレオチドの塩基が当該標的核酸の対応するヌクレオチドの塩基と相補的であるプライマーが好ましい。
　本発明において、第1のプライマーセットと第2のプライマーセットが共存するというときは、第1のプライマーセットと第2のプライマーセットに含まれる全てのプライマーが、連続する単一の液相中（即ち、核酸増幅反応液中）に存在することを意味する。
　本発明において、第2のプライマーセットによる核酸増幅反応が起きない条件としては、アレル特異的プライマーが当該変異を含む核酸にアニールしない温度条件を使用することが好ましい。より具体的には、第2のプライマーセットによる核酸増幅反応が起きない条件としては、アレル特異的プライマーの融解温度（Tm）より1～19℃高い、2～18℃高い、3～17℃高い、4～16℃高い、5～15℃高い、6～14℃高い、7～13℃高い、8～12℃高い、又は9～11℃高い温度条件、あるいは、1℃高い、2℃高い、3℃高い、4℃高い、5℃高い、6℃高い、7℃高い、8℃高い、9℃高い、10℃高い、11℃高い、12℃高い、13℃高い、14℃高い、15℃高い、16℃高い、17℃高い、18℃高い、19℃高い、20℃高い、温度条件を使用することが好ましい。
　本発明において、多型部位としては、一塩基多型を含む部位が好ましい。興味の対象である遺伝子の興味の対象である多型部位において、変異を有するアレルは変異アレルと呼ばれ、変異を有しないアレルは野生型アレルと呼ばれる。
　本発明において、野生型アレルとは、検出しようとする遺伝子変異の変異部位において、検出しようとする変異を有しないアレルを意味する。本発明において、野生型アレルとしては、EGFR遺伝子のエクソン20のコドン790のアミノ酸がTのアレルが好ましい。
　本発明において、変異アレルとは、検出しようとする遺伝子変異の変異部位において、検出しようとする変異を有するアレルを意味する。本発明において、変異アレルとしては、EGFR遺伝子のエクソン20のコドン790のアミノ酸がMのアレルが好ましい。
　本発明において、核酸試料中の変異アレルを定量する方法としては、第2のプライマーセットによる増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、溶出時間をx-軸、溶出されたDNAの量をy-軸として表した曲線における当該増幅産物のピーク面積から、その核酸試料中に含まれる変異アレルを定量する方法が好ましい。この場合、増幅産物のピーク面積は、例えば、当該ピークの両側の極小点(極小点が存在しない場合には最小点)を結んだ直線をベースラインとして、当該曲線と当該ベースラインに囲まれた領域の面積をピーク面積として求めることができる。既知の量の変異アレルを含む核酸試料を対照試料として使用し、当該対照試料について得られる増幅産物のピーク面積と比較することによって、興味の対象となる核酸試料中に含まれる変異アレルの絶対量を定量することができる。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　[実施例1]
　EGFR遺伝子エクソン20のT790M変異アレルの高感度検出(1)
　ヒトEGFR遺伝子のエクソン20のT790M変異を有するDNAとして、NCI-H1975細胞株より抽出及び精製したDNAを用い、上記変異を持たないDNAとしては、K562細胞株より抽出及び精製したDNAを用いて、本発明により設計した測定系の性能が確保される第1のプライマーセットの濃度の範囲を評価した。
　・プライマー
　第1PCR反応に用いる第1のプライマーセット(配列番号3及び4)を、T790M変異を挟む領域に設定し、そのうちリバースプライマーを、第2のプライマーセット(配列番号4及び5)のリバースプライマーとの共通プライマーとして設計した。第2のプライマーセットのフォワードプライマーは、T790M(2369C->T)変異に対応するアレル特異的プライマーであり、その3’末端より2番目のヌクレオチドの塩基が当該変異の変異型ヌクレオチドの塩基(T)に対応し、3’末端より3番目のヌクレオチドの塩基が標的核酸の対応するヌクレオチドの塩基と相補でない塩基(T)を有し、かつ、その他のヌクレオチドの塩基が当該標的核酸の対応するヌクレオチドの塩基と相補的である。配列番号3のプライマーと配列番号4のプライマーの組み合わせで得られる増幅産物の鎖長は79bp、配列番号4のプライマーと配列番号5のプライマーで得られる増幅産物の鎖長は65bpである。
　配列番号3(第1フォワードプライマー)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　配列番号4(第1・第2リバースプライマー)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　配列番号5(第2フォワードプライマー)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　・競合核酸
　EGFRエクソン20のコドン790の野生型配列を含むDNAの増幅を抑制するため、コドン790野生型配列に相補的な配列を有する競合核酸として、PNAを適用した。配列番号6に示される塩基配列を有するPNAの合成を競合核酸合成受託会社(Panagene社)に委託した。
　配列番号6(競合核酸;PNA)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　・鋳型DNAの調製
　本実施例の鋳型DNAは、NCI-H1975細胞株より抽出したDNA(mutant;mu)とK562細胞株より抽出したDNA(wild)を、合計濃度が30ng/μLとなるように、各割合で混合して調製した。混合比(mu/wildの%)は、0.01%、0%(コントロール)となるように、wild由来DNAとmutant由来DNAを混和してそれぞれ調製した。
　・試薬
　以下の試薬を含む25μLの反応溶液を調製し、サーマルサイクラー装置CFX96(バイオラッド社)を用いて増幅を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　・増幅条件
　以下の条件で行った。
　98℃：30秒
　第1PCR反応; 98℃：10秒、70℃：15秒(55サイクル)
　第2PCR反応; 98℃：10秒、56℃：15秒(30サイクル)
　第2のプライマーセットのアレル特異的プライマーと同じ向きである第1フォワードプライマーの濃度を減少させて増幅反応を行った際の第2PCR反応(混合比0.01%)の増幅曲線を図1に示す。第1PCR用のリバースプライマー濃度が0.5μMの場合、第1PCR用フォワードプライマー濃度が0.005～0.025μMの範囲、すなわち第1のプライマーセットにおいて、第2のプライマーセットのASPと同じ向きのプライマーの濃度を、他方の1/100～1/20にした場合に、第2PCR反応時の増幅を認めた。本発明の検出方法を用いることで、変異遺伝子の混在率が非常に低い0.01%の場合においても増幅が可能となった。
　[実施例2]
　EGFR遺伝子エクソン20のT790M変異アレルの高感度検出(2)
　ヒトEGFR遺伝子のエクソン20のT790M変異を有するDNAとして、NCI-H1975細胞株より抽出及び精製したDNAを用いて、本発明により設計した測定系の測定感度を、第1PCR用のフォワードプライマーを含まない従来技術のASP-PCR法と比較した。
　・鋳型DNAの調製
　本実施例の鋳型は、NCI-H1975細胞株より抽出したDNA(Mutant)を、濃度が0.01ng/μL、0.003ng/μLとなるように調製して用いた。
　・試薬
　以下の試薬を含む25μLの反応溶液を調製し、サーマルサイクラー装置CFX96(バイオラッド社)を用いて増幅を行った。
　(1) ASP-PCR法(従来技術)
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　(2)第1PCR用フォワードプライマーを用いる場合(本発明)
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　・増幅条件
　(1)ASP-PCR法(従来技術)
　98℃:30秒
　PCR反応; 98℃:10秒、56℃:15秒(85サイクル)
　(2)第1PCR用フォワードプライマーを用いる場合(本発明)
　実施例1と同じ条件で行った。
　第1PCR用フォワードプライマーを用いないASP-PCR法による増幅反応を行った場合の増幅曲線を図2[A]、[B]に示す。DNA量が0.05ng/反応の場合[A]、10回測定したうち10回全てで増幅を認めたが、増幅曲線の立ち上がりのサイクル数は45～60サイクルで大きくばらついた。また、DNA量が少ない0.015ng/反応の場合[B]、10回測定したうち6回は増幅を認めなかった。増幅を認めた4回についても増幅曲線の立ち上がりのサイクル数はばらついており、再現性は不良であった。
　一方、第1PCR用フォワードプライマーの濃度を、第1PCR用リバースプライマーの1/20の0.025μMとなるように用いて、増幅反応を行った場合の第1反応と第2反応の増幅曲線を図2[C]～[F]に示す。DNA量が0.05ng/反応の場合([C]及び[D])は、10回測定したうち10回すべてで増幅を認め、増幅曲線の立ち上がりのサイクル数も揃っており、再現よく増幅可能であることを示す。また、DNA量が少ない0.015ng/反応の場合([E]及び[F])でも、10回測定したうち10回すべてで増幅を認めた。増幅曲線の立ち上がりサイクル数が第1PCR反応では35～40サイクル、第2PCR反応では15～20サイクルとわずかにばらつくものの、変異遺伝子のDNA量が微量でも確実に増幅可能であることが確認された。
　以上から、第1のプライマーセットによるPCR反応を組み合わせる際に、第1PCR用フォワードプライマーの濃度を意図的に減少させ、第1のプライマーセットにおいて、第2のプライマーセットのASPと同じ向きのプライマーの濃度を、他方の1/100～1/20にすることで、ASP-PCR法の測定感度及び再現性が向上することが示された。
　[実施例3]
　EGFR遺伝子エクソン20のT790M変異アレルの高感度検出(3)
　ヒトEGFR遺伝子のエクソン20のT790M変異を有するDNAとして、NCI-H1975細胞株より抽出及び精製したDNAを、上記変異を持たないDNAとしては、K562細胞株より抽出及び精製したDNAを用いて、本発明により設計した測定系の特異性と測定感度を評価した。
　・鋳型DNAの調製
　本実施例の鋳型は、NCI-H1975細胞株より抽出したDNA(mutant;mu)とK562細胞株より抽出したDNA(wild)を、合計濃度が30ng/μLとなるように、各割合で混合して調製した。混合比(mu/wildの%)は、0.1%、0.03%、0.01%、0%(コントロール)となるように、wild由来DNAとmutant由来DNAを混和してそれぞれ調製した。また、NCI-H1975細胞株より抽出したDNA(mutant;mu)を0.003ng/μLとなるように調製し、混合比(mu/wildの%)が100%の鋳型とした。
　・試薬
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　・増幅条件
　実施例1と同じ条件で行った。
　・イオン交換クロマトグラフィー条件
　HPLC用アニオンイオン交換樹脂カラム: TSKgelDNA-NPR(東ソー株式会社)
　溶離液: 20mM Tris-HCl(pH8.6)、0.47-0.62M NaClグラジエント(10min)
　流速: 0.75mL/min
　カラムオーブン: 25℃
　検出器: UV波長260nm
　上記条件で得られたPCR増幅産物を、イオン交換クロマトグラフィーにより分離した際に検出された溶出ピークを図3に示す。wild由来DNAを鋳型とした場合は、明確な溶出ピークを認めなかったが、mutant由来DNA(100%)を鋳型とした場合、PCR増幅産物である6.3分付近にメインの溶出ピーク(矢印)を認め、Mutant由来DNAの混在比率が0.01%でも同様の明確な溶出ピークを確認できた。
　以上の結果から、本発明で設計した測定系で得られたPCR増幅産物を、イオン交換クロマトグラフィーによる分離で得られた特異溶出ピークの有無を検出することで、変異遺伝子を高感度で検出することができ、かつ、特異性の確保もできることが示された。
　[実施例4]
　EGFR遺伝子エクソン20のT790M変異アレルの定量(1)
　ヒトEGFR遺伝子のエクソン20のT790M変異を有するDNAとして、NCI-H1975細胞株より抽出及び精製したDNAを、上記変異を持たないDNAとしては、K562細胞株より抽出及び精製したDNAを用いて、本発明により設計した測定系の定量性を評価した。
　・鋳型DNAの調製
　本実施例の鋳型は、NCI-H1975細胞株より抽出したDNA(mutant;mu)とK562細胞株より抽出したDNA(wild)を、合計濃度が10ng/μLとなるように、各割合で混合して調製した。混合比(mu/wildの%)は、10%、3%、1%、0.3%、0.1%、0%となるように、wild由来DNAとmutant由来DNAを混和してそれぞれ調製した。
　・試薬
　実施例3と同じ条件で行った。
　・増幅条件
　98℃:30秒
　第1PCR反応; 98℃:10秒、70℃:15秒(55～15サイクル)
　第2PCR反応; 98℃:10秒、56℃:15秒(30～47サイクル)
　第1PCR反応と第2PCR反応のサイクル数を適当に組み合わせて増幅反応を行った際の第2PCRの増幅曲線及び最終の相対蛍光強度(PFU)値と変異アレルの割合(%)との相関関係を図4[A]～[R]に示す。第1PCR反応で生成する増幅産物の量は、通常、増幅反応が飽和期に到達する場合は、核酸試料中に含まれる遺伝子変異の割合（％）を反映しないので、第2PCR反応で生成する増幅産物も核酸試料中の遺伝子変異の割合を反映しないと考えられる。現に、第1PCR反応のサイクル数を55として増幅反応を飽和期に到達させた[A]～[C]の場合は、第2PCR反応の増幅曲線は核酸試料中に含まれる遺伝子変異の割合（％）を全く反映していないことが分かる。一方、[D]～[F]のごとく、第1PCR反応のサイクル数を35に減らすことで、第１PCRの増幅反応が飽和期に到達しない条件となり、続く第2PCR反応の途中で第1PCR用のプライマーによる核酸試料中に含まれる遺伝子変異の量を反映した増幅産物の増幅曲線が得られるようになったことが示された。さらに、第１PCR反応のサイクル数を32から15の範囲とすること、さらに加えて、第2PCR反応のサイクル数を30以上に設定することにより、第1PCR反応で得られた、核酸試料中に含まれる遺伝子変異の量を反映した増幅産物に対して、ASPを用いた第2PCR反応が特異性を維持しながら増幅反応を継続し、第2PCR反応の最終サイクルにおけるPFU値と変異アレルの割合(%)との関係に、より正確な相関関係が認められた（[G]～[R]）。
　以上の結果から、第1PCR反応が飽和期に到達する前に、核酸試料中に含まれる遺伝子変異の量を反映して生成した増幅産物に対して、継続して少なくとも第2のプライマーセットが作用する条件で、ASPを用いた核酸増幅反応により変異遺伝子を選択的に増幅させることで、変異アレルの割合(%)の定量性が維持されることが示された。
　[実施例5]
　EGFR遺伝子エクソン20のT790M変異アレルの定量(2)
　・鋳型DNAの調製
　実施例4と同じ条件で行った。
　・試薬
　実施例3と同じ条件で行った。
　・増幅条件
　98℃:30秒
　第1PCR反応; 98℃:10秒、70℃:15秒
　第2PCR反応; 98℃:10秒、56℃:15秒
　サイクル数; 第1PCR+第2PCR=62サイクルとなる組み合わせ
　・イオン交換クロマトグラフィー条件
　実施例3と同じ条件で行った。
　第1PCR反応と第2PCR反応のサイクル数が合わせて62になる組み合わせで増幅反応を行い、その増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにより分離及び検出した溶出ピーク(メインの溶出ピークを矢印で示す)を図5[A]、[C]、[E]、及び[G]に示し、メインの溶出ピークの面積と変異アレルの割合(%)との相関関係を図5[B]、[D]、[F]、及び[H]に示す。
　実施例4で、第2PCR反応後の蛍光強度と変異アレルの割合(%)の相関性で良好な結果が得られたサイクル数の組み合わせ条件においては、6.3分付近に変異アレル由来である増幅産物の明確な溶出ピークが認められ、さらに[A]～[F]においては、その溶出ピークの面積と変異アレルの割合(%)でも良好な相関関係を認めている。実施例4で定量性が十分得られなかった第1PCR反応の35サイクル条件では、溶出ピークの定量性は認められるものの、変異アレルの割合について十分な結果は得られなかった。
　以上の結果から、第1PCR反応が飽和期に到達する前に、核酸試料中に含まれる変異遺伝子のDNA量を反映して生成した増幅産物に対して、継続して少なくとも第2のプライマーセットが作用する条件で、ASPを用いた核酸増幅反応により変異遺伝子を選択的に増幅させた後、その増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、増幅産物のピーク面積を比較することで、変異アレルの割合(%)の定量性が確保されることが示された。
　本発明の変異遺伝子検出方法は、上皮増殖因子受容体に対するチロシンキナーゼ阻害薬の癌患者における感受性を予測するためのコンパニオン診断薬及びシステムの生産や、その他の個別化医療の基礎となる診断薬及びシステムの生産に利用することができる。

Claims (8)

  1. 　核酸試料中に含まれる遺伝子変異を、DNAポリメラーゼを用いた核酸増幅反応による増幅産物の有無で検出する方法であって、当該遺伝子の多型部位を挟むように設計された第1のプライマーセットと、当該変異を含む核酸から選択的に増幅するアレル特異的プライマーを1つ以上含む第2のプライマーセットが共存する核酸増幅反応液中において、
    　(a) 第2のプライマーセットによる核酸増幅反応が起きない条件下にて、当該遺伝子の野生型アレルの配列を有し、当該多型部位の全部又は一部にハイブリダイゼーションする競合核酸の存在下で、第1のプライマーセットによる核酸増幅反応により、変異アレルを含む核酸を増幅させ、増幅産物を得る工程を含み、
    　(b) 工程(a)の増幅産物を得る際に、第1のプライマーセットのプライマーの濃度を、第2のプライマーセットの濃度と比較して、減少させて増幅反応させる工程を含み、
    　(c) 工程(a)で得られた増幅産物に対して、少なくとも第2のプライマーセットが作用する条件で核酸増幅反応により変異アレルを含む核酸を選択的に増幅させることで、核酸試料中に含まれる遺伝子変異を検出する方法。
  2. 　前記の第2のプライマーセットによる核酸増幅反応が起きない条件が、当該アレル特異的プライマーが当該変異を含む核酸にアニールしない温度条件である、請求項1に記載の方法。
  3. 　第2のプライマーセットのアレル特異的プライマーでないプライマーが、第1のプライマーセットの一方のプライマーと共通して設計される、請求項1又は2に記載の方法。
  4. 　第1のプライマーセットにおいて、第2のプライマーセットのアレル特異的プライマーと同じ向きのプライマーの濃度が、他方のプライマーの濃度の1/100～1/20である、請求項1～3のいずれかに記載の方法。
  5. 　第2のプライマーセットによる増幅産物の有無を、イオン交換クロマトグラフィーにより分離された増幅産物のピークの有無により検出する工程を含む、請求項1～4のいずれかに記載の方法。
  6. 　核酸試料中に含まれる変異アレルを、DNAポリメラーゼを用いた核酸増幅反応による増幅産物を用いて定量する方法であって、当該遺伝子の多型部位を挟むように設計された第1のプライマーセットと、当該変異を含む核酸から選択的に増幅するアレル特異的プライマーを1つ以上含む第2のプライマーセットが共存する核酸増幅反応液中において、
    　(a) 第2のプライマーセットによる核酸増幅反応が起きない条件下にて、当該遺伝子の野生型アレルの配列を有し、当該多型部位の全部又は一部にハイブリダイゼーションする競合核酸の存在下で、第1のプライマーセットによる核酸増幅反応により、変異アレルを含む核酸を増幅させ、増幅産物を得る工程を含み、
    　(b) 工程(a)の増幅産物を得る際に、第1のプライマーセットによる核酸増幅反応が飽和期に到達する前に、核酸試料中に含まれる変異アレルのDNA量を反映して生成した増幅産物に対して、継続して少なくとも第2のプライマーセットが作用する条件で核酸増幅反応により、変異アレルを含む核酸を選択的に増幅させることで、核酸試料中に含まれる変異アレルを定量する方法。
  7. 　第1のプライマーセットによる核酸増幅反応のサイクル数を15～32回に設定し、さらに第2のプライマーセットによる核酸増幅反応のサイクル数を30～60回に設定し、2つの反応を組み合わせて連続で行う、請求項6に記載の方法。
  8. 　第2のプライマーセットによる増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、当該増幅産物のピーク面積から、その核酸試料中に含まれる変異アレルを定量する、請求項6又は7に記載の方法。
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