JP2004512823A - 核酸配列の多重プライミング増幅プロセス - Google Patents
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Abstract
多重特異的配列およびまたはランダム配列オリゴヌクレオチドプライマーを使用する、とりわけコロニーおよびプラーク抽出物に存在する一本鎖または二本鎖環状ＤＮＡ分子の形態での標的ＤＮＡ配列の増幅のためのプロセスが、このような増幅標的配列を検出する方法と共に開示される。本発明で使用するキット含有成分も記載される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本出願は、２０００年６月２８日に受理された合衆国暫定特許出願番号第０９／６０５，１９２号の優先権を主張し、その開示は全体としてここに組み込まれている。
【０００２】
本発明は、従来のローリングサークル法を上回る量の有利性を持つ増幅産物の改良された収量の向上を提供するように、ローリングサークル増幅で多重複製フォークを確立するためのプロセスに関する。
【０００３】
【発明の背景】
標的ＤＮＡ分子を増幅する手段は、このような増幅ＤＮＡが、続くＤＮＡ配列決定、クローニング、マッピング、遺伝子型化、プローブの生成、および診断による同定を含む方法にしばしば利用されることが多いために価値がある。
【０００４】
これまでの所、核酸の増幅を可能にするいくつかの有用な方法が開発されてきた。その大部分は選択されたＤＮＡ標的およびまたはプローブの増幅の周辺で設計されたものであり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自給配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、およびＱβレプリカーゼでの増幅などが含まれている（バーケンマイヤーおよびマシャヴァール，ウイルス学方法ジャーナル，３５巻：１１７−１２６ページ（１９９１年）；ランディグレン，トレンズ・ジェネティクス，９巻：１９９−２０２ページ（１９９３年））。
【０００５】
加えて、Ｍ１３などのバクテリオファージからのプラスミドまたはＤＮＡなどの環状ＤＮＡ分子を増幅するいくつかの方法が使用されてきた。その一つは、大腸菌の適切な宿主菌株でのこれら分子の増殖であり、それに続く十分立証されたプロトコルによるＤＮＡの分解であった。（サムブルック，Ｊ．，フリッツ，Ｅ．Ｆ．，マニエイタス，Ｔ．，分子クローニング，ラボラトリーマニュアル，１９８９年，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，コールド・スプリング・ハーバー ニューヨーク）。またＰＣＲは、Ｍ１３などのバクテリオファージからのプラスミドおよびＤＮＡなどのようなＤＮＡ標的において、決まった配列を増幅するためにしばしば使用された方法であった。（ＰＣＲプロトコルズ，１９９０年，Ｍ．Ａ．イニス，Ｄ．Ｈ．ゲルファンド，Ｊ．Ｊ．スニンスキー編，アカデミック・プレス，サンディエゴ）。これらの方法のいくつかは、労力を要し、費用が高く、時間がかかり、効率が悪く、また感受性を欠いていることで難点がある。
【０００６】
これらの方法を改良したものとして、線型ローリングサークル増幅（ＬＲＣＡ）は、環状標的ＤＮＡ分子にアニーリングされたプライマーを使用し、ＤＮＡポリメラーゼが付加される。増幅標的サークル（ＡＴＣ）は新しいＤＮＡが作られる鋳型を形成し、それによりサークルに相補の反復配列の連続配列としてプライマー配列を伸長するが、時間当り約数千コピー（複製）を生成するにすぎない。ＬＲＣＡに対する改良は、増幅の新しいセンターを提供するために複製相補配列に対してアニーリングする付加プライマーと共に指数ＲＣＡ（ＥＲＣＡ）を使用することであり、これにより指数反応速度と増加増幅を提供する。指数ローリングサークル増幅（ＥＲＣＡ）は鎖置換反応のカスケードを採用し、ＨＲＣＡとしても引用される（ライザーディ，Ｐ．Ｍ．他，ネイチャー・ジェネティクス，（１９９８年）１９巻，２２５−２３１ページ）しかしＥＲＣＡは、プライマーＰ１の特異的ＤＮＡ配列を知る必要があるために、また環状ＤＮＡ標的分子が一本鎖ＤＮＡサークルになる必要性のために、環状ＤＮＡ標的分子にアニーリングされた単なる単一プライマーＰ１の使用に限定される。
【０００７】
本発明の方法（ここで多重プライムドローリングサークル増幅、すなわちＭＰＲＣＡとして引用されるもの）は、個別標的サークルの増幅のために多重プライマーを使用することにより、線状ローリングサークル増幅の感受性に改良を与える方法を採用して前記のこのような不利益を避ける。本発明は各環状標的ＤＮＡ分子から、多重タンデム配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）複製を生成するという利点を持つ。加えてＭＰＲＣＡは、ある実施例において、環状標的ＤＮＡ分子の配列が未知であり、一方環状標的ＤＮＡ分子は一本鎖（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖（ｄｓＤＮＡまたは複式ＤＮＡ）であってもよいという利点を持つ。本発明のある実施例のも一つの利点は、一本鎖または二本鎖環状標的ＤＮＡ分子の増幅が、等温線上およびまたは大気温度で行われるということである。また他の利点は、ローリングサークルの増幅の新しい適用で高度に有用である低コスト、標的サークルの低い濃度での感受性、柔軟性、とりわけ検出試薬の使用の際の柔軟性、および低い汚染へのリスクなどの利点を持つ。
【０００８】
本発明のある実施例では、反応で存在するエキソヌクレアーゼ活性による分解に耐性である多重プライマーを用いて、増幅産物ＤＮＡの収量を改良するための手順が採用されている。これはエキソヌクレアーゼ活性を含み、また長い培養期間にわたり行われる反応にプライマーが持続できるようにする利点を持つ。このプライマーの持続性は、新しいプライミング事象が反応の全培養時間に起こることを可能にし、それはＥＲＣＡの特質の一つであり、また増幅ＤＮＡの収量の増加をもたらすという利点を有する。
【０００９】
本発明の方法は、初めて「試験管内クローニング」すなわちサークルで囲まれる既知または未知の標的ＤＮＡの本体内にクローニングする必要なしで行うことを初めて可能にする。［標的ＤＮＡの周辺を含み、それに連結されて標的ＤＮＡに付着する］パドロックプローブを、ギャップ充填法により標的配列をサークル内に複製するために使用することができる（ライザーディ，Ｐ．Ｍ．他，ネイチャー・ジェネティクス，１９巻，２２５−２３１ページ（１９９８年））。選択肢として、標的配列は他の多くの一般に使用される方法で、環状ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ内に複製または挿入することができる。ＲＣＡ増幅は、生体でクローニングによるＤＮＡの増幅収量を生成する必要性を克服する。
【００１０】
予見される一つの応用は、ゲノムまたは他の複合体ＤＮＡｓから既知の配列を標的として捕捉することである。第２の応用は、全ゲノム増幅法で生成されるサークルのＲＣＡである。全ゲノム増幅は、ゲノムｃＤＮＡまたは他の複合体ＤＮＡのサブユニットのランダムプライミングまたは特異的プライミングされた生成を伴なう。従来の技術に基づく方法は、全ゲノム増幅の産物を環状化するのに使用できる。パドロックも環状標的を生成することができた。これらのサークルは、次いで本発明の標的増幅の基質を構成する。全ゲノム増幅の環状産物を生成する手段には拘らず、本発明のランダムプライミングＲＣＡは、配列が何かを知る必要なくて線状ＤＮＡｓの背景にわたりサークルの選択的増幅を可能にするであろう。同様に、環状ＤＮＡは、多重プライマーＲＣＡに特異的なプライマー配列の使用を可能にするであろう。
【００１１】
本発明の方法は、合成と産出の割合の増加を可能にするＬＲＣＡに勝る改良法である。これは、ＤＮＡポリメラーゼ伸長のための多重プライマー部位から生じる。ランダムプライマーＲＣＡもまた、二本鎖産物を生成するという利点を持つ。これは環状鋳型の複製により生成される線状ｓｓＤＮＡ産物が、それ自身ＤＮＡ合成のランダムプライミングにより、複式形態に転換されるであろうということのためである。二本鎖ＤＮＡ産物は、いずれかの鎖の配列決定を可能にすることで有利であり、および制限エンドヌクレアーゼ消化とクローニング、標識化、および検出に使用される他の方法を可能とするということでも同じく有利である。
【００１２】
鎖置換ＤＮＡ合成がランダムプライミングＲＣＡの間に生じ指数増幅となり得ることも期待される。これは従来のＥＲＣＡを上まわる改良であり、またＨＲＣＡと名付けられ（ライザーディ他（１９９８年））、サークル内に封入された非常に大きな標的を指数的に増幅する能力を持つことになる。細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）を含む大型環状ＤＮＡの増幅は、本発明で実行に移されるように減少されている。実際に従来のＥＲＣＡは、長さ２００ヌクレオチド以下の小さいサークルの使用に限定されていた。
【００１３】
縮重プライマー（チェン，Ｖ．Ｇ．およびネルソン，Ｓ．Ｆ．，全米科学アカデミー紀要，９３巻，１４６７６−１４６７９ページ（１９９６年））、およびゲノムＤＮＡなどの標的の複合混合物のサブセットが増幅するランダムプライマー（ザング，Ｌ．他，全米科学アカデミー紀要，８９巻，５８４７−５８５１ページ（１９９２年）を用いる全ゲノム増幅に関する方法が開示された。複雑性の減少がこれらの方法の目的の一つである。本発明の方法の更なる利点は、ＲＣＡ反応として、それがＤＮＡ標的の「サブセッティング」（部分集合）、すなわちＤＮＡ標的の複雑性を減少させる必要なしに環状ＤＮＡ標的分子を選択的に増幅することである。
【００１４】
【発明の説明】
本発明は、特異的プライマーまたはランダムプライマーを使用する環状ＤＮＡ標的の増幅を高めるプロセスに関する。それは単一プライミング鋳型環状ＤＮＡ分子で線状ローリングサークル増幅の感受性を改良する。一つの特異的実施例において、本発明のこの見地は、ＲＣＡからの増幅産物の収量を増加するために、環状標的ＤＮＡ分子にアニーリングされた（特異的またはランダム、エキソヌクレアーゼ−感受性、またはエキソヌクレアーゼ耐性の）多重プライマーを採用する。多重プライマーはサークルの多重位置にアニーリングし、ポリメラーゼによる伸長した産物はそれぞれの位置から開始される。このように、多重伸長は、単一増幅標的サークルから同時に達成される。
【００１５】
前記の方法の別の実施例では、多重プライマーの使用は、いくつか異なる方法で行われる。それはサークル上の異なる配列にアニーリングする２個またはそれ以上の特異的なプライマーの使用により、またはサークル上の２個またはそれ以上の別の位置で反復される配列に１個の与えられたプライマーアニーリングを持つことにより、あるいはサークル上の多くの位置でアニーリングできるランダムプライマーもしくは縮重プライマーを使用することにより達成される。縮重物は、１個またはそれ以上のヌクレオチドの位置が１個以上の塩基、すなわち決められた長さのオリゴヌクレオチドの混合物により占められ、混合物の個々の部材の１個またはそれ以上の位置がその位置での一つの可能性以上の間から無作為に選択される塩基により占められていることを引用する。このようなオリゴヌクレオチドの集まりは、標準オリゴヌクレオチド合成器具およびソフトウェアを用いて容易に合成される。ランダムは、それぞれのヌクレオチドの位置が、完全なセットの可能性の間から無作為に選択されるが、一般には４個のヌクレオシド、すなわちｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰ、またはｄＴＭＰに一般に限定されることを意味する。
【００１６】
ある実施例では、プライマーが酵素分解に耐性のプライマーを作るのに役立つ修飾ヌクレオチドのすべての型を含むヌクレオチドを含有する。酵素の分解は、ＤＮＡポリメラーゼと会合する３′−５′エキソヌクレアーゼ活性などのような特異的なエキソヌクレアーゼにより、または非特異的な汚染エキソヌクレアーゼにより起こることがある。
【００１７】
【発明の更なる説明】
本発明は、ＤＮＡ合成を大きく増幅し、そこに含まれる特異的な核酸配列の検出のために大幅に増加した信号増幅を提供する手段として、環状ＤＮＡ鋳型を用いる核酸配列増幅における多重プライマーの使用に関し、ここで特異的核酸配列は、例えば標的ＤＮＡに含まれ、そこでこのような標的は一本鎖または二本鎖環状ＤＮＡの形態にあり、あるいはこのような環状ＤＮＡの部分である、従来の方法がしばしばかなり複雑な標的を採用している一方、本発明は、単純プラスミド標的などのような比較的単純な標的を利用する。本発明で有用な標的ＤＮＡは、更に高分子量線状ＤＮＡをも含む。
【００１８】
加えて他の方法は、増幅材料のより複雑でないセットのものを生成するために、事実上複合体の標的ＤＮＡ分子（例えば、そのサンプル内での存在が検出され、またはその配列が続く方法あるいは手順での使用などのために増幅され、もしくはそのサンプル内での存在が、その配列が増幅される１個またはそれ以上の他の核酸の同定を決定するＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを含む核酸など）のランダムサブセットを増幅するように試みられてきたのに対して、本発明は、複雑性または他のサブセットを減少させるための努力なしでの単一標的の増幅に関する。従ってそれは、例えばコロニーまたはプラークから抽出されるＤＮＡにおいて、線状ＤＮＡ分子全体で環状標的の望ましい増幅という利点を取る。
【００１９】
一つの見地において、本発明は核酸配列を選択的に増幅する一つのプロセスに関し、増幅標的サークル（ＡＴＣｓ）が１個以上の多重一本鎖非環状オリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１）と結合し、またはその条件が多重タンデム配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）産物を形成するためにＰ１プライマーの伸長により前記増幅標的サークルの複製を促進する条件下で、Ｐ１、１個またはそれ以上の前記増幅標的サークル（ＡＴＣｓ）、ＤＮＡポリメラーゼおよび多重デオキシヌクレオシド三リン酸より成る混合物を含むことより成る。
【００２０】
かくして、一つの実施例では、キットの形態などのようなあらかじめ混合されたものを提供することができ、これは１個以上のポリメラーゼをさえ含むポリメラーゼ、ヘキサマーなどの保護オリゴヌクレオチドプライマー、必要とされるヌクレオシド三リン酸、適当な緩衝液、ピロホスファターゼ、および他の潜在的に望ましい成分を、各成分毎に別の小びんで、または異なる組合せで一緒に混合して、１個、２個、３個またはもっと別の小びんの全体を形成し、また例えば増幅プロセスで使用するための意図された標的核酸を懸濁するブランクまたは緩衝液小びんなどを含む。本発明の一つの実施例は、ＤＮＡ配列を増幅するためのキットより成り、ヌクレアーゼ耐性ランダムプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよび１個またはそれ以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）を含み、このｄＮＴＰｓは蛍光成分または放射能標識などで標識される。別の実施例では、前記ＤＮＡポリメラーゼは３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を持つ。望ましい実施例では、前記ＤＮＡポリメラーゼはφ２９ ＤＮＡポリメラーゼである。このようなキットは、更に本発明のプロセスを実行するために、文書で、またはコンピュータディスケットあるいはＣＤロムでの一連の使用説明書を含んでいる。
【００２１】
このような実施例の特異的な応用として、一つのプロセスが提供され、これによりサークルの形態にあるＤＮＡなどのような核酸のサンプルがＴＥ緩衝液などのような緩衝液に懸濁され、次いで加熱、冷却され、次いで前に列挙された成分と連続して接触され、または順次調節された温度、ｐＨその他の条件で、例えばそのような組合せで３０℃を維持して前記前もって混合されたものにこのような成分を加えることで接触される。
【００２２】
加えて、本発明に基づき開示されたプロセスを実施する際に使用される条件は、いずれか与えられた適用の間に変化する。かくして限定されない実施例により、ポリメラーゼまたは複数のポリメラーゼの基質として作用するプライマー−ＡＴＣ複合体の変性を起こすことなく、増幅を促進する異なる条件の下でハイブリッド形成を促進し、ＤＮＡポリメラーゼとヌクレオシド三リン酸が加えられる条件の下でプライマーとＡＴＣｓが加えられる。
【００２３】
も一つの実施例では、本発明は核酸配列を選択的に増幅する一つのプロセスに関し、それは
（ａ）多重一本鎖非環状オリゴヌクレオチドプライマーと、１個またはそれ以上の増幅標的サークル（ＡＴＣ）とを、前記ＡＴＣが１個以上の前記多重Ｐ１プライマーとハイブリッドを形成し、プライマー−ＡＴＣサンプル混合物を産生する条件下で混合し、
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼと多重デオキシヌクレオシド三リン酸を、Ｐ１プライマーの伸長により前記増幅標的サークルの複製を促進し、多重一次タンデム配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）を形成する条件下で加える、
ことより成る。
【００２４】
本発明の手順を実施する際に、成分を加えることのできる数多くの順序があり、前記追加の配列は限定することを意図するものではなくて、通常の技術を有するものが、議論の提示される特定の前後関係において、興味がありまたは価値があると認識するであろうすべての追加の組合せを含むように読み取られるべきであることは理解されねばならない。例えば、すべての成分は、ワンステッププロトコルで同時に加えることができ、あるいはＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ標的への追加の前に、エキソヌクレアーゼ耐性プライマーと混合することもできる。
【００２５】
要約すると、前記方法のステップは、ここで列挙されたいずれの順序でも実施することができるが、望ましければ、有利であれば、または別途便利であるならば、本発明の目的と利点が達成される限りにおいて、どのような適切な順序でも実施されるであろう。かくして例えば、前に列挙したプロセスは、既に前記ＤＮＡポリメラーゼを含有する培地で、前記プライマーとＡＴＣｓを混合することで実行され得るものである。
【００２６】
一つの実施例では、本発明は、ＡＴＣが少なくとも３、４、５、更に１０個またはそれ以上のプライマーオリゴヌクレオチドと結合し、またはハイブリッド形成し、前記各プライマーが適切な条件下で別のタンデム配列ＤＮＡ分子を産生するような、ここで記載されるプロセスに関する。もち論、タンデム配列ＤＮＡｓ（ＴＳ−ＤＮＡｓ）の配列が、鋳型として働くＡＴＣｓの配列に相補であるために、もしＡＴＣｓすべてがプライマーの配列に拘らず同じ配列を持つならば、ＴＳ−ＤＮＡ産物はすべて同じ配列を持つであろう。
【００２７】
各増幅標的サークル（ＡＴＣ）に対して多重（ここでは３個）プライマーを用いて、本発明の一つのサンプル実施例が図１で示される。増幅標的サークルの別のセグメントに相補の領域を持つ（それぞれ長さで約２０−５０塩基でＡで示されている）オリゴヌクレオチドプライマーは、（Ｂで示される）増幅標的サークルに特異的にハイブリッド形成する。ＣはＢのハイブリッド形成された構造にｄＮＴＰｓ、ＤＮＡポリメラーゼ、その他を追加した結果を示し、これにより、各プライマーの３′末端は伸長される。各産物の伸長が続き、ＤＮＡポリメラーゼは、隣接する酵素により合成されたＤＮＡを置換する。オリゴヌクレオチドプライマーは、前記プライマーの５′末端でヌクレオチドの領域または配列を任意に含有し、もしヌクレオチドの非相補領域または配列が、鎖置換ＤＮＡ合成を実行するためのＤＮＡポリメラーゼが能力を増大するのに有用であると見做されるならば、このヌクレオチドの領域または配列は、ＡＴＣに対して非相補である。ここで示される特異的実施例では、１個のＡＴＣは、同じ増幅標的サークル鋳型で３ラウンドの線状複製を達成するために、３個のプライマーと３個の酵素分子と相互作用する。
【００２８】
別の実施例では、本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチド（Ｐ１）プライマーは、特異的またはランダムのいずれかであり、後者がとりわけ有用である。ここで使用されるように、「特異的」という用語は、ワトソン−クリックの語義で、増幅標的サークル（ＡＴＣ）に存在する配列に相補であり、またオリゴヌクレオチドプライマー内の前記相補配列が前記プライマーの３′末端を含む場合には、とりわけＡＴＣに対するプライマーのハイブリッド形成を促進するのに役立つヌクレオチド配列を持ち、または持つように操作されるプライマーを引用する。このような特異的な配列は、その５′末端に、ＡＴＣ鋳型のいずれの部分にも相補でない配列を含み、ＡＴＣ鋳型の非相補部分は、増幅のラウンドを続けている間に、ＴＳ−ＤＮＡの置換を促進するのに役立つ。このような特異的プライマーが利用される場合には、一定のＡＴＣと結合するプライマーの数は、一般に前記ＡＴＣに存在する対応する相補部位の数と関係するであろう。
【００２９】
望ましい実施例では、増幅に使用されるプライマーは、ランダム配列を持つであろう。ここで使用されるように、「ランダム」という用語は、前記オリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１）が、増幅の鋳型として働く増幅標的サークル（ＡＴＣ）のヌクレオチド配列に無関係のヌクレオチド配列を持つことを意味する。このようなランダム関係の結果は、前記ランダムプライマーがハイブリッド化するＡＴＣの位置が、同じようにランダムであるであろうということである。加えてプライマーがランダム配列を持つために、与えられたプライマーが、ＡＴＣに不完全にハイブリッド化しまたＡＴＣの対応するヌクレオチドに相補的でない１個またはそれ以上のヌクレオチドを持つ場合には、実例が起こるであろう。このような発生が、本発明の広がりからこのようなプライマーの使用を除去するのに決して役立たないことは認識されるべきである。例えば、このような発生は、ＡＴＣにＤＮＡ合成を開始する際に、ランダムプライマーの効率を減少させることはありそうもないことである。
【００３０】
本発明のプロセスに有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、いずれか望ましい長さのものにすることができる。例えばこのようなプライマーは、望ましくは少なくとも２個のヌクレオチドから、約３０乃至５０ヌクレオチドの長さのものであり、もっとも望ましくは約５乃至約１０ヌクレオチドの長さのものであり、ヘキサマー（六量体）およびオクタマー（八量体）のものが特に望ましい実施例である。ここで使用されるこのような多重プライマーは、特異的のみ、またはランダムのみ、もしくはその両方の混合物であり、ランダムプライマーが形態と使用の面でとりわけ有用であり、また便利である。
【００３１】
図１で示された実施例は特異的プライマー（ここでは数字で３であるがいずれの数でも十分である）の使用を示すけれども、前記プライマーは容易にランダムにすることができ、より高次の数にすることができる。かくしてＡＴＣと結合される各プライマーは、それがＡＴＣの周りでＤＮＡポリメラーゼにより伸長されるにつれて複製フォークを産生する。ＡＴＣが大きければ、それだけ形成されると期待される増幅フォークが形成される。本発明に従って、一般にはＡＴＣ鋳型の約１０毎乃至約１０００ヌクレオチド毎に増幅フォークが存在し、約５０乃至約１００毎での増幅フォークも確かに一般的であり、本発明の範囲では約１０ヌクレオチド毎前後でも意外なことではない。
【００３２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＡＴＣの部分に相補であるセグメントを持ち、また図１で示される限定されない実施例は、このような３個のプライマーの使用を単に示すに過ぎず、それらすべては同じ長さのように見える。しかし既に述べたように、本発明は与えられたＡＴＣに結合するこのようなプライマーの数、あるいはこのようなプライマーの長さ、またはその配列を限定するものではなく、容易に異なる長さのものをまたは図で示されるようにすべて同じ長さのものを同じ実験で使用することができる。
【００３３】
本発明のプロセスで有用である増幅標的サークル（ＡＴＣｓ）は、一般に４０乃至１０，０００ヌクレオチドの間で含むＤＮＡまたはＲＮＡハイブリッド分子を含む一本鎖または二本鎖の環状ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。しかしＡＴＣのサイズに上限はないであろうことが予期される。ＡＴＣが複式サークルである場合には、このような数は、個々のヌクレオチド残基よりも、むしろ塩基対として引用されることを意図している。ここで開示されたプロセスで有用であるＡＴＣは、異なる目的のために、とりわけそれらを有用なものにする機能的に異なる部分またはセグメントを持つこともできる。少なくとも２個のこのような部分は、１個またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーに相補であり、また存在する場合には、プライマー相補部分または部位として引用される。本発明で有用である増幅標的サークルは、細菌コロニー、バクテリオファージ、ウイルスプラーク、酵母コロニー、バキュロウイルスコロニー、同じく遷移性形質移入真核細胞から直接誘導されるものを含む。このような源は、ＡＴＣｓを獲得する前に溶解されることもあり、またそうでないこともある。このような源が溶解された場合には、このような溶解は、溶解剤が熱、酵素を含む数多くの手段で達成され、その酵素は必ずしもそれに限定されないが、リゾチーム、ヘリカーゼ、グルシラーゼ、およびザイモリアーゼを含み、あるいは溶解剤は有機溶媒であってもよい。
【００３４】
本発明の増幅標的サークル（ＡＴＣｓ）は、ここで開示された方法により増幅される標的配列を含み、またここでの開示に従って、Ｐ１とＡＴＣの指名はＲＣＡの最初のラウンドを引用することを意味し、更にＰ１プライマーのための適切な配列の使用により、Ｐ２プライマーと指名されたオリゴヌクレオチドプライマーの次の混合物の追加により、ＤＮＡ増幅のこのような追加のラウンドの使用にた易く伸長でき、ここでＰ２プライマーはＰ１プライマーと殆んど同じ性質を持つが、タンデム配列ＤＮＡ産物（それ自身出発ＡＴＣに相補であるもの）の１個またはそれ以上に相補であるものである。もち論増幅のこのような更なるラウンドは、本発明のプロセスを用いるのに利用できる単なる一つの選択肢ではあるが、このような追加のラウンドの設計と実行は、分子生物学の技術を持つ人の通常の知識内に十分あり、ここではこれ以上記載することはしない。
【００３５】
ＭＰＲＣＡでは、増幅は各プライマーで起こり、これにより各プライマーで複製される一次ＡＴＣ（またはＡＴＣ）に相補であるセグメントのタンデム反復（すなわちＴＳ−ＤＮＡ）のコンカテマーを形成する。かくしてランダムプライマーが使用される場合には、多くのこのようなＴＳ−ＤＮＡｓが、対応するＡＴＣ配列の増幅が大幅に増加するように、各プライマーから１個形成され、何故なら産物のヌクレオチド配列、または構造は、鋳型として使用されるＡＴＣの配列のみに依存し、オリゴヌクレオチドプライマーがランダムまたは特異的もしくはその両方の混合物であろうとも、オリゴヌクレオチドプライマーの配列には依存しない。
【００３６】
これまでの技術はランダム配列を利用してきたが（例えばライザーディ他，合衆国特許第５，８５４，０３３号参照のこと）、これらは全ゲノムまたは線状配列の増幅に使用され、本発明の一本鎖または複式サークルの増幅に使用されたものではなかった。
【００３７】
本発明は、現存する方法を上まわる改良（チェン，Ｖ．ｇ．及びネルソン，Ｓ．Ｆ．，全米科学アカデミー紀要９３巻，１４６７６−１４６７９ページ（１９９６年））およびこの反応の望ましい酵素としてφ２９ ＤＮＡのここで提案された使用で、線状ＤＮＡ標的の増幅にランダムまたは多重プライマーを使用するランダムプライマー（ザン，Ｌ．他，全米化学アカデミー紀要，８９巻，５８４７−５８５１ページ（１９９２年））、およびエキソヌクレアーゼ耐性プライマー（下記参照）を提供する。従って本発明は、φ２９ ＤＮＡポリメラーゼの特徴の利点を得る高分子量線状ＤＮＡ標的の増幅のための方法、およびφ２９ ＤＮＡポリメラーゼと会合する３′−５′エンドヌクレアーゼ活性と両立するエキソヌクレアーゼ耐性ポリマーを含み、ここで前記線状ＤＮＡ標的はＡＴＣに代って使用される。
【００３８】
前に記載したように、本発明に従って開示された増幅のための鋳型として利用される増幅標的サークルは、一本鎖ＤＮＡサークルまたは複式（二本鎖）ＤＮＡサークルである。前記ＡＴＣｓが複式である場合には、前記複式の少なくとも一本鎖がニックを含有することが望ましい。このようなニックは一般に複式サークルで存在するが、それらは更にそこに存在していなくても、従来の技術で公知の酵素法などによりこのようなサークルに導入される。選択肢としては、複式サークルの一つの鎖でのニックの存在は、望ましくもなくまた必要でもない。複式ＤＮＡサークルの２個の鎖は、ＭＰＲＣＡに必要な多重プライマーのハイブリッド形成を可能にする当業者に公知の手順により、ニックの不在下で変性され十分に巻きがとれるであろう。
【００３９】
複式サークルが採用される場合には、増幅は一般に鋳型として両方の鎖から起こるであろう。両鎖の同時の増幅は望ましくまた望ましくないこともある。複式サークルが更に前記サークルのＤＮＡを配列決定するように設計された反応で使用されるものとすると、両鎖の増幅は望ましい特徴のものとなり、そのため複式サークルは（必要な場合ニックの形成の場合を除き）更なる処置なしで直接使用することができる。しかし他の用途として、両鎖の同時の増幅が望ましい特徴ではない場合には、それは本発明のプロセスによる増幅に役立ち、鎖を変性し分離するため、あるいは選択肢として、複式環状鋳型の２個の鎖の１個のみに相補である配列を含む多重特異的プライマーを採用するために、当業者の技術の範囲内に十分にある。もち論他の有用な戦略も直ちに当業者に起こるであろうし、ここで更に詳細に記載する必要はない。
【００４０】
増幅サークルのサイズで、構造が一本鎖か複式であるか、また使用されるＤＮＡポリメラーゼに依存して、ＭＰＲＣＡは（採用される特定のプライマーおよび標的配列のためにしばしば臨時に決定される）サークル数、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓおよびＭｇ２＋を最適化できるきわめて高い度合の増幅（および感受性）を達成する。
【００４１】
ある状況では、起こり得る増幅の範囲、およびまたは形成されるＴＳ−ＤＮＡの量を計量的に決定し、あるいはある状況においては、出発混合物のＡＴＣｓが、構造的におよびまたはサイズの上からも均一でない場合に形成される増幅標的サークルの相対量を弁別する様式で測定できることが望ましい。このような場合には、本発明は、その計量測定がよりた易く行えるように、特殊なデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）が使用される場合などのようなかなり多数の標準検出計画で十分に機能する。もっとも一般的な例は、このようなヌクレオチド基質が放射能標識されるか、あるいは蛍光標識その他などの標識の他の型のものがそこに付着される場合である。改めてこのような状況で使用され得る方法は多くあり、それに伴なう技術は標準のものであり、当業者にとっては公知である。かくしてこのような検出標識は、直接または間接的に、増幅核酸と関連であるいずれかの分子を含み、直接または間接的に、測定可能でまた検出可能な信号を生じるものである。核酸内にとり込まれ、あるいは核酸プローブと結合する多くのこのような標識は、当業者に公知である。その一般的な例としては、放射性同位元素、蛍光分子、燐光分子、酵素、抗体、およびリガンドが含まれる。
【００４２】
蛍光標識の例は、ＣｙＤｙｅｓ、例えばＣｙ２，Ｃｙ３，Ｃｙ３．５，Ｃｙ５、およびＣｙ５．５を含み、エイマシャム・ファルマシア・バイオテックから利用できる（合衆国特許番号第５，２６８，４８６号）。適切な蛍光標識の更なる例はフルオレセイン，５，６−カルボキシメチルフルオレセイン，テキサスレッド，ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ），クマリン，ダンシルクロリド、およびローダミンを含む。望ましい蛍光標識はフルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）およびローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）である。これらのものは、モレキュラー・プローブス，ユージーン，オレゴンおよび−リサーチ・オーガニクス，クリーブランド，オハイオを含む各種の商業源から得ることができる。
【００４３】
標識ヌクレオチドは、検出標識の望ましい形態であり、何故なら、それらは合成期間中にＲＣＡの産物に直接取り込むことができるからである。増幅標識に取り込むことのできる検出標識の例は、ヌクレオチド類似体、例えばＢｒｄＵｒｄ（ホイおよびシムケ，突然変異研究，２９０巻：２１７−２３０ページ（１９９３年）），ＢｒＵＴＰ（ワンジック他，細胞生物学ジャーナル，１２２巻：２８３−２９３ページ（１９９３年））およびビオチン修飾ヌクレオチド（ランガー他，全米科学アカデミー紀要，７８巻：６６３３ページ（１９８１年））またはジゴキシゲニンなどの適切なハプテンで修飾されたヌクレオチド（カークホフ、分析生化学、２０５巻：３５９−３６４ページ（１９９２年）を含む。適切な蛍光標識ヌクレオチドは、フルオレセイン−イソシアネート−ｄＵＴＰ，シアニン−３−ｄＵＴＰおよびシアニン−５−ｄＵＴＰである（ユー他，核酸研究２２巻：３２２６−３２３２ページ（１９９４年））である。ＤＮＡの望ましいヌクレオチド類似体検出標識は、ＢｒｄＵｒｄ（ＢＵＤＲ三リン酸、シグマ）であり、また望ましいヌクレオチド類似体検出標識は、ビオチン−１６−ウリジン−５′−三リン酸（ビオチン−１６−ｄＵＴＰ ベーリンガー・マンハイム）である。放射能標識は、ここで開示された増幅方法にとりわけ有用である。かくして、このようなｄＮＴＰｓは、ここで記載された蛍光標識などのような容易に検出可能な成分を取り込むことも可能である。
【００４４】
本発明は、各種の方法で信号増幅を達成する手段を提供する。この場合の目標は、標的の検出と特徴付けを可能にする信号を増幅することである。ＤＮＡが、標識プローブのアニーリングにより、または標識ヌクレオチドの取り込みにより、あるいは合成後のＤＮＡ産物の標識化により、例えば検出可能分子の共有結合修飾またはインターカレーションにより検出される場合を含み、またそれに限定されない方法において、本発明は、ＤＮＡ産物を増幅し、またそれにより信号強度を増幅する方法を提供する。
【００４５】
本発明の方法は、多重プライミング事象が増幅の標的である環状ＤＮＡ分子に誘導される故で、大幅に増加した増幅を提供する。かくして、増幅の速度と範囲は、ＤＮＡサークルを複製する単一ＤＮＡポリメラーゼにより達成されたものに限定されない。その代わりに多重ＤＮＡポリメラーゼは、各鋳型サークルを同時に複製するために誘導され、そのそれぞれはプライマーの一つから開始する。これは本発明のユニークな特長を提供する特性である。
【００４６】
本発明の方法の一つの実施例では、完全にランダムなプライマーが増幅プロセス、特に望ましいプロセスに使用され、何故なら鋳型を提供するＡＴＣの配列が公知ではないからである。かくしていずれかの一本鎖または複式ＤＮＡサークルが、ここで開示された方法に基づいて、広範囲の精製ありまたはなしで容易に使用することができる。かくしてランダムプライマーを使用する主要な利点は、既知または未知の配列の環状ＤＮＡ標的が、線状および環状ＤＮＡ分子の両方の混合物を含むＤＮＡ分子の複合混合物の間から、優先してまた選択的に増幅されるということである。
【００４７】
特異的な実施例が実施例１で記載されており、ここでサークルの周りの９個の異なる部位でアニーリングされた９個の異なるオリゴヌクレオチドプライマーを持つバクテリオファージ、Ｍ１３ ＤＮＡは、６個またはそれより少ないプライマーを持つＭ１３ ＤＮＡよりもより大きな増幅を提供する。更に６個の異なるプライマーを持つＭ１３ ＤＮＡは、３個またはそれより少ないプライマーを持つＭ１３ ＤＮＡよりも大きな増幅を提供する。最後に、３個のプライマーを持つＭ１３ ＤＮＡは、Ｔ度１個のプライマーを持つＭ１３よりも大きな増幅を提供する。
【００４８】
も一つ特異的な実施例が実施例２で記載されており、ここでサークルの周りでアニーリングされたランダムオリゴヌクレオチドプライマーを持つＭ１３ ＤＮＡは、Ｔ度１個のプライマーを持つＭ１３で見られるものよりもより大きな増幅を提供する。
【００４９】
も一つの特異的な実施例が実施例３で記載されており、ここで未精製コロニー抽出物は、環状プラスミドＤＮＡ標的の源であり、また未精製プラーク抽出物は、環状バクテリオファージＭ１３ ＤＮＡ標的の源である。これらの環状標的は、本発明の方法を用いて存在する細菌ＤＮＡよりも優先的に増幅される。
【００５０】
も一つの特異的な実施例が実施例５に記載されており、ここでサークルの周りでアニーリングされた、エキソヌクレアーゼ耐性ランダムプライマーを持つＭ１３ ＤＮＡは、エキソヌクレアーゼ感受性ランダムプライマーを持つＭ１３で見られるものよりもより大きい増幅を提供する。これは、実施例４で提示された結果と一致しており、ここでは、そのような特別なエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを欠いているランダムプライマーが、しばしば容易に分解し、特にエキソヌクレアーゼ活性を持つ酵素が、高水準で存在する場合には、とりわけ容易に分解する。
【００５１】
も一つの特異的な実施例が実施例６で記載されており、ここでＭ１３ ＤＮＡの０．０１ｎｇの投入から増幅された鋳型ＤＮＡを用いるＤＮＡ配列が、非増幅ＤＮＡ鋳型２００ｎｇから達成された信号に類似した信号強度に帰着したことが示される。
【００５２】
も一つの特異的な実施例が実施例７に記載されており、ここで未精製コロニー抽出物は、環状ＢＡＣ ＤＮＡ標的の源であり、またこれらＢＡＣ標的は、本発明の方法を用いて存在する細菌ＤＮＡ以上に優先的に増幅されることが示される。
【００５３】
も一つの特異的な実施例が実施例８に記載されており、ここで未修飾ランダムヘキサマーに代えてエキソヌクレアーゼ耐性ランダムへキサマーを使用するヒトゲノムＤＮＡが、少なくとも２００倍の収量を改善できることが示される。
【００５４】
ここで開示された方法に有用なエキソヌクレアーゼ耐性プライマーは、それらをエキソヌクレアーゼ消化に対して耐性にする修飾ヌクレオチドを含むことができる。例えばプライマーは、プライマーの３′末端でヌクレオチドの間で１，２，３または４個のホスホチオエート結合を含むこともある。
【００５５】
かくしてある実施例においては、本発明は、以下のプロセスに関し、すなわちプライマーは、一般には酵素により、とりわけエキソヌクレアーゼにより、とりわけもっとも３′−５′−エキソヌクレアーゼ活性により、プライマーを分解に対して耐性にする少なくとも１個のヌクレオチドを含むことを特徴とするプロセスに関する。このような実施例においては、少なくとも１個のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチドであり、またはある修飾されたヌクレオチドである。このようなヌクレオチドは、一般に３′末端ヌクレオチドであるが、本発明のプロセスは、更にそのようなヌクレオチドが３′末端位置以外に位置し、また前記ポリマーの３′末端ヌクレオチドが、３′−５′−エキソヌクレアーゼ活性により除去できる実施例に関する。
【００５６】
ＡＴＣ鋳型を固体支持材に付着させる手段を提供することも、本発明の範囲内で有利である。これを達成するためには、増幅される固体支持材に単一オリゴヌクレオチドプライマーを付着させることだけでよい。かくして、本発明のプロセスを実施するに際して、一定のＡＴＣは多重プライマーに付着されるであろうけれども、その一つのみがある種の固体支持材にそれ自身をつなぎ留めることが必要とされる。このような拘束プライマーは二極性であり、従って２個の３′末端を持ち、これによりこのような末端が支持材にプライマーを付着させ、一方他の端部はサークルに付着できプライマーに増幅を提供するという点でしばしばこれは有利である。ＡＴＣに付着される他の多重プライマーが、それ自身をいずれかの型の支持材に付着することが必要とされるものは何も存在しない。二極性拘束プライマーは、ここで開示されるプロセスに対して、障害なく特異的でありまたはランダムであり得る。このような二極性プライマーの例、およびその調製と用途については、文献で明らかである［例えば前掲ライザーディ他（１９９８年）の開示を参照されたい］。
【００５７】
加えて、本発明のＡＴＣは、オリゴヌクレオチドプライマーがとりわけ便利で回りくどくないものではあるけれども、何らかの便利な手段によってある種の固体支持材に直接付着されるような形態で利用することができる。
【００５８】
このような支持材へのＡＴＣまたはオリゴヌクレオチドプライマーの付着は、前記ポリマーまたはＡＴＣを固体支持材に付着させるのに役立つ、例えば生物系または他のもののある種のポリマーなどのある分子種の手段を通じて行うことができる。このような本発明の方法に有用な固体基質は、オリゴヌクレオチドと連結することのできるいずれかの固形物質を含むことができる。これはアクリルアミド，セルロース，ニトロセルロース，ガラス，ポリスチレン，酢酸ビニルポリエチレン，ポリプロピレン，ポリメタアクリレート，ポリエチレン，ポリエチレンオキサイド，ガラス，ポリケイ酸塩，ポリカーボネート，テフロン（Ｒ），フルオロカーボン，ナイロン，シリコンラバー，ポリ無水物，ポリグリコール酸，ポリ乳酸，ポリオルソエステル，フマール酸ポリプロピル，コラーゲン，ポリグリコサミド，グリカン、およびポリアミノ酸などの物質を含む固体基質は、薄層フィルムまたは薄膜，ビート，ボトル，皿，線維，織布，形成ポリマー，粒子および微粒子を含むいずれかの有用な形態を持つことができる。固体基質のための望ましい形態はガラススライドまたはマイクロフィルターである（例えば標準の９６ウエル皿がそれである）。望ましい実施例は支持材としてガラスまたはプラスチックを利用する。更なる調製については、合衆国特許番号第５，８５４，０３３号を参照されたい。
【００５９】
オリゴヌクレオチドを固体基質に固定する方法は十分確立されている。アドレスプローブと検出プローブを含むオリゴヌクレオチドは、確立されたカップリング法を用いて基質に結合できる。例えば適切な付着法は、ピーズ他，全米科学アカデミー紀要，９１巻（１１号）：５０２２−５０２６ページ（１９９４年）に記載されている。オリゴヌクレオチドを固体基質に付着させる望ましい方法は、グオ他，核酸研究，２２巻：５４５６−５４６５ページ（１９９４年）に記載されている。
【００６０】
本発明に有用なオリゴヌクレオチドとＡＴＣｓは、確立されたオリゴヌクレオチド合成法を用いて合成することができる。オリゴヌクレオチドを合成する方法は、従来の技術で公知である。このような方法は、標準の酵素消化法からヌクレオチド断片分離法にまでわたることができる（例えば、サムブルック他，分子クローニング：ラボラトリーマニュアル，第二版，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク（１９８９年），ウー他，遺伝子バイオテクノロジーの方法（ＣＲＣプレス，ニューヨーク，ニューヨーク，１９９７年），および組換え遺伝子発現プロトコル，分子生物学，第６２巻所収（トゥアン，編，フマーナプレス，トトワ，ニュージャージー，１９９７年），これらの開示はここで引用例としてとり込まれている）。他に純粋に合成法としては、例えばミリゲンまたはベックマンシステム１プラスＤＮＡ合成機を利用するシアノエチルホスホルアミダイト法によるものもある（例えばミリゲン−バイオサーチ，バーリントン，マサチューセッツのモデル８７００自動合成機またはＡＢ１モデル３８０Ｂ）。オリゴヌクレオチドを作るのに有用な合成法は、更に生田他，アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー，５３巻：３２３−３５６ページ（１９８４年）（ホスホトリエステルとホスファイト−トリエステル法），およびナラン他，酵素学の方法，６５巻：６１０−６２０ページ（１９８０年），（ホスホトリエステル法）により記載されている。タンパク質核酸分子は、ニールセン他，バイオコンジュゲートケミカルズ，５巻：３−７ページ（１９９４年）に記載されたものなどの既知の方法を用いて作ることができる。
【００６１】
化学的硫化により、エキソヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエートジエステルを含むプライマーを合成する方法は、十分に確立されている。ランダムプライマーの固定相合成は、３′末端で１個またはいくつかの特異的に配置されたインターヌクレオチドホスホロチオエートジエステルを採用する。ホスホロチオエートトリステルは、五価リンを生成するために、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１ジオキサイド１，２、またはボーケージ試薬とのホスホロアミダイト化学反応の間に得られた中間ホスファイトトリエステルの酸化で導入することができ、ここでホスホロチオエートトリエステルはチオンとして存在する。このように形成されたチオンは、インターヌクレオチドホスホジエステルを生成するのに必要な続く酸化段階で安定している（マイヤー，Ｒ．Ｐ．，イーガン，Ｗ．，リーガン，Ｊ．Ｂ．，ボーケージ，Ｓ．Ｌ．，アメリカ化学学会ジャーナル，１１２巻：１２５３ページ，（１９９０年），およびマイヤー，Ｒ．Ｐ．，フィリップス，Ｌ．Ｒ．，イーガン，Ｗ．，リーガン，Ｊ．Ｂ．，ボーケージ，Ｓ．Ｌ．，有機化学ジャーナル，５５巻：４６９３ページ（１９９９年））。
【００６２】
ここで記載された多くのオリゴヌクレオチドは、それらの間でハイブリッドが形成できるように、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸のある部分に相補であるように設計される。これらのハイブリッドの安定性は、レスニックおよびフライヤー，バイオケミストリー，３４巻：１０８０７−１０８１５ページ（１９９５年），マグロー他，バイオテクニーク，８巻：６７４−６７８ページ（１９９ン年），およびライクリック他，核酸研究：６４０９−６４１２ページ（１９９０年）などに記載されたもののような既知の方法を使用して計算することができる。
【００６３】
ＲＣＡのローリングサークル複製段階で有用なＤＮＡポリメラーゼは、プライムド一本鎖サークル（または複式基質の各鎖）のローリングサークル複製を実行しなければならない。このようなポリメラーゼは、ここでローリングサークルＤＮＡポリメラーゼとして引用されている。ローリングサークル複製に関しては、ＤＮＡポリメラーゼが鋳型鎖に相補である鎖を置換できることが望ましく、この置換は鎖置換と名付けられ、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を欠いている。鎖置換は、ＡＴＣの多重タンデム複製の合成をもたらすのに必要である。５′→３′のエキソヌクレアーゼ活性は、もしそれが存在するなら、合成鎖の破壊を来たすことになるであろう。開示された方法で使用されるＤＮＡポリメラーゼが、高度に処理加工性であることも望ましい。開示された方法での使用にＤＮＡポリメラーゼの適合性は、ローリングサークルに複製を実行するその能力を評価することにより、容易に決定することができる。望ましいローリングサークルＤＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージφ−２９ ＤＮＡポリメラーゼ（合衆国特許番号５，１９８，５４３号、５，００１，０５０号，ブランコ他）、ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ（松本他，遺伝子８４巻：２４７ページ，（１９８９年）、ファージφ−ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（ジャン他，全米科学アカデミー紀要，８４巻：８２８７ページ（１９８７年）および、ズーおよび伊藤，バイオケミカル・バイオフィジカル・アクタ，１２１９巻：２６７−２７６ページ（１９９４年））、ＶＥＮＴ．ＲＴＭ．ＤＮＡポリメラーゼ（コン他，生物学化学ジャーナル．２６８巻：１９６５−１９７５ページ（１９９３年））、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレウノ断片（ジェイコブセン他，生化学ヨーロピアン・ジャーナル４５巻：６２３−６２７ページ（１９７４年））、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ（チャタージー他，遺伝子９７巻：１３−１９ページ（１９９１年））、およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素（カブードおよびベンコビッチ，カレント・バイオロジー：５巻１４９−１５７ページ（１９９５年））。φ−２９ ＤＮＡポリメラーゼがもっとも望ましい。同じく望ましいポリメラーゼは、Ｔ７生のポリメラーゼ、バシラス＝ステアロテルモフィルス（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、テルモアネロバクター＝テルモヒドロスルフリカス（Ｔｔｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（合衆国特許番号第５，７４４，３１２号）、およびテルムス・アクアティカス，テルムス・フラブスまたはテルムス・テルモフィルスのＤＮＡポリメラーゼを含む。同じように望ましいのは、φ２９，Ｃｐ−１，ＰＲＤ１，φ１５，φ２１，ＰＺＥ，ＰＺＡ，Ｎｆ，Ｍ２Ｙ，Ｂ１０３，ＳＦ５，ＧＡ−１，Ｃｐ−５，Ｃｐ−７，ＰＲ４，ＰＲ５，ＰＲ７２２およびＬ１７のファージのＤＮＡポリメラーゼから選択されるφ２９型ＤＮＡポリメラーゼである。特異的な実施例において、ＤＮＡポリメラーゼはバクテリオファージφ２９ ＤＮＡポリメラーゼであり、ここで多重プライマーはエキソヌクレアーゼ活性に耐性であり、標的ＤＮＡは高分子量線状ＤＮＡである。
【００６４】
ＲＣＡ期間中の鎖置換は、とりわけ複式ＡＴＣｓが鋳型として利用された場合には、例えばヘリカーゼなどのような鎖置換因子の使用を通じて促進することができる。たとえＤＮＡポリメラーゼがこのような因子の不在下でローリングサークル複製を実行しないとしても、鎖置換因子の存在下でローリングサークル複製を実行できるＤＮＡポリメラーゼはいずれも本発明のプロセスでの使用に適している。ＲＣＡで有用な鎖置換因子はＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット（鶴見他，ウイルス学ジャーナル，６７巻（１２号）７６４８−７６５３ページ（１９９３年））、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（ツァイーデルヘルト，およびファン・デル・フリート，ウイルス学ジャーナル，６８巻（２号）：１１５８−１１６４ページ（１９９４年参照）。ヘルペス単純性ウイルスタンパク質ＩＣＰ８（ベーマーおよびレーマン，ウイルス学ジャーナル，６７巻（２号）：７１１−７１５ページ（１９９３年）；スケーライター，およびレーマン，全米科学アカデミー紀要，９１巻（２２号），１０６６５−１０６６９ページ（１９９４年））、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ；リグラーおよびロマーノ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７０巻：８９１０−８９１９（１９９５年）および子牛胸腺ヘリカーゼ（シーゲル他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６７巻：１３６２９−１３６３５ページ（１９９２年））を含む。
【００６５】
ローリングサークル複製を実行するためのポリメラーゼの能力は、ファイアーおよびスー，全米科学アカデミー紀要，９２巻：４６４１−４６４５ページ（１９９５年）、およびライザーディ（合衆国特許番号５，８５４，０３３号、例えば実施例１など）に記載されたものなどのような、ポリメラーゼをローリングサークル複製で使用することにより決定することができる。
【００６６】
別の特異的な実施例において、標的ＤＮＡは、例えば一本鎖バクテリオファージＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡプラスミドまたはベクターであり、それはＤＮＡ配列決定、クローニング、またはマッピング、およびまたは検出の目的で増幅される。以下の実施例は、特異的なプロトコルを提供するが、条件は増幅されるＤＮＡサークルの同定に依存して変化することができる。
【００６７】
かくして本発明の手順を実行するにあたり、特定の緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条件、ｐＨおよびその他への言及は、それを限定することを意図するものではなく、議論が提示される特殊な前後関係で、通常の知識を有する者が関心があるまたは価値があるものとして認識するすべての関連する物質を含むように読み取られるべきであることは理解されねばならない。例えば、この一つの緩衝液または培養培地をも一つのものに置換して、しかも同一ではないにしても類似の結果を達成することはしばしば可能である。従来の技術に習熟した者は、無駄な実験を行うことなく、ここで開示された方法と手順を使用して、その目的に最適に役立つようにそのような置換を行うことができるようなシステムと方法論についての十分な知識を有するであろう。
【００６８】
本発明は、これから以下の限定されない実施例にしてより更に詳細に記載されるであろう。これらの実施例の開示を適用するに際して、本発明に基づき開示される方法の他の異なる実施例も、関連する技術に習熟した者に間違いなくそれら自身を提示するものとなるであろうことは十分に留意しておかなければならない。
【００６９】
【発明を実施するための最良の形態】
（実施例１）
多重特異的プライマーを使用するローリングサークル増幅における収量向上
【００７０】
ＲＣＡにおける増幅ＤＮＡの収量は、多重プライマーが基質ＤＮＡにアニーリングされる時に増幅することがここで示される。ＲＣＡでは、増幅ＤＮＡの収量は、環状ＤＮＡ鋳型に確立された複製フォークの数により限定されることもある。一本鎖環状ＤＮＡへの多重複製フォークの確立は、増幅が起こる点の数を比例的に増加させる。環状鋳型ＤＮＡにアニーリングされた多重プライマーの使用は、ＤＮＡポメラーゼによる多重複製フォークの確立に帰着する。この実施例は、多重プライマーが基質ＤＮＡにアニーリングされる時に、ＤＮＡ合成が増加することを実証する。
【００７１】
プライムドＭ１３ ＤＮＡは以下の通り調製された。Ｍ１３一本鎖ウイルス（＋）鎖ＤＮＡの周りの異なる部位にアニーリングする９個のオリゴヌクレオチドが得られた。アニーリング反応は、Ｍ１３ ＤＮＡとオリゴヌクレオチドのいずれか一つ、オリゴヌクレオチドの３個、オリゴヌクレオチドの６個、またはすべて９個のオリゴヌクレオチドのいずれかを含んでいた。アニーリングは、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，４０ｍＭのＮａＣｌ，６．５μｇのＭ１３ウイルス（＋）鎖ＤＮＡ（Ｍ１３サークルの２．７５ｐｍｏｌｅｓと等価）を含む反応液（１００μｌ）で５０ｐｍｏｌｅｓの各オリゴヌクレオチドが加えられて行われた。これらの条件下で、オリゴヌクレオチドの各プライマーに対する比率は、１８：１であった。反応は１分間９５℃に加熱され、３０分にわたり室温までゆっくり冷却された。９個のオリゴヌクレオチドの構造は以下の通りであった。
【００７２】
プライマー１
５’ ＴＣＴ ＧＴＴ ＴＡＴ ＡＧＧ ＧＣＣ ＴＣＴ ＴＣＧ ＣＴＡ ＴＴＡ ＣＧＣ ＣＡＧ ３’
（配列識別番号１）
プライマー２
５’ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＣＡＧ ＧＧＴ ＧＧＴ ＴＴＴ ＴＣＴ ＴＴＴ ＣＡＣ ＣＡＧ ＣＧＡ ＧＡＣ ＧＧＧ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＴＧ ＡＴＴ ＧＣＣ ＣＴＴ ＣＡＣ ＣＧＣ ＣＴＧ ３’
（配列識別番号２）
プライマー３
５’ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＡＣＣ ＡＣＡ ＣＣＣ ＧＣＣ ＧＣＧ ＣＴＴ ＡＡＴ ＧＣＧ ＣＣＧ ＣＴＡ ＣＡＧ ＧＧＣ ＧＣＧ ＴＡＣ ＴＡＴ ＧＧＴ ＴＧＣ ＴＴＴ ＧＡＣ ＧＡＧ ３’
（配列識別番号３）
プライマー４
５’ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＣ ＣＴＣ ＡＡＧ ＡＧＡ ＡＧＧ ＡＴＴ ＡＧＧ ＡＴＴ ＡＧＣ ＧＧＧ Ｇ ３’
（配列識別番号４）
プライマー５
５’ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＡＣ ＡＡＡ ＡＧＧ ＧＣＧ ＡＣＡ ＴＴＣ ＡＡＣ ＣＧＡ ＴＴＧ ＡＧＧ Ｇ ３’
（配列識別番号５）
プライマー６
５’ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＣＣ ＴＧＡ ＡＣＡ ＡＡＧ ＴＣＡ ＧＡＧ ＧＧＴ ＡＡＴ ＴＧＡ ＧＣＧ Ｃ ３’
（配列識別番号６）
プライマー７
５’ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＡＣ ＡＡＣ ＡＴＧ ＴＴＣ ＡＧＣ ＴＡＡ ＴＧＣ ＡＧＡ ＡＣＧ ＣＧＣ Ｃ ３’
（配列識別番号７）
プライマー８
５’ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＣＡ ＴＣＧ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＣＡ ＡＴＡ ＡＣＧ ＧＡＴ ＴＣＧ ＣＣＴ Ｇ ３’
（配列識別番号８）
プライマー９
５’ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＡＴ ＧＣＧ ＣＧＡ ＡＣＴ ＧＡＴ ＡＧＣ ＣＣＴ ＡＡＡ ＡＣＡ ＴＣＧ Ｃ ３’
（配列識別番号９）
一本鎖環状ＤＮＡにアニーリングされた多重プライマーの使用により、ＤＮＡ合成の収量増加を説明するために、４個のＲＣＡ反応が行われた。反応液（５０μｌ）は２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，７ｍＭのＭｇＣｌ２，および３０ｍＭのＮａＣｌ，２００μＭのデオキシリボヌクレオシド三リン酸，α−［３２Ｐ］ｄＣＴＰ、特異的活性４０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ全ｄＮＴＰ，１２ｎｇのプライムドＭ１３ウイルス（＋）鎖ＤＮＡおよび２６ユニットのＴ７シークエナーゼを含有していた。
【００７３】
反応は３７℃で２時間培養された。アリコートは３０分，６０分，９０分，および１２０分でとられ、放射性デオキシリボヌクレオチドの取り込みによりＤＮＡ合成を計量するために、ＤＥ８１フィルター上にスポットされた。投入Ｍ１３ ＤＮＡのフォールド増幅は、投入Ｍ１３ ＤＮＡに存在するデオキシリボヌクレオチドのｐｍｏｌで、とり込まれたデオキシリボヌクレオチドのｐｍｏｌを割ることにより決定された。その結果は図２で示されている。
【００７４】
そこで見ることができるように、著しくより多いＤＮＡ合成が、より多くのプライマーをそれにアニーリングしたＭ１３鋳型で現れる。
【００７５】
（実施例２）
ランダムヘキサマープライマーを使用するローリングサークル増幅における収量向上
【００７６】
多重ランダムヘキサマープライマーが基質ＤＮＡにアニーリングされる時に、ＲＣＡ内の増幅ＤＮＡの収量を向上されることも実証された。
【００７７】
プライムドＭ１３ ＤＮＡは以下の通り調製された。単一プライムドＭ１３は、前記の通り調製された。ランダムヘキサマープライムドＤＮＡは、Ｍ１３ ＤＮＡとランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドを含有していた。アニーリングは、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２０ｍＭのＫＣｌ，０．１ｍＭのＥＤＴＡ，６ｎｇのＭ１３ウイルス（＋）鎖ＤＮＡ（Ｍ１３サークルの２．５ｆｍｏｌｅｓに相当）、および６０００ｐｍｏｌｅｓのランダムヘキサマープライマーを含有する反応液（６０μｌ）で実施された。これらの条件下で、プライマー：サークル比は２．４×１０６：１であった。反応は１分９５℃まで加熱され、３０分にわたり室温までゆっくりと冷却された。
【００７８】
一本鎖環状ＤＮＡにアニーリングされたランダムヘキサマープライマーを使用してＤＮＡ合成の収量増加を説明するために、２個のＲＣＡ反応が行われた。反応液（２０μｌ）は５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭのＭｇＣｌ２，２０ｍＭの硫酸アンモニウム，および２００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン，１ｍＭのデオキシリボヌクレオシド三リン酸，α−［３２Ｐ］ｄＣＴＰ，特異的活性２４ｃｐｍ／ｐｍｏｌ全ｄＮＴＰ，および０．３２ユニットのφ２９ＤＮＡポリメラーゼを含有していた。第１反応液は、実施例１で記載の通り調製された１ｎｇの単一プラムイドＭ１３を含有し、一方第２反応液は、前に記載の通り調製された１ｎｇのランダムヘキサマープライムドＭ１３を含んでいた。
【００７９】
反応液は２４時間３７℃で培養された。アリコートが２時間，６時間および２４時間で採取され、放射性デオキシリボヌクレオチドのとり込みが確認された。投入Ｍ１３ ＤＮＡのフォールド増幅が、とり込まれたデオキシリボヌクレオチドのｐｍｏｌを投入Ｍ１３ ＤＮＡに存在するデオキシリボヌクレオチドのｐｍｏｌで割ることで確認された。その結果は図３で示される。
【００８０】
ここで見られるように、単一プライマーを持つＭ１３（単一プライムドＭ１３曲線の参照のこと）と比較して、Ｍ１３鋳型にアニーリングされた多重ランダムプライマーを持つＭ１３鋳型（ヘキサマープライムドＭ１３曲線を参照）で著しく多いＤＮＡ合成が生じる。Ｍ１３ ＤＮＡの３７０倍増幅がこれらの条件下で達成され、これは少量のＤＮＡ鋳型の増幅にとっては重要な有用性を持つ。
【００８１】
（実施例３）
ランダムヘキサマープライマーを使用する細菌コロニーとプラークからのプラスミドとバクテリオファージＤＮＡのローリングサークル増幅
【００８２】
多重ランダムヘキサマープライマーでプライミングされた環状プラスミドとバクテリオファージＤＮＡが、細菌コロニーまたはプラークからのＲＣＡを用いて採取された未精製物質から特異的に増幅されることも実証された。
【００８３】
ＤＮＡサンプルは以下の通り調製された。長さ１ｃｍのポリエチレン管材料（イントラメディック，ＰＥ２０，１．０９ｍｍ外径）の部分の一端が、大腸菌の菌叢において、プラスミドｐＵＣ１９またはバクテリオファージＭ１３のプラークで形質転換された大腸菌のコロニーに穿刺された。対照反応物としては、管材料は、平板内には穿刺されないか、またはプラスミドで形質転換されたプラークも細菌も含まない細菌菌叢の領域に穿刺された。管材料は次いで、２０μｌの緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含む）を含有するサーモサイクラー管（２００μｌ）に配置された。ランダムヘキサマープライマー（１０００ｐｍｏｌ）が各管に加えられ、反応液は９５℃で３分加熱され、その後３０分にわたり室温までゆっくりと冷却された。
【００８４】
ＲＣＡを行うために、反応液は最終量４０μｌで、最終濃度５０ｎＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭのＭｇＣｌ２，２０ｍＭの硫酸アンテニウム，５％のグリセロール，２００ｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン，１ｍＭのデオキシリボヌクレオシド三リン酸，α−［３２Ｐ］ｄＣＴＰ，特異活性６７ｃｐｍ／ｐｍｏｌ全ｄＮＴＰ，０．０４ユニットの酵母菌ピロホスファターゼ，および０．６ユニットのφ２９ ＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。
【００８５】
反応液は８時間３７℃で培養された。８時間後にアリコートが採取され、放射性デオキシリボヌクレオチドのとり込みが確認された。ＤＮＡ合成量は二つの方法で確認された。まずとり込まれたデオキシヌクレオチドの量が合成されたＤＮＡのナノグラム数を計算するのに使用された。第２に、放射能標識反応産物が、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで消化され、産物はアガロースゲル（１．０％，ＴＢＥ）を通して電気泳動により分析された。Ｍ１３（７．２キロベース）とｐＵＣ１９（２．７キロベース）の増幅の線状産物は計量され、既知の量の線状放射能標識Ｍ１３ ＤＮＡと比較された。増幅ＤＮＡの量の２個の測定値は一致した結果をもたらした。この結果は表１で示される。
【００８６】
表１は、多重ランダムへキサマープライマーでプライミングされたプラスミドとバクテリオファージＤＮＡが、細菌コロニーまたはプラークから採取された未精製物質から増幅された後のＤＮＡの収量（ｎｇで表示）を示す。ここで見られるように、ＤＮＡの著しい収量向上が、プラスミドまたはバクテリオファージＤＮＡを含まないサンプルと比較して、コロニー（ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡ）またはプラーク（バクテリオファージＭ１３ ＤＮＡ）から達成される。
【００８７】
【表１】
【００８８】
このような方法は、ゲノム，ｃＤＮＡまたは他の複合ＤＮＡｓの配列決定に採用されるこれまでの方法よりも際立った利点を提供する。
【００８９】
１．反応が遅く、高価で、労働集約的なプラスミドまたはファージのミニプレップの必要性の回避。プラスミドとファージの成長は、細菌宿主により寛容化されない「有害な」配列を予防することにより制限される。この方法はこれらそのそれぞれを潜在的に未然に予防し、成長とミニプレップに要する時間を約２４時間短縮するであろう。
【００９０】
２．両鎖の配列決定を可能にする産物の提供（ファージ鎖からの配列決定のみを可能にするＭ１３ファージミニプレップとの比較におけるもの）。
【００９１】
３．高処理量毛管配列機（例えばエイマシャム・ファーマシア・バイオテック，アプライド・バイオシステムズ，およびベックマン・インストゥルメンツで製造されたもの）により採用された動電学的注入に対する排除に理想的に適した分子サイズによる産物の提供。これとは逆に、ファージまたはプラスミドミニプレップは、正確な量で提供されないと毛管の遮断を起こし得る産物を産出する。
【００９２】
４．サンプル（プラークまたはコロニー）間で「標準化」されるＤＮＡ収量の提供。すなわち、産物量は投入鋳型量に拘らず不変に留まるよう構成することができる。この特徴は、鋳型の追加の超過が品質を低下させ、配列の長さを読み取ることが必要とされる毛管配列で特に有利な特徴である。
【００９３】
５．本方法は、ゲノム配列決定のためのベクター選択の際に、より大きな柔軟性を可能にする。サブクローニングは減少または排除される。現在ＢＡＣｓは、非常に限定された組成物のＭ１３ファージまたはプラスミドにサブクローン化される。部分または全体としての合成サブクローニングベクターは、ゲノム範囲を最大にし、配列決定反応数を最小にするように設計できるように製作可能である。
【００９４】
（実施例４）
φ２９ ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によるプライマーの分解
【００９５】
ランダムヘキサマープライマーは、ＲＣＡで用いられる条件下で、φ２９ ＤＮＡポリメラーゼの存在下で分解した。
【００９６】
プライムドＭ１３ ＤＮＡは以下の通り調製された。ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドは、１．３×１０７ｃｐｍ／ｐｍｏｌの特異活性までγ３２Ｐ ＡＴＰで５′末端標識された。アニーリング反応液（６０μｌ）は２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，４０ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ，６ｎｇのＭ１３ウイルス（＋）鎖ＤＮＡ（Ｍ１３サークルの２．５ｆｍｏｌｅｓに等価物）、および６０００ｐｍｏｌｅｓの標識ランダムヘキサマープライマーを含有していた。これらの条件の下で、プライマー：サークルの比率は２．４×１０６：１であった。反応液は９５℃まで１分加熱され、３０分にわたり室温までゆっくりと冷却された。
【００９７】
ＲＣＡ条件の下でφ２９ ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー分解を評価するために、反応液は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭのＭｇＣｌ２，２０ｍＭの硫酸アンモニウム，５％のグリセロ−ル，２００ｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン，１ｍＭのデオキシリボヌクレオシド三リン酸，０．０２ユニットの酵母菌ピロホスファターゼ，および０．１ユニット，１．０ユニットおよび１０ユニットのφ２９ ＤＮＡポリメラーゼの最終濃度を含む最終量にもたらされた。
【００９８】
反応液は２４時間３７℃で培養された。アリコート（３μｌ）が０時間，０．２５時間，２時間，６時間，および２３時間で採取され、反応産物は２５％ポリアクリルアミド配列決定ゲルを通じて電気泳動で分析された。結果は図４で示される。
【００９９】
ランダムプライマーは、φ２９ ＤＮＡポリメラーゼの１０ユニットの存在下で１５分で完全に分解した。プライマーは、φ２９ ＤＮＡポリメラーゼの０．１ユニットおよび１．０ユニットの存在下ではより長時間存続した。
【０１００】
かくして、このような分解を防止する方法の利用は有利である。そのような一つの方法は、次の実施例に記載される。
【０１０１】
（実施例５）
Ｍ１３ ＲＦＩ ＤＮＡのφ２９増幅でのエキソヌクレアーゼ耐性ランダムプライマーの作用
【０１０２】
多重エキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマーでプライミングされた環状二本鎖バクテリオファージＤＮＡは、エキソヌクレアーゼに感受性のプライマーでプライミングされたＤＮＡよりも、より大きい範囲で増幅される。
【０１０３】
エキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマーは、Ｎがランダムヌクレオチドを表し、下線部が５′−チオリン酸塩結合を持つヌクレオチド：５′ＮＮＮＮＮＮＴ３′を含む。
【０１０４】
この７マー（ヘプタマー）オリゴヌクレオチドにおいて、３′Ｔ残基はエキソヌクレアーゼ感受性であり、また２個の最後から２番目の３′ランダムヌクレオチドは、３′−＞５′エキソヌクレアーゼ活性に耐性である。３′−＞５′エキソヌクレアーゼの存在下では、３′Ｔ残基は除去され、エキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドを産出する。
【０１０５】
プライムドＭ１３ ＤＮＡは下記の通り調製された。アニーリング反応液は、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，４０ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ，６ｎｇのＭ１３ ＲＦＩ ＤＮＡ（Ｍ１３サークルの２．５ｆｍｏｌｅｓの等価物）、および６０００ｐｍｏｌｅｓのエキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマーを含有した。これらの条件下でプライマー：サークルの比率は２．４×１０６：１であった。反応液は９５℃で１分加熱され、３０分にわたり室温までゆっくりと冷却された。
【０１０６】
ＲＣＡを実行するために、反応液は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭのＭｇＣｌ２，２０ｍＭの硫酸アンモニウム，５％のグリセロール，２００ｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン，１ｍＭのデオキシリボヌクレオシド三リン酸，α−［３２Ｐ］ｄＣＴＰ，特異的活性６７ｃｐｍ／ｐｍｏｌ全ｄＮＴＰ，０．０２ユニットの酵母菌ピロホスファターゼ，および０．３ユニットのポリメラーゼの最終濃度を含有する２０μｌの最終量にもたらされた。
【０１０７】
反応液は３４℃で培養され、１３時間後にアリコートが採取され、放射性デオキシリボヌクレオチドのとり込みが確認された。投入Ｍ１３ ＤＮＡのフォールド増幅は、とり込まれたデオキシリボヌクレオチドのｐｍｏｌを投入Ｍ１３ ＤＮＡに存在するデオキシリボヌクレオチドのｐｍｏｌで割ることで確認された。その結果は図５で示される。
【０１０８】
ここで見られるようにエキソヌクレアーゼ耐性（エキソＲ）プライマーが使用される時に、投入ＤＮＡの著しいフォールド増幅が起こり、加えてφ２９ ＤＮＡポリメラーゼの増量が反応液に加えられるにつれて、フォールド増幅の収量の増加が見られる（１０００ｐｍｏｌエキソＲへキサマー曲線および１００ｐｍｏｌエキソＲへキサマー曲線を参照）。これとは逆に、エキソヌクレアーゼ感受性（エキソＳ）プライマーを使用するフォールド増幅は、エキソＲプライマーで見られるものよりもずっと少ない。加えて、エキソＳプライマーを使用する最適増幅は、φ２９ ＤＮＡポリメラーゼの０．３ユニットを使用するものに見られ、一方酵素水準の高いものは増幅の収量が少なかった（１０００ｐｍｏｌエキソＳプライマー曲線を参照）。追加プライマーが不在の場合には、増幅は見られなかった（プライマー無しの曲線参照）。エキソヌクレアーゼ耐性ランダムプライマーは、高濃度のφ２９ ＤＮＡポリメラーゼを用いて、９０００以上のフォールド増幅の達成を可能にし、それは非常に低い水準のＤＮＡ鋳型の増幅には大きな効用を持つ。
【０１０９】
（実施例６）
エキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマーを使用するローリングサークル増幅で増幅される鋳型ＤＮＡを使用するＤＮＡ配列決定
【０１１０】
多重エキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマーを使用して増幅された環状一本鎖バクテリオファージＭ１３ ＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定のための鋳型として有用であることが確認された。
【０１１１】
一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８ ＤＮＡ（１ｎｇ）が、６２ｐｍｏｌｅｓのランダムヘキサマー，２．５ユニットのφ２９ ＤＮＡポリメラーゼ，０．００７ユニットの酵母菌無機ピロホスファターゼと組み合わせて、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１０ｍＭのＭｇＣｌ２，７５ｍＭのＫＣｌおよび０．５ｍＭのｄＮＴＰを含む緩衝液で、５マイクロリットル反応液で増幅された。反応液は、３０℃で１２時間培養され、Ｍ１３ ＤＮＡの増幅を可能にした。１ユニットのウシ腸アルカリ性ホスファターゼが加えられ、混合物は３７℃で３０分培養され、次いで９５℃で３分培養された。この反応液に４９５マイクロリットルの水が加えられ、０．０１ｎｇの投入Ｍ１３ｍｐ１８ ＤＮＡから増幅されたＤＮＡの量を含む５マイクロリットルの希釈サンプルが、５ｐｍｏｌｅｓの〜４０ユニバーサルプライマーと８マイクロリットルのＤＹＥｎａｍｉｃ（ダイエナミック）ＥＴ ターミネータープレミックス（エイマシャム・ファーマシア・バイオテック）を含む２０マイクロリットルの配列決定反応液に移された。この反応液は９５℃で２０秒、および６０℃で６０秒、２５回繰返して循環され、沈殿され、産物の１／２がＡＢＩ ３７３配列決定ゲル装置に適用された。生成する電気泳動図は表６で示される。得られた配列は平均信号強度１１９で４００ヌクレオチド以上にわたり正確であった。
【０１１２】
比較の目的で、２００ｎｇの純粋な非増幅一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８ ＤＮＡが、増幅ＤＮＡで記載されたのと全く同じにＤＮＡ配列決定の鋳型として使用された。生成する電気泳動図は図７で示される。得られた配列は、４２５の平均信号強度を持つ４００ヌクレオチド以上で正確であり、０．０１ｎｇの投入ＤＮＡから増幅されたＤＮＡ鋳型から得られたものの約３．６倍であった。
【０１１３】
ここで見られるように、０．０１ｎｇの投入Ｍ１３ ＤＮＡから増幅された鋳型ＤＮＡを用いる配列決定は、非増幅ＤＮＡ鋳型の２０，０００倍大きな量から達成された信号よりも僅か約４倍少ないだけであった。かくして記載された方法を使用するＤＮＡ鋳型増幅は、少量のＤＮＡ鋳型の配列決定も可能にする大きな有用性を有している。
【０１１４】
（実施例７）
エキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマーを使用する細菌コロニーからの細菌人工染色体ＤＮＡのローリングサークル増幅
【０１１５】
多重エキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマーでプライミングされた細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡが、ＲＣＡを用いる細菌コロニーから採取された未精製物質から特異的に増幅されることが確認された。
【０１１６】
ＤＮＡサンプルは以下の通り調製された。ＢＡＣ含有細菌菌株（リサーチ・ジェネティクス）が筋状に配列され、単一コロニーとして成長した。一片のポリエチレン管部材（イントラメディック，ＰＥ２０，１．０９ｍｍ外径）がコロニーに穿刺され、管部材は２０μｌの緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，４０ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ）を含むサーモサイクラーに配置された。エキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマー（オリゴヌクレオチドの３′末端に最近接して位置する２個のチオリン酸塩結合を含むように修飾されたランダムヘキサマー，１０００ｐｍｏｌ）が各管部材に加えられ、反応液は９５℃で３分加熱され、８時間にわたりゆっくりと室温まで冷却された。ＲＣＡを行うために反応液は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭのＭｇＣｌ２，２０ｍＭの硫酸アンモニウム，５％のグリセロール，２００ｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン，０．５ｍＭのデオキシリボヌクレオシド三リン酸，０．０４ユニットの酵母菌ピロホスファターゼ，および０．６ユニットのφ２９ ＤＮＡポリメラーゼの最終濃度を含む４０μｌの最終量にもたらされた。
【０１１７】
反応液は８時間３７℃で培養された。反応が終結した後、アリコートが採取され、ＤＮＡ合成は（臭化エチジウム染色アガロースゲルから）測光法で確認された。増幅ＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼ分析およびＤＮＡ配列決定の両方で確認された通り、ＢＡＣ ＤＮＡであると確認された。増幅ＢＡＣ ＤＮＡの収量は、単一細菌コロニーから３μｇであった。かくして、エンドヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマーを用いるＲＣＡは、細菌コロニーから直接ＢＡＣ ＤＮＡを増幅することで、大きな有用性を持つ。
【０１１８】
（実施例８）
エキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマーを使用するヒトゲノムＤＮＡの増幅
【０１１９】
ヒトゲノムＤＮＡの増幅が、エキソヌクレアーゼ感受性プライマーでプライミングされたヒトゲノムＤＮＡに比べてエキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマーを使用してかなりの範囲まで生じることが確認された。
【０１２０】
ヒトゲノムＤＮＡ（プロメガ）は以下の通り増幅された。ＤＮＡ（２０ｎｇ）は、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１０ｍＭのＭｇＣｌ２，５０ｍＭのＫＣ１よりなる緩衝液で７００ｐｍｏｌのエキソヌクレアーゼ感受性ランダムヘキサマー、またはエキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマー（すなわち、オリゴヌクレオチドの３′末端に最近接する２個のチオリン酸塩結合を含むように修飾されたランダムヘキサマー）のいずれかで混合され、９５℃で３分培養され、４℃まで冷却された。これらの混合物は、次いで、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１０ｍＭのＭｇＣｌ２，５０ｍＭのＫＣｌおよび０．５ｍＭのｄＮＴＰの全量５０マイクロリットルより成る緩衝液で、６４ユニットのφ２９ ＤＮＡポリメラーゼと０．０４ユニットの酵母菌無機ピロホスファターゼで組合わされた。反応液はＤＮＡの増幅が可能になるように、３０℃で１６時間培養された。一度増幅されるとＤＮＡ産物は（臭化エチジウム染色アガロースゲルから）測光法で計量された。ランダムヘキサマープライマーを用いてプライミングされたＤＮＡサンプルは２倍増幅され、一方ヌクレアーゼ耐性ヘキサマーを用いてプライミングされたＤＮＡサンプルは４００倍増幅された。かくして未修飾ランダムヘキサマーに代ってエキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマーの使用は、少なくとも２００倍収量を改善することができ、ヒトゲノムＤＮＡなどのような高分子量ＤＮＡ調製物の有効な増幅に大きな有用性をもつことになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に基づく一般的な実施例を示す図。増幅標的サークルに相補である領域を持つオリゴヌクレオチドプライマー（Ａで示されるもの）は、増幅標的サークルに特異的にハイブリッド形成する（Ｂで示される）。ＣはＢのハイブリッド形成された構造へのｄＮＴＰｓ，ＤＮＡポリメラーゼなどの追加の結果を示し、これにより各プライマーの３′末端は伸長される。各産物の伸長は、ＤＮＡポリメラーゼが隣接する酵素により合成されたＤＮＡを置換することで継続する。この場合、１個の標的サークルは、同じ増幅標的サークル鋳型で線状複製３ラウンドを達成するために、３個のプライマーと３個の酵素に相互作用する。より多くのプライマーを使用することもできる。多重特異的プライマーを使用することもできるし、あるいはプライマーは標的サークルにランダムな位置でハイブリッド形成するランダム配列のものであることも可能である。
【図２】Ｍ１３と各種の数のアニーリングされたプライマーを使用する増幅反応である（出発鋳型のｐｍｏｌ当りで形成されたｐｍｏｌ／投入またはピコモル数での）フォールド増幅を示すグラフ。Ｍ１３ ＤＮＡ基質にアニーリングされたプライマー数は、各曲線の最終データ点のグラフの左隣りに注で示される。単一プライマーを使用するプロットは線状ＲＣＡ（ＬＲＣＡ）反応である。
【図３】Ｍ１３と多重ランダムプライマー、または単一プライマーを使用したローリングサークル増幅期間でのフォールド増幅（ｐｍｏｌ／投入：産物にとり込まれたデオキシヌクレオチドのｐｍｏｌｅｓで測定されたＤＮＡ合成量として定義されたもの）対経過時間（時間）の関係を示すグラフ。Ｍ１３基質にアニーリングされたランダムへキサマープライマーまたは単一プライマーの存在は、各曲線の最終データ点のグラフの右隣りに注で示される。
【図４】プライマー、ここではランダムヘキサマー（未反応残存プライマー％）対経過時間（時間）のφ２９ ＤＮＡポリメラーゼの量は、各曲線の最終データ点のグラフの右隣りに注で示される。
【図５】Ｍ１３とエキソヌクレアーゼ耐性（エキソＲ）ランダムプライマーまたはエキソヌクレアーゼ感受性（エキソＳ）ランダムプライマーを用いるローリングサークル増幅期間中のフォールド増幅（産物／投入のｐｍｏｌ表示）対反応液に加えられたφ２９ ＤＮＡポリメラーゼの量（ユニット表示）の関係を示すグラフ。Ｍ１３基質にアニーリングされたエキソＲまたはエキソＳランダムヘキサマープライマーの存在、またはプライマーの存在なしは、各曲線の最終データ点の右隣りに注で示される。
【図６】鋳型としてのＭ１３ ＤＮＡの０．０１ｎｇからのＭＰＲＣＡにより増幅されたＤＮＡを使用するＤＮＡ配列決定反応を実行する結果を表示するＤＮＡ配列決定反応を示す電気泳動図。
【図７】鋳型としてのＭ１３ ＤＮＡの２００ｎｇを使用するＤＮＡ配列決定反応を実行する結果を表示するＤＮＡ配列決定反応を示す電気泳動図。
【発明の属する技術分野】
本出願は、２０００年６月２８日に受理された合衆国暫定特許出願番号第０９／６０５，１９２号の優先権を主張し、その開示は全体としてここに組み込まれている。
【０００２】
本発明は、従来のローリングサークル法を上回る量の有利性を持つ増幅産物の改良された収量の向上を提供するように、ローリングサークル増幅で多重複製フォークを確立するためのプロセスに関する。
【０００３】
【発明の背景】
標的ＤＮＡ分子を増幅する手段は、このような増幅ＤＮＡが、続くＤＮＡ配列決定、クローニング、マッピング、遺伝子型化、プローブの生成、および診断による同定を含む方法にしばしば利用されることが多いために価値がある。
【０００４】
これまでの所、核酸の増幅を可能にするいくつかの有用な方法が開発されてきた。その大部分は選択されたＤＮＡ標的およびまたはプローブの増幅の周辺で設計されたものであり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自給配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、およびＱβレプリカーゼでの増幅などが含まれている（バーケンマイヤーおよびマシャヴァール，ウイルス学方法ジャーナル，３５巻：１１７−１２６ページ（１９９１年）；ランディグレン，トレンズ・ジェネティクス，９巻：１９９−２０２ページ（１９９３年））。
【０００５】
加えて、Ｍ１３などのバクテリオファージからのプラスミドまたはＤＮＡなどの環状ＤＮＡ分子を増幅するいくつかの方法が使用されてきた。その一つは、大腸菌の適切な宿主菌株でのこれら分子の増殖であり、それに続く十分立証されたプロトコルによるＤＮＡの分解であった。（サムブルック，Ｊ．，フリッツ，Ｅ．Ｆ．，マニエイタス，Ｔ．，分子クローニング，ラボラトリーマニュアル，１９８９年，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，コールド・スプリング・ハーバー ニューヨーク）。またＰＣＲは、Ｍ１３などのバクテリオファージからのプラスミドおよびＤＮＡなどのようなＤＮＡ標的において、決まった配列を増幅するためにしばしば使用された方法であった。（ＰＣＲプロトコルズ，１９９０年，Ｍ．Ａ．イニス，Ｄ．Ｈ．ゲルファンド，Ｊ．Ｊ．スニンスキー編，アカデミック・プレス，サンディエゴ）。これらの方法のいくつかは、労力を要し、費用が高く、時間がかかり、効率が悪く、また感受性を欠いていることで難点がある。
【０００６】
これらの方法を改良したものとして、線型ローリングサークル増幅（ＬＲＣＡ）は、環状標的ＤＮＡ分子にアニーリングされたプライマーを使用し、ＤＮＡポリメラーゼが付加される。増幅標的サークル（ＡＴＣ）は新しいＤＮＡが作られる鋳型を形成し、それによりサークルに相補の反復配列の連続配列としてプライマー配列を伸長するが、時間当り約数千コピー（複製）を生成するにすぎない。ＬＲＣＡに対する改良は、増幅の新しいセンターを提供するために複製相補配列に対してアニーリングする付加プライマーと共に指数ＲＣＡ（ＥＲＣＡ）を使用することであり、これにより指数反応速度と増加増幅を提供する。指数ローリングサークル増幅（ＥＲＣＡ）は鎖置換反応のカスケードを採用し、ＨＲＣＡとしても引用される（ライザーディ，Ｐ．Ｍ．他，ネイチャー・ジェネティクス，（１９９８年）１９巻，２２５−２３１ページ）しかしＥＲＣＡは、プライマーＰ１の特異的ＤＮＡ配列を知る必要があるために、また環状ＤＮＡ標的分子が一本鎖ＤＮＡサークルになる必要性のために、環状ＤＮＡ標的分子にアニーリングされた単なる単一プライマーＰ１の使用に限定される。
【０００７】
本発明の方法（ここで多重プライムドローリングサークル増幅、すなわちＭＰＲＣＡとして引用されるもの）は、個別標的サークルの増幅のために多重プライマーを使用することにより、線状ローリングサークル増幅の感受性に改良を与える方法を採用して前記のこのような不利益を避ける。本発明は各環状標的ＤＮＡ分子から、多重タンデム配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）複製を生成するという利点を持つ。加えてＭＰＲＣＡは、ある実施例において、環状標的ＤＮＡ分子の配列が未知であり、一方環状標的ＤＮＡ分子は一本鎖（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖（ｄｓＤＮＡまたは複式ＤＮＡ）であってもよいという利点を持つ。本発明のある実施例のも一つの利点は、一本鎖または二本鎖環状標的ＤＮＡ分子の増幅が、等温線上およびまたは大気温度で行われるということである。また他の利点は、ローリングサークルの増幅の新しい適用で高度に有用である低コスト、標的サークルの低い濃度での感受性、柔軟性、とりわけ検出試薬の使用の際の柔軟性、および低い汚染へのリスクなどの利点を持つ。
【０００８】
本発明のある実施例では、反応で存在するエキソヌクレアーゼ活性による分解に耐性である多重プライマーを用いて、増幅産物ＤＮＡの収量を改良するための手順が採用されている。これはエキソヌクレアーゼ活性を含み、また長い培養期間にわたり行われる反応にプライマーが持続できるようにする利点を持つ。このプライマーの持続性は、新しいプライミング事象が反応の全培養時間に起こることを可能にし、それはＥＲＣＡの特質の一つであり、また増幅ＤＮＡの収量の増加をもたらすという利点を有する。
【０００９】
本発明の方法は、初めて「試験管内クローニング」すなわちサークルで囲まれる既知または未知の標的ＤＮＡの本体内にクローニングする必要なしで行うことを初めて可能にする。［標的ＤＮＡの周辺を含み、それに連結されて標的ＤＮＡに付着する］パドロックプローブを、ギャップ充填法により標的配列をサークル内に複製するために使用することができる（ライザーディ，Ｐ．Ｍ．他，ネイチャー・ジェネティクス，１９巻，２２５−２３１ページ（１９９８年））。選択肢として、標的配列は他の多くの一般に使用される方法で、環状ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ内に複製または挿入することができる。ＲＣＡ増幅は、生体でクローニングによるＤＮＡの増幅収量を生成する必要性を克服する。
【００１０】
予見される一つの応用は、ゲノムまたは他の複合体ＤＮＡｓから既知の配列を標的として捕捉することである。第２の応用は、全ゲノム増幅法で生成されるサークルのＲＣＡである。全ゲノム増幅は、ゲノムｃＤＮＡまたは他の複合体ＤＮＡのサブユニットのランダムプライミングまたは特異的プライミングされた生成を伴なう。従来の技術に基づく方法は、全ゲノム増幅の産物を環状化するのに使用できる。パドロックも環状標的を生成することができた。これらのサークルは、次いで本発明の標的増幅の基質を構成する。全ゲノム増幅の環状産物を生成する手段には拘らず、本発明のランダムプライミングＲＣＡは、配列が何かを知る必要なくて線状ＤＮＡｓの背景にわたりサークルの選択的増幅を可能にするであろう。同様に、環状ＤＮＡは、多重プライマーＲＣＡに特異的なプライマー配列の使用を可能にするであろう。
【００１１】
本発明の方法は、合成と産出の割合の増加を可能にするＬＲＣＡに勝る改良法である。これは、ＤＮＡポリメラーゼ伸長のための多重プライマー部位から生じる。ランダムプライマーＲＣＡもまた、二本鎖産物を生成するという利点を持つ。これは環状鋳型の複製により生成される線状ｓｓＤＮＡ産物が、それ自身ＤＮＡ合成のランダムプライミングにより、複式形態に転換されるであろうということのためである。二本鎖ＤＮＡ産物は、いずれかの鎖の配列決定を可能にすることで有利であり、および制限エンドヌクレアーゼ消化とクローニング、標識化、および検出に使用される他の方法を可能とするということでも同じく有利である。
【００１２】
鎖置換ＤＮＡ合成がランダムプライミングＲＣＡの間に生じ指数増幅となり得ることも期待される。これは従来のＥＲＣＡを上まわる改良であり、またＨＲＣＡと名付けられ（ライザーディ他（１９９８年））、サークル内に封入された非常に大きな標的を指数的に増幅する能力を持つことになる。細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）を含む大型環状ＤＮＡの増幅は、本発明で実行に移されるように減少されている。実際に従来のＥＲＣＡは、長さ２００ヌクレオチド以下の小さいサークルの使用に限定されていた。
【００１３】
縮重プライマー（チェン，Ｖ．Ｇ．およびネルソン，Ｓ．Ｆ．，全米科学アカデミー紀要，９３巻，１４６７６−１４６７９ページ（１９９６年））、およびゲノムＤＮＡなどの標的の複合混合物のサブセットが増幅するランダムプライマー（ザング，Ｌ．他，全米科学アカデミー紀要，８９巻，５８４７−５８５１ページ（１９９２年）を用いる全ゲノム増幅に関する方法が開示された。複雑性の減少がこれらの方法の目的の一つである。本発明の方法の更なる利点は、ＲＣＡ反応として、それがＤＮＡ標的の「サブセッティング」（部分集合）、すなわちＤＮＡ標的の複雑性を減少させる必要なしに環状ＤＮＡ標的分子を選択的に増幅することである。
【００１４】
【発明の説明】
本発明は、特異的プライマーまたはランダムプライマーを使用する環状ＤＮＡ標的の増幅を高めるプロセスに関する。それは単一プライミング鋳型環状ＤＮＡ分子で線状ローリングサークル増幅の感受性を改良する。一つの特異的実施例において、本発明のこの見地は、ＲＣＡからの増幅産物の収量を増加するために、環状標的ＤＮＡ分子にアニーリングされた（特異的またはランダム、エキソヌクレアーゼ−感受性、またはエキソヌクレアーゼ耐性の）多重プライマーを採用する。多重プライマーはサークルの多重位置にアニーリングし、ポリメラーゼによる伸長した産物はそれぞれの位置から開始される。このように、多重伸長は、単一増幅標的サークルから同時に達成される。
【００１５】
前記の方法の別の実施例では、多重プライマーの使用は、いくつか異なる方法で行われる。それはサークル上の異なる配列にアニーリングする２個またはそれ以上の特異的なプライマーの使用により、またはサークル上の２個またはそれ以上の別の位置で反復される配列に１個の与えられたプライマーアニーリングを持つことにより、あるいはサークル上の多くの位置でアニーリングできるランダムプライマーもしくは縮重プライマーを使用することにより達成される。縮重物は、１個またはそれ以上のヌクレオチドの位置が１個以上の塩基、すなわち決められた長さのオリゴヌクレオチドの混合物により占められ、混合物の個々の部材の１個またはそれ以上の位置がその位置での一つの可能性以上の間から無作為に選択される塩基により占められていることを引用する。このようなオリゴヌクレオチドの集まりは、標準オリゴヌクレオチド合成器具およびソフトウェアを用いて容易に合成される。ランダムは、それぞれのヌクレオチドの位置が、完全なセットの可能性の間から無作為に選択されるが、一般には４個のヌクレオシド、すなわちｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰ、またはｄＴＭＰに一般に限定されることを意味する。
【００１６】
ある実施例では、プライマーが酵素分解に耐性のプライマーを作るのに役立つ修飾ヌクレオチドのすべての型を含むヌクレオチドを含有する。酵素の分解は、ＤＮＡポリメラーゼと会合する３′−５′エキソヌクレアーゼ活性などのような特異的なエキソヌクレアーゼにより、または非特異的な汚染エキソヌクレアーゼにより起こることがある。
【００１７】
【発明の更なる説明】
本発明は、ＤＮＡ合成を大きく増幅し、そこに含まれる特異的な核酸配列の検出のために大幅に増加した信号増幅を提供する手段として、環状ＤＮＡ鋳型を用いる核酸配列増幅における多重プライマーの使用に関し、ここで特異的核酸配列は、例えば標的ＤＮＡに含まれ、そこでこのような標的は一本鎖または二本鎖環状ＤＮＡの形態にあり、あるいはこのような環状ＤＮＡの部分である、従来の方法がしばしばかなり複雑な標的を採用している一方、本発明は、単純プラスミド標的などのような比較的単純な標的を利用する。本発明で有用な標的ＤＮＡは、更に高分子量線状ＤＮＡをも含む。
【００１８】
加えて他の方法は、増幅材料のより複雑でないセットのものを生成するために、事実上複合体の標的ＤＮＡ分子（例えば、そのサンプル内での存在が検出され、またはその配列が続く方法あるいは手順での使用などのために増幅され、もしくはそのサンプル内での存在が、その配列が増幅される１個またはそれ以上の他の核酸の同定を決定するＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを含む核酸など）のランダムサブセットを増幅するように試みられてきたのに対して、本発明は、複雑性または他のサブセットを減少させるための努力なしでの単一標的の増幅に関する。従ってそれは、例えばコロニーまたはプラークから抽出されるＤＮＡにおいて、線状ＤＮＡ分子全体で環状標的の望ましい増幅という利点を取る。
【００１９】
一つの見地において、本発明は核酸配列を選択的に増幅する一つのプロセスに関し、増幅標的サークル（ＡＴＣｓ）が１個以上の多重一本鎖非環状オリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１）と結合し、またはその条件が多重タンデム配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）産物を形成するためにＰ１プライマーの伸長により前記増幅標的サークルの複製を促進する条件下で、Ｐ１、１個またはそれ以上の前記増幅標的サークル（ＡＴＣｓ）、ＤＮＡポリメラーゼおよび多重デオキシヌクレオシド三リン酸より成る混合物を含むことより成る。
【００２０】
かくして、一つの実施例では、キットの形態などのようなあらかじめ混合されたものを提供することができ、これは１個以上のポリメラーゼをさえ含むポリメラーゼ、ヘキサマーなどの保護オリゴヌクレオチドプライマー、必要とされるヌクレオシド三リン酸、適当な緩衝液、ピロホスファターゼ、および他の潜在的に望ましい成分を、各成分毎に別の小びんで、または異なる組合せで一緒に混合して、１個、２個、３個またはもっと別の小びんの全体を形成し、また例えば増幅プロセスで使用するための意図された標的核酸を懸濁するブランクまたは緩衝液小びんなどを含む。本発明の一つの実施例は、ＤＮＡ配列を増幅するためのキットより成り、ヌクレアーゼ耐性ランダムプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよび１個またはそれ以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）を含み、このｄＮＴＰｓは蛍光成分または放射能標識などで標識される。別の実施例では、前記ＤＮＡポリメラーゼは３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を持つ。望ましい実施例では、前記ＤＮＡポリメラーゼはφ２９ ＤＮＡポリメラーゼである。このようなキットは、更に本発明のプロセスを実行するために、文書で、またはコンピュータディスケットあるいはＣＤロムでの一連の使用説明書を含んでいる。
【００２１】
このような実施例の特異的な応用として、一つのプロセスが提供され、これによりサークルの形態にあるＤＮＡなどのような核酸のサンプルがＴＥ緩衝液などのような緩衝液に懸濁され、次いで加熱、冷却され、次いで前に列挙された成分と連続して接触され、または順次調節された温度、ｐＨその他の条件で、例えばそのような組合せで３０℃を維持して前記前もって混合されたものにこのような成分を加えることで接触される。
【００２２】
加えて、本発明に基づき開示されたプロセスを実施する際に使用される条件は、いずれか与えられた適用の間に変化する。かくして限定されない実施例により、ポリメラーゼまたは複数のポリメラーゼの基質として作用するプライマー−ＡＴＣ複合体の変性を起こすことなく、増幅を促進する異なる条件の下でハイブリッド形成を促進し、ＤＮＡポリメラーゼとヌクレオシド三リン酸が加えられる条件の下でプライマーとＡＴＣｓが加えられる。
【００２３】
も一つの実施例では、本発明は核酸配列を選択的に増幅する一つのプロセスに関し、それは
（ａ）多重一本鎖非環状オリゴヌクレオチドプライマーと、１個またはそれ以上の増幅標的サークル（ＡＴＣ）とを、前記ＡＴＣが１個以上の前記多重Ｐ１プライマーとハイブリッドを形成し、プライマー−ＡＴＣサンプル混合物を産生する条件下で混合し、
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼと多重デオキシヌクレオシド三リン酸を、Ｐ１プライマーの伸長により前記増幅標的サークルの複製を促進し、多重一次タンデム配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）を形成する条件下で加える、
ことより成る。
【００２４】
本発明の手順を実施する際に、成分を加えることのできる数多くの順序があり、前記追加の配列は限定することを意図するものではなくて、通常の技術を有するものが、議論の提示される特定の前後関係において、興味がありまたは価値があると認識するであろうすべての追加の組合せを含むように読み取られるべきであることは理解されねばならない。例えば、すべての成分は、ワンステッププロトコルで同時に加えることができ、あるいはＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ標的への追加の前に、エキソヌクレアーゼ耐性プライマーと混合することもできる。
【００２５】
要約すると、前記方法のステップは、ここで列挙されたいずれの順序でも実施することができるが、望ましければ、有利であれば、または別途便利であるならば、本発明の目的と利点が達成される限りにおいて、どのような適切な順序でも実施されるであろう。かくして例えば、前に列挙したプロセスは、既に前記ＤＮＡポリメラーゼを含有する培地で、前記プライマーとＡＴＣｓを混合することで実行され得るものである。
【００２６】
一つの実施例では、本発明は、ＡＴＣが少なくとも３、４、５、更に１０個またはそれ以上のプライマーオリゴヌクレオチドと結合し、またはハイブリッド形成し、前記各プライマーが適切な条件下で別のタンデム配列ＤＮＡ分子を産生するような、ここで記載されるプロセスに関する。もち論、タンデム配列ＤＮＡｓ（ＴＳ−ＤＮＡｓ）の配列が、鋳型として働くＡＴＣｓの配列に相補であるために、もしＡＴＣｓすべてがプライマーの配列に拘らず同じ配列を持つならば、ＴＳ−ＤＮＡ産物はすべて同じ配列を持つであろう。
【００２７】
各増幅標的サークル（ＡＴＣ）に対して多重（ここでは３個）プライマーを用いて、本発明の一つのサンプル実施例が図１で示される。増幅標的サークルの別のセグメントに相補の領域を持つ（それぞれ長さで約２０−５０塩基でＡで示されている）オリゴヌクレオチドプライマーは、（Ｂで示される）増幅標的サークルに特異的にハイブリッド形成する。ＣはＢのハイブリッド形成された構造にｄＮＴＰｓ、ＤＮＡポリメラーゼ、その他を追加した結果を示し、これにより、各プライマーの３′末端は伸長される。各産物の伸長が続き、ＤＮＡポリメラーゼは、隣接する酵素により合成されたＤＮＡを置換する。オリゴヌクレオチドプライマーは、前記プライマーの５′末端でヌクレオチドの領域または配列を任意に含有し、もしヌクレオチドの非相補領域または配列が、鎖置換ＤＮＡ合成を実行するためのＤＮＡポリメラーゼが能力を増大するのに有用であると見做されるならば、このヌクレオチドの領域または配列は、ＡＴＣに対して非相補である。ここで示される特異的実施例では、１個のＡＴＣは、同じ増幅標的サークル鋳型で３ラウンドの線状複製を達成するために、３個のプライマーと３個の酵素分子と相互作用する。
【００２８】
別の実施例では、本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチド（Ｐ１）プライマーは、特異的またはランダムのいずれかであり、後者がとりわけ有用である。ここで使用されるように、「特異的」という用語は、ワトソン−クリックの語義で、増幅標的サークル（ＡＴＣ）に存在する配列に相補であり、またオリゴヌクレオチドプライマー内の前記相補配列が前記プライマーの３′末端を含む場合には、とりわけＡＴＣに対するプライマーのハイブリッド形成を促進するのに役立つヌクレオチド配列を持ち、または持つように操作されるプライマーを引用する。このような特異的な配列は、その５′末端に、ＡＴＣ鋳型のいずれの部分にも相補でない配列を含み、ＡＴＣ鋳型の非相補部分は、増幅のラウンドを続けている間に、ＴＳ−ＤＮＡの置換を促進するのに役立つ。このような特異的プライマーが利用される場合には、一定のＡＴＣと結合するプライマーの数は、一般に前記ＡＴＣに存在する対応する相補部位の数と関係するであろう。
【００２９】
望ましい実施例では、増幅に使用されるプライマーは、ランダム配列を持つであろう。ここで使用されるように、「ランダム」という用語は、前記オリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１）が、増幅の鋳型として働く増幅標的サークル（ＡＴＣ）のヌクレオチド配列に無関係のヌクレオチド配列を持つことを意味する。このようなランダム関係の結果は、前記ランダムプライマーがハイブリッド化するＡＴＣの位置が、同じようにランダムであるであろうということである。加えてプライマーがランダム配列を持つために、与えられたプライマーが、ＡＴＣに不完全にハイブリッド化しまたＡＴＣの対応するヌクレオチドに相補的でない１個またはそれ以上のヌクレオチドを持つ場合には、実例が起こるであろう。このような発生が、本発明の広がりからこのようなプライマーの使用を除去するのに決して役立たないことは認識されるべきである。例えば、このような発生は、ＡＴＣにＤＮＡ合成を開始する際に、ランダムプライマーの効率を減少させることはありそうもないことである。
【００３０】
本発明のプロセスに有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、いずれか望ましい長さのものにすることができる。例えばこのようなプライマーは、望ましくは少なくとも２個のヌクレオチドから、約３０乃至５０ヌクレオチドの長さのものであり、もっとも望ましくは約５乃至約１０ヌクレオチドの長さのものであり、ヘキサマー（六量体）およびオクタマー（八量体）のものが特に望ましい実施例である。ここで使用されるこのような多重プライマーは、特異的のみ、またはランダムのみ、もしくはその両方の混合物であり、ランダムプライマーが形態と使用の面でとりわけ有用であり、また便利である。
【００３１】
図１で示された実施例は特異的プライマー（ここでは数字で３であるがいずれの数でも十分である）の使用を示すけれども、前記プライマーは容易にランダムにすることができ、より高次の数にすることができる。かくしてＡＴＣと結合される各プライマーは、それがＡＴＣの周りでＤＮＡポリメラーゼにより伸長されるにつれて複製フォークを産生する。ＡＴＣが大きければ、それだけ形成されると期待される増幅フォークが形成される。本発明に従って、一般にはＡＴＣ鋳型の約１０毎乃至約１０００ヌクレオチド毎に増幅フォークが存在し、約５０乃至約１００毎での増幅フォークも確かに一般的であり、本発明の範囲では約１０ヌクレオチド毎前後でも意外なことではない。
【００３２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＡＴＣの部分に相補であるセグメントを持ち、また図１で示される限定されない実施例は、このような３個のプライマーの使用を単に示すに過ぎず、それらすべては同じ長さのように見える。しかし既に述べたように、本発明は与えられたＡＴＣに結合するこのようなプライマーの数、あるいはこのようなプライマーの長さ、またはその配列を限定するものではなく、容易に異なる長さのものをまたは図で示されるようにすべて同じ長さのものを同じ実験で使用することができる。
【００３３】
本発明のプロセスで有用である増幅標的サークル（ＡＴＣｓ）は、一般に４０乃至１０，０００ヌクレオチドの間で含むＤＮＡまたはＲＮＡハイブリッド分子を含む一本鎖または二本鎖の環状ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。しかしＡＴＣのサイズに上限はないであろうことが予期される。ＡＴＣが複式サークルである場合には、このような数は、個々のヌクレオチド残基よりも、むしろ塩基対として引用されることを意図している。ここで開示されたプロセスで有用であるＡＴＣは、異なる目的のために、とりわけそれらを有用なものにする機能的に異なる部分またはセグメントを持つこともできる。少なくとも２個のこのような部分は、１個またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーに相補であり、また存在する場合には、プライマー相補部分または部位として引用される。本発明で有用である増幅標的サークルは、細菌コロニー、バクテリオファージ、ウイルスプラーク、酵母コロニー、バキュロウイルスコロニー、同じく遷移性形質移入真核細胞から直接誘導されるものを含む。このような源は、ＡＴＣｓを獲得する前に溶解されることもあり、またそうでないこともある。このような源が溶解された場合には、このような溶解は、溶解剤が熱、酵素を含む数多くの手段で達成され、その酵素は必ずしもそれに限定されないが、リゾチーム、ヘリカーゼ、グルシラーゼ、およびザイモリアーゼを含み、あるいは溶解剤は有機溶媒であってもよい。
【００３４】
本発明の増幅標的サークル（ＡＴＣｓ）は、ここで開示された方法により増幅される標的配列を含み、またここでの開示に従って、Ｐ１とＡＴＣの指名はＲＣＡの最初のラウンドを引用することを意味し、更にＰ１プライマーのための適切な配列の使用により、Ｐ２プライマーと指名されたオリゴヌクレオチドプライマーの次の混合物の追加により、ＤＮＡ増幅のこのような追加のラウンドの使用にた易く伸長でき、ここでＰ２プライマーはＰ１プライマーと殆んど同じ性質を持つが、タンデム配列ＤＮＡ産物（それ自身出発ＡＴＣに相補であるもの）の１個またはそれ以上に相補であるものである。もち論増幅のこのような更なるラウンドは、本発明のプロセスを用いるのに利用できる単なる一つの選択肢ではあるが、このような追加のラウンドの設計と実行は、分子生物学の技術を持つ人の通常の知識内に十分あり、ここではこれ以上記載することはしない。
【００３５】
ＭＰＲＣＡでは、増幅は各プライマーで起こり、これにより各プライマーで複製される一次ＡＴＣ（またはＡＴＣ）に相補であるセグメントのタンデム反復（すなわちＴＳ−ＤＮＡ）のコンカテマーを形成する。かくしてランダムプライマーが使用される場合には、多くのこのようなＴＳ−ＤＮＡｓが、対応するＡＴＣ配列の増幅が大幅に増加するように、各プライマーから１個形成され、何故なら産物のヌクレオチド配列、または構造は、鋳型として使用されるＡＴＣの配列のみに依存し、オリゴヌクレオチドプライマーがランダムまたは特異的もしくはその両方の混合物であろうとも、オリゴヌクレオチドプライマーの配列には依存しない。
【００３６】
これまでの技術はランダム配列を利用してきたが（例えばライザーディ他，合衆国特許第５，８５４，０３３号参照のこと）、これらは全ゲノムまたは線状配列の増幅に使用され、本発明の一本鎖または複式サークルの増幅に使用されたものではなかった。
【００３７】
本発明は、現存する方法を上まわる改良（チェン，Ｖ．ｇ．及びネルソン，Ｓ．Ｆ．，全米科学アカデミー紀要９３巻，１４６７６−１４６７９ページ（１９９６年））およびこの反応の望ましい酵素としてφ２９ ＤＮＡのここで提案された使用で、線状ＤＮＡ標的の増幅にランダムまたは多重プライマーを使用するランダムプライマー（ザン，Ｌ．他，全米化学アカデミー紀要，８９巻，５８４７−５８５１ページ（１９９２年））、およびエキソヌクレアーゼ耐性プライマー（下記参照）を提供する。従って本発明は、φ２９ ＤＮＡポリメラーゼの特徴の利点を得る高分子量線状ＤＮＡ標的の増幅のための方法、およびφ２９ ＤＮＡポリメラーゼと会合する３′−５′エンドヌクレアーゼ活性と両立するエキソヌクレアーゼ耐性ポリマーを含み、ここで前記線状ＤＮＡ標的はＡＴＣに代って使用される。
【００３８】
前に記載したように、本発明に従って開示された増幅のための鋳型として利用される増幅標的サークルは、一本鎖ＤＮＡサークルまたは複式（二本鎖）ＤＮＡサークルである。前記ＡＴＣｓが複式である場合には、前記複式の少なくとも一本鎖がニックを含有することが望ましい。このようなニックは一般に複式サークルで存在するが、それらは更にそこに存在していなくても、従来の技術で公知の酵素法などによりこのようなサークルに導入される。選択肢としては、複式サークルの一つの鎖でのニックの存在は、望ましくもなくまた必要でもない。複式ＤＮＡサークルの２個の鎖は、ＭＰＲＣＡに必要な多重プライマーのハイブリッド形成を可能にする当業者に公知の手順により、ニックの不在下で変性され十分に巻きがとれるであろう。
【００３９】
複式サークルが採用される場合には、増幅は一般に鋳型として両方の鎖から起こるであろう。両鎖の同時の増幅は望ましくまた望ましくないこともある。複式サークルが更に前記サークルのＤＮＡを配列決定するように設計された反応で使用されるものとすると、両鎖の増幅は望ましい特徴のものとなり、そのため複式サークルは（必要な場合ニックの形成の場合を除き）更なる処置なしで直接使用することができる。しかし他の用途として、両鎖の同時の増幅が望ましい特徴ではない場合には、それは本発明のプロセスによる増幅に役立ち、鎖を変性し分離するため、あるいは選択肢として、複式環状鋳型の２個の鎖の１個のみに相補である配列を含む多重特異的プライマーを採用するために、当業者の技術の範囲内に十分にある。もち論他の有用な戦略も直ちに当業者に起こるであろうし、ここで更に詳細に記載する必要はない。
【００４０】
増幅サークルのサイズで、構造が一本鎖か複式であるか、また使用されるＤＮＡポリメラーゼに依存して、ＭＰＲＣＡは（採用される特定のプライマーおよび標的配列のためにしばしば臨時に決定される）サークル数、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓおよびＭｇ２＋を最適化できるきわめて高い度合の増幅（および感受性）を達成する。
【００４１】
ある状況では、起こり得る増幅の範囲、およびまたは形成されるＴＳ−ＤＮＡの量を計量的に決定し、あるいはある状況においては、出発混合物のＡＴＣｓが、構造的におよびまたはサイズの上からも均一でない場合に形成される増幅標的サークルの相対量を弁別する様式で測定できることが望ましい。このような場合には、本発明は、その計量測定がよりた易く行えるように、特殊なデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）が使用される場合などのようなかなり多数の標準検出計画で十分に機能する。もっとも一般的な例は、このようなヌクレオチド基質が放射能標識されるか、あるいは蛍光標識その他などの標識の他の型のものがそこに付着される場合である。改めてこのような状況で使用され得る方法は多くあり、それに伴なう技術は標準のものであり、当業者にとっては公知である。かくしてこのような検出標識は、直接または間接的に、増幅核酸と関連であるいずれかの分子を含み、直接または間接的に、測定可能でまた検出可能な信号を生じるものである。核酸内にとり込まれ、あるいは核酸プローブと結合する多くのこのような標識は、当業者に公知である。その一般的な例としては、放射性同位元素、蛍光分子、燐光分子、酵素、抗体、およびリガンドが含まれる。
【００４２】
蛍光標識の例は、ＣｙＤｙｅｓ、例えばＣｙ２，Ｃｙ３，Ｃｙ３．５，Ｃｙ５、およびＣｙ５．５を含み、エイマシャム・ファルマシア・バイオテックから利用できる（合衆国特許番号第５，２６８，４８６号）。適切な蛍光標識の更なる例はフルオレセイン，５，６−カルボキシメチルフルオレセイン，テキサスレッド，ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ），クマリン，ダンシルクロリド、およびローダミンを含む。望ましい蛍光標識はフルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）およびローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）である。これらのものは、モレキュラー・プローブス，ユージーン，オレゴンおよび−リサーチ・オーガニクス，クリーブランド，オハイオを含む各種の商業源から得ることができる。
【００４３】
標識ヌクレオチドは、検出標識の望ましい形態であり、何故なら、それらは合成期間中にＲＣＡの産物に直接取り込むことができるからである。増幅標識に取り込むことのできる検出標識の例は、ヌクレオチド類似体、例えばＢｒｄＵｒｄ（ホイおよびシムケ，突然変異研究，２９０巻：２１７−２３０ページ（１９９３年）），ＢｒＵＴＰ（ワンジック他，細胞生物学ジャーナル，１２２巻：２８３−２９３ページ（１９９３年））およびビオチン修飾ヌクレオチド（ランガー他，全米科学アカデミー紀要，７８巻：６６３３ページ（１９８１年））またはジゴキシゲニンなどの適切なハプテンで修飾されたヌクレオチド（カークホフ、分析生化学、２０５巻：３５９−３６４ページ（１９９２年）を含む。適切な蛍光標識ヌクレオチドは、フルオレセイン−イソシアネート−ｄＵＴＰ，シアニン−３−ｄＵＴＰおよびシアニン−５−ｄＵＴＰである（ユー他，核酸研究２２巻：３２２６−３２３２ページ（１９９４年））である。ＤＮＡの望ましいヌクレオチド類似体検出標識は、ＢｒｄＵｒｄ（ＢＵＤＲ三リン酸、シグマ）であり、また望ましいヌクレオチド類似体検出標識は、ビオチン−１６−ウリジン−５′−三リン酸（ビオチン−１６−ｄＵＴＰ ベーリンガー・マンハイム）である。放射能標識は、ここで開示された増幅方法にとりわけ有用である。かくして、このようなｄＮＴＰｓは、ここで記載された蛍光標識などのような容易に検出可能な成分を取り込むことも可能である。
【００４４】
本発明は、各種の方法で信号増幅を達成する手段を提供する。この場合の目標は、標的の検出と特徴付けを可能にする信号を増幅することである。ＤＮＡが、標識プローブのアニーリングにより、または標識ヌクレオチドの取り込みにより、あるいは合成後のＤＮＡ産物の標識化により、例えば検出可能分子の共有結合修飾またはインターカレーションにより検出される場合を含み、またそれに限定されない方法において、本発明は、ＤＮＡ産物を増幅し、またそれにより信号強度を増幅する方法を提供する。
【００４５】
本発明の方法は、多重プライミング事象が増幅の標的である環状ＤＮＡ分子に誘導される故で、大幅に増加した増幅を提供する。かくして、増幅の速度と範囲は、ＤＮＡサークルを複製する単一ＤＮＡポリメラーゼにより達成されたものに限定されない。その代わりに多重ＤＮＡポリメラーゼは、各鋳型サークルを同時に複製するために誘導され、そのそれぞれはプライマーの一つから開始する。これは本発明のユニークな特長を提供する特性である。
【００４６】
本発明の方法の一つの実施例では、完全にランダムなプライマーが増幅プロセス、特に望ましいプロセスに使用され、何故なら鋳型を提供するＡＴＣの配列が公知ではないからである。かくしていずれかの一本鎖または複式ＤＮＡサークルが、ここで開示された方法に基づいて、広範囲の精製ありまたはなしで容易に使用することができる。かくしてランダムプライマーを使用する主要な利点は、既知または未知の配列の環状ＤＮＡ標的が、線状および環状ＤＮＡ分子の両方の混合物を含むＤＮＡ分子の複合混合物の間から、優先してまた選択的に増幅されるということである。
【００４７】
特異的な実施例が実施例１で記載されており、ここでサークルの周りの９個の異なる部位でアニーリングされた９個の異なるオリゴヌクレオチドプライマーを持つバクテリオファージ、Ｍ１３ ＤＮＡは、６個またはそれより少ないプライマーを持つＭ１３ ＤＮＡよりもより大きな増幅を提供する。更に６個の異なるプライマーを持つＭ１３ ＤＮＡは、３個またはそれより少ないプライマーを持つＭ１３ ＤＮＡよりも大きな増幅を提供する。最後に、３個のプライマーを持つＭ１３ ＤＮＡは、Ｔ度１個のプライマーを持つＭ１３よりも大きな増幅を提供する。
【００４８】
も一つ特異的な実施例が実施例２で記載されており、ここでサークルの周りでアニーリングされたランダムオリゴヌクレオチドプライマーを持つＭ１３ ＤＮＡは、Ｔ度１個のプライマーを持つＭ１３で見られるものよりもより大きな増幅を提供する。
【００４９】
も一つの特異的な実施例が実施例３で記載されており、ここで未精製コロニー抽出物は、環状プラスミドＤＮＡ標的の源であり、また未精製プラーク抽出物は、環状バクテリオファージＭ１３ ＤＮＡ標的の源である。これらの環状標的は、本発明の方法を用いて存在する細菌ＤＮＡよりも優先的に増幅される。
【００５０】
も一つの特異的な実施例が実施例５に記載されており、ここでサークルの周りでアニーリングされた、エキソヌクレアーゼ耐性ランダムプライマーを持つＭ１３ ＤＮＡは、エキソヌクレアーゼ感受性ランダムプライマーを持つＭ１３で見られるものよりもより大きい増幅を提供する。これは、実施例４で提示された結果と一致しており、ここでは、そのような特別なエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを欠いているランダムプライマーが、しばしば容易に分解し、特にエキソヌクレアーゼ活性を持つ酵素が、高水準で存在する場合には、とりわけ容易に分解する。
【００５１】
も一つの特異的な実施例が実施例６で記載されており、ここでＭ１３ ＤＮＡの０．０１ｎｇの投入から増幅された鋳型ＤＮＡを用いるＤＮＡ配列が、非増幅ＤＮＡ鋳型２００ｎｇから達成された信号に類似した信号強度に帰着したことが示される。
【００５２】
も一つの特異的な実施例が実施例７に記載されており、ここで未精製コロニー抽出物は、環状ＢＡＣ ＤＮＡ標的の源であり、またこれらＢＡＣ標的は、本発明の方法を用いて存在する細菌ＤＮＡ以上に優先的に増幅されることが示される。
【００５３】
も一つの特異的な実施例が実施例８に記載されており、ここで未修飾ランダムヘキサマーに代えてエキソヌクレアーゼ耐性ランダムへキサマーを使用するヒトゲノムＤＮＡが、少なくとも２００倍の収量を改善できることが示される。
【００５４】
ここで開示された方法に有用なエキソヌクレアーゼ耐性プライマーは、それらをエキソヌクレアーゼ消化に対して耐性にする修飾ヌクレオチドを含むことができる。例えばプライマーは、プライマーの３′末端でヌクレオチドの間で１，２，３または４個のホスホチオエート結合を含むこともある。
【００５５】
かくしてある実施例においては、本発明は、以下のプロセスに関し、すなわちプライマーは、一般には酵素により、とりわけエキソヌクレアーゼにより、とりわけもっとも３′−５′−エキソヌクレアーゼ活性により、プライマーを分解に対して耐性にする少なくとも１個のヌクレオチドを含むことを特徴とするプロセスに関する。このような実施例においては、少なくとも１個のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチドであり、またはある修飾されたヌクレオチドである。このようなヌクレオチドは、一般に３′末端ヌクレオチドであるが、本発明のプロセスは、更にそのようなヌクレオチドが３′末端位置以外に位置し、また前記ポリマーの３′末端ヌクレオチドが、３′−５′−エキソヌクレアーゼ活性により除去できる実施例に関する。
【００５６】
ＡＴＣ鋳型を固体支持材に付着させる手段を提供することも、本発明の範囲内で有利である。これを達成するためには、増幅される固体支持材に単一オリゴヌクレオチドプライマーを付着させることだけでよい。かくして、本発明のプロセスを実施するに際して、一定のＡＴＣは多重プライマーに付着されるであろうけれども、その一つのみがある種の固体支持材にそれ自身をつなぎ留めることが必要とされる。このような拘束プライマーは二極性であり、従って２個の３′末端を持ち、これによりこのような末端が支持材にプライマーを付着させ、一方他の端部はサークルに付着できプライマーに増幅を提供するという点でしばしばこれは有利である。ＡＴＣに付着される他の多重プライマーが、それ自身をいずれかの型の支持材に付着することが必要とされるものは何も存在しない。二極性拘束プライマーは、ここで開示されるプロセスに対して、障害なく特異的でありまたはランダムであり得る。このような二極性プライマーの例、およびその調製と用途については、文献で明らかである［例えば前掲ライザーディ他（１９９８年）の開示を参照されたい］。
【００５７】
加えて、本発明のＡＴＣは、オリゴヌクレオチドプライマーがとりわけ便利で回りくどくないものではあるけれども、何らかの便利な手段によってある種の固体支持材に直接付着されるような形態で利用することができる。
【００５８】
このような支持材へのＡＴＣまたはオリゴヌクレオチドプライマーの付着は、前記ポリマーまたはＡＴＣを固体支持材に付着させるのに役立つ、例えば生物系または他のもののある種のポリマーなどのある分子種の手段を通じて行うことができる。このような本発明の方法に有用な固体基質は、オリゴヌクレオチドと連結することのできるいずれかの固形物質を含むことができる。これはアクリルアミド，セルロース，ニトロセルロース，ガラス，ポリスチレン，酢酸ビニルポリエチレン，ポリプロピレン，ポリメタアクリレート，ポリエチレン，ポリエチレンオキサイド，ガラス，ポリケイ酸塩，ポリカーボネート，テフロン（Ｒ），フルオロカーボン，ナイロン，シリコンラバー，ポリ無水物，ポリグリコール酸，ポリ乳酸，ポリオルソエステル，フマール酸ポリプロピル，コラーゲン，ポリグリコサミド，グリカン、およびポリアミノ酸などの物質を含む固体基質は、薄層フィルムまたは薄膜，ビート，ボトル，皿，線維，織布，形成ポリマー，粒子および微粒子を含むいずれかの有用な形態を持つことができる。固体基質のための望ましい形態はガラススライドまたはマイクロフィルターである（例えば標準の９６ウエル皿がそれである）。望ましい実施例は支持材としてガラスまたはプラスチックを利用する。更なる調製については、合衆国特許番号第５，８５４，０３３号を参照されたい。
【００５９】
オリゴヌクレオチドを固体基質に固定する方法は十分確立されている。アドレスプローブと検出プローブを含むオリゴヌクレオチドは、確立されたカップリング法を用いて基質に結合できる。例えば適切な付着法は、ピーズ他，全米科学アカデミー紀要，９１巻（１１号）：５０２２−５０２６ページ（１９９４年）に記載されている。オリゴヌクレオチドを固体基質に付着させる望ましい方法は、グオ他，核酸研究，２２巻：５４５６−５４６５ページ（１９９４年）に記載されている。
【００６０】
本発明に有用なオリゴヌクレオチドとＡＴＣｓは、確立されたオリゴヌクレオチド合成法を用いて合成することができる。オリゴヌクレオチドを合成する方法は、従来の技術で公知である。このような方法は、標準の酵素消化法からヌクレオチド断片分離法にまでわたることができる（例えば、サムブルック他，分子クローニング：ラボラトリーマニュアル，第二版，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク（１９８９年），ウー他，遺伝子バイオテクノロジーの方法（ＣＲＣプレス，ニューヨーク，ニューヨーク，１９９７年），および組換え遺伝子発現プロトコル，分子生物学，第６２巻所収（トゥアン，編，フマーナプレス，トトワ，ニュージャージー，１９９７年），これらの開示はここで引用例としてとり込まれている）。他に純粋に合成法としては、例えばミリゲンまたはベックマンシステム１プラスＤＮＡ合成機を利用するシアノエチルホスホルアミダイト法によるものもある（例えばミリゲン−バイオサーチ，バーリントン，マサチューセッツのモデル８７００自動合成機またはＡＢ１モデル３８０Ｂ）。オリゴヌクレオチドを作るのに有用な合成法は、更に生田他，アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー，５３巻：３２３−３５６ページ（１９８４年）（ホスホトリエステルとホスファイト−トリエステル法），およびナラン他，酵素学の方法，６５巻：６１０−６２０ページ（１９８０年），（ホスホトリエステル法）により記載されている。タンパク質核酸分子は、ニールセン他，バイオコンジュゲートケミカルズ，５巻：３−７ページ（１９９４年）に記載されたものなどの既知の方法を用いて作ることができる。
【００６１】
化学的硫化により、エキソヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエートジエステルを含むプライマーを合成する方法は、十分に確立されている。ランダムプライマーの固定相合成は、３′末端で１個またはいくつかの特異的に配置されたインターヌクレオチドホスホロチオエートジエステルを採用する。ホスホロチオエートトリステルは、五価リンを生成するために、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１ジオキサイド１，２、またはボーケージ試薬とのホスホロアミダイト化学反応の間に得られた中間ホスファイトトリエステルの酸化で導入することができ、ここでホスホロチオエートトリエステルはチオンとして存在する。このように形成されたチオンは、インターヌクレオチドホスホジエステルを生成するのに必要な続く酸化段階で安定している（マイヤー，Ｒ．Ｐ．，イーガン，Ｗ．，リーガン，Ｊ．Ｂ．，ボーケージ，Ｓ．Ｌ．，アメリカ化学学会ジャーナル，１１２巻：１２５３ページ，（１９９０年），およびマイヤー，Ｒ．Ｐ．，フィリップス，Ｌ．Ｒ．，イーガン，Ｗ．，リーガン，Ｊ．Ｂ．，ボーケージ，Ｓ．Ｌ．，有機化学ジャーナル，５５巻：４６９３ページ（１９９９年））。
【００６２】
ここで記載された多くのオリゴヌクレオチドは、それらの間でハイブリッドが形成できるように、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸のある部分に相補であるように設計される。これらのハイブリッドの安定性は、レスニックおよびフライヤー，バイオケミストリー，３４巻：１０８０７−１０８１５ページ（１９９５年），マグロー他，バイオテクニーク，８巻：６７４−６７８ページ（１９９ン年），およびライクリック他，核酸研究：６４０９−６４１２ページ（１９９０年）などに記載されたもののような既知の方法を使用して計算することができる。
【００６３】
ＲＣＡのローリングサークル複製段階で有用なＤＮＡポリメラーゼは、プライムド一本鎖サークル（または複式基質の各鎖）のローリングサークル複製を実行しなければならない。このようなポリメラーゼは、ここでローリングサークルＤＮＡポリメラーゼとして引用されている。ローリングサークル複製に関しては、ＤＮＡポリメラーゼが鋳型鎖に相補である鎖を置換できることが望ましく、この置換は鎖置換と名付けられ、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を欠いている。鎖置換は、ＡＴＣの多重タンデム複製の合成をもたらすのに必要である。５′→３′のエキソヌクレアーゼ活性は、もしそれが存在するなら、合成鎖の破壊を来たすことになるであろう。開示された方法で使用されるＤＮＡポリメラーゼが、高度に処理加工性であることも望ましい。開示された方法での使用にＤＮＡポリメラーゼの適合性は、ローリングサークルに複製を実行するその能力を評価することにより、容易に決定することができる。望ましいローリングサークルＤＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージφ−２９ ＤＮＡポリメラーゼ（合衆国特許番号５，１９８，５４３号、５，００１，０５０号，ブランコ他）、ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ（松本他，遺伝子８４巻：２４７ページ，（１９８９年）、ファージφ−ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（ジャン他，全米科学アカデミー紀要，８４巻：８２８７ページ（１９８７年）および、ズーおよび伊藤，バイオケミカル・バイオフィジカル・アクタ，１２１９巻：２６７−２７６ページ（１９９４年））、ＶＥＮＴ．ＲＴＭ．ＤＮＡポリメラーゼ（コン他，生物学化学ジャーナル．２６８巻：１９６５−１９７５ページ（１９９３年））、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレウノ断片（ジェイコブセン他，生化学ヨーロピアン・ジャーナル４５巻：６２３−６２７ページ（１９７４年））、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ（チャタージー他，遺伝子９７巻：１３−１９ページ（１９９１年））、およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素（カブードおよびベンコビッチ，カレント・バイオロジー：５巻１４９−１５７ページ（１９９５年））。φ−２９ ＤＮＡポリメラーゼがもっとも望ましい。同じく望ましいポリメラーゼは、Ｔ７生のポリメラーゼ、バシラス＝ステアロテルモフィルス（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、テルモアネロバクター＝テルモヒドロスルフリカス（Ｔｔｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（合衆国特許番号第５，７４４，３１２号）、およびテルムス・アクアティカス，テルムス・フラブスまたはテルムス・テルモフィルスのＤＮＡポリメラーゼを含む。同じように望ましいのは、φ２９，Ｃｐ−１，ＰＲＤ１，φ１５，φ２１，ＰＺＥ，ＰＺＡ，Ｎｆ，Ｍ２Ｙ，Ｂ１０３，ＳＦ５，ＧＡ−１，Ｃｐ−５，Ｃｐ−７，ＰＲ４，ＰＲ５，ＰＲ７２２およびＬ１７のファージのＤＮＡポリメラーゼから選択されるφ２９型ＤＮＡポリメラーゼである。特異的な実施例において、ＤＮＡポリメラーゼはバクテリオファージφ２９ ＤＮＡポリメラーゼであり、ここで多重プライマーはエキソヌクレアーゼ活性に耐性であり、標的ＤＮＡは高分子量線状ＤＮＡである。
【００６４】
ＲＣＡ期間中の鎖置換は、とりわけ複式ＡＴＣｓが鋳型として利用された場合には、例えばヘリカーゼなどのような鎖置換因子の使用を通じて促進することができる。たとえＤＮＡポリメラーゼがこのような因子の不在下でローリングサークル複製を実行しないとしても、鎖置換因子の存在下でローリングサークル複製を実行できるＤＮＡポリメラーゼはいずれも本発明のプロセスでの使用に適している。ＲＣＡで有用な鎖置換因子はＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット（鶴見他，ウイルス学ジャーナル，６７巻（１２号）７６４８−７６５３ページ（１９９３年））、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（ツァイーデルヘルト，およびファン・デル・フリート，ウイルス学ジャーナル，６８巻（２号）：１１５８−１１６４ページ（１９９４年参照）。ヘルペス単純性ウイルスタンパク質ＩＣＰ８（ベーマーおよびレーマン，ウイルス学ジャーナル，６７巻（２号）：７１１−７１５ページ（１９９３年）；スケーライター，およびレーマン，全米科学アカデミー紀要，９１巻（２２号），１０６６５−１０６６９ページ（１９９４年））、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ；リグラーおよびロマーノ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７０巻：８９１０−８９１９（１９９５年）および子牛胸腺ヘリカーゼ（シーゲル他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６７巻：１３６２９−１３６３５ページ（１９９２年））を含む。
【００６５】
ローリングサークル複製を実行するためのポリメラーゼの能力は、ファイアーおよびスー，全米科学アカデミー紀要，９２巻：４６４１−４６４５ページ（１９９５年）、およびライザーディ（合衆国特許番号５，８５４，０３３号、例えば実施例１など）に記載されたものなどのような、ポリメラーゼをローリングサークル複製で使用することにより決定することができる。
【００６６】
別の特異的な実施例において、標的ＤＮＡは、例えば一本鎖バクテリオファージＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡプラスミドまたはベクターであり、それはＤＮＡ配列決定、クローニング、またはマッピング、およびまたは検出の目的で増幅される。以下の実施例は、特異的なプロトコルを提供するが、条件は増幅されるＤＮＡサークルの同定に依存して変化することができる。
【００６７】
かくして本発明の手順を実行するにあたり、特定の緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条件、ｐＨおよびその他への言及は、それを限定することを意図するものではなく、議論が提示される特殊な前後関係で、通常の知識を有する者が関心があるまたは価値があるものとして認識するすべての関連する物質を含むように読み取られるべきであることは理解されねばならない。例えば、この一つの緩衝液または培養培地をも一つのものに置換して、しかも同一ではないにしても類似の結果を達成することはしばしば可能である。従来の技術に習熟した者は、無駄な実験を行うことなく、ここで開示された方法と手順を使用して、その目的に最適に役立つようにそのような置換を行うことができるようなシステムと方法論についての十分な知識を有するであろう。
【００６８】
本発明は、これから以下の限定されない実施例にしてより更に詳細に記載されるであろう。これらの実施例の開示を適用するに際して、本発明に基づき開示される方法の他の異なる実施例も、関連する技術に習熟した者に間違いなくそれら自身を提示するものとなるであろうことは十分に留意しておかなければならない。
【００６９】
【発明を実施するための最良の形態】
（実施例１）
多重特異的プライマーを使用するローリングサークル増幅における収量向上
【００７０】
ＲＣＡにおける増幅ＤＮＡの収量は、多重プライマーが基質ＤＮＡにアニーリングされる時に増幅することがここで示される。ＲＣＡでは、増幅ＤＮＡの収量は、環状ＤＮＡ鋳型に確立された複製フォークの数により限定されることもある。一本鎖環状ＤＮＡへの多重複製フォークの確立は、増幅が起こる点の数を比例的に増加させる。環状鋳型ＤＮＡにアニーリングされた多重プライマーの使用は、ＤＮＡポメラーゼによる多重複製フォークの確立に帰着する。この実施例は、多重プライマーが基質ＤＮＡにアニーリングされる時に、ＤＮＡ合成が増加することを実証する。
【００７１】
プライムドＭ１３ ＤＮＡは以下の通り調製された。Ｍ１３一本鎖ウイルス（＋）鎖ＤＮＡの周りの異なる部位にアニーリングする９個のオリゴヌクレオチドが得られた。アニーリング反応は、Ｍ１３ ＤＮＡとオリゴヌクレオチドのいずれか一つ、オリゴヌクレオチドの３個、オリゴヌクレオチドの６個、またはすべて９個のオリゴヌクレオチドのいずれかを含んでいた。アニーリングは、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，４０ｍＭのＮａＣｌ，６．５μｇのＭ１３ウイルス（＋）鎖ＤＮＡ（Ｍ１３サークルの２．７５ｐｍｏｌｅｓと等価）を含む反応液（１００μｌ）で５０ｐｍｏｌｅｓの各オリゴヌクレオチドが加えられて行われた。これらの条件下で、オリゴヌクレオチドの各プライマーに対する比率は、１８：１であった。反応は１分間９５℃に加熱され、３０分にわたり室温までゆっくり冷却された。９個のオリゴヌクレオチドの構造は以下の通りであった。
【００７２】
プライマー１
５’ ＴＣＴ ＧＴＴ ＴＡＴ ＡＧＧ ＧＣＣ ＴＣＴ ＴＣＧ ＣＴＡ ＴＴＡ ＣＧＣ ＣＡＧ ３’
（配列識別番号１）
プライマー２
５’ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＣＡＧ ＧＧＴ ＧＧＴ ＴＴＴ ＴＣＴ ＴＴＴ ＣＡＣ ＣＡＧ ＣＧＡ ＧＡＣ ＧＧＧ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＴＧ ＡＴＴ ＧＣＣ ＣＴＴ ＣＡＣ ＣＧＣ ＣＴＧ ３’
（配列識別番号２）
プライマー３
５’ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＡＣＣ ＡＣＡ ＣＣＣ ＧＣＣ ＧＣＧ ＣＴＴ ＡＡＴ ＧＣＧ ＣＣＧ ＣＴＡ ＣＡＧ ＧＧＣ ＧＣＧ ＴＡＣ ＴＡＴ ＧＧＴ ＴＧＣ ＴＴＴ ＧＡＣ ＧＡＧ ３’
（配列識別番号３）
プライマー４
５’ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＣ ＣＴＣ ＡＡＧ ＡＧＡ ＡＧＧ ＡＴＴ ＡＧＧ ＡＴＴ ＡＧＣ ＧＧＧ Ｇ ３’
（配列識別番号４）
プライマー５
５’ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＡＣ ＡＡＡ ＡＧＧ ＧＣＧ ＡＣＡ ＴＴＣ ＡＡＣ ＣＧＡ ＴＴＧ ＡＧＧ Ｇ ３’
（配列識別番号５）
プライマー６
５’ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＣＣ ＴＧＡ ＡＣＡ ＡＡＧ ＴＣＡ ＧＡＧ ＧＧＴ ＡＡＴ ＴＧＡ ＧＣＧ Ｃ ３’
（配列識別番号６）
プライマー７
５’ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＡＣ ＡＡＣ ＡＴＧ ＴＴＣ ＡＧＣ ＴＡＡ ＴＧＣ ＡＧＡ ＡＣＧ ＣＧＣ Ｃ ３’
（配列識別番号７）
プライマー８
５’ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＣＡ ＴＣＧ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＣＡ ＡＴＡ ＡＣＧ ＧＡＴ ＴＣＧ ＣＣＴ Ｇ ３’
（配列識別番号８）
プライマー９
５’ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＡＴ ＧＣＧ ＣＧＡ ＡＣＴ ＧＡＴ ＡＧＣ ＣＣＴ ＡＡＡ ＡＣＡ ＴＣＧ Ｃ ３’
（配列識別番号９）
一本鎖環状ＤＮＡにアニーリングされた多重プライマーの使用により、ＤＮＡ合成の収量増加を説明するために、４個のＲＣＡ反応が行われた。反応液（５０μｌ）は２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，７ｍＭのＭｇＣｌ２，および３０ｍＭのＮａＣｌ，２００μＭのデオキシリボヌクレオシド三リン酸，α−［３２Ｐ］ｄＣＴＰ、特異的活性４０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ全ｄＮＴＰ，１２ｎｇのプライムドＭ１３ウイルス（＋）鎖ＤＮＡおよび２６ユニットのＴ７シークエナーゼを含有していた。
【００７３】
反応は３７℃で２時間培養された。アリコートは３０分，６０分，９０分，および１２０分でとられ、放射性デオキシリボヌクレオチドの取り込みによりＤＮＡ合成を計量するために、ＤＥ８１フィルター上にスポットされた。投入Ｍ１３ ＤＮＡのフォールド増幅は、投入Ｍ１３ ＤＮＡに存在するデオキシリボヌクレオチドのｐｍｏｌで、とり込まれたデオキシリボヌクレオチドのｐｍｏｌを割ることにより決定された。その結果は図２で示されている。
【００７４】
そこで見ることができるように、著しくより多いＤＮＡ合成が、より多くのプライマーをそれにアニーリングしたＭ１３鋳型で現れる。
【００７５】
（実施例２）
ランダムヘキサマープライマーを使用するローリングサークル増幅における収量向上
【００７６】
多重ランダムヘキサマープライマーが基質ＤＮＡにアニーリングされる時に、ＲＣＡ内の増幅ＤＮＡの収量を向上されることも実証された。
【００７７】
プライムドＭ１３ ＤＮＡは以下の通り調製された。単一プライムドＭ１３は、前記の通り調製された。ランダムヘキサマープライムドＤＮＡは、Ｍ１３ ＤＮＡとランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドを含有していた。アニーリングは、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２０ｍＭのＫＣｌ，０．１ｍＭのＥＤＴＡ，６ｎｇのＭ１３ウイルス（＋）鎖ＤＮＡ（Ｍ１３サークルの２．５ｆｍｏｌｅｓに相当）、および６０００ｐｍｏｌｅｓのランダムヘキサマープライマーを含有する反応液（６０μｌ）で実施された。これらの条件下で、プライマー：サークル比は２．４×１０６：１であった。反応は１分９５℃まで加熱され、３０分にわたり室温までゆっくりと冷却された。
【００７８】
一本鎖環状ＤＮＡにアニーリングされたランダムヘキサマープライマーを使用してＤＮＡ合成の収量増加を説明するために、２個のＲＣＡ反応が行われた。反応液（２０μｌ）は５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭのＭｇＣｌ２，２０ｍＭの硫酸アンモニウム，および２００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン，１ｍＭのデオキシリボヌクレオシド三リン酸，α−［３２Ｐ］ｄＣＴＰ，特異的活性２４ｃｐｍ／ｐｍｏｌ全ｄＮＴＰ，および０．３２ユニットのφ２９ＤＮＡポリメラーゼを含有していた。第１反応液は、実施例１で記載の通り調製された１ｎｇの単一プラムイドＭ１３を含有し、一方第２反応液は、前に記載の通り調製された１ｎｇのランダムヘキサマープライムドＭ１３を含んでいた。
【００７９】
反応液は２４時間３７℃で培養された。アリコートが２時間，６時間および２４時間で採取され、放射性デオキシリボヌクレオチドのとり込みが確認された。投入Ｍ１３ ＤＮＡのフォールド増幅が、とり込まれたデオキシリボヌクレオチドのｐｍｏｌを投入Ｍ１３ ＤＮＡに存在するデオキシリボヌクレオチドのｐｍｏｌで割ることで確認された。その結果は図３で示される。
【００８０】
ここで見られるように、単一プライマーを持つＭ１３（単一プライムドＭ１３曲線の参照のこと）と比較して、Ｍ１３鋳型にアニーリングされた多重ランダムプライマーを持つＭ１３鋳型（ヘキサマープライムドＭ１３曲線を参照）で著しく多いＤＮＡ合成が生じる。Ｍ１３ ＤＮＡの３７０倍増幅がこれらの条件下で達成され、これは少量のＤＮＡ鋳型の増幅にとっては重要な有用性を持つ。
【００８１】
（実施例３）
ランダムヘキサマープライマーを使用する細菌コロニーとプラークからのプラスミドとバクテリオファージＤＮＡのローリングサークル増幅
【００８２】
多重ランダムヘキサマープライマーでプライミングされた環状プラスミドとバクテリオファージＤＮＡが、細菌コロニーまたはプラークからのＲＣＡを用いて採取された未精製物質から特異的に増幅されることも実証された。
【００８３】
ＤＮＡサンプルは以下の通り調製された。長さ１ｃｍのポリエチレン管材料（イントラメディック，ＰＥ２０，１．０９ｍｍ外径）の部分の一端が、大腸菌の菌叢において、プラスミドｐＵＣ１９またはバクテリオファージＭ１３のプラークで形質転換された大腸菌のコロニーに穿刺された。対照反応物としては、管材料は、平板内には穿刺されないか、またはプラスミドで形質転換されたプラークも細菌も含まない細菌菌叢の領域に穿刺された。管材料は次いで、２０μｌの緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含む）を含有するサーモサイクラー管（２００μｌ）に配置された。ランダムヘキサマープライマー（１０００ｐｍｏｌ）が各管に加えられ、反応液は９５℃で３分加熱され、その後３０分にわたり室温までゆっくりと冷却された。
【００８４】
ＲＣＡを行うために、反応液は最終量４０μｌで、最終濃度５０ｎＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭのＭｇＣｌ２，２０ｍＭの硫酸アンテニウム，５％のグリセロール，２００ｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン，１ｍＭのデオキシリボヌクレオシド三リン酸，α−［３２Ｐ］ｄＣＴＰ，特異活性６７ｃｐｍ／ｐｍｏｌ全ｄＮＴＰ，０．０４ユニットの酵母菌ピロホスファターゼ，および０．６ユニットのφ２９ ＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。
【００８５】
反応液は８時間３７℃で培養された。８時間後にアリコートが採取され、放射性デオキシリボヌクレオチドのとり込みが確認された。ＤＮＡ合成量は二つの方法で確認された。まずとり込まれたデオキシヌクレオチドの量が合成されたＤＮＡのナノグラム数を計算するのに使用された。第２に、放射能標識反応産物が、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで消化され、産物はアガロースゲル（１．０％，ＴＢＥ）を通して電気泳動により分析された。Ｍ１３（７．２キロベース）とｐＵＣ１９（２．７キロベース）の増幅の線状産物は計量され、既知の量の線状放射能標識Ｍ１３ ＤＮＡと比較された。増幅ＤＮＡの量の２個の測定値は一致した結果をもたらした。この結果は表１で示される。
【００８６】
表１は、多重ランダムへキサマープライマーでプライミングされたプラスミドとバクテリオファージＤＮＡが、細菌コロニーまたはプラークから採取された未精製物質から増幅された後のＤＮＡの収量（ｎｇで表示）を示す。ここで見られるように、ＤＮＡの著しい収量向上が、プラスミドまたはバクテリオファージＤＮＡを含まないサンプルと比較して、コロニー（ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡ）またはプラーク（バクテリオファージＭ１３ ＤＮＡ）から達成される。
【００８７】
【表１】
このような方法は、ゲノム，ｃＤＮＡまたは他の複合ＤＮＡｓの配列決定に採用されるこれまでの方法よりも際立った利点を提供する。
【００８９】
１．反応が遅く、高価で、労働集約的なプラスミドまたはファージのミニプレップの必要性の回避。プラスミドとファージの成長は、細菌宿主により寛容化されない「有害な」配列を予防することにより制限される。この方法はこれらそのそれぞれを潜在的に未然に予防し、成長とミニプレップに要する時間を約２４時間短縮するであろう。
【００９０】
２．両鎖の配列決定を可能にする産物の提供（ファージ鎖からの配列決定のみを可能にするＭ１３ファージミニプレップとの比較におけるもの）。
【００９１】
３．高処理量毛管配列機（例えばエイマシャム・ファーマシア・バイオテック，アプライド・バイオシステムズ，およびベックマン・インストゥルメンツで製造されたもの）により採用された動電学的注入に対する排除に理想的に適した分子サイズによる産物の提供。これとは逆に、ファージまたはプラスミドミニプレップは、正確な量で提供されないと毛管の遮断を起こし得る産物を産出する。
【００９２】
４．サンプル（プラークまたはコロニー）間で「標準化」されるＤＮＡ収量の提供。すなわち、産物量は投入鋳型量に拘らず不変に留まるよう構成することができる。この特徴は、鋳型の追加の超過が品質を低下させ、配列の長さを読み取ることが必要とされる毛管配列で特に有利な特徴である。
【００９３】
５．本方法は、ゲノム配列決定のためのベクター選択の際に、より大きな柔軟性を可能にする。サブクローニングは減少または排除される。現在ＢＡＣｓは、非常に限定された組成物のＭ１３ファージまたはプラスミドにサブクローン化される。部分または全体としての合成サブクローニングベクターは、ゲノム範囲を最大にし、配列決定反応数を最小にするように設計できるように製作可能である。
【００９４】
（実施例４）
φ２９ ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によるプライマーの分解
【００９５】
ランダムヘキサマープライマーは、ＲＣＡで用いられる条件下で、φ２９ ＤＮＡポリメラーゼの存在下で分解した。
【００９６】
プライムドＭ１３ ＤＮＡは以下の通り調製された。ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドは、１．３×１０７ｃｐｍ／ｐｍｏｌの特異活性までγ３２Ｐ ＡＴＰで５′末端標識された。アニーリング反応液（６０μｌ）は２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，４０ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ，６ｎｇのＭ１３ウイルス（＋）鎖ＤＮＡ（Ｍ１３サークルの２．５ｆｍｏｌｅｓに等価物）、および６０００ｐｍｏｌｅｓの標識ランダムヘキサマープライマーを含有していた。これらの条件の下で、プライマー：サークルの比率は２．４×１０６：１であった。反応液は９５℃まで１分加熱され、３０分にわたり室温までゆっくりと冷却された。
【００９７】
ＲＣＡ条件の下でφ２９ ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー分解を評価するために、反応液は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭのＭｇＣｌ２，２０ｍＭの硫酸アンモニウム，５％のグリセロ−ル，２００ｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン，１ｍＭのデオキシリボヌクレオシド三リン酸，０．０２ユニットの酵母菌ピロホスファターゼ，および０．１ユニット，１．０ユニットおよび１０ユニットのφ２９ ＤＮＡポリメラーゼの最終濃度を含む最終量にもたらされた。
【００９８】
反応液は２４時間３７℃で培養された。アリコート（３μｌ）が０時間，０．２５時間，２時間，６時間，および２３時間で採取され、反応産物は２５％ポリアクリルアミド配列決定ゲルを通じて電気泳動で分析された。結果は図４で示される。
【００９９】
ランダムプライマーは、φ２９ ＤＮＡポリメラーゼの１０ユニットの存在下で１５分で完全に分解した。プライマーは、φ２９ ＤＮＡポリメラーゼの０．１ユニットおよび１．０ユニットの存在下ではより長時間存続した。
【０１００】
かくして、このような分解を防止する方法の利用は有利である。そのような一つの方法は、次の実施例に記載される。
【０１０１】
（実施例５）
Ｍ１３ ＲＦＩ ＤＮＡのφ２９増幅でのエキソヌクレアーゼ耐性ランダムプライマーの作用
【０１０２】
多重エキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマーでプライミングされた環状二本鎖バクテリオファージＤＮＡは、エキソヌクレアーゼに感受性のプライマーでプライミングされたＤＮＡよりも、より大きい範囲で増幅される。
【０１０３】
エキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマーは、Ｎがランダムヌクレオチドを表し、下線部が５′−チオリン酸塩結合を持つヌクレオチド：５′ＮＮＮＮＮＮＴ３′を含む。
【０１０４】
この７マー（ヘプタマー）オリゴヌクレオチドにおいて、３′Ｔ残基はエキソヌクレアーゼ感受性であり、また２個の最後から２番目の３′ランダムヌクレオチドは、３′−＞５′エキソヌクレアーゼ活性に耐性である。３′−＞５′エキソヌクレアーゼの存在下では、３′Ｔ残基は除去され、エキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドを産出する。
【０１０５】
プライムドＭ１３ ＤＮＡは下記の通り調製された。アニーリング反応液は、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，４０ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ，６ｎｇのＭ１３ ＲＦＩ ＤＮＡ（Ｍ１３サークルの２．５ｆｍｏｌｅｓの等価物）、および６０００ｐｍｏｌｅｓのエキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマーを含有した。これらの条件下でプライマー：サークルの比率は２．４×１０６：１であった。反応液は９５℃で１分加熱され、３０分にわたり室温までゆっくりと冷却された。
【０１０６】
ＲＣＡを実行するために、反応液は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭのＭｇＣｌ２，２０ｍＭの硫酸アンモニウム，５％のグリセロール，２００ｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン，１ｍＭのデオキシリボヌクレオシド三リン酸，α−［３２Ｐ］ｄＣＴＰ，特異的活性６７ｃｐｍ／ｐｍｏｌ全ｄＮＴＰ，０．０２ユニットの酵母菌ピロホスファターゼ，および０．３ユニットのポリメラーゼの最終濃度を含有する２０μｌの最終量にもたらされた。
【０１０７】
反応液は３４℃で培養され、１３時間後にアリコートが採取され、放射性デオキシリボヌクレオチドのとり込みが確認された。投入Ｍ１３ ＤＮＡのフォールド増幅は、とり込まれたデオキシリボヌクレオチドのｐｍｏｌを投入Ｍ１３ ＤＮＡに存在するデオキシリボヌクレオチドのｐｍｏｌで割ることで確認された。その結果は図５で示される。
【０１０８】
ここで見られるようにエキソヌクレアーゼ耐性（エキソＲ）プライマーが使用される時に、投入ＤＮＡの著しいフォールド増幅が起こり、加えてφ２９ ＤＮＡポリメラーゼの増量が反応液に加えられるにつれて、フォールド増幅の収量の増加が見られる（１０００ｐｍｏｌエキソＲへキサマー曲線および１００ｐｍｏｌエキソＲへキサマー曲線を参照）。これとは逆に、エキソヌクレアーゼ感受性（エキソＳ）プライマーを使用するフォールド増幅は、エキソＲプライマーで見られるものよりもずっと少ない。加えて、エキソＳプライマーを使用する最適増幅は、φ２９ ＤＮＡポリメラーゼの０．３ユニットを使用するものに見られ、一方酵素水準の高いものは増幅の収量が少なかった（１０００ｐｍｏｌエキソＳプライマー曲線を参照）。追加プライマーが不在の場合には、増幅は見られなかった（プライマー無しの曲線参照）。エキソヌクレアーゼ耐性ランダムプライマーは、高濃度のφ２９ ＤＮＡポリメラーゼを用いて、９０００以上のフォールド増幅の達成を可能にし、それは非常に低い水準のＤＮＡ鋳型の増幅には大きな効用を持つ。
【０１０９】
（実施例６）
エキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマーを使用するローリングサークル増幅で増幅される鋳型ＤＮＡを使用するＤＮＡ配列決定
【０１１０】
多重エキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマーを使用して増幅された環状一本鎖バクテリオファージＭ１３ ＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定のための鋳型として有用であることが確認された。
【０１１１】
一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８ ＤＮＡ（１ｎｇ）が、６２ｐｍｏｌｅｓのランダムヘキサマー，２．５ユニットのφ２９ ＤＮＡポリメラーゼ，０．００７ユニットの酵母菌無機ピロホスファターゼと組み合わせて、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１０ｍＭのＭｇＣｌ２，７５ｍＭのＫＣｌおよび０．５ｍＭのｄＮＴＰを含む緩衝液で、５マイクロリットル反応液で増幅された。反応液は、３０℃で１２時間培養され、Ｍ１３ ＤＮＡの増幅を可能にした。１ユニットのウシ腸アルカリ性ホスファターゼが加えられ、混合物は３７℃で３０分培養され、次いで９５℃で３分培養された。この反応液に４９５マイクロリットルの水が加えられ、０．０１ｎｇの投入Ｍ１３ｍｐ１８ ＤＮＡから増幅されたＤＮＡの量を含む５マイクロリットルの希釈サンプルが、５ｐｍｏｌｅｓの〜４０ユニバーサルプライマーと８マイクロリットルのＤＹＥｎａｍｉｃ（ダイエナミック）ＥＴ ターミネータープレミックス（エイマシャム・ファーマシア・バイオテック）を含む２０マイクロリットルの配列決定反応液に移された。この反応液は９５℃で２０秒、および６０℃で６０秒、２５回繰返して循環され、沈殿され、産物の１／２がＡＢＩ ３７３配列決定ゲル装置に適用された。生成する電気泳動図は表６で示される。得られた配列は平均信号強度１１９で４００ヌクレオチド以上にわたり正確であった。
【０１１２】
比較の目的で、２００ｎｇの純粋な非増幅一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８ ＤＮＡが、増幅ＤＮＡで記載されたのと全く同じにＤＮＡ配列決定の鋳型として使用された。生成する電気泳動図は図７で示される。得られた配列は、４２５の平均信号強度を持つ４００ヌクレオチド以上で正確であり、０．０１ｎｇの投入ＤＮＡから増幅されたＤＮＡ鋳型から得られたものの約３．６倍であった。
【０１１３】
ここで見られるように、０．０１ｎｇの投入Ｍ１３ ＤＮＡから増幅された鋳型ＤＮＡを用いる配列決定は、非増幅ＤＮＡ鋳型の２０，０００倍大きな量から達成された信号よりも僅か約４倍少ないだけであった。かくして記載された方法を使用するＤＮＡ鋳型増幅は、少量のＤＮＡ鋳型の配列決定も可能にする大きな有用性を有している。
【０１１４】
（実施例７）
エキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマーを使用する細菌コロニーからの細菌人工染色体ＤＮＡのローリングサークル増幅
【０１１５】
多重エキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマーでプライミングされた細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡが、ＲＣＡを用いる細菌コロニーから採取された未精製物質から特異的に増幅されることが確認された。
【０１１６】
ＤＮＡサンプルは以下の通り調製された。ＢＡＣ含有細菌菌株（リサーチ・ジェネティクス）が筋状に配列され、単一コロニーとして成長した。一片のポリエチレン管部材（イントラメディック，ＰＥ２０，１．０９ｍｍ外径）がコロニーに穿刺され、管部材は２０μｌの緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，４０ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ）を含むサーモサイクラーに配置された。エキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマー（オリゴヌクレオチドの３′末端に最近接して位置する２個のチオリン酸塩結合を含むように修飾されたランダムヘキサマー，１０００ｐｍｏｌ）が各管部材に加えられ、反応液は９５℃で３分加熱され、８時間にわたりゆっくりと室温まで冷却された。ＲＣＡを行うために反応液は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭのＭｇＣｌ２，２０ｍＭの硫酸アンモニウム，５％のグリセロール，２００ｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン，０．５ｍＭのデオキシリボヌクレオシド三リン酸，０．０４ユニットの酵母菌ピロホスファターゼ，および０．６ユニットのφ２９ ＤＮＡポリメラーゼの最終濃度を含む４０μｌの最終量にもたらされた。
【０１１７】
反応液は８時間３７℃で培養された。反応が終結した後、アリコートが採取され、ＤＮＡ合成は（臭化エチジウム染色アガロースゲルから）測光法で確認された。増幅ＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼ分析およびＤＮＡ配列決定の両方で確認された通り、ＢＡＣ ＤＮＡであると確認された。増幅ＢＡＣ ＤＮＡの収量は、単一細菌コロニーから３μｇであった。かくして、エンドヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマーを用いるＲＣＡは、細菌コロニーから直接ＢＡＣ ＤＮＡを増幅することで、大きな有用性を持つ。
【０１１８】
（実施例８）
エキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマーを使用するヒトゲノムＤＮＡの増幅
【０１１９】
ヒトゲノムＤＮＡの増幅が、エキソヌクレアーゼ感受性プライマーでプライミングされたヒトゲノムＤＮＡに比べてエキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマープライマーを使用してかなりの範囲まで生じることが確認された。
【０１２０】
ヒトゲノムＤＮＡ（プロメガ）は以下の通り増幅された。ＤＮＡ（２０ｎｇ）は、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１０ｍＭのＭｇＣｌ２，５０ｍＭのＫＣ１よりなる緩衝液で７００ｐｍｏｌのエキソヌクレアーゼ感受性ランダムヘキサマー、またはエキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマー（すなわち、オリゴヌクレオチドの３′末端に最近接する２個のチオリン酸塩結合を含むように修飾されたランダムヘキサマー）のいずれかで混合され、９５℃で３分培養され、４℃まで冷却された。これらの混合物は、次いで、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１０ｍＭのＭｇＣｌ２，５０ｍＭのＫＣｌおよび０．５ｍＭのｄＮＴＰの全量５０マイクロリットルより成る緩衝液で、６４ユニットのφ２９ ＤＮＡポリメラーゼと０．０４ユニットの酵母菌無機ピロホスファターゼで組合わされた。反応液はＤＮＡの増幅が可能になるように、３０℃で１６時間培養された。一度増幅されるとＤＮＡ産物は（臭化エチジウム染色アガロースゲルから）測光法で計量された。ランダムヘキサマープライマーを用いてプライミングされたＤＮＡサンプルは２倍増幅され、一方ヌクレアーゼ耐性ヘキサマーを用いてプライミングされたＤＮＡサンプルは４００倍増幅された。かくして未修飾ランダムヘキサマーに代ってエキソヌクレアーゼ耐性ランダムヘキサマーの使用は、少なくとも２００倍収量を改善することができ、ヒトゲノムＤＮＡなどのような高分子量ＤＮＡ調製物の有効な増幅に大きな有用性をもつことになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に基づく一般的な実施例を示す図。増幅標的サークルに相補である領域を持つオリゴヌクレオチドプライマー（Ａで示されるもの）は、増幅標的サークルに特異的にハイブリッド形成する（Ｂで示される）。ＣはＢのハイブリッド形成された構造へのｄＮＴＰｓ，ＤＮＡポリメラーゼなどの追加の結果を示し、これにより各プライマーの３′末端は伸長される。各産物の伸長は、ＤＮＡポリメラーゼが隣接する酵素により合成されたＤＮＡを置換することで継続する。この場合、１個の標的サークルは、同じ増幅標的サークル鋳型で線状複製３ラウンドを達成するために、３個のプライマーと３個の酵素に相互作用する。より多くのプライマーを使用することもできる。多重特異的プライマーを使用することもできるし、あるいはプライマーは標的サークルにランダムな位置でハイブリッド形成するランダム配列のものであることも可能である。
【図２】Ｍ１３と各種の数のアニーリングされたプライマーを使用する増幅反応である（出発鋳型のｐｍｏｌ当りで形成されたｐｍｏｌ／投入またはピコモル数での）フォールド増幅を示すグラフ。Ｍ１３ ＤＮＡ基質にアニーリングされたプライマー数は、各曲線の最終データ点のグラフの左隣りに注で示される。単一プライマーを使用するプロットは線状ＲＣＡ（ＬＲＣＡ）反応である。
【図３】Ｍ１３と多重ランダムプライマー、または単一プライマーを使用したローリングサークル増幅期間でのフォールド増幅（ｐｍｏｌ／投入：産物にとり込まれたデオキシヌクレオチドのｐｍｏｌｅｓで測定されたＤＮＡ合成量として定義されたもの）対経過時間（時間）の関係を示すグラフ。Ｍ１３基質にアニーリングされたランダムへキサマープライマーまたは単一プライマーの存在は、各曲線の最終データ点のグラフの右隣りに注で示される。
【図４】プライマー、ここではランダムヘキサマー（未反応残存プライマー％）対経過時間（時間）のφ２９ ＤＮＡポリメラーゼの量は、各曲線の最終データ点のグラフの右隣りに注で示される。
【図５】Ｍ１３とエキソヌクレアーゼ耐性（エキソＲ）ランダムプライマーまたはエキソヌクレアーゼ感受性（エキソＳ）ランダムプライマーを用いるローリングサークル増幅期間中のフォールド増幅（産物／投入のｐｍｏｌ表示）対反応液に加えられたφ２９ ＤＮＡポリメラーゼの量（ユニット表示）の関係を示すグラフ。Ｍ１３基質にアニーリングされたエキソＲまたはエキソＳランダムヘキサマープライマーの存在、またはプライマーの存在なしは、各曲線の最終データ点の右隣りに注で示される。
【図６】鋳型としてのＭ１３ ＤＮＡの０．０１ｎｇからのＭＰＲＣＡにより増幅されたＤＮＡを使用するＤＮＡ配列決定反応を実行する結果を表示するＤＮＡ配列決定反応を示す電気泳動図。
【図７】鋳型としてのＭ１３ ＤＮＡの２００ｎｇを使用するＤＮＡ配列決定反応を実行する結果を表示するＤＮＡ配列決定反応を示す電気泳動図。
Claims (67)
- 核酸配列を選択的に増幅する一つのプロセスであって、１個またはそれ以上の増幅標的サークル（ＡＴＣｓ）が、１個以上の多重一本鎖非環状オリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１）と結合し、またここでその条件が多重タンデム配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）産物を形成するために、Ｐ１プライマーの伸長により、前記増幅標的サークルの複製を促進するという条件下で、前記多重一本鎖非環状オリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１）、１個またはそれ以上の増幅標的サークル（ＡＴＣｓ）、ＤＮＡポリメラーゼおよび多重デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）より成る混合物を形成することを含むことを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここに前記多重プライマーが、ＡＴＣの部分に相補である特異的な配列を持つことを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記多重プライマーが、ランダムプライマーであることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記多重プライマーが、ランダムプライマーと特異的プライマーの混合物より成ることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記多重プライマーが、長さで２乃至５０ヌクレオチドの範囲内にあることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記多重プライマーが、長さで２乃至３５ヌクレオチドの範囲内にあることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記多重プライマーが、長さで２乃至１０ヌクレオチドであることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記多重プライマーが、ヘキサマー（六量体）であることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記多重プライマーが、オクタマー（八量体）であることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記多重プライマーが、ＡＴＣに相補でない前記プライマーの５′末端で１個の領域を含むことを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記ＡＴＣが、一本鎖ＤＮＡサークルであることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記ＡＴＣが、少なくとも１個のニックを持つ複式ＤＮＡサークルであることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記ＡＴＣが、ニックを持たない複式ＤＮＡサークルであることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記ＡＴＣが、一本鎖ＲＮＡサークルであることを特徴とするプロセス。
- 請求項１２または請求項１３記載のプロセスであって、更に複式ＤＮＡサークルの２個の鎖を分離する変性段階を含むことを特徴とするプロセス。
- 請求項１５記載のプロセスであって、ここで増幅標的サークルが、細菌コロニー、バクテリオファージ、ウイルスプラーク、酵母コロニー、バキュロウイルスプラーク、および遷移形質移入真核細胞より成るグループから選択される部材から直接誘導されることを特徴とするプロセス。
- 請求項１６記載のプロセスであって、ここで前記部材が、溶菌されていることを特徴とするプロセス。
- 請求項１７記載のプロセスであって、ここで溶菌が、熱、酵素、および有機溶媒より成るグループから選択される作用薬での処置により実現されることを特徴とするプロセス。
- 請求項１８記載のプロセスであって、ここで前記酵素が、リゾチーム、ヘリカーゼ、グルシラーゼ、およびザイモリアーゼより成るグループから選択されることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記ＡＴＣが、サイズで約１０，０００ヌクレオチド以下であることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記ＡＴＣが、サイズで約１０，０００ヌクレオチド以上であることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記ＡＴＣが、サイズで約１，０００ヌクレオチド以下であることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記ＡＴＣが、サイズで約１００ヌクレオチド以下であることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで増幅標的サークルが、一本鎖バクテリオファージＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡプラスミドまたは他のベクター、あるいはこのようなベクターから誘導されたクローンを含むことを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで増幅される増幅標的サークルが、未知の配列組成物のものであることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記ｄＮＴＰが、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＵＴＰ、前記のものとは異なる自然発生ｄＮＴＰ、ｄＮＴＰの類似体、および普遍塩基を持つｄＮＴＰより成るグループから選択された部材であることを特徴とするプロセス。
- 請求項２６記載のプロセスであって、ここで少なくとも１個の前記ｄＮＴＰが、放射能標識されることを特徴とするプロセス。
- 請求項２６記載のプロセスであって、ここで少なくとも１個のヌクレオチドが、そこへの取り込みに続き、ＴＳ−ＤＮＡにヌクレアーゼ活性に対する耐性を与えることを特徴とするプロセス。
- 請求項２８記載のプロセスであって、ここで少なくとも１個の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチドであることを特徴とするプロセス。
- 請求項２８記載のプロセスであって、ここで前記ヌクレアーゼ活性が、エンドヌクレアーゼによるものであることを特徴とするプロセス。
- 請求項２８記載のプロセスであって、ここで前記ヌクレアーゼ活性が、エキソヌクレアーゼによるものであることを特徴とするプロセス。
- 請求項２８記載のプロセスであって、ここで前記ヌクレアーゼ活性が、３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼによるものであることを特徴とするプロセス。
- 請求項３１記載のプロセスであって、ここで前記エキソヌクレアーゼ活性が、追加されたエキソヌクレアーゼ酵素によるものであることを特徴とするプロセス。
- 請求項２８記載のプロセスであって、ここで前記ヌクレアーゼ活性が、汚染ヌクレアーゼによるものであることを特徴とするプロセス。
- 請求項２８記載のプロセスであって、ここで少なくとも１個の前記ヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドであることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで少なくとも１個のＰ１プライマーが固体支持材に付着されることを特徴とするプロセス。
- 請求項３６記載のプロセスであって、ここで前記固体支持材がガラスまたはプラスチックで作られることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記多重プライマーがエキソヌクレアーゼ活性に対して耐性を持つことを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記多重プライマーがエキソヌクレアーゼ活性に耐性であり、前記標的ＤＮＡが高分子量線状ＤＮＡであることを特徴とするプロセス。
- 請求項３８記載のプロセスであって、ここで前記エキソヌクレアーゼ活性が、酵素により起こることを特徴とするプロセス。
- 請求項３８記載のプロセスであって、ここで前記エキソヌクレアーゼ活性が３′−５′−エキソヌクレアーゼにより起こることを特徴とするプロセス。
- 請求項３８記載のプロセスであって、ここで前記エキソヌクレアーゼ活性が、３′−５′−エキソヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼにより起こることを特徴とするプロセス。
- 請求項３８記載のプロセスであって、ここで前記エキソヌクレアーゼ活性が汚染ヌクレアーゼにより起こることを特徴とするプロセス。
- 請求項３８記載のプロセスであって、ここで前記各多重プライマーが、前記プライマーをエキソヌクレアーゼ活性に耐性にする少なくとも１個のヌクレオチドを含むことを特徴とするプロセス。
- 請求項４４記載のプロセスであって、ここで前記少なくとも１個のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドであることを特徴とするプロセス。
- 請求項４５記載のプロセスであって、ここで前記修飾ヌクレオチドが、３′末端ヌクレオチドであることを特徴とするプロセス。
- 請求項４６記載のプロセスであって、ここで前記修飾ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチドであることを特徴とするプロセス。
- 請求項４４記載のプロセスであって、ここで前記各多重プライマーが、前記プライマーをエキソヌクレアーゼ活性に耐性にする少なくとも２個のヌクレオチドを含むことを特徴とするプロセス。
- 請求項３５記載のプロセスであって、ここで前記少なくとも１個のヌクレオチドが、３′末端位置以外に位置することを特徴とするプロセス。
- 請求項４９記載のプロセスであって、ここで前記プライマーの前記３′末端ヌクレオチドが、３′−５′−エキソヌクレアーゼ活性により除去できることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記ＤＮＡポリメラーゼが、バクテリオファージφ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｓ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージ Ｍ２ ＤＮＡポリメラーゼ、ファージφＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素、Ｔ７生ポリメラーゼおよびＢｓｔポリメラーゼより成るグループから選択される部材であることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記ＤＮＡポリメラーゼが、バクテリオファージφ２９ ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記ＤＮＡポリメラーゼが、バクテリオファージφ２９ ＤＮＡポリメラーゼであり、また前記多重プライマーがエキソヌクレアーゼ活性に耐性であることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記ＤＮＡポリメラーゼが、バクテリオファージφ２９ ＤＮＡポリメラーゼであり、ここで前記多重プライマーがエキソヌクレアーゼ活性に耐性であり、また前記標的ＤＮＡが高分子線状ＤＮＡであることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記ＤＮＡポリメラーゼが、３′，５′−エキソヌクレアーゼ活性を示さないことを特徴とするプロセス。
- 請求項５５記載のプロセスであって、ここで前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｔｆｌ、およびＴｔｈポリメラーゼなどの３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼ、真核ＤＮＡポリメラーゼアルファ、およびφ２９ ＤＮＡポリメラーゼのエキソ（−）バージョンなどの３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を排除するように修飾されたＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片、ＶｅｎｔおよびＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼより成るグループから選択されることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記ＤＮＡポリメラーゼが逆転写酵素であることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで前記ＡＴＣがＲＮＡであり、また前記ＤＮＡポリメラーゼが逆転写酵素であることを特徴とするプロセス。
- 請求項１記載のプロセスであって、ここで線状ＤＮＡ標的が前記ＡＴＣの代りに使用されることを特徴とするプロセス。
- 請求項３４乃至４９いずれかに記載のプロセスであって、ここで線状ＤＮＡ標的が、前記ＡＴＣの代りに使用されることを特徴とするプロセス。
- 請求項５３記載のプロセスであって、ここで前記ＤＮＡポリメラーゼが、φ２９ ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とするプロセス。
- 核酸配列を選択的に増幅する一つのプロセスであって、
（ａ）増幅標的サークル（ＡＴＣ）が多重一本鎖非環状オリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１）の１個と結合してプライマーＡＴＣサンプル混合物を産生する条件の下で、多重一本鎖非環状オリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１）と１個またはそれ以上の増幅標的サークル（ＡＴＣ）を混合し、
（ｂ）Ｐ１プライマーの伸長により、前記増幅標的サークルの複製を促進して多重一次タンデム配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）産物を形成する条件の下で、ＤＮＡポリメラーゼと多重デオキシヌクレオシド三リン酸を加える、
ことを含むことを特徴とするプロセス。 - 請求項１記載のプロセスであって、ここで少なくとも１個のデオキシリボヌクレオシド三リン酸が、容易に検出可能な成分を含むことを特徴とするプロセス。
- 請求項６３記載のプロセスであって、ここで検出可能な成分が、蛍光標識であることを特徴とするプロセス。
- ヌクレアーゼ耐性ランダムプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよび１個またはそれ以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含むことを特徴とする増幅ＤＮＡ配列のための一つのキット。
- 請求項６５記載のキットであって、ここで前記ＤＮＡポリメラーゼが、３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を持つことを特徴とするプロセス。
- 請求項６５記載のキットであって、ここで前記ＤＮＡポリメラーゼがφ２９ ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とするキット。
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