JP2023539360A - サンプル中の１つ以上の標的分析物を検出するためのキット並びにそれを作製及び使用する方法 - Google Patents

サンプル中の１つ以上の標的分析物を検出するためのキット並びにそれを作製及び使用する方法 Download PDF

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Abstract

サンプル中の１つ以上の標的分析物を検出、同定、又は定量化するためのオリゴヌクレオチド、方法、及びキット、並びにオリゴヌクレオチドを支持体表面に固定化するための方法が提供される。【選択図】なし

Description

本開示は、サンプル中の１つ以上の標的分析物を検出するためのキット、並びにそれを作製及び使用する方法に関する。
一塩基多型（ＳＮＰ）とは、集団のかなりの部分（＞１％）に各々現れる２つ以上の異なるヌクレオチド残基（アレル）が存在する、生物のゲノムにおける一塩基多様性を指す。ＳＮＰは、個体間の配列多様性の最も頻繁な形態であり、多くの遺伝性疾患の病因に関与する。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍａｐｐｉｎｇ，ａｎｄ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０：１０７７－１０８２。ヒトゲノムには推定１，０００万のＳＮＰがあり、コーディング領域及び非コーディング領域で生じる可能性がある。Ｋｒｕｇｌｙａｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｓ ｔｈｅ Ｓｐｉｃｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２７：２３４－２３６。多くのＳＮＰは細胞機能に影響を与えないが、他のＳＮＰは遺伝性形質、遺伝性疾患、加齢性疾患、並びに薬物要因及び環境要因への反応に関連している。
ジェノタイピングアッセイは、サンプル中のヌクレオチド配列の存在を検出するために使用される遺伝子検査であり、サンプル中のＳＮＰ又は、欠失及び挿入、重複、並びに転座を含むがこれらに限定されない他の配列多様性の存在を検出するために使用することができる。高密度オリゴヌクレオチドアレイは、チップ上に配列された数十万のプローブを使用して、多くのヌクレオチド配列の同時調査を可能にする。
サンプル中のヌクレオチド配列の大規模な分析は、配列を疾患又は疾患への感受性と関連付けるため、配列を薬物応答の個々の変動性に結び付けるため、又は集団研究を実施するために必要であるため、サンプル中のヌクレオチド配列を同定するためのキットの必要性が残っている。
サンプル中の標的核酸配列を含む標的オリゴヌクレオチドを検出するための方法が本明細書に提供される。一態様では、この方法は、
（ａ）標的補体が標的オリゴヌクレオチドの標的核酸配列にハイブリダイズして、反応生成物を形成する条件下で、サンプルを、オリゴヌクレオチドタグ、標的補体、及び検出オリゴヌクレオチドを含む検出プローブと接触させることと、
（ｂ）反応生成物のオリゴヌクレオチドタグが捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、固定化された検出複合体を形成する条件下で、捕捉オリゴヌクレオチドが固定化される支持体表面を、反応生成物を含む混合物と接触させることと、
（ｃ）固定化された検出複合体を、増幅テンプレートを含む検出混合物と接触させることと、
（ｄ）増幅テンプレートを増幅して、検出標識部位を含む１つ以上の核酸配列を含むアンプリコンを形成することと、
（ｅ）検出試薬の核酸配列がアンプリコンの検出標識部位にハイブリダイズする条件下で、アンプリコンを、標識及び検出標識部位に相補的な核酸配列を含む検出試薬と接触させることと、
（ｆ）検出標識部位に結合した標識を検出することと、を含む。一態様では、サンプルは、（ａ）でアンカー試薬及び検出プローブと接触させられる。一態様では、アンカー試薬は、オリゴヌクレオチドタグ及びアンカー配列を含む。一態様では、検出プローブは、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグ、一本鎖ＲＮＡ標的相補体、及び一本鎖ＤＮＡ検出オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、アンカー試薬は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグ及び一本鎖ＤＮＡアンカー配列を含む。
一態様では、この方法は、（ｃ）の前に、非結合プローブの一本鎖ＲＮＡを分解するために、固定化された検出複合体をＲＮａｓｅと接触させることを含む。
一態様では、サンプル中に標的核酸配列を含む標的オリゴヌクレオチドを検出するための方法が提供される。一態様では、この方法は、
（ａ）サンプルを、
（ｉ）一本鎖ＤＮＡ配列を含むオリゴヌクレオチドタグ、一本鎖ＲＮＡ配列を含む標的補体、及び一本鎖ＤＮＡ配列を含む検出オリゴヌクレオチドを含む検出プローブ、並びに
（ｉｉ）一本鎖ＤＮＡ配列を含むオリゴヌクレオチドタグ及び一本鎖ＤＮＡ配列を含むアンカー配列を含むアンカー試薬と接触させることであって、
検出プローブの標的相補体が標的オリゴヌクレオチドの標的核酸配列にハイブリダイズして、オリゴヌクレオチドタグ、標的オリゴヌクレオチド及び標的補体の標的核酸配列を含む二本鎖ＲＮＡ二本鎖を含む反応生成物を形成する、接触させることと、
（ｂ）反応生成物のオリゴヌクレオチドタグが捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズして支持体表面に検出複合体を形成する条件下で、複数の捕捉オリゴヌクレオチドが個別の結合ドメインに固定化されている１つ以上の電極を含む支持体表面を、反応生成物を含む混合物と接触させることと、
（ｃ）支持体表面をＲＮａｓｅと接触させて、結合していない検出プローブの一本鎖ＲＮＡを分解することと、
（ｄ）固定化された検出複合体を、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）テンプレート及びポリメラーゼを含む検出混合物と接触させることと、
（ｅ）ＲＣＡによってテンプレートを増幅して、検出複合体に付着した伸長配列を形成することであって、伸長配列が、検出標識部位を含む複数の核酸配列を含む、増幅することと、
（ｆ）検出試薬の核酸配列が検出標識部位にハイブリダイズする条件下で、伸長配列を、電気化学発光（ＥＣＬ）標識及び伸長配列の検出標識部位に相補的である核酸配列を含む検出試薬と接触させることと、
（ｇ）ＥＣＬ標識を、ＥＣＬ共反応物を含むＥＣＬ読み取り緩衝液と接触させ、電極に電位を印加することによって、伸長配列に結合したＥＣＬ標識を検出することと、を含む。
一態様では、サンプル中の標的ヌクレオチド配列を検出するための方法が提供される。一態様では、この方法は、
（ａ）サンプルを、
（ｉ）一本鎖オリゴヌクレオチドタグ及びサンプル中の標的ヌクレオチド配列の第１の領域に相補的である第１の核酸配列を含む標的化プローブ、並びに
（ｉｉ）検出オリゴヌクレオチド及び標的ヌクレオチド配列の第２の領域に相補的である第２の核酸配列を含む検出プローブ、を含む混合物と接触させることであって、
標的化プローブの第１の核酸配列及び検出プローブの第２の核酸配列が、標的オリゴヌクレオチドの隣接する核酸配列に相補的である、接触させることと、
（ｂ）標的化プローブ及び検出プローブが標的オリゴヌクレオチドのそれらの対応するヌクレオチド配列に結合し、核酸リガーゼが標的化及び検出プローブを連結して、オリゴヌクレオチドタグ及び検出オリゴヌクレオチドを含む反応生成物を形成する条件下で、核酸リガーゼの存在下で、標的オリゴヌクレオチド、標的化プローブ及び検出プローブを含む混合物をインキュベートすることと、
（ｃ）反応生成物のオリゴヌクレオチドタグが捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、固定化された検出複合体を形成する条件下で、捕捉オリゴヌクレオチドが固定化されている支持体表面を、反応生成物を含む混合物と接触させることと、
（ｄ）固定化された検出複合体を、増幅テンプレートを含む検出混合物と接触させることと、
（ｅ）増幅テンプレートを増幅して、検出標識部位を含む１つ以上の核酸配列を含むアンプリコンを形成することと、
（ｆ）検出試薬の核酸配列が検出標識部位にハイブリダイズする条件下で、アンプリコンを、標識及び検出標識部位に相補的である核酸配列を含む検出試薬と接触させることと、
（ｇ）支持体表面に結合した標識を検出することと、を含む。
一態様では、検出プローブは、標的化プローブの３’末端に隣接する標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする５’末端を有する。
一態様では、この方法は、（ｂ）において形成された反応生成物を、標的オリゴヌクレオチドから反応生成物を解離する変性条件に曝露することを含む。
一態様では、増幅テンプレートは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。一態様では、増幅テンプレートは、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって増幅される。一態様では、増幅テンプレートは、環状増幅テンプレートを含む。
一態様では、ＲＣＡによって生成されたアンプリコンは、固定化された検出複合体に付着した伸長配列を含む。一態様では、アンプリコンは、複数の検出標識部位を含む。
一態様では、増幅テンプレートは、５’末端ヌクレオチド配列及び３’末端ヌクレオチド配列を含む直鎖増幅テンプレートを含み、５’及び３’末端ヌクレオチド配列は検出配列にハイブリダイズすることができ、内部ヌクレオチド配列は検出試薬の核酸配列の相補体にハイブリダイズすることができ、増幅テンプレートの５’及び３’末端ヌクレオチド配列は内部配列と重複しない。
一態様では、増幅テンプレートは、５’末端ヌクレオチド配列及び３’末端ヌクレオチド配列を含む直鎖増幅テンプレートを含み、５’及び３’末端ヌクレオチド配列は検出配列にハイブリダイズすることができ、第１の内部配列は、アンカーオリゴヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズすることができ、第２の内部配列は、検出試薬の核酸配列の相補体にハイブリダイズすることができ、増幅テンプレートの５’及び３’末端ヌクレオチド配列は、第１及び第２の内部配列と重複しない。
一態様では、３’及び５’末端配列の長さの合計は、約１４～約２４ヌクレオチドの長さである。一態様では、３’及び５’末端配列の長さの合計は、約１４又は約１５ヌクレオチドの長さである。
一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＧＴＴＣＴＧＴＣ－３’（配列番号１６６６）の５’末端配列及び５’－ＧＴＧＴＣＴＡ－３’（配列番号１６６７）の３’末端配列を含む。
一態様では、検出オリゴヌクレオチドは、増幅テンプレートの５’末端配列に相補的な第１の配列と、増幅テンプレートの３’末端配列に相補的な隣接する第２の配列とを含む。
一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧ－３’（配列番号１６６８）のヌクレオチド配列を含む。一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡ－３’（配列番号１６６９）のヌクレオチド配列を含む。一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＧＴＴＣＴＧＴＣＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＡ－３’（配列番号１６７０）からなる配列を含む。一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＧＣＴＧＴＧＣＡＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＡ－３’（配列番号１６７１）のヌクレオチド配列を含む。
一態様では、検出オリゴヌクレオチドは、５’－ＧＡＣＡＧＡＡＣＴＡＧＡＣＡＣ－３’（配列番号１６６４）の１４又は１５個の連続したヌクレオチドを含む。
一態様では、増幅テンプレートは、長さが約５０～約７８ヌクレオチドの非天然オリゴヌクレオチド配列を含む。一態様では、増幅テンプレートの非天然オリゴヌクレオチド配列は、約５３～約７６ヌクレオチド、約５０～約７０ヌクレオチド、約５３～約６１ヌクレオチド、又は約５４～約６１ヌクレオチドの長さである。一態様では、増幅テンプレートの非天然オリゴヌクレオチド配列は、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、又は約７６ヌクレオチドの長さである。一態様では、増幅テンプレートの非天然オリゴヌクレオチド配列は、約６１ヌクレオチドの長さである。
一態様では、検出試薬の核酸配列は、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴ－３’（配列番号１６７２）の１４又は１５個の連続したヌクレオチドに対する少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。一態様では、検出試薬の核酸配列は、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴ－３’（配列番号１６７２）を含む。一態様では、検出試薬の核酸配列は、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧ－３’（配列番号１６６８）を含む。
一態様では、アンカー試薬のアンカー配列は、長さが約１０～約３０の核酸のオリゴヌクレオチドを含む。一態様では、アンカー試薬のアンカー配列は、長さが約１７又は約２５のオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む。一態様では、アンカー試薬のアンカー配列は、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡ－３’（配列番号１６６９）を含む。一態様では、アンカー試薬のアンカー配列は、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＧＣＣＧＴＣＡＡ－３’（配列番号１６６５）からなる。
一態様では、支持体表面は、１つ以上のカーボンベースの電極を含む。一態様では、支持体表面は、１つ以上のカーボンベースの電極を含むマルチウェルプレートを含む。一態様では、電極は、カーボンインク電極を含む。
一態様では、支持体表面は、１つ以上のカーボンベースの電極を含むマルチウェルプレートを含み、複数の捕捉オリゴヌクレオチドは、個別のドメインでカーボンベースの電極上に固定化されている。一態様では、複数の捕捉オリゴヌクレオチドは、アレイ内の個別の結合ドメインの支持体表面に固定化されている。
一態様では、標識は、電気化学発光（ＥＣＬ）標識を含む。一態様では、この方法は、電極を、電気化学発光共反応物を含む電気化学発光読み取り緩衝液と接触させ、電極に電位を印加することによってアッセイシグナルを生成するステップを含む。
一態様では、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドは、以下の要件、
（ａ）約４０％～約５０％のＧＣ含量と、
（ｂ）約３０％～約７０％のＡＧ含量と、
（ｃ）約３０％～約７０％のＣＴ含量と、
（ｄ）３つ以下の配列での塩基リピートの最大列と、
（ｅ）７つを超える相補的塩基対が連続して一致する列との望ましくないオリゴヌクレオチド－オリゴヌクレオチドの相互作用がないことと、
（ｆ）１８個以下の連続した塩基の列との望ましくないオリゴヌクレオチド－オリゴヌクレオチドの相互作用がないことであって、
（ｉ）両端の末端塩基が相補的に一致しており、
（ｉｉ）前記相補的塩基対の一致の合計から不一致の合計を引いたものが７より大きい、相互作用がないことと、
（ｇ）ゲノム又は自然界における配列又は配列の補体、あるいはその両方に一致する２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６塩基対以上の列がないことと、
（ｈ）それらの補体を有する配列のハイブリダイゼーションの自由エネルギーの差は、約１ｋＣａｌ／モル、約２ｋＣａｌ／モル、約３ｋＣａｌ／モル、又は約４ｋＣａｌ／モル未満であることと、
（ｉ）ステム内に４つ以上の連続した一致がある予測ヘアピンループがないことと、
（ｊ）ステム内に４つ以上の連続した一致があり、ループサイズが６塩基を超える予測ヘアピンループがないことと、のうちの１つ以上を満たす非交差反応性オリゴヌクレオチドのセットから選択される。
一態様では、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１～６４から選択される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｂ）配列番号１～６４から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｃ）配列番号１～６４から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｄ）配列番号１～６４から選択される配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｅ）（ａ）～（ｄ）のうちのいずれかから選択される捕捉オリゴヌクレオチドと、から選択される。
一態様では、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１～１０から選択される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｂ）配列番号１～１０から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｃ）配列番号１～１０から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｄ）配列番号１～１０から選択される配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｅ）（ａ）～（ｄ）のうちのいずれかから選択される捕捉オリゴヌクレオチドと、から選択される。
一態様では、サンプル中の標的ヌクレオチド配列を検出するためのキットが提供される。一態様では、このキットは、
（ａ）１つ以上の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む支持体表面と、
（ｂ）オリゴヌクレオチドタグ、標的補体、及び検出オリゴヌクレオチドを含む検出プローブと、
（ｃ）増幅テンプレートと、
（ｄ）核酸リガーゼと、
（ｅ）核酸ポリメラーゼと、
（ｆ）標識及び核酸配列を含む検出試薬と、を含む。
一態様では、このキットは、オリゴヌクレオチドタグ及びアンカーオリゴヌクレオチドを含むアンカー試薬を含む。一態様では、アンカー試薬は、支持体表面に固定化されている。一態様では、アンカーオリゴヌクレオチドは、約１０～約３０の核酸の長さである。一態様では、アンカーオリゴヌクレオチドは、１７又は２５オリゴヌクレオチドの長さである。
一態様では、キット内のアンカーオリゴヌクレオチドは、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡ－３’（配列番号１６６９）を含む。一態様では、アンカーオリゴヌクレオチドは、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＧＣＣＧＴＣＡＡ－３’（配列番号１６６５）からなる。
一態様では、キット内の増幅テンプレートは、５’末端ヌクレオチド配列及び３’末端ヌクレオチド配列を含む直鎖増幅テンプレート（５’及び３’末端ヌクレオチド配列は検出配列にハイブリダイズすることができ、内部ヌクレオチド配列はアンカー試薬のアンカー配列の相補体にハイブリダイズすることができ、増幅テンプレートの５’及び３’末端ヌクレオチド配列は内部配列と重複しない）を含む。
一態様では、キット内の増幅テンプレートは、５’末端ヌクレオチド配列及び３’末端ヌクレオチド配列を含む直鎖増幅テンプレートを含み、５’及び３’末端ヌクレオチド配列は、検出配列にハイブリダイズすることができ、第１の内部ヌクレオチド配列は、アンカー試薬のアンカー配列の相補体にハイブリダイズすることができ、第２の内部ヌクレオチド配列は、検出試薬の核酸配列の相補体にハイブリダイズすることができ、増幅テンプレートの５’及び３’末端ヌクレオチド配列は、第１及び第２の内部配列と重複しない。一態様では、増幅テンプレートは、５’末端ホスフェート基を含む。
一態様では、キット内の増幅テンプレートは、約５３～約６１ヌクレオチドの長さである。一態様では、５’及び３’末端配列の長さの合計は、約１４～約２４ヌクレオチドの長さである。一態様では、３’及び５’末端配列の長さの合計は、約１４～約１９ヌクレオチドの長さである。一態様では、３’及び５’末端配列の長さの合計は、約１４又は約１５ヌクレオチドの長さである。
一態様では、キット内の増幅テンプレートは、５’－ＧＴＴＣＴＧＴＣ－３’（配列番号１６６６）の５’末端配列及び５’－ＧＴＧＴＣＴＡ－３’（配列番号１６６７）の３’末端配列を含む。一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧ－３’（配列番号１６６８）のヌクレオチド配列を含む。一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡ－３’（配列番号１６６９）のヌクレオチド配列を含む。一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＧＴＴＣＴＧＴＣＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＡ－３’（配列番号１６７０）からなる配列を含む。一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＧＣＴＧＴＧＣＡＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＡ－３’（配列番号１６７１）のヌクレオチド配列を含む。
一態様では、キット内の増幅テンプレートは、環状増幅テンプレートを含む。
一態様では、キット内の検出プローブは、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグ、一本鎖ＲＮＡ標的相補体、及び一本鎖ＤＮＡ検出オリゴヌクレオチドを含む。
一態様では、キット内のアンカー試薬は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグ及び一本鎖ＤＮＡアンカー配列を含む。
一態様では、キットは、ＲＮａｓｅを含む。
一態様では、キット内の検出プローブの検出オリゴヌクレオチドは、増幅テンプレートの５’末端配列に相補的な第１の配列と、増幅テンプレートの３’末端配列に相補的な隣接する第２の配列とを含む。
一態様では、キット内の検出試薬の核酸配列は、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴ－３’（配列番号１６７２）の１４又は１５個の連続したヌクレオチドに対する少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。一態様では、検出試薬の核酸配列は、配列５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴ－３’（配列番号１６７２）を含む。一態様では、検出試薬の核酸配列は、配列５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧ－３’（配列番号１６６８）を含む。
一態様では、キット内の検出試薬の標識は、電気化学発光（ＥＣＬ）標識を含む。
一態様では、キット内の支持体表面は、カーボンベースの支持体表面を含む。一態様では、支持体表面は、カーボンベースの電極を含む。一態様では、支持体表面は、カーボンインク電極を含む。一態様では、支持体表面はマルチウェルプレートアッセイの消耗品を含み、プレートの各ウェルはカーボンインク電極を含む。一態様では、支持体表面は、ビーズを含む。
一態様では、複数の捕捉オリゴヌクレオチドが、個別の結合ドメイン内のキットの固相支持体上に固定化され、アレイを形成する。一態様では、複数捕捉オリゴヌクレオチド及び少なくとも１つのアンカー試薬は、個別の結合ドメイン内の固相支持体上に固定化され、アレイを形成し、各結合ドメインは、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つ及び少なくとも１つのアンカー試薬を含む。
一態様では、キットの支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドは、以下の要件、
（ａ）約４０％～約５０％のＧＣ含量と、
（ｂ）約３０％～約７０％のＡＧ含量と、
（ｃ）約３０％～約７０％のＣＴ含量と、
（ｄ）３つ以下の配列での塩基リピートの最大列と、
（ｅ）７つを超える相補的塩基対が連続して一致する列との望ましくないオリゴヌクレオチド－オリゴヌクレオチドの相互作用がないことと、
（ｆ）１８個以下の連続した塩基の列との望ましくないオリゴヌクレオチド－オリゴヌクレオチドの相互作用がないことであって、
（ｉ）両端の末端塩基が相補的に一致しており、
（ｉｉ）前記相補的塩基対の一致の合計から不一致の合計を引いたものが７より大きい、相互作用がないことと、
（ｇ）ゲノム又は自然界における配列又は配列の補体、あるいはその両方に一致する２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６塩基対以上の列がないことと、
（ｈ）それらの補体を有する配列のハイブリダイゼーションの自由エネルギーの差は、約１ｋＣａｌ／モル、約２ｋＣａｌ／モル、約３ｋＣａｌ／モル、又は約４ｋＣａｌ／モル未満であることと、
（ｉ）ステム内に４つ以上の連続した一致がある予測ヘアピンループがないことと、
（ｊ）ステム内に４つ以上の連続した一致があり、ループサイズが６塩基を超える予測ヘアピンループがないことと、のうちの１つ以上を満たす非交差反応性オリゴヌクレオチドのセットから選択される。
一態様では、キットの支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１～６４から選択される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｂ）配列番号１～６４から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｃ）配列番号１～６４から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｄ）配列番号１～６４から選択される配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｅ）（ａ）～（ｄ）のうちのいずれかから選択される捕捉オリゴヌクレオチドと、から選択される。
一態様では、キットの支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１～１０から選択される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｂ）配列番号１～１０から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｃ）配列番号１～１０から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｄ）配列番号１～１０から選択される配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｅ）（ａ）～（ｄ）のうちのいずれかから選択される捕捉オリゴヌクレオチドと、から選択される。
一態様では、サンプル中の標的ヌクレオチド配列を検出するためのキットが提供され、
（ａ）１つ以上の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む支持体表面と、
（ｂ）オリゴヌクレオチドタグ及びアンカーオリゴヌクレオチドを含むアンカー試薬と、
（ｃ）オリゴヌクレオチドタグ、標的補体、及び一本鎖ＤＮＡ検出オリゴヌクレオチドを含む検出プローブと、
（ｄ）電気化学発光（ＥＣＬ）標識及び核酸配列を含む検出試薬と、
（ｅ）５’末端ヌクレオチド配列及び３’末端ヌクレオチド配列を含む直鎖増幅テンプレートであって、５’及び３’末端ヌクレオチド配列は、検出配列にハイブリダイズすることができ、第１の内部ヌクレオチド配列は、アンカー試薬のアンカー配列の相補体にハイブリダイズすることができ、第２の内部ヌクレオチド配列は、検出試薬の核酸配列の相補体にハイブリダイズすることができ、増幅テンプレートの５’及び３’末端ヌクレオチド配列は、第１及び第２の内部配列と重複しない、直鎖増幅テンプレートと、
（ｆ）核酸リガーゼと、
（ｇ）核酸ポリメラーゼと、を含む。
一態様では、アンカー試薬は、キットの支持体表面に固定化されている。一態様では、アンカー試薬は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグ及び一本鎖ＤＮＡアンカーオリゴヌクレオチドを含み、検出プローブは、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグ、一本鎖ＲＮＡ標的補体及び一本鎖ＤＮＡ検出オリゴヌクレオチドを含み、キットは、ＲＮａｓｅを更に含む。
一態様では、サンプル中の標的ヌクレオチド配列を検出するためのキットが提供され、
（ａ）固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む支持体表面と、
（ｂ）一本鎖オリゴヌクレオチドタグ及びサンプル中の標的ヌクレオチド配列の第１の領域に相補的である第１の核酸配列を含む標的化プローブと、
（ｃ）検出オリゴヌクレオチド及び標的ヌクレオチド配列の第２の領域に相補的である第２の核酸配列を含む検出プローブであって、標的化プローブの第１の核酸配列及び検出プローブの第２の核酸配列が、標的ヌクレオチドの隣接する配列に相補的である、検出プローブと、
（ｄ）増幅テンプレートと、
（ｅ）核酸リガーゼと、
（ｆ）核酸ポリメラーゼと、
（ｇ）標識及び核酸配列を含む検出試薬と、を含む。
一態様では、標的化プローブは、検出プローブの５’末端ヌクレオチドが相補的である領域に隣接する標的ヌクレオチド配列の領域に相補的な末端３’ヌクレオチドを有する。一態様では、標的化プローブの末端３’ヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列の多型ヌクレオチドに相補的である。
一態様では、サンプル中の標的ヌクレオチド配列を検出するためのキットが提供され、
（ａ）固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む支持体表面と、
（ｂ）オリゴヌクレオチドタグ及びアンカーオリゴヌクレオチドを含むアンカー試薬と、
（ｃ）一本鎖オリゴヌクレオチドタグ及びサンプル中の標的ヌクレオチド配列の第１の領域に相補的である第１の核酸配列を含む標的化プローブと、
（ｄ）検出オリゴヌクレオチド及び標的ヌクレオチド配列の第２の領域に相補的である第２の核酸配列を含む検出プローブであって、標的化プローブの第１の核酸配列及び検出プローブの第２の核酸配列が、標的ヌクレオチドの隣接する配列に相補的である、検出プローブと、
（ｅ）５’末端ヌクレオチド配列及び３’末端ヌクレオチド配列を含む直鎖増幅テンプレートであって、５’及び３’末端ヌクレオチド配列は、検出配列にハイブリダイズすることができ、第１の内部ヌクレオチド配列は、アンカー試薬のアンカー配列の相補体にハイブリダイズすることができ、第２の内部ヌクレオチド配列は、検出試薬の核酸配列の相補体にハイブリダイズすることができ、増幅テンプレートの５’及び３’末端ヌクレオチド配列は、第１及び第２の内部配列と重複しない、直鎖増幅テンプレートと、
（ｆ）核酸リガーゼと、
（ｇ）核酸ポリメラーゼと、
（ｈ）電気化学発光（ＥＣＬ）標識及び核酸配列を含む検出試薬と、を含む。
一態様では、キットは、直鎖増幅テンプレート並びにライゲーション緩衝液、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、及びこれらの組み合わせから選択される１つ以上の追加の成分を含む検出混合物を含む。一態様では、検出混合物は、ＢＳＡ、緩衝液、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、又はそれらの組み合わせから選択される、ローリングサークル増幅のための１つ以上の成分を含む。一態様では、検出混合物は、アセチルＢＳＡを含む。
一態様では、キットは、ＥＣＬ読み取り緩衝液を含む。
オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）ハイブリダイゼーションステップの概略図である。 ＯＬＡライゲーションステップの概略図である。 ＯＬＡ検出ステップの概略図である。 ハイブリダイゼーションが起こらないＯＬＡプローブの不一致の概略図である。 プローブの３’末端に標識ｄｄＮＴＰが付加されたプライマー伸長アッセイ（ＰＥＡ）の概略図である。 プローブの３’末端に非標識ｄｄＮＴＰが付加されたＰＥＡの概略図である。 捕捉オリゴヌクレオチドと電極との間のリンカー（又はスペーサー）の長さを変化させた場合の、プローブの捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーション及び電気化学発光を使用した検出に対する効果を示すグラフである。 捕捉オリゴヌクレオチドアレイ洗浄条件が異なる場合の、アレイの１つの要素に特異的なオリゴヌクレオチドプローブの測定された交差反応性に対する効果を示すグラフである。 標的ＢＲＡＦ遺伝子領域を含有する核酸テンプレートの濃度の関数としてのＢＲＡＦ変異の電気化学発光ＯＬＡのアッセイシグナルを比較し、変異配列と野生型配列で生成されたシグナルを比較するグラフである。 電気化学発光ＯＬＡのパネルによって生成されたアッセイシグナルを、それらの特異的標的配列の濃度の関数として示すグラフである。 ブロッキングオリゴヌクレオチドを含めることにより、電気化学発光ＯＬＡのパネルのブリッジングバックグラウンドシグナルを低減することができることを示すグラフである。 ブロッキングオリゴヌクレオチドを含めるか、高ストリンジェンシーの高温浸漬ステップを追加することにより、プローブの捕捉オリゴヌクレオチドへの非特異的結合による電気化学発光ＯＬＡのバックグラウンドの上昇を低減することができることを示すグラフである。 変異体ＢＲＡＦ及びＮＲＡＳ配列の予測パーセンテージに対する、変異細胞と野生型細胞の混合物から抽出されたＰＣＲ増幅ゲノムＤＮＡから得られた電気化学発光ＯＬＡの変異配列の実際のパーセンテージを示す。 ＢＲＡＦ １７９９Ｔ＞Ａ変異の電気化学発光ＰＥＡのアッセイシグナルを、変異配列及び野生型配列を表すテンプレート核酸の濃度の関数として示し、アッセイが変異配列に特異的であることを示している。 ＢＲＡＦ及びＮＲＡＳ ＳＮＰの電気化学発光ＰＥＡのパネルが、入力ＤＮＡ濃度に対して線形応答を示したことを示すグラフである。 変異体ＢＲＡＦ １７９９Ｔ＞Ａ配列の予測パーセンテージに対する、変異細胞と野生型細胞の混合物から抽出されたＰＣＲ増幅ゲノムＤＮＡを測定する電気化学発光ＢＲＡＦ １７９９Ｔ＞Ａ ＯＬＡアッセイを使用した変異配列の実際のパーセンテージを示す。 変異体ＮＲＡＳ １８１Ｃ＞Ａ配列の予測パーセンテージに対する、変異細胞と野生型細胞の混合物から抽出されたＰＣＲ増幅ゲノムＤＮＡを測定する電気化学発光ＮＲＡＳ １８１Ｃ＞Ａ ＯＬＡアッセイを使用した変異配列の実際のパーセンテージを示す。 変異体１８２Ａ＞Ｔ配列の予測パーセンテージに対する、変異細胞と野生型細胞の混合物から抽出されたＰＣＲ増幅ゲノムＤＮＡを測定する電気化学発光１８２Ａ＞Ｔ ＯＬＡアッセイを使用した変異配列の実際のパーセンテージを示す。 本明細書の実施形態に記載されるように、オリゴヌクレオチド代謝産物を含有し得るサンプル中の標的ヌクレオチド配列、例えば治療用オリゴヌクレオチドの検出、同定、及び／又は定量化のためのオリゴヌクレオチドライゲーション増幅（ＯＬＡ）アッセイを示す。 本明細書の実施形態に記載されるように、オリゴヌクレオチド代謝産物を含有し得るサンプル中の標的ヌクレオチド配列、例えば、治療用オリゴヌクレオチドの検出、同定、及び／又は定量化のための直接ハイブリダイゼーション方法を示す。 本明細書の実施形態に記載されるように、オリゴヌクレオチド代謝産物を含有し得るサンプル中の標的ヌクレオチド配列、例えば、治療用オリゴヌクレオチドの検出、同定、及び／又は定量化のための直接表面コーティングを有するヌクレアーゼ保護アッセイ（ＮＰＡ）を示す。 本明細書の実施形態に記載されるように、オリゴヌクレオチド代謝産物を含有し得るサンプル中の標的ヌクレオチド配列、例えば、治療用オリゴヌクレオチドの検出、同定、及び／又は定量化のためのハイブリダイゼーション／保護アッセイを示す。 サンプル中の抗体、例えば、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の検出、同定、及び／又は定量化のためのサンドイッチアッセイを示す。 ＡＳＯ配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む陽性対照オリゴヌクレオチドによってブリッジングされた標的化プローブ及び検出プローブの概略図として示されている。 サンプル中の抗体、例えば、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の検出、同定、及び／又は定量化のための、図１９に示されるサンドイッチアッセイの修飾を示す。 本明細書に記載のシグナル増幅のための検出オリゴヌクレオチドを用いた標的オリゴヌクレオチド配列の検出方法の概略図である。 本明細書に記載されるように、検出オリゴヌクレオチドを含む反応生成物を支持体表面に固定化するための方法の概略図である。 ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）による検出複合体の検出方法の概略であり、検出複合体は、アンカーオリゴヌクレオチドを介して支持体表面に固定化されている。 図２３Ａ及びＢに示される方法で使用するためのプローブ及びアンカー試薬のオリゴヌクレオチド配列の例を提供する。
Ａ．定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈上別段の必要がない限り、単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形、例えば「ａ」又は「ａｎ」が含まれ、複数形、例えば「１つ以上」又は「少なくとも１つ」が含まれ、「又は」という用語は、代替案のみを指すように明示的に示されていない限り、又は代替案が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味することができる。「含むこと」、「含む」及び「含まれる」という用語は、限定するものではない。本明細書で提供される任意のタイプの範囲には、説明されている特定の範囲内の全ての値、及び特定の範囲の端点に関する値が含まれる。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、例えば、組成物中の成分の量、濃度、体積、処理温度、処理時間、収率、流速、圧力、及びそれらの範囲を変更するために使用され、本発明を説明する際に使用される。「約」という用語は、例えば、化合物、組成物、濃縮物、又は製剤を作製するために使用される典型的な測定及び処理手順によって、これらの手順での偶発的なエラーによって、方法を実行するために使用される出発材料又は成分の製造、供給源、又は純度の違い、及び他の同様の考慮事項によって、発生する数値の変動の多様性を指す。「約」という用語はまた、特定の初期濃度又は混合物を有する製剤のエージングのために異なる量、及び特定の初期濃度又は混合物を有する製剤を混合又は処理するために異なる量を包含する。「約」という用語で修飾されている場合、本明細書に添付される特許請求の範囲には、このような同等物が含まれる。
本明細書で使用される場合、「間」という単語を使用して表される範囲は、範囲の端点を含む。したがって、例えば、５０℃～７０℃の範囲は、５０℃～７０℃を含み、すなわち、それは、５０℃及び７０℃の端点を含む。
一般に、細胞及び組織培養、分子生物学、並びに本明細書に記載のタンパク質及びオリゴ又はポリヌクレオチドの化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、及びそれらの技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。アミノ酸は、本明細書では、それらの一般的に既知である３文字記号又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される１文字記号のいずれかによって参照され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に認められている一文字コードによって参照され得る。
「標的分析物」としては、本明細書に記載の方法及びキットによって検出及び分析することができる任意の目的の分子を挙げてもよいが、核酸、タンパク質、炭水化物、糖、及び脂質などの生物学的分子を挙げることができる。一態様では、標的分析物は、標的ヌクレオチド配列である。別の態様では、標的分析物は、タンパク質である。一態様では、標的分析物は、ＤＮＡ結合タンパク質である。「標的分析物」という用語は、目的の分子全体、又は目的の分子のセグメント若しくは部分を指すことができる。一態様では、標的分析物は、修飾された分子、例えば、目的の分子の標識された、切断された、又は化学的若しくは酵素的に処理されたバージョンを含む。
「標的ヌクレオチド配列」としては、原核生物又は真核生物のＤＮＡ生物のＤＮＡ又はＲＮＡに見られる配列を挙げてもよいが、これらに限定されない、任意の目的のヌクレオチド配列を挙げることができる。これらとしては、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ、一本鎖若しくは二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、又はＤＮＡ／ＲＮＡモザイクを挙げてもよい。標的ヌクレオチド配列としては、ｍｉＲＮＡ、治療用ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡウイルス、又はそれらの組み合わせを挙げることができる。二本鎖ヌクレオチド配列の場合、標的ヌクレオチド配列はどちらの鎖でも同定することができる。標的ヌクレオチド配列は、抽出、例えば、核ＤＮＡ又はウイルスゲノムＤＮＡ若しくはＲＮＡを必要とし得るか、あるいはサンプル、例えば、血清若しくは血漿中の無細胞胎児ＤＮＡ若しくは無細胞腫瘍ＤＮＡ又は循環中の治療用オリゴヌクレオチドにおいて直接操作され得る。標的ヌクレオチド配列は、生物学的サンプルから直接単離することができるか、又は生物学的サンプルからの増幅された配列を含むことができる。増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）逆転写それに続くポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、又はローリングサークル増幅（ＲＣＡ）が知られており、かつ挙げられるが、これに限定されない。本明細書の増幅方法に適したポリメラーゼとしては、例えば、ＤＮＡ増幅のためのＴａｑ、Ｐｈｉ、Ｂｓｔ、及びＶｅｎｔ－ｅｘｏ、並びに例えば、ＲＮＡ増幅のためのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
標的ヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド、例えば、治療用オリゴヌクレオチドであり得る。本明細書で使用される「治療用オリゴヌクレオチド」は、生体分子と相互作用して治療効果を提供することができるオリゴヌクレオチドを指す。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。ＡＳＯは、ＲＮＡプロセシングに影響を及ぼし、かつ／又はタンパク質発現を調節することができる。ＡＳＯは、一本鎖ＲＮＡに結合してＲＮＡを不活性化する一本鎖オリゴヌクレオチドである。ＡＳＯは、典型的には約５、１０、１５、２０又は２５ヌクレオチド～約３０、３５、４０、４５又は５０ヌクレオチドの長さである一本鎖オリゴヌクレオチドである。一態様では、ＡＳＯは、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合し、それによって遺伝子を不活性化する。一態様では、遺伝子は、疾患遺伝子である。したがって、ＡＳＯは、疾患遺伝子のｍＲＮＡを不活性化して、特定の疾患の原因となるタンパク質の産生を防止又は改善することができる。一態様では、ＡＳＯは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの組み合わせを含む。治療用オリゴヌクレオチド及びＡＳＯは、例えば、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７６４：１－１５（２０１１）、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ５９：６０５－６３０（２０１９）、及びＳｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２５（５）：１０６９－１０７５（２０１７）に更に記載されている。
一態様では、標的分析物は、抗薬物抗体（ＡＤＡ）である。本明細書で使用される場合、「抗薬物抗体」又は「ＡＤＡ」は、バイオ医薬製品に対して生物においてインビボで誘発される抗体である。ＡＤＡは、タンパク質及び抗体を含むがこれらに限定されない治療用ポリペプチド、並びにアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、短鎖干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの合成ガイド鎖を含むがこれらに限定されない治療用オリゴヌクレオチドなどのバイオ医薬品に対して誘発することができる。ＡＤＡは、結合抗体と呼ばれるバイオ医薬製品に結合することができる任意の抗体アイソタイプを含むことができ、中和抗体と呼ばれる治療用製品の機能的活性を阻害することができる結合抗体の亜集団を含むこともできる。ＡＤＡの検出は、免疫原性の重要な尺度であり得、バイオ医薬製品の安全性及び有効性の両方に影響を与える可能性がある。
サンプル中の治療用オリゴヌクレオチドなどの標的ヌクレオチド配列は、ヌクレアーゼの存在、温度、ｐＨ、塩濃度などの様々な要因のために、経時的に分解、すなわち短縮する可能性がある。標的ヌクレオチド配列の分解生成物は、オリゴヌクレオチド代謝産物とも呼ばれる。一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、標的ヌクレオチド配列よりも１ヌクレオチド以上、２ヌクレオチド以上、３ヌクレオチド以上、４ヌクレオチド以上、５ヌクレオチド以上、６ヌクレオチド以上、７ヌクレオチド以上、８ヌクレオチド以上、９ヌクレオチド以上、１０ヌクレオチド以上、１５ヌクレオチド以上、又は２０ヌクレオチド以上短い。一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、標的ヌクレオチド配列よりも約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、又は約１０％短い。一態様では、本開示のサンプルは、標的ヌクレオチド配列、例えば、治療用オリゴヌクレオチド、及び１つ以上のオリゴヌクレオチド代謝産物、例えば、治療用オリゴヌクレオチド代謝産物を含む。
一態様では、標的ヌクレオチド配列は、治療用オリゴヌクレオチドである。特定の態様では、サンプル中の治療用オリゴヌクレオチドの分解は、治療用オリゴヌクレオチドに対する薬力学的応答を示す。本明細書では治療用オリゴヌクレオチド代謝産物とも呼ばれる、分解又は短縮された治療用オリゴヌクレオチドは、治療有効性を失う可能性がある。本開示の方法を使用して、オリゴヌクレオチド代謝産物、例えば、治療用オリゴヌクレオチド代謝産物と比較して、標的ヌクレオチド配列、例えば、治療用オリゴヌクレオチドの量を測定することができる。一態様では、本開示の方法を使用して、標的ヌクレオチド配列、例えば、治療用オリゴヌクレオチドの薬物動態パラメータを決定する。一態様では、標的ヌクレオチド配列、例えば治療用オリゴヌクレオチドの薬物動態パラメータは、生物学的環境、例えば患者における標的ヌクレオチド配列、例えば治療用オリゴヌクレオチドの分解の速度及び／又は分解量を測定することによって決定される。一態様では、測定される薬物動態パラメータは、クリアランス、体積分布、血漿濃度、半減期、ピーク時間、ピーク濃度、利用可能率、又はそれらの組み合わせである。薬物動態パラメータの測定及び解釈の更なる議論は、例えば、Ｂｅｎｅｔ，Ｅｕｒ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｄｉｓ Ｓｕｐｐｌ １３４：４５－６１（１９８４）及びＬｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，”Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｖｅｒｓｉｏｎ，ｒｅｖｉｓｅｄ Ｍａｙ ２０１９に見出すことができる。サンプル中に存在するオリゴヌクレオチド代謝産物は、サンプル中の標的ヌクレオチド配列の検出、同定、及び／又は定量化にも干渉する可能性がある。したがって、サンプルからオリゴヌクレオチド代謝産物を除去することが望ましい場合がある。したがって、本開示の方法はまた、例えば、標的ヌクレオチド配列の量のより正確な測定値を得るために、サンプルからオリゴヌクレオチド代謝産物を低減及び／又は除去するために使用することもできる。
一態様では、標的分析物は、オリゴヌクレオチドタグ及び標識を含む「反応生成物」を生成するために使用され得る標的オリゴヌクレオチドである。様々な方法を使用して、反応生成物を生成することができる。一態様では、反応生成物は、サンドイッチアッセイ、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、プライマー伸長アッセイ（ＰＥＡ）、直接ハイブリダイゼーションアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのアッセイ又は他の標的増幅アッセイ、及びヌクレアーゼ保護アッセイを含むがこれらに限定されない、方法によって生成される。一態様では、反応生成物は、検出プローブ及び／又は標的化プローブがハイブリダイズされる標的オリゴヌクレオチドを含む「ハイブリダイゼーション複合体」である。一態様では、ハイブリダイゼーション複合体は、核酸リガーゼが標的化及び検出プローブを連結する条件下で、核酸リガーゼの存在下でインキュベートすることができる。一態様では、反応生成物は、オリゴヌクレオチドタグ及び標識を含む。一態様では、反応生成物は、オリゴヌクレオチド及び検出オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、反応生成物は、標的オリゴヌクレオチド並びにオリゴヌクレオチドタグ、標的補体、及び検出オリゴヌクレオチドを含む検出プローブを含む。一態様では、標的相補体は、標的オリゴヌクレオチドの核酸配列に相補的な核酸配列を含む。一態様では、検出プローブは、標的補体と標的オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイズによって、標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。一態様では、反応生成物は、本明細書に記載されるように「サンドイッチ錯体」である。
一態様では、「検出複合体」は、反応生成物を支持体表面に固定化することによって形成される。一態様では、反応生成物は、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドと、反応生成物に存在するオリゴヌクレオチドタグの相補的ヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションによって支持体表面に固定化される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」は、３つのステップ：（１）二本鎖ＤＮＡテンプレートを加熱して鎖を分離する変性と、（２）プライマーが標的ＤＮＡ配列に隣接する領域に結合するアニールと、（３）ＤＮＡポリメラーゼがテンプレート鎖に沿って各プライマーの３’末端を伸長させる伸長と、の繰り返しサイクルを含む標的ヌクレオチド配列を増幅するために使用される技術を指す。ＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを利用することができる。
「ヌクレオチド」は、窒素塩基、五炭素糖（リボース又はデオキシリボース）及び少なくとも１つのリン酸基を含むモノマー単位を指す。ヌクレオチドとしては、ＲＮＡで見られるＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＧ及びＧＴＰ、ＤＮＡで見られるデオキシリボヌクレオシド三リン酸、最も一般にｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、並びに例えば、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰとしてポリメラーゼを介した伸長のために必要な３’－ＯＨを欠いている、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）などのリボヌクレオシド三リン酸が挙げられる。
「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴ」は、約５～約１００、約１０～約５０、若しくは約１０～約２５ヌクレオチドの長さ、又は少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、若しくは５０～最大約５０、７５、若しくは１００ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を有する核酸を指す。本明細書に記載のプローブ、プライマー、タグ、又は捕捉オリゴヌクレオチドを含むがこれらに限定されないオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ－ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｋｅｙ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｏｒ ｄｅｏｘｙｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２２（２）：１８５９－１８６２によって記述されたホスホルアミダイト法、又はＭａｔｔｅｕｃｃｉ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｎ ａ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｕｐｐｏｒｔ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３（１１）：３１８５－３１９１によるトリエステル法を含む既知の方法を使用して調製され得る。
例えば、本開示の標的配列又はオリゴヌクレオチド試薬中のものを含む、本開示のヌクレオチド及び核酸は、ハイブリダイゼーション反応にも関与することができる非天然の化学構造を含む構造類似体を含み得る。一例では、ヌクレオチド又は核酸は、それを標識に連結するか、又は、例えば、アミン又はチオール修飾ヌクレオチド塩基、リン酸又は糖の使用を介して、標識に連結することができる反応性官能基を提供する化学修飾を含み得る。「反応性官能基」という用語は、例えば、別の官能基と共有結合を形成するために、更なる化学反応を受けることができる原子又は原子の関連する基を指す。反応性官能基の例としては、アミノ、チオール、ヒドロキシ、及びカルボニル基が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、反応性官能基は、チオール基を含む。これらの化学修飾を介してヌクレオチド又は核酸に連結することができる標識としては、ビオチン、ハプテン、フルオロフォア、及び電気化学発光（ＥＣＬ）標識などの検出可能な部分が挙げられるが、これらに限定されない。
別の態様では、ヌクレオチドは、例えば、リボース又はデオキシリボース基をジデオキシリボースで置き換えることによって、それが組み込まれている核酸鎖の酵素的又は化学的伸長を防止するように修飾することができる。別の例では、ヌクレオチド塩基（例えば、糖又はリン酸基）を一緒に連結する骨格成分は、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の使用によって、又は２’－Ｏ－メチル置換ＲＮＡ、ロックド核酸、架橋核酸、及びモルホリノ核酸に見られるものなどのリボース類似体の組み込みによって、修飾又は置き換えることができる。これらの「骨格」類似体は、核酸又はオリゴヌクレオチドの骨格結合の１つ、一部、又は全てに存在し得、結合安定性又はヌクレアーゼへの結合の安定性が改善されたハイブリダイゼーション生成物などの特定の利点を提供し得る。ヌクレオチド及び核酸構造類似体の別の例では、非天然ヌクレオチド塩基が含まれ得る。非天然（「非カノニカル」塩基とも呼ばれる）は、天然（カノニカルな）塩基とハイブリダイズするか、又は別の非天然塩基とハイブリダイズする可能性がある。
「単離された」とは、標的分析物、例えば、ポリペプチド又はタンパク質、あるいは通常はその天然に存在する環境でそれに付随又は相互作用する他の配列若しくは成分を実質的又は本質的に含まないオリゴヌクレオチド若しくは核酸配列を指す。一態様では、単離されたヌクレオチド配列は、その自然環境において核酸配列には見られない成分又は配列を含む。「単離された」という用語はまた、そのような非天然又は組換えで産生された配列が自然界に見出されないので、非天然又は組換えで産生されたオリゴヌクレオチド若しくはタンパク質配列を含む。特に、非天然オリゴヌクレオチド又は組換えで産生されたオリゴヌクレオチドは、天然に存在することが見出されない、すぐに隣接する配列を有し得る。
本明細書で使用される場合、「多様体」という用語は、参照ポリペプチド又はオリゴヌクレオチド配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるか、あるいは少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の参照配列の連続したアミノ酸若しくはヌクレオチドを含む、ポリペプチド又はオリゴヌクレオチド配列を指す。
「同一」という用語は、２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド配列が、比較ウィンドウ上の同じ位置に、それぞれ同一の核酸塩基又は同一のアミノ酸残基を含むことを意味する。「配列同一性％」という用語は、比較ウィンドウ上で２つの整列した配列を比較し、両方の配列で同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が出現する位置の数を決定して、一致する位置の数を算出し、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを算出することによって決定することができる。比較ウィンドウには、完全長配列が含まれる場合もあれば、より大きな配列の一部が含まれる場合もある。ＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、又はＥＮＴＲＥＺを含むがこれらに限定されない、２つ又は配列間のパーセント同一性を決定するための様々な方法及びアルゴリズムが知られている。
「捕捉オリゴヌクレオチド」は、支持体表面に固定化することができ、相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする（したがって、表面に捕捉する）ように設計されるオリゴヌクレオチド試薬を指す。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的反応生成物上に存在する一本鎖オリゴヌクレオチドタグと選択的にハイブリダイズすることができる一本鎖配列である。捕捉オリゴヌクレオチドは、固体形態で、例えば、凍結乾燥されて、溶液中で、又は支持体表面、例えば、粒子（例えば、微粒子、ビーズ）上に又はアレイに固定化されて提供され得る。２つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドが一緒に提供され得る。一緒に提供される２つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドの例としては、本明細書に記載の親捕捉オリゴヌクレオチドのセット又はサブセット（本明細書ではセットとも呼ばれる）が挙げられる。
「アンカー試薬」は、検出複合体を支持体表面に固定するのを助けるために支持体表面に固定化することができる化合物を指す。アンカー試薬は、オリゴヌクレオチド配列、アプタマー、アプタマーリガンド、抗体、抗原、リガンド、受容体、ハプテン、エピトープ、又はミモトープを含み得る。一態様では、アンカー試薬は、アンカーオリゴヌクレオチドを含む。一態様では、アンカーオリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、アンカーオリゴヌクレオチドは、検出複合体に結合した伸長配列又はアンプリコンのアンカー配列相補体の核酸配列に相補的な核酸配列を有するアンカー配列を含む。一態様では、アンカー試薬は、アンカー配列及びオリゴヌクレオチドタグを含む。一態様では、アンカー配列は、支持体表面に直接的に付着している。一態様では、アンカー配列は、オリゴヌクレオチドタグと、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションによって、支持体表面に間接的に付着している。一態様では、アンカー配列は、ＤＮＡ配列である。一態様では、アンカー配列は、ＲＮＡ配列である。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡ配列である。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡ配列である。一態様では、アンカー配列は、ＤＮＡ配列であり、オリゴヌクレオチドタグ配列は、ＤＮＡ配列である。
「プローブ」又は「プライマー」は、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド配列を含む試薬を指す。プローブは、標的ヌクレオチド配列の一部に相補的又は実質的に相補的である一本鎖配列を含むことができる。一態様では、プローブは、捕捉オリゴヌクレオチドに相補的であるオリゴヌクレオチドタグ配列（本明細書では指向性配列と呼ばれることもある）を含む。一態様では、プローブは、標識を含む。一態様では、プローブは、オリゴヌクレオチドタグ及び標識を含む。一態様では、プローブは、オリゴヌクレオチドタグ及び検出オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、標的ヌクレオチド配列及びオリゴヌクレオチドタグ配列に相補的である配列は、プローブ内の同じ核酸鎖上に存在する。一態様では、標的ヌクレオチド配列及びオリゴヌクレオチドタグ配列に相補的である配列は、プローブ内の異なる鎖上に存在し、例えば、プローブは、標的配列及びブリッジング配列に相補的な配列を有する第１の鎖と、タグ配列及び第１の鎖上のブリッジング配列に相補的な配列を有する第２の鎖とを含む場合があり、第１及び第２の鎖がハイブリダイズするか、又はブリッジング配列を介してハイブリダイズすることができる。プローブは、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はそれらの組み合わせであり得、修飾された核酸塩基類似体を含有し得るか、又は標識若しくは標識を付着するのに適したリンカーによって修飾されている。プローブは、標的ヌクレオチド配列へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さでなければならず、典型的には、約５～約１００、約１０～約５０、約２０～約３０、又は少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、若しくは２５、及び最大約３０、３５、４０、４５、５０、７５又は１００ヌクレオチドの長さでなければならない。プローブは、化学的若しくは酵素的合成を含む当該技術分野で知られている任意の適切な方法によって、又は非特異的核酸切断化学物質若しくは酵素を使用するより大きな核酸の切断によって、又は部位特異的制限エンドヌクレアーゼを用いて調製することができる。いくつかの用途では、標的配列の相補的領域にハイブリダイズするプローブは、ポリメラーゼによるプローブの伸長をプライミングすることができ、標的配列上の隣接する一本鎖領域の複製の開始点として機能する。
「標的化プローブ」は、標的補体及びオリゴヌクレオチドタグを含むプローブを指す。一態様では、標的相補体は、サンプル中の標的オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列配列を有するオリゴヌクレオチドである。一態様では、標的相補体は、一本鎖オリゴヌクレオチドである。一態様では、標的相補体は、ＤＮＡ配列である。一態様では、標的相補体は、ＲＮＡ配列である。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、一本鎖オリゴヌクレオチドである。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を有する。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡ配列である。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡ配列である。
「検出プローブ」は、標的補体及び標識を含むオリゴヌクレオチドプローブを指す。一態様では、標的相補体は、サンプル中の標的ヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド配列を含む。一態様では、標識は、電気化学発光（ＥＣＬ）標識などの検出可能な標識である。一態様では、標識は、検出可能な標識を付着させるのに好適な結合パートナーを含む。一態様では、標識は、ビオチンを含み、ストレプトアビジン又はアビジンを含む検出可能な標識に結合することができる。一態様では、標識は、当該技術分野で既知のオリゴヌクレオチド増幅技術を使用して伸長又は増幅することができる検出オリゴヌクレオチド配列を含む。一態様では、検出オリゴヌクレオチドは、標識された検出試薬がハイブリダイズすることができる１つ以上、又は複数の検出標識部位を含む伸長配列（又はアンプリコン）を形成するように伸長する。一態様では、伸長配列（又はアンプリコン）は、アンカーオリゴヌクレオチドの核酸配列に相補的であり、アンカーオリゴヌクレオチドの核酸配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有するアンカー配列相補体を含む。一態様では、アンカー配列補体は、支持体表面に固定化されたアンカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、検出複合体を支持体表面に固定化する。一態様では、支持体表面に固定化された検出複合体に付着した伸長配列が検出される。一態様では、検出プローブは、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドタグを含む。一態様では、反応生成物は、オリゴヌクレオチドタグ、標的相補体、及び標識を含む。一態様では、検出プローブは、オリゴヌクレオチドタグ、標的補体、及び検出オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡ配列である。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、ＲＮＡ配列である。一態様では、標的相補体は、ＤＮＡ配列である。一態様では、標的相補体は、ＲＮＡ配列である。一態様では、検出オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ配列である。一態様では、検出オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ配列である。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡ配列であり、標的補体は、ＲＮＡ配列であり、検出オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ配列である。
「リンカー」（本明細書では「スペーサー」とも呼ばれる）は、ある化学部分を別の化学部分に結合する１つ以上の原子、例えば、反応性官能基又は標識をオリゴヌクレオチドに結合する１つ以上の原子を指す。リンカーは、１つ以上の原子、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の原子～約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の原子を含むヌクレオチド又は非ヌクレオチド化合物であってもよく、炭素、酸素、硫黄、窒素、及びリン、並びにそれらの組み合わせなどの原子を含むことができる。リンカーの例としては、アミド、エステル、カーボネート、及びエーテル基などの低分子量基、並びにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びアルキル鎖などの高分子量連結基が挙げられる。したがって、リンカーは、１つ以上の原子、単位、又は分子を含んでもよい。
「標識」は、検出可能な物理的特性を有するか、又は化学基若しくは部分に検出可能な物理的特性を示すことができる化学基又は部分を指し、例えば、基質の検出可能な生成物への変換を触媒する酵素を含む。標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的、又は他の方法によって検出することができる。標識の例としては、放射性同位元素、酵素、基質、蛍光分子、化学発光部分、電気化学発光部分、磁性粒子、及び生物発光部分が挙げられるが、これらに限定されない。別の態様では、標識は、結合対のメンバーである化合物であり、結合対の第１のメンバー（「一次結合試薬」と呼ぶことができる）が、例えば、基質に付着し、オリゴヌクレオチド、及び結合対の他のメンバー（「二次結合試薬」と呼ぶことができる）は、検出可能な物理的特性を有する。結合対の非限定的な例としては、ビオチン及びストレプトアビジン、又はアビジン、相補的オリゴヌクレオチド、ハプテン及びハプテン結合パートナー、並びに抗体／抗原結合対が挙げられる。一態様では、標識は、検出オリゴヌクレオチドを含む。「検出」とは、標識の存在又は非存在に基づいて、オリゴヌクレオチドなどの物質の存在を検出、観察、又は定量化することを指す。
「検出試薬」とは、標的分析物、プローブ、反応生成物又は検出複合体の存在を検出するために使用することができる化合物を指す。一態様では、検出試薬は、検出可能な標識を含む。一態様では、検出可能な標識は、電気化学発光（ＥＣＬ）標識を含む。一態様では、検出試薬は、検出可能な標識及び付着要素を含み、付着要素は、検出可能な標識を標的分析物、プローブ、反応生成物、又は検出複合体に付着させる。一態様では、付着エレメントは、結合対のメンバーである。一態様では、付着エレメントは、ストレプトアビジンを含み、検出試薬が、ストレプトアビジンのビオチンへの結合を介してプローブ、反応生成物又は検出複合体に結合するように、プローブ、反応生成物又は検出複合体は、ビオチンを含む。一態様では、付着エレメントは、検出複合体に結合した伸長配列（又はアンプリコン）上の検出標識部位のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。一態様では、伸長配列（又はアンプリコン）は、ＲＣＡによって生成される。一態様では、検出試薬は、検出可能な標識と、検出複合体に結合した伸長配列（又はアンプリコン）上の検出標識部位のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドとを含む。一態様では、検出試薬は、電気化学発光標識と、検出複合体に結合した伸長配列（又はアンプリコン）上の検出標識部位のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドとを含む。「相補的」は、例えば、ワトソン－クリック型塩基対形成モデルに従って、水素結合の形成によって相互作用する核酸分子又は核酸分子の配列を指す。例えば、ハイブリダイゼーションは、２つの相補的ＤＮＡ分子間（ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション）、２つのＲＮＡ分子間（ＲＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーション）、又は相補的ＤＮＡとＲＮＡ分子との間（ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーション）で起こり得る。ハイブリダイゼーションは、より長いヌクレオチド配列の一部に相補的である短いヌクレオチド配列の間で起こり得る。ハイブリダイゼーションは、１００％の「配列相補性」を有しない配列間（すなわち、ワトソン－クリック型塩基対形成モデルなどの塩基対形成モデルに基づいてヌクレオチドの１００％未満が整列する配列）で起こり得るが、配列の相補性が低いと、配列の相補性が高い配列よりも安定性が低く、ハイブリダイズが起こりにくい。一態様では、相補的配列のヌクレオチドは、ワトソン－クリックモデルに基づいて１００％の配列相補性を有する。別の態様では、相補的配列のヌクレオチドは、ワトソン－クリックモデルに基づいて、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相補性を有する。
２つの相補的配列がハイブリダイズするかどうかは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する可能性があり、温度、溶媒、イオン強度、及びその他のパラメータなどの条件に応じて変化する可能性がある。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、他の潜在的に交差反応する又は干渉する配列の存在下で、２つの相補的な核酸配列の所望のハイブリダイゼーション生成物の選択的な形成又は維持を提供するように選択することができる。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、典型的には、より長い相補的配列は、より短い相補的配列よりも高温で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、定義されたイオン強度、化学変性剤の濃度、ｐＨ、及びハイブリダイゼーションパートナーの濃度で、特定のヌクレオチド配列の熱融解点（Ｔｍ）（すなわち、配列の５０％が実質的に相補的な配列にハイブリダイズする温度）よりも約５℃～約１０℃低い。一般に、Ｇ及びＣ塩基の割合が高いヌクレオチド配列は、Ｇ及びＣ塩基のパーセンテージが低いヌクレオチド配列よりもストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。一般に、ストリンジェンシーは、温度の上昇、ｐＨの上昇、イオン強度の低下、又は化学核酸変性剤（ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、及びエチレンカーボネートなど）の濃度の上昇によって高めることができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、典型的には、約１Ｍ、５００ｍＭ、又は２００ｍＭ未満の塩濃度、約２０℃、３０℃、４０℃、６０℃、又は８０℃を超えるハイブリダイゼーション温度、及び約１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％を超える化学変性剤の濃度が挙げられる。多くの要因がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える可能性があるため、パラメータの組み合わせは、パラメータのみの絶対値よりも重要な場合がある。
「補体」又は「相補的」という用語は、その塩基が塩基ごとに相補的な塩基対を形成する２つのオリゴヌクレオチドを指し、例えば、ＡがＴ又はＵと対になり、ＣがＧと対になる状況である。完全な相補性又は１００％の相補性は、１つのオリゴヌクレオチド配列又は領域の各ヌクレオチドが、２番目のオリゴヌクレオチド鎖又は領域の各ヌクレオチドと水素結合することができる状況を指す。「実質的な相補性」は、部分的に相補的であり、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる配列を指す。実質的に相補的な配列は、それらの全長に沿ってハイブリダイズする必要はない。
「対応する」は、捕捉オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドタグとの間の関係を指すために使用することができ、オリゴヌクレオチドタグは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特定の捕捉オリゴヌクレオチド配列に特異的に結合するように設計される。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、その対応する捕捉分子に特異的に結合し、ストリンジェントな条件下で他の捕捉分子と結合又は交差反応しない。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、その対応する捕捉分子に特異的に結合し、ストリンジェントな条件下でアレイ内の他の捕捉分子と結合又は交差反応しない。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、その「対応する」捕捉オリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部に相補的である配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。一態様では、「対応する」オリゴヌクレオチドタグ及び捕捉オリゴヌクレオチド配列のヌクレオチドは、ワトソン－クリックモデルに基づいて１００％の配列相補性を有する。別の態様では、対応する配列のヌクレオチドは、ワトソン－クリックモデルに基づいて、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相補性を有する。
一本鎖ポリヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドがそれらの３’及び５’炭素原子間のホスホジエステル結合によって結合され、その結果、末端の５’及び３’炭素がポリヌクレオチドのいずれかの末端で露出されるため（分子の５’－（ホスホリル）及び３’－（ヒドロキシル）末端と呼ばれる場合がある）、「方向」又は「方向性」を有する。「逆」オリゴヌクレオチドは、５’－から３’－方向に読み取られたときに参照オリゴヌクレオチドとしてリバース配列を有する。例えば、参照オリゴヌクレオチド配列の場合５’－ＡＣＣＧＡＴＣＡＴＧ－３’（配列番号１６４９）、「逆」オリゴヌクレオチド配列は、５’－ＧＴＡＣＴＡＧＣＣＡ－３’（配列番号１６５０）である。
ワトソン－クリック塩基対形成並びにＤＮＡ－ＤＮＡ、ＲＮＡ－ＲＮＡ、及びＲＮＡ－ＤＮＡ二重らせんの逆平行性によって定義される規則によれば、配列の補体には、元の配列の塩基のワトソン－クリックパートナーである（又は実質的にそうである）塩基の列が、３’から５’の順序で含まれる。配列５’－ＡＣＣＧＡＴＣＡＴＧ－３’（配列番号１６４９）の補体の例は、５’－ＣＡＴＧＡＴＣＧＧＴ－３’（配列番号１６５１）である。逆補体という用語が本明細書で配列に関して使用される場合、それは元の配列のリバースの補体を指すために使用される。配列５’－ＡＣＣＧＡＴＣＡＴＧ－３’（配列番号１６４９）の逆補体の例は、５’－ＴＧＧＣＴＡＧＴＡＣ－３’（配列番号１６５２）である。
「交差反応する」又は「交差反応性」は、サンプル中の２つ以上の他のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列の能力を指す。一態様では、「交差反応する」という用語は、サンプル中の第２のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチド配列の能力を指し、第２のオリゴヌクレオチド配列は、第１のオリゴヌクレオチド配列に対して相補的又は実質的に相補的ではない。一態様では、「交差反応する」又は「交差反応性」という用語は、サンプル中の２つ以上のオリゴヌクレオチドタグ又は２つ以上のタグされた標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする捕捉オリゴヌクレオチドの能力を指す。一態様では、交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな捕捉ハイブリダイゼーション条件下で、サンプル中の１つ以上のオリゴヌクレオチドタグにハイブリダイズする。一態様では、ストリンジェントな捕捉ハイブリダイゼーション条件は、２７℃～４７℃の温度、２１％～４１％のホルムアミド濃度、３００ｍＭ～５００ｍＭの塩濃度、及び７．５～８．５のｐＨを含む。一態様では、ストリンジェントな捕捉ハイブリダイゼーション条件は、約３７℃の温度、約３１％のホルムアミド濃度、約４００ｍＭの塩濃度、及び８．０のｐＨを含む。
「非交差反応性」又は「非交差反応すること」は、サンプル中の特定のオリゴヌクレオチド配列にのみハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチド配列、例えば、サンプル中の対応する相補的配列にのみハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチド配列の能力を指す。一態様では、「非交差反応性」という用語は、２つ以上のオリゴヌクレオチドタグ又は２つ以上のタグされた標的ヌクレオチド配列を含むサンプル中の１つのオリゴヌクレオチドタグにのみハイブリダイズする捕捉オリゴヌクレオチドの能力を指す。一態様では、非交差反応性オリゴヌクレオチドプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、サンプル中の１つのオリゴヌクレオチドタグにのみハイブリダイズする。一態様では、非交差反応性とは、第１のオリゴヌクレオチドがサンプル中のその相補的配列以外の配列に結合する比率が、ストリンジェントな捕捉ハイブリダイゼーション条件下で０．０５％未満であることを意味する。
「リガーゼ」は、第２のヌクレオチド配列の５’リン酸を有する１つのヌクレオチド配列の３’ヒドロキシル間のホスホジエステル結合の形成を触媒することによってヌクレオチド配列を一緒に結合することができる酵素の分類を指す。リガーゼとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）リガーゼ、Ｔ．Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡリガーゼ（例えば、ＨｉＦｉリガーゼ）、又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ＤＮＡリガーゼが挙げられる。一態様では、リガーゼは、熱安定性リガーゼである。「ライゲーション」は、１つのヌクレオチド配列の３’ヒドロキシルと、第２のヌクレオチド配列の５’リン酸との間のホスホジエステル結合の形成によって２つのヌクレオチド配列を一緒に結合するプロセスを指す。
「アレイ」は、本明細書では結合ドメイン又はアレイ要素と呼ばれる、空間的に異なる（すなわち、重複しない）アドレス可能な位置を２つ以上有する１つ以上の支持体表面を指す。一態様では、各アドレス可能な位置としては、例えば、捕捉分子を含むアッセイ試薬が挙げられる。
「支持体表面」は、様々な物質、例えば、オリゴヌクレオチド又はポリペプチドを固定化することができる表面材料を指す。「支持体表面」は、平面又は非平面であることができる。一態様では、支持体表面は、平坦な表面を含む。一態様では、支持体表面は、複数のウェルを備えたプレート、すなわち「マルチウェルプレート」である。マルチウェルプレートは、任意のパターン又は構成で配置された、任意のサイズ又は形状の任意の数のウェルを含むことができる。別の態様では、支持体表面は、曲面を有する。一態様では、支持体表面は、１つ以上の粒子、ビーズ、又はミクロスフェアによって提供される。粒子、ビーズ、又はミクロスフェアという用語は、特に明記しない限り、同じ意味で使用することができる。一態様では、支持体表面は、色分けされた粒子、ビーズ、又はミクロスフェアを含む。一態様では、支持体表面は、アッセイプレート、スライド、カートリッジ、ビーズ、又はチップなどのアッセイモジュールを含む。一態様では、支持体表面は、アッセイフローセル又はアッセイ流体工学を含む。
一態様では、支持体表面は、例えば、「遺伝子チップ」デバイスで一般的であるように、複数のアドレス可能な位置（「スポット」と呼ばれることがある）を含む。別の態様では、アレイは、ビーズの懸濁液中の各ビーズがアドレス可能な位置を表す「ビーズアレイ」アプローチのように、各々が１つのアドレス可能な位置を有する複数の支持体表面を含む（例えば、フローサイトメトリー又は顕微鏡検出技術を使用してアドレス指定され得る）。別の態様では、アレイは、各々が表面ごとに１つ以上、又は２つ以上のアドレス可能な位置を有する複数の支持体表面を含む。支持体表面上のアドレス可能な位置は、均一な行及び列に配置することもできるか、あるいは他のパターンを形成することもできる。アレイ上のアドレス可能な位置の数は、例えば、１０未満から５０、１００、２００、５００、又は１０００を超えるまで変動し得る。「マルチプレックス」とは、単一のアッセイで２つ以上のアッセイ標的を同時に分析することを指す。
「カーボンベース」とは、主成分として元素状カーボン（Ｃ）を含有する材料を指す。カーボン含有又はカーボンベースの材料の例としては、カーボン、カーボンブラック、グラファイトカーボン、ガラス状カーボン、カーボンナノチューブ、カーボンフィブリル、グラファイト、カーボンファイバー、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。カーボンベースの材料としては、例えば、グラファイト、カーボンブラック、又はカーボンナノチューブを含む元素状カーボンを挙げることができる。一態様では、カーボンベースの材料としては、導電性カーボン－ポリマー複合材料、導電性ポリマー、又はマトリックス中に分散された導電性粒子、例えば、カーボンインク、カーボンペースト、又は金属インクが挙げられる。導電性カーボン粒子としては、例えば、マトリックス、例えば、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、ポリビニルクロリド、又はアクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）などのポリマーマトリックスに分散されたカーボンフィブリル、カーボンブラック、又はグラファイトカーボンが挙げられる。このようなポリマーマトリックスとしてはまた、ビニルアセテート、エチレン、ビニルアルコール、ビニルクロリド、アクリロニトリル、ブタジエン、スチレン、又は他のモノマーから選択されるモノマーを含み得る２つ以上のタイプの成分モノマーとのコポリマーを挙げることができる。
「アレル」は、標的ヌクレオチド配列のゲノム多様体を指し、翻訳されると、機能的又は機能不全の遺伝子生成物をもたらす可能性がある。２つのアレル形態は、「野生型アレル」及び「変異体」又は「多様体」アレルと呼ばれる場合がある。「野生型」は、集団において優勢であるヌクレオチド配列を指す。「変異体」又は「多様体」は、集団内で頻度が低いヌクレオチド配列を指す。変異体又は多様体のヌクレオチド配列は、機能的な結果をもたらす場合と持たない場合がある。
「多型」又は「多型部位」は、２つ以上の核酸のグループにおける１つの多様体を指す。「一塩基多様体」（「一塩基多型」、「ＳＮＰ」、又は「一塩基変化」とも呼ばれる）は、一塩基のみを含む多様体を指す。一塩基多様体は、多型部位でのあるヌクレオチドの別のヌクレオチドへの置換、又は参照ヌクレオチド配列からのヌクレオチドの欠失、又は参照ヌクレオチド配列へのヌクレオチドの挿入を含み得る。一塩基多様体は、一般的なもの（例えば、集団の少なくとも１％に存在する）又はまれなもの（例えば、集団の１％未満に存在する）であり得る。
「キット」は、例えば、組成物を作成するため、デバイスを製造するため、又は方法を実行するために一緒に使用されるために提供又は収集される成分のセットを指す。キットには、１つ以上の成分を含むことができる。キットの成分は、１つのパッケージ又は複数のパッケージで提供され得、各パッケージには成分のうちの１つ以上を含有することができる。キットの列挙された成分は、キットの使用のために組み合わされる単一の物理的部品又は複数の部品として提供される場合もある。例えば、キットの機器構成要素は、完全に組み立てられた状態で、又は使用前に組み立てられる複数の機器部品として提供され得る。同様に、キットの液体試薬成分は、容器内の完全な液体製剤として、完全な液体製剤を提供するために組み合わされる１つ以上の乾燥試薬及び１つ以上の液体希釈剤として、又は２つ以上の液体溶液として提供され得る。完全な液体製剤を提供するために組み合わせる必要がある。当該技術分野で知られているように、アッセイ用のキット成分は、異なる貯蔵ニーズ、例えば４℃対－７０℃の貯蔵温度を有するために、しばしば別々に出荷及び貯蔵される。
Ｂ．概要
本明細書に記載されるのは、サンプル中の１つ以上の標的分析物を同定、検出又は定量化するためのキット、並びにそれを作製及び使用するための方法に関する。一態様では、方法又はキットは、支持体表面上の個別の結合ドメインに固定化されている、又は固定化され得る１つ以上の捕捉分子を含む。一態様では、捕捉分子は、プローブ又は反応生成物に付着した一本鎖オリゴヌクレオチドタグのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する一本鎖捕捉オリゴヌクレオチドである。一態様では、オリゴヌクレオチドタグを含むプローブは、標的分析物に会合して、標的分析物を捕捉分子に導く。一態様では、標的分析物は、オリゴヌクレオチドタグを含む第１のプローブ及び標識を含む第２のプローブに会合している。一態様では、標的分析物は、オリゴヌクレオチドタグ及び標識を含む検出プローブに会合している。一態様では、反応生成物は、標的ヌクレオチド配列をテンプレートとして使用して生成される。一態様では、反応生成物は、オリゴヌクレオチドタグ及び標識を含む。一態様では、反応生成物は、オリゴヌクレオチドタグ及び標識を含む検出プローブに会合した標的分析物を含む。一態様では、方法又はキットは、１つ以上のオリゴヌクレオチドタグを含む。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドと反応生成物上のタグの相補的ヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションは、反応生成物を支持体表面に固定化して検出複合体を形成し、捕捉された反応生成物は、添付の標識に基づいて同定、検出、又は定量化することができる。
一態様では、１つ以上のオリゴヌクレオチドを支持体表面に固定化する方法が提供される。一態様では、この方法は、支持体表面上にチオール反応性基を含む１つ以上のオリゴヌクレオチドを固定化することを含む。一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、１つ以上の結合ドメインの支持体表面に固定化されている。一態様では、この方法は、チオール含有洗浄溶液（本明細書ではブロッキング溶液又はブロッカーとも呼ばれる）で支持体表面を洗浄して、結合していないオリゴヌクレオチドを除去するステップを含む。一態様では、各結合ドメインは、約０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、又は０．０１％未満の汚染捕捉オリゴヌクレオチドを含む。
一態様では、本明細書に記載のサンプル中の１つ以上の標的分析物を同定、検出又は定量化するための方法及びキットは、従来の方法よりも高い感度を提供する。一態様では、本開示の方法及びキットは、サンプル中のナノモル、適切にはピコモル、又はより適切にはフェムトモル濃度の標的分析物を検出することができる。一態様では、本開示の方法及びキットは、サンプル中の少なくとも約０．１ｆＭ、１ｆＭ、２５ｆＭ、５０ｆＭ、７５ｆＭ若しくは１００ｆＭ及び最大約５００ｆＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、５００ｐＭ若しくは１ｎＭ、又は約０．１ｆＭ～約１ｎＭ、約１ｆＭ～約１００ｐＭ、約１０ｆＭ～約１０ｐＭ、約５０ｆＭ～約１ｐＭ、若しくは約１００ｆＭ～約５００ｆＭの標的分析物を検出することができる。一態様では、本開示の方法及びキットは、サンプル中の約０．１ｆＭ、約１ｆＭ、約２．５ｆＭ、約５ｆＭ、約１０ｆＭ、約２５ｆＭ、約５０ｆＭ、約１００ｆＭ、約２５０ｆＭ、約５００ｆＭ、約１ｐＭ、約２．５ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約２５ｐＭ、約５０ｐＭ、約１００ｐＭ、又は約１ｎＭの標的分析物を検出することができる。
特定の態様では、本明細書で提供される方法及びキットは、サンプル中のフェムトモル濃度のポリヌクレオチド、例えば、治療用オリゴヌクレオチド又はｍＲＮＡなどのＲＮＡを検出することができ、これにより、ポリヌクレオチドを増幅する必要性がなく、検出、同定、及び／又は定量化することが有利に可能である。
一態様では、本明細書で提供される方法及びキットは、従来の方法と比較して、サンプル中の１つ以上の標的分析物を同定、検出、又は定量化するために必要な時間を短縮することができる。一態様では、本開示の方法及びキットは、約１時間～約４８時間、約１．５時間～約２４時間、約２時間～約１８時間、約２．５時間～約１２時間、約３時間～約１０時間、約３．５時間～約８時間、約４時間～約６時間、又は約４．５時間～約５時間で、サンプル中の１つ以上の標的分析物を同定、検出、又は定量化することができる。一態様では、本開示の方法及びキットは、約４８時間未満、約３６時間未満、約２４時間未満、約１８時間未満、約１２時間未満、約１０時間未満、約９時間未満、約８時間未満、約７時間未満、約６時間未満、約５時間未満、約４時間未満、約３時間未満、約２時間未満、又は約１時間未満で、サンプル中の１つ以上の標的分析物を同定、検出又は定量化することができる。
Ｃ．捕捉分子
一態様では、方法又はキットは、支持体表面上の個別の結合ドメインに固定化されている、又は固定化され得る１つ以上の捕捉分子を含む。一態様では、捕捉分子は、天然配列ではない。別の態様では、捕捉分子は、組換え産生される。一態様では、非交差反応性捕捉分子のセットの配列は、数学的アルゴリズムを使用して生成される。
一態様では、捕捉分子は、一本鎖オリゴヌクレオチドタグのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する一本鎖捕捉オリゴヌクレオチドである。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、標的分析物に付着している。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、標的分析物に会合しているプローブに付着している。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、標的ヌクレオチド配列をテンプレートとして使用して生成された反応生成物に付着している。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドタグの相補的ヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションは、目的の標的又は反応生成物を支持体表面に固定化して、検出複合体を形成する。次いで、捕捉された標的又は反応生成物は、添付された標識に基づいて同定、検出、又は定量化することができる。
一態様では、この方法又はキットは、同定、検出、又は測定される各標的ヌクレオチド配列についての異なる捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、複数の捕捉オリゴヌクレオチドとそれらの相補的オリゴヌクレオチドタグとの間のハイブリダイゼーションは、捕捉オリゴヌクレオチドのアレイ全体で同時に並行して起こる。アレイは、本明細書に記載の２つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含むか、又はそれからなり得る。したがって、アレイは、２～１５０個以上の捕捉オリゴヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、又は最大６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、若しくは１５０個の捕捉オリゴヌクレオチドを含み得る。アレイ内のオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの「親セット」又は「サブセット」（本明細書では「セット」とも呼ばれる）を含むか、又はそれらからなり得る。
一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）を含む核酸配列、又はハイブリダイゼーション反応にも関与し得る天然に存在しない化学構造を含む構造類似体を含む一本鎖核酸配列を含む。
一態様では、特定のアレイで使用される捕捉オリゴヌクレオチドは、同様の結合エネルギー又は融解温度（Ｔｍ）を有し、例えば、少なくとも約０．５℃、１℃、２℃、３℃、４℃、又は互いに５℃以内であり、オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、オリゴヌクレオチドの５０％がその補体とハイブリダイズし、５０％が溶液中で遊離する温度を指す。Ｔｍは、既知の方法を使用して、例えば、温度の関数としてその補体を有するオリゴヌクレオチドの吸光度変化を測定することによって決定することができる。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、５０ｍＭ ＮａＣｌで約５０℃～約７０℃、５５℃～約６５℃、又は少なくとも約５０℃、５５℃、若しくは６０℃～最大約６０℃、６５℃、若しくは７０℃の融解温度（Ｔｍ）を有する。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、約４０％～約６０％、又は約４０％～約５０％のＧＣ含有量を有する。
一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、約２０～約１００、約３０～約５０、又は約３５～約４０ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６～最大約３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、７５、又は１００ヌクレオチドの長さである。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、少なくとも２０、２４、３０、又は３６個のヌクレオチドを含む。少なくとも約２０、２４、３０、又は３６ヌクレオチドの長さである捕捉オリゴヌクレオチドは、タグされた標的又は反応生成物に結合することができ、より短い捕捉オリゴヌクレオチドと比較して、より高温で結合されたままで、特異性が改善する（すなわち、非特異的結合が少ない）。一態様では、アレイ内の１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、その相補的オリゴヌクレオチドタグの核酸配列と長さが同一ではない。実際、例えば、最大５、１０、１５、２０又は２５塩基だけ、その相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドタグよりも長い配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドを含むことが望ましい場合がある。一態様では、タグされた標的又は反応生成物及び捕捉オリゴヌクレオチドは、約１：１の比率で含まれる。別の態様では、タグされた標的又は反応生成物が過剰に存在して、タグされた標的又は反応生成物が捕捉オリゴヌクレオチドに結合する可能性を高める。一態様では、タグされた反応生成物及び捕捉オリゴヌクレオチドは、約２：１、３：１、４：１又は５：１の比で含まれる。
一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、支持体表面に共有結合的に又は非共有結合的に固定化されている。一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、支持体表面上の１つ以上の結合ドメインに共有結合的に又は非共有結合的に固定化されている。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、例えば、オリゴヌクレオチド上の負に帯電したリン酸基と支持体表面上の正電荷との間の静電相互作用を介して支持体表面に吸着される。一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、表面に固定化されている第２の結合パートナーへの捕捉オリゴヌクレオチドに（直接的又はリンカー部分を介して）付着した第１の結合パートナーの結合を介して支持体表面に固定化されている。一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、支持体表面に共有結合的に固定化されている。一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、支持体表面に直接固定化されている。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、リンカーを介して支持体表面に固定化されている。
一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、反応性官能基を含む。一態様では、官能基は、チオール（－ＳＨ）又はアミン（－ＮＨ２）基を含む。一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、反応性官能基を介して支持体表面に固定化されている。一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、リンカーを介して捕捉オリゴヌクレオチドに付着している反応性官能基を介して支持体表面に固定化されている。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、チオール又はアミン基を介して支持体表面に固定化されている。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、リンカー（本明細書では「スペーサー」とも呼ばれる）を介して捕捉オリゴヌクレオチドに付着しているチオール又はアミン基を介して支持体表面に固定化されている。一態様では、リンカーは、約３～約２０個の原子若しくは分子若しくは単位、又は少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０～最大約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０個の原子若しくは分子若しくは単位を含む。一態様では、リンカーは、炭素原子リンカーである。一態様では、リンカーは、エチレングリコールリンカー、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーである。一態様では、リンカーは、最大３、４、５、又は６個の連続するＰＥＧ単位を含む。別の態様では、リンカーは、３つの連続するＰＥＧ単位を含む。別の態様では、リンカーは、６つの連続するＰＥＧ単位を含む。リンカーは、実施例２に示される構造を有し得る。
一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質で前処理された支持体表面に固定化されている。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、架橋剤を介して支持体表面に固定化されている。タンパク質及び核酸を互いに又は他の材料に接続するための好適なホモ二官能性及びヘテロ二官能性架橋剤は、当該技術分野で周知であり、例えば、２０１２年にＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって発行されたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）を参照されたい。一態様では、架橋剤は、アミン反応性部分（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド又はＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルなど）及びマレイミド、ヨードスクシンイミド、又は活性化ジスルフィド（ピリジルジスルフィドなど）などのチオール反応性部分を含むヘテロ二官能性架橋剤であり、このようなヘテロ二官能性の交差官能性（ｃｒｏｓｓ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）架橋剤としては、例えば、スルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）が挙げられる。一態様では、アミン反応性部分（例えば、ＳＭＣＣのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）部分）は、タンパク質と反応して、チオール反応性部分（例えば、ＳＭＣＣのマレイミド部分）をタンパク質に導入する。それにより、チオール反応性部分は、チオール修飾捕捉オリゴヌクレオチドと反応して、安定なチオエーテル結合を介して連結されたタンパク質－オリゴヌクレオチドコンジュゲートを形成する。タンパク質－オリゴヌクレオチドコンジュゲートのアレイは、タンパク質で吸着又は反応する表面に試薬のパターンを印刷して、パターン化されたアレイを生成することによって形成することができる。一態様では、アレイは、例えばスクリーン印刷されたカーボンインク電極などのグラファイトカーボン表面にタンパク質－オリゴヌクレオチドコンジュゲートを印刷することによって形成される。例えば、米国特許公開第２０１６／００６９８７２号、米国特許第６，９７７，７２２号及び同第７，８４２，２４６号を参照し、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、タンパク質で前処理されていない支持体表面に固定化されている。一態様では、上記のように、オリゴヌクレオチドを固定化するために使用されるタンパク質－オリゴヌクレオチドのタンパク質成分は、ＢＳＡである。
１つのアプローチでは、コンピュータアルゴリズムを使用して、以下の要件、（ａ）約４０％～約５０％のＧＣ含量と、（ｂ）約３０％～約７０％のＡＧ含量と、（ｃ）約３０％～約７０％のＣＴ含量と、（ｄ）３つ以下の配列での塩基リピートの最大列と、（ｅ）７つを超える相補的塩基対が連続して一致する列との望ましくないオリゴヌクレオチド－オリゴヌクレオチドの相互作用がないことと、（ｆ）（ｉ）両端の末端塩基が相補的に一致し、（ｉｉ）相補的塩基対の一致の合計から不一致の合計を引いたものが７より大きい、１８個以下の連続した塩基の列との望ましくないオリゴヌクレオチド－オリゴヌクレオチドの相互作用がないことと、（ｇ）所与のゲノム、例えば、ヒトゲノム又は自然界における配列における配列（又は配列の補体、あるいはその両方）に一致する２０塩基対以上（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６ｂｐ）の列がないことと、（ｈ）それらの補体を有する配列（又はその補体を有する５’末端からの最初の２４個のオリゴヌクレオチド）のハイブリダイゼーションの自由エネルギーの差が、約１ｋＣａｌ／モル、約２ｋＣａｌ／モル、約３ｋＣａｌ／モル、又は約４ｋＣａｌ／モル未満であることと、（ｉ）ステム内に４つ以上の連続した一致がある予測ヘアピンループがないことと、（ｊ）ステム内に４つ以上の連続した一致があり、ループサイズが６塩基を超える予測ヘアピンループがないことと、の１つ以上を満たす上記の長さ（例えば、２４、３０、又は３６ｍｅｒ）の捕捉オリゴヌクレオチドのセットを生成する。一態様では、少なくとも基準（ａ）～（ｈ）が考慮される。この文脈における望ましくないオリゴヌクレオチド－オリゴヌクレオチド相互作用は、オリゴヌクレオチドとそれ自体、セット内の別の配列、又はセット内の別の配列の補体との相互作用を指す。ハイブリダイゼーションの自由エネルギー（ΔＧ）は、一般に、指定されたイオン強度、温度、及びｐＨに対して、例えば、室温（約２５℃）での生理学的イオン強度及びｐＨ（約１５０ｍＭ ＮａＣｌ、約ｐＨ７．２）又は約２３℃での約２００ｍＭの一価カチオン、約ｐＨ７．０、あるいは別の関連条件に対して計算される。代替的又は追加的に、以下の構成のうちの１つ以上を回避することができる：アッセイで使用される他の捕捉オリゴヌクレオチドと対になった場合のＧ／Ｃリッチ配列間に位置決めされる単一ヌクレオチドループ又は単一ヌクレオチド不一致の形成。
一態様では、捕捉分子は、配列番号１～７７４のうちのいずれかに示されるオリゴヌクレオチド配列を含む（表１～１２）。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１～７７４のうちのいずれかに示される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を有する。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１～７７４のうちのいずれかに示される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１～７７４のうちのいずれかに示される配列の少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。
別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１～６４のうちのいずれかに示されるヌクレオチド配列を有する。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１～６４のうちのいずれかに示される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を有する。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１～６４のうちのいずれかに示される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１～６４のうちのいずれかに示される配列の少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。
別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１０、１１～１３、２５～２６、３３～３７、４２、４４～４６、５４、及び５９～６２のうちのいずれかに示されるヌクレオチド配列を有する。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１０、１１～１３、２５～２６、３３～３７、４２、４４～４６、５４、及び５９～６２のうちのいずれかに示される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を有する。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１０、１１～１３、２５～２６、３３～３７、４２、４４～４６、５４、及び５９～６２のうちのいずれかに示される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１０、１１～１３、２５～２６、３３～３７、４２、４４～４６、５４、及び５９～６２のうちのいずれかに示される配列の少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。
別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１０のうちのいずれかに示されるヌクレオチド配列を有する。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１０のうちのいずれかに示される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を有する。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１０のうちのいずれかに示される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１０のうちのいずれかに示される配列の少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１０のうちのいずれかに示される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含む配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を有する。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１０のうちのいずれかに示される配列の少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含む配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を有する。
一態様では、塩基配列を使用し、アルゴリズムを使用して非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットを生成する。一態様では、最大４組の非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドが生成され、（ａ）非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドの第１のセットは、塩基配列を使用して生成され、（ｂ）第１のセットの捕捉オリゴヌクレオチド配列に相補的である配列を有する非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドの第２のセットを生成することができ、（ｃ）第１のセットの捕捉オリゴヌクレオチド配列のリバース配列を有する非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドの第３のセットを生成することができ、（ｄ）第１のセットの捕捉オリゴヌクレオチド配列のリバース補体である配列を有する非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドの第４のセットを生成することができる。
一態様では、塩基配列を使用して生成された非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドの各セットは、「親セット」と呼ばれる。親セットからの２つ以上のオリゴヌクレオチドを選択して、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドの「サブセット」（本明細書では「セット」とも呼ばれる）を形成することができ、サブセット内の各オリゴヌクレオチドは同じ親セットのメンバーである（すなわち、サブセットには、２つ以上の親セットからの捕捉オリゴヌクレオチドを含めることはできない）。
例えば、塩基配列を使用して（ａ）親非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドの第１のセットを生成することができ、（ｂ）第１のセットの捕捉オリゴヌクレオチド配列に相補的である配列を有する親非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドの第２のセットを生成することができ、（ｃ）第１のセットの捕捉オリゴヌクレオチド配列のリバース配列を有する親非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドの第３のセットを生成することができ、（ｄ）第１のセットの捕捉オリゴヌクレオチド配列のリバース補体である配列を有する親非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドの第４のセットを生成することができる。
サブセット（又はセット）としては、（ａ）第１の親セットからの２つ以上の非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチド、（ｂ）第２の親セットからの２つ以上の非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチド、（ｃ）第３の親セットからの２つ以上の非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチド、又は（ｄ）第４の親セットからの２つ以上の非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドを挙げることができる。一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセット又はサブセットは、親非交差反応性オリゴヌクレオチドのセットから選択される約５０～約１５０、約５０～約１００、約６０～約７５、又は約６０～約６５個の非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセット又はサブセットは、親非交差反応性オリゴヌクレオチドのセットから選択される少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５及び最大約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、又は１５０個の非交差反応性オリゴヌクレオチドを含む。
一態様では、第１の塩基配列を使用して、表１（配列番号１～６４）に示される非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドの第１のセットを生成する。非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのこの第１のセットの相補的配列を使用して、表４（配列番号１８７～２５０）に示される非交差反応性配列の別のセットを生成することができる。非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのこの第１のセットのリバース配列を使用して、表７（配列番号３７３～４３６）に示される非交差反応性配列の別のセットを生成することができる。非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのこの第１のセットの逆相補的配列を使用して、表１０（配列番号５５９～６２２）に示される非交差反応性配列の別のセットを生成することができる。
一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表１（配列番号１～６４）に示される親セットからの２つ以上の配列を含む。一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表４（配列番号１８７～２５０）に示される親セットからの２つ以上の配列を含む。一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表７（配列番号３７３～４３６）に示される親セットからの２つ以上の配列を含む。一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表１０（配列番号５５９～６２２）に示される親セットからの２つ以上の配列を含む。一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表１（配列番号１～６４）、表４（配列番号１８７～２５０）、表７（配列番号３７３～４３６）、又は表１０（配列番号５５９～６２２）に示される親セットから選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５、及び最大６４個の非交差反応性配列のサブセットである。
一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表１（配列番号１～６４）、表４（配列番号１８７～２５０）、表７（配列番号３７３～４３６）又は表１０（配列番号５５９～６２２）に示される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるヌクレオチド配列を有する１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。別の態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表１（配列番号１～６４）、表４（配列番号１８７～２５０）、表７（配列番号３７３～４３６）、又は表１０（配列番号５５９～６２２）に示される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表１（配列番号１～６４）、表４（配列番号１８７～２５０）、表７（配列番号３７３～４３６）、又は表１０（配列番号５５９～６２２）に示される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含む配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるヌクレオチド配列を有する１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。
一態様では、第２の塩基配列を使用して、表２（配列番号６５～１２２）に示される非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドの第２のセットを生成する。非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのこの第２のセットの相補的配列を使用して、表５（配列番号２５１～３０８）に示される非交差反応性配列の別のセットを生成することができる。非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのこの第２のセットのリバース配列を使用して、表８（配列番号４３７～４９４）に示される非交差反応性配列の別のセットを生成することができる。非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのこの第２のセットの逆相補的配列を使用して、表１１（配列番号６２３～６８０）に示される非交差反応性配列の別のセットを生成することができる。
一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表２（配列番号６５～１２２）に示される親セットからの２つ以上の配列を含む。一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表５（配列番号２５１～３０８）に示される親セットからの２つ以上の配列を含む。一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表８（配列番号４３７～４９４）に示される親セットからの２つ以上の配列を含む。一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表１１（配列番号６２３～６８０）に示される親セットからの２つ以上の配列を含む。一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表２（配列番号６５～１２２）、表５（配列番号２５１～３０８）、表８（配列番号４３７～４９４）、又は表１１（配列番号６２３～６８０）に示される親セットから選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５、及び最大６４個の非交差反応性配列のサブセットである。
一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表２（配列番号６５～１２２）、表５（配列番号２５１～３０８）、表８（配列番号４３７～４９４）、又は表１１（配列番号６２３～６８０）に示された配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるヌクレオチド配列を有する１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。別の態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表２（配列番号６５～１２２）、表５（配列番号２５１～３０８）、表８（配列番号４３７～４９４）、又は表１１（配列番号６２３～６８０）に示される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表２（配列番号６５～１２２）、表５（配列番号２５１～３０８）、表８（配列番号４３７～４９４）、又は表１１（配列番号６２３～６８０）に示される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるものの少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。
一態様では、第３の塩基配列を使用して、表３（配列番号１２３～１８６）に示される非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドの第３のセットを生成する。非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのこの第３のセットの相補的配列を使用して、表６（配列番号３０９～３７２）に示される非交差反応性配列の別のセットを生成することができる。非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのこの第３のセットのリバース配列を使用して、表９（配列番号４９５～５５８）に示される非交差反応性配列の別のセットを生成することができる。非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのこの第３のセットの逆相補的配列を使用して、表１２（配列番号６８１～７４４）に示される非交差反応性配列の別のセットを生成することができる。
一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表３（配列番号１２３～１８６）に示される親セットからの２つ以上の配列を含む。一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表６（配列番号３０９～３７２）に示される親セットからの２つ以上の配列を含む。一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表９（配列番号４９５～５５８）に示される親セットからの２つ以上の配列を含む。一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表１２（配列番号６８１～７４４）に示される親セットからの２つ以上の配列を含む。一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表３（配列番号１２３～１８６）、表６（配列番号３０９～３７２）、表９（配列番号４９５～５５８）、又は表１２（配列番号６８１～７４４）に示される親セットから選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５、及び最大６４個の非交差反応性配列のサブセットである。
一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表３（配列番号１２３～１８６）、表６（配列番号３０９～３７２）、表９（配列番号４９５～５５８）、又は表１２（配列番号６８１～７４４）に示される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるヌクレオチド配列を有する１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。別の態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表３（配列番号１２３～１８６）、表６（配列番号３０９～３７２）、表９（配列番号４９５～５５８）、又は表１２（配列番号６８１～７４４）に示される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、表３（配列番号１２３～１８６）、表６（配列番号３０９～３７２）、表９（配列番号４９５～５５８）、又は表１２（配列番号６８１～７４４）に示される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるものの少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。
一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、配列番号１～６４から選択される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する捕捉オリゴヌクレオチドと、配列番号１～６４から選択される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドと、配列番号１～６４から選択される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを有する捕捉オリゴヌクレオチドと、配列番号１～６４から選択される配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドと、それらの組み合わせと、から選択される１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。
一態様では、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットは、配列番号１～１０から選択される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する捕捉オリゴヌクレオチドと、配列番号１～１０から選択される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドと、配列番号１～１０から選択される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを有する捕捉オリゴヌクレオチドと、配列番号１～１０から選択される配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドと、それらの組み合わせと、から選択される１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。
一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドはタンパク質に共有結合的に結合し、支持体表面へのタンパク質の吸着を介して支持体表面への固定化が達成される。使用することができるタンパク質の例としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのアルブミン、免疫グロブリン、又は支持体表面に吸着するその能力のために選択された別のタンパク質が挙げられる。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、結合パートナー対からの第１の結合パートナーに（直接的又はリンカーを介して）付着し、固定化は、支持体表面に固定化されている結合パートナー対からの第２の結合パートナーへのこの第１の結合パートナーの結合によって達成される。捕捉オリゴヌクレオチドの固定化に使用するのに適した結合パートナー対としては、ビオチン－ストレプトアビジン、ビオチン－アビジン、抗体－ハプテン、抗体－エピトープタグ（例えば、抗体－ＦＬＡＧ）、ニッケル－ＮＴＡ、及び受容体－リガンド対などの当該技術分野で知られている結合パートナー対が挙げられる。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、チオール（－ＳＨ）又はアミン（－ＮＨ２）基を介してタンパク質又は第１の結合パートナーに共有結合的に結合している。この結合は、直接又は連結基（例えば、２０１２年にＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃにより発行されたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されているような二官能性連結基）を介して行うことができる。一態様では、チオール又はアミン基は、捕捉オリゴヌクレオチドの５’又は３’末端にある。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、５’末端チオール化オリゴヌクレオチドである。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、３’末端チオール化オリゴヌクレオチドである。一態様では、チオール基は、捕捉オリゴヌクレオチドの内部位置に組み込まれている。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１４８９～１４９８（表２５）のうちのいずれかに示される配列を含むヌクレオチド配列を有する。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１４８９～１４９８のうちのいずれかに示される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を有する。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１４８９～１４９８に示される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１４８９～１４９８のうちのいずれかに示される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。
一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、チオール（－ＳＨ）又はアミン（－ＮＨ２）基を介して支持体表面に共有結合的に結合している。一態様では、チオール又はアミン基は、捕捉オリゴヌクレオチドの５’又は３’末端にある。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、５’末端チオール化オリゴヌクレオチドである。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、３’末端チオール化オリゴヌクレオチドである。一態様では、チオール基は、捕捉オリゴヌクレオチドの内部位置に組み込まれている。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１４８９～１４９８（表２５）のうちのいずれかに示される配列を含むヌクレオチド配列を有する。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１４８９～１４９８のうちのいずれかに示される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を有する。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１４８９～１４９８に示される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１４８９～１４９８のうちのいずれかに示される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。
一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１４８９～１４９８に示されるヌクレオチド配列の補体、リバース補体又は逆補体であるヌクレオチド配列を有する。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１４８９～１４９８に示される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列の補体、リバース補体又は逆補体であるヌクレオチド配列を有する。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１４８９～１４９８に示される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを有する配列の補体、リバース補体又は逆補体である配列を有する。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１４８９～１４９８のうちのいずれかに示される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含む配列の補体、リバース補体又は逆補体であるヌクレオチド配列を有する。
一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘ－ＴＡＧ技術と同様に、天然配列とのハイブリダイゼーションを低減するために３つの塩基（ＴＡＧ）のみを含む。
Ｄ．アンカー試薬
一態様では、支持体表面は、検出複合体を支持体表面にアンカーするためのアンカー試薬を含む。例えば、アンカー試薬は、低結合親和性相互作用及び／又は高分子量標識又は標識部位を有する検出複合体を安定化するのに役立つことができる。アンカー試薬は、２０２０年２月２８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０／０２０２８８号（「ＩＭＰＲＯＶＥＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＣＯＮＤＵＣＴＩＮＧ ＭＵＬＴＩＰＬＥＸＥＤ ＡＳＳＡＹＳ」と題される）に開示されており、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一態様では、アンカー試薬は、オリゴヌクレオチド配列、アプタマー、アプタマーリガンド、抗体、抗原、リガンド、受容体、ハプテン、エピトープ、又はミモトープを含む。一態様では、アンカー試薬は一本鎖オリゴヌクレオチド配列を含み、アンカーオリゴヌクレオチドと呼ぶことができる。一態様では、アンカーオリゴヌクレオチドは、検出複合体に結合したアンカー配列相補体のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。一態様では、アンカー領域を有するオリゴヌクレオチドは、検出複合体に付着している。一態様では、アンカー試薬は、検出複合体に付着したアンカー領域に結合するＤＮＡ結合タンパク質である。一態様では、アンカー試薬はインターカレーターであり、検出複合体に付着したアンカー領域は二本鎖オリゴヌクレオチド配列である。一態様では、検出複合体に付着したアンカー領域は、アンカー試薬によって結合される１つ以上の修飾オリゴヌクレオチド塩基を含む。
一態様では、アンカー試薬は、検出複合体に付着したアンカー配列補体にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有するアンカーオリゴヌクレオチドを含む。一態様では、アンカーオリゴヌクレオチドは、検出複合体に付着している伸長配列（又はアンプリコン）に存在するアンカー配列補体にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有する。一態様では、アンカーオリゴヌクレオチドは、検出試薬に結合しない伸長配列（又はアンプリコン）のアンカー配列補体にハイブリダイズする配列を含む。アンカーオリゴヌクレオチド配列は、本明細書に記載の伸長プロセス中に検出複合体に付着する伸長配列（又はアンプリコン）にハイブリダイズすることができる任意の配列を含むことができる。一態様では、アンカー配列補体にハイブリダイズするアンカーオリゴヌクレオチド配列は、約２０ヌクレオチドの長さ、及び最大約３０ヌクレオチドの長さである。一態様では、アンカー試薬は、アンカー配列及びオリゴヌクレオチドタグを含み、オリゴヌクレオチドタグは、アンカー試薬を支持体表面に固定化する。一態様では、アンカー試薬は、アンカー配列、オリゴヌクレオチドタグ、及びポリ（Ａ）オリゴヌクレオチド配列などのリンカーを含む。
アンカー試薬は、オリゴヌクレオチドを固定するための当該技術分野で知られている方法を使用して、共有結合的又は非共有結合的に、支持体表面に直接又は間接的に結合することができる。一態様では、アンカー試薬は、固体支持体上に直接固定化される。一態様では、アンカー試薬は、固体支持体に間接的に固定化される。一態様では、アンカー試薬は、支持体表面に共有結合的に付着している。一態様では、アンカー試薬は、支持体表面に共有結合的に付着している。一態様では、支持体表面は、１つ以上の、又は複数の捕捉分子を含む。一態様では、捕捉分子は、一本鎖オリゴヌクレオチドタグのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する一本鎖捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、アンカー試薬は、アンカー配列を含む。一態様では、アンカー配列は、検出複合体から伸長するアンプリコンのアンカー配列相補体に相補的である。一態様では、アンカー試薬は、オリゴヌクレオチドタグを含む。一態様では、アンカー試薬は、アンカー試薬のオリゴヌクレオチドタグと、支持体表面にハイブリダイズする相補的配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションによって支持体表面に固定化される。
一態様では、アンカー試薬は、アンカー配列相補体又は捕捉オリゴヌクレオチドに相補的ではないオリゴヌクレオチド配列を含む。一態様では、非相補的領域は、検出複合体のアンカー配列相補体に相補的であるアンカーオリゴヌクレオチドの領域を、表面から離れて伸長するように機能するリンカー配列を含む。一態様では、リンカー配列は、ポリ（Ａ）配列を含む。
一態様では、アンカー試薬のアンカー配列は、長さが約１０～約３０、又は約１７～約２５の核酸を有するオリゴヌクレオチドを含む。一態様では、アンカー試薬のアンカー配列は、長さが約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、又は約２０、及び最大約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、又は約３０核酸の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。一態様では、アンカー試薬のアンカー配列は、長さが約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、又は約３０核酸の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。一態様では、アンカー試薬は、長さが約１７又は約２５のオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む。
一態様では、アンカー試薬のアンカー配列は、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡ－３’（配列番号１６６９）を含むヌクレオチド配列を有する。一態様では、アンカー試薬のアンカー配列は、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡ－３’（配列番号１６６９）からなるヌクレオチド配列を有する。一態様では、アンカー試薬のアンカー配列は、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＧＣＣＧＴＣＡＡ－３’（配列番号１６６５）を含むヌクレオチド配列を有する。一態様では、アンカー試薬のアンカー配列は、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＧＣＣＧＴＣＡＡ－３’（配列番号１６６５）からなるヌクレオチド配列を有する。
一態様では、アンカー試薬のセットが提供され、各アンカー試薬は、オリゴヌクレオチドタグ、リンカー、及びアンカーオリゴヌクレオチドを含む。一態様では、各アンカー試薬は、５’オリゴヌクレオチドタグ、ポリＡリンカー、及び３’アンカーオリゴヌクレオチドを含む。一態様では、１０個のアンカー試薬のセットが、１０スポットアッセイで使用するために提供される。一態様では、１０個のアンカー試薬のセットが、相補的オリゴヌクレオチド捕捉分子がアッセイプレートのウェル内の１０個の別個の結合ドメインに固定化されている１０スポットアッセイプレートと共に使用するために提供される。
一態様では、セット内のアンカー試薬のうちの１つ以上は、同じリンカー配列を含む。一態様では、セット内のアンカー試薬のうちの１つ以上は、セット内の他のアンカー試薬とは異なるリンカー配列を含む。一態様では、セット内のアンカー試薬の各々は、同じリンカー配列を含む。一態様では、リンカー配列は、ポリＡ配列を含む。一態様では、リンカー配列は、約１～約１０のアデニン塩基を含む。一態様では、リンカー配列は、約１、約２、約３、約４、又は約５～最大約６、約７、約８、約９又は約１０個のアデニン塩基を含む。一態様では、リンカー配列は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、又は約１０個のアデニン塩基を含む。一態様では、リンカー配列は、約５個のアデニン塩基を含む。一態様では、リンカー配列は、約６個のアデニン塩基を含む。一態様では、リンカー配列は、約７個のアデニン塩基を含む。
一態様では、アンカー試薬のうちの１つ以上は、セット内の他のアンカー試薬と同じアンカー配列を含む。一態様では、アンカー試薬のうちの１つ以上は、セット内の他のアンカー試薬とは異なるアンカー配列を含む。一態様では、セット内のアンカー試薬の各々は、同じアンカー配列を含む。
一態様では、表２６に示されるものなどの１０個のアンカー試薬のセットが、１０スポットアッセイプレートと共に使用するために提供される。
Ｅ．支持体表面
一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドが支持体表面に固定化されている。捕捉オリゴヌクレオチドは、従来の結合アッセイで使用される支持体表面を含む、様々な支持体表面に固定化され得る。一態様では、支持体表面は、平坦な表面を有する。別の態様では、支持体表面は、曲面を有する。一態様では、支持体表面は、アッセイプレート、スライド、カートリッジ、ビーズ、又はチップなどのアッセイモジュールを含む。一態様では、支持体表面は、色分けされたミクロスフェアを含む。例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＢＡＤＧＥ，ＢｅａｄｓＡｒｒａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａ Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏａｓｓａｙ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（１１）：１８８８－１８９８を参照されたい。一態様では、支持体表面は、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドが固定化されている１つ以上のビーズを含む。
支持体表面は、ポリスチレン及びポリプロピレンなどのポリマー、セラミック、ガラス、例えば、カーボンベースのインクなどのカーボン－ポリマー複合材料を含む複合材料を含む、様々な適切な材料から作製することができる。一態様では、支持体表面は、カーボンベースの支持体表面である。
一態様では、支持体表面は、１つ以上の粒子又は「ビーズ」によって提供される。一態様では、ビーズは、最大約１ｃｍ（又は１０，０００μｍ）、５，０００μｍ、１，０００μｍ、５００μｍ、又は１００μｍまでの直径を有することができる。一態様では、ビーズは、約１０ｎｍ～約１００μｍ、約１００ｎｍ～約１０μｍ、又は約０．５μｍ～約５μｍの直径を有する。一態様では、ビーズは常磁性であり、磁場を使用することによってビーズを捕捉する能力を提供する。一態様では、支持体表面は、ストレプトアビジン又はアビジンでコーティングされた磁性ビーズによって提供され、ビオチン標識された捕捉オリゴヌクレオチドは、ビーズ上に固定化される。
一態様では、支持体表面は、複数のウェルを備えたプレート、すなわち「マルチウェルプレート」である。マルチウェルプレートは、任意のパターン又は構成で配置された、任意のサイズ又は形状の任意の数のウェルを含むことができる。一態様では、マルチウェルプレートは、約１～約１０，０００のウェルを含む。一態様では、マルチウェルアッセイプレートは、プレート及びウェルの数、サイズ、形状、及び構成について業界標準のフォーマットを使用する。標準フォーマットの例としては、９６、３８４、１５３６、及び９６００ウェルプレートが挙げられ、ウェルは２次元アレイで構成されている。他のマルチウェルフォーマットとしては、シングルウェル、２ウェル、６ウェル、２４ウェル、及び６１４４ウェルプレートが挙げられる。一態様では、支持体表面は、９６ウェルプレートを含む。
一態様では、支持体表面は、捕捉分子が結合ドメインと呼ばれる既知の位置に印刷される２次元のパターン化されたアレイを含む。一態様では、支持体表面は、捕捉オリゴヌクレオチドが固定化される個別の、重複しない、アドレス可能な結合ドメインのパターン化されたアレイを含み、各結合ドメインにおける捕捉オリゴヌクレオチドの配列は知られており、適切な標的分析物又は標的反応生成物と相関させることができる。一態様では、特定の結合ドメイン内の全ての捕捉オリゴヌクレオチドは同じ配列を有し、ある結合ドメイン内の捕捉オリゴヌクレオチドは、他の結合ドメイン内の捕捉オリゴヌクレオチドとは異なる配列を有する。一態様では、複数の結合ドメインが支持体表面上に整然とした行及び列に配列され、各結合ドメインの正確な位置及び配列がコンピュータデータベースに記録される。一態様では、アレイは、対称的なグリッドパターンで配置される。他の態様では、アレイは、放射状に分布した線、らせん状の線、又は順序付けられたクラスターを含むがこれらに限定されない別のパターンで配置される。別の態様では、各結合ドメインは、１つ以上の微粒子又はビーズの表面上に位置決めされ、微粒子又はビーズは、異なる結合ドメイン間の識別を可能にするようにコード化されている。
一態様では、支持体表面は、捕捉分子及びアンカー試薬が結合ドメインと呼ばれる既知の位置に固定化される２次元のパターン化されたアレイを含む。一態様では、捕捉分子及びアンカー試薬は、同じ結合ドメイン上に配置される。一態様では、捕捉分子及びアンカー試薬は、２つの別個の結合ドメイン上に配置される。一態様では、支持体表面は、複数の別個の結合ドメインを含み、捕捉分子及びアンカー試薬は、同じ結合ドメイン上に配置される。一態様では、支持体表面は、複数の別個の結合ドメインを含み、捕捉分子及びアンカー試薬は、２つの別個の結合ドメイン上に配置される。一態様では、支持表面はプレートのウェルであり、ウェルは、捕捉分子及びアンカー試薬が配置される複数の別個の結合ドメインを含む。一態様では、ウェルは、捕捉分子及びアンカー試薬がウェル内の２つの別個の結合ドメイン上に配置される複数の別個の結合ドメインを含む。一実施形態では、ウェルは、捕捉分子及びアンカー試薬がウェル内の同じ結合ドメイン上に配置される複数の別個の結合ドメインを含み得る。一態様では、ウェルは、捕捉分子及びアンカー試薬が電極上の同じ結合ドメイン上に配置される複数の別個の結合ドメインを含む電極を含む。一態様では、ウェルは、捕捉分子及びアンカー試薬が電極上の２つの別個の結合ドメイン上に配置される複数の別個の結合ドメインを含む電極を含む。一態様では、支持体表面は、電極を含み、測定工程は、電極に電圧波形を印加して、電気化学発光（ＥＣＬ）シグナルを生成することを含む。
一態様では、支持体表面は、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドに対応する各ウェル内の１つ以上の個別のアドレス可能な結合ドメインを含むマルチウェルプレートである。一態様では、支持体表面は、野生型ヌクレオチド配列を検出するための少なくとも１つの結合ドメインと、変異ヌクレオチド配列を検出するための別個の結合ドメインとを含む。一態様では、各ウェルは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個の結合ドメインを含む。一態様では、各ウェルは、少なくとも７、１０、１６、又は２５個の結合ドメインを含む。
一態様では、支持体表面は、少なくとも２４、９６、又は３８４ウェルを含むマルチウェルプレートであり、各ウェルは、異なる捕捉オリゴヌクレオチドが個別の結合ドメインに固定化されている最大１０個の結合ドメインのアレイを含む。より特定の態様では、支持体表面は、各ウェルが最大１０個の結合ドメインを有するアレイを含む９６ウェルプレートである。一態様では、９６ウェルプレートの各ウェルは、最大１０個の結合ドメインを含み、その上に最大１０個の個別の捕捉オリゴヌクレオチドが固定化されている。一態様では、各ウェルは、同じ捕捉オリゴヌクレオチドを有する同じパターン化されたアレイを含む。別の態様では、異なるウェルは、捕捉オリゴヌクレオチドの異なるパターン化されたアレイを含み得る。
一態様では、支持体表面は、一連の別個の結合ドメインを含む。一態様では、支持体表面は、各ウェルに一連の別個の結合ドメインを含むマルチウェルプレートを含む。一態様では、各結合ドメインは、一本鎖捕捉オリゴヌクレオチド及びアンカーオリゴヌクレオチドを含む。一態様では、一本鎖捕捉オリゴヌクレオチド及びアンカーオリゴヌクレオチドは、各ウェルの１つ以上の別個の結合ドメインに固定化されている。一態様では、各結合ドメインは、一本鎖捕捉オリゴヌクレオチド及びアンカーオリゴヌクレオチドを含む。一態様では、支持体表面は、各ウェル内に約２～約１５０個の別個の結合ドメイン、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０若しくは最大６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０又は１５０個の結合ドメインを含む。一態様では、支持体表面は、各ウェル内に最大１０個の別個の結合ドメインを含む。一態様では、特定の結合ドメイン内の全ての捕捉オリゴヌクレオチドは同じ配列を有し、特定の結合ドメイン内の全てのアンカーオリゴヌクレオチドは同じ配列を有する。一態様では、ある結合ドメイン内の捕捉オリゴヌクレオチドは、他の結合ドメイン内の捕捉オリゴヌクレオチドとは異なる配列を有する。一態様では、ある結合ドメイン内のアンカーオリゴヌクレオチドは、他の結合ドメイン内のアンカーオリゴヌクレオチドと同じ配列を有する。
一態様では、捕捉オリゴヌクレオチド及びアンカーオリゴヌクレオチドは、各ウェル内の別個の結合ドメインに固定化されている。一態様では、支持体表面は、捕捉オリゴヌクレオチドを共動かし、別個の結合ドメインにオリゴヌクレオチドをアンカーすることによって調製される。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチド及びアンカーオリゴヌクレオチドは、捕捉オリゴヌクレオチド及びアンカーオリゴヌクレオチドをマルチウェルプレートのウェルのアレイにスポット又は印刷することによって固定化されている。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチド及びアンカーオリゴヌクレオチドは、例えば、コンタクトピン印刷又はマイクロスタンピングを含む接触印刷によって、又は、例えば、フォトリソグラフィー、レーザー書き込み、エレクトロスプレー蒸着、及びインクジェット印刷を含む非接触印刷によってスポット又は印刷される。
一態様では、アンカーオリゴヌクレオチド及び捕捉オリゴヌクレオチドは、共に、反応性官能基を含む。一態様では、官能基は、チオール（－ＳＨ）又はアミン（－ＮＨ２）基を含む。一態様では、アンカーオリゴヌクレオチド及び捕捉オリゴヌクレオチドは、反応性官能基を介して支持体表面に固定化されている。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチド、アンカーオリゴヌクレオチド又は両方は、リンカーを介して捕捉又はアンカーオリゴヌクレオチドに付着している反応性官能基を介して支持体表面に固定化されている。
一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、チオール修飾を含み、チオール部分を介して支持体表面上に固定化されている。一態様では、チオール修飾捕捉オリゴヌクレオチドは、ｎ－メルカプトプロパノール修飾を含む。一態様では、チオール修飾捕捉オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端に連結したｎ－メルカプトプロパノール修飾を含む。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、リンカー（本明細書では「スペーサー」とも呼ばれる）を介して捕捉オリゴヌクレオチドに付着しているチオール又はアミン基を介して支持体表面に固定化されている。一態様では、リンカーは、約３～約２０個の原子若しくは分子若しくは単位、又は少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０～最大約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０個の原子若しくは分子若しくは単位を含む。一態様では、リンカーは、炭素原子リンカーである。一態様では、リンカーは、エチレングリコールリンカー、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーである。一態様では、リンカーは、最大３、４、５、又は６個の連続するＰＥＧ単位を含む。別の態様では、リンカーは、３つの連続するＰＥＧ単位を含む。別の態様では、リンカーは、６つの連続するＰＥＧ単位を含む。
一態様では、アンカーオリゴヌクレオチドは、チオール修飾を含み、チオール部分を介して支持体表面に固定化されている。一態様では、チオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドは、ｎ－メルカプトプロパノール修飾を含む。一態様では、チオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端に連結したｎ－メルカプトプロパノール修飾を含む。一態様では、アンカーオリゴヌクレオチドは、リンカー（本明細書では「スペーサー」とも呼ばれる）を介してアンカーオリゴヌクレオチドに付着しているチオール又はアミン基を介して支持体表面に固定化されている。一態様では、リンカーは、約３～約２０個の原子若しくは分子若しくは単位、又は少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０～最大約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０個の原子若しくは分子若しくは単位を含む。一態様では、リンカーは、炭素原子リンカーである。一態様では、リンカーは、エチレングリコールリンカー、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーである。一態様では、リンカーは、最大３、４、５、又は６個の連続するＰＥＧ単位を含む。別の態様では、リンカーは、３つの連続するＰＥＧ単位を含む。別の態様では、リンカーは、６つの連続するＰＥＧ単位を含む。
一態様では、捕捉オリゴヌクレオチド、アンカーオリゴヌクレオチド、又はその両方は、チオール修飾を含み、チオール部分を介して支持体表面に固定化されている。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチド、アンカーオリゴヌクレオチド、又はその両方は、リンカーを介して付着しているチオール基を介して支持体表面に固定化されている。一態様では、リンカーは、炭素原子リンカーである。一態様では、リンカーは、エチレングリコールリンカー、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーである。一態様では、リンカーは、最大３、４、５、又は６個の連続するＰＥＧ単位を含む。別の態様では、リンカーは、３つの連続するＰＥＧ単位を含む。別の態様では、リンカーは、６つの連続するＰＥＧ単位を含む。
一態様では、チオール修飾捕捉オリゴヌクレオチド及びチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドは、緩衝溶液中にチオール修飾オリゴヌクレオチドを含む印刷溶液を使用して固定化されている。一態様では、印刷溶液は、リン酸ナトリウム、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、トレハロース、及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む。一態様では、チオール修飾捕捉オリゴヌクレオチド及びチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドは、同じ印刷溶液に含まれる。一態様では、チオール修飾捕捉オリゴヌクレオチド及びチオール修飾アンカーオリゴヌクレオチドは、支持体表面に同時に固定化されている。
Ｆ．電極
一態様では、例えば、ポリペプチド又は核酸配列を含む標的分析物は、電気化学発光を使用して同定、検出、又は定量化される。電気化学発光を使用する分析物の多重測定は、米国特許第７，８４２，２４６号及び同第６，９７７，７２２号に記載されており、それらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一態様では、支持体表面は、１つ以上の電極を含む。一態様では、支持体表面は、１つ以上の作用電極及び１つ以上の対電極を含む。一態様では、支持体表面は、電気化学的又は電気化学発光アッセイで使用するために、１つ以上の電極上に形成された１つ以上の結合ドメインを含む。
一態様では、結合ドメインは、捕捉オリゴヌクレオチドでコーティングされたビーズを電極表面上に収集することによって形成される。一態様では、ビーズは常磁性であり、ビーズは、磁場を使用することによって電極上に収集される。
一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、支持体表面上の１つ以上の電極上の１つ以上の結合ドメインに共有結合的に又は非共有結合的に固定化されている。一態様では、複数の個別の結合ドメインが、サンプル中の標的分析物の多重測定のために１つ以上の電極上に存在する。
一態様では、電極は、アッセイ容器、アッセイフローセル、アッセイ流体工学、又はアッセイを実行するのに有用な他の成分を提供するアッセイモジュール内に提供される。電気化学発光アッセイを実行するためのアッセイモジュールの例としては、例えば、マルチアレイケース、アッセイプレートケース、カートリッジケースなどが挙げられる。一態様では、電極は、アッセイ容器、アッセイフローセル、アッセイ流体工学、又はアッセイを実行するのに有用な他の成分を提供するアッセイモジュール内に提供される。電気化学発光アッセイを実行するためのアッセイモジュールの例は、米国特許第６，６７３，５３３号、同第７，８４２，２４６号、同第９，７３１，２９７号、及び同第８，２９８８３４号に記載されている。一態様では、支持体表面は、少なくとも１つの電極を含むマルチウェルプレートである。一態様では、マルチウェルアッセイプレートの各ウェルは、少なくとも１つの電極を含む。一態様では、マルチウェルアッセイプレートの少なくとも１つのウェルは、作用電極を含む。別の態様では、マルチウェルアッセイプレートの少なくとも１つのウェルは、作用電極及び対電極を含む。別の態様では、マルチウェルアッセイプレートの各ウェルは、作用電極及び対電極を含む。一態様では、作用電極は隣接しているが、対電極と電気的に接触していない。
一態様では、電極は、例えば、金、銀、白金、ニッケル、鋼、イリジウム、銅、アルミニウム、導電性合金、又はそれらの組み合わせなどの金属を含む導電性材料から構築される。別の態様では、電極としては、ケイ素及びゲルマニウムなどの半導体材料、又は酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）及び酸化アンチモンスズ（ＡＴＯ）などの半導体フィルムが挙げられる。別の態様では、電極としては、酸化アルミニウムでコーティングされたアルミニウムなどの酸化物でコーティングされた金属が挙げられる。一態様では、電極としては、カーボンベースの材料が挙げられる。一態様では、電極としては、導電性複合材料、インク、ペースト、ポリマーブレンド、及び金属／非金属複合材料を含有する材料の混合物が挙げられ、例えば、導電性又は半導電性材料と非導電性材料との混合物を含む。一態様では、電極としては、カーボン、ガラス状カーボン、カーボンブラック、グラファイトカーボン、カーボンナノチューブ、カーボンフィブリル、グラファイト、カーボンファイバー、及びそれらの混合物などのカーボンベースの材料が挙げられる。一態様では、電極としては、導電性カーボン－ポリマー複合材料、導電性ポリマー、又はマトリックス中に分散された導電性粒子、例えば、カーボンインク、カーボンペースト、又は金属インクが挙げられる。一態様では、作用電極は、例えば、マトリックス、例えば、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニルアセテート、ポリビニルクロリド、ポリビニルアルコール、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、又はこれらのポリマーのうちの１つ以上のコポリマーなどのポリマーマトリックスに分散された、カーボンフィブリル、カーボンブラック、又はグラファイトカーボンなどの導電性カーボン粒子を含むカーボン－ポリマー複合体からなる。
一態様では、作用電極は、連続導電性シート又は１つ以上の導電性材料のフィルムで作製されており、これらは、押し出し、プレス、又は成形することができる。別の態様では、作用電極は、例えば、印刷、塗装、コーティング、スピンコーティング、蒸着、化学蒸着、電解析出、無電解析出、フォトリソグラフィー又は他の電子機器微細加工技術によって、基板上に沈着又はパターン化された導電性材料で作製されている。一態様では、作用電極としては、例えば、インクジェット印刷、レーザー印刷、又はスクリーン印刷によって、ポリマー支持体上に印刷された導電性カーボンインクが挙げられる。カーボンインクは知られており、Ａｃｈｅｓｏｎ Ｃｏｌｌｏｉｄｓ Ｃｏ．（例えば、Ａｃｈｅｓｏｎ ４４０Ｂ、４２３ｓｓ、ＰＦ４０７Ａ、ＰＦ４０７Ｃ、ＰＭ－００３Ａ、３０Ｄ０７１、４３５Ａ、Ｅｌｅｃｔｒｏｄａｇ ５０５ＳＳ及びＡｑｕａｄａｇ（商標））、Ｅ．Ｉ．Ｄｕ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ａｎｄ Ｃｏ．（例えば、Ｄｕｐｏｎｔ ７１０５、７１０１、７１０２、７１０３、７１４４、７０８２、７８６１Ｄ、及びＣＢ０５０）、Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｉｎｃ（例えば、Ｃ－１００）、及びＥｒｃｏｎ Ｉｎｃ．（例えば、Ｇ－４５１）によって産生される材料が挙げられる。
一態様では、作用電極は、連続フィルムである。別の態様では、作用電極は、１つ以上の離散領域又は離散領域のパターンを含む。あるいは、作用電極は、複数の接続された領域を含み得る。作用電極上の露出電極表面の１つ以上の領域は、作用電極を覆うパターン化された絶縁層によって、例えば、作用電極上にパターン化された誘電性インク層をスクリーン印刷することによって、又はダイカット絶縁フィルムを接着することによって定義され得る。露出領域は、作用電極上に印刷された試薬のアレイのアレイ要素を定義することができ、上記のようにアレイの形状及びパターンをとることができる。一態様では、絶縁層は、露出した作用電極表面の一連の円形領域（又は「スポット」）を定義する。
対電極は、一般に作用電極について上記の特性のうちの１つ以上を有し得る。一態様では、作用電極及び対電極は、同じ材料で構築されている。別の態様では、作用電極及び対電極は、同じ材料から構築されておらず、例えば、作用電極は炭素電極であり得、対電極は金属電極であり得る。
一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、受動吸着によって１つ以上の電極に固定化される。別の態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドが電極上に共有結合的に固定化されている。一態様では、電極は、例えば、電極の表面に捕捉オリゴヌクレオチドなどの試薬を固定化するために、誘導体化又は修飾されている。一態様では、電極は、試薬の固定化を改善するために、例えば、試薬の固定化のための官能基を導入するために、又はその吸着特性を高めるために、化学的又は機械的処理によって修飾される。導入することができる官能基の例としては、カルボン酸（ＣＯＯＨ）、ヒドロキシ（ＯＨ）、アミノ（ＮＨ２）、活性化カルボキシル（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）－エステル）、ポリ－（エチレングリコール）、チオール、アルキル（（ＣＨ２）ｎ）基、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、１つ以上の試薬、例えば、捕捉オリゴヌクレオチドは、共有又は非共有手段のいずれかによって、カーボン含有電極、例えば、カーボンブラック、フィブリル、又は別の材料に分散されたカーボンに固定化される。チオール基を有する捕捉分子は、タンパク質層又は化学的架橋層などの追加のチオール反応性層を最初に沈着させる必要なしに、炭素含有電極、例えばスクリーン印刷されたカーボンインク電極に共有結合的に結合することができることが見出された。一態様では、チオール修飾オリゴヌクレオチドなどのチオール基を有する捕捉分子を電極に直接付着させるための方法が提供され、電極上に捕捉表面及びアレイを形成するための単純で、堅牢で、効率的かつ再現可能なプロセスを提供する。一態様では、チオール基を有する１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、最初にチオール反応性層を電極に加えることなく、チオールと電極との反応を通じて、スクリーン印刷されたカーボンインク電極などの炭素含有電極に直接固定化される。
一態様では、電極は、プラズマ、例えば、グロー放電プラズマなどの低温プラズマで処理されて、電極の物理的特性、化学組成、又は表面化学的特性を変化させ、例えば、捕捉オリゴヌクレオチドなどの試薬の固定化、又は汚染物質の低減、他の材料への接着の改善、表面の湿潤性の変更、材料の沈着の促進、パターンの作成、又は均一性の改善を補助する。有用なプラズマの例としては、酸素、窒素、アルゴン、アンモニア、水素、フルオロカーボン、水、及びそれらの組み合わせが挙げられる。一態様では、酸素プラズマを使用して、カーボン－ポリマー複合材料中のカーボン粒子で電極を処理する。別の態様では、酸素を使用して、カルボン酸又は他の酸化炭素官能基を炭素又は有機材料（例えば、活性エステル又は塩化アシル）に導入して、試薬のカップリングを促進する。別の態様では、アンモニア含有プラズマを使用して、アッセイ試薬のカップリングに使用するためのアミノ基を導入することができる。一態様では、電極は、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドの固定化を補助するために前処理されていない。
一態様では、支持体表面は、各ウェルに１つ以上の作用電極又は対電極を有するマルチウェルプレートなどのアッセイモジュールを含む。一態様では、マルチウェルプレートは、各ウェル内に複数の作用電極又は対電極を含む。一態様では、マルチウェルプレートの作用電極又は対電極は、カーボン、例えば、カーボンインクのスクリーン印刷された層を含む。一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、捕捉オリゴヌクレオチド上のチオール部分を介してスクリーン印刷されたカーボンインク上に固定化される。一態様では、作用電極は、反応生成物に付着している標識から電気化学発光シグナルを誘導するために使用される。一態様では、電気化学発光シグナルは、三級アルキルアミン、例えば、トリプロピルアミン又はブチルジエタノールアミンなどの共反応物の存在下で、ルテニウム－トリス－ビピリジンから放出される。
一態様では、電極は、誘電性インク（すなわち、電気絶縁性インク）によって定義される上記のような結合ドメインを含有する。電極は、上記の結合ドメインを定義するパターンで誘電体がその上に印刷された作用電極である。一態様では、結合ドメインは、露出した作用電極（又は「スポット」）のほぼ円形の領域である。電極は、射出成形された９６ウェルプレートの上部をウェルの下部を定義するマイラーシートに接着することによって形成された９６ウェルプレート内にある。マイラーシートの上面には、スクリーン印刷されたカーボンインク電極が印刷されており、各ウェルは、ウェルのほぼ中央にカーボンインク作用電極を含み、ウェルのほぼ２つの端に向かって２つのカーボンインク対電極を含む。マイラーシートの下部に印刷され、導電性の貫通穴を介してシートの上部に接続された電極は、作用電極及び対電極に電圧を印加するための接点を提供する。
Ｇ．捕捉分子を固定化する方法
一態様では、１つ以上の捕捉分子を支持体表面に固定化する方法が提供される。一態様では、１つ以上の捕捉分子は、本明細書に記載されるような１つ以上の一本鎖捕捉オリゴヌクレオチド分子を含む。
一態様では、この方法は、カーボンベースの支持体表面を含む支持体表面上に１つ以上の捕捉分子を固定化することを含む。一態様では、この方法は、１つ以上の電極を含む支持体表面上に１つ以上の捕捉分子を固定化することを含む。一態様では、この方法は、１つ以上のカーボンベースの電極を含む支持体表面上に１つ以上の捕捉分子を固定化することを含む。
一態様では、支持体表面は、１つ以上の電極を含むマルチウェルプレートである。一態様では、支持体表面は、各ウェルに１つ以上の電極を含むマルチウェルプレートである。一態様では、１つ以上の捕捉分子が、アレイ内の支持体表面に固定化されている。
一態様では、この方法は、マルチウェルプレートの第１のウェルの第１の電極上にアレイ内の２つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドをスポット又は印刷し、続いてマルチウェルプレートの１つ以上の追加ウェルの電極上のアレイ内の１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを印刷することを含む。一態様では、各ウェルの印刷されたアレイのうちの少なくともいくつかは同じである。別の態様では、各ウェルの印刷されたアレイのうちの少なくともいくつかは異なる。
一態様では、１つ以上の捕捉分子は、結合ドメインと呼ばれる、アレイ内の１つ以上の既知の位置にスポット又は印刷される。一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、個別の、重複しない、アドレス可能な結合ドメインに固定化され、各結合ドメインにおける捕捉オリゴヌクレオチドの配列は既知であり、標的分析物と相関させることができる。一態様では、特定の結合ドメイン内の全ての捕捉オリゴヌクレオチドは同じ配列を有し、ある結合ドメイン内の捕捉オリゴヌクレオチドは、他の結合ドメイン内の捕捉オリゴヌクレオチドとは異なる配列を有する。
一態様では、１つ以上の捕捉分子が、支持体表面上の個別の結合ドメイン上にスポット又は印刷される。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドのアレイが、支持体表面上の個別の結合ドメイン上にスポット又は印刷される。一態様では、捕捉分子は、例えば、コンタクトピン印刷又はマイクロスタンピングを含む接触印刷によって、又は、例えば、フォトリソグラフィー、レーザー書き込み、エレクトロスプレー蒸着、及びインクジェット印刷を含む非接触印刷によってスポット又は印刷される。一般に、スポッティング又は印刷方法は、１つ以上の捕捉分子を含む１つ以上の液滴を支持体表面上の個別の結合ドメインに適用し、液滴を乾燥させることを含む。一態様では、液滴は、支持体表面の領域を覆うように広がることができる。一態様では、支持体表面は、より高い濡れ性の１つ以上の領域及びより低い濡れ性の１つ以上の領域を含み、より高い濡れ性の領域は、結合ドメイン又はアレイ要素を定義する。濡れ性とは、液体と固体表面との相互作用、より具体的には、水溶液が固体表面に広がらず、収縮して液滴を形成する現象を指す。一態様では、固体支持体は、少量の水溶液が１つ以上の個別の結合ドメインに分配されるときに液滴形成を促進する表面特性を有する。高い濡れ性領域に印刷された捕捉分子の溶液は、低い濡れ性領域との境界に広がり、結合ドメインの形状及び位置を正確に制御する。一態様では、結合ドメインは、作用電極上の露出電極表面の領域であり、作用電極上のパターン化された絶縁層（例えば、スクリーン印刷されたカーボンインク電極上のスクリーン印刷された誘電性インク）は、露出電極領域のより低い湿潤性境界を定義する。
オリゴヌクレオチドを支持体表面に固定化する方法が知られており（例えば、Ｂａｌａｓｈｅｂ Ｎｉｍｓｅ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ：Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｅｎｓｏｒｓ．１４（２）：２２２０８－２２２２９を参照されたい）、一般に以下のメカニズム、（１）例えば、電荷－電荷又は疎水性相互作用による物理的吸着、（２）例えば、化学結合を介した、共有結合による固定化、及び（３）ストレプトアビジン－ビオチン固定化などの非共有結合タンパク質－リガンド相互作用、のうちの１つ以上に基づいている。一態様では、１つ以上のオリゴヌクレオチドは、官能化された支持体表面に固定化されている。一態様では、１つ以上のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の官能基を含むように修飾されていない支持体表面に固定化されている。一態様では、１つ以上のオリゴヌクレオチドは、以下の部分、アミン、ニトロセルロース、ポリ（１－リジン）、ＰＡＡＨ、及びジアゾニウムのうちの１つ以上を含む支持体表面への物理的吸収によって固定化される。一態様では、１つ以上のオリゴヌクレオチドは、例えば、チオール（－ＳＨ）又はアミン（－ＮＨ２）基、又はヒドラジド基を介した共有相互作用によって支持体表面に固定化されている。一態様では、支持体表面は、例えば、カルボキシル（－ＣＯＯＨ）、アルデヒド（－ＣＨＯ）、エポキシ（－ＣＨＣＨ２Ｏ）、イソチオシアネート（－Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）、マレイミド（－ＨＣ２（ＣＯ）２ＮＨ）、若しくはメルカプトシラン（－Ｓｉ－Ｒ－ＳＨ）を含む反応性官能基を含むか、又は含むように修飾される。一態様では、オリゴヌクレオチドは、例えば、チオール、アミン、若しくはヒドラジド基を含む反応性官能基を含むか、又は含むように修飾される。一態様では、１つ以上のオリゴヌクレオチドは、支持体表面に存在する求核性又は求電子性の官能基を介して支持体表面に固定化されている。
一態様では、１つ以上の捕捉分子は、チオール基を含む。一態様では、１つ以上の捕捉分子は、捕捉分子上に存在するチオール基を介して支持体表面に固定化されている。一態様では、この方法は、チオール基を含む１つ以上の捕捉分子をカーボンベースの支持体表面にスポット又は印刷し、印刷された支持体表面をインキュベートして、チオール基を介して支持体表面に１つ以上の捕捉分子を固定化することを含む。一態様では、１つ以上の捕捉分子は、チオール基を介して支持体表面に共有結合的に付着している。
一態様では、１つ以上の捕捉分子は、捕捉分子を含有する液滴（例えば、５０ｎＬ）を支持体表面に印刷することによって支持体表面に固定化され、液滴を広げ、液滴を乾燥させ、捕捉分子を支持体表面に固定化するのに十分な時間（例えば、一晩）、乾燥した液滴をインキュベートする。一態様では、チオール基を含む１つ以上の捕捉分子は、捕捉分子を含有する液滴を支持体表面に印刷することによってカーボンベースの支持体表面に固定化され、液滴を広げ、液滴を乾燥させ、チオール基を介して捕捉分子を支持体表面に固定化するのに十分な時間、乾燥した液滴をインキュベートする。一態様では、液滴は、アレイで印刷される。一態様では、液滴は、１つ以上の結合ドメインで印刷される。一態様では、カーボンベースの支持体表面は、１つ以上のカーボンベースの電極を含む。一態様では、１つ以上の捕捉分子は、チオール基を介してカーボンベースの電極に共有結合的に付着している。一態様では、パターン化された絶縁層がカーボンベースの支持体表面に含まれ、支持体表面に印刷された液滴の広がりを区切る。
一態様では、カーボンベースの支持体表面は、例えば、支持体表面に１つ以上の官能基を導入するために、例えば、捕捉分子上のチオール基と支持体表面との間の反応性を高めるために前処理される。一態様では、カーボンベースの支持体表面は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質で前処理されている。別の態様では、カーボンベースの支持体表面は、チオール基を介して支持体表面に１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを固定化する前に、支持体表面に官能基を導入するために前処理されない。一態様では、支持体表面は、捕捉分子及び支持体表面上のチオール基の反応性を高めるためにタンパク質で修飾されていない。
一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドが表面にスポット又は印刷されて遊離捕捉オリゴヌクレオチド（すなわち、支持体表面に固定化されていない捕捉オリゴヌクレオチド）を除去した後、支持体表面を洗浄（又はブロッキング）溶液で洗浄する（本明細書では「ブロッキング」ステップとも呼ばれ、例えば、実施例３を参照されたい）。一態様では、支持体表面は、印刷及び乾燥後に洗浄溶液で洗浄される。一態様では、支持体表面は、乾燥パッケージに包装される前に洗浄される。別の態様では、支持体表面は、乾燥パッケージに包装された後に洗浄される。
一態様では、洗浄又はブロッキングステップは、洗浄又はブロッキング溶液を表面に添加し（例えば、９６ウェルアッセイプレートの場合、１ウェル当たり５０ｕＬの溶液）、３０～６０分間インキュベートすることを含む。インキュベーション温度は、任意の都合のよい温度、例えば、室温又は３７℃であり得る。インキュベーションは、表面を振とうしながら行ってもよい。洗浄又はブロッキングステップは、洗浄又はブロッキング溶液を除去し、ＰＢＳなどの緩衝液で表面をすすぐことを含み得る。
一態様では、洗浄溶液は、チオール含有化合物を含む。洗浄ステップ中に、カーボンベースの電極上の１つの結合ドメインからの過剰なチオール含有捕捉分子が別の結合ドメインに移動し、恒久的に固定される可能性がある。捕捉分子のこの移動、及び結果として生じる結合ドメインの交差汚染は、洗浄溶液にチオール含有化合物を含めることによって低減することができる。理論に拘束されることを望まないが、洗浄溶液中のチオール含有化合物は、遊離（非結合）捕捉オリゴヌクレオチドと競合し、異なる結合ドメインから除去される過剰捕捉オリゴヌクレオチドの結合による結合ドメインの交差汚染を防止すると考えられている。一態様では、洗浄溶液は、水溶性チオール含有化合物を含む。一態様では、洗浄溶液は、約２００ｇ／モル、約１７５ｇ／モル、約１５０ｇ／モル、又は約１２５ｇ／モル未満の分子量を有する水溶性チオール含有化合物を含む。一態様では、水溶性チオール含有化合物は、双性イオンを含む。
一態様では、洗浄溶液は、システイン（例えば、Ｌ－システイン）、システアミン、ジチオスレイトール、３－メルカプトプロプリオノエート、及び３－メルカプト－１－プロパンスルホン酸から選択される水溶性チオールを含む。一態様では、水溶性チオール含有化合物は、システインを含む。
一態様では、洗浄溶液は、ｐＨ緩衝成分を含む。一態様では、ｐＨ緩衝成分は、トリスを含む。一態様では、洗浄溶液は、界面活性剤を含む。一態様では、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む。一態様では、洗浄溶液は、金属キレート剤を含む。
一態様では、洗浄溶液は、約５ｍＭ～約７５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、約２５ｍＭ及び約７５ｍＭ、又は約５０ｍＭのチオール含有化合物を含む。一態様では、洗浄溶液は、約５ｍＭ～約７５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、約２５ｍＭ及び約７５ｍＭ、又は約５０ｍＭのシステインを含む。一態様では、洗浄溶液は、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、又は約１５ｍＭ～約２５ｍＭ、又は約２０ｍＭのトリスなどの緩衝液を含む。一態様では、洗浄溶液は、約０．０５％～約０．５％、又は約０．０５％～０．２％、又は約０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００などの界面活性剤を含む。一態様では、洗浄溶液は、約７～約９、約７．５～約８．５、又は約８．０のｐＨを有する。
一態様では、洗浄溶液又はブロッキング溶液としては、以下の試薬、（ｉ）ＰＳ２０、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（約１，０００ｋＤ又は約３６０ｋＤ）、フィコール、及びポリエチレングリコール（約３ｋＤ及び約１０ｋＤ）を含むがこれらに限定されないハイブリダイゼーションアッセイのバックグラウンドシグナルを低減するために有用な既知のポリマーと、（ｉｉ）サーモン精子ＤＮＡ、ニシンＤＮＡ、仔ウシ胸腺ＤＮＡ、せん断ポリＡ、酵母ｔＲＮＡを含むがこれらに限定されない核酸又はその他のポリアニオン、及びヘパリンと、（ｉｉｉ）ＢＳＡ及びポリＢＳＡを含むがこれらに限定されないモノマー及び高分子タンパク質ブロッキング剤と、（ｉｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、ｔｒｉｔｏｎ－１００、及びｔｗｅｅｎ－２０を含むがこれらに限定されない界面活性剤と、（ｖ）ホルムアミド及びプロピレングリコールを含むがこれらに限定されない水素結合不安定化剤と、のうちの１つ以上が挙げられる。
一態様では、この方法は、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを支持体表面に固定化し、次いで、過剰の固定化されていない捕捉オリゴヌクレオチドを洗浄溶液で支持体表面から洗い流すステップを含む。一態様では、洗浄は、ストリンジェントな洗浄条件下で固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを洗浄することを含む。一態様では、ストリンジェントな洗浄条件は、約２７℃～約４７℃の温度、約２１％～約４１％のホルムアミド濃度、約３００ｍＭ～約５００ｍＭの塩濃度、及び約７．５～約８．５のｐＨを含む。一態様では、高ストリンジェンシー条件は、約３７℃の温度、約３１％のホルムアミド濃度、約４００ｍＭの塩濃度、及び８．０のｐＨを含む。一態様では、固定化されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも５、１０、３０、又は６０分間、高ストリンジェンシー条件に曝露される。別の態様では、高ストリンジェンシー条件は、低塩条件、例えば、約４０ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、又は１０ｍＭ未満の塩濃度を有する緩衝液を含む。一態様では、高ストリンジェンシー条件は、３７℃での０．１倍ＰＢＳなどの低塩条件を含む。
一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドが、アレイ内の支持体表面に固定化されている。一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、１つ以上の結合ドメインにおいて支持体表面に固定化されている。一態様では、アレイの１つの結合ドメインに印刷された捕捉オリゴヌクレオチドは、アレイ内の他の結合ドメインに印刷された捕捉オリゴヌクレオチドとは異なる配列を有する。
理論に拘束されることを望まないが、洗浄溶液は、緩く結合した捕捉オリゴヌクレオチドを溶液にもたらし、そこから、ＳＨ共有結合又は他のメカニズムのいずれかを介してそれらが表面に再沈着する可能性があると考えられている。捕捉オリゴヌクレオチドが、異なるヌクレオチド配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドを有する結合ドメイン上に再沈着される場合、それは汚染捕捉分子と考えられる。汚染捕捉分子の存在は、アッセイの結果を妨げる可能性がある。一態様では、本明細書に記載の方法によって調製されたアレイの結合ドメインは、約０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、又は０．０１％未満の汚染捕捉分子を含む。
一態様では、捕捉分子のセットの結合パートナー（すなわち、オリゴヌクレオチドタグ）間の交差反応性は、約０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、又は０．０１％未満である。一態様では、アッセイの特異性（非相補的配列の結合又は捕捉オリゴヌクレオチドの交差汚染のいずれかからの交差反応性を含む）が決定される。一態様では、特異性は、ＱＣプローブがプレート表面に固定化された対応する相補的捕捉分子にハイブリダイズする条件下で、１つ以上の標識ＱＣプローブを含有する１つ以上のサンプルを１つ以上の複製プレートに加えることによって決定される。次いで、プレートを洗浄して過剰なＱＣプローブを除去し、一次標識の検出又は二次結合パートナーの添加のいずれかによって、結合したＱＣプローブの存在を検出する。交差反応性は、各アレイについて、例えば、マルチウェルプレートの各ウェルについて、非特異的捕捉ヌクレオチドを有するスポットへのプローブの結合から検出されたシグナルとして、対応する相補的捕捉ヌクレオチドを有するスポットへのプローブの結合からのシグナルのパーセンテージとして計算することができる。一態様では、計算には、ＱＣプローブがない場合に検出された非特異的バックグラウンドシグナルの補正が含まれる。
一態様では、アッセイの特異性は、一連の品質管理（ＱＣ）オリゴヌクレオチドプローブを使用して決定される。一態様では、ＱＣプローブは、表面に固定化された非交差反応性捕捉分子のセットにおける対応する捕捉分子の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続した核酸に相補的なヌクレオチド配列を含む。一態様では、セットは、配列番号１～７７４のうちのいずれかに示される配列を有する非交差反応性捕捉分子のセットにおける対応する捕捉分子の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続した核酸に相補的なヌクレオチド配列を有するＱＣプローブを含む。一態様では、セットは、配列番号１～６４に示される非交差反応性捕捉分子のセットにおける対応する捕捉分子の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続した核酸に相補的なヌクレオチド配列を有するＱＣプローブを含む。一態様では、セットは、配列番号１～１０に示される非交差反応性捕捉分子のセットにおける対応する捕捉分子の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続した核酸に相補的なヌクレオチド配列を有するＱＣプローブを含む。
一態様では、ＱＣプローブは、標識を含む。一態様では、標識は、ＱＣプローブに直接的に付着している。別の態様では、標識は、リンカーを介してＱＣプローブに付着している。一態様では、標識は、結合対のメンバーである化合物であり、結合対の第１のメンバー（「一次結合試薬」と呼ぶことができる）が、例えば、基質に付着し、オリゴヌクレオチド、及び結合対の他のメンバー（「二次結合試薬」と呼ぶことができる）は、検出可能な物理的特性を有する。例又は一次標識としては、電気化学発光標識、遷移金属、例えばルテニウムを含む有機金属錯体が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、一次標識は、ストレプトアビジンを含む。一態様では、一次標識は、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ標識ストレプトアビジンを含む。
一態様では、標識は、一次結合試薬に結合する二次結合試薬を含む。一態様では、一次結合試薬としては、ビオチン、ハプテン、ストレプトアビジン、アビジン、又は抗体若しくは抗原が挙げられる。一態様では、二次結合試薬としては、ビオチン、ハプテン、ストレプトアビジン、アビジン、又は抗体若しくは抗原が挙げられる。一態様では、二次結合試薬は、電気化学発光標識を含む。一態様では、二次結合試薬としては、遷移金属、例えば、ルテニウムを含む有機金属錯体が挙げられる。一態様では、ＱＣプローブはビオチンを含み、二次結合試薬はＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ標識ストレプトアビジンを含む。一態様では、ＱＣプローブは、以下の構造に示されるように、ビオチンで３’末端が修飾されている。
一態様では、汚染された捕捉分子のパーセントは、実施例４の方法によって測定される。
一態様では、プレート上の（プレート内）又は２つ以上のプレートにわたる（プレート間）１つ以上の結合ドメインの均一性は、変動係数（ＣＶ）を決定するための既知の方法を使用して決定することができる。一態様では、プレート内又はプレート間結合ドメインは、約１０％、９．５％、９％、８．５％、８％、７．５％、７％、６．５％、６％、５．５％、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、又は１％未満のＣＶを有する。一態様では、プレート内又はプレート間ＣＶの平均は、約３％～約６％、又は約５％未満である。一態様では、結合ドメインの均一性は、実施例５の方法によって測定される。
Ｈ．アプタマー固定化
一態様では、１つ以上のアプタマーを支持体表面に固定化する方法が提供される。一態様では、１つ以上のアプタマーは、本明細書に記載されるように支持体表面に固定化される１つ以上の一本鎖捕捉分子に結合することによって、支持体表面に固定化されている。一態様では、アプタマーは、標的分子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドであり、例えば、小分子、タンパク質、核酸、細胞、組織、及び生物の非共有相互作用（静電相互作用や疎水性相互作用など）を含む分子標的に結合するＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＸＮＡアプタマーを含むことができる。別の態様では、アプタマーは、タンパク質足場によって表示される少なくとも１つ以上の可変ペプチドドメインを含む標的分子に特異的に結合することができるペプチドである。一態様では、固定化されたアプタマーは、１つ以上の標的分析物のプローブとして使用される。一態様では、固定化されたアプタマーは、マイクロアレイで使用される。
Ｉ．オリゴヌクレオチドプローブ
一態様では、方法又はキットは、サンプル中の標的分析物に特異的に結合することができる１つ以上のプローブ試薬を含む。一態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、サンプル中の標的分析物に特異的に結合することができる結合パートナーを含む。
本明細書で使用される場合、「結合パートナー」という用語は、特定の条件のセット下で互いに特異的に結合する部分の対のメンバーを指し、すなわち、結合対は、環境に存在する他の部分を実質的に排除して互いに結合する。結合パートナーは、例えば、同族抗原との抗体、２つの相補的ヌクレオチド配列間の相互作用、又はビオチン及びストレプタビジン又はアビジン間の相互作用を含む、例えば、共有結合又は非共有結合相互作用を介して、別の分子が特異的に相互作用する、ポリペプチド、脂質、糖脂質、核酸分子、炭水化物又は他の分子などの任意の分子であってよい。「対応する」という用語は、２つの特定の結合パートナー間の関係を指し、その結果、結合パートナー対の一方のメンバーは、対の他方のメンバーに「対応する」。
一態様では、結合パートナーは、標的分析物に特異的に結合する抗体を含む。別の態様では、結合パートナーは、オリゴヌクレオチドプローブが標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるように、標的分析物のオリゴヌクレオチド配列に相補的であるオリゴヌクレオチド配列を含む。
一態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドタグ及び結合パートナーを含む。一態様では、結合パートナーは、標的ヌクレオチド配列の一部に相補的又は実質的に相補的である一本鎖配列を含む。一態様では、プローブは、捕捉オリゴヌクレオチドの配列に相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドタグを含む。一態様では、オリゴヌクレオチドタグ及び結合パートナーは、単一のオリゴヌクレオチド鎖の異なる領域である。
一態様では、プローブは、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はロックド核酸（ＬＮＡ）を含む核酸配列を含む一本鎖核酸配列である。一態様では、プローブは、１つ以上の修飾された窒素塩基類似体、又は標識若しくは標識を付着するのに適した反応性官能基若しくはリンカーを含むように修飾された塩基を含む。
一態様では、プローブは、約５～約１００、約１０～約５０、約２０～約３０、又は少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、若しくは２５、及び最大約３０、３５、４０、４５、５０、７５又は１００ヌクレオチドの長さである。プローブは、化学的若しくは酵素的合成を含む当該技術分野で知られている任意の適切な方法によって、又は非特異的核酸切断化学物質若しくは酵素を使用するより大きな核酸の切断によって、又は部位特異的制限エンドヌクレアーゼを用いて調製することができる。いくつかの用途では、標的配列の相補的領域にハイブリダイズするプローブは、ポリメラーゼによるプローブの伸長をプライミングすることができ、標的配列上の隣接する一本鎖領域の複製の開始点として機能する。
一態様では、プローブは、標識を含む。一態様では、標識は、プローブに直接的に付着している。別の態様では、標識は、リンカーを介してプローブに付着している。一態様では、標識は、結合対のメンバーである化合物であり、結合対の第１のメンバー（「一次結合試薬」と呼ぶことができる）が、例えば、基質に付着し、オリゴヌクレオチド、及び結合対の他のメンバー（「二次結合試薬」と呼ぶことができる）は、検出可能な物理的特性を有する。例又は一次標識としては、電気化学発光標識、遷移金属、例えばルテニウムを含む有機金属錯体が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、一次標識は、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ標識である。
一態様では、二次結合試薬は、一次結合試薬に結合する。一態様では、一次結合試薬としては、ビオチン、ハプテン、ストレプトアビジン、アビジン、又は抗体若しくは抗原が挙げられる。一態様では、二次結合試薬としては、ビオチン、ハプテン、ストレプトアビジン、アビジン、又は抗体若しくは抗原が挙げられる。一態様では、二次結合試薬は、電気化学発光標識を含む。一態様では、二次結合試薬としては、遷移金属、例えば、ルテニウムを含む有機金属錯体が挙げられる。一態様では、二次結合試薬は、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ標識を含む。
一態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドタグ及び標的相補体、例えば、標的核酸配列の配列に相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。一態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドタグ、標的補体及び検出オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、検出オリゴヌクレオチドは、増幅テンプレートの核酸配列に相補的である核酸配列を有する検出配列を含む。一態様では、検出オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＳＤＡ（鎖置換増幅）、３ＳＲ（自立合成反応）、又はヘリカーゼ依存性増幅又はローリングサークル増幅（ＲＣＡ）などの等温増幅法を含むが、これらに限定されない、増幅反応のためのプライマーとして機能する。一態様では、検出オリゴヌクレオチドを増幅テンプレートと接触させ、検出オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅テンプレートを増幅させる。一態様では、検出オリゴヌクレオチドは、増幅テンプレートと接触し、検出オリゴヌクレオチドは、例えば、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって、増幅テンプレートの増幅のためのプライマーとして機能する。
一態様では、オリゴヌクレオチドプローブのセットが提供される。一態様では、１０個のオリゴヌクレオチドプローブのセットが提供される。一態様では、各オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドタグ及び結合パートナーを含む。一態様では、各オリゴヌクレオチドプローブは、５’オリゴヌクレオチドタグ、標的相補体、及び３’検出オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、１０個のオリゴヌクレオチドプローブのセットが、１０スポットアッセイで使用するために提供される。一態様では、１０個のオリゴヌクレオチドプローブのセットが、相補的オリゴヌクレオチド捕捉分子がアッセイプレートのウェル内の１０個の別個の結合ドメインに固定化されている１０スポットアッセイプレートと共に使用するために提供される。
一態様では、セット内のオリゴヌクレオチドプローブのうちの１つ以上は、同じ検出オリゴヌクレオチド配列を含む。一態様では、セット内のオリゴヌクレオチドプローブのうちの１つ以上は、セット内の他のオリゴヌクレオチドプローブとは異なる検出オリゴヌクレオチド配列を含む。一態様では、セット内のオリゴヌクレオチドプローブの各々は、同じ検出オリゴヌクレオチド配列を含む。
一態様では、１０個のオリゴヌクレオチドプローブのセット、例えば、表２７に示されるものが、１０スポットアッセイプレートと共に使用するために提供される。
一態様では、１つ以上のプローブ試薬を含むキットが提供される。一態様では、エンドユーザは、１つ以上のプローブ試薬を調製する。
Ｊ．オリゴヌクレオチドタグ
一態様では、プローブは、捕捉分子のオリゴヌクレオチド配列に特異的に結合する配列を有するオリゴヌクレオチドタグを含む。一態様では、タグは、一本鎖捕捉オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、組換え的に産生される。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、天然に存在する配列ではない。一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）を含む核酸配列、又はハイブリダイゼーション反応にも関与し得る天然に存在しない化学構造を含む構造類似体を含む一本鎖核酸配列を含む。
一態様では、タグは、プローブの５’末端に付着している。別の態様では、タグは、プローブの３’末端に付着している。一態様では、タグは、標的ヌクレオチド配列に相補的ではなく、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズしない。
一態様では、標的ヌクレオチド配列及びオリゴヌクレオチドタグ配列に相補的である配列は、プローブ内の１つの核酸鎖上に存在する。別の態様では、標的ヌクレオチド配列及びオリゴヌクレオチドタグ配列に相補的である配列は、異なる核酸鎖上に存在する。一態様では、プローブは、標的配列及び第１のブリッジング配列と相補的な配列を有する第１の鎖と、オリゴヌクレオチドタグ配列及び第１のブリッジング配列と相補的な第２のブリッジング配列を有する第２の鎖とを含み、第１及び第２の鎖は、ハイブリダイズするか、又は第１及び第２のブリッジング配列を介してハイブリダイズすることができる。
一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、標識を含む。一態様では、標識は、オリゴヌクレオチドタグに直接的に付着している。別の態様では、標識は、リンカーを介してオリゴヌクレオチドタグに付着している。一態様では、標識は、オリゴヌクレオチドタグの５’末端ヌクレオチドに付着している。別の態様では、標識は、オリゴヌクレオチドタグの３’末端ヌクレオチドに付着している。一態様では、標識は、オリゴヌクレオチドタグの長さに沿って付着している。
一態様では、標識としては、放射性、蛍光、化学発光、電気化学発光、光吸収、光散乱、電気化学、磁気及び酵素標識が挙げられる。一態様では、標識は、電気化学発光標識を含む。一態様では、標識は、ハプテンを含む。一態様では、標識は、ビオチン、フルオレセイン、又はジゴキシゲニンである。一態様では、標識は、遷移金属を含む有機金属錯体を含む。一態様では、遷移金属は、ルテニウムを含む。一態様では、標識は、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識である。
一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、標識として一次結合試薬を含み、一次結合試薬は、二次結合試薬の結合パートナーである。一態様では、一次結合試薬としては、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、又は抗原が挙げられる。一態様では、二次結合試薬は、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、又は抗体を含む。一態様では、一次結合試薬は、オリゴヌクレオチドを含み、二次結合試薬は、一次結合試薬の配列に相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドである。
一態様では、タグは、少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５、及び最大約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０、あるいは約１５～約４０、又は約２０～約３０ヌクレオチドの長さであるヌクレオチド配列を有する。一態様では、タグは、相補的捕捉オリゴヌクレオチド配列よりも少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、及び最大約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０、あるいは約１～約２０、又は約１０～約１５、又は約１２～約１３ヌクレオチド短いヌクレオチド配列を含む。一態様では、タグは、少なくとも約２４、３０、又は３６ヌクレオチドの長さであるヌクレオチド配列を有する。
一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、配列番号１～７７４（表１～１２）のうちのいずれかに示される配列を有する捕捉分子にハイブリダイズする配列を有する。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、配列番号１～７４４（表１～１２）のうちのいずれかに示される配列を有する相補的捕捉分子にハイブリダイズする配列を有する。一態様では、タグは、配列番号１～７４４のうちのいずれかに示される配列の少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドである配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する。一態様では、タグは、配列番号１～７４４のうちのいずれかに示される配列の少なくとも約２４、３０、又は３６個の連続したヌクレオチドである配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、配列番号７４５～１４８８（表１３～２４）のうちのいずれかに示される核酸配列を有する。
一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、配列番号７４５～１４８８（表１３～２４）のうちのいずれかに示される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。別の態様では、オリゴヌクレオチドタグは、配列番号７４５～１４８８（表１３～２４）のうちのいずれかに示される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。別の態様では、オリゴヌクレオチドタグは、配列番号７４５～１４８８（表１３～２４）のうちのいずれかに示される配列の少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。別の態様では、オリゴヌクレオチドタグは、配列番号７４５～１４８８（表１３～２４）のうちのいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。別の態様では、オリゴヌクレオチドタグは、配列番号７４５～１４８８（表１３～２４）のうちのいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列の少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。
一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、配列番号７４５～７５４、７５５～７５７、７６９～７７０、７７７～７８１、７８６、７８８～７９０、７９８、及び８０３～８０６のうちのいずれかに示される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。別の態様では、オリゴヌクレオチドタグは、配列番号７４５～７５４、７５５～７５７、７６９～７７０、７７７～７８１、７８６、７８８～７９０、７９８、及び８０３～８０６のうちのいずれかに示される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。別の態様では、オリゴヌクレオチドタグは、配列番号７４５～７５４、７５５～７５７、７６９～７７０、７７７～７８１、７８６、７８８～７９０、７９８、及び８０３～８０６のうちのいずれかに示される配列の少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。別の態様では、オリゴヌクレオチドタグは、配列番号７４５～７５４、７５５～７５７、７６９～７７０、７７７～７８１、７８６、７８８～７９０、７９８、及び８０３～８０６のうちのいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、配列番号７４５～７５４、７５５～７５７、７６９～７７０、７７７～７８１、７８６、７８８～７９０、７９８、及び８０３～８０６のうちのいずれかに示されるヌクレオチド配列を有する。
一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、配列番号７４５～７５４のうちのいずれかに示される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。別の態様では、オリゴヌクレオチドタグは、配列番号７４５～７５４のうちのいずれかに示される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。別の態様では、オリゴヌクレオチドタグは、配列番号７４５～７５４のうちのいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、配列番号７４５～７５４のうちのいずれかに示されるヌクレオチド配列を有する。
一態様では、方法又はキットは、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの「親セット」から選択される非交差反応性オリゴヌクレオチドタグのセットを含む。一態様では、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグのセットは、非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットに相補的である。一態様では、セット内の非交差反応性オリゴヌクレオチドタグは、捕捉オリゴヌクレオチドの対応するセット内のそれらの対応する相補的配列にハイブリダイズするように構成される。一態様では、セット内のオリゴヌクレオチドタグは、相補的配列と比較して０．０５％未満の捕捉オリゴヌクレオチドの対応するセット内の非相補的配列にハイブリダイズする。
親セットからの２つ以上のオリゴヌクレオチドを選択して、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの「サブセット」を形成することができ、サブセット内の各オリゴヌクレオチドは、元の親セットのメンバーである。サブセットには、２つ以上の親セットからのオリゴヌクレオチドタグを含めることはできない。一態様では、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグのセット又はサブセットは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５、及び最大６４個の親非交差反応性配列のセットから選択された非交差反応性配列を含む。
一態様では、表１（配列番号１～６４）に示される１つ以上の捕捉配列に相補的である非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第１のセットが生成される。一態様では、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第１のセットは、表１３（配列番号７４５～８０８）に示される親セットからの２つ以上のオリゴヌクレオチドタグを含む。
一態様では、表２（配列番号６５～１２２）に示される１つ以上の捕捉配列に相補的である非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第２のセットが生成される。一態様では、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第２のセットは、表１４（配列番号８０９～８６６）に示される親セットからの２つ以上のオリゴヌクレオチドタグを含む。
一態様では、表３（配列番号１２３～１８６）に示される１つ以上の捕捉配列に相補的である非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第３のセットが生成される。一態様では、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第３のセットは、表１５（配列番号８６７～９３０）に示される親セットからの２つ以上のオリゴヌクレオチドタグを含む。
一態様では、表４（配列番号１８７～２５０）に示される１つ以上の捕捉配列に相補的である非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第４のセットが生成される。一態様では、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第４のセットは、表１６（配列番号９３１～９９４）に示される親セットからの２つ以上のオリゴヌクレオチドタグを含む。
一態様では、表５（配列番号２５１～３０８）に示される１つ以上の捕捉配列に相補的である非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第５のセットが生成される。一態様では、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第２のセットは、表１７（配列番号９９５～１０５２）に示される親セットからの２つ以上のオリゴヌクレオチドタグを含む。
一態様では、表６（配列番号３０９～３７２）に示される１つ以上の捕捉配列に相補的である非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第６のセットが生成される。一態様では、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第２のセットは、表１８（配列番号１０５３～１１１６）に示される親セットからの２つ以上のオリゴヌクレオチドタグを含む。
一態様では、表７（配列番号３７３～４３６）に示される１つ以上の捕捉配列に相補的である非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第７のセットが生成される。一態様では、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第２のセットは、表１９（配列番号１１１７～１１８０）に示される親セットからの２つ以上のオリゴヌクレオチドタグを含む。
一態様では、表８（配列番号４３７～４９４）に示される１つ以上の捕捉配列に相補的である非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第８のセットが生成される。一態様では、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第２のセットは、表２０（配列番号１１８１～１２３８）に示される親セットからの２つ以上のオリゴヌクレオチドタグを含む。
一態様では、表９（配列番号４９５～５５８）に示される１つ以上の捕捉配列に相補的である非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第９のセットが生成される。一態様では、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第２のセットは、表２１（配列番号１２３９～１３０２）に示される親セットからの２つ以上のオリゴヌクレオチドタグを含む。
一態様では、表１０（配列番号５５９～６２２）に示される１つ以上の捕捉配列に相補的である非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第１０のセットが生成される。一態様では、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第２のセットは、表２２（配列番号１３０３～１３６６）に示される親セットからの２つ以上のオリゴヌクレオチドタグを含む。
一態様では、表１１（配列番号６２３～６８０）に示される１つ以上の捕捉配列に相補的である非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第１１のセットが生成される。一態様では、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第２のセットは、表２３（配列番号１３６７～１４２４）に示される親セットからの２つ以上のオリゴヌクレオチドタグを含む。
一態様では、表１２（配列番号６８１～７４４）に示される１つ以上の捕捉配列に相補的である非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第１２のセットが生成される。一態様では、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグの第２のセットは、表２４（配列番号１４２５～１４８８）に示される親セットからの２つ以上のオリゴヌクレオチドタグを含む。
一態様では、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグのセットは、表１（配列番号１～６４）、表２（配列番号６５～１２２）、表３（配列番号１２３～１８６）、表４（配列番号１８７～２５０）、表５（配列番号２５１～３０８）、表６（配列番号３０９～３７２）、表７（配列番号３７３～４３６）、表８（配列番号４３７～４９４）、表９（配列番号４９５～５５８）、表１０（配列番号５５９～６２２）、表１１（配列番号６２３～６８０）、又は表１２（配列番号６８１～７４４）の捕捉オリゴヌクレオチドの配列に相補的である配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるヌクレオチド配列を有する１つ以上のタグを含む。一態様では、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグのセットは、表１３（配列番号７４５～８０８）、表１４（配列番号８０９～８６６）、表１５（配列番号８６７～９３０）、表１６（配列番号９３１～９９４）、表１７（配列番号９９５～１０５２）、表１８（配列番号１０５３～１１１６）、表１９（配列番号１１１７～１１８０）、表２０（配列番号１１８１～１２３８）、表２１（配列番号１２３９～１３０２）、表２２（配列番号１３０３～１３６６）、表２３（配列番号１３６７～１４２４）、又は表２４（配列番号１４２５～１４８８）に示される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるヌクレオチド配列を有する１つ以上のタグを含む。
別の態様では、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグのセットは、表１（配列番号１～６４）、表２（配列番号６５～１２２）、表３（配列番号１２３～１８６）、表４（配列番号１８７～２５０）、表５（配列番号２５１～３０８）、表６（配列番号３０９～３７２）、表７（配列番号３７３～４３６）、表８（配列番号４３７～４９４）、表９（配列番号４９５～５５８）、表１０（配列番号５５９～６２２）、表１１（配列番号６２３～６８０）、又は表１２（配列番号６８１～７４４）の捕捉オリゴヌクレオチドの配列に相補的である配列の少なくとも２０、２１、２２、２３又は２４個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する１つ以上のタグを含む。別の態様では、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグのセットは、表１３（配列番号７４５～８０８）、表１４（配列番号８０９～８６６）、表１５（配列番号８６７～９３０）、表１６（配列番号９３１～９９４）、表１７（配列番号９９５～１０５２）、表１８（配列番号１０５３～１１１６）、表１９（配列番号１１１７～１１８０）、表２０（配列番号１１８１～１２３８）、表２１（配列番号１２３９～１３０２）、表２２（配列番号１３０３～１３６６）、表２３（配列番号１３６７～１４２４）、又は表２４（配列番号１４２５～１４８８）に示される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３又は２４個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する１つ以上のタグを含む。
別の態様では、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグのセットは、表１（配列番号１～６４）、表２（配列番号６５～１２２）、表３（配列番号１２３～１８６）、表４（配列番号１８７～２５０）、表５（配列番号２５１～３０８）、表６（配列番号３０９～３７２）、表７（配列番号３７３～４３６）、表８（配列番号４３７～４９４）、表９（配列番号４９５～５５８）、表１０（配列番号５５９～６２２）、表１１（配列番号６２３～６８０）、又は表１２（配列番号６８１～７４４）の捕捉オリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である配列の少なくとも２０、２１、２２、２３又は２４個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する１つ以上のタグを含む。一態様では、非交差反応性オリゴヌクレオチドタグのセットは、表１３（配列番号７４５～８０８）、表１４（配列番号８０９～８６６）、表１５（配列番号８６７～９３０）、表１６（配列番号９３１～９９４）、表１７（配列番号９９５～１０５２）、表１８（配列番号１０５３～１１１６）、表１９（配列番号１１１７～１１８０）、表２０（配列番号１１８１～１２３８）、表２１（配列番号１２３９～１３０２）、表２２（配列番号１３０３～１３６６）、表２３（配列番号１３６７～１４２４）、又は表２４（配列番号１４２５～１４８８）に示される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である配列の少なくとも２０、２１、２２、２３又は２４個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有する１つ以上のオリゴヌクレオチドタグを含む。
一態様では、セット内の非交差反応性オリゴヌクレオチドタグは、配列番号７４５～８０８から選択される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、又は２４個の連続ヌクレオチドを有する配列を有するオリゴヌクレオチドタグと、配列番号７４５～８０８から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を有するオリゴヌクレオチドタグと、配列番号７４５～８０８から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、又は２４個の連続したヌクレオチドを有する配列を有するオリゴヌクレオチドタグと、配列番号７４５～８０８から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドタグと、それらの組み合わせと、から選択される。
一態様では、セット内の非交差反応性オリゴヌクレオチドタグは、配列番号７４５～７５４から選択される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、又は２４個の連続ヌクレオチドを有する配列を有するオリゴヌクレオチドタグと、配列番号７４５～７５４から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を有するオリゴヌクレオチドタグと、配列番号７４５～７５４から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、又は２４個の連続したヌクレオチドを有する配列を有するオリゴヌクレオチドタグと、配列番号７４５～７５４から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドタグと、それらの組み合わせと、から選択される。
Ｋ．標識オリゴヌクレオチド生成物の検出
一態様では、サンプル中の１つ以上の標的分析物を標識及び検出するための方法及びキットが提供される。一態様では、サンプル中の１つ以上の標的分析物の存在は、オリゴヌクレオチドタグを含む反応生成物を生成することによって決定される。一態様では、反応生成物は、標識を含む。様々な方法を使用して、反応生成物を生成することができる。一態様では、反応生成物は、サンドイッチアッセイ、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、プライマー伸長アッセイ（ＰＥＡ）、直接ハイブリダイゼーションアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのアッセイ又は他の標的増幅アッセイ、及びヌクレアーゼ保護アッセイを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の方法によって生成される。
１．サンドイッチアッセイ
一態様では、サンドイッチアッセイを使用して、サンプル中の１つ以上の標的分析物を検出、同定、又は定量化するための方法及びキットが提供される。一態様では、方法又はキットは、標的化プローブ及び検出プローブを含む１つ以上のプローブのセットを含む。一態様では、標的化プローブは、支持体表面及び第１の結合パートナーに固定化された捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドタグを含む。一態様では、第１の結合パートナーは、第１の核酸配列を含む。一態様では、第１の結合パートナーの第１の核酸配列は、サンプル中の標的ヌクレオチド配列の第１の領域に相補的である。一態様では、第１の結合パートナーの第１の核酸配列は、治療用オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡオリゴヌクレオチド配列を含む。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、治療用ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡウイルス、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、又はそれらの組み合わせから選択される。一態様では、第１の結合パートナーの第１の核酸配列は、サンプル中の抗薬物抗体（ＡＤＡ）によって特異的に結合される。別の態様では、第１の結合パートナーは、サンプル中の標的分析物に特異的に結合する抗体を含む。一態様では、検出プローブは、標識及び第２の結合パートナーを含む。
一態様では、第２の結合パートナーは、第２の核酸配列を含む。一態様では、第２の結合パートナーの第２の核酸配列は、標的ヌクレオチド配列の第２の領域に相補的である。一態様では、第２の結合パートナーの第２の核酸配列は、治療用オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡオリゴヌクレオチド配列を含む。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、治療用ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡウイルス、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、又はそれらの組み合わせから選択される。一態様では、第２の結合パートナーの第２の核酸配列は、サンプル中の抗薬物抗体（ＡＤＡ）によって特異的に結合される。一態様では、第１の結合パートナーの第１のＡＳＯ及び第２の結合パートナーの第２のＡＳＯは、同じ抗薬物抗体によって特異的に結合される。
一態様では、第１の結合パートナーの第１のＡＳＯのヌクレオチド配列及び第２の結合パートナーの第２のＡＳＯのヌクレオチド配列は、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である。一態様では、第２の結合パートナーは、サンプル中の標的分析物に特異的に結合する抗体を含む。一態様では、標的化プローブ及び検出プローブは、サンプル中の同じ標的分析物に同時に結合して、反応生成物を形成することができる。一態様では、反応生成物は、サンドイッチ錯体である。
一態様では、方法又はキットは、多重化アレイで使用して、複数の標的分析物を並行して検出、同定、又は定量化することができる複数のプローブのセットを含む。一態様では、プローブの各セットは、別のセットの標的化プローブとは異なる第１の標的分析物に特異的に結合する第１の結合パートナーを有する標的化プローブと、他のセットの標的化プローブとは異なる捕捉オリゴヌクレオチド配列に相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドタグと、を含む。一態様では、プローブの各セットは、第１の標的分析物及び標識に特異的に結合する第２の結合パートナーを含む検出プローブを含む。一態様では、方法又はキットは、オリゴヌクレオチドプローブの複数のセットを含む。一態様では、プローブの各セットは、第１の結合パートナーが第１の標的ヌクレオチド配列に相補的である核酸配列を含む標的化プローブと、捕捉オリゴヌクレオチド配列に相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドタグと、を含み、１つのセットの標的化プローブの標的ヌクレオチド配列は、別のセットの標的化プローブの標的ヌクレオチド配列と異なる。一態様では、１つのセットの標的化プローブのオリゴヌクレオチドタグの配列は、別のセットの標的化プローブのオリゴヌクレオチドタグの配列とは異なる捕捉オリゴヌクレオチド配列に相補的である。一態様では、方法又はキットは、１つ以上の標的ヌクレオチド中の第２の標的ヌクレオチド配列に相補的な第２の標的ヌクレオチド配列である第２の結合パートナーを有する検出プローブを含む。
一態様では、この方法は、１つ以上の表面を有する１つ以上のカーボンベースの電極、及び本明細書に記載の１つ以上の非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドを含むアレイを提供するステップを含み、１つ以上の非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドが、１つ以上のカーボンベース電極の１つ以上の表面上の１つ以上の結合ドメインに固定化されている。一態様では、この方法は、１つ以上の標的分析物を、支持体表面及び標識に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であるオリゴヌクレオチドタグと会合させ、次いで、アレイを、１つ以上のタグ及び標識された標的分析物又は反応生成物を含む組成物と接触させるステップを含む。本明細書で使用される場合、「会合」又は「会合した」は、オリゴヌクレオチドタグ又は標識が標的分析物に共有結合的に又は非共有結合的に結合しているいずれかであることを意味する。一態様では、１つ以上の標的分析物は、サンドイッチ錯体のオリゴヌクレオチドタグ及び標識に会合している。一態様では、標的分析物を使用して、オリゴヌクレオチドタグ及び標識を含む反応生成物を生成する。一態様では、この方法は、サンドイッチ錯体又は反応生成物のオリゴヌクレオチドタグがそれらの対応する相補的捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、アレイ位置における標識の存在又は非存在に基づく標的分析物を同定、検出又は定量化する条件下で、サンドイッチ錯体又は反応生成物を支持体表面とともにインキュベートするステップを含む。
２．オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）
一態様では、アレイは、標的分析物である組成物と接触させ、標的分析物は、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドに相補的であるオリゴヌクレオチドタグに会合する。一態様では、アレイは、複数の標的分析物を含む組成物と接触させ、各標的分析物は、異なる捕捉オリゴヌクレオチドに相補的であるオリゴヌクレオチドタグに会合し、標的分析物は、アレイ位置におけるオリゴヌクレオチドタグの結合に基づいて、同定、検出又は定量化され得る。一態様では、アレイは、タグ及び標識された反応生成物を含む組成物と接触させられる。一態様では、アレイは、複数のタグ及び標識された反応生成物を含む組成物と接触させ、各標的分析物を使用して、異なる捕捉オリゴヌクレオチドに相補的であるオリゴヌクレオチドタグを含む反応生成物を生成し、サンプル中の標的分析物は、アレイ位置における反応生成物の結合に基づいて、同定、検出又は定量化され得る。
一態様では、タグ及び標識された反応生成物は、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）によって調製され、１つ以上の標的ヌクレオチド配列を同定、検出又は定量化するために捕捉及び検出することができる。一態様では、ライゲーションアッセイは、１つ以上の標的ヌクレオチド配列における一塩基多型（ＳＮＰ）を検出、同定又は定量化するために使用される。一態様では、ライゲーションアッセイを使用して、サンプル中のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を検出、同定、又は定量化する。一態様では、ライゲーションアッセイは、サンプル中の１つ以上の標的ヌクレオチド配列の増幅に続いて実施される。別の態様では、ライゲーションアッセイは、１つ以上の標的ヌクレオチド配列が増幅されていないサンプルで実施される。一態様では、ライゲーションアッセイからの反応生成物は、捕捉及び検出の前に増幅される。別の態様では、ライゲーションアッセイからの反応生成物は、捕捉及び検出の前に増幅されない。ライゲーションアッセイの反応生成物は、既知の方法を使用して増幅することができる。
オリゴヌクレオチドライゲーション反応を実施するための方法が知られており、一般に以下のステップを含む。目的の１つ以上のヌクレオチド配列を含有するか、又は含有し得るサンプルを、１つ以上の標的ヌクレオチド配列に相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドプローブの対と接触させ、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる。標的ヌクレオチド配列の隣接領域にハイブリダイズするプローブをライゲーションして、反応生成物を形成する。一態様では、これらのステップを繰り返して、反応生成物の複数のコピーを得ることができる。一態様では、ライゲーション反応混合物中のヌクレオチド配列は、アニールステップの前に変性される。標的ヌクレオチド配列は、サンプル中の反応生成物の存在、不在、又は量に基づいて、検出、同定、又は定量化することができる。
ＤＮＡリガーゼによるプローブの結合は、３つの事象（１）オリゴヌクレオチドプローブが、標的ヌクレオチド配列内の相補的配列にハイブリダイズすることと、（２）オリゴヌクレオチドプローブが、ヌクレオチドが介在することなく、５’から３’の方向で互いに隣接していることと、（３）オリゴヌクレオチドプローブが、それらの結合部位で標的ヌクレオチド配列と完全な塩基対相補性を有することと、に依存する。プライマーと標的と間の単一ヌクレオチドの不一致は、ライゲーションを阻害する可能性がある。
一態様では、プローブは、標的ヌクレオチド配列（合計約８０塩基対）のＳＮＰ部位の両側に約４０塩基対を含む核酸配列を同定し、約１８～約２８ヌクレオチドに及ぶＳＮＰの上流及び下流に相補的配列を有するプローブを作製することによって生成される。一態様では、ＳＮＰ位置で異なる２つの標的化プローブが生成される。典型的には、野生型及び多様型アレルを検出するために必要な検出プローブは１つだけである。
別の態様では、標的ヌクレオチド配列は、小さな核酸、例えば、少なくとも約１５塩基対、少なくとも約１６塩基対、少なくとも約１７塩基対、少なくとも約１８塩基対、少なくとも約１９塩基対、又は少なくとも約２０塩基対、及び最大約２０塩基対の長さ、最大約２５塩基対の長さ、最大約３０塩基対の長さ、最大約４０塩基対の長さ、又は最大約５０塩基対の長さである。一態様では、このような小さな核酸標的を検出するためのプローブは、少なくとも約８塩基対、少なくとも約９塩基対、少なくとも約１０塩基対、少なくとも約１１塩基対、又は少なくとも約１２塩基対、及び最大約２０塩基対の長さ、最大約２５塩基対の長さ、最大約３０塩基対の長さ、最大約４０塩基対の長さ、又は最大約５０塩基対の長さを含み、プローブ及び小さな核酸標的は、本明細書に記載されるように別のものをハイブリダイズした後にライゲーションされる。
オリゴヌクレオチドプローブ配列の長さは、ＯＬＡ反応のライゲーション温度要件（例えば、約６２℃～約６４℃）に基づいて変化する可能性がある。プローブの長さが所与の反応温度に適したものになるまで、塩基を標的化又は検出プローブに付加するか、又は検出プローブから除去することができる。
標的化及び検出プローブの配列及び長さが決定された後、オリゴヌクレオチドタグを標的化プローブに付加することができる。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、上流の標的化プローブの５’末端に付加される。一態様では、各オリゴヌクレオチドタグは、支持体表面に固定化された異なる捕捉オリゴヌクレオチドに相補的である。一態様では、検出プローブは、標識を含む。一態様では、検出プローブは、５’リン酸基及び３’標識を含む。一態様では、検出プローブは、５’リン酸基及び３’ビオチン標識を含む。
一態様では、この方法は、２つ以上の対のプローブの使用を含む。一態様では、プローブの対が、サンプル中の各標的配列に対して提供される。一態様では、ＳＮＰ対の検出のために３つのプローブ、一塩基多型で変化する２つの標的化プローブ、及び１つの検出プローブが調製される。一態様では、２つの標的化プローブは、５’オリゴヌクレオチドタグ及び目的の標的核酸における野生型又は多様型一塩基多型のいずれかに相補的である３’核酸を含み、検出プローブは３’標識を含む。一態様では、３’標識は、検出可能な二次結合試薬に結合する一次結合試薬である。一態様では、３’標識はビオチンを含み、二次結合試薬はＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧストレプトアビジンを含む。一態様では、多型部位の各アレルに対して一対のプローブを調製することができ、例えば、２つのプローブを調製することができ、１つは野生型アレル用であり、１つは変異型アレル用である。一態様では、ライゲーション反応は、各標的ヌクレオチド配列に対して実施される。別の態様では、多重化されたライゲーション反応は、２つ以上の標的ヌクレオチド配列に対して実施される。一態様では、多重化ライゲーション反応は、約１～約１００、又は最大２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０、７５、又は１００個の標的ヌクレオチド配列に対して実施される。一態様では、多重化ライゲーション反応を実施して、各ウェル中の最大１０個の標的ヌクレオチド配列を検出、同定、又は定量化する。一態様では、複数のアレル対が検出、同定、又は定量化される。一態様では、最大５つのアレル対（すなわち、野生型及び変異型ＳＮＰ対）が、各ウェルで検出、同定、又は定量化される。一態様では、検出、同定又は定量化は、サンプルが多様型アレルについてホモ接合性、ヘテロ接合性、又はヌルであるかどうかを決定することを含む。
一態様では、プローブは、テンプレート依存性リガーゼ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）リガーゼ、Ｔ．Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡリガーゼ、又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼを使用して結合している。一態様では、リガーゼは、熱安定性リガーゼである。別の態様では、プローブは、化学ライゲーションによって結合している。一態様では、ハイブリダイゼーション及びライゲーションは、例えば、複数のサーモサイクル及び熱安定性リガーゼを使用して、組み合わされたステップで実施される。一態様では、反応混合物は、少なくとも約１００Ｕ／ｍＬ、５００Ｕ／ｍＬ、又は１０００Ｕ／ｍＬ及び最大約１５００Ｕ／ｍＬ又は２０００Ｕ／ｍＬリガーゼを含む。
一態様では、ライゲーションアッセイは、サンプルを１つ以上のプローブの対及びライゲーション緩衝液中のリガーゼと組み合わせることによって実施される。一態様では、サンプル、プローブ、及びリガーゼをライゲーション緩衝液と組み合わせて、少なくとも約１０μＬ、１５μＬ、又は２０μＬ及び最大約２０μＬ、２５μＬ、又は５０μＬの体積を有するライゲーション反応混合物を形成する。
一態様では、プローブの各対は、標的化プローブ及び検出プローブを含む。一態様では、標的化プローブは、標的ヌクレオチド配列の第１の領域に相補的であるヌクレオチド配列と、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドタグと、を含む。一態様では、検出プローブは、標識及び、標的化プローブ配列の第１の核酸配列が相補的である第１の領域に隣接する標的ヌクレオチド配列の第２の領域に相補的であるヌクレオチド配列を含む。一態様では、標的化プローブの５’末端はリン酸化されており、プローブの対が標的ヌクレオチド配列にアニールされると、検出プローブの３’－ヒドロキシルに隣接し、その結果、２つのプローブの末端は、ホスホジエステル結合の形成によってライゲーションされ得る。一態様では、検出プローブの５’末端はリン酸化されており、プローブの対が標的ヌクレオチド配列にアニールされると、標的化プローブの３’－ヒドロキシルに隣接し、その結果、２つのプローブの末端は、ホスホジエステル結合の形成によってライゲーションされ得る。
一態様では、標的化プローブは、約５～約１００、約１０～約５０、約２０～約３０、又は少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、若しくは２５、及び最大約３０、３５、４０、４５、５０、７５又は１００ヌクレオチドを含む。一態様では、少なくとも約１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ又は５ｎＭ、及び最大約５ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭ又は５０ｎＭの標的化プローブが反応混合物に含まれる。
一態様では、標的化プローブの全長は、標的ヌクレオチド配列に相補的である。別の態様では、標的化プローブの一部は、標的ヌクレオチド配列に相補的である。一態様では、標的化プローブは、多型部位の下流の標的ヌクレオチド配列に相補的である。一態様では、標的化プローブは、一塩基多様体を含む標的ヌクレオチド配列の領域に相補的である核酸配列を含むアレル特異的プローブである。一態様では、標的化プローブは、一塩基多型を含む標的ヌクレオチド配列の領域に相補的である核酸配列を含むアレル特異的プローブである。一態様では、標的化プローブの３’末端核酸は、標的ヌクレオチド配列の多型核酸に相補的である。別の態様では、標的化プローブの３’末端核酸は、標的ヌクレオチド配列の多型核酸のヌクレオチド３’に相補的である。
一態様では、標的化プローブは、捕捉分子に特異的に結合するタグを含む。一態様では、タグは、一本鎖捕捉オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である一本鎖オリゴヌクレオチド配列を含む。一態様では、タグは、標的化プローブの５’末端に付着している。別の態様では、タグは、標的化プローブの３’末端に付着している。一態様では、タグは、標的ヌクレオチド配列に相補的ではなく、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズしない。
一態様では、タグは、相補的捕捉オリゴヌクレオチド配列よりも少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、及び最大約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０、あるいは約１～約２０、又は約１０～約１５、又は約１２～約１３ヌクレオチド短いヌクレオチド配列を含む。一態様では、タグは、少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５、及び最大約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０、あるいは約１５～約４０、又は約２０～約３０ヌクレオチドの長さであるヌクレオチド配列を有する。
一態様では、タグは、配列番号１～１０に示される捕捉オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を含む。一態様では、タグは、配列番号１～１０に示される捕捉オリゴヌクレオチドの配列の約２０～約２５、又は約２４の連続したヌクレオチドに相補的であるヌクレオチド配列を含む。一態様では、一本鎖オリゴヌクレオチドタグは、捕捉オリゴヌクレオチドの配列に基づく既知の方法を使用して調製される。
一態様では、オリゴヌクレオチドプローブの各対は、約５～約１００、約１０～約５０、約２０～約３０、又は少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、若しくは２５、及び最大約３０、３５、４０、４５、５０、７５若しくは１００ヌクレオチドを有する検出プローブを含む。
一態様では、標的化及び検出プローブは、約６０℃～約６５℃、又は約６２℃～約６４℃の融解温度を有する。一態様では、標的化及び検出プローブは、同様の融解温度（すなわち、約１℃、２℃、３℃、４℃、又は５℃以内）を有する。
一態様では、標的ヌクレオチド配列の標的化及び検出プローブは、１：１の比率でライゲーション反応混合物に含まれる。別の態様では、検出プローブは過剰に含まれ、例えば、ライゲーション反応混合物は、標的化プローブと比較して、少なくとも約５倍、１０倍、又は２０倍多くの検出プローブを含むことができる。一態様では、少なくとも約１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、又は２００ｎＭの検出プローブが反応混合物に含まれる。
一態様では、検出プローブの全長は、標的ヌクレオチド配列に相補的である。別の態様では、検出プローブの一部は、標的ヌクレオチド配列に相補的である。一態様では、検出プローブは、多型部位の上流の標的ヌクレオチド配列に相補的である。一態様では、検出プローブは、一塩基多様体を含む標的ヌクレオチド配列の領域に相補的である核酸配列を含む。一態様では、検出プローブは、一塩基多型を含む標的ヌクレオチド配列の領域に相補的である核酸配列を含む。一態様では、検出プローブの５’末端核酸は、標的ヌクレオチド配列の多型核酸に相補的である。別の態様では、検出プローブの５’末端核酸は、標的ヌクレオチド配列の多型核酸の５’である核酸にハイブリダイズする。
一態様では、検出プローブは、標識を含む。一態様では、標識は、検出プローブの３’末端に付着している。一態様では、標識は、検出プローブの３’末端に付着し、５’末端は、標的化プローブの３’末端がハイブリダイズする標的ヌクレオチドの配列に直接隣接する標的ヌクレオチドの配列に相補的である核酸配列を有する。一態様では、標識は、検出プローブの５’末端に付着し、３’末端は、標的化プローブの５’末端がハイブリダイズする標的ヌクレオチドの配列に直接隣接する標的ヌクレオチドの配列に相補的である核酸配列を有する。
一態様では、標的化プローブは、標的化プローブの３’末端が標的ヌクレオチド配列の多型ヌクレオチドの真上に位置し、検出プローブが多型部位に隣接する標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、ライゲーション反応の５’末端を提供する。標的化プローブが標的ヌクレオチド配列の多型ヌクレオチドに相補的である場合、第１のオリゴヌクレオチドは多型部位で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、ライゲーションが起こり得る。標的化プローブがヌクレオチド配列の多型ヌクレオチドに相補的でない場合、第１のオリゴヌクレオチドは多型部位で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズせず、ライゲーションが起こらない。
別の態様では、標的化プローブは、標的化プローブの末端５’－塩基が標的ヌクレオチド配列の多型ヌクレオチドの真上に位置し、検出プローブが多型部位に隣接する標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、ライゲーション反応の３’末端を提供する。
別の態様では、検出プローブは、検出プローブの末端５’－塩基が標的ヌクレオチド配列の多型ヌクレオチドの真上に位置し、標的化プローブが多型部位に隣接する標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、ライゲーション反応の３’末端を提供する。
別の態様では、検出プローブは、検出プローブの末端３’－塩基が標的ヌクレオチド配列の多型ヌクレオチドの真上に位置し、標的化プローブが多型部位に隣接する標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズして、ライゲーション反応の５’末端を提供する。
一態様では、この方法は、（ｉ）１つ以上の標的ヌクレオチドを含有するサンプルを、一対のオリゴヌクレオチドプローブ及びＤＮＡリガーゼと接触させて、ライゲーション反応混合物を形成することと、（ｉｉ）プローブの対を標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズすることであって、対が、標的ヌクレオチド配列の多型ヌクレオチドの真上に位置する末端３’又は５’塩基を有する捕捉又は検出プローブを含む、ハイブリダイズすることと、（ｉｉｉ）標的化及び検出プローブを一緒にライゲーションして、標識及びタグされた反応生成物を形成することと、（ｉｖ）１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドが標識及びタグされた反応生成物で固定化されている支持体表面に接触させることと、（ｖ）タグを捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることと、（ｖｉ）タグ及び標識された反応生成物の存在を検出することと、を含む。
一態様では、ライゲーションアッセイで使用されるプローブは、標的ヌクレオチド配列を超えて（すなわち、ｎＭレベルで）含まれ、したがって、場合によっては、オリゴヌクレオチド及び標的の非特異的結合をプレート上で、正のシグナルとして検出することができる。理論に拘束されることを望まないが、非特異的ハイブリダイゼーションは、プローブが標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、ライゲーションなしでハイブリダイズしたままであり、ライゲーション反応生成物によるものではないが、ブリッジングバックグラウンドと呼ばれる非特異的なシグナルであるシグナルをもたらす結果である可能性があると考えられている。
一態様では、この方法は、ライゲーション反応混合物中に１つ以上のブロッキングプローブを提供することを含む。一態様では、ライゲーション反応混合物に１つ以上のブロッキングプローブを含めることにより、非特異的なブリッジングバックグラウンドが低減する。本明細書で使用される場合、「ブロッキングプローブ」という用語は、標的ヌクレオチド配列に相補的であり、プローブライゲーション部位にまたがるが、タグ又は標識を含まない一本鎖ヌクレオチド配列、又は標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように設計されたプローブに相補的である一本鎖ヌクレオチド配列を指す。一態様では、ブロッキングプローブは、プローブ配列とほぼ同一直線上にある。一態様では、ブロッキングプローブは、標的ヌクレオチド配列又は標的ヌクレオチド配列に対して向けられたプローブのいずれかに相補的である少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０、及び最大約５０、７５、１００、１５０、若しくは２００、又は約２０～約２００、若しくは約５０～約１００のヌクレオチドを含む。一態様では、一対のブロッキングプローブがライゲーション反応混合物に含まれ、第１のブロッキングプローブは、接続プローブと同一である配列を有するが、相補的なオリゴヌクレオチドタグを有さず、第２のブロッキングプローブは、検出プローブと同一の配列を有するが、ビオチン標識を有しない。一態様では、最大２、３、４又は５個の追加のヌクレオチドを、プローブ配列に隣接する標的ヌクレオチド配列に相補的であるブロッキングプローブの５’及び３’末端に付加することができる。
理論に拘束されることを望まないが、ブロッキングプローブの存在は、標的ヌクレオチド配列が標的配列にアニールされるがライゲーションされていないプローブの架橋として機能する複合体の形成を低減させ、複合体は誤ったシグナルを生成する可能性があると考えられている。一態様では、一対のブロッキングプローブがライゲーション反応混合物に含まれる。別の態様では、１つ以上のブロッキングプローブが、対応するＯＬＡプローブよりも過剰にライゲーション反応混合物に含まれる。一態様では、１つ以上のブロッキングプローブが、対応するＯＬＡプローブよりも少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍モル過剰に含まれる。
オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイの一実施形態は、図１に概略的に表されている。簡単に言えば、多型部位２を含む標的ヌクレオチド配列１は、オリゴヌクレオチドタグ４を有する標的化プローブ３と、多型部位に相補的であるヌクレオチド及び標識６を有する検出プローブ５とを含む一対のオリゴヌクレオチドプローブと接触させられる。オリゴヌクレオチドプローブ３、５は、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる。（図１Ａ）多型部位で完全な相補性でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ３、５をライゲーションして、タグされた４及び標識された６反応生成物１１を形成する。（図１Ｂ）タグされた４及び標識された６ライゲーション生成物１１を含有する反応混合物を、１つ以上の結合ドメイン９に固定化された１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチド７を有する支持体表面に導入する。タグされたオリゴヌクレオチド４に含有される相補的ヌクレオチドと捕捉オリゴヌクレオチド７との間のハイブリダイゼーションにより、タグされた４及び標識された６ライゲーション生成物１１が支持体表面に固定化される場合、シグナル１０が検出される。（図１Ｃ）。
一態様では、多重リガーゼ検出反応が提供される。一態様では、サンプルは、１つ以上のアレル特異的プローブ及び１つ以上の一般的なプローブと接触させられる。一態様では、１つ以上のアレル特異的プローブは、捕捉オリゴヌクレオチド配列に相補的である配列、及び目的の多型に対応する３’配列を有する５’オリゴヌクレオチドタグを含む上流プローブを含む。一態様では、１つ以上の一般的なプローブは、５’－リン酸化及び３’－ビオチン化された下流プローブである。一態様では、多重ライゲーションプローブを、１つ以上の標的分析物を含有するサンプルと接触させ、ハイブリダイズさせ、隣接するプローブをＤＮＡリガーゼでライゲーションして、ライゲーション生成物を形成する。一態様では、１つ以上の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドをライゲーション生成物と接触させ、オリゴヌクレオチドタグをそれらの対応する捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることができる。固定化されたライゲーション生成物は、例えば、標識されたストレプトアビジン、例えば、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ標識されたストレプトアビジンを使用して検出することができる。
一態様では、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）は、オリゴヌクレオチド代謝産物とも呼ばれる、標的ヌクレオチド配列の分解生成物を含み得るサンプルに含まれる標的ヌクレオチド配列の検出、同定、及び／又は定量化に使用される。一態様では、標的ヌクレオチド配列を含有するサンプルは、１つ以上のオリゴヌクレオチド代謝産物を更に含む。一態様では、ＯＬＡは、オリゴヌクレオチド代謝産物と比較したサンプル中の標的ヌクレオチド配列の量を測定するために使用される。一態様では、ＯＬＡを使用して、標的ヌクレオチド配列の薬物動態パラメータを決定する。一態様では、測定される薬物動態パラメータは、クリアランス、体積分布、血漿濃度、半減期、ピーク時間、ピーク濃度、利用可能率、又はそれらの組み合わせである。薬物動態パラメータの測定及び解釈は、本明細書に記載されている。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、治療用オリゴヌクレオチドである。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、治療用オリゴヌクレオチド代謝産物である。治療用オリゴヌクレオチド、ＡＳＯ、並びにそれらの代謝及び薬理学が本明細書に記載されている。
一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、標的ヌクレオチド配列よりも１ヌクレオチド以上、２ヌクレオチド以上、３ヌクレオチド以上、４ヌクレオチド以上、５ヌクレオチド以上、６ヌクレオチド以上、７ヌクレオチド以上、８ヌクレオチド以上、９ヌクレオチド以上、１０ヌクレオチド以上、１５ヌクレオチド以上、又は２０ヌクレオチド以上短い。一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、標的ヌクレオチド配列よりも約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、又は約１０％短い。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、治療用オリゴヌクレオチドである。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、治療用オリゴヌクレオチド代謝産物である。
例示的な実施形態が図１５に示されている。図１５において、標的ヌクレオチド配列を含有するサンプルは、テンプレートオリゴヌクレオチドと接触させられる。テンプレートオリゴヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列に相補的な第１の配列、及び第１の配列に隣接し、標的ヌクレオチド配列のライゲーションパートナーに相補的な第２の配列を含む。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、テンプレートオリゴヌクレオチドの第１の配列にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド配列のライゲーションパートナーは、テンプレートオリゴヌクレオチドの第２の配列にハイブリダイズする。一態様では、標的ヌクレオチド配列及びライゲーションパートナーは、テンプレートオリゴヌクレオチドの全長にわたってハイブリダイズする。一態様では、標的ヌクレオチド配列及びライゲーションパートナーは、テンプレートオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして、二本鎖複合体を形成する。標的ヌクレオチド配列及びライゲーションパートナーは、本明細書に記載の方法を使用して一緒にライゲーションされて、標的ヌクレオチド配列ライゲーション生成物を形成する。次いで、標的ヌクレオチド配列ライゲーション生成物を、標的ヌクレオチド配列ライゲーション生成物に相補的であり、標的ヌクレオチド配列ライゲーション生成物にハイブリダイズすることを可能にする一本鎖オリゴヌクレオチドプローブの対と接触させられる。一態様では、標的ヌクレオチド配列ライゲーション生成物の隣接領域にハイブリダイズすることができるプローブが、標的ヌクレオチド配列ライゲーション生成物に付加される。一態様では、各々が標的ヌクレオチド配列ライゲーション生成物の隣接領域にハイブリダイズする２つの隣接するプローブがライゲーションされて、反応生成物を形成する。一態様では、プローブは、本明細書に記載の標的化プローブ及び検出プローブを含む。一態様では、標的化プローブ及び検出プローブは、標的ヌクレオチド配列ライゲーション生成物の全長にわたってハイブリダイズする。一態様では、標的化プローブは、オリゴヌクレオチドタグを含む。標的化プローブ及びオリゴヌクレオチドタグは、本明細書で更に説明される。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である。一態様では、検出プローブは、標識を含む。検出プローブ及び標識は、本明細書で更に説明される。一態様では、標識はビオチンを含み、検出試薬はストレプトアビジンに連結されている。別の態様では、標識はハプテンを含み、検出試薬は、抗体などのハプテン結合パートナーに連結されている。標識、検出試薬、及び標識と検出試薬との間の結合様式は、本明細書で更に説明される。一態様では、表面は、標識に結合するための検出試薬と接触させられる。一態様では、検出試薬は、電気化学発光試薬である。一態様では、検出試薬は、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧを含む。一態様では、電気化学発光は、標的ヌクレオチド配列を検出、同定、及び／又は定量化するために、本明細書に記載されるように測定される。一態様では、サンプル中の標的ヌクレオチド配列の量を測定して、標的ヌクレオチド配列の薬物動態パラメータを決定する。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、治療用オリゴヌクレオチドである。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、治療用オリゴヌクレオチドを増幅することなく検出される。一態様では、サンプル中の治療用オリゴヌクレオチドは、核酸抽出ステップなしで検出される。
一態様では、標的ヌクレオチド配列を含有するサンプルはまた、１つ以上のオリゴヌクレオチド代謝産物を含む。一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、標的ヌクレオチド配列の検出、同定、及び／又は定量化を妨害する。したがって、サンプルからオリゴヌクレオチド代謝産物を除去することが望ましい場合がある。したがって、一態様では、一本鎖オリゴヌクレオチドに特異的なヌクレアーゼ（すなわち、「一本鎖特異的ヌクレアーゼ」）がサンプルに付加され、図１５に概説されているようにプローブに付加される前に、標的ヌクレオチド配列ライゲーション生成物及びテンプレートオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされる。一本鎖特異的ヌクレアーゼは、一本鎖オリゴヌクレオチド代謝産物を特異的に除去する一方で、ハイブリダイズした標的ヌクレオチド配列ライゲーション生成物及びテンプレートオリゴヌクレオチドに対して実質的に非反応性である。一態様では、一本鎖特異的ヌクレアーゼは、過剰なハイブリダイズしていないテンプレートオリゴヌクレオチドを更に除去する。一本鎖特異的ヌクレアーゼの非限定的な例としては、ヌクレアーゼＳ１（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅから単離される）、ヌクレアーゼＰ１（例えば、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍから単離される）、ヌクレアーゼＭＢ（例えば、ｍｕｎｇ ｂｅａｎ Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａから単離される）、並びにＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｅｓｐｅｊｉａｎａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、及びＵｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓから単離されるヌクレアーゼが挙げられる。一本鎖特異的ヌクレアーゼとしてはまた、例えば、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ Ｉ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｌ、ＲＮａｓｅ Ｐ、ＲＮａｓｅ ＰｈｙＭ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ｔ２、ＲＮａｓｅ Ｕ２、ＲＮａｓｅ Ｖ、ＰＮＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ ＰＨ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、ＲＮａｓｅＯＮＥ、オリゴリボヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼＩ、及びエキソリボヌクレアーゼＩＩなどのＲＮａｓｅが挙げられ得る。本発明の方法に適切であり得る追加のヌクレアーゼとしては、特定のＤＮａｓｅが挙げられる。一本鎖特異的ヌクレアーゼを含む追加のヌクレアーゼは、例えば、Ｙａｎｇ，Ｑ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ４４（１）：１－９３（２０１１）及びＤｅｓａｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２６：４５７－４９１（２００３）に提供されている。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、治療用オリゴヌクレオチドである。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、治療用オリゴヌクレオチド代謝産物である。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、ＲＮＡを含む。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、ｍｉＲＮＡ、治療用ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡウイルス、又はそれらの組み合わせを含む。
３．プライマー伸長アッセイ（ＰＥＡ）
別の態様では、サンプル中の１つ以上の標的ヌクレオチド配列が、プライマー伸長アッセイ（ＰＥＡ）を使用して検出、同定、又は定量化される。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、１つ以上の一塩基多様体（ＳＮＶ）を含む。別の態様では、ヌクレオチド配列は、１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を含む。一態様では、プライマー伸長は、サンプル中の標的ヌクレオチド配列の増幅に続いて実施される。別の態様では、プライマー伸長は、増幅されていないサンプルに対して実施される。
プライマー伸長アッセイを実施するための方法は知られており、一般に以下のステップを含む：サンプルを、標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブと接触させられる。一態様では、プローブの全長は、標的ヌクレオチド配列に相補的である。別の態様では、プローブの一部は、標的ヌクレオチド配列に相補的である。一態様では、プローブは、プローブが多型ヌクレオチドの下流の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように、多型の３’末端に直接隣接する標的ヌクレオチド配列の核酸配列に相補的である核酸配列を含む。一態様では、プローブは、約５～約１００、約１０～約５０、約２０～約３０、又は少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、若しくは２５、及び最大約３０、３５、４０、４５、５０、７５又は１００ヌクレオチドの長さを含む。
一態様では、プローブは、捕捉分子に特異的に結合するタグを含む標的化プローブである。一態様では、タグは、一本鎖捕捉オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補的である一本鎖オリゴヌクレオチド配列を含む。一態様では、タグは、標的化プローブの５’末端に付着している。一態様では、タグは、標的化プローブの５’末端に付着し、標的化プローブの３’末端核酸は、標的ヌクレオチド配列の多型部位のすぐ下流の核酸に相補的である。一態様では、一本鎖オリゴヌクレオチドタグは、捕捉オリゴヌクレオチドの配列に基づいて、エンドユーザによって既知の方法を使用して調製される。
一態様では、タグは、捕捉オリゴヌクレオチド配列よりも少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０、及び最大約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０、あるいは約１～約２０、又は約１０～約１５ヌクレオチド短いヌクレオチド配列を含む。一態様では、タグは、少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５、及び最大約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０、あるいは約１５～約４０、又は約２０～約３０ヌクレオチドの長さであるヌクレオチド配列を有する。一態様では、タグは、配列番号１～６４に示される捕捉オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を含む。一態様では、タグは、配列番号１～１０に示される捕捉オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を含む。
一態様では、１つ以上のタグオリゴヌクレオチドは、それらの対応する捕捉オリゴヌクレオチドの完全な配列に相補的である配列を含む。一態様では、１つ以上のタグオリゴヌクレオチドは、それらの対応する捕捉オリゴヌクレオチドの配列の一部のみに相補的である配列を含む。例えば、限定としてではなく、捕捉オリゴヌクレオチドは、明細書に記載のリンカーを含み得、これは、それが付着する表面の近位で、タグオリゴヌクレオチド配列に相補的ではないオリゴヌクレオチド配列からなるか、又はそれを含み得る（例えば、チオール修飾末端ヌクレオチドで始まる）。タグオリゴヌクレオチドと捕捉オリゴヌクレオチドとの間の相補性の領域も長さが異なる場合がある。本発明のいくつかの態様では、オリゴヌクレオチド間の相補性の領域は、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６のヌクレオチドの長さである。
一態様では、この方法は、１つ以上の標的ヌクレオチド配列を含有するサンプルを標的化プローブと接触させ、ポリメラーゼ及びｄｄＡ、ｄｄＴ、ｄｄＣ、ｄｄＧを含む１つ以上の２’３’－ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を含むプライマー伸長反応混合物の存在下で標的化プローブを標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることを含む。一態様では、ｄｄＮＴＰは、多型部位に相補的であり、標識されている。一態様では、多型部位に相補的ではないｄｄＮＴＰは、標識されていない。一態様では、野生型多型ヌクレオチドに相補的であるｄｄＮＴＰは、標識されている。別の態様では、ｄｄＮＴＰは、変異多型ヌクレオチドに相補的であり、標識されている。一態様では、標的化プローブの３’末端は、単一のｄｄＮＴＰによって伸長される。一態様では、標識ｄｄＮＴＰが多型ヌクレオチドに相補的である場合、プライマーは、１つの標識ｄｄＮＴＰによって伸長されて、タグ及び標識された反応生成物を形成する。標識ｄｄＮＴＰが多型ヌクレオチドに相補的でなく、プライマーが非標識ｄｄＮＴＰによって伸長され、検出されない場合。
適切なポリメラーゼ酵素としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、及びそれらの活性サブユニット（例えば、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。一態様では、ポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼなどの熱安定性ポリメラーゼである。
プライマー伸長アッセイの一実施形態は、図２に概略的に表されている。簡単に言えば、多型部位２２を含む標的ヌクレオチド配列２１は、ＤＮＡポリメラーゼ及び２’３’－ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）（すなわち、ｄｄＡ、ｄｄＴ、ｄｄＣ、ｄｄＧ）を含むプライマー伸長反応混合物の存在下で、オリゴヌクレオチドタグ２５を有する標的化プローブ２３と接触させ、多形部位に相補的であるｄｄＮＴＰ２５は、２６と標識されている。標的化プローブの３’末端は、単一のｄｄＮＴＰによって伸長される。図２Ａに示すように、標識ｄｄＮＴＰが多型ヌクレオチドに相補的である場合、プライマーは、１つの標識ｄｄＮＴＰによって伸長されて、タグ及び標識された反応生成物を形成する。図２Ｂに示すように、多型ヌクレオチドが標識ｄｄＮＴＰに相補的でない場合、プライマーは非標識ｄｄＮＴＰによって伸長され、検出されない非標識反応生成物が生じる。
４．直接ハイブリダイゼーション
一態様では、直接ハイブリダイゼーション法を使用して、サンプル中の１つ以上の標的分析物を検出、同定、又は定量化するための方法又はキットが提供される。一態様では、方法又はキットは、サンプル中の１つ以上の標的核酸の配列に相補的である１つ以上の核酸配列を含む１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチド（本明細書では「標的特異的捕捉オリゴヌクレオチド」と呼ばれる）を含む。一態様では、方法又はキットは、多重化アレイで使用して、複数の標的分析物を並行して検出、同定、又は定量化することができる複数の標的特異的捕捉オリゴヌクレオチドを含む。
一態様では、この方法は、１つ以上の標的特異的捕捉分子が固定化される支持体表面を提供するステップを含む。一態様では、支持体表面は、平坦な表面を有する。一態様では、支持体表面は、複数のウェルを備えたプレート、すなわち「マルチウェルプレート」である。マルチウェルプレートは、任意のパターン又は構成で配置された、任意のサイズ又は形状の任意の数のウェルを含むことができる。別の態様では、支持体表面は、曲面を有する。一態様では、支持体表面は、アッセイプレート、スライド、カートリッジ、ビーズ、又はチップなどのアッセイモジュールを含む。一態様では、支持体表面は、１つ以上の粒子又は「ビーズ」によって提供される。一態様では、支持体表面は、色分けされたミクロスフェアを含む。例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＢＡＤＧＥ，ＢｅａｄｓＡｒｒａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａ Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏａｓｓａｙ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（１１）：１８８８－１８９８を参照されたい。一態様では、支持体表面は、１つ以上の標的特異的捕捉オリゴヌクレオチドが固定化されている１つ以上のビーズを含む。
一態様では、１つ以上の標的特異的捕捉分子は、アレイ内の結合ドメインに固定化されている。一態様では、支持体表面は、１つ以上の表面を有する１つ以上のカーボンベースの電極と、１つ以上のカーボンベースの電極の１つ以上の表面上の１つ以上の結合ドメインに固定化された１つ以上の標的特異的捕捉オリゴヌクレオチドとを含む。
一態様では、１つ以上の標的分析物を含有するか、又は含有することが疑われるサンプルを、１つ以上の標的核酸上の配列に相補的な１つ以上の配列を含む１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ、及び標識されたプライマーが標的分析物にハイブリダイズする条件下で、１つ以上の標的分析物に相補的である配列を含む標識プライマーと接触させられる。次いで、ＰＣＲ増幅などの既知の技術を使用して標的分析物を増幅し、標識された反応生成物を形成することができる。
一態様では、１つ以上の標的特異的捕捉オリゴヌクレオチド配列が固定化される支持体表面は、１つ以上の標識された反応生成物のオリゴヌクレオチドタグがそれらの対応する相補的捕捉オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズし、固定化された検出複合体を形成し、アレイ位置における標識の存在又は非存在に基づいて、標的分析物を同定、検出又は定量化することができる条件下で、標識された反応生成物と接触させられる。
一態様では、直接ハイブリダイゼーションを使用して、サンプル中のウイルスの存在を検出、同定、又は定量化する。一態様では、直接ハイブリダイゼーションは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ジェノタイピングに使用することができる。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の感染は、子宮頸がんの主な原因である。２００を超えるＨＰＶ遺伝型が同定されており、約４０が生殖器感染の原因である。ＨＰＶ型１６、１８、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５３、５６、５８、５９、６６、６８、７３及び８２は、発がん性であるとみなされる。Ｍｕｎｏｚ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３（４８）：５１８．
一態様では、直接ハイブリダイゼーションを使用して、サンプル中の細菌の存在を検出、同定、又は定量化する。一態様では、直接ハイブリダイゼーションを使用して、サンプル中のＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）を検出、同定、又は定量化する。一態様では、直接ハイブリダイゼーションを使用して、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの３つの主要な血清型（血清型Ａ～Ｃ）の１つ以上を検出、同定、又は定量化する。
一態様では、直接ハイブリダイゼーションを使用して、サンプル中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａの存在を検出、同定、又は定量化する。２６００以上の異なる血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）が同定されており、チフス性及び非チフス性の血清型（ｓｅｒｖｏｖａｒ）に分けることができる。Ｇａｌ－ｍｏｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓａｍｅ ｓｐｅｃｉｅｓ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ：ｈｏｗ ａｎｄ ｗｈｙ ｔｙｐｈｏｉｄａｌ ａｎｄ ｎｏｎ－ｔｙｐｈｏｉｄａｌ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｖｏｖａｒｓ ｄｉｆｆｅｒ．Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５（３９１）ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１４．００３９１。
一態様では、直接ハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチド代謝産物を含有し得るサンプル中の標的ヌクレオチド配列、例えば、治療用オリゴヌクレオチドの検出、同定、及び／又は定量化に使用される。一態様では、標的ヌクレオチド配列を含有するサンプルは、１つ以上のオリゴヌクレオチド代謝産物を更に含む。一態様では、直接ハイブリダイゼーションを使用して、オリゴヌクレオチド代謝産物と比較したサンプル中の標的ヌクレオチド配列の量を測定する。一態様では、直接ハイブリダイゼーションを使用して、標的ヌクレオチド配列の薬物動態パラメータを決定する。一態様では、測定される薬物動態パラメータは、クリアランス、体積分布、血漿濃度、半減期、ピーク時間、ピーク濃度、利用可能率、又はそれらの組み合わせである。薬物動態パラメータの測定及び解釈は、本明細書に記載されている。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、治療用オリゴヌクレオチドである。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。治療用オリゴヌクレオチド、ＡＳＯ、並びにそれらの代謝及び薬理学が本明細書に記載されている。
一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、標的ヌクレオチド配列よりも１ヌクレオチド以上、２ヌクレオチド以上、３ヌクレオチド以上、４ヌクレオチド以上、５ヌクレオチド以上、６ヌクレオチド以上、７ヌクレオチド以上、８ヌクレオチド以上、９ヌクレオチド以上、１０ヌクレオチド以上、１５ヌクレオチド以上、又は２０ヌクレオチド以上短い。一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、標的ヌクレオチド配列よりも約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、又は約１０％短い。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、治療用オリゴヌクレオチドである。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、治療用オリゴヌクレオチド代謝産物である。
の例示的な実施形態が図１６に示されている。図１６において、標的ヌクレオチド配列を含有するサンプルは、標的ヌクレオチド配列及び標的ヌクレオチド配列補体がハイブリダイズする条件下で、標的ヌクレオチド配列に対する相補的配列を含む標的ヌクレオチド配列補体と接触させられる。一態様では、標的ヌクレオチド配列及び標的ヌクレオチド配列補体は、それらの全長にわたってハイブリダイズしている。一態様では、標的ヌクレオチド配列分析物及び標的ヌクレオチド配列補体は、ハイブリダイズして二本鎖ハイブリダイゼーション複合体を形成する。一態様では、標的ヌクレオチド配列を含有するサンプルは、１つ以上のオリゴヌクレオチド代謝産物を更に含む。標的ヌクレオチド配列の代謝産物、例えば、ＡＳＯなどの治療用オリゴヌクレオチドが本明細書に記載されている。一態様では、この方法は、オリゴヌクレオチド代謝産物を除去することを含む。一態様では、標的ヌクレオチド配列及び標的ヌクレオチド配列補体がハイブリダイズしている間に、一本鎖特異的ヌクレアーゼがサンプルに付加される。一態様では、一本鎖特異的ヌクレアーゼは、ハイブリダイズした標的ヌクレオチド配列及び標的ヌクレオチド配列補体に対して実質的に非反応性である一方で、一本鎖オリゴヌクレオチド代謝産物を特異的に除去する。一態様では、一本鎖特異的ヌクレアーゼは、ハイブリダイズしていない過剰な標的ヌクレオチド配列補体を更に除去する。一本鎖特異的ヌクレアーゼを含む適切なヌクレアーゼの例が本明細書に提供される。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、治療用オリゴヌクレオチドである。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、治療用オリゴヌクレオチド代謝産物である。
一態様では、一本鎖特異的ヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチド代謝産物及び／又はハイブリダイズしていない標的ヌクレオチド配列補体の除去後、標的ヌクレオチド配列の隣接領域にハイブリダイズすることができるプローブが付加される。一態様では、各々が標的ヌクレオチド配列の隣接領域にハイブリダイズする２つの隣接するプローブがライゲーションされて、反応生成物を形成する。一態様では、プローブは、本明細書に記載の標的化プローブ及び検出プローブを含む。一態様では、標的化プローブ及び検出プローブは、標的ヌクレオチド配列の全長にわたってハイブリダイズする。一態様では、標的化プローブは、オリゴヌクレオチドタグを含む。標的化プローブ及びオリゴヌクレオチドタグは、本明細書で更に説明される。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である。一態様では、検出プローブは、標識を含む。検出プローブ及び標識は、本明細書で更に説明される。一態様では、検出プローブは、検出試薬に結合することができる。一態様では、検出プローブは、ビオチン標識を含む。一態様では、標識はビオチンを含み、検出試薬はストレプトアビジンに連結されている。別の態様では、標識はハプテンを含み、検出試薬は、抗体などのハプテン結合パートナーに連結されている。標識、検出試薬、及び標識と検出試薬との間の結合様式は、本明細書で更に説明される。一態様では、表面は、標識に結合するための検出試薬と接触させられる。一態様では、検出試薬は、電気化学発光試薬である。一態様では、検出試薬は、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧを含む。一態様では、電気化学発光は、標的ヌクレオチド配列を検出、同定、及び／又は定量化するために、本明細書に記載されるように測定される。一態様では、サンプル中の標的ヌクレオチド配列の量を測定して、標的ヌクレオチド配列の薬物動態パラメータを決定する。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、治療用オリゴヌクレオチドである。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、治療用オリゴヌクレオチド代謝産物である。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、ＲＮＡを含む。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、ｍｉＲＮＡ、治療用ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡウイルス、又はそれらの組み合わせを含む。
５．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
一態様では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、サンプル中の１つ以上の標的分析物を検出、同定、又は定量化するための方法又はキットが提供される。一態様では、標的核酸は、ＰＣＲを使用して増幅される。一態様では、１つ以上のＰＣＲプライマーのセットを含む方法又はキットが提供され、プライマーの各セットは、上流プライマー及び下流プライマーを含む。一態様では、サンプル中の標的ヌクレオチド配列は、１つ以上の上流及び下流のＰＣＲプライマーを使用して増幅される。
一態様では、サンプル中の１つ以上の標的ヌクレオチド分析物は、１つ以上の修飾された上流又は下流プライマーを使用して増幅される。一態様では、１つ以上の標的ヌクレオチド分析物は、相補的配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように構成されたオリゴヌクレオチドタグ配列を含む１つ以上の上流プライマーを使用して増幅される。一態様では、１つ以上の標的ヌクレオチド分析物は、標識を含む１つ以上の下流プライマーを使用して増幅される。一態様では、１つ以上の標的ヌクレオチド分析物は、相補的配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように構成されたオリゴヌクレオチドタグ配列を含む１つ以上の下流プライマーを使用して増幅される。一態様では、１つ以上の標的ヌクレオチド分析物は、標識を含む１つ以上の上流プライマーを使用して増幅される。
一態様では、標的ヌクレオチド配列は、１つ以上の修飾ＰＣＲプライマーを使用して増幅され、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように構成されたオリゴヌクレオチドタグを含むＰＣＲ反応生成物を形成する。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、１つ以上の修飾ＰＣＲプライマーを使用して増幅されて、標識を含むＰＣＲ反応生成物を形成する。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、１つ以上の修飾ＰＣＲプライマーを使用して増幅され、支持体表面及び標識に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように構成されたオリゴヌクレオチドタグを含むＰＣＲ反応生成物を形成する。ＰＣＲ反応生成物を標識するための方法は知られており、例えば、標識されたデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）又は標識を含む修飾された上流又は下流のプライマーを含む。
一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、支持体表面上のアレイ内の結合ドメインに固定化されている。一態様では、ＰＣＲ反応生成物は、オリゴヌクレオチドタグをその対応する捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることによって支持体表面に捕捉され、それによって、支持体表面に固定化される検出複合体を形成する。
一態様では、１つ以上の標的分析物は、ライゲーション媒介増幅（ＬＭ ＰＣＲ）を使用して検出、同定、又は定量化される。一態様では、１つ以上の標的分析物は、本明細書に記載の方法と組み合わせた多重「ライゲーション媒介増幅」を使用して、検出、同定、又は定量化される。一態様では、１つ以上の標的ヌクレオチド分析物は、上流及び下流のプローブを使用して逆転写される。一態様では、上流プローブは、Ｔ７などのユニバーサルプライマー部位に相補的なヌクレオチド配列、オリゴヌクレオチドタグ配列、及び遺伝子特異的配列を含み、下流プローブは、上流のプローブとＴ３などのユニバーサルプライマーサイトとの遺伝子特異的フラグメントに接触している遺伝子特異的フラグメントを含む。一態様では、下流のプローブは５’－リン酸化されている。一態様では、プローブはそれらの標的にアニーリングされ、遊離プローブが除去され、アニールされたプローブがリガーゼを使用してライゲーションされて、増幅テンプレートが得られる。一態様では、ＰＣＲは、Ｔ３及び５’－ビオチン化Ｔ７プライマーを用いて実施される。一態様では、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドタグがそれらの対応する捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする条件下で、ビオチン化アンプリコンと接触させる。一態様では、捕捉された標識アンプリコンは、標識ストレプトアビジン、例えば、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ標識ストレプトアビジンとインキュベートされ、捕捉された標識アンプリコンを検出、同定又は定量化することができる。例えば、Ｐｅｃｋ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓＧｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．７（７）：Ｒ６１を参照されたい。
一態様では、標的分析物は、ｃＤＮＡである。一態様では、標的分析物は、ｍＲＮＡである。一態様では、ｃＤＮＡは、オリゴｄＴプライマーを使用してポリＡテールｍＲＮＡから合成される。一態様では、ｃＤＮＡは、ランダムプライミングされたｃＤＮＡ合成を使用して、ｍＲＮＡから生成することができる。
６．ヌクレアーゼ保護アッセイ（ＮＰＡ）
一態様では、ヌクレアーゼ保護アッセイ法を使用して、サンプル中の１つ以上の標的分析物を検出、同定、又は定量化するための方法又はキットが提供される。一態様では、ヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、標的分析物を含有するか、又は含有することが疑われるサンプル中の標的分析物を検出、同定、又は定量化する。一態様では、標的分析物は、例えば、一本鎖ＲＮＡを含む一本鎖核酸を含む。一態様では、標的分析物は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。一態様では、サンプルは、標的分析物がプローブにハイブリダイズしてタグされた反応生成物を形成する条件下で、標的分析物の配列に相補的な配列及びオリゴヌクレオチドタグ配列を含む１つ以上の一本鎖プローブと接触させられる。一態様では、プローブは、一本鎖ＤＮＡタグ配列及び標的分析物の核酸配列に相補的である一本鎖ＲＮＡ配列を含むＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドプローブである。一態様では、ハイブリッドプローブは、ビオチン標識を含む。
一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドが固定化される支持体表面は、１つ以上のオリゴヌクレオチドタグ配列が支持体表面に固定化される対応する捕捉オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズする条件下で、タグされた反応生成物を含む混合物と接触させられる。オリゴヌクレオチドタグを支持体表面上の対応する捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた後、支持体表面を洗浄し、ＲＮａｓｅが、一本鎖ＲＮＡ分子を消化し、標的ＲＮＡをハイブリダイズしていないスポットに結合した過剰なプローブを除去し、プローブと標的ＲＮＡとの間の不一致部位を切断できる条件下で一本鎖ＲＮＡに特異的なＲＮａｓｅ、例えば、ＲＮａｓｅ Ａ又はＲＮａｓｅ Ｉと接触させられる。
一態様では、ｍｉＲＮＡ分析は、アニール温度の漸進的低減の間にＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブが標的ｍｉＲＮＡにハイブリダイズするステップダウンプローブハイブリダイゼーションステップを含む。
一態様では、直接表面コーティングを施したヌクレアーゼ保護アッセイ（ＮＰＡ）は、オリゴヌクレオチド代謝産物とも呼ばれる、標的ヌクレオチド配列の分解生成物を含有し得るサンプル中にある標的ヌクレオチド配列の検出、同定、及び／又は定量化のために使用される。一態様では、標的ヌクレオチド配列を含有するサンプルは、１つ以上のオリゴヌクレオチド代謝産物を更に含む。一態様では、直接表面コーティングを施したＮＰＡを使用して、オリゴヌクレオチド代謝産物と比較したサンプル中の標的ヌクレオチド配列の量を測定する。一態様では、直接表面コーティングを施したＮＰＡを使用して、治療用オリゴヌクレオチドの薬物動態パラメータを決定する。一態様では、測定される薬物動態パラメータは、クリアランス、体積分布、血漿濃度、半減期、ピーク時間、ピーク濃度、利用可能率、又はそれらの組み合わせである。薬物動態パラメータの測定及び解釈は、本明細書に記載されている。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、治療用オリゴヌクレオチドである。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、治療用オリゴヌクレオチド代謝産物である。治療用オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、並びにそれらの代謝及び薬理学が本明細書に記載されている。
一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、標的ヌクレオチド配列よりも１ヌクレオチド以上、２ヌクレオチド以上、３ヌクレオチド以上、４ヌクレオチド以上、５ヌクレオチド以上、６ヌクレオチド以上、７ヌクレオチド以上、８ヌクレオチド以上、９ヌクレオチド以上、１０ヌクレオチド以上、１５ヌクレオチド以上、又は２０ヌクレオチド以上短い。一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、標的ヌクレオチド配列よりも約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、又は約１０％短い。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、治療用オリゴヌクレオチドである。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、治療用オリゴヌクレオチド代謝産物である。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、治療用オリゴヌクレオチドを増幅することなく検出される。一態様では、サンプル中の治療用オリゴヌクレオチドは、核酸抽出ステップなしで検出される。
例示的な実施形態が図１７に示されている。図１７において、標的ヌクレオチド配列に対する相補的配列を含む標的ヌクレオチド配列補体が、捕捉オリゴヌクレオチドとして使用される。標的ヌクレオチド配列補体は、一端に標識を含み、他端に表面付着部分を含む。捕捉オリゴヌクレオチドを表面に固定化する方法は、本明細書に記載され、例えば、静電相互作用、相補的結合パートナー、相補的反応性官能基、リンカー（例えば、反応性官能基を含む架橋剤）などを含む。一態様では、表面は、標的ヌクレオチド配列補体の表面付着部分を介して標的ヌクレオチド配列補体でコーティングされている。一態様では、表面付着部分は、チオールを含む。一態様では、表面付着部分は、ビオチンを含む。
一態様では、標的ヌクレオチド配列補体でコーティングされた表面は、標的ヌクレオチド配列補体及び標的ヌクレオチド配列がハイブリダイズする条件下で、標的ヌクレオチド配列を含有するサンプルと接触させられる。一態様では、標的ヌクレオチド配列及び標的ヌクレオチド配列補体は、それらの全長にわたってハイブリダイズしている。一態様では、標的ヌクレオチド配列及び標的ヌクレオチド配列補体は、ハイブリダイズして二本鎖ハイブリダイゼーション複合体を形成する。一態様では、標的ヌクレオチド配列を含有するサンプルは、１つ以上のオリゴヌクレオチド代謝産物を更に含む。標的ヌクレオチド配列の代謝産物、例えば、ＡＳＯなどの治療用オリゴヌクレオチドが本明細書に記載されている。一態様では、この方法は、オリゴヌクレオチド代謝産物を除去することを含む。一態様では、標的ヌクレオチド配列及び標的ヌクレオチド配列補体がハイブリダイズしている間に、一本鎖特異的ヌクレアーゼがサンプルに付加される。一態様では、一本鎖特異的ヌクレアーゼは、ハイブリダイズした標的ヌクレオチド配列－標的ヌクレオチド配列補体に対して実質的に非反応性である一方で、一本鎖オリゴヌクレオチド代謝産物を特異的に除去する。一本鎖特異的ヌクレアーゼを含む適切なヌクレアーゼの例が本明細書に提供される。
一態様では、一本鎖特異的ヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチド代謝産物の除去後、表面を、標的ヌクレオチド配列補体上の標識に結合することができる検出試薬と接触させられる。一態様では、標識はビオチンを含み、検出試薬はストレプトアビジンに連結されている。別の態様では、標識はハプテンを含み、検出試薬は、抗体などのハプテン結合パートナーに連結されている。標識、検出試薬、及び標識と検出試薬との間の結合様式は、本明細書で更に説明される。一態様では、検出試薬は、電気化学発光試薬である。一態様では、検出試薬は、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧを含む。一態様では、電気化学発光は、標的ヌクレオチド配列を検出、同定、及び／又は定量化するために、本明細書に記載されるように測定される。一態様では、サンプル中の標的ヌクレオチド配列の量を測定して、標的ヌクレオチド配列の薬物動態パラメータを決定する。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、治療用オリゴヌクレオチドである。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、治療用オリゴヌクレオチド代謝産物である。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、ＲＮＡを含む。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、ｍｉＲＮＡ、治療用ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡウイルス、又はそれらの組み合わせを含む。
別の態様では、標的ヌクレオチド配列は、小さな核酸、例えば、少なくとも約１５塩基対、少なくとも約１６塩基対、少なくとも約１７塩基対、少なくとも約１８塩基対、少なくとも約１９塩基対、又は少なくとも約２０塩基対、及び最大約２０塩基対の長さ、最大約２５塩基対の長さ、最大約３０塩基対の長さ、最大約４０塩基対の長さ、又は最大約５０塩基対の長さである。一態様では、このような小さな核酸標的を検出するためのプローブは、少なくとも約８塩基対、少なくとも約９塩基対、少なくとも約１０塩基対、少なくとも約１１塩基対、又は少なくとも約１２塩基対、及び最大約２０塩基対の長さ、最大約２５塩基対の長さ、最大約３０塩基対の長さ、最大約４０塩基対の長さ、又は最大約５０塩基対の長さを含み、プローブ及び小さな核酸標的は、本明細書に記載されるように別のものをハイブリダイズした後にライゲーションされる。
７．ハイブリダイゼーション／保護アッセイ
一態様では、ハイブリダイゼーション／保護アッセイは、オリゴヌクレオチド代謝産物を含有し得るサンプル中の標的ヌクレオチド配列、例えば、治療用オリゴヌクレオチドの検出、同定、及び／又は定量化に使用される。一態様では、標的ヌクレオチド配列を含有するサンプルは、１つ以上のオリゴヌクレオチド代謝産物を更に含む。一態様では、ハイブリダイゼーション／保護アッセイを使用して、オリゴヌクレオチド代謝産物と比較したサンプル中の標的ヌクレオチド配列の量を測定する。一態様では、ハイブリダイゼーション／保護アッセイを使用して、治療用オリゴヌクレオチドの薬物動態パラメータを決定する。一態様では、測定される薬物動態パラメータは、クリアランス、体積分布、血漿濃度、半減期、ピーク時間、ピーク濃度、利用可能率、又はそれらの組み合わせである。薬物動態パラメータの測定及び解釈は、本明細書に記載されている。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、治療用オリゴヌクレオチドである。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。治療用オリゴヌクレオチド、ＡＳＯ、並びにそれらの代謝及び薬理学が本明細書に記載されている。
一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、標的ヌクレオチド配列よりも１ヌクレオチド以上、２ヌクレオチド以上、３ヌクレオチド以上、４ヌクレオチド以上、５ヌクレオチド以上、６ヌクレオチド以上、７ヌクレオチド以上、８ヌクレオチド以上、９ヌクレオチド以上、１０ヌクレオチド以上、１５ヌクレオチド以上、又は２０ヌクレオチド以上短い。一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、標的ヌクレオチド配列よりも約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、又は約１０％短い。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、治療用オリゴヌクレオチドである。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、治療用オリゴヌクレオチド代謝産物である。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、治療用オリゴヌクレオチドを増幅することなく検出される。一態様では、サンプル中の治療用オリゴヌクレオチドは、核酸抽出ステップなしで検出される。
例示的な実施形態が図１８に示されている。図１８において、標的ヌクレオチド配列を含有するサンプルは、（ｉ）標的ヌクレオチド配列に相補的な標的ヌクレオチド配列補体配列、（ｉｉ）オリゴヌクレオチドタグ、及び（ｉｉｉ）標識を含む標的ヌクレオチド配列補体プローブと接触させられる。一態様では、標的ヌクレオチド配列補体プローブのオリゴヌクレオチドタグは、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である。一態様では、標的ヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドタグは二本鎖であり、オリゴヌクレオチドタグの１つの鎖は、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である。オリゴヌクレオチドタグ及び捕捉オリゴヌクレオチドは、本明細書で更に説明される。一態様では、標的ヌクレオチド配列補体プローブの標識は、検出試薬に結合することができる。一態様では、標識はビオチンを含み、検出試薬はストレプトアビジンに連結されている。別の態様では、標識はハプテンを含み、検出試薬は、抗体などのハプテン結合パートナーに連結されている。標識、検出試薬、及び標識と検出試薬との間の結合様式は、本明細書で更に説明される。
一態様では、標的ヌクレオチド配列は、標的ヌクレオチド配列補体プローブにハイブリダイズする。一態様では、標的ヌクレオチド配列及び標的ヌクレオチド配列補体プローブは、標的ヌクレオチド配列及び標的ヌクレオチド配列補体配列の全長にわたってハイブリダイズする。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは二本鎖であり、標的ヌクレオチド配列及び標的ヌクレオチド配列補体配列はハイブリダイズして二本鎖ハイブリダイゼーション複合体を形成する。一態様では、標的ヌクレオチド配列を含有するサンプルは、１つ以上のオリゴヌクレオチド代謝産物を更に含む。標的ヌクレオチド配列の代謝産物、例えば、ＡＳＯなどの治療用オリゴヌクレオチドが本明細書に記載されている。一態様では、この方法は、オリゴヌクレオチド代謝産物を除去することを含む。一態様では、標的ヌクレオチド配列及び標的ヌクレオチド配列補体がハイブリダイズしている間に、一本鎖特異的ヌクレアーゼがサンプルに付加される。一態様では、一本鎖特異的ヌクレアーゼは、ハイブリダイズした標的ヌクレオチド配列－標的ヌクレオチド配列補体に対して実質的に非反応性である一方で、一本鎖オリゴヌクレオチド代謝産物を特異的に除去する。一態様では、一本鎖特異的ヌクレアーゼは、過剰なハイブリダイズしていない標的ヌクレオチド配列補体プローブを更に除去する。一本鎖特異的ヌクレアーゼを含む適切なヌクレアーゼの例が本明細書に提供される。
一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物及び／又はハイブリダイズしていない標的ヌクレオチド配列補体プローブの除去後、ハイブリダイズした標的ヌクレオチド配列－標的ヌクレオチド配列補体プローブは、表面の捕捉オリゴヌクレオチドへの標的ヌクレオチド配列補体プローブ上のオリゴヌクレオチドタグの結合を介して支持体表面に固定化されている。一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物及び／又はハイブリダイズしていない標的ヌクレオチド配列補体プローブは、ハイブリダイズした標的ヌクレオチド配列－標的ヌクレオチド配列補体プローブの固定化の前に除去され、同時除去／固定化、又は固定化とそれに続く除去フォーマットと比較して改善された感度を提供する。一態様では、検出試薬が表面に付加され、検出試薬は、標的ヌクレオチド配列補体プローブ上の標識に結合する。一態様では、検出試薬は、電気化学発光試薬である。一態様では、検出試薬は、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧを含む。一態様では、電気化学発光は、標的ヌクレオチド配列を検出、同定、及び／又は定量化するために、本明細書に記載されるように測定される。一態様では、サンプル中の標的ヌクレオチド配列の量を測定して、標的ヌクレオチド配列の薬物動態パラメータを決定する。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、治療用オリゴヌクレオチドである。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一態様では、オリゴヌクレオチド代謝産物は、治療用オリゴヌクレオチド代謝産物である。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、ＲＮＡを含む。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、ｍｉＲＮＡ、治療用ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡウイルス、又はそれらの組み合わせを含む。
８．シグナル増幅
一態様では、標識された反応生成物からのシグナルは、例えば、低い数の結合事象の検出、例えば、個々の検出複合体の検出を改善するために増幅される。一態様では、標識された反応生成物からの検出可能なシグナルは、複数の標識又は検出標識部位を含むアンプリコンを生成することによって増幅され、それによって反応生成物に対する検出可能なシグナルが増幅される。一態様では、標識された反応生成物からの検出可能なシグナルは、複数の標識又は検出標識部位を含む伸長プローブを反応生成物に付着させることによって増幅され、それによって、反応生成物に対する検出可能なシグナルが増幅される。一態様では、反応生成物は、支持体表面に固定化されて、検出複合体を形成する。一態様では、標識された検出複合体からの検出可能なシグナルは、複数の標識又は検出標識部位を含む伸長プローブを検出複合体に付着させることによって増幅され、それによって検出可能なシグナルが増幅される。一態様では、アンカー試薬は、検出複合体を安定化させるために、支持体表面に固定化されている。一態様では、標識された反応生成物からの検出可能なシグナルは、複数の標識又は検出標識部位を含む伸長プローブを反応生成物に付着させることによって増幅され、アンカー試薬は、例えば、「ＩＭＰＲＯＶＥＤ ＡＳＳＡＹ ＭＥＴＨＯＤＳ」と題された２０１４年３月１２日に出願された国際出願第２０１４／１６５０６１号、及び「ＩＭＰＲＯＶＥＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＣＯＮＤＵＣＴＩＮＧ ＭＵＬＴＩＰＬＥＸＥＤ ＡＳＳＡＹＳ」と題された２０２０年２月２８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２０２８８号に記載されているように、検出複合体を安定化するために支持体表面に固定化され、その開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一態様では、検出複合体は、本明細書に記載されているように生成された反応生成物を支持体表面に固定化することによって形成される。一態様では、反応生成物は、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドと、反応生成物に付着されたオリゴヌクレオチドタグの相補的ヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションによって支持体表面に固定化される。一態様では、検出複合体は、アンカー試薬を介して支持体表面にアンカーされている。一態様では、アンカー試薬は、アンカーオリゴヌクレオチドを含む。一態様では、アンカーオリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチド配列を含む。一態様では、アンカーオリゴヌクレオチドは、検出複合体に付着するアンカー配列相補体のオリゴヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。
一態様では、標識された検出複合体からのシグナルは、増幅される。一態様では、標識された検出複合体からのシグナルは、複数の標識又は検出標識部位を含む１つ以上のアンプリコンを生成することによって増幅される。一態様では、標識された検出複合体からのシグナルは、複数の標識又は検出標識部位を含む伸長ヌクレオチド配列を検出複合体に付着させることによって増幅される。一態様では、複数の標識又は検出標識部位を含む伸長ヌクレオチド配列は、検出複合体に付着しており、検出複合体は、アンカー試薬を介して支持体表面にアンカーされている。
一態様では、サンプル中の分析物は、本明細書に記載の反応生成物を形成し、反応生成物を捕捉分子に固定化して検出複合体を形成することによって検出される。一態様では、捕捉分子は、捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、反応生成物は、捕捉オリゴヌクレオチドの核酸配列に相補的である核酸配列を有するオリゴヌクレオチドタグを含む。一態様では、反応生成物は、検出配列を含む。一態様では、検出配列は、１つ以上、又は複数の、検出可能な標識又は検出標識部位を含む、伸長配列又はアンプリコンを形成するように伸長する
一態様では、検出配列は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＳＤＡ（鎖置換増幅）、３ＳＲ（自立合成反応）、又はヘリカーゼ依存性増幅又はローリングサークル増幅（ＲＣＡ）などの等温増幅法などの増幅技術のためのプライマーとして使用されるが、これらに限定されない。一態様では、検出配列は、増幅テンプレートと接触され、検出配列は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、増幅テンプレートを増幅するためにプライマーとして使用される。一態様では、検出配列は、増幅テンプレートと接触し、検出配列は、例えば、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって、増幅テンプレートの増幅のためのプライマーとして機能する。
一態様では、増幅テンプレートは、直鎖増幅テンプレートである。一態様では、増幅テンプレートは、環状増幅テンプレートである。一態様では、検出配列を伸長することは、検出配列を環状増幅テンプレートと接触させることと、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって検出配列を伸長することとを含む。一態様では、検出配列を伸長することは、検出配列を直鎖増幅テンプレートと接触させることと、例えば、直鎖テンプレートの５’及び３’末端を連結して環を形成することによって、環状増幅テンプレートを形成することと、ＲＣＡによる環状テンプレートを伸長することとを含む。一態様では、アンプリコンは、複数の検出標識部位を含む。一態様では、拡張配列は、複数の検出標識部位を含む。一態様では、伸長配列は、伸長後、表面上に局在したままである。
ＲＣＡの技術は当該技術分野で知られている（例えば、Ｂａｎｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６：５０７３ ５０７８，１９９８、Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９：２２６，１９９８、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：１０１１３ １１９，２０００、Ｆａｒｕｑｉ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２：４，２０００、Ｎａｌｌｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：ｅ１１８，２００１、Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１：１０９５ １０９９，２００１、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：３５９ ３６５，２００２、米国特許第６，０５４，２７４号、同第６，２９１，１８７号、同第６，３２３，００９号、同第６，３４４，３２９号、及び同第６，３６８，８０１号）を参照されたい）、並びに直鎖ＲＣＡ（ＬＲＣＡ）及び指数関数的ＲＣＡ（ＥＲＣＡ）等の変形を含む。ＲＣＡは、元の標的ＤＮＡ（この場合は、検出配列）にコピー鎖が付着した、環状テンプレートの何千ものコピーを生成し、迅速なシグナル増幅を可能にする。
一態様では、増幅テンプレートは直鎖テンプレートであり、その５’及び３’末端を連結して環状テンプレートを生成することができる。一態様では、検出配列は、増幅テンプレートの核酸配列に相補的である核酸配列を含む。一態様では、検出オリゴヌクレオチドは、増幅反応のプライマーとして機能する。一態様では、検出オリゴヌクレオチドは、ＲＣＡのプライマーとして機能する。一態様では、ＲＣＡは、検出オリゴヌクレオチドを伸長して伸長配列又はアンプリコンを形成する。
一態様では、増幅テンプレートは、５’末端ヌクレオチド配列及び３’末端ヌクレオチド配列を有する直鎖増幅テンプレートである。一態様では、増幅テンプレートの５’及び３’末端ヌクレオチド配列は、検出配列にハイブリダイズすることができる。一態様では、増幅テンプレートは、アンカー試薬のアンカー配列の相補体にハイブリダイズすることができる内部ヌクレオチド配列を含む。一態様では、増幅テンプレートの５’及び３’末端ヌクレオチド配列は、内部配列と重複しない。一態様では、増幅テンプレートは、アンカー試薬のアンカー配列の相補体にハイブリダイズすることができる第１の内部ヌクレオチド配列と、検出試薬の核酸配列の相補体にハイブリダイズすることができる第２の内部ヌクレオチド配列とを含む。一態様では、増幅テンプレートの５’及び３’末端ヌクレオチド配列は、第１又は第２の内部配列と重複しない。一態様では、増幅テンプレートは、５’末端ホスフェート基を有する。
一態様では、増幅テンプレートは、長さが約４０～約１００ヌクレオチドの非天然オリゴヌクレオチドである。一態様では、増幅テンプレートは、長さが約５０～約７８ヌクレオチドの非天然オリゴヌクレオチドである。一態様では、増幅テンプレートは、非天然オリゴヌクレオチドは、長さが約５３～約７６ヌクレオチドである。一態様では、増幅テンプレートは、非天然オリゴヌクレオチドは、長さが約５０～約７０ヌクレオチドである。一態様では、増幅テンプレートは、非天然オリゴヌクレオチドは、長さが約５３～約６１ヌクレオチドである。一態様では、増幅テンプレートは、非天然オリゴヌクレオチドは、長さが約５４～約６１ヌクレオチドである。一態様では、増幅テンプレートは、非天然オリゴヌクレオチドは、約６１ヌクレオチドの長さである。一態様では、増幅テンプレートは、長さが約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４又は約５５、及び最大約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、又は約７６ヌクレオチドからなる非天然のオリゴヌクレオチドである。一態様では、増幅テンプレートは、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、又は約７６ヌクレオチドの長さの非天然オリゴヌクレオチドである。
一態様では、増幅テンプレートの５’及び３’末端配列の長さの合計は、約１４～約２４ヌクレオチドの長さである。一態様では、増幅テンプレートの３’及び５’末端配列の長さの合計は、約１４～約１９ヌクレオチドの長さである。一態様では、増幅テンプレートの３’及び５’末端配列の長さの合計は、約１４、約１５、約１６又は約１７、及び最大約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３又は約２４ヌクレオチドの長さである。一態様では、増幅テンプレートの３’及び５’末端配列の長さの合計は、長さが約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３又は約２４ヌクレオチドである。一態様では、増幅テンプレートの３’及び５’末端配列の長さの合計は、約１４又は約１５ヌクレオチドの長さである。
一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＧＴＴＣＴＧＴＣ－３’（配列番号１６６６）の５’末端配列及び５’－ＧＴＧＴＣＴＡ－３’（配列番号１６６７）の３’末端配列を有する。一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧ－３’（配列番号１６６８）を含むヌクレオチド配列を有する。一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧ－３’（配列番号１６６８）からなるヌクレオチド配列を有する。一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡ－３’（配列番号１６６９）を含むヌクレオチド配列を有する。一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡ－３’（配列番号１６６９）からなるヌクレオチド配列を有する。一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＧＴＴＣＴＧＴＣＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＡ－３’（配列番号１６７０）を含むヌクレオチド配列を有する。一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＧＴＴＣＴＧＴＣＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＡ－３’（配列番号１６７０）からなるヌクレオチド配列を有する。一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＧＣＴＧＴＧＣＡＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＡ－３’（配列番号１６７１）を含むヌクレオチド配列を有する。一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＧＣＴＧＴＧＣＡＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＡ－３’（配列番号１６７１）からなるヌクレオチド配列を有する。
一態様では、支持体表面は、捕捉分子及びアンカーオリゴヌクレオチドを含み、１つ以上の工程において、反応生成物は、捕捉分子及び検出試薬に結合される。一態様では、反応生成物は、同時に又は実質的に同時に、捕捉分子及び検出試薬に結合される。一態様では、反応生成物は、（いずれかの順序で）逐次、捕捉分子及び検出試薬に結合される。一態様では、検出複合体は、捕捉分子、反応生成物、及び検出試薬を含む支持体表面上に形成される。一態様では、検出試薬は、本明細書では検出オリゴヌクレオチドと称される、オリゴヌクレオチド配列を含む。一態様では、検出オリゴヌクレオチドは、アンカー試薬のアンカー配列に相補的であり、アンカー配列とハイブリダイズすることができるアンカー配列相補体を含む伸長配列（又はアンプリコン）を形成するように伸長する。一態様では、アンカー配列はアンカー配列相補体にハイブリダイズし、支持体表面に結合した伸長配列が検出される。
一態様では、伸長配列（又はアンプリコン）は、標識された検出試薬のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する１つ以上、又は複数の検出標識部位を含む。一態様では、標識された検出試薬は、検出標識部位のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、及び検出可能な標識を含む。一態様では、検出可能な標識は、電気化学発光標識を含む。一態様では、１つ以上、又は複数の標識された検出試薬は、アンプリコンにハイブリダイズし、検出複合体を検出するために使用される。一態様では、伸長プロセスは、アンプリコンに相補的な１つ以上の標識プローブを添加することなく、表面上のアンプリコンを直接検出するために使用されるアンプリコンに標識ヌクレオチド塩基を組み込む。
一態様では、検出配列は、約１０～約３０ヌクレオチドの長さの核酸配列を有する。一態様では、検出配列は、少なくとも約１２～約２８ヌクレオチドの長さであるヌクレオチド配列を有する。一態様では、検出配列は、少なくとも約１３～約２６ヌクレオチドの長さであるヌクレオチド配列を有する。一態様では、検出配列は、少なくとも約１４～約２４ヌクレオチドの長さであるヌクレオチド配列を有する。一態様では、検出配列は、少なくとも約１１～約２２ヌクレオチドの長さであるヌクレオチド配列を有する。一態様では、検出配列は、少なくとも約１２～約２１ヌクレオチドの長さであるヌクレオチド配列を有する。一態様では、検出配列は、少なくとも約１３～約２０ヌクレオチドの長さであるヌクレオチド配列を有する。一態様では、検出配列は、少なくとも約１３～約１８ヌクレオチドの長さであるヌクレオチド配列を有する。一態様では、検出配列は、少なくとも約１４～約１９ヌクレオチドの長さであるヌクレオチド配列を有する。一態様では、検出配列は、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４又は約１５、及び最大約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、又は約３０ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を有する。一態様では、検出配列は、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、又は約３０ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を有する。一態様では、検出配列は、約１４ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。一態様では、検出配列は、約１５ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。
一態様では、検出プローブの検出オリゴヌクレオチドは、増幅テンプレートの５’末端配列に相補的な第１の配列と、増幅テンプレートの３’末端配列に相補的な隣接する第２の配列とを有する。一態様では、検出試薬の核酸配列は、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴ－３’（配列番号１６７２）に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を有する。一態様では、検出試薬の核酸配列は、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴ－３’（配列番号１６７２）の少なくとも約１４、約１５、約１６、約１７、約１８又は約１９の連続したヌクレオチドを含む配列を有する。一態様では、検出試薬の核酸配列は、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴ－３’（配列番号１６７２）の少なくとも約１４、約１５、約１６、約１７、約１８又は約１９の連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％配列同一性を有する配列を有する。一態様では、検出試薬の核酸配列は、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴ－３’（配列番号１６７２）の１４又は１５個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％配列同一性を有する配列を有する。一態様では、検出試薬の核酸配列は、配列５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴ－３’（配列番号１６７２）を含む。一態様では、検出試薬の核酸配列は、配列５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴ－３’（配列番号１６７２）からなる。一態様では、検出試薬の核酸配列は、配列５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧ－３’（配列番号１６６８）を含む。一態様では、検出試薬の核酸配列は、配列５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧ－３’（配列番号１６６８）からなる。
一態様では、例えば、図２２及び２３に示されるように、アンカー試薬及びシグナル増幅プロセスの両方が使用される。例えば、標的ヌクレオチド配列、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む標的分析物を含むサンプルは、標的補体が標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズして反応生成物を形成する条件下で、標的補体、オリゴヌクレオチドタグ、及び検出オリゴヌクレオチドを含む検出プローブと接触させられる。一態様では、標的相補体は、ＲＮＡを含み、オリゴヌクレオチドタグ及び検出オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ配列を含む。一態様では、標的相補体は、ＲＮＡであり、オリゴヌクレオチドタグ及び検出オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡである。
一態様では、サンプルはまた、アンカー配列及びオリゴヌクレオチドタグを含むアンカー試薬と接触させる。一態様では、アンカー配列及びオリゴヌクレオチドタグは、共に、ＤＮＡ配列を含む。
一態様では、支持体表面は、反応生成物のオリゴヌクレオチドタグ、非結合プローブ、及びアンカー試薬がハイブリダイズして、支持体表面に固定化されたオリゴヌクレオチドを捕捉する条件下で、反応生成物、非結合プローブ、及び非結合アンカー試薬を含む混合物と接触させられる。本明細書で使用される場合、「非結合プローブ」とは、標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされていない検出プローブを指す。一態様では、支持体表面は、ＲＮａｓｅと接触させて、固定化された「非結合プローブ」中の一本鎖ＲＮＡを分解する。
一態様では、検出混合物は、支持体表面に付加される。一態様では、検出混合物は、ローリングサークル増幅のための直鎖テンプレート及びリガーゼを含む。一態様では、検出混合物はまた、例えば、ライゲーション緩衝液、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、及びそれらの組み合わせを含む、１つ以上の追加の成分を含む。一態様では、検出混合物は、例えば、ＢＳＡ、緩衝液、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、又はそれらの組み合わせを含む、ローリングサークル増幅のための１つ以上の成分を含む。一態様では、検出混合物は、アセチルＢＳＡを含む。
一態様では、直鎖ＤＮＡテンプレートは環化され、環状ＤＮＡテンプレートは、ローリングサークル増幅によって増幅されて、検出オリゴヌクレオチドを伸長し、１つ以上の検出標識部位及びアンカーオリゴヌクレオチド配列相補体を含むアンプリコンを生成する。一態様では、アンカーオリゴヌクレオチド配列相補体は、支持体表面に固定化されたアンカーオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズする。一態様では、１つ以上、又は複数の標識化された検出試薬は、シグナルを増幅するために、アンプリコンの検出標識部位にハイブリダイズする。
一態様では、サンプル中の標的分析物は、伸長配列に結合した検出可能な標識を検出することによって検出される。一態様では、伸長配列は、支持体表面から溶離液に放出され、溶離液中の伸長配列が検出される。
一態様では、サンプル中の標的オリゴヌクレオチドを検出するための方法が提供され、標的オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列を含む。一態様では、この方法は、
（ａ）標的補体が標的オリゴヌクレオチドの標的核酸配列にハイブリダイズして、反応生成物を形成する条件下で、サンプルを、オリゴヌクレオチドタグ、標的補体、及び検出オリゴヌクレオチドを含む検出プローブと接触させることと、
（ｂ）反応生成物のオリゴヌクレオチドタグが捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、固定化された検出複合体を形成する条件下で、捕捉オリゴヌクレオチドが固定化される支持体表面を、反応生成物を含む混合物と接触させることと、
（ｃ）固定化された検出複合体を、増幅テンプレートを含む検出混合物と接触させることと、
（ｄ）増幅テンプレートを増幅して、検出標識部位を含む１つ以上の核酸配列を含むアンプリコンを形成することと、
（ｅ）検出試薬の核酸配列がアンプリコンの検出標識部位にハイブリダイズする条件下で、アンプリコンを、標識及び検出標識部位に相補的な核酸配列を含む検出試薬と接触させることと、
（ｆ）検出標識部位に結合した標識を検出することと、を含む。
一態様では、サンプルは、（ａ）でアンカー試薬及び検出プローブと接触させ、アンカー試薬は、オリゴヌクレオチドタグ及びアンカー配列を含む。
一態様では、検出プローブは、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグ、一本鎖ＲＮＡ標的相補体、及び一本鎖ＤＮＡ検出オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、アンカー試薬は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグ及び一本鎖ＤＮＡアンカー配列を含む。一態様では、この方法は、（ｃ）の前に、非結合プローブの一本鎖ＲＮＡを分解するために、固定化された検出複合体をＲＮａｓｅと接触させることを含む。
一態様では、サンプル中の標的オリゴヌクレオチドを検出するための方法が提供され、標的オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列を含む。一態様では、この方法は、
（ａ）サンプルを、
（ｉ）一本鎖ＤＮＡ配列を含むオリゴヌクレオチドタグ、一本鎖ＲＮＡ配列を含む標的補体、及び一本鎖ＤＮＡ配列を含む検出オリゴヌクレオチドを含む検出プローブ、並びに
（ｉｉ）一本鎖ＤＮＡ配列を含むオリゴヌクレオチドタグ及び一本鎖ＤＮＡ配列を含むアンカー配列を含むアンカー試薬と接触させることであって、
検出プローブの標的相補体が標的オリゴヌクレオチドの標的核酸配列にハイブリダイズして、オリゴヌクレオチドタグ、標的オリゴヌクレオチド及び標的補体の標的核酸配列を含む二本鎖ＲＮＡ二本鎖を含む反応生成物を形成する、接触させることと、
（ｂ）反応生成物のオリゴヌクレオチドタグが捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズして支持体表面に検出複合体を形成する条件下で、複数の捕捉オリゴヌクレオチドが個別の結合ドメインに固定化されている１つ以上の電極を含む支持体表面を、反応生成物を含む混合物と接触させることと、
（ｃ）支持体表面をＲＮａｓｅと接触させて、結合していない検出プローブの一本鎖ＲＮＡを分解することと、
（ｄ）固定化された検出複合体を、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）テンプレート及びポリメラーゼを含む検出混合物と接触させることと、
（ｅ）ＲＣＡによってテンプレートを増幅して、検出複合体に付着した伸長配列を形成することであって、伸長配列が、検出標識部位を含む複数の核酸配列を含む、増幅することと、
（ｆ）検出試薬の核酸配列が検出標識部位にハイブリダイズする条件下で、伸長配列を、電気化学発光（ＥＣＬ）標識及び伸長配列の検出標識部位に相補的である核酸配列を含む検出試薬と接触させることと、
（ｇ）ＥＣＬ標識を、ＥＣＬ共反応物を含むＥＣＬ読み取り緩衝液と接触させ、電極に電位を印加することによって、伸長配列に結合したＥＣＬ標識を検出することと、を含む。
一態様では、サンプル中の標的ヌクレオチド配列を検出するための方法が提供される。一態様では、この方法は、
（ａ）サンプルを、
（ｉ）一本鎖オリゴヌクレオチドタグ及びサンプル中の標的ヌクレオチド配列の第１の領域に相補的である第１の核酸配列を含む標的化プローブ、並びに
（ｉｉ）検出オリゴヌクレオチド及び標的ヌクレオチド配列の第２の領域に相補的である第２の核酸配列を含む検出プローブ、を含む混合物と接触させることであって、
標的化プローブの第１の核酸配列及び検出プローブの第２の核酸配列が、標的オリゴヌクレオチドの隣接する核酸配列に相補的である、接触させることと、
（ｂ）標的化プローブ及び検出プローブが標的オリゴヌクレオチドのそれらの対応するヌクレオチド配列に結合し、核酸リガーゼが標的化及び検出プローブを連結して、オリゴヌクレオチドタグ及び検出オリゴヌクレオチドを含む反応生成物を形成する条件下で、核酸リガーゼの存在下で、標的オリゴヌクレオチド、標的化プローブ及び検出プローブを含む混合物をインキュベートすることと、
（ｂ）反応生成物のオリゴヌクレオチドタグが捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、固定化された検出複合体を形成する条件下で、捕捉オリゴヌクレオチドが固定化されている支持体表面を、反応生成物を含む混合物と接触させることと、
（ｃ）固定化された検出複合体を、増幅テンプレートを含む検出混合物と接触させることと、
（ｄ）増幅テンプレートを増幅して、検出標識部位を含む１つ以上の核酸配列を含むアンプリコンを形成することと、
（ｅ）検出試薬の核酸配列が検出標識部位にハイブリダイズする条件下で、アンプリコンを、標識及び検出標識部位に相補的である核酸配列を含む検出試薬と接触させることと、
（ｆ）支持体表面に結合した標識を検出することと、を含む。一態様では、検出プローブは、標的化プローブの３’末端に隣接する標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする５’末端を有する。
一態様では、この方法は、（ｂ）において形成された反応生成物を、標的オリゴヌクレオチドから反応生成物を解離する変性条件に曝露することを含む。
Ｌ．サンプル
本明細書に記載の方法又はキットは、１つ以上の標的分析物を含有するか、又は含有することが疑われるサンプル中の１つ以上の標的分析物を検出するのに適している。一態様では、標的分析物は、標的ヌクレオチド配列を含む。別の態様では、標的分析物は、標的タンパク質を含む。一態様では、サンプルは、１つ以上の原核生物又は真核生物の目的のＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含むか、又は含むことが疑われる。一態様では、サンプルは、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、家禽、ウマを含むがこれらに限定されないヒト若しくは他の哺乳動物などの生物、又は植物、細菌、真菌、原生生物、若しくはウイルスなどの他の生物から得られる生物学的サンプルである。一態様では、生物学的サンプルとしては、組織、細胞、細胞抽出物、若しくは生検などの物質、又は、尿、血液、唾液、羊水、感染若しくは炎症の領域からの滲出液、頬細胞を含有するうがい薬、脳脊髄液、若しくは滑液などの生体液が挙げられる。一態様では、サンプルは、個人から単離される。別の態様では、サンプルは、個体の群に由来する。一態様では、サンプルは、１つ以上、又は複数の個別のサンプル又はプールされたサンプルを含む。
一態様では、サンプルは、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｃＤＮＡ、全ゲノム増幅ＤＮＡ、又はそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを含むがこれらに限定されない１つ以上の標的ＤＮＡ配列を含む。別の態様では、サンプルは、リボソームＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、又はそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない一本鎖又は二本鎖ＲＮＡを含むがこれらに限定されない１つ以上の標的ＲＮＡ配列を含む。別の態様では、サンプルは、ＰＣＲ生成物、プラスミド、コスミド、ＤＮＡライブラリ、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、合成オリゴヌクレオチド、制限フラグメント、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、又はＤＮＡ／ＲＮＡモザイク核酸などのアンプリコンである１つ以上の標的ヌクレオチド配列を含むか、又は含むことが疑われる。二本鎖核酸の場合、標的ヌクレオチド配列はどちらの鎖にも存在することができる。一態様では、サンプルは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含まない。
一態様では、サンプルは、１つ以上の標的ヌクレオチド配列、例えば、治療用オリゴヌクレオチドを含み、サンプルはまた、オリゴヌクレオチド代謝産物を含み得る。本明細書で使用される「治療用オリゴヌクレオチド」は、生体分子と相互作用して治療効果を提供することができるオリゴヌクレオチドを指す。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。ＡＳＯは、典型的には約５、１０、１５、２０又は２５ヌクレオチド～約３０、３５、４０、４５又は５０ヌクレオチドの長さである一本鎖オリゴヌクレオチドである。ＡＳＯは、ＲＮＡプロセシングに影響を及ぼし、かつ／又はタンパク質発現を調節することができる。ＡＳＯは、一本鎖ＲＮＡに結合してＲＮＡを不活性化する一本鎖オリゴヌクレオチドである。一態様では、ＡＳＯは、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合し、それによって遺伝子を不活性化する。一態様では、遺伝子は、疾患遺伝子である。したがって、ＡＳＯは、疾患遺伝子のｍＲＮＡを不活性化して、特定の疾患の原因となるタンパク質の産生を防止又は改善することができる。一態様では、ＡＳＯは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの組み合わせを含む。
サンプル中のオリゴヌクレオチド、例えば、ＡＳＯなどの治療用オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼの存在、温度、ｐＨ、塩濃度などの様々な要因のために、例えば、経時的に分解することができる。特定の態様では、サンプル中の治療用オリゴヌクレオチドの分解は、治療用オリゴヌクレオチドに対する薬力学的応答を示す。本明細書では治療用オリゴヌクレオチド代謝産物とも呼ばれる、分解又は短縮された治療用オリゴヌクレオチドは、治療有効性を失う可能性がある。一態様では、サンプルは、治療用オリゴヌクレオチド及び１つ以上の治療用オリゴヌクレオチド代謝産物を含む。一態様では、治療用オリゴヌクレオチド代謝産物は、治療用オリゴヌクレオチドよりも、１ヌクレオチド以上、２ヌクレオチド以上、３ヌクレオチド以上、４ヌクレオチド以上、５ヌクレオチド以上、６ヌクレオチド以上、７ヌクレオチド以上、８ヌクレオチド以上、９ヌクレオチド以上、１０ヌクレオチド以上、１５ヌクレオチド以上、又は２０ヌクレオチド以上短い。一態様では、治療用オリゴヌクレオチド代謝産物は、治療用オリゴヌクレオチドよりも約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、又は約１０％短い。
一態様では、本明細書で提供される方法を使用して、治療用オリゴヌクレオチド代謝産物と比較したサンプル中の治療用オリゴヌクレオチドの量を測定する。一態様では、治療用オリゴヌクレオチドの薬物動態パラメータは、生物学的環境、例えば患者における治療用オリゴヌクレオチドの分解の速度及び／又は量を測定することによって決定される。したがって、一態様では、本明細書で提供される方法を使用して、治療用オリゴヌクレオチドの薬物動態パラメータを決定する。一態様では、測定される薬物動態パラメータは、クリアランス、体積分布、血漿濃度、半減期、ピーク時間、ピーク濃度、利用可能率、又はそれらの組み合わせである。薬物動態パラメータの測定及び解釈は、本明細書に更に記載されている。
一態様では、サンプルは、１つ以上の抗薬物抗体（ＡＤＡ）を含む。一態様では、ＡＤＡは、治療用タンパク質又は治療用抗体を含むがこれらに限定されない治療用ポリペプチドに結合する。一態様では、ＡＤＡは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、短鎖干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの合成ガイド鎖を含むがこれらに限定されない治療用オリゴヌクレオチドに結合する。一態様では、ＡＤＡは、バイオ医薬製品に結合することができる。一態様では、ＡＤＡは、治療用製品の機能的活性を阻害することができる。
一態様では、サンプルは、１つ以上の増幅されていない標的ヌクレオチド配列を含む。別の態様では、サンプルは、生物学的サンプルからの配列の増幅又はクローニングによって得られた１つ以上の標的ヌクレオチド配列を含む。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）逆転写それに続くポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、又はローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含むがこれに限定されない方法によって達成することができる。
一態様では、サンプルは、１つ以上の標的タンパク質を含むか、又は含むことが疑われる。一態様では、標的タンパク質は、例えば、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡに結合することができるＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質を含む、ＤＮＡ結合タンパク質を含む。ＤＮＡ結合タンパク質の例としては、転写因子、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、及びヒストンが挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、ＤＮＡ結合タンパク質は、特定のＤＮＡ配列、例えば、転写因子に結合する。
一態様では、１つ以上の標的分析物は、生物学的サンプルから精製される。サンプルから標的分析物を精製するための方法が知られている。生物学的サンプルからヌクレオチド配列を精製するための方法は知られており、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）又は陰イオン交換高圧液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ ＨＰＬＣ）又はポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）が含まれる。生物学的サンプルからタンパク質を精製するための方法は知られており、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び電気泳動などのクロマトグラフィーが含まれる。
一態様では、サンプルは、少なくとも約１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、若しくは１０μｇ、及び最大約２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、若しくは５０μｇ、又は、約１μｇ～約５０μｇ、又は約５μｇ～約２０μｇの１つ以上の標的分析物、例えば、細胞株から精製されたゲノムＤＮＡ又は全ゲノム増幅されたＤＮＡを含む。一態様では、サンプルは、少なくとも約０．１μＬ、０．５μＬ、１μＬ、２μＬ、３μＬ、４μＬ、５μＬ、及び最大約６μＬ、７μＬ、８μＬ、９μＬ、１０μＬ、１５μＬ、２０μＬ若しくは２５μＬ、又は約１μＬ～約２５μＬ、又は約０．１μＬ～約５μＬの１つ以上の標的分析物を含有するサンプル、例えば、１つ以上の増幅生成物、例えば、細胞株ＤＮＡから生成されたＰＣＲアンプリコンを含有するサンプルを含む。一態様では、サンプルは、少なくとも約１ｎｇ／μＬ、５ｎｇ／μＬ又は１０ｎｇ／μＬ、及び最大約２５ｎｇ／μＬ、５０ｎｇ／μＬ又は１００ｎｇ／μＬの分析物濃度を有する。
一態様では、サンプルは、標的分析物の少なくとも１つのコピーを含む。一態様では、サンプルは、１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２又は１０１未満のコピー数の標的核酸を含む。一態様では、これらのコピーは、約０．００１ｍＬ～約１ｍＬのサンプル、又は約１ｍＬ、０．１ｍＬ、０．０１ｍＬ、若しくは０．００１ｍＬ未満のサンプル中に存在する。
Ｍ．サンプル増幅
本明細書に記載の方法又はキットは、１つ以上の標的ヌクレオチド配列が増幅されていないサンプルに関連して使用することができるが、サンプル中の標的ヌクレオチドの量を増加させるための増幅ステップを含むことが望ましい場合がある。例えば、標的ヌクレオチド配列が１つ以上のまれな変異、例えば、がんに関連する１つ以上のまれな又は低アレル画分変異を含む場合、標的ヌクレオチド配列を増幅することが望ましい場合がある。
一態様では、固定化された検出複合体は、増幅試薬と接触させられ、検出複合体及び増幅試薬はそれぞれ、結合対のメンバーを含む。いくつかの態様では、結合対は、受容体－リガンド対、抗原－抗体対、ハプテン－抗体対、エピトープ－抗体対、ミモトープ－抗体対、アプタマー－標的分子対、又はインターカレーター－標的分子対を含む。いくつかの態様では、結合対は、ビオチン／ストレプトアビジン又はビオチン／アビジンである。
一態様では、増幅試薬は、検出配列を含む。一態様では、検出配列は、増幅テンプレートの核酸配列に相補的である核酸配列を含む。一態様では、検出配列は、アンカー配列及びオリゴヌクレオチドタグを含むアンカー試薬に相補的である核酸配列を含む。
一態様では、検出配列は、１つ以上の検出可能な標識又は検出標識部位を含む伸長配列又はアンプリコンを形成するように伸長される。一態様では、標識は、検出可能な標識を付着させるのに好適な結合パートナーを含む。一態様では、標識は、ビオチンを含み、ストレプトアビジンを含む検出可能な標識に結合することができる。
一態様では、標的ヌクレオチド配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。ＰＣＲ増幅の方法が知られている。例えば、ＳａｉｋｉらによるＰｒｉｍｅｒ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ａ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７－４９１を参照されたい。簡単に言えば、ＰＣＲ増幅では、標的ヌクレオチド配列は、増幅される特定のヌクレオチド配列に隣接する２つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させられる。熱変性、プライマーの相補的配列へのアニール、及びアニールされたプライマーのＤＮＡポリメラーゼによる伸長の繰り返しサイクルにより、約２ｎの標的フラグメントが指数関数的に蓄積され、ｎはサイクル数である。
別の態様では、標的ヌクレオチド配列は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、すなわち、ポリメラーゼが環状テンプレートにアニールされたプライマーに単一ヌクレオチドを連続的に付加する等温核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）増幅技術を使用して増幅され、環状テンプレートに相補的である複数の、例えば数十～数百のタンデムリピートを含有する長い一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ配列をもたらす。
別の態様では、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）を使用して、ゲノムＤＮＡサンプルを増幅する。全ゲノム増幅の方法は知られており、例えば、多重置換増幅（ＭＤＡ）、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲ（ＤＯＰ－ＰＣＲ）及びプライマー伸長前増幅（ＰＥＰ）が含まれる。ＤＯＰ－ＰＣＲ及びＰＥＰは標準的なＰＣＲ技術に基づいているが、ＭＤＡは等温反応セットアップを使用する。
いくつかの態様では、増幅は、ＤＮＡ又はＲＮＡ合成を開始するためにポリメラーゼによって使用される１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの使用を含む。プライマーは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエート結合含有ＤＮＡ、又はそれらの組み合わせであり得、ヌクレオチド類似体又は修飾ヌクレオチドを含む。一般に、プライマーは、約１０～約１００、若しくは約１５～約３０、又は少なくとも約１０、１５若しくは２０～最大約２５、３０、３５、４０、４５若しくは５０ヌクレオチドの長さの一本鎖オリゴヌクレオチドである。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドプライマーは、増幅されるテンプレートの領域がプライマーによって定義されるように、標的ヌクレオチド配列の特定の領域に相補的である特定のプライマーである。オリゴヌクレオチドプライマーを調製するための方法が知られている。一態様では、市販の増幅プライマーを使用することができる。一態様では、プライマーは、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％純粋である。
一態様では、サンプルは、ＰＣＲ生成物を含む。一態様では、ＰＣＲ生成物は、約２５ｂｐ～約５００ｂｐ、又は約５０ｂｐ～約３００ｂｐ、又は約７５ｂｐ～約２００ｂｐの長さである。一態様では、ＰＣＲプライマーは、多重ＰＣＲアッセイで使用される他のプライマーと同様の（すなわち、約５℃又は１℃以内の）融解温度を有する。
Ｎ．検出
一態様では、標的分析物は、アレイ内で検出、同定、又は定量化される。一態様では、例えば、ＰＣＲ反応生成物、ＯＬＡ反応生成物、ＰＥＡ反応生成物、サンドイッチ錯体、又は本明細書に記載のＮＰＡ反応生成物を含む反応生成物は、アレイで検出、同定又は定量化することができる。一態様では、アレイは多重アレイであり、標的分析物は、アレイ上の固定化された標的分子に付着した標識の検出によって検出、同定、又は定量化される。一態様では、支持体表面は、タグされた反応生成物を含むハイブリダイゼーション混合物と接触され、反応生成物は、一本鎖オリゴヌクレオチドタグとその対応する相補的捕捉オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって支持体表面に固定化され、検出複合体を形成する。一態様では、反応生成物は、固体支持体が反応生成物と接触させられる前に増幅される。一態様では、反応生成物は、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、又は５０倍に増幅される。
一態様では、ハイブリダイゼーション混合物は、ハイブリダイゼーション緩衝液を含む。一態様では、反応生成物の存在又は量は、反応生成物に付着した標識に基づいて検出、同定、又は定量化することができる。一態様では、支持体表面は、反応生成物がその上に固定化された後、洗浄緩衝液で洗浄される。
一態様では、１つ以上の標的ヌクレオチド配列の存在は、支持体表面に固定化された反応生成物の検出に基づいて、検出、同定、又は定量化される。一態様では、固定化された反応生成物の存在は、蛍光、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、蛍光偏光（ＦＰ）、発光、化学発光、生物発光、蛍光、光散乱又は電極誘起発光を含むがこれらに限定されない反応生成物上の標識からの発光を監視することによって検出される。別の態様では、標識は、光散乱、吸光度、蛍光などの測定可能なシグナルをもたらす化学活性を有する酵素又は他の化学反応種を含む。酵素標識の例としては、ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼが挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、標識は、ビオチン、フルオレセイン、又はジゴキシゲニンを含むがこれらに限定されない、検出可能なハプテンである。一態様では、反応生成物は、ビオチン標識を含む。
一態様では、反応生成物は、支持体表面に位置付けられる１つ以上の結合ドメインに固定化される。一態様では、１つ以上の結合ドメインが１つ以上の電極上に位置付けられ、検出、同定又は定量化には、電圧波形を１つ以上の電極に印加して、捕捉された反応生成物の標識を刺激して電気化学的又は発光シグナルを生成することが含まれる。一態様では、検出、同定、又は定量化には、電気化学発光シグナルを測定し、シグナルをサンプル中の標的ヌクレオチド配列の存在又は量と相関させることが含まれる。一態様では、放出される光の強度は、放出される光がサンプル中の標的ヌクレオチドの量の定量的決定を提供できるように、サンプル中の標的の量に比例する。
一態様では、支持体表面は、反応生成物がその上に固定化された後、検出混合物と接触させられる。一態様では、検出混合物は、電気化学発光標識を含む。電気化学発光標識の例には、ｉ）金属が、例えば、トリス－ビピリジル－ルテニウム（ＲｕＢｐｙ）部分などのＲｕ含有及びＯｓ含有有機金属化合物を含む、第ＶＩＩＩ族の貴金属に由来する有機金属化合物、並びにｉｉ）ルミノール及び関連化合物が含まれる。一態様では、検出混合物はまた、１つ以上の電気化学発光共反応物、及びｐＨ緩衝剤、界面活性剤、防泡剤、消泡剤、塩、金属イオン又は金属キレート剤などの１つ以上の追加の成分を含む。「電気化学発光共反応物」という用語は、電気化学発光標識に関与する種を指し、トリプロピルアミン（ＴＰＡ）、シュウ酸塩イオン、アスコルビン酸及びＲｕＢｐｙ用の過硫酸塩及びルミノール用の過酸化水素などの三級アミンを含むがこれらに限定されない。電気化学発光を測定するための方法は知られており、測定を行うための機器は市販されている。例えば、電気化学発光を使用した分析物の多重測定は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＬＬＣ、ＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ（登録商標）及びＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒライン又は製品で使用される（例えば、米国特許第７，８４２，２４６号及び同第６，９７７，７２２号を参照し、それらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
一態様では、ビオチンは反応生成物に共有結合的に付着し、検出混合物は、アビジン部分を介して固定化された反応生成物に結合するストレプトアビジンコンジュゲート標識を含む。一態様では、ストレプトアビジンコンジュゲート標識は、電気化学発光（ＥＣＬ）標識である。一態様では、電気化学発光標識は、Ｓｕｌｆｏ－ＴＡＧ ＮＨＳ－エステル（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）などのｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
一態様では、キット又は方法を使用して、１つ以上の標的ヌクレオチド配列における１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を検出、同定又は定量化する。一態様では、目的のＳＮＰの存在は、サンプル中の野生型アレルと多様型アレルとの間の比率を決定することによって検出される。一態様では、比率は、サンプル中に存在する野生型及び多様型アレルの検出可能な標識の比率を決定することによって決定される。一態様では、野生型及び多様型アレルの電気化学発光標識の比率が決定される。以下の式を使用して、サンプル中に存在する野生型又は多様型アレルの比率を決定できる。
ＥＣＬ比率ＷＴ＝（ＳｉｇｎａｌＷＴ－）／（ＳｉｇｎａｌＷＴ－Ｂｋｇ＋ＳｉｇｎａｌＭＵＴ－Ｂｋｇ）
ＥＣＬ比率ＭＵＴ＝（ＳｉｇｎａｌＭＵＴ－Ｂｋｇ）／（ＳｉｇｎａｌＷＴ－Ｂｋｇ＋ＳｉｇｎａｌＭＵＴ－Ｂｋｇ）
式中、ＳｉｇｎａｌＷＴは野生型アレルで検出されたＥＣＬシグナル、ＳｉｇｎａｌＭＵＴは多様型アレルで検出されたシグナル、Ｂｋｇはバックグラウンドシグナルである。一態様では、バックグラウンドシグナルは、結合ドメイン間で異なる場合があるため、バックグラウンドシグナルは、野生型又は多様型アレルに対応する結合ドメインに特異的である。一態様では、バックグラウンド値は、「リガーゼ対照なし」サンプルの２つのウェルにおける複製スポットの平均値である。
この比率は、サンプル中に存在する野生型及び多様型配列の割合を推定する。一態様では、サンプルの可能性は、ホモ接合性の野生型、ヘテロ接合性、又はホモ接合性の多様体である。一態様では、ホモ接合性の野生型又は多様型の比率は約０．８より大きく、ヘテロ接合体は約０．３～約０．７であり、多様体（又は野生型）の不在は約０．２未満でなければならない。ホモ接合アレルの比率は、シグナルの変動性のために１．０より大きくなる可能性がある。同様に、アレルがない場合、バックグラウンド減算により、比率がゼロ未満になる可能性がある。
一態様では、キット又は方法を使用して、がん変異の１つ以上のまれな又は低アレル画分を検出する。一態様では、サンプルに存在するまれな又は低アレル画分の変異の頻度は、以下の式を使用して、ＥＣＬシグナルから検量線を生成することによって決定される。
ＥＣＬ比率ＭＵＴ＝（ＳｉｇｎａｌＭＵＴ）／（ＳｉｇｎａｌＷＴ＋ＳｉｇｎａｌＭＵＴ）。
全てのシグナルが検量線と比較され、バックグラウンドが適合度で考慮されるため、検量線の作成にバックグラウンド減算は必須ではない。検量線は、特定のアレルに対して検出可能な最低パーセント多様型アレルを確立し、サンプルデータをカーブにフィッティングすることで、各サンプルに存在するパーセント多様体の決定が可能になる。
一態様では、アッセイは、１ウェル当たり約１×１０５～１０×１０５、又は約１０×１０５、９×１０５、８×１０５、７×１０５、６×１０５、５×１０５、４×１０５、３×１０５、２×１０５、若しくは１×１０５未満の分子の検出限界（ＬＯＤ）を有する。一態様では、ＯＬＡベースのアッセイのＬＯＤは、１ウェル当たり約１×１０５～５×１０５、又は約２×１０５分子である。一態様では、ＰＥＡベースアッセイのＬＯＤは、１ウェル当たり約４×１０５～６×１０５、又は約５×１０５の分子である。
Ｏ．使用方法
本明細書に記載されているのは、サンプル中の１つ以上の標的分析物を同定、検出、又は定量化するための方法及びキットである。一態様では、標的分析物は、ヌクレオチド配列である。別の態様では、標的分析物は、タンパク質である。一態様では、標的分析物は、野生型ヌクレオチド又はペプチド配列を含有するか、又は含有することが疑われる。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、欠失、付加、置換、転位、転換、再配列、又は転座などの変異を含有するか、又は含有することが疑われる。一態様では、変異には、ミスセンス、ナンセンス、サイレント、又はスプライス部位の変異が含まれる。
一態様では、方法又はキットを使用して、サンプル中の１つ以上のヌクレオチド配列を検出、同定、又は定量化する。一態様では、方法又はキットを使用して、サンプル中の１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）、コピー数多様体（ＣＮＶ）、又は他の配列多様体若しくは変異を検出、同定、又は定量化する。
一態様では、方法又はキットを使用して、例えば、複数のゲノム若しくは種、複数の個体、又は組織若しくは細胞の混合物に由来する腫瘍サンプルなどの生物学的サンプルからの核酸の混合物を含有するサンプル中の１つ以上の標的ヌクレオチド配列を同定、検出又は定量化する。一態様では、方法又はキットを使用して、サンプル中に存在し得る１つ以上のヌクレオチド配列を検出する。一態様では、方法又はキットを使用して、少なくとも約５０％又は最大約１００％の頻度で存在する一塩基多様体を検出する。一態様では、多様体は存在しない。別の態様では、方法又はキットを使用して、サンプル中に存在するヌクレオチド配列の約１％を超えて存在する１つ以上の一塩基多型を検出する。一態様では、方法又はキットを使用して、サンプル中に存在するヌクレオチド配列の約５％又は１０％未満に存在する一塩基多型を検出する。一態様では、この方法又はキットを使用して、標的領域に変異を有するヌクレオチド配列及び野生型核酸配列の不均一な混合物を含有する生物学的サンプル中の核酸変異を同定、検出又は定量化することができ、変異は、標的ヌクレオチド配列の約１％～約５％に存在する可能性がある。一態様では、方法又はキットを使用して、例えば、前立腺がん、乳がん、結腸がん、膵臓がん、又は子宮頸がんなどのがんを示す単一ヌクレオチドのがん関連変異を含む、生物学的サンプル又は組織生検におけるがん性又は前がん性組織の存在を示す標的ヌクレオチドにおける１つ以上の変異を分析する。一態様では、方法又はキットを使用して、サンプル中のヌクレオチド配列の約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％又は０．０５％未満に存在する変異を検出する。一態様では、方法又はキットを使用して、血液サンプル、細胞外液、細胞外小胞、又はリキッドバイオプシーに存在する１つ以上の標的ヌクレオチド配列を検出する。一態様では、方法又はキットを使用して、正常細胞のバックグラウンドにおける循環腫瘍細胞の変異、又は血液中の腫瘍由来の無細胞ＤＮＡの検出を含むがこれらに限定されない、腫瘍学において目的の１つ以上の変異を検出する。一態様では、この方法又はキットは、薬剤開発に重要な１つ以上の変異を同定、検出、又は定量化するために使用される。
一態様では、方法又はキットを使用して、サンプル中のＲＮＡを検出、同定、又は定量化する。一態様では、方法又はキットを使用して、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）及び球状核酸（ＳＮＡ）を含む、サンプル中の非コードＲＮＡを検出、同定又は定量化する。一態様では、この方法又はキットは、ジェノタイピングアッセイに使用される。ジェノタイピング法は知られており、一般に、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用するプローブハイブリダイゼーション、プローブライゲーション、及びシグナル増幅のステップ、増幅生成物の支持体表面への固定化、及び標的分析物の検出を含む。一態様では、この方法又はキットは、ヒトジェノタイピングアッセイに使用される。別の態様では、この方法又はキットは、植物ジェノタイピングアッセイ、例えば、農業ゲノムアッセイに使用される。一態様では、方法又はキットを使用して、例えば、遺伝子発現分析又はトランスクリプトーム分析において、転写活性（コーディング及び非コーディング）を特徴付ける。
一態様では、方法又はキットは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）発現の多重分析に使用することができる。ｍｉＲＮＡは、例えば、細胞の分化及び増殖、発生のタイミング、造血、免疫応答、アポトーシス、並びに神経系のパターン形成などの基本的な細胞プロセスを調節する小さな非コードＲＮＡ（約２０～２２ヌクレオチドの長さ）である。ヒトゲノムは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする約２０００個の遺伝子を含む。（Ｋａｗａｈａｒａ（２０１４）Ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ａｎｄ ｓｏｍａｔｉｃ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ａｎｄ ｍｃｉｒｏ－ＲＮＡ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ．Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ａｎｏｍａｌｉｅｓ．５４：１２－２１）。ｍｉＲＮＡレベル、発現のタイミング、位置、又は標的認識の変化は壊滅的な結果をもたらす可能性があり、ｍｉＲＮＡの発現プロファイリングは、様々な生物学的プロセスに関する貴重な情報を提供する可能性がある。一次、前駆体、及び成熟ｍｉＲＮＡレベルの分析、並びにｍｉＲＮＡ標的の特定及び特性評価は、特定の変異体又は疾患におけるｍｉＲＮＡの生合成又は機能のステップを決定するために重要である。（Ｖａｎ Ｗｙｎｓｂｅｒｇｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０６：２１９－２５２を参照されたい）。ｍｉＲＮＡ（ｉｓｏｍｉＲ）の配列長の変動により、標的化能力又は特異性が変化する可能性がある。（Ｃａｍｍａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｇｅｎｅｓ：ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．６：１８６）。
発生異常及びがんを含む様々なヒトの疾患は、ｍｉＲＮＡ遺伝子内、若しくはｍｉＲＮＡプロセシング機構をコードするｍｉＲＮＡ関連遺伝子内、又は標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲのｍｉＲＮＡ結合部位内の生殖細胞変異又は体細胞変異によって引き起こされる。ＤＧＣＲ８（ＤｉＧｅｏｒｇｅ症候群）、ＤＩＣＥＲ１（胸膜肺芽細胞腫、嚢胞性腎腫、卵巣セルトリ－ライディッヒ型腫瘍、松果体芽細胞腫、非上皮性卵巣腫瘍）、ＴＡＲＢＰ２（結腸腫瘍、胃腫瘍）、ＸＰＯ５（結腸腫瘍、胃腫瘍、子宮内膜腫瘍）、ｍＲ－１４及びｍｉＲ－１４６（５ｑ－症候群）、ｍｉ－Ｒ－１７、ｍｉＲ－１８ａ、ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－１９ｂ、ｍｉＲ－２０ａ及びｍｉＲ－９２ａ（Ｆｅｉｎｇｏｌｄ症候群２）、ｍｉＲ１５ａ及びｍｉＲ－１６－１（慢性リンパ性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、前立腺腫瘍）、ｍｉＲ－１６－１（慢性リンパ性白血病）、ｍｉＲ－９６（重度の難聴）、ｍｉＲ－８４（ＥＤＩＣＴ症候群）、ＳＬＩＴＲＫ１（トゥレット症候群）、ＩＲＧＭ（クローン病）並びにＨＤＡＣ６（Ｘ連鎖優性軟骨異形成症）を含むがこれらに限定されないヒト疾患に関連するｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ関連の遺伝子。（Ｋａｗａｈａｒａ，Ｙ．（２０１４）Ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ａｎｄ ｓｏｍａｔｉｃ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ａｎｄ ｍｃｉｒｏ－ＲＮＡ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ．Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ａｎｏｍａｌｉｅｓ．５４：１２－２１。）
一態様では、方法又はキットを使用して、サンプル中の１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ配列を同定、検出、又は定量化する。一態様では、方法又はキットを使用して、一塩基ヌクレオチドの違いを有するマイクロＲＮＡを同定、検出、又は定量化する。一態様では、この方法は、固定化された捕捉オリゴヌクレオチド配列に相補的なタグ配列及びｍｉＲＮＡ配列に相補的な配列を含む１つ以上の標識プローブの使用を含む。一態様では、標識は、ビオチン標識を含む。別の態様では、標識は、化学発光標識を含む。一態様では、この方法は、タグ配列の捕捉オリゴヌクレオチド配列への結合に適した条件下で、１つ以上の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを有する支持体表面を、固定化された捕捉オリゴヌクレオチド配列に相補的であるタグ配列及び標的ｍｉＲＮＡ配列に相補的である配列を含む１つ以上のプローブと接触させることを含む。次いで、支持体表面を洗浄して過剰なプローブを除去し、次いで、ｍｉＲＮＡ配列が固定化プローブ配列にハイブリダイズすることができる条件下で、１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ配列を含むか、又は含むことが疑われるサンプルと接触させられる。
一態様では、方法又はキットを使用して、がん、アルツハイマー病、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、サラセミア、又はハンチントン病を含むがこれらに限定されない、障害又は疾患に関連する１つ以上のヌクレオチド配列又は多様体を同定、検出、又は定量化する。一態様では、方法又はキットを使用して、シトクロムｐ４５０などの多型遺伝子の１つ以上の多型を検出することができる。
多くの疾患が、肝レンズ核変性症（ＡＰＰ７Ｂ）、肥満（ＭＣ４Ｒ）、真性糖尿病、２型（ＩＲＳ１）、嚢胞性線維症（ＣＴＦＲ）、レット症候群（ＭＥＣＰ２）、アルツハイマー病（ＡＰＰ）、クロイツフェルト・ヤコブ症候群（ＰＲＮＰ）、家族性地中海熱（ＭＥＦＶ）、胃腸間質腫瘍（ＫＩＴ）、褐色細胞腫（ＲＥＴ）、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、尿崩症、神経原性（ＡＶＰ）、脆弱Ｘ症候群（ＦＭＲ１）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ欠損症（ＯＴＣ）、ブルガダ症候群（ＳＣＮ５Ａ）、マルファン症候群（ＦＢＮ１）、真性多血症（ＪＡＫ２）、多嚢胞性腎臓、常染色体劣性（ＰＫＨＤ１）、悪性高熱症（ＲＹＲ１）、及びカナバン病（ＡＳＰＡ）を含むがこれらに限定されない遺伝的多様性に関連していることが知られている。Ｐｉｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＤｉｓＧｅＮＥＴ：ａ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｙｎａｍｉｃａｌ ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｇｅｎｅｓ．Ｄａｔａｂａｓｅ：ｄｏｉ：１０．１０９３／ｄａｔａｂａｓｅ／ｂａｖ０２８。
一態様では、例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＰＲＮＰ）、デング熱ショック症候群（ＭＩＣＢ）、Ｂ型肝炎（ＨＬＡ－ＤＰＡ１及びＨＬＡ－ＤＰＢ１）、Ｃ型肝炎（ＩＬ２８Ｂ）、ＨＩＶ－１及びＡＩＤＳ（ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＣＰ５、ＭＩＣＡ、ＰＳＯＲＳ１Ｃ３、ＺＮＲＤ１、ＲＮＦ３９、ＰＡＲＤ３Ｂ及びＣＸＣＲ６）、ハンセン病（ＬＡＣＣ１、ＮＯＤ２、ＲＩＰＫ２、ＣＣＤＣ１２２及びＴＮＦＳＦ１５）、髄膜炎菌性疾患（ＣＦＨ）、マラリア（ＨＢＢ）、並びに結核（ＧＡＴＡ６、ＴＡＧＥ１、ＲＢＢＰ８及びＣＡＢＬＥＳ１）を含む感染症表現型に関連する１つ以上のＳＮＰを検出、同定又は定量化するための方法又はキットが提供される。Ｆａｒｅｅｄ ａｎｄ Ａｆｚａｌ（２０１２）Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｅｇｙｐｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ．１４：１２３－１３４。
一態様では、例えば、自己免疫疾患、心血管状態、糖尿病、胃腸障害、脂質代謝障害、及び神経精神状態を含む、疾患に関連する１つ以上のＳＮＰを検出、同定又は定量化するための方法又はキットが提供される。自己免疫疾患に関連するＳＮＰは知られており、例えば、関節リウマチに関連するＳＮＰ（ＳＰＲＥＤ２、ＡＮＫＲＤ５５、ＩＬ６ＳＴ、ＰＸＫ、ＲＢＰＪ、ＣＣＲ６、ＩＲＦ５、ＴＲＡＦ１－Ｃ５、ＮＴＡＦＩＰ３付近の染色体６ｑ２３．３及びＯＬＩＧ３）、及び全身性エリテマトーデス（ＢＡＮＫ１）が含まれる。心血管状態に関連するＳＮＰは知られており、例えば、心房細動／心房粗動に関連するＳＮＰ（ＰＩＴＸ２付近の染色体４ｑ２５）、冠状動脈疾患（ＣＤＫＮ２Ａ／Ｂ及びＭＴＨＦＤ１Ｌ）、冠状動脈性心疾患（ＤＡＢ２ＩＰ）及び心筋疾患（ＣＤＫＮ２Ａ／Ｂ）が含まれる。糖尿病に関連するＳＮＰは知られており、例えば、１型糖尿病に関連するＳＮＰ（ＦＵＴ２、Ｃ１２ｏｒｆ３０、ＥＲＢＢ３、ＫＩＡＡ０３５０、ＰＴＰＮ２、ＣＤ２２６、ＴＲＡＦＤ１及びＰＴＰＮ１１）、及び２型糖尿病（ＫＣＮＱ１、ＳＬＣ３０Ａ８、ＦＴＯ、ＨＨＥＸ、ＣＤＫＡＬ１、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＩＧＦＢＰ２、ＣＤＫＮ２Ａ／Ｂ及びＩＧＦ２ＢＰ２）が含まれる。胃腸障害に関連するＳＮＰは知られており、例えば、セリアック病に関連するＳＮＰ（ＫＩＡ１１０９、ＴＥＮＲ、ＩＬ２及びＩＬ２１）、クローン病（ＰＴＰＮ２、ＩＲＧＭ、ＮＫＸ２－３、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＢＳＮ、ＭＳＴ１及びＩＲＧＭ）、胆石（ＡＢＣＧ８及びＳＨ２Ｂ３／ＬＮＫ）、及び炎症性腸疾患（ＩＬ２３Ｒ）が含まれる。脂質代謝障害に関連するＳＮＰには、例えば、ＨＤＬコレステロールに関連するＳＮＰ（ＧＡＬＮＴ２及びＭＶＫ／ＭＭＡＢ）、ＬＤＬｌ－コレステロール（ＣＥＬＳＲ２、ＰＳＲＣ１、ＳＯＲＴ１、ＣＩＬＰ２及びＰＢＸ４）、トリグリセリド（ＢＣＬ７Ｂ、ＴＢＬ２、ＭＬＸＩＰＬ、ＣＩＬＰ２、ＰＢＸ４、ＴＲＩＢ１、ＧＡＬＮＴ２、ＡＮＧＰＴＬ３、ＤＯＣＫ７、ＡＴＧ４Ｃ、ＧＣＫＲ、ＴＲＩＢ１、ＮＣＡＮ／ＣＩＬＰ２及びＭＬＸＩＰＬ）が含まれる。神経精神状態に関連するＳＮＰは知られており、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＤＰＰ６）に関連するＳＮＰ、遅発性アルツハイマー病（ＧＡＢ２）を有するＡＰＯＥ ｅ４、双極性障害（ＤＧＫＨ、ＰＡＬＢ２、ＮＤＵＦＡＢ１及びＤＣＴＮ５）、多発性硬化症（ＫＩＡＡ ０３５０、ＩＬ２ＲＡ及びＩＬ７ＲＡ）、レストレスレッグス症候群（ＢＴＢＤ９、ＭＥＩＳ１、ＢＴＢＤ９、ＭＡＰ２Ｋ５及びＬＢＸＣＯＲ１）、及び統合失調症（ＣＳＦ２ＲＡ）が含まれる。Ｆａｒｅｅｄ ａｎｄ Ａｆｚａｌ（２０１２）Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｅｇｙｐｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ．１４：１２３－１３４。
一態様では、方法又はキットを使用して、がんに関連する１つ以上のヌクレオチド配列又は多様体を同定、検出、又は定量化する。一態様では、核酸配列は、野生型配列である。一態様では、核酸配列は、変異体又は多様型配列である。一態様では、ヌクレオチド配列の変異は、がんに関連している。一態様では、方法又はキットを使用して、ＢＲＡＦ又はＫＲＡＳなどの１つ以上のがん遺伝子又はがん原遺伝子、あるいはＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＴＥＮ、ＣＴＦＲ、ＴＰ５３などの１つ以上の腫瘍抑制遺伝子、並びにそれらの組み合わせの野生型、変異体、又は多様体の核酸配列の有無を同定、検出、又は定量化する。（例えば、Ｃｏｎｃｅｒｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１７）Ｔｈｅ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｅｓｔｉｎｇを参照されたい）。
一態様では、方法又はキットを使用して、医学的に関連するがんのＤＮＡ又はＲＮＡベースのマーカーを検出する。別の態様では、方法又はキットを使用して、効果的ながん治療の選択を支援するために薬を個別化する。一態様では、方法又はキットを使用して、遺伝性がんのリスクのある人を同定する。遺伝性がんとは、がんを発症する人のリスクを大幅に高める一群の遺伝的欠陥を指し、例えば、Ｌｉ－Ｆｒａｕｍｅｎｉ症候群（ｐ５３）、家族性腺腫様ポリープ病（ＡＰＣ）、乳がん（ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＴＰ５３、ＣＨＥＫ２、ＡＴＭ、ＮＢＳ／ＮＢＮ、ＢＬＭ、ＰＴＥＮ、ＭＲＥ１１、ＢＲＩＰ１、ＢＡＲＤ１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄ、ＲＥＣＱＬ、ＦＡＮＣＣ、及びＦＡＮＣＭ）、及び遺伝非ポリープ性結腸直腸がん（ＨＮＰＣＣ）症候群、（ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２、ＥＰＣＡＭ、ＡＰＣ、ＭＵＴＹＨ、ＮＴＨＬ１、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＤ１、ＳＭＡＤ４、ＢＭＰＲ１Ａ、及びＳＴＫ１１）を含む特定の遺伝子の生殖細胞変異を同定することで診断することができる。Ｓｏｋｏｌｅｎｋｏ ａｎｄ Ｉｍｙａｎｉｔｏｖ（２０１８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．Ｆｒｏｎｔ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏ．５（７６）：１－１５。
がんの追加のＳＮＰマーカーは知られており、例えば、乳がん（ＦＧＦＲ２、ＴＮＣＲ９／ＬＯＣ６４３７１４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＬＳＰ１及びＥＲＢＢ４）、基底細胞がん（ＲＨＯＵ、ＰＡＤＩ４、ＰＡＤＩ６、ＲＣＣ２、ＡＲＨＧＥＦ１０Ｌ、ＫＲＴ５、ＣＤＫＮ２Ａ／Ｂ、ＴＣＦ２、ＩＧＦ２、ＩＧＦ２Ａ、ＩＮＳ及びＴＨ）、結腸直腸がん（ＯＲＦ、ＤＱ５１５８９７及びＳＭＡＤ７）、肺がん（ＣＨＲＮＡ３、ＣＨＲＮＡ５、ＣＨＲＮＢ４、ＰＳＭＡ４、ＬＯＣＩ２３６８８及びＴＲＮＡＡ－ＵＧＣ）、黒色腫（ＣＤＣ９１Ｌ１）、神経芽腫（ＦＬＪ２２５３６、ＦＬＪ４４１８０及びＢＡＲＤ１）、及び甲状腺がん（ＦＯＸＥ１及びＮＫＸ２－１）のマーカーが含まれる。Ｆａｒｅｅｄ ａｎｄ Ａｆｚａｌ（２０１２）Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｅｇｙｐｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ．１４：１２３－１３４。
一態様では、例えば、自閉症、知的障害及びてんかんなどの神経発達障害、先天性心臓欠陥及び他の先天性異常を含む、ヒトの疾患に関連する１つ以上のコピー数多様体（ＣＮＶ）又は異数性を検出、同定又は定量化するための方法又はキットが提供される。一態様では、ＣＮＶは、欠失を含む。別の態様では、ＣＮＶは、重複を含む。ＣＮＶの欠失に関連する障害の例としては、頭のサイズに影響を与える障害、精神障害及び代謝（ＫＣＴＤ１３及びＰＲＲＴ２）、睡眠調節及び代謝（ＲＡＩ１）、顔の外観（ＥＬＮ）、心臓異常、乳児高カルシウム血症、成長又は発達遅延（ＬＩＭＫ－１）、異形性特徴、発達遅延、心臓欠陥（ＧＡＴＡ４）、知的障害、てんかん、発作、顔と指の異形性（ＣＨＲＮＡ７）、知的障害、特徴的な顔の特徴、てんかん、心臓欠陥、泌尿生殖器の異常（ＫＡＮＳＬ１）、及び異形の顔の特徴、ベロカーディオ－顔面症候群、先天性心臓病、学習障害、聴力損失（ＴＢＸ１）が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＮＶの重複に関連する障害の例としては、頭のサイズに影響を与える障害、精神障害及び代謝（ＫＣＴＤ１３及びＰＲＲＴ２）、睡眠調節及び代謝（ＲＡＩ１）、顔の外観（ＥＬＮ）、異形性の特徴、発達遅延、心臓障害（ＧＡＴＡ４）、言語及び言語の遅延、自閉症、てんかん（ＬＩＭＫ－１）、知的障害、自閉症、再発性耳感染症、耳介低位、肥満（ＣＨＲＮＡ７）、発達遅延、小頭症、顔面異形症、異常な指及び多毛症、成長障害（ｆａｉｌｕｒｅ ｔｏ ｔｈｒｉｖｅ）（ＫＡＮＳＬ１）、及び異形の顔の特徴、鼻咽腔の機能不全、先天性心臓病、知的障害、発話の遅れ、難聴及び成長障害（ＴＢＸ１）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｇｏｌｚｉｏ ａｎｄ Ｋａｔｓａｎｉｓ（２０１３）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ＣＮＶｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．２３（３）：２４０－２４８。ＣＮＶに関連して頻繁に観察される障害としては、Ｗｉｌｌａｉｍｓ（ＥＬＮ、欠失表現型）、Ｐｒａｄｅｒ－Ｗｉｌｌｉ又はＡｎｇｅｌｍａｎ（ＵＢＥ３Ａ、欠失表現型）、Ｓｍｉｔｈ－Ｍａｇｅｎｉｓ（ＲＡＩ１、欠失表現型）、Ｐｏｔｏｃｋｉ－Ｌｕｐｓｋｉ（ＲＡＩ１、重複表現型）、Ｋｏｏｌｅｎ－ｄｅ Ｖｒｉｅｓ（ＭＡＰＴ、ＫＡＮＳＬ１、欠失表現型）、ＤｉＧｅｏｒｇｅ／Ｖｅｌｏ－ｃａｒｉｏ－ｆａｃｉａｌ（ＴＢＸ１、ＨＩＲＡ、欠失表現型）、並びに腎嚢胞及び糖尿病（ＨＮＦＩＢ、欠失表現型）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＣＮＶｓ，Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ。Ｃｌｉｎｉｃｓ ａｎｄ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌｏｇｙ．４２（２）：２２７－－２４２、Ａｏｕｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｇｅｎｅｓ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．６（２）：９９－１１２。
一態様では、本明細書に記載の方法又はキットは、対応する治療用製品の使用に関する情報を提供するためのコンパニオン診断デバイスとして使用することができる。例えば、方法又はキットを使用して、乳がん又は卵巣がんに対するＬｙｎｐａｒｚａ（登録商標）（オラパリブ）、Ｔａｌｚｅｎｎａ（登録商標）（タラゾパリブ）、又はＲｕｂｒａｃａ（登録商標）（ルカパリブ）などの治療に関連する患者管理のためのＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２、非小細胞肺がんに対するＩｒｅｓｓａ（登録商標）（ゲフィチニブ）、Ｇｉｌｏｔｒｉｆ（登録商標）（アファチニブ）又はＶｉｚｉｍｐｒｏ（登録商標）（ダコミチニブ）、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）（エルロチニブ）、又はＴａｇｒｉｓｓｏ（登録商標）（オシメルチニブ）などの治療に関連する患者管理のためのＥＧＦＲ、非小細胞肺がんに対するＫｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）（ペムブロリズマブ）又はＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）（アテゾリズマブ）などの治療に関連する患者管理のためのＰＤ－Ｌ１、急性骨髄性白血病に対するＴｉｂｓｏｖｏ（登録商標）（イボシデニブ）などの治療に関連する患者管理のためのＩＤＨ１、慢性骨髄性白血病に対するＴａｓｉｇｎａ（登録商標）（ニロチニブ）などの治療に関連する患者管理のためのＢＣＲ－ＡＢＬ、非小細胞肺がんに対するＺｙｋａｄｉａ（登録商標）（セリチニブ）、Ｘａｌｋｏｒｉ（登録商標）（クリゾチニブ）、Ａｌｅｃｅｎｓａ（登録商標）（アレクチニブ）などの治療に関連する患者管理のためのＡＬＫ、急性骨髄性白血病に対するＩｄｈｉｆａ（登録商標）（エナシデニブ）などの治療に関連する患者管理のためのＩＤＨ２、結腸直腸がんに対するＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）などの治療に関連する患者管理のためのＲＡＳ、急性骨髄性白血病に対するＲｙｄａｐｔ（登録商標）（ミドスタウリン）及びＸｏｓｐａｔａ（登録商標）（ギルテリニブ）などの治療に関連する患者管理のためのＦＬＴ３、積極的な全身性肥満細胞症に対するＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標）（メシル酸イマチニブ）などの治療に関連する患者管理のためのＫＩＴ（Ｄ８１６Ｖ）、骨髄異形成症候群／骨髄増殖性疾患に対するＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標）（メシル酸イマチニブ）などの治療に関連する患者管理のためのＰＤＧＦＲＢ、結腸直腸がんに対するＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）又はＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）などの治療に関連する患者管理のためのＫＲＡＳ又はＥＧＦＲ、消化管間質腫瘍に対するＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標）（メシル酸イマチニブ）又はＧｌｉｖｅｃ（登録商標）（メシル酸イマチニブ）などの治療に関連する患者管理のためのｃ－ＫＩＴ、乳がんに対するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、Ｐｅｒｊｅｔａ（登録商標）（ペルツズマブ）、又はＫａｄｃｙｌａ（登録商標）（アドトラスツズマブ）などの治療に関連する患者管理のためのＨＥＲ－２、胃がん及び胃食道がんに対するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）などの治療に関連する患者管理のためのＨＥＲ－２、黒色腫に対するＢｒａｆｔｏｖｉ（登録商標）（エンコラフェニブ）、Ｍｅｋｔｏｖｉ（登録商標）（ビニメチニブ）、Ｍｅｋｉｎｉｓｔ（登録商標）（トラメチニブ）、Ｔａｆｉｎｉｌａｒ（登録商標）（ダブラフェニブ）、Ｚｅｌｂｏｒａｆ（登録商標）（ベムラフェニブ）、又はＣｏｔｅｌｌｉｃ（登録商標）（コビメチニブ）などの治療に関連する患者管理のためのＢＲＡＦ、あるいはそれらの組み合わせなどの１つ以上の遺伝子を検出、同定又は定量化する。例えば、ｆｄａ．ｇｏｖで入手可能なＦＤＡの認可又は承認されたコンパニオン診断デバイスのリスト（インビトロ及びイメージングツール）を参照されたい。
一態様では、方法又はキットを使用して、例えば、臨床診断、食品安全性試験、環境モニタリング又は生物防御のために、臨床又は環境サンプル中の病原性生物を検出するための１つ以上のヌクレオチド配列又は多様体を同定、検出、又は定量化する。一態様では、方法又はキットを使用して、ウイルス、細菌、寄生虫及び真菌の病原体を含む１つ以上の病原体を同定、検出、又は定量化する。一態様では、方法又はキットを使用して、１つ以上の抗生物質又は抗ウイルス耐性の病原性生物を同定、検出、又は定量化する。
一態様では、方法又はキットは、１つ以上の病原性ゲノムの存在を検出するように構成された１つ以上のプローブのセットを含む。一態様では、この方法又はキットは、病原体検出、ジェノタイピング、ウイルスの検出、病原性マーカーの検出、抗生物質耐性の検出、又は発生調査のためのハイスループットスクリーニングに使用され、例えば、Ｆｏｕｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｅｒａ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．６：１１４。一態様では、ウイルス病原体の検出及びジェノタイピングのための方法又はキットが提供され、例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ－ｂａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．ＰＮＡＳ．９９（２４）：１５６８７－１５６９２。
ウイルスゲノム配列は既知であり、例えば、ＮＣＢＩウイルスゲノムリソースを使用して見つけることができ、ＮＣＢＩウイルスゲノムリソースは、公開されている全てのウイルスゲノム配列をカタログ化し、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｖｉｒｕｓｅｓからアクセスできる。同様に、微生物ゲノム配列は既知であり、例えば、ＮＣＢＩ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅを使用して見つけることができ、ＮＣＢＩ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅは、公開されている全ての微生物ゲノム配列をカタログ化し、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｍｉｃｒｏｂｅｓからアクセスできる。
別の態様では、方法又はキットを使用して、１つ以上のウイルス、例えば、インフルエンザＡ及びＢウイルス（例えば、インフルエンザＡウイルス・サブタイプＨ１、Ｈ３、及びＨ５；パラインフルエンザウイルス１型、２型、３型及び４型；呼吸器合胞体ウイルスＡ型及びＢ型；アデノウイルス；メタニューモウイルス（ＭＰＶ）；ライノウイルス；エンテロウイルス；並びにＯＣ４３及び２２９Ｅ、又は重症急性呼吸器症候群コロナウイルス、ＮＬ６３及びＨＫＵ１などのコロナウイルス（ＣｏＶ）；鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１；並びにヒトボカウイルスを含む）を含むがこれらに限定されない１つ以上の呼吸器ウイルスを検出、同定又は定量化することができる。一態様では、ウイルスキャプシド（ＣＡ）タンパク質を検出するための方法又はキットが提供される。
一態様では、方法又はキットは、分類学的ファミリー又はサブファミリーに固有であるが、そのファミリー内の種によって共有されるゲノム領域に一致する１つ以上の「ディスカバリー」プローブを含む。「ディスカバリー」プローブは、ファミリー内でよりゆっくりと進化し、既知のファミリー内の種を検出するのに役立つ標的配列をプローブする。別の態様では、方法又はキットは、個々の種又は株に固有の高度に可変な領域を標的とする１つ以上の「センサス」プローブを含む。「センサス」プローブは、サンプル中の特定の生物株を同定するのに役立つ。ＭｃＬｏｕｇｈｌｉｎ，Ｋ．Ｓ．（２０１１）Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｆｏｒ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｒｉｅｆ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１０（６）：３４２－３５３。
一態様では、方法又はキットを使用して、病原性細菌に関連する核酸配列を検出、同定、又は定量化する。多種多様な好気性及び嫌気性細菌を同定するために使用される一般的な遺伝子標的は、１６ＳｒＲＮＡ又はｒＤＮＡである。細菌のＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットをコードするｒｐｏＢ遺伝子は、細菌の同定、例えば急速に増殖するマイコバクテリアの同定にも使用できる。他の細菌遺伝子標的としては、ｔｕｆ（伸長因子Ｔｕ）、ｇｙｒＡ又はｇｙｒＢ（ｇｙｒａｓｅＡ又はＢ）、ｓｏｄａ（マンガン依存性スーパーオキシドジスムターゼ）及び熱ショックタンパク質が挙げられる。Ｐｅｔｔｉ，Ｃ．Ａ．（２００７）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｂｙ Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４４：１１０８－１１１４。
一態様では、方法又はキットを使用して、糞便検体中の１つ以上の病原性生物を同定、検出、又は定量化する。一態様では、方法又はキットを使用して、ヒトの糞便検体中の１つ以上のウイルス、寄生虫又は細菌の核酸配列を同定、検出、又は定量化する。一態様では、方法又はキットを使用して、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ／Ｂ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７、 ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）ＬＴ／ＳＴ、ｓｈｉｇａ様毒素産生Ｅ．ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）ｓｔｘ１／ｓｔｘ２、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、及びＹｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａを含むがこれらに限定されない１つ以上の細菌又は細菌毒素を同定、検出、又は定量化する。一態様では、方法又はキットを使用して、アデノウイルス、ノロウイルス、及びロタウイルスを含むがこれらに限定されない１つ以上のウイルスを同定、検出、又は定量化する。一態様では、方法又はキットを使用して、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｏｌｙｔｉｃａ、又はＧｉａｒｄｉａを含むがこれらに限定されない１つ以上の寄生虫を同定、検出、又は定量化する。
一態様では、方法又はキットを使用して、臓器移植の結果に関連する１つ以上のヌクレオチド配列又は多様体を同定、検出、又は定量化する。一態様では、方法又はキットを使用して、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を同定、検出、又は定量化して、臓器移植手順に役立つ情報を提供する。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子は、ほとんど全ての有核細胞に発現しており、移植片拒絶反応に重要である。系は非常に多型である。ＨＬＡクラスＩには３つの古典的な遺伝子座がある。ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃｗ、並びにクラスＩＩの５つの遺伝子座：ＨＬＡ－ＤＲ、－ＤＱ、－ＤＰ、－ＤＭ、及び－ＤＯ。Ｍａｈｄｉ，Ｂ．Ｍ．（２０１３）Ａ ｇｌｏｗ ｏｆ ＨＬＡ ｔｙｐｉｎｇ ｉｎ ｏｒｇａｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２：６。７，５００を超える異なるアレル及び５，４５８を超える発現抗原が現在知られている。（Ｌａｐｅｒｒｏｕｓａｚ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＨＬＡ ａｎｄ ｎｏｎ－ＨＬＡ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｓｗｉｓｓ Ｍｅｄ．Ｗｋｌｙ．１４２：ｗ１３６６８。
一態様では、方法又はキットを使用して、患者の循環中の核酸、例えば、核酸治療薬を同定、検出、又は定量化する。様々な核酸治療薬は知られており、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＮＡアプタマー及び遺伝子治療などのＤＮＡ治療薬、並びにマイクロＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ、リボザイム、ＲＮＡデコイ及び環状ＲＮＡなどのＲＮＡ治療薬が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）網膜炎の管理のためのホミビルセン及びアポリポタンパク質Ｂ－１００合成の阻害剤であるミポメルセンが挙げられる。遺伝子治療で使用されるオリゴヌクレオチドの例としては、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の発現のためのＧｅｎｄｉｃｉｎｅ及びリポタンパク質リパーゼ欠損症の患者のためのＡｌｉｐｇｅｎｅが挙げられる。Ｍｉｒａｖｉｒｓｅｎは、肝臓特異的なマイクロＲＮＡ－１２２を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。臨床試験における追加の治療用核酸は、Ｓｒｉｄｈａｒａｎ ａｎｄ Ｇｏｇｔａｙ（２０１６）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｔａｔｕｓ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８２（３）：６５９－６７２によって記載されているものが含まれ、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一態様では、遺伝子発現研究のための方法又はキットが提供される。一態様では、サンプル中のｍＲＮＡ発現を検出、同定又は定量化するための方法又はキットが提供される。一態様では、１つ以上の調節多型（ｒＳＮＰ）を検出、同定又は定量化するための方法又はキットが提供される。「調節多型」という用語は、遺伝子発現に影響を与える可能性のあるエクソン領域の外側で発生する多型を指す。シス作用性調節多型は、同じアレルに存在する遺伝子のコピーに作用し、通常、それが調節する遺伝子の座位の中又は近くに存在する。トランス作用性調節多型は、別の遺伝子の発現に影響を与えるある遺伝子の多型である。Ｋｎｉｇｈｔ，Ｊ．Ｃ．（２００５）Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｒａｉｔｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（Ｂｅｒｌ．）．８３（２）：９７－１０９。多形性シス及びトランス作用性ヒト遺伝子発現の調節因子は知られており、Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ Ｃｉｓ－ａｎｄ Ｔｒａｎｓ－Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＰＬＯＳ Ｂｉｏｌ．８（９）：ｅ１０００４８０によって記載されているものが含まれ、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一態様では、方法又はキットを使用して、ＤＮＡメチル化多型又は他の後成的多様性などの１つ以上のヌクレオチド配列又は多様体を同定、検出、又は定量化する。
一態様では、方法又はキットを使用して、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を同定、検出、又は定量化する。ＭＳＩは、ＤＮＡミスマッチ修復の障害に起因する変異の素因を示す。ＭＳＩは、例えば、Ｓｃｈｌｏｔｔｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，”ｅＬＳ ２００４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｇ．ｅｌｓ．００００８４０に更に記載される。
一態様では、方法又はキットを使用して、例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む、遺伝子編集技術による１つ以上のヌクレオチド配列又は多様体を同定、検出、又は定量化する。
一態様では、方法又はキットを使用して、サンプル中の１つ以上のタンパク質を同定、検出、又は定量化する。一態様では、タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質である。一態様では、方法又はキットを使用して、サンプルから１つ以上の標的ＤＮＡ結合タンパク質を単離する。別の態様では、方法又はキットを使用して、サンプル中の１つ以上のＤＮＡ結合タンパク質の同一性を確認するか、又はサンプル中のＤＮＡ結合タンパク質の相対量を決定する。一態様では、方法又はキットを使用して、転写因子－ＤＮＡ結合相互作用を測定する。一態様では、ＤＮＡ結合タンパク質が結合する一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ配列は、本明細書に記載のように支持体表面に固定化され、ＤＮＡ結合タンパク質を含有するか、又は含有することが疑われるサンプルと接触させられる。一態様では、固定化されたＤＮＡ配列は、ＤＮＡ結合タンパク質が支持体表面上の固定化されたＤＮＡ配列に結合する条件下で、ＤＮＡ結合タンパク質を含有するか、又は含有することが疑われるサンプルと接触させられる。次いで、表面を洗浄して、例えば、非特異的に結合したタンパク質を含む破片を除去する。一態様では、標的ＤＮＡ結合タンパク質は、固定化されたＤＮＡから溶出され、例えば、ウエスタンブロット又は質量分析によって検出される。別の態様では、固定化された標的ＤＮＡ結合タンパク質は、例えば、タンパク質に特異的に結合する標識抗体又は電気化学発光標識を使用して、標識及び検出される。一態様では、サンプルは、１つ以上のＤＮＡ結合タンパク質を含む細胞溶解物である。一態様では、支持体表面は、マイクロウェルプレートである。一態様では、マイクロプレートフォーマットは、例えば、変異又は活性化アッセイのために、ハイスループット分析に関連して使用される。
一態様では、方法又はキットを使用して、病原性又は薬剤耐性に関連する一塩基多様体又は一塩基多型などの１つ以上のヌクレオチド配列又は多様体を同定、検出、又は定量化する。別の態様では、方法又はキットを使用して、特定の産業又は農業用途に関連する一塩基多様体又は一塩基多型、例えば、遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）に関連する変異などの１つ以上のヌクレオチド配列又は変異体を同定、検出、又は定量化する。一態様では、方法又はキットをゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）で使用して、１つ以上の多様体、例えば、一塩基多様体が疾患に関連するかどうかを決定することができる。
一態様では、方法又はキットを使用して、１つ以上の一塩基多様体を同定、検出、又は定量化する。一態様では、方法又はキットを使用して、約１～約１００、又は約５～約１００の定義された一塩基多様体を同定、検出、又は定量化し、１つ以上の一塩基多型が含まれ得る。
一態様では、サンプル中の複数の標的ヌクレオチド配列の同時の並行した同定、検出又は定量化のための方法及びキットが提供される。一態様では、サンプル中の最大１００個の標的ヌクレオチド配列、例えば、サンプル中の約１～約１００、又は約５～約１００個の標的ヌクレオチド配列を同定、検出又は定量化するための方法が提供される。一態様では、ユーザ又は製造業者が、特定のユーザ要件に基づいて１つ以上の標的ヌクレオチド配列を検出するための多重結合アッセイを構成することができる方法又はキットが提供される。
一態様では、この方法は、標的ヌクレオチド配列をテンプレートとして使用してタグ及び標識された反応生成物を生成し、支持体表面をタグ及び標識された反応生成物と接触させることを含み、支持体表面は、複数の捕捉分子が固定化されている１つ以上の結合ドメインのパターン化されたアレイを含む。一態様では、捕捉分子は、個別の結合ドメインに固定化された一本鎖捕捉オリゴヌクレオチドを含み、各結合ドメインは、特定のヌクレオチド配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、タグ及び標識された反応生成物は、捕捉オリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドタグを含む。一態様では、タグ及び標識された反応生成物は、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）によって生成される。別の態様では、タグ及び標識された反応生成物は、プライマー伸長アッセイ（ＰＥＡ）によって生成される。一態様では、標識は電気化学発光（ＥＣＬ）標識であり、支持体表面は、固定化された反応生成物の標識からの電気化学発光の放射を誘発するのに適した１つ以上の作用電極及び１つ以上の対電極を含む。
一態様では、標的ヌクレオチド配列は、野生型配列を含むか、又は含有することが疑われる。一態様では、標的ヌクレオチド配列は、欠失、付加、置換、転位、転換、再配列、又は転座などの変異を含むか、又は含有することが疑われる。一態様では、変異には、ミスセンス、ナンセンス、サイレント、又はスプライス部位の変異が含まれる。一態様では、１つ以上の標的ヌクレオチド配列における１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を同定、検出又は定量化するための方法及びキットが提供される。一態様では、集団の少なくとも約１％に存在する１つ以上の一般的な一塩基ＳＮＰを同定、検出、又は定量化するための方法及びキットが提供される。別の態様では、サンプル中に低頻度で存在する変異、例えば、サンプル中に０．０５％又は０．０１％未満で存在する変異を同定、検出、又は定量化するための方法及びキットが提供される。
一態様では、複数の標的分析物に対して多重結合アッセイを実施する方法が提供される。多重結合アッセイは知られており、２０１５年９月８日に出願されたＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＣＯＮＤＵＣＴＩＮＧ ＭＵＬＴＩＰＬＥＸＥＤ ＡＳＳＡＹＳと題された米国特許公開第２０１６／００６９８７２号に記載されているものが含まれ、その開示はその全体が本明細書に組み込まれる。
一態様では、多重結合アッセイを実施する方法は、第１のヌクレオチド配列を有する少なくとも第１の捕捉オリゴヌクレオチドが第１の結合ドメインに固定化され、第２のヌクレオチド配列を有する第２の捕捉オリゴヌクレオチドが第２の結合ドメインに固定化される支持体表面を提供することを含む。一態様では、第１及び第２のヌクレオチド配列は同じではない。一態様では、支持体表面は、１つ以上のステップで、少なくとも第１の標的化剤、第１の結合試薬、第２の標的化剤、及び第２の結合試薬と接触させられる。一態様では、第１の標的化剤は、第１の連結剤に動作可能に接続された第１のタグ配列を含む。一態様では、第１のタグ配列は、第１の捕捉オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。一態様では、第２の標的化剤は、第２の連結剤に動作可能に接続された第２のタグ配列を含む。一態様では、第２のタグ配列は、第２の捕捉オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。一態様では、第１の結合試薬は、第１の補足連結剤に作動可能に接続された第１の分析物に特異的に結合する第１の分析物結合ドメインを含む。一態様では、第２の結合試薬は、第２の補足連結剤に作動可能に接続された第２の分析物に特異的に結合する第２の分析物結合ドメインを含む。一態様では、第１の連結剤は、第１の補足連結剤の結合パートナーであり、第２の連結剤は、第２の連結剤の結合パートナーである。一態様では、支持体表面は、少なくとも第１及び第２のブリッジング剤と接触させられる。一態様では、第１のブリッジング剤は、第１の連結剤に結合する第１の連結剤結合部位と、第１の捕捉連結剤に結合する第１の補足連結剤結合部位とを含み、第２のブリッジング剤は、第２の連結剤に結合する第２の連結剤結合部位と、第２の補足連結剤に結合する第２の補足連結剤結合部位とを含む。
一態様では、支持体表面は、少なくとも第１の目的の分析物及び第２の目的の分析物を含有するか、又は含有することが疑われるサンプルと接触させられる。一態様では、少なくとも第１の検出複合体及び第２の検出複合体が形成される。一態様では、第１の検出複合体は、第１の結合ドメイン上に形成され、第１の標的化剤、第１の捕捉オリゴヌクレオチド、第１の結合試薬、及び第１の分析物を含む。一態様では、第１の検出複合体は、第１の結合ドメイン上に形成され、第１の標的化剤、第１の捕捉オリゴヌクレオチド、第１のブリッジング剤、第１の結合試薬、及び第１の分析物を含む。一態様では、第２の検出複合体は、第２の結合ドメイン上に形成され、第２の標的化剤、第２の捕捉オリゴヌクレオチド、第２の結合試薬、及び第２の分析物を含む。一態様では、第２の検出複合体は、第２の結合ドメイン上に形成され、第２の標的化剤、第２の捕捉オリゴヌクレオチド、第２のブリッジング剤、第２の結合試薬、及び第２の分析物を含む。一態様では、この方法は、第１及び第２の検出複合体を介して、第１及び第２の結合ドメインにそれぞれ固定化された第１及び第２の分析物の量を測定することを含む。
Ｐ．手動及び自動化された実施形態
本明細書に開示される方法は、手動で、自動化された技術を使用して、又はその両方で実施することができる。自動化された技術は、例えば、１つ以上のモジュール式機器、又は完全に統合された自動化された機器など、部分的に自動化されていてもよい。
自動化されたシステムの例は、記載され、一般に所有されている国際特許出願公開第２０１８／０１７１５６号及び同第２０１７／０１５６３６号並びに国際特許出願公開第２０１６／１６４４７７号に記載され、それらの各々は参照によりそれらの全体が組み込まれている。
本明細書の方法が実行され得る自動化システム（モジュール及び完全に統合された）は、以下の自動化サブシステム、ハードウェア（例えば、パーソナルコンピュータ、ラップトップ、ハードウェアプロセッサ、ディスク、キーボード、ディスプレイ、プリンタ）、ソフトウェア（例えば、ドライバ、ドライバコントローラ、データアナライザーなどのプロセス）、及びデータベース；液体処理サブシステム、例えば、サンプル処理及び試薬処理、例えば、ロボットピペッティングヘッド、シリンジ、撹拌装置、超音波混合装置、磁気混合装置；サンプル、試薬、並びに消耗品の保管及び処理サブシステム、例えば、ロボットマニピュレーター、チューブ又はリッド又はフォイルピアシング装置、リッド除去装置、線形及び円形コンベヤー及びロボットマニピュレーターなどの搬送装置、チューブラック、プレートキャリア、トラフキャリア、ピペットチップキャリア、プレートシェーカー；遠心分離機、アッセイ反応サブシステム、例えば、流体ベース及び消耗品ベース（チューブ及びマルチウェルプレートなど）；容器及び消耗品洗浄サブシステム、例えば、プレート洗浄装置；磁気分離器又は磁性粒子濃縮器サブシステム、例えば、フローセル、チューブ、及びプレートタイプ；細胞及び粒子の検出、分類及び分離サブシステム、例えば、フローサイトメーター及びコールターカウンター；比色、比濁、蛍光、及びＥＣＬ検出器などの検出サブシステム；温度制御サブシステム、例えば、空気処理、空冷、空気加温、ファン、送風機、水浴；廃棄物サブシステム、例えば、液体及び固体廃棄物容器；グローバル一意識別子（ＧＵＩ）検出サブシステム、例えば、フラットベッド及びワンドタイプなどの１Ｄ及び２Ｄバーコードスキャナー；サンプル識別子検出サブシステム、例えば、フラットベッドやワンドタイプなどの１Ｄ及び２Ｄバーコードスキャナー；を含み得るコンピュータサブシステムを含み得る。分析サブシステム、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、質量分析計などのクロマトグラフィーシステムも、モジュールにすることも、完全に統合することもできる。
サンプルの同定及び調製を実施するシステム又はモジュールは、アッセイを実施し、検出を実施するか、又はその両方を実施するシステム又はモジュールと組み合わせる（又は結び付けるか、隣接するか、ロボットで連結又は結合する）ことができる。同じ種類の複数のモジュラーシステムを組み合わせて、スループットを向上させることができる。モジュラーシステムは、化学的、生化学的、及び核酸分析などの他のタイプの分析を実行するモジュールと組み合わせることができる。
自動化されたシステムにより、バッチ、連続、ランダムアクセス、及びポイントオブケアのワークフローと、単一、中、及び高のサンプルスループットが可能になる。
システムは、例えば、以下のデバイス：プレートシーラー（例えば、Ｚｙｍａｒｋ）、プレートウォッシャー（例えば、ＢｉｏＴｅｋ、ＴＥＣＡＮ）、試薬ディスペンサー及び／又は自動ピペッティングステーション及び／又は液体処理ステーション（例えば、ＴＥＣＡＮ、Ｚｙｍａｒｋ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ）、インキュベーター（例えば、Ｚｙｍａｒｋ）、プレートシェーカー（例えば、Ｑ．Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｈｅｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、化合物ライブラリ又はサンプルストレージ及び／又は化合物及び／又はサンプル検索モジュールのうちの１つ以上を含み得る。これらのデバイスのうちの１つ以上は、ロボットアセンブリを介して本発明の装置に結合され、その結果、アッセイプロセス全体を自動的に実施することができる。代替の実施形態によれば、容器（例えば、プレート）は、装置と様々なデバイス（例えば、プレートのスタック）との間で手動で移動される。
自動システムは、以下の機能：（ａ）プレートなどの消耗品を検出サブシステム中に、内に、及び外に出し入れすること、（ｂ）他のサブシステム間で消耗品を移動すること、（ｃ）消耗品を保管すること、（ｄ）サンプル及び試薬の処理（例えば、試薬の混合及び／又は試薬の消耗品への導入に適合）、（ｅ）消耗品の振とう（例えば、試薬の混合及び／又は反応速度の増加）、（ｆ）消耗品の洗浄（例えば、プレートの洗浄及び／又はアッセイ洗浄ステップの実施（例えば、十分に吸引する））、（ｇ）フローセル又はチューブ若しくはプレートなどの消耗品中のＥＣＬを測定すること、の１つ以上を実施するように構成できる。自動化システムは、ラックに置かれた個々のチューブ、９６又は３８４ウェルプレートなどのマルチウェルプレートを処理するように構成することができる。
本明細書に記載されるような自動化システムに成分及びモジュールを統合するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｒｇｅａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｔｆｏｒｍ Ｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｏｕｔｓｏｕｒｃｉｎｇ，Ｍａｙ １７，２０１０を参照されたい。
実施形態では、自動化システムは、完全に自動化され、モジュール式であり、コンピュータ化され、広範囲の分析物に対してインビトロで定量的及び定性的試験を実施し、測光アッセイ、イオン選択性電極測定、及び／又は電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイを実施する。実施形態では、システムは、以下のハードウェア単位：制御単位、コア単位、及び少なくとも１つの分析モジュール、を含む。
実施形態では、制御単位は、グラフィカルユーザインターフェースを使用して全ての機器機能を制御し、モニタなどの読み出しデバイス、キーボード及びマウスなどの入力デバイス、並びにパーソナルコンピュータ、例えば、Ｗｉｎｄｏｗｓオペレーティングシステムが含まれる。実施形態では、コア単位は、割り当てられた各分析モジュールへのサンプルの運搬を管理するいくつかの成分からなる。コア単位の実際の構成は、分析モジュールの構成に依存し、分析モジュールは、当該技術分野で知られている方法を使用して当業者によって構成することができる。実施形態では、コア単位は、主要成分として、少なくともサンプリング単位及び１つのラックロータを含む。コンベヤーライン及び第２のラックロータは可能な伸長である。他のいくつかのコア単位成分には、サンプルラックローダー／アンローダー、ポート、バーコードリーダ（ラック及びサンプル用）、給水、及びシステムインターフェースポートが含まれる。実施形態では、分析モジュールは、ＥＣＬアッセイを実施し、試薬領域、測定領域、消耗品領域、及び前洗浄領域を含む。
Ｑ．キット
一態様では、サンプル中の１つ以上の標的分析物を同定、検出、又は定量化するためのアッセイを実施するためのキットが提供される。一態様では、キットは、製造業者又はエンドユーザによってカスタマイズされ、１つ以上の目的の標的タンパク質又はヌクレオチド配列を同定、検出、又は定量化することができる。一態様では、エンドユーザは、標的分析物又は反応生成物に関連するオリゴヌクレオチドタグと各結合ドメインに固定化された捕捉オリゴヌクレオチドとの間の相補性に基づいて、アレイ内の各結合ドメインに向けられる標的分析物を指定することができる。一態様では、キットは、ユーザの仕様に基づいて構成できるマルチウェルアッセイプレートを提供し、例えば、エンドユーザは、分析物のセットを選択し、その分析物のセットに対してユーザがカスタマイズした多重アッセイを構成することができる。
一態様では、キットが提供される。一態様では、キットは、本明細書に記載されるような非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットを含む。一態様では、キットは、表１（配列番号１～６４）、表２（配列番号６５～１２２）、表３（配列番号１２３～１８６）、表４（配列番号１８７～２５０）、表５（配列番号２５１～３０８）、表６（配列番号３０９～３７２）、表７（配列番号３７３～４３６）、表８（配列番号４３７～４９４）、表９（配列番号４９５～５５８）、表１０（配列番号５５９～６２２）、表１１（配列番号６２３～６８０）、若しくは表１２（配列番号６８１～７４４）から選択される２つ以上の非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチド、又はそれらの多様体を含む。一態様では、キットは、配列番号１～６４から選択される２つ以上の非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセット、又はその多様体を含む。一態様では、キットは、配列番号１～１０から選択される２つ以上の非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセット、又はその多様体を含む。一態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、少なくとも２４、３０、又は３６個のヌクレオチドを含む。
一態様では、キットは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５、及び最大６４個の非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットを含む。一態様では、キットは、最大１０個の非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットを含む。
一態様では、キットは、容器内に提供される１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、容器内の捕捉オリゴヌクレオチドは同じ配列を有し、各容器は、他の容器内の捕捉オリゴヌクレオチドの配列とは異なる（かつ相補的ではない）配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドを含有する。一態様では、キットは、別個の容器に、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５、及び最大６４個の非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットを含む。一態様では、キットは、別個の容器内に、最大１０個の標的ヌクレオチド配列を同定、検出、又は定量化するために使用することができる最大１０個の異なる捕捉オリゴヌクレオチドを含む。
一態様では、キットは、本明細書に記載されるように、支持体表面及び非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットを含む。一態様では、キットは、支持体表面に固定化された非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットを含む。一態様では、キットは、アレイ内の支持体表面に固定化された非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドのセットを含む。一態様では、キットは、アレイ内の既知の位置を有する１つ以上の個別の結合ドメインに固定化された１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、キットは、ビーズアレイ上に固定化された２つ以上の非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドを含む。
一態様では、キットは、支持体表面上の１つ以上の結合ドメインに固定化された１つ以上の非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、キットは、２つ以上の固有の結合ドメインに固定化された２つ以上の非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチドを含み、各固有の結合ドメインに固定化された捕捉オリゴヌクレオチドの配列は同じである。一態様では、キットは、少なくともいくつかの捕捉オリゴヌクレオチドが支持体表面に共有結合的に結合されていない１つ以上の結合ドメインを含む。一態様では、キットは、少なくともいくつかの捕捉オリゴヌクレオチドが、チオール基を介してカーボンベースの表面、例えば、カーボンベースの電極に共有結合的に結合されていない１つ以上の結合ドメインを含む。一態様では、１つ以上の結合ドメインは、チオール基を介して支持体表面に共有結合的に結合されていない１０％、１５％、２０％、２５％、５０％又は７５％を超える捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、キットは、約０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、又は０．０１％未満の汚染捕捉オリゴヌクレオチドを有する１つ以上の結合ドメインを含む。
一態様では、キットは、官能基を含む１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、キットは、チオール基を含む１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、チオール基を介してカーボンベースの支持体表面に共有結合的に付着している。一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、リンカーを介してチオール基に付着している。一態様では、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドは、チオール基を介して１つ以上の電極に付着している。
別の態様では、キットは、本明細書に記載されるような非交差反応性オリゴヌクレオチドタグのセットを含む。一態様では、キットは、相補的捕捉オリゴヌクレオチドと比較して０．０５％未満の非相補的捕捉オリゴヌクレオチドに結合する非交差反応性オリゴヌクレオチドタグのセットを含む。
一態様では、キットは、表１３（配列番号７４５～８０８）、表１４（配列番号８０９～８６６）、表１５（配列番号８６７～９３０）、表１６（配列番号９３１～９９４）、表１７（配列番号９９５～１０５２）、表１８（配列番号１０５３～１１１６）、表１９（配列番号１１１７～１１８０）、表２０（配列番号１１８１～１２３８）、表２１（配列番号１２３９～１３０２）、表２２（配列番号１３０３～１３６６）、表２３（配列番号１３６７～１４２４）、又は表２４（配列番号１４２５～１４８８）から選択される非交差反応性オリゴヌクレオチドのセット、又はその多様体を含む。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、少なくとも２０、２４、３０又は３６個のヌクレオチドを含む。
一態様では、キットは、容器内に提供される１つ以上のオリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチドタグを含み、容器内のオリゴヌクレオチドタグは同じ配列を有し、各容器は、他の容器内のオリゴヌクレオチドタグの配列とは異なる（かつ相補的ではない）配列を有するオリゴヌクレオチドタグを含有する。一態様では、キットは、別個の容器に、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５、及び最大６４個の非交差反応性オリゴヌクレオチドタグを含む。一態様では、キットは、最大１０個の非交差反応性オリゴヌクレオチドタグのセットを含む。
一態様では、キットは、支持体表面を含む。一態様では、キットは、カーボンベースの支持体表面を含む。一態様では、支持体表面は、少なくとも１つの電極を含む。一態様では、電極は、カーボンベースの電極である。一態様では、支持体表面は、１つ以上のカーボンインク電極を含む。一態様では、支持体表面は、少なくとも１つの作用電極及び少なくとも１つの対電極を含む。
一態様では、キットは、マルチウェルアッセイプレートを含む支持体表面を含む。一態様では、マルチウェルプレートの１つ以上のウェルは、１つ以上の電極を含む。一態様では、支持体表面は、１つ以上のウェルが１つ以上の作用電極及び１つ以上の対電極を含むマルチウェルプレートを含む。一態様では、支持体表面は、１つ以上の参照電極を含む。
一態様では、キットは、捕捉オリゴヌクレオチドの１つ以上のアレイが印刷される１つ以上の電極を有する支持体表面を含む。一態様では、キットは、捕捉オリゴヌクレオチドの１つ以上のアレイが印刷された１つ以上のマルチウェルプレートを含む。別の態様では、キットは、１つ以上のマルチウェルプレートと、１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む１つ以上のバイアルを含み、捕捉オリゴヌクレオチドは、マルチウェルプレートに印刷することができる。一態様では、エンドユーザ又は製造業者は、オリゴヌクレオチドタグを標的分析物と関連付けるか、キットに付属の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的であるオリゴヌクレオチドタグを有する反応生成物を生成することによって、どの標的ヌクレオチド配列を同定、検出又は定量化するかをカスタマイズすることができる。
一態様では、キットは、支持体表面上の１つ以上の結合ドメインに固定化された１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、キットは、マルチウェルプレートのウェル内の１つ以上の結合ドメインに固定化された１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、キットは、電極上の１つ以上の結合ドメインに固定化された１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、キットは、マルチウェルプレートの１つ以上のウェル内の電極上の１つ以上の結合ドメインに固定化された１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。
一態様では、キットは、最大１０個の捕捉オリゴヌクレオチドがマルチウェルプレートのウェル内の１つ以上の結合ドメインに固定化されている１つ以上のマルチウェルプレートを含み、各結合ドメインは、ウェル内の他の結合ドメインの捕捉オリゴヌクレオチドの配列とは異なる配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、キットは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５個の固有の結合ドメインに固定化された少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５個の異なる捕捉オリゴヌクレオチドを有する支持体表面を含む。一態様では、キットは、１つ以上のウェル内の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５個の固有の結合ドメインに固定化された少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５個の異なる捕捉オリゴヌクレオチドを有するマルチウェルプレートを含む。一態様では、キットは、１つ以上のマルチウェルプレートを含み、各ウェルは、アレイに固定化された最大１０個の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、マルチウェルプレートは、マルチウェルプレートの各ウェル内に１～１０の検出アッセイを作成するように構成することができる。
一態様では、キットは、当該技術分野で知られており、２４、９６、及び３８４ウェルプレートを含むことができるがこれらに限定されない標準フォーマットのマルチウェルプレートを含む。一態様では、キットは、１つ以上の９６ウェルプレートを含む。一態様では、キットは、１つのマルチウェルプレートを含む。別の態様では、キットは、１０マルチウェルプレートを含む。別の態様では、キットは、１０～１００マルチウェルプレートを含む。
一態様では、発光アッセイ、例えば、サンプル中の１つ以上の標的ヌクレオチド配列を同定、検出、又は定量化するための電気化学発光アッセイを実施するためのキットが提供される。一態様では、キットは、電気化学発光アッセイを実施するのに有用な１つ以上のアッセイ成分を含む。
一態様では、キットは、オリゴヌクレオチドタグをそれらの対応する相補的捕捉オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするための適切な条件（例えば、ストリンジェントな条件）を提供するために使用できるハイブリダイゼーション緩衝液を含む。一態様では、ハイブリダイゼーション緩衝液は、ホルムアミドなどの核酸変性剤を含む。一態様では、ハイブリダイゼーション緩衝液は、ハイブリダイゼーション緩衝液を形成するために組み合わせることができる２つの別個の成分として提供される。
一態様では、キットは、印刷後に支持体表面から遊離の（すなわち、固定化されていない）捕捉分子を除去するための洗浄溶液の容器を含む。一態様では、洗浄溶液は、水溶液である。一態様では、洗浄溶液は、チオール含有化合物を含む。一態様では、チオール含有化合物は水溶性であり、約２００ｇ／モル、１７５ｇ／モル、１５０ｇ／モル、又は１２５ｇ／モル未満の分子量を有する。一態様では、チオール含有化合物は、システイン、システアミン、ジチオスレイトール、３－メルカプトプロプリオネート、３－メルカプト－１－プロパンスルホン酸、及びそれらの組み合わせから選択される。一態様では、チオール含有化合物は、システインを含む。一態様では、チオール含有化合物は、双性イオンを含む。
一態様では、洗浄溶液中の水溶性チオール含有化合物は、ウォッシュオーバーを防止するために遊離捕捉オリゴヌクレオチドと競合する。ウォッシュオーバーとは、例えば、緩く結合した捕捉分子が表面から溶液、例えば、洗浄緩衝液、アッセイ希釈剤、又はサンプルに放出され、１つ以上の隣接する結合ドメインに移動するときに、捕捉分子が隣接する結合ドメインに再沈着することを指す。ウォッシュオーバーを減らすには、緩く結合した捕捉分子を除去し、再沈着を防止する必要がある。ウォッシュオーバーは、真の交差反応性がない場合でも、異なる分析物間の見かけの交差反応性を高める可能性がある。
理論に拘束されることを望まないが、洗浄溶液の作用機序は以下のとおり：洗浄溶液は、緩く結合した捕捉オリゴヌクレオチドを溶液にもたらし、そこから、ＳＨ共有結合又は他のメカニズムを介して表面に再沈着する可能性があると考えられている。捕捉オリゴヌクレオチドが、異なるヌクレオチド配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドを有する結合ドメイン上に再沈着される場合、それは汚染捕捉分子と考えられる。汚染捕捉分子の存在は、アッセイの結果を妨げる可能性がある。一態様では、洗浄溶液は、水溶性チオール含有化合物、例えばシステインを、捕捉オリゴヌクレオチドよりもはるかにモル過剰（少なくとも１０，０００倍）で含み、これにより、チオール含有化合物のチオール基が結合し、表面の利用可能な部位に結合するために、緩い捕捉オリゴヌクレオチドを打ち負かす。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（０．１％）は、ＳＨ基との表面反応性を不活性化し、トリス分子は、おそらく表面に結合する可能性のあるアミン基の存在が原因で、溶液中の結合を低減する。一態様では、本明細書に記載の方法によって調製されるアレイの結合ドメインは、約０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、又は０．０１％未満の汚染捕捉分子を含む。
一態様では、洗浄溶液は、チオール含有化合物、ｐＨ緩衝成分、界面活性剤、又はそれらの組み合わせを含み、約７～約９のｐＨを有する
一態様では、洗浄溶液は、約５ｍＭ～約７５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、約２５ｍＭ及び約７５ｍＭ、又は約５０ｍＭのシステインを含む。一態様では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００である。一態様では、洗浄は、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、又は約１５ｍＭ～約２５ｍＭ、又は約２０ｍＭのトリスなどの緩衝液を含む。一態様では、洗浄溶液は、約０．０５％～約０．５％、又は約０．０５％～０．２％、又は約０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００などの界面活性剤を含む。一態様では、洗浄溶液は、約７．５～約８．５、又は約８．０のｐＨを有する。一態様では、洗浄緩衝液は、約１５ｍＭ～約２５ｍＭのトリス、約ｐＨ８．０、約０．０５％～約０．１５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及び約２５ｍＭ～７５ｍＭのシステインを含む。より特定の態様では、洗浄溶液は、約２０ｍＭのトリス、約ｐＨ８．０、約０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及び約５０ｍＭのシステインを含む。
一態様では、洗浄溶液の１つ以上の成分が、乾燥形態でキットに提供される。一態様では、洗浄溶液の１つ以上の成分を再構成するための液体希釈剤がキットに提供される。
一態様では、キットは、標識を含む１つ以上の容器を含む。一態様では、標識は、放射性、蛍光、化学発光、電気化学発光、光吸収、光散乱、電気化学、磁気及び酵素標識から選択される。一態様では、標識は、電気化学発光標識を含む。一態様では、標識は、遷移金属を含む有機金属錯体を含む。一態様では、遷移金属は、ルテニウムを含む。一態様では、標識は、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識である。
一態様では、標識は、二次結合試薬の結合パートナーである一次結合試薬を含む。一態様では、二次結合試薬は、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、又は抗体を含む。一態様では、二次結合試薬は、アビジン、ストレプトアビジン、又は抗体を含む。一態様では、標識は、ビオチン、フルオレセイン、及びジゴキシゲニンから選択されるハプテンを含む。一態様では、標識は、第１のオリゴヌクレオチド配列を含む一次結合剤であり、二次結合試薬は、一次結合剤の第１のオリゴヌクレオチド配列に相補的である第２のオリゴヌクレオチド配列を含む。
一態様では、キットは、電気化学発光標識を含む１つ以上の容器を含む。より特定の態様では、キットは、トリス－ビピリジル－ルテニウム（ＲｕＢｐｙ）などのＲｕ含有又はＯｓ含有有機金属化合物を含む１つ以上の容器を含む。一態様では、標識は、遷移金属を含む有機金属錯体を含む。一態様では、遷移金属は、ルテニウムを含む。一態様では、標識は、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）標識（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含む。別の態様では、キットは、ルミノール又は他の関連化合物を含む１つ以上の容器を含む。
一態様では、キットは、１つ以上の電気化学発光共反応物を含む１つ以上の容器を含む。一態様では、１つ以上の電気化学発光共反応物は、支持体表面に共有結合的に又は非共有結合的に固定化されている。一態様では、１つ以上の電気化学発光共反応物が、支持体表面の１つ以上の作用電極に固定化されている。
一態様では、キットに含まれる標識は、一次結合試薬及び二次結合試薬を含む。一態様では、二次結合試薬は、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、又は抗体を含む。
一態様では、キットは、複数のアッセイに適合している。一態様では、キットは、再封可能なバッグ又は容器に含有されている。一態様では、バッグ又は容器は、実質的に水を透過しない。一態様では、バッグはホイル、例えば、アルミ化ホイルである。一態様では、キット及び試薬は乾燥状態で保存され、キットは、アッセイ試薬を乾燥状態に維持するための乾燥剤材料を含み得る。
一態様では、キットは、乾燥パッケージに包装された１つ以上の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む支持体表面を含む。一態様では、キットは、乾燥パッケージに包装される前にチオール含有洗浄溶液で洗浄された支持体表面を含む。一態様では、キットは、１つ以上の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む支持体表面を含み、支持体表面は、乾燥パッケージに包装される前にチオール含有洗浄溶液で洗浄されなかった。
一態様では、キットは、以下のアッセイ成分：１つ以上の非交差反応性捕捉オリゴヌクレオチド、１つ以上の緩衝液、例えば、洗浄緩衝液、ハイブリダイゼーション緩衝液、結合緩衝液、又は読み取り緩衝液のうちの１つ以上を含む。一態様では、ハイブリダイゼーション緩衝液は、核酸変性剤を含む。一態様では、核酸変性剤は、ホルムアミドを含む。一態様では、ハイブリダイゼーション緩衝液は、ハイブリダイゼーション緩衝液を形成するために組み合わせることができる２つの別個の成分として提供される。一態様では、結合緩衝液は、界面活性剤を含む。一態様では、読み取り緩衝液は、電気化学発光（ＥＣＬ）読み取り緩衝液を含む。
一態様では、ＥＣＬ読み取り緩衝液は、ＥＣＬ共反応体と呼ばれることができるＥＣＬ標識と相互作用する化合物を含む。一般的に使用される共反応物としては、三級アミン（例えば、ＵＳ５，８４６，４８５を参照）、オキサレート、及びＲｕ（Ｂｐｙ）３ ＋２からのＥＣＬ用の過硫酸塩、及びルミノールからのＥＣＬ用の過酸化水素（例えば、ＵＳ５，２４０，８６３を参照）が挙げられる。一態様では、ＥＣＬ共反応体は、三級アミンを含む。一態様では、ＥＣＬ共反応体は、三級アルキルアミンを含む。一態様では、ＥＣＬ共反応体は、三級ヒドロキシアルキルアミンを含む。一態様では、ＥＣＬ共反応体は、両性イオン性三級アミンを含む。一態様では、ＥＣＬ共反応体は、二次アミンを含む。一態様では、ＥＣＬ共反応体は、トリブチルアミン（ＴＢＡ）、（ジブチル）アミノエタノール（ＤＢＡＥ）、（ジエチル）アミノエタノール（ＤＥＡＥ）、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、ブチルジエタノールアミン（ＢＤＥＡ）、プロピルジエタノールアミン（ＰＤＥＡ）、エチルジエタノールアミン（ＥＤＥＡ）、メチルジエタノールアミン（ＭＤＥＡ）、ｔｅｒｔ－ブチルジエタノールアミン（ｔＢＤＥＡ）、ジブチルアミン（ＤＢＡ）、ブチルタノールアミン（ＢＥＡ）、ジエタノールアミン（ＤＥＡ）、ジブチルアミンプロピルスルホネート（ＤＢＡ－ＰＳ）、ジブチルアミンブチルスルホネート（ＤＢＡ－ＢＳ）、ブチルエタノールアミンプロピルスルホネート（ＢＥＡ－ＰＳ）、ブチルエタノールアミンブチルスルホネート（ＢＥＡ－ＢＳ）、ジエタノールアミンプロピルスルホネート（３－［ビス－（２－ヒドロキシ－エチル）－アミノ］－プロパン－１－スルホン酸、ＤＥＡ－ＰＳとしても知られている）、又はジエタノールアミンブチルスルホネート（ＤＥＡ－ＢＳ）から選択される。ＥＣＬ共反応体は、２０２０年７月１日に出願され、「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＡＳＳＡＹ ＭＥＡＳＵＲＥＭＥＮＴＳ」と題された米国特許第６３／０４７，１６７号に記載され、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一態様では、キットは、標識などの１つ以上のアッセイ成分を含む。一態様では、標識は、電気化学発光標識などの発光標識である。一態様では、キットは、少なくとも１つの電気化学発光共反応物を含む。一態様では、電気化学発光共反応物は、三級アミン、トリプロピルアミン、又はＮ－ブチルジエタノールアミンを含む。
一態様では、標識は、二次結合試薬の結合対である一次結合試薬を含む。一態様では、キットは、二次結合試薬を含む。一態様では、キットは、１つ以上のプレートウェルに乾燥形態の１つ以上のアッセイ成分を含む。一態様では、キットは、固有のキット識別子を含む。
一態様では、キットは、１つ以上の他のアッセイ成分を含む。一態様では、キットは、希釈剤、ブロッキング剤、安定剤、界面活性剤、塩、ｐＨ緩衝液、及び防腐剤を含むがこれらに限定されない１つ以上のアッセイを含む。一態様では、キットは、１つ以上のそのような成分の容器を含む。別の態様では、１つ以上の試薬が、キットに付属のアッセイ支持体表面に含まれている。
一態様では、キットは、１つ以上のプローブを１つ以上の標的ヌクレオチド配列に結合するための適切な条件を提供するために使用することができる結合緩衝液を含む。一態様では、結合緩衝液は、界面活性剤を含む。
一態様では、キットは、標識の存在を検出するための適切な条件を提供するために使用することができる読み取り緩衝液を含む。一態様では、キットは、例えば、三級アミン、トリプロピルアミン、及びＮ－ブチルジエタノールアミンを含む、１つ以上の電気化学発光共反応物を含む電気化学発光読み取り緩衝液を含む。一態様では、キットは、使用説明書又は固有のキット識別子を含む。
一態様では、キットは、標的ヌクレオチド配列における一塩基多型を検出するための１つ以上のアッセイ成分を含む。一態様では、キットは、以下の成分：目的の核酸中の標的配列に相補的な配列を含む標識オリゴヌクレオチドプローブ、１つ以上のブロッキングプローブ、１つ以上のヌクレオシド三リン酸、１つ以上の標識ヌクレオシド三リン酸、標識ジデオキシヌクレオシド三リン酸、リガーゼ、又はポリメラーゼのうちの１つ以上を含む。
一態様では、キットは、目的の核酸中の標的配列に相補的な第１の配列及び捕捉オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドタグを有する１つ以上の標識オリゴヌクレオチドプローブを含む。
一態様では、キットは、例えば、リガーゼ緩衝液又はＤＮＡリガーゼを含む、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイを使用して標的ヌクレオチド配列を同定、検出又は定量化するための１つ以上のアッセイ成分を含む。
一態様では、キットは、サンプル中の１つ以上の標的ヌクレオチド配列を検出、同定、又は定量化するための１つ以上のアッセイ成分を含み、１つ以上の標的ヌクレオチド配列は多型ヌクレオチドを含む。一態様では、キットは、オリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１つの対を含む。一態様では、キットは、複数の標的ヌクレオチド配列のための複数の対のオリゴヌクレオチドプローブを含む。一態様では、オリゴヌクレオチドプローブの対は、標的化プローブ及び検出プローブを含む。一態様では、標的化プローブは、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドタグ及びサンプル中の標的ヌクレオチド配列の第１の領域に相補的である第１の核酸配列を含む。一態様では、検出プローブは、標識及び、標的化プローブ配列の第１の核酸配列が相補的である第１の領域に隣接する標的ヌクレオチド配列の第２の領域に相補的である第２の核酸配列を含み、標的化又は検出プローブは、標的ヌクレオチド配列の多型ヌクレオチドの上に位置する末端３’又は５’ヌクレオチドを含む。一態様では、標識は、検出プローブの３’末端に付着している。
一態様では、標的化プローブは、検出プローブの５’末端ヌクレオチドが相補的である領域に隣接する標的ヌクレオチド配列の領域に相補的な末端３’ヌクレオチドを有する。一態様では、検出プローブの末端５’ヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列の多型ヌクレオチドに相補的である。
一態様では、キットは、標的ヌクレオチド配列に結合する第１及び第２の検出プローブを含み、第１及び第２の検出プローブは、末端５’ヌクレオチドのみが異なる。一態様では、第１の検出プローブは野生型配列に相補的であり、第２の検出プローブは変異配列に相補的である。
一態様では、キットは、リガーゼを含む。一態様では、キットは、１つ以上のヌクレオシド三リン酸を含む。
一態様では、キット又は方法は、１つ以上のブロッキングプローブを含む。一態様では、１つ以上のブロッキングプローブを使用して、例えば、がん変異のまれな又は低アレル画分の検出のために、アッセイ感度を高める。一態様では、ブロッキングプローブを使用して、テンプレート分子が非ライゲーションプローブを捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイズして非ライゲーションプローブから偽シグナルを生成することができる複合体に架橋するのを防止することにより、ＯＬＡアッセイにおけるバックグラウンドシグナルを低減する。一態様では、ブロッキングプローブは、標的ヌクレオチド配列に相補的であり、プローブライゲーション部位にまたがる一本鎖ヌクレオチド配列を含むが、タグ又は標識を含まない。一態様では、ブロッキングプローブは、プローブ配列とほぼ同一直線上にある。一態様では、ＯＬＡアッセイで使用される野生型又は多様型標的化プローブと同一の配列を有する第１のブロッキングプローブと、検出プローブと同一の配列を有する第２のブロッキングプローブとを含むが、５’リン酸又は３’標識は含まない一対のブロッキングプローブが使用される。
一態様では、ブロッキングプローブは、少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、４５若しくは５０、及び最大約５０、７５、１００、１５０、若しくは２００、又は約２０～約２００、若しくは約５０～約１００個のヌクレオチドを含む。一態様では、一対のブロッキングプローブがライゲーション反応混合物に含まれ、第１のブロッキングプローブは、接続プローブと同一である配列を有するが、オリゴヌクレオチドタグを有さず、第２のブロッキングプローブは、検出プローブと同一の配列を有するが、標識を有しない。一態様では、最大２、３、４又は５個の追加のヌクレオチドを、プローブ配列に隣接する標的ヌクレオチド配列に相補的であるブロッキングプローブの５’及び３’末端に付加することができる。一態様では、キットは、各対のオリゴヌクレオチドプローブに対して少なくとも１対のブロッキングプローブを含む。
一態様では、キットは、プライマー伸長アッセイで使用するための１つ以上の成分を含む。一態様では、キットは、プライマー伸長アッセイで使用するための１つ以上の標的化プローブを含む。一態様では、キットは、サンプル中の複数の標的ヌクレオチド配列に相補的である標的化核酸配列を含む複数のプローブを含む。一態様では、キットは、例えば、ポリメラーゼ、１つ以上のヌクレオシド三リン酸又は１つ以上のジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を含む、プライマー伸長アッセイのための他のアッセイ成分を含む。一態様では、キットは、１つ以上の標識又は非標識ヌクレオシド三リン酸を含む。一態様では、キットは、標識又は非標識ジデオキシヌクレオシド三リン酸を含む。
一態様では、標的化プローブは、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドタグ、サンプル中の標的ヌクレオチド配列に相補的である標的化核酸配列、及び標識を含む。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、標的化プローブの５’末端に付着し、標的化核酸配列は、サンプル中の１つ以上の標的ヌクレオチド配列の多型ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドに相補的である３’末端を有する。一態様では、オリゴヌクレオチドタグは、標的化プローブの５’末端に付着し、標的化核酸配列は、サンプル中の１つ以上の標的ヌクレオチド配列の多型ヌクレオチドに相補的な末端３’ヌクレオチドを含む。
一態様では、キットは、キットに付属する支持体表面上の捕捉オリゴヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドタグ及び標的分析物に特異的な結合パートナーを含む１つ以上の標的特異的プローブを含む。一態様では、キットは、オリゴヌクレオチドタグ及び１つ以上の標的分析物中の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列を有する１つ以上の標的特異的プローブを含む。一態様では、エンドユーザは、目的の１つ以上の標的分析物について、１つ以上の標的特異的プローブを生成する。
一態様では、キットは、標識ヌクレオシド三リン酸を含む。一態様では、キットは、標識ヌクレオシド三リン酸及び二次結合試薬を含む。一態様では、標識ヌクレオシド三リン酸は、二次結合試薬の結合パートナーである一次結合試薬を含む。一態様では、二次結合試薬は、アビジン、ストレプトアビジン、又は抗体を含み、標識ヌクレオシド三リン酸は、ビオチン又はハプテン標識を含む。一態様では、標識ヌクレオシド三リン酸は、放射性、蛍光、化学発光、電気化学発光、光吸収、光散乱、電気化学、磁気及び酵素標識を含む。一態様では、キットは、電気化学発光標識で標識されたヌクレオシド三リン酸を含む。一態様では、キットは、標的ヌクレオチド配列の多型ヌクレオチドに相補的な標識ジデオキシヌクレオチド三リン酸を含む。
一態様では、キットは、マルチウェルプレート、例えば、９６ウェルプレートなどの支持体表面を含み、マルチウェルプレートの各ウェルは、１つ以上の結合ドメインに固定化された１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、マルチウェルプレートの各ウェルは、１～１０個の結合ドメインを含み、固有の捕捉オリゴヌクレオチドは、ウェル内の各結合ドメインに固定化されている。一態様では、キットはまた、以下の反応成分：洗浄緩衝液、ハイブリダイゼーション緩衝液、標識、希釈剤、及び読み取り緩衝液のうちの１つ以上を含む。一態様では、洗浄緩衝液は、チオール含有化合物を含む。一態様では、洗浄緩衝液は、水溶液である。一態様では、チオール含有化合物は水溶性であり、約２００ｇ／モル、１７５ｇ／モル、１５０ｇ／モル、又は１２５ｇ／モル未満の分子量を有する。一態様では、チオール含有化合物は、システイン、システアミン、ジチオスレイトール、３－メルカプトプロプリオネート、３－メルカプト－１－プロパンスルホン酸、及びそれらの組み合わせから選択される。一態様では、チオール含有化合物は、システインを含む。一態様では、標識は、電気化学発光標識を含む。一態様では、標識は、二次結合パートナーを含む。一態様では、標識は、ストレプトアビジンで標識付けされたＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ－Ｔａｇを含む。
一態様では、サンプル中の標的ヌクレオチド配列を検出するためのキットが提供される。一態様では、このキットは、
（ａ）１つ以上の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む支持体表面と、
（ｂ）オリゴヌクレオチドタグ、標的補体、及び検出オリゴヌクレオチドを含む検出プローブと、
（ｃ）増幅テンプレートと、
（ｄ）核酸リガーゼと、
（ｅ）核酸ポリメラーゼと、
（ｆ）標識及び核酸配列を含む検出試薬と、を含む。
一態様では、キットはまた、オリゴヌクレオチドタグ及びアンカーオリゴヌクレオチドを含むアンカー試薬を含む。一態様では、アンカー試薬は、支持体表面に固定化されている。一態様では、アンカーオリゴヌクレオチドは、約１０～約３０の核酸の長さである。一態様では、アンカーオリゴヌクレオチドは、１７又は２５オリゴヌクレオチドの長さである。一態様では、アンカーオリゴヌクレオチドは、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡ－３’（配列番号１６６９）を含むヌクレオチド配列を有する。一態様では、アンカーオリゴヌクレオチドは、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＧＣＣＧＴＣＡＡ－３’（配列番号１６６５）からなるヌクレオチド配列を有する。
一態様では、キットは、５’末端ヌクレオチド配列及び３’末端ヌクレオチド配列を有する直鎖増幅テンプレートを含む。一態様では、５’及び３’末端ヌクレオチド配列は、検出配列にハイブリダイズすることができる。一態様では、増幅テンプレートは、アンカー試薬のアンカー配列の相補体にハイブリダイズすることができる内部ヌクレオチド配列を有する。一態様では、増幅テンプレートの５’及び３’末端ヌクレオチド配列は、内部配列と重複しない。一態様では、増幅テンプレートは、アンカー試薬のアンカー配列の相補体にハイブリダイズすることができる第１の内部ヌクレオチド配列と、検出試薬の核酸配列の相補体にハイブリダイズすることができる第２の内部ヌクレオチド配列とを有する。一態様では、増幅テンプレートの５’及び３’末端ヌクレオチド配列は、第１及び第２の内部配列と重複しない。一態様では、増幅テンプレートは、５′末端ホスフェート基を含む。
一態様では、増幅テンプレートは、約５３～約６１ヌクレオチドの長さである。一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＧＴＴＣＴＧＴＣ－３’（配列番号１６６６）の５’末端配列及び５’－ＧＴＧＴＣＴＡ－３’（配列番号１６６７）の３’末端配列を有する。一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧ－３’（配列番号１６６８）を含むヌクレオチド配列を有する。一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡ－３’（配列番号１６６９）を含むヌクレオチド配列を含む。一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＧＴＴＣＴＧＴＣＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＡ－３’（配列番号１６７０）からなるヌクレオチド配列を有する。一態様では、増幅テンプレートは、５’－ＧＣＴＧＴＧＣＡＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＡ－３’（配列番号１６７１）を含むヌクレオチド配列を有する。
一態様では、増幅テンプレートは、環状増幅テンプレートである。
一態様では、検出プローブは、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグ、一本鎖ＲＮＡ標的相補体、及び一本鎖ＤＮＡ検出オリゴヌクレオチドを含む。一態様では、アンカー試薬は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグ及び一本鎖ＤＮＡアンカー配列を含む。一態様では、キットは、ＲＮａｓｅを含む。
一態様では、検出プローブの検出オリゴヌクレオチドは、増幅テンプレートの５’末端配列に相補的な第１の配列と、増幅テンプレートの３’末端配列に相補的な隣接する第２の配列とを含む。一態様では、検出試薬の核酸配列は、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴ－３’（配列番号１６７２）の１４又は１５個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％配列同一性を有する配列を有する。一態様では、検出試薬の核酸配列は、配列５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴ－３’（配列番号１６７２）を含む。一態様では、検出試薬の核酸配列は、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧ－３’（配列番号１６６８）を含む。
一態様では、検出試薬の標識は、電気化学発光（ＥＣＬ）標識を含む。
一態様では、支持体表面は、カーボンベースの支持体表面を含む。一態様では、支持体表面は、カーボンベースの電極を含む。一態様では、支持体表面は、カーボンインク電極を含む。一態様では、支持体表面はマルチウェルプレートアッセイの消耗品を含み、プレートの各ウェルはカーボンインク電極を含む。
一態様では、支持体表面は、ビーズを含む。
一態様では、複数の捕捉オリゴヌクレオチドが、個別の結合ドメイン内の固相支持体上に固定化され、アレイを形成する。一態様では、複数捕捉オリゴヌクレオチド及び少なくとも１つのアンカー試薬は、個別の結合ドメイン内の固相支持体上に固定化され、アレイを形成し、各結合ドメインは、複数の捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つ及び少なくとも１つのアンカー試薬を含む。
一態様では、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドは、以下の要件、
（ａ）約４０％～約５０％のＧＣ含量と、
（ｂ）約３０％～約７０％のＡＧ含量と、
（ｃ）約３０％～約７０％のＣＴ含量と、
（ｄ）３つ以下の配列での塩基リピートの最大列と、
（ｅ）７つを超える相補的塩基対が連続して一致する列との望ましくないオリゴヌクレオチド－オリゴヌクレオチドの相互作用がないことと、
（ｆ）１８個以下の連続した塩基の列との望ましくないオリゴヌクレオチド－オリゴヌクレオチドの相互作用がないことであって、
（ｉ）両端の末端塩基が相補的に一致しており、
（ｉｉ）前記相補的塩基対の一致の合計から不一致の合計を引いたものが７より大きい、相互作用がないことと、
（ｇ）ゲノム又は自然界における配列又は配列の補体、あるいはその両方に一致する２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６塩基対以上の列がないことと、
（ｈ）それらの補体を有する配列のハイブリダイゼーションの自由エネルギーの差は、約１ｋＣａｌ／モル、約２ｋＣａｌ／モル、約３ｋＣａｌ／モル、又は約４ｋＣａｌ／モル未満であることと、
（ｉ）ステム内に４つ以上の連続した一致がある予測ヘアピンループがないことと、
（ｊ）前記ステム内に４つ以上の連続した一致があり、ループサイズが６塩基を超える予測ヘアピンループがないことと、のうちの１つ以上を満たす非交差反応性オリゴヌクレオチドのセットから選択される。
一態様では、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１～６４から選択される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｂ）配列番号１～６４から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｃ）配列番号１～６４から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｄ）配列番号１～６４から選択される配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｅ）（ａ）～（ｄ）のうちのいずれかから選択される捕捉オリゴヌクレオチドと、から選択される。
一態様では、支持体表面に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１～１０から選択される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｂ）配列番号１～１０から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｃ）配列番号１～１０から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｄ）配列番号１～１０から選択される配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
（ｅ）（ａ）～（ｄ）のうちのいずれかから選択される捕捉オリゴヌクレオチドと、から選択される。
一態様では、サンプル中の標的ヌクレオチド配列を検出するためのキットが提供され、
（ａ）１つ以上の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む支持体表面と、
（ｂ）オリゴヌクレオチドタグ及びアンカーオリゴヌクレオチドを含むアンカー試薬と、
（ｃ）オリゴヌクレオチドタグ、標的補体、及び一本鎖ＤＮＡ検出オリゴヌクレオチドを含む検出プローブと、
（ｄ）電気化学発光（ＥＣＬ）標識及び核酸配列を含む検出試薬と、
（ｅ）５’末端ヌクレオチド配列及び３’末端ヌクレオチド配列を含む直鎖増幅テンプレートであって、５’及び３’末端ヌクレオチド配列は、検出配列にハイブリダイズすることができ、第１の内部ヌクレオチド配列は、アンカー試薬のアンカー配列の相補体にハイブリダイズすることができ、第２の内部ヌクレオチド配列は、検出試薬の核酸配列の相補体にハイブリダイズすることができ、増幅テンプレートの５’及び３’末端ヌクレオチド配列は、第１及び第２の内部配列と重複しない、直鎖増幅テンプレートと、
（ｆ）核酸リガーゼと、
（ｇ）核酸ポリメラーゼと、を含む。
一態様では、アンカー試薬は、支持体表面に固定化されている。一態様では、アンカー試薬は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグ及び一本鎖ＤＮＡアンカーオリゴヌクレオチドを含み、検出プローブは、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグ、一本鎖ＲＮＡ標的補体及び一本鎖ＤＮＡ検出オリゴヌクレオチドを含み、キットは、ＲＮａｓｅを更に含む。
一態様では、サンプル中の標的ヌクレオチド配列を検出するためのキットが提供され、
（ａ）固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む支持体表面と、
（ｂ）一本鎖オリゴヌクレオチドタグ及びサンプル中の標的ヌクレオチド配列の第１の領域に相補的である第１の核酸配列を含む標的化プローブと、
（ｃ）検出オリゴヌクレオチド及び標的ヌクレオチド配列の第２の領域に相補的である第２の核酸配列を含む検出プローブであって、標的化プローブの第１の核酸配列及び検出プローブの第２の核酸配列が、標的ヌクレオチドの隣接する配列に相補的である、検出プローブと、
（ｄ）増幅テンプレートと、
（ｅ）核酸リガーゼと、
（ｆ）核酸ポリメラーゼと、
（ｇ）標識及び核酸配列を含む検出試薬と、を含む。
一態様では、標的化プローブは、検出プローブの５’末端ヌクレオチドが相補的である領域に隣接する標的ヌクレオチド配列の領域に相補的な末端３’ヌクレオチドを有する。一態様では、標的化プローブの末端３’ヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列の多型ヌクレオチドに相補的である。
一態様では、サンプル中の標的ヌクレオチド配列を検出するためのキットが提供され、
（ａ）固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む支持体表面と、
（ｂ）オリゴヌクレオチドタグ及びアンカーオリゴヌクレオチドを含むアンカー試薬と、
（ｃ）一本鎖オリゴヌクレオチドタグ及びサンプル中の標的ヌクレオチド配列の第１の領域に相補的である第１の核酸配列を含む標的化プローブと、
（ｄ）検出オリゴヌクレオチド及び標的ヌクレオチド配列の第２の領域に相補的である第２の核酸配列を含む検出プローブであって、標的化プローブの第１の核酸配列及び検出プローブの第２の核酸配列が、標的ヌクレオチドの隣接する配列に相補的である、検出プローブと、
（ｅ）５’末端ヌクレオチド配列及び３’末端ヌクレオチド配列を含む直鎖増幅テンプレートであって、５’及び３’末端ヌクレオチド配列は、検出配列にハイブリダイズすることができ、第１の内部ヌクレオチド配列は、アンカー試薬のアンカー配列の相補体にハイブリダイズすることができ、第２の内部ヌクレオチド配列は、検出試薬の核酸配列の相補体にハイブリダイズすることができ、増幅テンプレートの５’及び３’末端ヌクレオチド配列は、第１及び第２の内部配列と重複しない、直鎖増幅テンプレートと、
（ｆ）核酸リガーゼと、
（ｇ）核酸ポリメラーゼと、
（ｈ）電気化学発光（ＥＣＬ）標識及び核酸配列を含む検出試薬と、を含む。
一態様では、キットは、直鎖増幅テンプレート並びにライゲーション緩衝液、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、及びこれらの組み合わせから選択される１つ以上の追加の成分を含む検出混合物を含む。一態様では、検出混合物は、ＢＳＡ、緩衝液、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、又はそれらの組み合わせから選択される、ローリングサークル増幅のための１つ以上の成分を含む。一態様では、検出混合物は、アセチルＢＳＡを含む。
一態様では、キットは、ＥＣＬ読み取り緩衝液を含む。
Ｒ．データベース
疾患及び障害の遺伝的関連についての情報を提供し、以下を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の方法及びキットに関連して使用できる情報及び配列を提供する様々なデータベースが利用可能である。
遺伝的関連データベース
複雑な疾患及び障害からの遺伝的関連データのデータベース。２０１４年９月１日現在、データベースは「凍結」されている。しかしながら、２０１４年８月１８日現在の全てのデータは、テキスト又はＳＱＬ形式
ｇｅｎｅｔｉｃａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｄｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖでダウンロードできる。
ＣｌｉｎＶａｒ
ＮＣＢＩデータベースには、病原性、変異の種類などによって結果を表示するためのフィルターが含まれている。
ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｌｉｎｖａｒ？ｔｅｒｍ＝ｈｕｍａｎ％５Ｂｏｒｇｎ％５Ｄ
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
一般的な目的の遺伝子のリストを提供する。
ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｔｏｏｌｓ－ａｎｄ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｕｓａｇｅ－ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ／ｇｅｎｅｔｉｃ－ｍａｒｋｅｒｓ
Ｇｅｎｏｍｅ ｉｎ ａ ｂｏｔｔｌｅ（ＧＩＡＢ）（生物学における計測学のための共同イニシアチブ）
ＮＩＳＴが主催する官民学術コンソーシアムは、ヒトゲノムの全塩基配列を臨床診療に橋渡しできるようにするための技術インフラストラクチャを開発する。高度に特徴付けられた参照物質のゲノムを提供する
ｊｉｍｂ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｇｉａｂ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／
ＥＮＳＥＭＢＬゲノムブラウザ
Ｅｎｓｅｍｂｌは、脊椎動物ゲノム用のゲノムブラウザであり、ゲノミクス研究用の参照データセット及び分析ツールを作成、統合、及び配布する。
ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ
ＣＯＳＭＩＣゲノムブラウザ
がんで見つかった体細胞変異のカタログを提供する
ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｏｓｍｉｃ／ｂｒｏｗｓｅ／ｇｅｎｏｍｅ
ＮＣＩゲノムデータコモンズ
精密医療をサポートするがんゲノム研究間でのデータ共有を可能にする統合データリポジトリをがん研究コミュニティに提供する。
ｐｏｒｔａｌ．ｇｄｃ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ
ＮＣＢＩリソース
ＳＮＰ及びその他の多様体（挿入、欠失、転座など）をカバーするｄｂＳＮＰ及びｄｂＶＡＲ
ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐ
ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｂｖａｒ
ゲノム多様体アーカイブのデータベース
全ての種で、公開されているゲノム構造多様体のアーカイブ、系統、及び分布を提供するリポジトリ。
ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｄｇｖａ
ＩＧＳＲ：国際ゲノムサンプルリソース
１０００ゲノムプロジェクトのリポジトリ
ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｄａｔａ
ＩｎＳｉＧＨＴ多様体データベース
ＩｎＳｉＧＨＴは、消化器がんの原因となる遺伝子で再配列決定されたＤＮＡ多様体の最も包括的なデータベースを収容及びキュレートする。
ｉｎｓｉｇｈｔ－ｇｒｏｕｐ．ｏｒｇ／ｖａｒｉａｎｔｓ／ｄａｔａｂａｓｅｓ
ＵＣＳＣゲノムブラウザ
ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ
Ｓ．参照による組み込み
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書で引用された全ての参考文献、及びそれらがまだ含まれていない範囲で、そこに引用された参考文献は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ｔ．捕捉オリゴヌクレオチド
Ｕ．オリゴヌクレオチドタグ
Ｖ．サンプルシグナル増幅試薬
実施例
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて、方法の様々な変更が、前述の説明及び付随する図から当業者に明らかになるであろう。このような変更は、特許請求の範囲内に含まれることを意図している。
実施例１．非相互作用捕捉オリゴヌクレオチドの選択
ソフトウェアを使用して、１００，０００～１，０００，０００のヌクレオチド配列のグループをランダムに生成した。３６ｍｅｒの複数のグループが作成された。各グループ内で、ＧＣ含量（４０％≦ＧＣ含量≦５０％）、ＡＧ含量（３０％≦ＡＧ含量≦７０％）及びＣＴ含量（３０％≦ＣＴ含量≦７０％）の基準を満たさない配列が除外され、ＧＣ（又はＡＧ又はＣＴ）含量は、Ｇ又はＣ（又はそれぞれ、Ａ若しくはＧ、又はＣ若しくはＴ）であるヌクレオチドのパーセンテージを指す。配列は、３塩基より長い塩基リピートの伸長がある場合にも除外された。グループ内で、非相互作用配列のセットが、グループから最初にランダムに選択された配列を起点として反復プロセスにより選択された。すでにセット内にある配列との相互作用が予測されないことに基づいて、追加の配列は一度に１つずつセットに付加された。配列が以下の基準を満たしている場合、配列がセットに付加された。配列自体、セットの前のメンバー、又はセットの前のメンバーの補体との配列のアラインメントが、（ａ）連続した一連の７つを超える相補的塩基対が連続して一致する場合、又は（ｂ）１８塩基以下の配列がある場合が見つからず、（ｉ）両端の末端塩基が相補的一致であり、（ｉｉ）相補的塩基対の合計塩基対の一致から不一致の合計を引いたものが７より大きかった。このアプローチを使用して、およそ５０～１５０の配列のセットを同定することができた（例えば、配列番号１～６４、６５～１２２及び１２３～１８６）。追加のセットは、元のセットのうちの１つにある全ての配列の補体をリバースさせるか、見つけることによって作成できる（例えば、配列番号１８７～２５０、２５１～３０８、３０９～３７２、３７３～４３６、４３７～４９４、４９５～５５８、５５９～６２２、６２３～６８０、及び６８１～７４４）。配列は十分に長いため、自然界で一致する配列を見つける確率は非常に低い。選択したセットをヒトゲノムと比較してＢＬＡＳＴ検索したところ、２０塩基対より長い一致又は相補的な配列は見つからなかった。セットの１つからの１０個の配列及び３０個の配列のサブセット（それぞれ、配列番号１～１０、１１～１３、２５～２６、３３～３７、４２、４４～４６、５４及び５９～６２）が、３６ｍｅｒのフルセットの自由エネルギーの分布のほぼ中央に位置する（計算された自由エネルギーは約２４～約２２ｋｃａｌ／モルの範囲）ハイブリダイゼーションの自由エネルギー（３５ｍｅｒの５’端を起点として３６ｍｅｒ配列の最初の２４ヌクレオチドに相補的な２４ｍｅｒプローブへのハイブリダイゼーションの場合）を有するとして選択された。１０個のオリゴヌクレオチドセットを使用して、これらの配列を以下の実施例において捕捉試薬として使用する方法を示した。
実施例２．捕捉オリゴヌクレオチドアレイの形成
アレイは、１０スポット９６ウェルＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ（登録商標）プレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ．）上に形成された。これらの９６ウェルプレートは、射出成形された９６ウェルプレートの上部を、ウェルの下部を定義するマイラーシートに接着することによって形成される。マイラーシートの上面には、スクリーン印刷されたカーボンインク電極が印刷されており、各ウェルは、ウェルのほぼ中央にカーボンインク作用電極を含み、ウェルのほぼ２つの端に向かって２つのカーボンインク対電極を含む。作用電極は、アレイ要素の位置を定義する露出した作用電極（又は「スポット」）の１０個のほぼ円形の領域を定義するパターンでその上に印刷された誘電体（すなわち、電気絶縁性インク）を有する。マイラーシートの下部に印刷され、導電性の貫通穴を介してシートの上部に接続された電極は、作用電極及び対電極に電圧を印加するための接点を提供する。統合されたカーボンベースの電極を備えたプレートの説明については、例えば、米国特許第６，９７７，７２２号及び同第７，８４２，２４６号を参照されたい。
配列番号１～１０の捕捉オリゴヌクレオチドアレイは、チオール修飾捕捉オリゴヌクレオチドを含有する５０ｎＬの液滴を沈着させることによってこれらのプレートに印刷された（以下の構造に示す電極上の個々のスポットにある６ｍｅｒポリエチレングリコール（ＰＥＧ６）スペーサーを介してオリゴヌクレオチドの３’末端に連結されたｎ－メルカプトプロパノール修飾を使用）。印刷溶液には、リン酸ナトリウム、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、トレハロース、及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有する緩衝液中にチオールオリゴヌクレオチドが含まれ、カーボンインク表面を飽和させるのに必要な量に対してオリゴヌクレオチドが過剰であり、液滴が印刷された誘電性インク層によって定義されるように、スポットの端に広がるのに十分なＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が含まれる。液滴を一晩乾燥させ、その間にオリゴヌクレオチドがカーボンインク表面に結合した。プレートは、乾燥剤を含む密封されたポーチに包装された。
実施例３．アレイ内の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するビオチン標識オリゴヌクレオチドを測定するための手順
この手順では、捕捉オリゴヌクレオチドアレイを備えたプレートを実施例２に記載のように調製し、例えば、サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）及びポリメラーゼ伸長アッセイ（ＰＥＡ）のビオチン標識生成物を測定するために使用した。この手順には、アレイを最初にブロッキング溶液で処理して、非特異的スポットの交差汚染を防止しながら、過剰な固定化されていない捕捉オリゴヌクレオチドを溶解する最初のブロッキングステップが含まれた。全体的な手順としては、以下のステップが含まれた。
１．ブロッキング
２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０（トリスはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを指す）中に５０ｍＭのＬ－システイン及び０．１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有する５０ｕＬの溶液を各ウェルに添加した。プレートを振とうしながら室温（又は３７℃）で３０～６０分間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でウェルを３回洗浄することにより、ブロッキングステップを完了した。
２．サンプルの添加
２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０中に３１％ホルムアミド、４００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有する緩衝液中にビオチン標識生成物を含有する５０ｕＬの試験サンプルを、各ウェルに添加した。サンプルを添加した後、プレートを振とうしながら３７℃で１時間インキュベートして、ストリンジェントな結合条件を提供し、室温で５分間冷却し、ＰＢＳで３回洗浄した。
３．ストリンジェントな条件下での高温浸漬（任意選択の）
５０ｕＬの０．１倍ＰＢＳ（塩濃度 約１５ｍＭ）を各ウェルに添加し、プレートを振とうしながら３０分間３７℃でインキュベートし、その後プレートを室温で５分間冷却し、ＰＢＳで３回洗浄した。このオプションのステップは、例えば、ビオチン標識ＯＬＡ生成物の誤った捕捉オリゴヌクレオチドへの非特異的結合を最小限に抑えることによって、又は非共有ハイブリダイゼーション相互作用を介したビオチンへの指向性配列の結合を防止することによって、ＯＬＡアッセイなどのアッセイにおける特異性を改善する。
４．二次結合試薬の添加
ビオチン標識プローブを検出するために、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０にＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ ＥＣＬ標識（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ．）で標識された１ｕｇ／ｍＬのストレプトアビジンを含有する５０ｕＬの溶液を各ウェルに添加し、プレートを振とうしながら３０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。
５．ＥＣＬ検出
ＥＣＬ標識からＥＣＬを測定するために、ＥＣＬ共反応物としてブチルジエタノールアミン（ＢＤＥＡ）を含有する１５０ｕＬのＥＣＬ読み取り緩衝液（２０１９年１月３日に出願されたＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＣＡＲＲＹＩＮＧ ＯＵＴ ＡＳＳＡＹ ＭＥＡＳＵＲＥＭＥＮＴＳと題された係属中の特許出願６２／７８７，８９２を参照）を各ウェルに添加し、プレートをＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ６００又はＱｕｉｃｋＰｌｅｘ ＳＱ１２０ＥＣＬプレートリーダで分析した。プレートリーダは、プレートの下部にある電気接点に接触し、各ウェル内の作用電極及び対極に電圧波形を印加し、ＥＣＬを画像化し、各アレイ要素からの総ＥＣＬ放出に比例するＥＣＬシグナルを報告した。
実施例４．捕捉オリゴヌクレオチドアレイの均一性及び交差反応性
実施例２に記載のように調製された多くのプレートを、コーティングの均一性及びアレイ要素間の交差反応性について、捕捉オリゴヌクレオチド（配列番号７４５～７５４）の第１の２４個のヌクレオチド（５’末端から）に相補的であるビオチン含有ＱＣプローブのセットを使用して試験した。オプションの高温浸漬ステップなしで、実施例３に記載された手順に従ってプレートを試験した。使用されたＱＣプローブには、以下の構造に示すように、ビオチン修飾で３’末端が修飾されたプローブが含まれていた。
コーティングの均一性を測定するために、６枚のプレートの全てのウェルを２ｐＭの１０個のビオチン標識ＱＣプローブの混合物、及び２ｎＭの同じプローブの非ビオチン修飾バージョンを含有するサンプルで試験した。各捕捉オリゴヌクレオチドからのＥＣＬシグナルの平均及びプレート内変動係数（ＣＶ）（すなわち、所与のプレートの所与のスポットからのシグナルの平均及びＣＶ）を決定した。６枚のプレート全体の平均プレート内ＣＶは、全ての捕捉オリゴヌクレオチドで５％未満であり、３．６％～４．６％の範囲であった。プレート内シグナル平均のＣＶは、全ての捕捉オリゴヌクレオチドで６％未満であり、３．５％～５．５％の範囲であった。
アレイの特異性（非相補的配列の結合又は捕捉オリゴヌクレオチドの交差汚染のいずれかからの交差反応性を含む）を測定するために、２００ｐＭの個々のビオチン標識ＱＣプローブを含有するサンプルを、１枚のプレートに添加した（ＱＣプローブ当たり８個の複製、１６個のブランクサンプル）。各非特異的捕捉ヌクレオチドに対する個々のＱＣプローブの交差反応性の中央値は、各特異性サンプルの８個の複製について決定され、各ウェルについての交差反応性は、プローブの非特異的捕捉ヌクレオチドを有するスポットへの結合によるシグナルと同様に、プローブのその特異的相補的捕捉ヌクレオチドを有するスポットへの結合によるシグナルのパーセンテージとして計算された（ＱＣプローブがない場合の非特異的バックグラウンドシグナルの補正後）。９０の可能な非特異的プローブ／捕捉相互作用について、８１（９０％）は、０．０１％以下の交差反応性を示し、最大の交差反応性は０．０３％であった。
実施例５．捕捉オリゴヌクレオチドのリンカーの比較
モデル１２ｍｅｒ捕捉オリゴヌクレオチド及びモデル２４ｍｅｒ捕捉オリゴヌクレオチドを使用して、オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドをカーボンベースの電極に連結するために使用されるチオールとの間の異なる長さのリンカーの使用を比較した。リンカーには、実施例２に記載のＰＥＧ６スペーサーを有するリンカー、３ｍｅｒのポリエチレングリコール（ＰＥＧ３）スペーサーを除く類似のリンカー、及び以下に示すポリエチレングリコールスペーサーを含まないリンカーが含まれた。
捕捉オリゴヌクレオチドを、実施例２に記載のように９６ウェルプレートの炭素電極に固定化し、ホルムアミドの非存在下で室温でハイブリダイゼーションを実行したことを除いて、実施例４に記載の条件と同様の条件下で、捕捉配列に相補的なビオチン修飾ＱＣプローブの様々な濃度で試験した。図３は、異なるリンカーのウェル内のプローブ分子数の関数として測定されたＥＣＬシグナルを示し、ＱＣプローブの捕捉オリゴヌクレオチドへの結合からのＥＣＬシグナルが、１２ｍｅｒ及び２４ｍｅｒ捕捉オリゴヌクレオチドの両方のリンカーの長さとともに増加したことを示している。
実施例６．アレイを調製するためのブロッキング条件の比較
アレイから過剰な捕捉オリゴヌクレオチドを除去するためのブロッキング条件を比較した。印刷されたアレイを備えたプレートは、実施例２に記載されるように調製され、ブロッキング溶液の組成を変えることを除いて、実施例４に記載されるようにブロック及び洗浄された。次いで、アレイの特異性を、実施例４に記載されているように特徴付けた。図４は、他の捕捉オリゴヌクレオチドに相補的なＱＣプローブへの曝露から生じる、配列番号５の捕捉オリゴヌクレオチドとのスポットに対する交差反応性を示している。この図は、ブロッキングステップを省略すると、異なるスポットでの捕捉オリゴヌクレオチドの交差汚染により、有意な交差反応性が観察されることを示している。ＰＢＳにＢＳＡを含む従来のブロッキング溶液では、わずかな改善しか見られなかった。トリス＋Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００をブロッキング溶液として使用すると、観察された交差反応性が大幅に改善する。トリス／Ｔｒｉｔｏｎ製剤にシステインを添加すると、交差反応性が検出不可能なレベル（≦０．０１％）に更に低減する。しかしながら、製剤にＢＳＡを添加しても、同じ改善は見られなかった。別の実験では、５～５０～５００ｍＭの範囲のシステイン濃度がブロッキングに効果的であることが決定され、システインではなくＢＳＡでのブロッキングが、それらの相補的捕捉オリゴヌクレオチドのＱＣプローブ（データは示されていない）の所望の相互作用によりシグナルの低減をもたらし得ることも決定された。
システインなどのチオールブロッキング剤ほど効果的ではないが、交差汚染の低減に有用な他のブロッキング剤（データは示されていない）には、（ｉ）ＰＳ２０、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（約１，０００ｋＤ及び約３６０ｋＤ）、フィコール及びポリエチレングリコール（約３ｋＤ及び約１０ｋＤ）を含む、ハイブリダイゼーションアッセイでバックグラウンドシグナルを低減するために使用されるポリマーと、（ｉｉ）サーモン精子ＤＮＡ、ニシンＤＮＡ、子ウシ胸腺ＤＮＡ、せん断ポリＡ、酵母ｔＲＮＡを含む核酸及びその他のポリアニオン、並びにヘパリンと、（ｉｉｉ）ＢＳＡを含むモノマー及び高分子タンパク質ブロッキング剤、並びにポリ－ＢＳＡと、（ｉｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、ｔｒｉｔｏｎ－１００、及びｔｗｅｅｎ－２０を含む界面活性剤と、（ｖ）ホルムアミド及びプロピレングリコールなどの水素結合不安定化剤と、が含まれる。
ブロッキング及び洗浄ステップは、アレイの製造中及びアレイのパッケージングの前に実行することができることに留意されたい。しかしながら、アレイを使用する直前にこのステップを実行すると、最高の性能が達成される。ブロッキング後も、固定化されたオリゴヌクレオチドとの弱い塩基－塩基相互作用を介して結合する、緩く結合した交差汚染オリゴヌクレオチドが存在する可能性がある。これらは通常、アッセイで使用されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の間に解離するが、乾燥させてアレイ上に長期間保存すると、不可逆的に固定化される可能性がある。
実施例７．一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するためのオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）の手順。
ＳＮＰの検出は、図１に示されるようなオリゴヌクレオチドプローブの対、（ｉ）配列番号７４５～７５４から選択される配列を含む５’末端に向かう配列を含む指向性プローブ（すなわち、実施例２に記載のように調製されたアレイ中の捕捉オリゴヌクレオチドの１つにハイブリダイズする配列）及びＳＮＰ部位及びその下流の分析物核酸配列に相補的である３’末端の第１のプローブ配列（３’末端は、分析物中のＳＮＰヌクレオチドに相補的である）並びに（ｉｉ）ＳＮＰのすぐ上流の分析物ヌクレオチド配列に相補的であり、３’末端にビオチン部分を含む第２のプローブ配列を有する検出プローブ、を使用して実行される。分析物及びリガーゼの存在下で、プローブ対は、指向性プローブがＳＮＰヌクレオチドと一致する場合にのみライゲーションされる。ＳＮＰ位置での異なるヌクレオチドのレベル（例えば、野生型ヌクレオチドと変異ヌクレオチドとのレベル）を比較する場合、各選択肢に指向性プローブが提供される。一部のアッセイでは、ＳＮＰのＯＬＡ指示及び検出プローブの配列には、コード領域のセンスＤＮＡ鎖配列が含まれる（ＢＲＡＦ１７９９、ＮＲＡＳ１８１、及びＮＲＡＳ１８２の場合）が、他のアッセイでは、ＯＬＡ指向性及び検出プローブの配列には、コード領域のアンチセンスＤＮＡ鎖配列（ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、及びＡＰＣの場合）が含まれる。
ブロッキングオリゴヌクレオチドプローブは、ＯＬＡプローブの各々に対して開発された。ブロッキングプローブは、分析物結合部分の一致した配列（すなわち、第１又は第２のプローブ配列）を使用する。場合によっては、分析物上の標的配列に隣接する対応するヌクレオチドに相補的である３’又は５’末端に、いくつか（例えば、３個）の追加ヌクレオチドを有することもあるが、これらの追加ヌクレオチドは一般にブロッキング活性を提供する必要はない。
プローブの性能を試験するために使用できる野生型及び変異型標的各々に対して、合成ＤＮＡテンプレートも作成された。
オリゴアレイで試験された７つのＳＮＰのＯＬＡプローブの配列は、以下の表２６に列挙されており、捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な領域が太字で示されている。
ＯＬＡアッセイ手順には、以下のステップが含まれる。
１．ＯＬＡ反応混合物を調製する
試験する核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、全ゲノム増幅ＤＮＡ、又は合成ＤＮＡ分析物）を、各指向性プローブ、各検出プローブ、及びＴａｑ ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中の５００Ｕ／ｍＬのＴａｑ ＤＮＡリガーゼと組み合わせる。あるいは、ＨｉＦｉ Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ライゲーションの特異性を改善させることもできる。（ＰＣＲ生成物のように）高い標的ＤＮＡレベルの場合、指向性プローブ及び検出プローブはそれぞれ５ｎＭ及び１００ｎＭである。標的ＤＮＡレベルが低い場合、プローブは１０ｎＭ及び２００ｎＭの濃度である。
２．ＯＬＡ反応を実行する
サーモサイクラーで、（ｉ）９５℃で２分間加熱し、（ｉｉ）９５℃で３０秒間の加熱を３０サイクル実行し、次いで６２℃で５分間（ＤＮＡの標的レベルが低いサンプルの場合）又は２分間（ＤＮＡの標的レベルが高いサンプルの場合）冷却し、（ｉｉｉ）９５℃で５分間加熱することによって、反応混合物を処理する。任意選択で、最終加熱条件の前に、第１及び第２のプローブ配列に相補的である（又はそれを含む）ブロックプローブは、ＯＬＡプローブに対して５０倍過剰であり、指向プローブ及び検出プローブの非共有結合複合体の再形成を防止する。
３．ＥＣＬアッセイによるＯＬＡ反応生成物を測定する
ＯＬＡ反応生成物を希釈して、以下のおおよそのレベルの緩衝液及び塩を有する溶液を提供する。２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０中に３１％ホルムアミド、４００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００。このサンプルを分析して、実施例３に記載されているように反応生成物を検出する。
任意選択で、リガーゼを添加せずにこのプロセスを繰り返して、ライゲーションされた生成物がない場合のアッセイバックグラウンドシグナルを決定することができる。ＳＮＰ位置で複数の代替ヌクレオチドを測定する場合、各々のパーセンテージは、各々からの特定のシグナルを比較することによって決定できる。例えば、ＳＮＰ位置で野生型及び変異ヌクレオチドのレベルを測定する場合、野生型（ＷＴ）の特異的シグナルは、野生型指向性プローブをＳＳＷＴ＝ＳＷＴ－ＢＷＴとして捕捉するアレイ要素で測定されたシグナルから決定でき、ＳＳは特異的シグナル、Ｓはリガーゼの存在下でのシグナル、Ｂはリガーゼがない場合のバックグラウンドである。同様に、変異体（Ｍ）に特異的なシグナルは、ＳＳＭ＝ＳＭ－ＢＭとして変異型指向性プローブを捕捉するアレイ要素から決定される。野生型又は変異型であるＳＮＰ位置のヌクレオチドのパーセンテージは、それぞれ、％ＷＴ＝ＳＳＷＴ／（ＳＳＷＴ＋ＳＳＭ）及び％Ｍ＝ＳＳＭ／（ＳＳＷＴ＋ＳＳＭ）として計算される。これらの比率を使用して、例えば、ゲノムＤＮＡを分析してヘテロ接合性を特定することができる。ヘテロ接合性を決定するための可能な％Ｍしきい値は、％Ｍ＜０．２（ホモ接合性野生型）、０．３＜％Ｍ＜０．７（ヘテロ接合性変異体）及び０．８＜％Ｍ（ホモ接合性変異体）である。多くのアプリケーションでは、バックグラウンド補正された特定のシグナル（ＳＳ）の代わりにシグナル（Ｓ）を使用してパーセンテージを計算することもできる。
実施例８．ＯＬＡを使用して合成ＤＮＡ標的のＳＮＰを検出する
ＯＬＡアッセイを、黒色腫及び結腸がんを含む、がんに共通する５つの変異の検出のために実行した。ＢＲＡＦ ｃ．１７９９Ｔ＞Ａ（ｐ．Ｖ６００Ｅ）、ＮＲＡＳ ｃ．１８１Ｃ＞Ａ（ｐ．Ｑ６１Ｋ）、ＰＩＫ３ＣＡ ｃ．１６３３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｅ５４５Ｋ）、ＫＲＡＳ ｃ．３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇ１２Ｄ）、及びＡＰＣ ｃ．４３４８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１４５０＊）（ｃ．１７９９Ｔ＞Ａは、ＴからＡへのヌクレオチド１７９９の遺伝子変異を表し、ｐ．Ｖ６００Ｅは、ＶからＥへのコード化タンパク質のアミノ酸６００の結果として生じる変化を表す）。ＯＬＡアッセイは、分析物としてテンプレート配列、並びに対応する直接、検出、及び遮断プローブログライン（１４８９～１５２３）を使用して、実施例７に記載されているように実行した。図５は、ウェルごとに添加されたテンプレート分子（変異型又は野生型）の数の関数としてのＢＲＡＦ変異（１７９９Ａ）のアッセイからのシグナルを示し、アッセイが野生型と比較して変異に対して高い特異性を有することを示している。図６は、テンプレート分子の数の関数としての１０のアッセイ全てのシグナルを示しており、アッセイシグナルがテンプレート濃度とともに直線的に増加することを示している。異なるアッセイの検出限界は、１ウェル当たり全て約２×１０５分子であった。各アッセイについて、表２７は、正しいテンプレートの１０８コピーと、ＳＮＰ部位で単一の不一致を有するテンプレートの１０８コピーとの測定されたシグナルを比較する。１０８個のテンプレート分子の一致した配列と不一致の配列とのシグナルの比率として提供される特異性は、多数決アッセイでは１００を超え（ＷＴ＞Ｍｕｔ置換の場合８７～６２９の範囲）、アッセイは、野生型の＜１％のレベルでまれな変異を検出することができることを示している。
実施例９．非特異的なアッセイバックグラウンドを低減するためのブロッキングオリゴの使用。
ＯＬＡアッセイでは、ライゲーションを行うために、プローブを分析物ＤＮＡ（テンプレート）にハイブリダイゼーションする必要がある。プローブ及びテンプレートは、ライゲーション事象がなくてもハイブリダイズしたままになる場合がある。この複合体は、プレートに固定化された捕捉オリゴに（指向性プローブを介して）結合し、ブリッジングバックグラウンドと呼ばれるシグナルを（検出プローブを介して）生成する可能性がある。一方のアレルの存在量が他方のアレルよりも少ない場合（例えば、まれながん変異）、ブリッジングバックグラウンドは、まれなアレル分析物のライゲーション事象から発生したシグナルに匹敵する可能性があるため、ブリッジングバックグラウンドは、実際の特異的シグナルとして誤って解釈され、変異を欠くサンプルの偽陽性結果をもたらす可能性がある。
ブリッジングバックグラウンドを軽減するためのアプローチの１つは、ＤＮＡハイブリッドを高温（９５℃、及び４℃（又は氷上）までの急速冷却）で融解することである。この手順は、ブリッジングバックグラウンドの軽減に役立つが、サンプル中の少量の変異の検出に必要な程度ではない。更に、このアプローチは制御が難しいため、サンプル処理のわずかな変動（プレートへのロード中の加熱及び処理後の冷却速度）により、バックグラウンドに影響を与える望ましくないＤＮＡ複合体の形成条件が生じる可能性がある。
ブリッジングバックグラウンド形成を評価するために、リガーゼが反応混合物に添加されなかったことを除いて、実施例８に記載されるように、ＯＬＡサンプルを１０プレックスＯＬＡアッセイ（ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ１８１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、及びＡＰＣ）用に調製した。１反応当たり１０９コピーの合成テンプレートを反応混合物中で使用して、ブロッキングオリゴの存在下及び非存在下で、アッセイ当たりの反応の１／１０回（１０８コピー／ウェル）を、実施例７に記載したようにプレート上で試験した。
図７に示すように、ブロッキングオリゴなしで試験したサンプルでは、バックグラウンドは７，０００～３０，０００カウントの範囲であり、これはおそらく、残留テンプレートへの再ハイブリダイゼーション（「ブリッジング」）による検出プローブへの指向性プローブの非共有結合的付着のレベルによるものである。ブロッキングオリゴが存在する場合、同じサンプルのバックグラウンドシグナルは１８０～５５０カウントに大幅に低下する。ブロッキングオリゴがない場合、ブリッジングバックグラウンドはテンプレート濃度の増加とともに増加し（データは示されていない）、テンプレート濃度が高い場合（例えば、１ウェル当たり１０８コピー以上）に最も顕著になる。したがって、ブロッキングプローブは、テンプレート濃度が高い実験条件（例えば、野生型配列のバックグラウンドが高い場合のまれながん変異の検出）に最も有用である。
実施例１０．ＯＬＡの感度及び特異性に対するブロッキングオリゴの効果。
アッセイの感度及び特異性に対するブロッキングオリゴの効果を評価するために、ブロッキングオリゴの存在下及び非存在下で、３つのＯＬＡアッセイ：ＢＲＡＦ ｃ．１７９９Ｔ＞Ａ（ｐ．Ｖ６００Ｅ）、ＮＲＡＳ ｃ．１８１Ｃ＞Ａ（ｐ．Ｑ６１Ｋ）、及びＮＲＡＳ ｃ．１８２Ａ＞Ｔ（ｐ．Ｑ６１Ｌ）を試験した。ＯＬＡサンプルを、実施例８に記載のＢＲＡＦ及びＮＲＡＳ１８１アッセイ並びに実施例７（行１５２４～２７）に列挙された配列を使用するＮＲＡＳ１８２アッセイ用の合成テンプレート及びＯＬＡプローブを使用して調製した。実施例７に記載されているように、ＯＬＡサンプルを試験し、各サンプルは、最終加熱ステップの前に、ブロッキングオリゴを添加した場合と添加しない場合で試験した。各アッセイについて、表２８は、正しいテンプレートの２×１０８コピーと、加熱及びロードする前にサンプルに添加したブロッキングオリゴを有さずＳＮＰ部位で単一の不一致を有するテンプレートの２×１０８コピーとの測定されたシグナルを比較する。この表は、ブロッキングオリゴの添加が特異的シグナル（つまり、正しいスポット上の標的のシグナル）にわずかな効果しか及ぼさなかったことを示しており、ブロッキングオリゴがアッセイの感度を低下させなかったことを示している。この表は、誤ったスポットでの非特異的シグナルが大幅に減少し、特異性の改善につながったことも示している。ブロッキングオリゴをサンプルに添加すると、１０８個のテンプレート分子の一致した配列と不一致の配列とのシグナルの比率として提供される特異性が、最大１５倍改善した。特異性の改善は、ブロッキングオリゴの存在下での特異性をブロッキングオリゴの非存在下での特異性で割ることによって計算された。
実施例１１．高温浸漬又はブロッキングプローブを使用して、ＯＬＡ形式の非特異的バックグラウンドを低減する
実施例３のビオチン標識オリゴヌクレオチドを捕捉及び測定するための手順は、非特異的ハイブリダイゼーション反応を最小限にするために、ストリンジェントな条件下（高温を含む）でハイブリダイゼーションを実行する。しかしながら、ハイブリダイゼーション後及びプレート洗浄前のプレートの冷却は、洗浄ステップまで持続する可能性があるいくつかの非特異的ハイブリダイゼーション反応が起こる可能性がある、よりストリンジェントが少ない条件下での時間が得られる。この効果を軽減するための１つのアプローチは、非特異的ハイブリダイゼーションの反応速度を遅くするために４℃（又は氷上）に急速に冷却することだが、プレートを冷却するタイミングを制御するのは難しい場合がある。したがって、個別に、又はタンデムで、観察された非特異的ハイブリダイゼーションを大幅に低減させることが見出された他の２つのアプローチ、ブロッキングプローブの使用及び高温浸漬ステップの使用、が開発された。
５つの異なるＳＮＰ：ＮＲＡＳ ｃ．１８２Ａ＞Ｔ、ＴＰ５３ ｃ．５２４Ｇ＞Ａ、ＰＩＫ３ＣＡ ｃ．１６３３Ｇ＞Ａ、ＫＲＡＳ ｃ．３５Ｇ＞Ａ、及びＡＰＣ ｃ．４３４８Ｃ＞Ｔの野生型及び変異型を測定するために、実施例２に記載のプレートを使用して、１０プレックスＯＬＡアッセイを開発した。ＯＬＡサンプルは、実施例８に記載のＰＩＫ３Ｃ、ＫＲＡＳ及びＡＰＣの合成テンプレート及びＯＬＡプローブを使用し、実施例７に記載の配列表（行１５２６～３６）からＮＲＡＳ１８２及びＴＰ５３の追加の配列を使用して調製された。このアッセイでは、ＫＲＡＳ ＳＮＰアッセイ用のビオチン標識検出プローブは、捕捉オリゴヌクレオチドアレイのスポット６の捕捉オリゴヌクレオチドとの相互作用が弱く、ライゲーションがない場合にそのスポットのバックグラウンドシグナルが上昇することが見出された。図８は、実施例７に記載されているようにアッセイを実行したが、分析物又はリガーゼが存在せず、ブロッキングオリゴヌクレオチド又は高温浸漬ステップを使用しない場合に、スポット６で観察されたバックグラウンドシグナルの上昇を示している。
ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ＯＬＡプロトコル中のライゲーションステップの完了時だが、９５℃最終変性ステップの前に添加された（ＯＬＡプローブに対して５０倍過剰量で）。図８は、ブロッキングプローブの添加により、非特異的結合のレベルが劇的に低減したことを示している。
高温浸漬ステップは、ＯＬＡ生成物を捕捉オリゴヌクレオチドアレイにインキュベートし、アレイを洗浄して過剰な非結合試薬を除去した後に実行される。高温浸漬を利用して、更に３０分間、弱く結合したヌクレオチドが解離させるストリンジェントな条件下（低塩（０．１倍ＰＢＳ）及び高温（３７℃））でインキュベートし、次いで洗い流した。図８は、ブロッキングプローブと同様に、高温浸漬ステップにより、非特異的結合のレベルが劇的に低減したことを示している。ブロッキングプローブ及び高温浸漬ステップの両方を利用することにより、更に低減を達成することができる。ブロッキングプローブ及び高温浸漬ステップは、ＯＬＡ生成物からの真のシグナルに大きな効果を与えなかった（データは示されていない）。
実施例１２．全ゲノム増幅（ＷＧＡ）生成物及び増幅なしのゲノムＤＮＡの変異を検出するためのＯＬＡの使用
表２９に示すように、ＢＲＡＦ又はＮＲＡＳ遺伝子のいずれかの変異に関するヘテロ接合性の細胞株をＡＴＣＣコレクションから選択した。
細胞株Ａ２０５８及びＮＣＩ－Ｈ１２９９からのＤＮＡを、ＲＥＰＬＩ－ｇ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ）、１０ｎｇ／反応を使用して全ゲノム増幅（ＷＧＡ）にかけ、細胞株ＨＬ－６０からのＤＮＡを増幅せずにＯＬＡ反応に使用した。上記の実施例８に記載されているように、ＯＬＡアッセイを実施した。２つのＷＧＡ ＤＮＡサンプルをＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ１８１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳ、及びＡＰＣアッセイで試験し、ＨＬ６０ ｇＤＮＡをＢＲＡＦ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ ＫＲＡＳ、及びＮＲＡＳ１８２アッセイで試験した。５～１５ｕｇのＤＮＡサンプルをＯＬＡ反応に使用し、２～６ｕｇをＥＣＬアッセイウェルに入れた。
各サンプルで実施された各アッセイについて、表３０～３２は、標的変異を有する測定された配列の％を示している（実施例７に記載されているように計算された）。測定された変異率＜２０％はホモ接合体の野生型サンプルとして分類され、３０％～７０％の変異率はヘテロ接合体（５０％変異）として分類され、８０％を超える変異率はホモ接合性変異体として分類された。表は、各細胞株が予想される遺伝型に基づいて正しく分類されたことを示す。
実施例１３．ＯＬＡを使用してＰＣＲ生成物を検出する
野生型バックグラウンドの低レベルの変異を模倣するＢＲＡＦ ｃ．１７９９Ｔ＞Ａ及びＮＲＡＳ ｃ．１８１Ｃ＞Ａ変異の模擬がんサンプルを作成するために、様々なＡＴＣＣ細胞株（表２９）のゲノムＤＮＡを、０～５０％の範囲の変異レベルを作成する事前に指定したレベルで混合した。表に示されているように、各細胞株は、黒色腫で一般的に見られる３つの変異：のうちの１つについてヘテロ接合であった。ＢＲＡＦ ｃ．１７９９Ｔ＞Ａ（ｐ．Ｖ６００Ｅ）；ＮＲＡＳ ｃ．１８１Ｃ＞Ａ（ｐ．Ｑ６１Ｋ）．ＢＲＡＦ ｃ．１７９９Ｔ＞Ａサンプルを生成するために、細胞株Ａ２０５８及びＮＣＩ－Ｈ１２９９のゲノムＤＮＡを混合した。ＮＲＡＳ ｃ．１８１Ｃ＞Ａサンプルを生成するために、細胞株Ａ２０５８及びＮＣＩ－Ｈ１２９９のゲノムＤＮＡを混合した。ＮＲＡＳ及びＢＲＡＦアンプリコンは、各模擬がんサンプルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（３５サイクル、１０ｎｇのゲノムＤＮＡインプット）によって生成された。
変異型及び野生型ＳＮＰのオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイは、実施例８に記載されているようにＰＣＲ増幅サンプルで実施された。ＰＣＲ生成物を希釈し、２０ｕｌのＯＬＡ混合物当たり０．０１ｕｌを使用して、１アッセイウェル当たりＯＬＡ生成物の１／１０を、プレート（０．００１ｕｌのＰＣＲ生成物／アッセイウェルの）で試験した。結果を使用して、変異ヌクレオチドを含む各ＳＮＰのパーセントを計算した。（細胞株ＤＮＡの混合物に基づく）変異ヌクレオチドの予測されたパーセンテージの関数として計算されたパーセンテージは、表３３及び３４、並びに図９に提供されている。図及び表は、計算された比率が予測された比率に非常に近いことを示しており、また、ほとんど全てのアッセイで、０．２％という低い変異率が純粋な野生型サンプルと区別できることも示している。
実施例１４．一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するためのポリメラーゼ伸長アッセイ（ＰＥＡ）の手順
ＳＮＰの検出は、図２に示されるようなオリゴヌクレオチドプローブ：配列番号７４５～７５４から選択される配列を含む５’末端に向かう配列を含む指向性プローブ（すなわち、実施例２に記載のように調製されたアレイ中の捕捉オリゴヌクレオチドの１つにハイブリダイズする配列）、及びＳＮＰ部位からの下流の分析物核酸配列に相補的である３’末端の第１のプローブ配列（３’末端は、分析物中のＳＮＰヌクレオチドから１つ下流にあるヌクレオチドに相補的である）を使用して実行される。分析物、ポリメラーゼ、及びＳＮＰ部位への相補的ビオチン修飾ジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）の存在下で、指向性プローブはビオチン修飾ヌクレオチドを含むように伸長される。ＳＮＰ位置での異なるヌクレオチドのレベル（例えば、野生型ヌクレオチドと変異ヌクレオチドとのレベル）を比較する場合、反応は、ＳＮＰ位置のヌクレオチドに適切なｄｄＮＴＰを使用して異なるウェルで繰り返される。
ＰＥＡアッセイ手順には、以下のステップが含まれる。
１．ＰＥＡ反応混合物を調製する
試験する核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、全ゲノム増幅ＤＮＡ、又は合成ＤＮＡ分析物）を５０ｎＭ指向性プローブ、目的のＳＮＰヌクレオチドに相補的なビオチン－ｄｄＮＴＰ及び非標識ｄｄＮＴＰの各々２ｕＭ、並びにＴｈｅｒｍｏＰｏｌ（登録商標）反応緩衝液中の１２０Ｕ／ｍＬのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼを組み合わせる。
２．ＰＥＡ反応を実行する
サーモサイクラーで、（ｉ）９６℃で２分間加熱し、（ｉｉ）９５℃で３０秒間の加熱を３０サイクル実行し、次いで５５℃で３０秒間冷却し、７２℃で３０秒間加熱することによって、反応混合物を処理する。
３．ＥＣＬアッセイによるＰＥＡ反応生成物を測定する
ＰＥＡ反応生成物を希釈して、以下のおおよそのレベルの緩衝液及び塩を有する溶液を提供する。２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０中に３１％ホルムアミド、４００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００。このサンプルを分析して、実施例３に記載されているように反応生成物を検出する。
任意選択で、ポリメラーゼの非存在下で測定を繰り返して、伸長プローブの非存在下でバックグラウンドシグナルを決定することができる。実施例７のＯＬＡフォーマットについて記載したように、所与のＳＮＰ位置で異なるヌクレオチドを検出するアッセイのためのシグナル又はバックグラウンド補正された特異的シグナルの比較を使用して、各ヌクレオチドを有するサンプル中の核酸のパーセンテージを推定することができる。
実施例１５．ＰＥＡを使用して合成ＤＮＡ標的のＳＮＰを検出する
プライマー伸長アッセイ（ＰＥＡ）のオリゴヌクレオチドプローブは、黒色腫に共通する３つの変異：ＢＲＡＦ ｃ．１７９９Ｔ＞Ａ（ｐ．Ｖ６００Ｅ）、ＮＲＡＳ ｃ．１８１Ｃ＞Ａ（ｐ．Ｑ６１Ｋ）、及びＮＲＡＳ ｃ．１８２Ａ＞Ｔ（ｐ．Ｑ６１Ｌ）を試験した。目的のＳＮＰの位置ごとに指向性プローブが作成された。初期のプロトタイプ捕捉アレイは、前の実施例のアレイに関連して使用された。指向性プローブは、以下の表３５に列挙されており、捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な領域がキャップで示されている。
異なる捕捉配列の使用を除いて、分析物としてテンプレート配列を使用して、実施例１４及び３に記載されているようにアッセイを実施した。この実験では、高温浸漬ステップは使用されなかった。図１０は、ウェルごとに添加されたテンプレート分子（変異型又は野生型）の数の関数としてのＢＲＡＦ変異（１７９９Ａ）のアッセイからのシグナルを示し、アッセイが野生型と比較して変異に対して高い特異性を有することを示している。図１１は、テンプレート分子の数の関数としての６のアッセイ全てのシグナルを示しており（各アッセイに正しいテンプレートを使用）、アッセイシグナルがテンプレート濃度とともに直線的に増加することを示している。異なるアッセイの検出限界は、１ウェル当たり全て約５×１０５分子であった。各アッセイについて、表３６は、正しいテンプレートの１０８コピーと、ＳＮＰ部位で単一の不一致を有するテンプレートの１０８コピーとの測定されたシグナルを比較する。１０８個のテンプレート分子の一致した配列と不一致の配列とのシグナルの比率として提供される特異性は、おおよそ１０２～１０３の範囲であり、アッセイは、野生型の＜１％のレベルでまれな変異を検出することができることを示している。
実施例１６．ＰＥＡを使用してＰＣＲ生成物を検出する
表２９に示すＡＴＣＣ細胞株から抽出されたゲノムＤＮＡを使用して、ＮＲＡＳ及びＢＲＡＦアンプリコンは、各模擬がんサンプルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（３５サイクル、６０ｎｇのゲノムＤＮＡインプット）によって生成された。表に示されているように、各細胞株は、黒色腫で一般的に見られる３つの変異：ＢＲＡＦ ｃ．１７９９Ｔ＞Ａ（ｐ．Ｖ６００Ｅ）、ＮＲＡＳ ｃ．１８１Ｃ＞Ａ（ｐ．Ｑ６１Ｋ）、又はＮＲＡＳ ｃ．１８２Ａ＞Ｔ（ｐ．Ｑ６１Ｌ）のうちの１つについてヘテロ接合であった。野生型バックグラウンドで低レベルの変異を模倣する模擬がんサンプルを作成するために、細胞株ＤＮＡを事前に指定されたレベルで混合して、０～５０％の範囲の変異レベルを作成した。ＢＲＡＦ ｃ．１７９９Ｔ＞Ａサンプルを生成するために、細胞株Ａ２０５８及びＮＣＩ－Ｈ１２９９のゲノムＤＮＡを混合した。ＮＲＡＳ ｃ．１８１Ｃ＞Ａサンプルを生成するために、細胞株Ａ２０５８及びＮＣＩ－Ｈ１２９９のゲノムＤＮＡを混合した。ＮＲＡＳ ｃ．１８２Ａ＞Ｔサンプルを生成するために、細胞株Ａ２０５８及びＨＬ－６０のゲノムＤＮＡを混合した。
変異型及び野生型ＳＮＰのプライマー伸長アッセイは、実施例１５に記載されているようにサンプルで実施された。各サンプルについて、ＰＣＲ生成物の２つの異なる希釈液を試験した。結果を使用して、変異ヌクレオチドを含む各ＳＮＰのパーセントを計算した。（細胞株ＤＮＡの混合物に基づく）変異ヌクレオチドの予測されたパーセンテージの関数として計算されたパーセンテージは、表及びグラフ形式：ＢＲＡＦ１７９９Ｔ＞Ａの結果（表３７及び図１２）、ＮＲＡＳ１８１Ｃ＞８の結果（表３８及び図１３）、ＮＲＡＳ１８２Ａ＞Ｔの結果（表３９、図１４）に提供されている。図及び表は、計算された比率が予測された比率に非常に近いことを示しており、また、ほとんど全てのアッセイで、０．２％という低い変異率が純粋な野生型サンプルと区別できることも示している。
実施例１７．嚢胞性線維症（ＣＦ）変異を検出するためのオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、嚢胞性線維症の膜貫通コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の変異によって引き起こされる。最も一般的な変異ΔＦ５０８は、３つのヌクレオチドの欠失（Δは欠失を意味する）であり、タンパク質の５０８番目の位置にあるアミノ酸フェニルアラニン（Ｆ）が結果として失われる。ΔＦ５０８変異は、世界中のＣＦ症例の２／３（６６～７０％）、及び米国の症例の９０％を占めている。ΔＦ５０８変異は北ヨーロッパ系の人々で最も高い比率を有する。次に一般的な変異はＧ５４２Ｘ変異であり、これは米国のＣＦ症例の約５％を占めている。
ＣＦ変異は、実施例７に記載の方法を使用して検出することができる。ＣＦ変異を検出するためのＯＬＡプローブを表４０に列挙する。捕捉オリゴヌクレオチドに相補的である領域は太字で示されている。
実施例１８．ＢＲＣＡ変異を検出するためのオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）
ＢＲＣＡ変異は、腫瘍抑制遺伝子であるＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２遺伝子のいずれかの生殖細胞変異である。これらの遺伝子の変異は、罹患した人に遺伝性乳卵巣がん症候群を引き起こす可能性がある。これらの遺伝子の一般的な変異には、ＢＲＣＡ１＊１８５ｄｅｌＡＧ（エクソン２）、ＢＲＣＡ１＊５３８２ｉｎｓＣ（エクソン２０）及びＢＲＣＡ２＊６１７４ｄｅｌＴ（エクソン１１）が含まれる。
ＢＲＣＡ変異は、実施例７に記載の方法を使用して検出することができる。ＢＲＣＡ変異を検出するためのＯＬＡプローブを表４１に列挙する。太字で示されている捕捉オリゴヌクレオチドに相補的である領域。
実施例１９．肺がんＳＮＰパネル
肺がん発症のリスク増強に関連する９つのＳＮＰのパネルが作成された。これらの変異は、以下のとおりである。
－ｒｓ１８０１１３３（ＭＴＨＦＲ Ｃ６７７Ｔ）
－ｒｓ１８０１２７０（ＣＤＫＮ１Ａ ｃ．９３Ｃ＞Ａ）
－ｒｓ３８４２（ＡＢＣＢ１ ｃ．＊１９３Ａ＞Ｇ）
－ｒｓ１０５１７３０（ＣＨＲＮＡ３ Ｄ３９８Ｎ）
－ｒｓ８０３４１９１（ＬＯＣ１２３６８８又はＨＹＫＫ ｃ．３３７＋２５６Ｔ＞Ｃ）
－ｒｓ２１２０９０（ＡＢＣＣ１ ｃ．＊８６６Ｔ＞Ａ）
－ｒｓ２２７３５３５（ＡＵＲＫＡ Ｆ３１Ｉ）
－ｒｓ１７８７９９６１（ＣＨＥＫ２ ｃ．５９９Ｔ＞Ｃ）
－ｒｓ２２４３８２８（ＭＰＯ ｃ．－７６４Ｔ＞Ｃ）
各変異に使用されるプローブ配列は、以下の表４２（上流）及び４３（下流）に示されている。
各変異のためのプローブを試験するために、第１又は第２の鎖のいずれかからのプローブが選択され、ＨＬ－６０細胞株から抽出されたＤＮＡに対して試験した。Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｃｅｌｌ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ カタログ番号１５８３８８）を使用してＤＮＡを抽出し、ＭｙＴａｑ ＨＳ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ カタログ番号ＢＩＯ－２５０４５）及び表４４及び４５にそれぞれ示されるアッセイ特異的ＰＣＲフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用して、１０ｎｇのＤＮＡを増幅した。
増幅後、実施例７に記載のようにＯＬＡを実施し、ＷＴ及び変異型アレルの頻度を決定した。各ＳＮＰの結果を表４６に示す。
実施例２０：ＲＮａｓｅ保護アッセイを使用したｍｉＲＮＡ検出
ＲＮａｓｅ保護アッセイはｍｉＲＮＡの定量化にて使用可能である。アッセイでは、捕捉オリゴヌクレオチド配列及びｍｉＲＮＡ相補的配列に相補的であるオリゴヌクレオチドタグ配列を含有するＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブが使用される。オリゴヌクレオチドタグ配列は、キメラプローブの５’末端に含まれる一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）配列であり得、ｍｉＲＮＡ相補的配列は、末端に３’ビオチンを有するキメラプローブの３’末端にある一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）配列であり得る。ｍｉＲ－１２２の配列を表４７に示し、キメラプローブを表４８に示す。
簡単に言えば、ｍｉＲＮＡは以下のとおり検出できる。
１）．サーマルサイクラーでｍｉＲＮＡをキメラプローブにハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション生成物を形成し、
２）．１つ以上の既知のブロッキング剤を使用してアッセイプレートをブロックし、
３）．ハイブリダイゼーション生成物のオリゴヌクレオチドタグ配列がアッセイプレート上の捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる条件下で、ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション生成物をブロックされたアッセイプレートに添加し、３７℃でインキュベートし、
４）．ＲＮａｓｅ Ａ又はＲＮａｓｅ Ｉ（３０℃～３７℃）でｓｓＲＮＡのオンプレート消化を実施し、以下
ａ）．プローブにハイブリダイズしていないｓｓＲＮＡ、
ｂ）．相補的なｍｉＲＮＡなしでプレートにハイブリダイズしたプローブ、及び
ｃ）．キメラプローブとの不一致がわずか一塩基のＲＮＡを消化し、
５）．ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ標識ストレプトアビジン（ＳＡ－ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標））（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を添加し、室温でインキュベートし、
６）．読み取り緩衝液Ｂをアッセイプレートに添加し、ＭＳＤ ＩｍａｇｅｒでＥＣＬシグナル生成を測定し、かつ
７）．結果を定量化のために検量線と比較する。
上記のプロトコルを使用して、合成ｍｉＲ－１２２ ｍｉＲＮＡを検出した。結果は、ｍｉＲ－１２２が１６０ｆＭの濃度で検出されたことを示しており、同じｍｉＲＮＡの５００ｆＭの検出を達成したＲｉｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ（２０１７）によって報告された結果よりも改善されている。
実施例２１．３つのプロトコルを使用したＡＳＯ検出（ＲＮａｓｅ保護、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼを使用したＯＬＡ、及びＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用したＯＬＡ）
モデルＤＮＡ ＡＳＯ（ＧＧＣ ＴＡＡ ＡＴＣ ＧＣＴ ＣＣＡ ＣＣＡ ＡＧ、配列番号１６４６）は、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼを使用したＯＬＡ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用したＯＬＡの３つの異なるプロトコルを使用して検出された。３つのプロトコル全てで使用される緩衝液は、以下のとおりである。トリス－ＨＣｌ、界面活性剤、及びシステインが含まれるブロッキング緩衝液；トリス－ＨＣｌ、界面活性剤、ＥＤＴＡ、塩、及びホルムアミドが含まれるハイブリダイゼーション緩衝液１（「ＨＢ１」）；トリス－ＨＣｌ、界面活性剤及びＥＤＴＡが含まれるハイブリダイゼーション緩衝液２（３つの全てのプロトコルにおいて使用される「ＨＢ２」；トリス－ＨＣｌ、界面活性剤、ＥＤＴＡ及び塩が含まれる希釈緩衝液。
Ａ．ＲＮａｓｅ保護アッセイ
１０ポイントの検量線は、キャリブレーターと２つのブランクの間で４倍に希釈して設定した。キャリブレーター（Ｃａｌ－１）最高濃度は１６６ｐＭ（約１×１０８コピー／μＬ）であった。分析物又はキャリブレーターは元々、水又は血漿で希釈されており、血漿が最も可能性の高いサンプルタイプであるユーザ症例シナリオを示している。開始サンプルサイズは２０μｌであった。
血漿サンプルに２×ＲＮＡｓｅｃｕｒｅ（２０μＬ）を添加し、混合物を６０℃で１０分間加熱した。次いで、キメラプローブを含む５×マスターミックスをサンプルに添加した（１０μＬ）。以下のプロトコルを使用して、サンプルをプローブにハイブリダイズさせた。８０℃～２分、６５℃～５分（その後、１℃下げ、５０℃まで、それぞれ５分間）、３７℃～保持。
プレートをブロッキング緩衝液で３０分間ブロックし、３７℃でハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション生成物をハイブリダイゼーション緩衝液２で７５μＬに希釈し、２０μＬのハイブリダイゼーション緩衝液１（２：３比 ＨＢ１：ＨＢ２／サンプル）を含む２つのウェルに３０μＬを添加した。プレートへのハイブリダイゼーションは３７℃で１時間行った。
ＲＮａｓｅ Ｉをプレートに添加し、消化を３７℃で３０分間完了した。ストレプトアビジンＡ－ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（希釈緩衝液中）をウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。アッセイ読み取り緩衝液を添加し、次いでプレートを読み取った。
Ｂ．Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼを含むＯＬＡ
１０ポイントの検量線は、キャリブレーターと２つのブランクの間で４倍に希釈して設定した。キャリブレーター（Ｃａｌ－１）最高濃度は１６６ｐＭ（約１×１０８コピー／μＬ）であった。分析物又はキャリブレーターは元々、水又は血漿で希釈されており、血漿が最も可能性の高いサンプルタイプであるユーザ症例シナリオを示している。開始サンプルサイズは１０μｌであった。
プローブ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、及びＴａｑリガーゼ緩衝液を含む２×マスターミックスを作製した。ＯＬＡの前に、２５μＬを各サンプル（１０μＬ）及び水（１５μＬ）に添加した。ＯＬＡサイクリングは以下のように実施した。９５℃－２分、９５℃－３０秒、３７℃－５分、４℃－保持。
プレートをブロッキング緩衝液で３０分間ブロックし、３７℃でサイクリングを行った。ＯＬＡ生成物をハイブリダイゼーション緩衝液２で７５μＬに希釈し、２０μＬのハイブリダイゼーション緩衝液１（２：３比 ＨＢ１：ＨＢ２／サンプル）を含む２つのウェルに３０μＬを添加した。プレートへのハイブリダイゼーションは３７℃で１時間行った。ハイブリダイゼーション後、ストレプトアビジン－ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（希釈緩衝液中）をウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。アッセイ読み取り緩衝液を添加し、次いでプレートを読み取った。
Ｃ．Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを含むＯＬＡ
１０ポイントの検量線は、キャリブレーターと２つのブランクの間で４倍に希釈して設定した。キャリブレーター（Ｃａｌ－１）最高濃度は１６６ｐＭ（約１×１０８コピー／μＬ）であった。分析物又はキャリブレーターは元々、水又は血漿で希釈されており、血漿が最も可能性の高いサンプルタイプであるユーザ症例シナリオを示している。開始サンプルサイズは２０μｌであった。
プローブ及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液を使用して２×マスターミックスを作製し、サンプルに添加した（２０μｌ）。サンプルは、９５℃まで２分間ランプアップし、５０％のランプレートで６５℃まで冷却し、次に３％のランプレートで４℃まで冷却することにより、プローブにハイブリダイズした。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、室温でのライゲーションを３０分間完了した。酵素は６５℃で１０分間のインキュベーションにより不活性化された。
プレートをブロッキング緩衝液で３０分間ブロックし、３７℃でライゲーション／不活性化を行った。ライゲーション生成物をハイブリダイゼーション緩衝液２で７５μＬに希釈し、２０μＬのハイブリダイゼーション緩衝液１（２：３比 ＨＢ１：ＨＢ２／サンプル）を含む２つのウェルに３０μＬを添加した。プレートへのハイブリダイゼーションを、３７℃で１時間実施した。ハイブリダイゼーション後、ストレプトアビジン－ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（希釈緩衝液中）をウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。アッセイ読み取り緩衝液を添加し、次いでプレートを読み取った。
実施例２２．２つのプロトコル（１ステップ及び２ステップ）を使用したＡＤＡ検出
アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）を検出するために２つの方法が開発された。同じ標的化プローブ及び検出プローブをどちらの方法に使用することができる。標的化プローブは、１２ｍｅｒのオリゴヌクレオチドタグ配列ＧＡＣＡＴＧＡＴＣＧＧＴ（配列番号１６４７）又は２４ｍｅｒのオリゴヌクレオチド配列ＡＣＴＧＧＴＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＣＧＧＴ（配列番号７４５）及びアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（ＡＳＯ）のいずれかを含むことができる。必要に応じて、オリゴヌクレオチドタグ配列とＡＳＯとの間にスペーサー配列を含めることができる。検出プローブには、ビオチン標識と、標的化プローブで使用されるのと同じアンチセンスオリゴヌクレオチド配列が含まれる。
Ａ．「１ステップ」
「１ステップ」ＡＤＡ検出方法の概略図を図１９に示す。
簡単に言えば、少なくとも約２５０ｎＭの標的化プローブ及び少なくとも約２５０ｎＭの検出プローブが、ポリプロピレンプレート中の標的化及び検出プローブ上のＡＳＯに対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）を含み得るサンプルと組み合わされて、混合物を形成する。混合物を室温で振とう（７００ｒｐｍ）しながら１時間インキュベートして、ＡＤＡがサンプルに存在する場合は、標的化プローブ及び検出プローブのＡＳＯに結合させる。
オリゴヌクレオチドタグ配列に相補的なヌクレオチド配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドが置かれた９６ウェルＮ－ＰＬＥＸプレート（ＭＳＤ）を、１ウェル当たり５０μＬのＮ－ＰＬＥＸブロッカーでブロックし、３７℃で３０分間振とう（７００ｒｐｍ）しながらインキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、ポリプロピレンプレートからの５０μＬの混合物をＮ－ＰＬＥＸプレートの各ウェルに移し、室温で振とう（７００ｒｐｍ）しながら１時間インキュベートして、混合物中の標的化プローブのオリゴヌクレオチドタグをプレートに固定化された捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。プレートを洗浄して混合物から非結合種を除去し、希釈液中の５０μＬのストレプトアビジン－ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧをＮ－ＰＬＥＸプレートの各ウェルに添加し、室温で振とう（７００ｒｐｍ）しながら３０分間インキュベートして、ストレプトアビジン－ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧは、プレートに固定化されている検出プローブのビオチン部分に結合させる。プレートを洗浄し、１５０μＬのＭＳＤ読み取り緩衝液をプレートの各ウェルに添加し、ＡＤＡの存在が決定される。
ＡＤＡの試験対象のサンプルに、かなりのレベルのＡＳＯ薬剤も含まれている場合（例えば、サンプルが薬剤を投与されたがまだクリアしていない患者からのものである場合）、サンプル中のＡＳＯはＡＤＡとの複合体として存在している可能性がある。これが発生した場合、循環ＡＳＯは、ＡＤＡの標的化及び検出プローブへの結合をブロックし、アッセイによるＡＤＡの検出を妨げる可能性がある。一態様では、アッセイを試験して、サンプル中のＡＳＯの存在に対するアッセイの感度を決定し、サンプル中に存在するＡＳＯがＡＤＡの測定を妨害するレベルを決定する。一態様では、アッセイがサンプル中のＡＳＯからの干渉に敏感である場合、この方法は、アッセイを実施する前に、サンプル中のＡＳＯをＡＤＡから解離させるための１つ以上のステップを含む。一態様では、解離は、ＡＳＯとＡＤＡとの間の結合相互作用を変性させるか、さもなければ不安定にするが、ＡＤＡの完全性を維持する条件にサンプルを曝露することによって達成される。一態様では、解離は、サンプルを酸性化することによって達成される。一態様では、解離は、サンプルを塩基性にすることによって達成される。一態様では、解離は、サンプルを加熱することによって達成される。一態様では、解離は、サンプルに変性剤を添加することによって達成される。一態様では、サンプルは、例えば、酸性化又は塩基性化されたサンプルを中和することによって、加熱されたサンプルを冷却することによって、又は変性剤で処理されたサンプルを希釈することによって、ＡＤＡ－ＡＳＯ複合体の形成に対して安定化する条件下で標的化及び検出プローブと組み合わされる。一態様では、ＡＳＯは、試験前にサンプル中で選択的に分解される。一態様では、ＡＳＯは、核酸及びタンパク質の異なる性質に基づいて選択的に分解される。一態様では、ＡＳＯは、例えば、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ又は他の非特異的ヌクレアーゼ、ホスホリラーゼ若しくはホスホモノエステラーゼなどのホスホジエステル結合を加水分解することができる酵素を使用して、酵素的に選択的に分解される。一態様では、ＡＳＯは酵素的に分解されるが、プローブの分解は、アッセイを実施する前にヌクレアーゼを阻害することによって防止される。
一態様では、例えば、陽性対照抗体を含有するサンプル中の異なる濃度のＡＳＯをスパイクすることによって、循環ＡＳＯからの干渉を評価するために、標的化及び検出プローブ上のＡＳＯに特異的に結合する陽性対照ＡＤＡが使用される。別の態様では、標的化プローブ及び検出プローブのＡＳＯヌクレオチド配列にハイブリダイズする陽性対照オリゴヌクレオチドを使用して、アッセイ条件を最適化する（図２０）。
Ｂ．「２ステップ」
「２ステップ」ＡＤＡ検出方法の概略図を図２１に示す。
オリゴヌクレオチドタグ配列に相補的なヌクレオチド配列を有する捕捉オリゴヌクレオチドが置かれた９６ウェルＮ－ＰＬＥＸプレート（ＭＳＤ）を、５０μＬ／ウェルのＮ－ＰＬＥＸブロッカーでブロックし、３７℃で３０分間振とう（７００ｒｐｍ）しながらインキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、ハイブリダイゼーション緩衝液に少なくとも約２５０ｎＭの標的化プローブを含有する５０μＬの混合物をＮ－ＰＬＥＸプレートの各ウェルに添加し、３７℃で１時間振とう（７００ｒｐｍ）しながらインキュベートして、標的化プローブのオリゴヌクレオチドタグをプレートにハイブリダイズされた捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。次いで、プレートを洗浄し、希釈剤と組み合わせた標的化プローブ及び少なくとも約２５０ｎＭの検出プローブ上のＡＳＯに対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）を含む可能性のある５０μＬのサンプルを、Ｎ－ＰＬＥＸの各ウェルに添加し、プレートを室温で振とう（７００ｒｐｍ）しながら１時間インキュベートして、ＡＤＡが存在する場合は、プレートに固定化された標的化プローブのＡＳＯに特異的に結合させる。次いで、プレートを洗浄し、希釈液中の５０μＬの検出プローブを１ウェル当たりＮ－ＰＬＥＸプレートに添加し、室温で振とう（７００ｒｐｍ）しながら１時間インキュベートして、検出プローブのＡＳＯをプレートに固定化されたＡＤＡに結合させる。プレートを洗浄し、希釈液中の５０μＬのストレプトアビジン－ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧをＮ－ＰＬＥＸプレートの各ウェルに添加し、室温で振とう（７００ｒｐｍ）しながら３０分間インキュベートして、ストレプトアビジンをプレートに固定化された検出プローブのビオチン部分に結合させる。プレートを洗浄し、１５０μＬのＭＳＤ読み取り緩衝液を１ウェル当たり添加し、ＡＤＡの存在が決定される。
ＡＤＡの試験対象のサンプルに、かなりのレベルのＡＳＯ薬剤も含まれている場合（例えば、サンプルが薬剤を投与されたがまだクリアしていない患者からのものである場合）、サンプル中のＡＳＯはＡＤＡとの複合体として存在している可能性がある。これが発生した場合、循環ＡＳＯは、ＡＤＡの標的化及び検出プローブへの結合をブロックし、アッセイによるＡＤＡの検出を妨げる可能性がある。一態様では、アッセイを試験して、サンプル中のＡＳＯの存在に対するアッセイの感度を決定し、サンプル中に存在するＡＳＯがＡＤＡの測定を妨害するレベルを決定する。一態様では、アッセイがサンプル中のＡＳＯからの干渉に敏感である場合、この方法は、アッセイを実施する前に、サンプル中のＡＳＯをＡＤＡから解離させるための１つ以上のステップを含む。一態様では、解離は、ＡＳＯとＡＤＡとの間の結合相互作用を変性させるか、さもなければ不安定化させる条件にサンプルを曝露することによって達成される。一態様では、解離は、サンプルを酸性化することによって達成される。一態様では、解離は、サンプルを塩基性にすることによって達成される。一態様では、解離は、サンプルを加熱することによって達成される。一態様では、解離は、サンプルに変性剤を添加することによって達成される。一態様では、サンプルは、例えば、酸性化又は塩基性化されたサンプルを中和することによって、加熱されたサンプルを冷却することによって、又は変性剤で処理されたサンプルを希釈することによって、ＡＤＡ－ＡＳＯ複合体の形成に対して安定化する条件下で標的化及び検出プローブと組み合わされる。
一態様では、ＡＳＯは、試験前にサンプル中で選択的に分解される。一態様では、ＡＳＯは、核酸及びタンパク質の異なる性質に基づいて選択的に分解される。一態様では、ＡＳＯは、例えば、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ又は他の非特異的ヌクレアーゼ、ホスホリラーゼ若しくはホスホモノエステラーゼなどのホスホジエステル結合を加水分解することができる酵素を使用して、酵素的に選択的に分解される。一態様では、ＡＳＯは酵素的に分解されるが、プローブの分解は、アッセイを実施する前にヌクレアーゼを阻害することによって防止される。
一態様では、例えば、陽性対照抗体を含有するサンプル中の異なる濃度のＡＳＯをスパイクすることによって、循環ＡＳＯからの干渉を評価するために、標的化及び検出プローブ上のＡＳＯに特異的に結合する陽性対照ＡＤＡが使用される。別の態様では、標的化プローブ及び検出プローブのＡＳＯヌクレオチド配列にハイブリダイズする陽性対照オリゴヌクレオチドを使用して、アッセイ条件を最適化する（図２０）。
実施例２３．伸長検出配列によるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の検出
ＭＳＤのＮ－ＰＬＥＸプラットフォームを使用したオリゴヌクレオチドの検出は、従来、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）とラベル付けされたストレプトアビジンを使用して検出されるプローブ又はプライマーに組み込まれるビオチン化オリゴを使用して行われてきた。この実施例では、ＲＮａｓｅ保護アッセイにおけるシグナルは、モデル２０量体アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の新規キメラプローブを使用して、プローブ上のビオチンを検出オリゴヌクレオチドに置き換えることによって増幅された。５’末端にＤＮＡオリゴヌクレオチドタグ（５’ＡＣＴＧＧＴＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＣＧＧＴ３’）（配列番号７４５）、続いて３’末端にＤＮＡ検出配列（５’ＧＡＣＡＧＡＡＣＴＡＧＡＣＡＣ３’）（配列番号１６６４）を有するＲＮＡ標的補体配列（５’ＣＵＵＧＧＵＧＧＡＧＣＧＡＵＵＵＡＧＣＣ３’）（配列番号１６６３）を含むキメラプローブを作製した（図２４に示す）。５’末端にＤＮＡオリゴヌクレオチドタグ（５’ＡＣＴＧＧＴＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＣＧＧＴ３’）（配列番号７４５）及びＤＮＡアンカー配列（５’ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＧＣＣＧＴＣＡＡ３’）（配列番号１６６５）を含む、アンカー試薬を作製した（図２４に示す）。
方法論は、図２２に概略的に示され、以下に説明される。
キャリブレーション曲線は、例えば、実施例２１に記載されているように、モデルＡＳＯを使用して生成された。
上記のキメラプローブ及びアンカー試薬を、モデルＡＳＯ分析物を含むサンプルに添加し、ハイブリダイズして反応生成物（ＡＳＯ／プローブ複合体）を形成させた。
捕捉オリゴヌクレオチドを固定化するＭＳＤＮ－ＰＬＥＸプレートを３７℃で３０分間ブロック緩衝液でブロックし、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（１×ＤＰＢＳ）を含有する洗浄緩衝液で洗浄した。反応生成物（ＡＳＯ／プローブ複合体）を含むサンプルをＭＳＤＮ－ＰＬＥＸプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートして、ＡＳＯ／プローブ複合体をＮ－ＰＬＥＸプレートにハイブリダイズした。次いで、プレートを１×ＤＰＢＳで洗浄してから、厳密な洗浄工程を行った（３７℃で３０分間、０．１×ＤＰＢＳ、約７００ｒｐｍで振とうした）。次いでプレートを洗浄し（１×ＤＰＢＳ）、ＲＮａｓｅＩを添加し、３７℃で３０分間インキュベートして、非結合プローブ、すなわち、プレート上に固定されたがＡＳＯにハイブリダイズされていないプローブ中のＲＮＡを分解した。次いで、プレートを洗浄し（１×ＤＰＢＳ）、試薬（Ｅ１：直鎖プレート、Ｅ２：アセチル－ＢＳＡ、及びＥ３：Ｔ４リガーゼ）を添加し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、プレートをＭＳＤ洗浄緩衝液（ＰＢＳ－Ｔ）で洗浄し、検出試薬（Ｄ１）及びＰｈｉ２９ポリメラーゼ（Ｄ２）を添加し、２７℃で１時間インキュベーションした。次いで、プレートをＭＳＤ洗浄緩衝液（ＰＢＳ－Ｔ）で洗浄し、ＭＳＤＧＯＬＤ読み取り緩衝液を添加し、ＡＳＯの存在を検出した。
Ｎ－ＰＬＥＸ上でＳ－ＰＬＥＸをＲＮａｓｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙと併用すると、ＡＳＯの検出限界が１０倍以上増加したが、バックグラウンドシグナルの増加及びポジティブシグナルの増加が観察された。
実施例２４：伸長検出配列によるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の検出
この実施例では、厳格な洗浄工程を省略した修飾アッセイを使用して、実施例２３からのＡＳＯを検出した。結果は、実施例２３で使用したアッセイの結果と同様であった。
実施例２５．オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）及び伸長検出配列を使用したアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＬＡ）の検出
この実施例では、拡張検出配列を有するオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）を使用して、実施例２３からのモデルアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を検出した。
簡潔に述べると、ＯＬＡ反応混合物を、モデルＡＳＯを、指向性プローブ（本明細書では標的化プローブとも称される）及びＴａｑＤＮＡリガーゼ反応緩衝液中の検出プローブと組み合わせることによって調製した。ＯＬＡ反応をサーモサイクラー内で実行して、反応生成物を生成した。
また、これが、ＡＳＯのオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）媒介検出のための実行可能な選択肢であることを立証することができた。

Claims (95)

  1. サンプル中の標的核酸配列を含む標的オリゴヌクレオチドを検出する方法であって、前記方法が、
    （ａ）前記サンプルを、オリゴヌクレオチドタグ、標的補体、及び検出オリゴヌクレオチドを含む、検出プローブと接触させることであって、前記標的補体が前記標的オリゴヌクレオチドの前記標的核酸配列にハイブリダイズして、反応生成物を形成する条件下で、接触させることと、
    （ｂ）捕捉オリゴヌクレオチドが固定化される支持体表面を、前記反応生成物を含む混合物と接触させることであって、前記反応生成物の前記オリゴヌクレオチドタグが前記捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、固定化された検出複合体を形成する条件下で、接触させることと、
    （ｃ）前記固定化された検出複合体を、増幅テンプレートを含む検出混合物と接触させることと、
    （ｄ）前記増幅テンプレートを増幅して、検出標識部位を含む１つ以上の核酸配列を含むアンプリコンを形成することと、
    （ｅ）前記アンプリコンを、標識及び前記検出標識部位に相補的である核酸配列を含む、検出試薬と接触させることであって、前記検出試薬の前記核酸配列が前記アンプリコンの前記検出標識部位にハイブリダイズする条件下で、接触させることと、
    （ｆ）前記検出標識部位に結合した前記標識を検出することと、を含む、方法。
  2. 前記サンプルを、（ａ）でアンカー試薬及び前記検出プローブと接触させ、前記アンカー試薬が、オリゴヌクレオチドタグ及びアンカー配列を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記検出プローブが、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグ、一本鎖ＲＮＡ標的相補体、及び一本鎖ＤＮＡ検出オリゴヌクレオチドを含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記アンカー試薬が、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグ及び一本鎖ＤＮＡアンカー配列を含む、請求項３に記載の方法。
  5. （ｃ）の前に、前記固定化された検出複合体をＲＮａｓｅと接触させて、非結合プローブの一本鎖ＲＮＡを分解することを含む、請求項３又は４に記載の方法。
  6. サンプル中の標的核酸配列を含む標的オリゴヌクレオチドを検出する方法であって、前記方法が、
    （ａ）前記サンプルを、
    （ｉ）一本鎖ＤＮＡ配列を含むオリゴヌクレオチドタグ、一本鎖ＲＮＡ配列を含む標的補体、及び一本鎖ＤＮＡ配列を含む検出オリゴヌクレオチドを含む、検出プローブ、並びに
    （ｉｉ）一本鎖ＤＮＡ配列を含むオリゴヌクレオチドタグ及び一本鎖ＤＮＡ配列を含むアンカー配列を含む、アンカー試薬と接触させることであって、
    前記検出プローブの前記標的相補体が前記標的オリゴヌクレオチドの前記標的核酸配列にハイブリダイズして、前記オリゴヌクレオチドタグ、前記標的オリゴヌクレオチド及び前記標的補体の前記標的核酸配列を含む二本鎖ＲＮＡ二本鎖を含む反応生成物を形成する、接触させることと、
    （ｂ）複数の捕捉オリゴヌクレオチドが個別の結合ドメインに固定化されている１つ以上の電極を含む支持体表面を、前記反応生成物を含む混合物と接触させることであって、前記反応生成物の前記オリゴヌクレオチドタグが前記捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズして前記支持体表面に検出複合体を形成する条件下で、接触させることと、
    （ｃ）前記支持体表面をＲＮａｓｅと接触させて、結合していない検出プローブの一本鎖ＲＮＡを分解することと、
    （ｄ）前記固定化された検出複合体を、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）テンプレート及びポリメラーゼを含む検出混合物と接触させることと、
    （ｅ）ＲＣＡによって前記テンプレートを増幅して、前記検出複合体に付着した伸長配列を形成することであって、前記伸長配列が、検出標識部位を含む複数の核酸配列を含む、形成することと、
    （ｆ）前記伸長配列を、電気化学発光（ＥＣＬ）標識及び前記伸長配列の前記検出標識部位に相補的である核酸配列を含む、検出試薬と接触させることであって、前記検出試薬の前記核酸配列が前記検出標識部位にハイブリダイズする条件下で、接触させることと、
    （ｇ）前記ＥＣＬ標識を、ＥＣＬ共反応物を含むＥＣＬ読み取り緩衝液と接触させ、前記電極に電位を印加することによって、前記伸長配列に結合した前記ＥＣＬ標識を検出することと、を含む、方法。
  7. サンプル中の標的ヌクレオチド配列を検出する方法であって、前記方法が、
    （ａ）前記サンプルを、
    （ｉ）一本鎖オリゴヌクレオチドタグ及び前記サンプル中の前記標的ヌクレオチド配列の第１の領域に相補的である第１の核酸配列を含む標的化プローブ、並びに
    （ｉｉ）検出オリゴヌクレオチド及び前記標的ヌクレオチド配列の第２の領域に相補的である第２の核酸配列を含む、検出プローブ、を含む混合物と接触させることであって、
    前記標的化プローブの前記第１の核酸配列及び前記検出プローブの第２の核酸配列が、前記標的オリゴヌクレオチドの隣接する核酸配列に相補的である、接触させることと、
    （ｂ）核酸リガーゼの存在下で、前記標的オリゴヌクレオチド、標的化プローブ及び検出プローブを含む前記混合物をインキュベートすることであって、前記標的化プローブ及び前記検出プローブが前記標的オリゴヌクレオチドのそれらの対応するヌクレオチド配列に結合し、前記核酸リガーゼが前記標的化及び検出プローブを連結して、前記オリゴヌクレオチドタグ及び検出オリゴヌクレオチドを含む反応生成物を形成する条件下で、インキュベートすることと、
    （ｃ）捕捉オリゴヌクレオチドが固定化されている支持体表面を、前記反応生成物を含む前記混合物と接触させることであって、前記反応生成物の前記オリゴヌクレオチドタグが前記捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、固定化された検出複合体を形成する条件下で、接触させることと、
    （ｄ）前記固定化された検出複合体を、増幅テンプレートを含む検出混合物と接触させることと、
    （ｅ）前記増幅テンプレートを増幅して、検出標識部位を含む１つ以上の核酸配列を含むアンプリコンを形成することと、
    （ｆ）前記アンプリコンを、標識及び前記検出標識部位に相補的である核酸配列を含む、検出試薬と接触させることであって、前記検出試薬の前記核酸配列が前記検出標識部位にハイブリダイズする条件下で、接触させることと、
    （ｇ）前記支持体表面に結合した前記標識を検出することと、を含む、方法。
  8. 前記検出プローブが、前記標的化プローブの３’末端に隣接する標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする５’末端を有する、請求項７に記載の方法。
  9. （ｂ）において形成された前記反応生成物を、前記標的オリゴヌクレオチドから前記反応生成物を解離する変性条件に曝露することを含む、請求項７に記載の方法。
  10. 前記増幅テンプレートが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記増幅テンプレートが、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって増幅される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記増幅テンプレートが、環状増幅テンプレートを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. ＲＣＡによって生成される前記アンプリコンが、前記固定化された検出複合体に付着した伸長配列を含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
  14. 前記アンプリコンが、複数の検出標識部位を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記増幅テンプレートが、５’末端ヌクレオチド配列及び３’末端ヌクレオチド配列を含む直鎖増幅テンプレートを含み、前記５’及び３’末端ヌクレオチド配列が、前記検出配列にハイブリダイズすることができ、内部ヌクレオチド配列が、前記検出試薬の前記核酸配列の相補体にハイブリダイズすることができ、前記増幅テンプレートの前記５’及び３’末端ヌクレオチド配列が、前記内部配列と重複しない、請求項１１に記載の方法。
  16. 前記増幅テンプレートが、５’末端ヌクレオチド配列及び３’末端ヌクレオチド配列を含む直鎖増幅テンプレートを含み、前記５’及び３’末端ヌクレオチド配列が、前記検出配列にハイブリダイズすることができ、第１の内部配列が、アンカーオリゴヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズすることができ、第２の内部配列が、前記検出試薬の前記核酸配列の相補体にハイブリダイズすることができ、前記増幅テンプレートの前記５’及び３’末端ヌクレオチド配列が、前記第１及び第２の内部配列と重複しない、請求項１１に記載の方法。
  17. 前記３’及び５’末端配列の長さの合計が、約１４～約２４ヌクレオチドの長さである、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記３’及び５’末端配列の長さの合計が、約１４又は約１５ヌクレオチドの長さである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記増幅テンプレートが、５’－ＧＴＴＣＴＧＴＣ－３’（配列番号１６６６）の５’末端配列及び５’－ＧＴＧＴＣＴＡ－３’（配列番号１６６７）の３’末端配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記検出オリゴヌクレオチドが、前記増幅テンプレートの前記５’末端配列に相補的な第１の配列と、前記増幅テンプレートの前記３’末端配列に相補的な隣接する第２の配列とを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記増幅テンプレートが、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧ－３’（配列番号１６６８）のヌクレオチド配列を含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
  22. 前記増幅テンプレートが、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡ－３’（配列番号１６６９）のヌクレオチド配列を含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
  23. 前記増幅テンプレートが、５’－ＧＴＴＣＴＧＴＣＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＡ－３’（配列番号１６７０）からなる配列を含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
  24. 前記増幅テンプレートが、５’－ＧＣＴＧＴＧＣＡＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＡ－３’（配列番号１６７１）のヌクレオチド配列を含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
  25. 前記検出オリゴヌクレオチドが、５’－ＧＡＣＡＧＡＡＣＴＡＧＡＣＡＣ－３’（配列番号１６６４）の１４又は１５個の連続したヌクレオチドを含む、請求項２３又は２４に記載の方法。
  26. 前記増幅テンプレートが、長さが約５０～約７８ヌクレオチドの非天然オリゴヌクレオチド配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記増幅テンプレートの前記非天然オリゴヌクレオチド配列が、約５３～約７６ヌクレオチド、約５０～約７０ヌクレオチド、約５３～約６１ヌクレオチド、又は約５４～約６１ヌクレオチドの長さである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記増幅テンプレートの前記非天然オリゴヌクレオチド配列が、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、又は約７６ヌクレオチドの長さである、請求項２６又は２７に記載の方法。
  29. 前記増幅テンプレートの前記非天然オリゴヌクレオチド配列が、約６１ヌクレオチドの長さである、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記検出試薬の前記核酸配列が、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴ－３’（配列番号１６７２）の１４又は１５個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％配列同一性を有する核酸を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記検出試薬の前記核酸配列が、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴ－３’（配列番号１６７２）を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記検出試薬の前記核酸配列が、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧ－３’（配列番号１６６８）を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記アンカー試薬の前記アンカー配列が、長さが約１０～約３０の核酸のオリゴヌクレオチドを含む、請求項２～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記アンカー試薬の前記アンカー配列が、長さが約１７又は約２５のオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む、請求項２～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記アンカー試薬の前記アンカー配列が、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡ－３’（配列番号１６６９）を含む、請求項２～３３のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記アンカー試薬の前記アンカー配列が、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＧＣＣＧＴＣＡＡ－３’（配列番号１６６５）からなる、請求項２～３３のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記支持体表面が、１つ以上のカーボンベースの電極を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記支持体表面が、１つ以上のカーボンベースの電極を含むマルチウェルプレートを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記電極が、カーボンインク電極を含む、請求項３８又は３９に記載の方法。
  40. 前記支持体表面が、１つ以上のカーボンベースの電極を含むマルチウェルプレートを含み、複数の捕捉オリゴヌクレオチドが、個別のドメインで前記カーボンベースの電極上に固定化されている、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドが、アレイ内の個別の結合ドメインの前記支持体表面に固定化されている、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記標識が、電気化学発光（ＥＣＬ）標識を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記電極を、電気化学発光共反応物を含む電気化学発光読み取り緩衝液と接触させ、前記電極に電位を印加することによってアッセイシグナルを生成するステップを含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記支持体表面に固定化された前記捕捉オリゴヌクレオチドが、以下の要件、
    （ａ）約４０％～約５０％のＧＣ含量と、
    （ｂ）約３０～約７０％のＡＧ含量と、
    （ｃ）約３０％～約７０％のＣＴ含量と、
    （ｄ）３つ以下の配列での塩基リピートの最大列と、
    （ｅ）７つを超える相補的塩基対が連続して一致する列との望ましくないオリゴヌクレオチド－オリゴヌクレオチドの相互作用がないことと、
    （ｆ）１８個以下の連続した塩基の列との望ましくないオリゴヌクレオチド－オリゴヌクレオチドの相互作用がないことであって、
    （ｉ）両端の末端塩基が相補的に一致しており、
    （ｉｉ）前記相補的塩基対の一致の合計から不一致の合計を引いたものが７より大きい、相互作用がないことと、
    （ｇ）ゲノム又は自然界における配列若しくは配列の補体、又はその両方に一致する２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６塩基対以上の列がないことと、
    （ｈ）それらの補体を有する配列のハイブリダイゼーションの自由エネルギーの差は、約１ｋＣａｌ／モル、約２ｋＣａｌ／モル、約３ｋＣａｌ／モル、又は約４ｋＣａｌ／モル未満であることと、
    （ｉ）ステム内に４つ以上の連続した一致がある予測ヘアピンループがないことと、
    （ｊ）前記ステム内に４つ以上の連続した一致があり、ループサイズが６塩基を超える予測ヘアピンループがないことと、のうちの１つ以上を満たす非交差反応性オリゴヌクレオチドのセットから選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記支持体表面に固定化された前記捕捉オリゴヌクレオチドが、
    （ａ）配列番号１～６４から選択される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する捕捉オリゴヌクレオチドと、
    （ｂ）配列番号１～６４から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
    （ｃ）配列番号１～６４から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する捕捉オリゴヌクレオチドと、
    （ｄ）配列番号１～６４から選択される配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
    （ｅ）（ａ）～（ｄ）のうちのいずれかから選択される捕捉オリゴヌクレオチドと、から選択される、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記支持体表面に固定化された前記捕捉オリゴヌクレオチドが、
    （ａ）配列番号１～１０から選択される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
    （ｂ）配列番号１～１０から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
    （ｃ）配列番号１～１０から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する捕捉オリゴヌクレオチドと、
    （ｄ）配列番号１～１０から選択される配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
    （ｅ）（ａ）～（ｄ）のうちのいずれかから選択される捕捉オリゴヌクレオチドと、から選択される、請求項４４に記載の方法。
  47. サンプル中の標的ヌクレオチド配列を検出するためのキットであって、前記キットが、
    （ａ）１つ以上の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む支持体表面と、
    （ｂ）オリゴヌクレオチドタグ、標的補体、及び検出オリゴヌクレオチドを含む、検出プローブと、
    （ｃ）増幅テンプレートと、
    （ｄ）核酸リガーゼと、
    （ｅ）核酸ポリメラーゼと、
    （ｆ）標識及び核酸配列を含む、検出試薬と、を含む、キット。
  48. オリゴヌクレオチドタグ及びアンカーオリゴヌクレオチドを含む、アンカー試薬を更に含む、請求項４７に記載のキット。
  49. 前記アンカー試薬が、前記支持体表面上に固定されている、請求項４８に記載のキット。
  50. 前記アンカーオリゴヌクレオチドが、約１０～約３０核酸の長さである、請求項４８又は４９に記載のキット。
  51. 前記アンカーオリゴヌクレオチドが、１７又は２５オリゴヌクレオチドの長さである、請求項５０に記載のキット。
  52. 前記アンカーオリゴヌクレオチドが、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡ－３’（配列番号１６６９）を含む、請求項４８～５０のいずれか一項に記載のキット。
  53. 前記アンカーオリゴヌクレオチドが、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＧＣＣＧＴＣＡＡ－３’（配列番号１６６５）からなる、請求項４８～５０のいずれか一項に記載のキット。
  54. 前記増幅テンプレートが、５’末端ヌクレオチド配列及び３’末端ヌクレオチド配列を含む直鎖増幅テンプレートを含み、前記５’及び３’末端ヌクレオチド配列が、前記検出配列にハイブリダイズすることができ、内部ヌクレオチド配列が、前記アンカー試薬の前記アンカー配列の相補体にハイブリダイズすることができ、前記増幅テンプレートの前記５’及び３’末端ヌクレオチド配列が、前記内部配列と重複しない、請求項４７～５３のいずれか一項に記載のキット。
  55. 前記増幅テンプレートが、５’末端ヌクレオチド配列及び３’末端ヌクレオチド配列を含む直鎖増幅テンプレートを含み、前記５’及び３’末端ヌクレオチド配列が、前記検出配列にハイブリダイズすることができ、第１の内部ヌクレオチド配列が、前記アンカー試薬の前記アンカー配列の相補体にハイブリダイズすることができ、第２の内部ヌクレオチド配列は、前記検出試薬の前記核酸配列の相補体にハイブリダイズすることができ、前記増幅テンプレートの前記５’及び３’末端ヌクレオチド配列が、前記第１及び第２の内部配列と重複しない、請求項４７～５３のいずれか一項に記載のキット。
  56. 前記増幅テンプレートが、５’末端ホスフェート基を含む、請求項５４又は５５に記載のキット。
  57. 前記増幅テンプレートが、約５３～約６１ヌクレオチドの長さである、請求項４７～５７のいずれか一項に記載のキット。
  58. 前記５’及び３’末端配列の長さの合計が、約１４～約２４ヌクレオチドの長さである、請求項５４～５７のいずれか一項に記載のキット。
  59. 前記３’及び５’末端配列の長さの合計が、約１４～約１９ヌクレオチドの長さである、請求項５８に記載のキット。
  60. 前記３’及び５’末端配列の長さの合計が、約１４又は約１５ヌクレオチドの長さである、請求項５８に記載のキット。
  61. 前記増幅テンプレートが、５’－ＧＴＴＣＴＧＴＣ－３’（配列番号１６６６）の５’末端配列及び５’－ＧＴＧＴＣＴＡ－３’（配列番号１６６７）の３’末端配列を含む、請求項４７～６０のいずれか一項に記載のキット。
  62. 前記増幅テンプレートが、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧ－３’（配列番号１６６８）のヌクレオチド配列を含む、請求項４７～６０のいずれか一項に記載のキット。
  63. 前記増幅テンプレートが、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡ－３’（配列番号１６６９）のヌクレオチド配列を含む、請求項４７～６０のいずれか一項に記載キット。
  64. 前記増幅テンプレートが、５’－ＧＴＴＣＴＧＴＣＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＡ－３’（配列番号１６７０）からなる配列を含む、請求項４７～６０のいずれか一項に記載のキット。
  65. 前記増幅テンプレートが、５’－ＧＣＴＧＴＧＣＡＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＡ－３’（配列番号１６７１）のヌクレオチド配列を含む、請求項４７～６０のいずれか一項に記載のキット。
  66. 前記増幅テンプレートが、環状増幅テンプレートを含む、請求項４７に記載のキット。
  67. 前記検出プローブが、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグ、一本鎖ＲＮＡ標的相補体、及び一本鎖ＤＮＡ検出オリゴヌクレオチドを含む、請求項４７～６６のいずれか一項に記載のキット。
  68. 前記アンカー試薬が、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグ及び一本鎖ＤＮＡアンカー配列を含む、請求項６７に記載のキット。
  69. ＲＮａｓｅを含む、請求項６７又は６８に記載のキット。
  70. 前記検出プローブの前記検出オリゴヌクレオチドが、前記増幅テンプレートの前記５’末端配列に相補的な第１の配列と、前記増幅テンプレートの前記３’末端配列に相補的な隣接する第２の配列とを含む、請求項５４又は５５に記載のキット。
  71. 前記検出試薬の前記核酸配列が、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴ－３’（配列番号１６７２）の１４又は１５個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも９０％配列同一性を有する配列を含む、請求項４７～７０のいずれか一項に記載のキット。
  72. 前記検出試薬の前記核酸配列が、前記配列５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴ－３’（配列番号１６７２）を含む、請求項４７～７０のいずれか一項に記載のキット。
  73. 前記検出試薬の前記核酸配列が、前記配列５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧ－３’（配列番号１６６８）を含む、請求項４７～７０のいずれか一項に記載のキット。
  74. 前記検出試薬の前記標識が、電気化学発光（ＥＣＬ）標識を含む、請求項４７～７３のいずれか一項に記載のキット。
  75. 前記支持体表面が、カーボンベースの支持体表面を含む、請求項４７～７４のいずれか一項に記載のキット。
  76. 前記支持体表面が、カーボンベースの電極を含む、請求項４７～７５のいずれか一項に記載のキット。
  77. 前記支持体表面が、カーボンインク電極を含む、請求項４７～７６のいずれか一項に記載のキット。
  78. 前記支持体表面が、マルチウェルプレートアッセイの消耗品を含み、前記プレートの各ウェルが、カーボンインク電極を含む、請求項４７～７７のいずれか一項に記載のキット。
  79. 前記支持体表面が、ビーズを含む、請求項４７に記載のキット。
  80. 複数の捕捉オリゴヌクレオチドが、個別の結合ドメイン内の固相支持体上に固定化され、アレイを形成する、請求項４７～７８のいずれか一項に記載のキット。
  81. 複数捕捉オリゴヌクレオチド及び少なくとも１つのアンカー試薬が、個別の結合ドメイン内の前記固相支持体上に固定化され、アレイを形成し、各結合ドメインが、前記複数の捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つ及び少なくとも１つのアンカー試薬を含む、請求項８０に記載のキット。
  82. 前記支持体表面に固定化された前記捕捉オリゴヌクレオチドが、以下の要件、
    （ａ）約４０％～約５０％のＧＣ含量と、
    （ｂ）約３０～約７０％のＡＧ含量と、
    （ｃ）約３０％～約７０％のＣＴ含量と、
    （ｄ）３つ以下の配列での塩基リピートの最大列と、
    （ｅ）７つを超える相補的塩基対が連続して一致する列との望ましくないオリゴヌクレオチド－オリゴヌクレオチドの相互作用がないことと、
    （ｆ）１８個以下の連続した塩基の列との望ましくないオリゴヌクレオチド－オリゴヌクレオチドの相互作用がないことであって、
    （ｉ）両端の末端塩基が相補的に一致しており、
    （ｉｉ）前記相補的塩基対の一致の合計から不一致の合計を引いたものが７より大きい、相互作用がないことと、
    （ｇ）ゲノム又は自然界における配列若しくは配列の補体、又はその両方に一致する２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６塩基対以上の列がないことと、
    （ｈ）それらの補体を有する配列のハイブリダイゼーションの自由エネルギーの差は、約１ｋＣａｌ／モル、約２ｋＣａｌ／モル、約３ｋＣａｌ／モル、又は約４ｋＣａｌ／モル未満であることと、
    （ｉ）ステム内に４つ以上の連続した一致がある予測ヘアピンループがないことと、
    （ｊ）前記ステム内に４つ以上の連続した一致があり、ループサイズが６塩基を超える予測ヘアピンループがないことと、のうちの１つ以上を満たす非交差反応性オリゴヌクレオチドのセットから選択される、請求項４７～８１のいずれか一項に記載のキット。
  83. 前記支持体表面上に固定化された前記捕捉オリゴヌクレオチドが、
    （ａ）配列番号１～６４から選択される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する捕捉オリゴヌクレオチドと、
    （ｂ）配列番号１～６４から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
    （ｃ）配列番号１～６４から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する捕捉オリゴヌクレオチドと、
    （ｄ）配列番号１～６４から選択される配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
    （ｅ）（ａ）～（ｄ）のうちのいずれかから選択される捕捉オリゴヌクレオチドと、から選択される、請求項８２に記載のキット。
  84. 前記支持体表面上に固定化された前記捕捉オリゴヌクレオチドが、
    （ａ）配列番号１～１０から選択される配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
    （ｂ）配列番号１～１０から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
    （ｃ）配列番号１～１０から選択される配列に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６個の連続したヌクレオチドを有する捕捉オリゴヌクレオチドと、
    （ｄ）配列番号１～１０から選択される配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドと、
    （ｅ）（ａ）～（ｄ）のうちのいずれかから選択される捕捉オリゴヌクレオチドと、から選択される、請求項８２に記載のキット。
  85. サンプル中の標的ヌクレオチド配列を検出するためのキットであって、前記キットが、
    （ａ）１つ以上の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む支持体表面と、
    （ｂ）オリゴヌクレオチドタグ及びアンカーオリゴヌクレオチドを含む、アンカー試薬と、
    （ｃ）オリゴヌクレオチドタグ、標的補体、及び一本鎖ＤＮＡ検出オリゴヌクレオチドを含む、検出プローブと、
    （ｄ）電気化学発光（ＥＣＬ）標識及び核酸配列を含む、検出試薬と、
    （ｅ）５’末端ヌクレオチド配列及び３’末端ヌクレオチド配列を含む直鎖増幅テンプレートであって、前記５’及び３’末端ヌクレオチド配列が、前記検出配列にハイブリダイズすることができ、第１の内部ヌクレオチド配列が、前記アンカー試薬の前記アンカー配列の相補体にハイブリダイズすることができ、第２の内部ヌクレオチド配列が、前記検出試薬の前記核酸配列の相補体にハイブリダイズすることができ、前記増幅テンプレートの前記５’及び３’末端ヌクレオチド配列が、前記第１及び第２の内部配列と重複しない、直鎖増幅テンプレートと、
    （ｆ）核酸リガーゼと、
    （ｇ）核酸ポリメラーゼと、を含む、キット。
  86. 前記アンカー試薬が、前記支持体表面上に固定されている、請求項８５に記載のキット。
  87. 前記アンカー試薬が、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグ及び一本鎖ＤＮＡアンカーオリゴヌクレオチドを含み、前記検出プローブが、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグ、一本鎖ＲＮＡ標的補体及び一本鎖ＤＮＡ検出オリゴヌクレオチドを含み、前記キットが、ＲＮａｓｅを更に含む、請求項８５又は８６に記載のキット。
  88. サンプル中の標的ヌクレオチド配列を検出するためのキットであって、前記キットが、
    （ａ）固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む支持体表面と、
    （ｂ）一本鎖オリゴヌクレオチドタグ及び前記サンプル中の前記標的ヌクレオチド配列の第１の領域に相補的である第１の核酸配列を含む標的化プローブと、
    （ｃ）検出オリゴヌクレオチド及び前記標的ヌクレオチド配列の第２の領域に相補的である第２の核酸配列を含む、検出プローブであって、前記標的化プローブの前記第１の核酸配列及び前記検出プローブの第２の核酸配列が、前記標的ヌクレオチドの隣接する配列に相補的である、検出プローブと、
    （ｄ）増幅テンプレートと、
    （ｅ）核酸リガーゼと、
    （ｆ）核酸ポリメラーゼと、
    （ｇ）標識及び核酸配列を含む、検出試薬と、を含む、キット。
  89. 前記標的化プローブが、前記検出プローブの前記５’末端ヌクレオチドが相補的である前記領域に隣接する前記標的ヌクレオチド配列の領域に相補的な末端３’ヌクレオチドを有する、請求項８８に記載のキット。
  90. 前記標的化プローブの前記末端３’ヌクレオチドが、前記標的ヌクレオチド配列の多型ヌクレオチドに相補的である、請求項８９に記載のキット。
  91. サンプル中の標的ヌクレオチド配列を検出するためのキットであって、前記キットが、
    （ａ）固定化された捕捉オリゴヌクレオチドを含む支持体表面と、
    （ｂ）オリゴヌクレオチドタグ及びアンカーオリゴヌクレオチドを含む、アンカー試薬と、
    （ｃ）一本鎖オリゴヌクレオチドタグ及び前記サンプル中の前記標的ヌクレオチド配列の第１の領域に相補的である第１の核酸配列を含む標的化プローブと、
    （ｄ）検出オリゴヌクレオチド及び前記標的ヌクレオチド配列の第２の領域に相補的である第２の核酸配列を含む、検出プローブであって、前記標的化プローブの前記第１の核酸配列及び前記検出プローブの第２の核酸配列が、前記標的ヌクレオチドの隣接する配列に相補的である、検出プローブと、
    （ｅ）５’末端ヌクレオチド配列及び３’末端ヌクレオチド配列を含む直鎖増幅テンプレートであって、前記５’及び３’末端ヌクレオチド配列が、前記検出配列にハイブリダイズすることができ、第１の内部ヌクレオチド配列が、前記アンカー試薬の前記アンカー配列の相補体にハイブリダイズすることができ、第２の内部ヌクレオチド配列が、前記検出試薬の前記核酸配列の相補体にハイブリダイズすることができ、前記増幅テンプレートの前記５’及び３’末端ヌクレオチド配列が、前記第１及び第２の内部配列と重複しない、直鎖増幅テンプレートと、
    （ｆ）核酸リガーゼと、
    （ｇ）核酸ポリメラーゼと、
    （ｈ）電気化学発光（ＥＣＬ）標識及び核酸配列を含む、検出試薬と、を含む、キット。
  92. 直鎖増幅テンプレート並びに、ライゲーション緩衝液、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、及びそれらの組み合わせから選択される、１つ以上の追加の成分を含む検出混合物を更に含む、請求項４７～９１のいずれか一項に記載のキット。
  93. 前記検出混合物が、ＢＳＡ、緩衝液、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、又はそれらの組み合わせから選択されるローリングサークル増幅のための１つ以上の成分を含む、請求項９２に記載のキット。
  94. 前記検出混合物が、アセチル－ＢＳＡを含む、請求項９２又は９３に記載のキット。
  95. ＥＣＬ読み取り緩衝液を更に含む、請求項４７～９１のいずれか一項に記載のキット。
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