CN116194591A - 序列转换反应 - Google Patents

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曼纽尔·杜瓦尔
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Abstract

本文公开了与靶分子的鉴定和/或定量相关的方法、组合物和试剂盒。

Description

序列转换反应
相关申请的交叉引用
本专利申请要求题为“SEQUENCE CONVERSION REACTION”并且于2020年6月10日提交的美国临时专利申请第63/037,575号，以及于2021年3月26日提交的题为“SEQUENCECONVERSION REACTION”的美国临时专利申请第63/166,955号的优先权，这些专利申请的每一个通过引用以其整体并入本文。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用以其整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请都被明确地和单独地指出通过引用并入一样。
领域
本公开内容涉及用于检测和定量分子靶，并且特别是用于检测和定量DNA和RNA的组合物、试剂盒和方法。设备和方法可以用于各种应用中，包括产前测试、病原体检测和癌症筛查。
背景
对提供高度准确和可再现结果的遗传测定存在需求。然而，在起始遗传物质的量在数量和/或品质上可能是低的时，这些高度可再现的结果难以实现。例如，由Evans等人提出的理论上所需的dPCR分区是约220,000个，以在2％的胎儿比例以99％的检测率和1％的假阳性率可靠地检测三体性。迄今，通过dPCR实现这一数字的尝试都失败了，因为母亲的血液每1mL-2mL血浆平均仅具有1000个无细胞DNA(cfDNA)的基因组拷贝。因此，将需要在染色体13、18和21上各检测约200个等位基因。在这样的情况下，将需要1800个寡核苷酸，并且由于许多技术原因，这是不实际的。因此，期望降低这样的测定的复杂性，以使dPCR成为NIPT的有用工具。这样的降低复杂性的测定对于遗传筛选将特别有用。这样的测定不仅可以对于产前测试，特别是包括非侵入性产前测试是有用的，而且还对于病原体、癌症筛查和其他应用是有用的。
非侵入性产前测试是指从怀孕女性、从怀孕女性获得的组织样品测试胎儿的特征。胎儿细胞和胎儿细胞的部分(包括胎儿核酸)存在于怀孕女性的血流中，并且胎儿组织可以提供丰富的信息。可以容易地且安全地从怀孕女性获得血液样品而对胎儿没有损害。DNA扩增技术的进步诸如聚合酶链式反应(PCR)和下一代测序(NGS)已经导致我们进行产前测试能力的显著提高，并且一些产前测试是商购可得的。现有的DNA扩增技术，如dPCR，在试图检测许多不同的靶序列时，具有各种技术限制，诸如非特异性和偏倚扩增。这些限制可能导致无法解释的结果。下一代测序(NGS)技术提供了技术优势，但遭受与高成本和长周转时间相关的复杂工作流程。因此，对改进的用于进行这些和其他测试的方法存在需求。特别是，由于低成本、快速周转时间和相对易用性，特别是与NGS相比，使dPCR能够用于这些测试将是期望的。
自从在母体血浆中发现无细胞胎儿DNA(cffDNA)以来，在利用这作为产前诊断的胎儿遗传物质来源方面存在快速进展。大多数无细胞DNA(cfDNA)是母体来源的，其中来自胎盘的胎儿部分在妊娠之后约9周的母体循环中可检测到，并且在妊娠早期仅占cfDNA的约10％。然而，由于cffDNA在分娩之后快速从母体循环中清理，它为产前诊断提供了作为胎儿遗传物质来源的巨大潜力。与下一代测序(NGS)发展相关的技术进步使得能够准确计数与母体血液中存在的特定染色体相关的DNA序列，这使得非整倍性的非侵入性产前测试(NIPT)得以非常快速发展。在2011年与2017年之间，在已公布的研究中，全部NIPT样品的99.7％都是在Illumina NGS系统上运行的，尽管暂时已经提出了替代方法。一种基于滚环扩增和荧光物体计数的方法于2018年首次商业化。
定量测量的可靠性随着测量次数(重复)改进。通常不存在足够可得的材料来产生实现所需准确度和精确度所需的测量次数(拷贝数太低)。例如，如之前提及并适用于NIPT，在1ml-2ml血浆中根据无细胞DNA(cfDNA)表示的基因组数目(染色体拷贝数、等位基因拷贝数)估计是大约1000个拷贝。这(例如)对于通过dPCR的NIPT不是足够的。先前的研究已经使用替代技术利用数十万次计数，以实现所需的性能。
数字聚合酶链式反应(dPCR)是可以用于直接定量和克隆扩增核酸链(包括DNA、cDNA或RNA)的常规PCR方法的生物技术改进。在dPCR中，样品被分离成大量的分区(例如液滴、微流体室等)并且反应在每一个分区中单独进行。这种分离允许绝对定量，而不需要标准曲线。尽管列出的理论优势和多年的发展，但dPCR在NIPT中不常用的主要技术原因是由于以下事实的问题：cfDNA的拷贝数太低而不能递送所需的统计精确度。理论上，人们可以进行多重dPCR，在感兴趣的染色体上扩增许多等位基因，以解决固有的低拷贝数问题。然而，多重dPCR中的引物-引物-探针相互作用引起非特异性且偏倚的扩增，显示为称为“雨(rain)”的可见现象，这是dPCR中的背景噪声形式。这个问题在具有挑战性的样品中特别明显。诊断测试需要高的稳健性，并且假设必须是样品具有挑战性。PCR以指数方式扩增靶，并且即使反应开始时的拷贝数相同，但反应效率的微小差异导致反应(例如40多个循环)结束时非常不同的拷贝数。
尽管数字PCR是数字是/否反应，但数据分析最终取决于阳性反应，即高于背景的TaqMan信号。对于被认为是阳性的分区，这继而取决于有足够的TaqMan探针被裂解，而这取决于在循环结束时产生了多少扩增子。在不同的分区中具有不同的PCR效率可能导致在不同的分区中不同量的扩增子，并且因此在一些分区中与其他分区相比切割探针更少(较低的信号)。这可能会导致“雨(rain)”和难以清楚地区分阳性和阴性。
此外，长度通常少于300个碱基对的cfDNA片段可以分配到单独分区中，具有来自给定染色体的数百或数千个潜在靶序列(测量对象)。为了以临床相关的方式检查多条(例如，三条或更多条)染色体，该测定需要能够潜在地扩增每条染色体的许多例如100个不同的等位基因位点(测量对象)。这意味着，在该实例中，每一个分区可能需要足够的300个引物对(600个引物)和300个不同探针的每一个来支持每个测量对象的检测。每一个分区中必须存在足够的引物和探针来支持单个靶测量对象的反应，而同时未使用的引物和探针需要存在但不干扰单个靶测量对象(独特序列)或引起假阳性结果。实际上，这样的反应不能可靠地进行。降低反应的复杂性并且提供可靠的靶检测和定量将是有利的。
公开内容的概述
本文描述了可以解决以上描述的限制和需求的方法、试剂盒和组合物。特别是，本文描述了多种方法，包括序列转换(sequence conversion)方法，其可以被称为序列转换测定或序列转换反应。如本文使用的，序列转换方法可以将一个(或更优选地更多个)靶区域，例如靶测量对象或等位基因转换成信号特异性区域(SSR)(该信号特异性区域被工程化为包括多核苷酸标志物区域(“工程化多核苷酸标志物”))，并且在一些情况下引物区域用于拷贝和/或扩增和/或检测工程化多核苷酸标志物。通过将相同的信号特异性区域连接至序列转换探针(SCP)亚组中的这些不同的靶测量对象区域(“靶特异性区域”或TSR)，可以共有共同特性，诸如作为特定染色体、基因、质粒、遗传途径等的部分的许多不同的靶区域可以共有共同信号特异性区域。然后可以组合序列转换探针的多个亚组。这还可以允许降低测定的复杂性和可变性，以在灵敏度、准确度和精确度方面提供显著优势。
通常，这些方法包括通过扩增和检测不同于原始序列的合成序列来检测天然存在的核酸序列。
因此，这些测定可以允许并行处理大量的遗传物质。此外，本文描述的方法和组合物(包括试剂盒)可以允许序列转换探针与DNA和RNA中的一种或两者(包括非常小的、先前难以测定的RNA和/或DNA片段)一起使用。本文描述的序列转换方法可以以极大保真度将靶测量对象(或多个靶测量对象)转换为信号特异性区域(例如，工程化多核苷酸标志物)，所述信号特异性区域可以例如通过与一个或更多个信号探针或信号标记结合，和/或通过遗传扩增和检测(例如，数字PCR等)被直接测定。
例如，本文描述的方法包括：将多于一个序列转换探针(SCP)与包括一个或更多个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一个SCP包括多核苷酸靶特异性区域(TSR)、亲和标签和信号特异性区域(SSR)，SSR包括第一工程化多核苷酸区域(其在本文中可以称为标志物，并且可以被一个或更多个特异性引物识别)，此外其中多于一个SCP包括不同的TSR；使SCP的TSR与一个或更多个靶测量对象杂交；切割具有与一个或更多个靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交SCP的SSR，其中cSSR不包括亲和标签；将cSSR与未杂交的SCP和杂交的TSR分离；以及检测来自cSSR的第一工程化多核苷酸标志物。
一种方法可以包括：将多于一个序列转换探针(SCP)与包括一个或更多个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一个SCP包括在亲和标签与信号特异性区域(SSR)之间的多核苷酸靶特异性区域(TSR)，所述信号特异性区域(SSR)包括第一工程化多核苷酸标志物和一个或更多个引物区域，此外其中多于一个SCP包括被配置为与不同靶测量对象和相同SSR杂交的多于一个不同的TSR；使SCP的TSR与一个或更多个靶测量对象杂交；切割具有与一个或更多个靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；将cSSR与未杂交的SCP和杂交的TSR分离；以及检测来自cSSR的第一工程化多核苷酸标志物。
在一些变化中，一种方法可以包括：将多于一个序列转换探针(SCP)与包括一个或更多个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一个SCP包括在亲和标签与信号特异性区域(SSR)之间的多核苷酸靶特异性区域(TSR)，所述信号特异性区域(SSR)包括在第一正向引物区域与第一反向引物区域之间的第一工程化多核苷酸标志物，此外其中多于一个SCP包括被配置为与不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，并且多于一个SCP的每一个SCP包括相同的第一正向引物区域和第一反向引物区域；使SCP的TSR与一个或更多个靶测量对象杂交；切割具有与一个或更多个靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；将cSSR与未杂交的SCP和杂交的TSR分离；以及检测来自cSSR的第一工程化多核苷酸标志物。如别处描述的，除了工程化多核苷酸标志物之外，还工程化了引物区域(例如，第一正向引物区域和第一反向引物区域)。在一些变化中，工程化多核苷酸标志物可以包括一个或更多个(包括第一正向和第一反向)引物区域。
一种方法可以包括：将多于一个序列转换探针(SCP)与包括一个或更多个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一个SCP包括在亲和标签与信号特异性区域(SSR)之间的多核苷酸靶特异性区域(TSR)，所述信号特异性区域(SSR)包括在第一正向引物区域与第一反向引物区域之间的第一工程化多核苷酸标志物，此外其中多于一个SCP包括被配置为与不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，其中多于一个SCP的至少一些SCP具有不同的第一正向引物区域和第一反向引物区域，其中存在的不同的第一正向引物区域和第一反向引物区域比存在的不同的TSR更少；使SCP的TSR与一个或更多个靶测量对象杂交；切割具有与一个或更多个靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；将cSSR与未杂交的SCP和杂交的TSR分离；以及检测来自cSSR的第一工程化多核苷酸标志物。
在一些变化中，一个或更多个引物区域可以包括第一正向引物区域和第一反向引物区域，其中第一工程化多核苷酸标志物的侧翼是第一正向引物区域和第二正向引物区域。
多于一个SCP可以包括多于一个不同的一个或更多个引物区域，使得不同SCP的一个或更多个引物区域的序列具有不同的序列。在一些变化中，一个或更多个引物区域具有相同的序列(例如正向引物和反向引物)。引物可以对每一个不同的工程化多核苷酸标志物具有特异性(并且可以是工程化多核苷酸标志物的部分或与其分离)。
通常，信号特异性区域(SSR)(例如，工程化多核苷酸标志物)可以被设计成在不同信号特异性区域之间具有大约相同的尺寸、GC含量等，使得它们将以大约相同的频率和/或效率被扩增，以防止检测和/或测量中的偏倚。
在本文描述的任何方法中，切割的SSR(cSSR)可以与未切割的SSR(例如，全长SCP)分离。例如，分离cSSR可以包括使用亲和标签将未杂交的SCP和杂交的TSR与cSSR分离。
通常，样品混合物可以是生物样品或从生物样品提取。例如，样品混合物可以是血液或血液提取物或任何其他体液和/或组织。例如，如本文描述的，在一些变化中，样品混合物是取自孕妇的血液样品，其包括母体遗传物质和胎儿遗传物质。
在一些变化中，在每一个SCP上，TSR可以在亲和标签与SSR之间。如提及的，可以使用任何适当的靶测量对象。例如，一个或更多个靶测量对象可以是DNA或RNA。例如，一个或更多个靶测量对象可以是mRNA、微RNA、rRNA、snRNA或RNAi、snoRNA、指导RNA、核糖核酸酶、YRNA、端粒酶RNA组分、反义RNA(aRNA)、CRISPR RNA、长非编码RNA、Piwi相互作用RNA、小干扰RNA、短发夹RNA、反式作用siRNA、重复相关siRNA、增强子RNA、病毒RNA、卫星RNA、基因组DNA、cfDNA、循环肿瘤DNA、无细胞胎儿DNA(cffDNA)、无细胞母体DNA、单链DNA(ssDNA)等。
序列转换探针(SCP)的靶特异性区域(TSR)可以是任何适当的长度。例如，TSR的长度可以在约13bp和100bp之间长，例如，在约13bp-50bp之间，长度在约13bp-45bp之间，在约13bp-40bp之间，长度在约13bp-35bp之间，长度在约13bp-30bp之间，等等。(例如，在约14bp-80bp之间，在约15bp-80bp之间等)。在一些变化中，TSR可以被配置为以3个或更少的错配(例如，以2个或更少的错配，以1个或更少的错配等)与一个或更多个靶测量对象杂交。TSR通常被选择为使得它代表大于80％独特的(unique to greater than 80％)基因组区域，这意味着靶特异性区域不与靶生物体的基因组(例如，人类基因组)中的任何其他区域共有80％或更多的同一性。如本文描述选择TSR，使得它将仅与基因组的单个(靶)区域杂交。然而，本文描述的方法和组合物可以允许个体之间可能存在的个体变化(例如，多态性)，同时仍然仅与特定的(独特的)靶区域杂交。例如，本文描述的方法可以允许具有80％或更大同一性的区域的杂交。因为TSR被选择为在靶基因组中高达80％同一性(允许一些变化/多态性)的独特的区域，所以TSR可以用于鉴定80％或更多(例如，81％或更多、82％或更多、83％或更多、84％或更多、85％或更多、86％或更多、87％或更多、88％或更多、89％或更多、90％或更多、95％或更多等)同一性的靶区域。
序列转换探针(SCP)可以包括任何适当的亲和标签。亲和标签可以在靶特异性区域上，例如与SCP的信号特异性区域(SSR)相对。在一些变化中，亲和标签在TSR的远端(例如，与SSR相对，SSR可以是5’末端或3’末端)。尽管本文描述的许多实例包括生物素作为亲和标签(其可以与链霉抗生物素蛋白基团结合)，但可以使用可以允许亲和标签与亲和配偶体之间特异性和牢固结合的任何其他亲和标签。例如，亲和标签可以是以下中的一种或更多种：肽标签或表位标签或多核苷酸标签。亲和标签的非限制性实例可以包括：白蛋白结合蛋白(ABP)、碱性磷酸酶(AP)、AU1表位、AU5表位、噬菌体T7表位(T7标签)、噬菌体V5表位(V5标签)、生物素-羧基载体蛋白(BCCP)、蓝舌病病毒标签(B标签)、钙调蛋白结合肽(CBP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、纤维素结合结构域(CBP)、壳多糖结合结构域(CBD)、胆碱结合结构域(CBD)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、E2表位、FLAG表位、半乳糖结合蛋白(GBP)、绿色荧光蛋白(GFP)、Glu-Glu(EE标签)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、人类流感血凝素(HA)、
Figure BDA0004113276060000081
组氨酸亲和标签(HAT)、辣根过氧化物酶(HRP)、HSV表位、酮类固醇异构酶(KSI)、KT3表位、LacZ、萤光素酶、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Myc表位、NusA、PDZ结构域、PDZ配体、聚精氨酸(Arg标签)、聚天冬氨酸(Asp标签)、聚半胱氨酸(Cys标签)、聚组氨酸(His标签)、聚苯丙氨酸(Phe标签)、Profinity eXact、蛋白C、S1标签、S标签、链霉抗生物素蛋白结合肽(SBP)、葡萄球菌蛋白A(蛋白A)、葡萄球菌蛋白G(蛋白G)、Strep标签、链霉抗生物素蛋白、小泛素样修饰物(SUMO)、串联亲和纯化(TAP)、T7表位、硫氧还蛋白(Trx)、TrpE、泛素、Universal、VSV-G等。
如以上提及的，这些方法中的任何一种都可以包括用核酸酶切割与一个或更多个靶测量对象杂交的SCP。可以使用任何适当的核酸酶。例如，核酸酶可以是以下中的一种或更多种：瓣状内切核酸酶/5’核酸酶、双链核酸酶、RNA特异性核酸酶、CAS。在一些变化中，核酸酶可以包括以下之一：RNA酶H、双链体特异性核酸酶(DSN)(例如，Evrogen目录号EA001)、双链DNA酶(dsDNA酶)和限制性内切核酸酶。例如，核酸酶可以是RNA酶H2。一个或更多个靶测量对象可以是RNA，并且第一工程化多核苷酸标志物可以包括DNA。
通常，通过将亲和标签与基底结合以去除未杂交的SCP和杂交的TSR，可以将切割的信号特异性区域(cSSR)与未切割的SCP(包括未切割的SCP自身的SSR)分离。在一些变化中，基底是固相基底，诸如，例如，磁珠或微孔滴定板。
序列转换探针的任何一个可以包括一个或更多个预定的切割或裂解区域，例如在SSR与TSR(和/或TSR的部分)之间。在一些变化中，特别是那些使用RNA酶H2的变化中，例如，SCP可以包括被配置为用作裂解位点的一个或更多个核糖，所述裂解位点是用于切割具有与一个或更多个靶测量对象杂交的TSR的SCP的裂解位点。
在这些方法的任何一种中，检测来自cSSR的第一工程化多核苷酸标志物可以包括使用对SSR特异性的一个或更多个引物扩增第一工程化多核苷酸标志物。
如提及的，切割的信号特异性区域可以通过本文描述的一种或更多种技术来特异性且有效地检测。例如，SSR(并且特别是工程化多核苷酸标志物)可以通过使用被配置为与第一正向引物区域杂交的引物和被配置为与第一反向引物区域杂交的引物扩增第一工程化多核苷酸标志物来检测。例如，检测可以包括通过使用被配置为与不同的第一正向引物区域杂交的引物和被配置为与第一反向引物区域杂交的引物扩增第一工程化多核苷酸标志物来检测来自cSSR的第一工程化多核苷酸标志物。可选地或另外地，检测第一工程化多核苷酸标志物可以包括使cSSR与标记的信号探针杂交并且检测来自标记的信号探针的信号。如本文更详细描述的，在一些变化中，本文描述的SSR可以仅包括一个引物区域(而不是一对)；例如，可以使用等温扩增和以一个引物的RCA。
检测第一工程化多核苷酸标志物可以包括使cSSR与标记的信号探针和捕获探针杂交并且检测来自标记的信号探针的信号。
本文还描述了用于进行本文描述的任何方法的试剂盒。例如，试剂盒可以包括针对多于一个靶测量对象的第一多于一个序列转换探针(SCP)，其中每一个SCP包括被配置为与多于一个靶测量对象中的一个靶测量对象杂交的多核苷酸靶特异性区域(TSR)，其中TSR在亲和标签与信号特异性区域(SSR)之间，SSR包括第一工程化多核苷酸标志物；被配置为切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP的核酸酶；和包括与亲和标签特异性结合的结合配偶体的基底。
在一些变化中，试剂盒包括：针对多于一个靶测量对象的第一多于一个序列转换探针(SCP)，其中每一个SCP包括被配置为与多于一个靶测量对象中的一个靶测量对象杂交的多核苷酸靶特异性区域(TSR)，其中TSR在亲和标签与信号特异性区域(SSR)之间，SSR包括第一工程化多核苷酸标志物；被配置为切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP的核酸酶；和包括与亲和标签特异性结合的结合配偶体的基底。
例如，试剂盒可以包括：针对第一多于一个靶测量对象的第一多于一个序列转换探针(SCP)，其中每一个SCP包括：被配置为与第一多于一个靶测量对象中的一个靶测量对象杂交的多核苷酸靶特异性区域(TSR)，并且其中TSR在亲和标签与信号特异性区域(SSR)之间，SSR包括在第一正向引物区域与第一反向引物区域之间的第一工程化多核苷酸标志物；被配置为切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP的核酸酶；被配置为与第一正向引物区域杂交的第一正向引物和被配置为与第一反向引物区域杂交的第一反向引物；和包括与亲和标签特异性结合的结合配偶体的基底。
多于一个SCP可以包括多于一个不同的第一正向引物区域和第一反向引物区域，此外其中存在的不同的第一正向引物区域和第一反向引物区域比存在的不同的TSR显著更少。多于一个SCP可以包括相同的第一正向引物区域和第一反向引物区域。
这些试剂盒的任何一个都可以包括被配置为与第一正向引物区域杂交的第一正向引物和被配置为与第一反向引物区域杂交的第一反向引物。在一些变化中，试剂盒可以包括针对不同于第一多于一个靶测量对象且彼此不同的一个或更多个另外的多于一个靶测量对象的一个或更多个另外的多于一个序列转换探针(SCP)，其中一个或更多个另外的多于一个SCP的每一个SCP包括：被配置为与一个或更多个另外的多于一个靶测量对象中的一个靶测量对象杂交的多核苷酸靶特异性区域(TSR)，并且其中TSR在亲和标签与第二信号特异性区域(sSSR)之间，其中一个或更多个另外的多于一个的每一个具有不同的sSSR，sSSR包括在第二正向引物区域与第二反向引物区域之间的第二工程化多核苷酸标志物，其中对于一个或更多个另外的多于一个的每一个，第二正向引物区域与所述第一正向引物区域相同或不同，并且第二反向引物区域与第二正向引物区域相同或不同。一个或更多个多于一个SCP的每一个可以包括多于一个不同的第二正向引物区域和第二反向引物区域，此外其中存在的不同的第二正向引物区域和第二反向引物区域比存在的不同的TSR显著更少。第二正向引物可以被配置为与第二正向引物区域杂交并且第二反向引物可以被配置为与第二反向引物区域杂交。
在试剂盒的一些变化中，SCP包括被配置为用作核酸酶的切割位点的至少一个核糖。这些试剂盒的任何一种都可以包括被配置为与工程化多核苷酸标志物杂交的捕获探针和被配置为与工程化多核苷酸标志物杂交的捕获探针或捕获探针和工程化多核苷酸标志物的复合物。这些试剂盒的任何一个都可以包括核酸扩增主混合物。
本文还描述了所描述的序列转换方法的应用。例如，本文描述了核酸扩增的方法。例如，一种方法可以包括：将多于一组序列转换探针(SCP)与包括多于一个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一组SCP包括多于一个SCP，其中每一个SCP包括：多核苷酸靶特异性区域(TSR)、亲和标签和包括工程化多核苷酸标志物和一个或更多个引物区域的信号特异性区域(SSR)，其中每一组SCP包括被配置为与不同靶测量对象和相同SSR杂交的多于一个不同的TSR；使多于一组SCP中的SCP的TSR与靶测量对象杂交；切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交SCP的SSR；使用亲和标签将cSSR与未杂交的SCP和杂交的TSR分离，以形成cSSR池；以及使用cSSR池和被配置为与cSSR的一个或更多个引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增工程化多核苷酸标志物。
在一些变化中，本文描述的测定可以包括方法或者可以是方法诸如数字PCR方法的部分。例如，本文描述了数字PCR的方法，该方法包括：将遗传物质的混合物与序列转换探针(SCP)的混合物合并，其中SCP各自包括被配置为与遗传物质中的多于一个靶测量对象之一杂交的靶特异性区域(TSR)，以及包括一组工程化多核苷酸标志物之一的信号特异性区域(SSR)，所述一组工程化多核苷酸标志物各自指示靶测量对象的亚组；使SCP混合物的TSR与遗传物质中的靶测量对象杂交；切割具有杂交的TSR的SCP，以从杂交的SCP释放切割的信号特异性区域(cSSR)；使用与SCP的TSR相邻的亲和标志物去除任何未切割的SCP，以形成cSSR池；以及使用cSSR池和扩增cSSR的工程化多核苷酸标志物的对cSSR特异性的一个或更多个引物进行数字PCR。
例如，数字PCR的方法可以包括：将遗传物质的混合物与序列转换探针(SCP)的混合物合并，其中SCP各自包括被配置为与遗传物质中的多于一个靶测量对象之一杂交的靶特异性区域(TSR)，以及包括一组工程化多核苷酸标志物之一的信号特异性区域(SSR)，所述一组工程化多核苷酸标志物指示与TSR杂交的靶测量对象位于哪个染色体上；使SCP混合物的TSR与遗传物质中的任何靶测量对象杂交；切割具有杂交的TSR的SCP，以从杂交的SCP释放切割的信号特异性区域(cSSR)；使用与SCP的TSR相邻的亲和标志物去除任何未切割的SCP，以形成cSSR池；以及使用cSSR池和扩增cSSR的工程化多核苷酸标志物的对cSSR特异性的一个或更多个引物进行数字PCR。这些方法的任何一种也可以包括去除与TSR结合的母体遗传物质/胎儿遗传物质。因此，该方法的后续步骤可以在没有母体遗传物质/胎儿遗传物质的情况下进行。
该方法可以包括使用cSSR池和一个或更多个引物进行数字PCR，包括使用cSSR和对cSSR的全部特异性的单对引物进行数字PCR。这些方法中的任何一种都可以包括使用cSSR池和一个或更多个引物进行数字PCR，包括使用多于一个引物进行数字PCR，其中引物的总数少于靶测量对象的总数。
遗传物质的混合物可以包括来自母体血液样品的母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物。
如提及的，切割可以包括用核酸酶(例如，瓣状内切核酸酶/5’核酸酶、双链核酸酶、RNA特异性核酸酶、CAS等)切割，例如RNA酶H、双链体特异性核酸酶、双链DNA酶(dsDNA酶)和限制性核酸内切酶切割。在一些变化中，核酸酶包括RNA酶H2。
通常，本文描述的工程化多核苷酸标志物可以是与遗传物质非关联的。
进行数字PCR可以包括将cSSR池以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得反应样品的至少一些包含cSSR，而一些不包含cSSR。这些方法可以包括分析在单独反应样品中cSSR的工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示在反应样品中推定整倍性染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示在反应样品中推定非整倍性染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字。该方法可以包括通过比较所述第一数字与所述第二数字来确定非整倍性的存在或不存在，其中第一数字与第二数字之间的差异指示多倍性和/或非整倍性的存在。
例如，一种确定胎儿非整倍性的方法可以包括：将母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物与多于一个序列转换探针(SCP)合并，其中每一个SCP包括在亲和标签与信号特异性区域(TSR)之间的多核苷酸靶特异性区域(TSR)，其中TSR被配置为与来自母体遗传物质和胎儿遗传物质的靶测量对象杂交，并且其中SSR包括工程化多核苷酸标志物和一个或更多个引物区域，此外其中多于一个SCP包括被配置为与来自母体遗传物质和胎儿遗传物质的不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，并且多于一个SCP的每一个SCP包括第一多于一个不同工程化多核苷酸标志物中的一个工程化多核苷酸标志物；将多于一个SCP的TSR与靶测量对象杂交；从具有与靶测量对象杂交的TSR的多于一个SCP切割SCP，以释放切割的SSR(cSSR)；将cSSR与未杂交的SCP和与靶测量对象杂交的TSR分离；将cSSR以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得反应样品的至少一些包含cSSR，而一些不包含cSSR；分析在单独反应样品中cSSR的工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示在反应样品中推定整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示在反应样品中推定非整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字；通过鉴定第一数字与第二数字之间的差异来确定胎儿非整倍性的存在或不存在。这些方法可以基于指示不同染色体的多于一个不同工程化多核苷酸标志物的不同工程化多核苷酸标志物来指示若干条染色体。
将母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物与多于一个SCP合并可以包括将母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物与第二多于一个SCP合并，其中第二多于一个SCP包括被配置为与来自母体遗传物质和胎儿遗传物质的不同靶测量对象杂交的第二多于一个不同的TSR，并且第二多于一个SCP的每一个SCP包括一个或更多个第二引物区域和第二多于一个不同的工程化多核苷酸标志物中的一个工程化多核苷酸标志物。第一多于一个不同的工程化多核苷酸标志物可以指示母体遗传物质和胎儿遗传物质的第一染色体，并且第二多于一个不同的工程化多核苷酸标志物指示母体遗传物质和胎儿遗传物质的第二染色体。第一多于一个不同的工程化多核苷酸标志物可以指示母体遗传物质和胎儿遗传物质的不同染色体。
工程化多核苷酸标志物可以各自指示母体遗传物质和胎儿遗传物质的染色体。多于一个SCP可以包括被配置为与来自母体遗传物质和胎儿遗传物质的不同染色体上的靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，并且第一多于一个不同的工程化多核苷酸标志物可以指示TSR对应于母体遗传物质和胎儿遗传物质的哪条染色体。
通常，工程化多核苷酸标志物的一个或更多个和一个或更多个第二引物区域可以是与母体遗传物质和胎儿遗传物质非关联的。多于一个SCP可以包括被配置为与来自母体遗传物质和胎儿遗传物质的同一染色体上的不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR。
多于一个SCP可以包括被配置为与来自母体遗传物质和胎儿遗传物质的不同染色体上的不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR。将cSSR分配到多于一个反应样品中可以包括以低体积和/或高稀释度分配cSSR，由此更多工程化多核苷酸标志物在包含三体或增加拷贝数的靶测量对象的样品中被检测到。
母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物可以取自少于4mL的血液。
例如，一种确定胎儿非整倍性的方法可以包括：将母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物与多于一个序列转换探针(SCP)(包括SCP的第一亚组和SCP的第二亚组)合并，其中多于一个SCP的每一个SCP包括：在亲和标签与信号特异性区域(SSR)之间的多核苷酸靶特异性区域(TSR)，其中TSR被配置为与来自母体遗传物质和胎儿遗传物质的靶测量对象杂交，并且其中SSR包括在正向引物区域与反向引物区域之间的工程化多核苷酸标志物，此外其中SCP的第一亚组包括被配置为与第一染色体上的不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，并且SCP的第一亚组的每一个SSR包括相同的第一正向引物区域和相同的第一反向引物区域，以及指示第一染色体的工程化多核苷酸标志物，此外其中SCP的第二亚组包括被配置为与第二染色体上的不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，并且SCP的第二亚组的每一个SSR包括相同的第二正向引物区域和相同的第二反向引物区域以及指示第二染色体的工程化多核苷酸标志物，其中第二正向引物区域与第一正向引物区域相同或不同，并且第二反向引物区域与第二正向引物区域相同或不同；使多于一个SCP的TSR与靶测量对象杂交；从具有与靶测量对象杂交的TSR的多于一个SCP切割SCP，以释放切割的SSR(cSSR)；将cSSR与未杂交的SCP分离；将cSSR以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得反应样品的至少一些包含cSSR，而一些不包含cSSR；分析在单独反应样品中cSSR的工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示在反应样品中推定整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示在反应样品中推定非整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字；通过比较所述第一数字与所述第二数字来确定胎儿非整倍性的存在或不存在。
本文描述的方法和组合物可以指示被检查的一条或更多条染色体(例如，染色体13、18和21)的拷贝数(或部分拷贝数)；例如，一条或每一条可以是非整倍性(和/或多倍体)。例如，3条中的2条可能是整倍性，3条中的1条可能是整倍性，和/或它们全部或它们中没有一个可能是整倍性。因此，本文描述的方法通常不需要存在预定义的整倍性参考，并且这些方法可以采用比例，并且无论哪个“更多”是非整倍性。
在本文描述的任何方法中，测定可以检查多于两条染色体(例如，13、18和21，并且在一些变化中，Y加X)。
本文描述的任何试剂盒都可以与数字PCR方法一起使用或适于与数字PCR方法一起使用。例如，可以用于如本文描述的数字PCR的试剂盒可以包括，例如：序列转换探针(SCP)的混合物，其中SCP各自包括被配置为与来自多于一条人类染色体的多于一个靶测量对象之一/多于一条人类染色体中的多于一个靶测量对象之一杂交的靶特异性区域(TSR)，包括一组工程化多核苷酸标志物之一的信号特异性区域(SSR)(所述工程化多核苷酸标志物指示与TSR杂交的靶测量对象位于哪个染色体上)，其中工程化多核苷酸标志物的侧翼是正向引物区域和反向引物区域，以及SCP上不与SSR重叠的区域上的亲和标签；被配置为切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP的核酸酶；包括与亲和标签特异性结合的结合配偶体的基底；以及被配置为与第一正向引物区域杂交的第一正向引物和被配置为与第一反向引物区域杂交的第一反向引物(在一些变化中)。试剂盒可以包括被配置为独特地鉴定单独工程化多核苷酸标志物的一组探针。
如本文描述方法的另一个变化包括使用被配置为倒位(例如挂锁)探针的一个或更多个序列转换探针。例如，本文描述的方法包括：将多于一组环化序列转换探针(cSCP)与包括多于一个靶测量对象的样品混合物合并，其中cSCP的每一组包括多于一个cSCP，其中每一个cSCP包括：包括被配置为与第一靶特异性区域杂交的有义探针的第一末端、包括被配置为与第二靶特异性区域杂交的反义探针的第二末端以及包括工程化多核苷酸标志物、正向引物区域和反向引物区域的信号特异性区域(SSR)，其中cSCP的每一组包括相同的SSR和被配置为与不同的靶测量对象杂交的多于一个不同的第一靶特异性区域和第二靶特异性区域；使多于一组cSCP的cSCP与靶测量对象杂交以产生环化复合物；使环化复合物与环化剂接触以使环化复合物的cSCP环化；以及使用环化的cSCP和被配置为与cSSR的正向引物区域和反向引物区域(例如，在一些变化中，如果需要)杂交的引物进行数字PCR，以扩增工程化多核苷酸标志物。
例如，一种方法可以包括：将多于一个环化序列转换探针(cSCP)亚组与包括多于一个靶测量对象的样品混合物合并，以形成合并的混合物，其中cSCP的每一个亚组包括多于一个cSCP，所述多于一个cSCP各自具有相同的信号特异性区域(SSR)，包括工程化多核苷酸标志物和被配置为与不同的靶测量对象杂交的一对靶特异性区域(TSR)；使多于一个cSCP亚组的cSCP与靶测量对象杂交以产生环化复合物；使环化复合物与环化剂接触以使环化复合物的cSCP环化；使合并的混合物中的未环化的cSCP与外切核酸酶接触以切割未环化的cSCP；以及使用环化的cSCP和被配置为与SSR的一个或更多个引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增工程化多核苷酸标志物。
被配置为倒位探针的序列转换探针方法可以被配置为确定胎儿非整倍性的方法。例如，一种方法可以包括：将包括多于一个靶测量对象的母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物与多于一组环化序列转换探针(cSCP)合并，其中cSCP的每一组包括多于一个cSCP，此外其中每一个cSCP包括：包括对来自多于一个靶测量对象的特定靶测量对象特异性的第一靶特异性区域的有义探针的第一末端、包括对特定靶测量对象特异性的第二靶特异性区域的反义探针的第二末端以及包括指示与特定靶测量对象关联的人类染色体的工程化多核苷酸标志物的信号特异性区域(SSR)、正向引物区域和反向引物区域，其中cSCP的每一组包括相同的SSR和被配置为与不同的特异性靶测量对象杂交的多于一个不同的第一靶特异性区域和第二靶特异性区域；使多于一个cSCP组的cSCP与靶测量对象杂交以产生环化复合物；使环化复合物与环化剂接触以使环化复合物的cSCP环化；以及将cSCP以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得反应样品的至少一些包含cSCP，而一些不包含cSCP；分析在单独反应样品中cSCP的工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示在反应样品中推定整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示在反应样品中推定非整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字；通过比较所述第一数字与所述第二数字来确定胎儿非整倍性的存在或不存在。
工程化多核苷酸标志物的侧翼可以是正向引物区域和反向引物区域，还包括使用外切核酸酶将环化的cSCP与线性cSCP分离。引物的数目可以比靶测量对象的数目少得多。样品混合物可以包括来自母体血液样品的母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物。进行数字PCR可以包括将cSCP池以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得反应样品的至少一些包含cSCP，而一些不包含cSCP。该方法可以还包括分析在单独反应样品中cSCP的工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示在反应样品中推定整倍性染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示在反应样品中推定非整倍性染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字。
这些方法中的任何一种都可以包括通过比较所述第一数字与所述第二数字来确定非整倍性的存在或不存在，其中第一数字与第二数字之间的差异指示非整倍性的存在。环化剂可以是例如连接酶。
如本文描述的序列转换方法的另一种变化包括引物驱动的方法和组合物。例如，本文描述的方法包括：将引物偶联的靶特异性探针的多于一个亚组与包括多于一个靶测量对象的样品混合物合并以形成合并的混合物，其中每一个引物偶联的靶特异性探针包括被配置为与多于一个靶测量对象中的靶测量对象杂交的靶特异性区域(TSR)和序列转换引物(SC引物)，其中引物偶联的靶特异性探针的每一个亚组包括相同的SC引物和多个不同的靶特异性区域；使引物偶联的靶特异性探针的靶特异性区域与靶测量对象杂交；切割与靶测量对象杂交的引物偶联的靶特异性探针以释放SC引物，而不释放未杂交的引物偶联的靶特异性探针的SC引物；使所释放的SC引物与序列转换模板(SCT)接触，并且使SC引物延伸以形成SCT的拷贝，其中SCT包括工程化多核苷酸标志物；将SCT的拷贝与SCT分离；以及使用SCT的拷贝和被配置为与SCT拷贝上的一个或更多个引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增工程化多核苷酸标志物。
切割与靶测量对象杂交的引物偶联的靶特异性探针可以包括使引物偶联的靶特异性探针与5’-核酸酶接触。
SC引物可以与亲和标签偶联，使得SC引物在从引物偶联的靶特异性探针的靶特异性区域切割之后保持加亲和标签的。使释放的SC引物与SCT接触可以包括使释放的SC引物与环化的SCT接触。SCT可以各自与亲和标签偶联，并且将SCT的拷贝与SCT分离可以包括将SCT与基底结合。
一个或更多个靶测量对象可以是DNA或RNA。
例如，确定胎儿非整倍性的方法可以包括：将引物偶联的靶特异性探针的多于一个亚组与包括多于一个靶测量对象的母体遗传物质和胎儿遗传物质的样品混合物合并以形成合并的混合物，其中每一个引物偶联的靶特异性探针包括被配置为与多于一个靶测量对象中的靶测量对象杂交的靶特异性区域(TSR)和序列转换引物(SC引物)，其中引物偶联的靶特异性探针的每一个亚组包括相同的SC引物和多个不同的靶特异性区域；使引物偶联的靶特异性探针的靶特异性区域与靶测量对象杂交；使引物偶联的靶特异性探针与核酸酶接触，以将SC引物从与靶测量对象杂交的引物偶联的靶特异性探针释放，而不释放未杂交的引物偶联的靶特异性探针的SC引物；使所释放的SC引物与偶联至亲和标签的序列转换模板(SCT)的亚组杂交；使杂交的SC引物延伸以形成SCT的拷贝，其中SCT的拷贝包括工程化多核苷酸标志物；使用亲和标签将SCT的拷贝与SCT分离；以及使用SCT的拷贝和被配置为与SCT拷贝上的一个或更多个引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增工程化多核苷酸标志物。本文还描述了被配置为进行这些方法的试剂盒。
通常，本文描述的方法可以与通过核酸扩增的检测一起使用或适于与通过核酸扩增的检测一起使用。通过核酸扩增的检测可以包括PCR和/或等温扩增。在一些变化中，这些核酸扩增方法和技术可以仅需要一种引物。在这些方法中的任何一种中，工程化多核苷酸标志物(例如，任何SSR)可以通过核酸扩增技术(诸如，但不限于PCR、数字PCR等)和/或杂交来检测。特别是，本文描述的方法可以与以下一起使用或适于与以下一起使用：等温扩增技术(例如，NASBA、LAMP、NEAR、WGA、SDA、HDA、RDA、CPT等)。
本文还描述了序列转换探针(SCP)和工程化它们的方法。例如，序列转换探针(SCP)可以包括：在15个与50个碱基对(bp)之间延伸的靶特异性区域(TSR)，其中TSR的多核苷酸序列仅与人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性，其中TSR包括用于II型限制性酶的关联限制性位点，所述II型限制性酶具有位于TSR的第一末端处或附近的切割位点，此外其中TSR具有大于50％的GC含量；以及具有延伸大于40bp(例如，大于45bp、大于50bp、大于55bp、在40bp与100bp之间、在40bp-90bp之间、在40bp-80bp之间、在50bp-100bp之间、在50bp-90bp之间、在50bp-80bp之间等)的多核苷酸序列的序列特异性区域(SSR)，其中SSR序列的多核苷酸序列不出现在人类基因组中，此外其中SSR具有大于50％的CG含量，其中TSR在第一末端处连接至SSR，此外其中关联限制性位点不是SCP中发夹结构的部分。SSR可以包括正向引物区域和反向引物区域。例如，SSR可以包括正向引物区域和反向引物区域以及在正向引物区域与反向引物区域之间的无碱基区域。
SCP可以具有预测的二级结构，所述二级结构具有少于50kcal/mol(例如，少于45、少于40、少于35、少于30等)kcal/mol的绝对最小自由能(MFE)。
II型限制性酶的切割位点可以在TSR的5’末端处。TSR可以具有大于55℃的解链温度(Tm)。TSR可以具有大于50％的GC含量。
II型限制性酶可以是以下中的一种：BsaI和BspQI。在一些实例中，II型限制性酶是以下中的一种：BsaI、BspQI、BbsI-HF、BtsCI、BtsI-v2、BtsIMutI、FauI、BsrDI、BsrI、BsmBI、BsmFI或BsmI。
例如，序列转换探针可以包括：在15个与50个碱基对(bp)之间延伸的靶特异性区域(TSR)，其中TSR的多核苷酸序列仅与人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性，其中TSR包括用于II型限制性酶的关联限制性位点，所述II型限制性酶具有位于TSR的第一末端处或附近的切割位点；以及延伸大于40bp(例如，大于45bp、大于50bp、大于55bp、在40bp与100bp之间、在40bp-90bp之间、在40bp-80bp之间、在50bp-100bp之间、在50bp-90bp之间、在50bp-80bp之间等)的序列特异性区域(SSR)，其中SSR序列的多核苷酸序列不出现在人类基因组中并且不会与人类染色体多核苷酸退火，此外其中SSR包括正向引物区域和反向引物区域以及在正向引物区域与反向引物区域之间的无碱基区域，其中TSR在第一末端处连接至SSR，此外其中关联限制性位点不是SCP中发夹结构的部分，并且SCP具有大于50％的GC含量。
例如，本文描述了序列转换探针(SCP)，具有：在15个与50个碱基对(bp)之间延伸的靶特异性区域(TSR)，其中TSR的多核苷酸序列仅与人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性；和包括SEQ ID NO.1的序列的序列特异性区域(SSR)，其中TSR连接至SSR。
例如，一种序列转换探针(SCP)可以包括：在15个与50个碱基对(bp)之间延伸的靶特异性区域(TSR)，其中TSR的多核苷酸序列仅与人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性；和包括SEQ ID NO.1的序列的序列特异性区域(SSR)，其中SSR在序列内包括无碱基区域，此外其中TSR连接至SSR。
一种序列转换探针(SCP)可以包括：在15个与50个碱基对(bp)之间延伸的靶特异性区域(TSR)，其中TSR的多核苷酸序列仅与人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性；和序列特异性区域(SSR)，包括：与无碱基区域偶联的SEQ ID NO.10的多核苷酸，所述无碱基区域与SEQ ID NO.11的多核苷酸偶联，其中TSR连接至SSR。
序列转换探针(SCP)可包括：具有以下任一项序列的靶特异性区域(TSR)：SEQ IDNo.8、SEQ ID No.12、SEQ ID No.15、SEQ ID No.18、SEQ ID No.21、SEQ ID No.24、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.30、SEQ ID No.33、SEQ ID No.36、SEQ ID No.39、SEQ ID No.42、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.48、SEQ ID No.51、SEQ ID No.54、SEQ ID No.57、SEQ ID No.60、SEQ IDNo.63、SEQ ID No.66、SEQ ID No.69、SEQ ID No.72或SEQ ID No.75；以及具有SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.4的序列的序列特异性区域(SSR)，其中TSR连接至SSR。
序列转换探针(SCP)可包括：具有以下任一项序列的靶特异性区域(TSR)：SEQ IDNo.8、SEQ ID No.12、SEQ ID No.15、SEQ ID No.18、SEQ ID No.21、SEQ ID No.24、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.30、SEQ ID No.33、SEQ ID No.36、SEQ ID No.39、SEQ ID No.42、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.48、SEQ ID No.51、SEQ ID No.54、SEQ ID No.57、SEQ ID No.60、SEQ IDNo.63、SEQ ID No.66、SEQ ID No.69、SEQ ID No.72或SEQ ID No.75；以及包含SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.4的序列的序列特异性区域(SSR)，其中SSR在序列内包括无碱基区域，此外其中TSR连接至SSR。
序列转换探针(SCP)可包括：具有以下任一项序列的靶特异性区域(TSR)：SEQ IDNo.8、SEQ ID No.12、SEQ ID No.15、SEQ ID No.18、SEQ ID No.21、SEQ ID No.24、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.30、SEQ ID No.33、SEQ ID No.36、SEQ ID No.39、SEQ ID No.42、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.48、SEQ ID No.51、SEQ ID No.54、SEQ ID No.57、SEQ ID No.60、SEQ IDNo.63、SEQ ID No.66、SEQ ID No.69、SEQ ID No.72或SEQ IDNo.75；以及序列特异性区域(SSR)，包括：与无碱基区域偶联的SEQ ID NO.10的多核苷酸，所述无碱基区域与SEQ IDNO.10的多核苷酸偶联，其中TSR连接至SSR。
本文还描述了包括任何一种SCP，并且优选地包括全部具有相同SSR的多种类型的SCP的试剂盒。例如，试剂盒可以包括：第一序列转换探针(SCP)，包括：在13个与50个碱基对(bp)之间(例如，在14bp与50bp之间，在15bp与50bp之间等)延伸的第一靶特异性区域(TSR)，其中第一TSR的多核苷酸序列与人类基因组内仅一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性(至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％的同一性等)，其中第一TSR包括用于II型限制性酶的关联限制性位点，所述II型限制性酶具有位于第一TSR的第一末端处或附近的切割位点，此外其中第一TSR具有大于50％的GC含量；和具有延伸大于40bp(例如，大于45bp、大于50bp、大于55bp、在40bp与100bp之间、在40bp-90bp之间、在40bp-80bp之间、在50bp-100bp之间、在50bp-90bp之间、在50bp-80bp之间等)的多核苷酸序列的第一序列特异性区域(SSR)，其中第一SSR序列的多核苷酸序列不出现在人类基因组中，此外其中第一SSR具有大于50％的CG含量，其中第一TSR在第一末端处连接至第一SSR，此外其中关联限制性位点不是第一SCP中发夹结构的部分；以及第二SCP，包括：在15个与50个碱基对(bp)之间延伸的第二TSR，其中第二TSR的多核苷酸序列仅与人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性，其中第二TSR包括用于II型限制性酶的关联限制性位点，所述II型限制性酶具有位于第二TSR的第一末端处或附近的切割位点，此外其中第二TSR具有大于50％的GC含量；和具有与第一SSR相同的多核苷酸序列的第二SSR，其中第二TSR在第一末端处连接至第二SSR，此外其中关联限制性位点不是第二SCP中发夹结构的部分。
这些试剂盒的任何一个也可以包括引物(例如，正向引物、反向引物、连接探针等)。
例如，本文描述了方法，包括：将第一多于一个序列转换探针(SCP)与包括一个或更多个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一个SCP包括包含靶特异性区域(TSR)和可环化信号特异性区域(SSR)的多核苷酸，可环化SSR包括包含一个或更多个引物区域的第一工程化多核苷酸标志物，此外其中第一多于一个SCP包括被配置为与不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，其中第一多于一个SCP的每一个SCP包括相同的SSR；使TSR与样品混合物内的一个或更多个靶测量对象杂交；切割具有与一个或更多个靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；以及使cSSR的每一个与锁探针杂交以产生环化复合物；使环化复合物与环化剂接触以使cSSR环化；以及检测来自环化的cSSR的第一工程化多核苷酸标志物。
一种方法可以包括：将第一多于一个序列转换探针(SCP)与包括一个或更多个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一个SCP包括包含靶特异性区域(TSR)和可环化信号特异性区域(SSR)的多核苷酸，可环化SSR包括包含一个或更多个引物区域的第一工程化多核苷酸标志物，此外其中第一多于一个SCP包括被配置为与不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，其中第一多于一个SCP的每一个SCP包括相同的SSR；使TSR与样品混合物内的一个或更多个靶测量对象杂交；切割具有与一个或更多个靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR，其中切割不产生单链突出端；以及使cSSR的每一个与具有第一序列的锁探针杂交以产生环化复合物；使环化复合物与环化剂接触以使cSSR环化；以及通过使用环化的cSSR(cirSSR)和被配置为与一个或更多个引物区域杂交的一个或更多个引物进行数字PCR以扩增第一工程化多核苷酸标志物来检测第一工程化多核苷酸标志物。
一种方法可以包括：将多于一组序列转换探针(SCP)与包括多于一个靶测量对象的样品混合物合并，其中SCP的每一组包括多于一个SCP，其中每一个SCP包括：多核苷酸靶特异性区域(TSR)和可环化信号特异性区域(SSR)，可环化SSR包括第一工程化多核苷酸标志物，所述第一工程化多核苷酸标志物包括一个或更多个引物区域，此外其中多于一个SCP包括不同的TSR；其中SCP的每一组包括相同的SSR和各自被配置为与不同的靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR；使TSR与样品混合物中的靶测量对象杂交；切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；使cSSR的每一个与锁探针杂交以产生环化复合物；使环化复合物与环化剂接触以使cSSR环化；以及检测来自环化的cSSR的第一工程化多核苷酸标志物。
一种确定胎儿非整倍性的方法可以包括：将包括多于一个靶测量对象的母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物与多于一组序列转换探针(SCP)合并，其中SCP的每一组包括多于一个SCP，此外其中每一个SCP包括：多核苷酸靶特异性区域(TSR)和可环化信号特异性区域(SSR)，可环化SSR包括包含一个或更多个引物区域的第一工程化多核苷酸标志物，此外其中多于一个SCP包括不同的TSR；其中SCP的每一组包括相同的SSR和被配置为与不同的靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR；使TSR与混合物中的靶测量对象杂交；切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；使cSSR的每一个与锁探针杂交以产生环化复合物；使环化复合物与环化剂接触以使cSSR环化；将环化的cSSR以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得反应样品的至少一些包含cSSR，而一些不包含cSSR；分析在单独反应样品中cSSR的工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示在反应样品中推定整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示在反应样品中推定非整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字；以及通过比较所述第一数字与所述第二数字来确定胎儿非整倍性的存在或不存在。
一种确定胎儿非整倍性的方法可以包括：将母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物与多于一个序列转换探针(SCP)合并，其中每一个SCP包括多核苷酸靶特异性区域(TSR)和信号特异性区域(TSR)，其中TSR被配置为与来自母体遗传物质和胎儿遗传物质的靶测量对象杂交，并且其中SSR包括包含一个或更多个引物区域的工程化多核苷酸标志物，此外其中多于一个SCP包括被配置为与来自母体遗传物质和胎儿遗传物质的不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，并且多于一个SCP的每一个SCP包括第一多于一个不同工程化多核苷酸标志物中的一个工程化多核苷酸标志物；使多于一个SCP的TSR与靶测量对象杂交；从具有与靶测量对象杂交的TSR的多于一个SCP切割SCP，而不留下单链突出端，以释放切割的SSR(cSSR)；使cSSR的每一个与具有第一多核苷酸序列的锁探针杂交以产生环化复合物；使环化复合物与环化剂接触以使cSSR环化；将环化的cSSR以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得反应样品的至少一些包含环化的cSSR，而一些不包含环化的cSSR；分析在单独反应样品中环化的cSSR的工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示在反应样品中推定整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示在反应样品中推定非整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字；通过鉴定第一数字与第二数字之间的差异来确定胎儿非整倍性的存在或不存在。
一种方法可以包括：使序列转换探针(SCP)的靶特异性区域(TSR)与混合物中的靶测量对象杂交；切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP，以将切割的序列特异性区域(cSSR)从SCP释放到混合物中；将包括第二引物区域的SSR延伸探针连接至cSSR，以形成长SSR；以及使用长SSR和被配置成与cSSR的一个或更多个引物区域和SSR延伸探针的第二引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增长SSR的一部分。
一种确定胎儿非整倍性的方法可以包括：将母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物与多于一个序列转换探针(SCP)(包括SCP的第一亚组和SCP的第二亚组)合并，其中多于一个SCP的每一个SCP包括：多核苷酸靶特异性区域(TSR)和信号特异性区域(SSR)，其中TSR被配置为与来自母体遗传物质和胎儿遗传物质的靶测量对象杂交，并且其中SSR包括具有正向引物区域和反向引物区域的工程化多核苷酸标志物，此外其中SCP的第一亚组包括被配置为与第一染色体上的不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，并且SCP的第一亚组的每一个SCP包括指示第一染色体的相同的第一正向引物区域和相同的第一反向引物区域，此外其中SCP的第二亚组包括被配置为与第二染色体上的不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，并且SCP的第二亚组的每一个SCP包括指示第二染色体的相同的第二正向引物区域和相同的第二反向引物区域，其中第二正向引物区域与第一正向引物区域相同或不同，并且第二反向引物区域与第二正向引物区域相同或不同；使多于一个SCP的TSR与靶测量对象杂交；从具有与靶测量对象杂交的TSR的多于一个SCP切割SCP，以释放切割的SSR(cSSR)；将cSSR与未杂交的SCP分离；使cSSR的每一个与具有第一多核苷酸序列的锁探针杂交以产生环化复合物；使环化复合物与环化剂接触以使cSSR环化；将环化的cSSR以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得反应样品的至少一些包含环化的cSSR，而一些不包含环化的cSSR；分析在单独反应样品中环化的cSSR的工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示在反应样品中推定整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示在反应样品中推定非整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字；通过比较所述第一数字与所述第二数字来确定胎儿非整倍性的存在或不存在。
序列转换探针(SCP)可以包括：在14个与50个碱基对(bp)之间延伸的靶特异性区域(TSR)，其中TSR的多核苷酸序列仅与人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性，其中TSR包括用于II型限制性酶的关联限制性位点，所述II型限制性酶具有位于TSR的第一末端处或附近的切割位点，此外其中TSR具有大于50％的GC含量；以及具有延伸大于40bp的多核苷酸序列的序列特异性区域(SSR)，其中SSR序列的多核苷酸序列不出现在人类基因组中，此外其中SSR具有大于50％的CG含量，其中TSR在第一末端处连接至SSR，此外其中关联限制性位点不是SCP中发夹结构的部分。
试剂盒可以包括：第一序列转换探针(SCP)，包括：在14个与50个碱基对(bp)之间延伸的靶特异性区域(TSR)，其中TSR的多核苷酸序列仅与人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性，其中TSR包括用于II型限制性酶的关联限制性位点，所述II型限制性酶具有位于TSR的第一末端处或附近的切割位点，此外其中TSR具有大于50％的GC含量；具有延伸大于40bp的多核苷酸序列的序列特异性区域(SSR)，其中SSR序列的多核苷酸序列不出现在人类基因组中，此外其中SSR具有大于50％的CG含量，其中TSR在第一末端处连接至SSR，此外其中关联限制性位点不是SCP中发夹结构的部分；以及SSR中的至少第一引物区域；以及与第一引物区域杂交的第一引物；以及与SSR的5’末端和SSR的3’末端两者杂交的锁探针。
SSR可以还包括SSR中的第二引物区域，此外其中试剂盒包括与第二引物区域杂交的第二引物。这些试剂盒的任何一种都可以包括II型限制性酶。
序列转换探针(SCP)可以包括：在14个与50个碱基对(bp)之间延伸的靶特异性区域(TSR)，其中TSR的多核苷酸序列仅与人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性，其中TSR包括用于II型限制性酶的关联限制性位点，所述II型限制性酶具有位于TSR的第一末端处或附近的切割位点；以及延伸大于40bp的序列特异性区域(SSR)，其中SSR序列的多核苷酸序列不出现在人类基因组中并且不会与人类染色体多核苷酸退火，此外其中SSR包括正向引物区域和反向引物区域以及在正向引物区域与反向引物区域之间的无碱基区域，其中TSR在第一末端处连接至SSR，此外其中关联限制性位点不是SCP中发夹结构的部分，并且SCP具有大于50％的GC含量。
试剂盒可以包括：第一序列转换探针(SCP)，包括：在15个与50个碱基对(bp)之间延伸的第一靶特异性区域(TSR)，其中第一TSR的多核苷酸序列仅与人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性，其中第一TSR包括用于II型限制性酶的关联限制性位点，所述II型限制性酶具有位于第一TSR的第一末端处或附近的切割位点，此外其中第一TSR具有大于50％的GC含量；和具有延伸大于40bp的多核苷酸序列的第一序列特异性区域(SSR)，其中第一SSR序列的多核苷酸序列不出现在人类基因组中，此外其中第一SSR具有大于50％的CG含量，其中第一TSR在第一末端处连接至第一SSR，此外其中关联限制性位点不是第一SCP中发夹结构的部分；以及第二SCP，包括：在15个与50个碱基对(bp)之间延伸的第二TSR，其中第二TSR的多核苷酸序列仅与人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性，其中第二TSR包括用于II型限制性酶的关联限制性位点，所述II型限制性酶具有位于第二TSR的第一末端处或附近的切割位点，此外其中第二TSR具有大于50％的GC含量；和具有与第一SSR相同的多核苷酸序列的第二SSR，其中第二TSR在第一末端处连接至第二SSR，此外其中关联限制性位点不是第二SCP中发夹结构的部分。
一种方法可以包括：将多于一个序列转换探针(SCP)与包括一个或更多个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一个SCP包括包含靶特异性区域(TSR)和信号特异性区域(SSR)的多核苷酸，SSR包括第一工程化多核苷酸标志物，此外其中多于一个SCP包括不同的TSR；使SCP的TSR与一个或更多个靶测量对象杂交；切割具有与一个或更多个靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；以及检测来自cSSR的第一工程化多核苷酸标志物。
一种方法可以包括：将多于一个序列转换探针(SCP)与包括一个或更多个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一个SCP包括包含靶特异性区域(TSR)和信号特异性区域(SSR)的多核苷酸，所述信号特异性区域(SSR)包括包含一个或更多个引物区域的第一工程化多核苷酸标志物，此外其中多于一个SCP包括被配置为与不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，其中多于一个SCP的每一个SCP包括相同的SSR；使SCP的TSR与样品混合物内的靶测量对象杂交；切割具有与一个或更多个靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；以及检测来自cSSR的第一工程化多核苷酸标志物。
一种方法可以包括：将多于一个序列转换探针(SCP)与包括一个或更多个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一个SCP包括包含靶特异性区域(TSR)和信号特异性区域(SSR)的多核苷酸，SSR包括包含一个或更多个引物区域的第一工程化多核苷酸，此外其中多于一个SCP包括被配置为与不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，并且多于一个SCP的每一个SCP包括相同的一个或更多个引物区域；使SCP的TSR与一个或更多个靶测量对象杂交；切割具有与一个或更多个靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；将cSSR与未杂交的SCP和杂交的TSR分离；以及检测来自cSSR的第一工程化多核苷酸标志物。
一种方法可以包括：将多于一个序列转换探针(SCP)与包括一个或更多个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一个SCP包括多核苷酸靶特异性区域(TSR)和信号特异性区域(SSR)，SSR包括包含第一引物区域的第一工程化多核苷酸标志物，此外其中多于一个SCP包括被配置为与不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，其中多于一个SCP中的至少一些SCP具有不同的第一引物区域，其中存在的不同的第一引物区域比存在的不同的TSR更少；使SCP的TSR与样品混合物内一个或更多个靶测量对象杂交；切割具有与一个或更多个靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；将包括第二引物区域的SSR延伸探针连接至cSSR，其中第二引物区域；以及检测来自cSSR的第一工程化多核苷酸标志物。
这些方法的任何一种都可以包括使用连接阻断剂(ligation blocker)来防止不期望的连接。例如，SSR的5’末端和SSR延伸探针的3’末端两者可以各自包括连接阻断剂。连接阻断剂可以包括以下中的一种：5’OH、5’生物素、5’倒位碱基、5’地高辛、5’D-碱基、3’PO4、3’生物素、3’倒位碱基、3’D-碱基。
一种方法可以包括：将多于一个序列转换探针(SCP)与包括一个或更多个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一个SCP包括多核苷酸靶特异性区域(TSR)和信号特异性区域(SSR)，SSR包括包含第一正向引物区域和第一反向引物区域的第一工程化多核苷酸标志物，此外其中多于一个SCP包括被配置为与不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，其中多于一个SCP中的至少一些SCP具有不同的第一正向引物区域和第一反向引物区域，其中存在的不同的第一正向引物区域和第一反向引物区域比存在的不同的TSR更少；使SCP的TSR与样品混合物内的一个或更多个靶测量对象杂交；切割具有与一个或更多个靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；将cSSR与未杂交的SCP和杂交的TSR分离；以及检测来自cSSR的第一工程化多核苷酸标志物。
试剂盒可以包括：针对多于一个靶测量对象的第一多于一个序列转换探针(SCP)，其中每一个SCP包括被配置为与多于一个靶测量对象中的一个靶测量对象杂交的多核苷酸靶特异性区域(TSR)，其中TSR在亲和标签与信号特异性区域(SSR)之间，SSR包括第一工程化多核苷酸标志物；被配置为切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP的核酸酶；和包括与亲和标签特异性结合的结合配偶体的基底。
一种方法可以包括：使序列转换探针(SCP)的靶特异性区域(TSR)与混合物中的靶测量对象杂交；切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP，以将切割的序列特异性区域(cSSR)从SCP释放到混合物中；在存在环化剂的情况下使cSSR与锁探针杂交，以使cSSR环化为环化的SSR(cirSSR)；以及使用环化的SSR和被配置为与cSSR的一个或更多个引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增cSSR的一部分。
试剂盒可以包括：针对多于一个靶测量对象的第一多于一个序列转换探针(SCP)，其中每一个SCP包括被配置为与多于一个靶测量对象中的一个靶测量对象杂交的多核苷酸靶特异性区域(TSR)，其中TSR在亲和标签与信号特异性区域(SSR)之间，SSR包括第一工程化多核苷酸标志物；被配置为切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP的核酸酶；和包括与亲和标签特异性结合的结合配偶体的基底。
试剂盒可以包括：针对第一多于一个靶测量对象的第一多于一个序列转换探针(SCP)，其中每一个SCP包括：被配置为与第一多于一个靶测量对象中的一个靶测量对象杂交的多核苷酸靶特异性区域(TSR)，并且其中TSR在亲和标签与信号特异性区域(SSR)之间，SSR包括包含一个或更多个引物区域的第一工程化多核苷酸标志物；被配置为切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP的核酸酶；被配置为与第一正向引物区域杂交的第一正向引物和被配置为与第一反向引物区域杂交的第一反向引物；和包括与亲和标签特异性结合的结合配偶体的基底。
一种方法可以包括：将多于一组序列转换探针(SCP)与包括多于一个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一组SCP包括多于一个SCP，其中每一个SCP包括：多核苷酸靶特异性区域(TSR)、亲和标签以及包括工程化多核苷酸标志物和一个或更多个引物区域的信号特异性区域(SSR)，其中每一组SCP包括被配置为与不同靶测量对象和相同SSR杂交的多于一个不同的TSR；使多于一组SCP中的SCP的TSR与靶测量对象杂交；切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交SCP的SSR；使用亲和标签将cSSR与未杂交的SCP和杂交的TSR分离，以形成cSSR池；以及使用cSSR池和被配置为与cSSR的一个或更多个引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增工程化多核苷酸标志物。
数字PCR的方法可以包括：将遗传物质的混合物与序列转换探针(SCP)的混合物合并，其中SCP各自包括被配置为与遗传物质中的多于一个靶测量对象之一杂交的靶特异性区域(TSR)，以及包括一组工程化多核苷酸标志物之一的信号特异性区域(SSR)，所述一组工程化多核苷酸标志物各自指示靶测量对象的亚组；使SCP混合物的TSR与遗传物质中的靶测量对象杂交；切割具有杂交的TSR的SCP，以从杂交的SCP释放切割的信号特异性区域(cSSR)；使用与SCP的TSR相邻的亲和标志物去除任何未切割的SCP，以形成cSSR池；以及使用cSSR池和扩增cSSR的工程化多核苷酸标志物的对cSSR特异性的一个或更多个引物进行数字PCR。
数字PCR的方法可以包括：将遗传物质的混合物与序列转换探针(SCP)的混合物合并，其中SCP各自包括被配置为与遗传物质中的多于一个靶测量对象之一杂交的靶特异性区域(TSR)，以及包括一组工程化多核苷酸标志物之一的信号特异性区域(SSR)，所述一组工程化多核苷酸标志物指示与TSR杂交的靶测量对象位于哪个染色体上；使SCP混合物的TSR与遗传物质中的任何靶测量对象杂交；切割具有杂交的TSR的SCP，以从杂交的SCP释放切割的信号特异性区域(cSSR)；使用与SCP的TSR相邻的亲和标记去除任何未切割的SCP，以形成cSSR池；以及使用cSSR池和扩增cSSR的工程化多核苷酸标志物的对cSSR特异性的一个或更多个引物进行数字PCR。
试剂盒可以包括：序列转换探针(SCP)的混合物，其中SCP各自包括被配置为与来自多于一条人类染色体的多于一个靶测量对象之一/多于一条人类染色体中的多于一个靶测量对象之一杂交的靶特异性区域(TSR)，包括一组工程化多核苷酸标志物之一的信号特异性区域(SSR)(所述工程化多核苷酸标志物指示与TSR杂交的靶测量对象位于哪个染色体上)，其中工程化多核苷酸标志物的侧翼是正向引物区域和反向引物区域，以及SCP上不与SSR重叠的区域上的亲和标签；被配置为切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP的核酸酶；包括与亲和标签特异性结合的结合配偶体的基底；以及被配置为与第一正向引物区域杂交的第一正向引物和被配置为与第一反向引物区域杂交的第一反向引物。
一种方法可以包括：将多于一组环化序列转换探针(cSCP)与包括多于一个靶测量对象的样品混合物合并，其中cSCP的每一组包括多于一个cSCP，其中每一个cSCP包括：包括被配置为与第一靶特异性区域杂交的有义探针的第一末端、包括被配置为与第二靶特异性区域杂交的反义探针的第二末端以及包括包含正向引物区域和反向引物区域的工程化多核苷酸标志物的信号特异性区域(SSR)，其中cSCP的每一组包括相同的SSR和被配置为与不同的靶测量对象杂交的多于一个不同的第一靶特异性区域和第二靶特异性区域；使多于一组cSCP的cSCP与靶测量对象杂交以产生环化复合物；使环化复合物与环化剂接触以使环化复合物的cSCP环化；以及使用环化的cSCP和被配置为与cSSR的正向引物区域和反向引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增工程化多核苷酸标志物。
一种方法可以包括：将环化序列转换探针(cSCP)的多于一个亚组与包括多于一个靶测量对象的样品混合物合并，以形成合并的混合物，其中cSCP的每一个亚组包括多于一个cSCP，所述多于一个cSCP各自具有相同的信号特异性区域(SSR)，包括工程化多核苷酸标志物和被配置为与不同的靶测量对象杂交的一对靶特异性区域(TSR)；使cSCP的多于一个亚组的cSCP与靶测量对象杂交以产生环化复合物；使环化复合物与环化剂接触以使环化复合物的cSCP环化；使合并的混合物中的未环化的cSCP与外切核酸酶接触以切割未环化的cSCP；以及使用环化的cSCP和被配置为与SSR的一个或更多个引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增工程化多核苷酸标志物。
一种确定胎儿非整倍性的方法可以包括：将包括多于一个靶测量对象的母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物与多于一组环化序列转换探针(cSCP)合并，其中cSCP的每一组包括多于一个cSCP，此外其中每一个cSCP包括：包括对来自多于一个靶测量对象的特定靶测量对象特异性的第一靶特异性区域的有义探针的第一末端、包括对特定靶测量对象特异性的第二靶特异性区域的反义探针的第二末端以及包括指示与特定靶测量对象关联的人类染色体的工程化多核苷酸标志物的信号特异性区域(SSR)、正向引物区域和反向引物区域，其中cSCP的每一组包括相同的SSR和被配置为与不同的特异性靶测量对象杂交的多于一个不同的第一靶特异性区域和第二靶特异性区域；使多于一组cSCP中的cSCP与靶测量对象杂交以产生环化复合物；使环化复合物与环化剂接触以使环化复合物的cSCP环化；以及将cSCP以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得反应样品的至少一些包含cSCP，而一些不包含cSCP；分析在单独反应样品中cSCP的工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示在反应样品中推定整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示在反应样品中推定非整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字；通过比较所述第一数字与所述第二数字来确定胎儿非整倍性的存在或不存在。
一种方法可以包括：将引物偶联的靶特异性探针的多于一个亚组与包括多于一个靶测量对象的样品混合物合并以形成合并的混合物，其中每一个引物偶联的靶特异性探针包括被配置为与多于一个靶测量对象中的靶测量对象杂交的靶特异性区域和序列转换引物(SC引物)，其中引物偶联的靶特异性探针的每一个亚组包括相同的SC引物和多于一个不同的靶特异性区域；使引物偶联的靶特异性探针的靶特异性区域与靶测量对象杂交；切割与靶测量对象杂交的引物偶联的靶特异性探针以释放SC引物，而不释放未杂交的引物偶联的靶特异性探针的SC引物；使所释放的SC引物与序列转换模板(SCT)接触，并且使SC引物延伸以形成SCT的拷贝，其中SCT包括工程化多核苷酸标志物；将SCT的拷贝从SCT中取出(removing)；以及使用SCT的拷贝和被配置为与SCT拷贝上的一个或更多个引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增工程化多核苷酸标志物。
一种确定胎儿非整倍性的方法可以包括：将引物偶联的靶特异性探针的多于一个亚组与包括多于一个靶测量对象的母体遗传物质和胎儿遗传物质的样品混合物合并以形成合并的混合物，其中每一个引物偶联的靶特异性探针包括被配置为与多于一个靶测量对象中的靶测量对象杂交的靶特异性区域(TSR)和序列转换引物(SC引物)，其中引物偶联的靶特异性探针的每一个亚组包括相同的SC引物和多于一个不同的靶特异性区域；使引物偶联的靶特异性探针的靶特异性区域与靶测量对象杂交；使引物偶联的靶特异性探针与外切核酸酶接触，以将SC引物从与靶测量对象杂交的引物偶联的靶特异性探针释放，而不释放未杂交的引物偶联的靶特异性探针的SC引物；使所释放的SC引物与偶联至亲和标签的序列转换模板(SCT)的亚组杂交；使杂交的SC引物延伸以形成SCT的拷贝，其中SCT的拷贝包括工程化多核苷酸标志物；使用亲和标签将SCT的拷贝从SCT中取出；以及使用SCT的拷贝和被配置为与SCT拷贝上的一个或更多个引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增工程化多核苷酸标志物。
本文还描述了序列转换探针。例如，一种序列转换探针(SCP)可以包括：在15个与50个碱基对(bp)之间延伸的靶特异性区域(TSR)，其中TSR的多核苷酸序列仅与人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性；和包括SEQ ID NO.1的序列的序列特异性区域(SSR)，其中TSR连接至SSR。
一种序列转换探针(SCP)可以包括：在15个与50个碱基对(bp)之间延伸的靶特异性区域(TSR)，其中TSR的多核苷酸序列仅与人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性；和包括SEQ ID NO.1的序列的序列特异性区域(SSR)，其中SSR在序列内包括无碱基区域，此外其中TSR连接至SSR。
一种序列转换探针(SCP)可以包括：在15个与50个碱基对(bp)之间延伸的靶特异性区域(TSR)，其中TSR的多核苷酸序列仅与人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性；和序列特异性区域(SSR)，包括：与无碱基区域偶联的SEQ ID NO.10的多核苷酸，所述无碱基区域与SEQ ID NO.10的多核苷酸偶联，其中TSR连接至SSR。
序列转换探针(SCP)可包括：具有以下任一项序列的靶特异性区域(TSR)：SEQ IDNo.8、SEQ ID No.12、SEQ ID No.15、SEQ ID No.18、SEQ ID No.21、SEQ ID No.24、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.30、SEQ ID No.33、SEQ ID No.36、SEQ ID No.39、SEQ ID No.42、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.48、SEQ ID No.51、SEQ ID No.54、SEQ ID No.57、SEQ ID No.60、SEQ IDNo.63、SEQ ID No.66、SEQ ID No.69、SEQ ID No.72或SEQ IDNo.75；以及具有SEQ ID NO.1的序列的序列特异性区域(SSR)，其中TSR连接至SSR。
序列转换探针(SCP)可包括：具有以下任一项序列的靶特异性区域(TSR)：SEQ IDNo.8、SEQ ID No.12、SEQ ID No.15、SEQ ID No.18、SEQ ID No.21、SEQ ID No.24、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.30、SEQ ID No.33、SEQ ID No.36、SEQ ID No.39、SEQ ID No.42、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.48、SEQ ID No.51、SEQ ID No.54、SEQ ID No.57、SEQ ID No.60、SEQ IDNo.63、SEQ ID No.66、SEQ ID No.69、SEQ ID No.72或SEQ IDNo.75；以及包含SEQ ID NO.1的序列的序列特异性区域(SSR)，其中SSR在序列内包括无碱基区域，此外其中TSR连接至SSR。
序列转换探针(SCP)可包括：具有以下任一项序列的靶特异性区域(TSR)：SEQ IDNo.8、SEQ ID No.12、SEQ ID No.15、SEQ ID No.18、SEQ ID No.21、SEQ ID No.24、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.30、SEQ ID No.33、SEQ ID No.36、SEQ ID No.39、SEQ ID No.42、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.48、SEQ ID No.51、SEQ ID No.54、SEQ ID No.57、SEQ ID No.60、SEQ IDNo.63、SEQ ID No.66、SEQ ID No.69、SEQ ID No.72或SEQ IDNo.75；以及序列特异性区域(SSR)，包括：与无碱基区域偶联的SEQ ID NO.10的多核苷酸，所述无碱基区域与SEQ IDNO.11的多核苷酸偶联，其中TSR连接至SSR。
一种方法可以包括：使以上描述的任何一个序列转换探针(SCP)的SCP的靶特异性区域(TSR)与混合物中的靶测量对象杂交；切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP，以将切割的序列特异性区域(cSSR)从SCP释放到混合物中；在存在环化剂的情况下使cSSR与锁探针杂交，以使cSSR环化为环化的SSR(cirSSR)；以及使用环化的SSR和被配置为与环化的SSR的一个或更多个引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增cSSR的至少一部分。
一种方法可以包括：将多于一组序列转换探针(SCP)与包括多于一个靶测量对象的样品混合物合并，其中SCP组的SCP的至少一个是以上描述SCP的任何一个，此外其中多于一个SCP包括不同的TSR，并且其中SCP的每一组包括相同的SSR和被配置为与不同的靶测量对象杂交的多于一个不同的第一特异性区域和第二靶特异性区域；使TSR与靶测量对象杂交；切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；使cSSR的每一个与锁探针杂交以产生环化复合物；使环化复合物与环化剂接触以使cSSR环化；以及使用环化的cSSR(cirSSR)和被配置为与cirSSR的正向引物区域和反向引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增cirSSR的至少一部分。
一种确定胎儿非整倍性的方法可以包括：将包括多于一个靶测量对象的母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物与多于一组序列转换探针(SCP)合并，其中SCP的每一组包括多于一个SCP，此外其中SCP组的SCP的至少一个是以上描述SCP的任何一个，并且其中多于一个SCP包括不同的TSR，此外其中SCP的每一组包括相同的SSR和被配置为与不同的靶测量对象杂交的多于一个不同的第一特异性区域和第二靶特异性区域；使TSR与靶测量对象杂交；切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；使cSSR的每一个与锁探针杂交以产生环化复合物；使环化复合物与环化剂接触以使cSSR环化；并且将环化的cSSR以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得反应样品的至少一些包含cSSR，而一些不包含cSSR；分析在单独反应样品中cSSR的工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示在反应样品中推定整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示在反应样品中推定非整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字；通过比较所述第一数字与所述第二数字来确定胎儿非整倍性的存在或不存在。
本文描述的全部方法和设备(以任何组合)在本文中都是预期的，并且可以用于实现本文描述的益处。
附图简述
本专利或申请文件包含至少一幅以彩色制作的图。具有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将在依请求和支付必要费用后由主管局提供。
特别地，本发明的新颖特征在所附权利要求中陈述。通过参考以下详细描述和附图将获得对本发明的特征和优点的更好理解，该详细描述阐述了利用本发明的原理的说明性实施方案，在附图中：
图1A至图1C示出了如本文描述的序列转换方法的实例。图1A示出了使用序列转换探针(SCP)的用于将靶多核苷酸线性转换为可以使用核酸扩增和/或通过与一个或更多个探针杂交来检测的工程化多核苷酸的序列转换方法的实例。图1B是其中序列转换探针与标记偶联的序列转换方法的另一个实例。图1C是其中序列转换探针与基底(例如磁珠)结合的序列转换方法的另一个实例。
图1D示出了如本文描述的序列转换方法的另一个实例。图1D示出了与图1A中示出的实例类似的使用序列转换探针(SCP)用于将靶多核苷酸线性转换为可以使用核酸扩增和/或通过与一个或更多个探针杂交来检测的工程化多核苷酸的序列转换方法的实例。
图2示出了如本文描述的序列转换方法的用途，该方法使用序列转换探针上的共同信号特异性区域(SSR)的亚组将来自多个靶测量对象的信号整合为单个信号。
图3示意性地示出了序列转换方法的另一个实例，其中序列转换探针包括核糖以在靶特异性区域(TSR)与信号特异性区域(SSR)之间形成一个或更多个切割位点。该变化可以使用例如RNA酶H2。
图4是示出了使用序列转换方法诸如图3中示出的方法整合多个不同的靶测量对象的另一个实例。
图5是序列转换方法的另一个实例，该方法可以用于在检测多核苷酸靶(例如，染色体、基因等)时通过包括具有相同(例如，共同)信号特异性区域(SSR)和共有共同期望类别(例如，染色体、基因等)(在该实例中显示为共同染色体的不同等位基因)的不同靶测量对象的多个序列转换探针(SCP)增加灵敏度。这可以提供线性扩增。
图6A示出了序列转换方法的实例，其中靶测量对象是RNA并且RNA序列可以被转换为DNA序列。该反应可以由核酸酶例如双链体特异性核酸酶(DSN)驱动。在图6A中示出的变化中，序列转换方法可以允许在释放SSR(例如形成切割的SSR或cSSR)时，通过DSN破坏序列转换探针(SCP)的靶特异性区域(TSR)来扩增RNA。
图6B示出了与图6A中示出的实例类似的序列转换方法的实例，其中在使用双链体特异性核酸酶(DSN)作为序列转换方法的核酸酶时，通过在序列转换探针的靶特异性区域(TSR)中包括错配，靶测量对象(例如，RNA靶测量对象)不被回收。
图7A示出了如本文描述的序列转换探针(SCP)的实例，包括在序列转换探针的5’末端或3’末端具有亲和标签(例如生物素)的序列转换探针。
图7B示出了将序列转换探针切割为切割的靶特异性区域(cTSR)和切割或裂解的信号特异性区域(cSSR)的一个实例。图7B中的“R”可以是限制性位点或核糖。如果R是核糖，则SCP被优先地切割核糖核苷酸的核酸酶诸如RNA酶H2切割(例如，在与靶测量对象序列杂交后)。可选地，“R”可以指限制性酶的识别位点(例如，用于通过限制性位点切割)。
图7C示出了为RNA或DNA靶配置的序列转换探针(SCP)的实例。该图示出了(上图)被双链体特异性核酸酶(DSN)切割的SCP，该双链体特异性核酸酶可以完全降解杂交的靶特异性区域(TSR)，使切割的信号特异性区域(cSSR)保持完整。图7C还示出了在存在DSN的情况下，在TSR与靶测量对象之间存在错配时可能发生的部分(例如，不完全)降解。这样的错配可能是有意引入的。
图8示意性地示出了如本文描述的序列转换方法的用途，以通过扩增将RNA靶测量对象转换为信号特异性区域(SSR或cSSR)DNA，因为靶测量对象RNA可以在靶特异性区域(TSR)降解后与SCP重新杂交。扩增可以是受限制的并且可以是线性的；例如，扩增可能受对RNA靶测量对象特异性的SCP的量的限制。
图9示出了与图8中示出的实例类似但用于DNA靶测量对象的序列转换方法的用途，其中靶DNA测量对象被重复使用，而SCP通过转换为切割或裂解的SSR(cSSR)和降解的靶特异性区域(TSR)而被消耗。在图9中，使用的酶是RNA酶H2，并且TSR包括优先地被RNA酶H2切割的多于一个核糖核苷酸。在一些变化中，通过将单个裂解位点朝向TSR的中心放置，例如用于RNA酶H2的核糖或用于切口限制性酶的限制性位点，可以实现相同的效果。
图10示出了序列转换方法的另一个实例，其中DNA靶测量对象和TSR被降解(使用的核酸酶是双链DNA酶(dsDNA酶))，释放裂解或切割的信号特异性区域(SSR)。在序列转换方法的一些变化中，将靶测量对象转化为SSR而没有扩增(例如，以1:1的比例)可以是期望的。
图11示意性地示出了常规数字PCR(dPCR)定量染色体的用途，这需要大量的引物对和探针。在图11中，染色体多核苷酸(染色体C13、C18和C21)显示为实线；测定中使用的实际遗传物质可能被断裂为循环无细胞DNA。
图12示出了被配置为与数字PCR一起使用以检测染色体的序列转换方法的一个实例。与图11中示意性地示出的方法相比，序列转换方法仅需要少量引物(例如，一对)和对指示三条染色体(例如，C13、C18和C21)的每一条的三个SSR的每一条特异性的三个探针。
图13示出了如本文描述的序列转换方法用于检测短靶测量对象，诸如微RNA(例如，具有少于约40个碱基对例如38bp、35bp、32bp、30bp等的长度的多核苷酸，否则难以或不可能与其他检测技术诸如TaqMan测定一起使用)的用途。序列转换方法可以将短靶测量对象转换为可以直接检测或者可以被扩增和检测的信号特异性区域(SSR)。
图14示出了与图13中示出的实例类似的可以用于检测短靶测量对象的序列转换方法的另一个实例。杂交反应可以要求最小长度，使得寡核苷酸可检测。对于某些杂交测定太短的分析物可以转换为更长的分析物，成为对这些测定有用的基底。在图14中，切割的SSR可以通过与报告物探针(直接或间接)和/或捕获探针(直接或间接)结合来直接检测。
图15示出了序列转换方法的一个实例，其中核酸酶是核糖核酸酶H，诸如RNA酶H2(或RNA酶HII)。序列转换探针(SCP)可以包括在靶特异性区域中或在靶特异性区域与信号特异性区域之间的区域中的核糖。
图16示出了序列转换方法的一个实例，其中序列转换探针被配置为被限制性酶切割以释放信号特异性区域。限制性内切酶可以与靶特异性区域中的识别位点匹配。在图16中，限制性位点在这里被配置为被Bmtl-HF识别。可以选择其他限制性位点来适应其他限制性酶。
图17和图18示出了序列转换方法的一个实例，其中可以用于从序列转换探针的其余部分切割信号特异性区域的核酸酶是瓣状内切核酸酶(例如，FEN-1)或5’-3’核酸酶。
图19A-图19C示出了序列转换方法变化的一个实例，其中序列转换探针被配置为倒位探针(在一些变化中，挂锁探针)。在该实例中，序列转换探针包括在第一末端处的第一靶特异性区域(TSR1)和在第二末端处的第二靶特异性区域(TSR2)；TSR1和TSR2与靶测量对象的辅助区域(adjunct region)杂交。每一个探针包括可以是多个靶测量对象区域共同的靶特异性区域。图19A示出了序列转换探针的线性形式，其可以称为环化序列转换探针(cSCP)。在该实例中，cSCP包括有义TSR1、一对引物区域、信号特异性区域(SSR)和反义TSR2。图19B示出了图19A的cSCP与测量对象杂交，形成可以被环化的环化复合物，所述环化例如通过添加环化剂，诸如连接酶，诸如图19C中示出的。
图20示出了使用环化序列转换探针的序列转换方法的一个实例。在图20中，测定包括多于一个环化序列转换探针(cSCP)，适于用作数字PCR测定的部分，例如用于确定一条或更多条染色体的非整倍性。如示出的，靶向不同染色体上的特定靶测量对象的多组cSCP可以与样品遗传物质合并，并且可以形成环化的cSCP并且用作数字PCR程序的输入。这种配置可以是完全工程化SSR(例如，包括合成序列，不对应于来自靶的遗传物质)。
图21A示出了使用序列转换探针(SCP)(包括可以被锁探针和连接酶环化(形成环化的SSR或cirSSR)的信号特异性区域(SSR))的序列转换方法的实例。在图21A中，测定包括多于一个序列转换探针，在SCP的靶序列区域(TSR)与靶区域(例如测量对象的)杂交之后，该多于一个序列转换探针可以被限制性酶切割以释放信号特异性区域，该信号特异性区域可以被锁探针和连接酶环化以形成cirSSR。线性DNA(包括杂交的DNA)可以被消化，并且剩余的cirSSR可以被扩增和/或检测。这可以是数字PCR定量方法的部分，例如检测染色体倍性。
图21B更详细地示出了图21A中示出的环化和扩增步骤。
图21C示出了与图21B类似的另一个实例，其中切割的SSR被配置为可环化SSR(其可以在存在连接酶的情况下被锁探针环化)。在图21C中，SSR不一定包括单独的第一杂交区域和第二杂交区域(例如，Hyb1、Hyb2)，但是锁探针可以被配置为与SSR的末端杂交，其中末端可以包括探针区域和引物区域(例如，正向引物)。
图21D示出了可以用于本文描述的程序的工作流程(包括但不限于图21A的程序(例如，作为用于检测染色体倍性的方法的部分))的一个实例。
图21E示出了可以用于本文描述的一些方法的工作流程的实例。
图22A-图22B示出了被配置为引物驱动测定的序列转换方法的变化的实例。在该实例中，第一引物偶联的靶特异性探针被配置为与靶测量对象杂交并且被例如核酸酶切割，以释放序列转换引物(SC引物)，然后该序列转换引物(SC引物)用于选择性延伸序列转换模板(SCT)。然后可以将延伸的SCT(“SCT的拷贝”或cSCT)与未延伸的SCT分离，并且可以检测延伸的SCT，或拷贝上的信号特异性区域(SSR)。在图22A中，SC引物与加亲和标签的序列转换模板(SCT)合并，并且延伸以制备序列转换模板的拷贝。在图22B中，SC引物可以被加亲和标签，并且与环化的(“环状模板”)序列转换模板(SCT)杂交以形成序列转换模板(cSCT)的拷贝。cSCT可以与加亲和标签的SCT(和与原始遗传物质)分离，并且用于定量，例如通过直接定量或通过扩增(例如通过数字PCR等)。
图23A示出了如本文描述形成的包括SSR(在反向引物区域与正向引物区域之间具有无碱基区域)和包括BspQI关联限制性位点的TSR的SCP的实例。
图23B示出了如本文描述的SCP的实例，与图23A示出的实例类似，并且包括5`SSR探针取向。
图24示意性地示出了用于鉴定基因组(例如，人类基因组)内仅出现一次并且在如本文描述的已知染色体上的一个或更多个TSR的方法的一个实例。
图25示意性地示出了如本文描述的用于鉴定SSR的方法的一个实例。
与图21B类似的图26A-图26D示意性地示出了SSR锁探针(图26A)的一个实例，如本文描述的，其可以使用锁探针(图26B、图26C)环化并且用于定量遗传信号(图26D)。
图27示意性地示出了与本文描述的任何方法一起使用的鉴定SCP的方法的一个实例，该方法可以与确定组分SSR和TSR区域的方法一起使用，诸如在图24-图25中示出的。
图28示出了显示预测的二级结构的SCP的一个实例，其中TSR上用于II型限制性酶的关联限制性位点不在发夹环区域内或者以其他方式被阻断(或闭塞)，因为二级结构阻止与II型限制性酶的相互作用。
图29A示出了如本文描述的序列转换方法的第一部分的实例。在图29A中，用于将靶多核苷酸(靶测量对象)转换为工程化多核苷酸的序列转换探针(SCP)与待检查靶测量对象(例如，在图29A中显示为基因组DNA)的样品混合物合并。SSR仅从那些与靶测量对象杂交的SCP中通过消化杂交的SCP被释放(作为cSSR)。
图29B示意性地示出了来自图29A的cSSR转化为可以使用核酸扩增和/或通过杂交检测的序列(其不包括任何基因组，例如靶测量对象、序列)。在图29B中，通过连接将SSR延伸探针选择性退火至cSSR的3’末端，并且所得最终扩增子(cSSR+SSR延伸探针)是线性多核苷酸产物，该产物可以被检测以指示样品中靶测量对象的存在和/或量。
图29C示意性地示出了来自图29A的cSSR转化为可以使用核酸扩增和/或通过杂交检测的序列(其不包括任何基因组，例如靶测量对象、序列)的另一个实例。在图29C中，SSR延伸探针被添加至cSSR的3’末端，并且整个产物(cSSR+SSR延伸探针)被环化。可以检测所得环状SSR(cirSSR)以指示样品中靶测量对象的存在和/或量。
图30是示出如本文描述的序列转换方法的一个实例的扩增图。
图31A-图31B示出了如本文描述的序列转换方法的一个实例的扩增图。
图32A-图32C示出了如本文描述的序列转换方法的一个实例的扩增图，与图29A-图29D示出的实例类似。
详细描述
本文提供了用于检测和定量核酸的组合物、试剂盒和方法。本文中一些方法的实践和一些组合物的用途可以简化和改进通过测量其核酸定量的分析物(例如细菌、人类或其他染色体、基因、病原体等的定量)的检测和定量。本文公开内容提供了用于将多于一个测量对象转换为较小数目或甚至单个统一测量对象的方法。例如，本文公开内容提供了用于将染色体上存在的一个或更多个等位基因的多于一个不同核酸靶转换为单个测量对象的方法。因此，这种方法可以简化使用核酸扩增和杂交定量方法诸如数字计数方法的测定。它还可以改进这些方法的准确度。通过PCR进行非侵入性产前测试(NIPT)的当前技术水平将需要许多独特的引物和/或探针，因为每一个独特的测量对象需要两个独特的引物，并且可能还需要一个独特的探针。本文公开的方法和组合物将化学简化为几个或甚至少至一个引物对(2个引物)和3个用于检测13、18和21三体性的NIPT的独特探针。这种方法广泛适用于杂交定量方法。
本公开内容可以显著简化NIPT dPCR测定的设计，提供容易选择包括较短序列在内的靶测量对象序列的灵活性，将NIPT测定的复杂性降低到全部染色体的几个或甚至单个引物对，并且可以仅需要每个染色体单个探针，同时允许每个染色体上足够多的等位基因被靶向/测试，以满足实现所需临床性能所需的统计上的重复数。
本文描述的这种方法和组合物(包括试剂盒)可以仅需要两个引物和三个探针来允许数字PCR分析，从而产生干净的反应。以从1mL-2mL血浆中提取的母体DNA和胎儿DNA开始，以实现每条染色体13、18和21的100 000个计数，用常规方法估计需要600个引物和300个探针，对于200 000个计数需要1200个引物和600个探针。
这些简化增加了测定的稳健性，并且允许靶向大量序列，而不必担心引物/引物/探针相互作用引起非特异性反应。
定义：
如本文使用的：精确度是指测量值与特定值或正确值的接近程度(closeness)。分析物是指分析中感兴趣的物质，诸如特定染色体、特定病毒、特定细菌的核酸等。
分析物特异性SSR是指定义的分析物(例如特定染色体、特定病毒、特定细菌等)的共同信号特异性区域(SSR)序列。“分析物特异性SSR”与不同的“测量对象特异性TSR”连接在序列转换探针(SCP)上。这些序列转换探针(SCP)通过检测多于一个分析物特异性测量对象(例如染色体或病原体上的不同等位基因)来检测共同分析物。
非整倍性是指细胞中存在错误数目的染色体(例如，错误数目的完整染色体或错误数目的染色体区段，诸如存在染色体区段的缺失或重复)的状态。在人类细胞体细胞的情况下，它可以指细胞不包含22对常染色体和一对性染色体的情况。在人类配子的情况下，它可以指细胞不包含23条染色体的每一条之一的情况。在单一染色体类型的情况下，它可以指存在多于或少于两个同源但不相同的染色体拷贝的情况，或者存在源自同一亲本的两个染色体拷贝的情况。在一些实施方案中，染色体区段的缺失是微缺失。
在附图中，“B”是指亲和标签，包括(但不限于)生物素或另一种亲和标签。亲和标签可以允许去除不想要的部分，诸如在杂交和切割步骤之后的不想要的部分。
染色体是指完整染色体，或染色体的区段或部分。
CRISPR-Cas是指用于受控或可编程基因组工程化的系统。CRISPR是指成簇规律间隔短回文重复序列。Cas是在特定RNA(可以称为指导RNA)指定的位置处切割DNA的内切核酸酶。
cirSSR是来源于cSSR的环化的外切核酸酶抗性信号特异性区域(SSR)。
cSSR是序列转换探针(SCP)在切割诸如被核酸酶切割之后的信号特异性区域(SSR)。
cTSR是序列转换探针(SCP)在例如被核酸酶切割之后的靶特异性区域(TSR)部分。
数字PCR(dPCR)是常规qRT-PCR的一种替代方法，用于核酸分子的绝对定量和检测。dPCR通过将DNA或cDNA样品分区为许多单独的、并行的PCR反应起作用；这些反应中的一些包含靶核酸分子(阳性)，而另一些不包含(阴性)并且扩增样品。DNA或cDNA的单个起始分子可以被扩增一百万倍或更多。在扩增期间，使用染料标记的探针检测序列特异性靶。在不存在靶序列时，没有信号累积。PCR分析后，使用阴性反应的分数生成样品中靶分子数目的绝对计数，而不需要标准品或内源性对照。
双链体是指DNA:DNA双链或DNA:RNA双链。
锁探针是指在存在连接酶的情况下促进cirSIR形成的寡核苷酸。
术语“试剂盒”(或“各部分的试剂盒”)是指包括一个或更多个容器以及任选地数据载体的制造物品。一个或更多个容器可以填充有本文描述的一种或更多种试剂。试剂盒中可以包括另外的容器，其包含例如稀释剂、缓冲液和另外的试剂诸如dNTP。数据载体可以是非电子数据载体，例如图形数据载体，诸如信息手册、信息表、条形码或访问码，或者电子数据载体，诸如软盘(floppy disk)、光盘(CD)、数字通用光盘(DVD)、微芯片或另一种基于半导体的电子数据载体。访问码可以允许访问数据库，例如互联网数据库、集中式数据库或分散式数据库。数据载体可以包括在本文描述的方法中使用试剂盒的说明。数据载体可以包括截止值或参考水平。在数据载体包括允许访问数据库的访问码的情况下，阈值或参考水平被存储在该数据库中。此外，数据载体可以包括关于如何进行本公开内容中的方法的信息或指令。
如本文使用的，测量对象是指表示分析物的(或分析物中的)许多可能序列/等位基因之一的核酸。
测量对象特异性TSR是指测量对象特异性的靶特异性区域(TSR)。不同的“测量对象特异性TSR”可以连接至共同的“分析物特异性SSR”。
NIPT是指非侵入性产前测试，并且在某些情况下可以指对母体血液或血浆中的无细胞DNA的基于三体性的分析。
核酸或核酸分子是指DNA和/或RNA。
核酸酶是指通过破坏核酸中核苷酸之间的键来降解核酸的酶。核酸酶可以作用于DNA(DNA酶)和/或RNA(RNA酶)。双链体特异性核酸酶(DSN)选择性地切割核酸双链体(DNA/DNA)或异源双链体(例如RNA/DNA)中的DNA。双链体特异性核酸酶可以保持一条链或一条链的部分完整。许多核酸酶商购可得，并且包括但不限于：限制性酶、5’-3’核酸酶、RNA酶H、RNA酶H2、RNA酶HII、RNA酶V、双链体特异性核酸酶(DSN)、λ外切核酸酶、T7外切核酸酶、外切核酸酶III、RecJf、外切核酸酶I、外切核酸酶T、外切核酸酶V、BAL-31核酸酶、绿豆核酸酶、DNA酶I、微球菌核酸酶、T7内切核酸酶I、T5外切核酸酶、Cas9及其任何组合。关于核酸酶及其底物的信息可以见于以下中：例如，Mishra,Nawin C；(Nucleases:Molecular Biologyand Applications,Wiley-Interscience(ISBN:978-0-471-39461-7)。另外的感兴趣的核酸酶包括但不限于：RNA酶V1(例如，用于切割dsRNA)、寡核糖核酸酶(例如，用于切割寡核苷酸)、外核糖核酸酶II(例如，用于切割成熟miRNA)。
寡核苷酸是指2个核苷酸至约500个核苷酸例如2个核苷酸至200个核苷酸的单链多聚体。寡核苷酸可以是合成的或者可以是酶促制备的，并且在一些实施方案中，长度小于10个至50个核苷酸。寡核苷酸可以包含核糖核苷酸单体(即，可以是寡核糖核苷酸或“RNA寡核苷酸”)或脱氧核糖核苷酸单体(即，可以是寡脱氧核糖核苷酸或“DNA寡核苷酸”)或化学接头。寡核苷酸的长度可以是例如10个至20个、11个至30个、31个至40个、41个至50个、51个-60个、61个至70个、71个至80个、80个至100个、100个至150个或150个至200个、多达500个或更多个核苷酸。
挂锁探针是指包括通过可能携带可检测功能的接头连接的两个靶互补区段的寡核苷酸。线性寡核苷酸探针的两个末端通过与靶序列杂交而处于并置(例如锁探针)。这种并置允许两个探针区段通过DNA连接酶的作用共价连接。如本文使用的，挂锁探针可以是特定类型的倒位探针，其中在探针末端处的靶互补区域之间不存在空位(例如，在杂交时靶互补区域跨越整个靶区域，不保持空位)。通常，倒位探针可以不包括空位(如在挂锁探针中)或者可以包括空位(例如，1bp的空位、2bp的空位、3bp的空位等)。具有较大空位(例如，>2-5bp、>2bp、>3bp、>4bp、>5bp等)的倒位探针可以称为连接器倒位探针(connectorinversion probe)。
引物是指单个DNA分子(DNA寡聚体)或其中DNA分子相同或接近相同的DNA分子的集合(DNA寡聚体)，并且引物包含设计为与靶向的基因座(例如靶向的多态性基因座或非多态性基因座)杂交的区域，并且可以包含设计为允许PCR扩增的引发序列。
R指一个或更多个核糖核苷酸或其他核苷酸类似物或限制性酶的识别位点；它们可以在与核酸靶杂交时允许位点特异性切割。
SCA是指序列转换方法。
SCORE是指序列转换反应。序列转换反应将核酸“转换”为不同的形式(有时称为“代表物(proxy)”)。
SCP是指序列转换探针。
SSR是指信号特异性区域。
序列是指DNA序列或遗传序列。它可以是指个体中的DNA分子或链的主要物理结构。它可以是指在该DNA分子中发现的核苷酸序列，或者DNA分子的互补链。它可以是指作为其计算机模拟表示的包含在DNA分子中的信息。
受试者是指任何生物体，诸如脊椎动物，特别是任何哺乳动物，包括人类和另一哺乳动物两者，例如动物，诸如啮齿动物、兔或非人灵长类动物(例如猴)。啮齿动物可以是小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或毛丝鼠。在一些实施方案中，受试者是怀孕人类女性。
底物是指酶作用的物质。例如：
T21、T18、T13分别是指染色体21、染色体18、染色体13的三体性。
TSR是指靶特异性区域。独特的靶特定区域表示独特的测量对象。(例如特定等位基因序列)
分析物可以通过测量值的总和来定量，例如，分析物人类染色体21潜在地包括由跨越染色体21的数千个可检测序列表示的数千个测量对象。染色体21具有～48兆字节的长度。这在理论上表示平均长度为100个碱基的480,000个独特的测量对象。
该方法在一些实施方案中使用连接至“测量对象特异性TSR”[对染色体上的独特序列/等位基因特异性]的“分析物特异性SSR”[意指例如染色体特异性SSR]。
序列转换方法
图1A示出了序列转换方法(例如，进行序列转换反应的方法)的一个实例，该方法用于通过将来自靶测量对象的感兴趣的靶转换为不同的形式，例如，可以充当靶测量对象的代表物的工程化“信号特异性区域”(SSR)，并且然后检测信号特异性区域(代表物)来检测感兴趣的靶。在一些实施方案中，靶测量对象可以是例如染色体等位基因的部分。图1A中示出的方法利用具有以下的至少两个不同功能结构域的序列转换探针(SCP)：第一，靶特异性区域(TSR)被配置为与靶的测量对象杂交，并且第二，信号特异性区域(SSR)被工程化为可容易地扩增和/或检测的。
图1A示出了序列转换探针(SCP)的靶特异性区域在适当的退火条件下与靶测量对象(例如，感兴趣的染色体的部分)杂交，形成靶-序列转换探针复合物(靶-SCP)。靶-序列转换探针复合物(靶-SCP)具有其中靶测量对象和序列转换探针的靶特异性区域(TSR)杂交的双链区域，和单链区域，即信号特异性区域(SSR)。在与靶测量对象复合时，序列转换探针(SCP)包括核酸酶识别位点，并且将靶-序列转换探针复合物(靶-SCP)暴露于核酸酶导致在核酸酶识别位点处切割序列转换探针(SCP)，并且在该实例中形成靶和序列转换探针的靶特异性区域(TSR)杂交的双链区域和单独裂解掉的单链区域，即信号特异性区域。尽管靶测量对象显示为多核苷酸片段，但它可以是任何尺寸，并且可以是更长的多核苷酸链的部分。靶测量对象可以是任何适当的多核苷酸，并且SCP可以适于与特定类型的靶(例如，RNA、DNA、寡核苷酸长度等)一起使用。
图1A中的亲和标签显示为生物素(B)，并且其结合配偶体链霉抗生物素蛋白(SA)与固体基底(例如磁珠或微量滴定板)的一个实例偶联。序列转换探针(SCP)可以用亲和标签标记，以帮助去除不想要的序列转换探针形式；特别是，它们可以被标记在靶特异性区域上。磁珠上的链霉抗生物素蛋白将与核酸上的生物素亲和标签结合。生物素标记的核酸可以是单链未裂解的SCP或从序列转换探针裂解的靶特异性区域(其可以与靶测量对象杂交)。因此，可以从反应中去除未裂解的序列转换探针(SCP)(以及在该变化中的靶DNA)。可以使用磁场将链霉抗生物素蛋白包被的磁珠和结合的生物素化DNA与信号特异性区域分离。例如，裂解的信号特异性区域可以从磁珠上去除(或者反之亦然)，诸如通过使用磁体或自旋柱来分离磁珠。可以分析溶液中信号特异性区域的存在，以确定原始样品中靶测量对象的存在或不存在。可以使用任何适当的检测方法。例如，在图1A中，可以使用扩增和检测或杂交和检测。可以使用核苷酸扩增技术(包括但不限于数字PCR)进行扩增和检测。扩增可以使用一个或更多个引物，诸如在一些变化中的正向引物(引物a)和反向引物(引物b)。在一些变化中，这种扩增可以通过使用荧光标志物来定量，诸如包括具有荧光团(R)和猝灭剂(Q)的探针的Taqman测定。可以使用其他扩增检测技术。
也可以使用裂解的SSR(cSSR)的直接可视化。例如，图1A示出了使用附接或被制成附接至固相并且被配置为与信号特异性区域杂交的捕获探针的杂交和检测。可选地或另外地，如示出的，可以使用被配置为结合(例如杂交)SSR(或SSR和捕获探针的组合)的信号探针。信号探针可以包括信号标记，诸如荧光标记。捕获探针和/或信号探针可以通过退火与SSR杂交，和/或它们可以通过其他分子相互作用特异性结合。例如，一个或更多个探针可以是抗体探针(或抗体的部分，诸如Fab片段等)、适配体探针等。
SSR可以被工程化为具有预定长度或长度范围、多核苷酸含量(例如GC比例等)和/或序列。特别是在其中使用多个不同SSR，指示不同的特定靶测量对象(单个测量对象)或者鉴定靶测量对象组(例如，按基因、按染色体、按遗传途径、按病原体、指示癌症的突变等分组)的变化中，SSR可以彼此不同，但是可以被工程化为具有类似的功能特性，诸如解链温度、引物区域、长度等。这可以有助于防止在检测(例如，扩增和/或结合)期间以其他方式可能发生的偏倚。
这些测定的任何一种，包括图1A中示出的测定，都可以包括使用多个SCP和/或SCP的亚组。SCP的每一个亚组可以包括相同的SSR和不同的TSR，这将在下文更详细地描述。在一些变化中，从SCP释放(切割或裂解)的SSR可以是未标记的或未直接标记的。在其他变化中，SSR可以是直接标记的。例如，图1B示出了另一种序列转换方法，该方法可以用于通过将靶测量对象转换为工程化信号特异性区域(SSR)，并且然后检测SSR来检测感兴趣的靶测量对象。该反应与图1A中描述的序列转换反应类似，除了序列转换探针的信号特异性区域用可以用于检测信号特异性区域代表物DNA的可检测报告物基因预标记。在图1B中，cSSR与固相结合(例如，使用捕获探针)，并且直接成像，或与成像剂反应。SSR可以与可以直接成像(例如荧光团)或间接成像(例如酶促报告物，诸如HRP等)的报告物偶联。
图1C示出了与图1A-图1B中示出的序列转换方法类似的序列转换方法的另一种变化。在该实例中，SCP最初与固相(例如，显示为磁珠)结合并且与遗传物质(包括一个或更多个靶测量对象)组合。在这种变化中，然后可以使SCP与靶测量对象杂交，并且可以使用核酸酶裂解SCP，释放多核苷酸信号特异性区域(SSR)，而杂交的靶特异性区域(TSR)连同未裂解(和未杂交)的SCP一起通过亲和标签保持与固体基底结合。因此，多于一个SCP可以连接至基底。在将切割的SSR与切割的TSR和未裂解的SCP分离之后，切割的SSR可以如以上描述，例如通过核酸扩增技术(诸如，但不限于PCR、数字PCR等)和/或杂交来检测。
在图1A中，序列转换探针(SCP)用与靶特异性区域(TSR)上或相邻的一个(或更多个，如下文描述的)亲和标签(例如，生物素)来生物素化。如图7A中描述的，TSR亲和标签可以在SCP的5’末端或3’末端处。在一些变化中，如图1D中示出的，在3’末端处包括TSR和亲和标签可以是特别有益的，其中SCP使用从3’末端延伸至5’末端的技术(例如化学寡核苷酸合成)来合成，使得亲和标签诸如生物素可以首先添加至3’末端。这可以确保每个SCP(和SCP的每个TSR)都是生物素化的，即使存在不完整的SCP。如果亲和标签在合成结束时添加(例如，在一些变化中，在SCP的5’末端处)，则可能形成不完整的SCP(例如，如果合成在添加亲和标签之前终止)。因此，3’生物素化可以降低或消除潜在地显著的背景或假阳性来源，否则其可能由未通过亲和标签被去除的SCP引起。如以上提及的，消除不完整的并且因此未加标签的(通过亲和标签)SCP的另一种可能的方法将是仅使用与固相表面，诸如磁珠结合的SCP，如图1C中示出的；这些可以被清洗以去除未加标签的SCP。
未通过亲和标签被去除的SCP的遗留潜在地是显著的，因为它们没有成功地与亲和标签偶联，或者因为在核酸酶处理后未切割的SCP没有通过亲和标签被充分保留和/或去除(参见，例如，图1A-图1B)。在这些实例中，以其他方式指示阳性信号的通过核酸酶切割从SCP释放的SSR与通过许多检测技术(包括PCR)衍生的未切割的SCP不可区分。任何未切割的SCP遗留入随后的TaqMan或dPCR都可能增加背景并且影响测定性能。对于一些超灵敏的临床应用，诸如，如本文描述的NIPT，即使微小水平的SCP遗留也可能导致无法忍受的背景信号。
SCP遗留并且因此背景的两个潜在来源包括未与亲和标签结合的序列转换探针(如截短的SCP可能发生的)和包括亲和标签但保持未结合的序列转换探针(如较低亲和力或较低保留结合可能发生的)。SCP遗留的问题特别重要，因为在高度灵敏的应用诸如NIPT中，确保最终信号仅由释放的SSR生成可能是至关重要的。如本文的一些变化中描述的，在序列转换反应用于NIPT时，这样的测定可能包含每条染色体～200或更多不同的SCP，以实现显著的临床性能。例如，在cfDNA中，1ml血浆中每个靶向的等位基因可能存在～1,000个基因组拷贝，导致每条染色体200,000个SSR分子。在100μl中每一个SCP的浓度为50pM(或每条染色体大约6×1011个SCP分子)，存在3×106的SCP:释放的SSR的比值(每条染色体)。对于NIPT，对于具有4％胎儿比例的样品，来自两条染色体的聚集释放的SSR(aggregatereleased SSR)少至2％的差异应该是理想可检测的。因此，可以计算会导致无法忍受的背景水平的SCP遗留的最大水平。合理的规格可能是，可归因于所期望的释放的SSR的正常与三体性之间的信号差异少于10％可能来自未裂解的SCP的遗留。这转换为非常严格的耐受性：10％(最大背景规格)×2％(4％胎儿比例的拷贝数差异)×200,000(每条染色体的SSR分子)＝耐受400个分子的遗留SCP。400个遗留的完整SCP分子转换为需要去除400/6×1011或SCP的99.9999999％以便在所期望的范围内分辨信号。这种严格的耐受性在实践中可能是高度要求的。
本文描述了可以解决这一问题的方法和组合物(包括试剂盒)。通常，作为这些方法和组合物的部分提供的SCP可以用不同构型的亲和标签(诸如生物素)标记：在5’末端处、内部或在3’末端处(以及在一些变化中，内部)。5’末端和3’末端生物素化在图7A中描述。商购可得的HPLC纯化的寡核苷酸(oligos)通常纯度少于95％，许多杂质是5’截短的种类。基于亚磷酰胺的寡核苷酸合成发生在3’至5’方向，并且从3’末端处的可控孔隙玻璃(CPG)酰胺开始。如果亲和标签或标记(在本实例中是生物素)被放置在3’末端处，这意味着合成可以从CPG-生物素开始。如果标签被放置在5’末端处，它是从CPG固体支持物裂解和去保护以及随后纯化之前添加的最后一个亚磷酰胺。在这种情况下，仅全长寡核苷酸携带5’生物素。合理地假设，即使高度纯化的5’-生物素化的SCP可能包含>1％的未生物素化的截短的污染物(该污染物可以通过例如PCR可检测)，因此引起背景信号。未生物素化的SCP可能不被链霉抗生物素蛋白包被的磁珠去除，因为它们缺乏结合所需的生物素。由于在合成的SCP探针中1％的杂质水平不能用链霉抗生物素蛋白(SA)珠去除，这些杂质可能导致6×109个分子(例如，6×1011分子的1％)，引起背景。
然而，在其中SCP的全部都用如以上描述合成的3’生物素标记的变化中，探针的全部都将具有3’生物素。因此，这可以是优选的标记构型。例如，参见图1D。在该实例中，如指示的合成SCP寡核苷酸，在3’末端处添加亲和标签(例如生物素)，并且化学寡核苷酸合成的方向从3’末端进行至5’末端。因此，即使存在截短的(例如，不完全合成的)SCP，如最左侧示出的，这些截短的SCP仍然在3’末端处生物素化。在与测量对象靶退火(与图1A中示出和以上描述的类似)和核酸酶处理后，信号特异性区域(SSR)通过切割与测量对象杂交的那些SCP被释放。然后，如示出的，裂解的TSR和未裂解的SCP通过使用亲和标志物诸如链霉抗生物素蛋白珠与固相基底结合被去除。所得阳性信号(未结合的SSR)可以与全长SCP以及任何截短的SCP分离，允许精确的扩增和/或检测，如示出的(例如，通过PCR)。
可选的变化在以上图1C中示出。如以上提及的，来自未生物素化的SCP杂质(例如，不包括亲和标志物的截短的SCP)的背景也可以通过将SCP与亲和配偶体预结合，诸如与链霉抗生物素蛋白(SA)珠预结合，随后大量洗涤来避免，如图1C中示出的。如果SCP合成为带有添加在3’末端处的亲和标签，这可以消除SCP的截短形式。因此，可以去除全部未生物素化的探针。如以上对于图1C描述的，可以将与SA珠(预包被珠)结合的SCP添加至提取的cfDNA。基因组靶序列可以与固相探针杂交。杂交步骤可能需要更长时间。任选地，可以在限制性消化期间添加另外的SA珠，以结合从初始SA珠释放的任何生物素-SCP。
如果期望更大的特异性，可以在SCP上5’末端附近包括添加的亲和标签(例如，正交亲和标签)，诸如地高辛，以排除截短的杂质。它必须是正交的(即不是生物素)，使得3’生物素-SCP不被去除。它可以在5’PO4末端附近，但不在5’PO4末端处，使得其不抑制连接。
通常，这些方法和组合物的任何一种都可以包括多个亲和标签，包括多个生物素基团。例如，多个生物素基团可以顺序添加至SCP的5’末端，或者在一些变化中添加至SCP的3’末端。为了增加结合强度，SCP结合亲和配偶体(例如，SA)的亲合力可以通过使用每个SCP的多于一个亲和标签(例如生物素)来增加。亲合力是指个体非共价结合相互作用(诸如抗体与抗原之间)的多种亲和力的累积强度，并且通常称为功能亲和力。为了增加亲合力，可以在SCP上添加多个(例如两个至四个)生物素标签，该生物素标签可以与每个链霉抗生物素蛋白(SA)上的四个结合位点相互作用。理论上，如果全部四个生物素都参与结合，Kd将是大约10-60M，对于以上描述估计的严格性来说绰绰有余(more than sufficient)。
即使生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用的亲和力极强，具有最佳情况下的10-15M的解离常数(Kd)，少量的生物素-SCP探针可能仍然保持未结合，因为即使这种极强的相互作用仍然是结合与未结合种类之间的平衡。未结合的生物素-SCP的理论水平在预期的反应条件下在报告的Kd(10-15M)和低10倍的Kd(10-14M)计算，如表1中示出的。
Figure BDA0004113276060000541
表1的最后一行示出了在例如SCP的3’末端上包括四个生物素的理论效果。
存在多种熟知的生物素修饰(其可以添加至3’末端、5’末端或者放置在内部，诸如标准品(C6接头)生物素、生物素-dT(其可以放置在内部))和导致两个功能生物素基团的双重生物素修饰(其作用是增加生物素-链霉抗生物素蛋白结合亲和力，并且可以用于需要高灵敏度的应用)，如以上描述的。
本文描述的任何方法和组合物(例如，试剂盒)可以提供SCP的裂解，以释放紧邻或尽可能接近(例如，在1bp内、在2bp内、在3bp内、在4bp内等)与测量对象杂交的TSR的SSR，这取决于使用的核酸酶。例如，如本文描述的，可以使用限制性酶。限制性酶可以特异性裂解双链DNA。裂解特异性可以通过切割与单链SSR的转换尽可能接近的双链TSR-靶DNA来增强。通过将切割位点工程化为尽可能接近双链DNA至单链DNA的Y-相交处(例如，TSR-SSR边界)，可以增强DNA切割的特异性。在一些变化中，可以使用II型限制性酶，诸如BsaI或BspQI，II型限制性酶在其识别序列之外靠一侧裂解，并且因此允许裂解更接近从双链TSR至单链SSR的Y-转换。在一个实例中，考虑到酶学需要，切割位点可以移动至相交处的两个碱基内。例如，可以通过在TSR-SSR边界处靶向作为TSR部分的BspQI识别位点来使用BspQI。
在序列转换方法(和包括序列转换方法的测定)的任何一种中，针对多种靶测量对象并且包括不同SSR的亚组的多个SCP可以用于按由共同SSR鉴定的类别或类型整合不同靶测量对象的组。
例如，这些测定的任何一种都可以包括多于一个不同的序列转换探针(SCP)，该序列转换探针(SCP)可以与包括靶测量对象的遗传物质样品混合物合并。合并的混合物可以称为测定混合物。如以上描述，每一个SCP可以包括多核苷酸靶特异性区域(TSR)、亲和标签和信号特异性区域(SSR)。SSR包括工程化多核苷酸标志物。SCP可以被配置为与多个(x)不同靶(例如，可以具有不同的TSR)杂交。在多于一个SCP中，其靶序列(例如靶RNA、靶DNA等)共有共同类型或类别的不同TSR可以具有相同的SSR。因此，不同SSR的数目(y)可以少于TSR的数目(例如，存在SSR的多达2倍或更多的TSR，多达3倍或更多、多达4倍或更多、多达5倍或更多、多达6倍或更多、多达7倍或更多、多达8倍或更多、多达9倍或更多、多达10倍或更多、多达15倍或更多、多达20倍或更多、多达25倍或更多、多达30倍或更多、多达40倍或更多、多达50倍或更多、多达100倍或更多、多达200倍或更多、多达300倍或更多等)。因此，这些测定可以是简化测定(reductive assays)，将大量不同的靶测量对象简化为较少数量的统一SSR(uniform SSRs)(例如，工程化多核苷酸标志物)。统一SSR可以被配置为表示一个类别，靶测量对象的亚组是该类别的成员。
图2示出了测定的一个实例，其中三个不同的测量对象(靶1、靶2、靶3)都共有共同信号特异性区域(SSR)。因此，共同SSR的检测，例如通过检测每一个SSR上的工程化多核苷酸标志物，可以发送存在靶1、靶2或靶3的任何一种的信号。该方法可以将三个序列简化为单个序列。其他整合是可能的，并且另外的SSR可以用于同一溶液(例如，同一测定混合物)中的不同靶测量对象。图4示出了使用序列转换方法的另一种变化的类似简化。在该实例中，靶1和靶2整合为第一SSR(SSR 1)，而靶3被转换为第二SSR(SSR 2)。此外，在该实例中，SCP可以包括TSR中或与TSR相邻的核糖(其提供用于裂解SCP的位点，例如通过RNA酶H2(其与RNA-DNA双链体特异性结合并且裂解RNA链)裂解SCP的位点)；SCP中的核糖被RNA酶H2识别为RNA链，并且因此可以被裂解。
图3示出了使用特异性切割DNA-RNA复合物的核酸酶的测定的操作原理。在图3中，在SCP的靶特异性区域(TSR)与靶测量对象(这里显示为DNA靶)杂交时，该测定使用RNA酶H2核酸酶将SSR从SCP裂解。如以上讨论的，SCP包括核糖，在与靶测量对象结合时，形成RNA酶H2的裂解位点。通常，RNA酶H2与RNA-DNA双链体结合并且裂解RNA链。释放的切割的SSR(cSSR)可以包含TSR序列部分的一小部分(这是由RNA酶H2对裂解的特定需要引起的)，并且此外也可以是测定设计的部分。在图3中，该方法与图1A中描述的序列转换方法类似，除了核酸酶识别位点是序列转换探针的靶特异性区域中本来是DNA的核糖(“R”)。核酸酶RNA酶H2与RNA-DNA双链体结合(在这种情况下在“R”处)并且在RNA(“R”)处裂解序列转换探针，破坏序列转换探针的靶测量对象和靶特异性区域(TSR)与单链区域、裂解的信号特异性区域或cSSR杂交的双链区域。在该实例中，cSSR包含靶特异性区域(TSR)的一小部分。裂解的信号特异性区域可以使用扩增和检测或杂交和检测来分析，诸如图1A中示出的，或者可以用信号标记预先标记，诸如图1B中示出的并且进行分析。
这些实例(例如，图2和图4)示出了本文描述的序列转换反应如何可以用于使用相同的信号特异性区域代表物DNA测定多个不同的靶。图2示出了三个不同的靶特异性区域(TSR)，每一个靶测量对象(靶1、靶2和靶3)一个。在该实例中，全部三个序列转换探针的SSR是相同的；该序列对全部三个序列转换探针是共同的。该测定可以遵循图1A-图1C中示出的步骤，并且示出的反应可以在单个反应容器中进行。由于全部三个(或更多)反应产生相同的信号特异性区域(SSR)，检测步骤，例如扩增和检测或杂交和检测，可以针对SSR(或多于一个SSR，其可以被工程化为具有类似的检测特性，包括共有引物、共同长度范围等)进行优化。虽然此处显示的是三个靶测量对象，该序列转换方法可以延伸至多于3个靶测量对象(例如，多达4个、多达5个、多达10个、多达20个、多达50个、多达100个、多达500个、多达750个、多达1000个、多达1200个、多达1500个、多达2000个等，至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少20个、至少50个、至少100个、至少500个、至少750个、至少1000个、至少1200个、至少1500个、至少2000个等，包括这些数字之间的任何数字)。为了进行测定，每一个序列转换探针可以包括工程化多核苷酸标志物，该工程化多核苷酸标志物可以包括(或者可以是SSR的另一个可能相邻的区域的部分)一个或更多个引物区域。如以上提及的，对于SCP的亚组(或在一些变化中的全部)，SSR可以是相同的。因此，SCP的亚组可以具有不同的TSR，并且可以对应于共有将它们放置到一个类型(检测类型)的特性的TSR的亚组。
靶测量对象的检测类型的实例包括染色体(例如，同一染色体上的不同基因或染色体组)、基因(例如，同一基因的不同等位基因)、遗传途径(例如，遗传途径中的不同基因)、外显子(例如，同一基因的不同外显子)、病原体(例如，共同病原体，包括病毒的不同基因/等位基因等)、已知驱动癌症(例如肺癌)的不同突变等。靶测量对象的任何分组都可以被包括在共同的工程化SSR中。
例如，对于用于非侵入性产前测试的测定，SCP的多于一个亚组可以对应于不同的染色体，使得对于每一个染色体(在每一个亚组内)，多于一个不同的TSR可以针对单个染色体的不同部分并且共有相同的SSR。
图5示出了序列转换方法的另一个实例，其中多个序列(多个靶测量对象)是相同靶(例如，病原体)的等位基因，并且全部SCP具有不同的TSR，但是共有相同的信号特异性区域(SSR)。通过靶向靶诸如病原体的若干个等位基因(子序列)，可以增加检测灵敏度。可以使用RNA和/或DNA靶。在该实例中，示出了用于检测和定量人类染色体13的SSR，例如，用于检测三体性13，尽管该原理可以延伸至任何类别(例如，染色体、基因、途径、病原体、癌症突变等)或感兴趣的DNA的其他区域，并且可以用于检测染色体添加(例如，三体性)、缺失和正常。在该实例中，SSR包括工程化多核苷酸标志物(“C13探针”)和引物可以与之杂交的正向引物区域(共同引物1)和反向引物区域(共同引物2)。在实践中，对于染色体13上的不同靶测量物(C13等位基因1、C13等位基因2和C13等位基因n)，可以使用具有不同序列转换探针(SCP)的多个不同SCP。C13等位基因n表示可以包括任何数目(n)的另外的序列转换探针。不同的C13探针的SSR是相同的。不同的SSR可以用于另一个测量对象，诸如用于另一条染色体或染色体13的另一部分。该方法与图2中示出的方法类似，除了每一个序列转换探针包括用于如以上描述被RNA酶H2裂解的核糖(R)，可选地它可以包含限制性酶的识别位点。可以使用其他核酸酶(有或没有核糖)。由于C13等位基因1、C13等位基因2和C13等位基因n反应产生相同的SSR，在测试另外的组(例如，染色体)时，检测步骤(例如，扩增和检测或杂交和检测)可以针对单个SSR或一个类别的SSR进行优化。在一些变化中，该序列转换方法可以延伸至多于3个靶(例如，多达4个、多达5个、多达10个、多达20个、多达50个、多达100个、多达500个或至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少20个、至少50个、至少100个、至少500个等，至这些数字之间的任何数字)，和/或具有不同SSR的任何另外数目的亚组。
图6A示出了序列转换方法的另一个实例，其被配置为使用双链体特异性核酸酶(DSN)检测RNA靶。该实例还示出了RNA靶测量对象转换为DNA信号特异性区域(SSR)。在图6A中，RNA靶测量对象与具有靶特异性区域(TSR)的SCP杂交，并且这种杂交允许DSN将SSR从SCP裂解，释放SSR(到切割的SSR或cSSR)并且进一步降解SCP的TSR。这也将RNA靶测量对象释放回到溶液(例如混合物)中，在那里它可以再次与SCP的另一个拷贝结合并且释放cSSR。这可以线性扩增RNA靶测量对象(进入DNA cSSR)；扩增可能受到SCP浓度和/或杂交/退火条件(包括温度)的限制。类似的方法可以用RNA酶H2用于DNA/DNA双链体(例如，使用DNA测试)，其中TSR包括如描述的多种核糖核酸酶(例如，在图9中)。
在一些变化中，将靶物质(例如，RNA靶测量对象)从反应中去除可以是期望的。图6B示出了这样做的方法的一个实例，其中通过在RNA靶测量对象的碱基与序列转换探针的TSR之间包括一个或更多个(例如，多于一个)错配，在核酸酶(DSN)切割释放cSSR之后，RNA靶测量对象被阻止释放。DSN将完全匹配的短DNA-DNA双链体(10bp-12bp)与具有至少一个错配的相同长度的双链体区分开。例如，DSN需要至少10bp的DNA或15bp的DNA-RNA完全双链体用于裂解。因此，在图6B中，使用与RNA靶测量对象的工程化错配可以仅允许TSR的部分降解，使得靶测量对象可以保持与TSR杂交，并且可以如以上描述与cSSR分离。
图1A-图6B中描述的序列转换探针通常包括靶特异性区域(TSR)和信号特异性区域(SSR)两者，如图7A中示出的。如以上描述的，TSR和SSR可以组合，并且TSR部分可以与亲和标签偶联。亲和标签和TSR可以在5’末端或3’末端处，SSR在相对的末端处，如图7A中示出的。通常，SSR是合成序列，它被配置为不与样品中的遗传物质结合。SSR可以包括工程化多核苷酸标志物。该标志物可以是任何长度，例如在30bp与500bp之间(例如在40bp-400bp之间、在40bp-300bp之间、在40bp-200bp之间、在约50bp-90bp之间、在约50bp-80bp之间等)，并且可以相邻和/或可以包括一个或更多个引物区域(一个或更多个引物可以与其杂交)用于扩增和/或检测。例如，在一些变化中，工程化多核苷酸标志物的侧翼可以是正向引物区域。
图7B示出了序列转换探针(SCP)的实例，该序列转换探针(SCP)被配置为与DNA一起使用，并且包括一个或更多个核糖核苷酸。例如，在一些变化中，DNA靶测量对象的SCP可以被核酸酶诸如RNA酶H2裂解(在与其靶测量对象杂交时)。在图7B中，核糖核苷酸在序列中由“R”表示，R也可以代表限制性酶的识别位点。这些SCP的任何一个也可以包括一个或更多个化学接头。如图7B中示出的，核糖核苷酸的位置可以在TSR上在RNA酶H2活性限制内选择。
图7C示意性地示出了用于与DNA或RNA靶测量对象一起使用的SCP的实例。如以上图6A和图6B中描述的，在TSR与靶测量对象杂交并且使用核酸酶诸如DSN时，在释放裂解的SSR(cSSR)时，TSR可以被降解。在其中TSR包括部分错配的一些变化中，在SCP已经被DSN裂解之后，部分降解的区域可能不会降解。
如以上提及的，在仅TSR被降解(例如，被DSN或RNA酶H2)时，完整的靶测量对象可以被释放并且允许与SCP的另一个拷贝杂交。这在图8中被示出，显示双链体特异性核酸酶(DSN)与扩增反应一起使用。图9示出了使用RNA酶H2的并行变化，其中DNA靶测量对象可以被循环以扩增信号(cSSR)。在图9中，当RNA酶H2或类似的核酸酶(其降解RNA/DNA双链体的RNA)时，可以通过TSR中的一个或更多个核糖核苷酸实现扩增，以允许更完全的降解。如果仅使用单个核糖核苷酸，可以调节探针的Tm和/或反应温度，以在探针裂解之后解离靶测量对象，并且允许通过将靶测量对象与另一个序列转换探针(SCP)重新结合来扩增。
可选地，图10示出了其中通过使用双链DNA酶(dsDNA酶)用TSR降解DNA靶测量对象，使切割的SSR(cSSR)保持完整的实例。在一些变化中，在靶测量对象与SSR之间提供1:1的转换可以是期望的。例如，然后可以扩增SSR，而不是原始的靶测量对象，并且SSR可以被工程化为防止扩增偏倚。限制性酶通常裂解DNA双链体的两条链，从而破坏靶测量对象，并且确保1个靶测量对象正好释放1个SSR。
例如，本文描述的方法和组合物(例如，试剂盒)的任何一种可以用于向包括数字PCR的程序提供输入，以提供定量数据。
本文描述的方法和组合物也可以用于检测非常短的靶测量对象序列。例如，图13示出了一种用于鉴定短(例如，30bp或更小)靶测量对象的方法。短靶测量对象序列(例如30个碱基或更小)可能难以用现有的测定，诸如TaqMan测定检测，其需要两个引物和一个探针，并且多于60个碱基的靶测量对象长度是期望的，以容纳两个引物和一个探针所需的空间。因此，这种非常简单的测定可能不容易用于较小的多核苷酸，诸如微RNA。在图13中，SCP被配置为使得SCP包括靶特异性区域(TSR)，该靶特异性区域(TSR)被配置为与小的(例如，30bp)靶测量对象杂交；然后暴露于核酸酶可以释放信号特异性区域(SSR)，该信号特异性区域(SSR)显著更长(例如，100bp)，并且可以包括位于工程化多核苷酸标志物侧翼的引物结合区域(引物结合区域1和引物结合区域2)。如示出的，TaqMan探针和引物可以与工程化多核苷酸标志物和侧翼引物区域杂交，以允许检测(例如，在扩增期间，通过从猝灭剂Qu附近释放报告物标记Re)。如以上描述的，未杂交的SCP可以通过亲和标签去除。
类似的技术可以用于小靶测量对象的直接检测，如图14中示出的。在该实例中，短靶测量对象可通过与报告物探针杂交来检测。短靶测量对象序列(例如，例如30个碱基)也可能难以通过高度灵敏且特异性杂交技术(诸如“nCounter System”，其需要长度～100个碱基的靶测量对象)检测。通常，在附图中(除非另有说明)，探针和组分的尺寸仅用于说明目的，并且可以适应测定的需要。
在图14中，SCP包括与小的(30bp或更少)靶杂交的靶特异性区域(TSR)，并且在暴露于核酸酶时释放(更长的)信号特异性区域(SSR)。释放的SSR可以与未杂交的SCP分离并探测，例如使用报告物探针(例如，用报告物标记进行标记的)并且在一些变化中使用捕获探针，如示出的。
如以上提及的，在一些变化中，本文描述的用于进行序列转换方法的方法可以包括限制性内切核酸酶作为核酸酶。例如，图16中示出了这一点。在该实例中，核酸酶的识别位点可以是序列转换探针(SCP)的靶特异性区域(TSR)的部分。在图16中，限制性位点位于靶测量对象序列区域的5’末端附近。因此，靶测量对象可以被选择为包括限制性酶识别位点的特定亚组之一(在图16中，该位点是Bmtl-HF识别位点)，在SCP与靶测量对象结合后，该位点可以用于容易裂解SCP的信号特异性区域(SSR)。超过280种限制性酶是商购可得的(例如，来自New England Biolabs)，允许选择不同的识别位点和其他酶特性。在一些变化中，酶(限制性内切核酸酶)可以在一定的温度范围(37℃-70℃)工作，BsaI就是一个实例。本文描述的方法在选择靶序列时可以提供足够的灵活性，使得人们可以根据生物信息学选择适合酶的序列识别位点。可以使用不同的长度识别位点，并且可以避免非特异性切割。
通常，靶特异性区域可以被设计为使得与靶测量对象的结合是最佳的。例如，TSR可以被配置为与至少5mer结合，并且可以针对基因组的编码(基因)部分。序列可以被限制为包含至少一半GC(对于6mer为3个至6个)。在鉴定良好的靶测量对象区域时，重复的区域(例如，多拷贝区域)可以是优选的，因为它们可能增加总信号，或者如果例如期望精确的染色体计数，则可能被避免。
图17-图18示出了序列转换方法的另一个实例，其中核酸酶是5’-3’核酸酶。5’-3’核酸酶可以是DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)的部分。在该实例中，在靶测量对象在存在5’-3’核酸酶的情况下与靶特异性区域结合时，信号特异性区域被释放，如图17-图18中示出的。该实例中的亲和标签在SCP的3’末端上，使得未杂交的SCP可以与释放的SSR分离，如以上描述的。作为5’-3’核酸酶的替代物，可以使用瓣状内切核酸酶(例如FEN-1)。
图19A-图19C和图20示出了序列转换测定的另一个实例。在该变化中，序列转换探针被配置为倒位探针(inversion probe)(例如挂锁探针)，其可以以与以上描述的SCA的其他实施方案类似的方式使用。序列转换探针的这种变化可以称为环化序列转换探针(cSCP)。例如，cSCP可以包括一对靶特异性区域(在该实施方案中是一对位于末端的靶特异性区域)和信号特异性区域(SSR)。信号特异性区域还可以包括用于与引物杂交的一个或更多个引物区域。例如，在图19A中，示意性地示出了SCP，并且包括对靶测量对象的靶子序列特异性的R1(第一靶特异性区域，TSR 1)和R2(第二靶特异性区域，TSR 2)。TSR1可以是有义的，并且TSR2可以是反义的，使得在与靶测量对象杂交时(如图19B中示出的)SSR与靶测量对象形成环化复合物。环通过连接闭合，并且剩余的线性探针可以用外切核酸酶清理。cSCP还包括第一引物区域(PB1，与引物1杂交)和第二引物区域(PB2，与引物2杂交)，以及SSR的工程化多核苷酸标志物(TAG)部分，对于一些变化，其可以被配置为例如TaqMan探针结合位点。
例如，在一些变化中，cSCP可以被配置为与NIPT一起使用，并且可以包括作为染色体上选择的靶序列的第一靶特异性区域和第二靶特异性区域(例如，R1和R2)。PB1和PB2可以是通用引物(例如，一对)，并且TAG区域可以是用于每一条染色体的特异性TaqMan探针(例如，总计3个，染色体13、18和21各一个)。
在使用中，cSCP可以如图19B中示出的与靶测量对象杂交，形成环化复合物。这种复合物可以通过使用环化剂诸如连接酶进行环化，如图19C中示出的。
图20示出了使用针对不同染色体的多于一个不同cSCP的测定(例如，NIPT测定)的一个实例。在图20中，多组(n组)cSCP被添加至包括多个靶测量对象的遗传物质混合物中。cSCP的每一组可以具有共同共有的SSR(SSRn)，以及多对靶特异性区域(例如，x组靶特异性区域，有义区域和反义区域两者)。这些多组cSCP可以与遗传物质合并并且杂交，以在靶测量对象上形成环化复合物。然后可以添加环化剂(例如，连接酶)来使那些已经与靶测量对象杂交并形成环化复合物的cSCP环化。然后，未环化的cSCP可以被核酸酶诸如降解单链cSCP的外切核酸酶降解。然后可以测定剩余的环化的cSCP，以确定存在哪些标志物，以及以何种比例或量存在。例如，可以使用各种SSR区域(n个SSR区域)如以上描述地使用数字PCR方法。图20中描述的cSCP确保完全合成的SSR。与挂锁探针不同，来源于该cSCP的扩增子不包含任何靶序列。
使用其中序列转换探针被配置为倒位探针(例如挂锁探针)的序列转换测定可以是特别有利的。如以上提及图1D描述，在一些变化中可能需要非常严格的耐受性，特别是在适于用于与NIPT一起使用的变化中，如本文描述的。包括环化SSR的序列转换测定可以解决这种需要，特别是在全部未环化的DNA(包括杂交的多核苷酸和未杂交的多核苷酸)都可以被消化和去除(例如，通过使用核酸酶，诸如DNA酶、外切核酸酶等)的情况下。这种方法可能不一定依赖于亲和标志物(例如，SA-生物素)SCP清理，并且在一些变化中可能不包括SCP上的亲和标志物。任选地，可以包括亲和标志物。
如以上描述的，在一些变化中，SSR可以被工程化，使得SSR仅在与SCP分离并且环化之后变得PCR可检测的，例如，通过包括彼此远离而不是彼此朝向取向的引物(图21B)。这还可以确保最终信号仅由已环化的释放的SSR(例如，切割的SSR)生成。通常，如以上描述的，SSR可以包括工程化多核苷酸标志物；不同的SCP可以包括相同的SSR，提供其中多个靶特异性区域(例如，全部都形成更高阶关系，诸如同一染色体、同一基因、同一等位基因等)的简化测定可以与相同的SSR输出偶联。在SSR仅在与SCP分离并且环化之后变得PCR可检测的情况下，外切核酸酶清理步骤变得是任选的，因为线性(未环化)SSR不能被扩增并且生成信号。
图21A示出了实现这样的实施方案的方法的一个实例。在图21A中，切割的SSR由释放的SSR形成受保护的单链DNA环(闭环倒位探针)。这种环化的SSR(cirSSR)对外切核酸酶处理是耐受的，允许随后通过外切核酸酶降解完整的线性SCP，如图21A中示出的。该反应是高度特异性的，因为SCP不能环化；在SSR从SCP释放时，它可以被环化。
例如，在图21A中，SCP包括SSR区域和TSR区域(如以上描述的，其可以对准在3’末端处或在5’末端处的TSR取向)。任选地，TSR可以与亲和标志物偶联(或可以包括)亲和标志物；在一些变化中，不包括亲和标志物。如果包括亲和标志物，亲和标志物可以用于与固相(例如链霉抗生物素蛋白包被的磁珠)结合，如以上提及图1B描述的。SCP还可以包括序列特异性区域(SSR)，该序列特异性区域(SSR)被配置为通过用核酸酶切割释放之后被环化，如图21A中示出的。在该实例中，在切割的SSR与锁探针杂交并且与连接酶合并时，切割的SSR环化形成环化的SSR(cirSSR)。为了使线性cSSR环化，可以将其与特定的锁探针杂交，允许cSSR在与其DNA靶杂交后在通过限制性酶活性从SCP释放之后的连接酶介导的环化。锁探针包括识别切割的SSR的5’末端和3’末端的区域(其中一个末端以倒位取向与切割的SSR的末端互补，并且相对末端以非倒位取向与切割的SSR的另一个末端互补，使得切割的SSR以环形方式杂交)。在连接之后，可以任选地添加一种或更多种核酸酶(例如，外切核酸酶)来消化线性DNA，包括完整的SCP。环化的SSR不会被消化线性DNA的一种或更多种酶切割，并且可以用于去除未切割的SCP以及靶DNA(测量对象DNA)和TSR。然后在下游PCR或dPCR中扩增环状cSSR，而没有未消化的SCP的非特异性信号贡献。仅可以检测环状SSR，例如使用SSR中取向为使得它们仅在SSR环化时被扩增，产生可检测的探针的引物区域，如图21A中示出的。如以上提及的，除了环化和外切核酸酶消化之外，任选的亲和标签(即生物素)可以用于一个或更多个另外的清理步骤。在引物位点之间将限制性位点工程化到SSR中可以是有益的，该限制性位点允许在PCR开始之前用限制性酶线性化cirSSR。
通常，在图21A中示出的方法中使用核酸酶(例如内切核酸酶，例如DNA酶)是任选的(由虚线箭头指示)。因为SSR上引发区域的方向仅在SSR已经被切割和环化后才被正确取向，所以即使在存在未环化的SSR(包括完整或截短的SCP)的情况下，扩增和/或检测可以是足够特异性的。
图21B示出了切割的SSR从包括如本文描述的倒位探针的序列转换探针的环化的更详细的实例。在图21B中，切割的SSR被工程化为包括5’杂交末端区域(第一杂交区域，Hyb1)和3’杂交末端区域(第二杂交区域，Hyb2)以及正向引物区域和第二引物区域和探针区域。任选地，第一杂交区域(Hyb1)可以包括正向引物结合区域的部分，并且第二杂交区域(Hyb2)可以包括探针结合区域的部分，如图21C中示出的。这种在杂交区域中使用正向引物和/或探针结合区域的部分的任选设计导致与具有单独杂交和引物结合区域的SSR相比长度降低的SSR。由于SSR的完全合成和工程化性质，这种任选的设计是可能的。如本文描述的，工程化探针区域可以是可以用于检测切割的SSR的合成区域(例如，工程化的、非天然存在的区域)。在图21B中，切割的SSR可以包括正向引物区域(用于与第一正向引物杂交)和反向引物区域(用于与第二反向引物杂交)。在切割的SSR中，正向引物和反向引物可以串联布置。这些区域可以取向为使得在环化后(如图21B中示出的，在与锁探针杂交以及连接以使切割的SSR环化后)，正向引物和反向引物可以朝向彼此取向，允许复制(例如扩增)切割的SSR中包括探针的区域。在图21B中，这由最终扩增子示出，该最终扩增子包括5’末端处的正向引物区域和3’末端处的反向引物区域，而探针在正向引物与反向引物之间。在一些变化中，探针可以包括或掺入Hyb1和Hyb2的一种或两者。因此，在该实例中，SSR的挂锁结构仅在与SCP分离并环化之后才变得PCR可检测。在图21B中示出的连接的环化的倒位探针(在一些变化中其可以是挂锁探针)中，环化的SSR中示出的星形表示连接的切口，这可以允许PCR引物跨越连接的接点(the ligated junction)扩增。在一些变化中，探针可以被配置为包括TaqMan探针结合区域。如描述的，为了进一步改进特异性，引物区域(用于与引物杂交)和探针区域可以以这样的方式布置在SSR上，即它们仅在环化之后变得PCR可扩增，形成挂锁探针。挂锁布置可以依赖于切割的SSR环化，并且即使在存在SCP的情况下也可以产生特定的cSSR信号。该系统可以是高度特异性的，因为在切割的SSR呈线性形式时，与SSR中的正向引物区域和反向引物区域杂交的引物可以指向错误的方向(例如，彼此远离)，但在环化的切割的SSR构型中可以指向正确的方向(例如，朝向彼此)。在图21A-图21C中，倒位和/或挂锁探针被配置为与基因组靶中未发现的序列杂交。相比之下，杂交序列来源于合成靶(synthetic target)。
图21D示出了如本文描述的方法(例如，工作流程)的一个实例。该方法可以与如描述的环状cSSR一起使用。在该实例中，该方法并入了图21A中描述的一般方法，其中序列转换探针被配置为倒位探针；特别是，在该变化中，SCP包括被配置为由锁探针环化的SSR。锁探针对于全部切割的SSR可以是通用的(例如，具有不同工程化鉴定(探针)区域的SSR的3’末端区域和5’末端区域可以是相同的)；可选地，不同的切割的SSR可以具有可以被使用的不同锁探针(例如，作为锁探针池的部分)。
在图21D中，工作流程可以通过向室(例如，孔或管)添加包括靶测量对象的混合物开始2101；该混合物可以包含例如母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物(例如，如来自母体血液样品)。该物质可以是胎儿DNA和母体DNA的提取物(例如，图21D中提取的DNA的50μL部分)。可以将SCP物质添加至包括测量对象的混合物2102。SCP物质可以是例如包括多于一个不同靶特异性区域(TSR)的SCP混合物的部分，其中不同的TSR被分为共有相同SSR的两个或更多个亚组，如以上描述的。例如，在图21D中，可以将20μL的SCP混合物添加至混合物中并且加热以使DNA解链(例如，加热至大约95℃)，然后冷却(例如，至大约50℃)以允许TSR与混合物中的测量对象杂交2102。杂交后，可以将核酸酶(例如，限制性酶)添加至混合物2103，以切割已经与测量对象杂交的任何SCP。例如，可以添加10μL限制性酶并且孵育1小时(例如，在50℃)，随后热灭活限制性酶(在80℃20分钟)；这可以通过切割SCP来释放SSR。然后可以(一起或顺序地)添加一个或更多个锁探针和连接酶以使SSR环化2104。例如，在图21D中，可以添加20μL连接酶和一个或更多个锁探针，并且在50℃孵育2小时。在一些变化中，在环化后，混合物中的线性DNA可以被消化2105，例如通过(任选地)添加核酸酶(例如，10μL外切核酸酶)并且孵育(例如在37℃1小时，随后在例如80℃热灭活20分钟)。然后可以取所得混合物的样品2106用于检测和/或扩增(例如，100μL至110μL上清液的5μL至10μL样品可以用于如本文描述的一个或更多个dPCR程序)。注意，在材料被添加至如图21D中示出的孔或管中时，混合物可以任选地被混合(搅拌、涡旋等)。
该工作流程(其在该实例中不依赖于生物素链霉抗生物素蛋白的清理)对于切割的SSR扩增可以是高度特异性的，并且在使用破坏未切割的SCP的外切核酸酶消化时，可以防止可能由未切割的SCP以其他方式产生的全部或大部分背景。
与如本文描述的序列转换方法一起使用的工作流程的另一个实例，与图21D的工作流程类似，在图21中示出。如在图21D中，在图21E中，这些量(以μL表示)仅为示例性的；可以使用其他体积。类似地，温度和时间仅是实例，并且可以被修改。在图21E中，序列转换探针被配置为被切割以释放切割的SSR(例如，cSSR和/或短cSSR)。所得cSSR可以保持线性，或者其可以被环化。在一些实例中，可以使用锁探针将另外的引物，诸如SSR延伸探针连接至末端(例如3’末端)。
在图21E中，工作流程可以通过将待测试的混合物添加至室(例如，孔或管)开始，以鉴定靶测量对象的存在和/或量；该混合物可以包含例如母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物(例如，如来自母体血液样品)。该物质可以是胎儿DNA和母体DNA的提取物(例如，图21E中提取的DNA的50μL部分)。可以将SCP物质添加至潜在包括测量对象的混合物。SCP物质可以是例如包括多于一个不同靶特异性区域(TSR)的SCP混合物的部分，其中不同的TSR被分为共有相同SSR的两个或更多个亚组，如以上描述的。例如，在图21E中，可以将10μL的SCP混合物添加至样品混合物中并且加热以使DNA解链(例如，加热至大约95℃)，然后冷却(例如，至大约50℃)以允许TSR与混合物中的任何测量对象杂交。杂交后，可以将核酸酶(例如，限制性酶，例如II型限制性酶)添加至混合物，以切割已经与测量对象杂交的SCP，释放切割的SSR(cSSR)。例如，可以添加10μL限制性酶并且孵育1小时(例如，在50℃)，随后热灭活限制性酶(在80℃20分钟)。任选地，具有cSSR(例如，短CSSR)的混合物可以通过添加链霉抗生物素蛋白磁珠、通过将链霉抗生物素蛋白磁珠与包括cSSR的混合物分离来去除未裂解的SCP和切割的TSR来清理。
在一些实例中，如下文更详细描述的，然后可以添加一个或更多个锁探针、SSR延伸探针和连接酶(一起或顺序地)以将SSR延伸探针连接至短cSSR的末端。在一些实例中，这可以产生环状cSSR(cirSSR)；可选地，cSSR(包括短cSSR和SSR延伸探针的“长cSSR”)可以保持线性。例如，在图21E中，可以添加10μL连接酶和一个或更多个锁探针，并且在50℃孵育2小时。在一些实例中(例如，在环化时)，混合物中的线性DNA可以被消化，例如通过(任选地)添加核酸酶(例如，10μL外切核酸酶)并且孵育(例如在37℃1小时，随后在例如80℃热灭活20分钟)。然后可以取所得混合物的样品用于检测和/或扩增(例如，70μ-80μL上清液样品可以用于如本文描述的一个或更多个dPCR程序)。注意，在材料被添加至如图21E中示出的孔或管中时，混合物可以任选地被混合(搅拌、涡旋等)。这种工作流程对于切割的SSR扩增可以是高度特异性的，并且可以防止可能由未切割的SCP产生的全部或大部分背景。
序列转换方法的另一个变化示于图22A和图22B中，并且包括引物驱动的序列转换方法。在本文描述的序列转换方法的引物驱动变化中，引物偶联的靶特异性探针(PCTSP)可以用于最初与靶杂交，并且在靶测量对象存在时释放引物(序列转换引物或SC引物)。PCTSP一旦与靶测量对象杂交，就被核酸酶(例如外切核酸酶)裂解以释放SC引物。然后SC引物可以引发包括信号特异性区域(SSR)的序列转换模板(SCT)的延伸，形成序列转换模板(cSCT)的拷贝。SCT包括亲和标签(在图22A中示出为生物素)，或者在一些变化中可以通过亲和标签或其他方式与固相基底结合。可以将SCT与拷贝的SCT分离，并且然后拷贝的SCT可以通过扩增检测或通过直接检测来检测。例如，在一些变化中，序列转换模板(cSCT)的拷贝可以通过数字PCR(例如，如以上描述的针对SSR区域)进行分析。
图22B是图22A中描述的方法的另一个变化，其中相同的引物偶联的靶特异性探针可以用于生成如以上描述的SC引物，然而引物可以与环状(而不是线性，如图22A中示出的)序列转换模板(SCT)的互补SC区域杂交。如图22B中示出的，SC引物可以与环状单链SCT杂交以产生序列转换模板的拷贝(cSCT)，其在单个引物驱动复制时(取决于测定条件)可以具有SSR的多个拷贝。这可以提供检测的一些扩增。
在图22B中示出的变化中，引物偶联的靶特异性探针(PCTSP)的SC引物区域包括亲和标签。因此，环状模板的拷贝(环状序列转换模板的拷贝)各自在掺入SC引物的末端(在图22B中，5’末端)处掺入亲和标志物。然后可以将加亲和标签的cSCT与环状序列转换模板分离，并且在例如数字PCR测定中进行测定。
通常，本文描述的方法和组合物可以允许将一个寡核苷酸序列转换为另一个，包括将若干个寡核苷酸序列转换为一个序列。这方面的实例可以包括将RNA转换为DNA、将长序列转换为短序列、将短序列转换为长序列、将第一序列转换为另一序列、增加分析物的表观拷贝数等。
通常，工程化SSR序列可以被指定为具有靶测量对象序列所不具有的期望的特性。因此，这些方法和组合可以将许多序列简化(例如，转换、翻译)为少数序列，例如，将它们整合为单个序列。如本文描述的，这可以将靶序列的长度改变为使其可检测或更容易检测的长度。例如，PCR扩增子通常需要具有一定的长度以适应正向引物和反向引物，并且在TaqMan PCR的情况下，需要另外的探针结合区域。用于检测多核苷酸的现有技术通常受多核苷酸尺寸的限制，通常需要约100个碱基或更长的靶区域长度，这使得较短的DNA靶或RNA靶(例如，例如25个碱基或更小)难以被容易检测到。本文描述的方法和组合物可以实现这样的靶的检测。
SCP可以以任何适当的方式合成。SCP探针可以例如通过偶联已经预先制造的若干种不同的多-mer(multi-mers)来制备。例如，将SSR作为单个构建模块或若干个构建模块添加可能是有利的，因为它将是恒定的，并且化学连接不一定是核苷酸或DNA。它可能包括任何其他化学接头。从结构角度来看，SCP不需要是100％寡核苷酸。
序列转换方法的另一个变化在图29A-图29D中示出。在该实例中，该方法包括是包括靶特异性区域(TSR)和信号特异性区域(SSR)的多核苷酸的序列转换探针(SCP)。SSR可以是可环化SSR。SSR包括第一工程化多核苷酸标志物，该第一工程化多核苷酸标志物包括一个或更多个引物区域(在本实例中显示为正向引物FB，但它可以是反向引物RP)。SSR的5’末端可以包括连接阻断剂，诸如5’OH、5’生物素、5’倒位碱基、5’地高辛、5’D-碱基、3’PO4、3’生物素、3’倒位碱基，3’D-碱基。在图29A中，SCP的5’末端的连接阻断剂显示为5’D。SCP的3’末端包括一个(或更多个)生物素。
在本文描述的方法的任何一种中可以一起使用多于一个SCP。多于一个SCP可以包括配置为与不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，而该(第一)多个SCP中的SCP的每一个可以包括相同的SSR，如以上描述的。在图29A中，SSR称为“短SSR”，因为它稍后可以与SSR延伸探针退火，如下文描述的。SSR可以包括无碱基区域或其他阻止转录的区域(由黑色圆圈显示的功能区域)。SSR(短SSR)的一个末端或两个末端可以被配置为与接头或锁探针杂交，分别如图29B和图29C中示出的。
在图29A中，将SCP添加至样品混合物，以测试一个(或在一些实例中，更多个)靶测量对象的存在。如本文描述的，靶测量对象可以是基因组(例如，染色体)靶，并且混合物可以包括待测试的样品。如果样品中存在对应于TSR的靶测量对象，则SCP可以杂交(通过退火)，使得TSR区域与本实例中示出的靶测量对象和基因组靶测量对象杂交；如以上描述的，可以使用任何适当的测量对象。核酸酶(诸如但不限于II型限制性酶)可以用于切割SCP，释放切割的SSR(cSSR)。任选地，可以使用链霉抗生物素蛋白(例如，磁性链霉抗生物素蛋白珠)清洗样品，以去除未切割的SCP和切割的TSR，如示出的。然后所得cSSR(或“短cSSR”)可以如图29B(线性产物)或图29C(环状产物)所示进行处理。
任选地，在一些实例中，可以将SSR延伸探针添加至短cSSR的末端(例如，3’末端)。在图29B中，添加SSR延伸探针连同锁探针(其也可称为接头探针)，以将SSR延伸探针连接至短cSSR的3’末端，以便形成可以检测的最终扩增子。SSR延伸探针可以包括第二引物区域(例如，包括反向引物RP或正向引物FP)，在图29B中示出包括反向引物。图29B中的SSR延伸探针的3’末端包括连接阻断剂(这里显示为3’P*)，以防止不适当/不期望的连接。在该实例中，锁探针与短cSSR和SSR延伸探针二者杂交。然后所得最终扩增子可以使用针对第一引物区域和第二引物区域的引物来扩增，如示出的。图29B示出了线性最终扩增子。可选地，在一些实例中，最终扩增子可以是环状的，如图29C中示出的。
在图29C中，如同在图29B中一样，可以将SSR延伸探针添加至切割的(“短”)SSR(短cSSR)的末端。在该实例中，cSSR包括第一引物区域(包括FP或RP)和探针区域。转录中断区域(显示为矩形)可以存在于第一引物区域与SSR的5’末端之间，诸如无碱基区域。该实例SSR的5’末端还包括连接阻断剂。与图29B中一样，还包括SSR延伸探针。这些实例的任何一个中的锁探针也可以是一个末端或两个末端上的连接阻断剂(如图29B和图29C中示出的)。短cSSR可以用锁探针环化，使得SSR延伸探针连接到所得环化的cSSR(cirSSR)中。然后可以如以上描述检测cirSSR，在第一(例如正向)引物区域与第二(例如反向)引物区域之间形成最终扩增子，如示出的。
SSR延伸探针的使用是任选的，并且可以用于显著降低背景，这在一些实例中可以是特别有帮助的。通常，SSR延伸探针可以包括适当数目的核苷酸(例如，在6个与40个之间或更多个)，并且序列可以是对第二引物区域特异性的。
图21E中示出的工作流程可以与以上示出的图29A-图29C中示出的技术一起使用。图21E中示出的方法可以并入图29A-图29C中描述的一般方法，其中序列转换探针被配置为被切割以释放可以使用锁探针与SSR延伸探针退火的短切割的SSR(短cSSR)。所得SSR可以保持线性，或者它可以被锁探针环化。锁探针对于全部切割的SSR可以是通用的(例如，具有不同工程化鉴定(探针)区域的SSR的3’末端区域和5’末端区域可以是相同的)；可选地，不同的切割的SSR可以具有可以被使用的不同锁探针(例如，作为锁探针池的部分)。
实施例
本文描述的序列转换方法(例如，使用描述的SCP探针)可以用于多种不同技术和/或作为其的部分。例如，这些方法可以与dPCR一起使用用于应用，包括(但不限于)：通过使用cffDNA的数字染色体计数检测非整倍性、用于肿瘤学的体细胞突变组、综合征病原体组等。
例如，用于肿瘤学的体细胞突变组可以有利于检测癌基因诸如EGFR、KRAS、BRAF中的许多已知癌症驱动体细胞突变(cancer driver somatic mutations)，以帮助指导治疗选择或癌症筛查。这样的突变在文献中是已知的，并且可以存在于多种数据库(例如COSMIC)中。人们将用多个SCP探针使SCP与来自基因A的感兴趣突变位点(例如EGFR)杂交，每一个SCP探针具有独特的TSR，但全部都具有共同SSR(例如用于FAM标记的探针的探针结合位点)。TSR将与感兴趣的突变(例如EGFR L858R、T790M等)完全匹配，但会与野生型基因错配。结果，仅与完全匹配的突变位点结合的SCP会被核酸酶裂解。第二个基因(基因B，例如KRAS)的多个SCP对于基因B中感兴趣的突变将类似地具有独特的TSR，但是将具有共同SSR(例如具有用于HEX标记的探针的探针结合位点)。人们将用少至一对引物和针对每一个基因特异性标记的探针在dPCR中扩增和检测所得SSR。
本文描述的方法和试剂盒的任何一种都可以用于微小残留病监测。微小残留病(MRD)是指治疗之后仍然在体内的小数目癌细胞或来源于这样的癌细胞的无细胞循环DNA。剩余细胞的数目可能如此之小，以至于它们不会引起任何身体迹象或症状，并且通常甚至不能通过传统方法，诸如在显微镜下观察细胞和/或通过追踪血液中的异常血清蛋白被检测到。MRD阳性测试结果意味着检测到残留(residual)(剩余的(remaining))疾病。阴性结果意味着没有检测到残留疾病。因此，本文描述的方法和试剂盒可以用于检测来自微小残留病的癌细胞或无细胞循环DNA的标志物。治疗癌症之后，体内任何剩余的癌细胞都可能变得活跃并且开始繁殖，引起疾病复发。检测MRD可以指示治疗不完全有效或治疗不完全。治疗之后可能存在微小残留病，因为不是癌细胞的全部对治疗有响应，或者因为癌细胞对使用的药物变得耐受。
本文描述的方法和系统(例如，试剂盒)的任何一种可以用于检测移植排斥。例如，本文描述的方法可以检测供者来源的无细胞DNA，并且因此可以追踪出现在移植受者血液(或其他组织或液体)中的来自器官供者的DNA标志物。例如，来自供者器官的受伤或死亡细胞将供者DNA片段释放到血液中，并且较高的供者DNA的含量指示受者移植排斥的较高风险。本文描述的方法和系统(例如，试剂盒)可以用于检测供者和患者DNA的相对量，与本文描述的用于检测胎儿DNA和母体DNA的方法类似。当前用于检测心脏移植排斥的测试依赖于频繁且痛苦的心脏组织活组织检查。这些活组织检查有损伤心脏的风险，并且受其侵入性(获得组织样品的能力)和检测急性排斥的可靠性的限制。急性或快速排斥往往发生在移植之后的头三至六个月，相比之下慢性排斥发生在多年之后。例如，可以使用本文描述的测定来监测患者的血液样品以确认急性排斥的迹象。
这些方法和组合物可以被配置为综合征病原体组。这样的组可以有利于用SCP探针联合检测(例如，通过dPCR)来检测病原细菌、酵母和/或真菌的组。例如，可以用包括可能导致相同症状(例如急性腹泻)并且以相同方式治疗(例如相同类型的抗生素)的一种或更多种细菌(例如弯曲菌属(Campylobacter)、艰难梭菌(C.difficile)等)中的一个或更多个靶序列(例如16S RNA)的SCP来检测引起胃肠不适的多种肠道病原体。SCP将具有多个独特的TSR，但对于共同治疗模式共有共同的SSR(Fam用于A类型抗生素；Hex用于B类型抗生素)。
实施例1
在一个实例中，本文描述的方法可以用于鉴定遗传样品的倍性。
传统的使用dPCR检测非整倍性的方法需要大量的引物和探针以实现统计学意义。例如，图11示意性地示出了常规dPCR NIPT测定的操作原理。注意，通常母体染色体cfDNA/胎儿染色体cfDNA是断裂的，尽管为了方便起见，在图11和图12中用实线指示，以显示染色体上的原始连接性。在该简化实例中，如果在三条染色体(例如，C13、C18和C21)的每一条上检查n个等位基因，每一条染色体需要2n个引物(每个等位基因两个)，并且染色体上的每个等位基因需要至少n个探针。因此，例如，如果在每一条染色体上使用200个靶测量对象，则需要1800个寡核苷酸。如以上描述的，相比之下，本文描述的方法可以改为使用低得多的数目的寡核苷酸。在一些变化中，如果在每一条染色体上使用200个靶测量对象，仅5个寡核苷酸(每一条染色体各一个探针和单独一对引物)，即使靶测量对象的数目增加，本文描述的dPCR测定中的寡核苷酸的数目也不改变。这在图12中示出。使用本文描述的序列转换方法来提供切割的SSR(cSSR)显著降低对单独引物和探针的需求。此外，因为工程化SSR可以被设计为具有相当的结合和扩增特性(例如，使用相同或类似的引物等)，所得信号的信噪比可以比传统的dPCR方法好得多。
例如，这些方法可以用于鉴定染色体21、染色体18和染色体13的每一条上的靶测量对象(例如，100个至200个靶测量对象)。该信息(例如，来自每一条染色体的已鉴定的靶测量对象的数目)可以用于确定这些染色体的每一条的倍性。在一些变化中，该方法可以包括确定每一个带有核糖的TSR的长度，以在70℃加减10℃杂交，该带有核糖的TSR在裂解之后不会解离。核糖可以尽可能靠近3’末端放置以最小化环化/扩增。该方法还可任选地包括确定SSR扩增部分作为理想扩增子。用于C21/C18/C13的引物可以全部相同，并且针对C21、C18和C13的每一条的探针可以是对C21、C18和C13特异性的标准TaqMan探针。每一个信号转换探针(SCP)可以在一个末端处具有亲和标签，诸如但不限于5’末端处的生物素。假设用于C21/C13/C18的每一条的200个靶测量对象和100,000个孔或液滴阵列，该方法可以包括获得用于C21的200个不同的SCP，获得用于C18的200个不同的SCP，以及获得用于C13的200个不同的SCP。探针可以以1:1:1的比例混合。现在应该存在等摩尔比例的大约600个SCP。总量可以通过实验确定，但可以预期是靶DNA浓度的至少10倍高。单独探针的典型浓度可以在5pM–500pM的范围内。孵育时间、温度和缓冲液条件可以影响最佳条件。核酸酶(例如，RNA酶H2)可以在添加SCP之前、一起或之后添加，然而对于一些核酸酶(例如限制性酶)，通常优选最后添加。例如，限制性酶需要在SCP杂交之后添加，否则它们可能在SCP能够结合之前破坏靶DNA等位基因。一旦反应完成，未裂解的SCP和cTSR将被与固相(例如珠、柱、磁珠等)结合的链霉抗生物素蛋白去除。上清液或等分试样可以与用于数字PCR反应的PCR主混合物混合，并且遵循本领域已知的标准方案运行。
然后，可以比较阳性T21、阳性T18和阳性T13计数的数目，并且基于数学变换(例如，差异、比例或其他)来确定结果是正常还是异常。
实施例2：用于使用限制性酶的NIPT(三体性13、18和21的检测)的序列转换方法
如以上提及的，在一些变化中，可以使用限制性内切核酸酶(“限制性酶”)。例如，在一些变化中，包括染色体材料的遗传物质样品的倍性可以使用本文描述的方法来确定。
在本文描述的使用核酸酶将SSR与SCP分离的方法的任何一种中，可以确定待使用的限制性酶，并且可以将限制性位点工程化到SCP中。例如，用于确定限制性酶的选择标准可以基于使用方法的具体需要，并且可以包括大约～6个碱基长的识别位点(其他长度的限制性位点也起作用)；该酶在高于45℃开始稳定且有效。选择的酶可以因为它可以被热灭活而被选择。在一些变化中，识别位点可以以足够的频率(理想地>500)存在于染色体13、染色体18和染色体21的每一条上的潜在靶序列中，以支持测定统计需要(例如，每条染色体的探针数目)。
在设计SCP时，鉴定的限制性位点可以延伸至靶特异性区域(TSR)序列。例如，该方法可以包括基于选择的限制性酶鉴定染色体21、染色体18和染色体13上的200个或更多个序列靶。可能的候选限制性酶可以包括BsmI(NEB目录号R0134L)、BsmBI-v2(NEB目录号R0739S)、BspQI(NEB目录号R0712S)、BsaI(NEB目录号R0535S)、BsaI-HF-v2(NEB目录号R3733S)或BssHII(NEB目录号R0199L)。可以被鉴定具有选择的限制性酶识别位点序列的等位基因以供对染色体13、染色体18和染色体21使用。为了确定靶特异性区域的5’末端，可以定义探针的Tm。由于这些限制性酶的许多在高于45℃(反应温度)工作良好，TSR应该理想地在反应温度完全结合。因此，Tm高于55℃的探针可以用作靶。基于50mM NaCl中的该Tm，10个-40个碱基的TSR探针长度可能是理想的，这取决于GC含量。TSR结合序列可以延伸(使用生物信息学技术)到下游多于6个碱基(方向3’)。序列上游(方向5’)可以根据需要延伸以实现期望的Tm。可以鉴定出独特的序列：在不是预期染色体的染色体上存在的具有多于80％同一性(或同源性)的序列可以被弃去，特别是携带酶识别位点的那些序列。可以过滤掉限制性位点中与常见SNP结合的序列(例如，在人类群体中>～1％频率的)。该方法还可以包括确保剩余的序列不彼此重叠。
如本文使用的，在比较多核苷酸序列时，如果两个序列的每一个的核苷酸序列在序列为了最大对应被比对时是相同的，则称两个序列是“相同的”。如本文描述的两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以根据本领域公认的实践和标准来确定，例如，以下中描述的BLAST和BLAST 2.0算法：Altschul等人，Nucl.Acids Res.25:3389-3402(1977)和Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。
也可以确定信号特异性区域(SSR)的序列。例如，通过鉴定(使用生物信息学)人类基因组或人类病原体中不存在的足够长以携带PCR扩增子的3个寡核苷酸序列。该3个序列可以是合成的(与人类基因组具有非常小的同源性或同一性)，可以包含对于全部三个寡核苷酸相同的两个通用引物结合位点(一个在SSR的5’-末端处，一个在SSR的3’-末端处)，寡核苷酸可以在引物位点之间包含对染色体13、染色体18或染色体21特异性的TaqMan探针结合位点。
最终的序列转换探针(SCP)设计可以通过将染色体13、染色体18和染色体21的200个鉴定的靶特异性区域(TSR)的每一个与它们各自的通用信号特异性区域(C13 SSR、C18SSR和C21 SSR)串联来确定。TSR可以在5’末端处，并且将合成为带有5’生物素标签；SSR在3’末端处。这产生200个对每一个染色体特异性的序列转换探针。可以生成大约600个HPLC纯化的探针，例如为染色体13、染色体18和染色体21提供大约200个鉴定的SCP。
引物和探针可以针对具有58℃延伸温度的dPCR循环条件进行优化。例如，引物Tm可以是58℃-60℃，探针Tm可以是68℃-70℃。第一探针(例如，探针1，C21)可以包括报告物1(例如，FAM)和猝灭剂(例如，Iowa Black)。第二探针(探针2，C18)可以包括报告物2(例如，HEX)和猝灭剂(例如，Iowa Black)。第三探针(探针3，C13)可以包括报告物3(例如，Cy5)和猝灭剂(例如，Iowa Black)。可以优化用于dPCR的引物和探针以与用于探针的Bio RadddPCR Supermix(目录号：186-3010，用于500个反应)相容。
该方法可以包括：(1)母体cfDNA和胎儿cfDNA提取，(2)序列转换反应，(3)序列转换反应的清理，(4)cSSR的分区(例如液滴生成)，(5)dPCR，和(6)数据分析。
样品收集和DNA提取可以包括分离血浆(例如，在血液抽取后五天内)。平均9.5mL全血可以通过双重离心方案在无细胞DNA
Figure BDA0004113276060000771
血液收集管(Streck)中收集，该双重离心方案包括以1342×g持续30分钟的第一离心步骤，将血浆级分转移至第二管以及以2267×g持续20分钟的第二离心步骤。将血浆储存在-80℃，直到进一步处理。
按照制造商的说明，从1mL怀孕女性的血浆中提取cfDNA。试剂：
Figure BDA0004113276060000772
RSCccfDNA血浆试剂盒(目录号：AS1480)；仪器：ProMega/>
Figure BDA0004113276060000773
RSC 48Instrument(AS8500)。将cfDNA在50μL洗脱缓冲液中洗脱。使盐遗留最小化。
序列转换反应
将50μl cfDNA洗脱液转移至微量滴定板上，并且添加10μL SCP溶液，该SCP溶液包含5pM-500pM(最终)基因座特异性SCP探针(对于600个SCP探针，3nM-300nM的总SCP探针浓度。探针处于等摩尔浓度)。在95℃变性60秒，然后降低温度至50℃-65℃。添加10μL限制性酶缓冲液(包含1U-10U BsaI-HF-v2(New England Biolabs)，7μL 10×CutSmart缓冲液目录号B7204S)并且混合。遵循Zhang等人(Nat Chem.2018Jan；10(1):91–98.)的指导优化在50℃-65℃的孵育时间和探针浓度，得到0.5小时-24小时孵育时间，5pM-500pM探针(单独SCP)。温度、浓度和时间彼此相互作用并且允许多种解决方案适应用户需求。
一旦反应已经完成，序列转换反应的清理可以包括通过与结合至固相(例如珠、柱、磁珠)的链霉抗生物素蛋白结合来去除任何未切割的SCP和cTSR。cSSR可以被分区用于dPCR。例如，来自序列转换反应清理的上清液可以与dPCR主混合物和特定dPCR系统所需的任何另外的试剂(例如用于BioRad QX ONE液滴数字PCR系统的液滴生成的油)混合。选择分区的数目，使得能够实现测定的预期用途所需的统计显著性。dPCR工作流程，包括液滴生成在“QX ONE Droplet Digital PCR System and QX ONE Software User Guide”中描述。
可以对所得SSR进行数字PCR(dPCR)。例如，Bio-Rad QX ONE液滴数字PCR系统(M/N12006536)可以与PX1 PCR板密封器(1814000)和用于探针的Supermix(Biorad目录号：186-3010，用于500个反应)一起使用。
下表2示出了对于一个反应实现900nM引物浓度和250nM探针浓度的最终浓度的正向引物、反向引物和探针的10μM工作液溶液所需的体积：
Bio-Rad ddPCR用于探针的SuperMix 11μl
正向引物(10μM) 2.0μl
反向引物(10μM) 2.0μl
探针(10μM) 0.55μl
分子级水 4.45μl
样品 2μl
注意，如果需要更高的样品输入，则降低分子级水的体积。总体积考虑了移液的死体积。
表3示出了可以使用的dPCR的热循环方案的实例：
Figure BDA0004113276060000791
可以比较阳性染色体21、阳性染色体18和阳性染色体13计数的数目(例如，空分区与被占用分区，使用泊松分布来确定绝对拷贝数)，并且基于数学变换(例如，差异、比率或其他)，以确定特定样品的染色体21、染色体18或染色体13的非整倍性的风险是否增加。其他风险因素，如母体年龄、为携带遗传易位的载体、已经有过一个非整倍性的孩子等，可以与测定结果组合使用，以生成风险评分。
SCP的设计与选择
本文描述了用于设计和选择序列转换探针(SCP)的方法，该序列转换探针(SCP)可以用于与本文描述和示出的任何序列转换反应(包括但不限于图21A中示出的测定)的任何一种。通常，本文描述的序列转换反应使用序列转换探针(SCP)，该序列转换探针(SCP)包括与特定靶序列杂交的靶特异性区域(TSR)和信号特异性区域(SSR)，该信号特异性区域(SSR)是不存在于靶序列池中的合成序列(例如，不在被检查的基因组中)。SCP通常包括在TSR与SSR之间的用于核酸酶的化学不稳定位点或识别位点，该不稳定位点或识别位点被配置为使得仅在TSR与特定靶序列结合时SSR才可以从TSR裂解。如以上提及的，任选的亲和标签诸如生物素可以存在于5’末端或3’末端处，优选地存在于3’末端处，末端处可以包括多于一个亲和标签分子。
例如，序列转换测定可以从提取的受试者(或汇集的受试者)样品，例如无细胞DNA(cfDNA)开始。然后将SCP探针添加至提取的cfDNA，可以将其加热以使双链cfDNA变性，并且冷却以允许SCP探针特异性退火以靶向cfDNA内的等位基因。然后添加核酸酶(例如限制性酶)，并且孵育以在预定位置处裂解杂交的SCP探针，仅从其TSR区域已经与cfDNA的靶区域杂交的那些SCP探针释放SCP探针的SSR部分(切割的SSR或cSSR)。然后可以添加锁探针和连接酶来使cSSR环化。任选地，可以消化非环状ssDNA和dsDNA；该步骤不是必要的，特别是在利用“引物远离”扩增子构型(如图21C和图26C-图26D中示出的)的情况下。环化的SSR可以任选地被扩增。包含环状cSSR的上清液可以用于dPCR检测反应。例如，SSR上正向引物和反向引物和探针结合位点的反向取向可以确保仅环化的SSR(cirSSR)可以被扩增。
因此，本文描述了形成序列转换探针(SCP)的方法，可以用于形成功能SCP。这些SCP可以在序列转换测定的任何一种中起作用。尽管例如在SEQ ID No.1-SEQ ID No.5和SEQ ID No.8-SEQ ID No.75中提供了SCP以及形成它们的SSR和TSR的序列的具体实例，但应该理解，本文描述的方法教导并且使本领域技术人员能够制备将与本文描述的序列转换测定一起起作用的SCP，并且不限于特定的序列。具有符合本文描述用于选择和组合TSR和SSR的特性的几乎任何序列的SCP将起作用。
例如，SCP通常可以包括在15个与80个碱基对(bp)之间延伸的靶特异性区域(TSR)，其中TSR的多核苷酸序列仅与靶(例如，人类)基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％同一性(例如，至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％等)。在一些情况下，TSR的多核苷酸序列可以在15bp与50bp之间、在15bp与45bp之间、在15bp与35bp之间、在15bp与30bp之间等。优选地TSR在15bp与35bp之间。如下文将更详细描述的，TSR仅与靶基因组内一条染色体的单个区域同源(例如，具有显著同一性)，使得TSR将以合理的亲和力仅与基因组内的单个位点结合。如更详细描述的，可以选择TSR，使得它出现在基因组中的已知染色体(例如，染色体21)上。尽管本文描述的实例特定于人类基因组的测定，但是应该理解，这些测定可以针对其他基因组(包括其他动物基因组、植物基因组等)的靶。
明确选择TSR以在TSR序列内包括用于II型限制性酶的关联限制性位点。本文提供了可以使用的II型限制性酶的实例。在一些实例中，限制性酶的切割位点可以在TSR的第一末端处或附近。TSR可以具有大于50％的GC含量。
如提及的，TSR探针对给定的染色体是特异性的，并且在该染色体中仅出现一次。通常，如以上描述的，包括具有相同SSR但不同TSR的多个SCP实例。SCP组内的TSR的全部(包括各种不同的TSR探针)可以具有相同的限制性位点。限制性位点(用于II型限制性酶的关联限制性位点)可以位于该SPC组的TSR的全部中的大约相同的位置。例如，关联位点可以与切割位点一起位于TSR的3’末端的8bp内(例如，7bp内、6bp内、5bp内、4bp内、3bp内、2bp内、1bp内等)，在那里TSR与SSR偶联。例如，TSR的全部可以分别在TSR的5’末端和3’末端的下游和上游约10bp内具有关联限制性位点。关联位点可以与TSR的末端(例如，5’末端)相邻，在那里TSR与SSR偶联。在一些实例中，SCP组内的该组TSR的TSR的全部具有大约相同的尺寸(例如，约13bp、约14bp、约15bp、约16bp、约17bp、约18bp、约19bp、约20bp、约21bp、约22bp、约23bp、约24bp、约25bp、约26bp、约27bp、约28bp、在约13bp-50bp之间、在约15bp-40bp之间、在约15bp-35bp之间、在约15bp-30bp之间、在约15bp-25bp之间等)。
SCP组的不同TSR都是各自独特的且不重叠的；SCP组的TSR彼此不重叠(例如，全部都与基因组的不同的、不重叠的区域杂交)。
通常，每一个TSR的GC含量大于50％，并且每一个TSR的Tm(解链温度)通常在设定范围内(例如，大于55℃、大于56℃、大于57℃、大于58℃、大于59℃、在约55℃-65℃之间、在约57℃-67℃之间、在约57℃-65℃之间等)。
最后，如下文将更详细描述的，可以选择每一个TRS探针以使它们的预测二级结构最小化。可以通过计算以kcal/mol计的最小自由能(MFE)并且确定TSR内用于II型限制性酶的关联限制性位点是否不属于发夹环的部分或以其他方式被第二结构阻断或破坏来计算或近似二级结构。一旦推定TSR已经与SSR组合，该确定也可以或可选地在SCP阶段进行。
序列特异性区域(SSR)可以具有延伸大于40bp(例如，大于45bp、大于50bp、大于55bp、在40bp与100bp之间、在40bp-90bp之间、在40bp-80bp之间、在50bp-100bp之间、在50bp-90bp之间、在50bp-80bp之间等)的多核苷酸序列。SSR序列的多核苷酸序列不出现在靶基因组中。例如，SSR可以具有被工程化并且与靶基因组(例如，人类基因组，包括非染色体DNA，诸如线粒体DNA)比较以确认它不出现在靶基因组的序列内(使得它不会与靶基因组杂交)的序列。SSR可以具有大于50％的CG含量。
通常，离II型限制性酶区域的切割位点最近的TSR末端(例如，5’末端)可以连接至SSR。如以上已经提及的，关联限制性位点不是组装的SCP中发夹结构的部分。
通常，SCP组的每一个SCP的SSR可以是相同的多核苷酸序列，并且可以共有一组以高选择性和高效率杂交的正向引物和反向引物。例如，SSR可以包括正向引物区域和反向引物区域。
SSR可以包括基于多核苷酸序列的修饰阻止或阻断酶促延伸(例如聚合酶)的一个或更多个区域。例如，SSR的任何一个可以包括正向引物区域和反向引物区域以及在正向引物区域与反向引物区域之间的无碱基区域。
无碱基区域(也称为无碱基位点或AP位点，或无嘌呤/无嘧啶位点)可以通过水解DNA中的核苷残基生成无碱基位点而天然产生。最常见的是，dA位点被水解，引起脱嘌呤并且产生无碱基残基。这些位点可以被包括在工程化多核苷酸(包括本文描述的SSR)中。例如，1,2’-双脱氧核糖修饰可以用于将单个碱基空间插入DNA寡核苷酸序列，这复制碱基配对能力的一个核苷酸损失，该核苷酸损失可以通过脱嘌呤或其他机制天然发生。C3间隔物亚磷酰胺(iSpC3)可以用作寡核苷酸中的间隔物臂。在需要更长的间隔物时，可以多次添加化合物。3’-间隔物C3 CPG或亚磷酰胺也可以充当外切核酸酶和聚合酶的阻断剂，并且可以用于在寡核苷酸内引入稳定的无碱基位点。例如，可以使用dSpacer CE亚磷酰胺(5’-O-二甲氧基三苯甲基-1’,2’-双脱氧核糖-3’-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)。dSpacer也称为无碱基位点、四氢呋喃(THF)或无嘌呤/无嘧啶(AP)位点。它可以掺入到寡核苷酸序列内部，或在序列的5’末端或3’末端处。可以使用任何数目的间隔物来形成无碱基区域/位点(例如，1个、2个、3个、4个、5个等)。
图23A示意性地示出了如本文描述的SCP的一个实例。在该实例中，SCP包括SSR和TSR。该实例中的SSR与SEQ ID No.4中示出的SSR类似，但包括在反向引物区域与正向引物区域之间的无碱基区。例如，可以通过将无碱基区域之前的多核苷酸区域(SEQ ID NO.2)与无碱基区域之后的多核苷酸区域(SEQ ID NO.5)连接来构建SSR，其中无碱基区域连接两个多核苷酸区域。然后将该SSR与TSR(例如，SEQ ID NO.75)偶联，其如本文描述从人类染色体21上的独特BspQI位点构建。如以上描述的，SSR还包括两个探针区域，该两个探针区域可以与接头多核苷酸杂交，以在SSR已经被切割之后使其环化。
图23B示意性地示出了如本文描述的SPC的另一个实例，该实例使用被配置为通过无碱基位点将SEQ ID NO.78连接至SEQ ID NO.79的SSR区域。
SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21、SEQID NO.24、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.39、SEQID NO.42、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.57、SEQID NO.60、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.72或SEQ ID NO.75示出了使用本文描述的方法工程化的TSR的实例。图24示出了设计TSR(或TSR组)的方法的一个实例。图24中示出的示意图使用了靶基因组。在该实例中，靶基因组是GRC38.p13人类基因组组装(例如，完整的GCF_000001405.26_GRCh38_genomic.fna)，但是可以使用任何基因组序列表。
该GCF_000001405.26_GRCh38_genomic.fna以全部其他尚未分配至染色体的短重叠群(它们的～430个)为特征。在图24中示出的实例中，靶染色体是人类染色体21，并且使用的II型限制性内切酶是BsaI。不管使用的II型限制性酶或染色体如何，本文描述的方法是相同的。
扫描靶基因组以确认基因组内具有靶II型限制性位点2402(例如，在本实例中为BsaI)的全部位置，以提供这些位点的基因组坐标。从基因组位置选择上游和下游的固定区域(例如，在5’上游的16个核苷酸，和在3’下游的5个核苷酸)2404，并且然后审查推定的TSR以去除任何包括重复2406的区域，因为每一个TSR在整个基因组2408中必须是完全独特的。然后过滤推定的TSR，以鉴定仅存在于靶染色体2410(在该实例中染色体21)上的那些TSR。然后检查所得推定TSR以鉴定它们的Tm(例如，使用同源双链体Tm预测模型)2412。任何具有少于58℃的预测Tm的推定TSR都被排除。然后检查所得“高Tm”推定TSR，以确认它们在与整个基因组约80％同一性内是独特的；允许例如，多于2(或者在一些情况下多于3个、多于4个、多于5个等)的错配以保持推定TSR，否则它们被消除2416。计算给定候选(例如chr21BsaI TSR)已经针对具有给定数目错配的基因组其余部分的命中多少次数可以用作潜在交叉反应性的过滤器。任何重叠的推定TSR也被消除2418。全部推定TSR 2420与基因组其余TSR之间的类似性也使用近似字符串匹配方法基于它们的字符串距离来估计。然后将一个或更多个推定TSR与预期的SSR(参见下文)2422组合以形成推定SCP，并且检查推定SCP序列以消除任何具有二级结构2424的序列，该二级结构2424将抑制靶II型限制性酶(例如BsaI)的酶促活性。
二级结构可以使用任何适当的方法来估计和计算，其中各种方法是本领域技术人员已知的和可得的。例如，II型限制性酶关联位点处或附近的二级结构和发夹折叠可以使用RNAFold ViennaRNA软件包来确定。例如，图28示出了可以用于SCP的预测二级结构的一个实例。在图28中，预测的二级结构使用RNAFold ViennaRNA软件包计算；在该实例中，推定TSR的关联II型限制性酶被预测采用稳定的二级结构，并且具有高GC含量。BspQI关联限制性位点不在发夹区域内。因此，可以选择SCP来仅鉴定满足以上标准的那些SCP，包括不存在包括同源限制性酶识别位点的明显的二级结构(并且特别是没有发夹环)。
在图24中示出的实例中，在靶II型限制性酶是BasI，并且靶染色体是染色体21时，该方法最初在GRCh38基因组中鉴定了1,740,533个BsaI推定TSR。这些中的979,551个是独特的，并且这些推定TSR中的11,393个在染色体21中，但是仅有11,290个TSR具有大于58℃的Tm。在这些中，仅325个推定TSR与其他染色体不重叠且不交叉反应。这些325个推定TSR中，二级结构预测鉴定了基本上没有包括或闭塞II型限制性酶识别(和切割)位点的二级结构的亚组。SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21、SEQID NO.24、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.75示出了使用以上标准鉴定的TSR的实例，其可以用作本文描述的序列转换测定的部分。在使用不同的II型限制性酶(例如BspQI)时，使用类似的过程来鉴定其他推定TSR。SEQ ID NO.:42、SEQ ID NO.:45、SEQ ID NO.:48、SEQ ID NO.:51、SEQ ID NO.:54、SEQID NO.:57、SEQ ID NO.:60、SEQ ID NO.:63、SEQ ID NO.:66、SEQ ID NO.:69和SEQ IDNO.:72示出了以这种方式鉴定的TSR。
如提及的，可以使用任何适当的II型限制性酶。这些酶可以选自具有6个或7个碱基长的识别位点的商购可得酶的列表。酶应该是热灭活的，并且优选地是重组的。酶的识别位点应该足够频繁地(理想地，例如，多于约500次)出现在每一条靶染色体(例如，染色体13、染色体18和/或染色体21)上，这可以支持测定统计需要。优选地，酶可以在升高的温度(例如，45℃、50℃等)杂交，诸如在50℃左右工作良好的酶。具有低盐耐受性和/或不能够被热灭活和/或具有高“星号活性(star activity)”(例如，缺乏非特异性裂解活性的一种形式)的限制性酶被排除作为在TSR设计中使用的选项。
也可以使用并行过程来选择SSR。尽管可以使用单个SSR，但是可以形成多个推定SSR。例如，在图25中，示意图示出了设计可以与TSR的任何一个组合的SSR的方法的一个实例。SSR通常具有大于约50％的GC含量，并且可以在核酸扩增测试的环境下由不太可能与靶基因组DNA(例如，人类基因组DNA)交叉反应的短DNA序列(例如，30mer)形成。在该实例中，该方法可以从鉴定非靶基因组开始，优选地来自不同的界或门2502。例如，在图25中，使用植物物种(例如，藤地莓(Epigaea repens)，即五月花(May flower))，并且将其分为不重叠的30mer延伸2504。然后检查这些不同的推定30mer延伸以确定它们的解链温度(Tm)；具有低于约50℃的Tm的那些被排除，而具有高于50℃的Tm的那些被保留2506。在该实例中，鉴定了约140个候选SSR。然后检查这些推定SSR以确认不存在于人类基因组中2508(例如，使用针对所用的靶人类基因组的blast查询)。然后仅是独特的那些(可以允许一些错配，诸如2个或更少的错配、3个或更少的错配、4个或更少的错配、5个或更少的错配、6个或更少的错配、7个或更少的错配、8个或更少的错配等)被保持为推定SSR。在一些实例中，可以检查较大(例如，大于30mer)的候选SSR，诸如40mer、50mer等。在一些实例中，较小的候选SSR可以通过与其他新序列的部分组合来扩增。然后可以针对人类基因组以较低严格性检查推定SSR，例如，允许一些错配(例如，通过运行推定SSR的子区域)2510。然后可以分析一个或更多个所得候选物以确定如以上描述的二级结构预测。具有低二级结构预测的候选物可以用作SSR序列。可选地，如果在该阶段的候选物确实具有高二级结构预测，则候选SSR的序列可以通过在一个或更多个位置(包括随机位置)处进行G/T取代而被修饰，并且所得修饰的序列可以再次与靶基因组进行比较2514。
SEQ ID NO.1中鉴定的SSR示出了SSR的一个实例；可选的SSR在SEQ ID NO.2-5示出。例如，SEQ ID NO.2示出了SSR部分。该部分可以与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5的SSR部分组合(例如，如图23A中示出的，通过无碱基区域连接)。如提及的，鉴定的SSR的任何一个都可以被修饰以包括破坏复制的短区域，特别是在相对面向(背对面向)的正向多核苷酸与反向多核苷酸之间的短区域，用于以后的检测扩增。如图26-图26D中示出的，SSR(一旦从TSR上切割)可以如先前描述环化，并且使用通用引物(正向引物和反向引物)进行测定，一旦线性化，就允许扩增，如以上描述的。
例如，可以使用数字PCR(dPCR)进行检测。在一些实例中，系统可以包括TaqMan探针。TaqMan探针位点可以在SSR上工程化，使得TaqMan探针不干扰本文描述的方法。例如，TaqMan探针可以位于SSR的3’末端处，而不是SSR的5’末端处或横跨切割位点，这两者都可以干扰该方法。例如，如果TaqMan探针横跨切割位点，TaqMan探针也可以用于桥接正向引物和反向引物，导致不期望的扩增(并且因此产生不期望的PCR信号)。可选地，已经发现使TaqMan探针位点位于SSR 5’末端可以导致TaqMan探针的隔离。
图27示出了根据以上描述的一个或更多个SSR和TSR确定最终SCP的方法。SCP可以如描述的那样被工程化为既是独特的(例如，使得TSR区域与单个染色体特有的单个位点杂交)又使得SSR不与靶基因组的任何一个杂交。此外，SCP可以被配置为使得二级结构稳定并且不阻断或封闭限制性位点(例如，关联限制性位点或关联限制性位点和切割位点)。例如，在图27中，每一个推定TSR区域的反向互补序列与如以上描述鉴定的SSR组合以形成SCP2702。然后如描述地计算SCP的二级结构2704。例如，可以对SCP进行发夹/二级结构预测，以确定限制性位点是或者不是(或者它有多少)被预测的二级结构阻断或封闭。例如，可以基于最小自由能(MFE)和应用的阈值来应用数字评分以确定SCP是否有效。例如，绝对最小自由能(计算的最小自由能的绝对值)可以被选择为少于阈值(例如，少于20、少于25、少于30、少于35、少于40、少于45、少于50、少于55、少于60、少于65、少于70、少于75、少于80、少于85、少于90、少于95、少于100等)kcal/mol。
SCP可以是大约90个核苷酸长的单链DNA，每个设计具有高GC含量，其倾向于采用稳定的二级结构。如以上描述对于人类染色体21确定的SCP的实例在以下中提供：SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.27、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.42、SEQ IDNO.45、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.60、SEQ IDNO.63、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.72或SEQ ID NO.75。可以例如通过无碱基区域连接至另外的SSR区域(诸如SEQ ID NO.10中示出的)的部分SCP在以下中示出：SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.29、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.44、SEQ IDNO.47、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.62、SEQ IDNO.65、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.74和SEQ ID NO.77。
另外的实例
本文描述的各种方法和步骤使用如本文描述的样品引物和模板来检查。使用SCP(“SCR0083”)(其包括在3’末端处具有BspQI识别序列的TSR，并且在位点NC_000021.9_27305245对染色体21是特异性的)显示了工作流程的一个实例(本文称为“全引物远离环化工作流程(full primer away circularization workflow)”)。
在该实例中，将SCP SCR0083(0.5nM；SEQ ID No.83；IDT)与靶SCR0113(SEQ IDNo.84，3.4e5个拷贝；IDT)在10mM Tris-HCl、1mM Na2-EDTA、100mM NaCl、10mM MgCl2，pH8.0(40μl)中退火，通过加热至95℃持续5min，以0.015℃/秒冷却至50℃并且保持5min。将与其TSR合成靶退火的SCP在包含50mM Tris-HCl、100mM NaCl、10mM MgCl2、100mg/ml BSA的最终消化缓冲液中用BspQI(20U；NEB目录号R0712)在50℃消化60min。消化后是在80℃的20分钟热灭活步骤。然后将消化的SCP的SSR通过用Hi-T4连接酶(60U；NEB目录号M2622)处理在50mM Tris-HCl、20mM MgCl2、1.5mM ATP、0.5nM锁探针SCR0080(SEQ ID No.85；IDT)中在50℃连接70分钟。连接后是在65℃的10min热灭活步骤。然后将环化的SSR通过以下实时PCR扩增并检测：使用TaqMan Fast Advanced MasterMix(ThermoFisher目录号4444556)、200nM正向引物和反向引物(SSR1_FP，SEQ ID No.86；SSR1_RP，SEQ ID No.87；IDT)和100nMTaqMan探针SCR0078(SEQ ID No.88；IDT)通过在95℃变性20”，随后是40个循环的95℃持续1”和60℃持续20”，QuantStudio Real Time PCR System(ThermoFisher Scientific)。
使用SCR0083的“引物远离”qPCR测定和无模板对照(NTC)的消化的、环化的染色体21特异性序列转换探针SCR0083(SEQ ID No.83)的扩增曲线在图30中示出。
该工作流程示出了成功完成的多个连续步骤，从SCP与靶退火开始，然后通过特异性限制性酶(该实例中为BspQI)裂解SCP，从而将TSR与SSR分离，并且将所得裂解的SSR(cSSR)连接为共价封闭的单链环状DNA，并且最后通过“引物远离”qPCR检测环化的产物。
在一些实例中，可以切割TSR，使得在所得cSSR中不存在TSR(没有靶序列)。
还检查了具有qPCR读取的多重SCR。显示了对两种SSR用通用引物对和两种不同的TaqMan探针(一种用FAM标记，另一种用HEX标记)的高效且特异性的扩增和检测。在该实例中，TaqMan PCR被用作检测方法。各自的探针对其预期的SSR是高度特异性的，并且不与非预期的SSR或人类基因组DNA发生交叉反应。
在该实例中，合成的信号特异性区域(SSR)寡核苷酸SCR0076(SEQ ID No.89；IDT)和SCR0136(SEQ ID No.90；IDT)在存在共同正向引物和反向引物的情况下扩增，并且用关联或非关联TaqMan探针即对于SCR0076(SEQ ID No.89)的SCR0078(SEQ ID No.88)或对于SCR0136(SEQ ID No.90)的SCR0134(SEQ ID No.91)检测。SSR靶对应于在裂解并且通过连接环化之后存在于SCR0083(SEQ ID No.83)(对于染色体21)和SCR0133(SEQ ID No.99，对于染色体18)中的序列转换探针(SCP)中的SSR。
另外地，通过使用水(无模板对照；NTC)或在存在100ng来源于HeLa细胞系的人类基因组DNA(gDNA；NEB；目录号N4006)的情况下检查特异性。如下进行实时PCR：使用TaqManFast Advanced MasterMix(ThermoFisher目录号4444556)、200nM正向引物和反向引物(SSR1_FP，SEQ ID No.86；SSR1_RP，SEQ ID No.87；IDT)和100nM TaqMan探针SCR0078(SEQID No.88；IDT)或SCR0134(SEQ ID No.91；IDT)通过在QuantStudio Real Time PCRSystem(ThermoFisher Scientific)上在95℃变性20”，随后是40个循环的95℃持续1”和60℃持续20”。
图31A包括扩增曲线，显示SCR0078 TaqMan探针仅扩增SSR靶SCR0076。基因组DNA即SCR0136和非模板对照未被扩增。在图31B中，扩增曲线显示SCR00134 TaqMan探针仅扩增SSR靶SCR0136。基因组DNA即SCR0076和非模板对照未被扩增。
还进行了对两条不同人类染色体上的靶的多重检测的完整工作流程(具有dPCR读取)。通过两个SCP(一个对染色体21特异性的(SCR0083；位点NC_000021.9_27305245)，另一个对染色体18特异的(SCR0133；位点NC_000018.10_647934))对两条人类染色体上的靶的特异性多重检测，两者都映射至GRCh38.p13初级组装_647934。使用数字PCR作为绝对定量的检测方法。在不存在SCP的情况时，未检测到人类基因组DNA。
使对染色体21(NC_000021.9_27305245)特异性的序列转换探针(SCP)SCR0083(0.5nM；SEQ ID No.83；IDT)和对染色体18(NC_000018.10_647934)特异性的序列转换探针SCR0133(0.5nM；SEQ IDNo.99；IDT)与100ng来源于HeLa细胞系(NEB；目录号N4006)的人类基因组在10mM Tris-HCl、1mM Na2-EDTA、100mM NaCl、10mM MgCl2，pH 8.0(40ml)中退火，通过加热至95℃持续5min，以0.015℃/秒冷却至50℃并且保持5min。将与基因组DNA退火的SCP在包含50mM Tris-HCl、100mM NaCl、10mM MgCl2、100mg/ml BSA的最终消化缓冲液中用BspQI(20U；NEB目录号R0712)在60℃消化60min。消化后是在80℃的20分钟热灭活步骤。然后将消化的SCP的SSR通过用Hi-T4连接酶(60U；NEB目录号M2622)处理在50mM Tris-HCl、20mM MgCl2、1.5mM ATP、0.5nM的各自锁探针SCR0080(SeqID 3；IDT)和SCR0135(SEQ IDNo.93；IDT)中在50℃连接70分钟。连接后是在65℃的10min热灭活步骤。然后将环化的SSR通过以下数字PCR扩增并检测：在QIAcuity数字PCR系统(Qiagen,Netherlands)上使用26K24孔纳米板使用QIAcuity探针PCR试剂盒(Qiagen目录号250101)、800nM正向引物和反向引物(SSR1_FP，SEQ IDNo.85；SSR1_RP，SEQ ID No.87；IDT)和400nM TaqMan探针SCR0078(SEQID No.88；IDT)和SCR0134(SEQ ID No.91；IDT)通过在95变性2’，随后是40个循环的95℃持续15”和60℃持续30”。使用QIAcuity软件套件1.2.18(Qiagen)对FAM和HEX通道中的阳性分区和阴性分区进行定量，并且转换为绝对浓度(拷贝数/ml)，如表2中示出的。作为阴性对照，基因组DNA在不存在SCP的情况下被处理至完整的工作流程中。
染色体21和染色体18来源产物的绝对定量在表2中示出。该比例不是1:1，因为已知HeLa细胞系是超倍体。仅用HeLa gDNA(无SCP)的阴性对照在Fam和Hex通道中产生0个阳性分区和0个拷贝/μl。
表2
Figure BDA0004113276060000911
还进行了SCP的两部分测定，包括线性连接和qPCR，与以上描述的图29A和图29B类似。这种两部分的SCP测定，在通过核酸酶裂解去除TSR后，反向引物结合位点替代TSR。引物结合区域，也称为SSR延伸探针，可以通过一个连接事件连接至短cSSR以生成线性单链SSR(参见，例如，图29B)，或者通过两个连接事件以生成共价闭合的环状单链SSR(参见，例如，图29C)。所得SSR可以通过qPCR检测。如本文描述的，进行产生线性SSR的单个连接事件的实例。例如，2e4个拷贝/ml的短SSR(SCR0146，SEQ ID No.97)和有或没有3’磷酸的0.5nM SSR延伸探针(SCR0142，SEQ ID No.95或SCR0142a，SEQ ID No.96)在存在0.5nM锁探针(SCR0147，SEQ ID No.98)的情况下在50mM Tris-HCl、20mM MgCl2、1.5mM ATP中通过用Hi-T4连接酶(60U；NEB目录号M2622)处理在50℃连接70分钟。连接后是在65℃的10min热灭活步骤。然后将连接产物通过以下实时PCR扩增并检测：使用TaqMan Fast AdvancedMasterMix(ThermoFisher目录号4444556)、200nM正向引物和反向引物(SSR1_FP，SEQ IDNo.86；SSR1_RP，SEQ ID No.87；IDT)和100nM TaqMan探针SCR0078(SEQ ID No.88；IDT)通过在95℃变性20”，随后是40个循环的95℃持续1”和60℃持续20”，QuantStudio Real TimePCR System(ThermoFisher Scientific)。
图32A-图32C示出了扩增曲线。例如，图32A示出了有和没有连接酶的扩增的结果。图32B示出了有和没有连接酶的结果，并且图32C也示出了有和没有连接酶的对照结果。连接可以用SCR0146(短SSR)、SCR0147(锁探针)和SCR0142或SCR0142a(亚SCP(Sub-SCP))发生。对于仅SCR0146和SCR0142而没有锁探针(非特异性连接)，也发生连接。对于仅SCR0146和SCR0142a，没有发生连接。亚SCP上的3’磷酸阻断非特异性连接。
当一个特征或要素在本文被描述为“在另一特征或要素上”时，它可直接在另一特征或要素上，或也可能存在中间的特征或要素。相反，当一个特征或要素被描述为“直接在另一特征或要素上”时，没有中间的特征或要素存在。应当理解，当一个特征或要素被描述为“连接”、“附接”或“偶联”到在另一特征或要素时，它可直接连接、附接或偶联到另一特征或要素，或可存在中间的特征或要素。相反，当一个特征或元件被称为“直接连接”、“直接附接”或“直接偶联”到另一特征或要素时，没有中间的特征或要素存在。虽然关于一个实施方案进行了描述或示出，但是这样描述或示出的特征和要素可以应用于其它实施方案。本领域技术人员应当理解，参考“邻近”另一特征配置的结构或特征可具有与相邻特征重叠或在相邻特征下方的部分。
本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不意图限制本发明。例如，除上下文明确说明之外，如本文使用的，单数形式“a(一)”、“an(一)”和“the(该)”旨在同样包括复数形式。还应当理解的是，术语“包括/包含(comprises)”和/或“包括/包含(comprising)”当在本说明书中使用时，指定所陈述的特征、步骤、操作、要素和/或部件的存在，但不排除存在或添加一个或更多个其它特征、步骤、操作、要素、部件和/或它们的组。如本文使用的，术语“和/或”包括相关联的所列项目中的一项或更多项的任意组合和所有组合，并且可缩写为“/”。
空间相关的术语，诸如“在...下(under)”、“在...下(below)”、“低于(lower)”、“在...上(over)”、“上部(upper)”等可以在本文中使用，以便于描述如附图所示的一个元件或特征相对于另外的一个或更多个元件或特征的关系。将理解的是，空间相关的术语旨在包括除了附图中描绘的定向之外的使用或操作中的装置的不同的定向。例如，如果附图中的装置是反向的，如要素被描述为“在其他要素或特征下(under)”、“在其它要素或特征下(beneath)”，则所述要素将被定位成“在其他要素或特征上(over)”。因此，示例性术语“在...下(under)”可以涵盖在...上和在...下的两种方向。该装置可以以其他方式定向(旋转90度或以其他定向)，并且本文使用的空间相对描述词被相应地解释。类似地，除另外特别说明之外，术语“向上(upwardly)”、“向下(downwardly)”、“垂直(vertical)”、“水平(horizontal)”等在本文中仅用于说明的目的。
虽然术语“第一”和“第二”在本文中可以用于描述各种特征/元件(包括步骤)，但是这些特征/元件不应该受这些术语的限制，除非上下文另有说明。这些术语可以用于区分一个特征/元件与另一个特征/元件。因此，在不脱离本发明的教导的情况下，下面讨论的第一特征/元件可以被称为第二特征/元件，并且同理，下面讨论的第二特征/元件可以被称为第一特征/元件。
在本说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有要求，术语“包括/包含(comprise)”及其诸如“包括/包含(comprises)”和“包括/包含(comprising)”的变型意味着可以在方法和制品中共同使用各种部件(例如，组合物以及包括装置的设备和方法)。例如，术语“包括/包含(comprising)”将被理解为暗示包含任何所述的要素或步骤，但不排除任何其它要素或步骤。
通常，本文描述的设备和方法的任何一种应该被理解为包括性的，但是组分和/或步骤的全部或亚组可以可选地是排他性的，并且可以被表示为“由各种组件、步骤、子组分或子步骤组成”或可选地“基本上由各种组件、步骤、子组分或子步骤组成”。
如本文在说明书和权利要求书中使用的，包括在实施例中使用的，并且除非另有明确说明，所有数字可被读作仿佛前面有“约(about)”或“大约(approximately)”的词语，即使该术语没有明确出现。可以在描述幅度和/或位置时使用短语“约”或“大约”，来指示所描述的值和/或位置在值和/或位置的合理预期范围内。例如，数值可以具有为所陈述的值(或值的范围)的+/-0.1％、所陈述的值(或值的范围)的+/-1％、所陈述的值(或值的范围)的+/-2％、所陈述的值(或值的范围)的+/-5％、所陈述的值(或值的范围)的+/-10％等的值。本文给出的任何数值还应当理解为包括约或大约于该值，除非上下文另有说明。例如，如果值“10”被公开，则“约10”也被公开。本文列举的任何数值范围旨在包括包含在其中的所有子范围。还应当理解，在一个值被公开时，也公开了“小于或等于”该值、“大于或等于该值”以及值之间的可能范围，如本领域技术人员适当地理解的。例如，如果公开了值“X”，则也公开了“小于或等于X”以及“大于或等于X”(例如，其中X是数值)。还应当理解，在整个申请中，以多种不同的格式提供数据，并且该数据表示数据点的任何组合的端点和起始点以及范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则应当理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于、和等于10和15以及在10和15之间被认为是公开的。还应当理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则也公开了11、12、13以及14。
虽然上面描述了各种说明性实施方案，但是在不脱离如权利要求所描述的本发明的范围的情况下，可以对各种实施方案进行若干改变中的任一个。例如，在替代实施方案中，通常可以改变执行各种所描述的方法步骤的顺序，并且在其它替代实施方案中，可以一起跳过一个或更多个方法步骤。各种装置和系统实施方案的可选特征可以被包括在一些实施方案中而不被包括在其它实施方案中。因此，前面的描述主要被提供用于示例性目的，并且不应被解释为限制在权利要求中所阐述的本发明的范围。
本文所包括的实施例和说明通过说明而非限制的方式示出其中可以实践主题的具体实施方案。如所提到的，可以利用和从其导出其它实施方案，使得可以做出结构和逻辑替换和改变而不脱离本公开内容的范围。仅为了方便，本发明主题的这样的实施方案在本文中可单独地或共同地由术语“发明”来提及，并且不意图将本申请的范围主动地限制为任何单个发明或发明构思，如果实际上多于一个被公开的话。因此，虽然本文已经说明和描述了特定实施方案，但是被认为实现相同目的的任何布置可以替代所示的特定实施方案。本公开内容旨在覆盖各种实施方案的任何和所有修改或变型。在阅读以上描述后，以上实施方案的组合以及本文未具体描述的其它实施方案对于本领域的技术人员将是明显的。
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Claims (244)

1.一种方法，包括：
将第一多于一个序列转换探针(SCP)与包括一个或更多个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一个SCP包括包含靶特异性区域(TSR)和可环化信号特异性区域(SSR)的多核苷酸，所述可环化SSR包括包含一个或更多个引物区域的第一工程化多核苷酸标志物，此外其中所述第一多于一个SCP包括被配置为与不同的靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，其中所述第一多于一个SCP的每一个SCP包括相同的SSR；
使所述TSR与所述样品混合物内的一个或更多个靶测量对象杂交；
切割具有与所述一个或更多个靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；和
使所述cSSR的每一个与锁探针杂交以产生环化复合物；
使所述环化复合物与环化剂接触以使所述cSSR环化；以及
检测来自环化的cSSR的所述第一工程化多核苷酸标志物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使所述cSSR的每一个与所述锁探针杂交包括使所述cSSR的每一个与所述锁探针和SSR延伸探针杂交，其中所述SSR延伸探针包括用于在检测所述第一工程化多核苷酸标志物中使用的第二引物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述SSR被配置为不与所述样品混合物中的测量对象杂交。
4.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述第一工程化多核苷酸标志物包括使用所述环化的cSSR(cirSSR)和被配置为与所述一个或更多个引物区域杂交的一个或更多个引物进行数字PCR以扩增所述第一工程化多核苷酸标志物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中进行数字PCR包括将cirSSR池以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得所述反应样品的至少一些包含cirSSR，而一些不包含cirSSR。
6.根据权利要求3所述的方法，还包括分析在单独反应样品中所述cSSR的所述第一工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示在所述反应样品中推定整倍性染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示在所述反应样品中推定非整倍性染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字。
7.根据权利要求4所述的方法，还包括通过比较所述第一数字与所述第二数字来确定非整倍性的存在或不存在，其中所述第一数字与所述第二数字之间的差异指示非整倍性的存在。
8.根据权利要求1所述的方法，其中使所述cSSR的每一个与所述锁探针杂交包括使用相同多核苷酸序列的所述锁探针与所述cSSR的全部杂交。
9.根据权利要求1所述的方法，还包括在使所述环化复合物与所述环化剂接触之后，用一种或更多种外切核酸酶消化所述混合物中的非环状DNA。
10.根据权利要求1所述的方法，其中每一组SCP的SSR指示不同的染色体。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品混合物中的一个或更多个靶测量对象包括无细胞DNA(cfDNA)。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品混合物包括来自母体血液样品的母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述环化剂是连接酶。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述可环化SSR还包括第一杂交区域和第二杂交区域，其中所述第一杂交区域和所述第二杂交区域被配置为与所述锁探针杂交。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或更多个引物区域包括布置在所述可环化SSR上，使得除非所述可环化SSR被环化，否则针对所述正向引物区域和所述第二引物区域的PCR扩增引物不能在所述可环化SSR上扩增所述第一工程化多核苷酸标志物的正向引物区域和反向引物区域。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述锁探针被配置为与所述第一工程化多核苷酸标志物的至少一部分以及与所述正向引物区域的至少一部分杂交以产生环化复合物。
17.根据权利要求1所述的方法，其中将所述第一多于一个SCP合并还包括将第二多于一个SCP与所述样品混合物合并，其中所述第二多于一个SCP包括被配置为与不同的靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，其中所述第二多于一个SCP的每一个SCP包括相同的第二SSR，其中所述相同的第二SSR不同于所述第一多于一个SCP的SSR。
18.根据权利要求1所述的方法，其中检测来自所述环化的cSSR的所述第一工程化多核苷酸标志物包括检测微小残留病监测的方法。
19.根据权利要求1所述的方法，其中检测来自所述环化的cSSR的所述第一工程化多核苷酸标志物包括检测移植排斥的方法。
20.一种方法，包括：
将第一多于一个序列转换探针(SCP)与包括一个或更多个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一个SCP包括包含靶特异性区域(TSR)和可环化信号特异性区域(SSR)的多核苷酸，所述可环化SSR包括包含一个或更多个引物区域的第一工程化多核苷酸标志物，此外其中所述第一多于一个SCP包括被配置为与不同的靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，其中所述第一多于一个SCP的每一个SCP包括相同的SSR；
使所述TSR与所述样品混合物内的一个或更多个靶测量对象杂交；
切割具有与所述一个或更多个靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR，其中所述切割不产生单链突出端；和
使所述cSSR的每一个与具有第一序列的锁探针杂交以产生环化复合物；
使所述环化复合物与环化剂接触以使所述cSSR环化；以及
通过使用环化的cSSR(cirSSR)和被配置为与所述一个或更多个引物区域杂交的一个或更多个引物进行数字PCR以扩增所述第一工程化多核苷酸标志物来检测所述第一工程化多核苷酸标志物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中使所述cSSR的每一个与锁探针杂交包括使所述cSSR的每一个与锁探针和SSR延伸探针杂交，其中所述SSR延伸探针包括用于在检测所述第一工程化多核苷酸标志物中使用的第二引物区域。
22.根据权利要求20所述的方法，其中进行数字PCR包括将cirSSR池以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得所述反应样品的至少一些包含cirSSR，而一些不包含cirSSR。
23.根据权利要求20所述的方法，还包括分析在单独反应样品中所述cSSR的所述第一工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示在所述反应样品中推定整倍性染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示在所述反应样品中推定非整倍性染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字。
24.根据权利要求23所述的方法，还包括通过比较所述第一数字与所述第二数字来确定非整倍性的存在或不存在，其中所述第一数字与所述第二数字之间的差异指示非整倍性的存在。
25.根据权利要求20所述的方法，还包括在使所述环化复合物与所述环化剂接触之后，用一种或更多种外切核酸酶消化所述混合物中的非环状DNA。
26.根据权利要求20所述的方法，其中所述样品混合物中的一个或更多个靶测量对象包括无细胞DNA (cfDNA)。
27.根据权利要求20所述的方法，其中所述样品混合物包括来自母体血液样品的母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物。
28.根据权利要求20所述的方法，其中所述环化剂是连接酶。
29.根据权利要求20所述的方法，其中所述可环化SSR还包括第一杂交区域和第二杂交区域，其中所述第一杂交区域和所述第二杂交区域被配置为与所述锁探针杂交。
30.根据权利要求20所述的方法，其中所述cirSSR包括布置在所述cirSSR上，使得除非所述cirSSR被环化，否则针对所述正向引物区域和所述第二引物区域的PCR扩增引物不能在所述cirSSR上扩增所述第一工程化多核苷酸标志物的正向引物区域和反向引物区域。
31.根据权利要求20所述的方法，其中使所述cSSR的每一个与锁探针杂交包括使所述cSSR的5’末端与所述锁探针的第一末端杂交，使所述cSSR的3’末端与所述锁探针的第二末端杂交，以及使包括第二引物区域的SSR延伸探针多核苷酸与所述锁探针的在所述第一末端与所述第二末端之间的部分杂交以产生环化复合物。
32.一种方法，包括：
将多于一组序列转换探针(SCP)与包括多于一个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一组SCP包括多于一个SCP，其中每一个SCP包括：
多核苷酸靶特异性区域(TSR)，和
可环化信号特异性区域(SSR)，所述可环化SSR包括第一工程化多核苷酸标志物，所述第一工程化多核苷酸标志物包括一个或更多个引物区域，
此外，其中所述多于一个SCP包括不同的TSR；
其中每一组SCP包括相同的SSR和多于一个不同的TSR，所述多于一个不同的TSR各自被配置为与不同的靶测量对象杂交；
使所述TSR与所述样品混合物中的靶测量对象杂交；
切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；
使所述cSSR的每一个与锁探针杂交以产生环化复合物；
使所述环化复合物与环化剂接触以使所述cSSR环化；以及
检测来自环化的cSSR的所述第一工程化多核苷酸标志物。
33.一种确定胎儿非整倍性的方法，所述方法包括：
将包括多于一个靶测量对象的母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物与多于一组序列转换探针(SCP)合并，其中每一组SCP包括多于一个SCP，此外其中每一个SCP包括：
多核苷酸靶特异性区域(TSR)，和
可环化信号特异性区域(SSR)，所述可环化SSR包括第一工程化多核苷酸标志物，所述第一工程化多核苷酸标志物包括一个或更多个引物区域，
此外，其中所述多于一个SCP包括不同的TSR；
其中每一组SCP包括相同的SSR和被配置为与不同的靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR；
使所述TSR与所述混合物中的靶测量对象杂交；
切割具有与所述靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；
使所述cSSR的每一个与锁探针杂交以产生环化复合物；
使所述环化复合物与环化剂接触以使所述cSSR环化；
将环化的cSSR以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得所述反应样品的至少一些包含cSSR，而一些不包含cSSR；
分析单独反应样品中所述cSSR的所述工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示所述反应样品中推定整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示所述反应样品中推定非整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字；以及
通过比较所述第一数字与所述第二数字来确定胎儿非整倍性的存在或不存在。
34.根据权利要求33所述的方法，其中将所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物与所述多于一个SCP合并还包括将所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物与第二多于一个SCP合并，其中所述第二多于一个SCP包括被配置为与来自所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的不同靶测量对象杂交的第二多于一个不同的TSR，并且所述第二多于一个SCP的每一个SCP包括包含一个或更多个第二引物区域的第二多于一个不同的工程化多核苷酸标志物。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述第一多于一个不同的工程化多核苷酸标志物指示所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的第一染色体，并且所述第二多于一个不同的工程化多核苷酸标志物指示所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的第二染色体。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述第一多于一个不同的工程化多核苷酸标志物指示所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的不同染色体。
37.根据权利要求33所述的方法，其中所述工程化多核苷酸标志物各自指示所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的染色体。
38.根据权利要求33所述的方法，其中所述多于一个SCP包括被配置为与来自所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的不同染色体上的靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，并且其中所述第一多于一个不同的工程化多核苷酸标志物指示TSR对应于所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的哪个染色体。
39.根据权利要求33所述的方法，其中所述工程化多核苷酸标志物的一个或更多个和一个或更多个第二引物区域是与所述母体遗传物质和胎儿遗传物质非关联的。
40.根据权利要求33所述的方法，其中所述多于一个SCP包括被配置为与来自所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的同一染色体上的不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR。
41.根据权利要求33所述的方法，其中所述多于一个SCP包括被配置为与来自所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的不同染色体上的不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR。
42.根据权利要求33所述的方法，其中将所述cSSR分配到所述多于一个反应样品中包括以低体积和/或高稀释度分配所述cSSR，由此在包含增加拷贝数的靶测量对象的样品中检测到更多工程化多核苷酸标志物。
43.根据权利要求33所述的方法，其中所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物取自少于4mL的血液。
44.根据权利要求33所述的方法，其中使所述cSSR的每一个与所述锁探针杂交包括使用相同多核苷酸序列的所述锁探针与所述cSSR的全部杂交。
45.根据权利要求33所述的方法，还包括在使所述环化复合物与所述环化剂接触之后，用一种或更多种外切核酸酶消化所述混合物中的非环状DNA。
46.根据权利要求33所述的方法，其中所述环化剂是连接酶。
47.根据权利要求33所述的方法，其中所述可环化SSR还包括第一杂交区域和第二杂交区域，其中所述第一杂交区域和所述第二杂交区域被配置为与所述锁探针杂交。
48.根据权利要求33所述的方法，其中所述一个或更多个引物区域包括布置在所述可环化SSR上，使得除非所述cirSSR被环化，否则针对所述正向引物区域和所述第二引物区域的PCR扩增引物不能在所述可环化SSR上扩增所述第一工程化多核苷酸标志物的正向引物区域和反向引物区域。
49.根据权利要求33所述的方法，其中所述锁探针被配置为与所述第一工程化多核苷酸标志物的至少一部分以及与所述正向引物区域的至少一部分杂交以产生环化复合物。
50.一种确定胎儿非整倍性的方法，所述方法包括：
将母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物与多于一个序列转换探针(SCP)合并，其中每一个SCP包括多核苷酸靶特异性区域(TSR)和信号特异性区域(SSR)，其中所述TSR被配置为与来自所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的靶测量对象杂交，并且其中所述SSR包括包含一个或更多个引物区域的工程化多核苷酸标志物，此外其中所述多于一个SCP包括被配置为与来自所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的不同靶测量对象杂交的多于一个不同TSR，并且所述多于一个SCP的每一个SCP包括第一多于一个不同工程化多核苷酸标志物中的一个工程化多核苷酸标志物；
使所述多于一个SCP的所述TSR与所述靶测量对象杂交；
从具有与所述靶测量对象杂交的TSR的多于一个SCP切割SCP，而不留下单链突出端，以释放切割的SSR(cSSR)；
使所述cSSR的每一个与具有第一多核苷酸序列的锁探针杂交以产生环化复合物；
使所述环化复合物与环化剂接触以使所述cSSR环化；
将环化的cSSR以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得所述反应样品的至少一些包含环化的cSSR，而一些不包含环化的cSSR；
分析单独反应样品中所述环化的cSSR的所述工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示所述反应样品中推定整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示所述反应样品中推定非整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字；
通过鉴定所述第一数字与所述第二数字之间的差异来确定胎儿非整倍性的存在或不存在。
51.根据权利要求50所述的方法，其中将所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物与所述多于一个SCP合并还包括将所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物与第二多于一个SCP合并，其中所述第二多于一个SCP包括被配置为与来自所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的不同靶测量对象杂交的第二多于一个不同的TSR，并且所述第二多于一个SCP的每一个SCP包括所述一个或更多个第二引物区域和第二多于一个不同的工程化多核苷酸标志物中的一个工程化多核苷酸标志物。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述第一多于一个不同的工程化多核苷酸标志物指示所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的第一染色体，并且所述第二多于一个不同的工程化多核苷酸标志物指示所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的第二染色体。
53.根据权利要求50所述的方法，其中所述第一多于一个不同的工程化多核苷酸标志物指示所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的不同染色体。
54.根据权利要求50所述的方法，其中所述工程化多核苷酸标志物各自指示所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的染色体。
55.根据权利要求50所述的方法，其中所述多于一个SCP包括被配置为与来自所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的不同染色体上的靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，并且其中所述第一多于一个不同的工程化多核苷酸标志物指示TSR对应于所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的哪个染色体。
56.根据权利要求50所述的方法，其中所述工程化多核苷酸标志物的一个或更多个和一个或更多个第二引物区域是与所述母体遗传物质和胎儿遗传物质非关联的。
57.根据权利要求50所述的方法，其中所述多于一个SCP包括被配置为与来自所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的同一染色体上的不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR。
58.根据权利要求50所述的方法，其中所述多于一个SCP包括被配置为与来自所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的不同染色体上的不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR。
59.根据权利要求50所述的方法，其中将所述cSSR分配到所述多于一个反应样品中包括以低体积和/或高稀释度分配所述cSSR，由此更多工程化多核苷酸标志物在包含增加拷贝数的靶测量对象的样品中被检测到。
60.根据权利要求50所述的方法，其中所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物取自少于4mL的血液。
61.一种方法，包括：
使序列转换探针(SCP)的靶特异性区域(TSR)与混合物中的靶测量对象杂交；
切割具有与所述靶测量物杂交的TSR的SCP，以将切割的序列特异性区域(cSSR)从所述SCP释放到所述混合物中；
将包括第二引物区域的SSR延伸探针连接至所述cSSR，以形成长SSR；以及
使用所述长SSR和被配置为与所述cSSR的一个或更多个引物区域以及与所述SSR延伸探针的第二引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增所述长SSR的一部分。
62.根据权利要求61所述的方法，其中进行数字PCR包括将长SSR池以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得所述反应样品的至少一些包含长SSR，而一些不包含长SSR。
63.根据权利要求61所述的方法，还包括分析单独反应样品中所述长SSR的所述第一工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示所述反应样品中推定整倍性染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示所述反应样品中推定非整倍性染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字。
64.一种确定胎儿非整倍性的方法，所述方法包括：
将母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物与包括序列转换探针(SCP)的第一亚组和SCP的第二亚组的多于一个SCP合并，其中所述多于一个SCP中的所述SCP的每一个包括：
多核苷酸靶特异性区域(TSR)和信号特异性区域(SSR)，其中所述TSR被配置为与来自所述母体遗传物质和胎儿遗传物质的靶测量物杂交，并且其中所述SSR包括具有正向引物区域和反向引物区域的工程化多核苷酸标志物，
此外，其中所述SCP的第一亚组包括被配置为与第一染色体上的不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，并且所述SCP的第一亚组的每一个SCP包括指示所述第一染色体的相同的第一正向引物区域和相同的第一反向引物区域，
此外，其中所述SCP的第二亚组包括被配置为与第二染色体上的不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，并且所述SCP的第二亚组的每一个SCP包括指示所述第二染色体的相同的第二正向引物区域和相同的第二反向引物区域，其中所述第二正向引物区域与所述第一正向引物区域相同或不同，并且所述第二反向引物区域与所述第二正向引物区域相同或不同；
使所述多于一个SCP的TSR与所述靶测量对象杂交；
将SCP从具有与所述靶测量对象杂交的TSR的多于一个SCP切割，以释放切割的SSR(cSSR)；
将所述cSSR与未杂交的SCP分离；
使所述cSSR的每一个与具有第一多核苷酸序列的锁探针杂交以产生环化复合物；
使所述环化复合物与环化剂接触以使所述cSSR环化；
将环化的cSSR以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得所述反应样品的至少一些包含环化的cSSR，而一些不包含环化的cSSR；
分析在单独反应样品中所述环化的cSSR的所述工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示在所述反应样品中推定整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示在所述反应样品中推定非整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字；
通过比较所述第一数字与所述第二数字来确定胎儿非整倍性的存在或不存在。
65.一种序列转换探针(SCP)，所述SCP包括：
在14个与50个碱基对(bp)之间延伸的靶特异性区域(TSR)，其中所述TSR的多核苷酸序列仅与人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性，其中所述TSR包括II型限制性酶的关联限制性位点，所述II型限制性酶具有位于所述TSR的第一末端处或附近的切割位点，此外其中所述TSR具有大于50％的GC含量；以及
具有延伸大于40bp的多核苷酸序列的序列特异性区域(SSR)，其中所述SSR序列的多核苷酸序列不出现在所述人类基因组中，此外其中所述SSR具有大于50％的CG含量，
其中所述TSR在所述第一末端处连接至所述SSR，此外其中所述关联限制性位点不是所述SCP中发夹结构的部分。
66.根据权利要求65所述的序列转换探针，其中所述SSR包括正向引物区域和反向引物区域。
67.根据权利要求65所述的序列转换探针，其中所述SSR包括正向引物区域和反向引物区域以及在所述正向引物区域与所述反向引物区域之间的无碱基区域。
68.根据权利要求65所述的序列转换探针，其中所述SCP具有预测的二级结构，所述二级结构具有少于50kcal/mol的绝对最小自由能(MFE)。
69.根据权利要求65所述的序列转换探针，其中所述II型限制性酶的切割位点位于所述TSR的5’末端处。
70.根据权利要求65所述的序列转换探针，其中所述TSR具有大于55℃的解链温度(Tm)。
71.根据权利要求65所述的序列转换探针，其中所述TSR具有大于50％的GC含量。
72.根据权利要求65所述的序列转换探针，其中所述II型限制性酶切割而不产生单链突出端。
73.根据权利要求65所述的序列转换探针，其中所述II型限制性酶是以下之一：BsaI、BspQI、BbsI-HF、BtsCI、BtsI-v2、BtsIMutI、FauI、BsrDI、BsrI、BsmBI、BsmFI和BsmI。
74.根据权利要求65所述的序列转换探针，其中所述II型限制性酶是以下之一：BsaI和BspQI。
75.根据权利要求65所述的序列转换探针，还包括亲和标签。
76.根据权利要求75所述的序列转换探针，其中所述亲和标签包括多于一个生物素标签。
77.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
第一序列转换探针(SCP)，包括：
在14个与50个碱基对(bp)之间延伸的靶特异性区域(TSR)，其中所述TSR的多核苷酸序列仅与人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性，其中所述TSR包括II型限制性酶的关联限制性位点，所述II型限制性酶具有位于所述TSR的第一末端处或附近的切割位点，此外其中所述TSR具有大于50％的GC含量；
具有延伸大于40bp的多核苷酸序列的序列特异性区域(SSR)，其中所述SSR序列的多核苷酸序列不出现在所述人类基因组中，此外其中所述SSR具有大于50％的CG含量，其中所述TSR在所述第一末端处连接至所述SSR，此外其中所述关联限制性位点不是所述SCP中发夹结构的部分；和
所述SSR中的至少第一引物区域；和
与所述第一引物区域杂交的第一引物；以及
与所述SSR的5’末端和所述SSR的3’末端两者杂交的锁探针。
78.根据权利要求77所述的试剂盒，其中所述SSR还包括所述SSR中的第二引物区域，此外其中所述试剂盒包括与所述第二引物区域杂交的第二引物。
79.根据权利要求77所述的试剂盒，还包括所述II型限制性酶。
80.一种序列转换探针(SCP)，所述SCP包括：
在14个与50个碱基对(bp)之间延伸的靶特异性区域(TSR)，其中所述TSR的多核苷酸序列仅与人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性，其中所述TSR包括用于II型限制性酶的关联限制性位点，所述II型限制性酶具有位于所述TSR的第一末端处或附近的切割位点；和
延伸大于40bp的序列特异性区域(SSR)，其中所述SSR序列的多核苷酸序列不出现在所述人类基因组中并且不会与人类染色体多核苷酸退火，此外其中所述SSR包括正向引物区域和反向引物区域以及在所述正向引物区域与所述反向引物区域之间的无碱基区域，
其中所述TSR在所述第一末端处连接至所述SSR，此外其中所述关联限制性位点不是所述SCP中发夹结构的部分，并且所述SCP具有大于50％的GC含量。
81.根据权利要求80所述的序列转换探针，其中所述SSR包括正向引物区域和反向引物区域。
82.根据权利要求80所述的序列转换探针，其中所述SSR包括正向引物区域和反向引物区域以及在所述正向引物区域与所述反向引物区域之间的无碱基区域。
83.根据权利要求80所述的序列转换探针，其中所述SCP具有预测的二级结构，所述二级结构具有少于50kcal/mol的绝对最小自由能(MFE)。
84.根据权利要求80所述的序列转换探针，其中所述TSR具有大于55℃的解链温度(Tm)。
85.根据权利要求80所述的序列转换探针，其中所述II型限制性酶切割而不产生单链突出端。
86.根据权利要求80所述的序列转换探针，其中所述II型限制性酶是以下之一：BsaI、BspQI、BbsI-HF、BtsCI、BtsI-v2、BtsIMutI、FauI、BsrDI、BsrI、BsmBI、BsmFI和BsmI。
87.根据权利要求80所述的序列转换探针，其中所述II型限制性酶是以下之一：BsaI和BspQI。
88.根据权利要求80所述的序列转换探针，还包括亲和标签。
89.根据权利要求88所述的序列转换探针，其中所述亲和标签包括多于一个生物素标签。
90.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
第一序列转换探针(SCP)，包括：
在15个与50个碱基对(bp)之间延伸的第一靶特异性区域(TSR)，其中所述第一TSR的多核苷酸序列仅与人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性，其中所述第一TSR包括用于II型限制性酶的关联限制性位点，所述II型限制性酶具有位于所述第一TSR的第一末端处或附近的切割位点，此外其中所述第一TSR具有大于50％的GC含量；和
具有延伸大于40bp的多核苷酸序列的第一序列特异性区域(SSR)，其中所述第一SSR序列的多核苷酸序列不出现在所述人类基因组中，此外其中所述第一SSR具有大于50％的CG含量，
其中所述第一TSR在所述第一末端处连接至所述第一SSR，此外其中所述关联限制性位点不是所述第一SCP中发夹结构的部分；以及
第二SCP，包括：
在15个与50个碱基对(bp)之间延伸的第二TSR，其中所述第二TSR的多核苷酸序列仅与所述人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性，其中所述第二TSR包括用于所述II型限制性酶的关联限制性位点，所述II型限制性酶具有位于所述第二TSR的第一末端处或附近的切割位点，此外其中所述第二TSR具有大于50％的GC含量；和
具有与所述第一SSR相同的多核苷酸序列的第二SSR，其中所述第二TSR在所述第一末端处连接至所述第二SSR，此外其中所述关联限制性位点不是所述第二SCP中发夹结构的部分。
91.根据权利要求90所述的试剂盒，还包括与所述第一SSR和所述第二SSR两者上的正向引物区域杂交的正向引物；其中所述试剂盒还包括：包括反向引物区域的SSR延伸探针、反向引物和被配置为与所述第一SSR和所述第二SSR以及所述SSR延伸探针杂交的锁探针。
92.根据权利要求90所述的试剂盒，其中所述第一SSR和所述第二SSR各自包括正向引物区域和反向引物区域以及在所述正向引物区域与所述反向引物区域之间的无碱基区域。
93.根据权利要求90所述的试剂盒，还包括所述II型限制性酶。
94.一种方法，包括：
将多于一个序列转换探针(SCP)与包括一个或更多个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一个SCP包括包含靶特异性区域(TSR)和信号特异性区域(SSR)的多核苷酸，所述SSR包括第一工程化多核苷酸标志物，此外其中所述多于一个SCP包括不同的TSR；
使所述SCP的TSR与所述一个或更多个靶测量对象杂交；
切割具有与所述一个或更多个靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；以及
检测来自所述cSSR的所述第一工程化多核苷酸标志物。
95.一种方法，所述方法包括：
将多于一个序列转换探针(SCP)与包括一个或更多个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一个SCP包括包含靶特异性区域(TSR)和信号特异性区域(SSR)的多核苷酸，所述信号特异性区域(SSR)包括包含一个或更多个引物区域的第一工程化多核苷酸标志物，此外其中所述多于一个SCP包括被配置为与不同的靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，其中所述多于一个SCP的每一个SCP包括相同的SSR；
使所述SCP的TSR与所述样品混合物内的靶测量对象杂交；
切割具有与所述一个或更多个靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；以及
检测来自所述cSSR的所述第一工程化多核苷酸标志物。
96.一种方法，包括：
将多于一个序列转换探针(SCP)与包括一个或更多个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一个SCP包括包含靶特异性区域(TSR)和信号特异性区域(SSR)的多核苷酸，所述SSR包括包含一个或更多个引物区域的第一工程化多核苷酸，此外其中所述多于一个SCP包括被配置为与不同的靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，并且所述多于一个SCP的每一个SCP包括相同的一个或更多个引物区域；
使所述SCP的TSR与所述一个或更多个靶测量对象杂交；
切割具有与所述一个或更多个靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；
将所述cSSR与未杂交的SCP和所述杂交的TSR分离；以及
检测来自所述cSSR的所述第一工程化多核苷酸标志物。
97.一种方法，包括：
将多于一个序列转换探针(SCP)与包括一个或更多个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一个SCP包括多核苷酸靶特异性区域(TSR)和信号特异性区域(SSR)，所述SSR包括包含第一引物区域的第一工程化多核苷酸标志物，此外其中所述多于一个SCP包括被配置为与不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，其中所述多于一个SCP的至少一些SCP具有不同的第一引物区域，其中存在的不同的第一引物区域比存在的不同的TSR更少；
使所述SCP的TSR与所述样品混合物内的一个或更多个靶测量对象杂交；
切割具有与所述一个或更多个靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；
将包括第二引物区域的SSR延伸探针连接至所述cSSR；以及
检测来自所述cSSR的所述第一工程化多核苷酸标志物。
98.一种方法，包括：
将多于一个序列转换探针(SCP)与包括一个或更多个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一个SCP包括多核苷酸靶特异性区域(TSR)和信号特异性区域(SSR)，所述SSR包括包含第一正向引物区域和第一反向引物区域的第一工程化多核苷酸标志物，此外其中所述多于一个SCP包括被配置为与不同靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，其中所述多于一个SCP的至少一些SCP具有不同的第一正向引物区域和第一反向引物区域，其中存在的不同的第一正向引物区域和第一反向引物区域比存在的不同的TSR更少；
使所述SCP的TSR与所述样品混合物内的一个或更多个靶测量对象杂交；
切割具有与所述一个或更多个靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；
将所述cSSR与未杂交的SCP和所述杂交的TSR分离；以及
检测来自所述cSSR的所述第一工程化多核苷酸标志物。
99.根据权利要求97所述的方法，其中所述SSR的5’末端和所述SSR延伸探针的3’末端两者各自包括连接阻断剂。
100.根据权利要求96所述的方法，其中所述一个或更多个引物区域包括第一正向引物区域和第一反向引物区域，其中所述第一工程化多核苷酸标志物包括所述第一正向引物区域和所述第二正向引物区域。
101.根据权利要求94所述的方法，其中所述多于一个SCP包括多于一个不同的一个或更多个引物区域，使得不同SCP的一个或更多个引物区域的序列具有不同的序列。
102.根据权利要求93-101中任一项所述的方法，其中所述TSR位于所述SCP的3’末端处，并且所述SSR位于所述SCP的5’末端处。
103.根据权利要求93-102中任一项所述的方法，其中所述SCP还包括亲和标签。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述亲和标签是以下中的一种或更多种：肽标签或表位标签、多核苷酸标签或多于一个生物素标签。
105.根据权利要求103所述的方法，其中所述亲和标签包括至少2个生物素标签。
106.根据权利要求93-94中任一项所述的方法，还包括将所述cSSR与未切割的SCP和杂交的TSR分离。
107.根据权利要求95或97中任一项所述的方法，其中分离所述cSSR包括在不消化所述cSSR的情况下消化未切割的SCP和杂交的TSR。
108.根据权利要求103-106中任一项所述的方法，其中分离所述cSSR包括使所述亲和标签结合至基底以去除所述未杂交的SCP和所述杂交的TSR。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述基底是磁珠。
110.根据权利要求95或97中任一项所述的方法，其中分离所述cSSR包括使所述cSSR环化。
111.根据权利要求110所述的方法，还包括切割任何未环化的多核苷酸。
112.根据权利要求93-111中任一项所述的方法，其中所述样品混合物是生物样品或是从生物样品中提取的。
113.根据权利要求93-96中任一项所述的方法，其中在每一个SCP上，所述TSR在亲和标签与所述SSR之间。
114.根据权利要求93-113中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个靶测量对象是DNA或RNA。
115.根据权利要求93-113中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个靶测量对象是mRNA、微RNA、rRNA、snRNA或RNAi。
116.根据权利要求93-115中任一项所述的方法，其中所述TSR长度在14bp与50bp之间。
117.根据权利要求93-115中任一项所述的方法，其中所述TSR长度在14bp与35bp之间。
118.根据权利要求93-115中任一项所述的方法，其中所述TSR被配置为与具有至少一个错配的所述一个或更多个靶测量对象杂交。
119.根据权利要求93-118中任一项所述的方法，其中切割包括用核酸酶切割与一个或更多个靶测量对象杂交的SCP。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述核酸酶是以下中的一种或更多种：瓣状内切核酸酶/5’核酸酶、双链核酸酶、RNA特异性核酸酶、CAS。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述核酸酶包括以下中的一种：RNA酶H、双链特异性核酸酶(DSN)、双链DNA酶(dsDNA酶)和限制性内切核酸酶。
122.根据权利要求121所述的方法，其中所述核酸酶包括RNA酶H2。
123.根据权利要求121所述的方法，其中所述核酸酶包括限制性酶。
124.根据权利要求123所述的方法，其中所述限制性酶是以下中的一种或更多种：BsmI、BsmBI-v2、BspQI、BsaI、BsaI-HF-v2和BssHII。
125.根据权利要求93-126中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个靶测量对象是RNA。
126.根据权利要求93-125中任一项所述的方法，其中所述SCP包括被配置为用作裂解位点的至少一个限制性位点，所述裂解位点是用于切割具有与所述一个或更多个靶测量对象杂交的TSR的SCP的裂解位点。
127.根据权利要求93-125中任一项所述的方法，其中所述SCP包括被配置为用作裂解位点的至少一个核糖，所述裂解位点是用于切割具有与所述一个或更多个靶测量对象杂交的TSR的SCP的裂解位点。
128.根据权利要求93-127中任一项所述的方法，其中检测来自所述cSSR的所述第一工程化多核苷酸标志物包括扩增所述第一工程化多核苷酸标志物。
129.根据权利要求97所述的方法，其中检测来自所述cSSR的所述第一工程化多核苷酸标志物包括使用被配置为与所述第一正向引物区域杂交的引物和被配置为与所述第一反向引物区域杂交的引物扩增所述第一工程化多核苷酸标志物。
130.根据权利要求97所述的方法，其中检测来自所述cSSR的所述第一工程化多核苷酸标志物包括使用被配置为与所述不同的第一正向引物区域杂交的引物和被配置为与所述第一反向引物区域杂交的引物扩增所述第一工程化多核苷酸标志物。
131.根据权利要求93-130中任一项所述的方法，其中检测所述第一工程化多核苷酸标志物包括使所述cSSR与标记的信号探针杂交并且检测来自所述标记的信号探针的信号。
132.根据权利要求93-131中任一项所述的方法，其中检测所述第一工程化多核苷酸标志物包括使所述cSSR与标记的信号探针和与捕获探针杂交并且检测来自所述标记的信号探针的信号。
133.根据权利要求93-132中任一项所述的方法，其中检测所述第一工程化多核苷酸标志物包括使标记的cSSR与捕获探针杂交并且检测来自所述标记的cSSR探针的信号。
134.一种试剂盒，包括：
针对多于一个靶测量对象的第一多于一个序列转换探针(SCP)，其中每一个SCP包括被配置为与所述多于一个靶测量对象中的一个靶测量对象杂交的多核苷酸靶特异性区域(TSR)，其中所述TSR在亲和标签与信号特异性区域(SSR)之间，所述SSR包括第一工程化多核苷酸标志物；
被配置为切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP的核酸酶；以及
基底，包括与所述亲和标签特异性结合的结合配偶体。
135.一种方法，包括：
使序列转换探针(SCP)的靶特异性区域(TSR)与混合物中的靶测量对象杂交；
切割具有与所述靶测量物杂交的TSR的SCP，以将切割的序列特异性区域(cSSR)从所述SCP释放到所述混合物中；
使所述cSSR与锁探针在存在环化剂的情况下杂交，以使所述cSSR环化为环化的SSR(cirSSR)；以及
使用环化的SSR和被配置为与所述cSSR的一个或更多个引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增所述cSSR的一部分。
136.根据权利要求135所述的方法，其中进行数字PCR包括将cirSSR池以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得所述反应样品的至少一些包含cirSSR，而一些不包含cirSSR。
137.根据权利要求136所述的方法，还包括分析在单独反应样品中所述cSSR的所述第一工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示在所述反应样品中推定整倍性染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示在所述反应样品中推定非整倍性染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字。
138.根据权利要求137所述的方法，还包括通过比较所述第一数字与所述第二数字来确定非整倍性的存在或不存在，其中所述第一数字与所述第二数字之间的差异指示非整倍性的存在。
139.根据权利要求135所述的方法，还包括在使所述cirSSR环化之后用一种或更多种外切核酸酶消化非环状DNA。
140.根据权利要求135所述的方法，其中所述样品混合物中的靶测量对象包括无细胞DNA(cfDNA)。
141.根据权利要求135所述的方法，其中所述样品混合物包括来自母体血液样品的母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物。
142.根据权利要求135所述的方法，其中所述环化剂是连接酶。
143.根据权利要求135所述的方法，其中所述可环化SSR还包括第一杂交区域和第二杂交区域，其中所述第一杂交区域和所述第二杂交区域被配置为与所述锁探针杂交。
144.根据权利要求135所述的方法，其中所述一个或更多个引物区域包括布置在所述可环化SSR上，使得除非所述cirSSR被环化，否则针对所述正向引物区域和所述第二引物区域的PCR扩增引物不能在所述可环化SSR上扩增所述第一工程化多核苷酸标志物的正向引物区域和反向引物区域。
145.根据权利要求135所述的方法，其中所述锁探针被配置为与所述第一工程化多核苷酸标志物的至少一部分以及与所述正向引物区域的至少一部分杂交以产生环化复合物。
146.根据权利要求135所述的方法，其中将所述第一多于一个SCP合并还包括将第二多于一个SCP与所述样品混合物合并，其中所述第二多于一个SCP包括被配置为与不同的靶测量对象杂交的多于一个不同的TSR，其中所述第二多于一个SCP的每一个SCP包括不同于所述第一多于一个SCP的所述SSR的相同的SSR。
147.根据权利要求135所述的方法，其中检测来自所述环化的cSSR的所述第一工程化多核苷酸标记包括检测微小残留病监测的方法。
148.根据权利要求135所述的方法，其中检测来自所述环化的cSSR的所述第一工程化多核苷酸标志物包括检测移植排斥的方法。
149.一种试剂盒，包括：
针对多于一个靶测量对象的第一多于一个序列转换探针(SCP)，其中每一个SCP包括被配置为与所述多于一个靶测量对象中的一个靶测量对象杂交的多核苷酸靶特异性区域(TSR)，其中所述TSR在亲和标签与信号特异性区域(SSR)之间，所述SSR包括第一工程化多核苷酸标志物；
配置为切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP的核酸酶；以及
基底，包括与所述亲和标签特异性结合的结合配偶体。
150.一种试剂盒，包括：
针对第一多于一个靶测量对象的第一多于一个序列转换探针(SCP)，其中每一个SCP包括：
多核苷酸靶特异性区域(TSR)，被配置为与所述第一多于一个靶测量对象中的一个靶测量对象杂交，并且
其中所述TSR在亲和标签与信号特异性区域(SSR)之间，所述SSR包括第一工程化多核苷酸标志物，所述第一工程化多核苷酸标志物包括一个或更多个引物区域；
被配置为切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP的核酸酶；
被配置为与所述第一正向引物区域杂交的第一正向引物和被配置为与所述第一反向引物区域杂交的第一反向引物；以及
基底，包括与所述亲和标签特异性结合的结合配偶体。
151.根据权利要求149或150中任一项所述的试剂盒，其中所述TSR位于所述SCP的3’末端处，并且所述SSR位于所述SCP的5’末端处。
152.根据权利要求149-151中任一项所述的试剂盒，其中所述亲和标签包括多于一个生物素标签。
153.根据权利要求149-152中任一项所述的试剂盒，其中所述多于一个SCP包括多于一个不同的第一正向引物区域和第一反向引物区域，此外其中存在的不同的第一正向引物区域和第一反向引物区域比存在的不同的TSR显著更少。
154.根据权利要求153所述的试剂盒，其中所述多于一个SCP包括相同的第一正向引物区域和第一反向引物区域。
155.根据权利要求149-154所述的试剂盒，还包括被配置为与所述第一正向引物区域杂交的第一正向引物和被配置为与所述第一反向引物区域杂交的第一反向引物。
156.根据权利要求149-155中任一项所述的试剂盒，还包括针对不同于所述第一多于一个靶测量对象且彼此不同的一个或更多个另外的多于一个靶测量对象的一个或更多个另外的多于一个序列转换探针(SCP)，其中所述一个或更多个另外的多于一个SCP的每一个SCP包括：
多核苷酸靶特异性区域(TSR)，被配置为与所述一个或更多个另外的多于一个靶测量对象中的一个靶测量对象杂交，并且
其中所述TSR在所述亲和标签与第二信号特异性区域(sSSR)之间，其中所述一个或更多个另外的多于一个的每一个具有不同的sSSR，所述sSSR包括在第二一个或更多个引物区域之间的第二工程化多核苷酸标志物，其中对于所述一个或更多个另外的多于一个的每一个，所述第二正向引物区域与所述第一正向引物区域相同或不同，并且所述第二反向引物区域与所述第二正向引物区域相同或不同。
157.根据权利要求156所述的试剂盒，其中所述一个或更多个所述多于一个SCP的每一个包括多于一个不同的第二正向引物区域和第二反向引物区域，此外其中存在的不同的第二正向引物区域和第二反向引物区域比存在的不同的TSR显著更少。
158.根据权利要求149-157所述的试剂盒，还包括被配置为与所述第二正向引物区域杂交的第二正向引物和被配置为与所述第二反向引物区域杂交的第二反向引物。
159.根据权利要求149-158中任一项所述的试剂盒，其中所述TSR长度在14bp与50bp之间。
160.根据权利要求149-159中任一项所述的试剂盒，其中所述TSR长度在14bp与40bp之间。
161.根据权利要求149-160中任一项所述的试剂盒，其中所述亲和标签是生物素。
162.根据权利要求149-161中任一项所述的试剂盒，其中所述亲和标签是以下中的一种或更多种：肽标签或表位标签。
163.根据权利要求148-162中任一项所述的试剂盒，其中所述核酸酶是以下中的一种或更多种：瓣状内切核酸酶/5’核酸酶、双链核酸酶、RNA特异性核酸酶、CAS。
164.根据权利要求163所述的试剂盒，其中所述核酸酶包括以下中的一种：RNA酶H、双链体特异性核酸酶(DSN)、双链DNA酶(dsDNA酶)和限制性内切核酸酶。
165.根据权利要求163所述的试剂盒，其中所述核酸酶包括RNA酶H2。
166.根据权利要求163所述的试剂盒，其中所述核酸酶包括限制性酶。
167.根据权利要求163所述的试剂盒，其中所述限制性酶是以下中的一种或更多种：BsmI、BsmBI-v2、BspQI、BsaI、BsaI-HF-v2和BssHII。
168.根据权利要求149-167中任一项所述的试剂盒，其中所述SCP包括所述SSR上的信号标记。
169.根据权利要求149-168中任一项所述的试剂盒，其中所述基底是固相基底。
170.根据权利要求149-169中任一项所述的试剂盒，其中所述基底是磁珠。
171.根据权利要求149-170中任一项所述的试剂盒，其中所述SCP包括被配置为用作所述核酸酶的切割位点的至少一个核糖。
172.根据权利要求149-135中任一项所述的试剂盒，其中所述SCP包括被配置为用作内切核酸酶的切割位点的至少一个限制性位点。
173.根据权利要求149-172中任一项所述的试剂盒，还包括被配置为与所述工程化多核苷酸标志物杂交的捕获探针或所述捕获探针和所述工程化多核苷酸标志物的复合物。
174.根据权利要求149-173中任一项所述的试剂盒，还包括核酸扩增混合物。
175.一种方法，包括：
将多于一组序列转换探针(SCP)与包括多于一个靶测量对象的样品混合物合并，其中每一组SCP包括多于一个SCP，其中每一个SCP包括：
多核苷酸靶特异性区域(TSR)，
亲和标签，和
信号特异性区域(SSR)，包括
工程化多核苷酸标志物，和
一个或更多个引物区域，
其中每一组SCP包括被配置为与不同的靶测量对象和相同的SSR杂交的多于一个不同的TSR；
使所述多于一组SCP的所述SCP的TSR与所述靶测量对象杂交；
切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；
使用所述亲和标签将所述cSSR与未杂交的SCP和杂交的TSR分离，以形成cSSR池；以及
使用所述cSSR池和被配置为与所述cSSR的一个或更多个引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增所述工程化多核苷酸标志物。
176.一种数字PCR的方法，所述方法包括：
将遗传物质的混合物与序列转换探针(SCP)的混合物合并，其中所述SCP各自包括被配置为与所述遗传物质中的多于一个靶测量对象之一杂交的靶特异性区域(TSR)，以及包括一组工程化多核苷酸标志物之一的信号特异性区域(SSR)，所述一组工程化多核苷酸标志物各自指示所述靶测量对象的一个亚组；
使SCP的混合物的TSR与所述遗传物质中的靶测量对象杂交；
切割具有杂交的TSR的SCP，以从杂交的SCP释放切割的信号特异性区域(cSSR)；
使用与所述SCP的TSR相邻的亲和标记去除任何未切割的SCP，以形成cSSR池；以及
使用所述cSSR池和扩增所述cSSR的工程化多核苷酸标志物的对所述cSSR特异性的一个或更多个引物进行数字PCR。
177.一种数字PCR的方法，所述方法包括：
将遗传物质的混合物与序列转换探针(SCP)的混合物合并，其中所述SCP各自包括被配置为与所述遗传物质中的多于一个靶测量对象之一杂交的靶特异性区域(TSR)，以及包括一组工程化多核苷酸标志物之一的信号特异性区域(SSR)，所述一组工程化多核苷酸标志物指示与所述TSR杂交的靶测量对象位于哪个染色体上；
使SCP的混合物的TSR与所述遗传物质中的任何靶测量对象杂交；
切割具有杂交的TSR的SCP，以从杂交的SCP释放切割的信号特异性区域(cSSR)；
使用与所述SCP的TSR相邻的亲和标记去除任何未切割的SCP，以形成cSSR池；以及
使用所述cSSR池和扩增所述cSSR的工程化多核苷酸标志物的对所述cSSR特异性的一个或更多个引物进行数字PCR。
178.根据权利要求175-177中任一项所述的方法，其中所述TSR位于所述SCP的3’末端处，并且所述SSR位于所述SCP的5’末端处。
179.根据权利要求175-178中任一项所述的方法，其中所述亲和标签包括多于一个生物素标签。
180.根据权利要求179所述的方法，其中所述亲和标签包括至少2个生物素标签。
181.根据权利要求175-180中任一项所述的方法，其中使用所述cSSR池和所述一个或更多个引物进行数字PCR包括使用所述cSSR和对所述cSSR的全部具有特异性的单对引物进行数字PCR。
182.根据权利要求175-181中任一项所述的方法，其中使用所述cSSR池和所述一个或更多个引物进行数字PCR包括使用多于一个引物进行数字PCR，其中所述引物的总数少于靶测量对象的总数。
183.根据权利要求175-182中任一项所述的方法，其中所述遗传物质的混合物包括来自母体血液样品的母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物。
184.根据权利要求175-183中任一项所述的方法，其中切割包括用核酸酶切割。
185.根据权利要求184所述的方法，其中所述核酸酶是以下中的一种或更多种：瓣状内切核酸酶/5’核酸酶、双链核酸酶、RNA特异性核酸酶、CAS。
186.根据权利要求185所述的方法，其中所述核酸酶包括以下中的一种：RNA酶H、双链体特异性核酸酶(DSN)、双链DNA酶(dsDNA酶)和限制性内切核酸酶。
187.根据权利要求186所述的方法，其中所述核酸酶是RNA酶H2。
188.根据权利要求186所述的方法，其中所述核酸酶包括限制性酶。
189.根据权利要求188所述的方法，其中所述限制性酶是以下中的一种或更多种：BsmI、BsmBI-v2、BspQI、BsaI、BsaI-HF-v2和BssHII。
190.根据权利要求175-189中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸标志物是与所述遗传物质非关联的。
191.根据权利要求175-190中任一项所述的方法，其中进行数字PCR包括将所述cSSR池以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得所述反应样品的至少一些包含cSSR，而一些不包含cSSR。
192.根据权利要求191所述的方法，还包括分析在单独反应样品中所述cSSR的所述工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示在所述反应样品中推定整倍性染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示在所述反应样品中推定非整倍性染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字。
193.根据权利要求192所述的方法，还包括通过比较所述第一数字与所述第二数字来确定非整倍性的存在或不存在，其中所述第一数字与所述第二数字之间的差异指示非整倍性的存在。
194.根据权利要求175-193中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸标志物包括指示染色体13、18和21的每一个的标志物。
195.根据权利要求194所述的方法，其中所述工程化多核苷酸标志物包括指示染色体X&Y的每一个的标志物。
196.一种试剂盒，包括：
序列转换探针(SCP)的混合物，其中所述SCP各自包括被配置为与来自多于一条人类染色体的多于一个靶测量对象之一/多于一条人类染色体中的多于一个靶测量对象之一杂交的靶特异性区域(TSR)；包括一组工程化多核苷酸标志物之一的信号特异性区域(SSR)，所述一组工程化多核苷酸标志物指示与所述TSR杂交的靶测量对象位于哪个染色体上，其中所述工程化多核苷酸标志物的侧翼是正向引物区域和反向引物区域；以及所述SCP上不与所述SSR重叠的区域上的亲和标签；
被配置为切割具有与靶测量对象杂交的TSR的SCP的核酸酶；
基底，包括与所述亲和标签特异性结合的结合配偶体；以及
被配置为与所述第一正向引物区域杂交的第一正向引物和被配置为与所述第一反向引物区域杂交的第一反向引物。
197.根据权利要求196所述的试剂盒，还包括被配置为独特鉴定单独工程化多核苷酸标志物的一组探针。
198.根据权利要求196所述的试剂盒，其中所述TSR长度在14bp与50bp之间。
199.根据权利要求196所述的试剂盒，其中所述亲和标签是生物素。
200.根据权利要求196所述的试剂盒，其中所述亲和标签是以下中的一种或更多种：肽标签或表位标签。
201.根据权利要求196所述的试剂盒，其中所述核酸酶选自以下的组：RNA酶H、双链体特异性核酸酶、双链DNA酶(dsDNA酶)。
202.根据权利要求196所述的试剂盒，其中所述核酸酶是RNA酶H2。
203.根据权利要求196所述的试剂盒，其中所述核酸酶包括限制性内切核酸酶。
204.根据权利要求196所述的试剂盒，其中所述基底是固相基底。
205.根据权利要求196所述的试剂盒，其中所述基底是磁珠。
206.根据权利要求196所述的试剂盒，其中所述SCP包括被配置为用作所述核酸酶的切割位点的至少一个核糖。
207.一种方法，包括：
将多于一组环化序列转换探针(cSCP)与包括多于一个靶测量对象的样品混合物合并，其中cSCP的每一组包括多于一个cSCP，其中每一个cSCP包括：
第一末端，包括被配置为与第一靶特异性区域杂交的有义探针，
第二末端，包括被配置为与第二靶特异性区域杂交的反义探针，和
信号特异性区域(SSR)，包括
工程化多核苷酸标志物，包括：正向引物区域和反向引物区域，
其中cSCP的每一组包括相同的SSR和被配置为与不同的靶测量对象杂交的多于一个不同的第一靶特异性区域和第二靶特异性区域；
使所述多于一组cSCP的所述cSCP与所述靶测量对象杂交以产生环化复合物；
使所述环化复合物与环化剂接触以使所述环化复合物的cSCP环化；以及
使用环化的cSCP和被配置为与所述cSSR的正向引物区域和反向引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增所述工程化多核苷酸标志物。
208.一种方法，包括：
将环化序列转换探针(cSCP)的多于一个亚组与包括多于一个靶测量对象的样品混合物合并以形成合并的混合物，其中cSCP的每一个亚组包括多于一个cSCP，所述多于一个cSCP各自具有相同的包括工程化多核苷酸标志物的信号特异性区域(SSR)和被配置为与不同的靶测量对象杂交的一对靶特异性区域(TSR)；
使所述cSCP的多于一个亚组的cSCP与所述靶测量对象杂交以产生环化复合物；
使所述环化复合物与环化剂接触以使所述环化复合物的cSCP环化；
使所述合并的混合物中的未环化的cSCP与外切核酸酶接触以切割所述未环化的cSCP；以及
使用环化的cSCP和被配置为与所述SSR的一个或更多个引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增所述工程化多核苷酸标志物。
209.一种确定胎儿非整倍性的方法，所述方法包括：
将包括多于一个靶测量对象的母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物与多于一组环化序列转换探针(cSCP)合并，其中cSCP的每一组包括多于一个cSCP，此外其中每一个cSCP包括：
第一末端，包括对来自所述多于一个靶测量对象的特定靶测量对象特异性的第一靶特异性区域的有义探针，
第二末端，包括对所述特定靶测量对象特异性的第二靶特异性区域的反义探针，和
信号特异性区域(SSR)，包括
工程化多核苷酸标志物，指示与所述特定靶测量对象关联的人类染色体，
正向引物区域，和
反向引物区域，
其中cSCP的每一组包括相同的SSR和被配置为与不同的特定靶测量对象杂交的多于一个不同的第一靶特异性区域和第二靶特异性区域；
使所述多于一组cSCP的所述cSCP与所述靶测量对象杂交以产生环化复合物；
使所述环化复合物与环化剂接触以使所述环化复合物的cSCP环化；以及
将所述cSCP以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得所述反应样品的至少一些包含cSCP，而一些不包含cSCP；
分析在单独反应样品中所述cSCP的所述工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示在所述反应样品中推定整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示在所述反应样品中推定非整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字；
通过比较所述第一数字与所述第二数字来确定胎儿非整倍性的存在或不存在。
210.根据权利要求207-209中任一项所述的方法，其中每一组SCP的SSR指示不同的染色体。
211.根据权利要求207-209中任一项所述的方法，其中所述工程化多核苷酸标志物的侧翼是所述正向引物区域和反向引物区域，还包括使用外切核酸酶将环化的cSCP与线性cSCP分离。
212.根据权利要求207-209中任一项所述的方法，其中所述引物的数目比靶测量对象的数目少得多。
213.根据权利要求207-209中任一项所述的方法，其中所述样品混合物包括来自母体血液样品的母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物。
214.根据权利要求207-208中任一项所述的方法，其中进行数字PCR包括将所述cSCP池以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得所述反应样品的至少一些包含cSCP，而一些不包含cSCP。
215.根据权利要求214所述的方法，还包括分析在单独反应样品中所述cSCP的所述工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示在所述反应样品中推定整倍性染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示在所述反应样品中推定非整倍性染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字。
216.根据权利要求215所述的方法，还包括通过比较所述第一数字与所述第二数字来确定非整倍性的存在或不存在，其中所述第一数字与所述第二数字之间的差异指示非整倍性的存在。
217.根据权利要求207-216中任一项所述的方法，其中所述环化剂是连接酶。
218.一种方法，包括：
将引物偶联的靶特异性探针的多于一个亚组与包括多于一个靶测量对象的样品混合物合并以形成合并的混合物，其中每一个引物偶联的靶特异性探针包括被配置为与所述多于一个靶测量对象中的靶测量对象杂交的靶特异性区域和序列转换引物(SC引物)，其中所述引物偶联的靶特异性探针的每一个亚组包括相同的SC引物和多个不同的靶特异性区域；
使所述引物偶联的靶特异性探针的靶特异性区域与所述靶测量对象杂交；
切割与所述靶测量对象杂交的引物偶联的靶特异性探针以释放SC引物，而不释放未杂交的引物偶联的靶特异性探针的SC引物；
使所释放的SC引物与序列转换模板(SCT)接触，并且使所述SC引物延伸以形成所述SCT的拷贝，其中所述SCT包括工程化多核苷酸标志物；
将所述SCT的拷贝从所述SCT中取出；以及
使用所述SCT的拷贝和被配置为与所述SCT的拷贝上的一个或更多个引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增所述工程化多核苷酸标志物。
219.根据权利要求218所述的方法，其中切割与所述靶测量对象杂交的引物偶联的靶特异性探针包括使所述引物偶联的靶特异性探针与外切核酸酶接触。
220.根据权利要求218所述的方法，其中所述SC引物与亲和标签偶联，使得所述SC引物在从所述引物偶联的靶特异性探针的靶特异性区域切割之后保持加亲和标签。
221.根据权利要求218所述的方法，其中使所释放的SC引物与所述SCT接触包括使所释放的SC引物与环化的SCT接触。
222.根据权利要求218所述的方法，其中所述SCT各自与亲和标签偶联，并且其中将所述SCT的拷贝从所述SCT中取出包括将所述SCT与基底结合。
223.根据权利要求218所述的方法，其中所述一个或更多个靶测量对象是DNA或RNA。
224.根据权利要求223所述的方法，其中所述一个或更多个靶测量对象是mRNA、微RNA、rRNA、snRNA或RNAi。
225.一种确定胎儿非整倍性的方法，所述方法包括：
将引物偶联的靶特异性探针的多于一个亚组与包括多于一个靶测量对象的母体遗传物质和胎儿遗传物质的样品混合物合并以形成合并的混合物，其中每一个引物偶联的靶特异性探针包括被配置为与所述多于一个靶测量对象中的靶测量对象杂交的靶特异性区域(TSR)和序列转换引物(SC引物)，其中所述引物偶联的靶特异性探针的每一个亚组包括相同的SC引物和多个不同的靶特异性区域；
使所述引物偶联的靶特异性探针的靶特异性区域与所述靶测量对象杂交；
使所述引物偶联的靶特异性探针与外切核酸酶接触，以从被配置为与靶测量对象杂交的引物偶联的靶特异性探针释放SC引物，而不释放未杂交的引物偶联的靶特异性探针的SC引物；
使所释放的SC引物与偶联至亲和标签的序列转换模板(SCT)的亚组杂交；
使杂交的SC引物延伸以形成所述SCT的拷贝，其中所述SCT的拷贝包括工程化多核苷酸标志物；
使用所述亲和标签将所述SCT的拷贝从所述SCT中取出；以及
使用所述SCT的拷贝和被配置为与所述SCT拷贝上的一个或更多个引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增所述工程化多核苷酸标志物。
226.一种试剂盒，被配置为进行权利要求218-225中任一项所述的方法。
227.一种序列转换探针(SCP)，所述SCP包括：
在15个与50个碱基对(bp)之间延伸的靶特异性区域(TSR)，其中所述TSR的多核苷酸序列仅与人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性；以及
包括SEQ ID NO.1的序列的序列特异性区域(SSR)，其中所述TSR连接至所述SSR。
228.一种序列转换探针(SCP)，所述SCP包括：
在15个与50个碱基对(bp)之间延伸的靶特异性区域(TSR)，其中所述TSR的多核苷酸序列仅与人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性；以及
包括SEQ ID NO.1的序列的序列特异性区域(SSR)，其中所述SSR在所述序列内包括无碱基区域，此外其中所述TSR连接至所述SSR。
229.一种序列转换探针(SCP)，所述SCP包括：
在15个与50个碱基对(bp)之间延伸的靶特异性区域(TSR)，其中所述TSR的多核苷酸序列仅与人类基因组内一条染色体的单个区域具有至少80％的同一性；以及
序列特异性区域(SSR)，包括：与无碱基区域偶联的SEQ ID NO.10的多核苷酸，所述无碱基区域与SEQ ID NO.10的多核苷酸偶联，其中所述TSR连接至所述SSR。
230.一种序列转换探针(SCP)，所述SCP包括：
靶特异性区域(TSR)，具有以下任一项的序列：SEQ ID No.8、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.15、SEQ ID No.18、SEQ ID No.21、SEQ ID No.24、SEQ ID No.27、SEQ ID No.30、SEQ IDNo.33、SEQ ID No.36、SEQ ID No.39、SEQ ID No.42、SEQ ID No.45、SEQ ID No.48、SEQ IDNo.51、SEQ ID No.54、SEQ ID No.57、SEQ ID No.60、SEQ ID No 63、SEQ ID No.66、SEQ IDNo.69、SEQ ID No.72或SEQ ID No.75；以及
序列特异性区域(SSR)，具有SEQ ID NO.1的序列，其中所述TSR连接至所述SSR。
231.一种序列转换探针(SCP)，所述SCP包括：
靶特异性区域(TSR)，具有以下任一项的序列：SEQ ID No.8、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.15、SEQ ID No.18、SEQ ID No.21、SEQ ID No.24、SEQ ID No.27、SEQ ID No.30、SEQ IDNo.33、SEQ ID No.36、SEQ ID No.39、SEQ ID No.42、SEQ ID No.45、SEQ ID No.48、SEQ IDNo.51、SEQ ID No.54、SEQ ID No.57、SEQ ID No.60、SEQ ID No.63、SEQ ID No.66、SEQ IDNo.69、SEQ ID No.72或SEQ ID No.75；以及
序列特异性区域(SSR)，包括SEQ ID NO.1的序列，其中所述SSR在所述序列内包括无碱基区域，
此外，其中所述TSR连接至所述SSR。
232.一种序列转换探针(SCP)，所述SCP包括：
靶特异性区域(TSR)，具有以下任一项的序列：SEQ ID No.8、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.15、SEQ ID No.18、SEQ ID No.21、SEQ ID No.24、SEQ ID No.27、SEQ ID No.30、SEQ IDNo.33、SEQ ID No.36、SEQ ID No.39、SEQ ID No.42、SEQ ID No.45、SEQ ID No.48、SEQ IDNo.51、SEQ ID No.54、SEQ ID No.57、SEQ ID No.60、SEQ ID No.63、SEQ ID No.66、SEQ IDNo.69、SEQ ID No.72或SEQ ID No.75；以及
序列特异性区域(SSR)，包括：与无碱基区域偶联的SEQ ID NO.10的多核苷酸，所述无碱基区域与SEQ ID NO.11的多核苷酸偶联，其中所述TSR连接至所述SSR。
233.一种方法，包括：
使权利要求227-232中任一项所述的序列转换探针(SCP)的靶特异性区域(TSR)与混合物中的靶测量对象杂交；
切割具有与所述靶测量物杂交的TSR的SCP，以将切割的序列特异性区域(cSSR)从所述SCP释放到所述混合物中；
使所述cSSR与锁探针在存在环化剂的情况下杂交，以使所述cSSR环化为环化的SSR(cirSSR)；以及
使用所述cirSSR和被配置为与所述cirSSR的一个或更多个引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增所述cirSSR的至少一部分。
234.一种方法，包括：
将多于一组序列转换探针(SCP)与包括多于一个靶测量对象的样品混合物合并，其中所述组SCP的至少一个SCP是权利要求227-232中任一项所述的SCP，此外其中所述多于一个SCP包括不同的TSR，并且其中每一组SCP包括相同的SSR和被配置为与不同的靶测量对象杂交的多于一个不同的第一特异性区域和第二靶特异性区域；
使所述TSR与靶测量对象杂交；
切割具有与所述靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；
使所述cSSR的每一个与锁探针杂交以产生环化复合物；
使所述环化复合物与环化剂接触以使所述cSSR环化；以及
使用环化的cSSR(cirSSR)和被配置为与所述cirSSR的正向引物区域和反向引物区域杂交的引物进行数字PCR，以扩增所述cirSSR的至少一部分。
235.一种确定胎儿非整倍性的方法，所述方法包括：
将包括多于一个靶测量对象的母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物与多于一组序列转换探针(SCP)合并，其中每一组SCP包括多于一个SCP，此外其中所述组SCP的至少一个SCP是权利要求227-232中任一项所述的SCP，并且其中所述多于一个SCP包括不同的TSR，此外其中每一组SCP包括相同的SSR和被配置为与不同的靶测量对象杂交的多于一个不同的第一靶特异性区域和第二靶特异性区域；
使所述TSR与靶测量对象杂交；
切割具有与所述靶测量对象杂交的TSR的SCP，以释放切割的SSR(cSSR)，而不释放未杂交的SCP的SSR；
使所述cSSR的每一个与锁探针杂交以产生环化复合物；
使所述环化复合物与环化剂接触以使所述cSSR环化；和
将环化的cSSR以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得所述反应样品的至少一些包含cSSR，而一些不包含cSSR；
分析在单独反应样品中所述cSSR的所述工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示在所述反应样品中推定整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示在所述反应样品中推定非整倍性胎儿染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字；
通过比较所述第一数字与所述第二数字来确定胎儿非整倍性的存在或不存在。
236.根据权利要求233-235中任一项所述的方法，被配置为微小残留病监测的方法。
237.根据权利要求233-235中任一项所述的方法，被配置为检测移植排斥的方法。
238.根据权利要求233-237中任一项所述的方法，还包括在使所述环化复合物与所述环化剂接触之后，用一种或更多种外切核酸酶消化所述混合物中的非环状DNA。
239.根据权利要求233-238中任一项所述的方法，其中每一组SCP的SSR指示不同的染色体。
240.根据权利要求233-239中任一项所述的方法，其中所述引物的数目比靶测量对象的数目少得多。
241.根据权利要求233-240中任一项所述的方法，其中所述样品混合物包括来自母体血液样品的母体遗传物质和胎儿遗传物质的混合物。
242.根据权利要求233-241中任一项所述的方法，其中进行数字PCR包括将所述cirSSR池以一定稀释度分配到多于一个反应样品中，使得所述反应样品的至少一些包含cirSSR，而一些不包含cirSSR。
243.根据权利要求242所述的方法，还包括分析在单独反应样品中所述cSSR的所述工程化多核苷酸标志物的存在或不存在，以提供表示在所述反应样品中推定整倍性染色体存在或不存在的二进制结果的第一数字和表示在所述反应样品中推定非整倍性染色体存在或不存在的二进制结果的第二数字。
244.根据权利要求233-243中任一项所述的方法，其中所述环化剂是连接酶。
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