JP4163386B2 - 環状化核酸プローブの増幅方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の属する分野
本発明は、一般的には閉鎖した環状核酸プローブを増幅する方法に関し、より詳しくは回転環状増幅により閉じた環状核酸プローブを増幅する方法に関する。本発明の方法は、遺伝子疾患、遺伝子変異又は微生物若しくはウイルスの存在などの核酸配列検出を含む適用の範囲に有用であるが、それらに限定されない。
【０００２】
発明の背景
本明細書中番号により参照される刊行物の出版目録に関する詳細は本明細書の末尾にまとめられている。
【０００３】
感染性疾患や遺伝子疾患の診断のために種々の核酸増幅技術が存在する。１０年以上前のその発明以来、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) （１）は研究及びDNA に基づく診断における第一選択の方法となった。これはそのスピード、簡便さおよび選択性による。しかしながらPCR は温度の循環を要求し、従って高価な温度循環のための装置の使用が必要である。温度の循環を要求する他の増幅技術には、リガーゼ連鎖反応(LCR) （２）や転写に基づく増幅システム(TAS) （３）が挙げられる。
【０００４】
多数の温度循環を要求せず、本質的に等温のシステムである他の増幅技術も種々存在する。これらのうちのいくつかは、転写により媒介されるか、絶対必要な反応成分としてRNA を要求し、従って増幅環境をリボソームヌクレアーゼ汚染がないよう維持する必要がある。これらの方法には、Ｑβレプリカーゼシステム（４）、自己継続配列複製(3SR) （５）や核酸配列に基づく増幅(NASBA) （６）が挙げられる。
【０００５】
現在、本質的にRNA 中間体を要求しない核酸配列増幅のための少なくとも二つの等温技術があるようだ。連鎖置換増幅(SDA) （７）は、ヘミホスホロチオ化認識部位に切れ目を入れる制限酵素の能力及び切れ目で複製を開始し下流鎖を置き換えるポリメラーゼの能力に依存する等温技術である。核酸配列増幅に用いうる他の等温技術は回転環状増幅(RCA) である。
【０００６】
これまでに、種々の形態の回転環状増幅技術が記載されている（８、９）。本質的には、その技術は環状DNA プローブからの増幅に依存する。環状プローブは、一般的に「南京錠プローブ」と呼ばれ、目的の標的配列に相補的なその５’末端及び３’末端の両者に領域を有し、非標的由来起源のヌクレオチド領域により隔てられるように設計される。ハイブリダイゼーションの際に、そのプローブの５’末端及び３’末端は互いに極めて接近する。二つのプローブ領域が互いに隣接していれば、５’末端及び３’末端は結合して環状プローブをつくり得る。しかしながらある場合には、これらのプローブ領域はヌクレオチドの短い伸張により互いに隔てられる。この領域を埋め、環状プローブを形成しなければならない。これに関しては、スペーサーオリゴヌクレオチドの使用、又はトリリン酸デオキシヌクレオチド分子との組み合わせでDNA ポリメラーゼ（又はRNA 標的の場合には逆転写酵素）を用いて連結の前のギャップを埋めるといった、種々の技術が用いられうる。
【０００７】
回転環状増幅技術に関する重要な問題は、バックグラウンド増幅が起こることである。本発明の出現の前には、このバックグラウンド増幅は、二つのプライマーの５’末端間にある領域を引いた全ユニット反復を包含するプライマーによる欠失断片反復として見逃されていた（８）。バックグラウンド増幅は、二つのプライマーを用いる回転環状増幅にとって重要な問題であると同時に限界を表すものである。また陽性の誤った結果の主たる原因でもある。実際、このバックグラウンド増幅が起こることにより提起された問題の大きさは、許容できる特異性レベルを有する二プライマー回転環状増幅技術が使用不可能となるほどのものであった。
【０００８】
本発明に至る研究において、本発明者らはこのバックグラウンド増幅の起源を決定し、特徴づけた。このバックグラウンド増幅のクラスを「AmpX」と命名した。本発明者らは、それが反応混合物に存在する線状核酸プローブ分子を利用する代替増幅反応であることを決定した。典型的には、この反応生成物は頭から尾への縦列反復の多量体である。しかしながら、本発明者らは、このAmpX反応の生成物が、環状プローブ全体からの配列を包含するのではなく、二つのプライマー結合部位を介在する配列及びプライマー結合部位に隣接するいくつかのさらなる鋳型分子配列を含む線状標的分子の領域の反復を含むことを決定した。
【０００９】
従って、本発明者らはその増幅に先立ち、閉じた環状核酸プローブ分子を豊富化することによりAmPXバックグラウンド増幅を最小にする方法を開発した。閉じた環状核酸プローブ分子の豊富化した集団を用いる増幅工程を行うことにより、AmpX反応により起こるバックグラウンド増幅の発生率は有意に減少し、それによりより特異的な回転環状増幅が起こることを可能とする。
【００１０】
発明の要約
本明細書及び請求の範囲にわたり、文章の脈絡が別意を要求しない限り、用語「を含む(comprise)」並びに「を含む(comprises) 」及び「を含んでいる(comprising)」といった活用形は、述べた数若しくは工程又は数の群若しくは工程の群を含むが、他の数若しくは工程又は数の群若しくは工程の群を排除するものではないと理解されるであろう。
【００１１】
本明細書は、引用文献の後に、プログラムPatentIn version２．０を用いて作成されたヌクレオチド配列情報を含む。各ヌクレオチド配列は、数字による指示＜２１０＞の後に配列特定子（例えば、＜２１０＞1 、＜２１０＞２など）により配列表中で特定されている。各ヌクレオチド配列についての長さ、配列の型(DNAなど）及び生物起源は、それぞれ数字による指示の位置＜２１１＞、＜２１２＞及び＜２１３＞にある情報により示される。本明細書中で参照されるヌクレオチド配列は、数字による指示の位置<400> の後の配列の指示（例えば、＜４００１＞１、＜４００＞２など）にある情報により特定される。
【００１２】
従って本発明の一つの側面では、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用の後に形成される環状核酸プローブを増幅する方法であって、該環状核酸プローブを豊富化する工程及びその後該環状核酸プローブを増幅させる工程を含む方法が提供される。
【００１３】
本発明の別の一側面では、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進させる工程、環状核酸プローブを形成させ該環状核酸プローブを豊富化させる工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅させる工程を含む回転環状増幅方法が提供される。
【００１４】
なおも本発明の別の側面では、より詳しく、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進させる工程、環状核酸プローブを形成させ該環状核酸プローブを豊富化させる工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅させる工程を含む複数プライマー回転環状増幅方法が提供される。
【００１５】
本発明のさらなる側面では、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用の後に形成される環状核酸プローブを増幅する方法であって、該環状核酸プローブを酵素的に豊富化させる工程及び該環状核酸プローブを増幅させる工程を含む方法が提供される。
【００１６】
なおも本発明のさらなる側面では、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進させる工程、環状核酸プローブを形成させ、該環状核酸プローブを酵素的豊富化により豊富化させる工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅させる工程を含む複数プライマー回転環状増幅方法が提供される。
【００１７】
なおも本発明の別のさらなる側面では、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用の後に形成される環状核酸プローブを増幅する方法であって、該環状核酸プローブを非酵素的に豊富化させる工程及び該環状核酸プローブを増幅させる工程を含む方法が提供される。
【００１８】
なおも本発明の別のさらなる側面では、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進させる工程、環状核酸プローブを形成させ該環状核酸プローブを非酵素的豊富化により豊富化させる工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅させる工程を含む複数プライマー回転環状増幅方法が提供される。
【００１９】
本発明のなおも別の側面では、核酸プローブと標的核酸分子とが相互作用して該プローブの両末端領域が非隣接二本鎖を形成する反応を促進させる工程、環状核酸プローブを形成させる工程、該両末端領域の間に介在する領域中に捕捉リガンドを組み込み該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅する工程を含む複数プライマー回転環状増幅方法が提供される。
【００２０】
本発明のなおもさらなる側面では、核酸プローブと標的核酸分子とが相互作用して該プローブの両末端領域が非隣接二本鎖を形成する反応を促進させる工程、環状核酸プローブを形成させる工程、該両末端領域の間に介在する領域中にビオチン化捕捉リガンドを組み込み該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅する工程を含む複数プライマー回転環状増幅方法が提供される。
【００２１】
別の側面では、本発明は環状核酸プローブを豊富化する方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、及び環状核酸プローブを形成させ該環状核酸プローブを豊富化する工程を含む方法を目的とする。
【００２２】
本発明のなおも別の側面では、環状核酸プローブを豊富化する方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、及び環状核酸プローブを形成させ該環状核酸プローブを酵素的豊富化により豊富化する工程を含む方法を提供する。
【００２３】
本発明のなおも別の側面では、環状核酸プローブを豊富化する方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、及び環状核酸プローブを形成させ該環状核酸プローブを非酵素的豊富化により豊富化する工程を含む方法を目的とする。
【００２４】
本発明のなおも別の側面では、環状核酸プローブを豊富化する方法であって、核酸プローブと標的核酸分子とが相互作用して該プローブの両末端領域が非隣接二本鎖を形成する反応を促進させる工程、及び環状核酸プローブを形成し、該両末端領域の間に介在する領域中に捕捉リガンドを組み込み該環状核酸プローブを豊富化する工程を含む方法を目的とする。
【００２５】
さらなる側面では、環状核酸プローブを豊富化する工程及びその後該環状核酸プローブを増幅する工程を含む環状核酸プローブを増幅する方法において、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用の後に形成される環状プローブを増幅する工程を含む改良法が提供される。
【００２６】
さらなる別の側面では、回転環状増幅方法において、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成させて該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅する工程を含む改良法が提供される。
【００２７】
なおも別のさらなる側面では、回転環状増幅方法において、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成させて該環状核酸プローブを酵素的豊富化により豊富化する工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅する工程を含む改良法が提供される。
【００２８】
なおも別のさらなる側面では、回転環状増幅方法において、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成させて該環状核酸プローブを非酵素的豊富化により豊富化する工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅する工程を含む改良法が提供される。
【００２９】
本発明の別の側面では、回転環状増幅方法において、核酸プローブと標的核酸分子とが相互作用して該プローブの両末端領域が非隣接二本鎖を形成する反応を促進させる工程、環状核酸プローブを形成させ、該両末端領域の間に介在する領域中に捕捉リガンドを組み込み、該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅する工程を含む改良法が提供される。
【００３０】
本発明の別の側面では、疾病状態を診断する方法又は遺伝的変異型を検出する方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成させ該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅する工程を含む方法を意図する。
【００３１】
別の側面では、本発明は疾病状態を診断する方法又は遺伝的変異型を検出する方法であって、核酸プローブと標的核酸分子とが相互作用して該プローブの両末端領域が非隣接二本鎖を形成する反応を促進させる工程、環状核酸プローブを形成させ、該両末端領域の間に介在する領域中に捕捉リガンドを組み込み、該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅する工程を含む方法を意図する。
【００３２】
本発明のなおも別の側面では、回転環状増幅を促進するためのキットであって、一つ以上の任意の核酸プローブ、酵素、捕捉リガンド、環状核酸プローブを単離する手段、及び該プローブの環状化、単離及び増幅を促進するために有用な試薬を収容するように適応させた区画を含むキットを提供する。例えば、生物試料を受容するためのさらなる区画が含まれていてもよい。
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明は、部分的には、回転環状増幅の間などの環状プローブの増幅の間に起こるある種の非特異的バックグラウンド増幅反応の同定に基づく。この種の非特異的増幅は「AmpX」と呼ばれ、本発明者らにより反応混合物中の線状核酸プローブ及び開放環状核酸プローブの存在により起こると特定された。従って、本発明者らは増幅計画中に、その増幅に先立ち閉じた環状プローブ分子を豊富化する工程を取り込むことによりAmpX非特異的増幅を最小にする方法を開発した。この工程は、例えば、閉じた環状分子の精製又は線状分子及び／又は開放環状分子の除去により達成されるであろう。
【００３４】
従って本発明の一つの側面では、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用の後に形成される環状核酸プローブを増幅する方法であって、該環状核酸プローブを豊富化する工程及びその後該核酸プローブを増幅させる工程を含む方法Ｇａ提供される。
【００３５】
環状核酸プローブを形成する工程及び該プローブを豊富化する工程はいかような順序でも実施され得ると理解されるべきである。つまり、ハイブリダイズしたプローブはその豊富化に先立ち環状化されてもよく、又はハイブリダイズした核酸プローブの豊富化がその環状化に先立ち実施されてもよい。さらに、本発明の一以上の任意の工程は連続して実施しても、同時に実施してもよい。
【００３６】
より詳しくは、本発明は、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進させる工程、環状核酸プローブを形成させ該環状核酸プローブを豊富化させる工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅させる工程を含む回転環状増幅方法を提供する。
【００３７】
「回転環状増幅」への言及は、特定の増幅形態又は特定の増幅計画への言及ととるべきでない。環状核酸分子を増幅する任意の方法への言及と理解されるべきである。
【００３８】
「相互作用」への言及は、相補的なヌクレオチド塩基対間のハイブリダイゼーションといった相互作用のいずれの形態又はプローブ分子の核酸若しくは非核酸部分と標的分子の核酸若しくは非核酸部分との間の結合形成といった他のいくつかの形態の相互作用への言及であると理解されるべきである。相互作用は、共有結合、水素結合、ファンデルワールス力又は任意の他の相互作用機構といった結合形成を介して起こるであろうが、これらに限定されない。以下、二つの核酸分子間の「ハイブリダイゼーション」への言及は全て該分子間の相互作用のいずれの形態も、例えば該分子が該分子の非核酸成分の相互作用により会合することとなる場合をも含むものと理解されるべきである。
【００３９】
「核酸プローブ」への言及は、ヌクレオチド配列又はその機能的誘導体の配列を含む任意の分子であって、その機能が標的核酸配列と該ヌクレオチド配列の少なくとも一領域のハイブリダイゼーションを含む分子への言及と理解されるべきである。従って「標的核酸配列」への言及は、ヌクレオチド配列又はその機能的誘導体を含む任意の分子であって、目的分子であり、従って精査する工程を介して特定される分子への言及である。核酸プローブ及び標的核酸配列は両者とも非核酸成分を含んでいてもよい。例えば、核酸プローブは非核酸検出標識又は分子の機能を促進する他の非核酸成分を含んでいてもよい。同様に、標的核酸配列は非核酸成分を含んでいてもよい。例えば、標的核酸配列は抗体に結合していてもよい。これは、例えば標的核酸配列が該標的核酸配列に対する自己免疫応答などの免疫応答にある個体から単離した生物試料に存在する場合に起こるであろう。別の例では、核酸プローブは核酸側鎖を有するペプチド骨格を含むタンパク質核酸であってもよい。
【００４０】
用語「核酸プローブ」は、二以上のヌクレオチド配列分子への言及を含むとも理解されるべきである。それらの分子は一のヌクレオチド配列分子を形成するように連結、会合又は結合し、その連結又は他の形態の結合は標的配列を核酸プローブで精査する間か又はその後に行われる。従ってヌクレオチド配列分子の連結又は他の形態の会合の促進は、核酸プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションの前、間又は後などの標的配列の精査の間又は後のいつでも実施され得るだろう。例えば、Rep 媒介系の連結では（例は図１に図解して表す）、標的配列は二つの核酸分子で精査する。第一のプローブ分子は末端TATTATT 配列を含み、他方第二のプローブ分子は末端TATTATTAC 配列を含む。これらのプローブの標的配列へのハイブリダイゼーションの後、Rep 分子を利用して該第二のプローブ分子の末端TATTATTAC のTATTATT 成分の開裂を促進し、その後該第二のプローブ分子の末端ACを、例えば該第二のプローブ分子に隣接する位置で標的配列にハイブリダイズした第一のプローブ分子の末端TATTATT 成分へ連結する。
【００４１】
核酸プローブは好ましくは一本鎖ヌクレオチド配列であり、例えば線状コンホメーション又は開放環状コンホメーションを含むいずれのコンホメーションを有していてもよい。すなわち、該ヌクレオチドプローブは実質上環状の形態ではあるが、その末端領域は結合していない。核酸プローブの「末端領域」への言及は、核酸プローブの各末端に位置する領域への言及である。核酸プローブは核酸プローブの各末端領域のいずれかに位置する二つの別々の標的プローブ領域を含んでいることが好ましい。しかしながら標的プローブ領域は核酸プローブの末端領域に位置する必要はなく、核酸プローブの他のいずれかの適切な領域に位置していてもよいと理解されるべきである。標的プローブ領域は、目的の標的核酸配列の一以上のヌクレオチド配列領域に相補的なヌクレオチド領域である。核酸プローブの両末端領域間に位置するヌクレオチド配列領域も、少なくとも一のプライマー領域を含んでいることが好ましい。「プライマー領域」はプライマーの少なくとも部分と相互作用するよう設計されたヌクレオチド配列への言及である。「プライマー領域」への言及は、センスプライマーが対応するヌクレオチド配列のいずれかへの言及も含む。当該技術分野における熟練者は、プライマーが標的核酸配列の領域と相互作用するヌクレオチド配列を含む分子であり、そこから相補的ヌクレオチド合成が、例えばDNA ポリメラーゼなどのポリメラーゼを利用して開始されると理解するであろう。プライマーとプライマー領域との相互作用は、相補的な塩基対のハイブリダイゼーション又はプライマーを含む非核酸成分とプライマー領域との相互作用などの適切な手段のいずれかにより起こるであろうが、これらに限定されない。核酸プローブは複製起点、プロモーター、核酸及び／又は非核酸検出標識に対応する領域を任意に含んでいてもよい。
【００４２】
本発明の一実施態様では、核酸プローブは二つの標的プローブ領域及び二つのプライマー領域を含み、該環状核酸プローブの指数的増幅は第一プライマーと該核酸プローブのプライマー領域との相互作用、及び第一プライマーと該プローブとの相互作用の後合成される核酸プローブの相補鎖領域と第二プライマーとの相互作用により達成される。この回転環状増幅方法を本明細書中、「二プライマー回転環状増幅」とよぶ。
【００４３】
本発明の方法により、該プライマーは適切な任意の方法により機能し得る。例えば、第一プライマーは該核酸プローブのプライマー領域と相補的な塩基対をなすことにより相互作用するよう設計し得る。このタイプのプライマーは一般に相補的プライマーとよばれ、該核酸プローブに相補的な核酸鎖の合成を促進する。第二プライマーは該核酸プローブの第二プライマー領域に対応するセンスプライマーとして設計され、それにより第一プライマーを利用して合成された鎖に相補的な核酸鎖の合成を促進する。代替として、核酸プローブの二又はそれ以上の異なるプライマー領域を認識する単一のプライマーヌクレオチド配列を用いてもよい。これに関し、該プライマー領域は相補的なヌクレオチド配列配向のものであってもよい。なおも別の例では、一またはそれ以上のプライマーはプライマー領域で核酸又は非核酸成分と相互作用し、それにより相補的核酸鎖の合成を促進する非核酸成分を含んでもよい。本発明の方法は三以上のプライマーを利用する増幅（本明細書中、「複数プライマー増幅」という）にも及ぶ。例えば、二又はそれ以上の相補的プライマーが別々のプライマー領域に向かい、二又はそれ以上のセンスプライマーが別々のプライマー領域に向かう。「複数プライマー増幅」は核酸プローブの二又はそれ以上の別々のプライマー領域を認識する単一の配列の使用も含むと理解されるべきである。
【００４４】
従って本発明は、より詳しくは核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成し該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増幅する工程を含む複数プライマー回転環状増幅方法を提供する。
【００４５】
複数プライマー回転環状増幅は二プライマー回転環状増幅であることが好ましい。
【００４６】
「核酸」への言及は、デオキシリボ核酸及びリボ核酸の両者又はそれらの誘導体への言及と理解されるべきである。本発明の方法に利用される核酸分子は天然に生じるもの（例えば、生物試料を用いてもよい）、組み換え生成物又は合成生成物といったいずれの起源であってもよい。生物試料を用いる場合は、例えば標的核酸配列の可能な供給源として、（例えば、紙などの固相にそれを結合する目的で）試験に先立ち核酸成分を任意選択的に試料から抽出してもよい。これは必須ではないが、本発明の方法は、例えば血液試料を用いて実施してもよく、生検体標本を用いてin situ で実施してもよい。
【００４７】
「誘導体」への言及は、天然、合成又は組み換え体起源からの断片、部分、部位、化学的等価物、類似体、変異体、相同体及び擬似体への言及を含むと理解されるべきである。「機能的誘導体」とは、複数のヌクレオチド又は核酸配列の一またはそれ以上の機能的活性を表す誘導体として理解されるべきである。該複数のヌクレオチド又は核酸配列の誘導体としては、他のタンパク質性又は非タンパク質性分子に融合したヌクレオチド又は核酸配列の特定のエピトープ又は部分を有する断片が挙げられる。本明細書中意図した類似体としては、その化学的構成又は全体のコンホメーションの修飾などのヌクレオチド又は核酸配列への修飾が挙げられるが、これらに限定されない。これには、例えば断片骨格形成又は相補的塩基対ハイブリダイゼーションのレベルなどで、ヌクレオチド又は核酸配列が他のヌクレオチド又は核酸配列と相互作用する様式の修飾が挙げられる。ヌクレオチド又は核酸配列のビオチン化は、本明細書中に定義する「機能的誘導体」の一例である。核酸配列の誘導体は一または複数のヌクレオチド置換、欠失及び／又は付加により導かれ得る。用語「機能的誘導体」は、例えば天然産物スクリーニングの後に得られる生成物などの、ヌクレオチド又は核酸配列の一またはそれ以上の機能的活性を表すヌクレオチド又は核酸配列を含むと理解されるべきである。
【００４８】
核酸プローブと標的核酸配列との相互作用の促進は、いずれかの適切な方法により実施し得る。これらの方法は当該技術分野の通常の知識を有する者に知られている。
【００４９】
該標的プローブ領域が標的核酸配列と相互作用する場合は、該核酸プローブは開放環状コンホメーションをとる（本明細書中、「開放環状核酸プローブ」という）。標的核酸配列と相互作用することにより、該標的プローブ領域は一般に、例えば該標的核酸配列のヌクレオチドと該核酸プローブの標的プローブ領域のヌクレオチド間の相補的ヌクレオチド塩基対により二つの別々の二本鎖領域を形成する（以下「二本鎖（複数）」という）。核酸プローブの５’末端の末端ヌクレオチドと核酸プローブの３’末端の末端ヌクレオチドとの間には、ホスホジエステル結合などの結合がないことにより、これらの二つの二本鎖は隣接せずに存在する。二本鎖（複数）の間に、標的核酸配列起源のヌクレオチドの介在領域が存在し得る。このヌクレオチドの介在領域はいくつのヌクレオチドを含み得る。
【００５０】
また「開放環状核酸プローブ」への言及は、二又はそれ以上の核酸プローブを含む単一の開放環状コンフィギュレーションの形成をも含むと理解されるべきである。例えば、二重開放環状核酸プローブ（これは「開放環状核酸プローブ」の意味に含まれる）は、
(i) 第一核酸プローブの５’標的プローブ領域が第一標的核酸配列分子にハイブリダイズし、かつ該プローブの３’標的プローブ領域が第二標的核酸配列分子にハイブリダイズし、及び
(ii)第二核酸プローブの３’標的プローブ領域が該第一標的核酸配列にハイブリダイズし、該第二プローブの５’標的プローブ領域が該第二標的核酸配列にハイブリダイズする、
場合に形成される。
【００５１】
前記第一標的核酸配列及び第二標的核酸配列は同じであっても、又は異なっていてもよい。従って二重開放環状核酸プローブは2 対の非隣接二本鎖を表す。一つは第一標的核酸配列上に位置し、他方は第二標的核酸配列上に位置する。このタイプの開放環状プローブは、単一のプローブには同様に作用し、同一の生成物をつくる。これらの複数開放環状核酸プローブは環状化し、単一プローブのみを含む開放環状プローブと同様の方法で豊富化される。実際、どの与えられた反応混合物も単一プローブタイプと複数プローブタイプ（二重プローブなど）の両者の開放環状核酸プローブを含む可能性が高い。
【００５２】
核酸プローブを増幅させるためには、二本鎖領域で標的配列と相互作用する開放環状核酸プローブが環状化する必要がある。「環状化」とは、閉じた環状の形成を意味する。環状化はギャップ−充填又はスペーサーオリゴヌクレオチド連結といった幾つかの方法のうちのいずれかにより実施されればよいが、これらに限定されない。「ギャップ−充填」への言及は、ヌクレオチド配列の合成を介して開放環状核酸プローブの両末端を結合する、開放環状核酸プローブの環状化への言及である。これに関し、開放環状核酸プローブは必要なdNTP、リガーゼ及びDNA ポリメラーゼと反応させる。「スペーサーオリゴヌクレオチド連結」とは、一またはそれ以上の先に合成されたヌクレオチド配列（「スペーサーオリゴヌクレオチド」という）を開放環状核酸プローブの５’末端と３’末端の間のギャップに挿入することを意味する。次にスペーサーの両末端を、例えばリガーゼ酵素を用いて開放環状核酸プローブの両末端と連結する。一以上のスペーサーオリゴヌクレオチドを使用する場合には、例えば開放環状核酸プローブの５’末端と３’末端との間のギャップを充填するように、縦列で連結すればよい。
【００５３】
開放環状核酸プローブの環状化の際、ここで隣接する二本鎖は一般的にらせん型フォーメーションをとるであろう。この標的核酸配列の周りのプローブのハイブリダイズした部分はねじれることが必須であり、標的核酸配列の周りに環状化したプローブの「施錠」を生じる。この「施錠」はしばしば「南京錠形成」又は「南京錠的環状化」とよばれる。従って環状核酸プローブへの言及は、南京錠プローブ及び非南京錠プローブの両者への言及を含むと理解されるべきである。
【００５４】
本発明はいずれかの理論又は作用様式に限定されるものではなく、開放環状核酸プローブの環状化の後、反応混合物は通常、種々の割合で、環状化された核酸プローブ（「閉じた環状核酸プローブ」ともいわれる）、開放環状核酸プローブ及び線状核酸プローブを含むものとなろう。線状核酸プローブは標的核酸配列と相互作用せず、又は連結しないプローブである。環状化の後、残りの開放環状核酸プローブは、環状化工程によっても変わらないそれらのプローブ及び例えば、スペーサーが核酸プローブ両末端のうちの一つにのみ（すなわち５’末端又は３’末端）に連結される場合又はギャップ−充填合成が部分的にのみ完了される場合などの不完全に環状化されたそれらのプローブの両者を含むであろう。このような反応混合物を用いて二プライマー回転環状増幅を実施する場合には、得られる増幅生成物は、
(i) 第一プライマーから合成された核酸配列、このヌクレオチド配列は閉じた環状核酸プローブの配列に相補的な配列の縦列反復を含む、及び
(ii)第二プライマーから合成されたヌクレオチド配列、このヌクレオチド配列は第一プライマーにより形成された核酸配列に相補的な核酸配列の縦列反復を含む、
を含むであろう。
【００５５】
これらの増幅生成物は一本鎖核酸配列として又は相補的な核酸配列に完全に又は部分的にハイブリダイズした核酸配列として存在するであろう。「部分的ハイブリダイゼーション」とは、核酸配列の部分が相補的な配列にハイブリダイズし、核酸配列の部分が一本鎖型であることを意味する。これは、例えばプライマーが核酸配列の二又はそれ以上の縦列反復と相互作用し、下流プライマーから合成された増幅生成物が隣接する上流プライマーに出会う場合などの鎖置換の効果により起こるであろう。この場合、下流生成物から形成された増幅プライマーはその相補的合成伸長を続行するにつれ上流プライマーと置き換わることになる。
【００５６】
しかしながら前記増幅生成物(i) 及び(ii)だけでなく、本発明者らは同じく生成されるAmpX反応と呼ばれる、これまで同定されなかった骨格増幅生成物を特徴づけた。この増幅生成物は通常、プローブ配列に相補的な一又はそれ以上の縦列反復を含むが、第一プライマー領域から第二プライマー領域まで伸張し、第一プライマー領域及び第二プライマー領域を含むヌクレオチド配列である。しかしながらこれらの縦列反復は、そのヌクレオチド配列の下流プライマー部位及び／又は欠失に隣接する余分のヌクレオチド配列をも含んでいてもよい。この反応は、開放環状核酸プローブ又は線状核酸プローブの存在下で起こる。このAmpX反応が起こる正確なメカニズムは不明であるが、ある種の異常なプライマー活動及び開放環状核酸プローブ又は線状核酸プローブの鎖侵入事象を含むものと考えられる。
【００５７】
なおも本発明を一理論又は一作用様式に限定するものではないが、本発明者らは環状核酸分子を増幅する方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用の後で該プローブの増幅の前に実施する豊富化工程を組み込んだ方法を開発した。この豊富化工程は閉じた環状プローブ形成の前又は後のいずれに実施してもよい。
【００５８】
「豊富化」への言及は、線状核酸分子に対する閉じた環状核酸プローブの割合を増大することへの言及と理解されるべきである。これは、例えば、線状核酸分子（線状核酸プローブ及び／又は線状標的配列など）を分解、除去、不活性化又は減少させることにより又は反応混合物から閉じた環状核酸プローブを特異的に単離することにより達成されうる。
【００５９】
閉じた環状核酸プローブの豊富化は、電気泳動による分離、クロマトグラフィーによる分離（例えば、サイズ排除又はアフィニティークロマトグラフィー）又は、例えばエキソヌクレアーゼなどの酵素を用いて線状核酸分子を分解する（本明細書中、「酵素的豊富化」という）といった多数の方法のうちのいずれかにより達成できるが、これらに限定されない。本発明を一理論又は一作用様式に限定することなく、エキソヌクレーゼは線状核酸分子から末端ヌクレオチドを切断することにより機能する。閉じた環状核酸プローブは分解されず、それにより豊富化される。例えば、遊離のDNA 末端を分解することにより機能するが、閉じた環状分子を分解しない酵素エキソヌクレアーゼIII を用いて線状及び/ 又は開放環状分子を分解してもよい。この工程は線状分子及び／又は開放環状分子を選択的に除去することにより、閉じた環状分子を豊富化し、好ましくは環状化工程の後ではあるが増幅工程の前に実施される。線状及び／又は開放環状のヌクレオチド配列の集団を減少させることにより、閉じた環状核酸プローブの豊富化を達成するためには、酵素的豊富化が特に有用である。
【００６０】
従って一実施態様では、本発明は核酸プローブと標的核酸配列との相互作用の後に形成される環状核酸プローブを増幅する方法であって、環状核酸プローブの形成を酵素的に高める工程及び該環状核酸プローブの酵素的豊富化並びに該環状核酸プローブを増幅する工程を含む方法を提供する。
【００６１】
より詳しくは本発明は複数プライマー回転環状増幅方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成し酵素的豊富化により該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増幅させる工程を含む方法を提供する。
【００６２】
好ましくは、該酵素的豊富化はエキソヌクレアーゼを用いて実施される。
【００６３】
酵素的豊富化だけでなく、閉じた環状核酸プローブは非酵素的方法を用いても豊富化できる。本発明の方法に用いるために適切な非酵素的方法の例としては、電気泳動による分離、クロマトグラフィーによる分離（例えば、サイズ排除又はアフィニティークロマトグラフィーによる）又は捕捉リガンドを閉じた環状プローブに導入しそれにより閉じた環状プローブを単離することが挙げられるが、これらに限定されない。電気泳動による分離又はクロマトグラフィーによる分離といった方法は、例えば線状核酸分子の割合を減少するよう設計されるが、閉じた環状核酸プローブの単離を促進するには捕捉リガンドの使用が特に有用である。捕捉リガンドは環状化の際、開放環状プローブの両末端に介在する領域中に導入される。しかしながら本発明は、この特定の方法による捕捉リガンドの導入に限定されないと理解されるべきである。これに関し、閉じた環状核酸プローブの単離を促進するように核酸プローブの他の領域中に捕捉リガンドを導入してもよい。
【００６４】
従って別の実施態様では、本発明は核酸プローブと標的核酸配列との相互作用の後に形成される環状核酸プローブを増幅する方法であって、該環状核酸プローブの非酵素的豊富化の工程及び該環状核酸プローブを増幅させる工程を含む方法を提供する。
【００６５】
より詳しくは、本発明は複数プライマー回転環状増幅方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成し、該環状核酸プローブを非酵素的豊富化により豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増幅させる工程を含む方法を提供する。
【００６６】
なおもより詳しくは、本発明は複数プライマー回転環状増幅方法であって、核酸プローブと標的核酸分子の相互作用を促進し、該プローブの両末端領域が隣接しない二本鎖を形成する工程、環状核酸プローブを形成し、該両末端領域の間に介在する領域に捕捉リガンドを組み込み、該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増幅させる工程を含む方法を提供する。
【００６７】
「捕捉リガンド」とは、その中に組み込まれる核酸プローブの選択的単離を可能とする分子を意味する。捕捉リガンドは適切な方法のいずれにより組み込まれてもよい。捕捉リガンドは（例えば、ギャップ−充填又はスペーサーオリゴヌクレオチド連結のいずれかにより）開放環状核酸プローブの５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドを連結するために用いられる修飾ヌクレオチドの形態をとってもよく、あるいは非修飾核酸（核酸標識など）であって、その配列が核酸標識を組み込んでいるプローブ分子の単離を促進する核酸を含んでいてもよい。例えば、捕捉リガンドはGCN4認識配列を含むヌクレオチド配列であってもよい（図２参照）。別の例では、ヌクレオチド配列捕捉リガンドが導入される。これは他と異なるハイブリダイゼーション能力により閉じた環状核酸プローブを単離させる配列である。豊富化方法の一例を図３に図解して表す。この例では、豊富化工程は固相捕捉により達成される。しかしながらこの方法は固相捕捉に限定されないと理解されるべきである。
【００６８】
従って捕捉リガンドはそれ自身、選択的精製を可能とするものであっても良く、及び開放環状プローブを環状化するよう作用してもよい。例えば、捕捉リガンドは介在領域中に連結されるヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドであってもよい。この場合、オリゴヌクレオチドが作用して開放環状プローブを環状化し、そして合成される修飾ヌクレオチドの利用により、該修飾により該プローブの選択的精製を行う。代替的には、ヌクレオチド類似体をdNTP類似体として開放環状プローブを含む反応混合物中に導入してもよい。これはギャップ−充填合成により開放環状プローブを環状化する。
【００６９】
捕捉リガンドは、代替的には捕捉分子が連結、結合又は会合する核酸分子又はヌクレオチドの形態をとってもよく、核酸分子又はヌクレオチドは開放環状核酸プローブの５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドを連結することになる。本発明は、一またはそれ以上の連結ヌクレオチドとの関連を介して捕捉リガンドを含むための、任意の適切な分子の使用にも及ぶと理解されるべきである。例えば、ギャップ−充填オリゴヌクレオチドに結合した磁性ビーズを、抗体により結合されうるハプテンなどの分子として考える。
【００７０】
捕捉リガンドは、反応混合物に適用して二本鎖の水素結合を壊す変性条件に耐えるものであることが好ましい。この工程は通常、豊富化工程において標的分子と同時に精製される遊離開放環状核酸プローブに対し実施される。一実施態様では、捕捉リガンドはビオチン化オリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドの開放環状核酸プローブへの連結の後、閉じた環状核酸プローブが形成される。閉じた環状プローブは、連結したオリゴヌクレオチドに結合したビオチン分子をストレプトアビジンに結合することにより単離できる。
【００７１】
捕捉リガンドを組み込んでいる閉じた環状プローブの豊富化は、捕捉リガンドを含む閉じた環状核酸プローブの架橋及び沈殿といった、又は捕捉リガンドを介した閉じた環状プローブの固相への結合といった適切な方法のいずれかにより達成されるであろう。
【００７２】
従って本発明の一実施態様は、複数プライマー回転環状増幅方法であって、核酸プローブと標的核酸分子との相互作用を促進し、該プローブの両末端領域が非隣接二本鎖を形成する工程、環状核酸プローブを形成し、ビオチン化捕捉リガンドを該両末端領域に介在する領域に組み込み、該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増幅させる工程を含む方法を提供する。
【００７３】
環状核酸プローブの豊富化の後、当該技術分野の者に周知の方法により、環状プローブを増幅させてもよい。本発明のこの側面をいかようにも限定せず、環状プローブの一部分に相補的なプライマーからヌクレオチド伸長を開始することにより、増幅を実施するとよい。一本鎖置き換えDNA ポリメラーゼの使用により、この伸長反応では、環状標的に相補的な、大きな縦列に配置された多量体一本鎖DNA 生成物が生産される。これは高速伸長する新しい鎖の３’末端の下流のいずれかの核酸を継続して置き換えることにより起こる。この反応自身により、環状プローブからDNA が線状増幅されるが、生産される分子のサイズ及び得られる増幅のレベルは連鎖置換DNA ポリメラーゼの進行性により限定される。等温度条件下で指数的増幅速度論に達するには、第二オリゴヌクレオチドを使用する。環状プローブについてのプライマー事象の開始から生産される多量体ポリマーは、この第二プライマーの複数プライマー結合部位を含み、これにより複数DNA 鎖合成の同時開始が促進される。連鎖置換ポリメラーゼの性質及び一本鎖多量体ポリマー上での複数鎖合成の同時開始により、得られる生成物は、多量体ポリマーの長さの延長及び置き換えをする高度に分岐した鎖網である。環状プローブに相補的な元のプライマーもこれらの置き換えられた鎖のプライマーとなることができる。次に、この分子カスケードは、もはやプライマー作用することができる部位がなくなるまで、又は反応のための基質の一つが涸渇するまで続行する。完全に置き換えられた鎖自体が他の置き換え鎖と相互作用することによりプライマーとして作用してもよいとも考えられる。伝統的な核酸増幅技術により得られるより、かなり大きな増幅が結果として生ずる。
【００７４】
本発明の方法は反応混合物から閉じた環状核酸プローブのみを必ずしも選択的に単離しないと理解されるべきである。むしろ、閉じた環状プローブを豊富化する方法である。例えば、環状化したプローブが標的配列の周りで南京錠的コンホメーションにある場合、その南京錠的コンホメーションのせいで、該プローブの単離によって標的配列も単離され得る。
【００７５】
閉じた環状プローブの増幅後、当該技術分野の者に知られる挿入色素での生成物の染色、検出標識の直接生成物への組み込み、又は他の種々の検出分子との結合能力といった広範囲の技術を用いて増幅生成物を任意に検出してもよいが、これらに限定されない。これらには放射活性同位元素、蛍光分子、リン光分子、酵素、抗体及びリガンドなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
一つの実施例では、増幅された生成物の検出には回転環状増幅を用いる固相系の増幅が含まれる。この実施例では、増幅プライマーの一つを固体支持体に結合する。この固体支持体はオリゴヌクレオチドが結合できるものであればいかなる固体材料であってもよい。このような材料は当該技術分野の者に知られる。これらの材料を、磁性ビーズ、マイクロタイタートレー、膜及び計量棒といった複数の形態に取り込めばよいが、これらに限定されない。増幅反応に用いられる第二プライマーは、分子標識（例えば、フルオレセイン）を含む。代替的には、ビオチン、DIG 又は発蛍光団といった分子標識を、増幅したDNA の合成の際に標識したヌクレオチドの形態に組み込んでもよい。増幅反応の際、両プライマーを回転環状増幅に用いる場合は、生成物の一部は固体支持体の表面に直接結合する。さらにこれらの生成物は、分子標識を含む第二プライマーから複製することにより標識されるであろう。したがって反応の未使用プライマー及び他の反応副生成物は、付着した増幅生成物を崩壊させずに、固体支持体から直接洗浄できる。次に、付着した生成物を分子標識を利用して特定できる。この増幅の一例で用いたプライマーを図４に図解して表す。
【００７７】
別の例では、本発明はDNA ミクロアレイの関係での回転環状増幅の適用に及ぶと理解されるべきである。
【００７８】
別の側面では、本発明は環状核酸プローブを豊富化する方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、及び環状核酸プローブを形成し、該環状核酸プローブを豊富化する工程からなる方法に関する。
【００７９】
一実施態様では、本発明は環状核酸プローブを豊富化する方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、及び環状核酸プローブを形成し、該環状核酸プローブを酵素的豊富化により豊富化する工程を含む方法を提供する。
【００８０】
別の実施態様では、本発明は環状核酸プローブを豊富化する方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、及び環状核酸プローブを形成し、該環状核酸プローブを非酵素的豊富化により豊富化する工程を含む方法を目的とする。
【００８１】
なおもより詳しくは、本発明は環状核酸プローブを豊富化する方法であって、核酸プローブと標的核酸分子との相互作用を促進し、該プローブの両末端が隣接しない二本鎖を形成する工程、及び環状核酸プローブを形成し、捕捉リガンドを該両末端領域の間に介在する領域に組み込み、該環状核酸プローブを豊富化する工程を含む方法を目的とする。
【００８２】
最も具体的には、該捕捉リガンドはビオチン化ヌクレオチドである。
【００８３】
なおも別の側面では、環状核酸プローブを増幅する方法において、該方法が該環状核酸プローブを豊富化する工程及びその後該環状核酸プローブを増幅する工程を含み、そして核酸プローブと標的核酸配列との相互作用の後に形成される該環状プローブを増幅する工程を含む改良法を提供する。
【００８４】
好ましくは、回転環状増幅方法において、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成し、該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増幅させる工程を含む改良法を提供する。
【００８５】
本発明の側面の一実施態様では、回転環状増幅方法において、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成し、該環状核酸プローブを酵素的豊富化により豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増幅させる工程を含む改良法を提供する。
【００８６】
本発明の別の側面では、回転環状増幅方法において、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成し、該環状核酸プローブを非酵素的豊富化により豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増幅させる工程を含む改良法を提供する。
【００８７】
より詳しくは、本発明は、回転環状増幅方法において、核酸プローブと標的核酸分子とが相互作用して該プローブの両末端領域が非隣接二本鎖を形成する反応を促進させる工程、環状核酸プローブを形成し、該両末端領域の間に介在する領域中に捕捉リガンドを組み込み、該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増させる工程を含む改良法を提供する。
【００８８】
最も詳しくは、該捕捉リガンドはビオチン化ヌクレオチドである。
【００８９】
本発明の核酸配列はヒトゲノム由来であればよいが、ヒト以外の動物及び植物、微生物（例えば、細菌、寄生体又は酵母）、ウイルス及びプリオン配列由来のゲノム及びヌクレオチド配列も本発明に含まれる。本発明で意図されるヒト以外の動物としては、霊長類、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、ロバ）、研究試験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ）、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ）、鳥類（例えば、ニワトリ、ガチョウ、アヒル及び他の飼鳥類、猟鳥、エミュー、ダチョウ）及び捕獲野生又は飼育動物（例えば、キツネ、カンガルー、ディンゴ）が挙げられる。本発明の操作は核酸分子が由来する種に関して同種又は異種であってもよいことを理解すべきである。「同種」操作は、本発明の方法に利用される全核酸分子が同じ種に由来する場合をいう。「異種」操作は、核酸分子の少なくとも１種が他の核酸分子の種とは異なる種由来である場合をいう。多くの場合、（核酸プローブなどの）与えられる核酸分子は種由来ではなく、天然では生じないヌクレオチド配列を含むように設計されることになる。該プローブの各領域は一またはそれ以上の種に由来する天然に生じる配列に基づいてもよい（例えば、プロモーター領域又は標的プローブ領域）。
【００９０】
本発明の方法は、等温度増幅の特異性を改良するために有用である。これには、例えば鎖の置き換え合成により形成される閉じた環状核酸プローブ配列の縦列補体の形成に関する特異性を改良することが挙げられる。本発明は、ヒト、動物、植物、寄生体、細菌又はウイルス起源の分子配列といった生物試料又は環境的試料に見いだされる特異的遺伝子配列の検出、特定、定量及び／又はタイプ決定といった診断的適用にも有用である。これには、対立遺伝子識別、遺伝子変異型の特定（例えば、患者の薬物応答を予測する目的で）、単純ヌクレオチド多形の同定及び鎖置換生成物の多重検出が挙げられるが、これらに限定されず、例えば増幅した縦列成分は、複数の異なって増幅された標的配列を分離させ、同時に定量的に検出させる複数色をコードするプローブを用いて検出される。さらに、本発明は遺伝的疾患又は細菌及びウイルス感染といった感染性疾患の診断に関して有用である。これに関し、本発明の一適用では、生物試料（血液、尿、粘液又は生検試料）を厳密に調べることであり、その核酸プローブの標的プローブ領域が目的とする標的核酸配列を含む細菌又はウイルスの存在を検出する。
【００９１】
従って本発明のなおも別の側面では、疾病状態を診断する方法又は遺伝的変異型を検出する方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成し、該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増幅させる工程を含む方法を意図する。
【００９２】
好ましい一実施態様では、該豊富化工程は非酵素的豊富化である。
【００９３】
別の好ましい実施態様では、該豊富化工程は酵素的豊富化工程である。
【００９４】
この好ましい実施態様に従い、本発明は疾病状態を診断する方法又は遺伝的変異型を検出する方法であって、核酸プローブと標的核酸分子とが相互作用して該プローブの両末端領域が非隣接二本鎖を形成する反応を促進させる工程、環状核酸プローブを形成し、該両末端領域の間に介在する領域中に捕捉リガンドを組み込み、該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増幅させる工程を含む方法を意図する。
【００９５】
該標的分子は、生物試料中に存在してもよい。従って、生物試料は直接試験してもよく、生物試料中に存在する他の全て又は一部の核酸材料を試験に先立ち単離してもよい。標的核酸配列が、生ウイルスの不活性化などの試験に先立つ前処理を受けることは、本発明の範囲内である。
【００９６】
本発明の方法は、トランス活性化因子の機能的解析及びサウスウェスタンブロット解析に使用する転写因子及び生成物のアフィニティークロマトグラフィーのためのデンドリマープローブ、分子量マーカー、固定化リガンドといった核酸生成物を形成させるのにも有用であるが、これらに限定されない。
【００９７】
AmpXバックグラウンド増幅問題は、二又はそれ以上のプライマーが線状核酸プローブに結合できる場合に起こる反応により生じるので、本発明の別の側面では、二つのプライマーがいずれのオリゴヌクレオチドにも結合しないようにこれらのプローブを設計することによって、環状核酸プローブを増幅する方法に関する。従って、連結反応物の精製は必要でない。適切に設計された核酸プローブ及びプライマーの一例を図１９に図解して説明する。
【００９８】
本発明のなおも別の側面では、環状核酸分子の増幅を促進するためのキットであって、一つ以上の任意の核酸プローブ、酵素、捕捉リガンド、環状核酸プローブを単離する手段、及び該プローブの環状化、単離及び増幅を促進するために有用な試薬を収容するように適応させた区画を含むキットに関する。さらに区画は、例えば生物試料を受容する区画を含めてもよい。
【００９９】
好ましくは、該増幅は回転環状増幅である。
【０１００】
本発明のさらなる特徴を以下の限定されない図面及び／又は実施例により完全に記載する。しかしながら、この詳細な記載は本発明を例証する目的においてのみ含まれるものと理解されるべきである。
【０１０１】
実施例１
ＡｍｐＸ分析−材料
細菌株
大腸菌ＰＮＧ８０１株は大腸菌Ｋ１２野生株Ｗ１４８５（ハーバード大学、エヌ．クレックナーから入手できる）の誘導株である。カナマイシン耐性遺伝子をコードするミニ−トランスポゾンＴｎ１０（Ｎｏ．１０３）を大腸菌Ｗ１４８５株（１０）に導入した。その結果得られるカナマイシン耐性群から１株を選びＰＮＧ８０１と命名した。先に記述された（ギブコ，ＢＲＬ）大腸菌ＤＨ５αを、ミニ−トランスポゾンを含まない大腸菌ゲノムを表す負の対照として用いた。ゲノムＤＮＡは両大腸菌株から抽出し（１１）、ＴＥ緩衝液に再懸濁した。
【０１０２】
プライマー
オリゴヌクレオチドはブレサテック・アンド・ギブコＢＲＬから購入し、標準的ホスホルアミダイト化学を用いて合成した。鋳型として増幅反応に使用したオリゴヌクレオチドは均一になるまでゲル精製したが他のオリゴヌクレオチドは全て脱塩調製品として使用に供した。
【０１０３】
ＡｍｐＸ増幅反応
ＤＮＡは６０μＬ反応で増幅した。各反応液は１６ピコモルの各プライマー、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ4)2 ＳＯ4 、２０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．８、２００μＭのｄＮＴＰ、２ｍＭのＭｇＳＯ4 ：０．１％ｖ／ｖのトリトンＸ−１００を含む。２μＬの鋳型部分標本を各反応液に添加し、９４℃、３０秒の変性サイクル、次いで５５〜６０℃で５分間の平衡を行った。増幅は４ＵのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ニュウ・イングランド・バイオラブズ）の添加で開始し、反応は等温的に６０℃に維持して２．５〜３時間行った。
【０１０４】
核酸の電気泳動及びハイブリダイゼーション
増幅生産物はＴＡＥ又はＴＢＥ緩衝液中で２％ｖ／ｖアガロースゲルを通して電気泳動させ（１２）、エチジウムブロミド染色で可視化した。ブロットの前に、核酸を０．５ＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣｌ中で３０分間変性させた後、１Ｍトリス塩酸ｐＨ８．０、１．５ＭのＮａＣｌ中で３０分間中和した。次いで、製造業者の指示書に従って核酸を毛細管でハイボンド−Ｎ+ 膜（アマシャム）に移した。オリゴヌクレオチドプローブは、ターミナルトランスフェラーゼ（ベーリンガー・マンハイム）を用いてＤＩＧ−ｄｄＵＴＰで３’標識を付した。
【０１０５】
膜は、５〜１０ｍｌのラピッドヒブバッファー（アマシャム）中で４２℃で３０分間、前ハイブリダイゼーションを行った。このＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドを次にハイブリダイゼーション緩衝液に添加し、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした。そのブロットを製造業者の指示通りに洗浄しＣＤＰ−スター（ベーリンガー・マンハイム）を用いて発色させた。
【０１０６】
クローニング及び配列分析
増幅反応の生産物は、クローニングの前に、ウィザードＰＣＲＤＮＡ精製カラム（プロメガ）を通して精製した。次いで、精製された生産物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ）に１６℃、３時間で直接連結した後、大腸菌ＤＨ５αに電気穿孔法により導入した（１３）。挿入物の配列は色素停止化学及びアプライド・バイオシステムズ３７３ＡＤＮＡ配列決定器を用いて決定した。
【０１０７】
実施例２
ＡｍｐＸ分析−結果
合成されたｓｓＤＮＡ分子からのＡｍｐＸ増幅
ランダム配列の９０マーの合成オリゴヌクレオチドを合成し、最初の増幅反応の鋳型として用いた（図５Ａ）。該鋳型分子の配列に基づいて種々のより小さなプライマーも合成した。これらは該鋳型分子に関しそのサイズ、方向、及び位置が異なるように設計された（図５Ａ）。
【０１０８】
増幅反応には反対のプライマーの種々の組合せが使用された。典型的には、１ピコモルの鋳型を１６ピコモルの各プライマーと混合した。変性及び６０℃での平衡の後、鎖置換性エクソヌクレアーゼマイナスＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの添加により反応を開始した。次いで該反応を６０℃で３時間インキュベートした後、生産物をアガロースゲル電気泳動により検討した（図５Ｂ）。
【０１０９】
これらの反応のそれぞれから、生産物の集団が製造された。これらは試験されたプライマー組合せにもかかわらず、特徴的なバンド形成パターンを示した。これらの生産物のサイズは、１００ヌクレオチドより小さな分子から泳動後にもウエル中に留まる程に大きな分子にまで広がっていた。１回の増幅反応から得られる生産物はそれぞれ相互に標準単位長だけサイズが異なるように見えた。この単位長はその反応に用いたプライマー組合せが異なれば異なっていた。ＤＮＡ増幅のレベルもプライマー組合せが異なれば異なっていた。しかし、一般に、分光学的検定では、該反応は３時間の反応の間に１０〜４０μｇの生産物を合成できたことを示した。
【０１１０】
さらに、一連の多量体生産物を生産するように見えたこの等温増幅は、この一つの特定の鋳型配列に限られるものではなかった。さらに６個の鋳型配列及びそれらの対応するプライマー集合も増幅生産物を形成した。
【０１１１】
ＡｍｐＸ増幅生産物の分析
異なるプライマー組合せを用いた４回の別々の増幅反応から得られた生産物を分析してそれらの分子組成を決定した。まず、増幅生産物の全集団を、鋳型分子を横断して分布している開裂部位を有する４個の別の制限酵素で消化することにより分析した。特定反応生産物のより詳細な分析はクローニング及び部分的配列決定により行った。
【０１１２】
一般に、プライマーが鋳型分子の末端から離れて位置する場合、反応から得られる増幅生産物は、一つのプライマー結合部位から次のものまで及ぶ鋳型分子の縦列反復から成り立っていた。しかしながら、幾つかの反復はプライマー結合部位（複数）に隣接する鋳型配列をも含んでいた。稀には、増幅生産物は上述のような鋳型分子の領域の縦列反復であるが欠失を含むものから成っていた。時には、配列の欠失は一つの反復単位から次の反復単位まで変化する。増幅された領域の一部の例を以下に概述する。
【０１１３】
プライマーＰ５Ｃ及びＢ４Ｃを用いる増幅反応から得られる生産物の大部分を、Ｓａｕ３ＡＩ又はＴａｑＩではなく、ＡｌｕＩ及びＥｃｏＲＩで消化して低分子量の生産物にした（図６Ａ（ｉ））。これは、増幅された配列がプライマー結合領域プラスその介在配列を含む鋳型分子の領域の縦列反復から成っていたことを示す。配列分析は一般にこの意見と一致したが、該増幅領域はプライマーＰ５Ｃ結合部位に隣接する二つの付加的ヌクレオチドを含むことが示され、プライマーＢ４Ｃの５’末端からの一つのヌクレオチドが反復単位のそれぞれで一様に欠如していた（図６Ａ（ii))。高濃度の制限酵素を用いて行ったときでさえも、この反応からの生産物がすべてＡｌｕＩ及びＥｃｏＲＩで消化されたわけではなかったことは興味深い。このことは、増幅生産物の一部に点突然変異か又は他の増幅領域の変化も存在していたことを示唆する。
【０１１４】
同様な結果は、生産物がプライマーＰ５Ｅ及びＢ４Ｉを用いて該鋳型分子から得られたときにも観察された。これらのプライマーはそれぞれ該鋳型分子の５’及び３’末端により近く位置していた。この反応から得られる生産物の大部分をＡｌｕＩ、ＥｃｏＲＩ及びＴａｑＩで消化し、生産物の相当の量をＳａｕ３ＡＩでも消化した（図６Ｂ(i))。配列分析は、またも該生産物が鋳型分子のある領域の縦列反復から成り立っており、それは一つのプライマー結合部位から次のものまで及ぶばかりでなくＰ５Ｅプライマー及びＢ４Ｉプライマーの結合部位に隣接する配列のそれぞれ６及び７オリゴヌクレオチドをふくんでいたことを示した。クローニングされたこの反応の生産物が、Ｐ５Ｅに対するプライマー結合部位に隣接する領域に、この配列をＳａｕ３ＡＩ消化に不感受性とするであろう点突然変異を有していたことは興味深い。従って、制限プロフィル及び配列分析から、この反応生産物が、その大部分が鋳型全体の縦列反復とし配列されており、その一部がＳａｕ３ＡＩ部位における点突然変異を有するものである分子の混合集団から成り立っていることが示唆される。
【０１１５】
プライマーＢ４ＩとＰ５Ｄを用いる増幅反応からの生産物をＥｃｏＲＩとＴａｑＩのみで消化し、Ｓａｕ３ＡＩ又はＡｌｕＩで消化しなかった（図６Ｃ(i))。ＡｌｕＩ部位はプライマーＰ５Ｄの配列内に位置しているからＡｌｕＩでの消化は予想されなかった。配列分析から、Ｂ４Ｉプライマー結合部位及びＰ５ＤとＢ４Ｉの間の鋳型分子の介在配列を含むがプライマーＰ５Ｄの最後の１１ヌクレオチドのみを含む領域の縦列反復を、この反応からの生産物は含んでいたことが示される（図６Ｃ(ii)) 。該ＡｌｕＩ部位はＰ５Ｄの欠失した領域内にあり、こうして、ＡｌｕＩが該反応生産物を開裂する能力を持たないことが説明される。
【０１１６】
プライマーＢ４ＣとＰ１を用い該鋳型分子から増幅された生産物の大部分はＳａｕ３ＡＩ及びＥｃｏＲＩで消化されるが、ＡｌｕＩ又はＴａｑＩで消化されなかった（図６Ｄ(i))。このことは、該反応生産物の大部分が二つのプライマー結合部位の間に介在する配列の領域を持たなかったことを示唆する。配列分析はこれを確認し、増幅された配列がＢ４Ｃ及びＰ１のプライマー結合部位プラス該二つプライマーの間に介在する配列の大部分を含むが、プライマーＰ１結合部位の近くに１２ヌクレオチドの欠失を有することを示した。該ＡｌｕＩ部位はこの欠失領域内にある、こうして、ＡｌｕＩが増幅された生産物を開裂する能力を持たないことが説明される。この反復もＢ４Ｃに対するプライマー結合部位に隣接するさらに一つのヌクレオチドを含み、Ｐ１プライマー結合部位の５’末端から一つのヌクレオチドが欠失していた。
【０１１７】
異なるプライマー組合せを用いる他の増幅反応からの生産物もクローニングし配列決定して、上に概述した例と類似の結果を与えた。
【０１１８】
ＡｍｐＸ増幅反応の感度
合成鋳型オリゴヌクレオチドを１０倍系列希釈を用いて希釈し増幅反応の感度の限界を求めた。プライマーＢ４Ｃ及びＰ５Ｃを３時間増幅に用いると、該反応の検出感度は鋳型の約１０-4ピコモルであった。他のプライマー組合せ及び鋳型の検出感度は同様であった。しかしながら、幾つかの場合では、検出感度は鋳型の１０-8ピコモル未満まで増加した（図７）。このことは、該反応を開始するために少なくとも鋳型の１×１０8 コピーが必要であることを示すものである。インキュベーションを長くしても、一般に、この検定の検出感度は増加しなかった。１×１０-4ピコモルの鋳型からの３０μｇの生産物の増幅は１×１０7 倍の増幅可能性を表す。
【０１１９】
大腸菌内でのミニ−トランスポゾンＴｎ１０誘導体のＡｍｐＸ検出
ゲノム鋳型から既知の目的の配列を増幅するＡｍｐＸ反応の潜在的能力を証明するために、特定のミニ−トランスポゾン配列を含む大腸菌ゲノムの存在を検出するための増幅反応を実施した。プライマー１Ｆ及び１Ｒは、ミニ−トランスポゾンＴｎ１０誘導体の１２０塩基対領域を含む配列を増幅するように設計した（図８Ａ）。この領域はＨｉｎｄIII をも含んでいた。この反応生産物内の介在配列の一部の存在を検出するためのプローブとして使用するため、１Ｆと１Ｒの間に位置するさらなるプライマー、Ｉｎ９０３をも合成した（図８Ａ）。
【０１２０】
Ｔｎ１０陽性及び陰性の両大腸菌株由来のゲノムＤＮＡを種々の量で用いる二連の反応を設定した。変性及びＢｓｔポリメラーゼ付加の後、６０℃の等温条件を用い２．５時間、標準的ＡｍｐＸ増幅反応を行った。増幅の後、各反応物の１μＬをＨｉｎｄIII で消化した（図８Ａ）。
【０１２１】
未消化の生産物及びＨｉｎｄIII 開裂生産物を２％アガロースゲルを通して並べて電気泳動し、エチジウムブロミドで染色して可視化した（図８Ｂ）。鋳型を添加しなかった対照の反応では、生産物は観察されなかった。同様に、大腸菌ＤＨ５αゲノムＤＮＡを添加しなかった反応全てで生産物は増幅されなかった。しかしながら、該反応液に２０ｎｇ以上の大腸菌ＰＮＧ８０１ゲノムＤＮＡを添加したとき、増幅が起こった。
【０１２２】
これらの反応のそれぞれで増幅された生産物の集団はオリゴヌクレオチド鋳型を用いて観察されたものと類似であった。これらのサイズは丁度１００塩基対をこえたものから極端に大きな分子にまで及んだ。１回の増幅からの生産物はそれぞれサイズが標準的単位長だけ相互に異なっているようであった。しかしながら、この例では、プライマー組合せを変えずにおいたにもかかわらず、該単位長は反応毎に全く劇的に変化した。このことは、この増幅の発生に至らしめた該反応の開始事象に変化があったことをおそらく示すものと考えられた。該反応生産物のＨｉｎｄIII での消化により、該反応のそれぞれからの生産物の大部分が均一な反復サイズを含むことが示された。さらに、標識された内部プローブであるＩｎ９０３は全ての反応生産物とハイブリダイズでき、該反応生産物中に該介在配列の領域が存在することを確認させた。
【０１２３】
三つの別々の増幅反応からの生産物の配列分析は、予期したように、この集団のそれぞれの内にある異なるセットの縦列反復単位を明らかにした。それぞれはプライマー結合部位と対応する介在配列の両方を含むが、該プライマー結合部位のそれぞれに隣接する配列の長さが異なっていた。この付加的な配列の長さは０と７７ヌクレオチドの間で変動した。該反復単位の配列は配列決定された分子の個々の反復の間では変化するようには見えなかった。１個のプライマーセット及び一つの鋳型濃度を用いて複数の反応が行われた大腸菌ＰＮＧ８０１ゲノムＤＮＡ鋳型を用いる一部の実験では、同一反応の幾つかが増幅に失敗した。このこと及び異なる増幅領域の証拠から、該反応が進行するためには特定の開始事象が起こる必要があることが示唆される。
【０１２４】
実施例３
回転環状増幅のための南京錠的環状化
標識化スペーサー計画
この手順は、目的の標的に相補的な標識化スペーサーオリゴヌクレオチドを利用する閉じた環状プローブの一般的作成方法を概述する。南京錠プローブ、標的配列、及び他の必須の成分の実験的設計は図９に例示する。
【０１２５】
５０μＬの反応容量には、連結緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．３、２５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．５ｍＭのＮＡＤ、０．０１％ｖ／ｖのトリトンＸ−１００）中の１ピコモルの南京錠的オリゴヌクレオチド、１ピコモルのスペーサーオリゴヌクレオチド、及び１ピコモルの合成オリゴヌクレオチド標的が含まれていた。この反応液をまず９４℃に３分間加熱した。この管が９４℃に達したとき、１μＬのアンプリガーゼ（５Ｕ／μＬ、エピセントル・テクノロジーズ）を添加した。次いで、該反応液を６０℃まで冷却し、そして１時間、連結反応を起こさせた。
【０１２６】
ギャップ充填計画
この手順はギャップ充填反応において標識ヌクレオチドを利用する閉じた環状プローブの作成のための実験計画を概述する。この取り組みの実験設計は図９に例示したものと同様であるが、標識スペーサーが標識ヌクレオチドとのギャップ充填反応により置き換えられている。
【０１２７】
５０μＬ反応容量には、連結／ギャップ−充填緩衝液（５０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ−（３−プロパンスルホン酸）〔ＥＰＰＳ〕、１８０ｍＭのＫ+ （ｐＨを７．８に調整するために添加するＫＯＨ及びＫ+ の最終濃度を調整するために添加されるＫＣｌ）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2 、１０ｍＭのＮＨ4 Ｃｌ、１００μＭのＮＡＤ+ 、１００μｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））中の１ピコモルの南京錠オリゴヌクレオチド、１ピコモルの合成オリゴヌクレオチド標的、１５ピコモルのビオチン−１４−ｄＡＴＰ及び各１５ピコモルのｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰを含んでいた。この反応液をまず９４℃まで３分間加熱した。この管が９４℃に達したとき、１μＬの酵素混合液（アンプリガーゼ５Ｕ／μＬ、エピセンター・テクノロジーズとタックポリメラーゼ１Ｕ／μＬ、パーキン・エルマー）を添加した。次いで、該反応液を６０℃まで冷やし、１時間インキュベートして連結反応及びギャップ−充填反応を起こさせた。
【０１２８】
両環状化手順における、分子標識の量は精製手順で使用される親和性基質媒体の最大結合能力を超えるべきでない。
【０１２９】
実施例４
ＡｍｐＸ最小化回転環状増幅のための南京錠精製
ビーズの調製
今日では、ストレプトアビジン被覆スーパーパラマグネティック・ビーズ（ダイナル）が多くの精製反応に用いられる。これらのビーズは保存剤を含む緩衝液中に入った状態で供給される。従って、使用する前に洗浄する。５回の５０μＬの連結反応のそれぞれに対して、最初のビーズ混合物の１２５μＬ部分が必要である。
【０１３０】
ビーズを１．５ｍｌミクロフュージ管に分配した。該ビーズを磁石板上で単離し、上清を除去し、次いで該ビーズを１２５μＬの２×ＢＷ緩衝液（１０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ＭのＮａＣｌ）に懸濁した。この手順をさらに３回繰り返した後、最後に該ビーズを２５０μＬの２×ＢＷ緩衝液中に再懸濁した。
【０１３１】
閉じた環状分子の捕捉
洗浄したビーズ５０μＬを５０μＬの連結反応液と混合し、室温で３０分間インキュベートし、溶液中のビーズを周期的に混合し続けた。該ビーズ及びその結果付着した標識分子を次に磁石板を用いて捕捉し、液体を除去した。次いで、ビーズを１００μＬの１×ＢＷ緩衝液（５ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．５、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１ＭのＮａＣｌ）中に再懸濁した。この洗浄手順を１×ＢＷ緩衝液を用いてもう一度、０．１ＭのＮａＯＨを用いて３回（各５分）繰り返してハイブリダイズした分子をすべて除去し、最後にＴＥで２回洗浄し、ビーズを中和した。次いで、該ビーズを最後に５０μＬのＴＥ（１０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。
【０１３２】
実施例５
環状豊富化を伴う又は伴わないＲＣＡ増幅
６０μＬの反応液は、２０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ８．８（２５℃）、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、２ｍＭのＭｇＳＯ4 、０．１％ｖ／ｖのトリトンＸ−１００中に、１０ピコモルの各増幅プライマー、１６７μＭのｄＮＴＰｓ、及び１μＬの連結反応液（非精製又は精製）を含んでいた。この反応液を９４℃で３分間加熱した後、所望の増幅温度（５０〜７０℃）まで５分間冷やした。この反応液のそれぞれに０．５μＬのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（８Ｕ／μＬ、ＮＥＢ）を添加し、該管を所望の増幅温度で１．５〜２時間インキュベートした。
【０１３３】
時間は存在する環状物の量と特定増幅反応の効率に依存し、その量や反応効率が減少すると増加させ得る。
【０１３４】
実施例６
回転環状増幅における豊富化標識環状分子の利点
回転環状増幅（ＲＣＡ）反応を粗連結反応液を用いて行うと、バンド形成の二つの標準タイプが典型的に明らかとなる（図１０）。鋳型が充分な濃度で存在するとき、そのサイズが標準単位長だけ相互に異なるＤＮＡ分子の梯子として、非典型的なＲＣＡバンド形成パターンが見られる（図１０、非精製及び精製＋ｖｅレーン）。従って、この単位長は該ＲＣＡ反応で標的として利用された環状分子のサイズに対応する。ＲＣＡ反応で鋳型が存在せず又は充分に存在しない場合は、異なるタイプのバンド形成パターンが可視化される。再び、その生産物は、そのサイズが標準単位長だけ相互に異なるが、この単位長は予想された環状分子のサイズには対応しないＤＮＡ分子の梯子として配列される。その代わり、反復のサイズは典型的には該二つのプライマーの間に介在する領域と同じサイズである（図１０、非精製−ｖｅレーン）。この背景反応は「ＡｍｐＸ」と名づけられた。この背景反応は、連結反応後に反応液中に残存する残りの非環状化南京錠プローブによるものであることも証明された。閉じた環状プローブ形成反応に南京錠的オリゴヌクレオチドと共に標識スペーサー分子を利用すると、標識分子を該閉じた環状プローブの中に組み込むことが可能である。これらの標識分子は次いで分子標識とその基質の間の親和性を用いて精製することができる。非変性及び変性条件の両方の下での連続洗浄工程によりＡｍｐＸ背景を含まないＲＣＡ反応用の鋳型を作成することができる（図１０、精製−ｖｅレーン）。
【０１３５】
実施例７
ゲノム鋳型からの改良されたＲＣＡ
閉じた環状プローブ形成（標識スペーサー）及び精製計画を利用し、図１１に示す配列を用いて新たなＲＣＡ手順の多様性を試験した。四つの異なる連結反応を２連で設定した。陰性対照反応（図１２、レーン１）は南京錠ＦＶ２とＬｉｇＷを含むが鋳型を含まず、後の工程で反応にリガーゼを全く添加しなかった。南京錠ＦＶ２とＬｉｇＷと共に連結反応の鋳型としてホモ接合型野生型ヒトｇＤＮＡ（７７０ｎｇ）を用いた（図１２、レーン２）。二つの他の陽性対照連結反応も設定した。すなわち、南京錠ＦＶ２とＬｉｇＷを含み、鋳型として野生型標的オリゴヌクレオチド（１ピコモル）を用いた野生型対照反応（図１２、レーン３）、及び南京錠ＦＶ２とＬｉｇＭを含み、鋳型として突然変異標的オリゴヌクレオチド（１ピコモル）を用いた突然変異対照反応（図１２、レーン４）である。反応は全て９４℃まで加熱した後１μＬのアンプリガーゼを添加した。次いで、反応液を６０℃まで冷やし、１時間インキュベートして連結反応を起こさせた。連結反応の後、概述した計画を用いて１セットの反応物を精製し、最後に未処理の反応物と同容量に再懸濁した。
【０１３６】
次に、未精製及び精製した連結反応液をＲＣＡ用の鋳型として用い、プライマーＦＶ３及びＦＶ４を用いて６０℃で１時間４０分増幅させた。各連結反応物の１μＬだけをＲＣＡ反応液に添加した。これはそれぞれの連結反応の鋳型として用いられるヒトｇＤＮＡの１５．４ｎｇ又はオリゴヌクレオチドの２０ｆｍｏｌの等価物に等しい。存在する背景が増幅用プライマーＦＶ３及びＦＶ４によるものであったか否かを決定するため、ＲＣＡは鋳型の添加なしでも行われた（図１２、レーンＣ）。各反応物の１０μＬ部分を、φＸ１７４ＨａｅIII 消化ＤＮＡマーカー（図１２、レーンＭ）と共に２％アガロースゲルを通してＴＢＥ緩衝液中で電気泳動し、エチジウムブロミド染色により可視化した（図１２、パネルＡ）。次いで、このゲルをナイロン膜にサザン・ブロットし、標識ＬｉｇＷプローブと４５℃で一晩ハイブリダイズさせて、増幅されたＤＮＡ種のどれが南京錠プローブの二つの末端の間に介在する領域の配列を含むかを明らかにした。（図１２、パネルＢ）。
【０１３７】
エチジウムブロミド染色の後、鋳型を添加しなかった増幅反応物の中には背景のバンド形成は存在しなかった（図１２、パネルＡ、レーンＣ）。未精製鋳型が増幅されたとき、全てのレーンで多量体のバンド形成パターンが可視化された。オリゴヌクレオチド対照中のバンドの大部分は、予想された環状分子の正確なサイズに対応する生産物の間の標準単位長を持つ正しいＲＣＡ生産物であるようであった（図１２、パネルＡ、未精製レーン３及び４）。しかしながら、ＡｍｐＸ反応のバンド形成パターンと一致するバンド形成パターンが陰性対照反応に存在し（図１２、パネルＡ、未精製レーン１）、そしてＡｍｐＸバンド形成パターンとＲＣＡバンド形成パターンの混合パターンがヒトｇＤＮＡ試料中に存在するように見えた（図１２、パネルＡ、未精製レーン２）。
【０１３８】
対照的に、精製した連結反応物は完全に異なる一連の結果を与えた。ここでも、オリゴヌクレオチド対照のバンドの大部分は、そのサイズが予想された環状分子に対応し生産物の間に標準単位長を持つ正しいＲＣＡ生産物であるようであった（図１２、パネルＡ、精製レーン３及び４）。しかしながら、精製は陰性対照反応からＡｍｐＸ背景を除去したようであり（図１２、パネルＡ、精製レーン１）、そしてさらにヒトｇＤＮＡ反応に存在するバンド形成パターンを一掃し、そのためそれは付加的なＡｍｐＸ背景を持たないＲＣＡ生産物（図１２、パネルＡ、精製レーン２）とより一層一致するように見えた。これらの反応を標識ＬｉｇＷオリゴヌクレオチドで精査することにより、未精製陰性対照反応で生産されたＤＮＡは全て南京錠プローブの二つの末端の間に介在する領域の正しい配列を含んでいなかったことが示され、この証拠はさらに支持された（図１２、パネルＢ、未精製レーン１）。この精査の結果は、ＲＣＡの前に精製されなかったヒトｇＤＮＡ連結物から増幅された配列の一部は南京錠プローブの二つの末端の間に目的の正しい配列を含んでいたのに対し、増幅されたＤＮＡの大部分はこの配列を含んでいなかったことも示していた（図１２、パネルＢ、未精製レーン２）。対照的に、精製したｇＤＮＡ連結物から増幅されたＤＮＡの大部分は正しい介在領域を持つ配列を含むようであった。
【０１３９】
実施例８
ＲＣＡ反応の感度
実施例７で概述したように、ＲＣＡ反応を用いてヒトｇＤＮＡの１５．４ｎｇ程の微量から目的の配列を検出することが可能であった。ＲＣＡの感度を精製した環状分子についてさらに試験した。具体的には、未標識環状分子を、合成標的分子を用いて変性ポリアクリルアミドゲル上で行われた連結反応物からの正確なバンドを切り出すことにより精製した。これらの環状分子を抽出し、精製し、ＵＶ分光光度法分析により定量した。次にこの精製された物質を希釈し、ＲＣＡ反応の鋳型として使用した（図１３）。
【０１４０】
例示したように、この反応はＲＣＡ反応物中に存在する１０未満の環状分子を検出することができた。さらに、これらの反応液がウシ血清アルブミン１５μｇや１μＬのＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ（１：１０００希釈、モレキュラー・プローブズ）を反応緩衝液に添加することにより僅かに変更される場合も、該反応液は実時間蛍光測定により追跡して形成されるＤＮＡの量を評価することができる（図１４）。
【０１４１】
このデータを用いて、閾値の蛍光レベルを選ぶことができ、各試料がこの閾値に達するための時間を、存在する環状分子の量の対数に対してプロットすると、直線関係が観察される（図１５）。従って、ＲＣＡ反応は定量的であり、増幅反応に添加される環状物の数の予測が可能である。
【０１４２】
実施例９
ＲＣＡ反応の特異性
閉じた環状プローブ形成（標識スペーサー）及び精製計画を用いて、目的の正確な配列を検出するためのＲＣＡの特異性を明らかにすることが可能である。この遺伝子（すなわち、ヒトｇＤＮＡ）をコードするか又は該遺伝子（すなわち、大腸菌ｇＤＮＡ）をコードしないヒト因子Ｖ遺伝子鋳型及びゲノム鋳型の検出のため、図１１に概述したオリゴヌクレオチド設定を用いて、本発明者らは閉じた環状プローブ形成が、目的の遺伝子をコードするＤＮＡが存在するときのみ起こることを証明することができ、そして連結反応はこの条件の下で行われた。
【０１４３】
四つの別々の連結反応を設定した。そのそれぞれは南京錠ＦＶ２及びＬｉｇＷオリゴヌクレオチドを含んでいた。負の対照反応（図１６、レーン１）には鋳型は添加せず、その後の工程では反応にリガーゼを添加しなかった。一つの反応では、精製した大腸菌ｇＤＮＡ（２０ｎｇ）を負のｇＤＮＡ基質として用い（図１６、レーン２）、一方別の反応では精製したホモ接合型野生型ヒトｇＤＮＡ（２０ｎｇ）を正のｇＤＮＡ基質として用いた（図１６、レーン３）。さらに、野生型標的オリゴヌクレオチド（１ピコモル）を環状物形成のための正の対照として用いた（図１６、レーン４）。全ての反応液は９４℃まで加熱した後１μＬのアンプリガーゼを添加した。次いで、この反応物を６０℃まで冷却し、１時間インキュベートして連結反応を起こさせた。連結反応の後、該反応物を概述した計画を用いて精製し、最後に未処理の反応物と同量に再懸濁した。
【０１４４】
次いで、精製した連結反応物の各半分を、プライマーＦＶ３及びＦＶ４を用い６０℃で２時間増幅させるＲＣＡ用の鋳型として用いた。これはそれぞれの連結反応に鋳型として用いられる大腸菌ｇＤＮＡの１０ｎｇ、ヒトｇＤＮＡの１０ｎｇ又はオリゴヌクレオチドの０．５ピコモルの等価物に等しい。各反応物の１０μＬ部分を、φＸ１７４ＨａｅIII 消化ＤＮＡマーカー（図１６、レーンＭ）と共にＴＢＥ緩衝液中の２％アガロースを通す電気泳動にかけ、エチジウムブロミド染色で可視化した（図１６）。
【０１４５】
ＲＣＡ増幅の前に正確に閉じた環状鋳型分子を形成することが可能であったこれらの反応からは、ＲＣＡ生産物のみが生産されることは全く明らかである。
【０１４６】
実施例１０
閉じた環状豊富化ＲＣＡを用いる単一ヌクレオチド多型の検出
ＲＣＡは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が閉じた環状プローブの中に組み込まれるとき、それを識別することができる。野生型環状物及び突然変異環状物は、野生型環状物（Ｗ）を形成するときはＬｉｇＷと野生型標的オリゴヌクレオチド（１ピコモル）と共に、又は突然変異環状物（Ｍ）を形成するときはＬｉｇＭと突然変異標的オリゴヌクレオチド（１ピコモル）と共に南京錠ＦＶ２を用いる連結反応で形成された（図１１及び１７を参照）。鋳型が添加されず後の工程でリガーゼが添加されなかった負の対照反応も含めた（Ｃ）。連結反応は標準的計画に従って６０℃で１時間行い、次いで環状物を標準的精製計画を用いて精製した。
【０１４７】
ＲＣＡがＳＮＰの間を識別するためには、増幅プライマーの設計に注意が必要である。一般に、一つのプライマーは南京錠プライマーの「骨格」を表す閉じた環状プローブの領域に対し設計される。しかしながら、増幅特異的プライマーはその３’末端が突然変異特異的塩基に隣接するように設計されねばならない。該プライマーの３’末端上の最後の塩基の下流のオリゴヌクレオチドにおける突然変異も増幅の間に識別の助けとなると考えられる。因子Ｖ遺伝子に関するＳＮＰの検出のために選択されたプライマーは図１７に例示される。
【０１４８】
プライマーＦＶ３及びＦＶ４を用いる標準的ＲＣＡ反応を６３．５℃で１．５時間行い、ＴＢＥ緩衝液中２％ｗ／ｖアガロースを通して電気泳動し、エチジウムブロミド染色により可視化した場合、野生型環状物及び突然変異環状物の両方を検出することができた（図１８、ＦＶ３／ＦＶ４）。しかしながら、プライマーＦＶ３及びＦＶ５を用いて反応を行った場合、野生型環状物のみが増幅された（図１８、ＦＶ３／ＦＶ５）。同様に、プライマーＦＶ３及びＦＶ６を用いて反応を行った場合、突然変異環状物のみが増幅された（図１８、ＦＶ３／ＦＶ６）。負の対照反応ではいずれもＤＮＡは増幅されなかった。従って、ＲＣＡと共に対立遺伝子特異的プライマーを用いることによりＳＮＰを同定することが可能である。
【０１４９】
実施例１１
ＲＣＡ・ＳＰＡを用いるクラミジア・ニューモニエー及びトラコマチス
由来の配列の識別
この実施例はクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis)及びクラミジア・ニューモニエー（Chlamydia pneumoniae) 由来の合成ＤＮＡ標的の間の識別に関する。
１．この標的は、熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）をコードするシー．トラコマチス及びシー．ニューモニエーのｇｒｏＥＬの４０塩基の一本鎖合成断片であった。
２．保存配列にアニールし種特異的配列を含むギャップを残す単一の南京錠プローブを用いた。
３．プライマーの設計は次の通りであった。プライマーＦＶＣＯＭＴ南京錠プローブに関してアンチセンスであり、南京錠骨格、すなわち、標的にアニールしない南京錠プローブの部分、にアニールするように設計される。それはその５’末端にオリゴ糖−Ｔドメインをも含み、それと固体支持体の間のスペーサーとして働く。この対立遺伝子特異的プライマーは南京錠プローブ及びスペーサー配列と同一のセンスにあり、３’末端の４個の塩基がスペーサー配列の５’末端の４個の塩基と同一となるように設計される。
４．アニーリング／連結反応は標的、南京錠及び両対立遺伝子特異的スペーサーの存在下に行われた。
５．次いで、対立遺伝子特異的プライマーを用いる固相増幅（ＳＰＡ）ＲＣＡ反応において、環状物に信号が送られた。標的配列に指示された通りに、この反応物に含まれるプライマーが、環に組込まれたスペーサーと適合した時にだけ、増幅が生じた。
【０１５０】
連結反応
連結反応液は１×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ライフ・テクノロジーズ）、６ピコモルの南京錠ＨＳＰ２、５２ピコモルのＰｎｅスペーサー、５２ピコモルのＴｒａスペーサー、３．２ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ライフ・テクノロジーズ）、及び５０ピコモルの合成標的を４０μＬ反応液中に含んでいた。連結反応は９４℃で３分間変性した後室温で２０分間行った。
【０１５１】
ＲＣＡ
ＦＶＣｏｍＴが共有結合したヌンクウエル（Nunc wells) を１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡの５０μＬで１時間ブロックした。反応物は、６０μＬの反応液中に１×サーモポリメラーゼ緩衝液（ニューイングランド・バイオラブズ）、１０ｍＭのｄＮＴＰｓ（ベーリンガー・マンハイム）、１０ピコモルのＦＶＣｏｍＴ、１０ピコモルの標識Ｐｎｅ４又はＴｒａ４、４ＵのＢＳＴ・ＤＮＡポリメラーゼ大断片（ニューイングランド・バイオラブズ）、及び１μＬの連結された環状物を含んだ。９４℃で３分間の最初の変性の後、ＭＪリサーチ・ペルチア・サーマル・サイクラー−２００上で、等温ＲＣＡ反応を５５℃で１時間４０分行った。
【０１５２】
固相検出
室温でＴＢＳＴ（１００ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．１％ｖ／ｖのトゥィーン２０）で３回洗浄することによりウエルからＲＣＡ溶液を除去した。ウエルを１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡの５０μＬで３０分間ブロックし、ＴＢＳＴで３回洗浄した。抗フルオレセインアルカリ性ホスファターゼ抗体（ベーリンガー・マンハイム）をＴＢＳＴで３０００倍に希釈し、３０分間ウエルに添加（５０μＬ）した。ウエルをＴＢＳＴで６回洗浄し、ＴＢＳ（１００ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で２回洗浄した。各ウエルに、暗室条件下で５０μＬのＰＮＰＰ（パラ−ニトロフェニレンホスフェート）基質（シグマ）（０．２Ｍトリスで１ｍｇ／ｍＬ）を添加した。指示された時間の後４０５ｎｍでウエルを読み取った。
【０１５３】
ヌンクウエルへのＦＶＣＯＭＴの共有結合
被覆混合液には、１００ｎＭのＦＶＣｏｍＴ、１０ｍＭのＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）及び１０ｍＭの１−メチル−イミダゾールを含めた。各ウエルに１００μＬを添加し、ウエルを密閉して５０℃で一晩インキュベートた。ウエルをＴＢＳＴで３回洗浄し、次いで５分間液体を吸い取り、ＴＢＳＴで３回洗浄した。残存する塩を除くため、ウエルを脱イオン水で１回洗浄し、４℃で貯蔵した。
【０１５４】
オリゴヌクレオチド配列
シー．ニューモニエー由来の合成標的：
ＴＣＣ ＴＴＡ ＡＣＴ ＴＴＣ ＴＡＴ ＡＡＴ ＣＴＧ ＣＡＡ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＴＴ ＴＴＡ ＴＴＴ ＴＡＧ ＧＡＣ ＧＧＣ ＣＡＴ Ｇ
<400>27
シー. トラコマチス由来の合成標的：
ＴＣＣ ＴＴＡ ＡＡＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＡＣ ＴＣＴ ＣＴＴ ＡＧＴ ＴＴＴ ＴＡＴ ＴＧＣ ＡＧＡ ＡＣＴ ＧＣＧ ＡＴＡ
<400>28
シー. ニューモニエー特異的スペーサー（スペーサーＰＮＥ）：
５’６ＡＡ ＧｂＴ ＡＡＣ３’
シー．トラコマチス特異的スペーサー（スペーサーＴＲＡ）：
５’６ｂＴ ＧＣＡ ＡＡＣ３’
南京錠プローブ（ＬＯＣＫＨＳＰ２）：
５’６ＧＣ ＡＧＧ ＴＡＡ ＡＧＡ ＡＧＧ ＣＧＣ ＣＧＣ ＧＧＴ ＧＡＧ ＣＴＡ ＴＡＴ ＧＧＧ ＧＡＣ ＴＡＴ ＧＡＡ ＴＴＴ ＧＣＴ ＣＣＡ ＴＴＡ ＡＡＧ ＣＡＡ ＡＴＴ ＧＣ３’<400>30
シー. ニューモニエー特異的スペーサー（ＰＮＥ４）：
５’７ＣＣ ＡＴＴ ＡＡＡ ＧＣＡ ＡＡＴ ＴＧＣ ＡＡＧ Ｔ３’
<400>30
シー．トラコマチス特異的スペーサー（ＴＲＡ４）：
５’７ＣＣ ＡＴＴ ＡＡＡ ＧＣＡ ＡＡＴ ＴＧＣ ＴＧＣ Ａ３’
<400>31
６＝リン酸塩
７＝ＦＡＭ
ｂ＝ビオチン
【０１５５】
結果
（ｉ）固定化された対立遺伝子特異的プライマー、即ちＳＰＡ反応の比色検出
読み取りは４０５ｎｍの吸収であり、結果は表１に示してある。全ての場合に最も高い読みは標的配列／プライマー配列が適合した場合に得られたことを見ることができる。
（ii) 液相材料、ＳＰＡの読み取りと増幅の一致を示す
結果は図２０に示す。
【０１５６】
実施例１２
固相増幅（ＳＰＡ）及び因子Ｖライデン突然変異の検出
南京錠的環状化
閉じた環状プローブの形成（標識スペーサー）及び精製計画を用いて、回転環状増幅が固体支持体上に固定化されたプライマーから開始しうる能力を試験した。負（−ｖｅ）及び正（＋ｖｅ）の対照反応は両方とも各１ピコモルの南京錠ＦＶ２、ＬｉｇＷ及び野生型標的オリゴヌクレオチドを含んでいた。両反応を９４℃まで加熱し、次いで正の対照反応のみに１μＬのアンプリガーゼを添加した。この反応物を６０℃まで冷やし、１時間インキュベートして連結反応を起こさせた。連結反応の後、両反応物を概述した計画により精製した。南京錠配列及びオリゴヌクレオチド配列は図４に示す。
【０１５７】
固相増幅
製造者の指示に従って、ヌクレオリンク・プレート（ヌンク）にＦＶＣｏｍＴプライマー（５ピコモル）を共有結合させた。このプレートをＴＢＳＴ緩衝液（１００ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖのトゥィーン２０）中の１％ｗ／ｖＢＳＡ（１００ｍｇ／ｍＬ）中で室温で３０分間インキュベートすることによりブロックした。続いてこのブロック溶液をプレートから除去し、ウエル中で増幅反応を組立てた。標準的６０μＬの反応液を設定した。そのそれぞれは１０ピコモルの蛍光標識されたＦＶＷ１プライマーを含んでいた。正の対照反応のウエルにはさらに種々の量のＦＶＣｏｍＴを添加したが、ウエルに付着させるのではなく、溶液中に加えた。ウエルに結合したプライマーに加え１０ピコモルのＦＶＷ１及び１０ピコモルのＦＶＣｏｍＴを含む単一の反応液を用いて負の対照反応を試験した。それぞれの鋳型１μＬを各反応液に加え、ウエルを９４℃まで３分間加熱し、次いで６０℃まで冷やした。Ｂｓｔポリメラーゼ（４単位）を添加し、ウエルを６０℃で１００分間インキュベートした。
【０１５８】
検出−溶液相
増幅の後、ＲＣＡ反応物それぞれの１０μＬを２％ｗ／ｖアガロースゲル上で泳動させ、エチジウムブロミドで染色してＲＣＡ反応物の溶液相生産物を可視化した。
【０１５９】
予期されたように、負の対照反応液においては生産物は見えなかった。正の対照反応液の一部では溶液相に生産物が見えた。予想されたように、最大量の生産物は反応液の溶液相にさらにＦＶＣｏｍＴ１０ピコモルを添加したときに観察された（図２１）。追加した溶液相のＦＶＣｏｍＴのレベルが減少すると、可視化される生産物の量も減少した。しかしながら、添加したＦＶＣｏｍＴが０．１ピコモル以下のときは生産物は可視化されなかった（図２１）。
【０１６０】
固相検出
増幅した後、ウエルをＴＢＳＴ（２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖトゥィーン）中で３回洗浄し、ＴＢＳＴ中の１％ｗ／ｖＢＳＡで、室温で３０分間インキュベートすることによりブロックした。次いでそのウエルをＴＢＳＴで３回洗浄した。そのウエルそれぞれに、ＴＢＳＴで５０００倍に希釈した抗フルオレセイン−アルカリ性ホスファターゼ複合体抗体の５０μＬを添加し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、このウエルをＴＢＳＴ中で６回洗浄し、ＴＢＳ（２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で２回洗浄した。このウエルそれぞれにｐＮＰＰアルカリ性ホスファターゼ基質（シグマ）を５０μＬ添加し、このプレートを暗所に４０分間静置した。次いで、このプレートを４０５ｎｍで読み取った。その結果を表２に示す。
【０１６１】
強い吸光度の読みが４０分後に得られた。正の対照反応は全て、負の対照よりも少なくとも３倍であった。追加した溶液相のＦＶＣｏｍＴプライマーの濃度を変えても、生じたシグナルのレベルは劇的には変わらないようであった。
【０１６２】
当業者は、ここに記述した本発明が具体的に記述されたもの以外に変更及び改変することが容易であることを認めるであろう。本発明はこのような変更及び改変のすべてを包含すると理解されるべきである。本発明は本明細書で個々に又は集合的に言及され又は示された工程、特徴、組成及び化合物の全て、及びこれらの任意の２以上の工程又は特徴の組合せの全てをも含むものである。
【０１６３】
【表１】
【０１６４】
【表２】
【０１６５】
引用文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、Rep 媒介環状連結を図解して表す。
【図２】 図２は、GCN4認識配列（＜４００＞２６）を組み込んだ核酸プローブを図解して表す。
【図３】 図３は、分画ハイブリダイゼーションによる捕捉を図解して表す。
【図４】 図４は、南京錠FV2 を図解して表す。＜４００＞１３は南京錠FV-2配列及び＜４００＞１４LigWスペーサーを表す。＜４００＞１６は野生型標的、＜４００＞２４及び＜４００＞２５は増幅プライマーを表す。
【図４（ｉ）】 図４（i)は、南京錠FV2 を図解して表す。＜４００＞１３は南京錠FV-2配列及び＜４００＞１４LigWスペーサーを表す。＜４００＞１６は野生型標的、＜４００＞２４及び＜４００＞２５は増幅プライマーを表す。
【図４ （ｉｉ） 】 図４ (ii) は、南京錠FV2 を図解して表す。＜４００＞１３は南京錠FV-2配列及び＜４００＞１４LigWスペーサーを表す。＜４００＞１６は野生型標的、＜４００＞２４及び＜４００＞２５は増幅プライマーを表す。
【図５ａ】 パネルA は、増幅反応に用いる合成標的分子及びプライマーを図解して説明する（＜４００＞１〜＜４００＞８）。これらのプライマーの種々の組み合わせを等温度増幅反応に用いた。
【図５ｂ】 図５ｂは、合成標的分子からの等温度増幅を写真により表す。各反応から生成物１０μL を増幅した後、２％w/v アガロースゲル並行１００bpラダー（レーンM ）にのせ、電気泳動し、臭化エチジウムにより可視化した（パネルB ）。反応には、プライマーP1/B4C（レーン１）、P5C/B4C （レーン２）、P5C/B4（レーン３）、P5C/B4I （レーン４）、P4D/B4C （レーン５）、P5D/B4I （レーン６）及びP5E/B4I （レーン７）だけでなく、合成標的を加えなかったプライマーB4C/P5C （レーンC ）を用いたコントロールも含まれた。
【図６ａ】 図ａ６は、増幅生成物の制限消化及び配列解析を写真により表す。プライマーB4C/P5C （パネルA ）、B4I/P5E （パネルB ）、B4I/P5D （パネルC ）及びB4C/P1（パネルD ）を用いた４つの別の増幅反応の生成物を、制限消化及び配列解析により解析した。各反応のアリコートを、Sau3AI（レーンS ）、Alul（レーンA ）、EcoRI （レーンE ）及びTaql（レーンT ）で別々に消化し、２％w/v アガロースゲル並行２０bpラダー（レーンM ）及び未消化コントロール（レーンU ）により電気泳動した。生成物を臭化エチジウム染色により可視化した（カラム(i) ）。各増幅についての反応生成物をクローニングし、部分的に配列決定した。配列横の矢印は、クローンからの配列読みの方向を表す。各分子左の数字は、見いだされる各分子の逐次反復を表す。図解内の文字は、反復分子内に見いだされる変異を表す。各反復単位内のスペースは、存在する欠失を表す。
【図６ｂ】 図６ｂは、増幅生成物の制限消化及び配列解析を写真により表す。プライマーB4C/P5C （パネルA ）、B4I/P5E （パネルB ）、B4I/P5D （パネルC ）及びB4C/P1（パネルD ）を用いた４つの別の増幅反応の生成物を、制限消化及び配列解析により解析した。各反応のアリコートを、Sau3AI（レーンS ）、Alul（レーンA ）、EcoRI （レーンE ）及びTaql（レーンT ）で別々に消化し、２％w/v アガロースゲル並行２０bpラダー（レーンM ）及び未消化コントロール（レーンU ）により電気泳動した。生成物を臭化エチジウム染色により可視化した（カラム(i) ）。各増幅についての反応生成物をクローニングし、部分的に配列決定した。配列横の矢印は、クローンからの配列読みの方向を表す。各分子左の数字は、見いだされる各分子の逐次反復を表す。図解内の文字は、反復分子内に見いだされる変異を表す。各反復単位内のスペースは、存在する欠失を表す。
【図６ｃ】 図６ｃは、増幅生成物の制限消化及び配列解析を写真により表す。プライマーB4C/P5C （パネルA ）、B4I/P5E （パネルB ）、B4I/P5D （パネルC ）及びB4C/P1（パネルD ）を用いた４つの別の増幅反応の生成物を、制限消化及び配列解析により解析した。各反応のアリコートを、Sau3AI（レーンS ）、Alul（レーンA ）、EcoRI （レーンE ）及びTaql（レーンT ）で別々に消化し、２％w/v アガロースゲル並行２０bpラダー（レーンM ）及び未消化コントロール（レーンU ）により電気泳動した。生成物を臭化エチジウム染色により可視化した（カラム(i) ）。各増幅についての反応生成物をクローニングし、部分的に配列決定した。配列横の矢印は、クローンからの配列読みの方向を表す。各分子左の数字は、見いだされる各分子の逐次反復を表す。図解内の文字は、反復分子内に見いだされる変異を表す。各反復単位内のスペースは、存在する欠失を表す。
【図６ｄ】 図６ｄは、増幅生成物の制限消化及び配列解析を写真により表す。プライマーB4C/P5C （パネルA ）、B4I/P5E （パネルB ）、B4I/P5D （パネルC ）及びB4C/P1（パネルD ）を用いた４つの別の増幅反応の生成物を、制限消化及び配列解析により解析した。各反応のアリコートを、Sau3AI（レーンS ）、Alul（レーンA ）、EcoRI （レーンE ）及びTaql（レーンT ）で別々に消化し、２％w/v アガロースゲル並行２０bpラダー（レーンM ）及び未消化コントロール（レーンU ）により電気泳動した。生成物を臭化エチジウム染色により可視化した（カラム(i) ）。各増幅についての反応生成物をクローニングし、部分的に配列決定した。配列横の矢印は、クローンからの配列読みの方向を表す。各分子左の数字は、見いだされる各分子の逐次反復を表す。図解内の文字は、反復分子内に見いだされる変異を表す。各反復単位内のスペースは、存在する欠失を表す。
【図７】 図７は、増幅反応の選択性を写真により表す。合成標的分子の連続希釈を作成し、増幅反応の鋳型として用いた。増幅後、各反応から生成物１０μL を２％w/v アガロースゲルにより電気泳動し、臭化エチジウム染色により可視化した。
【図８ａ】 図８ａは、E.coliを含むミニトランスポゾンの検出を写真により表す。KanRミニトランスポゾンの１２０bp領域を増幅するために設計したプライマー（＜４００＞９）を、内部ハイブリダイゼーションプローブとして用いたオリゴヌクレオチドIn903 （＜４００＞１１）と共に説明する（パネルA ）。この特殊なミニトランスポゾンを担持する、種々の量のE.coli PNG801 ゲノムDNA からミニトランスポゾン配列を増幅する反応に、プライマー1F（＜４００＞１０）及び1R（＜４００＞１２）を用いた。増幅反応は、陰性コントロールとして種々の量のE.coli DH5αゲノムDNA についても実施し、増幅後、生成物1 μL をHindIII （レーンH ）で消化し、未消化コントロール（レーンU ）及び分子量マーカー（レーンM ）と並行して2 ％w/v アガロースゲルにより電気泳動した。鋳型を加えなかったコントロール反応も含まれた。
【図８ｂ】 図８ｂは、E.coliを含むミニトランスポゾンの検出を写真により表す。KanRミニトランスポゾンの１２０bp領域を増幅するために設計したプライマー（＜４００＞９）を、内部ハイブリダイゼーションプローブとして用いたオリゴヌクレオチドIn903 （＜４００＞１１）と共に説明する（パネルA ）。この特殊なミニトランスポゾンを担持する、種々の量のE.coli PNG801 ゲノムDNA からミニトランスポゾン配列を増幅する反応に、プライマー1F（＜４００＞１０）及び1R（＜４００＞１２）を用いた。増幅反応は、陰性コントロールとして種々の量のE.coli DH5αゲノムDNA についても実施し、増幅後、生成物1 μL をHindIII （レーンH ）で消化し、未消化コントロール（レーンU ）及び分子量マーカー（レーンM ）と並行して2 ％w/v アガロースゲルにより電気泳動した。鋳型を加えなかったコントロール反応も含まれた。
【図９】 図９は、南京錠的ハイブリダイゼーション及び環状化の図解ダイアグラムである。
【図１０】 図１０は、未精製鋳型又は精製鋳型のいずれかを用いた合成標的についてのRCA 反応を写真により表す。二重の連結反応を1 ページに概説した（標識したスペーサープロトコル）。この反応に用いたオリゴヌクレトチドをダイアグラムとして説明する（図１１）。２本の別の試験管には各反応セットが含まれていた。陰性コントロール反応（−ve）には南京錠FV2 及びLigWが含まれ、他方陽性コントロール反応（＋ve）には南京錠FV2 、LigW及び野生型標的オリゴヌクレオチドが含まれていた。９４℃３分間の最初の変性後、アンプリガーゼ１μL を陽性コントロール反応のみに加えた。連結反応は６０℃で１時間行った。次に、連結の１セットを記載した方法により精製した。次に、未精製及び精製連結反応を６０℃で１時間４０分の間プライマーFV3 及びFV4 と共にRCA に付した。各反応から１０μＬを２％w/v アガロースに、TBE 緩衝液において、HaeIII消化DNA マーカー（レーン4M）並行φX174で電気泳動し、臭化エチジウム染色して可視化した。
【図１１】 図１１は、オリゴヌクレオチド設計の概略を表すものであり、該設計は、RCA を使用しての因子Ｖライデン遺伝子検出の通常アレル及び突然変異アレルの、回転環状増幅検出のために使用する。（南京錠ＦＶ２：<400>13 ；ＬｉｇＷスペーサー：<400>14 ；ＬｉｇＭスペーサー：<400>15 ；野性型標的：<400>16 ；突然変異型標的：<400>17 ；プライマー：<400>18 及び：<400>19 ）。
【図１２】 図１２は、RCA 反応についての未精製鋳型及び精製鋳型の比較を写真により表す。
【図１３】 図１３は、精製した環状からのRCA 選択性を写真により表す。精製環状分子の１０倍連続希釈をRCA 反応の鋳型として６０℃で２．５時間用いた。各反応に存在する環状の数を、８×１０9 （レーン１）、８×１０8 （レーン２）、８×１０7 （レーン３）、８×１０6 （レーン４）、８×１０5 （レーン５）、８×１０4 （レーン６）、８×１０3 （レーン７）、８×１０2 （レーン８）、８×１０1 （レーン９）８（レーン１０）、０．８（レーン１１）と見積もった。さらに、陰性コントロール反応も含め、プライマーによる人工産物が反応の間に形成されていないことを確認した。各増幅生成物のアリコート１０μL を２％w/v アガロースに、TBE 緩衝液において、DNA マーカーX （Roche 、レーンM ）と並行して電気泳動し、臭化エチジウム染色して可視化した。
【図１４】 図１４は、回転環状増幅反応のリアルタイム可視化をグラフで表す。
【図１５】 図１５は、存在する環の数と蛍光閾値に達するまでの時間の直線関係をグラフで表す。
【図１６】 図１６は、RCA の目的遺伝子特異的検出能を写真により表す。
【図１７】 図１７は、因子Ｖライデン通常及び変異配列のSNP 検出のためのオリゴヌクレオチド設計を図解して表す（野生型配列：＜４００＞２０、変異配列：＜４００＞２１、FV5 ：＜４００＞２２、FV6:＜４００＞２３、ＦＶ3 ：＜４００＞１８）。
【図１８】 図１８は、SNP 検出のためのRCA のポテンシャルを写真により表す。
【図１９】 図１９は、二つのプライマーがいずれのオリゴヌクレオチドにも結合しないように設計された南京錠プローブを図解して表す。
【図２０】 図２０は、実施例１１に記載した反応で生成した溶液相材料を写真により表す。
【図２１】 図２１は、実施例１２に記載した反応で生成した溶液相材料を写真により表す。
【配列表】
発明の属する分野
本発明は、一般的には閉鎖した環状核酸プローブを増幅する方法に関し、より詳しくは回転環状増幅により閉じた環状核酸プローブを増幅する方法に関する。本発明の方法は、遺伝子疾患、遺伝子変異又は微生物若しくはウイルスの存在などの核酸配列検出を含む適用の範囲に有用であるが、それらに限定されない。
【０００２】
発明の背景
本明細書中番号により参照される刊行物の出版目録に関する詳細は本明細書の末尾にまとめられている。
【０００３】
感染性疾患や遺伝子疾患の診断のために種々の核酸増幅技術が存在する。１０年以上前のその発明以来、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) （１）は研究及びDNA に基づく診断における第一選択の方法となった。これはそのスピード、簡便さおよび選択性による。しかしながらPCR は温度の循環を要求し、従って高価な温度循環のための装置の使用が必要である。温度の循環を要求する他の増幅技術には、リガーゼ連鎖反応(LCR) （２）や転写に基づく増幅システム(TAS) （３）が挙げられる。
【０００４】
多数の温度循環を要求せず、本質的に等温のシステムである他の増幅技術も種々存在する。これらのうちのいくつかは、転写により媒介されるか、絶対必要な反応成分としてRNA を要求し、従って増幅環境をリボソームヌクレアーゼ汚染がないよう維持する必要がある。これらの方法には、Ｑβレプリカーゼシステム（４）、自己継続配列複製(3SR) （５）や核酸配列に基づく増幅(NASBA) （６）が挙げられる。
【０００５】
現在、本質的にRNA 中間体を要求しない核酸配列増幅のための少なくとも二つの等温技術があるようだ。連鎖置換増幅(SDA) （７）は、ヘミホスホロチオ化認識部位に切れ目を入れる制限酵素の能力及び切れ目で複製を開始し下流鎖を置き換えるポリメラーゼの能力に依存する等温技術である。核酸配列増幅に用いうる他の等温技術は回転環状増幅(RCA) である。
【０００６】
これまでに、種々の形態の回転環状増幅技術が記載されている（８、９）。本質的には、その技術は環状DNA プローブからの増幅に依存する。環状プローブは、一般的に「南京錠プローブ」と呼ばれ、目的の標的配列に相補的なその５’末端及び３’末端の両者に領域を有し、非標的由来起源のヌクレオチド領域により隔てられるように設計される。ハイブリダイゼーションの際に、そのプローブの５’末端及び３’末端は互いに極めて接近する。二つのプローブ領域が互いに隣接していれば、５’末端及び３’末端は結合して環状プローブをつくり得る。しかしながらある場合には、これらのプローブ領域はヌクレオチドの短い伸張により互いに隔てられる。この領域を埋め、環状プローブを形成しなければならない。これに関しては、スペーサーオリゴヌクレオチドの使用、又はトリリン酸デオキシヌクレオチド分子との組み合わせでDNA ポリメラーゼ（又はRNA 標的の場合には逆転写酵素）を用いて連結の前のギャップを埋めるといった、種々の技術が用いられうる。
【０００７】
回転環状増幅技術に関する重要な問題は、バックグラウンド増幅が起こることである。本発明の出現の前には、このバックグラウンド増幅は、二つのプライマーの５’末端間にある領域を引いた全ユニット反復を包含するプライマーによる欠失断片反復として見逃されていた（８）。バックグラウンド増幅は、二つのプライマーを用いる回転環状増幅にとって重要な問題であると同時に限界を表すものである。また陽性の誤った結果の主たる原因でもある。実際、このバックグラウンド増幅が起こることにより提起された問題の大きさは、許容できる特異性レベルを有する二プライマー回転環状増幅技術が使用不可能となるほどのものであった。
【０００８】
本発明に至る研究において、本発明者らはこのバックグラウンド増幅の起源を決定し、特徴づけた。このバックグラウンド増幅のクラスを「AmpX」と命名した。本発明者らは、それが反応混合物に存在する線状核酸プローブ分子を利用する代替増幅反応であることを決定した。典型的には、この反応生成物は頭から尾への縦列反復の多量体である。しかしながら、本発明者らは、このAmpX反応の生成物が、環状プローブ全体からの配列を包含するのではなく、二つのプライマー結合部位を介在する配列及びプライマー結合部位に隣接するいくつかのさらなる鋳型分子配列を含む線状標的分子の領域の反復を含むことを決定した。
【０００９】
従って、本発明者らはその増幅に先立ち、閉じた環状核酸プローブ分子を豊富化することによりAmPXバックグラウンド増幅を最小にする方法を開発した。閉じた環状核酸プローブ分子の豊富化した集団を用いる増幅工程を行うことにより、AmpX反応により起こるバックグラウンド増幅の発生率は有意に減少し、それによりより特異的な回転環状増幅が起こることを可能とする。
【００１０】
発明の要約
本明細書及び請求の範囲にわたり、文章の脈絡が別意を要求しない限り、用語「を含む(comprise)」並びに「を含む(comprises) 」及び「を含んでいる(comprising)」といった活用形は、述べた数若しくは工程又は数の群若しくは工程の群を含むが、他の数若しくは工程又は数の群若しくは工程の群を排除するものではないと理解されるであろう。
【００１１】
本明細書は、引用文献の後に、プログラムPatentIn version２．０を用いて作成されたヌクレオチド配列情報を含む。各ヌクレオチド配列は、数字による指示＜２１０＞の後に配列特定子（例えば、＜２１０＞1 、＜２１０＞２など）により配列表中で特定されている。各ヌクレオチド配列についての長さ、配列の型(DNAなど）及び生物起源は、それぞれ数字による指示の位置＜２１１＞、＜２１２＞及び＜２１３＞にある情報により示される。本明細書中で参照されるヌクレオチド配列は、数字による指示の位置<400> の後の配列の指示（例えば、＜４００１＞１、＜４００＞２など）にある情報により特定される。
【００１２】
従って本発明の一つの側面では、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用の後に形成される環状核酸プローブを増幅する方法であって、該環状核酸プローブを豊富化する工程及びその後該環状核酸プローブを増幅させる工程を含む方法が提供される。
【００１３】
本発明の別の一側面では、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進させる工程、環状核酸プローブを形成させ該環状核酸プローブを豊富化させる工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅させる工程を含む回転環状増幅方法が提供される。
【００１４】
なおも本発明の別の側面では、より詳しく、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進させる工程、環状核酸プローブを形成させ該環状核酸プローブを豊富化させる工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅させる工程を含む複数プライマー回転環状増幅方法が提供される。
【００１５】
本発明のさらなる側面では、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用の後に形成される環状核酸プローブを増幅する方法であって、該環状核酸プローブを酵素的に豊富化させる工程及び該環状核酸プローブを増幅させる工程を含む方法が提供される。
【００１６】
なおも本発明のさらなる側面では、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進させる工程、環状核酸プローブを形成させ、該環状核酸プローブを酵素的豊富化により豊富化させる工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅させる工程を含む複数プライマー回転環状増幅方法が提供される。
【００１７】
なおも本発明の別のさらなる側面では、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用の後に形成される環状核酸プローブを増幅する方法であって、該環状核酸プローブを非酵素的に豊富化させる工程及び該環状核酸プローブを増幅させる工程を含む方法が提供される。
【００１８】
なおも本発明の別のさらなる側面では、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進させる工程、環状核酸プローブを形成させ該環状核酸プローブを非酵素的豊富化により豊富化させる工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅させる工程を含む複数プライマー回転環状増幅方法が提供される。
【００１９】
本発明のなおも別の側面では、核酸プローブと標的核酸分子とが相互作用して該プローブの両末端領域が非隣接二本鎖を形成する反応を促進させる工程、環状核酸プローブを形成させる工程、該両末端領域の間に介在する領域中に捕捉リガンドを組み込み該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅する工程を含む複数プライマー回転環状増幅方法が提供される。
【００２０】
本発明のなおもさらなる側面では、核酸プローブと標的核酸分子とが相互作用して該プローブの両末端領域が非隣接二本鎖を形成する反応を促進させる工程、環状核酸プローブを形成させる工程、該両末端領域の間に介在する領域中にビオチン化捕捉リガンドを組み込み該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅する工程を含む複数プライマー回転環状増幅方法が提供される。
【００２１】
別の側面では、本発明は環状核酸プローブを豊富化する方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、及び環状核酸プローブを形成させ該環状核酸プローブを豊富化する工程を含む方法を目的とする。
【００２２】
本発明のなおも別の側面では、環状核酸プローブを豊富化する方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、及び環状核酸プローブを形成させ該環状核酸プローブを酵素的豊富化により豊富化する工程を含む方法を提供する。
【００２３】
本発明のなおも別の側面では、環状核酸プローブを豊富化する方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、及び環状核酸プローブを形成させ該環状核酸プローブを非酵素的豊富化により豊富化する工程を含む方法を目的とする。
【００２４】
本発明のなおも別の側面では、環状核酸プローブを豊富化する方法であって、核酸プローブと標的核酸分子とが相互作用して該プローブの両末端領域が非隣接二本鎖を形成する反応を促進させる工程、及び環状核酸プローブを形成し、該両末端領域の間に介在する領域中に捕捉リガンドを組み込み該環状核酸プローブを豊富化する工程を含む方法を目的とする。
【００２５】
さらなる側面では、環状核酸プローブを豊富化する工程及びその後該環状核酸プローブを増幅する工程を含む環状核酸プローブを増幅する方法において、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用の後に形成される環状プローブを増幅する工程を含む改良法が提供される。
【００２６】
さらなる別の側面では、回転環状増幅方法において、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成させて該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅する工程を含む改良法が提供される。
【００２７】
なおも別のさらなる側面では、回転環状増幅方法において、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成させて該環状核酸プローブを酵素的豊富化により豊富化する工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅する工程を含む改良法が提供される。
【００２８】
なおも別のさらなる側面では、回転環状増幅方法において、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成させて該環状核酸プローブを非酵素的豊富化により豊富化する工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅する工程を含む改良法が提供される。
【００２９】
本発明の別の側面では、回転環状増幅方法において、核酸プローブと標的核酸分子とが相互作用して該プローブの両末端領域が非隣接二本鎖を形成する反応を促進させる工程、環状核酸プローブを形成させ、該両末端領域の間に介在する領域中に捕捉リガンドを組み込み、該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅する工程を含む改良法が提供される。
【００３０】
本発明の別の側面では、疾病状態を診断する方法又は遺伝的変異型を検出する方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成させ該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅する工程を含む方法を意図する。
【００３１】
別の側面では、本発明は疾病状態を診断する方法又は遺伝的変異型を検出する方法であって、核酸プローブと標的核酸分子とが相互作用して該プローブの両末端領域が非隣接二本鎖を形成する反応を促進させる工程、環状核酸プローブを形成させ、該両末端領域の間に介在する領域中に捕捉リガンドを組み込み、該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅する工程を含む方法を意図する。
【００３２】
本発明のなおも別の側面では、回転環状増幅を促進するためのキットであって、一つ以上の任意の核酸プローブ、酵素、捕捉リガンド、環状核酸プローブを単離する手段、及び該プローブの環状化、単離及び増幅を促進するために有用な試薬を収容するように適応させた区画を含むキットを提供する。例えば、生物試料を受容するためのさらなる区画が含まれていてもよい。
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明は、部分的には、回転環状増幅の間などの環状プローブの増幅の間に起こるある種の非特異的バックグラウンド増幅反応の同定に基づく。この種の非特異的増幅は「AmpX」と呼ばれ、本発明者らにより反応混合物中の線状核酸プローブ及び開放環状核酸プローブの存在により起こると特定された。従って、本発明者らは増幅計画中に、その増幅に先立ち閉じた環状プローブ分子を豊富化する工程を取り込むことによりAmpX非特異的増幅を最小にする方法を開発した。この工程は、例えば、閉じた環状分子の精製又は線状分子及び／又は開放環状分子の除去により達成されるであろう。
【００３４】
従って本発明の一つの側面では、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用の後に形成される環状核酸プローブを増幅する方法であって、該環状核酸プローブを豊富化する工程及びその後該核酸プローブを増幅させる工程を含む方法Ｇａ提供される。
【００３５】
環状核酸プローブを形成する工程及び該プローブを豊富化する工程はいかような順序でも実施され得ると理解されるべきである。つまり、ハイブリダイズしたプローブはその豊富化に先立ち環状化されてもよく、又はハイブリダイズした核酸プローブの豊富化がその環状化に先立ち実施されてもよい。さらに、本発明の一以上の任意の工程は連続して実施しても、同時に実施してもよい。
【００３６】
より詳しくは、本発明は、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進させる工程、環状核酸プローブを形成させ該環状核酸プローブを豊富化させる工程、及び該豊富化された環状核酸プローブを増幅させる工程を含む回転環状増幅方法を提供する。
【００３７】
「回転環状増幅」への言及は、特定の増幅形態又は特定の増幅計画への言及ととるべきでない。環状核酸分子を増幅する任意の方法への言及と理解されるべきである。
【００３８】
「相互作用」への言及は、相補的なヌクレオチド塩基対間のハイブリダイゼーションといった相互作用のいずれの形態又はプローブ分子の核酸若しくは非核酸部分と標的分子の核酸若しくは非核酸部分との間の結合形成といった他のいくつかの形態の相互作用への言及であると理解されるべきである。相互作用は、共有結合、水素結合、ファンデルワールス力又は任意の他の相互作用機構といった結合形成を介して起こるであろうが、これらに限定されない。以下、二つの核酸分子間の「ハイブリダイゼーション」への言及は全て該分子間の相互作用のいずれの形態も、例えば該分子が該分子の非核酸成分の相互作用により会合することとなる場合をも含むものと理解されるべきである。
【００３９】
「核酸プローブ」への言及は、ヌクレオチド配列又はその機能的誘導体の配列を含む任意の分子であって、その機能が標的核酸配列と該ヌクレオチド配列の少なくとも一領域のハイブリダイゼーションを含む分子への言及と理解されるべきである。従って「標的核酸配列」への言及は、ヌクレオチド配列又はその機能的誘導体を含む任意の分子であって、目的分子であり、従って精査する工程を介して特定される分子への言及である。核酸プローブ及び標的核酸配列は両者とも非核酸成分を含んでいてもよい。例えば、核酸プローブは非核酸検出標識又は分子の機能を促進する他の非核酸成分を含んでいてもよい。同様に、標的核酸配列は非核酸成分を含んでいてもよい。例えば、標的核酸配列は抗体に結合していてもよい。これは、例えば標的核酸配列が該標的核酸配列に対する自己免疫応答などの免疫応答にある個体から単離した生物試料に存在する場合に起こるであろう。別の例では、核酸プローブは核酸側鎖を有するペプチド骨格を含むタンパク質核酸であってもよい。
【００４０】
用語「核酸プローブ」は、二以上のヌクレオチド配列分子への言及を含むとも理解されるべきである。それらの分子は一のヌクレオチド配列分子を形成するように連結、会合又は結合し、その連結又は他の形態の結合は標的配列を核酸プローブで精査する間か又はその後に行われる。従ってヌクレオチド配列分子の連結又は他の形態の会合の促進は、核酸プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションの前、間又は後などの標的配列の精査の間又は後のいつでも実施され得るだろう。例えば、Rep 媒介系の連結では（例は図１に図解して表す）、標的配列は二つの核酸分子で精査する。第一のプローブ分子は末端TATTATT 配列を含み、他方第二のプローブ分子は末端TATTATTAC 配列を含む。これらのプローブの標的配列へのハイブリダイゼーションの後、Rep 分子を利用して該第二のプローブ分子の末端TATTATTAC のTATTATT 成分の開裂を促進し、その後該第二のプローブ分子の末端ACを、例えば該第二のプローブ分子に隣接する位置で標的配列にハイブリダイズした第一のプローブ分子の末端TATTATT 成分へ連結する。
【００４１】
核酸プローブは好ましくは一本鎖ヌクレオチド配列であり、例えば線状コンホメーション又は開放環状コンホメーションを含むいずれのコンホメーションを有していてもよい。すなわち、該ヌクレオチドプローブは実質上環状の形態ではあるが、その末端領域は結合していない。核酸プローブの「末端領域」への言及は、核酸プローブの各末端に位置する領域への言及である。核酸プローブは核酸プローブの各末端領域のいずれかに位置する二つの別々の標的プローブ領域を含んでいることが好ましい。しかしながら標的プローブ領域は核酸プローブの末端領域に位置する必要はなく、核酸プローブの他のいずれかの適切な領域に位置していてもよいと理解されるべきである。標的プローブ領域は、目的の標的核酸配列の一以上のヌクレオチド配列領域に相補的なヌクレオチド領域である。核酸プローブの両末端領域間に位置するヌクレオチド配列領域も、少なくとも一のプライマー領域を含んでいることが好ましい。「プライマー領域」はプライマーの少なくとも部分と相互作用するよう設計されたヌクレオチド配列への言及である。「プライマー領域」への言及は、センスプライマーが対応するヌクレオチド配列のいずれかへの言及も含む。当該技術分野における熟練者は、プライマーが標的核酸配列の領域と相互作用するヌクレオチド配列を含む分子であり、そこから相補的ヌクレオチド合成が、例えばDNA ポリメラーゼなどのポリメラーゼを利用して開始されると理解するであろう。プライマーとプライマー領域との相互作用は、相補的な塩基対のハイブリダイゼーション又はプライマーを含む非核酸成分とプライマー領域との相互作用などの適切な手段のいずれかにより起こるであろうが、これらに限定されない。核酸プローブは複製起点、プロモーター、核酸及び／又は非核酸検出標識に対応する領域を任意に含んでいてもよい。
【００４２】
本発明の一実施態様では、核酸プローブは二つの標的プローブ領域及び二つのプライマー領域を含み、該環状核酸プローブの指数的増幅は第一プライマーと該核酸プローブのプライマー領域との相互作用、及び第一プライマーと該プローブとの相互作用の後合成される核酸プローブの相補鎖領域と第二プライマーとの相互作用により達成される。この回転環状増幅方法を本明細書中、「二プライマー回転環状増幅」とよぶ。
【００４３】
本発明の方法により、該プライマーは適切な任意の方法により機能し得る。例えば、第一プライマーは該核酸プローブのプライマー領域と相補的な塩基対をなすことにより相互作用するよう設計し得る。このタイプのプライマーは一般に相補的プライマーとよばれ、該核酸プローブに相補的な核酸鎖の合成を促進する。第二プライマーは該核酸プローブの第二プライマー領域に対応するセンスプライマーとして設計され、それにより第一プライマーを利用して合成された鎖に相補的な核酸鎖の合成を促進する。代替として、核酸プローブの二又はそれ以上の異なるプライマー領域を認識する単一のプライマーヌクレオチド配列を用いてもよい。これに関し、該プライマー領域は相補的なヌクレオチド配列配向のものであってもよい。なおも別の例では、一またはそれ以上のプライマーはプライマー領域で核酸又は非核酸成分と相互作用し、それにより相補的核酸鎖の合成を促進する非核酸成分を含んでもよい。本発明の方法は三以上のプライマーを利用する増幅（本明細書中、「複数プライマー増幅」という）にも及ぶ。例えば、二又はそれ以上の相補的プライマーが別々のプライマー領域に向かい、二又はそれ以上のセンスプライマーが別々のプライマー領域に向かう。「複数プライマー増幅」は核酸プローブの二又はそれ以上の別々のプライマー領域を認識する単一の配列の使用も含むと理解されるべきである。
【００４４】
従って本発明は、より詳しくは核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成し該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増幅する工程を含む複数プライマー回転環状増幅方法を提供する。
【００４５】
複数プライマー回転環状増幅は二プライマー回転環状増幅であることが好ましい。
【００４６】
「核酸」への言及は、デオキシリボ核酸及びリボ核酸の両者又はそれらの誘導体への言及と理解されるべきである。本発明の方法に利用される核酸分子は天然に生じるもの（例えば、生物試料を用いてもよい）、組み換え生成物又は合成生成物といったいずれの起源であってもよい。生物試料を用いる場合は、例えば標的核酸配列の可能な供給源として、（例えば、紙などの固相にそれを結合する目的で）試験に先立ち核酸成分を任意選択的に試料から抽出してもよい。これは必須ではないが、本発明の方法は、例えば血液試料を用いて実施してもよく、生検体標本を用いてin situ で実施してもよい。
【００４７】
「誘導体」への言及は、天然、合成又は組み換え体起源からの断片、部分、部位、化学的等価物、類似体、変異体、相同体及び擬似体への言及を含むと理解されるべきである。「機能的誘導体」とは、複数のヌクレオチド又は核酸配列の一またはそれ以上の機能的活性を表す誘導体として理解されるべきである。該複数のヌクレオチド又は核酸配列の誘導体としては、他のタンパク質性又は非タンパク質性分子に融合したヌクレオチド又は核酸配列の特定のエピトープ又は部分を有する断片が挙げられる。本明細書中意図した類似体としては、その化学的構成又は全体のコンホメーションの修飾などのヌクレオチド又は核酸配列への修飾が挙げられるが、これらに限定されない。これには、例えば断片骨格形成又は相補的塩基対ハイブリダイゼーションのレベルなどで、ヌクレオチド又は核酸配列が他のヌクレオチド又は核酸配列と相互作用する様式の修飾が挙げられる。ヌクレオチド又は核酸配列のビオチン化は、本明細書中に定義する「機能的誘導体」の一例である。核酸配列の誘導体は一または複数のヌクレオチド置換、欠失及び／又は付加により導かれ得る。用語「機能的誘導体」は、例えば天然産物スクリーニングの後に得られる生成物などの、ヌクレオチド又は核酸配列の一またはそれ以上の機能的活性を表すヌクレオチド又は核酸配列を含むと理解されるべきである。
【００４８】
核酸プローブと標的核酸配列との相互作用の促進は、いずれかの適切な方法により実施し得る。これらの方法は当該技術分野の通常の知識を有する者に知られている。
【００４９】
該標的プローブ領域が標的核酸配列と相互作用する場合は、該核酸プローブは開放環状コンホメーションをとる（本明細書中、「開放環状核酸プローブ」という）。標的核酸配列と相互作用することにより、該標的プローブ領域は一般に、例えば該標的核酸配列のヌクレオチドと該核酸プローブの標的プローブ領域のヌクレオチド間の相補的ヌクレオチド塩基対により二つの別々の二本鎖領域を形成する（以下「二本鎖（複数）」という）。核酸プローブの５’末端の末端ヌクレオチドと核酸プローブの３’末端の末端ヌクレオチドとの間には、ホスホジエステル結合などの結合がないことにより、これらの二つの二本鎖は隣接せずに存在する。二本鎖（複数）の間に、標的核酸配列起源のヌクレオチドの介在領域が存在し得る。このヌクレオチドの介在領域はいくつのヌクレオチドを含み得る。
【００５０】
また「開放環状核酸プローブ」への言及は、二又はそれ以上の核酸プローブを含む単一の開放環状コンフィギュレーションの形成をも含むと理解されるべきである。例えば、二重開放環状核酸プローブ（これは「開放環状核酸プローブ」の意味に含まれる）は、
(i) 第一核酸プローブの５’標的プローブ領域が第一標的核酸配列分子にハイブリダイズし、かつ該プローブの３’標的プローブ領域が第二標的核酸配列分子にハイブリダイズし、及び
(ii)第二核酸プローブの３’標的プローブ領域が該第一標的核酸配列にハイブリダイズし、該第二プローブの５’標的プローブ領域が該第二標的核酸配列にハイブリダイズする、
場合に形成される。
【００５１】
前記第一標的核酸配列及び第二標的核酸配列は同じであっても、又は異なっていてもよい。従って二重開放環状核酸プローブは2 対の非隣接二本鎖を表す。一つは第一標的核酸配列上に位置し、他方は第二標的核酸配列上に位置する。このタイプの開放環状プローブは、単一のプローブには同様に作用し、同一の生成物をつくる。これらの複数開放環状核酸プローブは環状化し、単一プローブのみを含む開放環状プローブと同様の方法で豊富化される。実際、どの与えられた反応混合物も単一プローブタイプと複数プローブタイプ（二重プローブなど）の両者の開放環状核酸プローブを含む可能性が高い。
【００５２】
核酸プローブを増幅させるためには、二本鎖領域で標的配列と相互作用する開放環状核酸プローブが環状化する必要がある。「環状化」とは、閉じた環状の形成を意味する。環状化はギャップ−充填又はスペーサーオリゴヌクレオチド連結といった幾つかの方法のうちのいずれかにより実施されればよいが、これらに限定されない。「ギャップ−充填」への言及は、ヌクレオチド配列の合成を介して開放環状核酸プローブの両末端を結合する、開放環状核酸プローブの環状化への言及である。これに関し、開放環状核酸プローブは必要なdNTP、リガーゼ及びDNA ポリメラーゼと反応させる。「スペーサーオリゴヌクレオチド連結」とは、一またはそれ以上の先に合成されたヌクレオチド配列（「スペーサーオリゴヌクレオチド」という）を開放環状核酸プローブの５’末端と３’末端の間のギャップに挿入することを意味する。次にスペーサーの両末端を、例えばリガーゼ酵素を用いて開放環状核酸プローブの両末端と連結する。一以上のスペーサーオリゴヌクレオチドを使用する場合には、例えば開放環状核酸プローブの５’末端と３’末端との間のギャップを充填するように、縦列で連結すればよい。
【００５３】
開放環状核酸プローブの環状化の際、ここで隣接する二本鎖は一般的にらせん型フォーメーションをとるであろう。この標的核酸配列の周りのプローブのハイブリダイズした部分はねじれることが必須であり、標的核酸配列の周りに環状化したプローブの「施錠」を生じる。この「施錠」はしばしば「南京錠形成」又は「南京錠的環状化」とよばれる。従って環状核酸プローブへの言及は、南京錠プローブ及び非南京錠プローブの両者への言及を含むと理解されるべきである。
【００５４】
本発明はいずれかの理論又は作用様式に限定されるものではなく、開放環状核酸プローブの環状化の後、反応混合物は通常、種々の割合で、環状化された核酸プローブ（「閉じた環状核酸プローブ」ともいわれる）、開放環状核酸プローブ及び線状核酸プローブを含むものとなろう。線状核酸プローブは標的核酸配列と相互作用せず、又は連結しないプローブである。環状化の後、残りの開放環状核酸プローブは、環状化工程によっても変わらないそれらのプローブ及び例えば、スペーサーが核酸プローブ両末端のうちの一つにのみ（すなわち５’末端又は３’末端）に連結される場合又はギャップ−充填合成が部分的にのみ完了される場合などの不完全に環状化されたそれらのプローブの両者を含むであろう。このような反応混合物を用いて二プライマー回転環状増幅を実施する場合には、得られる増幅生成物は、
(i) 第一プライマーから合成された核酸配列、このヌクレオチド配列は閉じた環状核酸プローブの配列に相補的な配列の縦列反復を含む、及び
(ii)第二プライマーから合成されたヌクレオチド配列、このヌクレオチド配列は第一プライマーにより形成された核酸配列に相補的な核酸配列の縦列反復を含む、
を含むであろう。
【００５５】
これらの増幅生成物は一本鎖核酸配列として又は相補的な核酸配列に完全に又は部分的にハイブリダイズした核酸配列として存在するであろう。「部分的ハイブリダイゼーション」とは、核酸配列の部分が相補的な配列にハイブリダイズし、核酸配列の部分が一本鎖型であることを意味する。これは、例えばプライマーが核酸配列の二又はそれ以上の縦列反復と相互作用し、下流プライマーから合成された増幅生成物が隣接する上流プライマーに出会う場合などの鎖置換の効果により起こるであろう。この場合、下流生成物から形成された増幅プライマーはその相補的合成伸長を続行するにつれ上流プライマーと置き換わることになる。
【００５６】
しかしながら前記増幅生成物(i) 及び(ii)だけでなく、本発明者らは同じく生成されるAmpX反応と呼ばれる、これまで同定されなかった骨格増幅生成物を特徴づけた。この増幅生成物は通常、プローブ配列に相補的な一又はそれ以上の縦列反復を含むが、第一プライマー領域から第二プライマー領域まで伸張し、第一プライマー領域及び第二プライマー領域を含むヌクレオチド配列である。しかしながらこれらの縦列反復は、そのヌクレオチド配列の下流プライマー部位及び／又は欠失に隣接する余分のヌクレオチド配列をも含んでいてもよい。この反応は、開放環状核酸プローブ又は線状核酸プローブの存在下で起こる。このAmpX反応が起こる正確なメカニズムは不明であるが、ある種の異常なプライマー活動及び開放環状核酸プローブ又は線状核酸プローブの鎖侵入事象を含むものと考えられる。
【００５７】
なおも本発明を一理論又は一作用様式に限定するものではないが、本発明者らは環状核酸分子を増幅する方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用の後で該プローブの増幅の前に実施する豊富化工程を組み込んだ方法を開発した。この豊富化工程は閉じた環状プローブ形成の前又は後のいずれに実施してもよい。
【００５８】
「豊富化」への言及は、線状核酸分子に対する閉じた環状核酸プローブの割合を増大することへの言及と理解されるべきである。これは、例えば、線状核酸分子（線状核酸プローブ及び／又は線状標的配列など）を分解、除去、不活性化又は減少させることにより又は反応混合物から閉じた環状核酸プローブを特異的に単離することにより達成されうる。
【００５９】
閉じた環状核酸プローブの豊富化は、電気泳動による分離、クロマトグラフィーによる分離（例えば、サイズ排除又はアフィニティークロマトグラフィー）又は、例えばエキソヌクレアーゼなどの酵素を用いて線状核酸分子を分解する（本明細書中、「酵素的豊富化」という）といった多数の方法のうちのいずれかにより達成できるが、これらに限定されない。本発明を一理論又は一作用様式に限定することなく、エキソヌクレーゼは線状核酸分子から末端ヌクレオチドを切断することにより機能する。閉じた環状核酸プローブは分解されず、それにより豊富化される。例えば、遊離のDNA 末端を分解することにより機能するが、閉じた環状分子を分解しない酵素エキソヌクレアーゼIII を用いて線状及び/ 又は開放環状分子を分解してもよい。この工程は線状分子及び／又は開放環状分子を選択的に除去することにより、閉じた環状分子を豊富化し、好ましくは環状化工程の後ではあるが増幅工程の前に実施される。線状及び／又は開放環状のヌクレオチド配列の集団を減少させることにより、閉じた環状核酸プローブの豊富化を達成するためには、酵素的豊富化が特に有用である。
【００６０】
従って一実施態様では、本発明は核酸プローブと標的核酸配列との相互作用の後に形成される環状核酸プローブを増幅する方法であって、環状核酸プローブの形成を酵素的に高める工程及び該環状核酸プローブの酵素的豊富化並びに該環状核酸プローブを増幅する工程を含む方法を提供する。
【００６１】
より詳しくは本発明は複数プライマー回転環状増幅方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成し酵素的豊富化により該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増幅させる工程を含む方法を提供する。
【００６２】
好ましくは、該酵素的豊富化はエキソヌクレアーゼを用いて実施される。
【００６３】
酵素的豊富化だけでなく、閉じた環状核酸プローブは非酵素的方法を用いても豊富化できる。本発明の方法に用いるために適切な非酵素的方法の例としては、電気泳動による分離、クロマトグラフィーによる分離（例えば、サイズ排除又はアフィニティークロマトグラフィーによる）又は捕捉リガンドを閉じた環状プローブに導入しそれにより閉じた環状プローブを単離することが挙げられるが、これらに限定されない。電気泳動による分離又はクロマトグラフィーによる分離といった方法は、例えば線状核酸分子の割合を減少するよう設計されるが、閉じた環状核酸プローブの単離を促進するには捕捉リガンドの使用が特に有用である。捕捉リガンドは環状化の際、開放環状プローブの両末端に介在する領域中に導入される。しかしながら本発明は、この特定の方法による捕捉リガンドの導入に限定されないと理解されるべきである。これに関し、閉じた環状核酸プローブの単離を促進するように核酸プローブの他の領域中に捕捉リガンドを導入してもよい。
【００６４】
従って別の実施態様では、本発明は核酸プローブと標的核酸配列との相互作用の後に形成される環状核酸プローブを増幅する方法であって、該環状核酸プローブの非酵素的豊富化の工程及び該環状核酸プローブを増幅させる工程を含む方法を提供する。
【００６５】
より詳しくは、本発明は複数プライマー回転環状増幅方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成し、該環状核酸プローブを非酵素的豊富化により豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増幅させる工程を含む方法を提供する。
【００６６】
なおもより詳しくは、本発明は複数プライマー回転環状増幅方法であって、核酸プローブと標的核酸分子の相互作用を促進し、該プローブの両末端領域が隣接しない二本鎖を形成する工程、環状核酸プローブを形成し、該両末端領域の間に介在する領域に捕捉リガンドを組み込み、該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増幅させる工程を含む方法を提供する。
【００６７】
「捕捉リガンド」とは、その中に組み込まれる核酸プローブの選択的単離を可能とする分子を意味する。捕捉リガンドは適切な方法のいずれにより組み込まれてもよい。捕捉リガンドは（例えば、ギャップ−充填又はスペーサーオリゴヌクレオチド連結のいずれかにより）開放環状核酸プローブの５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドを連結するために用いられる修飾ヌクレオチドの形態をとってもよく、あるいは非修飾核酸（核酸標識など）であって、その配列が核酸標識を組み込んでいるプローブ分子の単離を促進する核酸を含んでいてもよい。例えば、捕捉リガンドはGCN4認識配列を含むヌクレオチド配列であってもよい（図２参照）。別の例では、ヌクレオチド配列捕捉リガンドが導入される。これは他と異なるハイブリダイゼーション能力により閉じた環状核酸プローブを単離させる配列である。豊富化方法の一例を図３に図解して表す。この例では、豊富化工程は固相捕捉により達成される。しかしながらこの方法は固相捕捉に限定されないと理解されるべきである。
【００６８】
従って捕捉リガンドはそれ自身、選択的精製を可能とするものであっても良く、及び開放環状プローブを環状化するよう作用してもよい。例えば、捕捉リガンドは介在領域中に連結されるヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドであってもよい。この場合、オリゴヌクレオチドが作用して開放環状プローブを環状化し、そして合成される修飾ヌクレオチドの利用により、該修飾により該プローブの選択的精製を行う。代替的には、ヌクレオチド類似体をdNTP類似体として開放環状プローブを含む反応混合物中に導入してもよい。これはギャップ−充填合成により開放環状プローブを環状化する。
【００６９】
捕捉リガンドは、代替的には捕捉分子が連結、結合又は会合する核酸分子又はヌクレオチドの形態をとってもよく、核酸分子又はヌクレオチドは開放環状核酸プローブの５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドを連結することになる。本発明は、一またはそれ以上の連結ヌクレオチドとの関連を介して捕捉リガンドを含むための、任意の適切な分子の使用にも及ぶと理解されるべきである。例えば、ギャップ−充填オリゴヌクレオチドに結合した磁性ビーズを、抗体により結合されうるハプテンなどの分子として考える。
【００７０】
捕捉リガンドは、反応混合物に適用して二本鎖の水素結合を壊す変性条件に耐えるものであることが好ましい。この工程は通常、豊富化工程において標的分子と同時に精製される遊離開放環状核酸プローブに対し実施される。一実施態様では、捕捉リガンドはビオチン化オリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドの開放環状核酸プローブへの連結の後、閉じた環状核酸プローブが形成される。閉じた環状プローブは、連結したオリゴヌクレオチドに結合したビオチン分子をストレプトアビジンに結合することにより単離できる。
【００７１】
捕捉リガンドを組み込んでいる閉じた環状プローブの豊富化は、捕捉リガンドを含む閉じた環状核酸プローブの架橋及び沈殿といった、又は捕捉リガンドを介した閉じた環状プローブの固相への結合といった適切な方法のいずれかにより達成されるであろう。
【００７２】
従って本発明の一実施態様は、複数プライマー回転環状増幅方法であって、核酸プローブと標的核酸分子との相互作用を促進し、該プローブの両末端領域が非隣接二本鎖を形成する工程、環状核酸プローブを形成し、ビオチン化捕捉リガンドを該両末端領域に介在する領域に組み込み、該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増幅させる工程を含む方法を提供する。
【００７３】
環状核酸プローブの豊富化の後、当該技術分野の者に周知の方法により、環状プローブを増幅させてもよい。本発明のこの側面をいかようにも限定せず、環状プローブの一部分に相補的なプライマーからヌクレオチド伸長を開始することにより、増幅を実施するとよい。一本鎖置き換えDNA ポリメラーゼの使用により、この伸長反応では、環状標的に相補的な、大きな縦列に配置された多量体一本鎖DNA 生成物が生産される。これは高速伸長する新しい鎖の３’末端の下流のいずれかの核酸を継続して置き換えることにより起こる。この反応自身により、環状プローブからDNA が線状増幅されるが、生産される分子のサイズ及び得られる増幅のレベルは連鎖置換DNA ポリメラーゼの進行性により限定される。等温度条件下で指数的増幅速度論に達するには、第二オリゴヌクレオチドを使用する。環状プローブについてのプライマー事象の開始から生産される多量体ポリマーは、この第二プライマーの複数プライマー結合部位を含み、これにより複数DNA 鎖合成の同時開始が促進される。連鎖置換ポリメラーゼの性質及び一本鎖多量体ポリマー上での複数鎖合成の同時開始により、得られる生成物は、多量体ポリマーの長さの延長及び置き換えをする高度に分岐した鎖網である。環状プローブに相補的な元のプライマーもこれらの置き換えられた鎖のプライマーとなることができる。次に、この分子カスケードは、もはやプライマー作用することができる部位がなくなるまで、又は反応のための基質の一つが涸渇するまで続行する。完全に置き換えられた鎖自体が他の置き換え鎖と相互作用することによりプライマーとして作用してもよいとも考えられる。伝統的な核酸増幅技術により得られるより、かなり大きな増幅が結果として生ずる。
【００７４】
本発明の方法は反応混合物から閉じた環状核酸プローブのみを必ずしも選択的に単離しないと理解されるべきである。むしろ、閉じた環状プローブを豊富化する方法である。例えば、環状化したプローブが標的配列の周りで南京錠的コンホメーションにある場合、その南京錠的コンホメーションのせいで、該プローブの単離によって標的配列も単離され得る。
【００７５】
閉じた環状プローブの増幅後、当該技術分野の者に知られる挿入色素での生成物の染色、検出標識の直接生成物への組み込み、又は他の種々の検出分子との結合能力といった広範囲の技術を用いて増幅生成物を任意に検出してもよいが、これらに限定されない。これらには放射活性同位元素、蛍光分子、リン光分子、酵素、抗体及びリガンドなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
一つの実施例では、増幅された生成物の検出には回転環状増幅を用いる固相系の増幅が含まれる。この実施例では、増幅プライマーの一つを固体支持体に結合する。この固体支持体はオリゴヌクレオチドが結合できるものであればいかなる固体材料であってもよい。このような材料は当該技術分野の者に知られる。これらの材料を、磁性ビーズ、マイクロタイタートレー、膜及び計量棒といった複数の形態に取り込めばよいが、これらに限定されない。増幅反応に用いられる第二プライマーは、分子標識（例えば、フルオレセイン）を含む。代替的には、ビオチン、DIG 又は発蛍光団といった分子標識を、増幅したDNA の合成の際に標識したヌクレオチドの形態に組み込んでもよい。増幅反応の際、両プライマーを回転環状増幅に用いる場合は、生成物の一部は固体支持体の表面に直接結合する。さらにこれらの生成物は、分子標識を含む第二プライマーから複製することにより標識されるであろう。したがって反応の未使用プライマー及び他の反応副生成物は、付着した増幅生成物を崩壊させずに、固体支持体から直接洗浄できる。次に、付着した生成物を分子標識を利用して特定できる。この増幅の一例で用いたプライマーを図４に図解して表す。
【００７７】
別の例では、本発明はDNA ミクロアレイの関係での回転環状増幅の適用に及ぶと理解されるべきである。
【００７８】
別の側面では、本発明は環状核酸プローブを豊富化する方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、及び環状核酸プローブを形成し、該環状核酸プローブを豊富化する工程からなる方法に関する。
【００７９】
一実施態様では、本発明は環状核酸プローブを豊富化する方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、及び環状核酸プローブを形成し、該環状核酸プローブを酵素的豊富化により豊富化する工程を含む方法を提供する。
【００８０】
別の実施態様では、本発明は環状核酸プローブを豊富化する方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、及び環状核酸プローブを形成し、該環状核酸プローブを非酵素的豊富化により豊富化する工程を含む方法を目的とする。
【００８１】
なおもより詳しくは、本発明は環状核酸プローブを豊富化する方法であって、核酸プローブと標的核酸分子との相互作用を促進し、該プローブの両末端が隣接しない二本鎖を形成する工程、及び環状核酸プローブを形成し、捕捉リガンドを該両末端領域の間に介在する領域に組み込み、該環状核酸プローブを豊富化する工程を含む方法を目的とする。
【００８２】
最も具体的には、該捕捉リガンドはビオチン化ヌクレオチドである。
【００８３】
なおも別の側面では、環状核酸プローブを増幅する方法において、該方法が該環状核酸プローブを豊富化する工程及びその後該環状核酸プローブを増幅する工程を含み、そして核酸プローブと標的核酸配列との相互作用の後に形成される該環状プローブを増幅する工程を含む改良法を提供する。
【００８４】
好ましくは、回転環状増幅方法において、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成し、該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増幅させる工程を含む改良法を提供する。
【００８５】
本発明の側面の一実施態様では、回転環状増幅方法において、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成し、該環状核酸プローブを酵素的豊富化により豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増幅させる工程を含む改良法を提供する。
【００８６】
本発明の別の側面では、回転環状増幅方法において、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成し、該環状核酸プローブを非酵素的豊富化により豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増幅させる工程を含む改良法を提供する。
【００８７】
より詳しくは、本発明は、回転環状増幅方法において、核酸プローブと標的核酸分子とが相互作用して該プローブの両末端領域が非隣接二本鎖を形成する反応を促進させる工程、環状核酸プローブを形成し、該両末端領域の間に介在する領域中に捕捉リガンドを組み込み、該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増させる工程を含む改良法を提供する。
【００８８】
最も詳しくは、該捕捉リガンドはビオチン化ヌクレオチドである。
【００８９】
本発明の核酸配列はヒトゲノム由来であればよいが、ヒト以外の動物及び植物、微生物（例えば、細菌、寄生体又は酵母）、ウイルス及びプリオン配列由来のゲノム及びヌクレオチド配列も本発明に含まれる。本発明で意図されるヒト以外の動物としては、霊長類、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、ロバ）、研究試験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ）、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ）、鳥類（例えば、ニワトリ、ガチョウ、アヒル及び他の飼鳥類、猟鳥、エミュー、ダチョウ）及び捕獲野生又は飼育動物（例えば、キツネ、カンガルー、ディンゴ）が挙げられる。本発明の操作は核酸分子が由来する種に関して同種又は異種であってもよいことを理解すべきである。「同種」操作は、本発明の方法に利用される全核酸分子が同じ種に由来する場合をいう。「異種」操作は、核酸分子の少なくとも１種が他の核酸分子の種とは異なる種由来である場合をいう。多くの場合、（核酸プローブなどの）与えられる核酸分子は種由来ではなく、天然では生じないヌクレオチド配列を含むように設計されることになる。該プローブの各領域は一またはそれ以上の種に由来する天然に生じる配列に基づいてもよい（例えば、プロモーター領域又は標的プローブ領域）。
【００９０】
本発明の方法は、等温度増幅の特異性を改良するために有用である。これには、例えば鎖の置き換え合成により形成される閉じた環状核酸プローブ配列の縦列補体の形成に関する特異性を改良することが挙げられる。本発明は、ヒト、動物、植物、寄生体、細菌又はウイルス起源の分子配列といった生物試料又は環境的試料に見いだされる特異的遺伝子配列の検出、特定、定量及び／又はタイプ決定といった診断的適用にも有用である。これには、対立遺伝子識別、遺伝子変異型の特定（例えば、患者の薬物応答を予測する目的で）、単純ヌクレオチド多形の同定及び鎖置換生成物の多重検出が挙げられるが、これらに限定されず、例えば増幅した縦列成分は、複数の異なって増幅された標的配列を分離させ、同時に定量的に検出させる複数色をコードするプローブを用いて検出される。さらに、本発明は遺伝的疾患又は細菌及びウイルス感染といった感染性疾患の診断に関して有用である。これに関し、本発明の一適用では、生物試料（血液、尿、粘液又は生検試料）を厳密に調べることであり、その核酸プローブの標的プローブ領域が目的とする標的核酸配列を含む細菌又はウイルスの存在を検出する。
【００９１】
従って本発明のなおも別の側面では、疾病状態を診断する方法又は遺伝的変異型を検出する方法であって、核酸プローブと標的核酸配列との相互作用を促進する工程、環状核酸プローブを形成し、該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増幅させる工程を含む方法を意図する。
【００９２】
好ましい一実施態様では、該豊富化工程は非酵素的豊富化である。
【００９３】
別の好ましい実施態様では、該豊富化工程は酵素的豊富化工程である。
【００９４】
この好ましい実施態様に従い、本発明は疾病状態を診断する方法又は遺伝的変異型を検出する方法であって、核酸プローブと標的核酸分子とが相互作用して該プローブの両末端領域が非隣接二本鎖を形成する反応を促進させる工程、環状核酸プローブを形成し、該両末端領域の間に介在する領域中に捕捉リガンドを組み込み、該環状核酸プローブを豊富化する工程、及び該豊富化した環状核酸プローブを増幅させる工程を含む方法を意図する。
【００９５】
該標的分子は、生物試料中に存在してもよい。従って、生物試料は直接試験してもよく、生物試料中に存在する他の全て又は一部の核酸材料を試験に先立ち単離してもよい。標的核酸配列が、生ウイルスの不活性化などの試験に先立つ前処理を受けることは、本発明の範囲内である。
【００９６】
本発明の方法は、トランス活性化因子の機能的解析及びサウスウェスタンブロット解析に使用する転写因子及び生成物のアフィニティークロマトグラフィーのためのデンドリマープローブ、分子量マーカー、固定化リガンドといった核酸生成物を形成させるのにも有用であるが、これらに限定されない。
【００９７】
AmpXバックグラウンド増幅問題は、二又はそれ以上のプライマーが線状核酸プローブに結合できる場合に起こる反応により生じるので、本発明の別の側面では、二つのプライマーがいずれのオリゴヌクレオチドにも結合しないようにこれらのプローブを設計することによって、環状核酸プローブを増幅する方法に関する。従って、連結反応物の精製は必要でない。適切に設計された核酸プローブ及びプライマーの一例を図１９に図解して説明する。
【００９８】
本発明のなおも別の側面では、環状核酸分子の増幅を促進するためのキットであって、一つ以上の任意の核酸プローブ、酵素、捕捉リガンド、環状核酸プローブを単離する手段、及び該プローブの環状化、単離及び増幅を促進するために有用な試薬を収容するように適応させた区画を含むキットに関する。さらに区画は、例えば生物試料を受容する区画を含めてもよい。
【００９９】
好ましくは、該増幅は回転環状増幅である。
【０１００】
本発明のさらなる特徴を以下の限定されない図面及び／又は実施例により完全に記載する。しかしながら、この詳細な記載は本発明を例証する目的においてのみ含まれるものと理解されるべきである。
【０１０１】
実施例１
ＡｍｐＸ分析−材料
細菌株
大腸菌ＰＮＧ８０１株は大腸菌Ｋ１２野生株Ｗ１４８５（ハーバード大学、エヌ．クレックナーから入手できる）の誘導株である。カナマイシン耐性遺伝子をコードするミニ−トランスポゾンＴｎ１０（Ｎｏ．１０３）を大腸菌Ｗ１４８５株（１０）に導入した。その結果得られるカナマイシン耐性群から１株を選びＰＮＧ８０１と命名した。先に記述された（ギブコ，ＢＲＬ）大腸菌ＤＨ５αを、ミニ−トランスポゾンを含まない大腸菌ゲノムを表す負の対照として用いた。ゲノムＤＮＡは両大腸菌株から抽出し（１１）、ＴＥ緩衝液に再懸濁した。
【０１０２】
プライマー
オリゴヌクレオチドはブレサテック・アンド・ギブコＢＲＬから購入し、標準的ホスホルアミダイト化学を用いて合成した。鋳型として増幅反応に使用したオリゴヌクレオチドは均一になるまでゲル精製したが他のオリゴヌクレオチドは全て脱塩調製品として使用に供した。
【０１０３】
ＡｍｐＸ増幅反応
ＤＮＡは６０μＬ反応で増幅した。各反応液は１６ピコモルの各プライマー、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ4)2 ＳＯ4 、２０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．８、２００μＭのｄＮＴＰ、２ｍＭのＭｇＳＯ4 ：０．１％ｖ／ｖのトリトンＸ−１００を含む。２μＬの鋳型部分標本を各反応液に添加し、９４℃、３０秒の変性サイクル、次いで５５〜６０℃で５分間の平衡を行った。増幅は４ＵのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ニュウ・イングランド・バイオラブズ）の添加で開始し、反応は等温的に６０℃に維持して２．５〜３時間行った。
【０１０４】
核酸の電気泳動及びハイブリダイゼーション
増幅生産物はＴＡＥ又はＴＢＥ緩衝液中で２％ｖ／ｖアガロースゲルを通して電気泳動させ（１２）、エチジウムブロミド染色で可視化した。ブロットの前に、核酸を０．５ＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣｌ中で３０分間変性させた後、１Ｍトリス塩酸ｐＨ８．０、１．５ＭのＮａＣｌ中で３０分間中和した。次いで、製造業者の指示書に従って核酸を毛細管でハイボンド−Ｎ+ 膜（アマシャム）に移した。オリゴヌクレオチドプローブは、ターミナルトランスフェラーゼ（ベーリンガー・マンハイム）を用いてＤＩＧ−ｄｄＵＴＰで３’標識を付した。
【０１０５】
膜は、５〜１０ｍｌのラピッドヒブバッファー（アマシャム）中で４２℃で３０分間、前ハイブリダイゼーションを行った。このＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドを次にハイブリダイゼーション緩衝液に添加し、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした。そのブロットを製造業者の指示通りに洗浄しＣＤＰ−スター（ベーリンガー・マンハイム）を用いて発色させた。
【０１０６】
クローニング及び配列分析
増幅反応の生産物は、クローニングの前に、ウィザードＰＣＲＤＮＡ精製カラム（プロメガ）を通して精製した。次いで、精製された生産物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ）に１６℃、３時間で直接連結した後、大腸菌ＤＨ５αに電気穿孔法により導入した（１３）。挿入物の配列は色素停止化学及びアプライド・バイオシステムズ３７３ＡＤＮＡ配列決定器を用いて決定した。
【０１０７】
実施例２
ＡｍｐＸ分析−結果
合成されたｓｓＤＮＡ分子からのＡｍｐＸ増幅
ランダム配列の９０マーの合成オリゴヌクレオチドを合成し、最初の増幅反応の鋳型として用いた（図５Ａ）。該鋳型分子の配列に基づいて種々のより小さなプライマーも合成した。これらは該鋳型分子に関しそのサイズ、方向、及び位置が異なるように設計された（図５Ａ）。
【０１０８】
増幅反応には反対のプライマーの種々の組合せが使用された。典型的には、１ピコモルの鋳型を１６ピコモルの各プライマーと混合した。変性及び６０℃での平衡の後、鎖置換性エクソヌクレアーゼマイナスＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの添加により反応を開始した。次いで該反応を６０℃で３時間インキュベートした後、生産物をアガロースゲル電気泳動により検討した（図５Ｂ）。
【０１０９】
これらの反応のそれぞれから、生産物の集団が製造された。これらは試験されたプライマー組合せにもかかわらず、特徴的なバンド形成パターンを示した。これらの生産物のサイズは、１００ヌクレオチドより小さな分子から泳動後にもウエル中に留まる程に大きな分子にまで広がっていた。１回の増幅反応から得られる生産物はそれぞれ相互に標準単位長だけサイズが異なるように見えた。この単位長はその反応に用いたプライマー組合せが異なれば異なっていた。ＤＮＡ増幅のレベルもプライマー組合せが異なれば異なっていた。しかし、一般に、分光学的検定では、該反応は３時間の反応の間に１０〜４０μｇの生産物を合成できたことを示した。
【０１１０】
さらに、一連の多量体生産物を生産するように見えたこの等温増幅は、この一つの特定の鋳型配列に限られるものではなかった。さらに６個の鋳型配列及びそれらの対応するプライマー集合も増幅生産物を形成した。
【０１１１】
ＡｍｐＸ増幅生産物の分析
異なるプライマー組合せを用いた４回の別々の増幅反応から得られた生産物を分析してそれらの分子組成を決定した。まず、増幅生産物の全集団を、鋳型分子を横断して分布している開裂部位を有する４個の別の制限酵素で消化することにより分析した。特定反応生産物のより詳細な分析はクローニング及び部分的配列決定により行った。
【０１１２】
一般に、プライマーが鋳型分子の末端から離れて位置する場合、反応から得られる増幅生産物は、一つのプライマー結合部位から次のものまで及ぶ鋳型分子の縦列反復から成り立っていた。しかしながら、幾つかの反復はプライマー結合部位（複数）に隣接する鋳型配列をも含んでいた。稀には、増幅生産物は上述のような鋳型分子の領域の縦列反復であるが欠失を含むものから成っていた。時には、配列の欠失は一つの反復単位から次の反復単位まで変化する。増幅された領域の一部の例を以下に概述する。
【０１１３】
プライマーＰ５Ｃ及びＢ４Ｃを用いる増幅反応から得られる生産物の大部分を、Ｓａｕ３ＡＩ又はＴａｑＩではなく、ＡｌｕＩ及びＥｃｏＲＩで消化して低分子量の生産物にした（図６Ａ（ｉ））。これは、増幅された配列がプライマー結合領域プラスその介在配列を含む鋳型分子の領域の縦列反復から成っていたことを示す。配列分析は一般にこの意見と一致したが、該増幅領域はプライマーＰ５Ｃ結合部位に隣接する二つの付加的ヌクレオチドを含むことが示され、プライマーＢ４Ｃの５’末端からの一つのヌクレオチドが反復単位のそれぞれで一様に欠如していた（図６Ａ（ii))。高濃度の制限酵素を用いて行ったときでさえも、この反応からの生産物がすべてＡｌｕＩ及びＥｃｏＲＩで消化されたわけではなかったことは興味深い。このことは、増幅生産物の一部に点突然変異か又は他の増幅領域の変化も存在していたことを示唆する。
【０１１４】
同様な結果は、生産物がプライマーＰ５Ｅ及びＢ４Ｉを用いて該鋳型分子から得られたときにも観察された。これらのプライマーはそれぞれ該鋳型分子の５’及び３’末端により近く位置していた。この反応から得られる生産物の大部分をＡｌｕＩ、ＥｃｏＲＩ及びＴａｑＩで消化し、生産物の相当の量をＳａｕ３ＡＩでも消化した（図６Ｂ(i))。配列分析は、またも該生産物が鋳型分子のある領域の縦列反復から成り立っており、それは一つのプライマー結合部位から次のものまで及ぶばかりでなくＰ５Ｅプライマー及びＢ４Ｉプライマーの結合部位に隣接する配列のそれぞれ６及び７オリゴヌクレオチドをふくんでいたことを示した。クローニングされたこの反応の生産物が、Ｐ５Ｅに対するプライマー結合部位に隣接する領域に、この配列をＳａｕ３ＡＩ消化に不感受性とするであろう点突然変異を有していたことは興味深い。従って、制限プロフィル及び配列分析から、この反応生産物が、その大部分が鋳型全体の縦列反復とし配列されており、その一部がＳａｕ３ＡＩ部位における点突然変異を有するものである分子の混合集団から成り立っていることが示唆される。
【０１１５】
プライマーＢ４ＩとＰ５Ｄを用いる増幅反応からの生産物をＥｃｏＲＩとＴａｑＩのみで消化し、Ｓａｕ３ＡＩ又はＡｌｕＩで消化しなかった（図６Ｃ(i))。ＡｌｕＩ部位はプライマーＰ５Ｄの配列内に位置しているからＡｌｕＩでの消化は予想されなかった。配列分析から、Ｂ４Ｉプライマー結合部位及びＰ５ＤとＢ４Ｉの間の鋳型分子の介在配列を含むがプライマーＰ５Ｄの最後の１１ヌクレオチドのみを含む領域の縦列反復を、この反応からの生産物は含んでいたことが示される（図６Ｃ(ii)) 。該ＡｌｕＩ部位はＰ５Ｄの欠失した領域内にあり、こうして、ＡｌｕＩが該反応生産物を開裂する能力を持たないことが説明される。
【０１１６】
プライマーＢ４ＣとＰ１を用い該鋳型分子から増幅された生産物の大部分はＳａｕ３ＡＩ及びＥｃｏＲＩで消化されるが、ＡｌｕＩ又はＴａｑＩで消化されなかった（図６Ｄ(i))。このことは、該反応生産物の大部分が二つのプライマー結合部位の間に介在する配列の領域を持たなかったことを示唆する。配列分析はこれを確認し、増幅された配列がＢ４Ｃ及びＰ１のプライマー結合部位プラス該二つプライマーの間に介在する配列の大部分を含むが、プライマーＰ１結合部位の近くに１２ヌクレオチドの欠失を有することを示した。該ＡｌｕＩ部位はこの欠失領域内にある、こうして、ＡｌｕＩが増幅された生産物を開裂する能力を持たないことが説明される。この反復もＢ４Ｃに対するプライマー結合部位に隣接するさらに一つのヌクレオチドを含み、Ｐ１プライマー結合部位の５’末端から一つのヌクレオチドが欠失していた。
【０１１７】
異なるプライマー組合せを用いる他の増幅反応からの生産物もクローニングし配列決定して、上に概述した例と類似の結果を与えた。
【０１１８】
ＡｍｐＸ増幅反応の感度
合成鋳型オリゴヌクレオチドを１０倍系列希釈を用いて希釈し増幅反応の感度の限界を求めた。プライマーＢ４Ｃ及びＰ５Ｃを３時間増幅に用いると、該反応の検出感度は鋳型の約１０-4ピコモルであった。他のプライマー組合せ及び鋳型の検出感度は同様であった。しかしながら、幾つかの場合では、検出感度は鋳型の１０-8ピコモル未満まで増加した（図７）。このことは、該反応を開始するために少なくとも鋳型の１×１０8 コピーが必要であることを示すものである。インキュベーションを長くしても、一般に、この検定の検出感度は増加しなかった。１×１０-4ピコモルの鋳型からの３０μｇの生産物の増幅は１×１０7 倍の増幅可能性を表す。
【０１１９】
大腸菌内でのミニ−トランスポゾンＴｎ１０誘導体のＡｍｐＸ検出
ゲノム鋳型から既知の目的の配列を増幅するＡｍｐＸ反応の潜在的能力を証明するために、特定のミニ−トランスポゾン配列を含む大腸菌ゲノムの存在を検出するための増幅反応を実施した。プライマー１Ｆ及び１Ｒは、ミニ−トランスポゾンＴｎ１０誘導体の１２０塩基対領域を含む配列を増幅するように設計した（図８Ａ）。この領域はＨｉｎｄIII をも含んでいた。この反応生産物内の介在配列の一部の存在を検出するためのプローブとして使用するため、１Ｆと１Ｒの間に位置するさらなるプライマー、Ｉｎ９０３をも合成した（図８Ａ）。
【０１２０】
Ｔｎ１０陽性及び陰性の両大腸菌株由来のゲノムＤＮＡを種々の量で用いる二連の反応を設定した。変性及びＢｓｔポリメラーゼ付加の後、６０℃の等温条件を用い２．５時間、標準的ＡｍｐＸ増幅反応を行った。増幅の後、各反応物の１μＬをＨｉｎｄIII で消化した（図８Ａ）。
【０１２１】
未消化の生産物及びＨｉｎｄIII 開裂生産物を２％アガロースゲルを通して並べて電気泳動し、エチジウムブロミドで染色して可視化した（図８Ｂ）。鋳型を添加しなかった対照の反応では、生産物は観察されなかった。同様に、大腸菌ＤＨ５αゲノムＤＮＡを添加しなかった反応全てで生産物は増幅されなかった。しかしながら、該反応液に２０ｎｇ以上の大腸菌ＰＮＧ８０１ゲノムＤＮＡを添加したとき、増幅が起こった。
【０１２２】
これらの反応のそれぞれで増幅された生産物の集団はオリゴヌクレオチド鋳型を用いて観察されたものと類似であった。これらのサイズは丁度１００塩基対をこえたものから極端に大きな分子にまで及んだ。１回の増幅からの生産物はそれぞれサイズが標準的単位長だけ相互に異なっているようであった。しかしながら、この例では、プライマー組合せを変えずにおいたにもかかわらず、該単位長は反応毎に全く劇的に変化した。このことは、この増幅の発生に至らしめた該反応の開始事象に変化があったことをおそらく示すものと考えられた。該反応生産物のＨｉｎｄIII での消化により、該反応のそれぞれからの生産物の大部分が均一な反復サイズを含むことが示された。さらに、標識された内部プローブであるＩｎ９０３は全ての反応生産物とハイブリダイズでき、該反応生産物中に該介在配列の領域が存在することを確認させた。
【０１２３】
三つの別々の増幅反応からの生産物の配列分析は、予期したように、この集団のそれぞれの内にある異なるセットの縦列反復単位を明らかにした。それぞれはプライマー結合部位と対応する介在配列の両方を含むが、該プライマー結合部位のそれぞれに隣接する配列の長さが異なっていた。この付加的な配列の長さは０と７７ヌクレオチドの間で変動した。該反復単位の配列は配列決定された分子の個々の反復の間では変化するようには見えなかった。１個のプライマーセット及び一つの鋳型濃度を用いて複数の反応が行われた大腸菌ＰＮＧ８０１ゲノムＤＮＡ鋳型を用いる一部の実験では、同一反応の幾つかが増幅に失敗した。このこと及び異なる増幅領域の証拠から、該反応が進行するためには特定の開始事象が起こる必要があることが示唆される。
【０１２４】
実施例３
回転環状増幅のための南京錠的環状化
標識化スペーサー計画
この手順は、目的の標的に相補的な標識化スペーサーオリゴヌクレオチドを利用する閉じた環状プローブの一般的作成方法を概述する。南京錠プローブ、標的配列、及び他の必須の成分の実験的設計は図９に例示する。
【０１２５】
５０μＬの反応容量には、連結緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．３、２５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．５ｍＭのＮＡＤ、０．０１％ｖ／ｖのトリトンＸ−１００）中の１ピコモルの南京錠的オリゴヌクレオチド、１ピコモルのスペーサーオリゴヌクレオチド、及び１ピコモルの合成オリゴヌクレオチド標的が含まれていた。この反応液をまず９４℃に３分間加熱した。この管が９４℃に達したとき、１μＬのアンプリガーゼ（５Ｕ／μＬ、エピセントル・テクノロジーズ）を添加した。次いで、該反応液を６０℃まで冷却し、そして１時間、連結反応を起こさせた。
【０１２６】
ギャップ充填計画
この手順はギャップ充填反応において標識ヌクレオチドを利用する閉じた環状プローブの作成のための実験計画を概述する。この取り組みの実験設計は図９に例示したものと同様であるが、標識スペーサーが標識ヌクレオチドとのギャップ充填反応により置き換えられている。
【０１２７】
５０μＬ反応容量には、連結／ギャップ−充填緩衝液（５０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ−（３−プロパンスルホン酸）〔ＥＰＰＳ〕、１８０ｍＭのＫ+ （ｐＨを７．８に調整するために添加するＫＯＨ及びＫ+ の最終濃度を調整するために添加されるＫＣｌ）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2 、１０ｍＭのＮＨ4 Ｃｌ、１００μＭのＮＡＤ+ 、１００μｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））中の１ピコモルの南京錠オリゴヌクレオチド、１ピコモルの合成オリゴヌクレオチド標的、１５ピコモルのビオチン−１４−ｄＡＴＰ及び各１５ピコモルのｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰを含んでいた。この反応液をまず９４℃まで３分間加熱した。この管が９４℃に達したとき、１μＬの酵素混合液（アンプリガーゼ５Ｕ／μＬ、エピセンター・テクノロジーズとタックポリメラーゼ１Ｕ／μＬ、パーキン・エルマー）を添加した。次いで、該反応液を６０℃まで冷やし、１時間インキュベートして連結反応及びギャップ−充填反応を起こさせた。
【０１２８】
両環状化手順における、分子標識の量は精製手順で使用される親和性基質媒体の最大結合能力を超えるべきでない。
【０１２９】
実施例４
ＡｍｐＸ最小化回転環状増幅のための南京錠精製
ビーズの調製
今日では、ストレプトアビジン被覆スーパーパラマグネティック・ビーズ（ダイナル）が多くの精製反応に用いられる。これらのビーズは保存剤を含む緩衝液中に入った状態で供給される。従って、使用する前に洗浄する。５回の５０μＬの連結反応のそれぞれに対して、最初のビーズ混合物の１２５μＬ部分が必要である。
【０１３０】
ビーズを１．５ｍｌミクロフュージ管に分配した。該ビーズを磁石板上で単離し、上清を除去し、次いで該ビーズを１２５μＬの２×ＢＷ緩衝液（１０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ＭのＮａＣｌ）に懸濁した。この手順をさらに３回繰り返した後、最後に該ビーズを２５０μＬの２×ＢＷ緩衝液中に再懸濁した。
【０１３１】
閉じた環状分子の捕捉
洗浄したビーズ５０μＬを５０μＬの連結反応液と混合し、室温で３０分間インキュベートし、溶液中のビーズを周期的に混合し続けた。該ビーズ及びその結果付着した標識分子を次に磁石板を用いて捕捉し、液体を除去した。次いで、ビーズを１００μＬの１×ＢＷ緩衝液（５ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．５、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１ＭのＮａＣｌ）中に再懸濁した。この洗浄手順を１×ＢＷ緩衝液を用いてもう一度、０．１ＭのＮａＯＨを用いて３回（各５分）繰り返してハイブリダイズした分子をすべて除去し、最後にＴＥで２回洗浄し、ビーズを中和した。次いで、該ビーズを最後に５０μＬのＴＥ（１０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。
【０１３２】
実施例５
環状豊富化を伴う又は伴わないＲＣＡ増幅
６０μＬの反応液は、２０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ８．８（２５℃）、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、２ｍＭのＭｇＳＯ4 、０．１％ｖ／ｖのトリトンＸ−１００中に、１０ピコモルの各増幅プライマー、１６７μＭのｄＮＴＰｓ、及び１μＬの連結反応液（非精製又は精製）を含んでいた。この反応液を９４℃で３分間加熱した後、所望の増幅温度（５０〜７０℃）まで５分間冷やした。この反応液のそれぞれに０．５μＬのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（８Ｕ／μＬ、ＮＥＢ）を添加し、該管を所望の増幅温度で１．５〜２時間インキュベートした。
【０１３３】
時間は存在する環状物の量と特定増幅反応の効率に依存し、その量や反応効率が減少すると増加させ得る。
【０１３４】
実施例６
回転環状増幅における豊富化標識環状分子の利点
回転環状増幅（ＲＣＡ）反応を粗連結反応液を用いて行うと、バンド形成の二つの標準タイプが典型的に明らかとなる（図１０）。鋳型が充分な濃度で存在するとき、そのサイズが標準単位長だけ相互に異なるＤＮＡ分子の梯子として、非典型的なＲＣＡバンド形成パターンが見られる（図１０、非精製及び精製＋ｖｅレーン）。従って、この単位長は該ＲＣＡ反応で標的として利用された環状分子のサイズに対応する。ＲＣＡ反応で鋳型が存在せず又は充分に存在しない場合は、異なるタイプのバンド形成パターンが可視化される。再び、その生産物は、そのサイズが標準単位長だけ相互に異なるが、この単位長は予想された環状分子のサイズには対応しないＤＮＡ分子の梯子として配列される。その代わり、反復のサイズは典型的には該二つのプライマーの間に介在する領域と同じサイズである（図１０、非精製−ｖｅレーン）。この背景反応は「ＡｍｐＸ」と名づけられた。この背景反応は、連結反応後に反応液中に残存する残りの非環状化南京錠プローブによるものであることも証明された。閉じた環状プローブ形成反応に南京錠的オリゴヌクレオチドと共に標識スペーサー分子を利用すると、標識分子を該閉じた環状プローブの中に組み込むことが可能である。これらの標識分子は次いで分子標識とその基質の間の親和性を用いて精製することができる。非変性及び変性条件の両方の下での連続洗浄工程によりＡｍｐＸ背景を含まないＲＣＡ反応用の鋳型を作成することができる（図１０、精製−ｖｅレーン）。
【０１３５】
実施例７
ゲノム鋳型からの改良されたＲＣＡ
閉じた環状プローブ形成（標識スペーサー）及び精製計画を利用し、図１１に示す配列を用いて新たなＲＣＡ手順の多様性を試験した。四つの異なる連結反応を２連で設定した。陰性対照反応（図１２、レーン１）は南京錠ＦＶ２とＬｉｇＷを含むが鋳型を含まず、後の工程で反応にリガーゼを全く添加しなかった。南京錠ＦＶ２とＬｉｇＷと共に連結反応の鋳型としてホモ接合型野生型ヒトｇＤＮＡ（７７０ｎｇ）を用いた（図１２、レーン２）。二つの他の陽性対照連結反応も設定した。すなわち、南京錠ＦＶ２とＬｉｇＷを含み、鋳型として野生型標的オリゴヌクレオチド（１ピコモル）を用いた野生型対照反応（図１２、レーン３）、及び南京錠ＦＶ２とＬｉｇＭを含み、鋳型として突然変異標的オリゴヌクレオチド（１ピコモル）を用いた突然変異対照反応（図１２、レーン４）である。反応は全て９４℃まで加熱した後１μＬのアンプリガーゼを添加した。次いで、反応液を６０℃まで冷やし、１時間インキュベートして連結反応を起こさせた。連結反応の後、概述した計画を用いて１セットの反応物を精製し、最後に未処理の反応物と同容量に再懸濁した。
【０１３６】
次に、未精製及び精製した連結反応液をＲＣＡ用の鋳型として用い、プライマーＦＶ３及びＦＶ４を用いて６０℃で１時間４０分増幅させた。各連結反応物の１μＬだけをＲＣＡ反応液に添加した。これはそれぞれの連結反応の鋳型として用いられるヒトｇＤＮＡの１５．４ｎｇ又はオリゴヌクレオチドの２０ｆｍｏｌの等価物に等しい。存在する背景が増幅用プライマーＦＶ３及びＦＶ４によるものであったか否かを決定するため、ＲＣＡは鋳型の添加なしでも行われた（図１２、レーンＣ）。各反応物の１０μＬ部分を、φＸ１７４ＨａｅIII 消化ＤＮＡマーカー（図１２、レーンＭ）と共に２％アガロースゲルを通してＴＢＥ緩衝液中で電気泳動し、エチジウムブロミド染色により可視化した（図１２、パネルＡ）。次いで、このゲルをナイロン膜にサザン・ブロットし、標識ＬｉｇＷプローブと４５℃で一晩ハイブリダイズさせて、増幅されたＤＮＡ種のどれが南京錠プローブの二つの末端の間に介在する領域の配列を含むかを明らかにした。（図１２、パネルＢ）。
【０１３７】
エチジウムブロミド染色の後、鋳型を添加しなかった増幅反応物の中には背景のバンド形成は存在しなかった（図１２、パネルＡ、レーンＣ）。未精製鋳型が増幅されたとき、全てのレーンで多量体のバンド形成パターンが可視化された。オリゴヌクレオチド対照中のバンドの大部分は、予想された環状分子の正確なサイズに対応する生産物の間の標準単位長を持つ正しいＲＣＡ生産物であるようであった（図１２、パネルＡ、未精製レーン３及び４）。しかしながら、ＡｍｐＸ反応のバンド形成パターンと一致するバンド形成パターンが陰性対照反応に存在し（図１２、パネルＡ、未精製レーン１）、そしてＡｍｐＸバンド形成パターンとＲＣＡバンド形成パターンの混合パターンがヒトｇＤＮＡ試料中に存在するように見えた（図１２、パネルＡ、未精製レーン２）。
【０１３８】
対照的に、精製した連結反応物は完全に異なる一連の結果を与えた。ここでも、オリゴヌクレオチド対照のバンドの大部分は、そのサイズが予想された環状分子に対応し生産物の間に標準単位長を持つ正しいＲＣＡ生産物であるようであった（図１２、パネルＡ、精製レーン３及び４）。しかしながら、精製は陰性対照反応からＡｍｐＸ背景を除去したようであり（図１２、パネルＡ、精製レーン１）、そしてさらにヒトｇＤＮＡ反応に存在するバンド形成パターンを一掃し、そのためそれは付加的なＡｍｐＸ背景を持たないＲＣＡ生産物（図１２、パネルＡ、精製レーン２）とより一層一致するように見えた。これらの反応を標識ＬｉｇＷオリゴヌクレオチドで精査することにより、未精製陰性対照反応で生産されたＤＮＡは全て南京錠プローブの二つの末端の間に介在する領域の正しい配列を含んでいなかったことが示され、この証拠はさらに支持された（図１２、パネルＢ、未精製レーン１）。この精査の結果は、ＲＣＡの前に精製されなかったヒトｇＤＮＡ連結物から増幅された配列の一部は南京錠プローブの二つの末端の間に目的の正しい配列を含んでいたのに対し、増幅されたＤＮＡの大部分はこの配列を含んでいなかったことも示していた（図１２、パネルＢ、未精製レーン２）。対照的に、精製したｇＤＮＡ連結物から増幅されたＤＮＡの大部分は正しい介在領域を持つ配列を含むようであった。
【０１３９】
実施例８
ＲＣＡ反応の感度
実施例７で概述したように、ＲＣＡ反応を用いてヒトｇＤＮＡの１５．４ｎｇ程の微量から目的の配列を検出することが可能であった。ＲＣＡの感度を精製した環状分子についてさらに試験した。具体的には、未標識環状分子を、合成標的分子を用いて変性ポリアクリルアミドゲル上で行われた連結反応物からの正確なバンドを切り出すことにより精製した。これらの環状分子を抽出し、精製し、ＵＶ分光光度法分析により定量した。次にこの精製された物質を希釈し、ＲＣＡ反応の鋳型として使用した（図１３）。
【０１４０】
例示したように、この反応はＲＣＡ反応物中に存在する１０未満の環状分子を検出することができた。さらに、これらの反応液がウシ血清アルブミン１５μｇや１μＬのＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ（１：１０００希釈、モレキュラー・プローブズ）を反応緩衝液に添加することにより僅かに変更される場合も、該反応液は実時間蛍光測定により追跡して形成されるＤＮＡの量を評価することができる（図１４）。
【０１４１】
このデータを用いて、閾値の蛍光レベルを選ぶことができ、各試料がこの閾値に達するための時間を、存在する環状分子の量の対数に対してプロットすると、直線関係が観察される（図１５）。従って、ＲＣＡ反応は定量的であり、増幅反応に添加される環状物の数の予測が可能である。
【０１４２】
実施例９
ＲＣＡ反応の特異性
閉じた環状プローブ形成（標識スペーサー）及び精製計画を用いて、目的の正確な配列を検出するためのＲＣＡの特異性を明らかにすることが可能である。この遺伝子（すなわち、ヒトｇＤＮＡ）をコードするか又は該遺伝子（すなわち、大腸菌ｇＤＮＡ）をコードしないヒト因子Ｖ遺伝子鋳型及びゲノム鋳型の検出のため、図１１に概述したオリゴヌクレオチド設定を用いて、本発明者らは閉じた環状プローブ形成が、目的の遺伝子をコードするＤＮＡが存在するときのみ起こることを証明することができ、そして連結反応はこの条件の下で行われた。
【０１４３】
四つの別々の連結反応を設定した。そのそれぞれは南京錠ＦＶ２及びＬｉｇＷオリゴヌクレオチドを含んでいた。負の対照反応（図１６、レーン１）には鋳型は添加せず、その後の工程では反応にリガーゼを添加しなかった。一つの反応では、精製した大腸菌ｇＤＮＡ（２０ｎｇ）を負のｇＤＮＡ基質として用い（図１６、レーン２）、一方別の反応では精製したホモ接合型野生型ヒトｇＤＮＡ（２０ｎｇ）を正のｇＤＮＡ基質として用いた（図１６、レーン３）。さらに、野生型標的オリゴヌクレオチド（１ピコモル）を環状物形成のための正の対照として用いた（図１６、レーン４）。全ての反応液は９４℃まで加熱した後１μＬのアンプリガーゼを添加した。次いで、この反応物を６０℃まで冷却し、１時間インキュベートして連結反応を起こさせた。連結反応の後、該反応物を概述した計画を用いて精製し、最後に未処理の反応物と同量に再懸濁した。
【０１４４】
次いで、精製した連結反応物の各半分を、プライマーＦＶ３及びＦＶ４を用い６０℃で２時間増幅させるＲＣＡ用の鋳型として用いた。これはそれぞれの連結反応に鋳型として用いられる大腸菌ｇＤＮＡの１０ｎｇ、ヒトｇＤＮＡの１０ｎｇ又はオリゴヌクレオチドの０．５ピコモルの等価物に等しい。各反応物の１０μＬ部分を、φＸ１７４ＨａｅIII 消化ＤＮＡマーカー（図１６、レーンＭ）と共にＴＢＥ緩衝液中の２％アガロースを通す電気泳動にかけ、エチジウムブロミド染色で可視化した（図１６）。
【０１４５】
ＲＣＡ増幅の前に正確に閉じた環状鋳型分子を形成することが可能であったこれらの反応からは、ＲＣＡ生産物のみが生産されることは全く明らかである。
【０１４６】
実施例１０
閉じた環状豊富化ＲＣＡを用いる単一ヌクレオチド多型の検出
ＲＣＡは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が閉じた環状プローブの中に組み込まれるとき、それを識別することができる。野生型環状物及び突然変異環状物は、野生型環状物（Ｗ）を形成するときはＬｉｇＷと野生型標的オリゴヌクレオチド（１ピコモル）と共に、又は突然変異環状物（Ｍ）を形成するときはＬｉｇＭと突然変異標的オリゴヌクレオチド（１ピコモル）と共に南京錠ＦＶ２を用いる連結反応で形成された（図１１及び１７を参照）。鋳型が添加されず後の工程でリガーゼが添加されなかった負の対照反応も含めた（Ｃ）。連結反応は標準的計画に従って６０℃で１時間行い、次いで環状物を標準的精製計画を用いて精製した。
【０１４７】
ＲＣＡがＳＮＰの間を識別するためには、増幅プライマーの設計に注意が必要である。一般に、一つのプライマーは南京錠プライマーの「骨格」を表す閉じた環状プローブの領域に対し設計される。しかしながら、増幅特異的プライマーはその３’末端が突然変異特異的塩基に隣接するように設計されねばならない。該プライマーの３’末端上の最後の塩基の下流のオリゴヌクレオチドにおける突然変異も増幅の間に識別の助けとなると考えられる。因子Ｖ遺伝子に関するＳＮＰの検出のために選択されたプライマーは図１７に例示される。
【０１４８】
プライマーＦＶ３及びＦＶ４を用いる標準的ＲＣＡ反応を６３．５℃で１．５時間行い、ＴＢＥ緩衝液中２％ｗ／ｖアガロースを通して電気泳動し、エチジウムブロミド染色により可視化した場合、野生型環状物及び突然変異環状物の両方を検出することができた（図１８、ＦＶ３／ＦＶ４）。しかしながら、プライマーＦＶ３及びＦＶ５を用いて反応を行った場合、野生型環状物のみが増幅された（図１８、ＦＶ３／ＦＶ５）。同様に、プライマーＦＶ３及びＦＶ６を用いて反応を行った場合、突然変異環状物のみが増幅された（図１８、ＦＶ３／ＦＶ６）。負の対照反応ではいずれもＤＮＡは増幅されなかった。従って、ＲＣＡと共に対立遺伝子特異的プライマーを用いることによりＳＮＰを同定することが可能である。
【０１４９】
実施例１１
ＲＣＡ・ＳＰＡを用いるクラミジア・ニューモニエー及びトラコマチス
由来の配列の識別
この実施例はクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis)及びクラミジア・ニューモニエー（Chlamydia pneumoniae) 由来の合成ＤＮＡ標的の間の識別に関する。
１．この標的は、熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）をコードするシー．トラコマチス及びシー．ニューモニエーのｇｒｏＥＬの４０塩基の一本鎖合成断片であった。
２．保存配列にアニールし種特異的配列を含むギャップを残す単一の南京錠プローブを用いた。
３．プライマーの設計は次の通りであった。プライマーＦＶＣＯＭＴ南京錠プローブに関してアンチセンスであり、南京錠骨格、すなわち、標的にアニールしない南京錠プローブの部分、にアニールするように設計される。それはその５’末端にオリゴ糖−Ｔドメインをも含み、それと固体支持体の間のスペーサーとして働く。この対立遺伝子特異的プライマーは南京錠プローブ及びスペーサー配列と同一のセンスにあり、３’末端の４個の塩基がスペーサー配列の５’末端の４個の塩基と同一となるように設計される。
４．アニーリング／連結反応は標的、南京錠及び両対立遺伝子特異的スペーサーの存在下に行われた。
５．次いで、対立遺伝子特異的プライマーを用いる固相増幅（ＳＰＡ）ＲＣＡ反応において、環状物に信号が送られた。標的配列に指示された通りに、この反応物に含まれるプライマーが、環に組込まれたスペーサーと適合した時にだけ、増幅が生じた。
【０１５０】
連結反応
連結反応液は１×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ライフ・テクノロジーズ）、６ピコモルの南京錠ＨＳＰ２、５２ピコモルのＰｎｅスペーサー、５２ピコモルのＴｒａスペーサー、３．２ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ライフ・テクノロジーズ）、及び５０ピコモルの合成標的を４０μＬ反応液中に含んでいた。連結反応は９４℃で３分間変性した後室温で２０分間行った。
【０１５１】
ＲＣＡ
ＦＶＣｏｍＴが共有結合したヌンクウエル（Nunc wells) を１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡの５０μＬで１時間ブロックした。反応物は、６０μＬの反応液中に１×サーモポリメラーゼ緩衝液（ニューイングランド・バイオラブズ）、１０ｍＭのｄＮＴＰｓ（ベーリンガー・マンハイム）、１０ピコモルのＦＶＣｏｍＴ、１０ピコモルの標識Ｐｎｅ４又はＴｒａ４、４ＵのＢＳＴ・ＤＮＡポリメラーゼ大断片（ニューイングランド・バイオラブズ）、及び１μＬの連結された環状物を含んだ。９４℃で３分間の最初の変性の後、ＭＪリサーチ・ペルチア・サーマル・サイクラー−２００上で、等温ＲＣＡ反応を５５℃で１時間４０分行った。
【０１５２】
固相検出
室温でＴＢＳＴ（１００ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．１％ｖ／ｖのトゥィーン２０）で３回洗浄することによりウエルからＲＣＡ溶液を除去した。ウエルを１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡの５０μＬで３０分間ブロックし、ＴＢＳＴで３回洗浄した。抗フルオレセインアルカリ性ホスファターゼ抗体（ベーリンガー・マンハイム）をＴＢＳＴで３０００倍に希釈し、３０分間ウエルに添加（５０μＬ）した。ウエルをＴＢＳＴで６回洗浄し、ＴＢＳ（１００ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で２回洗浄した。各ウエルに、暗室条件下で５０μＬのＰＮＰＰ（パラ−ニトロフェニレンホスフェート）基質（シグマ）（０．２Ｍトリスで１ｍｇ／ｍＬ）を添加した。指示された時間の後４０５ｎｍでウエルを読み取った。
【０１５３】
ヌンクウエルへのＦＶＣＯＭＴの共有結合
被覆混合液には、１００ｎＭのＦＶＣｏｍＴ、１０ｍＭのＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）及び１０ｍＭの１−メチル−イミダゾールを含めた。各ウエルに１００μＬを添加し、ウエルを密閉して５０℃で一晩インキュベートた。ウエルをＴＢＳＴで３回洗浄し、次いで５分間液体を吸い取り、ＴＢＳＴで３回洗浄した。残存する塩を除くため、ウエルを脱イオン水で１回洗浄し、４℃で貯蔵した。
【０１５４】
オリゴヌクレオチド配列
シー．ニューモニエー由来の合成標的：
ＴＣＣ ＴＴＡ ＡＣＴ ＴＴＣ ＴＡＴ ＡＡＴ ＣＴＧ ＣＡＡ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＴＴ ＴＴＡ ＴＴＴ ＴＡＧ ＧＡＣ ＧＧＣ ＣＡＴ Ｇ
<400>27
シー. トラコマチス由来の合成標的：
ＴＣＣ ＴＴＡ ＡＡＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＡＣ ＴＣＴ ＣＴＴ ＡＧＴ ＴＴＴ ＴＡＴ ＴＧＣ ＡＧＡ ＡＣＴ ＧＣＧ ＡＴＡ
<400>28
シー. ニューモニエー特異的スペーサー（スペーサーＰＮＥ）：
５’６ＡＡ ＧｂＴ ＡＡＣ３’
シー．トラコマチス特異的スペーサー（スペーサーＴＲＡ）：
５’６ｂＴ ＧＣＡ ＡＡＣ３’
南京錠プローブ（ＬＯＣＫＨＳＰ２）：
５’６ＧＣ ＡＧＧ ＴＡＡ ＡＧＡ ＡＧＧ ＣＧＣ ＣＧＣ ＧＧＴ ＧＡＧ ＣＴＡ ＴＡＴ ＧＧＧ ＧＡＣ ＴＡＴ ＧＡＡ ＴＴＴ ＧＣＴ ＣＣＡ ＴＴＡ ＡＡＧ ＣＡＡ ＡＴＴ ＧＣ３’<400>30
シー. ニューモニエー特異的スペーサー（ＰＮＥ４）：
５’７ＣＣ ＡＴＴ ＡＡＡ ＧＣＡ ＡＡＴ ＴＧＣ ＡＡＧ Ｔ３’
<400>30
シー．トラコマチス特異的スペーサー（ＴＲＡ４）：
５’７ＣＣ ＡＴＴ ＡＡＡ ＧＣＡ ＡＡＴ ＴＧＣ ＴＧＣ Ａ３’
<400>31
６＝リン酸塩
７＝ＦＡＭ
ｂ＝ビオチン
【０１５５】
結果
（ｉ）固定化された対立遺伝子特異的プライマー、即ちＳＰＡ反応の比色検出
読み取りは４０５ｎｍの吸収であり、結果は表１に示してある。全ての場合に最も高い読みは標的配列／プライマー配列が適合した場合に得られたことを見ることができる。
（ii) 液相材料、ＳＰＡの読み取りと増幅の一致を示す
結果は図２０に示す。
【０１５６】
実施例１２
固相増幅（ＳＰＡ）及び因子Ｖライデン突然変異の検出
南京錠的環状化
閉じた環状プローブの形成（標識スペーサー）及び精製計画を用いて、回転環状増幅が固体支持体上に固定化されたプライマーから開始しうる能力を試験した。負（−ｖｅ）及び正（＋ｖｅ）の対照反応は両方とも各１ピコモルの南京錠ＦＶ２、ＬｉｇＷ及び野生型標的オリゴヌクレオチドを含んでいた。両反応を９４℃まで加熱し、次いで正の対照反応のみに１μＬのアンプリガーゼを添加した。この反応物を６０℃まで冷やし、１時間インキュベートして連結反応を起こさせた。連結反応の後、両反応物を概述した計画により精製した。南京錠配列及びオリゴヌクレオチド配列は図４に示す。
【０１５７】
固相増幅
製造者の指示に従って、ヌクレオリンク・プレート（ヌンク）にＦＶＣｏｍＴプライマー（５ピコモル）を共有結合させた。このプレートをＴＢＳＴ緩衝液（１００ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖのトゥィーン２０）中の１％ｗ／ｖＢＳＡ（１００ｍｇ／ｍＬ）中で室温で３０分間インキュベートすることによりブロックした。続いてこのブロック溶液をプレートから除去し、ウエル中で増幅反応を組立てた。標準的６０μＬの反応液を設定した。そのそれぞれは１０ピコモルの蛍光標識されたＦＶＷ１プライマーを含んでいた。正の対照反応のウエルにはさらに種々の量のＦＶＣｏｍＴを添加したが、ウエルに付着させるのではなく、溶液中に加えた。ウエルに結合したプライマーに加え１０ピコモルのＦＶＷ１及び１０ピコモルのＦＶＣｏｍＴを含む単一の反応液を用いて負の対照反応を試験した。それぞれの鋳型１μＬを各反応液に加え、ウエルを９４℃まで３分間加熱し、次いで６０℃まで冷やした。Ｂｓｔポリメラーゼ（４単位）を添加し、ウエルを６０℃で１００分間インキュベートした。
【０１５８】
検出−溶液相
増幅の後、ＲＣＡ反応物それぞれの１０μＬを２％ｗ／ｖアガロースゲル上で泳動させ、エチジウムブロミドで染色してＲＣＡ反応物の溶液相生産物を可視化した。
【０１５９】
予期されたように、負の対照反応液においては生産物は見えなかった。正の対照反応液の一部では溶液相に生産物が見えた。予想されたように、最大量の生産物は反応液の溶液相にさらにＦＶＣｏｍＴ１０ピコモルを添加したときに観察された（図２１）。追加した溶液相のＦＶＣｏｍＴのレベルが減少すると、可視化される生産物の量も減少した。しかしながら、添加したＦＶＣｏｍＴが０．１ピコモル以下のときは生産物は可視化されなかった（図２１）。
【０１６０】
固相検出
増幅した後、ウエルをＴＢＳＴ（２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖトゥィーン）中で３回洗浄し、ＴＢＳＴ中の１％ｗ／ｖＢＳＡで、室温で３０分間インキュベートすることによりブロックした。次いでそのウエルをＴＢＳＴで３回洗浄した。そのウエルそれぞれに、ＴＢＳＴで５０００倍に希釈した抗フルオレセイン−アルカリ性ホスファターゼ複合体抗体の５０μＬを添加し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、このウエルをＴＢＳＴ中で６回洗浄し、ＴＢＳ（２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で２回洗浄した。このウエルそれぞれにｐＮＰＰアルカリ性ホスファターゼ基質（シグマ）を５０μＬ添加し、このプレートを暗所に４０分間静置した。次いで、このプレートを４０５ｎｍで読み取った。その結果を表２に示す。
【０１６１】
強い吸光度の読みが４０分後に得られた。正の対照反応は全て、負の対照よりも少なくとも３倍であった。追加した溶液相のＦＶＣｏｍＴプライマーの濃度を変えても、生じたシグナルのレベルは劇的には変わらないようであった。
【０１６２】
当業者は、ここに記述した本発明が具体的に記述されたもの以外に変更及び改変することが容易であることを認めるであろう。本発明はこのような変更及び改変のすべてを包含すると理解されるべきである。本発明は本明細書で個々に又は集合的に言及され又は示された工程、特徴、組成及び化合物の全て、及びこれらの任意の２以上の工程又は特徴の組合せの全てをも含むものである。
【０１６３】
【表１】
【表２】
引用文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、Rep 媒介環状連結を図解して表す。
【図２】 図２は、GCN4認識配列（＜４００＞２６）を組み込んだ核酸プローブを図解して表す。
【図３】 図３は、分画ハイブリダイゼーションによる捕捉を図解して表す。
【図４】 図４は、南京錠FV2 を図解して表す。＜４００＞１３は南京錠FV-2配列及び＜４００＞１４LigWスペーサーを表す。＜４００＞１６は野生型標的、＜４００＞２４及び＜４００＞２５は増幅プライマーを表す。
【図４（ｉ）】 図４（i)は、南京錠FV2 を図解して表す。＜４００＞１３は南京錠FV-2配列及び＜４００＞１４LigWスペーサーを表す。＜４００＞１６は野生型標的、＜４００＞２４及び＜４００＞２５は増幅プライマーを表す。
【図４ （ｉｉ） 】 図４ (ii) は、南京錠FV2 を図解して表す。＜４００＞１３は南京錠FV-2配列及び＜４００＞１４LigWスペーサーを表す。＜４００＞１６は野生型標的、＜４００＞２４及び＜４００＞２５は増幅プライマーを表す。
【図５ａ】 パネルA は、増幅反応に用いる合成標的分子及びプライマーを図解して説明する（＜４００＞１〜＜４００＞８）。これらのプライマーの種々の組み合わせを等温度増幅反応に用いた。
【図５ｂ】 図５ｂは、合成標的分子からの等温度増幅を写真により表す。各反応から生成物１０μL を増幅した後、２％w/v アガロースゲル並行１００bpラダー（レーンM ）にのせ、電気泳動し、臭化エチジウムにより可視化した（パネルB ）。反応には、プライマーP1/B4C（レーン１）、P5C/B4C （レーン２）、P5C/B4（レーン３）、P5C/B4I （レーン４）、P4D/B4C （レーン５）、P5D/B4I （レーン６）及びP5E/B4I （レーン７）だけでなく、合成標的を加えなかったプライマーB4C/P5C （レーンC ）を用いたコントロールも含まれた。
【図６ａ】 図ａ６は、増幅生成物の制限消化及び配列解析を写真により表す。プライマーB4C/P5C （パネルA ）、B4I/P5E （パネルB ）、B4I/P5D （パネルC ）及びB4C/P1（パネルD ）を用いた４つの別の増幅反応の生成物を、制限消化及び配列解析により解析した。各反応のアリコートを、Sau3AI（レーンS ）、Alul（レーンA ）、EcoRI （レーンE ）及びTaql（レーンT ）で別々に消化し、２％w/v アガロースゲル並行２０bpラダー（レーンM ）及び未消化コントロール（レーンU ）により電気泳動した。生成物を臭化エチジウム染色により可視化した（カラム(i) ）。各増幅についての反応生成物をクローニングし、部分的に配列決定した。配列横の矢印は、クローンからの配列読みの方向を表す。各分子左の数字は、見いだされる各分子の逐次反復を表す。図解内の文字は、反復分子内に見いだされる変異を表す。各反復単位内のスペースは、存在する欠失を表す。
【図６ｂ】 図６ｂは、増幅生成物の制限消化及び配列解析を写真により表す。プライマーB4C/P5C （パネルA ）、B4I/P5E （パネルB ）、B4I/P5D （パネルC ）及びB4C/P1（パネルD ）を用いた４つの別の増幅反応の生成物を、制限消化及び配列解析により解析した。各反応のアリコートを、Sau3AI（レーンS ）、Alul（レーンA ）、EcoRI （レーンE ）及びTaql（レーンT ）で別々に消化し、２％w/v アガロースゲル並行２０bpラダー（レーンM ）及び未消化コントロール（レーンU ）により電気泳動した。生成物を臭化エチジウム染色により可視化した（カラム(i) ）。各増幅についての反応生成物をクローニングし、部分的に配列決定した。配列横の矢印は、クローンからの配列読みの方向を表す。各分子左の数字は、見いだされる各分子の逐次反復を表す。図解内の文字は、反復分子内に見いだされる変異を表す。各反復単位内のスペースは、存在する欠失を表す。
【図６ｃ】 図６ｃは、増幅生成物の制限消化及び配列解析を写真により表す。プライマーB4C/P5C （パネルA ）、B4I/P5E （パネルB ）、B4I/P5D （パネルC ）及びB4C/P1（パネルD ）を用いた４つの別の増幅反応の生成物を、制限消化及び配列解析により解析した。各反応のアリコートを、Sau3AI（レーンS ）、Alul（レーンA ）、EcoRI （レーンE ）及びTaql（レーンT ）で別々に消化し、２％w/v アガロースゲル並行２０bpラダー（レーンM ）及び未消化コントロール（レーンU ）により電気泳動した。生成物を臭化エチジウム染色により可視化した（カラム(i) ）。各増幅についての反応生成物をクローニングし、部分的に配列決定した。配列横の矢印は、クローンからの配列読みの方向を表す。各分子左の数字は、見いだされる各分子の逐次反復を表す。図解内の文字は、反復分子内に見いだされる変異を表す。各反復単位内のスペースは、存在する欠失を表す。
【図６ｄ】 図６ｄは、増幅生成物の制限消化及び配列解析を写真により表す。プライマーB4C/P5C （パネルA ）、B4I/P5E （パネルB ）、B4I/P5D （パネルC ）及びB4C/P1（パネルD ）を用いた４つの別の増幅反応の生成物を、制限消化及び配列解析により解析した。各反応のアリコートを、Sau3AI（レーンS ）、Alul（レーンA ）、EcoRI （レーンE ）及びTaql（レーンT ）で別々に消化し、２％w/v アガロースゲル並行２０bpラダー（レーンM ）及び未消化コントロール（レーンU ）により電気泳動した。生成物を臭化エチジウム染色により可視化した（カラム(i) ）。各増幅についての反応生成物をクローニングし、部分的に配列決定した。配列横の矢印は、クローンからの配列読みの方向を表す。各分子左の数字は、見いだされる各分子の逐次反復を表す。図解内の文字は、反復分子内に見いだされる変異を表す。各反復単位内のスペースは、存在する欠失を表す。
【図７】 図７は、増幅反応の選択性を写真により表す。合成標的分子の連続希釈を作成し、増幅反応の鋳型として用いた。増幅後、各反応から生成物１０μL を２％w/v アガロースゲルにより電気泳動し、臭化エチジウム染色により可視化した。
【図８ａ】 図８ａは、E.coliを含むミニトランスポゾンの検出を写真により表す。KanRミニトランスポゾンの１２０bp領域を増幅するために設計したプライマー（＜４００＞９）を、内部ハイブリダイゼーションプローブとして用いたオリゴヌクレオチドIn903 （＜４００＞１１）と共に説明する（パネルA ）。この特殊なミニトランスポゾンを担持する、種々の量のE.coli PNG801 ゲノムDNA からミニトランスポゾン配列を増幅する反応に、プライマー1F（＜４００＞１０）及び1R（＜４００＞１２）を用いた。増幅反応は、陰性コントロールとして種々の量のE.coli DH5αゲノムDNA についても実施し、増幅後、生成物1 μL をHindIII （レーンH ）で消化し、未消化コントロール（レーンU ）及び分子量マーカー（レーンM ）と並行して2 ％w/v アガロースゲルにより電気泳動した。鋳型を加えなかったコントロール反応も含まれた。
【図８ｂ】 図８ｂは、E.coliを含むミニトランスポゾンの検出を写真により表す。KanRミニトランスポゾンの１２０bp領域を増幅するために設計したプライマー（＜４００＞９）を、内部ハイブリダイゼーションプローブとして用いたオリゴヌクレオチドIn903 （＜４００＞１１）と共に説明する（パネルA ）。この特殊なミニトランスポゾンを担持する、種々の量のE.coli PNG801 ゲノムDNA からミニトランスポゾン配列を増幅する反応に、プライマー1F（＜４００＞１０）及び1R（＜４００＞１２）を用いた。増幅反応は、陰性コントロールとして種々の量のE.coli DH5αゲノムDNA についても実施し、増幅後、生成物1 μL をHindIII （レーンH ）で消化し、未消化コントロール（レーンU ）及び分子量マーカー（レーンM ）と並行して2 ％w/v アガロースゲルにより電気泳動した。鋳型を加えなかったコントロール反応も含まれた。
【図９】 図９は、南京錠的ハイブリダイゼーション及び環状化の図解ダイアグラムである。
【図１０】 図１０は、未精製鋳型又は精製鋳型のいずれかを用いた合成標的についてのRCA 反応を写真により表す。二重の連結反応を1 ページに概説した（標識したスペーサープロトコル）。この反応に用いたオリゴヌクレトチドをダイアグラムとして説明する（図１１）。２本の別の試験管には各反応セットが含まれていた。陰性コントロール反応（−ve）には南京錠FV2 及びLigWが含まれ、他方陽性コントロール反応（＋ve）には南京錠FV2 、LigW及び野生型標的オリゴヌクレオチドが含まれていた。９４℃３分間の最初の変性後、アンプリガーゼ１μL を陽性コントロール反応のみに加えた。連結反応は６０℃で１時間行った。次に、連結の１セットを記載した方法により精製した。次に、未精製及び精製連結反応を６０℃で１時間４０分の間プライマーFV3 及びFV4 と共にRCA に付した。各反応から１０μＬを２％w/v アガロースに、TBE 緩衝液において、HaeIII消化DNA マーカー（レーン4M）並行φX174で電気泳動し、臭化エチジウム染色して可視化した。
【図１１】 図１１は、オリゴヌクレオチド設計の概略を表すものであり、該設計は、RCA を使用しての因子Ｖライデン遺伝子検出の通常アレル及び突然変異アレルの、回転環状増幅検出のために使用する。（南京錠ＦＶ２：<400>13 ；ＬｉｇＷスペーサー：<400>14 ；ＬｉｇＭスペーサー：<400>15 ；野性型標的：<400>16 ；突然変異型標的：<400>17 ；プライマー：<400>18 及び：<400>19 ）。
【図１２】 図１２は、RCA 反応についての未精製鋳型及び精製鋳型の比較を写真により表す。
【図１３】 図１３は、精製した環状からのRCA 選択性を写真により表す。精製環状分子の１０倍連続希釈をRCA 反応の鋳型として６０℃で２．５時間用いた。各反応に存在する環状の数を、８×１０9 （レーン１）、８×１０8 （レーン２）、８×１０7 （レーン３）、８×１０6 （レーン４）、８×１０5 （レーン５）、８×１０4 （レーン６）、８×１０3 （レーン７）、８×１０2 （レーン８）、８×１０1 （レーン９）８（レーン１０）、０．８（レーン１１）と見積もった。さらに、陰性コントロール反応も含め、プライマーによる人工産物が反応の間に形成されていないことを確認した。各増幅生成物のアリコート１０μL を２％w/v アガロースに、TBE 緩衝液において、DNA マーカーX （Roche 、レーンM ）と並行して電気泳動し、臭化エチジウム染色して可視化した。
【図１４】 図１４は、回転環状増幅反応のリアルタイム可視化をグラフで表す。
【図１５】 図１５は、存在する環の数と蛍光閾値に達するまでの時間の直線関係をグラフで表す。
【図１６】 図１６は、RCA の目的遺伝子特異的検出能を写真により表す。
【図１７】 図１７は、因子Ｖライデン通常及び変異配列のSNP 検出のためのオリゴヌクレオチド設計を図解して表す（野生型配列：＜４００＞２０、変異配列：＜４００＞２１、FV5 ：＜４００＞２２、FV6:＜４００＞２３、ＦＶ3 ：＜４００＞１８）。
【図１８】 図１８は、SNP 検出のためのRCA のポテンシャルを写真により表す。
【図１９】 図１９は、二つのプライマーがいずれのオリゴヌクレオチドにも結合しないように設計された南京錠プローブを図解して表す。
【図２０】 図２０は、実施例１１に記載した反応で生成した溶液相材料を写真により表す。
【図２１】 図２１は、実施例１２に記載した反応で生成した溶液相材料を写真により表す。
【配列表】
Claims (4)
- 第一の標的核酸配列分子及び第二の標的核酸配列分子を第一の核酸プローブ及び第二の核酸プローブと接触させる工程であって、該核酸プローブがそれぞれ５'標的プローブ領域と３'標的プローブ領域を含むものであり、該第一核酸プローブの５'標的プローブ領域が第一標的核酸配列分子とハイブリダイズし、該第一核酸プローブの３'標的プローブ領域が第二標的核酸配列分子とハイブリダイズするものであり、該第二核酸プローブの３'標的プローブ領域が第一標的核酸配列分子とハイブリダイズし、該第二核酸プローブの５'標的プローブ領域が第二標的核酸配列分子とハイブリダイズするものであり、第一及び第二の標的核酸配列分子の標的核酸配列が別々のものである工程、
第一及び第二核酸プローブを環状化することにより環状核酸プローブを形成する工程であって、該第一核酸プローブの５’末端と該第二核酸プローブの３’末端との間のギャップが閉じられ、かつ該第一核酸プローブの３’末端と該第二核酸プローブの５’末端との間のギャップが閉じられる工程、を含む環状核酸プローブを形成する方法。 - 該環状核酸プローブを増幅する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
- 該増幅が回転環状増幅である、請求項２記載の方法。
- 該回転環状増幅が一又はそれ以上の相補的プライマーを使用するものであり、該相補的プライマーが該核酸プローブに相補的なものであり、該回転環状増幅が一又はそれ以上のセンスプライマーを使用するものであり、該回転環状増幅が該核酸プローブに相補的な核酸鎖を形成するものであり、該センスプライマーが該核酸プローブに相補的な核酸鎖に相補的なものであり、該センスプライマーが該核酸プローブに相補的な核酸鎖の領域と相互作用するものである、請求項３記載の方法。
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