JP2003522527A - 一塩基多型の検出 - Google Patents

一塩基多型の検出

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JP2003522527A JP2001548756A JP2001548756A JP2003522527A JP 2003522527 A JP2003522527 A JP 2003522527A JP 2001548756 A JP2001548756 A JP 2001548756A JP 2001548756 A JP2001548756 A JP 2001548756A JP 2003522527 A JP2003522527 A JP 2003522527A
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チェン，ジンウェン
コルトン，ヘイディ，エム．
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    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Abstract

(57)【要約】 第1核酸中の所定のヌクレオチドを可動性固相支持体を用いて同定する方法、および標的核酸中の核酸多型の検出用の可動性固相支持体に基づく読み取り技術の用途を改良するための新規読み取り方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】背景 発明の分野 本発明は、核酸サンプルにおける一塩基多型(SNP)の高速検出方法を提供する
。本発明はさらに新規の読取り(readout)方法を提供して、標的核酸中の核酸多
型を検出するための可動性固体支持体利用型読取り技術の使用を改善する。上記
方法は、ゲノムDNA、および増幅DNA、RNAなどにおけるSNPの検出に利用でき、つ
まりこれらを様々な目的、例えば遺伝子型分類(ヒトおよび他の動物における疾
患突然変異検出および血統(parentage)決定などのため)、病原体検出および同定
、ならびに示差的遺伝子発現のために活用できるようにする。本発明はさらに、
核酸の比較的短い部分のランオフ配列決定反応を利用して核酸を同定する方法を
提供する。この方法は、例えば、ESTの小さい部分のみからESTを同定するために
、またヌクレオチド多型の分析において利用できる。反応を多重化(multiplex)
して、データ読出し容量を増加することができる。
【０００２】背景技術 単一塩基多型を検出する方法は、典型的に、ハイブリダイゼーション反応を必
要としてきた。例えば、Luminex FlowMetrix利用型SNP分析を行う方法は、２つ
の異なる色のFACS分析可能ビーズに対するPCR産物の差次的ハイブリダイゼーシ
ョンを必要とする。FlowMetrix系は、現在、８つの濃度の２種類の染料(オレン
ジおよび赤)で染色された、均一な大きさの５ミクロンポリスチレン-ジビニルベ
ンゼンビーズからなる。８つの濃度の２種類の染料からなるマトリックスによっ
て、Luminex PCコンピュータボードで適宜改変されたFACScaliburによりそれぞ
れ区別化可能な64個の異なる色のビーズ(８２)が得られる。Luminex SNP分析に
おいて、ビーズに共有結合するのは短い(約18〜20塩基の)「標的」オリゴデオキシ
ヌクレオチド(オリゴ)である。標的オリゴの中央に位置するヌクレオチドが多型
塩基をコードする。一対のビーズを合成する(対のビーズのそれぞれに多型オリ
ゴヌクレオチドの１つが付着されている)。分析されるSNPを囲むDNA領域のPCRを
行って、PCR産物を生成する。正確な相補鎖がコードされたビーズに対して優先
的にPCR産物をハイブリダイズさせる条件を確立する。１つの形式(「競合体無し」
)においては、PCR産物自体がフルオレセイン染料を取り込み、FACScaliburにか
けている間に測定されるビーズ上のフルオレセイン染色の獲得がハイブリダイゼ
ーションを示す。第２の形式(「競合体有り」)においては、ビーズを競合体と共に
PCR産物にハイブリダイズさせる。この場合、競合体自体をフルオレセインで標
識する。そして、非標識化PCR産物での置換えによるフルオレセインの損失が、
有効なハイブリダイゼーションを示す。「競合体有り」の場合の方が、SNP分析に
おいては識別力がより高いと言われている。
【０００３】 DNAにおける一塩基多型を分類する方法として、標識化Genetic Bit Analysis(
GBA)が記載されている[Genetic Bit Analysis: a solid phase method for typi
ng single nucleotide polymorphisms. Nikiforov T T; Rendle R B; Goelet P;
Rogers Y H; Kotewicz M L; Anderson S; Trainor G L; Knapp M R. NUCLEIC A
CIDS RESEARCH, (1994) 22 (20) 4167-75]。この方法では、多型部位を含むゲノ
ムDNAの特定の断片を、１本の規定プライマーおよび１本のホスホロチオエート
修飾プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりまず増幅する。二本
鎖PCR産物を、酵素T7遺伝子6エキソヌクレアーゼで処置して一本鎖にし、固定化
オリゴヌクレオチドプライマーに対するハイブリダイゼーションにより96ウェル
ポリスチレンプレートの個々のウェル上に捕捉させる。このプライマーは、目的
の多型部位にすぐ隣接する一本鎖標的DNAにハイブリダイズするように設計され
る。大腸菌DNAポリメラーゼＩまたは改変型T7DNAポリメラーゼ(シークエナーゼ)
のクレノウ断片を使用し、１つのビオチン標識化ジデオキシヌクレオシド三リン
酸、１つのフルオレセイン標識化ジデオキシヌクレオシド三リン酸、および２つ
の非標識ジデオキシヌクレオシド三リン酸の混合物を使用して、捕捉オリゴヌク
レオチドの３’末端を１塩基伸長させる。そして、アルカリホスファターゼおよ
び西洋ワサビペルオキシダーゼの抗体コンジュゲートを使用して、ELISA形式で
伸長塩基の特性を決定する。この論文は、本方法の生化学的特徴も詳細に記載し
ている。この方法の半自動化バージョン(Genetic Bit Analysis (GBA)と称され
る)は、ウマゲノム中の26の二対立遺伝子(diallelic)多型の所定のセットを使用
したサラブレッドウマの大規模な血統証明のために使用される。また、固定化プ
ライマーでのミニ配列決定を利用して、PCR産物における突然変異が検出されて
きた[Minisequencing: A Specific Tool for DN A Analysis and Diagnostics on Oligonucleotide Arrays. Pastinen, T.ら Gen
ome Research 7:606-614 (1997)]。
【０００４】 GBAを改良するために、5’→3’二本鎖特異的T7遺伝子6エキソヌクレアーゼの
加水分解活性に対するホスホロチオエート結合の影響が研究されている[The use
of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparat
ion of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase h
ybridization. Nikiforov T T; Rendle R B; Kotewicz M L; Rogers Y H. PCR M
ETHODS AND APPLICATIONS, (1994) 3 (5) 285-91]。１つのホスホロチオエート
残基を5’末端に含む二本鎖DNA基質が、非修飾のものと同じぐらい効率的に、こ
の酵素により加水分解されることが分かった。しかし、酵素活性は、４つのホス
ホロチオエートの存在により完全に阻害された。これらの結果に基づき、二本鎖
PCR産物を完全長一本鎖DNA断片に変換する方法が開発された。この方法では、一
方のPCRプライマーがその5’末端において４つのホスホロチオエートを含み、そ
の逆鎖のプライマーは改変されない。増幅の後、二本鎖産物をT7遺伝子6エキソ
ヌクレアーゼで処置する。ホスホロチオエート化された鎖をこの酵素の活性から
保護し、その一方で逆鎖は加水分解される。ホスホロチオエート化PCRプライマ
ーを5’ビオチン化した場合、マイクロタイタープレート上に固定化されたオリ
ゴヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼーションの後に一本鎖PCR産物
を容易に比色検出できる。塩の存在下にて、比較的短いオリゴヌクレオチドを、
親水性表面を有するマイクロタイタープレートに固定化する単純かつ効率的な方
法も記載されている。
【０００５】 表面結合オリゴヌクレオチドのアレイに対する鋳型ハイブリダイゼーション(
またはハイブリダイゼーションおよび酵素処理)に基づくDNA分析は、高密度、並
行、低コスト、かつ自動化可能処理によく適している[Fluorescence detection
applied to non-electrophoretic DNA diagnostics on oligonucleotide arrays
. Ives, Jeffrey T.; Rogers, Yu Hui; Bogdanov, Valery L.; Huang, Eric Z.;
Boyce-Jacino, Michael; Goelet, Philip L.L.C., Proc. SPIE-Int. Soc. Opt.
Eng., 2680 (Ultrasensitive Biochemical Diagnostics), 258-269 (1996)]。
標識化DNAの直接蛍光検出により、直線性、大きいダイナミックレンジ、多分析
物検出、処理簡便性、および正当なコストでの安全な操作の利点が得られる。Mo
lecular Tool Corporationは、所有権を有する固相遺伝子型分類の酵素的方法を
、96ウェルプレートおよびガラス顕微鏡スライドにおけるDNA処理に適用してい
る。蛍光標識されたGBAジデオキシヌクレオチドを検出するためには、約100 mol
s/μm2の検出限界が必要とされる。市販プレートリーダーは、約1000 mols/μm2 を検出し、アルゴンレーザおよび熱電気冷却CCDを備える実験セットアップは約
１桁低い大きさのシグナルを検出できる。現在の限界は、ガラス蛍光によるもの
である。フルオレセイン、エオシン、テトラメチルローダミン、リサミンおよび
テキサスレッドで標識されたジデオキシヌクレオチドは特徴決定されており、光
退色(photobleaching)、消光、および蛍光色素(fluorogenic)基質での間接的検
出が調査されている。
【０００６】 ハイブリダイゼーションによるSNP分析は有力な方法であるが、いくつかの欠
点を有する。これらとしては、i)各対立遺伝子対に対して、２つの標的、そして
可能であれば２つの競合体オリゴヌクレオチドを合成する必要性；ii)対立遺伝
子間を効率的に区別するハイブリダイゼーションパラメータ(緩衝液含量、温度
、時間)の確立；およびiii)ハイブリダイゼーションパラメータに影響し得る二
次構造を含む領域の回避が挙げられる。
【０００７】 上記GBA方法の現在の限界としては、i)二次元固体表面上で得られる限界密度
、ii)退色、iii)ガラスおよびプラスチック基板の自己蛍光、iv)オリゴヌクレオ
チドをガラスに一貫的に結合させることの困難性、ならびにv)新規固定アレイを
作成する系のための費用、簡便性、および適応性が挙げられる。
【０００８】 本発明は、多染料色/濃度許容能を有する可動性固体支持体系(例えば、FlowMe
trix系)の有力なマトリックス化許容能を利用するGBA単塩基鎖伸長(SBCE)を用い
て、上記欠点を克服する新規系を提供する。本発明は、このような多型同定方法
から得た反応生成物の検出を改善する方法をさらに提供する。本明細書に記載す
るようなおよび当該分野で公知の様々な検出方法を、本発明の検出方法を利用し
て向上させることができる。このような方法は、本発明と組み合わせられて、時
間-およびコスト効率性を有する読取り形式を提供し、これは多くのプライマー
と個々に使用する所与のビーズを用いる手段を提供できる。この読取り方法はま
た、多くの多型検出方法、例えば、SBCE、OLA、およびクレバーゼ(cleavase)反
応/シグナル放出(インベーダー(Invader)法、Third Wave Technologies)などと
も利用できる。
【０００９】図面の簡単な説明 （図面の簡単な説明については下記参照）。
【００１０】詳細な説明 本発明は、例えば色素、放射性標識、磁気タグまたはQuantum Dot（登録商標
）(Quantum Dot Corp.)で検出可能なようにタグ付けされたビーズなどの可動性
固体支持体を、核酸読取り工程に利用する方法を提供する。この核酸読取り工程
は、SBCE、OLAまたはクレバーゼ反応／シグナル放出などの可動性固体支持体に
連結された核酸の直接読取り、または、後に可動性固体支持体に取り付けられた
ジップコードによるなどして仲介核酸(intermediate nucleic acid)により捕捉
し、次いで可動性固体支持体を検出器（レーザー検出器など）の上を通過させる
ことにより、または検出器を可動性固体支持体上を通過させることにより、読取
り産物を選択したプラットフォーム上で解析する（溶液中での）間接読取りのい
ずれかである。仲介核酸系は多くの利点を提供する。例えば、連結の反応におい
て、溶液中におけるレポータープローブの標的オリゴヌクレオチドへの連結は、
微小球に直接結合された標的オリゴヌクレオチドへの連結よりもより効率的で再
現性が良い。加えて、ジップコードにより、最適に結合した微小球の規定のセッ
トの利用と再利用が可能になる。新規の一塩基多型が現れるたび毎に新しい微小
球を作る代わりに、１つのcジップコード(cZipCode)結合微小球の型を新規の一
塩基多型の解析に用いることができる。仲介核酸の系はタンパク質に基づく系に
応用することもできる（例えば、抗サイトカイン抗体をサイトカインの分析のた
めにジップコードオリゴに結合できる）。
【００１１】 本発明は、可動性固体支持体系の強力なマトリックス形成能を利用する、コー
ドされた可動性固体支持体を用いるSNPの読取りのための新規の系を提供する。
ある実施形態では、当該系はGBA一塩基鎖伸長(single base chain extension, S
BCE)を利用する。もう一つの実施形態では、当該系はオリゴヌクレオチド連結ア
ッセイを利用する。さらにもう一つの実施形態では、当該系は酵素的または化学
的な読取り方法を利用する。その方法は、酵素または化学物質を使用して多型部
位におけるミスマッチの塩基の修飾またはヌクレオチド鎖内部での切断を行い、
その結果取付けられていたレポーターの欠失を引き起こすか、または上記修飾の
結果、修飾を特定するための標識手段となることによるものである。このように
、更なる実施形態においては、当該系はエンドヌクレアーゼ・クレバーゼ／シグ
ナル放出の方法（Invader法, Third Wave Technologies）を利用する（例えばMa
rshallら、J. Clin. Microbiol. 35 (12): 3156-3162 (1997); Browら、J. Clin
. Microbiol. 34 (12): 3129-3137 (1997)を参照）。もう一つの実施形態では、
読取りに際して蛍光エネルギー転移（FET）を蛍光消光とともに用いる。
【００１２】 クレバーゼ酵素による読取りにおいては、標的核酸（例えばPCR産物またはゲ
ノムDNA）が相補的なインベーダープローブ(Invader probe)とシグナルプローブ
(Signal probe)の両者にハイブリダイズし、クレバーゼ酵素は標的核酸、インベ
ーダープローブおよびシグナルプローブの間に形成された特異的な構造を認識し
、分岐部位にてシグナルプローブを開裂して、それにより検出のためのシグナル
を放出する。その後別のシグナルプローブが該核酸に結合して、クレバーゼ反応
が再び開始する。この過程は何度も繰り返され、それによってシグナル増幅が高
まる。クレバーゼが作用するための要点は、インベーダープローブとシグナルプ
ローブとの重複した塩基の存在である。Invader Squaredという名の改良方法に
おいては、２ラウンドのインベーダーを同時に行う。一次インベーダー反応には
SNP特異的標的DNAの使用が含まれており、生じたクレバーゼ産物は、普遍的な(u
niversal)シグナルプローブおよび普遍的な相補的標的DNAとの二次インベーダー
反応において働く。第２ラウンドのインベーダーアッセイの後に、106以上のシ
グナル／標的／時間というシグナルの線形増幅が得られる。
【００１３】 本発明は更に、標的核酸に相補的な第１相補性領域と、可動性固体支持体に連
結された捕捉オリゴヌクレオチド（capture oligonucleotide）に相補的な第２
相補性領域（第１相補性領域の5’側）とを有する標的オリゴヌクレオチドを利
用する、標的核酸中の核酸多型を検出するための、可動性固体支持体に基づく読
取り技術の利用を改良する新規な読取り方法を提供する。改良された方法は、オ
リゴヌクレオチド連結アッセイ（OLA）または一塩基鎖伸長（SBCE）のような本
発明の明細書に記載する核酸多型を特定する幾つかの方法のいずれにも応用でき
る。該方法は増幅されたDNA、RNAなどと同様にゲノムDNA中のSNPの検出に利用す
ることができ、このために、（ヒトその他の動物中での疾患突然変異検出および
血統決定のための）遺伝子型分類、病原の検出と特定、および差次的遺伝子発現
を含む種々の目的に有用である。
【００１４】 本発明は更に、同じレーンでの短配列読取り（約１６塩基）を多重化するため
の簡単な方法の開発を提供する。この方法が応用できる用途は高スループット酵
母ツーハイブリッド解析である。この解析においては、相互作用しているタンパ
ク質の短い領域を配列決定し、その後にヒットする同定を決定するために巨大な
データベースを使用することが望まれる。解析された各ベイト（bait）はおよそ
100のヒットを生じるので、解析の効率を向上させる本発明の方法が求められ、
それゆえに開発したのである。
【００１５】 本発明は、ゲノムDNA、PCR産物などの増幅されたDNA、cDNA、cRNA、制限断片
または任意の他の所望の核酸サンプルを含む核酸サンプルを解析するために利用
できる。本明細書に記載の方法の一つをゲノムDNAで行う場合、典型的にはゲノ
ムDNAを該DNAの粘性が低下するように処理して、プライマーまたはプローブとゲ
ノムDNAの標的領域との接触をよりよくする。かかる粘性の低下は、DNアーゼ処
理またはゲノムDNAの好ましくは静かな剪断などの当業者に公知である任意の所
望の方法により達成できる。増幅されたDNAは幾つかの公知の方法のいずれかに
より得ることができる。ゲノムDNAの供給源は無数に有り、該方法を行う目的次
第であるが、選択する任意の組織、器官または細胞を含む。オリゴヌクレオチド
は例えば増幅またはde novo合成により作成できる。相補的核酸、すなわちcRNA
（DNAをT7-RNAポリメラーゼ／特異的配列プライマー融合体でプライムし、その
後にT7-RNAポリメラーゼを添加して最初のストランドを増幅してcRNAを作成する
方法により得た）およびcDNAは、当技術分野で公知の標準的な方法により得るこ
とができる。
【００１６】 こうして、本発明においては、「核酸」には、例えばオリゴヌクレオチド、ゲ
ノムDNA、16s リボゾームRNA、PCR産物、DNA断片、RNA分子、cDNA分子またはcRN
A分子のうちの任意のものが含まれ、核酸プライマーは、オリゴヌクレオチド、P
CR産物、LCR（リガーゼ連鎖反応）産物、DNA断片、RNA分子、cDNA分子またはcRN
A分子である。例示するプライマーまたはプローブはオリゴヌクレオチドである
ことが多いが、プライマーまたはプローブの供給源は本明細書中ではそれだけに
限定されない。
【００１７】 特許請求の範囲において、「a」および「an」は、それが使用されている文脈
によっては１以上を意味することもあり得る。
【００１８】 基本的なSBCE法においては、１つのオリゴヌクレオチドは、検出できるように
タグ付けされたビーズまたはロッドのような可動性固体支持体に取り付けられて
おり、好ましくは、FACS型系によるなどして所望の反応が起こると直ちにタグの
検出のための処理が可能である。例えば、支持体を検出の前に最終的に所定の位
置に固定しようとするのであれば、「tentagel」(「octopus」)を使用し、次い
で検出の前に所定の位置に固定することがきる。蛍光タグ、放射線標識または磁
気タグなどの任意の所望のタグを利用できる。しかしながら、好ましくは、選択
されたタグおよびラベルを検出し識別できるレーザー検出器などの検出器の上で
可動性固体支持体を通過させる他の検出系が利用できる（例えばPCT公報WO 9714
028を参照）。また、何らかの反応を行った後に、可動性固体支持体を二次元表
面上に固定し、レーザー検出器などの検出器を固定した可動性固体支持体の上で
通過させる検出系を利用することもできる。可動性固体支持体はポリスチレン-
ジビニルベンゼンなどの任意の有用な素材を含み得る。可動性固体支持体および
それと結合した核酸またはヌクレオチドの検出は、Luminex FlowMetrix（商標）
システムなどのFACSに基づく方法により行うことができる。
【００１９】 典型的なアッセイでは、オリゴヌクレオチドを5’末端がビーズに結合するよ
うに設計する。3’塩基は、行うアッセイによっては、多型塩基に応じて選択し
たヌクレオチドにおいて終わる。例えば、このプライマーまたはプローブの3’
塩基は、多型塩基の5’側のヌクレオチドにおいて、多型塩基に対応する塩基に
より終了してよい。SBCE法においてはオリゴの長さは重要ではないが、SNPの周
囲の領域から作られたPCR産物などの核酸サンプルによるハイブリダイゼーショ
ンを可能にするのに十分な長さがあることが必要である。行うアッセイによって
は、プライマーまたはプローブを正確なマッチが要求されるように設計すること
ができ、または、サンプル核酸に対する最初のハイブリダイゼーションに幾つか
のミスマッチを許容するように設計してもよい。
【００２０】 典型的なアッセイでは、鎖終結(chain termination)が可能なヌクレオチドを
使用する。かかる鎖終結は、同じ標識された塩基が標的配列中で再び現れる前に
起こる停止現象である。そのようなヌクレオチドは当技術分野で公知であり、例
えばジデオキシヌクレオチド（伸長反応にポリメラーゼを使用した場合）、チオ
ール誘導体（伸長反応にポリメラーゼを使用した場合）、3’デオキシヌクレオ
チド（伸長反応に逆転写酵素を使用した場合）、または3’デオキシリボヌクレ
オチド（伸長反応に逆転写酵素を使用した場合）が含まれる。これらのヌクレオ
チドはいずれも、例えばジヌクレオチド、トリヌクレオチド、またはより長いヌ
クレオチドであり得る。このように、例えばジヌクレオチドまたはより長い核酸
のバンク（bank）が、該バンク内に1個所以上にオプションのヌクレオチドが存
在するように、存在し得る。
【００２１】 したがって、本方法では、標識ステップは典型的には溶液中で実施し(これに
より、効率的なハイブリダイゼーションが得られる)、そして分析ステップは、
溶液中または固相非可動性支持体上のどちらで実施され得る。
【００２２】 したがって、本発明は、第1核酸中の所定のヌクレオチドを同定する方法であ
って、 (a) 第1核酸を、検出可能なタグを付した可動性固相支持体にその5’末端で
連結している核酸プライマーと、第1核酸と核酸プライマーとがハイブリダイゼ
ーション産物を形成可能なハイブリダイゼーション条件下で接触させること、こ
こで、核酸プライマーは第1核酸の所定のヌクレオチドのすぐ3’側に隣接する部
分に相補的な領域を含むものである； (b) ハイブリダイゼーション産物と同定される検出可能な標識化鎖終結ヌク
レオチドを用いてプライマー伸長反応をプライマー伸長条件下で実施すること；
および、 (c) ハイブリダイゼーション産物中に取り込まれた標識が存在するか否かを
検出すること； を含み、ここで、標識の存在がハイブリダイゼーション産物中への標識化ヌクレ
オチドの取り込みを示し、取り込まれた標識化ヌクレオチドの正体が所定のヌク
レオチドに相補的なヌクレオチドの正体を示すことにより、第1核酸中の所定の
ヌクレオチドが同定されることを特徴とする、上記方法を提供する。
【００２３】 特定の実施形態では、プライマーは3’の塩基が多型塩基のすぐ5’側のヌクレ
オチドで終わるように設計される。4種のジデオキシヌクレオチド三リン酸の混
合物のセットを作製する。各混合物は、4種のフルオレセイン分子に化学的に結
合した標識化ジデオキシヌクレオチド分子(即ち、ddATP-F、ddCTP-F、ddGTP-Fま
たはddTTP-F)のうちの１つと、3種の非標識化ジデオキシヌクレオチド三リン酸
を含む。１つの形態では、PCR産物をビーズに添加し、該ビーズを2つ以上の試験
管に分注する。鎖終結混合物を、試験管に入れ、ポリメラーゼを加えてSBCE反応
試験管を作製する。ポリメラーゼは、ビーズに結合したオリゴの3’末端に多型
部位の塩基に相補的な塩基を伸長させる。反応試験管は、FlowMEtrixで解析し、
同定されるビーズの特定の反応試験管中の標識の正体が、その部位の多型塩基を
示す。
【００２４】 本方法とハイブリダイゼーション法との比較は、本発明の利用性を示す。ハイ
ブリダイゼーションによるSNPの分析は、同一試験管内の２つのビーズ上の２つ
のオリゴを用いて、分析のために読み取る材料を作製する。SCBE法では、同一ビ
ーズ上の同一のオリゴを2種の異なる標識化ジデオキシヌクレオチドを含む2つの
試験管内で解析する。読み取り色素としてフルオレセインを用いる方法を本明細
書中に例示しているが、ビオチン化または他の適切な修飾ヌクレオチドを用いる
方法を組合わせることもできる。
【００２５】 鎖終結ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドであり、プライマー伸長を1種
の同定される標識化ジデオキシヌクレオチドと3種の異種の非標識化ジデオキシ
ヌクレオチドの存在下で実施することで、本方法を実施できる。他の実施形態で
は、鎖終結ヌクレオチドはジデオキシヌクレオチドであり、プライマー伸長は第
1の検出可能な標識で標識した同定される第1ジデオキシヌクレオチド、第２の検
出可能な標識で標識した同定される第２ジデオキシヌクレオチド、第３の検出可
能な標識で標識した同定される第３ジデオキシヌクレオチド、第４の検出可能な
標識で標識した同定される第４ジデオキシヌクレオチドの存在下で実施される。
そして、ハイブリダイゼーション産物中の第1、第2、第3または第4の検出可能な
標識の存在を検出することにより、第1、第2、第3または第4の各ジデオキシヌク
レオチドとして、所定のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの正体を同定する
。
【００２６】 FlowMetrixビーズは熱サイクルへの使用が可能である。したがって、SBCE法を
用いてゲノムスキャンを実施できる。本方法では、ゲノムDNAを剪断するか、ま
たは粘度を低減させるためにDNaseで処理して、ビーズに結合したオリゴに対し
てサイクルに供する。鋳型DNAの複雑さが非常に高いため、伸長されたハイブリ
ダイゼーションの最適化およびサイクル時間の必要が生じる。ビーズ上のCot分
析の実施を必要とする場合もあり得る。SNPの同定およびDNA配列決定へのこれら
のビーズおよびSBCEの使用については、上述から明らかである。
【００２７】 したがって、本発明は、粘度を低減させるための処理をしたゲノムDNA中の所
定のヌクレオチド多型を決定する方法であって、 (a) 核酸の1方の鎖の所定のヌクレオチドの5’側の部分に相補的な領域を含
む第1核酸プライマー、および核酸の反対鎖の所定のヌクレオチドの下流部分に
相補的な第2核酸プライマーを用いるゲノムDNAの増幅を、２つのプライマーの間
の所定のヌクレオチドの領域を特異的に増幅するための条件下で実施してPCR産
物を形成させること； (b) PCR産物を、検出可能なタグを付した可動性固相支持体にその5’末端で
連結している第1核酸と、ハイブリダイゼーション条件下で接触させてハイブリ
ダイゼーション産物を形成させること、ここで、第1核酸は、PCR産物の一方の鎖
の所定のヌクレオチドのすぐ5’側に隣接する部分に相補的な領域を含んでおり
； (c) ハイブリダイゼーション産物と同定される検出可能な標識化鎖終結ヌク
レオチドを用いてプライマー伸長反応をプライマー伸長条件下で実施すること； (d) ハイブリダイゼーション産物中に取り込まれた標識が存在するか否かを
検出すること、ここで、標識の存在がハイブリダイゼーション産物中への標識化
鎖終結ヌクレオチドの取り込みを示し、取り込まれた標識化鎖終結ヌクレオチド
の正体は、所定のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの正体を示す；および (e) 所定のヌクレオチドの正体を非多型ヌクレオチドと比較すること； を含み、所定のヌクレオチドの正体と非多型ヌクレオチドの正体との相違が、所
定のヌクレオチドの多型を示すことを特徴とする、上記方法を提供する。上記PC
R産物は一本鎖形態であってもよい。
【００２８】 本発明はさらに、粘度を低減させるための処理をしたゲノムDNA中の所定のヌ
クレオチドの多型を決定する方法であって、 (a) T7RNAポリメラーゼプロモーターを有する第1領域と核酸の一方の鎖の所
定のヌクレオチドのすぐ5'側の部分に相補的な第2領域とを含むオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用いて、２つのプライマーの間のヌクレオチドの領域を
特異的に増幅するための条件下で、第1鎖をcRNAとして増幅させるためのT7RNAポ
リメラーゼと、該cRNA鎖に相補的な第2鎖を増幅させるための逆転写酵素を用い
てゲノムDNAを増幅させて増幅産物を形成させること、 (b) 増幅産物を、検出可能なタグを付した可動性固相支持体にその5’末端で
連結している第1オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイゼーション条件下で接触
させてハイブリダイゼーション産物を形成させること； (c) ハイブリダイゼーション産物と同定される検出可能な標識化鎖終結ヌク
レオチドを用いてプライマー伸長反応をプライマー伸長条件下で実施すること； (d) ハイブリダイゼーション産物中に取り込まれた標識が存在するか否かを
検出すること、ここで、標識の存在がハイブリダイゼーション産物中への標識化
鎖終結ヌクレオチドの取り込みを示し、取り込まれた標識化鎖終結ヌクレオチド
の正体は、所定のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの正体を示す；および (e) 所定のヌクレオチドの正体を非多型ヌクレオチドと比較すること； を含み、所定のヌクレオチドの正体と非多型ヌクレオチドの正体との相違が、所
定のヌクレオチドの多型を示すことを特徴とする、上記方法を提供する。標識化
鎖終結ヌクレオチドは、例えば3’デオキシヌクレオチド、3’デオキシリボヌク
レオチド、チオールヌクレオチド誘導体またはジデオキシヌクレオチドであって
よい。増幅産物は一本鎖形態であってもよい。
【００２９】 さらに、ビーズに結合した核酸のすぐ下流に位置する数種のプライマーを設計
し合成してもよい。これらのプライマーを、i)第1鎖cDNAの生成に用いて、ii)そ
れにに結合したセットとT7RNAポリメラーゼを用いてcRNAを合成するのに用いる
ことができる。cRNAに必要であれば、第2鎖の合成は、ビーズに結合した配列の
外側であってすぐ上流ではない位置に位置する第2のプライマーセットを用いる
と良い。プライマーはビーズ-オリゴから離れたプライマーを有することにより
、該プライマーは結合を阻害しない。cDNAにはプライマーをFITC標識するとよい
。
【００３０】 本方法はさらに、粘度を低減させるための処理をしたゲノムDNAにおける所定
のヌクレオチド多型を決定する方法であって、 (a) 特異的ハイブリダイゼーション産物を形成させるための条件下で、ゲノ
ムDNAを、検出可能なタグを付した可動性固相支持体に5’末端で結合している第
1プライマーと接触させること、ここで、第1プライマーがゲノムDNAの一方の鎖
の所定のヌクレオチドのすぐ5’側に隣接している部分に相補的な第1相補性領域
を含んでいること； b） 上記特異的ハイブリダイゼーション産物と検出可能な同定される標識化
鎖終結ヌクレオチドとを用いたプライマー伸長反応をプライマー伸長条件下で実
施すること； c) ハイブリダイゼーション産物中に取り込まれた標識が存在するか否かを検
出すること、ここで、標識の存在がハイブリダイゼーション産物中への標識化鎖
終結ヌクレオチドの取り込みを示し、取り込まれた標識化鎖終結ヌクレオチドの
正体が所定のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの正体を示す；および d) 所定のヌクレオチドの正体を非多型ヌクレオチドと比較すること、 を含み、ここで、所定のヌクレオチドの正体と非多型ヌクレオチドの正体との相
違が、所定のヌクレオチドの多型を示すことを特徴とする、上記方法を提供する
。
【００３１】 DNAは一本鎖形態であってもよい。標識化鎖終結ヌクレオチドは、例えば、3’
デオキシヌクレオチド、3’デオキシリボヌクレオチド、チオールヌクレオチド
誘導体、またはジデオキシヌクレオチドでよい。かかる特定の実施形態ではゲノ
ムDNAは予め増幅されてはいないので、かかる方法におけるハイブリダイゼーシ
ョン時間は、ゲノムDNAへの第1プライマーのハイブリダイゼーションを可能とす
るのに十分な長さとすべきである。したがって、比較的長時間のハイブリダイゼ
ーション時間を用いるとよい。ゲノムDNAのハイブリダイゼーションについては
当業者に公知であるとおり(例えばSambrookら、Molecular Cloning: A Laborato
ry Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New
York 1989参照のこと)、例えば、12時間、24時間、または48時間などとする。
【００３２】 本明細書に記載のいずれの反応においても、作用するための温度条件を有する
ポリメラーゼ、またはジデオキシヌクレオチドを優先的に取り込むポリメラーゼ
などのヌクレオチドに対する特定の特異性を有するポリメラーゼなどの他のポリ
メラーゼを用いてもよい(Sanbrookら、参照のこと)。当業者は、かかるポリメラ
ーゼについて熟知しており、さらに、新規に発見された場合にはその新規ポリメ
ラーゼを、本明細書の教示より、本方法に組込むことができる。
【００３３】 本発明はさらに、オリゴヌクレオチド連結アッセイ(OLA)様式におけるビーズ
の使用を提供する。該方法では、ゲノムDNA、cRNAまたはPCR産物をビーズに結合
している第1核酸にハイブリダイズさせた後、蛍光標識を有する第2核酸に添加し
て、さらにリガーゼを添加する。ここで、第2核酸は3’末端に多型塩基を有して
いる。したがって、本発明は、第1核酸中の所定のヌクレオチドを同定する方法
であって、 a）第1核酸を、 (i)5’末端に検出可能なタグを付した可動性固相支持体に結合した第2核酸、こ
こで、第2核酸は、第1核酸の所定のヌクレオチドのすぐ3’側の部分に相補的な
領域を含み、かつ、所定のヌクレオチドと塩基対形成する位置にある試験ヌクレ
オチドでその3’末端が終わっていること、および (ii)第2核酸の所定のヌクレオチドのすぐ5’側に隣接している部分に相補的な領
域を含む第3の蛍光標識化核酸と、 第1核酸と第2核酸とがハイブリダイゼーション産物を形成可能であり、かつ第1
核酸と第3核酸とがハイブリダイゼーション産物を形成可能であるハイブリダイ
ゼーション条件下で、接触させること； b) 連結条件下でハイブリダイゼーション産物にリガーゼを添加すること；な
らびに c)ハイブリダイズした核酸を解離させた後、可動性固相支持体に結合した核酸
中の蛍光標識が存在するか否かを検出すること； を含み、ここで、標識の存在が、可動性固相支持体に結合した第2核酸への標識
化第3核酸の連結を示し、第2核酸中の試験ヌクレオチドの正体が所定のヌクレオ
チドに相補的なヌクレオチドの正体を示すことから、所定のヌクレオチドが同定
されることを特徴とする、上記方法を提供する。このオリゴヌクレオチド連結ア
ッセイは、(a)多型塩基がレポーターオリゴヌクレオチドまたはアクセプターオ
リゴヌクレオチドのいずれかの5’側に位置する場合、または(b)多型塩基がレポ
ーターオリゴヌクレオチドまたはアクセプターオリゴヌクレオチドのいずれかの
3’側に位置する場合の両方で実施することができる。
【００３４】 第1核酸は、ゲノムDNA(粘度を低減させるように、例えばDNase処理または剪断
力による処理などをしたもの)、PCR産物などの増幅された核酸、オリゴヌクレオ
チド、16sリボゾームRNA、DNA断片、RNA分子、cDNA分子、cRNA分子、制限酵素処
理により生成したDNA断片、サイズで所定のDNA、架橋増幅（Bridge-amplified）
DNA、16S RNA、16S DNAまたは任意の他の所望の核酸であってよい。任意の選択
したリガーゼ、例えばT4DNAリガーゼなどを用いることができる。熱安定性のリ
ガーゼが特に有用である。概説として、WuおよびWallace, Genomics 4: 560-569
(1989)を参照のこと。
【００３５】 本発明はさらに、縮重レポーターオリゴヌクレオチドのOLAによる読み取りへ
の使用を包含する。好ましくは、8 merのオリゴヌクレオチドであって、そのう
ちの6塩基は標的核酸に特異的となるように選択し、2塩基は可変的な位置、また
はゆらぎもしくは縮重する位置であるものを使用する。縮重は、レポーターオリ
ゴヌクレオチドの任意の位置に配置してよいが、好ましい位置は３位、４位、５
位、および６位である。所定のオリゴヌクレオチドと組合わせる好ましい可変的
な位置は、３位と６位、4位と5位、および3位と4位である。したがって、アッセ
イに用いる試薬として、全ての可能な8 merを合成することは実施可能ではない
かもしれないが、全ての可能な「6+2mer」を合成することはできる。さらに、レ
ポーターオリゴヌクレオチドが、非天然型誘導体(イノシンなど)をレポーターオ
リゴヌクレオチドに用いてもよい。例えば、本発明は、レポーター分子、または
ハプテン認識媒体（例えば、抗体、アビジン、ストレプトアビジンなど）によっ
てレポーター分子が結合できるハプテンに結合した8塩基相補性８merである場合
のOLA読み取り法も含む。本発明はさらに、レポーター分子またはハプテン認識
媒体によってレポーター分子が結合できるハプテンに結合した6塩基相補性８mer
(「6+2mer」)である場合のOLA読み取り法も含む。2つの非相補性塩基は、4種の
天然型塩基のいずれかであってよく、または非らせん阻害性の2本鎖構造を形成
し得る非天然型誘導体であってもよい。この非相補性塩基は3位および6位または
4位および5位に存在することが好ましい。非天然型塩基誘導体および/または6+2
merは、本明細書に記載の検出法を実施するのに用いるためのキットの成分とす
ることができる。
【００３６】 さらに、「Taqman」法を用いることもできる。該方法では、色素消光剤と色素
受容体を結合したオリゴに取り込ませ、ポリメラーゼに修復反応中に該色素消光
剤を除去させる。
【００３７】 本発明はさらに、2種の核酸がサンプル核酸にハイブリダイズするが、連結の
ステップを省く代わりに、マッチがサンプル核酸にハイブリダイズした2つの核
酸の間での蛍光エネルギー転移により検出されるというハイブリダイゼーション
方法を利用し得る。2つのハイブリダイゼーション用核酸は、ビーズに結合した
核酸の3’末端が試験塩基となるように設計されており、該試験塩基が多型塩基
に相補的である場合には、サンプル中に単波長の光をあてると、エネルギー転移
を第2の波長の光として読み取ることにより検出することができる。セカンドリ
ーダー（second reader）は、第2の波長の検出に用いることができる。したがっ
て、本発明は、第1核酸中の所定のヌクレオチドを同定する方法であって、 (a)第1核酸を、 i) 検出可能なタグを付した可動性固相支持体にその5’末端で連結し、かつ
、3’末端で蛍光標識に結合している第2核酸、ここで、第2核酸は、第1核酸の所
定のヌクレオチドのすぐ3’側の部分に相補的な領域を含み、かつ、所定のヌク
レオチドと塩基対形成する位置にある試験ヌクレオチドでその3’末端が終わっ
ていること、および ii) 5’末端に蛍光標識した第3核酸、ここで、第3核酸は、第2核酸の所定の
ヌクレオチドのすぐ5’側に隣接している部分に相補的な領域を含むものである
こと、 と接触させること； b) 第1核酸と第2核酸とがハイブリダイゼーション産物を形成可能であり、か
つ第1核酸と第3核酸とがハイブリダイゼーション産物を形成可能であるハイブリ
ダイゼーション条件下にすること；および c) 第2核酸の3’末端の蛍光標識と第3核酸の5’末端の蛍光標識との間に蛍光
エネルギー転移が存在するか否かを検出すること、ここで、蛍光エネルギー転移
の存在は第1核酸への試験ヌクレオチドのハイブリダイゼーションを示し、第2核
酸中のハイブリダイズした試験ヌクレオチドの正体が所定のヌクレオチドに相補
的なヌクレオチドの正体を示すことから、所定のヌクレオチドが同定される； を含む、上記方法を提供する。蛍光エネルギー転移(FET)の検出は、ハイブリダ
イズした核酸の解離後に実施してもよい。
【００３８】 本発明はまた、多型塩基の配列決定の方法であって：5’末端で可動性固相支
持体に結合しており、かつ第2核酸上の多型塩基に隣接する3’末端を有している
第1核酸；第2核酸の多型塩基に隣接する領域に相補的な結合したレポーター部分
を有する第3核酸；ここで、第1核酸と第3核酸とで、多型塩基の反対鎖のギャッ
プを規定する；２つの可能な多型塩基のセットの一方に相補的なヌクレオチド、
ポリメラーゼ、およびリガーゼ；ここで、ポリメラーゼは、ヌクレオチドが多型
塩基に相補的であればギャップをまたいでヌクレオチドを重合化させることがで
き、リガーゼは、レポーターに結合した第3核酸に新規に重合化したヌクレオチ
ドを連結させることができる；および、ビーズに共有結合したレポーターを検出
する手段；を含む、上記方法も提供する。特に、本発明は、第1核酸中の所定の
ヌクレオチドを同定する方法であって、 (a) 第1核酸を、 i) 検出可能なタグを付した可動性固相支持体に5’末端で連結している第2核
酸、ここで、第2核酸は、第1核酸の所定のヌクレオチドのすぐ3’側の部分に相
補的な領域を含むものとする；および ii) 蛍光標識した第3核酸、ここで、第3核酸は、第2核酸の所定のヌクレオチ
ドのすぐ5’側に隣接している部分に相補的な領域を含むものとする、 と、第1核酸と第2核酸とがハイブリダイゼーション産物を形成可能であり、かつ
第1核酸と第3核酸とがハイブリダイゼーション産物を形成可能であるハイブリダ
イゼーション条件下で接触させて、ここで、第1、第2および第3核酸は所定のヌ
クレオチドの反対鎖のギャップを規定するハイブリダイゼーション産物を形成す
る； b) 試験ヌクレオチド、ポリメラーゼおよびリガーゼを、重合化および連結の
ための条件下で添加すること；および c) ハイブリダイズした核酸を解離させた後、可動性固相支持体に連結してい
る核酸中に蛍光標識が存在するか否かを検出すること、ここで、標識の存在は第
２核酸に試験ヌクレオチドが重合化され、標識化第3核酸が可動性固相支持体に
連結している第2核酸に連結されたことを示し、試験ヌクレオチドの正体が所定
のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの正体を示すことから、所定のヌクレオ
チドが同定される； を含む、上記方法を提供する。
【００３９】 ポリメラーゼは、非鎖置換性ポリメラーゼであることが好ましい。さらに、熱
安定性ポリメラーゼであってよい。リガーゼはDNAリガーゼでよい。さらに熱安
定性リガーゼがよい。
【００４０】 本発明はさらに、1塩基多型を検出する方法であって、酵素または化学物質を
用いて核酸中の多型部位でミスマッチ塩基を修飾またはヌクレオチド鎖切断する
ことにより、結合したレポーターの喪失または修飾が起こり、該レポーターの喪
失を検出または修飾を検出することにより、修飾を同定するための標識手段が得
られるということを含む方法を提供する。ある例としては、末端標識(FITCなど)
化ゲノム断片または標識(FITCなど)化PCR断片を、オリゴヌクレオチドにハイブ
リダイズさせてビーズに結合させた後、該構築物を非対合DNAを認識および/また
は制限消化する酵素(FITC標識化recA、mutSまたはT7酵素など)で処理して、標識
の追加または喪失を解析する。他の例としては、DNAの一本鎖領域を認識し、か
つ該領域の修飾が可能な化学物質を利用して、修飾を検出する。
【００４１】 さらに、本明細書に記載の方法はいずれも、サンプル中の所定の核酸の発現を
定量する方法に利用できる。したがって、例えば、所定の遺伝子の発現を定量し
て標準資料または他の対照資料と比較する、示唆的遺伝子発現において利用する
ことができる。この方法では、対象の領域または対象の遺伝子(対立遺伝子、ま
たはハプロタイプ、または多型)を識別し得る領域に由来する遺伝子断片を、そ
の5’末端で検出可能な標識化可動性固相支持体に連結させること；メッセージ(
例えば、RNA,cDNA、cRNAなど)を該断片にハイブリダイズさせて、本明細書に記
載するように、プライマー伸長反応、リガーゼ反応またはハイブリダイゼーショ
ン/蛍光エネルギー転移反応を実施することにより蛍光を定量する。核酸プロー
ブは、所定の核酸の該核酸にユニークな部分に相補的な領域を含み得る。正常な
検体、または疾患/羅患検体、または特定の組織もしくは器官、または特定の種
から得られたものなどの標準試料を、比較対照として用いることにより、サンプ
ル中に検出された量についての結果が導かれる。
【００４２】 特に、本発明は、標的核酸中の所定のヌクレオチドを同定するために同定反応
の結果を検出する方法であって： a) 第1相補性領域と第2相補性領域とを含む標的オリゴヌクレオチドを、標的
核酸を含むサンプルと、標的オリゴヌクレオチドの第1相補性領域と、標的オリ
ゴヌクレオチドの第1相補性領域に相補的な標的核酸の領域とのハイブリダイゼ
ーション産物の形成が可能なハイブリダイゼーション条件下で接触させること、
ここで、第2相補性領域は第1相補性領域の5’側にあり、第1相補性領域は、標的
核酸の所定のヌクレオチドのすぐ3’側に隣接している部分に相補的な領域を含
むものであること； b） 所定のヌクレオチドの正体を決定するために、第１ハイブリダイゼーシ
ョン産物を用いて所定の同定反応を実施すること、ここで、標的オリゴヌクレオ
チドの第2相補性領域を含む選択的標識化検出産物が形成され得ること； c） 該検出産物を、可動性固相支持体に共有結合している捕捉オリゴヌクレ
オチドと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させて、第2ハイブリダイゼー
ション産物を形成させることにより検出産物を単離すること、ここで、該捕捉オ
リゴヌクレオチドは標的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域に相補的な核酸配
列を含むものであること；および d） 第2ハイブリダイゼーション産物中の標識化検出産物の標識を検出および
/または同定すること； を含み、ここで、標識の存在および/またはその正体が標的核酸中の所定のヌク
レオチドの正体を示すことを特徴とする、上記方法を提供する。
【００４３】 したがって、基本的な方法は、可動性固相支持体(ビーズなど)に連結した捕捉
オリゴヌクレオチドを使用して、反応に由来する反応産物を単離することを含む
。この単離を容易にするためには、「標的オリゴヌクレオチド」を、標的核酸の
ある領域に相補的な領域である第1相補性領域に加えて、さらに第1相補性領域の
5’側に位置し、かつ捕捉オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補的であ
る第2相補性領域を含むように設計する。したがって、反応(SBCEまたはOLA)の前
または後に、捕捉オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション反応に用いて、
該反応形態にある（例えば、連結産物またはプライマー伸長反応産物として）標
的オリゴヌクレオチドを単離することができる。したがって、他の多くのアッセ
イのように、標的核酸にハイブリダイズさせるための各オリゴヌクレオチド (例
えば、本発明の標的オリゴヌクレオチドの第1相補性領域など)に特異的なビーズ
を合成する必要がない。
【００４４】 本発明はさらに、縮重レポーターオリゴヌクレオチドのOLA読み取りにおける
使用、好ましくは本明細書に記載の6+2merの使用を包含する。かかるレポーター
オリゴヌクレオチドは、ここに記載する検出方法を実施するために有用なキット
の成分とすることができる。
【００４５】 捕捉オリゴヌクレオチドは、標的核酸と特異的なハイブリダイゼーションはし
ない、すなわち標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションが起こす程度の相補
性を有することのないように設計するとよい。例えば、標的とする種(ヒトなど)
に典型的に見られることのないヌクレオチド使用頻度を含むとよい。標的配列が
十分に判っている場合には、捕捉配列は、該標的配列にはない配列になるように
選択することができる。捕捉オリゴヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドの
第1相補性領域に選択的にハイブリダイズし得る(例えば、ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件など当業者に公知の選択的ハイブリダイゼーション条
件下で)ような十分な長さで、かつ標的オリゴヌクレオチドを用いて実施する同
定反応または捕捉オリゴヌクレオチドと標的オリゴヌクレオチドとのハイブリダ
イゼーション反応のいずれかを妨害しない長さであれば、任意の所望の長さであ
ってよい。所定の捕捉オリゴヌクレオチドの長さは、任意の選択した用途に用い
るために所望する捕捉オリゴヌクレオチドの種類の数の関数となる場合もある。
例えば、捕捉オリゴヌクレオチドは、8、10、12、15、18、20、21、22、23、24
、25、26、27、28、29、30、35、40またはそれ以上のヌクレオチドであってよい
。好ましい長さは、25ヌクレオチドぐらい、例えば、23、24、25、26、27または
28ヌクレオチドである。しかし、他の長さのオリゴヌクレオチドを利用すること
もできる。特定の核酸組成物についての任意の特定の用途について最適な長さを
決定することができることは、当業者であれば判るであろう。
【００４６】 異なる色のビーズにそれぞれが連結した数種の捕捉オリゴヌクレオチドのバン
クを作製することが有利である。相補性領域のバンクを、任意の特異的標的核酸
に対する標的オリゴヌクレオチドの作製に使用するために維持することもできる
。すると、所定のビーズのセットを用いて、任意の所定の検出作業に必須である
新規標的ヌクレオチドを簡単に作製することができる。
【００４７】 本発明は、標的核酸中の所定のヌクレオチドを同定するために反応産物を検出
する方法であって： a) 第1相補性領域と第2相補性領域とを含む標的オリゴヌクレオチドを、標
的核酸を含むサンプルと、標的オリゴヌクレオチドの第1相補性領域と、標的核
酸の標的オリゴヌクレオチドの第1相補性領域に相補的な領域とのハイブリダイ
ゼーション産物の形成が可能なハイブリダイゼーション条件下で接触させて、第
1ハイブリダイゼーション産物を形成させること、ここで、第1相補性領域はオリ
ゴヌクレオチドプライマーを含んでおり、第2相補性領域は捕捉オリゴヌクレオ
チドに相補的な核酸配列を含んでおり、かつオリゴヌクレオチドプライマーは、
標的核酸の所定のヌクレオチドのすぐ3’側に隣接する部分に相補的な領域を含
むものであること； b） プライマー伸長条件下で、第1ハイブリダイゼーション産物と同定される
検出可能な標識化鎖終結ヌクレオチドとを用いてプライマー伸長反応を実施して
プライマー伸長産物を形成させること； c） プライマー伸長産物を、可動性固相支持体に共有結合している捕捉オリ
ゴヌクレオチドと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させて単離された第2
ハイブリダイゼーション産物を形成させることによりプライマー伸長産物を単離
すること、ここで、捕捉オリゴヌクレオチドは標的オリゴヌクレオチドの第2相
補性領域に相補的な核酸配列を含むものであること；および d） 単離された第2ハイブリダイゼーション産物中の標識が存在するか否かを
検出すること； を含み、ここで、標識の存在がプライマー伸長産物中への標識化ヌクレオチドの
取り込みを示し、かつ同定された取り込まれた標識化ヌクレオチドの正体は所定
のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの正体を示すことから、標的核酸中の所
定のヌクレオチドが同定されることを特徴とする、上記方法を提供する。
【００４８】 典型的なアッセイでは、標識オリゴヌクレオチドは、5’末端が第2相補性領域
を含み、後に可動性固相支持体に連結した相補的捕捉オリゴヌクレオチドにハイ
ブリダイゼーションすることができるように、かつ3’末端が標的核酸の多型塩
基のすぐ3’側の領域に相補的な第1相補性領域を含むように設計する。実施する
アッセイによっては、多型塩基に所定のヌクレオチドの位置で、3’の塩基は終
結する。例えば、この標的オリゴヌクレオチドの3’の塩基は、多型塩基の5’側
のヌクレオチドで終結してもよく、多型塩基に対応する塩基で終結してもよい。
本発明はさらに、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（OLA）様式におけるビーズ
の使用を提供する。即ち、かかる使用では、ゲノムDNA、cRNAまたはPCR産物を、
標的核酸の所定のヌクレオチドのすぐ3’側の部分に相補的な第1相補性領域を有
する標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた後、蛍光標識を有するレポ
ーターオリゴヌクレオチドと混合し、さらにリガーゼを添加する。この場合、標
的オリゴヌクレオチドは3’末端に多型塩基を有する。捕捉読み取りによる典型
的なOLA反応では、試薬は、以下のものを含む：２つの相補性領域を有する標的
オリゴヌクレオチド；標的オリゴの第1相補性領域が、解析しようとする一塩基
多型にすぐ隣接している領域に相補的であり、かつ、標的オリゴヌクレオチドの
第2相補性領域は、捕捉オリゴヌクレオチドに相補的であること；可動性固相支
持体に共有結合している捕捉オリゴヌクレオチド；SNPを含む領域に相補的であ
りかつ読み取り手段とSNP位の反対鎖の3’塩基とを含むレポーターオリゴヌクレ
オチド；SNPの反対鎖のレポーター上の塩基が相補的であればレポーターと標的
とを連結可能なリガーゼ。該方法のある実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチド
に結合している可動性固相支持体に連結反応物を添加し、標準的ハイブリダイゼ
ーション条件下での第2相補性領域のビーズへのハイブリダイゼーションが起こ
り得る。レポーターの読み取りは、ルミネックスLX100型の機種を用いて実施で
きるであろう。
【００４９】 該システムの利点としては、異なる多数のSNPを解析するのに必要なビーズセ
ットの数が少なくてよいということが挙げられる。即ち、100色のビーズがあれ
ば、100種の捕捉オリゴヌクレオチドだけを合成すればよく、異なるウェルの中
でそれらを何度も繰り返して使えばよい。
【００５０】 したがって、本発明は、標的核酸中の所定のヌクレオチドを同定するために同
定反応(OLA)の結果を検出する方法であって： a）(i)第1相補性領域と第2相補性領域とを含む標的オリゴヌクレオチド、ここ
で、第1相補性領域は、標的核酸の所定のヌクレオチドのすぐ3’側に隣接してい
る部分に相補的な領域を含み、第2相補性領域は捕捉オリゴヌクレオチドに相補
的な核酸配列を含むものであること、ならびに(ii) 標的核酸の所定のヌクレオ
チドのすぐ5’側に隣接している部分に相補的な領域を含む蛍光標識化レポータ
ーオリゴヌクレオチドを、標的オリゴヌクレオチドの第1相補性領域と、標的核
酸の標的オリゴヌクレオチドの第1相補性領域に相補的な部分との間での特異的
ハイブリダイゼーションが可能であり、かつレポーターオリゴヌクレオチドと標
的核酸のレポーターオリゴヌクレオチドに相補的な領域との間での特異的ハイブ
リダイゼーションも可能であるハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸を含
むサンプルにハイブリダイズさせて、所定のヌクレオチドの反対鎖のギャップを
規定する（define）第１ハイブリダイゼーション産物を形成させること； b)同定される試験ヌクレオチド、ポリメラーゼおよびリガーゼを加えて、重合
化および連結のための条件下で標識産物を形成させること； c)ハイブリダイズした核酸を解離させること； d)ハイブリダイゼーション条件下で、可動性固相支持体に共有結合している捕
捉オリゴヌクレオチドと標識産物を接触させることにより標識化産物を単離して
第2ハイブリダイゼーション産物を形成させること、ここで、捕捉オリゴヌクレ
オチドは標的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域に相補的な核酸配列を含むも
のであること；および e)第2ハイブリダイゼーション産物中に標識が存在するか否かを検出すること
； を含み、ここで、標識の存在が、標的オリゴヌクレオチドへの同定される試験ヌ
クレオチドの重合化および重合化した標的オリゴヌクレオチドへの標識化レポー
ターオリゴヌクレオチドの連結を示すものであり、同定される試験ヌクレオチド
の正体が所定のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの正体を示すものであるこ
とから、標的核酸の所定のヌクレオチドが同定されることを特徴とする、上記方
法を提供する。
【００５１】 本発明全体に渡って用いる場合、標的核酸は粘度を低減させるための処理をし
たゲノムDNA、オリゴヌクレオチド、16s リボソームRNA、16S DNA PCR産物、DNA
断片、制限酵素処理により生成したDNA断片、サイズで所定のDNA、架橋増幅（Br
idge-amplified）DNA、RNA分子、cDNA分子またはcRNA分子であり得る。
【００５２】 本発明はさらに、粘度を低減させるための処理をしたゲノムDNA中の所定のヌ
クレオチド多型を決定する方法であって、 a) 核酸の一方の鎖の所定のヌクレオチドの5’側である部分に相補的な領域
を含む第1核酸プライマーと、核酸の反対鎖の所定のヌクレオチドの下流の部分
に相補的な第２核酸プライマーとを用いて、該２つのプライマーの間の所定のヌ
クレオチドの領域を特異的に増幅する条件下で、ゲノムDNAを増幅させてPCR産物
を形成させること、 b） PCR産物を、第1相補性領域と第2相補性領域とを含む標的オリゴヌクレオ
チドと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させて第1ハイブリダイゼーショ
ン産物を形成させること、ここで、第1相補性領域は、PCR産物の一方の鎖の所定
のヌクレオチドのすぐ5’側に隣接する部分に相補的であること； c） 第1ハイブリダイゼーション産物と検出可能な同定される標識化鎖終結ヌ
クレオチドとを用いたプライマー伸長反応を、プライマー伸長の条件下で実施し
てプライマー伸長産物を形成させること、； d) 可動性固相支持体に共有結合している捕捉オリゴヌクレオチドとプライマ
ー伸長産物を、ハイブリダイゼーション条件下で接触させて単離された第2ハイ
ブリダイゼーション産物を形成させることにより、プライマー伸長産物を単離す
ること、ここで、捕捉オリゴヌクレオチドは標的オリゴヌクレオチドの第2相補
性領域に相補的な核酸配列を含むものであること； e) 第2ハイブリダイゼーション産物中に取り込まれた標識が存在するか否か
を検出すること、ここで、標識の存在が、標識化鎖終結ヌクレオチドのプライマ
ー伸長産物への取り込みを示し、取り込まれた標識化鎖終結ヌクレオチドの正体
が所定のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの正体を示すものである；および f) 所定のヌクレオチドの正体を非多型ヌクレオチドと比較すること、 を含み、ここで、所定のヌクレオチドの正体と非多型ヌクレオチドの正体との相
違が、所定のヌクレオチドの多型を示すことを特徴とする、上記方法を提供する
。
【００５３】 本発明はさらに、粘度を低減させるための処理をしたゲノムDNA中の所定のヌ
クレオチド多型を決定する方法であって、 a) 核酸の一方の鎖のT7RNAポリメラーゼプロモーターを有する第1領域と所定
のヌクレオチドのすぐ5'側の部分に相補的な第2領域とを含むオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして用いて、２つのプライマーの間のヌクレオチドの領域を特
異的に増幅する条件下で、一本鎖をcRNAとして増幅させるためのT7RNAポリメラ
ーゼと、該cRNA鎖に相補的な第2鎖を増幅させるための逆転写酵素を用いてゲノ
ムDNAを増幅させて増幅産物を形成させること、 b） 増幅産物を、第1相補性領域と第2相補性領域とを含む標的オリゴヌクレ
オチドと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させて第1ハイブリダイゼーシ
ョン産物を形成させること、ここで、第1相補性領域は、PCR産物の一方の鎖の所
定のヌクレオチドのすぐ5’側に隣接する部分に相補的であり、第２相補性領域
は、第1相補性領域の5’側であること； c） 第1ハイブリダイゼーション産物と検出可能な同定される標識化鎖終結ヌ
クレオチドを用いたプライマー伸長反応を、プライマー伸長条件下で実施してプ
ライマー伸長産物を形成させること； d) プライマー伸長産物を、可動性固相支持体に共有結合している捕捉オリゴ
ヌクレオチドと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させて単離された第2ハ
イブリダイゼーション産物を形成させてプライマー伸長産物を単離すること、こ
こで、捕捉オリゴヌクレオチドは標的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域に相
補的な核酸配列を含むものであること； e) 第2ハイブリダイゼーション産物中に取り込まれた標識が存在するか否か
を検出すること、ここで、標識の存在が、標識化鎖終結ヌクレオチドのプライマ
ー伸長産物への取り込みを示し、取り込まれた標識化鎖終結ヌクレオチドの正体
が所定のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの正体を示すものである；および f) 所定のヌクレオチドの正体を非多型ヌクレオチドと比較すること； を含み、ここで、所定のヌクレオチドの正体と非多型ヌクレオチドの正体との相
違が、所定のヌクレオチドの多型を示すことを特徴とする、上記方法を提供する
。標識化鎖終結ヌクレオチドは、例えば、3’デオキシヌクレオチド、3’デオキ
シリボヌクレオチド、チオールヌクレオチド誘導体、またはジデオキシヌクレオ
チドでよい。増幅産物は、一本鎖形態であってもよい。さらに、標的オリゴヌク
レオチドのすぐ下流に位置する数種のプライマーを設計し合成してもよい。
【００５４】 本発明の方法はさらに、粘度を低減させるための処理をしたゲノムDNA中の所
定のヌクレオチド多型を決定する方法であって、 a) ゲノムDNAを、第1相補性領域と第2相補性領域とを含む標的オリゴヌクレ
オチドと、特異的第1ハイブリダイゼーション産物を形成させるためのハイブリ
ダイゼーション条件下で接触させること、ここで、第1相補性領域は、PCR産物の
一方の鎖の所定のヌクレオチドのすぐ5’側に隣接する部分に相補的であり、第
２相補性領域は、第1相補性領域の5’側であること； b） 第1ハイブリダイゼーション産物と検出可能な同定される標識化鎖終結ヌ
クレオチドを用いたプライマー伸長反応をプライマー伸長条件下で実施すること
； c) プライマー伸長産物を、可動性固相支持体に共有結合している捕捉オリゴ
ヌクレオチドと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させて単離された第2ハ
イブリダイゼーション産物を形成させてプライマー伸長産物を単離すること、こ
こで、捕捉オリゴヌクレオチドは標的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域に相
補的な核酸配列を含むものであること； d) 第2ハイブリダイゼーション産物中に取り込まれた標識が存在するか否か
を検出すること、ここで、標識の存在は標識化鎖終結ヌクレオチドのハイブリダ
イゼーション産物への取り込みを示し、取り込まれた標識化鎖終結ヌクレオチド
の正体が所定のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの正体を示すものである；
および e) 所定のヌクレオチドの正体を非多型ヌクレオチドと比較すること； を含み、ここで、所定のヌクレオチドの正体と非多型ヌクレオチドの正体との相
違が、所定のヌクレオチドの多型を示すことを特徴とする、上記方法を提供する
。DNAは、一本鎖形態であってもよい。標識化鎖終結ヌクレオチドは、例えば、3
’デオキシヌクレオチド、3’デオキシリボヌクレオチド、チオールヌクレオチ
ド誘導体、またはジデオキシヌクレオチドでよい。かかる特定の実施形態ではゲ
ノムDNAは予め増幅されてはいないので、かかる方法におけるハイブリダイゼー
ション時間は、ゲノムDNAへの第1プライマーのハイブリダイゼーションを可能と
するのに十分な長さとすべきである。したがって、比較的長時間のハイブリダイ
ゼーション時間を用いるとよい。ゲノムDNAのハイブリダイゼーションについて
は当業者に公知であるとおり(例えばSambrookら、参照のこと)、例えば、12時間
、24時間、または48時間などとする。
【００５５】 リガーゼを用いた反応では、任意のリガーゼを選択して用いてもよい。例えば
、T4リガーゼなどが挙げられる。熱安定性リガーゼが特に有用であろう。概説と
して、WuおよびWallace, Genomics 4: 560-569 (1989)を参照のこと。
【００５６】 本発明はさらに、２つの核酸をサンプル核酸にハイブリダイゼーションさせる
が、連結反応のステップは実施せず、その代わりにマッチ部をサンプル核酸にハ
イブリダイズした２つの核酸間での蛍光エネルギー転移により検出するハイブリ
ダイゼーション法も利用する。２つのハイブリダイズする核酸を、標識オリゴヌ
クレオチドの3’末端が試験塩基となるように設計し、多型塩基に相補的である
場合、単一波長の光をサンプルにあてると、エネルギーの転移が検出でき、第2
の波長の光として読み取ることができる。この第2の波長の検出に第2のリーダー
（reader）を用いることも可能である。したがって、本発明は、標的核酸中の所
定のヌクレオチドを同定する方法であって、 a) 標的核酸を、 i) 第1相補性領域と第2相補性領域とを含む標的オリゴヌクレオチド、ここで
、第1相補性領域は、第1核酸の所定のヌクレオチドのすぐ5’側の部分に相補的
であり、標的オリゴヌクレオチドは所定のヌクレオチドと塩基対形成する位置に
ある同定される試験ヌクレオチドの3’末端で終わっており、かつ第2相補性領域
は第1相補性領域の5’側であること；および ii) 蛍光標識レポーターオリゴヌクレオチド、ここで、該レポーターオリゴ
ヌクレオチドは、標的核酸の、所定のヌクレオチドのすぐ3’側に隣接している
部分に相補的な領域を含むものであること； と、標的核酸と標的オリゴヌクレオチドとがハイブリダイズ可能であり、かつ標
的核酸とレポーターオリゴヌクレオチドとがハイブリダイズ可能なハイブリダイ
ゼーション条件下で接触させることにより、第1ハイブリダイゼーション産物を
形成させること； b) 連結反応条件下で、第1ハイブリダイゼーション産物にリガーゼを添加す
ること； c) 第1ハイブリダイゼーション産物を、標的オリゴヌクレオチドの第2相補性
領域に相補的な核酸配列を含む、可動性固相支持体に共有結合した捕捉オリゴヌ
クレオチドと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させて単離された第2ハイ
ブリダイゼーション産物を形成させることにより第1ハイブリダイゼーション産
物を単離すること；および d) 第2ハイブリダイゼーション産物中のハイブリダイズした核酸を解離させ
た後、蛍光標識が存在するか否かを検出すること； を含み、ここで、標識の存在が標識化レポーターオリゴヌクレオチドの標的オリ
ゴヌクレオチドへの連結を示し、標的オリゴヌクレオチド中の試験ヌクレオチド
の正体が所定のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの正体を示すことにより、
所定のヌクレオチドが同定されることを特徴とする、上記方法を提供する。蛍光
エネルギー転移の検出は、ハイブリダイズした核酸の解離後に実施することがで
きる。
【００５７】 さらに、本発明は、標的核酸中の所定のヌクレオチドを同定する方法であって
、 a) 標的核酸を、 i) 3’末端で蛍光標識に連結している標的オリゴヌクレオチド、ここで、標
的オリゴヌクレオチドは、標的核酸の所定のヌクレオチドのすぐ3’側の部分に
相補的な第1相補性領域を含んでおり、標的オリゴヌクレオチドは所定のヌクレ
オチドと塩基対形成する位置にある試験ヌクレオチドの3’末端で終わっており
、かつ標的オリゴヌクレオチドは第1相補性領域の5’側に第2相補性領域を有し
ていること；および ii) 5’末端が蛍光標識されたレポーターオリゴヌクレオチド、ここで、該レ
ポーターオリゴヌクレオチドは、標的核酸の、所定のヌクレオチドのすぐ5’側
に隣接している部分に相補的な領域を含むものであること； と、標的核酸と標的オリゴヌクレオチドとがハイブリダイズ可能であり、かつ標
的核酸とレポーターオリゴヌクレオチドとがハイブリダイズ可能なハイブリダイ
ゼーション条件下で接触させて第1ハイブリダイゼーション産物を形成させるこ
と； b) 第1ハイブリダイゼーション産物を、標的オリゴヌクレオチドの第2相補性
領域に相補的な核酸配列を含む、可動性固相支持体に共有結合した捕捉オリゴヌ
クレオチドと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させて単離された第2ハイ
ブリダイゼーション産物を形成させることにより第1ハイブリダイゼーション産
物を単離すること；および c) 標的オリゴヌクレオチドの3’末端の蛍光標識と第2ハイブリダイゼーショ
ン産物中のレポーターオリゴヌクレオチドの5’末端の蛍光標識との間の蛍光エ
ネルギー転移が存在するか否かを検出すること； を含み、ここで、蛍光エネルギー転移の存在が同定される試験ヌクレオチドの標
的核酸へのハイブリダイゼーションを示し、標的オリゴヌクレオチド中のハイブ
リダイズした試験ヌクレオチドの正体が所定のヌクレオチドに相補的なヌクレオ
チドの正体を示すことにより、所定のヌクレオチドが同定されることを特徴とす
る、上記方法を提供する。
【００５８】 本発明はまた、標的核酸中の多型塩基の配列を決定する方法を提供する。該方
法には、標的核酸中の多型塩基のすぐ5’側に隣接する3’末端を有する標的核酸
の部分に相補的な第1相補性領域と、第1相補性領域の5’側の第2相補性領域とを
含む標的オリゴヌクレオチド；標的核酸中の多型塩基の3’にすぐ隣接する領域
に相補的な結合したレポーター部分を有するレポーターオリゴヌクレオチド；標
的オリゴヌクレオチドとレポーターオリゴヌクレオチドとが協同的に多型塩基の
反対側のギャップを規定すること；標的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域に
相補的な核酸配列を含む、可動性固相支持体(ポリスチレン-ジビニルベンゼンビ
ーズなど)に共有結合した捕捉オリゴヌクレオチド；２つの可能な多型塩基の組
み合わせのうちの一方に相補的なヌクレオチド；ヌクレオチドが多型塩基に相補
的であればギャップをまたいでヌクレオチドを重合化させることができるポリメ
ラーゼ、およびリガーゼは新規の重合化したヌクレオチドをレポーターオリゴヌ
クレオチドに連結させることができるリガーゼ；およびビーズに共有結合したレ
ポーターを検出するための手段のうちの1つ以上を含むキットを利用することが
できる。さらに、本発明は、標的核酸中の所定のヌクレオチドを同定する方法で
あって、 a) 標的核酸を、 i) 第１相補性領域と、第1相補性領域の5’側の第２相補性領域を含む標的オ
リゴヌクレオチド、ここで、第1相補性領域は、標的核酸の所定のヌクレオチド
のすぐ3’側に隣接している部分に相補的であること；および ii) 蛍光標識レポーターオリゴヌクレオチド、ここで、該レポーターオリゴ
ヌクレオチドは、第2核酸の、所定のヌクレオチドのすぐ5’側に隣接している部
分に相補的な領域を含むものであること； と、標的核酸と標的オリゴヌクレオチドとがハイブリダイゼーション産物を形成
し得、かつ標的核酸とレポーターオリゴヌクレオチドとがハイブリダイゼーショ
ン産物を形成し得るハイブリダイゼーション条件下で接触させて、標的核酸、標
的オリゴヌクレオチドおよびレポーターオリゴヌクレオチドが所定のヌクレオチ
ドの反対側のギャップを規定するハイブリダイゼーション産物を形成させること
； b) 重合化および連結のための条件下で、同定される試験ヌクレオチド、ポリ
メラーゼ、およびリガーゼを添加すること； c) 第1ハイブリダイゼーション産物を、標的オリゴヌクレオチドの第2相補性
領域に相補的な核酸配列を含む、可動性固相支持体に共有結合した捕捉オリゴヌ
クレオチドと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させて単離された第2ハイ
ブリダイゼーション産物を形成させることにより第1ハイブリダイゼーション産
物を単離すること；および d) 第2ハイブリダイゼーション産物中のハイブリダイズした核酸を解離させ
た後、蛍光標識が存在するか否かを検出すること； を含み、ここで、標識の存在が、試験核酸の標的オリゴヌクレオチドへの重合化
および標識化レポーターオリゴヌクレオチドの可動性固相支持体に結合した標的
オリゴヌクレオチドへの連結を示し、試験ヌクレオチドの正体が所定のヌクレオ
チドに相補的なヌクレオチドの正体を示すことにより、所定のヌクレオチドが同
定されることを特徴とする、上記方法を提供する。
【００５９】 ポリメラーゼは、好ましくは非鎖置換型(non-strand displacing)ポリメラー
ゼであり得る。さらに、熱安定性ポリメラーゼでもよい。リガーゼはDNAリガー
ゼでもよい。さらに、熱安定性リガーゼでもよい。
【００６０】 さらに、本明細書に記載のいずれの方法も、サンプル中の所定の核酸の発現を
定量する方法に利用することができる。したがって、例えば、所定の遺伝子の発
現を定量して、それを１つの標準試料またはその他の対照試料と比較するという
示差的(differential)遺伝子発現に用いることができる。この方法では、対象の
領域または対象の遺伝子(または対立遺伝子またはハプロタイプまたは多型)を識
別し得る領域に由来する遺伝子断片を、標識オリゴヌクレオチドの第1相補性領
域として用いるために選択し；メッセージ分子(例えば、RNA、cDNA、cRNA)を標
的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、本明細書に記載するようなプライ
マー伸長反応、リガーゼ反応またはハイブリダイゼーション/蛍光エネルギー転
移反応を実施することにより、蛍光を定量する。可動性固相支持体に結合してい
る対応する捕捉オリゴヌクレオチド(標的オリゴヌクレオチド中の利用される第2
相補性領域に相補的である)が、反応産物を捕捉するために用いられる。標的オ
リゴヌクレオチドの第1相補性領域は、所定の核酸の該核酸にユニークな部分に
相補的な領域を含んで良い。正常な検体または疾患に罹っているもしくは冒され
ている検体、または特定の組織もしくは器官、または特定の生物種から得たもの
などの標準試料を、比較対照として用いて、サンプル中の検出された量について
の結論を導くことができる。
【００６１】 したがって、本発明は、サンプル中の所定の核酸の発現を定量する方法であっ
て、 a) (i)所定の起源から単離したメッセージ核酸を、(ii) 所定の核酸の部分に
相補的な領域を含む第1相補性領域と、第1相補性領域の5’の第2相補性領域とを
含む標的オリゴヌクレオチドと接触させること； b） 第1ハイブリダイゼーション産物を用いて所定の同定反応を実施して、所
定のヌクレオチドの正体を決定すること、ここで、標的オリゴヌクレオチドの第
2相補性領域を含む選択的標識化検出産物が形成し得ること； c) 検出産物を、標的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域に相補的な核酸配
列を含む、可動性固相支持体に共有結合している捕捉オリゴヌクレオチドと、ハ
イブリダイゼーション条件下で接触させて単離されたハイブリダイゼーション産
物を形成させて検出産物を単離すること； d) 単離されたハイブリダイゼーション産物中の蛍光を定量すること； を含み、ここで、蛍光の量がサンプル中の所定の核酸の量を示すことを特徴とす
る、上記方法を提供する。
【００６２】 本明細書に記載のこれらの方法のいずれにおいても、サンプルを例えば、メッ
セージ分子を含む任意の体内サンプル(器官組織および/または細胞など)、なら
びに血液、赤血球もしくは白血球、骨髄、肝臓、腎臓、脳、皮膚、心臓、肺、脾
臓、膵臓、胆嚢、筋肉、神経系細胞、ニューロン、前駆細胞、卵巣、精巣、子宮
、腺などであってよい。
【００６３】 さらに、一塩基多型を検出するためのキットも提供する。該キットには、検出
可能なタグを付した可動性固相支持体(ポリスチレン-ジビニルベンゼンビーズな
ど)、および１〜4種の修飾(鎖終結型)ヌクレオチド(例えば、3’デオキシヌクレ
オチド、3’デオキシリボヌクレオチド、チオール誘導体、またはジデオキシヌ
クレオチド)が含まれる。さらに該キットは、ポリメラーゼ、特に修飾ヌクレオ
チドを優先的に組込むポリメラーゼを含み得る。さらには、該キットはリガーゼ
を含み得る。核酸を標識化するための1種以上の蛍光標識も含んでよい。ゲノムD
NAを使用する場合、該キットはさらに、DNAの粘度を低減するためのDNaseを含ん
で良い。該キットはさらに、ジヌクレオチドの組み合わせおよび/またはトリヌ
クレオチドの組み合わせの集合物のアレイを含み得る。鎖終結ヌクレオチドの替
りに、オリゴヌクレオチド連結アッセイ、対立遺伝子特異的ポリメラーゼアッセ
イ、クレバーゼ・シグナル放出反応、またはポリメラーゼ修復反応に利用する他
のレポータープローブおよび標識を含んで良い。
【００６４】 ある実施形態では、本発明は、標的核酸中の所定のヌクレオチドを同定するた
めに同定反応の結果を検出する方法であって： a. 第1相補性領域と第2相補性領域とを含む標的オリゴヌクレオチドを、標的
核酸を含むサンプルと、第1ハイブリダイゼーション産物の形成が可能なハイブ
リダイゼーション条件下で接触させること、ここで、第2相補性領域は第1相補性
領域の5’側にあり、第1相補性領域は、標的核酸の所定のヌクレオチドのすぐ3
’側に隣接している部分に相補的な領域を含むものであること； b. 選択的標識化レポータープローブの存在下で、所定のヌクレオチドの正体
を決定するために、第１ハイブリダイゼーション産物を用いて所定の同定反応を
実施すること、ここで、標的オリゴヌクレオチドおよびレポータープローブを含
む選択的標識化検出産物が形成され得ること； c. 該検出産物を、可動性固相支持体に直接または間接的に共有結合している
捕捉オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させて第2ハ
イブリダイゼーション産物を形成させることにより検出産物を単離すること、こ
こで、該捕捉オリゴヌクレオチドは標的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域に
相補的な核酸配列を含むものであること；および d. 第2ハイブリダイゼーション産物中の標識化検出産物の標識を検出するこ
と； を含み、ここで、標識の存在が標的核酸中の所定のヌクレオチドの正体を示すこ
とを特徴とする、上記方法を提供する。
【００６５】 本発明全体に渡って利用する場合、捕捉オリゴヌクレオチド(本明細書ではcジ
ップコード（ZipCode）とも称する)は、約50％以上のGC含量を有し得る。また、
捕捉オリゴヌクレオチドは、約60〜70℃のTmを有し得る。好ましくは、捕捉オリ
ゴヌクレオチドは、対象とする標的核酸を含有する細胞には存在しない配列を含
む。例えば、標的核酸が哺乳動物細胞に存在する配列であり、かつ捕捉オリゴヌ
クレオチドは細菌に存在するオリゴヌクレオチド配列を含むとよい。さらには、
捕捉オリゴヌクレオチドは、マイコバクテリウム・ツベルクロシス菌に存在する
オリゴヌクレオチド配列を含み得る。
【００６６】 また本発明全体に渡って利用する場合、捕捉オリゴヌクレオチドが5’アミン
基をさらに含んでも良い。捕捉オリゴヌクレオチドがルシフェラーゼcDNAをさら
に含んでもよい。例えば、ルシフェラーゼcDNAは、CAGGCCAAGTAACTTCTTCG(配列
番号59)の配列を有していてもよい。
【００６７】 また、本発明の様々な実施形態で用いられる場合は、捕捉オリゴヌクレオチド
は、可動性固相支持体に直接または間接的に結合していても良い。さらには、捕
捉オリゴヌクレオチドは、炭素原子のスペーサーを介して可動性固相支持体に間
接的に結合していても良い。捕捉オリゴヌクレオチドは、5’または3’末端のど
ちらかで可動性固相支持体に結合することができる。したがって、プローブにハ
イブリダイズするオリゴヌクレオチドに結合した標識は、標識の検出を妨害する
ことなく可動性固相支持体に引っ付いたりまたはそれから離れたりすることがで
きる。
【００６８】 本発明のさまざまな実施形態で用いられる場合、標的オリゴヌクレオチドの第
2相補性領域は、少なくとも８、10、15または25ヌクレオチドからなる核酸を含
むことが好ましい。さらには、標的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域は、表1
に示す配列番号１〜58からなる群から所定の配列を有する核酸を含むことができ
る。
【００６９】 本発明の同定反応は、1塩基鎖伸長反応であり得る。詳細には、1塩基鎖伸長反
応は、第1ハイブリダイゼーション産物を用いてプライマー伸長反応をプライマ
ー伸長条件下で実施することを含み、この場合、検出可能な標識化レポータープ
ローブは同定される鎖終結ヌクレオチドを含んでおり、かつ、第2ハイブリダイ
ゼーション産物中の標識の存在が第1ハイブリダイゼーション産物への標識化ヌ
クレオチドの取り込みを示すものであり、取り込まれた標識化ヌクレオチドの正
体は所定のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの正体を示すことから、標的核
酸中の所定のヌクレオチドが同定される。鎖終結ヌクレオチドは、3’デオキシ
ヌクレオチド、3’デオキシリボヌクレオチド、チオールヌクレオチド誘導体、
またはジデオキシヌクレオチドであり得る。鎖終結ヌクレオチドがジデオキシヌ
クレオチドである場合、プライマー伸長は、（１）1種の同定される標識化ジデ
オキシヌクレオチドと３種の異種の非標識ジデオキシヌクレオチドの存在下、（
２）1種の同定される標識化ジデオキシヌクレオチドと２種の異種の非標識ジデ
オキシヌクレオチドの存在下、（３）1種の同定される標識化ジデオキシヌクレ
オチドと1種の異種の非標識ジデオキシヌクレオチドの存在下、（４）1種の同定
される標識化ジデオキシヌクレオチドの存在下で、かつ異種の非標識ジデオキシ
ヌクレオチドの非存在下、のいずれかの条件下で実施され得る。鎖終結ヌクレオ
チドの標識は、ハプテン、放射性標識、および蛍光標識からなる群から選択され
得る。
【００７０】 本発明全体に渡って利用される場合、「標識」という用語は、標識する手段、
放射性標識および蛍光標識を提供するハプテンを指す。
【００７１】 本発明の他の実施形態では、同定反応はオリゴヌクレオチド連結反応であり得
る。詳細には、オリゴヌクレオチド連結反応は、標的オリゴヌクレオチドとレポ
ータープローブとの間での連結反応を、連結のための条件下で実施することを含
んでおり、ここで、選択的標識化レポータープローブは標的核酸の所定のヌクレ
オチドのすぐ5’側の部分に相補的な配列であって、標的核酸の所定のヌクレオ
チドと塩基対形成する位置にある同定される試験ヌクレオチドでその3’末端が
終わっている該配列を含むものであり、かつ、検出は第2ハイブリダイゼーショ
ン産物に取り込まれた標識が存在するか否かを検出することを含んでおり、ここ
で、標識の存在が反応産物中の標識化レポータープローブの取り込みを示し、か
つ取り込まれた標識化レポータープローブの正体が所定のヌクレオチドに相補的
なヌクレオチドの正体を示すことから、標的核酸中の所定のヌクレオチドが同定
されることを特徴とする。オリゴヌクレオチド連結反応において、レポータープ
ローブは、1種以上のヌクレオチドを含んで良く、かつ5’リン酸基を有してもよ
い。さらに、レポータープローブはまた、3’標識をも含む。好ましくは、レポ
ータープローブはオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、レポータープ
ローブのオリゴヌクレオチドは8-merである。OLAの利点は１つの試験管中で所定
のSNPに由来する対立遺伝子を読み取ることができることである(SBCEを用いると
、1つの蛍光団で標識したddNTPターミネータを用いる場合、問題とする各塩基に
ついて別々の試験管での解析が必要である)。さらに、OLA反応において、PCR調
製物に由来するdNTPを除去する必要がない。対照的に、SBCEの利点は、一塩基多
型それぞれについて別々のレポータープローブを設計する必要がないことである
。
【００７２】 他の実施形態では、同定反応は、対立遺伝子特異的重合化反応であってよい(
即ちミニシーケンス)。対立遺伝子特異的重合化反応は、非プルーフリーディン
グ(non-proof reading)ポリメラーゼを用いた重合反応を実施することを含んで
良い。この場合、レポータープローブは1種以上の選択的標識化デオキシヌクレ
オチドを含み、かつ、検出は第2ハイブリダイゼーション産物に取り込まれた標
識が存在するか否かを検出することを含んでおり、ここで、標識の存在がプライ
マーの伸長を示し、かつ標識の正体が所定のヌクレオチドに相補的なヌクレオチ
ドを示すことから、標的核酸中の所定のヌクレオチドが同定される。核酸プライ
マーは、オリゴヌクレオチド、PCR産物、DNA断片、RNA分子、cDNA分子、cRNA分
子またはゲノムDNAであってよい。
【００７３】 本発明全体に渡って用いる場合、可動性固相支持体がビーズであることが好ま
しく、ポリスチレン-ジビニルベンゼンビーズであることがさらに好ましい。あ
る実施形態では、ビーズはストレプトアビジンコートを施したものとすることが
でき、捕捉オリゴヌクレオチドはビオチン化したものでもよく、これにより、捕
捉プローブのビオチンとビーズ上のストレプトアビジンとにより、捕捉プローブ
とビーズとの間の高親和性結合が得られる。ビオチンをレポータープローブの標
識手段としておよび可動性固相支持体に捕捉プローブを結合させる手段として用
いる場合、可動性固相支持体上のストレプトアビジンは、可動性固相支持体にレ
ポータープローブのビオチンが直接結合するのを防止するためにビオチンで飽和
させておかなければいけないことは、当業者であれば判るであろう。
【００７４】 上述のように本発明の種々の実施形態で用いる場合、可動性固相支持体は、色
素、放射性標識、磁気性タグ、またはQuantum Dot(登録商標；Quantum Dot Corp
.)で検出可能なタグを付すことができる。検出可能なタグは、検出可能なタグの
検出が可能なレーザー検出装置上を可動性固相支持体を通過させるか、または、
二次元表面上に可動性固相支持体を置いて、固相支持体上の検出可能なタグの検
出/識別が可能なレーザー検出装置に固相支持体上を通過させるかのいずれかに
より、検出可能である。好ましくは、同一のレーザー検出装置は、標識化検出産
物の標識および第2ハイブリダイゼーション産物中の可動性固相支持体の検出可
能なタグを検出または識別する。放射性標識または放射性タグを本方法に用いる
場合、他の検出装置を用いる。例えば、放射性標識または放射性タグは、シンチ
レーション用液体中で読み取るためにサンプルを包埋して非レーザー検出器を用
いて検出することができる。
【００７５】 検出装置が各標識および検出可能なタグのシグナルを識別できるものならば、
同一の検出装置により、同一のサンプル中で多数の標識および検出可能なタグを
検出でき、多重化(multiplexing)することが可能である。本発明の様々な実施形
態では、可動性固相支持体は、例えば、異なる検出可能なタグ、および検出可能
なタグについて所定の捕捉プローブを有するビーズのセットを含み得る。分析的
読み取り装置はまた、固相支持体(ゲル、チップ、スライドガラス)および可動性
支持体の両方を含んでおり、例えば、マススペクトロメトリーおよび電気泳動(
ゲルおよびキャピラリー)などである。
【００７６】 同一のサンプル内でさらに多重化するためには、本発明全体に渡って示すよう
に、本発明の方法は、2種以上のレポータープローブの存在下で、所定の同定反
応を実施して異種の標識を有する検出産物を生成すること、ここで各レポーター
プローブは異なる検出可能な標識および標的核酸の所定のヌクレオチドに相補的
な異なるヌクレオチドを含むものであること、そして、第2ハイブリダイゼーシ
ョン産物中の標識化検出産物の異なる標識を検出することをさらに含んでもよく
、この場合、各標識の存在が標的核酸中の所定のヌクレオチドそれぞれの正体を
示す。場合によっては、第2ハイブリダイゼーション産物中の標識化検出産物の
異なる標識を定量することもでき、この場合、異なる標識の量が標的核酸中の所
定のヌクレオチドの相対的な存在量を示す。
【００７７】 多重化の他の実施形態としては、2種以上の捕捉オリゴヌクレオチドが可動性
固相支持体に共有結合していてもよく、この場合、各第2ハイブリダイゼーショ
ン産物が1種以上の標識を含む。したがって、例えば、異なる検出可能なタグを
有するビーズのセットにおいて、１つのビーズは2種以上の所定の捕捉プローブ
を有し得る。各ビーズは、それ自身検出可能なタグを有していても良く、捕捉プ
ローブの検出産物とのハイブリダイゼーションの際に、同一のビーズに2種の特
異的標識を有していても良い。例えば、特異的蛍光を有するビーズには、フルオ
ロセインおよびローダミンの両方の標識が結合していてもよい。検出装置は、１
つのビーズ上の3種全てのシグナルを識別でき、異なる蛍光波長を有するビーズ
の同一のシグナルを読み取ることができ得る。多重化法は、第2ハイブリダイゼ
ーション産物中の標識化検出産物の異なる標識を定量することをさらに含んでも
よく、この場合、異なる標識の量が標的核酸中の所定のヌクレオチドの相対的な
存在量を示す。
【００７８】 本発明は、あるいは、他の実施形態として、標的核酸中の所定のヌクレオチド
を同定するために同定反応の結果を検出する方法であって、標的核酸中の所定の
ヌクレオチドを同定するために同定反応の結果を検出する方法であって： a. 第1相補性領域と第2相補性領域とを含む標的オリゴヌクレオチドを、標的
核酸を含むサンプルと、第1ハイブリダイゼーション産物の形成が可能なハイブ
リダイゼーション条件下で接触させること、ここで、第2相補性領域は第1相補性
領域の3’側にあり、第1相補性領域は、標的核酸の所定のヌクレオチドのすぐ5
’側に隣接している部分に相補的な領域を含むものであること； b. 選択的標識化レポータープローブの存在下で、所定のヌクレオチドの正体
を決定するために、第１ハイブリダイゼーション産物を用いて所定の同定反応を
実施すること、ここで、標的オリゴヌクレオチドおよびレポータープローブを含
む選択的標識化検出産物が形成され得ること； c. 該検出産物を、可動性固相支持体に直接または間接的に共有結合している
捕捉オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させて第2ハ
イブリダイゼーション産物を形成させることにより検出産物を単離すること、こ
こで、該捕捉オリゴヌクレオチドは標的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域に
相補的な核酸配列を含むものであること；および d. 第2ハイブリダイゼーション産物中の標識化検出産物の標識を検出するこ
と； を含み、ここで、標識の存在が標的核酸中の所定のヌクレオチドの正体を示すこ
とを特徴とする、上記方法を提供する。本実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチ
ドは、5’または3’末端のいずれで可動性固相支持体に結合していても良い。好
ましくは、この3’から5’への方向性を用いる同定反応は、オリゴヌクレオチド
連結反応である。例えば、オリゴヌクレオチド連結反応は、標識オリゴヌクレオ
チドとレポータープローブとの間での連結反応を連結のための条件下で実施する
ことを含んでもよく、この場合、選択的標識化レポータープローブは標的核酸の
所定のヌクレオチドのすぐ3’側の部分に相補的な配列であって、標的核酸の所
定のヌクレオチドと塩基対形成する位置にある同定される試験ヌクレオチドでそ
の5’末端が終わっている該配列を含むものであり、かつ、検出は第2ハイブリダ
イゼーション産物に取り込まれた標識が存在するか否かを検出することを含んで
おり、ここで、標識の存在が反応産物中の標識化レポータープローブの取り込み
を示し、かつ取り込まれた標識化レポータープローブの正体が所定のヌクレオチ
ドに相補的なヌクレオチドの正体を示すことから、標的核酸中の所定のヌクレオ
チドが同定される。この実施形態では、レポータープローブは、1種以上のヌク
レオチドを含み、かつ3’リン酸基を有する。レポータープローブはさらに5’標
識を含む。
【００７９】 多重化手段として、本発明はさらに、1種以上の標的核酸中の１つ以上の所定の
ヌクレオチドを同定するために同定反応の結果を検出する方法であって： a. 1種以上の特異的標的オリゴヌクレオチドを、1種以上の標的核酸を含むサ
ンプルと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させて第1ハイブリダイゼーシ
ョン産物を形成させること、ここで、各標的オリゴヌクレオチドは第1特異的相
補性領域と第2特異的相補性領域とを含んでおり、各標的オリゴヌクレオチドの
第2相補性領域は第1相補性領域の5’側にあり、各標的オリゴヌクレオチドの第1
相補性領域は、標的核酸の所定のヌクレオチドのすぐ3’側の部分に相補的な配
列であって、標的核酸の所定のヌクレオチドと塩基対形成する位置にある同定さ
れる試験ヌクレオチドの3’末端で終わっている該配列を含むものであること； b. １種以上の選択的標識化レポータープローブの存在下で、第1ハイブリダ
イゼーション産物を用いて所定の同定反応を実施すること、ここで、標的オリゴ
ヌクレオチドの第1相補性領域とレポータープローブとを含む選択的標識化検出
産物が形成され得ること； c. 検出産物を、検出可能な特異的タグを付した可動性固相支持体に直接また
は間接的に共有結合している特異的捕捉オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイゼ
ーション条件下で接触させて第2ハイブリダイゼーション産物を形成させること
により検出産物を単離すること、ここで、各捕捉オリゴヌクレオチドは特異的標
的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域に相補的な核酸配列を含んでおり、かつ
、検出可能なタグは各捕捉オリゴヌクレオチドに特異的であること；および d. 第2ハイブリダイゼーション産物中の標識化検出産物の標識と、同一の第2
ハイブリダイゼーション産物中の可動性固相支持体の検出可能なタグを検出する
こと； を含み、ここで、同一の第2ハイブリダイゼーション産物中の標識および特異的
検出可能なタグの存在が標的核酸中の所定のヌクレオチドの正体を示すことを特
徴とする、上記方法を提供する。同定反応は、1塩基鎖伸長反応であってよい。
詳細には、1塩基鎖伸長反応は、第1ハイブリダイゼーション産物を用いたプライ
マー伸長反応をプライマー伸長条件下で実施することを含み、この場合、それぞ
れの検出可能な標識化レポータープローブは同定される鎖終結ヌクレオチドを含
んでおり、かつ、第2ハイブリダイゼーション産物中の所定の標識の存在が第1ハ
イブリダイゼーション産物への標識化ヌクレオチドの取り込みを示すものであり
、取り込まれた標識化ヌクレオチドの正体は所定のヌクレオチドに相補的なヌク
レオチドの正体を示すことから、標的核酸中の所定のヌクレオチドが同定される
。あるいは、同定反応はオリゴヌクレオチド連結反応であり得る。詳細には、オ
リゴヌクレオチド連結反応は、標識オリゴヌクレオチドとレポータープローブと
の間での連結反応を実施することを含む。あるいは、選択的標識化レポータープ
ローブは標的核酸の所定のヌクレオチドのすぐ5’側の部分に相補的な配列であ
って、標的核酸の所定のヌクレオチドと塩基対形成する位置にある同定される試
験ヌクレオチドの3’末端で終わっている該配列を含むものであり、かつ、検出
は第2ハイブリダイゼーション産物に取り込まれた標識が存在するか否かを検出
することを含んでおり、ここで、標識の存在が反応産物中の標識化レポータープ
ローブの取り込みを示し、かつ取り込まれた標識化レポータープローブの正体が
所定のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの正体を示すことから、標的核酸中
の所定のヌクレオチドが同定されることを特徴とする。あるいは、同定反応は、
対立遺伝子特異的重合化反応である。この場合、対立遺伝子特異的重合化反応は
、非プルーフリーディングポリメラーゼを用いた重合反応を実施することを含み
、各反応用プライマーは標的オリゴヌクレオチドの第1相補性領域を含んでおり
、レポータープローブは1種以上の選択的標識化デオキシヌクレオチドを含むも
のであること、および、検出は第2ハイブリダイゼーション産物に取り込まれた
標識が存在するか否かを検出することを含み、この場合、標識の存在がプライマ
ーの伸長を示し、かつ標識の正体が所定のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド
の正体を示すことから、標的核酸中の所定のヌクレオチドが同定される。
【００８０】 本発明において、同一の第2ハイブリダイゼーション産物中の検出装置が標識
化検出産物の種々の標識および可動性固相支持体の種々の検出可能なタグを検出
または識別する。場合によっては、第2ハイブリダイゼーション産物中の標識お
よび検出可能な特異的タグを定量することもでき、この場合、第2ハイブリダイ
ゼーション産物中の標識および検出可能な特異的タグの量が標的核酸中の所定の
ヌクレオチドの相対的な存在量を示す。
【００８１】 同様の実施例を、3’から5’への逆向きの方向性を用いて実施することもでき
る。したがって、本発明は1種以上の標的核酸中の１つ以上の所定のヌクレオチ
ドを同定するために同定反応の結果を検出する方法であって： a. 1種以上の特異的標的オリゴヌクレオチドを、1種以上の標的核酸を含むサ
ンプルと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させて第1ハイブリダイゼーシ
ョン産物を形成させること、ここで、各標的オリゴヌクレオチドは第1特異的相
補性領域と第2特異的相補性領域とを含んでおり、各標的オリゴヌクレオチドの
第2相補性領域は第1相補性領域の3’側にあり、それぞれの標的オリゴヌクレオ
チドの第1相補性領域は、標的核酸の所定のヌクレオチドのすぐ5’側の部分に相
補的な配列であって、標的核酸の所定のヌクレオチドと塩基対形成する位置にあ
る同定される試験ヌクレオチドでその5’末端が終わっている該配列を含むもの
であること； b. １種以上の選択的標識化レポータープローブの存在下で、第1ハイブリダ
イゼーション産物を用いて所定の同定反応を実施すること、ここで、標的オリゴ
ヌクレオチドの第1相補性領域およびレポータープローブを含む選択的標識化検
出産物が形成され得ること； c. 検出産物を、検出可能な特異的タグを付した可動性固相支持体に直接また
は間接的に共有結合している特異的捕捉オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイゼ
ーション条件下で接触させて第2ハイブリダイゼーション産物を形成させること
により検出産物を単離すること、ここで、各捕捉オリゴヌクレオチドは特異的標
的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域に相補的な核酸配列を含んでおり、かつ
、検出可能なタグは各捕捉オリゴヌクレオチドに特異的であること；および d. 第2ハイブリダイゼーション産物中の標識化検出産物の標識と、同一の第2
ハイブリダイゼーション産物中の可動性固相支持体の検出可能なタグを検出する
こと； を含み、ここで、同一の第2ハイブリダイゼーション産物中の標識および特異的
検出可能なタグの存在が標的核酸中の所定のヌクレオチドの正体を示すことを特
徴とする、上記方法を提供する。各捕捉オリゴヌクレオチドは、5’または3’末
端のどちらかで可動性固相支持体と結合していれば良い。好ましくは、同定反応
はオリゴヌクレオチド連結反応である。より好ましくは、レポータープローブは
、1種以上のヌクレオチドを含み、かつ5’リン酸基を有しており、さらに、5’
標識を含む。該5’リン酸基は、特異的リガーゼ酵素に対する基質として必要で
ある。
【００８２】 本発明は、ゲノムDNA中の1種以上の所定のヌクレオチドの多型を決定する方法
であって： a'. 核酸の一方の鎖の所定のヌクレオチドの5’側の部分に相補的な領域を含
む第1核酸プライマーと核酸の反対鎖の所定のヌクレオチドの下流の部分に相補
的な第２核酸プライマーとを用いて、該２つのプライマーの間の所定のヌクレオ
チドの領域を特異的に増幅する条件下で、ゲノムDNAを増幅させてPCR産物を形成
させること、 a''. T7RNAポリメラーゼプロモーターを有する第1領域と核酸の一方の鎖の所
定のヌクレオチドのすぐ5'側の部分に相補的な第2領域とを含むオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用いて、２つのプライマーの間のヌクレオチドの領域を
特異的に増幅する条件下で、第1鎖をcRNAとして増幅させるためのT7RNAポリメラ
ーゼと、該cRNA鎖に相補的な第2鎖を増幅させるための逆転写酵素を用いてゲノ
ムDNAを増幅させてｃRNA増幅産物を形成させること、または、 a'''. ゲノムDNAの粘度を低減させるためにゲノムDNAを処理すること；およ
び b. 1種以上のPCR産物、1種以上のcRNA増幅産物、または処理したゲノムDNAを
含むサンプルを1種以上の特異的標的オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイゼー
ション条件下で接触させて第1ハイブリダイゼーション産物を形成させること、
ここで、各標的オリゴヌクレオチドは第1特異的相補性領域および第2特異的相補
性領域を含んでおり、各標的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域は、第1相補性
領域の5’側にあり、かつ、各標的オリゴヌクレオチドの第1相補性領域は、標的
核酸の所定のヌクレオチドのすぐ5’側の部分に相補的な配列であって、PCR産物
、cRNA増幅産物、または処理したゲノムDNAの所定のヌクレオチドと塩基対形成
する位置にある同定される試験ヌクレオチドの3’末端で終わっている該配列を
含むものであること； c. 一種以上の選択的標識化レポータープローブの存在下で、第1ハイブリダ
イゼーション産物を用いて所定の同定反応を実施すること、ここで、標的オリゴ
ヌクレオチドの第1相補性領域およびレポータープローブを含む選択的標識化検
出産物が形成され得ること； d. 検出可能な特異的タグを付した可動性固相支持体に直接または間接的に共
有結合している特異的オリゴヌクレオチドと検出産物を、ハイブリダイゼーショ
ン条件下で接触させて第2ハイブリダイゼーション産物を形成させることにより
検出産物を単離すること、ここで、各捕捉オリゴヌクレオチドは特異的標的オリ
ゴヌクレオチドの第2相補性領域に相補的な核酸配列を含んでおり、かつ、検出
可能なタグは各捕捉オリゴヌクレオチドに特異的であること；および e. 第2ハイブリダイゼーション産物中の標識化検出産物の標識と、同一の第2
ハイブリダイゼーション産物中の可動性固相支持体の検出可能なタグとを検出す
ること、ここで、同一の第2ハイブリダイゼーション産物中の標識および検出可
能な特異的タグの存在が特異的PCR産物、cRNA増幅産物、または処理されたゲノ
ムDNAの所定のヌクレオチドの正体を示すものである；および f. 同定されたヌクレオチドの正体を非多型ヌクレオチドと比較すること； を含み、ここで、同定されたヌクレオチドの正体と非多型ヌクレオチドの正体と
の相違が、ゲノムDNAの1種以上の多型を示すことを特徴とする、上記方法を提供
する。同定反応は、上述の1塩基鎖伸長反応、オリゴヌクレオチド連結反応、ま
たは対立遺伝子特異的重合化反応であり得る。上述の通り、多重化のための多く
の手段を開発することができ、例えば、可動性固相支持体に共有結合した2種以
上の捕捉オリゴヌクレオチドを用いて、各第2ハイブリダイゼーション産物が1種
以上の標識を含むことを特徴とする方法がある。したがって、該方法は、第2ハ
イブリダイゼーション産物中の標識および検出可能な特異的タグを定量すること
をさらに含んでも良く、この場合第2ハイブリダイゼーション産物中の標識およ
び検出可能な特異的タグの量は標的核酸中の所定の各ヌクレオチドの相対的な存
在量を示す。
【００８３】 本発明はさらに、標的核酸中の1種以上の所定のヌクレオチドを同定するため
にクレバーゼ/シグナル放出反応の結果を検出する方法であって： a. 標的核酸を含むサンプルを、 (i)それぞれに第1相補性領域および試験ヌクレオチドに特異的な所定の第2相
補性領域を含む1種以上のシグナルプローブ、 ここで、第2相補性領域は、第1相補性領域の5’側にあり、かつ蛍光供与団を含
んでおり、第1相補性領域は(a)標的核酸の所定のヌクレオチドのすぐ5’側の部
分に相補的な配列、(b)標的核酸の所定のヌクレオチドと塩基対形成する位置に
ある5’末端の試験ヌクレオチド、および(c)同定される試験ヌクレオチドの3’
末端にある蛍光消光団を含むものであること、ならびに (ii)2つ以上のインベーダーオリゴヌクレオチド、 ここで、各インベーダーヌクレオチドは、(a)標的核酸の所定のヌクレオチドの
すぐ3’側の部分に相補的な配列、および(b)標的核酸の所定のヌクレオチドと塩
基対形成する位置にある5’末端の同定される試験ヌクレオチドを含むものであ
ること、 と、シグナルプローブの第1相補性領域と標的核酸のシグナルプローブの第1相補
性領域に相補的な部分との間、およびインベーダーオリゴヌクレオチドと標的核
酸の相補的部分との間で、重複ハイブリダイゼーション産物の形成が可能なハイ
ブリダイゼーション条件下で、接触させて重複ハイブリダイゼーション産物を形
成させること、ここで、重複ハイブリダイゼーション産物は所定のヌクレオチド
で重複すること； b. 同定される試験ヌクレオチドと所定のヌクレオチドが相補的である場合に
形成される重複ハイブリダイゼーション産物を特異的に切断するヌクレアーゼと
重複ハイブリダイゼーション産物を接触させることを含む特異的切断反応を実施
し、特異的第2相補性領域とシグナルプローブの第1相補性領域の同定される試験
ヌクレオチドとを含む検出産物を放出させること； c. 検出可能な特異的タグを付した可動性固相支持体に直接または間接的に共
有結合している特異的捕捉オリゴヌクレオチドと検出産物を、ハイブリダイゼー
ション条件下で接触させて非重複第2ハイブリダイゼーション産物を形成させる
ことにより検出産物を単離すること、ここで、各捕捉オリゴヌクレオチドは特異
的シグナルプローブの特異的第2相補性領域に相補的な核酸配列を含んでおり、
かつ、検出可能なタグは各捕捉オリゴヌクレオチドに特異的であること、および d. 非重複ハイブリダイゼーション産物中の蛍光供与団の存在および蛍光消
光団の不存在、ならびに同一の非重複ハイブリダイゼーション産物中の可動性固
相支持体の検出可能なタグの存在を検出すること； を含み、ここで検出可能な特異的タグおよび蛍光供与団の存在、ならびに蛍光消
光団の不存在が標的核酸中の所定のヌクレオチドの正体を示すことを特徴とする
、上記方法を提供する。場合によっては、上記ステップ(a)および(b)を繰り返し
て、検出産物のレベルを増大させることをさらに含んでもよい。上述の通り、各
捕捉オリゴヌクレオチドは、5’または3’末端のどちらで可動性固相支持体に結
合していても良い。本方法はさらに、検出可能な特異的タグおよび蛍光供与団の
存在量を定量することをさらに含んでもよく、この場合、同一の非重複ハイブリ
ダイゼーション産物中の蛍光消光団の不存在が標的核酸中の所定のヌクレオチド
それぞれの相対的な存在量を示す。
【００８４】 標的核酸中の1種以上の所定のヌクレオチドを同定するためにクレバーゼ/シグ
ナル放出反応の結果を検出する方法は、逆の3’から5’への方向の反応、即ち、 a. 標的核酸を含むサンプルに、 (i)それぞれに第1相補性領域および試験ヌクレオチドに特異的な所定の第2相
補性領域を含む1種以上のシグナルプローブ、 ここで、第2相補性領域は、第1相補性領域の3’側にあり、かつ蛍光供与団を含
んでおり、第1相補性領域は(a)標的核酸の所定のヌクレオチドのすぐ3’側の部
分に相補的な配列、(b)標的核酸の所定のヌクレオチドと塩基対形成する位置に
ある3’末端の試験ヌクレオチド、および(c)同定される試験ヌクレオチドの5’
末端にある蛍光消光団を含むものであること、ならびに (ii)2つ以上のインベーダーオリゴヌクレオチド、 ここで、各インベーダーヌクレオチドは、(a)標的核酸の所定のヌクレオチドの
すぐ5’側の部分に相補的な配列、および(b)標的核酸の所定のヌクレオチドと塩
基対形成する位置にある3’末端の同定される試験ヌクレオチドを含むものであ
ること、 を、シグナルプローブの第1相補性領域と標的核酸のシグナルプローブの第1相補
性領域に相補的な部分との間、およびインベーダーオリゴヌクレオチドと標的核
酸の相補的部分との間で、重複ハイブリダイゼーション産物の形成が可能なハイ
ブリダイゼーション条件下で、接触させて重複ハイブリダイゼーション産物を形
成させること、ここで、重複ハイブリダイゼーション産物は所定のヌクレオチド
で重複すること； b. 同定される試験ヌクレオチドと所定のヌクレオチドが相補的である場合に
形成される重複ハイブリダイゼーション産物を特異的に切断するヌクレアーゼと
重複ハイブリダイゼーション産物を接触させることを含む特異的切断反応を実施
し、特異的第2相補性領域とシグナルプローブの第1相補性領域の同定される試験
ヌクレオチドとを含む検出産物を放出させること； c. 検出産物を、検出可能な特異的タグを付した可動性固相支持体に直接また
は間接的に共有結合している特異的捕捉オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイゼ
ーション条件下で接触させて非重複第2ハイブリダイゼーション産物を形成させ
ることにより検出産物を単離すること、ここで、各捕捉オリゴヌクレオチドは特
異的シグナルプローブの特異的第2相補性領域に相補的な核酸配列を含んでおり
、かつ、検出可能なタグは各捕捉オリゴヌクレオチドに特異的であること、およ
び d. 非重複ハイブリダイゼーション産物中の蛍光供与団の存在および蛍光消光
団の不存在、ならびに同一の非重複ハイブリダイゼーション産物中の可動性固相
支持体の検出可能なタグの存在を検出すること； を含む方法であり、この場合、検出可能な特異的タグおよび蛍光供与団の存在、
ならびに蛍光消光団の不存在が標的核酸中の所定のヌクレオチドの正体を示す。
【００８５】 本発明は、標的核酸中の1種以上の所定のヌクレオチドを同定するためにポリ
メラーゼ/修復反応の結果を検出する方法であって、反対側の3’から5’への方
向性で、下記の： a. 標的核酸を含むサンプルを、 (i)それぞれに第1相補性領域および試験ヌクレオチドに特異的な所定の第2相補
性領域を含む1種以上のシグナルプローブと、シグナルプローブの第1相補性領域
と標的核酸のシグナルプローブの第1相補性領域に相補的な部分との間で第1ハイ
ブリダイゼーション産物の形成が可能なハイブリダイゼーション条件下で、接触
させること、 ここで、第2相補性領域は、第1相補性領域の3’側にあり、第1相補性領域は(a)
標的核酸の所定のヌクレオチドのすぐ5’側の部分に相補的な配列、(b)標的核酸
の所定のヌクレオチドと塩基対形成する位置にある、シグナルプローブの5’末
端の同定される試験ヌクレオチド、(c)試験ヌクレオチドの3’に位置するチオー
ル部位、(d)チオール部位の3’側にある蛍光供与団、(d) チオール部位の5’側
で試験ヌクレオチドの3’側に位置する蛍光消光団を含むこと； b. 試験ヌクレオチドと所定のヌクレオチドが相補的である場合にチオール部
位にてシグナルプローブを切断し、第2相補性領域と、シグナルプローブの第1相
補性領域とを含む、蛍光供与団を含むが蛍光消光団は含まない検出産物を放出さ
せるTaqポリメラーゼと第1ハイブリダイゼーション産物を接触させることを含む
ポリメラーゼ/修復反応を実施すること； c. 検出可能な特異的タグを付した可動性固相支持体に直接または間接的に共
有結合している特異的捕捉オリゴヌクレオチドと検出産物を、ハイブリダイゼー
ション条件下で接触させて第2ハイブリダイゼーション産物を形成させることに
より検出産物を単離すること、ここで、各捕捉オリゴヌクレオチドは特異的シグ
ナルプローブの特異的第2相補性領域に相補的な核酸配列を含んでおり、かつ、
検出可能なタグは各捕捉オリゴヌクレオチドに特異的であること；および d. 同一の第2ハイブリダイゼーション産物中の蛍光供与団の存在および蛍光
消光団の不存在、ならびに可動性固相支持体の検出可能な特異的タグの存在を検
出すること； を含み、ここで、検出可能な特異的タグおよび蛍光供与団の存在、ならびに蛍光
消光団の不存在が標的核酸中の所定のヌクレオチドの正体を示すことを特徴とす
る、上記方法を提供する。該方法は、上記ステップ(a)および(b)を繰り返して、
検出産物の量を増大させることをさらに含んでもよい。本方法はさらに、検出可
能な特異的タグおよび蛍光供与団の存在量を定量することをさらに含んでもよく
、この場合、同一の非重複ハイブリダイゼーション産物中の蛍光消光団の不存在
が標的核酸中の所定のヌクレオチドそれぞれの相対的な存在量を示す。
【００８６】 本発明はまた、サンプル中の所定の微生物の混入物を検出する方法であって： a. サンプルを、第１相補性領域および第２相補性領域をそれぞれに含む1種
以上の標的オリゴヌクレオチドと、標的オリゴヌクレオチドの第1相補性領域と
微生物核酸の標的オリゴヌクレオチドの第1相補性領域に相補的な領域との間で
ハイブリダイゼーション産物の形成が可能なハイブリダイゼーション条件下で接
触させて、第１ハイブリダイゼーション産物を形成させること、ここで、第1相
補性領域は所定の微生物の混入物に特異的な核酸部分に相補的な領域を含み、第
2相補性領域は特異的標識化レポータープローブに相補的な領域を含むものであ
ること； b. 1種以上の標識化レポータープローブの存在下で、第１ハイブリダイゼー
ション産物を用いて所定の同定反応を実施すること、ここで、特異的標的オリゴ
ヌクレオチドおよび標識をそれぞれに含む選択的標識化検出産物が形成され得る
こと； c. 該検出産物を、検出可能な特異的タグを付した可動性固相支持体に直接ま
たは間接的に共有結合している特異的捕捉オリゴヌクレオチドと、接触させるこ
とにより検出産物を単離すること、ここで、各捕捉オリゴヌクレオチドは特異的
標的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域に相補的な核酸配列を含んでおり、か
つ検出可能なタグは各捕捉オリゴヌクレオチドに特異的であること；および d. 第2ハイブリダイゼーション産物中の標識化検出産物の標識および同一の
第2ハイブリダイゼーション産物中の可動性固相支持体の検出可能なタグを検出
すること； を含み、ここで、同一の第2ハイブリダイゼーション産物中の標識および検出可
能な特異的タグの存在がサンプル中の微生物の混入物の正体を示すことを特徴と
する、上記方法を提供する。所定の微生物の混入物は、黄色ブドウ球菌（(Staph
ylococcus aureus, S.aureus)）、ブルクホルデリア・セパシア(B.セパシア、Bu
rkholderia cepacia, B.cepacia)、大腸菌、およびシュードモナス菌を含み得る
が、これらに限定はされない。複数の混入物を同一のサンプル中で、上述の多重
化技法を用いて同定することができる。同定反応は、上記に詳述したような、オ
リゴヌクレオチド連結反応、一塩基鎖伸長反応、対立遺伝子特異的重合化反応、
クレバーゼ/シグナル放出反応、ポリメラーゼ/修復反応でよいと理解される。微
生物DNAは、例えば同定反応の前にPCR等で増幅しても良い。微生物の混入物につ
いて試験できるサンプルは、食品サンプル、薬物/医薬品サンプル、血液サンプ
ル、尿サンプル、ならびに食品および薬剤の調製に用いるための種々の薬物を含
むが、これらに限定はさらない。
【００８７】 サンプル中の黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus, S.aureus)混入物を検
出するために、以下の核酸配列 GCCGGTGGAGTAACCTTTTAG (配列番号60)、または GCCGGTGGAGTAACCTTTTAGG (配列番号61) を有する黄色ブドウ球菌に特異的な核酸の一部分に相補的な第１相補性領域を用
いて方法を実施できる。
【００８８】 サンプル中のB.セパシアを検出するために、以下の核酸配列CTGAGAGGCGGGAGTG
CT (配列番号62)、またはCTGAGAGGCGGGAGTGCTC(配列番号63)を有するB.セパシア
に特異的な核酸の一部分に相補的な第１相補性領域を用いて方法を実施できる。
【００８９】 大腸菌またはシュードモナス属菌(Pseudomonas)のいずれかである細菌混入物
を検出するために、大腸菌またはシュードモナス属菌に特異的な核酸の一部分に
相補的な第１相補性領域が以下の核酸配列AATACCGCATA(配列番号64)またはAATAC
CGCATA C/A(配列番号65)を有する、方法を実施できる。 シュードモナス属菌またはB.セパシアである細菌混入物を検出するために、シ
ュードモナス属菌またはB.セパシアに特異的な核酸の一部分に相補的な第１の相
補性領域が以下の核酸配列AATACCGCATACG(配列番号66)、またはAATACCGCATACG T
/A(配列番号67)を有する、方法を実施できる。
【００９０】 以下の文献は、様々な技術に関する情報を提供する： PCT公報 WO 9714028 (Luminex Corp.) オーストラリア特許 AU 9723205(WO 9735033 (97/09/25)に基づく)(Molecular
Tool Inc.) 欧州特許公報 EP 754240 (WO 9521271に基づく)(Molecular Tool Inc.) 欧州特許公報 EP 736107 (WO 9517524に基づく)(Molecular Tool Inc.) 米国特許第5,610,287号 (97/03/11) (Molecular Tool Inc.) 欧州特許公報 EP 726905 (WO 9512607に基づく)(Molecular Tool Inc.) 米国特許第5,518,900号 (94/07/21) (Molecular Tool Inc.) 欧州特許公報 EP 576558 (WO 9215712に基づく)(Molecular Tool Inc.)
【００９１】 実施例１ オリゴヌクレオチド連結およびフローサイトメトリーによる多重化一塩基多型 遺伝子型分類 一塩基多型(SNP)遺伝子型分類のためのこのハイスループット方法では、オリ
ゴヌクレオチド連結アッセイ(OLA)および蛍光微小球のフローサイトメトリー分
析を使用し、OLAによりフルオレセイン化オリゴヌクレオチドレポータープロー
ブ(またはレポーター配列)に標的オリゴヌクレオチドを添加した。標的オリゴヌ
クレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたゲノム「標的」、および微
小球に結合した分離した相補的DNA配列の両方にハイブリダイズするように設計
された。微小球に結合した配列にハイブリダイズする標的オリゴヌクレオチド上
の配列は「ジップコード(ZipCode)」と称される。OLA改変型標的オリゴヌクレオチ
ドは、ジップコード相補体結合微小球にハイブリダイズする。異なる比率の赤お
よびオレンジ蛍光を有する微小球を使用することにより、多くのSNPが単一の試
験管の中で分析され得る多重化形式が可能になる。微小球のフローサイトメトリ
ー分析は、SNP遺伝子型分類に関連する微小球の種類および蛍光緑色シグナルの
両方を同時に同定する。第19染色体上のアポＥ遺伝子座付近に位置する９つのSN
Pマーカーについて７つのCEPH DNAサンプルの多重遺伝子型分類を行い、全ての
場合を配列決定する遺伝子型分類によりその結果を照合した。赤およびオレンジ
蛍光により個々に同定が可能な蛍光ラテックス微小球のセット、ならびに緑色蛍
光色素を使用した。異なる比率の赤およびオレンジ蛍光を有する微小球の使用に
より、多重化形式が可能になった。多くのSNPを単一の試験管で分析した。微小
球のフローサイトメトリー分析は、SNP遺伝子型に関連する微小球の種類および
蛍光緑色シグナルの両方を同時に同定した。
【００９２】 カルボキシル化表面および異なる比率の赤およびオレンジ蛍光を有するポリス
チレン微小球(直径5.5μm)はLuminex Corp. (Austin, TX)から購入した。カルボ
キシル化微小球への共有結合に使用したオリゴヌクレオチドは全て、5’アミン
基、C15またはC18スペーサー、および45ヌクレオチド(Oligos Etc, Bethel, ME
or PE Biosystems, Foster City, CA)で合成した。5’末端に最も近い20のヌク
レオチドは、ルシフェラーゼcDNA由来の共通配列(5’-CAG GCC AAG TAA CTT CTT
CG-3’)(配列番号59)を含んでおり、相補的フルオレセイン化ルシフェラーゼプ
ローブへのハイブリダイゼーションにより微小球への結合効率を決定するために
使用した。3’末端における25のヌクレオチドcジップコードは、結核菌(Mycobac
terium tuberculosis)ゲノムに由来する配列であった。このゲノムは、高いGC含
量を有する細菌ゲノムであるために選択された。選択された配列は、56〜72％の
GC含量、および61〜68℃の予想Tm値を有していた。レポーターオリゴヌクレオチ
ドは、5’ホスフェート基、および3’フルオレセインまたは3’ビオチン修飾の
いずれかで設計した(Oligos Etc, Bethel, ME or Biosource/Keystone, Camaril
lo, CA)。レポータープローブTmは、18〜24℃である８塩基レポーターを除いて
、36〜40℃の範囲にあった。標的オリゴヌクレオチドは、5’末端において25の
ヌクレオチドジップコード配列(表１を参照)、および3’末端において対立遺伝
子特異的配列を有していた。対立遺伝子特異的配列は、56〜56℃のTmを有するよ
うに設計された。1X PCR緩衝液I(Applied Biosystems, Foster City, CA)中1.5
単位のAmpliTaq Gold(Applied Biosystems, Foster City, CA)、400μM dNTP、2
00μM順方向PCRプライマー、および200μM逆方向PCRプライマーを用いて、150〜
462 bpの長さの標的核酸を10〜20ナノグラムのゲノムDNA(CEPH DNAはCoriell Ce
ll Repositories, Camden, NJから得た)から増幅した。典型的に、30μlの反応
液を、PE Biosystems 9700サーモサイクラー中で95℃にて10分間行い、その後40
回の３温度増幅サイクルを94℃、60℃および72℃にてそれぞれ30秒間保って行い
、72℃にてさらに５分間の伸長を行って終了した。反応後、サンプルを４℃に保
った。
【００９３】Ａ．微小球へのオリゴヌクレオチドの結合 カルボキシル化微小球(62μl 0.1 M 2-[N-モルホリノ]エタンスルホン酸(MES)
(Sigma, St. Louis, MO)中の2.5 X 106微小球)を、アミン修飾されたオリゴヌク
レオチド(25μl 0.1 M MES中５ナノモル)と混合した。３つの異なる時間(インキ
ュベーションの開始時、およびその後20分間隔で２回)において、0.3 mgの1-エ
チル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)(Pierce, Rockf
ord, IL)を微小球混合液に添加した。反応液は、60分間の室温インキュベーショ
ンの間に時折混合および音波処理して、微小球が凝集せずに懸濁状態を保つよう
にした。結合後、微小球を、0.02%Tween20(Sigma, St. Louis, MO)を含む１mlリ
ン酸緩衝化食塩水、次いで150μl 10 mM トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタ
ン塩酸塩/１mMエチレンジアミン四酢酸(pH8.0)(TE)中で洗浄した。微小球を、20
0μl TE中に再懸濁して４℃にて保存した。
【００９４】 微小球に共有結合したオリゴの数を評価するために、10,000の結合微小球、お
よび各cジップコードオリゴの5’末端上のルシフェラーゼ配列の20ヌクレオチド
に相補的な３ピコモルのフルオレセイン化オリゴを使用してハイブリダイゼーシ
ョンを行った。ハイブリダイゼーションは3.3X SSC中で45℃にて30分間行い、次
いで96℃にて２分間変性を行った。微小球は、0.02% Tween 20を含む300μl 2X
SSC中に再懸濁した0.02% Tween 20を含む200μl 2X SSCで洗浄し、フローサイト
メトリーにより分析した。
【００９５】Ｂ．ジップコード結合の特異性 58の標的オリゴヌクレオチドのセットを設計および合成した。各オリゴは、共
通対立遺伝子特異的3’部分を有していたが、それぞれユニークな5’ジップコー
ド配列を含んでいた。各標的オリゴヌクレオチドを標準的OLA反応に別々に使用
して、共通ゲノム標的核酸をアッセイした。得られた58の蛍光標識化OLA生成物
のセットを、標準的ハイブリダイゼーション反応において、それぞれ異なる相補
的ジップコードを担持する58種類の微小球の存在下で個々に使用した。フローサ
イトメトリー分析の後、複数の種類の微小球にハイブリダイズしたジップコード
を捨てた。置換ジップコードを設計し、新規の捕捉プローブを合成し、改変した
58のプローブのセットを再テストした。平均蛍光強度をMESF値に変換して、微小
球に結合したオリゴヌクレオチドの数を見積もった。平均cジップコード結合は
、１微小球当たり100,000〜約1,000,000MESFの範囲であった。平均結合が１微小
球当たり≧100,000MESFである微小球のみを使用した。(所与のジップコード配列
を有する)フルオレセイン化オリゴヌクレオチドを多重化した58のcジップコード
結合微小球のセット(58からなるセットのうち１種類の微小球のみが完全に相補
的な配列を含んでいた)とインキュベートさせることにより、ジップコードをハ
イブリダイゼーションの特異性について確認した。ジップコードの交差ハイブリ
ダイゼーション(または非ハイブリダイゼーション)はまれであったが、見つけた
場合には、その配列をジップコードの選択から除去し、別の非交差ハイブリダイ
ズ配列と置換した。５つのジップコード配列を交差反応性のために置換し、最初
は単に弱い反応を示した２つのジップコード配列が再テストの際に特異的なハイ
ブリダイゼーションを示した(従って保持した)。１つの完全に無反応なジップコ
ードは捨てた。第２ラウンドのハイブリダイゼーションにより、本発明者らのア
ッセイ条件下では、58のジップコード配列のそれぞれが58の微小球付着cジップ
コード配列のたったひとつのみとハイブリダイズすることが実証された。ジップ
コードの最適化配列を表１に示す。異なるジップコード配列を用いてSNPを分析
した場合の遺伝子型分類能力の違いは分からなかった。
【００９６】Ｃ．オリゴヌクレオチド連結反応 標的核酸(二本鎖PCR産物、150〜450塩基対の長さ)を3〜20 ng使用した。許容
可能緑色蛍光シグナルをこの濃度範囲にわたり観察した。標的オリゴヌクレオチ
ドは10 nM使用し、標的オリゴヌクレオチド：レポーター比は1:50であった。0.1
ピコモル標的オリゴヌクレオチド、５ピコモルレポーターオリゴヌクレオチド、
3〜20 ng dsDNA標的核酸(Picogreen(商標)染色、Molecular Probe, Eugene, OR
により決定)、および10 U Taq DNAリガーゼを含む10μlリガーゼ緩衝液中で反応
を行った。PE Biosystems 9700サーモサイクラーにおいてインキュベーションを
行い、96℃まで２分間加熱した後、30サイクルの２段階反応(94℃にて15秒間の
変性、その後35〜37℃にて１分間の連結)を行った。サイクル終了後、サンプル
を４℃に保った。標的オリゴヌクレオチドの3’塩基が標的SNPと相補的な場合は
、フルオレセイン化レポーターを捕捉プローブにラ連結させる。Taq DNAリガー
ゼを、10μl連結反応液当たり10単位使用した。なぜなら、酵素が高濃度(10μl
反応液容量当たり20〜80単位のリガーゼ)である場合、ミス連結(misligation)(
ミスマッチ末端3’塩基を有する捕捉プローブからのシグナル)の割合は２〜７倍
に高まったからである。
【００９７】Ｄ．OLA後の、標的オリゴヌクレオチド/レポータープローブと微小球とのハイブ リダイゼーション 標的オリゴヌクレオチド/レポーター分子とcジップコード結合微小球とのハイ
ブリダイゼーションを、高濃度塩(750 mM NaCl)、少ないインキュベーション容
量(10〜13μl)、および最低２時間のインキュベーションにより行った。cジップ
コード結合微小球(微小球は各種類につき5,000〜10,000)を、各ライゲーション
反応液に添加した。少ない容量の5 M NaClを添加して、塩濃度を750 mM NaClに
調節した。混合液を、PE Biosystems 9700サーモサイクラーにおいて96℃まで２
分間加熱し、次いで45℃にて２時間〜一晩インキュベートした。微小球を、0.02
% Tween20を含む200μl 2X SSCで洗浄した。ビオチン化レポータープローブを使
用した場合、５〜０μlのアビジン-FITC(Becton Dickinson, San Jose, CA)を、
30μl 2X SSC/0.02% Tween20に再懸濁させた洗浄ハイブリダイズ微小球に添加し
た。微小球を15分間室温にてインキュベートし、洗浄した。全ての微小球懸濁液
を、フローサイトメトリー分析の直前に、0.02% Tween20を含む300μl 2X SSCに
再懸濁させた。OLAの後、付着レポータープローブを有するかまたは持たない標
的オリゴヌクレオチドをそれぞれ、微小球に化学的に結合した25塩基cジップコ
ード配列を介して、特異的な蛍光微小球にハイブリダイズさせた。異なる比率の
赤およびオレンジ蛍光を有する微小球(それぞれ異なるcジップコードを担持する
)を多重化して、１本の試験管当たりいくつかのSNPを分析した。
【００９８】 バックグラウンド蛍光の可能性のある由来源は、「サンドウィッチ」複合体、す
なわちライゲートしていないジップコードがハイブリダイズした標的オリゴヌク
レオチド-標的核酸-レポーター複合体の形成であった。サンドウィッチ形成に起
因するバックグラウンド蛍光を、リガーゼの不在下で決定した。フローサイトメ
トリー分析の直前に微小球懸濁液を45℃にて最低15分間インキュベートすること
により(おそらくジップコードハイブリダイゼーションを妨害しない複合体から
のライゲートされていない短いレポーター分子の損失により)、このバックグラ
ウンド蛍光を最小限に抑えた。
【００９９】Ｅ．フローサイトメトリー分析およびMESF変換 Luminex Lab MAPハードウェアおよびソフトウェア(Luminex Corp., Austin, T
X)を備えたFACSCaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson, San Jose, CA
)を使用して微小球蛍光を測定した。FITC較正粒子のMESFユニットのためのQuant
um FluorescenceキットおよびQuickCalソフトウェア(全てSigma, St. Louis, MO
から入手)を使用して、全ての緑色蛍光測定を等量の可溶性蛍光色素(MESF)の分
子に変換した。微小球のみに起因する緑色蛍光を、全てのデータ値から引いた。
本明細書に記載する実験では、両方のSNP対立遺伝子を同じジップコードを用い
てアッセイした。従って、異なる試験管において同じ種類の微小球を用いて対立
遺伝子をアッセイした。同じ試験管中にある所与のSNPのための異なる対立遺伝
子も、異なるジップコードを有するユニークな種類の微小球を使用してアッセイ
した。
【０１００】 平均蛍光強度からMESFに生データを変換することによりいくつかの利点が得ら
れる。これらの利点としては、標準的な蛍光ユニットの使用、実験間のデータ比
較が可能なこと、計器間のデータ比較が可能なこと、および時間経過に伴う計器
における(レーザパワーの推移またはPMT低下による)シグナル可変性の標準化が
挙げられる。
【０１０１】Ｆ．短い縮重オリゴヌクレオチドレポータープローブを用いたOLA 非常に短いレポーターオリゴヌクレオチドを用いてOLA反応を行い、ハイスル
ープットモードでSNPを分析する際に必要となる全ての可能性のあるレポーター
配列のセットを合成する実現可能性を調査した。０または２つの縮重部位を含む
８塩基配列を、１つの実験セットにおいて使用して、多重化反応のコストを抑え
た。従って、６＋２mer (６つの定義づけられた位置および２つの縮重位置を含
む８塩基配列)を構成する短い８塩基オリゴヌクレオチド(5’-CTAAGTTA-3’)をS
NPのために設計し、標準的OLA反応において使用した。８塩基レポータープロー
ブは、GGホモ接合標的DNAを上手く同定した。８塩基レポーターから得たシグナ
ル強度は、18塩基レポーターで認められたものの65％であった。２つの６＋２縮
重レポーターオリゴヌクレオチドをテストした；それぞれ２つの縮重部位を(一
方は位置３および６、他方は位置４および５に)含んでいた。正しい5’-CTAAGTT
A-3’配列の濃度における有効な16分の１の減少を相殺するために、縮重レポー
ターを非縮重配列の16倍高い濃度で使用した。縮重オリゴヌクレオチドの両方が
、標的DNAのSNP遺伝子型を正確に同定した。
【０１０２】Ｇ．９つのSNPについての７つのDNAサンプルの多重化遺伝子型決定 図２は、OLAによる第19染色体上のApoE遺伝子座付近に位置した９つのSNPにつ
いて７つのDNAサンプルからフローサイトメトリー読み取りで得た多重化遺伝子
型決定の結果を示す。ゲノムDNAサンプルは、The Centre d’Etude du Polymorp
hisme Humain(CEPH)参照パネル(http:Hwww.cephb.fr/)を介して利用可能であっ
た。この実験では、各OLA反応液は、９つの標的オリゴヌクレオチド、レポータ
ープローブ、および９つの標的DNAサンプルのプールされた混合物を含んでいた
。所与の遺伝子座に対する異なる対立遺伝子を、２つの別々の反応液容量におい
てテストした。各反応混合液を、単一のステップで、９つの微小球セットにハイ
ブリダイズさせた。従って、ある一個体についての可能性のある18の遺伝子型分
析を２つのウェル(試験管)において行った。ジップコード1、2、4、5、10、14、
44、46および49(表１)をそれぞれ、SNP457、458、460、461、466、468、505、50
7および511に使用した。ビオチン化レポーターおよびアビジン-FITCをこの実験
において使用した。表２は、この実験で使用するジップコード、標的オリゴヌク
レオチド配列、レポーター配列、およびPCRプライマーを示す。
【０１０３】 ホモ接合およびヘテロ接合遺伝子型は容易に同定された。微小球に基づいたSN
P分析は、全ての場合において直接配列決定による遺伝子型決定と一致し、興味
深い点を１つ有していた。SNP466についてＣホモ接合であると決定された１人の
個体は、配列決定分析により、第３の対立遺伝子(CG)についてヘテロ接合である
ことが分かった。Ｇ対立遺伝子は、SNP 466についての実験設計に含まれていな
かったため、本発明者らの分析において該個体はCCであると思われた。ヘテロ接
合標的の場合、両方の対立遺伝子について蛍光シグナルは捕捉プローブから認め
られる。ヘテロ接合患者のシグナル強度は、場合により、ホモ接合DNAサンプル
よりもわずかに低い。これは、ヘテロ接合体については、相対的標的プローブ濃
度がホモ接合体の半分であることに関係するかもしれない。多重化実験(１試験
管当たり９種類の微小球)から得た遺伝子型決定結果は、一重(uniplex)実験(１
試験管当たり１微小球)と同じであった。
【０１０４】実施例２ 一塩基多型についての微小球に基づいたアッセイ 単塩基鎖伸長を使用した分析 一塩基鎖伸長および異なる蛍光の微小球のアレイのサイトメトリー分析を採用
して、一塩基多型(SNP)分析のための迅速な高スループット読出しを開発した。
蛍光微小球のアレイを、多重化の実現(multiplexing possibilities)を可能にす
る相補的ジップコード(cジップコード)と呼ばれるユニークな同定配列と結合さ
せる。所与のアッセイについて、多型塩基の照会は、ジップコードおよびSNP特
異的配列の両方を含むオリゴヌクレオチドを、DNAポリメラーゼおよびフルオレ
セイン化ジデオキシヌクレオチド対を用いて伸長することを含む。分析のために
反応生成物を捕捉するために、オリゴヌクレオチドのジップコード部分は、微小
球上にあるその相補的ジップコード(cジップコード)とハイブリダイズする。微
小球上に捕捉されたフルオレセイン標識を検出することにより、フローサイトメ
トリーを微小球の解読およびSNP決定に使用する。多重化能力に加えて、ジップ
コード系は、複数のSNPセットを、限定されたcジップコード付着微小球のセット
で分析することを可能にする。非交差反応性ジップコードの標準的なセットを上
述したように実験的に確立し、他の技術により決定された遺伝子型との比較によ
り該系の精度を確認した。
【０１０５】 本実施例に使用する、AmpliTaq、AmpliTaq GoldおよびAmpliTaq FS (カタログ
番号：361390)DNAポリメラーゼは、Perkin-Elmer Applied Biosystems (Foster
City, CA)から購入した。Klen TaqはAb Peptides, Inc.(St Louis, MO)から入手
した。二本鎖DNA定量のためのPicoGreenは、Molecular Probes(Eugene, OR)から
購入した。エビアルカリホスファターゼ(SAP)およびエキソヌクレアーゼＩ(Exo
1)は、Amersham Pharmacia (Cleveland, OH)から得た。蛍光標識化ジデオキシヌ
クレオチド三リン酸(ddNTP)は、NEN Life Science Products, Inc. (Boston, MA
)から得た。非標識化ddNTPは、Amersham Pharmacia (Cleveland, OH)から入手し
た。非改変型オリゴヌクレオチドは、Keystone Biosource(Camarillo, CA)から
購入した。CEPH DNA (NA07435, NA07445, NA10848, NA10849, NA07038A, NA0698
7AおよびNA10846)は、Coriell Cell Repositories(Camden, NJ)に注文した。5’
アミノ基を有するオリゴヌクレオチドは、Oligo Etc.(Wilsonville, OR)またはP
erkin-Elmer Applied Biosystemsに注文した。2-[N-モノホリノ]エタンスルホン
酸(MES)および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(E
DC)は、Sigma(St. Louis, IL)およびPierce(Rockford, IL)からそれぞれ購入し
た。DNAポリメラーゼは、テルマトーガ・ネアポリタナ(Thermatoga neapolitana
)(Tne)からクローニングし(参照により本明細書に援用される米国特許第5,912,1
55号；同第5,939,301号；および同第5,948,614号を参照)、エシェリキア・コリ(
大腸菌)において発現させた。5’〜3’エキソヌクレアーゼを欠くクレノウ断片(
TneK)を、AmpliTaqと同じアッセイ条件下でのSBCE反応のために使用した。Tne、
TneKおよびTneK FSのクローニングおよび発現の両方に関する詳細、ならびにSBC
Eにおける性能は別に提出する(submitted elsewhere)。カルボキシル化蛍光ポリ
スチレン微小球はLuminex Corp. (Austin, TX)から購入した。
【０１０６】Ａ．オリゴヌクレオチドの微小球への結合 先の実施例に記載したように、5’アミノ基を有する捕捉オリゴヌクレオチド
を、微小球の表面上のカルボキシル基に結合させた。これらのオリゴヌクレオチ
ドでは、炭素スペーサー(C15〜18)を5’アミノ基の隣で合成して、微小球による
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの可能性のある妨害を低減し、上述
したルシフェラーゼ配列を用いてオリゴヌクレオチドの微小球への結合効率をモ
ニターした。25塩基相補的ジップコード配列(cジップコードと命名、表１を参照
)を、マイコバクテリウム・ツベルクロシス菌ゲノムから任意に選択し、(上述し
たように)実験的に確認した。62μlの0.1 M MES緩衝液中のカルボキシル化微小
球(2.5×106)を、0.1 M MES(6.25μl)中の５nmolのオリゴヌクレオチドと混合し
た。新しく作成した30mg/ml EDC(10μl)を、微小球/オリゴ混合物に添加し、室
温にて20分間インキュベートした。10μl EDCを更に２ラウンド、20分間隔で追
加した。反応混合液を、時折混合し、インキュベーションの間に音波処理して、
微小球の分離および懸濁を確実にした。60分間の合計インキュベーション時間の
後、微小球を、１mlのリン酸緩衝化食塩水(PBS)および0.02％Tween20で２度洗浄
し、150μlのTE [Tris[ヒドロキシメチル]アミノメタン塩酸塩(10 mM)／l mMエ
チレンジアミン四酢酸(pH 8.0)]で濯ぎ、250μl TEに再懸濁させ、４℃にて保存
した。SeqLuc配列に相補的な蛍光標識配列をハイブリダイズすることにより、微
小球に結合したオリゴヌクレオチドの数を評価した。最小MESF値が100,000の微
小球をSBCE実験に使用した。
【０１０７】Ｂ．PCR増幅 GeneAmp 3700サーマルサイクラー(Perkin-Elmer)上の96ウェルプレートにおい
てPCR反応を行った。典型的な30μl反応混合液は、10 mM Tris-HCl(pH 8.3)、50
mM KCl、1.5 mM MgCl2、0.1 mM dNTP、各プライマーを0.2μM、AmpliTaq Gold
DNAポリメラーゼ(1.5ユニット)、および20 ngゲノムDNAを含んでいた。反応混合
液は、95℃にて10分間保持して、DNAポリメラーゼを活性化させ、94℃にて10秒
間、61℃にて45秒間および72℃にて90秒間を９サイクル、94℃にて10秒間、56℃
にて45秒間および72℃にて90秒間を９サイクル、ならびに94℃にて10秒間、61℃
にて45秒間および72℃にて90秒間をさらに25サイクル行って増幅を行った。さら
に72℃にて５分間の伸長の後、反応液を４℃に保った。
【０１０８】Ｃ．PCR産物の定量、プライマーおよびdNTPの分解 PicoGreen結合アッセイを製造元の指示どおりに使用して(Molecular Probes,
Eugene OR) PCR産物を定量した。CytoFluorマルチウェルプレートリーダーシリ
ーズ4000(PE Biosystems)を用いて蛍光強度を測定し、既知量のDNA標準に対して
量を計算した。PCRプライマーおよびdNTPを分解するために、１ユニットのSAPお
よび２ユニットの大腸菌エキソヌクレアーゼＩを10μlのPCR反応混合液に直接添
加した。反応液を37℃にて30分間、次いで99℃にて15分間インキュベートして酵
素を不活化した。一部のPCR産物をQiagen Qiaquickキット(Qiagen, Valencia, C
A)で洗浄した。
【０１０９】Ｄ．SBCE反応 単一のまたはプールされたPCR産物 (それぞれ10〜20 ng)のいずれかに、SBCE
反応混合液を合計容量10μlまで添加した。混合液は、80 mM Tris-HCl (pH 9.0)
、2 mM MgCl2、100 nMの標的オリゴヌクレオチド、３ユニットのAmpliTaq FS(Pe
rkin-Elmer)、10μMの各対立遺伝子特異的FITC標識化ddNTP、および30μMの非標
識の他の３つのdNTPからなる。反応混合液を、96℃にて２分間、その後94℃にて
30秒間、55℃にて30秒間および72℃にて30秒間を30サイクルでインキュベートし
た。反応液を、微小球を添加する前に４℃にて保持した。
【０１１０】 本発明者らの系において非改変型二本鎖PCR産物を鋳型として使用して、いく
つかの熱安定性DNAポリメラーゼを、フルオレセイン(FITC)標識化ddNTP取込みの
効率についてサーモサイクリング条件下で評価した。T/C多型(SNP 18)を含む１
つのPCR産物を、センスおよびアンチセンス捕捉オリゴヌクレオチドの両方で、
それぞれＴ、Ｃ、ＡおよびＧ取込みについて分析した。正確な塩基の対立遺伝子
特異的取り込みを、ゲノムDNAサンプルから生成した２つのホモ接合(CCおよびTT
)ならびにヘテロ接合(CT)PCR断片を用いてテストした。AmpliTaq FSは、最も高
いシグナルを生じ、３つの遺伝子型の可能性についてのddATP-FITCおよびddGTP-
FITC取込みの両方について100倍を上回る正シグナルと非特異的取り込み(ノイズ
)との比を生じた。AmpliTaq、KlenTaq、およびTneKは、はるかに弱いシグナルお
よび有意に低いシグナル-ノイズ比を生じた。同様の結果を、AmpliTaq FS およ
びテストした他のDNAポリメラーゼの両方によるＴおよびＣ塩基の取り込みにつ
いて得た。これらのデータは、微小球に基づいたSBCEアッセイ系が良好に機能し
、使用する条件下においてフルオレセイン標識化ddNTPを取り込むためにAmpliTa
q FSが適切な選択であることを明確に実証している。AmpliTaq FS、すなわちF66
7YバージョンのTaq Pol 1は、デオキシヌクレオチドとジデオキシヌクレオチド
とを区別しない。
【０１１１】Ｅ．微小球に対するSBCE反応混合液のハイブリダイゼーション SBCE反応の後、対立遺伝子特異的伸長生成物のそれぞれを、cジップコード相
補的配列を含む対応微小球により捕捉した。異なる微小球のプールを、１mg/ml
のウシ血清アルブミン(BSA)で37℃にて30〜60分間処置し、3000gにて５分間遠心
分離により濃縮した。蛍光微小球をそれぞれ約1200、10μl SBCE反応混合液に最
終容量が15μlになるように添加した。NaClおよびEDTAの濃度をそれぞれ1Mおよ
び20 mMに調節した。混合液を40℃にて２時間以上インキュベートした。200μl
の2x SSC(1x SSCは１リットル当たり8.77 gのNaClおよび4.41 gのクエン酸ナト
リウム(pH 7.0))-0.02% Tween 20を室温(RT)にて添加して、微小球を洗浄した。
1100×gで６分間の遠心分離の後、ペレット化した微小球を、250μlの2X SSC 0.
02% Tween 20に再懸濁して、フローサイトメトリー分析を行った。
【０１１２】Ｆ．フローサイトメトリー分析およびMESF変換 上述したようにLuminex Lab MAPハードウェアおよびソフトウェア(Luminex Co
rp, Austin, TX)を備えるFACSCaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson)
を用いて微小球蛍光を測定した。
【０１１３】Ｇ．多重化反応におけるSNPの分析 LumineX (商標) 蛍光微小球技術の主な利点は、単一の反応容器(すなわちウェ
ル)において同時に複数の生物学的反応を行う許容力である。微小球とcジップコ
ード (DNA配列)とのユニークな対合のストックを合成することにより、各蛍光微
小球は単一SNPのアドレスとなる。そうすれば、各SNPは捕捉オリゴヌクレオチド
においてコードされた指定(assigned)ジップコードのみを必要とし、多重化が可
能になる。この仮説を試験するために、ＴからＣへの変化を有する４つの多型を
多重反応にてアッセイした。ホモ接合(CCまたはTT)またはヘテロ接合(CT)ゲノム
DNAから生成されたPCR産物を別々にプールし、４つの捕捉オリゴヌクレオチドを
プライマーとしてSBCE反応液中に混合した。４つのSNPの全てが、可溶性蛍光色
素平均等量により測定されるシグナル強度(MESF値)に基づいて正しく遺伝子型決
定された。バックグラウンドMESF値は、特異的シグナルの数パーセントでしかな
かった。興味深いことに、２つのSNPに対する特異的PCR鋳型(TT)の不在下では、
ＡおよびＧ反応の両方についてのシグナルがバックグラウンドに近かった。これ
は、これら捕捉オリゴヌクレオチドと他の関係の無いDNA鋳型とのハイブリダイ
ゼーションがないことを示す。この結果は、逆鎖に対する捕捉オリゴを用いたＴ
およびＣ反応についてもほぼ同じであった。
【０１１４】Ｈ．微小球に基づいたSBCE反応の最適化 数千のDNAサンプルにおいて多数のSNPをアッセイする必要がある場合、試薬コ
ストが最小限な信頼性のある強固なアッセイが必須となる。従って、多数の実験
を行い、反応条件を最適化した。４つのSNPのための多重反応におけるSNP 18に
ついてのAmpliTaq FSの滴定曲線を作成した(先の多重実験において記載したのと
同じSNPを使用した)。４つのSNPのPCR産物(CC)のホモ接合混合物を鋳型として使
用し、アンチセンス捕捉ヌクレオチドを用いて対立遺伝子ＡおよびＧについてア
ッセイした。Ｇ反応の特異的シグナルは非常に高く、Ａ反応は低いままであった
。同様の結果を他の３つのSNPについて得た。使用したDNAポリメラーゼが0.5〜8
ユニットの場合にはシグナルの有意な増加はなかった。
【０１１５】 様々なddNTP-FITC濃度におけるSNP18のシグナル強度を分析した。３つの他のS
NPの存在下で反応を行ったところ、４つのSNPについての結果はほぼ同じであっ
た。ホモ接合(CC)DNAサンプルから増幅したPCR産物を鋳型として使用し、アンチ
センス捕捉オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。ddGTP-FITCの特異
的な取込みにより強いシグナルが生成されることが分かり、一方でＡ反応につい
てのシグナルはバックグラウンドレベルに近かった。シグナルは、FITC-ddNTPの
濃度が10μMから１μMに低下した場合も、一定のままであることが分かった。SB
CE反応においてddNTPがはるかに低い濃度(20〜750 nM)の場合に、特異的シグナ
ル(Ｇ反応)のほぼ直線的な増加を観察した。
【０１１６】 微小球に基づいたSBCE系の鍵となる成分は、塩基取込みのためのプライマーと
して使用され、かつ、得られるSBCE生成物を適切な微小球にハイブリダイズさせ
るためのアンカーの両方として使用される標的オリゴヌクレオチドである。様々
な濃度の標的オリゴヌクレオチドを、標準的な条件下で分析した。10および100
nMでは、有意差は認められなかった。標的オリゴヌクレオチド濃度が125 nMに増
加した場合に、シグナルが有意に低下することが分かった。
【０１１７】 PCR増幅のレベルは様々であり、他の因子の中でもとりわけプライマーおよび
鋳型配列に依存する。従って、微小球-SBCEアッセイの感度および許容性を、様
々な量のPCR産物を用いて標準的な条件下でテストした。この実験では、ホモ接
合(CC)ゲノムDNAから増幅したPCR産物を使用して、Ｃヌクレオチドの特異的取込
みまたはＴヌクレオチドの非特異的取込みのいずれかについてアッセイした。非
特異的Ｔ取込みはほぼゼロのままだったのに対して、Ｃ反応液由来のシグナルは
PCR産物の量の増加(40 ngまで)と共に増加することが分かった。特異的シグナル
は、使用するPCR産物の量(2.5 ngまで)に比例した。0.5 ngの少ないPCR産物の存
在下で正しい遺伝子型が生成され、ＣおよびＴ反応についてのMESF値はそれぞれ
4400および200であった。従って、アッセイ系は、相当に感度があい、最大で80
倍の鋳型物質の変化を許容できる。
【０１１８】Ｉ．微小球に基づいたSBCEアッセイの確認 アポリポタンパク質の１つの対立遺伝子変異体であるAPOE4が、若年性アルツ
ハイマー病発症の有意な感受性対立遺伝子またはリスクの要因であることは周知
である。関連研究のためにAPOＥ遺伝子に関連して百以上のSNPが開発されている
(Lai, E., Riley, J., Purvis, I.およびRoses, A. A 4-MB high-density singl
e nucleotide polymorphism-based map around human APOE. Genomics 54, 31-3
8 (1998))。これらのSNPを、７つのCEPH DNA由来のアンプリコンのDNA配列決定
により同定した。従って、これらのSNPについてほぼ全ての遺伝子型が利用可能
である(同上)。合計58のSNPを、このセットからランダムに選択し、SBCEアッセ
イを開発した。SNPはそれぞれ、ユニークなジップコード配列を利用した(表１)
。
【０１１９】 上記58のSNPを分析するための上記実験の典型的なセットを以下に記載する。
これらのSNPをそれぞれ、７つのCEPH DNAにわたり個々に増幅させ、PicoGreenア
ッセイを用いてPCR産物を定量した。各CEPH DNA由来の12のSNPについての等量の
PCR産物をプールし、４つ全ての塩基についてアッセイした。合計58のSNPのうち
、54のSNPが１回目の通過(first pass)で上手くアッセイ形式に変換されていた
。これらのSNPのうち２つのみが、アッセイにおいて完全に失敗し、４つのヌク
レオチドのいずれの取込みも示さなかった。別の２つのSNP(462、492)は、正確
な遺伝子型を生成したが、非常に低い特異的シグナル(1300および2200)を有して
いた。しかし、バックグラウンドノイズのレベルは500 MESF未満であった。これ
らの実験では、3000 MESF未満の特異的シグナルはいずれも、任意に失敗である
とみなした。他方の鎖をアッセイするための標的オリゴを設計し、４つの全ての
SNPを上手く救出(rescue)した。
【０１２０】 SNP503についての７つのCEPH DNAにおける４つの対立遺伝子それぞれのシグナ
ル強度に基づいて、遺伝子型はGG、AG、GG、AG、GG、AGと容易に読めた。シグナ
ルとノイズとの差が著しいために、残る77の遺伝子型の全ても同様に簡単に決定
できた。12のSNPは、いくつかの異なる種類の塩基置換(AG、AT、CG、CTおよびGT
)を表す。試験した５つ全てを、単純な多重反応において４塩基をアッセイする
ことにより分析できる。
【０１２１】 SBCEにより54のSNPから決定した合計180の遺伝子型(7つのDNAにおいて21のSNP
をアッセイし、１つのDNAにおいて33のSNPをアッセイした)を、DNA配列決定また
はTaqMan分析のいずれかで決定されたそれらの既知の遺伝子型と比較した。本発
明者らのアッセイから生成した180の遺伝子型の全てが正しいことが証明された
。
【０１２２】Ｊ．多重反応 12のSNP由来のPCR産物を、７つのCEPH DNA由来のDNAを用いて分析した。Ａ、
Ｃ、ＧおよびＴアッセイを、大量のPCR産物を収容するための12μl反応液中で、
各SNPについて10 ngのPCR産物を用いて行った。試薬を上述したものに対して比
例的に増やした。12の異なる微小球の混合液を１mg/ml BSAで45分間予備処理し
、フローサイトメトリー分析の前に40℃にて一晩ハイブリダイゼーションさせた
。約120の微小球の平均MESF値を示す。
【０１２３】 高い多重化許容量の限界をテストするために、本発明者らの系において分析さ
れたDNAサンプルから52のSNP由来のPCR産物をプールした。この実験で決定され
た52の遺伝子型全てが、12SNP多重反応の場合と同じであることが分かった。従
って、52の遺伝子型の全てを、単一の多重反応において正しく決定できる。
【０１２４】実施例３ ミニ配列決定(対立遺伝子座特異的重合反応)を使用した、一塩基多型についての 微小球に基づいたアッセイ 上述したSBCE方法を改変して、対立遺伝子座特異的重合反応を行った。従って
、標識化した鎖終結ジデオキシヌクレオチドを使用する代わりに、標識化デオキ
シヌクレオチドを使用した。SBCE反応については、２つ以上の標識化デオキシヌ
クレオチドを使用して対立遺伝子座特異的重合反応を多重化した。結果は、単一
試験管または複数試験管形式において対立遺伝子座特異的重合を同定反応として
用いて、遺伝子型が正しく予測されたことを示す。
【０１２５】実施例４ 一塩基鎖伸長(SBCE)を用いた微生物の混入物の微小球に基づいた分析 Ａ．細菌からのDNA抽出 この手順は、SBCE反応を阻害する可能性のあるタンパク質および細胞屑を除去
する。以下の試薬を使用した：栄養寒天上の細菌コロニー、DNAアーゼ(DNAse)を
含まない滅菌水、５mg/mLリゾチーム、3.75mg/mLリソスタフィン(lysostaphin)
、TE緩衝液(10mM Tris；１mM EDTA)、0.25M EDTA、1M DTT、20 mg/mLプロテイナ
ーゼＫ、10％ SDS、Perkin ElmerのPrepMan（著作権）試薬。
【０１２６】 栄養寒天プレートから得た大きいループ一杯分のコロニーの約四分の一を、滅
菌微量遠心管に入った245 uLの TE緩衝液に再懸濁させた。リゾチーム(５μl)を
細胞懸濁液に添加し、軽く叩いて懸濁液を緩やかに混合した。リソスタフィン(
５μl)を、スタフィロコッカス(Staphylococcus)からDNAを抽出する際にリゾチ
ームとして使用した。
【０１２７】 そして、細胞懸濁液を56℃にて45分間インキュベートした。以下を細胞懸濁液
に添加した：196.2 uLのTE、5.0 uLのDTT、20.0 uLのEDTA、25.0 uLのSDS、8.8
uLのプロテイナーゼＫ。軽く叩いて懸濁液を緩やかに混合し、その後37℃にて1
時間インキュベートした。PrepMan試薬を短時間攪拌して内容物を再懸濁させ、5
00 uLのPrepMan試薬を細胞懸濁液に添加した。懸濁液を56℃にて30分間インキュ
ベートし、次いで10秒間攪拌した。次いで、細胞懸濁液を沸騰水浴中で８分間イ
ンキュベートして、細胞を溶解させた。溶解した細胞懸濁液を、短時間攪拌して
、微量遠心分離器中で11,000 RPMにて２分間遠心分離し、細胞屑をペレット化し
た。100 uLの上清を900 uLの滅菌水に添加することによりDNAを1:10希釈した。
これは任意に４℃にて１週間まで保存できる。PCR反応の前に、100 uLの1:10希
釈液を2.5 mLの滅菌水に添加することでDNAをさらに希釈して1:250希釈液を作成
した。PCR反応においてこの1:250希釈液を10 uL使用する。
【０１２８】 DNA抽出の代替的な方法として、K.Boyeら(1999 Microbiol. Res 154: 23-26)
のプロトコールの改変法を以下のように使用できる：１つの細菌コロニー(直径
２〜３mm)をペトリ皿から取上げ、500μl水に懸濁させた。95℃にて15分間のイ
ンキュベーションの後、サンプルを15000 gにて５分間遠心分離した。強い振と
うにより、ペレットを200μlの5% Chelex-100樹脂(Bio-Rad)に再懸濁させた。Ch
elex-100樹脂および細胞屑を、１分間の遠心分離によりペレット化した。典型的
に、５μlの粗DNAをPCR増幅に使用できる。
【０１２９】Ｂ．16S配列決定のための細菌DNAのPCR増幅 本方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行って、SBCE反応の準備において、
細菌ゲノムの16s領域を増幅することを述べる。以下の試薬を使用した：すなわ
ち、AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ、Perkin Elmer 10X PCR緩衝液、10 mM dNT
P混合液(それぞれ2.5 mMのdNTP)、PCRプライマー(27F-5’-AgAgTTTgATCMTggCTCA
g-3’、および1525R-5’-AAggAggTgWTCCARCC-3’)、DNAアーゼを含まない滅菌水
、10X TBE緩衝液、アガロース、Molecular ProbeのSYBRグリーン核酸ゲル着色剤
、ゲル充填染料、分子量マーカー。
【０１３０】 PCR反応混合液を以下の通りに調製した：すなわち、全ての試薬を室温にて融
解し、使用時まで氷中で保存した。AmpliTaq Goldを滅菌水で1:5希釈した。プラ
イマー27Fおよびプライマー1525Rを、滅菌水で1:10希釈した。１回のPCR反応に
つき特定の容量を使用して原混合液を調製した(5.0 uLのPCR緩衝液、4.0 uLのdN
TP混合液、2.0 uLの1:5希釈AmpliTaq Gold、2.2 uLの1:10希釈プライマー27F、2
.4 uLの1:10希釈プライマー1525R、24.4 uLのDNAアーゼを含まない滅菌水)。
【０１３１】 40 uL容量の原混合物を、200 uL PCRチューブにピペットし、10 uLの1:250希
釈DNA鋳型を添加した。GeneAmp 9600サーマルサイクラーを用いて、PCRサーマル
サイクリングを行った：すなわち、95℃にて10分間を１サイクル；94℃にて30秒
間、56℃にて45秒間および72℃にて90秒間を35サイクル；72℃にて５分間を１サ
イクル、ならびに４℃にて１サイクル。サーマルサイクラーは、この方法を約３
時間行う。
【０１３２】 その後、ゲル電気泳動を使用してPCR産物を検出した。アガロースゲルは、当
該分野で周知の方法により調製した。10 uLのPCR産物を２uLのゲル充填染料と組
合せ、10 uLのサンプルをゲル中のウェルに充填した。８uLの分子量マーカーを
、別のウェルに充填し標準的条件下でゲルを泳動させた。その後、８uLのSYBR G
reen 核酸ゲルを含む約50mLのTBE緩衝液中でゲルを染色した。次いでUV光の中で
ゲルを検分し、バンドを分子量マーカーの対照バンドと比較することにより、PC
R産物の大きさが約1500 bpであることを確認した。
【０１３３】 PCR増幅の代替的なプロトコールでは、PCR反応条件は以下のとおりであった。
すなわち、10 mM Tris-HCl(pH 8.3)、50 mM KCl、1.5 mM MgCl2、0.001%ゼラチ
ン、４つのdNTPをそれぞれ0.1 mM、１ユニットのAmpliTag GOLD DNAポリメラー
ゼ(Perkin-Elmer)、および50 pmolの各プライマー(27f/1525rまたは66f/1392r(R
. Ghozziら, 1999, J. Clinical Microbiology 37: 3374-3379))を合計容量50μ
lである。95℃で10分間の初期変性ステップの後、30サイクルの増幅(94℃にて１
分間、55℃にて１分間および72℃にて２分間)を行った。10μlのPCR産物をアガ
ロースゲル上で分析した。
【０１３４】Ｃ．PCR産物からのDNA精製 PCR産物からDNAを精製するために、緩衝液PB、緩衝液PE、QiaQuickカラム、お
よび２mL回収チューブを含むQiagenのQiaQuick PCR精製キットを使用した。５容
量の緩衝液PBを、微量遠心管中で１容量のPCR反応混合物と混合させた。QiaQuic
kスピンカラムを２mL回収チューブに入れ、サンプル全体をＱiaQuickカラムに適
用した。カラムを60秒間11,000RPMにて遠心分離した。流出分は捨て、カラムを
同じ２mLチューブに入れた。
【０１３５】 DNAを洗浄するために、0.75 mLの緩衝液PEをカラムに添加した。カラムを60秒
間11,000RPMにて遠心分離した。流出分を同じく捨て、カラムを同じ２mLチュー
ブに入れた。次いで、カラムを60秒間11,000RPMにて遠心分離し、全ての残留エ
タノールを除去した。流出分を再度捨てた。次いで、カラムを清潔な微量遠心管
に入れた。
【０１３６】 DNAを再水和させるために、30 uLのDNAアーゼを含まない滅菌水を、QiaQuick
膜の中央に添加した。DNAを室温にて少なくとも１分間再水和させ、その後カラ
ムを11,000RPMにて60秒間遠心分離して、DNAをカラムから溶出させた。
【０１３７】 次いで、Milton Roy Spectronic 1201を用いて吸光度分光測定によりDNAを定
量した。
【０１３８】Ｄ．Luminexビーズプロトコール 一塩基鎖伸長/ビーズプロトコールにおいて以下の試薬を使用した：すなわち
、エビアルカリホスファターゼ(SAP)、エキソヌクレアーゼＩ、５uMプローブ＋
ジップコード、5X SBCE緩衝液、AmpliTaq FS、10 uM ddNTP、10 uM R6G-ddNTP、
250 nM対照オリゴヌクレオチド、5M NaCl、130 mM EDTA、および22の別々のビー
ズセット(それぞれ1000)(10 K/uLを0.1 uL)である。
【０１３９】 各DNA懸濁液に、10 uL容量当たり１uLのSAPおよび0.2 uLのExoIを添加した。
あるいはまた、20 uLの水および25.5 ul(約400 ng)のPCR産物の混合液を、Whatm
anプレートに分注して、5.5 ulのExoI/SAP混合液(50 ulのSAP(1U/ul、USB E7009
2Y)および５ulのExo I(10 u/ul、USB E70073Z))を用いてExoI/SAP消化させた。
完結化(clean-up)反応を37℃にて30分間行い、99℃にて30分間酵素を不能にし、
混合液を４℃にて保持する。２ulのアリコート(約10〜20 ng/rxn)を、SBCE反応
に使用した。
【０１４０】 SBCE反応用の原混合液を以下の試薬を用いて調製した：すなわち、0.1 ulの５
uMプローブ/ジップコード、4.0 ulの5X緩衝液、0.2 ulのAmpliTaq FS、2.0 ulの
それぞれ10 uMの冷ddNTP、2.0 ulの10 uM R6G ddNTP、1.0 ulの250 nM対照オリ
ゴヌクレオチド、0.7の水。10 uLの原混合液を、10 uLの清潔なDNA鋳型に添加し
た。あるいはまた、２ulのPCR産物を、別のプレートに移し、10 ulの以下のSBCE
反応混合液を添加した：25 nMの5 uMプローブ/ジップコード混合液、1X Amplita
q緩衝液、2.8ユニット／反応 のAmplitaq FS(12 u/ul)、約10 ng／反応 のPCR産
物、３uM冷ddNTP、１uM標識化ddNTP(例えば、10 uM R6G-ddATP、-ddCTP、-ddGTP
、または-ddUTP)。次いでプレートをサーマルサイクラーに置き、以下の条件下
でSBCE反応させた：すなわち96℃で２分間を１サイクル；94℃にて30秒間、55℃
にて30秒間、72℃にて30秒間を30サイクル；および4℃にて１サイクルを行い保
持した。
【０１４１】 その後、以下の混合液を10ul、それぞれのウェルに添加した：すなわち、合計
容量が10 ulかつ最終濃度が0.5M NaCl、13mM EDTA、および１回の反応につき1,0
00ビーズとするための、混合液３ulの5M NaCl、0.8 ulの0.5M EDTA、2 ulのビー
ズ混合物、4.2 ulの水。次いで、サンプルを緩やかに混合し、MJ Researchサー
マルサイクラー(96℃、２分間：40℃、60分間：終了)に置いた。
【０１４２】 SBCEステップにおいて標識するためにR6G-dNTPではなくビオチンを使用した場
合には洗浄が必要であった。ビーズを洗浄するために、110 ulの洗浄溶液(1X SS
C、0.02% Tween)を各ウェルにピペットした。リセットボタンを用いて、プログ
ラムのセッティングを確認する。次いで、プレートを2500rpmにて５分間遠心分
離し、上清を除去した。３回の洗浄を行った。
【０１４３】 ビーズおよび標識の蛍光を、LX100プレートリーダーおよびLuminexソフトウェ
アを用いて分析した。事象の基準数である100事象/ビーズを、約40 ulのサンプ
ルおよび60ul/分のフローセッティングを用いて計数した。
【０１４４】 この研究の結果は、各既知の混入物について正しい鎖終結ヌクレオチドの取込
みを示す。
【０１４５】 本明細書全体において、様々な文献を参照した。これらの文献は参照によりそ
れらの全体が本明細書に援用される。
【０１４６】 本発明を、特定の実施形態および実施例に関して記載してきたが、本発明の思
想を逸脱することなく、当業者により多くの改変および変更が可能であることが
理解されるであろう。従って、本発明の真の思想および範囲内にあるような改変
および変更は添付の請求の範囲により網羅されることを意図する。
【０１４７】
【表１】
【表２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は種々の混入細菌に特異的なプローブを製造するための16s rRNA
の樹状図を示す。
【図２】図２は９つのSNPについての７つのCEPH DNAサンプルの多重的な遺伝
子型分類を示す。オリゴヌクレオチドの連結を、7人のCEPH患者由来のPCRで増幅
した標的核酸を用いて行った。ビオチン化したレポーターとアビジンFITCを使用
した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｆ 33/58 Ａ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 キャスィー，ワレン，マイケル アメリカ合衆国 27709 ノースカロライ ナ州，リサーチ トライアングル パー ク，ピー．オー．ボックス 13398，ファ イブ ムーア ドライブ，グラクソスミス クライン (72)発明者 チェン，ジンウェン アメリカ合衆国 27709 ノースカロライ ナ州，リサーチ トライアングル パー ク，ピー．オー．ボックス 13398，ファ イブ ムーア ドライブ，グラクソスミス クライン (72)発明者 コルトン，ヘイディ，エム． アメリカ合衆国 27709 ノースカロライ ナ州，リサーチ トライアングル パー ク，ピー．オー．ボックス 13398，ファ イブ ムーア ドライブ，グラクソスミス クライン (72)発明者 テイラー，デービッド アメリカ合衆国 27709 ノースカロライ ナ州，リサーチ トライアングル パー ク，ピー．オー．ボックス 13398，ファ イブ ムーア ドライブ，グラクソスミス クライン (72)発明者 ウェイナー，マイケル，フィリップ アメリカ合衆国 27513 ノースカロライ ナ州，キャリー，スプリング バグ ドラ イブ 102 Ｆターム(参考） 2G045 DA12 DA13 DA14 FB02 FB04 FB07 FB12 4B024 AA11 CA04 CA09 CA11 CA20 FA10 HA08 HA13 HA14 4B063 QA12 QA18 QQ42 QR08 QR56 QR62 QR63 QS03 QS25 QS34 QS36 QX02 QX07

Claims (129)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 標的核酸中の所定のヌクレオチドを同定するために同定反応
    の結果を検出する方法であって： a. 第1相補性領域と第2相補性領域とを含む標的オリゴヌクレオチドを、標的
    核酸を含むサンプルと、第1ハイブリダイゼーション産物の形成が可能なハイブ
    リダイゼーション条件下で接触させること、ここで、第2相補性領域は第1相補性
    領域の5’側にあり、第1相補性領域は、標的核酸の所定のヌクレオチドのすぐ3
    ’側に隣接している部分に相補的な領域を含むものであること； b. 選択的標識化レポータープローブの存在下で、所定のヌクレオチドの正体
    を決定するために、第１ハイブリダイゼーション産物を用いて所定の同定反応を
    実施すること、ここで、標的オリゴヌクレオチドおよびレポータープローブを含
    む選択的標識化検出産物が形成され得ること； c. 該検出産物を、可動性固相支持体に直接または間接的に共有結合している
    捕捉オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させて第2ハ
    イブリダイゼーション産物を形成させることにより検出産物を単離すること、こ
    こで、該捕捉オリゴヌクレオチドは標的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域に
    相補的な核酸配列を含むものであること；および d. 第2ハイブリダイゼーション産物中の標識化検出産物の標識を検出するこ
    と； を含み、ここで、標識の存在が標的核酸中の所定のヌクレオチドの正体を示すこ
    とを特徴とする、上記方法。
  2. 【請求項２】 捕捉オリゴヌクレオチドが約50％以上のGC含量を有すること
    を特徴とする、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 捕捉オリゴヌクレオチドが約60〜70℃のTmを有することを特
    徴とする、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 捕捉オリゴヌクレオチドが標的核酸を含有する細胞には存在
    しない配列を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 標的核酸が哺乳動物細胞に存在する配列であり、かつ捕捉オ
    リゴヌクレオチドは細菌に存在するオリゴヌクレオチド配列を含むことを特徴と
    する、請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 捕捉オリゴヌクレオチドがマイコバクテリウム・ツベルクロ
    シス菌に存在するオリゴヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項４記
    載の方法。
  7. 【請求項７】 捕捉オリゴヌクレオチドが5’アミン基をさらに含むことを
    特徴とする、請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 捕捉オリゴヌクレオチドがルシフェラーゼcDNAをさらに含む
    ことを特徴とする、請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】 標的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域が少なくとも8ヌク
    レオチドからなる核酸を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】 標的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域が配列番号１〜
    ５８に示す配列からなる群より選択される配列を有する核酸を含むことを特徴と
    する、請求項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】 同定反応が一塩基鎖伸長反応であることを特徴とする、請
    求項１記載の方法。
  12. 【請求項１２】 一塩基鎖伸長反応が第1ハイブリダイゼーション産物を用
    いたプライマー伸長反応をプライマー伸長条件下で実施することを含み；検出可
    能な標識化レポータープローブは同定される鎖終結ヌクレオチドを含んでおり、
    そして、第2ハイブリダイゼーション産物中の標識の存在は第1ハイブリダイゼー
    ション産物への標識化ヌクレオチドの取り込みを示し、取り込まれた標識化ヌク
    レオチドの正体が所定のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの正体を示すこと
    から、標的核酸中の所定のヌクレオチドが同定されることを特徴とする、請求項
    １１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 鎖終結ヌクレオチドが、3’デオキシヌクレオチド、3’デ
    オキシリボヌクレオチド、チオールヌクレオチド誘導体、またはジデオキシヌク
    レオチドであることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 鎖終結ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドであり、プ
    ライマー伸長が、1種の同定される標識化ジデオキシヌクレオチドと３種の異種
    の非標識ジデオキシヌクレオチドの存在下で実施されることを特徴とする、請求
    項１２記載の方法。
  15. 【請求項１５】 鎖終結ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドであり、プ
    ライマー伸長が、1種の同定される標識化ジデオキシヌクレオチドと２種の異種
    の非標識ジデオキシヌクレオチドの存在下で実施されることを特徴とする、請求
    項１２記載の方法。
  16. 【請求項１６】 鎖終結ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドであり、プ
    ライマー伸長が、1種の同定される標識化ジデオキシヌクレオチドと１種の異種
    の非標識ジデオキシヌクレオチドの存在下で実施されることを特徴とする、請求
    項１２記載の方法。
  17. 【請求項１７】 鎖終結ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドであり、プ
    ライマー伸長が、1種の同定される標識化ジデオキシヌクレオチドの存在下で、
    かつ異種の非標識ジデオキシヌクレオチドの非存在下で実施されることを特徴と
    する、請求項１２記載の方法。
  18. 【請求項１８】 鎖終結ヌクレオチドの標識が、ハプテン、放射性標識、お
    よび蛍光標識からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２記載の方
    法。
  19. 【請求項１９】 同定反応がオリゴヌクレオチド連結反応であることを特徴
    とする、請求項１記載の方法。
  20. 【請求項２０】 オリゴヌクレオチド連結反応が、標的オリゴヌクレオチド
    とレポータープローブとの間での連結反応を、連結のための条件下で実施するこ
    とを含み、選択的標識化レポータープローブは標的核酸の所定のヌクレオチドの
    すぐ5’側の部分に相補的な配列であって、標的核酸の所定のヌクレオチドと塩
    基対形成する位置にある同定される試験ヌクレオチドでその3’末端が終わって
    いる該配列を有し、かつ、検出は第2ハイブリダイゼーション産物に取り込まれ
    た標識が存在するか否かを検出することを含んでおり、ここで、標識の存在が反
    応産物中への標識化レポータープローブの取り込みを示し、かつ取り込まれた標
    識化レポータープローブの正体が所定のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの
    正体を示すことから、標的核酸中の所定のヌクレオチドが同定されることを特徴
    とする、請求項１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 レポータープローブが1種以上のヌクレオチドを含み、か
    つ5’リン酸基を有していることを特徴とする、請求項２０記載の方法。
  22. 【請求項２２】 レポータープローブが3’標識をさらに含んでいることを
    特徴とする、請求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 レポータープローブがオリゴヌクレオチドであることを特
    徴とする、請求項２０記載の方法。
  24. 【請求項２４】 オリゴヌクレオチドが８merであることを特徴とする、請
    求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 同定反応が対立遺伝子特異的重合反応であることを特徴と
    する、請求項１記載の方法。
  26. 【請求項２６】 対立遺伝子特異的重合反応が、非プルーフリーディング(n
    on-proof)ポリメラーゼを用いた重合反応を実施することを含み、反応用プライ
    マーは標的オリゴヌクレオチドの第1相補性領域を含んでおり、レポータープロ
    ーブは1種以上の選択的標識化デオキシヌクレオチドを含み、かつ、検出は第2ハ
    イブリダイゼーション産物に取り込まれた標識が存在するか否かを検出すること
    を含んでおり、ここで、標識の存在がプライマーの伸長を示し、かつ標識の正体
    が所定のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを示すことから、標的核酸中の所
    定のヌクレオチドが同定されることを特徴とする、請求項２５記載の方法。
  27. 【請求項２７】 標的核酸が、オリゴヌクレオチド、16s リボソームRNA、P
    CR産物、DNA断片、RNA分子、cDNA分子またはcRNA分子であり、核酸プライマーは
    オリゴヌクレオチド、PCR産物、DNA断片、RNA分子、cDNA分子、cRNA分子または
    ゲノムDNAであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
  28. 【請求項２８】 可動性固相支持体がビーズであることを特徴とする、請求
    項１記載の方法。
  29. 【請求項２９】 2種以上のレポータープローブの存在下で、所定の同定反
    応を実施して異種の標識を有する検出産物を生成すること、ここで各レポーター
    プローブは異なる検出可能な標識および標的核酸の所定のヌクレオチドに相補的
    な異なるヌクレオチドを含むものであること、および、第2ハイブリダイゼーシ
    ョン産物中の標識化検出産物の異なる標識を検出することをさらに含み、ここで
    、各標識の存在が標的核酸中の所定のヌクレオチドそれぞれの正体を示すことを
    特徴とする、請求項１記載の方法。
  30. 【請求項３０】 第2ハイブリダイゼーション産物中の標識化検出産物の異
    なる標識を定量することをさらに含み、異なる標識の量が標的核酸中の所定のヌ
    クレオチドそれぞれの相対的な存在量を示すことを特徴とする、請求項２９記載
    の方法。
  31. 【請求項３１】 2種以上の捕捉オリゴヌクレオチドが可動性固相支持体に
    共有結合しており、かつ各第2ハイブリダイゼーション産物が1種以上の標識を含
    み得ることを特徴とする、請求項２９記載の方法。
  32. 【請求項３２】 第2ハイブリダイゼーション産物中の標識化検出産物の異
    なる標識を定量することをさらに含み、異なる標識の量が標的核酸中の所定のヌ
    クレオチドそれぞれの相対的な存在量を示すことを特徴とする、請求項３１記載
    の方法。
  33. 【請求項３３】 1種以上の標的核酸中の１つ以上の所定のヌクレオチドを
    同定するために同定反応の結果を検出する方法であって： a. 1種以上の特異的標的オリゴヌクレオチドを、1種以上の標的核酸を含むサ
    ンプルと、ハイブリダイゼーション条件下で接触させて第1ハイブリダイゼーシ
    ョン産物を形成させること、ここで、各標的オリゴヌクレオチドは第1特異的相
    補性領域と第2特異的相補性領域とを含んでおり、各標的オリゴヌクレオチドの
    第2相補性領域は第1相補性領域の5’側にあり、各標的オリゴヌクレオチドの第1
    相補性領域は、標的核酸の所定のヌクレオチドのすぐ3’側の部分に相補的な配
    列であって、標的核酸の所定のヌクレオチドと塩基対形成する位置にある同定さ
    れる試験ヌクレオチドでその3’末端が終わっている該配列を有すること； b. １種以上の選択的標識化レポータープローブの存在下で、第1ハイブリダ
    イゼーション産物を用いて所定の同定反応を実施すること、ここで、標的オリゴ
    ヌクレオチドの第1相補性領域とレポータープローブとを含む選択的標識化検出
    産物が形成され得ること； c. 検出産物を、検出可能な特異的タグを付した可動性固相支持体に直接また
    は間接的に共有結合している特異的捕捉オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイゼ
    ーション条件下で接触させて第2ハイブリダイゼーション産物を形成させること
    により検出産物を単離すること、ここで、各捕捉オリゴヌクレオチドは特異的標
    的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域に相補的な核酸配列を含んでおり、かつ
    、検出可能なタグは各捕捉オリゴヌクレオチドに特異的であること；および d. 第2ハイブリダイゼーション産物中の標識化検出産物の標識、および同一
    の第2ハイブリダイゼーション産物中の可動性固相支持体の検出可能なタグを検
    出すること； を含み、ここで、同一の第2ハイブリダイゼーション産物中の標識および検出可
    能な特異的タグの存在が標的核酸中の所定のヌクレオチドの正体を示すことを特
    徴とする、上記方法。
  34. 【請求項３４】 捕捉オリゴヌクレオチドが約50％以上のGC含量を有するこ
    とを特徴とする、請求項３３記載の方法。
  35. 【請求項３５】 各捕捉オリゴヌクレオチドが約60〜70℃のTmを有すること
    を特徴とする、請求項３３記載の方法。
  36. 【請求項３６】 各捕捉オリゴヌクレオチドが標的核酸を含有する細胞には
    存在しない配列を含むことを特徴とする、請求項３３記載の方法。
  37. 【請求項３７】 標的核酸が哺乳動物細胞に存在する配列であり、かつ捕捉
    オリゴヌクレオチドは細菌に存在するオリゴヌクレオチド配列を含むことを特徴
    とする、請求項３６記載の方法。
  38. 【請求項３８】 各捕捉オリゴヌクレオチドがマイコバクテリウム・ツベル
    クロシス菌に存在するオリゴヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項
    ３７記載の方法。
  39. 【請求項３９】 捕捉オリゴヌクレオチドが5’アミン基をさらに含むこと
    を特徴とする、請求項３３記載の方法。
  40. 【請求項４０】 各捕捉オリゴヌクレオチドがルシフェラーゼcDNAをさらに
    含むことを特徴とする、請求項３３記載の方法。
  41. 【請求項４１】 各標的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域が少なくとも8
    ヌクレオチドからなる核酸を含むことを特徴とする、請求項３３記載の方法。
  42. 【請求項４２】 各標的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域が第2相補性領
    域が配列番号１〜５８に示す配列からなる群より選択される配列を有する核酸を
    含むことを特徴とする、請求項３３記載の方法。
  43. 【請求項４３】 同定反応が一塩基鎖伸長反応であることを特徴とする、請
    求項３３記載の方法。
  44. 【請求項４４】 一塩基鎖伸長反応が第1ハイブリダイゼーション産物を用
    いたプライマー伸長反応をプライマー伸長条件下で実施することを含み、それぞ
    れの検出可能な標識化レポータープローブは、同定される鎖終結ヌクレオチドを
    含んでおり、第2ハイブリダイゼーション産物中の所定の標識の存在は第1ハイブ
    リダイゼーション産物への標識化ヌクレオチドの取り込みを示し、取り込まれた
    標識化ヌクレオチドの正体が所定のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの正体
    を示すことから、標的核酸中の所定のヌクレオチドが同定されることを特徴とす
    る、請求項４３記載の方法。
  45. 【請求項４５】 各鎖終結ヌクレオチドが、3’デオキシヌクレオチド、3’
    デオキシリボヌクレオチド、チオールヌクレオチド誘導体、またはジデオキシヌ
    クレオチドであることを特徴とする、請求項４４記載の方法。
  46. 【請求項４６】 鎖終結ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドであり、プ
    ライマー伸長が、1種の同定される標識化ジデオキシヌクレオチドと３種の異種
    の非標識ジデオキシヌクレオチドの存在下で実施されることを特徴とする、請求
    項４５記載の方法。
  47. 【請求項４７】 各鎖終結ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドであり、
    プライマー伸長が、1種の同定される標識化ジデオキシヌクレオチドと２種の異
    種の非標識ジデオキシヌクレオチドの存在下で実施されることを特徴とする、請
    求項４５記載の方法。
  48. 【請求項４８】 各鎖終結ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドであり、
    プライマー伸長が、1種の同定される標識化ジデオキシヌクレオチドと１種の異
    種の非標識ジデオキシヌクレオチドの存在下で実施されることを特徴とする、請
    求項４５記載の方法。
  49. 【請求項４９】 各鎖終結ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドであり、
    プライマー伸長が、1種の同定される標識化ジデオキシヌクレオチドの存在下で
    、かつ異種の非標識ジデオキシヌクレオチドの非存在下で実施されることを特徴
    とする、請求項４５記載の方法。
  50. 【請求項５０】 各鎖終結ヌクレオチドの標識が、ハプテン、放射性標識、
    および蛍光標識からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４５記載の
    方法。
  51. 【請求項５１】 同定反応がオリゴヌクレオチド連結反応であることを特徴
    とする、請求項３３記載の方法。
  52. 【請求項５２】 オリゴヌクレオチド連結反応が、標識オリゴヌクレオチド
    とレポータープローブとの間での連結反応を実施することを含むことを特徴とす
    る、請求項５１記載の方法。
  53. 【請求項５３】 レポータープローブが1種以上のヌクレオチドを含み、か
    つ5’リン酸基を有していることを特徴とする、請求項５２記載の方法。
  54. 【請求項５４】 レポータープローブが3’標識をさらに含んでいることを
    特徴とする、請求項５３記載の方法。
  55. 【請求項５５】 レポータープローブがオリゴヌクレオチドであることを特
    徴とする、請求項５２記載の方法。
  56. 【請求項５６】 オリゴヌクレオチドが８merであることを特徴とする、請
    求項５５記載の方法。
  57. 【請求項５７】 同定反応が対立遺伝子特異的重合反応であることを特徴と
    する、請求項３３記載の方法。
  58. 【請求項５８】 対立遺伝子特異的重合反応が、非プルーフリーディングポ
    リメラーゼを用いた重合反応を実施することを含み、各反応用プライマーは標的
    オリゴヌクレオチドの第1相補性領域を含んでおり、レポータープローブは1種以
    上の選択的標識化デオキシヌクレオチドを含み、かつ、検出は第2ハイブリダイ
    ゼーション産物に取り込まれた標識が存在するか否かを検出することを含んでお
    り、標識の存在がプライマーの伸長を示し、かつ標識の正体が所定のヌクレオチ
    ドに相補的なヌクレオチドを示すことから、標的核酸中の所定のヌクレオチドが
    同定されることを特徴とする、請求項５７記載の方法。
  59. 【請求項５９】 標的核酸が、オリゴヌクレオチド、16s リボソームRNA、P
    CR産物、DNA断片、RNA分子、cDNA分子またはcRNA分子であり、核酸プライマーは
    オリゴヌクレオチド、PCR産物、DNA断片、RNA分子、cDNA分子、cRNA分子または
    ゲノムDNAであることを特徴とする、請求項３３記載の方法。
  60. 【請求項６０】 可動性固相支持体がビーズであることを特徴とする、請求
    項３３記載の方法。
  61. 【請求項６１】 第2ハイブリダイゼーション産物中の標識と検出可能な特
    異的タグとを定量することをさらに含み、第2ハイブリダイゼーション産物中の
    標識および検出可能な特異的タグの量が標的核酸中のそれぞれの所定のヌクレオ
    チドの相対的な存在量を示すことを特徴とする、請求項３３記載の方法。
  62. 【請求項６２】 ゲノムDNA中の1種以上の所定のヌクレオチドの多型を決定
    する方法であって： a'. 核酸の一方の鎖の所定のヌクレオチドの5’側の部分に相補的な領域を含
    む第1核酸プライマーと、核酸の反対鎖の所定のヌクレオチドの下流の部分に相
    補的な第２核酸プライマーとを用いて、該２つのプライマーの間の所定のヌクレ
    オチドの領域を特異的に増幅する条件下で、ゲノムDNAを増幅させてPCR産物を形
    成させること； a''. T7RNAポリメラーゼプロモーターを有する第1領域と核酸の一方の鎖の所
    定のヌクレオチドのすぐ5'側の部分に相補的な第2領域とを含むオリゴヌクレオ
    チドをプライマーとして用いて、２つのプライマーの間のヌクレオチドの領域を
    特異的に増幅する条件下で、第1鎖をcRNAとして増幅させるためのT7RNAポリメラ
    ーゼと、該cRNA鎖に相補的な第2鎖を増幅させるための逆転写酵素を用いてゲノ
    ムDNAを増幅させてｃRNA増幅産物を形成させること、または、 a'''. ゲノムDNAの粘度を低減させるためにゲノムDNAを処理すること；およ
    び b. 1種以上のPCR産物、1種以上のcRNA増幅産物、または処理したゲノムDNAを
    含むサンプルを1種以上の特異的標的オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイゼー
    ション条件下で接触させて第1ハイブリダイゼーション産物を形成させること、
    ここで、各標的オリゴヌクレオチドは第1特異的相補性領域および第2特異的相補
    性領域を含んでおり、各標的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域は、第1相補性
    領域の5’側にあり、かつ、各標的オリゴヌクレオチドの第1相補性領域は、標的
    核酸の所定のヌクレオチドのすぐ5’側の部分に相補的な配列であって、PCR産物
    、cRNA増幅産物、または処理したゲノムDNA中の所定のヌクレオチドと塩基対形
    成する位置にある同定される試験ヌクレオチドでその3’末端が終わっている該
    配列を含むものであること； c. １種以上の選択的標識化レポータープローブの存在下で、第1ハイブリダ
    イゼーション産物を用いて所定の同定反応を実施すること、ここで、標的オリゴ
    ヌクレオチドの第1相補性領域およびレポータープローブを含む選択的標識化検
    出産物が形成され得ること； b. 検出可能な特異的タグを付した可動性固相支持体に直接または間接的に共
    有結合している特異的オリゴヌクレオチドと検出産物を、ハイブリダイゼーショ
    ン条件下で接触させて第2ハイブリダイゼーション産物を形成させることにより
    検出産物を単離すること、ここで、各捕捉オリゴヌクレオチドは特異的標的オリ
    ゴヌクレオチドの第2相補性領域に相補的な核酸配列を含んでおり、かつ、検出
    可能なタグは各捕捉オリゴヌクレオチドに特異的であること；および c. 第2ハイブリダイゼーション産物中の標識化検出産物の標識と、同一の第2
    ハイブリダイゼーション産物中の可動性固相支持体の検出可能なタグとを検出す
    ること、ここで、同一の第2ハイブリダイゼーション産物中の標識および特異的
    検出可能なタグの存在が特異的PCR産物、cRNA増幅産物、または処理されたゲノ
    ムDNA中の所定のヌクレオチドの正体を示すものである；および d. 同定されたヌクレオチドの正体を非多型ヌクレオチドと比較すること、 を含み、同定されたヌクレオチドの正体と非多型ヌクレオチドの正体との相違が
    、ゲノムDNAの1種以上の多型を示すことを特徴とする、上記方法。
  63. 【請求項６３】 各捕捉オリゴヌクレオチドが約50％以上のGC含量を有する
    ことを特徴とする、請求項６２記載の方法。
  64. 【請求項６４】 各捕捉オリゴヌクレオチドが約60〜70℃のTmを有すること
    を特徴とする、請求項６２記載の方法。
  65. 【請求項６５】 各捕捉オリゴヌクレオチドが標的核酸を含有する細胞には
    存在しない配列を含むことを特徴とする、請求項６２記載の方法。
  66. 【請求項６６】 標的核酸が哺乳動物細胞に存在する配列であり、かつ捕捉
    オリゴヌクレオチドは細菌に存在するオリゴヌクレオチド配列を含むことを特徴
    とする、請求項６５記載の方法。
  67. 【請求項６７】 各捕捉オリゴヌクレオチドがマイコバクテリウム・ツベル
    クロシス菌に存在するオリゴヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項
    ６６記載の方法。
  68. 【請求項６８】 各捕捉オリゴヌクレオチドが5’アミン基をさらに含むこ
    とを特徴とする、請求項６２記載の方法。
  69. 【請求項６９】 各捕捉オリゴヌクレオチドがルシフェラーゼcDNAをさらに
    含むことを特徴とする、請求項６２記載の方法。
  70. 【請求項７０】 各標的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域が少なくとも8
    ヌクレオチドからなる核酸を含むことを特徴とする、請求項６２記載の方法。
  71. 【請求項７１】 各標的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域が配列番号１
    〜５８に示す配列からなる群より選択される配列を有する核酸を含むことを特徴
    とする、請求項６２記載の方法。
  72. 【請求項７２】 同定反応が一塩基鎖伸長反応であることを特徴とする、請
    求項６２記載の方法。
  73. 【請求項７３】 一塩基鎖伸長反応が第1ハイブリダイゼーション産物を用
    いたプライマー伸長反応をプライマー伸長条件下で実施することを含み、それぞ
    れの検出可能な標識化レポータープローブは、同定される鎖終結ヌクレオチドを
    含んでいることを特徴とする、請求項７２記載の方法。
  74. 【請求項７４】 各鎖終結ヌクレオチドが、3’デオキシヌクレオチド、3’
    デオキシリボヌクレオチド、チオールヌクレオチド誘導体、またはジデオキシヌ
    クレオチドであることを特徴とする、請求項７３記載の方法。
  75. 【請求項７５】 各鎖終結ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドであり、
    プライマー伸長が1種の同定される標識化ジデオキシヌクレオチドと３種の異種
    の非標識ジデオキシヌクレオチドの存在下で実施されることを特徴とする、請求
    項７４記載の方法。
  76. 【請求項７６】 各鎖終結ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドであり、
    プライマー伸長が1種の同定される標識化ジデオキシヌクレオチドと２種の異種
    の非標識ジデオキシヌクレオチドの存在下で実施されることを特徴とする、請求
    項７４記載の方法。
  77. 【請求項７７】 各鎖終結ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドであり、
    プライマー伸長が1種の同定される標識化ジデオキシヌクレオチドと１種の異種
    の非標識ジデオキシヌクレオチドの存在下で実施されることを特徴とする、請求
    項７４記載の方法。
  78. 【請求項７８】 各鎖終結ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドであり、
    プライマー伸長が、1種の同定される標識化ジデオキシヌクレオチドの存在下で
    、かつ異種の非標識ジデオキシヌクレオチドの非存在下で実施されることを特徴
    とする、請求項７４記載の方法。
  79. 【請求項７９】 各鎖終結ヌクレオチドの標識が、ハプテン、放射性標識、
    および蛍光標識からなる群から選択されることを特徴とする、請求項７４記載の
    方法。
  80. 【請求項８０】 同定反応がオリゴヌクレオチド連結反応であることを特徴
    とする、請求項６２記載の方法。
  81. 【請求項８１】 オリゴヌクレオチド連結反応が、標識オリゴヌクレオチド
    とレポータープローブとの間での連結反応を実施することを含むことを特徴とす
    る、請求項８０記載の方法。
  82. 【請求項８２】 レポータープローブが1種以上のヌクレオチドを含み、か
    つ5’リン酸基を有していることを特徴とする、請求項８１記載の方法。
  83. 【請求項８３】 レポータープローブが3’標識をさらに含んでいることを
    特徴とする、請求項８２記載の方法。
  84. 【請求項８４】 レポータープローブがオリゴヌクレオチドであることを特
    徴とする、請求項８１記載の方法。
  85. 【請求項８５】 オリゴヌクレオチドが８merであることを特徴とする、請
    求項８４記載の方法。
  86. 【請求項８６】 同定反応が対立遺伝子特異的重合反応であることを特徴と
    する、請求項６２記載の方法。
  87. 【請求項８７】 対立遺伝子特異的重合反応が、非プルーフリーディングポ
    リメラーゼを用いた対立遺伝子特異的重合反応を実施することを含み、対立遺伝
    子特異的重合反応用の各プライマーは標的オリゴヌクレオチドの第1相補性領域
    を含んでおり、レポータープローブは1種以上の選択的標識化デオキシヌクレオ
    チドを含み、かつ検出は第2ハイブリダイゼーション産物に取り込まれた標識が
    存在するか否かを検出することを含んでおり、ここで、標識の存在がプライマー
    の伸長を示し、かつ標識の正体が所定のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを
    示すことを特徴とする、請求項８６記載の方法。
  88. 【請求項８８】 標的核酸が、オリゴヌクレオチド、16s リボソームRNA、P
    CR産物、DNA断片、RNA分子、cDNA分子またはcRNA分子であり、核酸プライマーは
    オリゴヌクレオチド、PCR産物、DNA断片、RNA分子、cDNA分子、cRNA分子または
    ゲノムDNAであることを特徴とする、請求項６２記載の方法。
  89. 【請求項８９】 可動性固相支持体がビーズであることを特徴とする、請求
    項６２記載の方法。
  90. 【請求項９０】 2種以上の捕捉オリゴヌクレオチドが可動性固相支持体に
    共有結合しており、かつ、各第2ハイブリダイゼーション産物が1種以上の標識を
    含み得ることを特徴とする、請求項６２記載の方法。
  91. 【請求項９１】 第2ハイブリダイゼーション産物中の標識および特異的タ
    グを定量することをさらに含み、同一の第2ハイブリダイゼーション産物中の標
    識および検出可能な特異的タグの量が標的核酸中のそれぞれの所定のヌクレオチ
    ドの相対的な存在量を示すことを特徴とする、請求項６２記載の方法。
  92. 【請求項９２】 標的核酸中の1種以上の所定のヌクレオチドを同定するた
    めにクレバーゼ/シグナル放出反応の結果を検出する方法であって： a. 標的核酸を含むサンプルを、 (i)第1相補性領域と、試験ヌクレオチドに特異的な所定の第2相補性領域とを
    それぞれに含む1種以上のシグナルプローブ、ここで、第2相補性領域は、第1相
    補性領域の5’側にあり、かつ蛍光供与団を含んでおり、第1相補性領域は(a)標
    的核酸の所定のヌクレオチドのすぐ5’側の部分に相補的な配列、(b)標的核酸の
    所定のヌクレオチドと塩基対形成する位置にある5’末端の試験ヌクレオチド、
    および(c)同定される試験ヌクレオチドの3’側にある蛍光消光団を含むものであ
    ること、および (ii)2つ以上のインベーダーオリゴヌクレオチド、ここで、各インベーダーオ
    リゴヌクレオチドは、(a)標的核酸の所定のヌクレオチドのすぐ3’側の部分に相
    補的な配列、および(b)標的核酸の所定のヌクレオチドと塩基対形成する位置に
    ある5’末端の同定される試験ヌクレオチドを含むものであること、 と、シグナルプローブの第1相補性領域と標的核酸のシグナルプローブの第1相補
    性領域に相補的な部分との間、およびインベーダーオリゴヌクレオチドと標的核
    酸の相補的部分との間で、重複ハイブリダイゼーション産物の形成が可能なハイ
    ブリダイゼーション条件下で、接触させて重複ハイブリダイゼーション産物を形
    成させること、ここで、重複ハイブリダイゼーション産物は所定のヌクレオチド
    で重複すること； b. 同定される試験ヌクレオチドと所定のヌクレオチドが相補的である場合に
    形成される重複ハイブリダイゼーション産物を特異的に切断するヌクレアーゼと
    重複ハイブリダイゼーション産物を接触させることを含む特異的切断反応を実施
    し、特異的第2相補性領域とシグナルプローブの第1相補性領域の同定される試験
    ヌクレオチドとを含む検出産物を放出させること； c. 検出可能な特異的タグを付した可動性固相支持体に直接または間接的に共
    有結合している特異的捕捉オリゴヌクレオチドと検出産物とを、ハイブリダイゼ
    ーション条件下で接触させて非重複第2ハイブリダイゼーション産物を形成させ
    ることにより検出産物を単離すること、ここで、各捕捉オリゴヌクレオチドは特
    異的シグナルプローブの特異的第2相補性領域に相補的な核酸配列を含んでおり
    、かつ、検出可能なタグは各捕捉オリゴヌクレオチドに特異的であること、およ
    び d. 非重複ハイブリダイゼーション産物中の蛍光供与団の存在および蛍光消光
    団の不存在、ならびに同一の非重複ハイブリダイゼーション産物中の可動性固相
    支持体の検出可能なタグの存在を検出すること； を含み、ここで、検出可能な特異的タグおよび蛍光供与団の存在、ならびに蛍光
    消光団の不存在が標的核酸中の所定のヌクレオチドの正体を示すことを特徴とす
    る、上記方法。
  93. 【請求項９３】 上記ステップ(a)および(b)を繰り返して、検出産物の量を
    増大させることをさらに含むことを特徴とする、請求項９２記載の方法。
  94. 【請求項９４】 捕捉オリゴヌクレオチドが約50％以上のGC含量を有するこ
    とを特徴とする、請求項９２記載の方法。
  95. 【請求項９５】 捕捉オリゴヌクレオチドが約60〜70℃のTmを有することを
    特徴とする、請求項９２記載の方法。
  96. 【請求項９６】 各捕捉オリゴヌクレオチドが標的核酸を含有する細胞には
    存在しない配列を含むことを特徴とする、請求項９２記載の方法。
  97. 【請求項９７】 標的核酸が哺乳動物細胞に存在する配列であり、かつ捕捉
    オリゴヌクレオチドは細菌に存在するオリゴヌクレオチド配列を含むことを特徴
    とする、請求項９６記載の方法。
  98. 【請求項９８】 捕捉オリゴヌクレオチドがマイコバクテリウム・ツベルク
    ロシス菌に存在するオリゴヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項９
    ７記載の方法。
  99. 【請求項９９】 各捕捉オリゴヌクレオチドが5’アミン基をさらに含むこ
    とを特徴とする、請求項９８記載の方法。
  100. 【請求項１００】 各捕捉オリゴヌクレオチドがルシフェラーゼcDNAをさら
    に含むことを特徴とする、請求項９８記載の方法。
  101. 【請求項１０１】 各捕捉オリゴヌクレオチドがその5’または3’末端のい
    ずれかで可動性固相支持体に結合していることを特徴とする、請求項９２記載の
    方法。
  102. 【請求項１０２】 各シグナルプローブの第2相補性領域が少なくとも8ヌク
    レオチドからなる核酸を含むことを特徴とする、請求項９２記載の方法。
  103. 【請求項１０３】 各シグナルプローブの第2相補性領域が配列番号１〜５
    ８に示す配列からなる群より選択される配列を有する核酸を含むことを特徴とす
    る、請求項９２記載の方法。
  104. 【請求項１０４】 検出可能な特異的タグおよび蛍光供与団の存在量を定量
    することをさらに含み、ここで、同一の非重複ハイブリダイゼーション産物中の
    蛍光消光団の不存在が標的核酸中のそれぞれの所定のヌクレオチドそれぞれの相
    対的な存在量を示すことを特徴とする、請求項９２記載の方法。
  105. 【請求項１０５】 標的核酸中の所定のヌクレオチドを同定するためにポリ
    メラーゼ/修復反応の結果を検出する方法であって： a. 標的核酸を含むサンプルを、それぞれに第1相補性領域および試験ヌクレ
    オチドに特異的な所定の第2相補性領域を含む1種以上のシグナルプローブと、シ
    グナルプローブの第1相補性領域と標的核酸のシグナルプローブの第1相補性領域
    に相補的な部分との間で第1ハイブリダイゼーション産物の形成が可能なハイブ
    リダイゼーション条件下で、接触させること、ここで、第2相補性領域は、第1相
    補性領域の3’側にあり、第1相補性領域は(a)標的核酸の所定のヌクレオチドの
    すぐ5’側の部分に相補的な配列、(b)標的核酸の所定のヌクレオチドと塩基対形
    成する位置にあるシグナルプローブの5’末端の同定される試験ヌクレオチド、(
    c)試験ヌクレオチドの3’に位置するチオール部位、(d)チオール部位の3’側に
    ある蛍光供与団、(d) チオール部位の5’側で試験ヌクレオチドの3’側に位置す
    る蛍光消光団を含むものであること； b. 試験ヌクレオチドと所定のヌクレオチドとが相補的である場合にチオール
    部位にてシグナルプローブを切断し、第2相補性領域と、シグナルプローブの第1
    相補性領域の蛍光供与団を含むが蛍光消光団は含まない部分とを含む検出産物を
    放出させるTaqポリメラーゼと第1ハイブリダイゼーション産物とを接触させるこ
    とを含むポリメラーゼ/修復反応を実施し； c. 検出産物を、検出可能な特異的タグを付した可動性固相支持体に直接また
    は間接的に共有結合している特異的捕捉オリゴヌクレオチドと、ハイブリダイゼ
    ーション条件下で接触させて第2ハイブリダイゼーション産物を形成させること
    により検出産物を単離すること、ここで、各捕捉オリゴヌクレオチドは特異的シ
    グナルプローブの特異的第2相補性領域に相補的な核酸配列を含んでおり、かつ
    、検出可能なタグは各捕捉オリゴヌクレオチドに特異的であること；および d. 同一の第2ハイブリダイゼーション産物中の蛍光供与団の存在および蛍光
    消光団の不存在、ならびに可動性固相支持体の検出可能な特異的タグの存在を検
    出すること； を含み、ここで、検出可能な特異的タグおよび蛍光供与団の存在、ならびに蛍光
    消光団の不存在が標的核酸中の所定のヌクレオチドの正体を示すことを特徴とす
    る、上記方法。
  106. 【請求項１０６】 上記ステップ(a)および(b)を繰り返して、検出産物の量
    を増大させることをさらに含むことを特徴とする、請求項１０５記載の方法。
  107. 【請求項１０７】 捕捉オリゴヌクレオチドが約50％以上のGC含量を有する
    ことを特徴とする、請求項１０５記載の方法。
  108. 【請求項１０８】 捕捉オリゴヌクレオチドが約60〜70℃のTmを有すること
    を特徴とする、請求項１０５記載の方法。
  109. 【請求項１０９】 各捕捉オリゴヌクレオチドが標的核酸を含有する細胞に
    は存在しない配列を含むことを特徴とする、請求項１０５記載の方法。
  110. 【請求項１１０】 標的核酸が哺乳動物細胞に存在する配列であり、かつ捕
    捉オリゴヌクレオチドは細菌に存在するオリゴヌクレオチド配列を含むことを特
    徴とする、請求項１０５記載の方法。
  111. 【請求項１１１】 各捕捉オリゴヌクレオチドがマイコバクテリウム・ツベ
    ルクロシス菌に存在するオリゴヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求
    項１１０記載の方法。
  112. 【請求項１１２】 各捕捉オリゴヌクレオチドが5’アミン基をさらに含む
    ことを特徴とする、請求項１１０記載の方法。
  113. 【請求項１１３】 各捕捉オリゴヌクレオチドがルシフェラーゼcDNAをさら
    に含むことを特徴とする、請求項１１０記載の方法。
  114. 【請求項１１４】 各シグナルプローブの第2相補性領域が少なくとも8ヌク
    レオチドからなる核酸を含むことを特徴とする、請求項１０５記載の方法。
  115. 【請求項１１５】 各シグナルプローブの第2相補性領域が配列番号１〜５
    ８に示す配列からなる群から選択される配列を有する核酸を含むことを特徴とす
    る、請求項１０５記載の方法。
  116. 【請求項１１６】 検出可能な特異的タグおよび蛍光供与団の存在量を定量
    することをさらに含み、ここで、同一の非重複ハイブリダイゼーション産物中の
    蛍光消光団の不存在が標的核酸中の所定のヌクレオチドそれぞれの相対的な存在
    量を示すことを特徴とする、請求項１０５記載の方法。
  117. 【請求項１１７】 サンプル中の所定の微生物の混入物を検出する方法であ
    って： a. サンプルを、第１相補性領域および第２相補性領域をそれぞれ1種以上の
    標的オリゴヌクレオチドと、標的オリゴヌクレオチドの第1相補性領域と微生物
    核酸の標的オリゴヌクレオチドの第1相補性領域に相補的な領域との間でのハイ
    ブリダイゼーション産物の形成が可能なハイブリダイゼーション条件下で、接触
    させて、第１ハイブリダイゼーション産物を形成させること、ここで、第1相補
    性領域は所定の微生物の混入物に特異的な核酸部分に相補的な領域を含み、第2
    相補性領域は特異的標識化レポータープローブに相補的な領域を含むものである
    こと； b. 1種以上の標識化レポータープローブの存在下で、第１ハイブリダイゼー
    ション産物を用いて所定の同定反応を実施すること、ここで、特異的標的オリゴ
    ヌクレオチドの第2相補性領域および標識をそれぞれに含む選択的標識化検出産
    物が形成され得ること； c. 該検出産物を、検出可能な特異的タグを付した可動性固相支持体に直接ま
    たは間接的に共有結合している特異的捕捉オリゴヌクレオチドと接触させること
    により検出産物を単離すること、ここで、各捕捉オリゴヌクレオチドは特異的標
    的オリゴヌクレオチドの第2相補性領域に相補的な核酸配列を含んでおり、かつ
    検出可能なタグは各捕捉オリゴヌクレオチドに特異的であること；および d. 第2ハイブリダイゼーション産物中の標識化検出産物の標識および同一の
    第2ハイブリダイゼーション産物中の可動性固相支持体の検出可能なタグを検出
    すること； を含み、ここで、同一の第2ハイブリダイゼーション産物中の標識および検出可
    能な特異的タグの存在がサンプル中の微生物の混入物の正体を示すことを特徴と
    する、上記方法。
  118. 【請求項１１８】 所定の微生物の混入物の１つがS.aureusであることを特
    徴とする、請求項１１７記載の方法。
  119. 【請求項１１９】 S.aureusに特異的な核酸部分に相補的な第１相補性領域
    が配列番号６０に示す核酸配列を有していることを特徴とする、請求項１１８記
    載の方法。
  120. 【請求項１２０】 S.aureusに特異的な核酸部分に相補的な第１相補性領域
    が配列番号６１に示す核酸配列を有していることを特徴とする、請求項１１８記
    載の方法。
  121. 【請求項１２１】 所定の微生物の混入物の１つがB.セパシアであることを
    特徴とする、請求項１１７記載の方法。
  122. 【請求項１２２】 B・セパシアに特異的な核酸部分に相補的な第１相補性
    領域が配列番号６２に示す核酸配列を有していることを特徴とする、請求項１２
    １記載の方法。
  123. 【請求項１２３】 B・セパシアに特異的な核酸部分に相補的な第１相補性
    領域が配列番号６３に示す核酸配列を有していることを特徴とする、請求項１２
    １記載の方法。
  124. 【請求項１２４】 所定の微生物の混入物の１つが大腸菌またはシュードモ
    ナス属菌のいずれかであることを特徴とする、請求項１１７記載の方法。
  125. 【請求項１２５】 大腸菌またはシュードモナス属菌に特異的な核酸部分に
    相補的な第１相補性領域が配列番号６４の核酸配列を有していることを特徴とす
    る、請求項１２４記載の方法。
  126. 【請求項１２６】 大腸菌またはシュードモナス属菌に特異的な核酸部分に
    相補的な第１相補性領域が配列番号６５の核酸配列を有していることを特徴とす
    る、請求項１２４記載の方法。
  127. 【請求項１２７】 所定の微生物の混入物の１つがシュードモナス属菌また
    はB・セパシアのいずれかであることを特徴とする、請求項１１７記載の方法。
  128. 【請求項１２８】 シュードモナス属菌またはB・セパシアに特異的な核酸
    部分に相補的な第１相補性領域が配列番号６６に示す核酸配列を有していること
    を特徴とする、請求項１２７記載の方法。
  129. 【請求項１２９】 シュードモナス菌またはB・セパシアに特異的な核酸部
    分に相補的な第１相補性領域が配列番号６７に示す核酸配列を有していることを
    特徴とする、請求項１２７記載の方法。
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