JPH08228784A - 改良された転写方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 慣用の転写方法を改良して不全型転写物の産
生を減少させること。 【解決手段】 プロモーター配列ＰＰおよびＰＰ'なら
びにエフェクター配列ＰＥからなる、機能的であり、か
つ、少なくとも一部分が二本鎖であるプロモーター領
域、および該プロモーター領域に機能的に連結する鋳型
核酸配列ＴＮからなる部分的にまたは完全に二本鎖の核
酸複合体を形成し、プロモーターの制御下で鋳型として
のＴＮの助けによってリボ核酸Ｒが形成される条件を調
節することからなる鋳型核酸Ｔにおける鋳型核酸配列Ｔ
Ｎのリボ核酸Ｒへの転写方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、鋳型核酸における
鋳型核酸配列のリボ核酸への転写方法、好適な試薬、お
よびこれらの試薬の好都合な適用および使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】イン・ビトロ転写は、ＲＮＡ分子を産生
させるのによく受け入れられる方法である。所望の鋳型
配列（以下、鋳型核酸配列と称される）に加えて、この
方法は、ＲＮＡポリメラーゼ、および、鋳型核酸配列に
機能的に連結されるプロモーターを必要とする。ファー
ジＴ３、Ｔ７またはＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼは、取
り扱いが容易であり、高い転写効率を示すので、それら
を使用するのが好ましい。鋳型分子（以下、鋳型核酸と
称される）は、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオ
チドである。ポリヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲを介
して得ることができるか、または、対応する転写ベクタ
ーにおいてクローンされ得る。ＲＮＡオリゴヌクレオチ
ドの産生のためのオリゴヌクレオチド、すなわち、短い
核酸の使用は、知られている。

【０００３】ＥＰ−Ａ−０４０８２９５には、部分的に
二本鎖の核酸が転写反応に付される核酸増幅方法が開示
されている。該核酸としては、ＤＮＡ鋳型配列およびプ
ロモーター核酸が挙げられ、該プロモーター核酸は、プ
ロモーター配列、標的ＤＮＡと相補的である配列、およ
び標的ＤＮＡの対の鎖と相補的である配列からなる。該
反応条件から、プロモーター核酸は、反応混合物中に含
有されるＲＮａｓｅによって消化されるので、該プロモ
ーター核酸は、ＤＮＡであると考えることができる。

【０００４】Ｊ.Ｍol.Ｂiol.２２４、３１９−３３４
（１９９２）から、イン・ビトロ転写方法により、約９
ヌクレオチドまでの長さを有する多量の不全型（aborti
ve）転写物が産生されることが知られている。これらの
短い転写物は、エタノールによる沈殿などの標準的な方
法によって定量的に分離することができない。かかる分
離は、例えば、ＨＰＬＣまたはゲル電気泳動法を介する
精製などの非常に複雑な方法を必要とする。不全型転写
物は、産生された全長転写物の量の正確な測定（例え
ば、光度測定法による）を妨害する。さらにまた、これ
らの不全型転写物の産生は、全長転写物の収量を減少さ
せる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、慣用
の転写方法を改良し、特に、不全型転写物の産生を減少
させることであった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、部分的にまた
は完全に二本鎖の核酸複合体を形成することによる鋳型
核酸Ｔにおける鋳型核酸配列ＴＮのリボ核酸Ｒへの転写
方法を提供するものである。該複合体は、プロモーター
配列ＰＰおよびＰＰ'の機能的な、少なくとも一部分が
二本鎖であるプロモーター領域、エフェクター配列Ｐ
Ｅ、ならびに該プロモーター領域に機能的に連結される
鋳型核酸ＴＮを含有する；さらに、鋳型配列としてＴＮ
を使用してリボ核酸Ｒが形成される条件は、プロモータ
ーの制御下である。

【０００７】本発明の中核は、全長転写物の収量に対す
る負の効果をあまり生じることなく、（例えば、プロモ
ーター領域における、または、この領域での）エフェク
ター配列ＰＥの存在のために、産生される不全型転写物
の量を減少させることができるという発見である。この
発見は、転写方法がプロモーターの制御下で行われるこ
とを条件に、全ての転写方法に適用され得る。この発見
は、イン・ビトロ転写について、および、Ｔ７、Ｔ３ま
たはＳＰ６などのファージＲＮＡポリメラーゼを使用す
る転写について特に重要なものである。

【０００８】核酸は、天然および合成の両方の核酸であ
ると解される。天然核酸は、例えば、ウイルス、細菌ま
たは多細胞微生物などにおいて生じるものである。それ
らは、糖リン酸骨格に結合した、フレームでの順序が個
々の微生物またはそのゲノムの一部分について特徴的で
ある核塩基を含有する。核酸の実質的な特徴は、それと
相補的である核塩基を有する核酸と二本鎖を形成する能
力である。

【０００９】合成核酸は、例えば、糖リン酸骨格をポリ
ペプチド骨格と置き換えることによって、または、天然
塩基の代わりに非天然塩基を導入することによって、構
造が修飾されたものと解される。しかしながら、前者
は、なおも、他の核酸、特に、天然核酸と二本鎖を形成
する能力を有している。

【００１０】当業者により、転写は、ＲＮＡポリメラー
ゼを用いてプロモーターの制御下で鋳型核酸の助けによ
りリボ核酸を産生させるための方法であると解される。

【００１１】鋳型核酸Ｔは、リボ核酸（Ｒ）に転写され
るべきである鋳型核酸配列ＴＮを含有する一本鎖または
二本鎖または部分的に二本鎖の核酸である。得られたリ
ボ核酸は、鋳型核酸配列と相補的である。鋳型核酸配列
ＴＮを含有する鎖は、暗号付け鎖（coding strand）と
して知られている。暗号付け鎖は、デオキシリボ核酸
（ＤＮＡ）でなければならない。

【００１２】本発明において解されるプロモーターは、
ＲＮＡポリメラーゼのための結合部位として、および、
転写のための開始部位として供される少なくとも部分的
に二本鎖の核酸領域である。鋳型核酸がその暗号付け鎖
の５'末端に結合される場合、鋳型核酸配列の転写物
は、好適な反応条件が設定されることを条件として合成
される。そこで、このプロモーターは、鋳型核酸配列に
機能的に連結されると記される。本発明は、プロモータ
ー鎖の一部が欠失していてもよいことを提案する。部分
的に二本鎖であろうと完全に二本鎖であろうと、プロモ
ーターの機能性を維持するために必要な全長が保持され
ることが重要であると思われる。実施例は、プロモータ
ー領域（その二本鎖）におけるいわゆるニックの取込み
が転写の効率に対する影響を全くまたは非常に僅かにし
か有しないことを示した。Ｔ７プロモーターを使用する
と、非暗号付け鎖の位置−５／−４、−８／−７、−１
７／−１１およびＴ７プロモーターの位置−１２／−１
３、−１４／−１５および−１５／−１６の間にニック
を有することができた（図１）。さらにまた、プロモー
ターの非暗号付け鎖ＰＰは、５'末端で始まってほぼ−
８位まで達しなければならないが、一方、暗号付け鎖
は、続く一本鎖領域が別の核酸とのハイブリダイゼーシ
ョンによって二本鎖に転換されることを必要とせずに、
５'末端で開始されてほぼ−１３位に達しなければなら
ないことが重要であると思われる。

【００１３】プロモーターの暗号付け鎖は、以下、プロ
モーター配列ＰＰ'と称され、一方、非暗号付け鎖は、
プロモーター配列ＰＰと称される。プロモーター領域に
おける核塩基の順序は、ファージ（例えば、Ｔ３、Ｔ７
またはＳＰ６）からの一連のプロモーターについて知ら
れている。

【００１４】配列ＰＴは、鋳型核酸とハイブリダイズさ
れ得る配列を示す。したがって、配列ＰＴは、鋳型核酸
の一部分と実質的に相補的である。好ましくは、長い鋳
型核酸配列は、該プロモーターの下流の鋳型核酸のこの
部分に続く。この長い鋳型核酸は、配列ＰＴがハイブリ
ダイズされ得る部分で始まる転写反応の目的物質であ
る。配列ＰＴは、好ましくは、ＲＮＡではない。

【００１５】本発明のエフェクター配列は、核酸でもあ
る。本発明の第１の好ましい態様では、エフェクター配
列における核塩基の順序は、選択された条件がエフェク
ター配列を鋳型核酸配列ＴＮ、その対の鎖ＴＮ'、プロ
モーター配列ＰＰまたはその対の鎖ＰＰ'とハイブリダ
イズさせないような順序である。好ましくは、エフェク
ター配列は、反応混合物に存在する他の核酸とハイブリ
ダイズすべきではない。本発明の第２の態様は、エフェ
クター配列がＤＮＡである場合に転写反応の全効率が負
に影響されるので、該エフェクター配列がＤＮＡではな
いのが好ましいことを提案する。

【００１６】エフェクター配列ＰＥの長さは、大体、無
関係である。しかしながら、実験により、最小長さ４ヌ
クレオチドを有すべきであることが判明した。ＰＥの好
ましい長さは、５〜５０であり、特に好ましい長さは、
１０〜３０ヌクレオチドである。

【００１７】プロモーター核酸Ｐは、他の核酸配列に加
えて、プロモーター配列ＰＰおよび／またはその対の鎖
ＰＰ'を含有する核酸であると解される。

【００１８】リンカーは、１個または数個の原子を含有
し、２つの核酸配列をお互いに共有結合させる分子の一
部であると解される。該リンカーは、ヌクレオシド起源
のものであっても、非ヌクレオシド起源のものであって
もよい。好ましくは、該リンカーは、核酸配列である。
１つの具体例では、該リンカーは、鋳型核酸配列とハイ
ブリダイズすることができる配列ＰＴである。

【００１９】別の具体例では、該リンカーは、プロモー
ター鎖とエフェクター配列との間の所望の連結である。

【００２０】図２は、ニックについて耐性を示すモデル
核酸（二本鎖、配列番号１０）である。

【００２１】エフェクター配列とプロモーター配列との
間の結合は、種々の方法で行うことができる。これらの
場合の１つは、図２に示される。第１の可能性におい
て、エフェクター配列ＰＥは、直接またはリンカーを介
して、プロモーター配列ＰＰの３'末端に結合する。

【００２２】第２の場合（図２のＡ）では、エフェクタ
ー配列は、プロモーターＰＰの１位におけるヌクレオチ
ドに直接連結される。これは、プロモーター配列の３'
ヒドロキシル基とエフェクター配列の５'ヒドロキシル
基との間での慣用のホスホジエステル結合を介する簡単
な方法で行うことができる。

【００２３】第３の具体例（図２のＢ）では、エフェク
ター配列は、完全なプロモーター配列と比較して、（Ｔ
７プロモーターを使用する場合）−１位から−８位まで
平滑末端化され得るプロモーター配列ＰＰの３'ヒドロ
キシル基に直接結合される。この場合、ＰＰに含有され
ないプロモーターヌクレオチドを含有する第２の分子を
使用する必要がない。

【００２４】第４の具体例では、エフェクター配列は、
プロモーター配列ＰＰの３'ヒドロキシル基に連結され
る；この３'末端は、（Ｔ７プロモーターを使用する場
合）ほぼプロモーター領域のヌクレオチド−９と５'末
端との間に位置する。この場合、ＰＰから分離される第
２のプロモーター配列を有することが必要であり、該配
列は、ＰＰに含有されないプロモーターヌクレオチドを
含有する（図２のＣ）。

【００２５】第５の具体例では、エフェクター配列の
３'末端は、プロモーター配列ＰＰにおけるヌクレオチ
ドの５'ヒドロキシル基に連結される。この位置は、−
１２位の下流に位置する。この場合、ＰＰに含有されな
いプロモーターヌクレオチドを含有する第２のプロモー
ターオリゴヌクレオチドを有するのも好ましい（図２の
Ｄ）。

【００２６】第６の具体例（図２のＥ）では、エフェク
ター配列ＰＥは、プロモーター配列ＰＰの５'末端に直
接連結される。

【００２７】さらなる可能性を図２のＦ〜Ｉに示す。

【００２８】前記具体例は、対応して、プロモーターの
暗号付け鎖、すなわち、プロモーター配列ＰＰ'に適用
することができる；しかしながら、前記のプロモーター
配列ＰＰ'の耐性限界を考慮しなければならない。

【００２９】第１の具体例（図２のＫ）では、エフェク
ター配列ＰＥは、プロモーター領域ＰＰ'の暗号付け鎖
の３'ヒドロキシル基に連結される。

【００３０】第２の具体例（図２のＬ）では、エフェク
ター配列ＰＥは、配列ＰＰ'の−１位〜約−１４位以上
までのヌクレオチドだけが存在するような方法でＰＰ'
の３'末端に連結される。この場合、一本鎖領域につい
てさらなるオリゴヌクレオチドを有する必要がない。

【００３１】第３の具体例（図２のＭ）では、エフェク
ター配列の５'末端は、エフェクター配列を含有するプ
ロモーター領域の鎖が−１位と約−１２位との間のヌク
レオチドだけを含有するような方法で、プロモーター領
域の暗号付け鎖の３'末端に連結される。

【００３２】第４の具体例（図２のＮ）では、エフェク
ター配列の３'末端は、プロモーター内の鎖ＰＰ'の５'
末端に結合される。この場合、一本鎖セグメントが、ハ
イブリダイゼーションによって、オリゴヌクレオチドま
たは伸長した鋳型核酸配列で覆われていることも推奨さ
れる。

【００３３】第５の具体例（Ｏ）では、鎖の５'末端
は、標的配列に連結された暗号付け鎖がプロモーター配
列全体を覆うように、エフェクター配列の３'末端に連
結される。

【００３４】第６の具体例では、エフェクター配列は、
プロモーターの暗号付け鎖が完全に保持され、鋳型配列
に結合されないように、鋳型核酸配列の３'末端に結合
される。

【００３５】現在までのところ、エフェクター配列の
３'末端が鎖ＰＰ'上のプロモーター領域の５'末端に連
結される具体例は、転写のために使用することができな
かった。

【００３６】しかしながら、これらの各々の場合、ＰＰ
の５'末端および／または補足オリゴヌクレオチドは、
直接またはループ構造の助けによりリンカーを介して、
ＰＰ'の３'末端または補足オリゴヌクレオチドに結合さ
れることも可能である。好ましくは、図２における各ケ
ースの左端は、長さ５〜４０ヌクレオチドのリンカーを
介して結合される。

【００３７】本発明の転写方法は、一般的に転写反応の
ために必要である全ての反応条件を必要とする。それら
は、特に、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（トランス
クリプターゼ）を含む。後者は、鋳型核酸配列ＴＮの多
くのＲＮＡコピーを合成するが、一方、例えば大きな鋳
型核酸に存在する配列が一本鎖であるかまたは二本鎖で
あるかは無関係である。ＲＮＡ分子は、プロモーターの
出発部分で始まって３'方向に形成される。該プロモー
ター配列は、翻訳されない。トランスクリプターゼは、
使用されるプロモーターと適合しなければならない。バ
クテリオファージＴ７の典型的なプロモーターを使用す
る場合、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼを使用することも必
要である。

【００３８】転写反応のもう１つの絶対的に必要な部分
は、モノリボヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰ）であ
る。それらは、ポリメラーゼによって、得られたリボ核
酸に結合される。これらのｒＮＴＰは、非修飾であって
もよいが、例えば標識基を付加することによって、修飾
することもできる。

【００３９】本発明において解されるような標識は、直
接または間接的に検出することができる基Ｌである。直
接検出可能な基としては、放射性（³²Ｐ）、着色され
た、または、蛍光性の基または金属原子が挙げられる。
間接的に検出可能な基としては、抗体、抗原、ハプテ
ン、または酵素もしくは酵素的に活性な部分酵素などの
免疫学的または酵素学的に活性な化合物が挙げられる。
それらは、次反応または反応シーケンスにおいて検出さ
れる。ハプテンは、それらが標識として使用される場合
にヌクレオシド三リン酸がポリメラーゼの基質として特
によく適しているので、特に好ましい；その場合、ハプ
テンまたはハプテン化ヌクレオシドに対する標識抗体と
の次反応は、容易に行われる。かかるヌクレオシド三リ
ン酸としては、ブロモヌクレオシド三リン酸またはジゴ
キシゲニン、ジゴキシン、ビオチンもしくはフルオレセ
イン結合ヌクレオシド三リン酸が挙げられる。ＥＰ−Ａ
−０３２４ ４７４に開示されているステロイドおよび
それらの検出は、特に好適であることを証明した。核酸
におけるそれらの取込みについての詳細は、ＥＰ−Ａ−
０ ３２４ ４７４に言及されている。

【００４０】天然一本鎖または人工一本鎖である鋳型核
酸からリボ核酸を産生するための転写反応の第１の特に
簡単な具体例では、この鋳型核酸Ｔは、プロモーター核
酸Ｐと接触させられる；後者は、プロモーター配列Ｐ
Ｐ、鋳型核酸配列とハイブリダイズすることができる配
列ＰＴ、およびエフェクターＰＥを含有する。該接触
は、ハイブリダイゼーション条件下で行われる。これら
の条件は、ハイブリッドの形成後に転写反応が生じるこ
とができるように設定しておくことができる。しかしな
がら、転写反応を開始するために、ハイブリダイゼーシ
ョン後だけに条件を調節することも可能である。転写に
必要な配列ＰＰ'は、Ｔに含有されるか、または、添加
される。多数の転写物は、充分な待ち時間の後に形成さ
れる。これらの転写物は、さらなる処理または使用のた
めに使用することができる。

【００４１】さらなる処理のための可能性は、このリボ
核酸のサイクル増幅法である。このために、リボ核酸
は、その伸長が、プロモーター核酸Ｐの部分ＰＴとハイ
ブリダイズすることができる一部分を含有する核酸に導
くように配列が選択されるプライマーＰＲとハイブリダ
イズすることができる。この反応は、ｃＤＮＡ合成のた
めに通常必要な試薬、例えば、リバーストランスクリプ
ターゼおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮ
ＴＰ）を必要とする。増幅を行うためには、リボ核酸お
よび伸長産生物は、ＰＲから分離されなければならない
か、または、リボ核酸は、消化されなければならない。
第２の可能性は、特にＲＮａｓｅ Ｈを使用する場合に
は、等温サイクル反応を許容するので、特に好都合であ
る。一本鎖として存在すると、該プライマーの伸長産生
物は、プロモーター核酸とハイブリダイズすることがで
きる。次いで、反応条件下で、伸長産生物の３'末端
は、暗号付け鎖ＰＰ'によって伸長されることができ
る。このようにして形成された部分的に二本鎖の核酸
は、ＲＮＡを産生させるための転写のために再度使用す
ることができる。反応混合物中に存在する伸長産生物の
数およびリボ核酸の数は、行われる反応サイクルの数に
従って増加する。

【００４２】図３に示される本発明の方法の別の具体例
では、部分的に二本鎖の核酸複合体は、前反応で形成さ
れる。転写反応で使用される鋳型核酸についての前段階
であり、この具体例ではＤＮＡまたはＲＮＡのいずれで
あってもよい一本鎖鋳型核酸Ｔ＊は、プライマーとハイ
ブリダイズされる。鋳型核酸のタイプに依存するｄＮＴ
Ｐおよびポリメラーゼ酵素を使用して、プライマーを伸
長させて、伸長産生物を形成する；次いで、後者は、鋳
型核酸として供される。伸長産生物が鋳型核酸配列ＴＮ
であるようにプライマーが選択されるという事実に注意
を払わなければならない。それは、配列ＰＴとハイブリ
ダイズされることができる配列も含有しなければならな
い。ＰＴは、ＰＰ'がＴ＊に含有される場合には必要で
はない。該プライマーの伸長産生物は、今、一本鎖形で
利用可能にされなければならない。これは、変性させる
ことによって（特に、ＤＮＡが鋳型核酸Ｔ＊として使用
される場合）またはＲＮａｓｅ Ｈでの処理によって
（鋳型核酸Ｔ＊がＲＮＡである場合）行われることがで
きる。その結果、プライマーの伸長産生物は、成分Ｐ
Ｐ'、ＰＴおよびＰＥをこの順序で含有するプロモータ
ー核酸Ｐとハイブリダイズされる。その結果、転写反応
が行わせしめられる。このようにして形成されたＲＮＡ
を再度サイクル増幅させることが可能になり、一方、別
に、プライマーおよびプロモーター核酸Ｐを再度使用す
ることも可能になる。次いで、このようにして形成され
たＲＮＡは、鋳型核酸Ｔ＊として再度使用される。

【００４３】従来技術により、プロモーター核酸を使用
する一連の増幅方法が知られている。これらの全ての方
法では、不全型転写物の形成は、なお、問題である。こ
れらの方法は、本発明によるプロモーター核酸配列がプ
ロモーター核酸として使用される本発明の助けにより改
良することができる。かかる公知の方法の例は、ＥＰ−
Ａ−０４０８２９５、ＰＥ−Ａ−０３２９８２２、ＷＯ
９０／０１０６８、ＰＥ−Ａ−０３７３９６０、ＥＰ
−Ａ−０３９７２６９およびＥＰ−Ａ−０３６９７７５
に開示されている。

【００４４】第３の具体例（図４）では、鋳型核酸Ｔと
して一本鎖領域を有する部分的に二本鎖の核酸（例え
ば、ＤＮＡ）が使用される。このタイプの鋳型核酸は、
例えば、オーバーラップ末端を生じつつ制限酵素による
消化によって得られる二本鎖核酸のフラグメントであ
る。鋳型核酸のかかるオーバーラップ末端は、部分的に
二本鎖のプロモーター核酸Ｐの鋳型特異的セグメントＰ
Ｔとハイブリタイズするために供される。該プロモータ
ー核酸は、エフェクター配列が直接または３'末端もし
くはプロモーター配列内でリンカーを介して結合される
プロモーター配列ＰＰを第一鎖中に含有する。さらにま
た、プロモーター核酸Ｐは、別の鎖の上でプロモーター
配列ＰＰ'および５'方向に鋳型特異的配列ＰＴを含有す
る。次いで、プロモーター核酸と鋳型核酸との複合体
は、ハイブリダイゼーション条件下で形成する。所望に
より、鋳型特異的配列の５'末端は、リガーゼによっ
て、その付近に位置する鋳型核酸の３'末端に共有結合
させることができる。次いで、該核酸複合体は、転写物
を産生するために利用可能である。配列ＰＴは、ＰＰの
３'末端で対応して位置することができ、ＰＴは、その
付近にＴＮの一部分またはＴＮと相補的である。

【００４５】第４の具体例（図５）では、制限酵素によ
る切断を必要とせずに、全く類似の核酸が得られる。天
然一本鎖または人工一本鎖である所望の鋳型核酸Ｔは、
例えば、チミン塩基の少なくとも一部がウラシル塩基に
よって置換される消化可能なプロモーター配列ＰＰ＊を
含有する第１のプロモーター核酸Ｐ＊と反応され；プロ
モーター核酸の３'末端には、鋳型核酸と相補的である
第１プライマー配列ＰＴ＊がある。ポリメラーゼ連鎖反
応（ＥＰ−Ａ−０２０２１８４）のために使用される条
件下で、すなわち、第１のプライマーの助けによって形
成される伸長産生物Ｖ１と部分的に相補的である別のプ
ライマーＰＲを使用して、一方の末端に二本鎖プロモー
ター配列を含有し、他方の末端に第２のプライマーの二
本鎖配列を含有する二本鎖核酸を形成する。あとでプラ
イマーＰＲの伸長産生物は、鋳型核酸Ｔとして供され
る。ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼとの処理により、プ
ロモーター配列ＰＰ＊は消化される。プロモーターセグ
メントにおいて部分的に一本鎖である核酸は、本発明の
部分的にまたは完全に一本鎖であるプロモーター核酸Ｐ
とハイブリダイズされる；該プロモーター核酸Ｐは、一
本鎖セグメントと相補的であるプロモーター配列ＰＰお
よびそれに直接結合されるエフェクター配列ＰＥを含有
する。このようにして形成された核酸複合体は、転写の
ために再度利用可能である。

【００４６】また、本発明は、プロモーター配列ＰＰお
よび／またはその対の鎖ＰＰ'、ならびに、ＤＮＡでは
ないエフェクター配列ＰＥを含有するプロモーター核酸
である。プロモーター配列ＰＰおよびＰＰ'は、それら
を構成している成分に関してエフェクター配列ＰＥとは
異なる。プロモーター配列ＰＰまたはＰＰ'は、ＤＮＡ
であるのが好ましい。プロモーター核酸は、一本鎖分子
であるのが好ましいが、二本鎖であってもよい。二本鎖
分子を使用する場合、プロモーター核酸は、ＰＰおよび
ＰＰ＊の両方またはその一部を含有し、その結果、形成
されたプロモーター領域は、完全に機能的である。

【００４７】図２のＡ〜ＥおよびＧについて既に記載し
たように、配列ＰＰおよびＰＥは、１本の鎖の上に位置
するのが好ましい。プロモーター核酸が鋳型特異的配列
ＰＴをも含有する場合、後者は、ＰＰおよびＰＥおよび
／またはＰＰ'およびＰＥと同一の鎖上に位置するのも
好ましい（図２のＧ）。

【００４８】図２のＫ、ＬおよびＮでは、ＰＰ'および
ＰＥは、１本の鎖の上に位置するのが好ましい。

【００４９】また、本発明は、行われるべき転写反応の
ために必要な全ての試薬を含有する試薬キットである；
例外は、リボ核酸が得られる鋳型核酸である。該キット
は、少なくとも１つのプロモーター核酸Ｐを含有する。

【００５０】また、本発明は、不全型転写物の形成を減
少させ、転写方法における核酸産生物の定量測定を改良
し、核酸の検出における感度を増加させ、および／また
は、転写反応において必要とされるモノヌクレオチドの
量を減少させるための、オーバーハング、特にプロモー
ター配列上でのＲＮＡの使用を提供するものである。

【００５１】本発明による不全型転写物の量の減少は、
公知の転写方法を有意に改良する。オーバーハングは、
特に、転写方法における核酸産生物の定量測定を改良す
る。かかる測定は、これまでは、形成される不全型転写
物の量が形成される全ての転写物の８０％までのオーダ
ーの範囲であることを考慮すると困難であった。本発明
によると、本発明の方法は、得られた不全型転写物が減
少させられる全長転写物の測定のためのバックグランド
シグナルに導くので、転写方法における核酸測定の感度
を増加させるために使用することもできる。不全型転写
物の産生は、全長転写物の産生のために利用可能ではな
いｒＮＴＰの増加した要求をも必要とする。本発明につ
いて、少数のリボヌクレオチドを使用することが可能で
ある。さらにまた、形成された全長転写物の数が増加
し、一方、ｒＮＴＰの量が同一のままであることも考え
られる。

【００５２】本発明では、ＤＮＡオーバーハングの長さ
に依存して、完全に除去されなかった場合にＲＮＡオー
バーハングよりもむしろＤＮＡオーバーハングの方が全
転写物の量を減少させることも判明した。知られている
限りでは、本発明によるエフェクター配列の、ＤＮＡオ
ーバーハングとの完全な置換は、ほとんどの場合、本発
明の効果に導かなかった。

【００５３】確実性をもって本発明の効果についての原
因を挙げることは可能ではなかったが、試験されたＴ７
−ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼがプロ
モーター領域で、または、該領域において、ＲＮＡオー
バーハングによって不全型から処理形態に転換すること
ができることが考えられると思われる。

【００５４】図６は、実施例において使用されるオリゴ
ヌクレオチドおよびそれらの配列を示す。デオキシリボ
ヌクレオチドは、大文字で示され、一方、リボヌクレオ
チドは、小文字で示される。全てのオリゴヌクレオチド
は、直鎖状および一本鎖である。

【００５５】

【実施例】以下の実施例は、より詳細に本発明を説明す
る。

【００５６】実施例１ 表１に示された全ての成分を添加することによって、反
応混合物Ａおよび反応混合物Ｂを得た。混合物Ａは、エ
フェクター配列ＰＥを除いて、混合物Ｂの全ての特徴を
含有する。

【００５７】

【表１】

【００５８】ＰＲＯ３：5'-GGACTGGAAGTAATACGACTCAC-
3'（配列番号２）

【００５９】１０×転写緩衝液： Ｔris（ｐＨ７.９） ４００mＭ ＭgＣl₂ ６０mＭ ＤＴＴ １００mＭ スペルミジン ２０mＭ

【００６０】前記混合物を３７℃でインキュベートし
た。５、１０、１５、３０および６０分後、４μlずつ
取り出し、配列決定ゲルについての停止緩衝液３μlを
使用して、該反応を停止した。産生された転写物の相対
的な量を測定するために、２０％配列決定ゲル［サムブ
ルック（Ｓambrook）ら（１９８９）モレキュラー・ク
ローニング（Ｍolecular Ｃloning）、シーエスエイチ
・ラボラトリー・プレス（ＣＳＨ ＬaboratoryPress）
第６.３６頁以下参照］中で測定を行った。変性後に３
μlずつを適用した。２３００ボルトの電圧を印加し
た。ゲルのオートラジオグラムが得られた（図７）。Ｅ
Ａ−Ａ−４０８２９５に示されたゲルについて仮定され
ているように、この表示は、短い転写物が肉眼で見るこ
とができる場合、面積を示す。混合物Ｂにおける不全型
転写物の量は、混合物Ａと比較して非常に減少させられ
ることを明らかに見ることができる。この実施例に記載
されている方法は、本発明によるプロモーター核酸の助
けによる転写についての一般的な作業指示として使用す
ることができる。この実施例は、プロモーター配列ＰＰ
の３'末端がプロモーター領域内であり、プロモーター
配列の非暗号付け鎖が完全ではない場合でさえ、エフェ
クター配列ＰＥがプロモーター配列ＰＰの３'末端に結
合され得ることを示す。この場合、エフェクター配列の
５'末端が−５位におけるヌクレオチド（シトシン）の
３'ヒドロキシル基に結合されるので、プロモーター領
域の非暗号付け鎖の−１位〜−４位は示されない。

【００６１】実施例２ さらに、本発明は、実施例１に記載した指示を使用し
て、他の具体例で試験された。 ａ）実施例１で挙げられた核酸の代わりに、エフェクタ
ー配列がプロモーター領域内でプロモーター配列ＰＰの
５'末端に結合される前記具体例５（図２のＤ）に対応
する具体例を使用した。プロモーター領域は、Ｔ７−Ｒ
ＮＡポリメラーゼプロモーターのコンセンサス配列であ
ると解される。このようにして産生されたプロモーター
核酸Ｐは、ＫＯＭＰ１ １５Ｒと称される（配列番号
４）。このプロモーター核酸は、Ｔ７のプロモーター領
域の−１位〜−１１位を含有する。さらにまた、該反応
混合物にＰＲＯ１と称される別のオリゴヌクレオチド
（配列番号５）を添加した；該オリゴヌクレオチドは、
プロモーター領域の非暗号付け鎖の−１２位〜−１７位
および鋳型核酸Ｔと相補的であるさらなるヌクレオチド
を含有する。ＯＲＰＰＭＯＫと称されるオリゴヌクレオ
チド（配列番号３）を鋳型核酸として使用した；それ
は、鋳型核酸配列、プロモーター配列ＰＰ'、およびオ
リゴヌクレオチドＰＲＯ１（配列番号５）と相補的であ
る別のセグメントを含有する。

【００６２】ｂ）別の具体例は、プロモーター領域の暗
号付け鎖内の位置にエフェクター配列ＰＥを結合させる
ことも可能であることを示した。この場合、ＰＥは、プ
ロモーター領域の−１２位のグアノシンに結合された。
このようにして形成されたプロモーター核酸は、３'末
端から始まって、エフェクター配列ＰＥ、プロモーター
配列ＰＰ'および鋳型核酸ＴＮを含有する。このプロモ
ーター核酸は、ＰＭＯＫ４ ２１Ｒと称される（配列番
号６）。さらにまた、反応混合物にオリゴヌクレオチド
ＯＲＰ４を添加する；このオリゴヌクレオチドは、その
５'末端において、プロモーター領域の暗号付け鎖の残
存する５ヌクレオチドおよびＰＲＯＫＯＭＰと称される
鎖（配列番号７）と相補的であるさらなるヌクレオチド
を有する。これらのオリゴヌクレオチドを一緒に維持
し、機能的なプロモーター領域を与えるためには、５'
末端から見るとＯＲＰ４（配列番号８）の３'末端と相
補的であるオリゴヌクレオチドＰＲＯＫＯＭＰ、プロモ
ーター領域の非暗号付け鎖、次いで、鋳型核酸と相補的
である配列を添加する。

【００６３】ｃ）実施例１の鋳型核酸およびプロモータ
ー配列ＰＰの選択を記載する別の実施例では、エフェク
ター配列長さの効果を試験した。実施例１のエフェクタ
ー配列は、１９リボヌクレオチドの長さを有し、一方、
ＰＲＯ３ ２５Ｒ（配列番号９）は、全長２５リボヌク
レオチドユニットを有するエフェクター配列を含有す
る。これは、エフェクター配列の長さが、少なくとも示
されたセグメントにおいては、本発明の効果に対する関
連した影響を有しないことを示す。

【００６４】図６において、リボヌクレオチドは、小文
字で示され、一方、デオキシリボヌクレオチドは、大文
字で示される。プロモーターのコンセンサス配列は、枠
で囲まれており、転写開始は、＋１で示される。

【００６５】図８のＢは、プロモーター領域におけるＤ
ＮＡオーバーハングの位置および長さの効果を示す図で
ある。ハッチングしたセグメント（図８のＡ）は、プロ
モーター領域を示す。垂直線の数は、オーバーハングを
作製するヌクレオチドの数を示す。「＋」は、生じた有
効な転写を示し、「−」は、転写がＤＮＡオーバーハン
グによって完全に阻害されたことを意味し、「＋／−」
は、減少した効力を示す（図８のＢ）。

【００６６】実施例３ 別の実施例では、プロモーター領域上のニックの効果を
試験した。図１は、プロモーター領域の暗号付け鎖およ
び／または非暗号付け鎖における所定のヌクレオチド位
置の間のニックおよび欠失リン酸基が耐性である（＋）
か、または、耐性ではない（−）かを示す（図１）。

【００６７】以下に、本発明の実施態様について記載す
る。 （１）ａ）ｉ）プロモーター配列ＰＰおよびＰＰ'なら
びにエフェクター配列ＰＥからなる、機能的であり、か
つ、少なくとも一部分が二本鎖であるプロモーター領
域、および ii）該プロモーター領域に機能的に連結する鋳型核酸配
列ＴＮからなる部分的にまたは完全に二本鎖の核酸複合
体を形成し、 ｂ）プロモーターの制御下で鋳型としてのＴＮの助けに
よってリボ核酸Ｒが形成される条件を調節することを特
徴とする、鋳型核酸Ｔにおける鋳型核酸配列ＴＮのリボ
核酸Ｒへの転写方法。 （２）エフェクター配列ＰＥが直接またはリンカーを介
してプロモーター領域に連結される前記（１）記載の転
写方法。 （３）ＰＥが、ＰＰもしくはＰＰ'の末端で、またはＰ
ＰもしくはＰＰ'内で結合される前記（１）または
（２）記載の転写方法。 （４）ＰＥが、所定の反応条件下で、鋳型核酸配列ＴＮ
ともその対の鎖ＴＮ'とも、プロモーター配列ＰＰとも
その対の鎖ＰＰ'ともハイブリダイズすることができな
い前記（１）、（２）または（３）記載の転写方法。 （５）機能的であり、かつ、少なくとも一部分が二本鎖
であるプロモーター領域（ここで、該プロモーター領域
は、エフェクター配列ＰＥが直接またはリンカーを介し
て結合されるプロモーター配列ＰＰおよびＰＰ'からな
り、該エフェクター配列ＰＥは、鋳型核酸配列ＴＮとも
その対の鎖ＴＮ'とも、プロモーター配列ＰＰともその
対の鎖ＰＰ'ともハイブリダイズすることができず、該
エフェクター配列ＰＥは、ＤＮＡではない）からなる部
分的にまたは完全に二本鎖の核酸複合体を形成すること
を特徴とするリボ核酸における鋳型核酸配列の転写方
法。 （６）核酸複合体が、プロモーター核酸Ｐが鋳型核酸Ｔ
にハイブリダイズして形成され、該プロモーター核酸Ｐ
が以下の成分：プロモーター配列ＰＰおよび／またはそ
の対の鎖ＰＰ'、鋳型核酸の少なくとも一部分とハイブ
リダイズすることができる配列ＰＴ、およびエフェクタ
ー配列ＰＥを含有する前記（１）または（５）記載の転
写方法。 （７）鋳型核酸配列ＴＮまたはＴＮ'が一本鎖または二
本鎖領域を有する核酸の一部分であり、配列ＰＴが鋳型
核酸の一本鎖領域にハイブリダイズされるかまたはハイ
ブリダイズされ得る前記（１）または（５）記載の転写
方法。 （８）鋳型核酸配列ＴＮがプロモーター配列ＰＰ'に共
有結合される前記（１）、（２）、（３）または（４）
記載の転写方法。 （９）エフェクター配列ＰＥがプロモーター配列ＰＰの
３'末端に位置する前記（１）または（５）記載の転写
方法。 （１０）エフェクター配列ＰＥが鋳型核酸Ｔの一部分と
相補的でも配列同一でもない前記（５）記載の転写方
法。 （１１）エフェクター配列ＰＥが最小長さ４ヌクレオチ
ド、好ましくは９ヌクレオチドを有する前記（１）また
は（５）記載の転写方法。 （１２）エフェクター配列Ｐの少なくとも一部分または
大部分がＲＮＡである前記（１）または（５）記載の転
写方法。 （１３）第１の一本鎖鋳型核酸Ｔ＊が第１のプロモータ
ー核酸Ｐ＊にハイブリダイズされ（ここで、該第１のプ
ロモーター核酸Ｐ＊は、分解可能なプロモーター配列Ｐ
Ｐ＊および配列ＰＴ＊を含有し、該配列ＰＴ＊は、鋳型
核酸Ｔ＊とハイブリダイズすることができる）、プロモ
ーター核酸Ｐ＊が、鋳型として鋳型核酸Ｔ＊を使用して
伸長されて、伸長産生物Ｖ１を形成し、該伸長産生物Ｖ
１と相補的である鎖が形成され、プロモーター配列Ｐ
Ｐ'が分解され、得られた相補鎖が鋳型核酸Ｔとして使
用される前記（１）または（５）記載の転写方法。 （１４）検出されるべき核酸配列が前記（１）または
（５）記載の鋳型核酸Ｔまたは前記（１３）記載の鋳型
核酸Ｔ＊として使用され、核酸配列の検出が、形成され
たＲＮＡを介して行われることを特徴とする核酸配列の
検出方法。 （１５）プロモーター配列ＰＰまたはその対の鎖ＰＰ＊
およびエフェクター配列ＰＥ（ここで、該エフェクター
配列ＰＥは、ＤＮＡではない）を含有することを特徴と
するプロモーター核酸。 （１６）個々の対の鎖ＰＰ'および／またはＰＰをも含
有する前記（１５）記載のプロモーター核酸。 （１７）鋳型特異的部分ＰＴをも含有する前記（１５）
記載のプロモーター核酸。 （１８）鋳型特異的配列がＰＰおよびＰＥと同一鎖上に
位置する前記（１７）記載のプロモーター核酸。 （１９）ＰＴがＰＰおよびＰＥと対の鎖上に位置する前
記（１７）記載のプロモーター核酸。 （２０）不全型転写物の産生を減少させるためのプロモ
ーター領域のＲＮＡオーバーハングの使用。 （２１）転写方法における核酸の定量的測定を改良する
ためのプロモーター領域のＲＮＡオーバーハングの使
用。 （２２）転写方法における核酸測定の感度を増大させる
ためのプロモーター領域のＲＮＡオーバーハングの使
用。 （２３）転写反応におけるモノヌクレオチド要求を減少
させるためのプロモーター領域のＲＮＡオーバーハング
の使用。

【００６８】

【配列表】

【００６９】配列番号：１ 配列の長さ：４２塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 オリゴヌクレオチド ハイポセティカル：Ｎｏ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１..２３ 他の情報：ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：２４..４２ 他の情報：ＲＮＡ 配列 GGACTGGAAG TAATACGACT CACCGCCGCG UCGCAGAAGA UC 42

【００７０】配列番号：２ 配列の長さ：２３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 オリゴヌクレオチド ハイポセティカル：Ｎｏ 配列 GGACTGGAAG TAATACGACT CAC 23

【００７１】配列番号：３ 配列の長さ：５４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 オリゴデオキシリボヌクレオチ
ド ハイポセティカル：Ｎｏ 配列 ATTCCATGAT TCATTGATTA TTGTCCCTAT AGTGAGTCGT ATTACTTCCA GTCC 54

【００７２】配列番号：４ 配列の長さ：５３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 オリゴヌクレオチド ハイポセティカル：Ｎｏ 配列の特徴： 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：１..１５ 他の情報：ＲＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：１６..５３ 他の情報：ＤＮＡ配列 ＣＧＣＣＧＣＧＵＣＧ ＣＡＧＡＡＧＡＣＴＣ ＡＣＴ
ＡＴＡＧＧＧＡ ＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡ ＴＧＡＡＴＣ
ＡＴＧＧ ＡＡＴ ５３

【００７３】配列番号：５ 配列の長さ：１６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 オリゴデオキシリボヌクレオチ
ド ハイポセティカル：Ｎｏ 配列 ＧＧＡＣＴＧＧＡＡＧ ＴＡＡＴＡＣ
１６

【００７４】配列番号：６ 配列の長さ：６０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 オリゴヌクレオチド ハイポセティカル：Ｎｏ 配列の特徴： 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：１..３９ 他の情報：ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：４０..６０ 他の情報：ＲＮＡ 配列 ＡＴＴＣＣＡＴＧＡＴ ＴＣＡＴＴＧＡＴＴＡ ＴＴＧＴＣＣＣＴＡＴ ＡＧＴ
ＧＡＧＴＣＧＣ ＧＣＣＧＣＧＵＣＧＣ ＡＧＡＡＧＡＵＣＵＣ ６０

【００７５】配列番号：７ 配列の長さ：５４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 オリゴデオキシリボヌクレオチ
ド ハイポセティカル：Ｎｏ 配列 ＧＧＡＣＴＧＧＡＡＧ ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ ＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ ＡＣＡ
ＡＴＡＡＴＣＡ ＡＴＧＡＡＴＣＡＴＧ ＧＡＡＴ ５４

【００７６】配列番号：８ 配列の長さ：１５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 オリゴデオキシリボヌクレオチ
ド ハイポセティカル：Ｎｏ 配列 TATTACTTCC AGTCC 15

【００７７】配列番号：９ 配列の長さ：４８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 オリゴヌクレオチド ハイポセティカル：Ｎｏ 配列の特徴： 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：１..２３ 他の情報：ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：２４..４８ 他の情報：ＲＮＡ 配列 GGACTGGAAG TAATACGACT CACCGCCGCG UCGCAGAAGA UCUCAAUC 48

【００７８】配列番号：１０ 配列の長さ：５４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 二本鎖オリゴデオキシリボヌク
レオチド ハイポセティカル：Ｙｅｓ 配列 GGACTGGAAG TAATACGACT CACTATAGGG ACAATAATCA ATGAATCATG GAAT 54

【図面の簡単な説明】

【図１】 プロモーター領域の暗号付け鎖および／また
は非暗号付け鎖における所定のヌクレオチド位置の間の
ニックおよび欠失リン酸基が耐性である（＋）か、また
は、耐性ではない（−）かを示す図。

【図２】 ニックについて耐性を示すモデル核酸を示す
図。

【図３】 本発明の転写方法を示す図。

【図４】 本発明の転写方法を示す図。

【図５】 本発明の転写方法を示す図。

【図６】 実施例において使用されるオリゴヌクレオチ
ドおよびそれらの配列を示す図。

【図７】 実施例１におけるゲル電気泳動によるオート
ラジオグラムの図面代用写真。

【図８】 ＡおよびＢは、プロモーター領域におけるＤ
ＮＡオーバーハングの位置および長さの効果を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フィオラ・ローゼメイヤー ベルギー、ベー−1300バヴル、ショゼ・ デ・ネルヴィアン（番地の表示なし） ア パルトマン12、パヴィヨン13 (72)発明者 ルドルフ・ザイブル ドイツ連邦共和国デー−82377ペンツベル ク、ザーランガーシュトラーセ46番

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）ｉ）プロモーター配列ＰＰおよびＰ
   Ｐ'ならびにエフェクター配列ＰＥからなる、機能的で
   あり、かつ、少なくとも一部分が二本鎖であるプロモー
   ター領域、および ii）該プロモーター領域に機能的に連結する鋳型核酸配
   列ＴＮからなる部分的にまたは完全に二本鎖の核酸複合
   体を形成し、 ｂ）プロモーターの制御下で鋳型としてのＴＮの助けに
   よってリボ核酸Ｒが形成される条件を調節することを特
   徴とする、鋳型核酸Ｔにおける鋳型核酸配列ＴＮのリボ
   核酸Ｒへの転写方法。
2. 【請求項２】 ＰＥが、ＰＰもしくはＰＰ'の末端で、
   またはＰＰもしくはＰＰ'内で結合される請求項１記載
   の転写方法。
3. 【請求項３】 機能的であり、かつ、少なくとも一部分
   が二本鎖であるプロモーター領域（ここで、該プロモー
   ター領域は、エフェクター配列ＰＥが直接またはリンカ
   ーを介して結合されるプロモーター配列ＰＰおよびＰ
   Ｐ'からなり、該エフェクター配列ＰＥは、鋳型核酸配
   列ＴＮともその対の鎖ＴＮ'とも、プロモーター配列Ｐ
   Ｐともその対の鎖ＰＰ'ともハイブリダイズすることが
   できず、該エフェクター配列ＰＥは、ＤＮＡではない）
   からなる部分的にまたは完全に二本鎖の核酸複合体を形
   成することを特徴とするリボ核酸における鋳型核酸配列
   の転写方法。
4. 【請求項４】 鋳型核酸配列ＴＮまたはＴＮ'が一本鎖
   または二本鎖領域を有する核酸の一部分であり、配列Ｐ
   Ｔが鋳型核酸の一本鎖領域にハイブリダイズされるかま
   たはハイブリダイズされ得る請求項１または３記載の転
   写方法。
5. 【請求項５】 エフェクター配列ＰＥが鋳型核酸Ｔの一
   部分と相補的でも配列同一でもない請求項３記載の転写
   方法。
6. 【請求項６】 第１の一本鎖鋳型核酸Ｔ＊が第１のプロ
   モーター核酸Ｐ＊にハイブリダイズされ（ここで、該第
   １のプロモーター核酸Ｐ＊は、分解可能なプロモーター
   配列ＰＰ＊および配列ＰＴ＊を含有し、該配列ＰＴ＊
   は、鋳型核酸Ｔ＊とハイブリダイズすることができ
   る）、 プロモーター核酸Ｐ＊が、鋳型として鋳型核酸Ｔ＊を使
   用して伸長されて、伸長産生物Ｖ１を形成し、 該伸長産生物Ｖ１と相補的である鎖が形成され、 プロモーター配列ＰＰ'が分解され、 得られた相補鎖が鋳型核酸Ｔとして使用される請求項１
   または３記載の転写方法。
7. 【請求項７】 プロモーター配列ＰＰまたはその対の鎖
   ＰＰ＊およびエフェクター配列ＰＥ（ここで、該エフェ
   クター配列ＰＥは、ＤＮＡではない）を含有することを
   特徴とするプロモーター核酸。
8. 【請求項８】 鋳型特異的部分ＰＴをも含有する請求項
   ７記載のプロモーター核酸。
9. 【請求項９】 不全型転写物の産生を減少させるための
   プロモーター領域のＲＮＡオーバーハングの使用。