JP2004065199A - ビーズ上で行う核酸増幅方法および核酸検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】液中での反応効率が高く特異的な核酸増幅が可能になる。また、操作が簡単ですぐに結果が出る実用性の高い核酸検出方法を提供する。
【解決手段】化学的に修飾されたビーズにプライマーを付加させる工程、前記プライマーが付加されたビーズ上で核酸増幅反応を行う工程を有する核酸増幅方法、および核酸検出方法。
【選択図】 図2
【解決手段】化学的に修飾されたビーズにプライマーを付加させる工程、前記プライマーが付加されたビーズ上で核酸増幅反応を行う工程を有する核酸増幅方法、および核酸検出方法。
【選択図】 図2
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸増幅方法に関する。特に、複数の増幅領域があっても非特異的反応が生ずる恐れがなく、かつ臨床現場での適用可能性の高い核酸増幅方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
従来、液中における核酸増幅反応は、1種類のサンプルをモニタリングするのに2本のプライマーを用いて、鋳型となる核酸に対してターゲット領域を10万倍以上に増幅する。検出方法に関しては、タックマン(TaqMan)PCR法、インベーダー(Invader)法、およびスナイパー(SniPer)法等で一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphisms:以下SNPsという)の検出が行われてきた。
【0003】
一方、ビーズを核酸検出に用いることが行うことが知られている。また、特開2002−85097号公報には、DNA断片をビーズに固定し、DNA断片の他端にオリゴマーを付加させる反応が開示されている。しかし、特開2002−85097号公報は、ビーズを化学的に修飾することおよび増幅反応を行うことは開示していない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来のSNPタイピングにおいては、▲1▼工程数が多い、▲2▼アレル特異的プローブの5’末端に蛍光物質が2種類必要である、および▲3▼SNPsのタイピングの前に増幅反応を行う必要がある、▲4▼複数の増幅領域がある場合に非特異的な増幅が生じてしまうという欠点を持っている。(中村裕輔編集「SNP遺伝子多型の戦略」中山書店p.p.94〜105等)
一塩基多型の検出のために核酸増幅反応を行うときには、複数の増幅領域を同じ反応系で増幅させるため2種類以上のプライマーが必要となり、1塩基の違いを判別することができず、非特異的な増幅が生じてしまう(図4)。また、臨床現場での実現という観点から、複雑な検出機構の回避を行わなければならない。
【0005】
臨床現場では、技師等が検査を行うことが多いため、複雑な操作を行うことは好ましくない。
よって、複数の増幅領域を有する場合でも非特異的増幅を阻害するとともに、操作が簡単で、すぐに結果が出る実用性の高い検出システムの開発が望まれていた。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ビーズ上で拡散増幅反応を行うことで上記課題を解決した。即ち、第1に本発明は、化学的に修飾されたビーズに合成オリゴヌクレオチドであるプライマーを付加させる工程、前記プライマーが付加されたビーズ上で核酸増幅反応を行う工程を有する核酸増幅方法である。
【0007】
本発明で言うビーズとは、ポリスチレン、ガラス、セラミックス、磁性体製等の直径数ミクロン程度の微小粒子であり、マイクロスフィアとも呼ばれているものである。本発明では、ビーズは限定されず、ポリスチレン製が好ましく例示される。
【0008】
前記核酸増幅反応は、プライマーを化学的に修飾されたビーズに結合させて行うことが好ましい。プライマーと化学的に修飾されたビーズを結合させる連結基は特に限定されないが、カルボジイミドカップリング反応によるものが好ましく例示される。この場合、具体的には、EDC(1−Ethyl−3−(3−Dimethylaminopropyl)−Carbodiimidehydrochloride)が好ましく用いられる。
【0009】
前記核酸増幅反応としては限定されないが、PCR(Polymerase Chain Reaction)法やLAMP(Loop−mediated Isothermal Amplification)法が好ましい。LAMP法はPCR法とは異なり常温で行うことができるので、ポリスチレン製のビーズを用いる場合でも、球形ビーズの変形を防止するという効果もある。
前記核酸は、DNAまたはRNA、特に変異したDNAまたはRNAであることができる。
【0010】
第2に、本発明は、上記各工程に加えて、前記核酸増幅反応の際に標識物質を取り込み、前記標識物質を検出する工程を有することができる。ビーズを用い、蛍光発光を検出する方法は既に知られており、これら検出技術を本発明に適用することができる。前記標識物質は限定されないが、Cy3等の蛍光物質、またビオチン、またはアミノアリルを介して蛍光物質によって検出する方法が好ましく例示される。
【0011】
第3に、本発明は、上記核酸増幅反応を利用した核酸配列決定方法であり、第4に、核酸変異検出方法である。特に、前記核酸変異検出が1塩基多型(SNPs)であり、遺伝子診断に用いられると効果的である。
【0012】
第5に、本発明は、上記核酸増幅反応が、臨床用として行われることを特徴とする核酸検出システムである。
【0013】
本発明によれば、一方のプライマーをビーズ上に固定し、目的の遺伝子だけを特異的に増幅させることが可能である。また、ビーズはDNAマイクロアレイまたはDNAチップなどの固体表面と異なり、反応液中に浮遊するので反応効率が高いという利点がある。
【0014】
【発明の実施の形態】
本発明の実施例以下に示す。
本実施例において、ビーズは、ポリスチレン製、カルボキシル基で被膜された直径5.5μmのビーズ(Luminex社製)を用いた。結合するDNAは、5’末端を炭素スペーサー(C6)を介してアミノ化した。このC6スペーサーと、プライマー配列の間の塩基によるスペーサーは任意である。このDNAを、カップリング剤にEDC(1−Ethyl−3−(3−Dimethylaminopropyl)−Carbodiimidehydrochloride)を用いてカルボジイミドカップリング反応によって、ビーズ上に共有結合させた。
【0015】
検出は、PCR反応の際に、Cy3−dUTPもしくはビオチン−dUTPもしくはアミノアリル−dUTPを取り込むことによりCy3またはフィコエリスリンの蛍光を検出する。
【0016】
ビーズへのプライマーの結合は以下の通りとした。
[1]200μlのビーズ(2.5×106個/ml)をチューブに移す。
[2]ビーズを12,000rpmで10分間遠心分離して上澄みを取り除く。
[3]50μlの0.1M MES pH4.5(2[N−Morpholino]EthaneSulfonic acid monohydrate;MES 0.976g, 5N NaCl)と合成オリゴヌクレオチド Primer1(1mM, 1μl)を加える。
[4]2.5ulのEDC(EDC 0.01g, 滅菌蒸留水 1ml)溶液をビーズのサンプルに加える。
[5]暗室で30分間インキュベートする。
[6]EDC溶液を再調節し、[4]〜[5]を繰り返す。
[7]ビーズを12,000rpmで5分間遠心分離して、上澄みを取り除く。
[8]ビーズに1mlのTween20(0.02%v/v)を加える。
[9]混合液を12,000rpmで5分間遠心して上澄みを取り除く。
[10]1mlのSDS 0.1%w/v(Sodium Dodecyl Sulphate)を加える。
【0017】
次にLuminex100システムによって結合確認を行った。検出のためのハイブリダイゼーションは以下の通りとした(図1)。
[1]1種類のビーズ当り5,000個になるようにTMAC(TetraMethylAmmonium Chloride :TMAC 50ml;5M TMAC 30ml, 20% Sarcosyl (sodium N−lauroyl−sarcosine) 250μl, Tris−HCl pH8.0 2.5ml, 0.5M EDTA(EthyleneDiaminoTetra−Acetate)pH8.0 400μl)30μlにビーズを溶かし、55℃でインキュベートする。
[2]1μMのビーズに結合させたオリゴヌクレオチドPrimer1と相補的な配列で、5’末端をビオチン化されたオリゴヌクレオチド1μM,1μlと蒸留水49μlを[1]に加え、55℃で20分インキュベートする。
[3]TMAC100μlあたりStreptavidin, R−phycoerythrin (Molecular Probes)を1μl加えて55℃でインキュベートする。
[4][2]に[3]を10μl加え、さらに55℃で5分間インキュベートする。
[5]Luminex100システムで蛍光強度を測定する(図2)。
【0018】
次に、ビーズ上でのDNA増幅確認をPCR反応にて行った。PCR反応液の組成を表1に示す。
【表1】
【0019】
反応条件を表2に示す。これを24サイクル行った。
【表2】
【0020】
PCR反応の結果を電気泳動によって検出した(図3)。レーン1では、濃度が5μMであるビーズ未結合のプライマー(フリープライマー)だけでPCR反応を行った。レーン2〜7では、ビーズに結合したプライマーと、濃度が5μMであるフリープライマーを添加してPCR反応を行った。レーン8では、ビーズに結合したプライマーだけを用いた。レーン9はポジティブコントロールであり、ビーズが未添加で2本のプライマー濃度がそれぞれ20μMの高濃度である。
【0021】
検出の際には、表3のPCR反応液の組成でPCR反応を行った。
【表3】
PCR産物を直接、Luminex100システムまたはフローサイトメトリーにて検出した。
【0022】
【発明の効果】
ビーズ上の核酸増幅を行うことで、液中での反応効率が高く特異的な核酸増幅が可能になる。また、操作が簡単ですぐに結果が出る実用性の高い核酸検出システムが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図1】ビーズへのオリゴヌクレオチドの結合確認検出の模式図を示す。
【図2】ビーズへのオリゴヌクレオチド結合確認の結果を示す。
【図3】PCR幅反応後の2%アガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図4】従来のマルチプレックス増幅反応とビーズ上で行うマルチプレクス増幅反応のイメージ図
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸増幅方法に関する。特に、複数の増幅領域があっても非特異的反応が生ずる恐れがなく、かつ臨床現場での適用可能性の高い核酸増幅方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
従来、液中における核酸増幅反応は、1種類のサンプルをモニタリングするのに2本のプライマーを用いて、鋳型となる核酸に対してターゲット領域を10万倍以上に増幅する。検出方法に関しては、タックマン(TaqMan)PCR法、インベーダー(Invader)法、およびスナイパー(SniPer)法等で一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphisms:以下SNPsという)の検出が行われてきた。
【0003】
一方、ビーズを核酸検出に用いることが行うことが知られている。また、特開2002−85097号公報には、DNA断片をビーズに固定し、DNA断片の他端にオリゴマーを付加させる反応が開示されている。しかし、特開2002−85097号公報は、ビーズを化学的に修飾することおよび増幅反応を行うことは開示していない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来のSNPタイピングにおいては、▲1▼工程数が多い、▲2▼アレル特異的プローブの5’末端に蛍光物質が2種類必要である、および▲3▼SNPsのタイピングの前に増幅反応を行う必要がある、▲4▼複数の増幅領域がある場合に非特異的な増幅が生じてしまうという欠点を持っている。(中村裕輔編集「SNP遺伝子多型の戦略」中山書店p.p.94〜105等)
一塩基多型の検出のために核酸増幅反応を行うときには、複数の増幅領域を同じ反応系で増幅させるため2種類以上のプライマーが必要となり、1塩基の違いを判別することができず、非特異的な増幅が生じてしまう(図4)。また、臨床現場での実現という観点から、複雑な検出機構の回避を行わなければならない。
【0005】
臨床現場では、技師等が検査を行うことが多いため、複雑な操作を行うことは好ましくない。
よって、複数の増幅領域を有する場合でも非特異的増幅を阻害するとともに、操作が簡単で、すぐに結果が出る実用性の高い検出システムの開発が望まれていた。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ビーズ上で拡散増幅反応を行うことで上記課題を解決した。即ち、第1に本発明は、化学的に修飾されたビーズに合成オリゴヌクレオチドであるプライマーを付加させる工程、前記プライマーが付加されたビーズ上で核酸増幅反応を行う工程を有する核酸増幅方法である。
【0007】
本発明で言うビーズとは、ポリスチレン、ガラス、セラミックス、磁性体製等の直径数ミクロン程度の微小粒子であり、マイクロスフィアとも呼ばれているものである。本発明では、ビーズは限定されず、ポリスチレン製が好ましく例示される。
【0008】
前記核酸増幅反応は、プライマーを化学的に修飾されたビーズに結合させて行うことが好ましい。プライマーと化学的に修飾されたビーズを結合させる連結基は特に限定されないが、カルボジイミドカップリング反応によるものが好ましく例示される。この場合、具体的には、EDC(1−Ethyl−3−(3−Dimethylaminopropyl)−Carbodiimidehydrochloride)が好ましく用いられる。
【0009】
前記核酸増幅反応としては限定されないが、PCR(Polymerase Chain Reaction)法やLAMP(Loop−mediated Isothermal Amplification)法が好ましい。LAMP法はPCR法とは異なり常温で行うことができるので、ポリスチレン製のビーズを用いる場合でも、球形ビーズの変形を防止するという効果もある。
前記核酸は、DNAまたはRNA、特に変異したDNAまたはRNAであることができる。
【0010】
第2に、本発明は、上記各工程に加えて、前記核酸増幅反応の際に標識物質を取り込み、前記標識物質を検出する工程を有することができる。ビーズを用い、蛍光発光を検出する方法は既に知られており、これら検出技術を本発明に適用することができる。前記標識物質は限定されないが、Cy3等の蛍光物質、またビオチン、またはアミノアリルを介して蛍光物質によって検出する方法が好ましく例示される。
【0011】
第3に、本発明は、上記核酸増幅反応を利用した核酸配列決定方法であり、第4に、核酸変異検出方法である。特に、前記核酸変異検出が1塩基多型(SNPs)であり、遺伝子診断に用いられると効果的である。
【0012】
第5に、本発明は、上記核酸増幅反応が、臨床用として行われることを特徴とする核酸検出システムである。
【0013】
本発明によれば、一方のプライマーをビーズ上に固定し、目的の遺伝子だけを特異的に増幅させることが可能である。また、ビーズはDNAマイクロアレイまたはDNAチップなどの固体表面と異なり、反応液中に浮遊するので反応効率が高いという利点がある。
【0014】
【発明の実施の形態】
本発明の実施例以下に示す。
本実施例において、ビーズは、ポリスチレン製、カルボキシル基で被膜された直径5.5μmのビーズ(Luminex社製)を用いた。結合するDNAは、5’末端を炭素スペーサー(C6)を介してアミノ化した。このC6スペーサーと、プライマー配列の間の塩基によるスペーサーは任意である。このDNAを、カップリング剤にEDC(1−Ethyl−3−(3−Dimethylaminopropyl)−Carbodiimidehydrochloride)を用いてカルボジイミドカップリング反応によって、ビーズ上に共有結合させた。
【0015】
検出は、PCR反応の際に、Cy3−dUTPもしくはビオチン−dUTPもしくはアミノアリル−dUTPを取り込むことによりCy3またはフィコエリスリンの蛍光を検出する。
【0016】
ビーズへのプライマーの結合は以下の通りとした。
[1]200μlのビーズ(2.5×106個/ml)をチューブに移す。
[2]ビーズを12,000rpmで10分間遠心分離して上澄みを取り除く。
[3]50μlの0.1M MES pH4.5(2[N−Morpholino]EthaneSulfonic acid monohydrate;MES 0.976g, 5N NaCl)と合成オリゴヌクレオチド Primer1(1mM, 1μl)を加える。
[4]2.5ulのEDC(EDC 0.01g, 滅菌蒸留水 1ml)溶液をビーズのサンプルに加える。
[5]暗室で30分間インキュベートする。
[6]EDC溶液を再調節し、[4]〜[5]を繰り返す。
[7]ビーズを12,000rpmで5分間遠心分離して、上澄みを取り除く。
[8]ビーズに1mlのTween20(0.02%v/v)を加える。
[9]混合液を12,000rpmで5分間遠心して上澄みを取り除く。
[10]1mlのSDS 0.1%w/v(Sodium Dodecyl Sulphate)を加える。
【0017】
次にLuminex100システムによって結合確認を行った。検出のためのハイブリダイゼーションは以下の通りとした(図1)。
[1]1種類のビーズ当り5,000個になるようにTMAC(TetraMethylAmmonium Chloride :TMAC 50ml;5M TMAC 30ml, 20% Sarcosyl (sodium N−lauroyl−sarcosine) 250μl, Tris−HCl pH8.0 2.5ml, 0.5M EDTA(EthyleneDiaminoTetra−Acetate)pH8.0 400μl)30μlにビーズを溶かし、55℃でインキュベートする。
[2]1μMのビーズに結合させたオリゴヌクレオチドPrimer1と相補的な配列で、5’末端をビオチン化されたオリゴヌクレオチド1μM,1μlと蒸留水49μlを[1]に加え、55℃で20分インキュベートする。
[3]TMAC100μlあたりStreptavidin, R−phycoerythrin (Molecular Probes)を1μl加えて55℃でインキュベートする。
[4][2]に[3]を10μl加え、さらに55℃で5分間インキュベートする。
[5]Luminex100システムで蛍光強度を測定する(図2)。
【0018】
次に、ビーズ上でのDNA増幅確認をPCR反応にて行った。PCR反応液の組成を表1に示す。
【表1】
【0019】
反応条件を表2に示す。これを24サイクル行った。
【表2】
【0020】
PCR反応の結果を電気泳動によって検出した(図3)。レーン1では、濃度が5μMであるビーズ未結合のプライマー(フリープライマー)だけでPCR反応を行った。レーン2〜7では、ビーズに結合したプライマーと、濃度が5μMであるフリープライマーを添加してPCR反応を行った。レーン8では、ビーズに結合したプライマーだけを用いた。レーン9はポジティブコントロールであり、ビーズが未添加で2本のプライマー濃度がそれぞれ20μMの高濃度である。
【0021】
検出の際には、表3のPCR反応液の組成でPCR反応を行った。
【表3】
PCR産物を直接、Luminex100システムまたはフローサイトメトリーにて検出した。
【0022】
【発明の効果】
ビーズ上の核酸増幅を行うことで、液中での反応効率が高く特異的な核酸増幅が可能になる。また、操作が簡単ですぐに結果が出る実用性の高い核酸検出システムが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図1】ビーズへのオリゴヌクレオチドの結合確認検出の模式図を示す。
【図2】ビーズへのオリゴヌクレオチド結合確認の結果を示す。
【図3】PCR幅反応後の2%アガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図4】従来のマルチプレックス増幅反応とビーズ上で行うマルチプレクス増幅反応のイメージ図
Claims (11)
- 化学的に修飾されたビーズにプライマーを付加させる工程、前記プライマーが付加されたビーズ上で核酸増幅反応を行う工程を有する核酸増幅方法。
- 前記化学的に修飾されたビーズは、ビーズ表面がカルボキシル基で被覆されたものであることを特徴とする請求項1に記載の核酸増幅方法。
- 前記核酸増幅反応は、プライマーを化学的に修飾されたビーズに結合させて行うことを特徴とする請求項1または2に記載の核酸増幅方法。
- 前記化学的に修飾されたビーズとプライマーとの結合は、カルボジイミドカップリング反応によるものであることを特徴とする請求項3に記載の核酸増幅方法。
- 前記核酸増幅反応が、PCR(Polymerase Chain Reaction)法またはLAMP(Loop−mediated Isothermal Amplification)法であることを特徴とする請求項1から4のいずれかに記載の核酸増幅方法。
- 前記核酸は、DNAまたはRNAであることを特徴とする請求項1から5のいずれかに記載の核酸増幅方法。
- 前記核酸増幅反応の際に標識物質を取り込み、前記標識物質を検出する工程を有することを特徴とする請求項1から6のいずれかに記載の核酸増幅方法。
- 前記標識物質が、Cy3、ビオチン、またはアミノアリルであることを特徴とする請求項7に記載の核酸増幅方法。
- 請求項1から8のいずれかに記載の核酸増幅反応が、核酸変異検出に利用されることを特徴とする核酸変異検出方法。
- 前記核酸変異検出が1塩基多型(SNPs)検出であることを特徴とする請求項9に記載の核酸変異検出方法。
- 請求項1から10のいずれかに記載の核酸増幅反応が、臨床用として行われることを特徴とする核酸検出システム。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002232964A JP2004065199A (ja) | 2002-08-09 | 2002-08-09 | ビーズ上で行う核酸増幅方法および核酸検出方法 |
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Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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JP2004065199A true JP2004065199A (ja) | 2004-03-04 |
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ID=32018213
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---|---|---|---|
JP2002232964A Pending JP2004065199A (ja) | 2002-08-09 | 2002-08-09 | ビーズ上で行う核酸増幅方法および核酸検出方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010223655A (ja) * | 2009-03-23 | 2010-10-07 | Panasonic Corp | センサおよびシーケンサー |
WO2021251445A1 (ja) * | 2020-06-12 | 2021-12-16 | 学校法人日本大学 | 核酸増幅反応用多層化プレミクス試薬およびReady to use核酸増幅反応キット |
-
2002
- 2002-08-09 JP JP2002232964A patent/JP2004065199A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010223655A (ja) * | 2009-03-23 | 2010-10-07 | Panasonic Corp | センサおよびシーケンサー |
WO2021251445A1 (ja) * | 2020-06-12 | 2021-12-16 | 学校法人日本大学 | 核酸増幅反応用多層化プレミクス試薬およびReady to use核酸増幅反応キット |
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