PT97194A - Processo para a multiplicacao especifica de acidos nuccleicos padrao e para a determinacao de acidos nucleicos - Google Patents
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Description
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Descrição da patente de invenção de BOEHRIIGER MAE-EHEIM GMBH, industrial e comercial, com sede em 6800 Mannheim 51, República Federal Alemã, (inventores: Dr.rer.nat. Ohristopli Kessler e Dr.med.Rudiger Ruher, residentes na República Federal Alemã), para «PROCESSO PARA A MULTIPLICAÇÃO ESPECIFICA DE ÁCIDOS FUCLEICOS PADRÃO E PARA A DETERMIEAÇÃO DE ÁCIDOS EU-CLEICOS"
Descrição 0 objectivo da invenção é um processo para a multiplicação específica de padrães de ácidos nucleicos e um processo para a determinação de ácidos nu-cleicos.
Os processos para a multiplicação específica de padrães de ácido nucleieo são descritos por exemplo no documento EP-A-0 200 562. Reste documento ê proposto que o ácido nucleieo que se pretende detectar seja multiplicado por um sistema in vitro. Para isto, pelo menos é adicionado um iniciador à amostra para cada banda única de ácido nucleieo a ser multiplicada. Partindo do iniciador - 1 - t t
> ,:í^ é formada uma banda de ácido nuoleico por uma reacção enzimá tiça de alongamento que é complementar a cada uma das bandas simples do ácido nuoleico. Esta reacção pode ser efectuada várias vezes uma após a outra e as bandas de ácido nuoleico recentemente formadas podem tambám ser multiplicadas. Uma desvantagem deste processo é de que é necessária uma fase de aquecimento entre cada fase da multiplicação.
Io documento EP-A-0 329 822 é descrito um processo para a multiplicação de padrães de ácido nu-cleico específicos por hibridização dos iniciadores de ácido nucleico para este padrão, formação dependente de padrão de ADI com estes iniciadores e transcrição deste ADI em vários ácidos nucleicos que são análogos ao padrão.
Uma desvantagem deste processo reside em particular no facto de o processo necessitar de longos períodos de incubação a temperaturas relativamente elevadas. Além disso o método é apenas adequado para a multiplicação de ADI apés um pré-tratamento complicado do padrão. 0 objecto da presente invenção reside em eliminar as desvantagens acima mencionadas do estado da técnica e proporcionar um processo sensível e mais simples para a multiplicação e para a detecção específica de padrSes de ácido nucleico. 0 tema da invenção refere-se a um processo para a multiplieação específica de padrSes de ácido nucleico por hlbridização dos iniciadores de ácido nucleico para este padrãç formação de um ácido nucleico complementar ao padrão com estes iniciadores e transcrição do ácido nucleico formado em vários ácidos nucleicos análogos ao padrão que é caracterizado por: o padrão ser hibridizado com dois iniciadores que são colocados na mesma orientação, que contém 2
íCTaavs^- · £3*30»
sequências complementares ao padrão e em que o segundo iniciador, na extremidade voltada para fora do primeiro iniciador, transporta um ponto de iniciação de transcrição e uma sequência de banda dupla a que se poàe ligas AEN po-limerase: os dois iniciadores hibridizados desta forma serem covalentemente ligados para formarem um ácido nucleico complementar ao padrão por preenchimento do intervalo entre eles e serem obtidos transcrições (ácidos nucleicos que são análogos ao padrão) deste ácido nucleico complementar ao padrão.
Numa forma de realização preferida as transcrições que são formadas são utilizadas de novo como padrão para a hibridização com os iniciadores e o ciclo da multiplicação é repetido. Numa realização ainda preferida podem-se utilizar outros iniciadores, em particular para aumentar a especificidade, que tenham uma região complementai· ao padrão e que sejam diferentes do iniciador utilizado no primeiro ciclo.
No sentido da invenção os padrões de ácido nucleico são considerados como ARN e AON originários de procariotas e eucariotas. Estes tambám incluem ácidos nucleicos virais e bacterianos bem como ácidos nucleicos originados em viréides. Eles podem ser de banda simples ou dupla. Eles podem ser ácidos nucleicos epissomáticos, como por exemplo plasmídeos ou ácidos nucleicos cromossé-mioos gendmicos. Os ácidos nucleicos podem ser caracteristi-cos para um organismo particular ou para um grupo de organismos.
Os ácidos nucleicos podem também ser utilizados como lisado bruto ou purificado (por exemplo por extracção com fenol ou centrifugação de gradiente de gua-nidina/isotiocianato). κ SESsca®»^»-^ .>
Os ácidos nucleicos modificados podem, contudo, também ser utilizados como ácidos nucleicos cortados por meio de enzimas de restrição ou ácidos nucleicos modificados por tratamento com exonuclease. No caso do AM, o cADN pode ser produzido previa mente. Foi' provado que ser vantajoso que os ácidos nucleicos esteiam na forma de bandas simples ou sejam convertidos numa forma de banda simples antes de se efectuar a reacção. B considerado que um iniciador é uma sequência de nucledtidos que contém sequências complementares ao padrão de ácido nucleico e pode hibridizar por este meio com o padrão em condições especificas (por exemplo Anal. Bioehem. 138 (1984) 267-284).
Um ácido nucleico complementar ao padrão é entendido como um ácido nucleico que é complementar ao padrão em pelo menos uma secção. Um ácido nucleico análogo ao padrão é entendido como um ácido nucleico que foi produzido por meio do processo de multiplicação e, como resultado disso, pelo menos uma secção corresponde às secções complementares aos iniciadores e ao intervalo de sequências preenchido, em que a sequência é homóloga à sequência do padrão.
Um fragmento de ácido nucleico que contém uma sequência complementar ao padrão ou preferivelmente 15 - 40, particularmente e preferivelmente 16 -- 25 bases é utilizada como segundo iniciador. Um sítio de iniciação de transcrição e uma sequência de dupla banda a que AM polimeraze se pode ligar segue esta sequência de banda simples contendo a sequência complementar. A sequência de banda dupla tem preferivelmente um comprimento de 17 - 110 bases, particularmente e preferivelmente 7-50 bases. Ambas as bandas da parte de banda dupla podem ectar ou presentes numa forma aberta ou as duas extremidades que se afastam da sequência complementar ao padrão podem es- - 4 -
tar ligadas através de uma outra sequência de ácido nuclei-co que tem preferivelmente um comprimento de 5 - 100» particularmente e preferivelmente 5-10 bases e representa preferivelmente um polinucleétido.
Numa realização preferida a secção da segunda sequência de iniciador que é complementar ao padrão começa com um terminal 5'fosforilado na extremidade voltada para o primeiro iniciador. S igualmente preferido que a extremidade 3' voltada para o primeiro iniciador termine com um didesoxidonucledtido que é particularmente e preferivelmente complementar ao sítio de iniciação de transcrição ou o último nucleotido (3’) da secção promotora.
As sequências de banda dupla adequadas a que se pode ligar uma ARI polimerase são por exemplo as descritas em Melton e col., NAR 12 (1984) 7035-7056, Pfeiffei', e Gilbert W., Protein Sequênces and DNA Analisis 1 (1988) 269 - 280. 0 primeiro iniciador contém sequências que são complementares ao padrão o que permite uma hi-bridização do iniciador ao padrão em condições restritas (ver acima). Estas condições são preferidas quando o iniciador se liga apenas às sequências específicas do iniciador no ácido nucleico padrão. 0 comprimento das regiões complementares do iniciador é preferivelmente de 15 - 40, em particular 16 - 25 bases.
Numa realização adicional preferida um dos dois iniciadores contém um parceiro ligado de forma co-valente a um par de ligação biolégico na sua extremidade que está voltada para fora do outro iniciador. Além disso, ou como alternativa, a transcrição dos ácidos nucleicos complementares ap padrão nos ácidos nucleicos análogos ao pa- - 5 -
drão pode ser efectuada utilizando tnononuoledtidos que contém um parceiro ligado a um par de ligação biológico, em vez de mononucledtidos não modificados. Os ácidos nuclei-cos complementares ao padrão e/ou as transoriçdes que são formadas podem ser em seguida removidas da solução de reac-ção e imobilizadas através de outro parceiro de ligação que' é imobilizado num veículo. Os ácidos nucleicos imobilizados desta forma podem ser em seguida detectados por exemplo por processos que são familiares ao especialista.
Exemplos de pares de ligação adequados são a biotinestreptadivina ou advina, anticorpo de heptano, antigénio-anticorpo, anticorpo de concavalina, açúcar-lecitina ou ácidos nucleicos complementares. Os ácidos nucleicos complementares que possuem um comprimento de 5 a 100, preferivelmente 10 - 30 bases são os que são preferivelmente utilizados.
Numa realização preferida o processo é utilizado para a multiplicação de padrães de ADN específicos e padrães de ARN específicos. Se o padrão de ADN estiver presentè como dupla banda, o padrão é preferivelmente conver· tido antes da hibridização na forma de banda única por processos que são bem conhecidos dos especialistas.
Numa realização preferida o ácido nu-cleico a ser multiplicado ou a ser determinado é convertido antes da hibridização com os iniciadores num padrão modificado por tratamento com endonuoleasses ou exonucleoses de restrição.
Numa realização ainda preferida a hibridização entre o padrão e o ADN complementar ao padrão é parada antes da produção da transcrição. Isto é preferivelmente efectuado com o RNaseH. 0 RNaseH de E.coli ou de timo de vitela é preferivelmente e particularmente o utilizado. 6 A concentração do MaseH é preferivelmente de 0,5 - 2 u/volume da mistura reaccional. A multiplicação é preferivelmente efectuada a 30 - 37°0 durante 30 min a 2 horas. 0 volume de mistura reaccional é escolhido preferivelmente de 25 -- 100 ,ul. A concentração do iniciador é preferivelmente de 0,3 - 3,5 μαιοΐ/ΐ em cada caso.
Para preencher o intervalo entre os iniciadores são preferivelmente utilizadas uma ligase e transcriptase inversa. A ligase Ϊ4 é partioularmente preferida como ligase. A concentração da ligase é preferivelmente de 1 a 10 U/volume de mistura reaecional. 0 intervalo pode também ser fechado por adição de um oligonucleótido adequado e ligação com ligase. Quando são adicionadas as ligases deve ser ligado um cofactor, por exemplo ΑΪΡ para 4. a ligase T4· ou MD para E.coli ligase. A concentração da transcriptase inversa é preferivelmente de 0 - 30 U/volume de ensaio. A MoMLV ou AMV transcriptase inversa é preferivelmente a utilizada como transcriptase inversa. A produção das transcrições é efectuada por adição de AM polimerase. E preferivelmente utilizada uma AM polimerase codificada com fago como por exemplo T7 AM polimerase, Ϊ3 AM polimerase ou SP6 AM polimerase. A concentração da polimerase é preferivelmente de 10 - 100 U/volume reaccional. A invenção também proporciona um processo para a detecção de padrães de ácidos nucleicos por hibridização de dois iniciadores de ácido nucleico a este padrão, formação de um ácido nucleico complementar ao padrão com estes iniciadores e transcrição do ácido nucleico formado em vários ácidos nucleicos análogos ao padrão, caracterizado por - 7 -
0 padrão ser hibridizado com dois iniciadores que são dispostos na mesma orientação, que contém sequências complementares ao padrão e que o segundo iniciador transporta na extremidade voltada para fora do primeiro iniciador, o sítio de iniciação de transcrição e uma sequência de banda dupla a qual se pode ligar a AM poli-merase. Os dois iniciadores hibridizados desta forma estão ligados de forma covalente para formarem um ácido nucleico complementar ao padrão por preenchimento do intervalo entre eles, as transcrições serem formadas a partir deste ácido nucleico complementar ao padrão e estas transcrições serem efectuadas de forma conhecida (por exemplo Molecular Cloning 1982, Eds. Maniatis e col., p, 199-206).
As realizações preferidas do processo de deteoção são análogas às do processo de multiplicação. A purificação posterior, ou a detecção dos produtos de transcrição formados, pode ser efectuada de forma acima descrita por imobilização e posterior detecção com processos aiequados. 2 geralmente e igualmente adequado separar produtos de transcrição por electroforese em gel, para se revelar o AM e para visualizar direota-mente ou por transferência de Northern e posteriormente hibridizar com sondas marcadas específicas para uma sequência alvo. São igualmente adequados os processos de hibridi-zação de ponto-, mancha-fenda-, mancha- com sondas marcadas especificas para uma sequência alvo e a marcação dos produtos de transcrição com um ou vários M!P que são marcados por exemplo com radioactividade, fluorescência ou com enzimas.
Os produtos podem ser tornados directa-mente visíveis na revelação de ponto- mancha- ou de Northern por incorporação de NTP marcados com 32p ou sem serem radio-activamente marcados. A incorporação da digoxigenina ou - 8 -
Biotina (conforme WO 89/06698) pode ser utilizada para a detecção directa utilizando um anticorpo de antidigoxige nina. A Figura 1 mostra a sequência de nucledti dos para o primeiro iniciador utilizado no Exemplo 1. A Figura 2 mostra duas variantes para o segundo iniciador. A Figura 3 mostra uma variante preferida de um processo de detecção para ácidos nucleiGos de acordo com a presente invenção.
Os seguintes exemplos e figuras ilustram a invençãoí
Exemplo 1
Produto de padrões de AM 0 plasmídeo pS3?T18 (sequência conforme WO 89/06698) é utilizado para a produção de transcrições do gene de resistência a neomicina (neo). 0 gene da neomicina (uma aminoglicdsido-3'-fosfotransferase 11) é inserido neste plasmidio da forma descrita por Beck e col., Gene 19 (1982) 327-356. Utilizando o plasmídeo resultante pSPI18neo as transcrições do gene na mesma orientação podem ser produzidas utilizando a SP6 AM polimerase. 0 plasmídeo gSPT18neo é linearizado com Bgll. As transcrições de AM que são utilizadas como padrões no Exemplo 2 são produzidas deste plasmídeo linearizado por uma transcrição in vitro da forma descrita em Bioehemical for Molecular Biology, Boeliringer Mannheim (1987) páginas 38 - 40. - 9 -
Exemplo 2
Amplificação de ARI a) Produção dos iniciadores 1 e 2 A sequência para o iniciador 1 (oligono-cleétido de Adi com 24 nucledtidos, Fig. 1) é complementar a uma região do mARI do gene neo que de acordo com a Beck e col. corresponde aos núcleos 2008-2031 da sequência de ADI. À sequência do iniciador 2 (também 24 nucledtidos Fig 2) corresponde as posiçães dos nucledtidos 1937-1960 do gene neo.
Além disso o iniciador 2 contém a sequência de dupla banda mínima necessária do promotor para a ARI polimerase do bacteriofago T7 (T7 ARIP, sequência conforme a Fig. 2) (Uhlenbeck e col., lature, 328 (1987) 569 - 600). Em adição o iniciador 2 contém uma região cíclica rica em Aí que estabiliza a dupla banda parcial. São representadas na Fig. 2 (ddA ou ddG nos terminais 3') duas variantes funcionais da sequência do iniciador. 0 inincia-dor 2 é fosforilado na extremidade 5' da forma descrita por exemplo por Maxam e Gilbert em Methods in Enzymology Volume 60 (1980) p. 499 e lucleic Acids Research 3 (1976) 863.
Além disso o ddA ou ddC são adicionados ao terminal 3’ também da forma descrita naquele documento. b) Reacção de amplificação
Mistura reaocional: 40 mmol/l íris HC1 (pH 8 a 37°C), 10 mmol/l Díí, 1 mmol/lespermidina, 0,01 σβ> ÍJ-riton X 100, 8 io polietileno glicol, 20 mmol/l MgO^j - 10
1 mmol/l ΑΤΡ, 2 mmol/l oada NTPs 1 mmol/l cadà dM!Ps, 500 nmol/l primário 1, 1 umol/1 primário 2, 5 u/volume reaooional Ϊ4 ligase, 40 u/volume reaooional S7 HMP, 20 ϋ/volume reaecional reverse transcriptase e 1 U/volume reaooional RNaseH.
As substâncias não enzimáticas utilizadas são pré-tratadas antes da utilização oom 0.1$ de piro carbonato de dietilo análogo a Maniatis (ver a seguir) páginas 7,3 - 7.4. A amostra (fragmento de ASM de acordo oom o Exemplo 1 ou as suas diluições) ê adicionada a um vaso de reacção com o volume de 50 μΐ. e o recipiente ê cheio com a mistura reaecional. A composição é incubada durante duas horas a 37°C, o ASM produzido ê precipitado com etanol, separado num gel de ARN, corado e transferido de uma membrana de nylon da forma descrita em Molecular Cloning, 1989, editores Sambrooh e col., CSH, páginas 7.43 - 7.51. 0 AHN ligado à membrana pode ser detectada com sondas neo - específicas que são marcadas com digoxigenina (produzida de acordo com "MA Labelling and Detection”, Boehringer Man-nheim GmbH, 1989, páginas 27 - 28 ou de acordo com ¥0 89/ /06698). - 11 -
Claims (1)
- REIVIEDIOACiÕES - li - Processo para a multiplicação específica de ácidos nucleicos padrão por hibridlzação de dois iniciadores de ácido nucleico para este padrão, formação de um ácido nucleico complementar ao padrão com estes iniciadores e transcrição dos ácidos nucleicos formados em vários ácidos nucleicos análogos ao padrão, caracterizado por o padrão ser hibridizado com dois iniciadores que são colocados na mesma orientação, que contém sequências complementares ao padrão colocados na mesma orientação, que contém sequências complementares ao padrão e em que o segundo iniciador, na extremidade voltada para fora do primeiro iniciador, transporta um ponto de iniciação de transcrição e uma sequência de banda dupla a que se pode ligar uma ARE polimerase, os dois iniciadores hibridizados desta forma serem covalentemente ligados para formarem um ácido nucleico complementar ao padrão por enchimento do intervalo entre eles e serem obtidos transcrições deste ácido nucleico complementar ao padrão. - 2* - Processo para a detecção de padrão de ácido nucleico por hibridização de dois iniciadores de ácido nucleico para este padrão, formação de um ácido nucleico complementar ao padrão com estes iniciadores e transcrição do ácido nucleico formado em vários ácidos nucleicos análogos ao padrão, caracterizado por: - 12o padrão ser hibridizado com dois iniciadores que são colocados com a mesma orientação, que contém sequências complementares ao padrão e dos quais o segundo iniciador transporta, na extremidade voltada para fora do primeiro inidador, um ponto de iniciação de transcrição e uma sequência de dupla banda a que se pode ligar uma ARE polimerase, os dois iniciadores hibridizados desta forma serem ligados covalentemente para formarem um ácido nucleico complementar ao padrão, por enchimento do intervalo entre eles, serem formadas transcrições a partir deste ácido nucleico complementar ao padrão e serem detecta-das estas transcrições de forma conhecida. - 5 § - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por as transcrições formadas serem utilizadas de novo como padrões para a hibridação com os iniciadores e se repetir o processo de multiplicação. _ 4a _ Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3 j caracterizado por a hibridização entre o padrão e o ácido nucleico complementar ao padrão ser parada antes da formação das transcrições. - 5& - Processo de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por a hibridização ser parada por REaseK. - 13 - SSSSSiSasssK*&m&. r** - 66 - Processo de acordo com as reivindicaçõe 1 a 5, caracterizado por se utilizar o APH como padrão. _ 7i - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizado por se utilizar ο ΑΗΪΓ como padrão. - 8& - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizado por se converter um padrão numa forma de banda simples antes da hibridização com os iniciadores . _ ga _ Processo de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizado por se clivar o padrão de ADN de dupla banda com uma ou várias endonucleases de restrição e se converter numa forma de banda simples. - 10 a - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 9, caracterizado por a sequência da banda dupla do primeir© iniciador ter um comprimento de 17 a 100 bases complementares cada uma. - 14 - - lia Processo de acordo com a reivindicação 10 caracterizado por as partes complementares da banda dupla estarem ligadas em conjunto através de um fragmento de um ácido nucleico com o comprimento de 5 a 100 bases. - 12ô - Processo de acordo com a reivindicação 1 a 11, caracterizado por a extremidade 5’ no segundo iniciador ser fosforilada e a extremidade 3' da dupla banda voltada para o primeiro iniciador terminar com um dideso- xinucleétido. 1 requerente reivindica a prioridade do pedido de patente alemã apresentado em 31 de Março de 1990, sob o is P 40 10 465. Lisboa, 28 de Março de 1991- 15 -
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