KR20200031615A - 변이 유전자 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 야생형 대립 유전자(야생형 알레르(wild-type allele))를 포함하는 핵산 시료에 있어서, 저빈도로 포함되는 돌연변이 유전자(변이 알레르(mutant allele))를 고감도로 검출하는 방법, 나아가 정량하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 흥미의 대상이 되는 유전자의 변이 부위를 사이에 두도록 설계된 제1 프라이머 세트와 당해 변이에 대응하는 ASP를 포함하는 제2 프라이머 세트를 혼합한 하나의 반응계에서, 당해 유전자의 야생형 대립 유전자로부터의 증폭 반응을 억제하는 경합 핵산을 포함하고, 특정한 프라이머 농도 조건을 선택하고, 또한 제1 및 제2 프라이머 세트에 의한 PCR 반응의 사이클수를 제어함으로써, 저빈도의 돌연변이 유전자로부터 증폭 산물을 얻는 것이 가능하고, 또한 정량성도 확보할 수 있다.

Description

변이 유전자 검출 방법
본 발명은 야생형 대립 유전자(야생형 알레르(wild-type allele))를 포함하는 핵산 시료에 있어서, 저빈도로 포함되는 돌연변이 유전자(변이 알레르(mutant allele))를 고감도로 검출 및 정량하는 방법에 관한 것이다.
유전자 변이에는, 유전적으로 계승되어지는 생식 세포 변이와 후천적으로 하나하나의 세포 내에서 야기되는 체세포 변이가 있다. 생식 세포 변이인 특정한 유전자의 1염기 다형(Single Nucleotide Polymorphism; SNP)이나 대표적인 체세포 변이인 점 변이(1염기 변이)가 각종 질병에 관련되어 있는 것이 보고되어 있어, 근년 그들의 염기 서열을 검출하는 것이, 특정한 약제의 효과가 기대되는 환자의 선별에 이용되고 있다.
예를 들어, 폐암의 치료약인 티로신 키나아제 저해제(TKI)의 약효 판단의 기초로서, 상피 성장 인자 수용체(EGFR)의 유전자 변이 검사가 행하여지고 있다. 이 검사는, 미량인 암 조직 검체를 사용하여 행하여지는 것, 및 정상 조직 및 암 조직 유래의 야생형 대립 유전자가 혼재하는 것으로부터, 고감도이며 또한 높은 특이성을 가질 것이 요구된다.
EGFR 유전자 변이 중에서, 특히 엑손 20의 코돈 790의 점 변이(T790M, 2369C->T)는 게피티닙이나 아파티닙 등의 제1 세대 및 제2 세대 TKI의 내성 변이로서 알려져 있다. 근년, 이 T790M 변이에 대하여 주효한 제3 세대의 TKI(오시머티닙)가 임상 응용되었지만, 폐암의 TKI 내성 및 재발이 보여진 환자에 대한 적용 조건으로서, T790M 변이의 검사가 요구되고 있다. 또한, T790M 변이에 의한 TKI 내성 및 폐암의 재발 징후를 간과하지 않기 위해서, 빈번한 횟수의 재생검(Re biopsy) 실시에 의한 조직 검체의 채취와 그 검체에서의 검사가 요구되게 되는데, 침습성이 높은 재생검은 환자에게 부담도 커서, 실시할 수 없는 경우도 있다. 그래서, 근년, 혈장 중에 흘러 나오는 암 조직 유래의 무세포 DNA(Cell free DNA)로부터 T790M 변이가 검출된 경우에도 오시머티닙을 처방하는 것이 가능해졌다. 그러나, 이 혈장 중 무세포 DNA는 미량이어서, 조직 검체로부터의 검출에 있어서 필요하게 되는 이상으로, 고감도의 변이 검출 방법이 필요하게 된다. 추가로, 폐암의 재발을 모니터링하기 위해서, T790M 변이의 양의 변화를 파악할 수 있는 정량 방법이 요망된다.
EGFR의 유전자 변이를 검출하는 방법으로서, 리얼타임 PCR법(비특허문헌 1)이나, 알레르 특이적 프라이머(Allele Specific Primer; ASP)를 사용한 ASP-PCR법과 Q 프로브에 의한 해리 곡선 해석을 조합한 MBP-QP법(비특허문헌 2)이 보고되어 있다. 이들 방법에 의한 검출 감도는 0.1 내지 1％ 정도로, 암 세포를 포함하는 것이 이미 확인된 조직 검체로부터의 검출에는 충분한 감도이지만, 재발 환자에게 있어서의 저빈도 변이의 검출에는 불충분하다고 보여진다. 근년, 이들 검출 방법보다도 100배 이상 고감도이며, 또한 정량이 가능한 디지털 PCR법이 등장하여, 이 방법을 사용하면 TKI 미치료 환자로부터 변이가 검출되는 등, 기존의 검출 방법으로는 검출 불가능했던 변이를 검출할 수 있음이 보고되어 있다(비특허문헌 3). 이러한 저빈도의 T790M 변이가 검출된 경우에도 제1, 2 세대 TKI의 내성이 되어 있는지, 제3 세대 TKI가 주효한지 등, 돌연변이 유전자의 비율과 약제 응답의 관계성을 평가해야 한다고 하는 생각이 널리 받아들여지고 있다. 이 관계성이 명확해지면, 내성 돌연변이 유전자의 비율에 따라 적절한 약제 선택이 가능하게 된다. 그러나, 고감도로 정량이 가능한 디지털 PCR법은 조작이 번잡하고, 또한 고가의 전용 장치가 필요하다.
전술한 ASP-PCR법은, EGFR이나 RAS 등의 유전자 변이(특히, 점 변이)를 검출하기 위해서, 간편하며 비교적 고감도인 방법인데, 이 방법으로 고감도의 변이 검출계를 구축하기 위해서는, ASP의 특이성 향상이 불가결하다. ASP는, 일반적으로, 3' 말단 1 내지 3염기 중 어느 1염기 다형 등의 유전자 다형의 변이형 뉴클레오티드에 대응하도록 설계되고, 또한 다형 부위 이외의 장소에 표적 핵산과 상보가 아닌 염기 서열(미스매치)을 인위적으로 가함으로써 특이성을 확보하도록 설계된다(특허문헌 1, 특허문헌 2, 및 출원인의 본건 출원 우선일에 있어서의 미공개 특허 출원(PCT/JP2017/12820)). 그러나, 미스매치를 인위적으로 첨가한 ASP에서는, 완전 매치의 프라이머와 비교하여 친화성이 약해지므로, 증폭 효율의 저하를 초래하는 경우가 있다.
1염기 변이를 검출하기 위한 ASP는 1염기의 차이에 의해 특이성을 확보하기 위해서, 프라이머 길이를 짧게 하는 것이 유효하다. 한편, 프라이머 길이가 짧은 ASP로 증폭을 행하는 경우, PCR의 어닐링 온도를 낮출 필요가 있는데, 이에 의해 비특이 증폭의 발생이 염려된다. 이러한 비특이 증폭은, 하나의 반응계에서 복수의 프라이머를 사용하여 복수 변이를 동시에 증폭하는 경우에는(멀티플렉스 PCR), 특히 발생하기 쉽다.
비특이 증폭을 저감시키는 방법으로서, 네스티드 PCR(Nested PCR)이 알려져 있다. 이 방법은 표적 서열을 사이에 두는 제1 프라이머 세트에 의해 제1 증폭 반응을 실시한 후, 이 제1 반응 용액의 1/20 내지 1/50을 제2 증폭 반응의 주형으로 하고, 제1 프라이머 세트보다도 내측에 설계한 제2 프라이머 세트에 의해, 목적으로 하는 서열을 증폭하는 방법이다. 이 방법은 제1 프라이머 세트에 의한 미스 프라이밍이 원인으로 비특이적인 산물이 증폭된 경우에도, 제2 프라이머 세트에서 동일한 비특이적인 영역이 증폭될 가능성은 낮은 것을 이용하여, 표적 서열을 포함하는 영역을 효율적으로 증가시킬 수 있다. 그러나, PCR 반응을 2회 실시하기 위해서, 조작이 번잡하고 시간도 걸린다. 또한, 제1 PCR 반응 후, 그 반응 용액을 제2 PCR 반응의 주형으로서 사용하기 때문에, 다량의 증폭 산물을 포함하는 반응 용액의 덮개를 개방할 필요가 있어, 측정 환경에 대한 증폭 산물의 오염(상호 오염)이 염려된다.
일본 특허 공개 제2005-160430호 공보 일본 특허 제3937136호
Biomed Res Int. 2013; 2013: 385087. J Thorac Oncol. 2011 Oct; 6(10): 1639-48. Clin Cancer Res. 2015 Aug 1; 21(15): 3552-60.
본 발명은 상기 종래의 과제를 해결하기 위해서, 야생형 대립 유전자(야생형 알레르(wild-type allele))를 포함하는 핵산 시료에 있어서, 저빈도로 포함되는 돌연변이 유전자(변이 알레르(mutant allele))를 고감도로 검출하는 방법, 나아가 정량하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 네스티드 PCR을 호모지니어스한 반응계에서 실시하는 것을 시도하고, 흥미의 대상이 되는 유전자의 변이 부위를 사이에 두도록 설계된 제1 프라이머 세트와 당해 변이에 대응하는 ASP를 포함하는 제2 프라이머 세트를 혼합한 하나의 반응계에서, 당해 유전자의 야생형 대립 유전자로부터의 증폭 반응을 억제하는 경합 핵산을 포함하고, 특정한 프라이머 농도 조건을 선택하고, 또한 수의에 의해 제1 및 제2 프라이머 세트에 의한 PCR 반응의 사이클수를 제어함으로써, 저빈도의 돌연변이 유전자로부터 고감도로 증폭 산물을 얻는 것이 가능하고, 또한 정량성도 확보할 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉 본 발명은 다음 [1] 내지 [8]을 제공하는 것이다.
[1] 핵산 시료 중에 포함되는 유전자 변이를, DNA 폴리메라아제를 사용한 핵산 증폭 반응에 의한 증폭 산물의 유무로 검출하는 방법으로서, 당해 유전자의 다형 부위를 사이에 두도록 설계된 제1 프라이머 세트와, 당해 변이를 포함하는 핵산으로부터 선택적으로 증폭하는 알레르 특이적 프라이머를 하나 이상 포함하는 제2 프라이머 세트가 공존하는 핵산 증폭 반응액 중에 있어서,
(a) 제2 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응이 일어나지 않는 조건 하에서, 당해 유전자의 야생형 알레르의 서열을 갖고, 당해 다형 부위의 전부 또는 일부에 하이브리다이제이션하는 경합 핵산의 존재 하에서, 제1 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응에 의해, 변이 알레르를 포함하는 핵산을 증폭시켜 증폭 산물을 얻는 공정을 포함하고,
(b) 공정 (a)의 증폭 산물을 얻을 때에, 제1 프라이머 세트의 프라이머의 농도를, 제2 프라이머 세트의 농도와 비교해 감소시켜서 증폭 반응시키는 공정을 포함하고,
(c) 공정 (a)에서 얻어진 증폭 산물에 대하여 적어도 제2 프라이머 세트가 작용하는 조건에서 핵산 증폭 반응에 의해 변이 알레르를 포함하는 핵산을 선택적으로 증폭시킴으로써, 핵산 시료 중에 포함되는 유전자 변이를 검출하는 방법.
[2] 상기 제2 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응이 일어나지 않는 조건이, 당해 알레르 특이적 프라이머가 당해 변이를 포함하는 핵산으로 어닐하지 않는 온도 조건인, 상기 [1]에 기재된 방법.
[3] 제2 프라이머 세트의 알레르 특이적 프라이머가 아닌 프라이머가, 제1 프라이머 세트의 한쪽 프라이머와 공통되게 설계되는, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[4] 제1 프라이머 세트에 있어서, 제2 프라이머 세트의 알레르 특이적 프라이머와 동일한 방향의 프라이머의 농도가, 다른 쪽 프라이머의 농도의 1/100 내지 1/20인, 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[5] 제2 프라이머 세트에 의한 증폭 산물의 유무를, 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리된 증폭 산물의 피크의 유무에 의해 검출하는 공정을 포함하는, 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[6] 핵산 시료 중에 포함되는 변이 알레르를, DNA 폴리메라아제를 사용한 핵산 증폭 반응에 의한 증폭 산물을 사용하여 정량하는 방법으로서, 당해 유전자의 다형 부위를 사이에 두도록 설계된 제1 프라이머 세트와, 당해 변이를 포함하는 핵산으로부터 선택적으로 증폭하는 알레르 특이적 프라이머를 하나 이상 포함하는 제2 프라이머 세트가 공존하는 핵산 증폭 반응액 중에 있어서,
(a) 제2 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응이 일어나지 않는 조건 하에서, 당해 유전자의 야생형 알레르의 서열을 갖고, 당해 다형 부위의 전부 또는 일부에 하이브리다이제이션하는 경합 핵산의 존재 하에서, 제1 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응에 의해, 변이 알레르를 포함하는 핵산을 증폭시켜 증폭 산물을 얻는 공정을 포함하고,
(b) 공정 (a)의 증폭 산물을 얻을 때에, 제1 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응이 포화기에 도달하기 전에, 핵산 시료 중에 포함되는 변이 알레르의 DNA량을 반영하여 생성한 증폭 산물에 대하여, 계속해서 적어도 제2 프라이머 세트가 작용하는 조건에서 핵산 증폭 반응에 의해, 변이 알레르를 포함하는 핵산을 선택적으로 증폭시킴으로써, 핵산 시료 중에 포함되는 변이 알레르를 정량하는 방법.
[7] 제1 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응의 사이클수를 15 내지 32회로 설정하고, 추가로 제2 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응의 사이클수를 30 내지 60회로 설정하고, 2개의 반응을 조합하여 연속으로 행하는, 상기 [6]에 기재된 방법.
[8] 제2 프라이머 세트에 의한 증폭 산물을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리하고, 당해 증폭 산물의 피크 면적으로부터, 그 핵산 시료 중에 포함되는 변이 알레르를 정량하는, 상기 [6] 또는 [7]에 기재된 방법.
본 발명에 따르면, 저빈도로 포함되는 돌연변이 유전자를 특이적으로, 또한 신속하게 검출 및 정량하는 것이 가능해진다. 예를 들어, 폐암 환자에 있어서의 EGFR 유전자 변이 검출과 같이, 돌연변이 유전자(예를 들어, T790M)에 대응하는 야생형 대립 유전자가 시료 중에 다량으로 혼재하는 경우에도, 고감도로 변이를 검출 및 정량할 수 있음으로써, 제1, 제2 세대 TKI의 내성의 리스크 판단이나 모니터링에 의한 임상으로의 응용을 가능하게 한다.
도 1은 제1 PCR용의 정방향 프라이머의 농도를 바꾸어서 PCR 증폭한 경우의 제2 PCR 반응 30사이클의 증폭 곡선을 도시한다.
도 2a는 ASP-PCR법에 의한 변이형(Mutant) 0.05ng으로부터 PCR 증폭한 경우의 증폭 곡선을 도시한다. 도 2b는 ASP-PCR법에 의한 변이형 0.015ng으로부터 PCR 증폭한 경우의 증폭 곡선을 도시한다. 도 2c는 제1 PCR용의 정방향 프라이머(0.025μM)를 사용하여 변이형 0.05ng으로부터 PCR 증폭한 경우의 제1 PCR 반응 55사이클의 증폭 곡선을 도시한다. 도 2d는 제1 PCR용의 정방향 프라이머(0.025μM)를 사용하여 변이형 0.05ng으로부터 PCR 증폭한 경우의 제2 PCR 반응 30사이클의 증폭 곡선을 도시한다. 도 2e는 제1 PCR용의 정방향 프라이머(0.025μM)를 사용하여 변이형 0.015ng으로부터 PCR 증폭한 경우의 제1 PCR 반응 55사이클의 증폭 곡선을 도시한다. 도 2f는 제1 PCR용의 정방향 프라이머(0.025μM)를 사용하여 변이형 0.015ng으로부터 PCR 증폭한 경우의 제2 PCR 반응 30사이클의 증폭 곡선을 도시한다.
도 3은 제1 PCR 반응 55사이클, 제2 PCR 반응 30사이클 후의 증폭 산물의 이온 교환 크로마토그래피에 의한 용출 피크를 도시한다.
도 4a는 제1 PCR 반응 55사이클의 증폭 곡선을 도시한다. 도 4b는 상기 도 4a의 제1 PCR 반응 55사이클 후, 제2 PCR 반응 30사이클의 증폭 곡선을 도시한다. 도 4c는 상기 도 4b의 제2 PCR 반응 30사이클 시의 RFU값과 T790M 변이 알레르 비율의 상관성을 도시한다. 도 4d는 제1 PCR 반응 35사이클의 증폭 곡선을 도시한다. 도 4e는 상기 도 4d의 제1 PCR 반응 35사이클 후, 제2 PCR 반응 30사이클의 증폭 곡선을 도시한다. 도 4f는 상기 도 4e의 제2 PCR 반응 30사이클 시의 RFU값과 T790M 변이 알레르 비율의 상관성을 도시한다. 도 4g는 제1 PCR 반응 32사이클의 증폭 곡선을 도시한다. 도 4h는 상기 도 4g의 제1 PCR 반응 32사이클 후, 제2 PCR 반응 30사이클의 증폭 곡선을 도시한다. 도 4i는 상기 도 4h의 제2 PCR 반응 30사이클 시의 RFU값과 T790M 변이 알레르 비율의 상관성을 도시한다. 도 4j는 제1 PCR 반응 25사이클의 증폭 곡선을 도시한다. 도 4k는 상기 도 4j의 제1 PCR 반응 25사이클 후, 제2 PCR 반응 30사이클의 증폭 곡선을 도시한다. 도 4l은 상기 도 4k의 제2 PCR 반응 30사이클 시의 RFU값과 T790M 변이 알레르 비율의 상관성을 도시한다. 도 4m은 제1 PCR 반응 25사이클의 증폭 곡선을 도시한다. 도 4n은 상기 도 4m의 제1 PCR 반응 25사이클 후, 제2 PCR 반응 37사이클의 증폭 곡선을 도시한다. 도 4o는 상기 도 4n의 제2 PCR 반응 37사이클 시의 RFU값과 T790M 변이 알레르 비율의 상관성을 도시한다. 도 4p는 제1 PCR 반응 15사이클의 증폭 곡선을 도시한다. 도 4q는 상기 도 4p의 제1 PCR 반응 15사이클 후, 제2 PCR 반응 47사이클의 증폭 곡선을 도시한다. 도 4r은 상기 도 4q의 제2 PCR 반응 47사이클 시의 RFU값과 T790M 변이 알레르 비율의 상관성을 도시한다.
도 5a는 제1 PCR 반응 15사이클, 제2 PCR 반응 47사이클 후의 증폭 산물 용출 피크를 도시한다. 도 5b는 상기 도 5a의 증폭 산물 용출 피크 면적과 T790M 변이 알레르 비율의 상관성을 도시한다. 도 5c는 제1 PCR 반응 25사이클, 제2 PCR 반응 37사이클 후의 증폭 산물 용출 피크를 도시한다. 도 5d는 상기 도 5c의 증폭 산물 용출 피크 면적과 T790M 변이 알레르 비율의 상관성을 도시한다. 도 5e는 제1 PCR 반응 32사이클, 제2 PCR 반응 30사이클 후의 증폭 산물 용출 피크를 도시한다. 도 5f는 상기 도 5e의 증폭 산물 용출 피크 면적과 T790M 변이 알레르 비율의 상관성을 도시한다. 도 5g는 제1 PCR 반응 35사이클, 제2 PCR 반응 27사이클 후의 증폭 산물 용출 피크를 도시한다. 도 5h는 상기 도 5g의 증폭 산물 용출 피크 면적과 T790M 변이 알레르 비율의 상관성을 도시한다.
이하에, 발명을 실시하기 위한 일 형태를 설명하지만, 본 발명은 이들 실시 형태에 전혀 한정되지 않으며, 그의 요지를 일탈하지 않는 범위에 있어서, 여러가지 양태로 실시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 제2 프라이머 세트의 알레르 특이적 프라이머(ASP)가 아닌 프라이머는, 제1 프라이머 세트의 한쪽 프라이머와 공통되게 설계할 수도 있다(이하, 공통되게 설계하는 프라이머를 「공통 프라이머(common primer)」라고 칭하는 경우가 있다). 즉, 공통 프라이머는, 제1 프라이머 세트와 제2 프라이머 세트의 양쪽에 있어서 역할을 한다. 이 경우, 공통 프라이머의 농도는, 제2 프라이머 세트의 농도에 맞추는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 제1 PCR 반응 시에 공존하고 있는 제2 프라이머 세트가 작용하지 않도록 하기 위해서, 제1 프라이머 세트의 Tm값의 가장 낮은 값이, 제2 프라이머 세트의 Tm값의 가장 낮은 값과 비교하여 10℃ 이상 높아지도록 설계하고, 또한 증폭 반응 온도의 차를 10℃ 이상으로 하는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, 제1 PCR 반응 시에 공존하고 있는 제2 프라이머 세트가 작용하지 않도록 하기 위해서, 제2 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응이 일어나지 않는 조건을 채용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 제1 프라이머 세트의 각 프라이머의 농도를, 제2 프라이머 세트의 ASP의 농도의 1/100 내지 1/20으로 하는 것이 바람직하다. 이 경우, 제1 프라이머 세트의 각 프라이머의 농도는, 한쪽이 다른 쪽의 100배, 20배, 또는 10배 이내인 것이 바람직하고, 제2 프라이머 세트의 각 프라이머의 농도는, 한쪽이 다른 쪽의 100배, 20배, 또는 10배 이내인 것이 바람직하다. 또한, 제2 프라이머 세트의 ASP가 아닌 프라이머를, 제1 프라이머 세트의 한쪽 프라이머와 공통되게 설계하는 경우에는, 제1 프라이머 세트에 있어서, 제2 프라이머 세트의 ASP와 동일한 방향의 프라이머의 농도를, 공통 프라이머의 농도의 1/100 내지 1/20으로 하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 제1 프라이머 세트에 있어서의, 제2 프라이머 세트의 ASP와 동일한 방향의 프라이머의 농도로서는, 0.010 내지 0.100μM, 0.020 내지 0.050μM, 또는 0.025 내지 0.040μM인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 돌연변이 유전자의 정량(야생형 대립 유전자에 대한 비율의 측정 및/또는 돌연변이 유전자의 카피수 측정)을 행하기 위해서는, 돌연변이 유전자의 변이 부위를 포함하는 검출 영역을 선택적으로 증폭시키는 조건이면 특별히 제한없이 채용할 수 있지만, 제1 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응이 대수기(exponential phase)를 경과하여 포화기(saturation phase)에 도달하기 전에, 적어도 제2 프라이머 세트가 작용하는 조건으로 변경해서(예를 들어, 증폭 반응 온도를 저하시켜서) 핵산 증폭 반응을 행하는 것이 바람직하다. 적합하게는, 제1 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응의 사이클수를 15 내지 32회, 16회 내지 31회, 17회 내지 30회, 18회 내지 29회, 19회 내지 28회, 20회 내지 27회, 21회 내지 26회, 22회 내지 25회, 또는 23회 내지 24회, 혹은 15회, 16회, 17회, 18회, 19회, 20회, 21회, 22회, 23회, 24회, 25회, 26회, 27회, 28회, 29회, 30회, 31회, 또는 32회로 설정하고, 추가로 제2 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응의 사이클수를 30회 내지 60회, 31회 내지 59회, 32회 내지 58회, 33회 내지 57회, 34회 내지 56회, 35회 내지 55회, 36회 내지 54회, 37회 내지 53회, 38회 내지 52회, 39회 내지 51회, 40회 내지 50회, 41회 내지 49회, 42회 내지 48회, 43회 내지 47회, 또는 44회 내지 46회, 혹은 30회, 31회, 32회, 33회, 34회, 35회, 36회, 37회, 38회, 39회, 40회, 41회, 42회, 43회, 44회, 45회, 46회, 47회, 48회, 49회, 50회, 51회, 52회, 53회, 54회, 55회, 56회, 57회, 58회, 59회, 또는 60회로 설정하고, 2개의 반응을 조합하여 연속으로 행하는 것을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「핵산 증폭 반응이 포화기에 도달한다」라고 할 때는, 이하의 (1) 또는 (2) 중 적어도 어느 하나의 경우에 해당하는 상황을 의미한다: (1) N회째의 사이클의 핵산 증폭 반응 후에 있어서의 증폭 산물의 양이, N-1회째의 사이클의 핵산 증폭 반응 후에 있어서의 증폭 산물의 양과 비교하여 1.3배 이하로 된 경우; (2) 핵산 증폭 반응의 사이클수를 x-축, 당해 사이클의 핵산 증폭 반응 후에 있어서의 증폭 산물의 양을 y-축으로서 플롯한 곡선에 변곡점이 나타난 경우(2회 미분이 양이 된 경우).
본 발명에 있어서, 제1 증폭 산물의 쇄길이는 250bp 이하 또한 50bp 이상인 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, 혈중의 무세포 DNA를 검출하는 경우, 제1 증폭 산물의 쇄길이는 120bp 이하 또한 50bp 이상인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 경합 핵산에는 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 및 3' 말단부터 DNA 폴리메라아제에 의한 DNA 합성 반응이 일어나지 않도록 3' 말단을 인산화 등의 수식을 실시한 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 경합 핵산의 농도는, 제1 프라이머 세트에 의한 증폭에 있어서, 검출 대상이 아닌 야생형 대립 유전자의 증폭을 억제하고, 검출 대상인 돌연변이 유전자의 증폭을 저해하지 않는 농도인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는, 경합 핵산의 농도는, 0.01 내지 1.00μM, 0.01 내지 0.75μM, 0.02 내지 0.50μM, 0.03 내지 0.30μM, 0.04 내지 0.25μM, 0.05 내지 0.20μM, 0.06 내지 0.17μM, 0.07 내지 0.14μM, 0.08 내지 0.13μM, 0.09 내지 0.11μM인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 경합 핵산의 서열은, 변이를 검출하려고 하는 유전자의 야생형 알레르의 다형 부위를 포함하는 적어도 10뉴클레오티드, 바람직하게는 10 내지 30뉴클레오티드, 11 내지 29뉴클레오티드, 12 내지 28뉴클레오티드, 13 내지 27뉴클레오티드, 14 내지 26뉴클레오티드, 15 내지 25뉴클레오티드, 16 내지 24뉴클레오티드, 17 내지 23뉴클레오티드, 18 내지 22뉴클레오티드, 또는 19 내지 21뉴클레오티드, 혹은 10뉴클레오티드, 11뉴클레오티드, 12뉴클레오티드, 13뉴클레오티드, 14뉴클레오티드, 15뉴클레오티드, 16뉴클레오티드, 17뉴클레오티드, 18뉴클레오티드, 19뉴클레오티드, 20뉴클레오티드, 21뉴클레오티드, 22뉴클레오티드, 23뉴클레오티드, 24뉴클레오티드, 25뉴클레오티드, 26뉴클레오티드, 27뉴클레오티드, 28뉴클레오티드, 29뉴클레오티드, 또는 30뉴클레오티드 서열과 완전히 일치하는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, 경합 핵산의 서열은, 변이를 검출하려고 하는 유전자의 DNA의 이중쇄 중, 어느 쇄의 서열을 채용해도 된다. 본 발명에 있어서, 경합 핵산의 길이는, 바람직하게는 10 내지 40뉴클레오티드, 11 내지 39뉴클레오티드, 12 내지 38뉴클레오티드, 13 내지 37뉴클레오티드, 14 내지 36뉴클레오티드, 15 내지 35뉴클레오티드, 16 내지 34뉴클레오티드, 17 내지 33뉴클레오티드, 18 내지 32뉴클레오티드, 19 내지 31뉴클레오티드, 20 내지 30뉴클레오티드, 21 내지 29뉴클레오티드, 22 내지 28뉴클레오티드, 23 내지 27뉴클레오티드, 24 내지 26뉴클레오티드, 25 내지 25뉴클레오티드, 26 내지 34뉴클레오티드, 27 내지 33뉴클레오티드, 28 내지 32뉴클레오티드, 혹은 29 내지 31뉴클레오티드, 또는 10뉴클레오티드, 11뉴클레오티드, 12뉴클레오티드, 13뉴클레오티드, 14뉴클레오티드, 15뉴클레오티드, 16뉴클레오티드, 17뉴클레오티드, 18뉴클레오티드, 19뉴클레오티드, 20뉴클레오티드, 21뉴클레오티드, 22뉴클레오티드, 23뉴클레오티드, 24뉴클레오티드, 25뉴클레오티드, 26뉴클레오티드, 27뉴클레오티드, 28뉴클레오티드, 29뉴클레오티드, 30뉴클레오티드, 31뉴클레오티드, 32뉴클레오티드, 33뉴클레오티드, 34뉴클레오티드, 35뉴클레오티드, 36뉴클레오티드, 37뉴클레오티드, 38뉴클레오티드, 39뉴클레오티드, 40뉴클레오티드, 41뉴클레오티드, 42뉴클레오티드, 43뉴클레오티드, 44뉴클레오티드, 45뉴클레오티드, 46뉴클레오티드, 47뉴클레오티드, 48뉴클레오티드, 49뉴클레오티드, 혹은 50뉴클레오티드이다. 본 발명에 있어서, 경합 핵산에 있어서의 다형 부위의 위치는, 당해 다형 부위의 전부 또는 일부가 당해 경합 핵산의 서열에 포함되는 위치이면, 어디여도 상관없다. 당해 다형 부위의 전부가 당해 경합 핵산의 서열에 포함되는 경우에는, 일 형태에 있어서는, 당해 다형 부위는 5'측으로부터 전체 길이의 1/10부터 9/10 사이의 뉴클레오티드에 대응하는 것이 바람직하다. 이 경우, 예를 들어, 길이가 49뉴클레오티드인 경합 핵산에 대해서는, 다형 부위는, 4.9(=49×1/10)부터 44.1 사이의 뉴클레오티드, 즉, 5번째부터 44번째의 뉴클레오티드에 대응하는 것이 바람직하다. 다른 양태에 있어서는, 당해 다형 부위는 5'측으로부터 전체 길이의 2/10부터 8/10 사이의 뉴클레오티드, 3/10부터 7/10 사이의 뉴클레오티드, 또는 4/10부터 6/10 사이의 뉴클레오티드에 대응하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 제2 프라이머 세트에 의한 증폭 산물을 검출 또는 정량하는 방법으로서는, SYBR(등록 상표) Green 등의 인터칼레이터를 사용하여, 발생한 형광 강도를 측정하는 방법이 바람직한데, 더욱 바람직한 방법으로서는, 증폭 산물을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리하고, 그의 피크의 존재 유무 및 피크 면적의 비교에 의해 행하는 방법이 바람직하다. 증폭 산물의 피크는, 통상 260㎚에 있어서의 흡광도 측정으로 검출되는데, 5' 말단에 형광 색소를 표지한 ASP를 사용함으로써 그 증폭 산물은 형광 검출기로 검출 가능하게 되므로, ASP 이외의 비특이 증폭 산물과 구별하는 경우에는 유용하다. 그 때에 사용되는 형광 색소로서는, 예를 들어, Alexa Fluor(등록 상표) 시리즈, Cy(등록 상표) 시리즈, ATTO 시리즈, DY 시리즈, DyLight(등록 상표) 시리즈, FAM, TAMRA 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 핵산 시료로서는, 야생형 알레르와 변이 알레르가 혼재하는 시료가 바람직하고, 특히, 야생형 알레르에 대하여 변이 알레르가 저빈도로 혼재하거나 또는 혼재하는 것이 의심되는 시료가 바람직하다. 본 명세서에 있어서, 「저빈도」란, 시료 중의 야생형 알레르의 DNA(wild)와 변이 알레르의 DNA(mu)의 혼합비(mu/wild의 ％)가 0.001 내지 0.01％, 0.001 내지 0.02％, 0.001 내지 0.05％, 0.001 내지 0.1％, 0.001 내지 0.2％, 0.001 내지 0.5％, 0.001 내지 1％, 0.001 내지 2％, 0.001 내지 5％, 0.001 내지 10％, 0.002 내지 0.01％, 0.002 내지 0.02％, 0.002 내지 0.05％, 0.002 내지 0.1％, 0.002 내지 0.2％, 0.002 내지 0.5％, 0.002 내지 1％, 0.002 내지 2％, 0.002 내지 5％, 0.002 내지 10％, 0.005 내지 0.01％, 0.005 내지 0.02％, 0.005 내지 0.05％, 0.005 내지 0.1％, 0.005 내지 0.2％, 0.005 내지 0.5％, 0.005 내지 1％, 0.005 내지 2％, 0.005 내지 5％, 0.005 내지 10％, 0.01 내지 0.01％, 0.01 내지 0.02％, 0.01 내지 0.05％, 0.01 내지 0.1％, 0.01 내지 0.2％, 0.01 내지 0.5％, 0.01 내지 1％, 0.01 내지 2％, 0.01 내지 5％, 혹은 0.01 내지 10％, 또는 0.001％, 0.002％, 0.005％, 0.01％, 0.02％, 0.05％, 0.1％, 0.2％, 0.5％, 1％, 2％, 5％, 혹은 10％인 것을 의미한다. 시료로서는, 티로신 키나아제 저해제(TKI)에 대하여 감수성이었던 적이 있는 암 환자의 암 조직 유래의 생체 시료가 바람직하다. 또한, 본 명세서에 있어서, 「고감도」란, 시료 중의 변이 알레르의 DNA의 농도가, 0.0001 내지 0.001ng/μL, 0.0001 내지 0.003ng/μL, 0.0001 내지 0.01ng/μL, 0.0001 내지 0.03ng/μL, 0.0001 내지 0.1ng/μL, 0.0001 내지 0.3ng/μL, 0.0001 내지 1ng/μL, 0.0003 내지 0.001ng/μL, 0.0003 내지 0.003ng/μL, 0.0003 내지 0.01ng/μL, 0.0003 내지 0.03ng/μL, 0.0003 내지 0.1ng/μL, 0.0003 내지 0.3ng/μL, 0.0003 내지 1ng/μL, 0.001 내지 0.003ng/μL, 0.001 내지 0.01ng/μL, 0.001 내지 0.03ng/μL, 0.001 내지 0.1ng/μL, 0.001 내지 0.3ng/μL, 0.001 내지 1ng/μL, 0.003 내지 0.01ng/μL, 0.003 내지 0.03ng/μL, 0.003 내지 0.1ng/μL, 0.003 내지 0.3ng/μL, 0.003 내지 1ng/μL, 0.01 내지 0.03ng/μL, 0.01 내지 0.1ng/μL, 0.01 내지 0.3ng/μL, 0.01 내지 1ng/μL, 0.03 내지 0.1ng/μL, 0.03 내지 0.3ng/μL, 혹은 0.03 내지 1ng/μL, 또는 0.0001ng/μL, 0.0003ng/μL, 0.001ng/μL, 0.003ng/μL, 0.01ng/μL, 0.03ng/μL, 0.1ng/μL, 0.3ng/μL, 혹은 1ng/μL의 경우에, 핵산 시료 중에 포함되는 유전자 변이를 검출할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 유전자 변이로서는, EGFR 유전자의 엑손 20의 코돈 790의 점 변이(T790M, 2369C->T)가 바람직하다. EGFR 유전자의 엑손 20의 코돈 790의 주위 서열을 서열 번호 1(야생형) 및 서열 번호 2(변이형)에 나타내었다.
(EGFR 유전자의 T790M 야생 서열 [ACG] 프래그먼트)
Figure pct00001
(EGFR 유전자의 T790M 변이 서열 [ATG] 프래그먼트)
Figure pct00002
본 발명에 있어서, 핵산 증폭 반응으로서는, 폴리메라아제 연쇄 반응법이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 알레르 특이적 프라이머로서는, 그의 3' 말단으로부터 2번째의 뉴클레오티드의 염기가 당해 변이의 변이형 뉴클레오티드의 염기에 대응하고, 3' 말단으로부터 3번째의 뉴클레오티드의 염기가 표적 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보가 아닌 염기를 갖고, 또한 기타의 뉴클레오티드의 염기가 당해 표적 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적인 프라이머가 바람직하다. 또한, 본 발명의 다른 양태에 있어서는, 알레르 특이적 프라이머는, 그의 3' 말단으로부터 3번째의 뉴클레오티드의 염기가 당해 변이의 변이형 뉴클레오티드의 염기에 대응하고, 3' 말단으로부터 2번째의 뉴클레오티드의 염기가 표적 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보가 아닌 염기를 갖고, 또한 기타의 뉴클레오티드의 염기가 당해 표적 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적인 프라이머가 바람직하다.
본 발명에 있어서, 제1 프라이머 세트와 제2 프라이머 세트가 공존한다고 할 때는, 제1 프라이머 세트와 제2 프라이머 세트에 포함되는 모든 프라이머가, 연속하는 단일의 액상 중(즉, 핵산 증폭 반응액 중)에 존재하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 제2 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응이 일어나지 않는 조건으로서는, 알레르 특이적 프라이머가 당해 변이를 포함하는 핵산으로 어닐하지 않는 온도 조건을 사용하는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는, 제2 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응이 일어나지 않는 조건으로서는, 알레르 특이적 프라이머의 융해 온도(Tm)보다 1 내지 19℃ 높은, 2 내지 18℃ 높은, 3 내지 17℃ 높은, 4 내지 16℃ 높은, 5 내지 15℃ 높은, 6 내지 14℃ 높은, 7 내지 13℃ 높은, 8 내지 12℃ 높은, 또는 9 내지 11℃ 높은 온도 조건, 혹은 1℃ 높은, 2℃ 높은, 3℃ 높은, 4℃ 높은, 5℃ 높은, 6℃ 높은, 7℃ 높은, 8℃ 높은, 9℃ 높은, 10℃ 높은, 11℃ 높은, 12℃ 높은, 13℃ 높은, 14℃ 높은, 15℃ 높은, 16℃ 높은, 17℃ 높은, 18℃ 높은, 19℃ 높은, 20℃ 높은, 온도 조건을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 다형 부위로서는, 1염기 다형을 포함하는 부위가 바람직하다. 흥미의 대상인 유전자의 흥미의 대상인 다형 부위에 있어서, 변이를 갖는 알레르는 변이 알레르라고 불리고, 변이를 갖지 않는 알레르는 야생형 알레르라고 불린다.
본 발명에 있어서, 야생형 알레르란, 검출하려고 하는 유전자 변이의 변이 부위에 있어서, 검출하려고 하는 변이를 갖지 않는 알레르를 의미한다. 본 발명에 있어서, 야생형 알레르로서는, EGFR 유전자의 엑손 20의 코돈 790의 아미노산이 T인 알레르가 바람직하다.
본 발명에 있어서, 변이 알레르란, 검출하려고 하는 유전자 변이의 변이 부위에 있어서, 검출하려고 하는 변이를 갖는 알레르를 의미한다. 본 발명에 있어서, 변이 알레르로서는, EGFR 유전자의 엑손 20의 코돈 790의 아미노산이 M인 알레르가 바람직하다.
본 발명에 있어서, 핵산 시료 중의 변이 알레르를 정량하는 방법으로서는, 제2 프라이머 세트에 의한 증폭 산물을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리하고, 용출 시간을 x-축, 용출된 DNA의 양을 y-축으로서 나타낸 곡선에 있어서의 당해 증폭 산물의 피크 면적으로부터, 그 핵산 시료 중에 포함되는 변이 알레르를 정량하는 방법이 바람직하다. 이 경우, 증폭 산물의 피크 면적은, 예를 들어, 당해 피크의 양측의 극소점(극소점이 존재하지 않는 경우에는 최소점)을 연결한 직선을 베이스 라인으로 하여, 당해 곡선과 당해 베이스 라인에 둘러싸인 영역의 면적을 피크 면적으로서 구할 수 있다. 기지의 양의 변이 알레르를 포함하는 핵산 시료를 대조 시료로서 사용하고, 당해 대조 시료에 대하여 얻어지는 증폭 산물의 피크 면적과 비교함으로써, 흥미의 대상이 되는 핵산 시료 중에 포함되는 변이 알레르의 절대량을 정량할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
EGFR 유전자 엑손 20의 T790M 변이 알레르의 고감도 검출 (1)
인간 EGFR 유전자의 엑손 20의 T790M 변이를 갖는 DNA로서, NCI-H1975 세포주로부터 추출 및 정제한 DNA를 사용하고, 상기 변이를 갖지 않는 DNA로서는, K562 세포주로부터 추출 및 정제한 DNA를 사용하여, 본 발명에 의해 설계한 측정계의 성능이 확보되는 제1 프라이머 세트의 농도 범위를 평가하였다.
·프라이머
제1 PCR 반응에 사용하는 제1 프라이머 세트(서열 번호 3 및 4)를 T790M 변이를 사이에 두는 영역에 설정하고, 그중 역방향 프라이머를, 제2 프라이머 세트(서열 번호 4 및 5)의 역방향 프라이머와의 공통 프라이머로서 설계하였다. 제2 프라이머 세트의 정방향 프라이머는, T790M(2369C->T) 변이에 대응하는 알레르 특이적 프라이머이며, 그의 3' 말단으로부터 2번째의 뉴클레오티드의 염기가 당해 변이의 변이형 뉴클레오티드의 염기(T)에 대응하고, 3' 말단으로부터 3번째의 뉴클레오티드의 염기가 표적 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보가 아닌 염기(T)를 갖고, 또한 기타의 뉴클레오티드의 염기가 당해 표적 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이다. 서열 번호 3의 프라이머와 서열 번호 4의 프라이머의 조합에서 얻어지는 증폭 산물의 쇄길이는 79bp, 서열 번호 4의 프라이머와 서열 번호 5의 프라이머에서 얻어지는 증폭 산물의 쇄길이는 65bp이다.
서열 번호 3(제1 정방향 프라이머)
Figure pct00003
서열 번호 4(제1·제2 역방향 프라이머)
Figure pct00004
서열 번호 5(제2 정방향 프라이머)
Figure pct00005
·경합 핵산
EGFR엑손 20의 코돈 790의 야생형 서열을 포함하는 DNA의 증폭을 억제하기 위해서, 코돈 790 야생형 서열에 상보적인 서열을 갖는 경합 핵산으로서, PNA를 적용하였다. 서열 번호 6에 나타나는 염기 서열을 갖는 PNA의 합성을 경합 핵산 합성 수탁 회사(Panagene사)에 위탁하였다.
서열 번호 6(경합 핵산; PNA)
Figure pct00006
·주형 DNA의 조제
본 실시예의 주형 DNA는, NCI-H1975 세포주로부터 추출한 DNA(변이형; mu)와 K562 세포주로부터 추출한 DNA(야생)를 합계 농도가 30ng/μL가 되도록, 각 비율로 혼합하여 조제하였다. 혼합비(mu/wild의 ％)는 0.01％, 0％(컨트롤)가 되도록, 야생 유래 DNA와 변이형 유래 DNA를 혼화하여 각각 조제하였다.
·시약
이하의 시약을 포함하는 25μL의 반응 용액을 조제하고, 서멀 사이클러 장치CFX96(바이오래드사)을 사용하여 증폭을 행하였다.
Figure pct00007
·증폭 조건
이하의 조건에서 행하였다.
98℃: 30초
제1 PCR 반응; 98℃: 10초, 70℃: 15초(55사이클)
제2 PCR 반응; 98℃: 10초, 56℃: 15초(30사이클)
제2 프라이머 세트의 알레르 특이적 프라이머와 동일한 방향인 제1 정방향 프라이머의 농도를 감소시켜서 증폭 반응을 행했을 때의 제2 PCR 반응(혼합비 0.01％)의 증폭 곡선을 도 1에 도시한다. 제1 PCR용의 역방향 프라이머 농도가 0.5μM인 경우, 제1 PCR용 정방향 프라이머 농도가 0.005 내지 0.025μM의 범위, 즉 제1 프라이머 세트에 있어서, 제2 프라이머 세트의 ASP와 동일한 방향의 프라이머의 농도를, 다른 쪽의 1/100 내지 1/20로 한 경우에, 제2 PCR 반응 시의 증폭을 보였다. 본 발명의 검출 방법을 사용함으로써 변이 유전자의 혼재율이 매우 낮은 0.01％의 경우에 있어서도 증폭이 가능하게 되었다.
[실시예 2]
EGFR 유전자 엑손 20의 T790M 변이 알레르의 고감도 검출 (2)
인간 EGFR 유전자의 엑손 20의 T790M 변이를 갖는 DNA로서, NCI-H1975 세포주로부터 추출 및 정제한 DNA를 사용하여, 본 발명에 의해 설계한 측정계의 측정 감도를, 제1 PCR용의 정방향 프라이머를 포함하지 않는 종래 기술의 ASP-PCR법과 비교하였다.
·주형 DNA의 조제
본 실시예의 주형은, NCI-H1975 세포주로부터 추출한 DNA(변이형)를 농도가 0.01ng/μL, 0.003ng/μL가 되도록 조제하여 사용하였다.
·시약
이하의 시약을 포함하는 25μL의 반응 용액을 조제하고, 서멀 사이클러 장치CFX96(바이오래드사)을 사용하여 증폭을 행하였다.
(1) ASP-PCR법(종래 기술)
Figure pct00008
(2) 제1 PCR용 정방향 프라이머를 사용하는 경우(본 발명)
Figure pct00009
·증폭 조건
(1) ASP-PCR법(종래 기술)
98℃: 30초
PCR 반응; 98℃: 10초, 56℃: 15초(85사이클)
(2) 제1 PCR용 정방향 프라이머를 사용하는 경우(본 발명)
실시예 1과 동일 조건에서 행하였다.
제1 PCR용 정방향 프라이머를 사용하지 않는 ASP-PCR법에 의한 증폭 반응을 행한 경우의 증폭 곡선을 도 2a, 2b에 도시하였다. DNA량이 0.05ng/반응인 경우 (도 2a), 10회 측정한 중 10회 모두에서 증폭을 보였지만, 증폭 곡선의 상승 사이클수는 45 내지 60사이클로 크게 변동되었다. 또한, DNA량이 적은 0.015ng/반응의 경우 (도 2b), 10회 측정한 중 6회는 증폭을 보이지 않았다. 증폭을 보인 4회에 대해서도 증폭 곡선의 상승 사이클수는 변동되어 있어, 재현성은 불량하였다.
한편, 제1 PCR용 정방향 프라이머의 농도를, 제1 PCR용 역방향 프라이머의 1/20인 0.025μM이 되도록 사용하여, 증폭 반응을 행한 경우의 제1 반응과 제2 반응의 증폭 곡선을 도 2c 내지 2f에 도시하였다. DNA량이 0.05ng/반응인 경우(도 2c 및 2d)는 10회 측정한 중 10회 모두에서 증폭을 보이고, 증폭 곡선의 상승 사이클수도 고르게 되어 있어, 재현성 좋게 증폭 가능한 것을 나타낸다. 또한, DNA량이 적은 0.015ng/반응의 경우(도 2e 및 2f)에서도, 10회 측정한 중 10회 모두에서 증폭을 보였다. 증폭 곡선의 상승 사이클수가 제1 PCR 반응에서는 35 내지 40사이클, 제2 PCR 반응에서는 15 내지 20사이클로 조금 변동되지만, 변이 유전자의 DNA량이 미량이라도 확실하게 증폭 가능한 것이 확인되었다.
이상으로부터, 제1 프라이머 세트에 의한 PCR 반응을 조합하는 때에, 제1 PCR용 정방향 프라이머의 농도를 의도적으로 감소시키고, 제1 프라이머 세트에 있어서, 제2 프라이머 세트의 ASP와 동일한 방향의 프라이머의 농도를, 다른 쪽의 1/100 내지 1/20로 함으로써, ASP-PCR법의 측정 감도 및 재현성이 향상되는 것이 나타났다.
[실시예 3]
EGFR 유전자 엑손 20의 T790M 변이 알레르의 고감도 검출 (3)
인간 EGFR 유전자의 엑손 20의 T790M 변이를 갖는 DNA로서, NCI-H1975 세포주로부터 추출 및 정제한 DNA를, 상기 변이를 갖지 않는 DNA로서는, K562 세포주로부터 추출 및 정제한 DNA를 사용하여, 본 발명에 의해 설계한 측정계의 특이성과 측정 감도를 평가하였다.
·주형 DNA의 조제
본 실시예의 주형은, NCI-H1975 세포주로부터 추출한 DNA(변이형; mu)와 K562 세포주로부터 추출한 DNA(야생)를 합계 농도가 30ng/μL가 되도록, 각 비율로 혼합하여 조제하였다. 혼합비(mu/wild의 ％)는 0.1％, 0.03％, 0.01％, 0％(컨트롤)가 되도록, 야생 유래 DNA와 변이형 유래 DNA를 혼화하여 각각 조제하였다. 또한, NCI-H1975 세포주로부터 추출한 DNA(변이형; mu)를 0.003ng/μL로 되도록 조제하고, 혼합비(mu/wild의 ％)가 100％인 주형으로 하였다.
·시약
Figure pct00010
·증폭 조건
실시예 1과 동일 조건에서 행하였다.
·이온 교환 크로마토그래피 조건
HPLC용 음이온 이온 교환 수지 칼럼: TSKgel DNA-NPR(도소 가부시키가이샤)
용리액: 20mM Tris-HCl(pH8.6), 0.47 내지 0.62M NaCl 구배(10min)
유속: 0.75mL/min
칼럼 오븐: 25℃
검출기: UV 파장 260㎚
상기 조건에서 얻어진 PCR 증폭 산물을, 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리했을 때에 검출된 용출 피크를 도 3에 도시한다. 야생 유래 DNA를 주형으로 한 경우에는, 명확한 용출 피크를 보이지 않았지만, 변이형 유래 DNA(100％)를 주형으로 한 경우, PCR 증폭 산물인 6.3분 부근에 메인의 용출 피크(화살표)를 보이고, 변이형 유래 DNA의 혼재 비율이 0.01％여도 마찬가지의 명확한 용출 피크를 확인할 수 있었다.
이상의 결과로부터, 본 발명에서 설계한 측정계로 얻어진 PCR 증폭 산물을, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 분리에서 얻어진 특이 용출 피크의 유무를 검출함으로써, 변이 유전자를 고감도로 검출할 수 있고, 또한 특이성의 확보도 할 수 있는 것이 나타났다.
[실시예 4]
EGFR 유전자 엑손 20의 T790M 변이 알레르의 정량 (1)
인간 EGFR 유전자의 엑손 20의 T790M 변이를 갖는 DNA로서, NCI-H1975 세포주로부터 추출 및 정제한 DNA를, 상기 변이를 갖지 않는 DNA로서는, K562 세포주로부터 추출 및 정제한 DNA를 사용하여, 본 발명에 의해 설계한 측정계의 정량성을 평가하였다.
·주형 DNA의 조제
본 실시예의 주형은, NCI-H1975 세포주로부터 추출한 DNA(변이형; mu)와 K562 세포주로부터 추출한 DNA(야생)를 합계 농도가 10ng/μL가 되도록, 각 비율로 혼합하여 조제하였다. 혼합비(mu/wild의 ％)는 10％, 3％, 1％, 0.3％, 0.1％, 0％가 되도록 야생 유래 DNA와 변이형 유래 DNA를 혼화하여 각각 조제하였다.
·시약
실시예 3과 동일 조건에서 행하였다.
·증폭 조건
98℃: 30초
제1 PCR 반응; 98℃: 10초, 70℃: 15초(55 내지 15사이클)
제2 PCR 반응; 98℃: 10초, 56℃: 15초(30 내지 47사이클)
제1 PCR 반응과 제2 PCR 반응의 사이클수를 적당히 조합하여 증폭 반응을 행했을 때의 제2 PCR의 증폭 곡선 및 최종의 상대 형광 강도(PFU)값과 변이 알레르의 비율(％)의 상관 관계를 도 4a 내지 4r에 도시하였다. 제1 PCR 반응으로 생성하는 증폭 산물의 양은, 통상, 증폭 반응이 포화기에 도달하는 경우에는, 핵산 시료 중에 포함되는 유전자 변이의 비율(％)을 반영하지 않으므로, 제2 PCR 반응에서 생성하는 증폭 산물도 핵산 시료 중의 유전자 변이의 비율을 반영하지 않는다고 생각된다. 실제로, 제1 PCR 반응의 사이클수를 55로 하여 증폭 반응을 포화기에 도달시킨 도 4a 내지 4c의 경우에는, 제2 PCR 반응의 증폭 곡선은 핵산 시료 중에 포함되는 유전자 변이의 비율(％)을 전혀 반영하고 있지 않는 것을 알 수 있다. 한편, 도 4d 내지 4f와 같이, 제1 PCR 반응의 사이클수를 35로 저감시킴으로써, 제1 PCR의 증폭 반응이 포화기가 도달하지 않는 조건이 되고, 계속되는 제2 PCR 반응의 도중에 제1 PCR용의 프라이머에 의한 핵산 시료 중에 포함되는 유전자 변이의 양을 반영한 증폭 산물의 증폭 곡선이 얻어지게 된 것이 나타났다. 또한, 제1 PCR 반응의 사이클수를 32 내지 15의 범위로 하는 것, 또한 추가로, 제2 PCR 반응의 사이클수를 30 이상으로 설정함으로써, 제1 PCR 반응으로 얻어진, 핵산 시료 중에 포함되는 유전자 변이의 양을 반영한 증폭 산물에 대하여 ASP를 사용한 제2 PCR 반응이 특이성을 유지하면서 증폭 반응을 계속하고, 제2 PCR 반응의 최종 사이클에 있어서의 PFU값과 변이 알레르의 비율(％)의 관계에, 보다 정확한 상관 관계가 보였다(도 4g 내지 4r).
이상의 결과로부터, 제1 PCR 반응이 포화기에 도달하기 전에, 핵산 시료 중에 포함되는 유전자 변이의 양을 반영하여 생성한 증폭 산물에 대하여, 계속해서 적어도 제2 프라이머 세트가 작용하는 조건에서, ASP를 사용한 핵산 증폭 반응에 의해 변이 유전자를 선택적으로 증폭시킴으로써, 변이 알레르의 비율(％)의 정량성이 유지되는 것이 나타났다.
[실시예 5]
EGFR 유전자 엑손 20의 T790M 변이 알레르의 정량 (2)
·주형 DNA의 조제
실시예 4와 동일 조건에서 행하였다.
·시약
실시예 3과 동일 조건에서 행하였다.
·증폭 조건
98℃: 30초
제1 PCR 반응; 98℃: 10초, 70℃: 15초
제2 PCR 반응; 98℃: 10초, 56℃: 15초
사이클수; 제1 PCR+제2 PCR=62사이클이 되는 조합
·이온 교환 크로마토그래피 조건
실시예 3과 동일 조건에서 행하였다.
제1 PCR 반응과 제2 PCR 반응의 사이클수가 합쳐서 62가 되는 조합으로 증폭 반응을 행하고, 그의 증폭 산물을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리 및 검출한 용출 피크(메인의 용출 피크를 화살표로 나타낸다)를 도 5a, 5c, 5e, 및 5g에 나타내고, 메인의 용출 피크의 면적과 변이 알레르의 비율(％)의 상관 관계를 도 5b, 5d, 5f, 및 5h에 도시하였다.
실시예 4에서, 제2 PCR 반응 후의 형광 강도와 변이 알레르의 비율(％)의 상관성에서 양호한 결과가 얻어진 사이클수의 조합 조건에 있어서는, 6.3분 부근에 변이 알레르 유래인 증폭 산물의 명확한 용출 피크가 보이고, 또한 도 5a 내지 5f에 있어서는, 그 용출 피크의 면적과 변이 알레르의 비율(％)에서도 양호한 상관 관계를 보이고 있다. 실시예 4에서 정량성이 충분히 얻어지지 않은 제1 PCR 반응의 35사이클 조건에서는, 용출 피크의 정량성은 보이지만, 변이 알레르의 비율에 대하여 충분한 결과는 얻어지지 않았다.
이상의 결과로부터, 제1 PCR 반응이 포화기에 도달하기 전에, 핵산 시료 중에 포함되는 변이 유전자의 DNA량을 반영하여 생성한 증폭 산물에 대하여, 계속해서 적어도 제2 프라이머 세트가 작용하는 조건에서, ASP를 사용한 핵산 증폭 반응에 의해 변이 유전자를 선택적으로 증폭시킨 후, 그 증폭 산물을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리하고, 증폭 산물의 피크 면적을 비교함으로써, 변이 알레르의 비율(％)의 정량성이 확보되는 것이 나타났다.
본 발명의 변이 유전자 검출 방법은, 상피 증식 인자 수용체에 대한 티로신 키나아제 저해약의 암 환자에 있어서의 감수성을 예측하기 위한 컴패니언 진단약 및 시스템의 생산이나, 기타의 개별화 의료의 기초가 되는 진단약 및 시스템의 생산에 이용할 수 있다.
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Claims (8)

  1. 핵산 시료 중에 포함되는 유전자 변이를, DNA 폴리메라아제를 사용한 핵산 증폭 반응에 의한 증폭 산물의 유무로 검출하는 방법으로서, 당해 유전자의 다형 부위를 사이에 두도록 설계된 제1 프라이머 세트와, 당해 변이를 포함하는 핵산으로부터 선택적으로 증폭하는 알레르 특이적 프라이머를 하나 이상 포함하는 제2 프라이머 세트가 공존하는 핵산 증폭 반응액 중에 있어서,
    (a) 제2 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응이 일어나지 않는 조건 하에서, 당해 유전자의 야생형 알레르의 서열을 갖고, 당해 다형 부위의 전부 또는 일부에 하이브리다이제이션하는 경합 핵산의 존재 하에서, 제1 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응에 의해, 변이 알레르를 포함하는 핵산을 증폭시켜 증폭 산물을 얻는 공정을 포함하고,
    (b) 공정 (a)의 증폭 산물을 얻을 때에, 제1 프라이머 세트의 프라이머의 농도를, 제2 프라이머 세트의 농도와 비교해 감소시켜서 증폭 반응시키는 공정을 포함하고,
    (c) 공정 (a)에서 얻어진 증폭 산물에 대하여 적어도 제2 프라이머 세트가 작용하는 조건에서 핵산 증폭 반응에 의해 변이 알레르를 포함하는 핵산을 선택적으로 증폭시킴으로써, 핵산 시료 중에 포함되는 유전자 변이를 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기한 제2 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응이 일어나지 않는 조건이, 당해 알레르 특이적 프라이머가 당해 변이를 포함하는 핵산으로 어닐하지 않는 온도 조건인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 알레르 특이적 프라이머가 아닌 프라이머가, 제1 프라이머 세트의 한쪽 프라이머와 공통되게 설계되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프라이머 세트에 있어서, 제2 프라이머 세트의 알레르 특이적 프라이머와 동일한 방향의 프라이머의 농도가, 다른 쪽 프라이머의 농도의 1/100 내지 1/20인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 프라이머 세트에 의한 증폭 산물의 유무를, 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리된 증폭 산물의 피크의 유무에 의해 검출하는 공정을 포함하는, 방법.
  6. 핵산 시료 중에 포함되는 변이 알레르를, DNA 폴리메라아제를 사용한 핵산 증폭 반응에 의한 증폭 산물을 사용하여 정량하는 방법으로서, 당해 유전자의 다형 부위를 사이에 두도록 설계된 제1 프라이머 세트와, 당해 변이를 포함하는 핵산으로부터 선택적으로 증폭하는 알레르 특이적 프라이머를 하나 이상 포함하는 제2 프라이머 세트가 공존하는 핵산 증폭 반응액 중에 있어서,
    (a) 제2 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응이 일어나지 않는 조건 하에서, 당해 유전자의 야생형 알레르의 서열을 갖고, 당해 다형 부위의 전부 또는 일부에 하이브리다이제이션하는 경합 핵산의 존재 하에서, 제1 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응에 의해, 변이 알레르를 포함하는 핵산을 증폭시켜 증폭 산물을 얻는 공정을 포함하고,
    (b) 공정 (a)의 증폭 산물을 얻을 때에, 제1 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응이 포화기에 도달하기 전에, 핵산 시료 중에 포함되는 변이 알레르의 DNA량을 반영하여 생성한 증폭 산물에 대하여, 계속해서 적어도 제2 프라이머 세트가 작용하는 조건에서 핵산 증폭 반응에 의해, 변이 알레르를 포함하는 핵산을 선택적으로 증폭시킴으로써, 핵산 시료 중에 포함되는 변이 알레르를 정량하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 제1 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응의 사이클수를 15 내지 32회로 설정하고, 추가로 제2 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응의 사이클수를 30 내지 60회로 설정하고, 2개의 반응을 조합하여 연속으로 행하는, 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 제2 프라이머 세트에 의한 증폭 산물을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리하고, 당해 증폭 산물의 피크 면적으로부터, 그 핵산 시료 중에 포함되는 변이 알레르를 정량하는, 방법.
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