JPH05211873A - 核酸鋳型の特異的増殖方法および核酸の決定方法 - Google Patents
核酸鋳型の特異的増殖方法および核酸の決定方法Info
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- JPH05211873A JPH05211873A JP3061502A JP6150291A JPH05211873A JP H05211873 A JPH05211873 A JP H05211873A JP 3061502 A JP3061502 A JP 3061502A JP 6150291 A JP6150291 A JP 6150291A JP H05211873 A JPH05211873 A JP H05211873A
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】増殖のための、および核酸鋳型の特異的な検出
のための、より簡素な、敏感な方法を提供する。 【構成】核酸鋳型が、同一方向に配列された２つのプラ
イマーでハイブリダイズされ、これらのプライマーは該
鋳型と相補的な配列を含有しており、これらのプライマ
ーのうちの第２プライマーは第１プライマーから離れた
端部に転写開始部位およびＲＮＡポリメラーゼが結合す
ることができる二本鎖配列を担持しており、このように
ハイブリダイズされた２つのプライマーを共有結合させ
て、それらの間のギャップを充足することによって鋳型
と相補的な核酸を形成し、この鋳型と相補的なこの核酸
の転写物を形成し、所望により、これらの転写物を公知
の方法で検出する。
のための、より簡素な、敏感な方法を提供する。 【構成】核酸鋳型が、同一方向に配列された２つのプラ
イマーでハイブリダイズされ、これらのプライマーは該
鋳型と相補的な配列を含有しており、これらのプライマ
ーのうちの第２プライマーは第１プライマーから離れた
端部に転写開始部位およびＲＮＡポリメラーゼが結合す
ることができる二本鎖配列を担持しており、このように
ハイブリダイズされた２つのプライマーを共有結合させ
て、それらの間のギャップを充足することによって鋳型
と相補的な核酸を形成し、この鋳型と相補的なこの核酸
の転写物を形成し、所望により、これらの転写物を公知
の方法で検出する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸鋳型の特異的な増
殖方法および核酸の決定方法に関する。
殖方法および核酸の決定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸鋳型の特異的増殖方法は、例えば、
欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ０２００３６２に開示されて
いる。それには、検出しようとする核酸を in vitro シ
ステムによって増殖することが提案されている。このた
めに、増殖されるべき各核酸一本鎖に関する試料に少な
くとも１つのプライマーを添加する。プライマーから始
まり、酵素的伸長反応によって核酸鎖が形成され、これ
は、各々の核酸一本鎖と相補的である。この反応は、か
わるがわる数回行うことができ、これによって、新しく
形成された核酸鎖を増殖することもできる。この方法の
欠点は、各増殖工程の間に加熱工程が必要であるという
ことである。
欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ０２００３６２に開示されて
いる。それには、検出しようとする核酸を in vitro シ
ステムによって増殖することが提案されている。このた
めに、増殖されるべき各核酸一本鎖に関する試料に少な
くとも１つのプライマーを添加する。プライマーから始
まり、酵素的伸長反応によって核酸鎖が形成され、これ
は、各々の核酸一本鎖と相補的である。この反応は、か
わるがわる数回行うことができ、これによって、新しく
形成された核酸鎖を増殖することもできる。この方法の
欠点は、各増殖工程の間に加熱工程が必要であるという
ことである。
【０００３】欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ０３２９８２２
には、核酸鋳型に２つの核酸プライマーをハイブリダイ
ズし、これらのプライマーによってＤＮＡを鋳型に依存
して形成し、このＤＮＡを鋳型に類似している多数の核
酸に転写することによって特異的な核酸鋳型を増殖する
方法が開示されている。この方法の欠点は、特に、該方
法が比較的高温で長いインキュベーション時間を必要と
するということである。さらに、該方法は、複雑化され
た鋳型の予備処理の後のＤＮＡの増殖のために適切であ
るだけである。
には、核酸鋳型に２つの核酸プライマーをハイブリダイ
ズし、これらのプライマーによってＤＮＡを鋳型に依存
して形成し、このＤＮＡを鋳型に類似している多数の核
酸に転写することによって特異的な核酸鋳型を増殖する
方法が開示されている。この方法の欠点は、特に、該方
法が比較的高温で長いインキュベーション時間を必要と
するということである。さらに、該方法は、複雑化され
た鋳型の予備処理の後のＤＮＡの増殖のために適切であ
るだけである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、前記
の従来技術の欠点を取除き、増殖のための、および核酸
鋳型の特異的な検出のための、より簡素な、特に敏感な
方法を提供することであった。
の従来技術の欠点を取除き、増殖のための、および核酸
鋳型の特異的な検出のための、より簡素な、特に敏感な
方法を提供することであった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、核酸鋳型に２
つの核酸プライマーを核酸鋳型にハイブリダイズし、こ
れらのプライマーによって該鋳型と相補的な核酸を形成
し、形成された核酸を該鋳型に類似の多数の核酸に転写
することによる核酸鋳型の特異的増殖方法であって、該
鋳型が、同一方向に配列された２つのプライマーでハイ
ブリダイズされ、これらのプライマーは該鋳型と相補的
な配列を含有しており、これらのプライマーのうちの第
２プライマーは第１プライマーから離れた端部に転写開
始部位およびＲＮＡポリメラーゼが結合することができ
る二本鎖配列を担持しており、このようにハイブリダイ
ズされた２つのプライマーを共有結合させて、それらの
間のギャップを充足することによって鋳型と相補的な核
酸を形成し、この鋳型と相補的なこの核酸の転写物を形
成することを特徴とする核酸鋳型の特異的増殖方法を提
供するものである。
つの核酸プライマーを核酸鋳型にハイブリダイズし、こ
れらのプライマーによって該鋳型と相補的な核酸を形成
し、形成された核酸を該鋳型に類似の多数の核酸に転写
することによる核酸鋳型の特異的増殖方法であって、該
鋳型が、同一方向に配列された２つのプライマーでハイ
ブリダイズされ、これらのプライマーは該鋳型と相補的
な配列を含有しており、これらのプライマーのうちの第
２プライマーは第１プライマーから離れた端部に転写開
始部位およびＲＮＡポリメラーゼが結合することができ
る二本鎖配列を担持しており、このようにハイブリダイ
ズされた２つのプライマーを共有結合させて、それらの
間のギャップを充足することによって鋳型と相補的な核
酸を形成し、この鋳型と相補的なこの核酸の転写物を形
成することを特徴とする核酸鋳型の特異的増殖方法を提
供するものである。
【０００６】好ましい具体例において、形成された転写
物は、プライマーとのハイブリダイゼーションのための
鋳型として再度使用され、増殖サイクルが繰り返され
る。さらに好ましい具体例において、最初のサイクルで
使用したプライマーのものと異なる鋳型と相補的な領域
を有する別のプライマーを使用して、特に、特異性を改
良することができる。
物は、プライマーとのハイブリダイゼーションのための
鋳型として再度使用され、増殖サイクルが繰り返され
る。さらに好ましい具体例において、最初のサイクルで
使用したプライマーのものと異なる鋳型と相補的な領域
を有する別のプライマーを使用して、特に、特異性を改
良することができる。
【０００７】本発明の意味において、核酸鋳型は、原核
生物または真核生物に起源を発するＤＮＡおよびＲＮＡ
と解される。これらは、ウイルス性および細菌性核酸な
らびにビロイド由来核酸も含む。それらは、一本鎖また
は二本鎖であり得る。それらは、プラスミドのようなエ
ピソーム核酸、またはゲノム染色体核酸であり得る。該
核酸は、個々の微生物または微生物の群に関して特徴的
であり得る。
生物または真核生物に起源を発するＤＮＡおよびＲＮＡ
と解される。これらは、ウイルス性および細菌性核酸な
らびにビロイド由来核酸も含む。それらは、一本鎖また
は二本鎖であり得る。それらは、プラスミドのようなエ
ピソーム核酸、またはゲノム染色体核酸であり得る。該
核酸は、個々の微生物または微生物の群に関して特徴的
であり得る。
【０００８】核酸は、粗溶解産物として使用され得る
か、または精製され得る(例えば、フェノール抽出また
はグアニジン／イソチオシアナート勾配溶液遠心分離に
よる)。
か、または精製され得る(例えば、フェノール抽出また
はグアニジン／イソチオシアナート勾配溶液遠心分離に
よる)。
【０００９】しかしながら、制限酵素によって切断され
た核酸またはエンドヌクレアーゼ処理によって修飾され
た核酸のような修飾核酸を使用することもできる。ＲＮ
Ａの場合、予め、cＤＮＡを製造することができる。核
酸が一本鎖の形態であるかまたは反応を行う前に一本鎖
形態に変換される場合に優れていることが示されてい
る。
た核酸またはエンドヌクレアーゼ処理によって修飾され
た核酸のような修飾核酸を使用することもできる。ＲＮ
Ａの場合、予め、cＤＮＡを製造することができる。核
酸が一本鎖の形態であるかまたは反応を行う前に一本鎖
形態に変換される場合に優れていることが示されてい
る。
【００１０】プライマーは、核酸鋳型と相補的な配列を
含有するヌクレオチド配列と解され、厳重な条件下でこ
の手段で鋳型とハイブリダイズされ得る(例えば、アナ
リティカル・バイオケミストリー(Ａnal.Ｂiochem.)、
１３８(１９８４)２６７〜２８４)。
含有するヌクレオチド配列と解され、厳重な条件下でこ
の手段で鋳型とハイブリダイズされ得る(例えば、アナ
リティカル・バイオケミストリー(Ａnal.Ｂiochem.)、
１３８(１９８４)２６７〜２８４)。
【００１１】鋳型と相補的な核酸は、少なくとも１つの
部分において鋳型と相補的である核酸と解される。鋳型
と類似の核酸は、増殖方法によって産生された核酸と解
され、結果として、少なくとも１つの部分がプライマー
と相補的な配列および充足ギャップ配列(filled up gap
sequence)に対応し、その配列は鋳型配列と均質であ
る。
部分において鋳型と相補的である核酸と解される。鋳型
と類似の核酸は、増殖方法によって産生された核酸と解
され、結果として、少なくとも１つの部分がプライマー
と相補的な配列および充足ギャップ配列(filled up gap
sequence)に対応し、その配列は鋳型配列と均質であ
る。
【００１２】好ましくは１５〜４０、特に好ましくは１
６〜２５塩基を有する鋳型と相補的な配列を含有する核
酸フラグメントを第２プライマーとして使用する。転写
開始部位およびＲＮＡポリメラーゼが結合し得る二本鎖
配列は、この相補的な配列を含有する一本鎖配列に続
く。二本鎖配列は、好ましくは１７〜１００塩基、特に
好ましくは７〜５０塩基の長さである。二本鎖部分の両
ストランドは、オープン形態で存在し得るか、または鋳
型と相補的な配列から離れて面している２つの末端が、
好ましくは５〜１００、特に好ましくは５〜１０塩基の
長さを有し、好ましくはポリヌクレオチドである別の核
酸配列を介して結合され得る。
６〜２５塩基を有する鋳型と相補的な配列を含有する核
酸フラグメントを第２プライマーとして使用する。転写
開始部位およびＲＮＡポリメラーゼが結合し得る二本鎖
配列は、この相補的な配列を含有する一本鎖配列に続
く。二本鎖配列は、好ましくは１７〜１００塩基、特に
好ましくは７〜５０塩基の長さである。二本鎖部分の両
ストランドは、オープン形態で存在し得るか、または鋳
型と相補的な配列から離れて面している２つの末端が、
好ましくは５〜１００、特に好ましくは５〜１０塩基の
長さを有し、好ましくはポリヌクレオチドである別の核
酸配列を介して結合され得る。
【００１３】好ましい具体例において、鋳型と相補的で
ある第２プライマー配列の部分は、第１プライマーと対
向している末端で、ホスホリル化５'末端によって開始
される。同様に、第１プライマーに面している３'末端
は、特に好ましくは転写開始部位またはプロモーター部
分の最後(３')のヌクレオチドと相補的であるジデオキ
シヌクレオチドによって末端処理されているのが好まし
い。
ある第２プライマー配列の部分は、第１プライマーと対
向している末端で、ホスホリル化５'末端によって開始
される。同様に、第１プライマーに面している３'末端
は、特に好ましくは転写開始部位またはプロモーター部
分の最後(３')のヌクレオチドと相補的であるジデオキ
シヌクレオチドによって末端処理されているのが好まし
い。
【００１４】ＲＮＡポリメラーゼが結合することができ
る適切な二本鎖配列は、例えば、メルトンら(Ｍelton e
t al.)、ＮＡＲ １２（１９８４）７０３５〜７０５
６、プファイファー(Ｐfeiffer)、およびギルバート・
ダブリュ(Ｇilbert Ｗ.)、プロテイン・シークェンシズ
・アンド・ディエヌエイ・アナリシス(Ｐrotein Ｓeque
nces and ＤＮＡ Ａnalysis）１（１９８８）２６９〜
２８０に開示されている。
る適切な二本鎖配列は、例えば、メルトンら(Ｍelton e
t al.)、ＮＡＲ １２（１９８４）７０３５〜７０５
６、プファイファー(Ｐfeiffer)、およびギルバート・
ダブリュ(Ｇilbert Ｗ.)、プロテイン・シークェンシズ
・アンド・ディエヌエイ・アナリシス(Ｐrotein Ｓeque
nces and ＤＮＡ Ａnalysis）１（１９８８）２６９〜
２８０に開示されている。
【００１５】第１プライマーは、厳格な条件下で鋳型に
プライマーをハイブリダイゼーションさせ得る鋳型と相
補的な配列を含む(上記参照)。プライマーを鋳型核酸中
のプライマー−特異的配列に結合させるだけのこれらの
条件が好ましい。
プライマーをハイブリダイゼーションさせ得る鋳型と相
補的な配列を含む(上記参照)。プライマーを鋳型核酸中
のプライマー−特異的配列に結合させるだけのこれらの
条件が好ましい。
【００１６】プライマーの相補的領域の長さは、好まし
くは１５〜４０、特に１６〜２５塩基である。
くは１５〜４０、特に１６〜２５塩基である。
【００１７】別の好ましい具体例において、２つのプラ
イマーのうちの１つは、他のプライマーから離れて面し
ているその末端で生物学的結合対の共有結合相手を含有
している。さらに、または択一的に、鋳型と相補的な核
酸の鋳型と類似の核酸への転写は、非修飾モノヌクレオ
チドの代わりに、生物学的結合対の結合相手を含むモノ
ヌクレオチドを使用して行うことができる。次いで、鋳
型と相補的な核酸または／および形成された転写物は、
反応溶液から取り出され、担体に固定されている他の結
合相手を介して固定され得る。次いで、この方法で固定
された核酸は、例えば、当業者に親しみのある方法によ
って検出することができる。
イマーのうちの１つは、他のプライマーから離れて面し
ているその末端で生物学的結合対の共有結合相手を含有
している。さらに、または択一的に、鋳型と相補的な核
酸の鋳型と類似の核酸への転写は、非修飾モノヌクレオ
チドの代わりに、生物学的結合対の結合相手を含むモノ
ヌクレオチドを使用して行うことができる。次いで、鋳
型と相補的な核酸または／および形成された転写物は、
反応溶液から取り出され、担体に固定されている他の結
合相手を介して固定され得る。次いで、この方法で固定
された核酸は、例えば、当業者に親しみのある方法によ
って検出することができる。
【００１８】好適な結合対の例は、ビオチン−ストレプ
トアビジンもしくはアビジン、ハプテン−抗体、抗原−
抗体、コンカナバリン−抗体、糖−レクチンまたは相補
的核酸である。５〜１００、好ましくは１０〜３０塩基
の長さを有する相補的核酸を使用するのが好ましい。
トアビジンもしくはアビジン、ハプテン−抗体、抗原−
抗体、コンカナバリン−抗体、糖−レクチンまたは相補
的核酸である。５〜１００、好ましくは１０〜３０塩基
の長さを有する相補的核酸を使用するのが好ましい。
【００１９】好ましい具体例において、該方法は、特異
的ＤＮＡ鋳型および特異的ＲＮＡ鋳型の増殖のために使
用する。ＤＮＡ鋳型が二本鎖状態で存在する場合、該鋳
型は、ハイブリダイゼーション前に、当業者に周知の方
法によって一本鎖形態に変換するのが好ましい。
的ＤＮＡ鋳型および特異的ＲＮＡ鋳型の増殖のために使
用する。ＤＮＡ鋳型が二本鎖状態で存在する場合、該鋳
型は、ハイブリダイゼーション前に、当業者に周知の方
法によって一本鎖形態に変換するのが好ましい。
【００２０】好ましい具体例において、増殖すべきまた
は決定すべき核酸は、プライマーとのハイブリダイゼー
ションの前に、制限エンドヌクレアーゼまたはエキソヌ
クレアーゼによる処理によって修飾鋳型に変換される。
は決定すべき核酸は、プライマーとのハイブリダイゼー
ションの前に、制限エンドヌクレアーゼまたはエキソヌ
クレアーゼによる処理によって修飾鋳型に変換される。
【００２１】別の好ましい具体例において、鋳型と鋳型
と相補的なＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションは、
転写物の産生の前に停止される。これは、好ましくは、
ＲＮaseＨによって行われる。特に好ましくは、イー・
コリ(Ｅ.coli)またはウシ胸腺由来ＲＮaseＨを使用す
る。ＲＮaseＨの濃度は、好ましくは、０.５〜２Ｕ／反
応容量である。
と相補的なＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションは、
転写物の産生の前に停止される。これは、好ましくは、
ＲＮaseＨによって行われる。特に好ましくは、イー・
コリ(Ｅ.coli)またはウシ胸腺由来ＲＮaseＨを使用す
る。ＲＮaseＨの濃度は、好ましくは、０.５〜２Ｕ／反
応容量である。
【００２２】増殖は、３０℃〜３７℃で３０分〜２時間
行うのが好ましい。反応容量は、２５〜１００マイクロ
リットルを選択するのが好ましい。プライマーの濃度
は、各々の場合、０.３〜３.５マイクロモル／リットル
であるのが好ましい。
行うのが好ましい。反応容量は、２５〜１００マイクロ
リットルを選択するのが好ましい。プライマーの濃度
は、各々の場合、０.３〜３.５マイクロモル／リットル
であるのが好ましい。
【００２３】プライマー間のギャップを充足するため
に、リガーゼおよび逆トランスクリプターゼを使用する
のが好ましい。リガーゼとして、Ｔ４リガーゼを使用す
るのが特に好ましい。リガーゼの濃度は、１〜１０Ｕ／
反応容量であるのが好ましい。ギャップは、好適なオリ
ゴヌクレオチドの添加およびリガーゼとの結合によって
閉じることもできる。リガーゼにコファクターを添加す
る場合、例えばＴ４リガーゼに対してＡＴＰまたはイー
・コリ(Ｅ.coli)リガーゼに対してＮＡＤ+を添加しなけ
ればならない。
に、リガーゼおよび逆トランスクリプターゼを使用する
のが好ましい。リガーゼとして、Ｔ４リガーゼを使用す
るのが特に好ましい。リガーゼの濃度は、１〜１０Ｕ／
反応容量であるのが好ましい。ギャップは、好適なオリ
ゴヌクレオチドの添加およびリガーゼとの結合によって
閉じることもできる。リガーゼにコファクターを添加す
る場合、例えばＴ４リガーゼに対してＡＴＰまたはイー
・コリ(Ｅ.coli)リガーゼに対してＮＡＤ+を添加しなけ
ればならない。
【００２４】逆トランスクリプターゼの濃度は、０〜３
０Ｕ／試験容量であるのが好ましい。逆トランスクリプ
ターゼとして、ＭoＭＬＶまたはＡＭＶ逆トランスクリ
プターゼを使用するのが好ましい。
０Ｕ／試験容量であるのが好ましい。逆トランスクリプ
ターゼとして、ＭoＭＬＶまたはＡＭＶ逆トランスクリ
プターゼを使用するのが好ましい。
【００２５】転写物の製造は、ＲＮＡポリメラーゼの添
加によって行われる。例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、
Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ ＲＮＡポリメラ
ーゼのようなファージ−解読ＲＮＡポリメラーゼを使用
するのが好ましい。ポリメラーゼの濃度は１０〜１００
Ｕ／反応容量であるのが好ましい。
加によって行われる。例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、
Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ ＲＮＡポリメラ
ーゼのようなファージ−解読ＲＮＡポリメラーゼを使用
するのが好ましい。ポリメラーゼの濃度は１０〜１００
Ｕ／反応容量であるのが好ましい。
【００２６】本発明は、核酸鋳型に２つの核酸プライマ
ーをハイブリダイズし、これらのプライマーによって該
鋳型と相補的な核酸を形成し、形成された核酸を該鋳型
に類似の多数の核酸に転写することによる核酸鋳型の検
出方法であって、該鋳型が、同一方向に配列された２つ
のプライマーでハイブリダイズされ、これらのプライマ
ーは該鋳型と相補的な配列を含有しており、これらのプ
ライマーのうちの第２プライマーが第１プライマーから
離れた端部に転写開始部位およびＲＮＡポリメラーゼが
結合することができる二本鎖配列を担持しており、この
ようにハイブリダイズされた２つのプライマーを共有結
合させて、それらの間のギャップを充足することによっ
て鋳型と相補的な核酸を形成し、該鋳型と相補的なこの
核酸から転写物を形成し、これらの転写物を公知の方法
（例えば、モレキュラー・クローニング(Ｍolecular Ｃ
loning) １９８２、マニアティスら編集、第１９９頁〜
第２０６頁）で検出することを特徴とする核酸鋳型の検
出方法を提供するものでもある。
ーをハイブリダイズし、これらのプライマーによって該
鋳型と相補的な核酸を形成し、形成された核酸を該鋳型
に類似の多数の核酸に転写することによる核酸鋳型の検
出方法であって、該鋳型が、同一方向に配列された２つ
のプライマーでハイブリダイズされ、これらのプライマ
ーは該鋳型と相補的な配列を含有しており、これらのプ
ライマーのうちの第２プライマーが第１プライマーから
離れた端部に転写開始部位およびＲＮＡポリメラーゼが
結合することができる二本鎖配列を担持しており、この
ようにハイブリダイズされた２つのプライマーを共有結
合させて、それらの間のギャップを充足することによっ
て鋳型と相補的な核酸を形成し、該鋳型と相補的なこの
核酸から転写物を形成し、これらの転写物を公知の方法
（例えば、モレキュラー・クローニング(Ｍolecular Ｃ
loning) １９８２、マニアティスら編集、第１９９頁〜
第２０６頁）で検出することを特徴とする核酸鋳型の検
出方法を提供するものでもある。
【００２７】本発明の検出方法の好ましい具体例は、増
殖方法の好ましい具体例と同様である。
殖方法の好ましい具体例と同様である。
【００２８】後に続く精製、または形成された転写生成
物の検出は、適切な方法による固定化および配列検出に
よって上記のように行われ得る。同様に、ゲル電気泳動
によって転写生成物を分離し、ＲＮＡを着色し、直接も
しくはノーザーントランスファーによって肉眼で観察
し、次いで、標的配列に関して特異的な標識プローブと
ハイブリダイズするのが適切である。同様に、標的配列
に関して特異的な標識プローブを用いて、例えば放射活
性、蛍光性または酵素によって標識された１またはいく
つかのＮＴＰaで転写生成物を標識するドット−、ブロ
ット／スロット−、ブロット−ハイブリダイゼーション
法が適切である。
物の検出は、適切な方法による固定化および配列検出に
よって上記のように行われ得る。同様に、ゲル電気泳動
によって転写生成物を分離し、ＲＮＡを着色し、直接も
しくはノーザーントランスファーによって肉眼で観察
し、次いで、標的配列に関して特異的な標識プローブと
ハイブリダイズするのが適切である。同様に、標的配列
に関して特異的な標識プローブを用いて、例えば放射活
性、蛍光性または酵素によって標識された１またはいく
つかのＮＴＰaで転写生成物を標識するドット−、ブロ
ット／スロット−、ブロット−ハイブリダイゼーション
法が適切である。
【００２９】生成物は、32Ｐ標識または非放射活性標識
ＮＴＰsと混合することによって、ドット−、スロット
−またはノーザンブロットにおいて直接肉眼で観察され
得る。抗ジゴキシゲニン抗体を用いる直接検出のために
ジゴキシゲニンまたはビオチン(国際出願公開ＷＯ ８９
／０６６９８参照)との混合物を使用することができ
る。
ＮＴＰsと混合することによって、ドット−、スロット
−またはノーザンブロットにおいて直接肉眼で観察され
得る。抗ジゴキシゲニン抗体を用いる直接検出のために
ジゴキシゲニンまたはビオチン(国際出願公開ＷＯ ８９
／０６６９８参照)との混合物を使用することができ
る。
【００３０】図１は、実施例１において使用する第１プ
ライマーのヌクレオチド配列を示す図である。
ライマーのヌクレオチド配列を示す図である。
【００３１】図２は、第２プライマーに関する２つの変
形例を示す図である。
形例を示す図である。
【００３２】図３は、本発明の核酸に関する検出法の好
ましい例を示す図である。
ましい例を示す図である。
【００３３】以下の実施例および添付の図面によって本
発明をさらに説明する。
発明をさらに説明する。
【００３４】
実施例１ ＲＮＡ鋳型の製造 ネオマイシン耐性遺伝子(neo)の転写物の製造のために
プラスミドpＳＰＴ１８(配列：国際出願公開ＷＯ ８９
／０６６９８参照)を使用する。ベックら(Ｂecket a
l.)、ジーン(Ｇene)１９(１９８２)３２７〜３３６の記
載に従って、このプラスミドにネオマイシン遺伝子(ア
ミノグリコシド−３'−ホスホトランスフェラーゼII)を
挿入する。得られたプラスミドpＳＰＴ１８neoを使用し
て、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、一方向の
遺伝子の転写物を製造することができる。ＢglＩを用い
てプラスミドpＳＰＴ１８neoを線形にする。バイオケミ
カルズ・フォー・モレキュラー・バイオロジー(Ｂioche
micals for Ｍolecular Ｂiology)、ベーリンガー・マ
ンハイム(Ｂoehringer Ｍannheim)(１９８７)第３８頁
〜第４０頁の記載に従って、in vitro 転写によって、
この線形プラスミドから実施例２における鋳型として使
用されるＲＮＡ転写物を製造する。
プラスミドpＳＰＴ１８(配列：国際出願公開ＷＯ ８９
／０６６９８参照)を使用する。ベックら(Ｂecket a
l.)、ジーン(Ｇene)１９(１９８２)３２７〜３３６の記
載に従って、このプラスミドにネオマイシン遺伝子(ア
ミノグリコシド−３'−ホスホトランスフェラーゼII)を
挿入する。得られたプラスミドpＳＰＴ１８neoを使用し
て、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、一方向の
遺伝子の転写物を製造することができる。ＢglＩを用い
てプラスミドpＳＰＴ１８neoを線形にする。バイオケミ
カルズ・フォー・モレキュラー・バイオロジー(Ｂioche
micals for Ｍolecular Ｂiology)、ベーリンガー・マ
ンハイム(Ｂoehringer Ｍannheim)(１９８７)第３８頁
〜第４０頁の記載に従って、in vitro 転写によって、
この線形プラスミドから実施例２における鋳型として使
用されるＲＮＡ転写物を製造する。
【００３５】実施例２ ＲＮＡ増幅 ａ）プライマー１および２の製造 プライマー１の配列(２４ヌクレオチドのＤＮＡオリゴ
ヌクレオチド、図１)は、ベックらに従ってＤＮＡ配列
のヌクレオチド２００８〜２０３１に対応するneo遺伝
子のmＲＮＡの領域に相補的である。プライマー２の配
列(２４ヌクレオチド、図２)は、neo遺伝子のヌクレオ
チド位置１９３７〜１９６０に対応する。さらに、プラ
イマー２は、バクテリオファージ Ｔ７のＲＮＡポリメ
ラーゼ(Ｔ７ＲＮＡＰ、配列：図２)に関して最小限必要
なプロモーターの二本鎖配列を含有する(ウーレンベッ
クら(Ｕhlenbeck et al.)、ネイチャー(Ｎature)、３２
８（１９８７）５９６〜６００)。また、プライマー２
は、部分二本鎖を安定にするＡＴ−豊富ループ領域を含
有する。該プライマー配列の２つの官能的変形を図２に
示す(３'末端のddＡまたはddＧ)。プライマー２は、例
えば、マキサム・アンド・ギルバート(Ｍaxam and Ｇil
bert)、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Ｍethods i
n Ｅnzymology)第６０巻(１９８０)第４９９頁およびヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ(Ｎucleic Ａcids Ｒe
search)３(１９７６)８６３の記載に従って、５'末端で
ホスホリル化される。また、ddＡまたはddＧは、該文献
に開示されているように３'末端で加えられる。
ヌクレオチド、図１)は、ベックらに従ってＤＮＡ配列
のヌクレオチド２００８〜２０３１に対応するneo遺伝
子のmＲＮＡの領域に相補的である。プライマー２の配
列(２４ヌクレオチド、図２)は、neo遺伝子のヌクレオ
チド位置１９３７〜１９６０に対応する。さらに、プラ
イマー２は、バクテリオファージ Ｔ７のＲＮＡポリメ
ラーゼ(Ｔ７ＲＮＡＰ、配列：図２)に関して最小限必要
なプロモーターの二本鎖配列を含有する(ウーレンベッ
クら(Ｕhlenbeck et al.)、ネイチャー(Ｎature)、３２
８（１９８７）５９６〜６００)。また、プライマー２
は、部分二本鎖を安定にするＡＴ−豊富ループ領域を含
有する。該プライマー配列の２つの官能的変形を図２に
示す(３'末端のddＡまたはddＧ)。プライマー２は、例
えば、マキサム・アンド・ギルバート(Ｍaxam and Ｇil
bert)、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Ｍethods i
n Ｅnzymology)第６０巻(１９８０)第４９９頁およびヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ(Ｎucleic Ａcids Ｒe
search)３(１９７６)８６３の記載に従って、５'末端で
ホスホリル化される。また、ddＡまたはddＧは、該文献
に開示されているように３'末端で加えられる。
【００３６】ｂ）増幅反応 反応混合物：４ミリモル／リットル トリス(Ｔris) Ｈ
Ｃl（３７℃でpＨ８）、１０ミリモル／リットル ＤＴ
Ｔ、１ミリモル／リットル スペルミジン、０.０１％
トリトン(Ｔriton) Ｘ １００、８％ ポリエチレングリ
コール、２０ミリモル／リットル ＭgＣl2、１ミリモル
／リットル ＡＴＰ、各２ミリモル／リットル ＮＴＰs
各１ミリモル／リットル dＮＴＰs、５００ナノモル／
リットル プライマー１、１マイクロモル／リットル プ
ライマー２、５Ｕ／反応容量 Ｔ４リガーゼ、４０Ｕ／
反応容量 Ｔ７ ＲＮＡＰ、２０Ｕ／反応容量 逆トラン
スクリプターゼおよび１Ｕ／反応容量 ＲＮaseＨ。
Ｃl（３７℃でpＨ８）、１０ミリモル／リットル ＤＴ
Ｔ、１ミリモル／リットル スペルミジン、０.０１％
トリトン(Ｔriton) Ｘ １００、８％ ポリエチレングリ
コール、２０ミリモル／リットル ＭgＣl2、１ミリモル
／リットル ＡＴＰ、各２ミリモル／リットル ＮＴＰs
各１ミリモル／リットル dＮＴＰs、５００ナノモル／
リットル プライマー１、１マイクロモル／リットル プ
ライマー２、５Ｕ／反応容量 Ｔ４リガーゼ、４０Ｕ／
反応容量 Ｔ７ ＲＮＡＰ、２０Ｕ／反応容量 逆トラン
スクリプターゼおよび１Ｕ／反応容量 ＲＮaseＨ。
【００３７】マニアティス(Ｍaniatis)(下記参照)第７.
３頁〜第７.４頁と類似の０.１％ジエチルピロカーボネ
ートと一緒に使用する前に、使用する非酵素物質を前処
理する。
３頁〜第７.４頁と類似の０.１％ジエチルピロカーボネ
ートと一緒に使用する前に、使用する非酵素物質を前処
理する。
【００３８】容量５０マイクロリットルの反応容器に試
料(実施例１のＲＮＡフラグメントまたはその希釈物)を
加え、該容器に反応混合物を入れる。
料(実施例１のＲＮＡフラグメントまたはその希釈物)を
加え、該容器に反応混合物を入れる。
【００３９】調製物を３７℃で２時間インキュベート
し、得られたＲＮＡをエタノールによって沈殿させ、Ｒ
ＮＡゲル中で分離し、着色させ、ナイロン膜上に移す
(モレキュラー・クローニング(Ｍolecular Ｃloning)、
１９８９、編集者：サンブルークら、ＣＳＨ、第７.４
３頁〜第７.５１頁の記載に従う)。膜−結合ＲＮＡは、
ジゴキシゲニン(“ディエヌエイ・ラベリング・アンド
・ディテクション(ＤＮＡＬabelling and Ｄetectio
n)"、ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミ
ット・ベシュレンクテル・ハフツング(Ｂoehringer Ｍa
nnheim ＧmbＨ)、１９８９、第２７頁〜第２８頁または
国際出願ＷＯ ８９／０６６９８に従って製造した)で標
識されたneo−特異的プローブによって検出することが
できる。
し、得られたＲＮＡをエタノールによって沈殿させ、Ｒ
ＮＡゲル中で分離し、着色させ、ナイロン膜上に移す
(モレキュラー・クローニング(Ｍolecular Ｃloning)、
１９８９、編集者：サンブルークら、ＣＳＨ、第７.４
３頁〜第７.５１頁の記載に従う)。膜−結合ＲＮＡは、
ジゴキシゲニン(“ディエヌエイ・ラベリング・アンド
・ディテクション(ＤＮＡＬabelling and Ｄetectio
n)"、ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミ
ット・ベシュレンクテル・ハフツング(Ｂoehringer Ｍa
nnheim ＧmbＨ)、１９８９、第２７頁〜第２８頁または
国際出願ＷＯ ８９／０６６９８に従って製造した)で標
識されたneo−特異的プローブによって検出することが
できる。
【図１】 図１は、実施例１において使用する第１プラ
イマーのヌクレオチド配列を示す図である。
イマーのヌクレオチド配列を示す図である。
【図２】 第２プライマーに関する２つの変形例を示す
図である。
図である。
【図３】 本発明の核酸に関する検出法の好ましい例を
示す図である。
示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リューディガー・ルーガー ドイツ連邦共和国8124ゼーシャウプト、ト ゥートツィンゲル・シュトラーセ２番
Claims (12)
- 【請求項１】 核酸鋳型に２つの核酸プライマーを核酸
鋳型にハイブリダイズし、これらのプライマーによって
該鋳型と相補的な核酸を形成し、形成された核酸を該鋳
型に類似の多数の核酸に転写することによる核酸鋳型の
特異的増殖方法であって、 該鋳型が、同一方向に配列された２つのプライマーでハ
イブリダイズされ、これらのプライマーは該鋳型と相補
的な配列を含有しており、これらのプライマーのうちの
第２プライマーは第１プライマーから離れた端部に転写
開始部位およびＲＮＡポリメラーゼが結合することがで
きる二本鎖配列を担持しており、 このようにハイブリダイズされた２つのプライマーを共
有結合させて、それらの間のギャップを充足することに
よって鋳型と相補的な核酸を形成し、 この鋳型と相補的なこの核酸の転写物を形成することを
特徴とする核酸鋳型の特異的増殖方法。 - 【請求項２】 核酸鋳型に２つの核酸プライマーをハイ
ブリダイズし、これらのプライマーによって該鋳型と相
補的な核酸を形成し、形成された核酸を該鋳型に類似の
多数の核酸に転写することによる核酸鋳型の検出方法で
あって、 該鋳型が、同一方向に配列された２つのプライマーでハ
イブリダイズされ、これらのプライマーは該鋳型と相補
的な配列を含有しており、これらのプライマーのうちの
第２プライマーが第１プライマーから離れた端部に転写
開始部位およびＲＮＡポリメラーゼが結合することがで
きる二本鎖配列を担持しており、このようにハイブリダ
イズされた２つのプライマーを共有結合させて、それら
の間のギャップを充足することによって鋳型と相補的な
核酸を形成し、該鋳型と相補的なこの核酸から転写物を
形成し、これらの転写物を公知の方法で検出することを
特徴とする核酸鋳型の検出方法。 - 【請求項３】 形成された転写物を、再度、プライマー
とのハイブリダイゼーションのための鋳型として使用
し、該増殖方法を繰り返す請求項１または２記載の方
法。 - 【請求項４】 鋳型と、該鋳型と相補的である核酸との
間のハイブリダイゼーションを転写物の形成前に停止さ
せる請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項５】 該ハイブリダイゼーションをＲＮaseＨ
によって停止させる請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 鋳型としてＤＮＡを使用する請求項１〜
５のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】 鋳型としてＲＮＡを使用する請求項１〜
５のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項８】 プライマーとのハイブリダイゼーション
前に鋳型を一本鎖形態に変換する請求項１〜６のいずれ
か１項記載の方法。 - 【請求項９】 二本鎖ＤＮＡ鋳型を１つまたはいくつか
の制限エンドヌクレアーゼによって開裂し、一本鎖形態
に変換する請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１０】 第１プライマーの二本鎖配列が、各
々、１７〜１００相補的塩基の長さを有している請求項
１〜９のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１１】 該二本鎖の相補的部分を５〜１００塩
基長の核酸フラグメントを介して一緒に結合する請求項
１０記載の方法。 - 【請求項１２】 第２プライマーにおける５'末端をホ
スホリル化し、第１プライマーと面している二本鎖の
３'末端をジデオキシヌクレオチドによって末端処理す
る請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4010465A DE4010465A1 (de) | 1990-03-31 | 1990-03-31 | Verfahren zur spezifischen vervielfaeltigung von nukleinsaeuretemplates und zur bestimmung von nukleinsaeuren |
| DE4010465.6 | 1990-03-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05211873A true JPH05211873A (ja) | 1993-08-24 |
Family
ID=6403520
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3061502A Pending JPH05211873A (ja) | 1990-03-31 | 1991-03-26 | 核酸鋳型の特異的増殖方法および核酸の決定方法 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0451591A1 (ja) |
| JP (1) | JPH05211873A (ja) |
| KR (1) | KR940010863B1 (ja) |
| AU (1) | AU631304B2 (ja) |
| CA (1) | CA2039388A1 (ja) |
| DE (1) | DE4010465A1 (ja) |
| FI (1) | FI911557A (ja) |
| IE (1) | IE911034A1 (ja) |
| IL (1) | IL97686A (ja) |
| NO (1) | NO911240L (ja) |
| NZ (1) | NZ237578A (ja) |
| PT (1) | PT97194A (ja) |
| ZA (1) | ZA912357B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2045337A1 (en) | 1998-11-09 | 2009-04-08 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Process for synthesizing nucleic acid |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5981179A (en) * | 1991-11-14 | 1999-11-09 | Digene Diagnostics, Inc. | Continuous amplification reaction |
| US6207368B1 (en) | 1992-08-04 | 2001-03-27 | Beckman Coulter, Inc. | Methods and reagents for controlling chain extension and ligation chain reactions |
| FR2726277B1 (fr) * | 1994-10-28 | 1996-12-27 | Bio Merieux | Oligonucleotide utilisable comme amorce dans une methode d'amplification basee sur une replication avec deplacement de brin |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3726934A1 (de) * | 1987-08-13 | 1989-02-23 | Merck Patent Gmbh | Verfahren zum nachweis von nukleinsaeure-sequenzen |
| WO1990001068A1 (en) * | 1988-07-22 | 1990-02-08 | Life Technologies, Inc. | Sequence specific assay for the detection of a nucleic acid molecule |
| CA2001110A1 (en) * | 1988-11-18 | 1990-05-18 | Zvi G. Loewy | Compositions and process for amplifying and detecting nucleic acid sequences |
| CA2004326A1 (en) * | 1988-12-23 | 1990-06-23 | Nanibushan Dattagupta | Assay of sequences using amplified genes |
| JPH05506987A (ja) * | 1990-03-07 | 1993-10-14 | エフ．ホフマン ― ラ ロシュ アーゲー | ライム病の診断方法 |
-
1990
- 1990-03-31 DE DE4010465A patent/DE4010465A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-03-22 KR KR1019910004537A patent/KR940010863B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-03-25 EP EP91104651A patent/EP0451591A1/de not_active Ceased
- 1991-03-26 NZ NZ237578A patent/NZ237578A/xx unknown
- 1991-03-26 JP JP3061502A patent/JPH05211873A/ja active Pending
- 1991-03-26 AU AU73817/91A patent/AU631304B2/en not_active Ceased
- 1991-03-26 IL IL9768691A patent/IL97686A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-03-26 NO NO91911240A patent/NO911240L/no unknown
- 1991-03-28 PT PT97194A patent/PT97194A/pt not_active Application Discontinuation
- 1991-03-28 FI FI911557A patent/FI911557A/fi not_active Application Discontinuation
- 1991-03-28 IE IE103491A patent/IE911034A1/en unknown
- 1991-03-28 CA CA002039388A patent/CA2039388A1/en not_active Abandoned
- 1991-03-28 ZA ZA912357A patent/ZA912357B/xx unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| FEBS LETTERS=1987 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2045337A1 (en) | 1998-11-09 | 2009-04-08 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Process for synthesizing nucleic acid |
| EP2287338A1 (en) | 1998-11-09 | 2011-02-23 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Process for synthesizing nucleic acid |
| US9909168B2 (en) | 1998-11-09 | 2018-03-06 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Method of synthesizing nucleic acid |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO911240L (no) | 1991-10-01 |
| IL97686A (en) | 1994-12-29 |
| AU631304B2 (en) | 1992-11-19 |
| NZ237578A (en) | 1993-09-27 |
| IL97686A0 (en) | 1992-06-21 |
| CA2039388A1 (en) | 1991-10-01 |
| FI911557A0 (fi) | 1991-03-28 |
| ZA912357B (en) | 1991-12-24 |
| KR910016919A (ko) | 1991-11-05 |
| PT97194A (pt) | 1991-11-29 |
| EP0451591A1 (de) | 1991-10-16 |
| DE4010465A1 (de) | 1991-10-02 |
| IE911034A1 (en) | 1991-10-09 |
| FI911557A (fi) | 1991-10-01 |
| KR940010863B1 (ko) | 1994-11-18 |
| NO911240D0 (no) | 1991-03-26 |
| AU7381791A (en) | 1991-10-03 |
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