JP2004521634A - ＭｕｔＳおよびＲｅｃＡを使用する変異検出 - Google Patents
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Abstract
変異、および単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む多型を検出する方法は、ＲｅｃＡ様リコンビナーゼタンパク質およびＭｕｔＳ様ミスマッチ結合タンパク質の使用に基づく。ＲｅｃＡでコートした、特定のＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブ（ＲｅｃＡフィラメント）を、二重鎖ＤＮＡにおける相同性検索に使用する。相同性配列の位置は、オリゴヌクレオチドプローブ、および試験ＤＮＡの１つの鎖から構成される、二重鎖領域を含むＤループ構造の形成を生じる。二重鎖領域中のミスマッチまたは不対塩基は、ＭｕｔＳ結合についての基質である。ＭｕｔＳとオリゴヌクレオチドまたはＲｅｃＡ標識との同時局在は、プローブと試験ＤＮＡとの間の特定の配列差異に特徴的である。また、本発明の方法を実施するに有用な組成物およびキットが、提供される。
Description
【技術分野】
【０００１】
分子生物学および医薬の分野における本発明は、１塩基変化（単一ヌクレオチド多型−ＳＮＰ）または野生型ＤＮＡ配列への単一塩基付加もしくは野生型ＤＮＡ配列からの単一塩基欠失ほど小さなものを含む変異および多型を検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術の説明）
ヒト分子および医療遺伝学における進歩は、変異および配列多型の効率的かつ正確な検出に依存し、これらの大部分は、単一塩基置換（単一ヌクレオチド多型−ＳＮＰ）および小さな付加または欠失から生じる。従って、サンプル中の特異的変異、ＳＮＰまたは変異核酸配列の存在を検出し得るアッセイは、疾患の予測および診断、法医学、疫学および公衆衛生において実質的な重要性を有する。このようなアッセイを使用して、例えば、個体における変異遺伝子の存在を検出し得、この個体が遺伝子疾患に罹患する可能性の検出を可能にする。変異を検出する能力は、細胞性癌遺伝子中の個々の変異が癌細胞へのこの細胞の形質転換を導くこの癌遺伝子の活性化を生じ得るという発見、および腫瘍サプレッサ遺伝子を不活性化する変異が腫瘍形成のプロセスにおいて必要な工程であるという発見を用いて、癌の早期検出または癌に対する感受性の発見における増大する重要性を担っている。ＳＮＰの検出は、ヒトおよび動物の疾患に関連した遺伝子を含む遺伝子の同定および位置決め（マッピング）における増加した重要性を想定している。
【０００３】
このようなアッセイの有用性および適用性を増加するという要求は、しばしば、アッセイの感度ならびに複雑性およびコストに悩まされる。従って、ＤＮＡにおける変更を検出するためのより高感度で、簡単でかつ比較的安価なアッセイを開発することが非常に望ましい。
【０００４】
核酸検出アッセイは、核酸分子の多数の特徴（例えば、そのサイズ、配列、制限エンドヌクレアーゼによる切断に対する感受性など）のいずれかに基づき得る。このようなアッセイの感度は、検出が観察者に報告または伝達される様式を変更することによって、増加され得る。従って、例えば、アッセイの感度は、検出可能に標識された試薬（例えば、酵素（Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら、米国特許第４，５８１，３３３号）、放射性同位体（Ｆａｌｋｏｗら、米国特許第４，３５８，５３５号；Ｂｅｒｎｉｎｇｅｒ、米国特許第４，４４６，２３７号）、蛍光標識（Ａｌｂａｒｅｌｌａら、ＥＰ１４４９１４）、化学標識（Ｓｈｅｌｄｏｎ ＩＩＩら、米国特許第４，５８２，７８９号；Ａｌｂａｒｅｌｌａら、米国特許第４，５６３，４１７号）、改変された塩基（Ｍｉｙｏｓｈｉら、ＥＰ１１９４４８）など）を使用することによって、増加され得る。
【０００５】
１つまたは数個の塩基から構成される遺伝的変化の検出を試みるために発明されたほとんどの方法は、ＰＣＲによる特定のＤＮＡ領域の増幅を含み、そして多くは、標準的な核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）と試験ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションを含み、その結果、変異は、ヘテロ二本鎖分子における誤対形成塩基または不対塩基として示される。これらの誤対形成塩基または不対塩基の検出は、種々の方法によって達成されている（Ｍｙｅｒｓ，ＲＭ，ら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２７５−２８４（１９８６）；Ｇｉｂｂｓ，Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：３０３−３０５（１９８７）；Ｌｕ，ＡＳ．ら、１９９２，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４：２４９−２５５（１９９２）；Ｃｏｔｔｏｎ，ＲＧ，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４３９７−４４０１（１９８８）；Ｃｏｔｔｏｎ，ＲＧ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７：４２２３−４２３３（１９８９）；Ｌｉｓｈａｎｓｋｉ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２６７４−２６７８（１９９４）；Ｗａｇｎｅｒ，ＲＥ，ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３９４４−３９４８（１９９５）；Ｄｅｂｂｉｅ，Ｐ．ら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：４８２５−４８２９（１９９７））。これらの方法の全ては、以下の要件に悩まされている：（１）特定のＤＮＡ領域が、変異またはＳＮＰの検出の前にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅されなければならないこと、および（２）増幅されたＤＮＡが、変性され、そしてミスマッチまたは不対塩基の形成を可能にするように公知の遺伝子型のいくつかの標準的なＤＮＡでアニールされなければならないこと。ＰＣＲ増幅は、増幅（これは比較的低い忠実度のプロセスである）の間にエラーを導入し、そして特に、ゲノムＤＮＡまたは大きなアンプリコンの変性およびアニーリングは、大きなアニールされていない一本鎖のフラグメントを残し得、このフラグメントは、不対塩基または誤対形成塩基を有する二本鎖ＤＮＡの領域を含む二次構造をとり得る。これらの誤対形成塩基および不対塩基は、標的ミスマッチまたは不対塩基の検出を妨害し得る。これらの方法の多くはまた、変異の正確な位置が既知であることを必要とし、そしてサンプルＤＮＡが問題の変異についてヘテロ接合性である場合には、解釈が困難である。従って、ほとんどは、変異およびＳＮＰのスクリーニングにおける使用に実用的ではない。
【０００６】
ＭｕｔＳおよびＲｅｃＡは、ＤＮＡ修復および遺伝子組換えに関与する細菌タンパク質であり、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて最もよく特徴付けされている。ＭｕｔＳは、Ｅ．ｃｏｌｉミスマッチ修復系のミスマッチ認識および結合タンパク質であり、これはＤＮＡ複製の間にＤＮＡポリメラーゼにより作製される誤りを修復するように機能する。この系はまた、遺伝子組換えの初期工程で生成されるハイブリッド重複におけるミスマッチを認識し、このようなミスマッチ含有領域に作用して組換えを停止する。従って、このミスマッチ修復系は、ＤＮＡ複製および遺伝子組換えの両方におけるエディターであり、両方のプロセスにおいて高い忠実度を保証する。（組換えの編集は、染色体の再配置を回避するため、首尾良い減数分裂を可能にするため、および非常に関連した種の間に遺伝的バリアを構築するために必須である）。
【０００７】
ＭｕｔＳは、変異およびＳＮＰの検出において使用されてきた（Ｌｉｓｈａｎｓｋｉら（前出）；Ｗａｇｎｅｒら（前出）；Ｄｅｂｂｉｅら（前出）；Ｗａｇｎｅｒおよびｃｏｌｌｅａｇｕｅｓによる特許−米国特許第６，０２７，８７７号、同第６，１１４，１１５号、同第６，１２０，９９２号、同第６，３２９，１４７号；およびＧｉｆｆｏｒｄ、米国特許第５，７５０，３３５号）。フィルター結合アッセイまたはゲルシフトアッセイ（Ｊｉｒｉｃｎｙら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７８４３−７８５３（１９８８）；Ｌｉｓｈａｎｓｋｉら（前出））におけるように、溶液中で使用される場合、ＭｕｔＳは、ほとんどのミスマッチを検出せず、非ミスマッチＤＮＡの高レベルのバックグラウンド結合を示すという点で、十分には機能しない。固定化ＭｕｔＳは、ミスマッチに結合する非常に増加した能力、およびミスマッチを有さないＤＮＡに結合する非常に減少した能力を有する（Ｗａｇｎｅｒら（前出））。しかし、固定化ＭｕｔＳでさえ、誤った組込みおよび誤ったプライミングの両方を含む、ＤＮＡにおけるＰＣＲにより誘導される誤りを被り、一本鎖ＤＮＡは、変異およびＳＮＰの検出アッセイにおける強力なコンペティターである。
【０００８】
ＲｅｃＡ（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて最もよく特徴付けされている細菌リコンビナーゼ）は、遺伝子組み替えのプロセスにおいて、特に、配列相同性の検索および認識において、および初期鎖交換プロセスにおいて、重要なプレイヤーである。ＲｅｃＡは、試験管中の鎖交換を触媒し得る。組換えは、複数のＲｅｃＡ分子が一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の伸長を被覆して、ＲｅｃＡ「フィラメント」として公知のものを形成する場合に、始まる。このフィラメントは、ＡＴＰの存在下で、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）中の相同配列を探す。相同性が存在する場合、三鎖（Ｄループ）構造が形成され、ここでこのＲｅｃＡフィラメントＤＮＡは、二重鎖の相補鎖と対形成する。対形成が完全ではない場合、すなわち、新たに生成した二重鎖中にミスマッチまたは不対塩基が存在する場合、ＭｕｔＳは、これらの構造に結合し得、そしてミスマッチ修復系（これはこのフィラメントＤＮＡを除去しそして元の二重鎖を回復させることによって組換え現象を停止するように作用する）の他のタンパク質を動員する。かなりの証拠（このほとんどは未だ未公開である）は、ＲｅｃＡおよびＭｕｔＳが、組換えの間に共存すること、およびＤＮＡへのＲｅｃＡの結合が、おそらく、ＭｕｔＳに対するミスマッチの提示を改善することによって、ＭｕｔＳミスマッチ認識を容易にし得ることを示唆する。
【０００９】
ＲｅｃＡは、特異的配列を含むプラスミドについてのプラスミドライブラリーのスクリーニングを容易にするために使用されている（Ｒｉｇａｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８３：９５９１−９５９５（１９８６））。この適用において、ビオチン化一本鎖ＤＮＡプローブは、ＲｅｃＡと反応して、ＲｅｃＡフィラメントを形成する。このフィラメントは、環状プラスミドＤＮＡにおける相同性検索のために使用される。このプローブが、アビジンに結合することによって除去される場合、このプローブに相同な配列を含むプラスミドは、ＲｅｃＡフィラメントおよびプラスミド二重鎖により形成される三本鎖（Ｄループ）構造によって単離される。これらの構造が安定化するために、ＡＴＰの代わりにアデノシン５’−［γ−チオ］三リン酸（ＡＴＰ［γ−Ｓ］）を使用する必要がある。ＡＴＰ［γ−Ｓ］は、ＲｅｃＡによる相同性検索を可能にし、非加水分解性であり、従って、三本鎖構造からＲｅｃＡを解離させない。
【００１０】
ＲｅｃＡはまた、細菌ゲノムＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ由来の特定のＤＮＡ領域のマッピングを容易にするために使用されている（Ｆｅｒｒｉｎ，ＬＪら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４；１４９４−１４９７（１９９１）；Ｆｅｒｒｉｎ，ＬＪら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：３７９−３８３（１９９４））。これらの用途において、ＲｅｃＡを、制限酵素（配列特異的二本鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）と共に使用して、特定のＤＮＡフラグメントの単離または同定を可能にする。ＲｅｃＡフィラメントを調製し、そして三本鎖（Ｄループ）構造の形成を可能にする条件下で、ゲノムＤＮＡと反応させる。次いで、このＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼまたは修飾メチラーゼのいずれかで処理する（メチラーゼ作用は、特異的制限エンドヌクレアーゼの特異的認識配列にメチル基を転移し、従って、この配列をエンドヌクレアーゼ消化から保護する）。三本鎖構造中のＲｅｃＡフィラメントの存在は、消化またはメチル化を防止する。
【００１１】
特異的ＲｅｃＡフィラメントはまた、制限エンドヌクレアーゼ生成性「粘着末端」がＤＮＡポリメラーゼにより満たされるのを保護するために使用され、その結果、ＲｅｃＡフィラメントが除去される際、特異的フラグメントがプラスミドベクター中にクローン化され得る（Ｆｅｒｒｉｎら、米国特許第５，７０７，８１１号）。
【００１２】
ＲｅｃＡ触媒型二重Ｄループの形成は、二本鎖ＤＮＡから特定のＤＮＡ領域を同定および単離するために使用されている（Ｓｅｎａら、米国特許第５，２７３，８８１号および同第５，６７０，３１６号）。この方法は、安定な構造を提供するために、比較的長いＤＮＡプローブ（＞７８ヌクレオチド）、およびこのプローブと二重Ｄループとの間の相補性を必要とする。この方法は、一緒になってＤループを形成するプローブと試験ＤＮＡが、プローブ／試験二重領域における誤対形成塩基または不対塩基の形成を生じる配列の相違を有さなければならない（変異またはＳＮＰの検出を可能にする）本発明とは基本的に対照的である。これらの文献は、ＤＮＡポリメラーゼを用いるオリゴヌクレオチドの伸長によってプローブに検出可能な標識を導入する可能性を記載する。重要なことに、この方法は、試験ＤＮＡの特定の配列の検出にのみ適切であるが、変異またはＳＮＰの検出（本発明の目的）には役立たない。さらに、これらの特許の教示は、二重Ｄループの使用に限定される。配列検出の限定された目的のためでさえ、単一Ｄループの使用の示唆はない。
【００１３】
このデータについての全ての記載またはこれらの文献の内容についての説明は、本出願人に利用可能な情報に基づき、そしてこれらの文献のデータまたは内容の正確さについてのいずれの承認も構成しない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、二本鎖試験ＤＮＡ分子中の変異および／またはＳＮＰを検出するための方法に関し、この方法は、以下の工程：
（ａ）必要に応じて検出可能に標識された一本鎖ＤＮＡプローブを提供する工程であって、このプローブは、（ｉ）既知のヌクレオチド配列または（ｉｉ）試験ＤＮＡの少なくとも一部の配列に相補的な配列を有する、工程；
（ｂ）プローブと、ＲｅｃＡタンパク質（または以下でより詳細に定義される、そのホモログ）とを接触させて、ＲｅｃＡフィラメントを形成する工程であって、このＲｅｃＡタンパク質は、必要に応じて検出可能に標識されている、工程；
（ｃ）ＲｅｃＡフィラメントと、試験ＤＮＡとを接触させ、それによりその試験ＤＮＡ中に３本鎖ＤＮＡ Ｄループ構造を形成する工程であって、このＤループ構造は、プローブおよび試験ＤＮＡの２つの鎖を含む、工程；
（ｄ）そのＤＮＡ−Ｄループ構造とＭｕｔＳ（または以下でより詳細に定義される、そのホモログ）と接触させる工程であって、このＭｕｔＳは、必要に応じて検出可能に標識されており、ここでＭｕｔＳは、Ｄループ構造の二重鎖部分に存在する１以上の塩基対ミスマッチまたは不対塩基に結合する、工程；
（ｅ）そのＤＮＡ Ｄループ構造に結合したＭｕｔＳの存在を検出する工程であって、ここで結合したＭｕｔＳの存在は、試験ＤＮＡ中の変異またはＳＮＰの存在を示す工程、
を包含する。
【００１５】
二本鎖試験ＤＮＡ分子中の変異および／またはＳＮＰを検出するための方法もまた提供され、この方法は、以下の工程：
（ａ）必要に応じて検出可能に標識された２つの相補性一本鎖オリゴヌクレオチドを含むプローブを提供する工程であって、このプローブは、（ｉ）既知のヌクレオチド配列または（ｉｉ）試験ＤＮＡの少なくとも一部の配列に相補的な配列を有する、工程；
（ｂ）一本鎖形態にあるそのオリゴヌクレオチドの各々と、ＲｅｃＡタンパク質とを接触させて、ＲｅｃＡフィラメントを形成する工程であって、このＲｅｃＡタンパク質は、必要に応じて検出可能に標識されている、工程；
（ｃ）そのＲｅｃＡフィラメントと、試験ＤＮＡとを接触させ、それにより試験ＤＮＡ中に４本鎖ＤＮＡ構造を形成する工程であって、この構造は、プローブおよび試験ＤＮＡの２つの鎖を含み、ここでそのプローブ鎖は、試験ＤＮＡ鎖とアニールする、工程；
（ｄ）そのＤＮＡ構造と、ＭｕｔＳタンパク質とを接触させる工程であって、このＭｕｔＳは必要に応じて検出可能に標識されており、ここでＭｕｔＳは、その４本鎖ＤＮＡ構造に存在する１以上の塩基対ミスマッチまたは不対塩基に結合する、工程；
（ｅ）そのＤＮＡ構造に結合したＭｕｔＳの存在を検出する工程であって、その結合したＭｕｔＳの存在は、試験ＤＮＡ中の変異またはＳＮＰの存在を示す、工程、
を包含する。
【００１６】
二本鎖試験ＤＮＡ分子中の変異および／またはＳＮＰを検出するための別の方法であって、この方法は、以下の工程：
（ａ）一本鎖ＤＮＡプローブを提供する工程であって、このプローブは、必要に応じて検出可能に標識されており、（ｉ）既知のヌクレオチド配列または（ｉｉ）この試験ＤＮＡ分子の少なくとも一部の配列に相補的な配列を有する工程；
（ｂ）そのプローブとＲｅｃＡタンパク質とを接触させて、ＲｅｃＡフィラメントを形成する工程であって、このＲｅｃＡタンパク質は、必要に応じて検出可能に標識されている、工程；
（ｃ）このＲｅｃＡフィラメントと、試験ＤＮＡとを接触させ、それにより、試験ＤＮＡ中に３本鎖ＤＮＡ Ｄループ構造を形成する工程であって、この構造は、プローブおよび試験ＤＮＡの二本鎖を含む、工程；
（ｄ）このＤＮＡ Ｄループ構造と、固定化ＭｕｔＳとを接触させる工程であって、この固定化ＭｕｔＳは、このＤループ構造の二重鎖部分に存在する１以上の塩基対ミスマッチまたは不対塩基に結合する、工程；
（ｅ）固定化プローブＤＮＡまたはＭｕｔＳに結合したＲｅｃＡの存在を検出する工程であって、ここで結合プローブＤＮＡまたはＲｅｃＡの存在は、その試験ＤＮＡ中の変異またはＳＮＰの存在を示す、工程、
を包含する。
【００１７】
本発明は、二本鎖試験ＤＮＡ分子中の変異および／またはＳＮＰを検出するための方法を包含し、この方法は、以下の工程：
（ａ）２つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドを含むプローブを提供する工程であって、このプローブは、必要に応じて検出可能に標識されており、（ｉ）既知のヌクレオチド配列または（ｉｉ）この試験ＤＮＡの少なくとも一部の配列に相補的な配列を有する、工程；
（ｂ）一本鎖形態にあるこのプローブオリゴヌクレオチドの各々を、ＲｅｃＡタンパク質と接触させて、ＲｅｃＡフィラメントを形成する工程であって、このＲｅｃＡタンパク質は、必要に応じて検出可能に標識されている、工程；
（ｃ）このＲｅｃＡフィラメントと、その試験ＤＮＡとを接触させ、それにより、試験ＤＮＡ中に４本鎖ＤＮＡ構造を形成し、この構造は、試験ＤＮＡの２つの鎖を含み、これらの鎖の各々に対して、プローブオリゴヌクレオチド鎖がアニールする、工程；ならびに
（ｄ）このＤＮＡ構造と、固定化したＭｕｔＳとを接触させ、それにより、変異および／またはＳＮＰを検出する工程であって、このＭｕｔＳは、４本鎖ＤＮＡ構造に存在する１以上の塩基対ミスマッチまたは不対塩基に結合する、工程、
を包含する。
【００１８】
上記の方法において、試験ＤＮＡ分子は、原核生物ゲノムＤＮＡ、真核生物ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、およびＰＣＲにより増幅されたＤＮＡフラグメント、または別の増幅方法により増幅されたＤＮＡフラグメントであり得る。
【００１９】
変異またはＳＮＰを確実に検出するために、上記のプローブ配列は、１以上のヌクレオチド置換、付加または欠失により変異またはＳＮＰの配列とは異ならなければならない。その結果、プローブ／試験へテロ二重鎖は、ＭｕｔＳ、またはＭｕｔＳホモログもしくは他のミスマッチ結合タンパク質（ＭＢＰ）により認識可能なミスマッチまたは不対塩基を含む。試験ＤＮＡ配列がプローブと同一である場合、試験結果は、「ネガティブ」である。上記で使用される「プローブ」が「１以上」の異なるプローブ分子を含み得ることが理解されるべきである。プローブは、好ましくは、約２０〜約６０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり。好ましくは、以下からなる群より選択される：（ａ）合成オリゴヌクレオチド；（ｂ）組換えオリゴヌクレオチド；および（ｃ）二本鎖ＤＮＡ分子を変性し、必要に応じて切断することにより得られる、オリゴヌクレオチド。プローブが２つの相補的ＤＮＡ分子を含む場合、それらは、ＲｅｃＡで別々にコーティングされ得る。このプローブは、付加物を含み得、この付加物は、Ｄループ形成の後に固定化を可能にするオリゴヌクレオチド、ビオチンまたはジゴキシゲニンなどであり得る。
【００２０】
ＲｅｃＡタンパク質は、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ由来である。
【００２１】
本明細書中に記載の方法において、検出は、検出可能に標識された化合物：プローブＤＮＡ、ＲｅｃＡ、ＭｕｔＳ（または以下で議論されるＳＳＢ）のいずれか１つを使用することに基づく。標識は、任意の適切な検出可能な標識であり得る（例えば、発蛍光団、発色団、放射性核種、ビオチン、ジゴキシゲニンなど）。タンパク質またはＤＮＡは、上記の発蛍光団、発色団、ビオチンなどが結合されたビーズを介して標識され得る。このプローブは、標識されたデオキシヌクレオチド三リン酸またはヌクレオチドターミネーターを使用してＤＮＡポリメラーゼ伸長により標識され得る。
【００２２】
好ましい検出は、結合したＭｕｔＳの検出であり、このＭｕｔＳは、溶液中にあってもよいし、ニトロセルロース、ポリスチレン、磁性ビーズなどのような固体表面に固定化されていてもよい。ＤＮＡ、ＲｅｃＡまたはＭｕｔＳは、標識のタンパク質への直接結合または結合により直接標識され得る。しかし、用語「検出可能に標識される（標識された）」はまた、タンパク質またはＤＮＡを参照するか否かにかかわらず、「間接的な」標識を含み、ここで「検出可能な標識」は、そのタンパク質またはＤＮＡの一次抗体でありまたは任意の他の結合パートナーであり、これらは、直接標識される。あるいは、検出可能な標識は、非標識一次抗体（例えば、抗ＭｕｔＳ、抗ＲｅｃＡ、抗ＳＳＢ）と、この一次抗体に特異的な直接標識された二次抗体との組み合わせである。
【００２３】
本発明の方法において、ＭｕｔＳ（またはそのホモログ）は、溶液中にあってもよいし、任意の固体支持体に固定化されていてもよい。
【００２４】
ＲｅｃＡまたは上記プローブが標識される場合、好ましい標識は、発蛍光団、発色団、放射性核種、ビオチン、ジゴキシゲニンであり、ここでこのプローブ標識とＭｕｔＳ標識またはＲｅｃＡ標識とＭｕｔＳ標識の関連は、試験ＤＮＡ中の変異またはＳＮＰの存在を示す。
【００２５】
ＭｕｔＳまたはＭｕｔＳホモログが標識される場合、この標識は、好ましくは、発蛍光団、発色団、放射性核種、ビオチン、ジゴキシゲニンまたは標識ビーズである。ＲｅｃＡまたはＲｅｃＡホモログについての好ましい標識は、発蛍光団である。検出可能な標識が発蛍光団である場合、好ましい検出方法は、フローサイトメトリーである。
【００２６】
上記の方法において、ＭｕｔＳまたはＭｕｔＳホモログは、固体支持体に固定化され得る。
【００２７】
好ましい実施形態において、ＲｅｃＡタンパク質は、標識され、検出は、ＤＮＡ Ｄループ構造に存在するＲｅｃＡ標識と会合したＭｕｔＳの検出である。
【００２８】
別の実施形態において、ＲｅｃＡまたはそのホモログの検出可能な標識は、標識抗ＲｅｃＡ一次抗体の形態にあるか、または非標識抗ＲｅｃＡ一次抗体とこの一次抗体に特異的な標識二次抗体の組み合わせの形態にある。
【００２９】
三本鎖またはＤループ構造の二重鎖部分に結合するＭｕｔＳは、構造を安定化させ、比較的短いオリゴヌクレオチドの使用を可能にする。このことにより、ともに近くに存在し得る変異およびＳＮＰを別々に検出することができる。従って、本発明の方法におけるＭｕｔＳの使用は、先行技術（例えば、Ｓｅｎａらの特許）を超える重要な全体的改善である。なぜなら、ＭｕｔＳの使用が、変異またはＳＮＰを含むＤループ構造と変異またはＳＮＰを含まないＤループ構造との間を区別するための基本として役立つからである。このことは、ＭｕｔＳを結合しないＤループ構造が、プローブおよび試験ＤＮＡが好ましくは、いずれのミスマッチも不対塩基もない（プローブの試験ＤＮＡからの解離が好まれる状態）、対形成されるＤループ構造であることが理由である。これは、バックグラウンドシグナルを最小にするというさらなる利点を有する。
【００３０】
上記の方法において、このＤＮＡ Ｄループ構造は、上記工程（ｄ）の前に一本鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質（Ｃｈａｓｅら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：３２１５−３２２７（１９８０））またはＳＳＢホモログ（これらは、必要に応じて検出可能に標識される）を付加することにより、さらに安定化され得る。ＳＳＢタンパク質が標識される場合、この標識は、発蛍光団、発色団、放射性核種、ビオチン、ジゴキシゲニン、または標識ビーズであり得、ＳＳＢ標識とＭｕｔＳ標識の会合は、試験ＤＮＡ中の変異またはＳＮＰの存在を示す。
【００３１】
３本鎖構造の安定性はまた、ＤＮＡ合成によりオリゴヌクレオチドを伸長させることにより増強され得る。このような伸長は、ＤＮＡポリメラーゼおよび４つのデオキシヌクレオチド三リン酸全ての添加を必要とする。
【００３２】
上記の方法において、フローサイトメトリー検出は、以下に結合する、２つ、３つまたは４つの標識の同時存在を検出し得る：（ａ）ＭｕｔＳおよびプローブ；（ｂ）ＭｕｔＳおよびＲｅｃＡ；（ｃ）ＭｕｔＳ、ＲｅｃＡおよびプローブ；（ｄ）ＭｕｔＳおよびＳＳＢ；（ｅ）ＭｕｔＳ、ＳＳＢ、およびプローブ；または（ｆ）ＭｕｔＳ、ＳＳＢ、プローブおよびＲｅｃＡ。
【００３３】
本発明はまた、ＤＮＡサンプル中の１つ以上の変異もしくは多型を検出するのに有用なキットを提供し、このキットは、その中に１つ以上の容器を受けるように適合され、このキットは、以下：
（ａ）必要に応じて検出可能に標識されるＲｅｃＡタンパク質を含む、第１の容器；
（ｂ）必要に応じて検出可能に標識されるＭｕｔＳタンパク質を含む、第２の容器；
（ｃ）ＭｕｔＳまたはＭｕｔＳホモログの結合を検出し得る緩衝液および試薬を含む、第３の容器または複数の容器
を備える。
【００３４】
さらに、ＤＮＡサンプル中の特定の変異もしくは特定の多型または特定の変異群もしくは多型群を検出するためか、または任意の変異または任意の多型についてＤＮＡの特定の領域を調べるために有用なキットが含まれ、このキットは、その中に１つ以上の容器を受けるように適合され、このキットは、以下：
（ａ）必要に応じて検出可能に標識されるＲｅｃＡタンパク質またはそのホモログを含む、第１の容器；
（ｂ）必要に応じて検出可能に標識されるＭｕｔＳタンパク質を含む、第２の容器；
（ｃ）特定のオリゴヌクレオチドプローブを含む第３の容器または複数の容器であって、このプローブは、サンプルのＤＮＡ中の特定の領域における特定の配列に対して相補的であるように選択され、そしてその特定のＤＮＡ領域中の変異配列または多型配列とのミスマッチ含有へテロ二重鎖または不対塩基含有ヘテロ二重鎖を形成し、このプローブは、必要に応じて検出可能に標識される、第３の容器；ならびに
（ｄ）プローブとサンプルＤＮＡとの間で形成された特定のヘテロ二重鎖に対するＭｕｔＳまたはＭｕｔＳホモログの結合を検出し得る緩衝液および試薬を含む、第４の容器または複数の容器、
を備える。
【００３５】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は、少なくとも２つのＤＮＡ結合タンパク質（ＲｅｃＡおよびＭｕｔＳ）の組み合わせを用いて、変異またはＳＮＰを検出するための新規技術を発明した。一般的には、この方法は、以下を用いる：
（１）試験ＤＮＡ分子であって、この分子は、任意の供給源由来の任意の合成ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、原核生物ＤＮＡまたは真核生物ＤＮＡであり得、そしてＰＣＲまたは任意の他の手段によって増幅され得る、試験ＤＮＡ分子；
（２）ＤＮＡプローブであって、このプローブは、任意の合成オリゴヌクレオチド、ＰＣＲアンプリコン、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、あるいは既知配列の任意の他のＤＮＡまたは試験ＤＮＡもしくはその部分に対して相補的な配列の任意の他のＤＮＡであり得る、ＤＮＡプローブ、
（３）以下に記載されるような、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲｅｃＡもしくはそのホモログ、ならびに
（４）以下に記載されるような、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭｕｔＳもしくはそのホモログ、または任意の原核生物種もしくは真核生物種由来の別のミスマッチ結合タンパク質。
【００３６】
本明細書中および本発明の特許請求の範囲に使用される場合（簡潔さおよび明確さのために）、用語「ＭｕｔＳ」、「ＲｅｃＡ」または「ＳＳＢ」は、ネイティブまたは変異体のＥ．ｃｏｌｉ ＭｕｔＳタンパク質、ＲｅｃＡタンパク質、もしくはＳＳＢタンパク質、またはこれらの「ホモログ」（以下に規定されるような）のいずれかを含むことが意図される。ＭｕｔＳ、ＲｅｃＡまたはＳＳＢなどの「ホモログ」などは、その参照」タンパク質に対して機能類似性、好ましくは構造類似性／配列類似性もまた有するタンパク質である。ホモログの１つの型は、同じ属またはさらには他の属の別の種由来の相同遺伝子によってコードされる。以下に記載されるように、上記のタンパク質（元々、細菌中で発見された）は、酵母から哺乳動物までの範囲の群において真核生物ホモログを有する。機能的ホモログは、その参照タンパク質の生化学活性および生物学的活性（特に、ＤＮＡ結合選択性またはＤＮＡ結合特異体）を保有しなければならず、その結果、機能ホモログは本明細書中に記載されるような有用性を有する。その機能特徴づけを考慮して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質、ＭｕｔＳタンパク質、またはＳＳＢタンパク質のホモログ（未だ発見されていないタンパク質も含む）の使用は、それらのタンパク質が記載されたＤＮＡ結合活性または「改善された」結合活性を有する場合、本発明の範囲内にある。改善の非限定的な例としては、ＭｕｔＳホモログによるＣ：Ｃミスマッチの認識、より短いＤＮＡ分子に結合するＲｅｃＡホモログ、またはＳＳＢホモログによる一本鎖ＤＮＡのより高い親和性結合が挙げられる。
【００３７】
「ホモログ」はまた、本発明における使用のためにタンパク質の所望の機能を改善するために実施される、変異誘発または組換えによって変更されたタンパク質を含むことが意図される。これらのアプローチは、一般に記載され、そして以下に十分に参照される。明らかに、過度の実験に頼らずにこのような遺伝子操作されたホモログを開発することは、当該分野の技術の範囲内である。従って、例えば、当業者は、これらのアプローチを、例えば、「ネイティブ」ＭｕｔＳタンパク質をコードするＤＮＡ（変異誘発）または各々が異なる「ネイティブ」ＭｕｔＳタンパク質をコードする２つ以上のＤＮＡ分子（組換え）で開始して、遺伝子産物を発現し、そして公知のスクリーニング技術（本発明の方法を含む）を用いて、適切なＤＮＡ結合活性を測定する。ゆえに、遺伝子操作された、改善ＭｕｔＳホモログ、改善ＲｅｃＡホモログ、または改善ＳＳＢホモログの特定の例がないとしても、当業者は、慣用的な実験のみを用いてこのようなホモログを生成かつ同定し得る。
【００３８】
タンパク質遺伝子の変異誘発（当該分野において慣用的である）は、一般的に、その遺伝子を細菌ベクターにクローニングし、そしてそのベクターを細胞中で変異誘発条件下（例えば、変異誘発ヌクレオチドアナログの存在下および／またはミスマッチ修復が欠損している条件下）で複製にすることによって、インビボで達成される。インビトロでの変異誘発（これもまた、当該分野において周知である）は、一般的に、誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲを利用し、ここで、所望の遺伝子は、ＰＣＲポリメラーゼによる誤った組み込みに有利な条件下（ヌクレオチドアナログ、偏った三リン酸プールなど）で増幅される。次いで、ＰＣＲ産物は、発現ベクター中にクローニングされ、そして得られるタンパク質は、細菌細胞中で機能について調べられる。
【００３９】
組換えは、一般的に、異なる種由来の相同遺伝子を混合し、これらを組換えさせ（頻繁には、変異誘発条件下で）、そして組換え遺伝子由来のタンパク質の改善された機能について選択またはスクリーニングすることを含む。この組換えは、ミスマッチ修復が欠損した条件下（これは、異なる配列間の組み換えを可能にし、かつ変異の生成も増加させる）で、インビボにて（最も一般的には細菌細胞中で）達成され得る。本発明者らのうちの一人は、このようなタンパク質「進化」の方法を開発した（Ｒａｄｍａｎら、米国特許第５，９１２，１１９号および同第５，９６５，４１５号）。さらに、Ｓｔｅｍｍｅｒおよびその共同研究者らは、「改善された」タンパク質を作製するために、異なる配列のインビボ組換えおよびインビトロ組換えの両方のための方法を案出した。ほとんどが、ＰＣＲ「シャッフリング」を含み、ここで、２つの異なる配列が設計され、そして一緒に混合されて、その結果、そのフラグメントは、ＰＣＲのためのプライマーおよび鋳型の両方として作用して、そのようにして異なる遺伝子の異なるセグメントを組合わせる。これは、要するに、遺伝子「組換え」である。しばしば、誤りがちのＰＣＲ条件が含められて、新規配列の生成をさらに刺激する。得られるＰＣＲ産物は、発現ベクターにクローニングされ、そして得されるタンパク質は、改善された機能についてスクリーニングされる。例えば、米国特許第５，５１２，４６３号；同第５，６０５，７９３号；同第５，８１，２３８号；同第５，８３０，７２１号；同第５，８３７，４５８号；同第６，０９６，５４８号；同第６，１１７，６７９号；同第６，１３２，９７０号；同第６，１６５，７９３号；同第６，１８０，４０６号；同第６，２５１，６７４号；同第６，２７７，６３８号；同第６，２８７，８６１号；同第６，２８７，８６２号；同第６，２９１，２４２号；同第６，２９７，０５３号；同第６，３０３，３４４号；同第６，３０９，８８３号；同第６，３１９，７１３号；同第６，３１９，７１４号；同第６，３２３，０３０号；同第６，３２６，２０４号；同第６，３３５，１６０号；同第６，３４４，３５６号を参照のこと。
【００４０】
示されるように、本発明のホモログは、一般的に、それらの参照タンパク質と配列類似性を共有する。２つのアミノ酸配列の（または２つの核酸配列の）同一性（％）を決定するために、配列は、最適の比較目的のためにアライメントされる（例えば、ギャップが、最適なアライメントのために、第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列の一方または両方にか、あるいは第１の核酸配列および第２の核酸配列の一方または両方に導入され得、そして非相同配列は、比較目的のために、無視され得る）。好ましいアライメント方法において、Ｃｙｓ残基がアライメントされる。比較される配列の長さは、参照配列（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭｕｔＳまたはＥ．ｃｏｌｉ ＲｅｃＡ）の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％である。次いで、対応するアミノ酸（またはヌクレオチド）位置のアミノ酸残基（またはヌクレオチド）が、比較される。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基（またはヌクレオチド）によって占められる場合、これらの分子はその位置で同一である。本明細書中に使用される場合、アミノ酸「同一性」または核酸「同一性」はまた、アミノ酸「相同性」または核酸「相同性」でもある。２つの配列間の同一性％は、最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、それらの配列によって共有される同一な位置の数の関数である。２つの配列間の配列の比較および同一性％の決定は、数理的なアルゴリズム（例えば、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれかを用いるＧＡＰプログラム（以下を参照のこと）に組込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０）））を用いて達成され得る。好ましいプログラムであるｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能なＧＣＧソフトウェアパッケージ中の「ＧＡＰ」は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＡマトリクスおよび４０、５０、６０、７０、もしくは８０のギャップウェイト、１、２、３、４、５、もしくは６のレングスウェイトを使用する。別のアプローチにおいて、２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の同一性％は、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９）））のアルゴリズムを用いて決定され、このアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれ、ＰＡＭ１２０重量残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップレングスペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用する。
【００４１】
特定のＭｕｔＳタンパク質、ＲｅｃＡタンパク質またはＳＳＢタンパク質の核酸配列またはタンパク質列を、さらに、「問い合わせ配列」として用いて、公のデータベースに対する検索を実行して、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連する配列を同定し得る。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実行され得る。比較目的のためのギャップアライメントを得るために、ギャップＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されるように利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴを用いる場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーターを使用し得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。例えば、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長＝１２）を使用して実行し、問い合わせＭｕｔＳコード核酸配列、問い合わせＲｅｃＡコード核酸配列または問い合わせＳＳＢコード核酸配列に相同なヌクレオチド配列を獲得し得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（好ましくは、スコア＝５０、ワード長＝３に設定）を使用して実行し、問い合わせＭｕｔＳタンパク質分子、問い合わせＲｅｃＡタンパク質分子または問い合わせＤＮＡタンパク質分子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の野生型配列）に相同なアミノ酸配列を獲得し得る。
【００４２】
従って、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭｕｔＳタンパク質、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質またはＥ．ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質の好ましいホモログは、まず第１に、ネイティブのＥ．ｃｏｌｉ ＭｕｔＳ（またはＲｅｃＡまたはＳＳＢ）の機能的活性を有するか、または、上記のようなネイティブのタンパク質を超える改善された活性さえも有する。好ましいホモログはまた、上記のように測定した場合、ネイティブのＥ．ｃｏｌｉタンパク質と、少なくとも約２０％（アミノ酸レベル）、好ましくは、少なくとも約４０％、さらに好ましくは、少なくとも約６０％、さらにより好ましくは、少なくとも約７０％、さらにより好ましくは、少なくとも約８０％、およびさらによりこのましくは、少なくとも約９０％の配列類似性を共有する。
【００４３】
異なる細菌由来の少なくとも６５個のＲｅｃＡ遺伝子がクローン化され、そして配列決定された（Ｓａｎｄｌｅｒ，ＳＪら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２４：２１２５−２１３２（１９９６）；Ｒｏｃａ，ＡＩら、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５：４１５−４５６（１９９０）；Ｅｉｓｅｎ，ＪＡ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．４１：１１０５−１１２３（１９９５）；Ｌｌｏｙｄ，ＡＴら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３７：３９９−４０７（１９９３））。ＲｅｃＡホモログ（ＲａｄＡとして公知）は、３つの始原種（ａｒｃｈａｅａｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）において同定されている（Ｓａｎｄｌｅｒら、前出；；Ｓｅｉｔｚ，ＥＭら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２：１２４８−１２５３（１９９８））。ＲｅｃＡの真核生物ホモログは、試験された全ての真核生物種において同定されており；原形の真核生物ＲｅｃＡホモログは、酵母Ｒａｄ５１タンパク質である（Ｓｅｉｔｚら、前出；Ｂｉａｎｃｏ，ＰＲら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ Ｂｉｏｓｃｉ．３：５７０−６０３（１９９８））。従って、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲｅｃＡの任意のホモログ（これは、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質のように、遺伝子組み換えの開始のためのＤＮＡフィラメント、ならびにインビボまたはインビトロで変異または進化された任意の機能的形態を形成する）は、本発明の範囲内に含まれる。
【００４４】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＭｕｔＳホモログの例は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＭｕｔＳタンパク質（Ｌｕら、前出；Ｈａｂｅｒ，ＬＴら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：１９７−２０２（１９８８）；Ｐａｎｇ，ＰＰら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６３：１００７−１０１５（１９８５））；およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＨｅｘＡタンパク質（Ｐｒｉｅｂｅ ＳＤら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：１９０−１９６（１９８８）；Ｈａｂｅｒら、前出）である。さらに、ＭｕｔＳまたはＨｅｘＡの真核生物ホモログ（例えば、酵母ＤＮＡ、ヒトＤＮＡ、マウスＤＮＡ、カエルＤＮＡまたはハムスターＤＮＡにおいて同定されたホモログ配列によりコードされるホモログ）もまた、用いられ得る（Ｓｈｉｍａｄａ，Ｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２０１７１（１９８９）；Ｌｉｎｔｏｎ，Ｊ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３０５８−３０７２（１９８９）；Ｆｕｊｉｉ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１００５７（１９８９））。原核生物種のＭｕｔＳホモログと真核生物種のＭｕｔＳホモログとの間の相同性は、Ｒｅｅｎａｎ，ＲＡら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３２：９６３−９７３（１９９２）に例証され、ここで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭｕｔＳヌクレオチド配列は、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＭｕｔＳ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｈｅｘＡ、マウスＲｅｐ−１、およびヒトＤＵＣ−１に対して、ある領域において、非常に相同であることが示されている。ＭｕｔＳのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（酵母）ホモログ（ＭＳＨ１およびＭＳＨ２と命名される）のクローニングを首尾良く導くＰＣＲプライマーは、この相同性に基づいていた。Ｒｅｅｎａｎら（前出）は、酵母ＭＳＨ１と、酵母ＭＳＨ２と、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭｕｔＳホモログと、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＭｕｔＳホモログと、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＭｕｔＳホモログとの間のアミノ酸配列相同性を示した。Ｎｅｗ，Ｌら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３９：９７−１０８（１９９３）は、別の酵母遺伝子（ＭＳＨ３）を開示し、これは、真核生物ＭｕｔＳのホモログであり、そしてＭｕｔＳと、ＨｅｘＡと、マウスＲＥＰ−３との間で最も保存された配列を示す。この配列相同性に基づく新規の酵母遺伝子についての検索は、酵母ＭＳＨ３の発見を導いた。Ｆｉｓｈｅｌ，Ｒら、Ｃｅｌｌ ７５：１０２７−１０２９（１９９３）は、ＰＣＲのためにＲｅｅｎａｎら（前出）により記載される他のＭｕｔＳホモログ由来の相同配列を用いる、別のヒトＭｕｔＳホモログ（ｈＭＳＨ２）のクローニングを記載した。
【００４５】
従って、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭｕｔＳの任意のホモログ（これは、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質のように、ＤＮＡミスマッチ（一塩基ミスマッチまたは数個の不対塩基）、およびインビボまたはインビトロで変異または進化された、任意の機能的形態のバージョンを認識する）は、本発明の範囲内に含まれる。
【００４６】
ＭｕｔＳおよびＲｅｃＡの両方はインビトロで機能する。ＭｕｔＳは、Ｇｅｎｅ Ｃｈｅｃｋ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＭＢＰ）変異検出技術（これは、現在、スクラピー感受性についてヒツジを遺伝子型決定するために市販されている）（Ｗａｇｎｅｒら、前出；Ｄｅｂｂｉｅら、前出；米国特許第６，０２７，８７７号、同第６，１１４，１１５号、同第６，１２０，９９２号、同第６，３２９，１４７号（これらの全ては、その全体が本明細書中で参考として援用される））の基準である。
【００４７】
ＲｅｃＡは、１５ヌクレオチド程度の短い配列ストレッチの沿って、インビトロで、３本鎖構造を形成する（Ｆｅｒｒｉｎら、１９９１、前出）。ＲｅｃＡおよびＭｕｔＳの活性を合わせることで、最も強力な変異／一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）検出系を作製し、この系において、ＲｅｃＡをコートしたｓｓＤＮＡは、試験ｄｓＤＮＡの事前の変性を必要とせずに、３本鎖（または「Ｄループ」）構造の形成を触媒する。Ｄループは、プローブＤＮＡおよび試験ＤＮＡの配列が同一ではない場合、ミスマッチまたは不対塩基を含む。これらのミスマッチ塩基または不対塩基は、ＭｕｔＳ（または、任意の種由来の任意のＭｕｔＳホモログもしくは任意の他のミスマッチ結合タンパク質）により認識され得る。ＭｕｔＳ結合は、Ｄループ構造を安定化する。従って、ＭｕｔＳとＲｅｃＡ媒介Ｄループ形成との組合わせは、（このようなＤループがミスマッチ塩基または不対塩基を含む場合）、非常に小さく安定なＤループの形成を可能にし、次いで、これは、変異およびＳＮＰについて短いＤＮＡ間隔の分離実験、ならびに既知（および未知）の変異およびＳＮＰについての小スケールスキャニングを可能にする。このような試験は、上記で引用される米国特許第５，２７３，８８１号および同第５，６７０，３１６号に、示唆も支持もされていない。
【００４８】
混合型「ＲｅｃＡ／ＭｕｔＳ」法を、種々のプラットホームと共に用い得る。これらのプラットホームのいくつかは、試験ＤＮＡのＰＣＲ増幅の必要なしに、変異／ＳＮＰ検出を可能にする。
【００４９】
（ＭｕｔＳ−ＲｅｃＡ共存のフローサイトメトリー検出を用いるＲｅｃＡ／ＭｕｔＳシステム）
１つの好ましい実施形態では、本発明のシステムは、以下を使用する：（１）標識したＲｅｃＡおよび標識したＭｕｔＳ；（２）フローサイトメトリーによる検出のために、検出可能に標識されている、特異的プローブオリゴヌクレオチド；および（３）標識のフローサイトメトリー検出。
【００５０】
プローブ特異性は、プローブの配列に由来する。プローブは、挿入の部位もしくは領域および隣接領域の、「正常」または野生型の非多型配列に相補的であるように設計されている。変異または多型が存在する場合、プローブ／試験ヘテロ二重鎖は、１または数個の誤対塩基または不対塩基を含む。変異または多型の非存在下で、プローブ／試験ヘテロ二重鎖は、完全に対合する。
【００５１】
ＲｅｃＡフィラメントおよび試験ＤＮＡにより形成されたＤループの形成または安定化は、さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質または別の種由来のこのタンパク質のホモログの添加によってか、あるいはテンプレートとして試験ＤＮＡを用いるプローブＤＮＡの伸長を、ＤＮＡポリメラーゼにより触媒させることによって、増強され得る。
【００５２】
この方法では、変異およびＳＮＰの検出は、（ａ）ＲｅｃＡおよびＭｕｔＳか、（ｂ）プローブＤＮＡおよびＭｕｔＳか、または（ｃ）ＲｅｃＡ、ＭｕｔＳおよびプローブＤＮＡのいずれかの共存の検出により達成される。あるいは、標識したＳＳＢまたはホモログを用いて、一本鎖部分に結合させることにより、Ｄループ構造を標識し得る。この場合、ＳＳＢシグナルとＭｕｔＳシグナルの共存は、Ｄループの二重鎖部分における１つ以上のミスマッチ塩基または不対塩基の存在を示す。
【００５３】
ＤＮＡプローブは、任意の長さであり得るが、好ましくは、約３０〜６０塩基長のオリゴヌクレオチド、より好ましくは、合成オリゴヌクレオチドであり得る。
【００５４】
プローブは、特定の変異または多型に特異的であるか、または既知または未知の変異またはＳＮＰの存在について試験されている特定の遺伝子領域に特異的である。
【００５５】
試験ＤＮＡは、（染色体全体までの）任意の長さであり得、そしてゲノムＤＮＡもしくはプラスミドＤＮＡか、またはＰＣＲアンプリコンのいずれかであり得る。
【００５６】
ＭｕｔＳタンパク質、ＲｅｃＡタンパク質およびＳＳＢタンパク質の標識は、種々の十分に確立された方法を介して達成され得る：タンパク質は、以下を含むが、これらに限定されない、発蛍光団または蛍光標識で直接標識され得る：フルオレセイン（および誘導体）、６−Ｆａｍ、Ｈｅｘ、テトラメチルローダミン、シアニン−５、ＣＹ−３、アロフィコシアニン、ルシファーイエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ ｙｅｌｌｏｗ）ＣＦ、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、ローダミン、Ｔａｍｒａ、ＲｏｘおよびＤａｂｃｙｌ。間接標識は、例えば、（例えば、発蛍光団を用いて）標識され得るＭｕｔＳまたはＲｅｃＡに特異的な、「一次」抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を利用する。あるいは、一次抗ＭｕｔＳ抗体および抗ＲｅｃＡ抗体に特異的な、二次抗体（例えば、抗アイソタイプ抗体のような抗免疫グロブリン）が、（例えば、発蛍光団を用いて）標識され得る。
【００５７】
別の実施形態では、タンパク質（ＭｕｔＳまたはＲｅｃＡ、一次抗体または二次抗体）が、ビオチン化される。次いで、ビオチンは、蛍光性のアビジン（またはストレプトアビジン）により結合される。あるいは、ストレプトアビジン（これは多価である）は、初めに、ビオチン化されたタンパク質のビオチンに結合され得、次いで、他の蛍光標識されたビオチン化化合物に結合され得る。このタンパク質は、蛍光性マイクロビーズ、または異なる検出可能な標識に付着されているマイクロビーズに付着され得る。蛍光性マイクロビーズへのタンパク質の付着は、以下が挙げられるが、これらに限定されない、当該分野で周知の任意の方法によってであり得る：ポリスチレンビーズまたは他のビーズへの直接吸着、カルボキシル基、アミノ基、トシル基または他の基を介する共有連結、ビオチン／アビジンもしくはストレプトアビジン相互作用を介する結合（タンパク質のビオチン化を必要とする）、および固定された抗体への結合。標識されたビーズへＭｕｔＳを付着させることによる、ＭｕｔＳの標識は、固定化（Ｗａｎｇｅｒら、前出；Ｄｅｂｂｉｅら、前出）と機能的に等価であり、従って、ＭｕｔＳがニトロセルロースまたはポリエステルに固定される場合に観察される効果に類似する、ＭｕｔＳ（または他のミスマッチ結合タンパク質）機能を増強する。
【００５８】
（ＲｅｃＡの標識の代わりに、またはＲｅｃＡの標識に加えて）ＭｕｔＳおよびＤＮＡプローブを標識することもまた可能である。このプローブは、発蛍光団またはビオチンもしくはジゴキシゲニンのような化合物を用いて直接標識され得、そして従来の方法により付加物を検出し得る。このプローブは、蛍光の測定、色の発光の測定、または選択された標識に適切な任意の他の方法により検出される。
【００５９】
シグナル増幅は、例えば、（ａ）標識二次抗体または（ｂ）アビジンコートマイクロビーズもしくはストレプトアビジンコートマイクロビーズを、ビオチン標識プローブに結合するために使用することによって、導入され得る。これは、例えば、結合された複数のビオチン化プローブを生じ、これらの複数のビオチン化プローブは、（このプローブ／試験ＤＮＡ複合体が１つ以上のミスマッチまたは不対塩基を含む場合）ＭｕｔＳ分子により結合され、それにより、そのシグナルが非常に増大する。
【００６０】
この手順は、このプローブを、ＲｅｃＡフィラメント、Ｄループまたは三本鎖構造の形成に適切な条件下で、ＲｅｃＡ、ＭｕｔＳおよび試験ＤＮＡと混合することによって、実行される。ＲｅｃＡフィラメント形成は、例えば、ＭｇＣｌ２または酢酸Ｍｇ（１〜４ｍＭ）、ジチオスレイトール（０．２〜０．５ｍＭ）、およびＡＴＰまたはＡＴＰ［γ−Ｓ］（０．３〜１．５ｍＭ）を含む、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液またはＴｒｉｓ−アセテート緩衝液（２０〜４０ｍＭ、ｐＨ７．４〜７．９）中で達成され得る。ＡＴＰが使用される場合、ホスホクレアチンおよびクレアチンキナーゼからなるＡＴＰ再生系が、含まれ得る。ＲｅｃＡおよびプローブは、一般的に、モル比０．１〜３（ヌクレオチドに対するＲｅｃＡ）で添加される。このプローブが二本鎖である場合、このプローブは、ＲｅｃＡコーティングの前に、変性されていなければならない。インキュベーションは、室温（好ましくは３７℃）で、５〜３０分間行われる。Ｄループ形成および三本鎖構造の形成は、二本鎖ＤＮＡにＲｅｃＡフィラメントを添加する工程、および好ましくは３７℃にて、約１５分〜約２時間インキュベートする工程を包含する。単一の反応容器中でＲｅｃＡフィラメントを形成し、そしてホモロジー検索を行うこともまた、可能である。すなわち、同時に、ＲｅｃＡをオリゴヌクレオチドおよび二本鎖ＤＮＡと混合することをもまた、可能である。例えば、Ｒｉｇａｓら（前出）；Ｈｏｎｉｂｅｒｇ，ＳＭら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３：９５８６−９５９０（１９８６）；Ｆｅｒｒｉｎらの刊行物（前出）のいずれかを参照のこと。
【００６１】
ＭｕｔＳによるミスマッチ結合は、ＲｅｃＡまたはＲｅｃＡフィラメントが添加される時またはその前に、そのＭｕｔＳを二本鎖試験ＤＮＡに添加することによって、達成される。ＭｕｔＳは、溶液中であり得るかまたは固定され得る。一般的に、０．１ｎｇ〜０．５μｇのＭｕｔＳが添加される。例えば、Ｌｉｓｈａｎｓｋｉら（前出）；Ｗａｇｎｅｒら（前出）；Ｄｅｂｂｉｅら（前出）；米国特許第６，０２７，８７７号；同第６，１１４，１１５号；同第６，１２０，９９２号；同第６，３２９，１４７号；Ｇｉｆｆｏｒｄの米国特許第５，７５０，３３５号；Ｊｉｒｉｃｎｙら（前出）を参照のこと。
【００６２】
ＲｅｃＡフィラメントによるホモロジー検索およびＭｕｔＳによるミスマッチ塩基または不対塩基の結合を可能にするようにインキュベーションした後、その混合物は、好ましくは、蛍光標識の場合はフローサイトメトリーによって分析される。このフローサイトメーターは、（ＭｕｔＳ上の標識ならびにＲｅｃＡおよび／またはプローブ上の標識の）両方の標識が同時に存在すること、またはその２つ（もしくは３つ）の標識が並置することにより生じる「第３の」色が存在することを、シグナルとして検出するように設定される。このようなシグナルの存在は、１個または２〜３個のミスマッチもしくは不対塩基によって、そのプローブとは異なる配列がそのサンプル中に存在することの指標である。
【００６３】
本明細書中に記載されるＲｅｃＡ／ＭｕｔＳ法の能力は、そのバックグラウンドシグナルが非常に低いこと、そしてＲｅｃＡコートオリゴヌクレオチドプローブが、ミスマッチ塩基または不対塩基とヘテロ二重鎖を生じる様式で試験ＤＮＡに結合している条件下でのみ、ＲｅｃＡ＋ＭｕｔＳ（またはＭｕｔＳ＋ＤＮＡプローブまたはＭｕｔＳ＋ＲｅｃＡ＋ＤＮＡプローブ）が、一緒に見出されることである。
【００６４】
ＭｕｔＳは、その試験ＤＮＡ中で見出される他のミスマッチに結合すると予測されるが、これらは、稀であるはずである。この方法において、その試験ＤＮＡが決して変性およびアニールをしていないので、このことは、稀である。試験ＤＮＡの変性およびアニーリングは、現行のＭｕｔＳベースの変異欠失技術の力を失わせ得るプロセスであり、それは、相同（またはほぼ相同）なＤＮＡのアニーリングにより、そしてミスマッチ含有二次構造を形成し得るｓｓＤＮＡ領域を生じる不完全アニーリングにより生成される、ランダムミスマッチが原因である。ＲｅｃＡは、そのサンプル中のすべてのｓｓＤＮＡをコートする能力を有するが、上記の理由から、ｓｓＤＮＡストレッチは、非常に稀である。
【００６５】
目的の配列は、一般に、染色体１つあたり１つだけ存在する。従って、ＲｅｃＡ−ＭｕｔＳ並置またはプローブＤＮＡ−ＭｕｔＳ並置の各々の出現を検出するためのフロー条件を設定することは、簡単な問題である。ランダムなＭｕｔＳ結合を（これが生じる場合に）克服するために、ＤＮＡフラグメントのサイズが、剪断またはヌクレアーゼ消化によって、減少され得る。この減少の効果は、そのプローブとＲｅｃＡとが結合する同じフラグメント中のランダムなＭｕｔＳ結合の可能性を最小にすることである。
【００６６】
本発明の一般的に適用可能な別の実施形態において、２つの相補的ＤＮＡプローブが、１つのＤＮＡプローブの代わりに使用され得る。これらのプローブは、好ましくは、その試験ＤＮＡに添加される前に、それらの自己アニーリングを最小にするために、ＲｅｃＡと別々に予めコートされる。これらの２つの相補的ｓｓＤＮＡプローブは、目的の領域中の試験ＤＮＡの両方の鎖に結合し、それにより、（１）プローブ長の二重の二重鎖を形成することによりＤループ構造を安定化することを補助し；（２）すべての変異体対合／野生型対合（ＧからＣへのまたはＣからＧへのトランスバージョンから生じる対合を含む）の検出を確実にし；そして（３）シグナル（特に、ほとんど認識されないミスマッチからのシグナル）を増大させる。上記（２）における認識を確実にすることは、特に重要である。なぜなら、Ｃ：Ｃミスマッチは、インビボでも、今日までに開発されたいかなるミスマッチ検出法において検出されず、一方、その逆のＧ：Ｇミスマッチは、常に十分に検出されるからである。本発明者らおよびその同僚らは、単一のヘテロ二重鎖フラグメント中のミスマッチの数を増加させると、ＭｕｔＳによる結合を増加させ、そして二重の二重鎖構造中の各二重鎖領域が、１つのミスマッチを含むことを、発見した。
【００６７】
本発明の一般的に適用可能な別の実施形態において、ＭｕｔＳは、固定され得、そしてプローブまたはＲｅｃＡのいずれかが、検出可能に標識され得る。本実施形態において、固定されたＭｕｔＳへのプローブまたはＲｅｃＡの結合は、そのプローブと試験ＤＮＡとの間に形成されるＤループ構造における１つ以上のミスマッチまたは不対塩基を示す。
【００６８】
一般的に適用可能な別の実施形態において、試験ｄｓＤＮＡが固体支持体に固定され、上記のように標識することによって、変異およびＳＮＰの検出が可能になる。ここで、好ましい試験ＤＮＡは、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡである。増幅されたＤＮＡの固定は、プライマーの１つにある５’標識（例えば、ビオチン）またはカルボキシル基もしくはアミノ基を使用することによって、達成され得る。５’ビオチン標識を含む増幅されたＤＮＡは、アビジン結合またはストレプトアビジン結合を介して、固体支持体に固定され得る。プローブＤＮＡは、ＲｅｃＡでコートされ、そして固定されたＤＮＡと混合されるか、または、固定前に、三本鎖構造形成またはＤループ構造形成を可能にする条件下でこのＤＮＡと混合される。標識ＭｕｔＳまたはホモログが、三本鎖構造形成またはＤループ構造形成の前、後、または間のいずれかで、添加される。固定されたＤＮＡへのＭｕｔＳ（またはそのホモログ）の結合は、三本鎖構造形成またはＤループ構造形成中の１つ以上のミスマッチまたは不対塩基の存在を示す。この実施形態は、理想的には、マイクロアレイ（ＤＮＡチップ）適用における使用に適切である。
【００６９】
一般的に適用可能な別の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、Ｒｉｇａｓら（前出）におけるようなプローブ／試験複合体の固定を可能にするための５’付加物を備えて調製される。この付加物は、このオリゴヌクレオチドの特異的検索を可能にする、ビオチン部分、特異的オリゴヌクレオチドまたは他の任意の付加物であり得る。このプローブは、ＲｅｃＡフィラメントを形成するようにＲｅｃＡと混合され、その後、特異的Ｄループ構造を形成するように試験ＤＮＡと混合される。このプローブは、検出可能なさらなる標識を含み得るか、またはＤループ構造形成後に、標識ヌクレオチド三リン酸もしくは標識ヌクレオチド三リン酸アナログを使用して、アニールしたオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼにより伸長させることによって、標識され得る。この場合、Ｄループ構造を形成するオリゴヌクレオチドのみが標識され、このことは、さらなるどんなバックグラウンドシグナルさえも減少させる。さらなる特異性が、ヌクレオチドターミネーター（例えば、ジデオキシヌクレオチド三リン酸またはアシクロヌクレオチド三リン酸）を４つすべてのターミネーターの混合物中で使用することによって得られ得、この混合物において、標識は、そのオリゴヌクレオチドの３’末端を超えて試験ＤＮＡ中の最初の塩基と相補的であるターミネーターとのみ結合されている。
【００７０】
そのオリゴヌクレオチドの５’標識は、任意の固体支持体にＤループ構造を固定するために使用され得る。ＭｕｔＳ標識と、そのオリゴヌクレオチドの３’標識との結合は、Ｄループ領域中の１つ以上のミスマッチまたは不対塩基の存在を示し、そして試験ＤＮＡ中の特異的配列の存在または非存在を診断する。その固体支持体がマイクロタイタープレートである場合、オリゴヌクレオチドシグナルに対するＭｕｔＳシグナルの比は、試験ＤＮＡの遺伝子型の特徴である。例えば、非常に高い比（広範なＭｕｔＳ結合）は、そのプローブと異なる配列を有する試験遺伝子型についてのホモ接合性を示し、そのＤループ中のヘテロ二重鎖は、ミスマッチまたは不対塩基を含む。低い比（ＭｕｔＳ結合がほとんどないかまたはない）は、そのプローブと同一の配列を有する試験遺伝子型についてのホモ接合性を示し、Ｄループ中のヘテロ二重鎖は、完全に対合している。中間の比（上記高い比の約半分）は、ヘテロ接合性遺伝子型を示し、Ｄループ中のヘテロ二重鎖の約半分が完全に対合しており、そして半分が、ミスマッチまたは不対塩基を含む。
【００７１】
臨床診断に本発明の方法を適用する際、少量の血液サンプルを用いて複数のアッセイを実施することが可能である（なぜなら、１μｌの血液は、約１０４コピーの各配列を含むからである）。検出される配列について、サンプル中のポジティブシグナルの数は、その遺伝子型の指標である。なぜなら、低いシグナルまたはシグナルがないことは、そのサンプルが、そのプローブと完全に相補的である配列についてホモ接合性であることを示すからである。非常に高いシグナルは、（ＭｕｔＳまたはそのホモログの認識特性により決定した場合に）１つもしくは２〜３個の一ヌクレオチド置換または１つもしくは２〜３個の不対塩基だけそのプローブと異なる配列についての、ホモ接合性を示す。中間のシグナルは、目的の配列についてのヘテロ接合性を示す。
【００７２】
慣用的変異検出のために、標準物（すなわち、既知の遺伝子型）が、遺伝子型決定のための標準曲線を提供するために、試験サンプルの各バッチとともに使用される。当然、標準曲線形成および遺伝子型決定は、試験ＤＮＡの正確な定量に依存する。従って、ＲｅｃＡ触媒されるＤループ形成、ＭｕｔＳ結合およびフローサイトメトリーシグナル検出が、すべて効率的であり、その結果、例えば、５，０００個〜２０，０００個の配列が、遺伝子型決定のために十分である場合、１０００個以上の多さの別個のアッセイが、１ｍｌの血液に対して実施され得る。
【００７３】
この技術は、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、または増幅されたＤＮＡの単一サンプル中のいくつかの部位が同時に質問される多重化に、理想的には適切である。この適用において、個々のプローブ＋試験ＤＮＡ（Ｄループ構造または三本鎖構造）が、多くのプローブと試験ＤＮＡとの混合物から別個に単離されるのを可能にする付加物（最も好ましくは、５’オリゴヌクレオチド付加物）を用いて設計される。５’オリゴヌクレオチドが使用される場合、単離は、固定された相補的配列のオリゴヌクレオチドにこの特異的オリゴヌクレオチド付加物をアニーリングさせる工程を包含する。検出のためのプローブ標識は、その単離部分からそのプローブの反対側の３’末端に付加され得るか、またはその反応の間にポリメラーゼにより付加され得る（下記を参照のこと）。
【００７４】
各フローサイトメトリーを実行した後に単一のサンプルを脱保護することによって、その単一のサンプルに対して複数の連続試験を実行することもまた、可能である。ＲｅｃＡおよびＭｕｔＳの除去は、三本鎖構造すべてが離れることを引き起こす。その後、このオリゴヌクレオチドプローブは、そのサンプルをミニＤＮＡ結合カラム（これは、短いオリゴヌクレオチドを保持しない）に通すことによって、除去され得る。その後、この試験ＤＮＡは、新しいプローブを用いて、プロセス全体を通して再利用され得る。このプロセス全体は、当該分野で周知の方法および技術を使用して、容易に自動化され得る。
【００７５】
（固定されたＭｕｔＳと組み合わされたＲｅｃＡ／ＭｕｔＳシステムの例）
ＲｅｃＡは、試験ＤＮＡの変性を必要とすることなく、ヘテロ二重鎖の形成を容易にするので、本発明のＲｅｃＡ／ＭｕｔＳシステムは、ヘテロ二重鎖ＤＮＡの形成に依存する実質的にすべての変異／ＳＮＰ検出方法を強化するものとして使用され得る。これは、以下を含む：（１）ゲルシフトアッセイ、（２）フィルター結合アッセイ、（３）ミスマッチ切断アッセイ、および（４）固定化ミスマッチ結合タンパク質（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＭＢＰ））アッセイ。本発明者らのうちの一人によって開発されたＩＭＢＰアッセイは、標識されたプローブＤＮＡとＭｕｔＳ（固定化）とを含む、本発明のＲｅｃＡ／ＭｕｔＳシステムの構成要素を利用する。
【００７６】
しかし、最も首尾良いＩＭＢＰアッセイ形式は、試験ＤＮＡ（一般的には、ＰＣＲアンプリコン）と等しい長さのプローブを必要とする。ＲｅｃＡ／ＭｕｔＳシステムとＩＭＢＰアッセイとを組み合わせることによって、以下が達成される：（１）試験ＤＮＡを変性させる必要性を排除する、（２）以前のＩＭＢＰアッセイ形式で使用可能であった長さよりも長いＰＣＲ産物の使用を可能にする、（３）長いプローブ（これは一般的に、クローン化された配列のＰＣＲ増幅によって生成される）を、より短い合成オリゴヌクレオチドプローブと置換することを可能にする、および（４）短いオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせを使用することによって、単一のＰＣＲ産物がその配列に沿っていくつかの異なる部位で試験されることを可能にする。
【００７７】
試験ＤＮＡのＰＣＲ増幅を必要とする変異検出アッセイを悩ませる１つの主な問題は、増幅の間における誤りの導入である。ＰＣＲは、インビボでのＤＮＡ複製と比較した場合に、低忠実度のプロセスであることが周知である。各増幅サイクルにおいて導入される誤りは、プロセス全体を通して増大され、そして一般的にその誤りは無作為な位置に導入されるので、それらの誤りはすべて、ＰＣＲアンプリコンが変性およびアニールされる場合にミスマッチを形成する。「フラグメントあたりの誤り」の数は最も関心の高いところであり、かつ所定のフラグメントにおける誤りの可能性は明らかにフラグメントの長さに依存するので、ＰＣＲの誤りの頻度は、変異検出アッセイにおいて使用され得るＰＣＲフラグメントの長さを制限する。
【００７８】
本発明のＲｅｃＡ／ＭｕｔＳシステムは、試験ＤＮＡを増幅または変性する必要性を完全に排除することによって、ＰＣＲの誤りに関するこれらの懸念を最小化するかまたは排除する。従って、増幅が使用される場合であっても、アッセイに影響を及ぼす誤りは、最終的なＰＣＲサイクルにおいて作製される誤りのみである（なぜなら、初期の誤りは最終的なＰＣＲサイクルにおいて正確にコピーされ、そしてその後には、その分子は変性されないからである）。さらに、試験ＤＮＡにアニールするプローブは、多数のミスマッチまたは不対塩基を導入しない。なぜなら、本発明のプローブは、好ましくは非常に短い（すなわち、約２０〜６０ヌクレオチド）からである。
【００７９】
上記の条件は、ＲｅｃＡ／ＭｕｔＳ方法をＩＭＢＰアッセイに適用する場合に使用される。プローブは、任意の長さのものであり得、そして任意の供給源に由来するものであり得るが、好ましくは、約２０〜６０ヌクレオチドの長さの合成オリゴヌクレオチドまたは一対の相補的オリゴヌクレオチド（上記を参照のこと）である。また、プローブは、（１）特定の変異もしくは多型に特異的であるか、または（２）既知もしくは未知の単一ヌクレオチド多型の存在について試験される特定の領域に特異的である。
【００８０】
一対のプローブが使用される場合（上記を参照のこと）、それらのプローブは、好ましくは、ＲｅｃＡと個々に混合される。ＲｅｃＡフィラメントの形成は、試験ＤＮＡの存在下においてかまたは試験ＤＮＡとの混合前のいずれかにおいて起こることが可能とされる。
【００８１】
試験ＤＮＡは、任意の供給源由来であり得、好ましくは、ゲノムＤＮＡまたはＰＣＲ増幅されたＤＮＡであり得る。
【００８２】
Ｄループ（または、一対の相補的プローブを使用する場合には二本の二重鎖）は、固定されたＭｕｔＳ（または他のＭＢＰ）と混合される前に（または、ＭｕｔＳ（または他のＭＢＰ）の存在下において）、形成され得る。固定は、任意の固体支持体または担体に対してであり得る。「固体支持体」または「担体」とは、タンパク質を結合し得、そして同時にそのタンパク質を解離せずに洗浄することを可能にし得る、任意の支持体を意図する。周知の支持体または担体としては、天然のセルロース、改変されたセルロース（例えば、ニトロセルロース）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリビニリデンジフルオリド、デキストラン、ナイロン、ポリアクリルアミドおよびアガロース、またはＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。磁気ビーズもまた有用である。支持体材料は、固定されたＭＢＰが標的核酸分子に結合し得る限りにおいて、実質的にすべての可能な構造的構成を有し得る。従って、支持体の構成としては、微粒子、ビーズ、多孔性および不透過性の細片（ｓｔｒｉｐ）および膜、反応容器（例えば、試験管およびマイクロタイタープレート）の内部表面などが挙げられ得る。当業者は、ＭＢＰを結合するための多くの他の適切な担体を知り、または慣用的な実験によってこれらを確認し得る。
【００８３】
上記のように、ＳＳＢタンパク質は、必要に応じて、Ｄループの形成を容易にするため、およびＤループの安定性を増大させるために使用される。上記で示したように、ＭｕｔＳは、ミスマッチまたは不対塩基を含むＤループ構造を安定化する。
【００８４】
ＭｕｔＳ結合ＤＮＡの検出は、通常、標識されたプローブを使用することによって達成される。プローブは、任意の標識方法（上記の方法を含む）によって調製される、任意の発蛍光団、発色団、放射性核種、または発光体（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）で標識され得る。プローブの標識化はまた、標識されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを使用する、Ｄループ構造におけるオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ媒介性伸長によって達成され得る。ＲｅｃＡの標識化（特に、標識化抗ＲｅｃＡ抗体を介した標識化）はシグナルを増幅し、その結果ゲノムＤＮＡは、事前の増幅をせずに試験され得る。
【００８５】
ＲｅｃＡ／ＭｕｔＳ方法の能力を誇張することは難しい。ＲｅｃＡ／ＭｕｔＳ方法は、迅速であり、少量のサンプルで動作し、そして診断的な遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）および変異／ＳＮＰ検出のための臨床的適用に容易に適合され得る。おそらく、本発明の最も重要な際立つ利点は、ＤＮＡ増幅（すなわち、ＰＣＲ）からのその完全な独立である。
【００８６】
（キット）
本発明はまた、本明細書中に記載した方法を実施するために有用なキットまたは試薬系に関する。このようなキットは、本明細書中に開示された方法に従うアッセイを行うために必要とされる必須の要素を含む、試薬の組み合わせを含む。試薬系は、商業的にパッケージングされた形態においてか、試薬の適合性を可能にする組成物もしくは混合物としてか、試験デバイス構成においてか、またはより代表的には、試験キット（すなわち、必要な試薬を保持する、１つ以上の容器、デバイスなどのパッケージングされた組み合わせ）として提示され、そして通常は、アッセイの実施についての書面での説明書を備える。本発明のキットは、本明細書中に記載された種々のアッセイ形式を実施するために任意の構成および組成を含み得る。
【００８７】
ＲｅｃＡ、ＭｕｔＳ、ならびに適用可能な場合には、抗体および／またはＳＳＢを含むキットは、本発明の範囲内である。１つの実施形態では、本発明のキットは、特定の変異および／または多型、あるいは標的ＤＮＡの特定領域における変異および／または多型の検出を可能にするように設計され、（ａ）選択された変異および／または（ｂ）ＳＮＰ、あるいは（ｃ）標的ＤＮＡの特定の領域（１つまたは複数）（既知または未知の任意の変異または多型について、領域を走査することを可能にするため）に対して特異的なオリゴヌクレオチドまたは他のプローブを備える。プローブは、上記のように標識され得る。キットはまた、以下を備える：標識されたＭｕｔＳ、またはＭｕｔＳの検出を可能にする抗体（これは、固体支持体もしくは担体に固定され得るか、または別個の担体と固定化可能な形態で提供され得る）；ＲｅｃＡ（これは、標識され得る）；ならびに、適切な緩衝液および試薬の複数の容器。
【００８８】
別のキットは、エンドユーザーが、変異および／または多型の検出についてそれらの独自のプローブを設計することを可能にするようにか、またはエンドユーザーの選んだＤＮＡ領域を走査することを可能にするように設計され；このようなキットは、プローブＤＮＡを除く上記のすべての試薬を備える。
【００８９】
上記で引用された参考文献はすべて、詳細に援用されたか否かは別として、本明細書中で参考として援用される。
【００９０】
ここで本発明を完全に記載したが、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、そして過度な実験を伴わずに、同じことが広範な等価なパラメーター、濃度および条件において実施され得ることが当業者によって理解される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、種々の検出様式を含むＲｅｃＡ＋ＭｕｔＳ変異／ＳＮＰ検出方法の概略図である。図１は、工程（１）においてＲｅｃＡ（○）タンパク質が添加されるオリゴヌクレオチド「プローブ」を示す。ＲｅｃＡは、このプローブを被覆し、「ＲｅｃＡフィラメント」を形成する。工程（２）において、ＲｅｃＡフィラメントが試験ＤＮＡに添加され、三重鎖構造または「Ｄループ」構造の形成を可能にする。工程（３）において、ＭｕｔＳタンパク質が添加される。このプローブが試験ＤＮＡ配列に同一である場合、完全に対を形成した二重鎖（「ミスマッチなし」）が形成され、そしてＭｕｔＳは結合しない（左）。プローブと試験ＤＮＡ配列との間に１つ以上の配列差異が存在する場合、１つ以上のミスマッチまたは対を形成していない塩基（「ミスマッチ（ＳＮＰ）」）を含むヘテロ二重鎖が形成され、そしてＭｕｔＳは、このヘテロ二重鎖に結合する。
【図２】図２は、種々の検出様式を含むＲｅｃＡ＋ＭｕｔＳ変異／ＳＮＰ検出方法の概略図である。図２は、工程（３）の後に形成される最終複合体を示す。ここで、プローブおよびＭｕｔＳｎｏ両方が、標識される。×＝プローブ標識。星印＝ＭｕｔＳ標識。
【図３】図３は、種々の検出様式を含むＲｅｃＡ＋ＭｕｔＳ変異／ＳＮＰ検出方法の概略図である。図３は、ＭｕｔＳが標識され（星印）そしてＲｅｃＡが標識された（＊）場合の、工程（３）の後に形成される最終複合体を示す。
【図４】図４は、種々の検出様式を含むＲｅｃＡ＋ＭｕｔＳ変異／ＳＮＰ検出方法の概略図である。図４は、ＳＳＢタンパク質（菱形）が添加された場合の、工程（３）の後に形成される最終複合体を示す。標識された（下向き黒三角で）ＳＳＢは、ｓｓＤＮＡに結合する。ここで、ＭｕｔＳはまた、標識される（星印）。
【図５】図５は、種々の検出様式を含むＲｅｃＡ＋ＭｕｔＳ変異／ＳＮＰ検出方法の概略図である。図５は、ＭｕｔＳが標識され、そしてプローブが標識デオキシヌクレオチド三リン酸を用いたポリメラーゼ伸長によって標識された（→←→←）後の、工程（３）の後に形成される最終複合体を示す。
【図６】図６は、種々の検出様式を含むＲｅｃＡ＋ＭｕｔＳ変異／ＳＮＰ検出方法の概略図である。図６は、ＭｕｔＳが固体表面（斜線部）に固定された場合の、工程（３）の後に形成される最終複合体を示す。この実施形態において、プローブは、標識される（×）。
【図７】図７は、種々の検出様式を含むＲｅｃＡ＋ＭｕｔＳ変異／ＳＮＰ検出方法の概略図である。図７は、プローブ（その配列は、試験ＤＮＡとのミスマッチまたはミス対形成を有する）が、２つの相補的オリゴヌクレオチド（これらの各々が、ＲｅｃＡ（○）によって「被覆」される）の形態である場合の、工程（３）の後に形成される最終複合体を示す。ＭｕｔＳは標識される（星印）。形成される構造は、二重Ｄループである。
【０００１】
分子生物学および医薬の分野における本発明は、１塩基変化（単一ヌクレオチド多型−ＳＮＰ）または野生型ＤＮＡ配列への単一塩基付加もしくは野生型ＤＮＡ配列からの単一塩基欠失ほど小さなものを含む変異および多型を検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術の説明）
ヒト分子および医療遺伝学における進歩は、変異および配列多型の効率的かつ正確な検出に依存し、これらの大部分は、単一塩基置換（単一ヌクレオチド多型−ＳＮＰ）および小さな付加または欠失から生じる。従って、サンプル中の特異的変異、ＳＮＰまたは変異核酸配列の存在を検出し得るアッセイは、疾患の予測および診断、法医学、疫学および公衆衛生において実質的な重要性を有する。このようなアッセイを使用して、例えば、個体における変異遺伝子の存在を検出し得、この個体が遺伝子疾患に罹患する可能性の検出を可能にする。変異を検出する能力は、細胞性癌遺伝子中の個々の変異が癌細胞へのこの細胞の形質転換を導くこの癌遺伝子の活性化を生じ得るという発見、および腫瘍サプレッサ遺伝子を不活性化する変異が腫瘍形成のプロセスにおいて必要な工程であるという発見を用いて、癌の早期検出または癌に対する感受性の発見における増大する重要性を担っている。ＳＮＰの検出は、ヒトおよび動物の疾患に関連した遺伝子を含む遺伝子の同定および位置決め（マッピング）における増加した重要性を想定している。
【０００３】
このようなアッセイの有用性および適用性を増加するという要求は、しばしば、アッセイの感度ならびに複雑性およびコストに悩まされる。従って、ＤＮＡにおける変更を検出するためのより高感度で、簡単でかつ比較的安価なアッセイを開発することが非常に望ましい。
【０００４】
核酸検出アッセイは、核酸分子の多数の特徴（例えば、そのサイズ、配列、制限エンドヌクレアーゼによる切断に対する感受性など）のいずれかに基づき得る。このようなアッセイの感度は、検出が観察者に報告または伝達される様式を変更することによって、増加され得る。従って、例えば、アッセイの感度は、検出可能に標識された試薬（例えば、酵素（Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら、米国特許第４，５８１，３３３号）、放射性同位体（Ｆａｌｋｏｗら、米国特許第４，３５８，５３５号；Ｂｅｒｎｉｎｇｅｒ、米国特許第４，４４６，２３７号）、蛍光標識（Ａｌｂａｒｅｌｌａら、ＥＰ１４４９１４）、化学標識（Ｓｈｅｌｄｏｎ ＩＩＩら、米国特許第４，５８２，７８９号；Ａｌｂａｒｅｌｌａら、米国特許第４，５６３，４１７号）、改変された塩基（Ｍｉｙｏｓｈｉら、ＥＰ１１９４４８）など）を使用することによって、増加され得る。
【０００５】
１つまたは数個の塩基から構成される遺伝的変化の検出を試みるために発明されたほとんどの方法は、ＰＣＲによる特定のＤＮＡ領域の増幅を含み、そして多くは、標準的な核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）と試験ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションを含み、その結果、変異は、ヘテロ二本鎖分子における誤対形成塩基または不対塩基として示される。これらの誤対形成塩基または不対塩基の検出は、種々の方法によって達成されている（Ｍｙｅｒｓ，ＲＭ，ら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２７５−２８４（１９８６）；Ｇｉｂｂｓ，Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：３０３−３０５（１９８７）；Ｌｕ，ＡＳ．ら、１９９２，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４：２４９−２５５（１９９２）；Ｃｏｔｔｏｎ，ＲＧ，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４３９７−４４０１（１９８８）；Ｃｏｔｔｏｎ，ＲＧ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７：４２２３−４２３３（１９８９）；Ｌｉｓｈａｎｓｋｉ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２６７４−２６７８（１９９４）；Ｗａｇｎｅｒ，ＲＥ，ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３９４４−３９４８（１９９５）；Ｄｅｂｂｉｅ，Ｐ．ら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：４８２５−４８２９（１９９７））。これらの方法の全ては、以下の要件に悩まされている：（１）特定のＤＮＡ領域が、変異またはＳＮＰの検出の前にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅されなければならないこと、および（２）増幅されたＤＮＡが、変性され、そしてミスマッチまたは不対塩基の形成を可能にするように公知の遺伝子型のいくつかの標準的なＤＮＡでアニールされなければならないこと。ＰＣＲ増幅は、増幅（これは比較的低い忠実度のプロセスである）の間にエラーを導入し、そして特に、ゲノムＤＮＡまたは大きなアンプリコンの変性およびアニーリングは、大きなアニールされていない一本鎖のフラグメントを残し得、このフラグメントは、不対塩基または誤対形成塩基を有する二本鎖ＤＮＡの領域を含む二次構造をとり得る。これらの誤対形成塩基および不対塩基は、標的ミスマッチまたは不対塩基の検出を妨害し得る。これらの方法の多くはまた、変異の正確な位置が既知であることを必要とし、そしてサンプルＤＮＡが問題の変異についてヘテロ接合性である場合には、解釈が困難である。従って、ほとんどは、変異およびＳＮＰのスクリーニングにおける使用に実用的ではない。
【０００６】
ＭｕｔＳおよびＲｅｃＡは、ＤＮＡ修復および遺伝子組換えに関与する細菌タンパク質であり、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて最もよく特徴付けされている。ＭｕｔＳは、Ｅ．ｃｏｌｉミスマッチ修復系のミスマッチ認識および結合タンパク質であり、これはＤＮＡ複製の間にＤＮＡポリメラーゼにより作製される誤りを修復するように機能する。この系はまた、遺伝子組換えの初期工程で生成されるハイブリッド重複におけるミスマッチを認識し、このようなミスマッチ含有領域に作用して組換えを停止する。従って、このミスマッチ修復系は、ＤＮＡ複製および遺伝子組換えの両方におけるエディターであり、両方のプロセスにおいて高い忠実度を保証する。（組換えの編集は、染色体の再配置を回避するため、首尾良い減数分裂を可能にするため、および非常に関連した種の間に遺伝的バリアを構築するために必須である）。
【０００７】
ＭｕｔＳは、変異およびＳＮＰの検出において使用されてきた（Ｌｉｓｈａｎｓｋｉら（前出）；Ｗａｇｎｅｒら（前出）；Ｄｅｂｂｉｅら（前出）；Ｗａｇｎｅｒおよびｃｏｌｌｅａｇｕｅｓによる特許−米国特許第６，０２７，８７７号、同第６，１１４，１１５号、同第６，１２０，９９２号、同第６，３２９，１４７号；およびＧｉｆｆｏｒｄ、米国特許第５，７５０，３３５号）。フィルター結合アッセイまたはゲルシフトアッセイ（Ｊｉｒｉｃｎｙら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７８４３−７８５３（１９８８）；Ｌｉｓｈａｎｓｋｉら（前出））におけるように、溶液中で使用される場合、ＭｕｔＳは、ほとんどのミスマッチを検出せず、非ミスマッチＤＮＡの高レベルのバックグラウンド結合を示すという点で、十分には機能しない。固定化ＭｕｔＳは、ミスマッチに結合する非常に増加した能力、およびミスマッチを有さないＤＮＡに結合する非常に減少した能力を有する（Ｗａｇｎｅｒら（前出））。しかし、固定化ＭｕｔＳでさえ、誤った組込みおよび誤ったプライミングの両方を含む、ＤＮＡにおけるＰＣＲにより誘導される誤りを被り、一本鎖ＤＮＡは、変異およびＳＮＰの検出アッセイにおける強力なコンペティターである。
【０００８】
ＲｅｃＡ（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて最もよく特徴付けされている細菌リコンビナーゼ）は、遺伝子組み替えのプロセスにおいて、特に、配列相同性の検索および認識において、および初期鎖交換プロセスにおいて、重要なプレイヤーである。ＲｅｃＡは、試験管中の鎖交換を触媒し得る。組換えは、複数のＲｅｃＡ分子が一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の伸長を被覆して、ＲｅｃＡ「フィラメント」として公知のものを形成する場合に、始まる。このフィラメントは、ＡＴＰの存在下で、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）中の相同配列を探す。相同性が存在する場合、三鎖（Ｄループ）構造が形成され、ここでこのＲｅｃＡフィラメントＤＮＡは、二重鎖の相補鎖と対形成する。対形成が完全ではない場合、すなわち、新たに生成した二重鎖中にミスマッチまたは不対塩基が存在する場合、ＭｕｔＳは、これらの構造に結合し得、そしてミスマッチ修復系（これはこのフィラメントＤＮＡを除去しそして元の二重鎖を回復させることによって組換え現象を停止するように作用する）の他のタンパク質を動員する。かなりの証拠（このほとんどは未だ未公開である）は、ＲｅｃＡおよびＭｕｔＳが、組換えの間に共存すること、およびＤＮＡへのＲｅｃＡの結合が、おそらく、ＭｕｔＳに対するミスマッチの提示を改善することによって、ＭｕｔＳミスマッチ認識を容易にし得ることを示唆する。
【０００９】
ＲｅｃＡは、特異的配列を含むプラスミドについてのプラスミドライブラリーのスクリーニングを容易にするために使用されている（Ｒｉｇａｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８３：９５９１−９５９５（１９８６））。この適用において、ビオチン化一本鎖ＤＮＡプローブは、ＲｅｃＡと反応して、ＲｅｃＡフィラメントを形成する。このフィラメントは、環状プラスミドＤＮＡにおける相同性検索のために使用される。このプローブが、アビジンに結合することによって除去される場合、このプローブに相同な配列を含むプラスミドは、ＲｅｃＡフィラメントおよびプラスミド二重鎖により形成される三本鎖（Ｄループ）構造によって単離される。これらの構造が安定化するために、ＡＴＰの代わりにアデノシン５’−［γ−チオ］三リン酸（ＡＴＰ［γ−Ｓ］）を使用する必要がある。ＡＴＰ［γ−Ｓ］は、ＲｅｃＡによる相同性検索を可能にし、非加水分解性であり、従って、三本鎖構造からＲｅｃＡを解離させない。
【００１０】
ＲｅｃＡはまた、細菌ゲノムＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ由来の特定のＤＮＡ領域のマッピングを容易にするために使用されている（Ｆｅｒｒｉｎ，ＬＪら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４；１４９４−１４９７（１９９１）；Ｆｅｒｒｉｎ，ＬＪら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：３７９−３８３（１９９４））。これらの用途において、ＲｅｃＡを、制限酵素（配列特異的二本鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）と共に使用して、特定のＤＮＡフラグメントの単離または同定を可能にする。ＲｅｃＡフィラメントを調製し、そして三本鎖（Ｄループ）構造の形成を可能にする条件下で、ゲノムＤＮＡと反応させる。次いで、このＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼまたは修飾メチラーゼのいずれかで処理する（メチラーゼ作用は、特異的制限エンドヌクレアーゼの特異的認識配列にメチル基を転移し、従って、この配列をエンドヌクレアーゼ消化から保護する）。三本鎖構造中のＲｅｃＡフィラメントの存在は、消化またはメチル化を防止する。
【００１１】
特異的ＲｅｃＡフィラメントはまた、制限エンドヌクレアーゼ生成性「粘着末端」がＤＮＡポリメラーゼにより満たされるのを保護するために使用され、その結果、ＲｅｃＡフィラメントが除去される際、特異的フラグメントがプラスミドベクター中にクローン化され得る（Ｆｅｒｒｉｎら、米国特許第５，７０７，８１１号）。
【００１２】
ＲｅｃＡ触媒型二重Ｄループの形成は、二本鎖ＤＮＡから特定のＤＮＡ領域を同定および単離するために使用されている（Ｓｅｎａら、米国特許第５，２７３，８８１号および同第５，６７０，３１６号）。この方法は、安定な構造を提供するために、比較的長いＤＮＡプローブ（＞７８ヌクレオチド）、およびこのプローブと二重Ｄループとの間の相補性を必要とする。この方法は、一緒になってＤループを形成するプローブと試験ＤＮＡが、プローブ／試験二重領域における誤対形成塩基または不対塩基の形成を生じる配列の相違を有さなければならない（変異またはＳＮＰの検出を可能にする）本発明とは基本的に対照的である。これらの文献は、ＤＮＡポリメラーゼを用いるオリゴヌクレオチドの伸長によってプローブに検出可能な標識を導入する可能性を記載する。重要なことに、この方法は、試験ＤＮＡの特定の配列の検出にのみ適切であるが、変異またはＳＮＰの検出（本発明の目的）には役立たない。さらに、これらの特許の教示は、二重Ｄループの使用に限定される。配列検出の限定された目的のためでさえ、単一Ｄループの使用の示唆はない。
【００１３】
このデータについての全ての記載またはこれらの文献の内容についての説明は、本出願人に利用可能な情報に基づき、そしてこれらの文献のデータまたは内容の正確さについてのいずれの承認も構成しない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、二本鎖試験ＤＮＡ分子中の変異および／またはＳＮＰを検出するための方法に関し、この方法は、以下の工程：
（ａ）必要に応じて検出可能に標識された一本鎖ＤＮＡプローブを提供する工程であって、このプローブは、（ｉ）既知のヌクレオチド配列または（ｉｉ）試験ＤＮＡの少なくとも一部の配列に相補的な配列を有する、工程；
（ｂ）プローブと、ＲｅｃＡタンパク質（または以下でより詳細に定義される、そのホモログ）とを接触させて、ＲｅｃＡフィラメントを形成する工程であって、このＲｅｃＡタンパク質は、必要に応じて検出可能に標識されている、工程；
（ｃ）ＲｅｃＡフィラメントと、試験ＤＮＡとを接触させ、それによりその試験ＤＮＡ中に３本鎖ＤＮＡ Ｄループ構造を形成する工程であって、このＤループ構造は、プローブおよび試験ＤＮＡの２つの鎖を含む、工程；
（ｄ）そのＤＮＡ−Ｄループ構造とＭｕｔＳ（または以下でより詳細に定義される、そのホモログ）と接触させる工程であって、このＭｕｔＳは、必要に応じて検出可能に標識されており、ここでＭｕｔＳは、Ｄループ構造の二重鎖部分に存在する１以上の塩基対ミスマッチまたは不対塩基に結合する、工程；
（ｅ）そのＤＮＡ Ｄループ構造に結合したＭｕｔＳの存在を検出する工程であって、ここで結合したＭｕｔＳの存在は、試験ＤＮＡ中の変異またはＳＮＰの存在を示す工程、
を包含する。
【００１５】
二本鎖試験ＤＮＡ分子中の変異および／またはＳＮＰを検出するための方法もまた提供され、この方法は、以下の工程：
（ａ）必要に応じて検出可能に標識された２つの相補性一本鎖オリゴヌクレオチドを含むプローブを提供する工程であって、このプローブは、（ｉ）既知のヌクレオチド配列または（ｉｉ）試験ＤＮＡの少なくとも一部の配列に相補的な配列を有する、工程；
（ｂ）一本鎖形態にあるそのオリゴヌクレオチドの各々と、ＲｅｃＡタンパク質とを接触させて、ＲｅｃＡフィラメントを形成する工程であって、このＲｅｃＡタンパク質は、必要に応じて検出可能に標識されている、工程；
（ｃ）そのＲｅｃＡフィラメントと、試験ＤＮＡとを接触させ、それにより試験ＤＮＡ中に４本鎖ＤＮＡ構造を形成する工程であって、この構造は、プローブおよび試験ＤＮＡの２つの鎖を含み、ここでそのプローブ鎖は、試験ＤＮＡ鎖とアニールする、工程；
（ｄ）そのＤＮＡ構造と、ＭｕｔＳタンパク質とを接触させる工程であって、このＭｕｔＳは必要に応じて検出可能に標識されており、ここでＭｕｔＳは、その４本鎖ＤＮＡ構造に存在する１以上の塩基対ミスマッチまたは不対塩基に結合する、工程；
（ｅ）そのＤＮＡ構造に結合したＭｕｔＳの存在を検出する工程であって、その結合したＭｕｔＳの存在は、試験ＤＮＡ中の変異またはＳＮＰの存在を示す、工程、
を包含する。
【００１６】
二本鎖試験ＤＮＡ分子中の変異および／またはＳＮＰを検出するための別の方法であって、この方法は、以下の工程：
（ａ）一本鎖ＤＮＡプローブを提供する工程であって、このプローブは、必要に応じて検出可能に標識されており、（ｉ）既知のヌクレオチド配列または（ｉｉ）この試験ＤＮＡ分子の少なくとも一部の配列に相補的な配列を有する工程；
（ｂ）そのプローブとＲｅｃＡタンパク質とを接触させて、ＲｅｃＡフィラメントを形成する工程であって、このＲｅｃＡタンパク質は、必要に応じて検出可能に標識されている、工程；
（ｃ）このＲｅｃＡフィラメントと、試験ＤＮＡとを接触させ、それにより、試験ＤＮＡ中に３本鎖ＤＮＡ Ｄループ構造を形成する工程であって、この構造は、プローブおよび試験ＤＮＡの二本鎖を含む、工程；
（ｄ）このＤＮＡ Ｄループ構造と、固定化ＭｕｔＳとを接触させる工程であって、この固定化ＭｕｔＳは、このＤループ構造の二重鎖部分に存在する１以上の塩基対ミスマッチまたは不対塩基に結合する、工程；
（ｅ）固定化プローブＤＮＡまたはＭｕｔＳに結合したＲｅｃＡの存在を検出する工程であって、ここで結合プローブＤＮＡまたはＲｅｃＡの存在は、その試験ＤＮＡ中の変異またはＳＮＰの存在を示す、工程、
を包含する。
【００１７】
本発明は、二本鎖試験ＤＮＡ分子中の変異および／またはＳＮＰを検出するための方法を包含し、この方法は、以下の工程：
（ａ）２つの相補的一本鎖オリゴヌクレオチドを含むプローブを提供する工程であって、このプローブは、必要に応じて検出可能に標識されており、（ｉ）既知のヌクレオチド配列または（ｉｉ）この試験ＤＮＡの少なくとも一部の配列に相補的な配列を有する、工程；
（ｂ）一本鎖形態にあるこのプローブオリゴヌクレオチドの各々を、ＲｅｃＡタンパク質と接触させて、ＲｅｃＡフィラメントを形成する工程であって、このＲｅｃＡタンパク質は、必要に応じて検出可能に標識されている、工程；
（ｃ）このＲｅｃＡフィラメントと、その試験ＤＮＡとを接触させ、それにより、試験ＤＮＡ中に４本鎖ＤＮＡ構造を形成し、この構造は、試験ＤＮＡの２つの鎖を含み、これらの鎖の各々に対して、プローブオリゴヌクレオチド鎖がアニールする、工程；ならびに
（ｄ）このＤＮＡ構造と、固定化したＭｕｔＳとを接触させ、それにより、変異および／またはＳＮＰを検出する工程であって、このＭｕｔＳは、４本鎖ＤＮＡ構造に存在する１以上の塩基対ミスマッチまたは不対塩基に結合する、工程、
を包含する。
【００１８】
上記の方法において、試験ＤＮＡ分子は、原核生物ゲノムＤＮＡ、真核生物ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、およびＰＣＲにより増幅されたＤＮＡフラグメント、または別の増幅方法により増幅されたＤＮＡフラグメントであり得る。
【００１９】
変異またはＳＮＰを確実に検出するために、上記のプローブ配列は、１以上のヌクレオチド置換、付加または欠失により変異またはＳＮＰの配列とは異ならなければならない。その結果、プローブ／試験へテロ二重鎖は、ＭｕｔＳ、またはＭｕｔＳホモログもしくは他のミスマッチ結合タンパク質（ＭＢＰ）により認識可能なミスマッチまたは不対塩基を含む。試験ＤＮＡ配列がプローブと同一である場合、試験結果は、「ネガティブ」である。上記で使用される「プローブ」が「１以上」の異なるプローブ分子を含み得ることが理解されるべきである。プローブは、好ましくは、約２０〜約６０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり。好ましくは、以下からなる群より選択される：（ａ）合成オリゴヌクレオチド；（ｂ）組換えオリゴヌクレオチド；および（ｃ）二本鎖ＤＮＡ分子を変性し、必要に応じて切断することにより得られる、オリゴヌクレオチド。プローブが２つの相補的ＤＮＡ分子を含む場合、それらは、ＲｅｃＡで別々にコーティングされ得る。このプローブは、付加物を含み得、この付加物は、Ｄループ形成の後に固定化を可能にするオリゴヌクレオチド、ビオチンまたはジゴキシゲニンなどであり得る。
【００２０】
ＲｅｃＡタンパク質は、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ由来である。
【００２１】
本明細書中に記載の方法において、検出は、検出可能に標識された化合物：プローブＤＮＡ、ＲｅｃＡ、ＭｕｔＳ（または以下で議論されるＳＳＢ）のいずれか１つを使用することに基づく。標識は、任意の適切な検出可能な標識であり得る（例えば、発蛍光団、発色団、放射性核種、ビオチン、ジゴキシゲニンなど）。タンパク質またはＤＮＡは、上記の発蛍光団、発色団、ビオチンなどが結合されたビーズを介して標識され得る。このプローブは、標識されたデオキシヌクレオチド三リン酸またはヌクレオチドターミネーターを使用してＤＮＡポリメラーゼ伸長により標識され得る。
【００２２】
好ましい検出は、結合したＭｕｔＳの検出であり、このＭｕｔＳは、溶液中にあってもよいし、ニトロセルロース、ポリスチレン、磁性ビーズなどのような固体表面に固定化されていてもよい。ＤＮＡ、ＲｅｃＡまたはＭｕｔＳは、標識のタンパク質への直接結合または結合により直接標識され得る。しかし、用語「検出可能に標識される（標識された）」はまた、タンパク質またはＤＮＡを参照するか否かにかかわらず、「間接的な」標識を含み、ここで「検出可能な標識」は、そのタンパク質またはＤＮＡの一次抗体でありまたは任意の他の結合パートナーであり、これらは、直接標識される。あるいは、検出可能な標識は、非標識一次抗体（例えば、抗ＭｕｔＳ、抗ＲｅｃＡ、抗ＳＳＢ）と、この一次抗体に特異的な直接標識された二次抗体との組み合わせである。
【００２３】
本発明の方法において、ＭｕｔＳ（またはそのホモログ）は、溶液中にあってもよいし、任意の固体支持体に固定化されていてもよい。
【００２４】
ＲｅｃＡまたは上記プローブが標識される場合、好ましい標識は、発蛍光団、発色団、放射性核種、ビオチン、ジゴキシゲニンであり、ここでこのプローブ標識とＭｕｔＳ標識またはＲｅｃＡ標識とＭｕｔＳ標識の関連は、試験ＤＮＡ中の変異またはＳＮＰの存在を示す。
【００２５】
ＭｕｔＳまたはＭｕｔＳホモログが標識される場合、この標識は、好ましくは、発蛍光団、発色団、放射性核種、ビオチン、ジゴキシゲニンまたは標識ビーズである。ＲｅｃＡまたはＲｅｃＡホモログについての好ましい標識は、発蛍光団である。検出可能な標識が発蛍光団である場合、好ましい検出方法は、フローサイトメトリーである。
【００２６】
上記の方法において、ＭｕｔＳまたはＭｕｔＳホモログは、固体支持体に固定化され得る。
【００２７】
好ましい実施形態において、ＲｅｃＡタンパク質は、標識され、検出は、ＤＮＡ Ｄループ構造に存在するＲｅｃＡ標識と会合したＭｕｔＳの検出である。
【００２８】
別の実施形態において、ＲｅｃＡまたはそのホモログの検出可能な標識は、標識抗ＲｅｃＡ一次抗体の形態にあるか、または非標識抗ＲｅｃＡ一次抗体とこの一次抗体に特異的な標識二次抗体の組み合わせの形態にある。
【００２９】
三本鎖またはＤループ構造の二重鎖部分に結合するＭｕｔＳは、構造を安定化させ、比較的短いオリゴヌクレオチドの使用を可能にする。このことにより、ともに近くに存在し得る変異およびＳＮＰを別々に検出することができる。従って、本発明の方法におけるＭｕｔＳの使用は、先行技術（例えば、Ｓｅｎａらの特許）を超える重要な全体的改善である。なぜなら、ＭｕｔＳの使用が、変異またはＳＮＰを含むＤループ構造と変異またはＳＮＰを含まないＤループ構造との間を区別するための基本として役立つからである。このことは、ＭｕｔＳを結合しないＤループ構造が、プローブおよび試験ＤＮＡが好ましくは、いずれのミスマッチも不対塩基もない（プローブの試験ＤＮＡからの解離が好まれる状態）、対形成されるＤループ構造であることが理由である。これは、バックグラウンドシグナルを最小にするというさらなる利点を有する。
【００３０】
上記の方法において、このＤＮＡ Ｄループ構造は、上記工程（ｄ）の前に一本鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質（Ｃｈａｓｅら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：３２１５−３２２７（１９８０））またはＳＳＢホモログ（これらは、必要に応じて検出可能に標識される）を付加することにより、さらに安定化され得る。ＳＳＢタンパク質が標識される場合、この標識は、発蛍光団、発色団、放射性核種、ビオチン、ジゴキシゲニン、または標識ビーズであり得、ＳＳＢ標識とＭｕｔＳ標識の会合は、試験ＤＮＡ中の変異またはＳＮＰの存在を示す。
【００３１】
３本鎖構造の安定性はまた、ＤＮＡ合成によりオリゴヌクレオチドを伸長させることにより増強され得る。このような伸長は、ＤＮＡポリメラーゼおよび４つのデオキシヌクレオチド三リン酸全ての添加を必要とする。
【００３２】
上記の方法において、フローサイトメトリー検出は、以下に結合する、２つ、３つまたは４つの標識の同時存在を検出し得る：（ａ）ＭｕｔＳおよびプローブ；（ｂ）ＭｕｔＳおよびＲｅｃＡ；（ｃ）ＭｕｔＳ、ＲｅｃＡおよびプローブ；（ｄ）ＭｕｔＳおよびＳＳＢ；（ｅ）ＭｕｔＳ、ＳＳＢ、およびプローブ；または（ｆ）ＭｕｔＳ、ＳＳＢ、プローブおよびＲｅｃＡ。
【００３３】
本発明はまた、ＤＮＡサンプル中の１つ以上の変異もしくは多型を検出するのに有用なキットを提供し、このキットは、その中に１つ以上の容器を受けるように適合され、このキットは、以下：
（ａ）必要に応じて検出可能に標識されるＲｅｃＡタンパク質を含む、第１の容器；
（ｂ）必要に応じて検出可能に標識されるＭｕｔＳタンパク質を含む、第２の容器；
（ｃ）ＭｕｔＳまたはＭｕｔＳホモログの結合を検出し得る緩衝液および試薬を含む、第３の容器または複数の容器
を備える。
【００３４】
さらに、ＤＮＡサンプル中の特定の変異もしくは特定の多型または特定の変異群もしくは多型群を検出するためか、または任意の変異または任意の多型についてＤＮＡの特定の領域を調べるために有用なキットが含まれ、このキットは、その中に１つ以上の容器を受けるように適合され、このキットは、以下：
（ａ）必要に応じて検出可能に標識されるＲｅｃＡタンパク質またはそのホモログを含む、第１の容器；
（ｂ）必要に応じて検出可能に標識されるＭｕｔＳタンパク質を含む、第２の容器；
（ｃ）特定のオリゴヌクレオチドプローブを含む第３の容器または複数の容器であって、このプローブは、サンプルのＤＮＡ中の特定の領域における特定の配列に対して相補的であるように選択され、そしてその特定のＤＮＡ領域中の変異配列または多型配列とのミスマッチ含有へテロ二重鎖または不対塩基含有ヘテロ二重鎖を形成し、このプローブは、必要に応じて検出可能に標識される、第３の容器；ならびに
（ｄ）プローブとサンプルＤＮＡとの間で形成された特定のヘテロ二重鎖に対するＭｕｔＳまたはＭｕｔＳホモログの結合を検出し得る緩衝液および試薬を含む、第４の容器または複数の容器、
を備える。
【００３５】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は、少なくとも２つのＤＮＡ結合タンパク質（ＲｅｃＡおよびＭｕｔＳ）の組み合わせを用いて、変異またはＳＮＰを検出するための新規技術を発明した。一般的には、この方法は、以下を用いる：
（１）試験ＤＮＡ分子であって、この分子は、任意の供給源由来の任意の合成ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、原核生物ＤＮＡまたは真核生物ＤＮＡであり得、そしてＰＣＲまたは任意の他の手段によって増幅され得る、試験ＤＮＡ分子；
（２）ＤＮＡプローブであって、このプローブは、任意の合成オリゴヌクレオチド、ＰＣＲアンプリコン、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、あるいは既知配列の任意の他のＤＮＡまたは試験ＤＮＡもしくはその部分に対して相補的な配列の任意の他のＤＮＡであり得る、ＤＮＡプローブ、
（３）以下に記載されるような、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲｅｃＡもしくはそのホモログ、ならびに
（４）以下に記載されるような、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭｕｔＳもしくはそのホモログ、または任意の原核生物種もしくは真核生物種由来の別のミスマッチ結合タンパク質。
【００３６】
本明細書中および本発明の特許請求の範囲に使用される場合（簡潔さおよび明確さのために）、用語「ＭｕｔＳ」、「ＲｅｃＡ」または「ＳＳＢ」は、ネイティブまたは変異体のＥ．ｃｏｌｉ ＭｕｔＳタンパク質、ＲｅｃＡタンパク質、もしくはＳＳＢタンパク質、またはこれらの「ホモログ」（以下に規定されるような）のいずれかを含むことが意図される。ＭｕｔＳ、ＲｅｃＡまたはＳＳＢなどの「ホモログ」などは、その参照」タンパク質に対して機能類似性、好ましくは構造類似性／配列類似性もまた有するタンパク質である。ホモログの１つの型は、同じ属またはさらには他の属の別の種由来の相同遺伝子によってコードされる。以下に記載されるように、上記のタンパク質（元々、細菌中で発見された）は、酵母から哺乳動物までの範囲の群において真核生物ホモログを有する。機能的ホモログは、その参照タンパク質の生化学活性および生物学的活性（特に、ＤＮＡ結合選択性またはＤＮＡ結合特異体）を保有しなければならず、その結果、機能ホモログは本明細書中に記載されるような有用性を有する。その機能特徴づけを考慮して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質、ＭｕｔＳタンパク質、またはＳＳＢタンパク質のホモログ（未だ発見されていないタンパク質も含む）の使用は、それらのタンパク質が記載されたＤＮＡ結合活性または「改善された」結合活性を有する場合、本発明の範囲内にある。改善の非限定的な例としては、ＭｕｔＳホモログによるＣ：Ｃミスマッチの認識、より短いＤＮＡ分子に結合するＲｅｃＡホモログ、またはＳＳＢホモログによる一本鎖ＤＮＡのより高い親和性結合が挙げられる。
【００３７】
「ホモログ」はまた、本発明における使用のためにタンパク質の所望の機能を改善するために実施される、変異誘発または組換えによって変更されたタンパク質を含むことが意図される。これらのアプローチは、一般に記載され、そして以下に十分に参照される。明らかに、過度の実験に頼らずにこのような遺伝子操作されたホモログを開発することは、当該分野の技術の範囲内である。従って、例えば、当業者は、これらのアプローチを、例えば、「ネイティブ」ＭｕｔＳタンパク質をコードするＤＮＡ（変異誘発）または各々が異なる「ネイティブ」ＭｕｔＳタンパク質をコードする２つ以上のＤＮＡ分子（組換え）で開始して、遺伝子産物を発現し、そして公知のスクリーニング技術（本発明の方法を含む）を用いて、適切なＤＮＡ結合活性を測定する。ゆえに、遺伝子操作された、改善ＭｕｔＳホモログ、改善ＲｅｃＡホモログ、または改善ＳＳＢホモログの特定の例がないとしても、当業者は、慣用的な実験のみを用いてこのようなホモログを生成かつ同定し得る。
【００３８】
タンパク質遺伝子の変異誘発（当該分野において慣用的である）は、一般的に、その遺伝子を細菌ベクターにクローニングし、そしてそのベクターを細胞中で変異誘発条件下（例えば、変異誘発ヌクレオチドアナログの存在下および／またはミスマッチ修復が欠損している条件下）で複製にすることによって、インビボで達成される。インビトロでの変異誘発（これもまた、当該分野において周知である）は、一般的に、誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲを利用し、ここで、所望の遺伝子は、ＰＣＲポリメラーゼによる誤った組み込みに有利な条件下（ヌクレオチドアナログ、偏った三リン酸プールなど）で増幅される。次いで、ＰＣＲ産物は、発現ベクター中にクローニングされ、そして得られるタンパク質は、細菌細胞中で機能について調べられる。
【００３９】
組換えは、一般的に、異なる種由来の相同遺伝子を混合し、これらを組換えさせ（頻繁には、変異誘発条件下で）、そして組換え遺伝子由来のタンパク質の改善された機能について選択またはスクリーニングすることを含む。この組換えは、ミスマッチ修復が欠損した条件下（これは、異なる配列間の組み換えを可能にし、かつ変異の生成も増加させる）で、インビボにて（最も一般的には細菌細胞中で）達成され得る。本発明者らのうちの一人は、このようなタンパク質「進化」の方法を開発した（Ｒａｄｍａｎら、米国特許第５，９１２，１１９号および同第５，９６５，４１５号）。さらに、Ｓｔｅｍｍｅｒおよびその共同研究者らは、「改善された」タンパク質を作製するために、異なる配列のインビボ組換えおよびインビトロ組換えの両方のための方法を案出した。ほとんどが、ＰＣＲ「シャッフリング」を含み、ここで、２つの異なる配列が設計され、そして一緒に混合されて、その結果、そのフラグメントは、ＰＣＲのためのプライマーおよび鋳型の両方として作用して、そのようにして異なる遺伝子の異なるセグメントを組合わせる。これは、要するに、遺伝子「組換え」である。しばしば、誤りがちのＰＣＲ条件が含められて、新規配列の生成をさらに刺激する。得られるＰＣＲ産物は、発現ベクターにクローニングされ、そして得されるタンパク質は、改善された機能についてスクリーニングされる。例えば、米国特許第５，５１２，４６３号；同第５，６０５，７９３号；同第５，８１，２３８号；同第５，８３０，７２１号；同第５，８３７，４５８号；同第６，０９６，５４８号；同第６，１１７，６７９号；同第６，１３２，９７０号；同第６，１６５，７９３号；同第６，１８０，４０６号；同第６，２５１，６７４号；同第６，２７７，６３８号；同第６，２８７，８６１号；同第６，２８７，８６２号；同第６，２９１，２４２号；同第６，２９７，０５３号；同第６，３０３，３４４号；同第６，３０９，８８３号；同第６，３１９，７１３号；同第６，３１９，７１４号；同第６，３２３，０３０号；同第６，３２６，２０４号；同第６，３３５，１６０号；同第６，３４４，３５６号を参照のこと。
【００４０】
示されるように、本発明のホモログは、一般的に、それらの参照タンパク質と配列類似性を共有する。２つのアミノ酸配列の（または２つの核酸配列の）同一性（％）を決定するために、配列は、最適の比較目的のためにアライメントされる（例えば、ギャップが、最適なアライメントのために、第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列の一方または両方にか、あるいは第１の核酸配列および第２の核酸配列の一方または両方に導入され得、そして非相同配列は、比較目的のために、無視され得る）。好ましいアライメント方法において、Ｃｙｓ残基がアライメントされる。比較される配列の長さは、参照配列（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭｕｔＳまたはＥ．ｃｏｌｉ ＲｅｃＡ）の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％である。次いで、対応するアミノ酸（またはヌクレオチド）位置のアミノ酸残基（またはヌクレオチド）が、比較される。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基（またはヌクレオチド）によって占められる場合、これらの分子はその位置で同一である。本明細書中に使用される場合、アミノ酸「同一性」または核酸「同一性」はまた、アミノ酸「相同性」または核酸「相同性」でもある。２つの配列間の同一性％は、最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、それらの配列によって共有される同一な位置の数の関数である。２つの配列間の配列の比較および同一性％の決定は、数理的なアルゴリズム（例えば、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれかを用いるＧＡＰプログラム（以下を参照のこと）に組込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０）））を用いて達成され得る。好ましいプログラムであるｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能なＧＣＧソフトウェアパッケージ中の「ＧＡＰ」は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＡマトリクスおよび４０、５０、６０、７０、もしくは８０のギャップウェイト、１、２、３、４、５、もしくは６のレングスウェイトを使用する。別のアプローチにおいて、２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の同一性％は、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９）））のアルゴリズムを用いて決定され、このアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれ、ＰＡＭ１２０重量残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップレングスペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用する。
【００４１】
特定のＭｕｔＳタンパク質、ＲｅｃＡタンパク質またはＳＳＢタンパク質の核酸配列またはタンパク質列を、さらに、「問い合わせ配列」として用いて、公のデータベースに対する検索を実行して、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連する配列を同定し得る。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実行され得る。比較目的のためのギャップアライメントを得るために、ギャップＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されるように利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴを用いる場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーターを使用し得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。例えば、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長＝１２）を使用して実行し、問い合わせＭｕｔＳコード核酸配列、問い合わせＲｅｃＡコード核酸配列または問い合わせＳＳＢコード核酸配列に相同なヌクレオチド配列を獲得し得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（好ましくは、スコア＝５０、ワード長＝３に設定）を使用して実行し、問い合わせＭｕｔＳタンパク質分子、問い合わせＲｅｃＡタンパク質分子または問い合わせＤＮＡタンパク質分子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の野生型配列）に相同なアミノ酸配列を獲得し得る。
【００４２】
従って、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭｕｔＳタンパク質、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質またはＥ．ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質の好ましいホモログは、まず第１に、ネイティブのＥ．ｃｏｌｉ ＭｕｔＳ（またはＲｅｃＡまたはＳＳＢ）の機能的活性を有するか、または、上記のようなネイティブのタンパク質を超える改善された活性さえも有する。好ましいホモログはまた、上記のように測定した場合、ネイティブのＥ．ｃｏｌｉタンパク質と、少なくとも約２０％（アミノ酸レベル）、好ましくは、少なくとも約４０％、さらに好ましくは、少なくとも約６０％、さらにより好ましくは、少なくとも約７０％、さらにより好ましくは、少なくとも約８０％、およびさらによりこのましくは、少なくとも約９０％の配列類似性を共有する。
【００４３】
異なる細菌由来の少なくとも６５個のＲｅｃＡ遺伝子がクローン化され、そして配列決定された（Ｓａｎｄｌｅｒ，ＳＪら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２４：２１２５−２１３２（１９９６）；Ｒｏｃａ，ＡＩら、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５：４１５−４５６（１９９０）；Ｅｉｓｅｎ，ＪＡ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．４１：１１０５−１１２３（１９９５）；Ｌｌｏｙｄ，ＡＴら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３７：３９９−４０７（１９９３））。ＲｅｃＡホモログ（ＲａｄＡとして公知）は、３つの始原種（ａｒｃｈａｅａｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）において同定されている（Ｓａｎｄｌｅｒら、前出；；Ｓｅｉｔｚ，ＥＭら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２：１２４８−１２５３（１９９８））。ＲｅｃＡの真核生物ホモログは、試験された全ての真核生物種において同定されており；原形の真核生物ＲｅｃＡホモログは、酵母Ｒａｄ５１タンパク質である（Ｓｅｉｔｚら、前出；Ｂｉａｎｃｏ，ＰＲら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ Ｂｉｏｓｃｉ．３：５７０−６０３（１９９８））。従って、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲｅｃＡの任意のホモログ（これは、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質のように、遺伝子組み換えの開始のためのＤＮＡフィラメント、ならびにインビボまたはインビトロで変異または進化された任意の機能的形態を形成する）は、本発明の範囲内に含まれる。
【００４４】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＭｕｔＳホモログの例は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＭｕｔＳタンパク質（Ｌｕら、前出；Ｈａｂｅｒ，ＬＴら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：１９７−２０２（１９８８）；Ｐａｎｇ，ＰＰら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６３：１００７−１０１５（１９８５））；およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＨｅｘＡタンパク質（Ｐｒｉｅｂｅ ＳＤら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：１９０−１９６（１９８８）；Ｈａｂｅｒら、前出）である。さらに、ＭｕｔＳまたはＨｅｘＡの真核生物ホモログ（例えば、酵母ＤＮＡ、ヒトＤＮＡ、マウスＤＮＡ、カエルＤＮＡまたはハムスターＤＮＡにおいて同定されたホモログ配列によりコードされるホモログ）もまた、用いられ得る（Ｓｈｉｍａｄａ，Ｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２０１７１（１９８９）；Ｌｉｎｔｏｎ，Ｊ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３０５８−３０７２（１９８９）；Ｆｕｊｉｉ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１００５７（１９８９））。原核生物種のＭｕｔＳホモログと真核生物種のＭｕｔＳホモログとの間の相同性は、Ｒｅｅｎａｎ，ＲＡら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３２：９６３−９７３（１９９２）に例証され、ここで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭｕｔＳヌクレオチド配列は、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＭｕｔＳ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｈｅｘＡ、マウスＲｅｐ−１、およびヒトＤＵＣ−１に対して、ある領域において、非常に相同であることが示されている。ＭｕｔＳのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（酵母）ホモログ（ＭＳＨ１およびＭＳＨ２と命名される）のクローニングを首尾良く導くＰＣＲプライマーは、この相同性に基づいていた。Ｒｅｅｎａｎら（前出）は、酵母ＭＳＨ１と、酵母ＭＳＨ２と、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭｕｔＳホモログと、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＭｕｔＳホモログと、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＭｕｔＳホモログとの間のアミノ酸配列相同性を示した。Ｎｅｗ，Ｌら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３９：９７−１０８（１９９３）は、別の酵母遺伝子（ＭＳＨ３）を開示し、これは、真核生物ＭｕｔＳのホモログであり、そしてＭｕｔＳと、ＨｅｘＡと、マウスＲＥＰ−３との間で最も保存された配列を示す。この配列相同性に基づく新規の酵母遺伝子についての検索は、酵母ＭＳＨ３の発見を導いた。Ｆｉｓｈｅｌ，Ｒら、Ｃｅｌｌ ７５：１０２７−１０２９（１９９３）は、ＰＣＲのためにＲｅｅｎａｎら（前出）により記載される他のＭｕｔＳホモログ由来の相同配列を用いる、別のヒトＭｕｔＳホモログ（ｈＭＳＨ２）のクローニングを記載した。
【００４５】
従って、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭｕｔＳの任意のホモログ（これは、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質のように、ＤＮＡミスマッチ（一塩基ミスマッチまたは数個の不対塩基）、およびインビボまたはインビトロで変異または進化された、任意の機能的形態のバージョンを認識する）は、本発明の範囲内に含まれる。
【００４６】
ＭｕｔＳおよびＲｅｃＡの両方はインビトロで機能する。ＭｕｔＳは、Ｇｅｎｅ Ｃｈｅｃｋ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＭＢＰ）変異検出技術（これは、現在、スクラピー感受性についてヒツジを遺伝子型決定するために市販されている）（Ｗａｇｎｅｒら、前出；Ｄｅｂｂｉｅら、前出；米国特許第６，０２７，８７７号、同第６，１１４，１１５号、同第６，１２０，９９２号、同第６，３２９，１４７号（これらの全ては、その全体が本明細書中で参考として援用される））の基準である。
【００４７】
ＲｅｃＡは、１５ヌクレオチド程度の短い配列ストレッチの沿って、インビトロで、３本鎖構造を形成する（Ｆｅｒｒｉｎら、１９９１、前出）。ＲｅｃＡおよびＭｕｔＳの活性を合わせることで、最も強力な変異／一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）検出系を作製し、この系において、ＲｅｃＡをコートしたｓｓＤＮＡは、試験ｄｓＤＮＡの事前の変性を必要とせずに、３本鎖（または「Ｄループ」）構造の形成を触媒する。Ｄループは、プローブＤＮＡおよび試験ＤＮＡの配列が同一ではない場合、ミスマッチまたは不対塩基を含む。これらのミスマッチ塩基または不対塩基は、ＭｕｔＳ（または、任意の種由来の任意のＭｕｔＳホモログもしくは任意の他のミスマッチ結合タンパク質）により認識され得る。ＭｕｔＳ結合は、Ｄループ構造を安定化する。従って、ＭｕｔＳとＲｅｃＡ媒介Ｄループ形成との組合わせは、（このようなＤループがミスマッチ塩基または不対塩基を含む場合）、非常に小さく安定なＤループの形成を可能にし、次いで、これは、変異およびＳＮＰについて短いＤＮＡ間隔の分離実験、ならびに既知（および未知）の変異およびＳＮＰについての小スケールスキャニングを可能にする。このような試験は、上記で引用される米国特許第５，２７３，８８１号および同第５，６７０，３１６号に、示唆も支持もされていない。
【００４８】
混合型「ＲｅｃＡ／ＭｕｔＳ」法を、種々のプラットホームと共に用い得る。これらのプラットホームのいくつかは、試験ＤＮＡのＰＣＲ増幅の必要なしに、変異／ＳＮＰ検出を可能にする。
【００４９】
（ＭｕｔＳ−ＲｅｃＡ共存のフローサイトメトリー検出を用いるＲｅｃＡ／ＭｕｔＳシステム）
１つの好ましい実施形態では、本発明のシステムは、以下を使用する：（１）標識したＲｅｃＡおよび標識したＭｕｔＳ；（２）フローサイトメトリーによる検出のために、検出可能に標識されている、特異的プローブオリゴヌクレオチド；および（３）標識のフローサイトメトリー検出。
【００５０】
プローブ特異性は、プローブの配列に由来する。プローブは、挿入の部位もしくは領域および隣接領域の、「正常」または野生型の非多型配列に相補的であるように設計されている。変異または多型が存在する場合、プローブ／試験ヘテロ二重鎖は、１または数個の誤対塩基または不対塩基を含む。変異または多型の非存在下で、プローブ／試験ヘテロ二重鎖は、完全に対合する。
【００５１】
ＲｅｃＡフィラメントおよび試験ＤＮＡにより形成されたＤループの形成または安定化は、さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質または別の種由来のこのタンパク質のホモログの添加によってか、あるいはテンプレートとして試験ＤＮＡを用いるプローブＤＮＡの伸長を、ＤＮＡポリメラーゼにより触媒させることによって、増強され得る。
【００５２】
この方法では、変異およびＳＮＰの検出は、（ａ）ＲｅｃＡおよびＭｕｔＳか、（ｂ）プローブＤＮＡおよびＭｕｔＳか、または（ｃ）ＲｅｃＡ、ＭｕｔＳおよびプローブＤＮＡのいずれかの共存の検出により達成される。あるいは、標識したＳＳＢまたはホモログを用いて、一本鎖部分に結合させることにより、Ｄループ構造を標識し得る。この場合、ＳＳＢシグナルとＭｕｔＳシグナルの共存は、Ｄループの二重鎖部分における１つ以上のミスマッチ塩基または不対塩基の存在を示す。
【００５３】
ＤＮＡプローブは、任意の長さであり得るが、好ましくは、約３０〜６０塩基長のオリゴヌクレオチド、より好ましくは、合成オリゴヌクレオチドであり得る。
【００５４】
プローブは、特定の変異または多型に特異的であるか、または既知または未知の変異またはＳＮＰの存在について試験されている特定の遺伝子領域に特異的である。
【００５５】
試験ＤＮＡは、（染色体全体までの）任意の長さであり得、そしてゲノムＤＮＡもしくはプラスミドＤＮＡか、またはＰＣＲアンプリコンのいずれかであり得る。
【００５６】
ＭｕｔＳタンパク質、ＲｅｃＡタンパク質およびＳＳＢタンパク質の標識は、種々の十分に確立された方法を介して達成され得る：タンパク質は、以下を含むが、これらに限定されない、発蛍光団または蛍光標識で直接標識され得る：フルオレセイン（および誘導体）、６−Ｆａｍ、Ｈｅｘ、テトラメチルローダミン、シアニン−５、ＣＹ−３、アロフィコシアニン、ルシファーイエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ ｙｅｌｌｏｗ）ＣＦ、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、ローダミン、Ｔａｍｒａ、ＲｏｘおよびＤａｂｃｙｌ。間接標識は、例えば、（例えば、発蛍光団を用いて）標識され得るＭｕｔＳまたはＲｅｃＡに特異的な、「一次」抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を利用する。あるいは、一次抗ＭｕｔＳ抗体および抗ＲｅｃＡ抗体に特異的な、二次抗体（例えば、抗アイソタイプ抗体のような抗免疫グロブリン）が、（例えば、発蛍光団を用いて）標識され得る。
【００５７】
別の実施形態では、タンパク質（ＭｕｔＳまたはＲｅｃＡ、一次抗体または二次抗体）が、ビオチン化される。次いで、ビオチンは、蛍光性のアビジン（またはストレプトアビジン）により結合される。あるいは、ストレプトアビジン（これは多価である）は、初めに、ビオチン化されたタンパク質のビオチンに結合され得、次いで、他の蛍光標識されたビオチン化化合物に結合され得る。このタンパク質は、蛍光性マイクロビーズ、または異なる検出可能な標識に付着されているマイクロビーズに付着され得る。蛍光性マイクロビーズへのタンパク質の付着は、以下が挙げられるが、これらに限定されない、当該分野で周知の任意の方法によってであり得る：ポリスチレンビーズまたは他のビーズへの直接吸着、カルボキシル基、アミノ基、トシル基または他の基を介する共有連結、ビオチン／アビジンもしくはストレプトアビジン相互作用を介する結合（タンパク質のビオチン化を必要とする）、および固定された抗体への結合。標識されたビーズへＭｕｔＳを付着させることによる、ＭｕｔＳの標識は、固定化（Ｗａｎｇｅｒら、前出；Ｄｅｂｂｉｅら、前出）と機能的に等価であり、従って、ＭｕｔＳがニトロセルロースまたはポリエステルに固定される場合に観察される効果に類似する、ＭｕｔＳ（または他のミスマッチ結合タンパク質）機能を増強する。
【００５８】
（ＲｅｃＡの標識の代わりに、またはＲｅｃＡの標識に加えて）ＭｕｔＳおよびＤＮＡプローブを標識することもまた可能である。このプローブは、発蛍光団またはビオチンもしくはジゴキシゲニンのような化合物を用いて直接標識され得、そして従来の方法により付加物を検出し得る。このプローブは、蛍光の測定、色の発光の測定、または選択された標識に適切な任意の他の方法により検出される。
【００５９】
シグナル増幅は、例えば、（ａ）標識二次抗体または（ｂ）アビジンコートマイクロビーズもしくはストレプトアビジンコートマイクロビーズを、ビオチン標識プローブに結合するために使用することによって、導入され得る。これは、例えば、結合された複数のビオチン化プローブを生じ、これらの複数のビオチン化プローブは、（このプローブ／試験ＤＮＡ複合体が１つ以上のミスマッチまたは不対塩基を含む場合）ＭｕｔＳ分子により結合され、それにより、そのシグナルが非常に増大する。
【００６０】
この手順は、このプローブを、ＲｅｃＡフィラメント、Ｄループまたは三本鎖構造の形成に適切な条件下で、ＲｅｃＡ、ＭｕｔＳおよび試験ＤＮＡと混合することによって、実行される。ＲｅｃＡフィラメント形成は、例えば、ＭｇＣｌ２または酢酸Ｍｇ（１〜４ｍＭ）、ジチオスレイトール（０．２〜０．５ｍＭ）、およびＡＴＰまたはＡＴＰ［γ−Ｓ］（０．３〜１．５ｍＭ）を含む、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液またはＴｒｉｓ−アセテート緩衝液（２０〜４０ｍＭ、ｐＨ７．４〜７．９）中で達成され得る。ＡＴＰが使用される場合、ホスホクレアチンおよびクレアチンキナーゼからなるＡＴＰ再生系が、含まれ得る。ＲｅｃＡおよびプローブは、一般的に、モル比０．１〜３（ヌクレオチドに対するＲｅｃＡ）で添加される。このプローブが二本鎖である場合、このプローブは、ＲｅｃＡコーティングの前に、変性されていなければならない。インキュベーションは、室温（好ましくは３７℃）で、５〜３０分間行われる。Ｄループ形成および三本鎖構造の形成は、二本鎖ＤＮＡにＲｅｃＡフィラメントを添加する工程、および好ましくは３７℃にて、約１５分〜約２時間インキュベートする工程を包含する。単一の反応容器中でＲｅｃＡフィラメントを形成し、そしてホモロジー検索を行うこともまた、可能である。すなわち、同時に、ＲｅｃＡをオリゴヌクレオチドおよび二本鎖ＤＮＡと混合することをもまた、可能である。例えば、Ｒｉｇａｓら（前出）；Ｈｏｎｉｂｅｒｇ，ＳＭら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３：９５８６−９５９０（１９８６）；Ｆｅｒｒｉｎらの刊行物（前出）のいずれかを参照のこと。
【００６１】
ＭｕｔＳによるミスマッチ結合は、ＲｅｃＡまたはＲｅｃＡフィラメントが添加される時またはその前に、そのＭｕｔＳを二本鎖試験ＤＮＡに添加することによって、達成される。ＭｕｔＳは、溶液中であり得るかまたは固定され得る。一般的に、０．１ｎｇ〜０．５μｇのＭｕｔＳが添加される。例えば、Ｌｉｓｈａｎｓｋｉら（前出）；Ｗａｇｎｅｒら（前出）；Ｄｅｂｂｉｅら（前出）；米国特許第６，０２７，８７７号；同第６，１１４，１１５号；同第６，１２０，９９２号；同第６，３２９，１４７号；Ｇｉｆｆｏｒｄの米国特許第５，７５０，３３５号；Ｊｉｒｉｃｎｙら（前出）を参照のこと。
【００６２】
ＲｅｃＡフィラメントによるホモロジー検索およびＭｕｔＳによるミスマッチ塩基または不対塩基の結合を可能にするようにインキュベーションした後、その混合物は、好ましくは、蛍光標識の場合はフローサイトメトリーによって分析される。このフローサイトメーターは、（ＭｕｔＳ上の標識ならびにＲｅｃＡおよび／またはプローブ上の標識の）両方の標識が同時に存在すること、またはその２つ（もしくは３つ）の標識が並置することにより生じる「第３の」色が存在することを、シグナルとして検出するように設定される。このようなシグナルの存在は、１個または２〜３個のミスマッチもしくは不対塩基によって、そのプローブとは異なる配列がそのサンプル中に存在することの指標である。
【００６３】
本明細書中に記載されるＲｅｃＡ／ＭｕｔＳ法の能力は、そのバックグラウンドシグナルが非常に低いこと、そしてＲｅｃＡコートオリゴヌクレオチドプローブが、ミスマッチ塩基または不対塩基とヘテロ二重鎖を生じる様式で試験ＤＮＡに結合している条件下でのみ、ＲｅｃＡ＋ＭｕｔＳ（またはＭｕｔＳ＋ＤＮＡプローブまたはＭｕｔＳ＋ＲｅｃＡ＋ＤＮＡプローブ）が、一緒に見出されることである。
【００６４】
ＭｕｔＳは、その試験ＤＮＡ中で見出される他のミスマッチに結合すると予測されるが、これらは、稀であるはずである。この方法において、その試験ＤＮＡが決して変性およびアニールをしていないので、このことは、稀である。試験ＤＮＡの変性およびアニーリングは、現行のＭｕｔＳベースの変異欠失技術の力を失わせ得るプロセスであり、それは、相同（またはほぼ相同）なＤＮＡのアニーリングにより、そしてミスマッチ含有二次構造を形成し得るｓｓＤＮＡ領域を生じる不完全アニーリングにより生成される、ランダムミスマッチが原因である。ＲｅｃＡは、そのサンプル中のすべてのｓｓＤＮＡをコートする能力を有するが、上記の理由から、ｓｓＤＮＡストレッチは、非常に稀である。
【００６５】
目的の配列は、一般に、染色体１つあたり１つだけ存在する。従って、ＲｅｃＡ−ＭｕｔＳ並置またはプローブＤＮＡ−ＭｕｔＳ並置の各々の出現を検出するためのフロー条件を設定することは、簡単な問題である。ランダムなＭｕｔＳ結合を（これが生じる場合に）克服するために、ＤＮＡフラグメントのサイズが、剪断またはヌクレアーゼ消化によって、減少され得る。この減少の効果は、そのプローブとＲｅｃＡとが結合する同じフラグメント中のランダムなＭｕｔＳ結合の可能性を最小にすることである。
【００６６】
本発明の一般的に適用可能な別の実施形態において、２つの相補的ＤＮＡプローブが、１つのＤＮＡプローブの代わりに使用され得る。これらのプローブは、好ましくは、その試験ＤＮＡに添加される前に、それらの自己アニーリングを最小にするために、ＲｅｃＡと別々に予めコートされる。これらの２つの相補的ｓｓＤＮＡプローブは、目的の領域中の試験ＤＮＡの両方の鎖に結合し、それにより、（１）プローブ長の二重の二重鎖を形成することによりＤループ構造を安定化することを補助し；（２）すべての変異体対合／野生型対合（ＧからＣへのまたはＣからＧへのトランスバージョンから生じる対合を含む）の検出を確実にし；そして（３）シグナル（特に、ほとんど認識されないミスマッチからのシグナル）を増大させる。上記（２）における認識を確実にすることは、特に重要である。なぜなら、Ｃ：Ｃミスマッチは、インビボでも、今日までに開発されたいかなるミスマッチ検出法において検出されず、一方、その逆のＧ：Ｇミスマッチは、常に十分に検出されるからである。本発明者らおよびその同僚らは、単一のヘテロ二重鎖フラグメント中のミスマッチの数を増加させると、ＭｕｔＳによる結合を増加させ、そして二重の二重鎖構造中の各二重鎖領域が、１つのミスマッチを含むことを、発見した。
【００６７】
本発明の一般的に適用可能な別の実施形態において、ＭｕｔＳは、固定され得、そしてプローブまたはＲｅｃＡのいずれかが、検出可能に標識され得る。本実施形態において、固定されたＭｕｔＳへのプローブまたはＲｅｃＡの結合は、そのプローブと試験ＤＮＡとの間に形成されるＤループ構造における１つ以上のミスマッチまたは不対塩基を示す。
【００６８】
一般的に適用可能な別の実施形態において、試験ｄｓＤＮＡが固体支持体に固定され、上記のように標識することによって、変異およびＳＮＰの検出が可能になる。ここで、好ましい試験ＤＮＡは、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡである。増幅されたＤＮＡの固定は、プライマーの１つにある５’標識（例えば、ビオチン）またはカルボキシル基もしくはアミノ基を使用することによって、達成され得る。５’ビオチン標識を含む増幅されたＤＮＡは、アビジン結合またはストレプトアビジン結合を介して、固体支持体に固定され得る。プローブＤＮＡは、ＲｅｃＡでコートされ、そして固定されたＤＮＡと混合されるか、または、固定前に、三本鎖構造形成またはＤループ構造形成を可能にする条件下でこのＤＮＡと混合される。標識ＭｕｔＳまたはホモログが、三本鎖構造形成またはＤループ構造形成の前、後、または間のいずれかで、添加される。固定されたＤＮＡへのＭｕｔＳ（またはそのホモログ）の結合は、三本鎖構造形成またはＤループ構造形成中の１つ以上のミスマッチまたは不対塩基の存在を示す。この実施形態は、理想的には、マイクロアレイ（ＤＮＡチップ）適用における使用に適切である。
【００６９】
一般的に適用可能な別の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、Ｒｉｇａｓら（前出）におけるようなプローブ／試験複合体の固定を可能にするための５’付加物を備えて調製される。この付加物は、このオリゴヌクレオチドの特異的検索を可能にする、ビオチン部分、特異的オリゴヌクレオチドまたは他の任意の付加物であり得る。このプローブは、ＲｅｃＡフィラメントを形成するようにＲｅｃＡと混合され、その後、特異的Ｄループ構造を形成するように試験ＤＮＡと混合される。このプローブは、検出可能なさらなる標識を含み得るか、またはＤループ構造形成後に、標識ヌクレオチド三リン酸もしくは標識ヌクレオチド三リン酸アナログを使用して、アニールしたオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼにより伸長させることによって、標識され得る。この場合、Ｄループ構造を形成するオリゴヌクレオチドのみが標識され、このことは、さらなるどんなバックグラウンドシグナルさえも減少させる。さらなる特異性が、ヌクレオチドターミネーター（例えば、ジデオキシヌクレオチド三リン酸またはアシクロヌクレオチド三リン酸）を４つすべてのターミネーターの混合物中で使用することによって得られ得、この混合物において、標識は、そのオリゴヌクレオチドの３’末端を超えて試験ＤＮＡ中の最初の塩基と相補的であるターミネーターとのみ結合されている。
【００７０】
そのオリゴヌクレオチドの５’標識は、任意の固体支持体にＤループ構造を固定するために使用され得る。ＭｕｔＳ標識と、そのオリゴヌクレオチドの３’標識との結合は、Ｄループ領域中の１つ以上のミスマッチまたは不対塩基の存在を示し、そして試験ＤＮＡ中の特異的配列の存在または非存在を診断する。その固体支持体がマイクロタイタープレートである場合、オリゴヌクレオチドシグナルに対するＭｕｔＳシグナルの比は、試験ＤＮＡの遺伝子型の特徴である。例えば、非常に高い比（広範なＭｕｔＳ結合）は、そのプローブと異なる配列を有する試験遺伝子型についてのホモ接合性を示し、そのＤループ中のヘテロ二重鎖は、ミスマッチまたは不対塩基を含む。低い比（ＭｕｔＳ結合がほとんどないかまたはない）は、そのプローブと同一の配列を有する試験遺伝子型についてのホモ接合性を示し、Ｄループ中のヘテロ二重鎖は、完全に対合している。中間の比（上記高い比の約半分）は、ヘテロ接合性遺伝子型を示し、Ｄループ中のヘテロ二重鎖の約半分が完全に対合しており、そして半分が、ミスマッチまたは不対塩基を含む。
【００７１】
臨床診断に本発明の方法を適用する際、少量の血液サンプルを用いて複数のアッセイを実施することが可能である（なぜなら、１μｌの血液は、約１０４コピーの各配列を含むからである）。検出される配列について、サンプル中のポジティブシグナルの数は、その遺伝子型の指標である。なぜなら、低いシグナルまたはシグナルがないことは、そのサンプルが、そのプローブと完全に相補的である配列についてホモ接合性であることを示すからである。非常に高いシグナルは、（ＭｕｔＳまたはそのホモログの認識特性により決定した場合に）１つもしくは２〜３個の一ヌクレオチド置換または１つもしくは２〜３個の不対塩基だけそのプローブと異なる配列についての、ホモ接合性を示す。中間のシグナルは、目的の配列についてのヘテロ接合性を示す。
【００７２】
慣用的変異検出のために、標準物（すなわち、既知の遺伝子型）が、遺伝子型決定のための標準曲線を提供するために、試験サンプルの各バッチとともに使用される。当然、標準曲線形成および遺伝子型決定は、試験ＤＮＡの正確な定量に依存する。従って、ＲｅｃＡ触媒されるＤループ形成、ＭｕｔＳ結合およびフローサイトメトリーシグナル検出が、すべて効率的であり、その結果、例えば、５，０００個〜２０，０００個の配列が、遺伝子型決定のために十分である場合、１０００個以上の多さの別個のアッセイが、１ｍｌの血液に対して実施され得る。
【００７３】
この技術は、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、または増幅されたＤＮＡの単一サンプル中のいくつかの部位が同時に質問される多重化に、理想的には適切である。この適用において、個々のプローブ＋試験ＤＮＡ（Ｄループ構造または三本鎖構造）が、多くのプローブと試験ＤＮＡとの混合物から別個に単離されるのを可能にする付加物（最も好ましくは、５’オリゴヌクレオチド付加物）を用いて設計される。５’オリゴヌクレオチドが使用される場合、単離は、固定された相補的配列のオリゴヌクレオチドにこの特異的オリゴヌクレオチド付加物をアニーリングさせる工程を包含する。検出のためのプローブ標識は、その単離部分からそのプローブの反対側の３’末端に付加され得るか、またはその反応の間にポリメラーゼにより付加され得る（下記を参照のこと）。
【００７４】
各フローサイトメトリーを実行した後に単一のサンプルを脱保護することによって、その単一のサンプルに対して複数の連続試験を実行することもまた、可能である。ＲｅｃＡおよびＭｕｔＳの除去は、三本鎖構造すべてが離れることを引き起こす。その後、このオリゴヌクレオチドプローブは、そのサンプルをミニＤＮＡ結合カラム（これは、短いオリゴヌクレオチドを保持しない）に通すことによって、除去され得る。その後、この試験ＤＮＡは、新しいプローブを用いて、プロセス全体を通して再利用され得る。このプロセス全体は、当該分野で周知の方法および技術を使用して、容易に自動化され得る。
【００７５】
（固定されたＭｕｔＳと組み合わされたＲｅｃＡ／ＭｕｔＳシステムの例）
ＲｅｃＡは、試験ＤＮＡの変性を必要とすることなく、ヘテロ二重鎖の形成を容易にするので、本発明のＲｅｃＡ／ＭｕｔＳシステムは、ヘテロ二重鎖ＤＮＡの形成に依存する実質的にすべての変異／ＳＮＰ検出方法を強化するものとして使用され得る。これは、以下を含む：（１）ゲルシフトアッセイ、（２）フィルター結合アッセイ、（３）ミスマッチ切断アッセイ、および（４）固定化ミスマッチ結合タンパク質（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＭＢＰ））アッセイ。本発明者らのうちの一人によって開発されたＩＭＢＰアッセイは、標識されたプローブＤＮＡとＭｕｔＳ（固定化）とを含む、本発明のＲｅｃＡ／ＭｕｔＳシステムの構成要素を利用する。
【００７６】
しかし、最も首尾良いＩＭＢＰアッセイ形式は、試験ＤＮＡ（一般的には、ＰＣＲアンプリコン）と等しい長さのプローブを必要とする。ＲｅｃＡ／ＭｕｔＳシステムとＩＭＢＰアッセイとを組み合わせることによって、以下が達成される：（１）試験ＤＮＡを変性させる必要性を排除する、（２）以前のＩＭＢＰアッセイ形式で使用可能であった長さよりも長いＰＣＲ産物の使用を可能にする、（３）長いプローブ（これは一般的に、クローン化された配列のＰＣＲ増幅によって生成される）を、より短い合成オリゴヌクレオチドプローブと置換することを可能にする、および（４）短いオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせを使用することによって、単一のＰＣＲ産物がその配列に沿っていくつかの異なる部位で試験されることを可能にする。
【００７７】
試験ＤＮＡのＰＣＲ増幅を必要とする変異検出アッセイを悩ませる１つの主な問題は、増幅の間における誤りの導入である。ＰＣＲは、インビボでのＤＮＡ複製と比較した場合に、低忠実度のプロセスであることが周知である。各増幅サイクルにおいて導入される誤りは、プロセス全体を通して増大され、そして一般的にその誤りは無作為な位置に導入されるので、それらの誤りはすべて、ＰＣＲアンプリコンが変性およびアニールされる場合にミスマッチを形成する。「フラグメントあたりの誤り」の数は最も関心の高いところであり、かつ所定のフラグメントにおける誤りの可能性は明らかにフラグメントの長さに依存するので、ＰＣＲの誤りの頻度は、変異検出アッセイにおいて使用され得るＰＣＲフラグメントの長さを制限する。
【００７８】
本発明のＲｅｃＡ／ＭｕｔＳシステムは、試験ＤＮＡを増幅または変性する必要性を完全に排除することによって、ＰＣＲの誤りに関するこれらの懸念を最小化するかまたは排除する。従って、増幅が使用される場合であっても、アッセイに影響を及ぼす誤りは、最終的なＰＣＲサイクルにおいて作製される誤りのみである（なぜなら、初期の誤りは最終的なＰＣＲサイクルにおいて正確にコピーされ、そしてその後には、その分子は変性されないからである）。さらに、試験ＤＮＡにアニールするプローブは、多数のミスマッチまたは不対塩基を導入しない。なぜなら、本発明のプローブは、好ましくは非常に短い（すなわち、約２０〜６０ヌクレオチド）からである。
【００７９】
上記の条件は、ＲｅｃＡ／ＭｕｔＳ方法をＩＭＢＰアッセイに適用する場合に使用される。プローブは、任意の長さのものであり得、そして任意の供給源に由来するものであり得るが、好ましくは、約２０〜６０ヌクレオチドの長さの合成オリゴヌクレオチドまたは一対の相補的オリゴヌクレオチド（上記を参照のこと）である。また、プローブは、（１）特定の変異もしくは多型に特異的であるか、または（２）既知もしくは未知の単一ヌクレオチド多型の存在について試験される特定の領域に特異的である。
【００８０】
一対のプローブが使用される場合（上記を参照のこと）、それらのプローブは、好ましくは、ＲｅｃＡと個々に混合される。ＲｅｃＡフィラメントの形成は、試験ＤＮＡの存在下においてかまたは試験ＤＮＡとの混合前のいずれかにおいて起こることが可能とされる。
【００８１】
試験ＤＮＡは、任意の供給源由来であり得、好ましくは、ゲノムＤＮＡまたはＰＣＲ増幅されたＤＮＡであり得る。
【００８２】
Ｄループ（または、一対の相補的プローブを使用する場合には二本の二重鎖）は、固定されたＭｕｔＳ（または他のＭＢＰ）と混合される前に（または、ＭｕｔＳ（または他のＭＢＰ）の存在下において）、形成され得る。固定は、任意の固体支持体または担体に対してであり得る。「固体支持体」または「担体」とは、タンパク質を結合し得、そして同時にそのタンパク質を解離せずに洗浄することを可能にし得る、任意の支持体を意図する。周知の支持体または担体としては、天然のセルロース、改変されたセルロース（例えば、ニトロセルロース）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリビニリデンジフルオリド、デキストラン、ナイロン、ポリアクリルアミドおよびアガロース、またはＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。磁気ビーズもまた有用である。支持体材料は、固定されたＭＢＰが標的核酸分子に結合し得る限りにおいて、実質的にすべての可能な構造的構成を有し得る。従って、支持体の構成としては、微粒子、ビーズ、多孔性および不透過性の細片（ｓｔｒｉｐ）および膜、反応容器（例えば、試験管およびマイクロタイタープレート）の内部表面などが挙げられ得る。当業者は、ＭＢＰを結合するための多くの他の適切な担体を知り、または慣用的な実験によってこれらを確認し得る。
【００８３】
上記のように、ＳＳＢタンパク質は、必要に応じて、Ｄループの形成を容易にするため、およびＤループの安定性を増大させるために使用される。上記で示したように、ＭｕｔＳは、ミスマッチまたは不対塩基を含むＤループ構造を安定化する。
【００８４】
ＭｕｔＳ結合ＤＮＡの検出は、通常、標識されたプローブを使用することによって達成される。プローブは、任意の標識方法（上記の方法を含む）によって調製される、任意の発蛍光団、発色団、放射性核種、または発光体（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）で標識され得る。プローブの標識化はまた、標識されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを使用する、Ｄループ構造におけるオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ媒介性伸長によって達成され得る。ＲｅｃＡの標識化（特に、標識化抗ＲｅｃＡ抗体を介した標識化）はシグナルを増幅し、その結果ゲノムＤＮＡは、事前の増幅をせずに試験され得る。
【００８５】
ＲｅｃＡ／ＭｕｔＳ方法の能力を誇張することは難しい。ＲｅｃＡ／ＭｕｔＳ方法は、迅速であり、少量のサンプルで動作し、そして診断的な遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）および変異／ＳＮＰ検出のための臨床的適用に容易に適合され得る。おそらく、本発明の最も重要な際立つ利点は、ＤＮＡ増幅（すなわち、ＰＣＲ）からのその完全な独立である。
【００８６】
（キット）
本発明はまた、本明細書中に記載した方法を実施するために有用なキットまたは試薬系に関する。このようなキットは、本明細書中に開示された方法に従うアッセイを行うために必要とされる必須の要素を含む、試薬の組み合わせを含む。試薬系は、商業的にパッケージングされた形態においてか、試薬の適合性を可能にする組成物もしくは混合物としてか、試験デバイス構成においてか、またはより代表的には、試験キット（すなわち、必要な試薬を保持する、１つ以上の容器、デバイスなどのパッケージングされた組み合わせ）として提示され、そして通常は、アッセイの実施についての書面での説明書を備える。本発明のキットは、本明細書中に記載された種々のアッセイ形式を実施するために任意の構成および組成を含み得る。
【００８７】
ＲｅｃＡ、ＭｕｔＳ、ならびに適用可能な場合には、抗体および／またはＳＳＢを含むキットは、本発明の範囲内である。１つの実施形態では、本発明のキットは、特定の変異および／または多型、あるいは標的ＤＮＡの特定領域における変異および／または多型の検出を可能にするように設計され、（ａ）選択された変異および／または（ｂ）ＳＮＰ、あるいは（ｃ）標的ＤＮＡの特定の領域（１つまたは複数）（既知または未知の任意の変異または多型について、領域を走査することを可能にするため）に対して特異的なオリゴヌクレオチドまたは他のプローブを備える。プローブは、上記のように標識され得る。キットはまた、以下を備える：標識されたＭｕｔＳ、またはＭｕｔＳの検出を可能にする抗体（これは、固体支持体もしくは担体に固定され得るか、または別個の担体と固定化可能な形態で提供され得る）；ＲｅｃＡ（これは、標識され得る）；ならびに、適切な緩衝液および試薬の複数の容器。
【００８８】
別のキットは、エンドユーザーが、変異および／または多型の検出についてそれらの独自のプローブを設計することを可能にするようにか、またはエンドユーザーの選んだＤＮＡ領域を走査することを可能にするように設計され；このようなキットは、プローブＤＮＡを除く上記のすべての試薬を備える。
【００８９】
上記で引用された参考文献はすべて、詳細に援用されたか否かは別として、本明細書中で参考として援用される。
【００９０】
ここで本発明を完全に記載したが、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、そして過度な実験を伴わずに、同じことが広範な等価なパラメーター、濃度および条件において実施され得ることが当業者によって理解される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、種々の検出様式を含むＲｅｃＡ＋ＭｕｔＳ変異／ＳＮＰ検出方法の概略図である。図１は、工程（１）においてＲｅｃＡ（○）タンパク質が添加されるオリゴヌクレオチド「プローブ」を示す。ＲｅｃＡは、このプローブを被覆し、「ＲｅｃＡフィラメント」を形成する。工程（２）において、ＲｅｃＡフィラメントが試験ＤＮＡに添加され、三重鎖構造または「Ｄループ」構造の形成を可能にする。工程（３）において、ＭｕｔＳタンパク質が添加される。このプローブが試験ＤＮＡ配列に同一である場合、完全に対を形成した二重鎖（「ミスマッチなし」）が形成され、そしてＭｕｔＳは結合しない（左）。プローブと試験ＤＮＡ配列との間に１つ以上の配列差異が存在する場合、１つ以上のミスマッチまたは対を形成していない塩基（「ミスマッチ（ＳＮＰ）」）を含むヘテロ二重鎖が形成され、そしてＭｕｔＳは、このヘテロ二重鎖に結合する。
【図２】図２は、種々の検出様式を含むＲｅｃＡ＋ＭｕｔＳ変異／ＳＮＰ検出方法の概略図である。図２は、工程（３）の後に形成される最終複合体を示す。ここで、プローブおよびＭｕｔＳｎｏ両方が、標識される。×＝プローブ標識。星印＝ＭｕｔＳ標識。
【図３】図３は、種々の検出様式を含むＲｅｃＡ＋ＭｕｔＳ変異／ＳＮＰ検出方法の概略図である。図３は、ＭｕｔＳが標識され（星印）そしてＲｅｃＡが標識された（＊）場合の、工程（３）の後に形成される最終複合体を示す。
【図４】図４は、種々の検出様式を含むＲｅｃＡ＋ＭｕｔＳ変異／ＳＮＰ検出方法の概略図である。図４は、ＳＳＢタンパク質（菱形）が添加された場合の、工程（３）の後に形成される最終複合体を示す。標識された（下向き黒三角で）ＳＳＢは、ｓｓＤＮＡに結合する。ここで、ＭｕｔＳはまた、標識される（星印）。
【図５】図５は、種々の検出様式を含むＲｅｃＡ＋ＭｕｔＳ変異／ＳＮＰ検出方法の概略図である。図５は、ＭｕｔＳが標識され、そしてプローブが標識デオキシヌクレオチド三リン酸を用いたポリメラーゼ伸長によって標識された（→←→←）後の、工程（３）の後に形成される最終複合体を示す。
【図６】図６は、種々の検出様式を含むＲｅｃＡ＋ＭｕｔＳ変異／ＳＮＰ検出方法の概略図である。図６は、ＭｕｔＳが固体表面（斜線部）に固定された場合の、工程（３）の後に形成される最終複合体を示す。この実施形態において、プローブは、標識される（×）。
【図７】図７は、種々の検出様式を含むＲｅｃＡ＋ＭｕｔＳ変異／ＳＮＰ検出方法の概略図である。図７は、プローブ（その配列は、試験ＤＮＡとのミスマッチまたはミス対形成を有する）が、２つの相補的オリゴヌクレオチド（これらの各々が、ＲｅｃＡ（○）によって「被覆」される）の形態である場合の、工程（３）の後に形成される最終複合体を示す。ＭｕｔＳは標識される（星印）。形成される構造は、二重Ｄループである。
Claims (28)
- 二本鎖試験ＤＮＡ分子中の変異および／またはＳＮＰを検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）必要に応じて検出可能に標識されている一本鎖ＤＮＡプローブを提供する工程であって、該プローブは、（ｉ）既知のヌクレオチド配列、または（ｉｉ）該試験ＤＮＡの少なくとも一部の配列に相補的な配列、を有する、工程；
（ｂ）該プローブを、必要に応じて検出可能に標識されているＲｅｃＡタンパク質と接触させて、ＲｅｃＡフィラメントを形成させる、工程；
（ｃ）該ＲｅｃＡフィラメントを該試験ＤＮＡと接触させて、これにより該試験ＤＮＡ中に三本鎖ＤＮＡ Ｄループ構造を形成させる工程であって、該Ｄループ構造は、該プローブおよび該試験ＤＮＡの２つの鎖を含む、工程；
（ｄ）該ＤＮＡ Ｄループ構造を、必要に応じて検出可能に標識されているＭｕｔＳタンパク質と接触させる工程であって、該ＭｕｔＳは、Ｄループ構造の二重鎖部分に存在する１つ以上の塩基対ミスマッチまたは不対塩基に結合する、工程；ならびに
（ｅ）ＤＮＡ Ｄループ構造に結合したＭｕｔＳの存在を検出する、工程、
を包含する方法であって、
ここで、該結合したＭｕｔＳの存在は、該試験ＤＮＡ中の変異またはＳＮＰの存在を示す、方法。 - 二本鎖試験ＤＮＡ分子中の変異および／またはＳＮＰを検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）必要に応じて検出可能に標識されている２つの相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドを含むプローブを提供する工程であって、該プローブは、既知のヌクレオチド配列、または該試験ＤＮＡの少なくとも一部の配列に相補的な配列、を有する、工程；
（ｂ）該オリゴヌクレオチドの各々を、一本鎖形態で、必要に応じて検出可能に標識されているＲｅｃＡタンパク質と接触させて、ＲｅｃＡフィラメントを形成させる、工程；
（ｃ）該ＲｅｃＡフィラメントを該試験ＤＮＡと接触させて、これにより該試験ＤＮＡ中に四本鎖ＤＮＡ構造を形成させる工程であって、該構造は、該プローブおよび該試験ＤＮＡの２つの鎖を含み、該プローブ鎖は、該試験ＤＮＡ鎖とアニーリングされている、工程；
（ｄ）該ＤＮＡ構造を、必要に応じて検出可能に標識されているＭｕｔＳタンパク質と接触させる工程であって、該ＭｕｔＳは、該四本鎖ＤＮＡ構造に存在する１つ以上の塩基対ミスマッチまたは不対塩基に結合する、工程；ならびに
（ｅ）ＤＮＡ構造に結合したＭｕｔＳの存在を検出する、工程、
を包含する方法であって、
ここで、該結合したＭｕｔＳの存在は、該試験ＤＮＡ中の変異またはＳＮＰの存在を示す、方法。 - 二本鎖試験ＤＮＡ分子中の変異および／またはＳＮＰを検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）必要に応じて検出可能に標識されている一本鎖ＤＮＡプローブを提供する工程であって、該プローブは、（ｉ）既知のヌクレオチド配列、または（ｉｉ）該試験ＤＮＡ分子の少なくとも一部の配列に相補的な配列、を有する、工程；
（ｂ）該プローブを、必要に応じて検出可能に標識されているＲｅｃＡタンパク質と接触させて、ＲｅｃＡフィラメントを形成させる、工程；
（ｃ）該ＲｅｃＡフィラメントを該試験ＤＮＡと接触させて、これにより該試験ＤＮＡ中に三本鎖ＤＮＡ Ｄループ構造を形成させる工程であって、該構造は、該プローブおよび該試験ＤＮＡの２つの鎖を含む、工程；
（ｄ）該ＤＮＡ Ｄループ構造を、該Ｄループ構造の二重鎖部分に存在する１つ以上の塩基対ミスマッチまたは不対塩基に結合する、固定化したＭｕｔＳと接触させる、工程；ならびに
（ｅ）ＭｕｔＳに結合した、固定化したプローブＤＮＡまたはＲｅｃＡの存在を検出する、工程、
を包含する方法であって、
ここで、該結合したプローブＤＮＡまたはＲｅｃＡの存在は、該試験ＤＮＡ中の変異またはＳＮＰの存在を示す、方法。 - 二本鎖試験ＤＮＡ分子中の変異および／またはＳＮＰを検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）必要に応じて検出可能に標識されている２つの相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドを含むプローブを提供する工程であって、該プローブは、既知のヌクレオチド配列、または該試験ＤＮＡの少なくとも一部の配列に相補的な配列、を有する、工程；
（ｂ）該プローブオリゴヌクレオチドの各々を、一本鎖形態で、必要に応じて検出可能に標識されているＲｅｃＡタンパク質と接触させて、ＲｅｃＡフィラメントを形成させる、工程；
（ｃ）該ＲｅｃＡフィラメントを該試験ＤＮＡと接触させて、これにより該試験ＤＮＡ中に四本鎖ＤＮＡ構造を形成させる工程であって、該構造は、各々がプローブオリゴヌクレオチド鎖にアニーリングされている該試験ＤＮＡの２つの鎖を含む、工程；ならびに
（ｄ）該ＤＮＡ構造を、該四本鎖ＤＮＡ構造中に存在する１つ以上の塩基対ミスマッチまたは不対塩基に結合する、固定化したＭｕｔＳと接触させる、工程、
を包含する方法であって、
これにより該変異および／またはＳＮＰを検出する、方法。 - 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記検出される変異が、単一ヌクレオチド置換または１〜４個のヌクレオチドの付加もしくは欠失である、方法。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記試験ＤＮＡ分子が、原核生物ゲノムＤＮＡ、真核生物ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、およびＰＣＲまたは別の増幅方法によって増幅されたＤＮＡフラグメントからなる群より選択される、方法。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記プローブは、以下：
（ａ）合成オリゴヌクレオチド；
（ｂ）組換えオリゴヌクレオチド；ならびに
（ｃ）二重鎖ＤＮＡ分子を変性、および必要に応じて切断することによって得られる、オリゴヌクレオチド、
からなる群より選択される、方法。 - 前記オリゴヌクレオチドが、約２０〜約６０ヌクレオチド長を有する、請求項７に記載の方法。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、ここで：
（ｉ）前記プローブおよび前記ＭｕｔＳが標識されている；
（ｉｉ）前記標識が、発蛍光団、発色団、放射性核種、ビオチンまたはジゴキシゲニンである；ならびに
（ｉｉｉ）該プローブ標識と該ＭｕｔＳ標識との結合が、前記試験ＤＮＡ中の前記変異またはＳＮＰの存在を示す、
方法。 - 前記ＲｅｃＡタンパク質がＥ．ｃｏｌｉ由来である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、ここで：
（ｉ）前記ＲｅｃＡおよび前記ＭｕｔＳが標識されている；
（ｉｉ）前記標識が、発蛍光団、発色団、放射性核種、ビオチンまたはジゴキシゲニンである；ならびに
（ｉｉｉ）該ＲｅｃＡ標識と該ＭｕｔＳ標識との結合が、前記試験ＤＮＡ中の前記変異またはＳＮＰの存在を示す、
方法。 - 前記ＭｕｔＳが、固体支持体に固定化されている、請求項１または２に記載の方法。
- 請求項１または２に記載の方法であって、前記検出可能なＭｕｔＳ標識が、発蛍光団、発色団、放射性核種、ビオチン、ジゴキシゲニン、検出可能に標識されたビーズ、検出可能に標識された抗ＭｕｔＳ抗体、または標識されていない抗ＭｕｔＳ抗体と、該抗ＭｕｔＳ抗体に特異的な、検出可能に標識された二次抗体との組み合わせである、方法。
- 請求項１または２に記載の方法であって、前記ＲｅｃＡタンパク質が標識されており、そして、前記検出が、前記ＤＮＡ Ｄループ構造中に存在する前記ＲｅｃＡ標識と結合した前記ＭｕｔＳ標識の検出である、方法。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記検出可能なＲｅｃＡ標識が、検出可能に標識された一次抗ＲｅｃＡ抗体、または標識されていない抗ＲｅｃＡ抗体と、抗ＲｅｃＡ抗体に特異的な、検出可能に標識された抗体との組み合わせ、の形態にある、方法。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記検出可能に標識されたプローブ、前記検出可能に標識されたＲｅｃＡおよび／または前記検出可能に標識されたＭｕｔＳの１つ以上が、発蛍光団で標識されている、方法。
- 前記検出が、フローサイトメトリーによる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記検出が、フローサイトメトリーによる、請求項１６に記載の方法。
- 前記ＤＮＡ Ｄループ構造が、工程（ｄ）の前に、必要に応じて検出可能に標識されているＳＳＢタンパク質を添加することによって安定化される、請求項１または３に記載の方法。
- 請求項１９に記載の方法であって、ここで：
（ｉ）前記ＳＳＢタンパク質が、検出可能な標識で標識されている；
（ｉｉ）前記標識が、発蛍光団、発色団、放射性核種、ビオチン、ジゴキシゲニン、標識された抗ＳＳＢ抗体、または標識されていない抗ＳＳＢ抗体と、該抗ＳＳＢ抗体に特異的な、標識された二次抗体との組み合わせである；ならびに
（ｉｉｉ）該ＳＳＢ標識と該ＭｕｔＳ標識との結合が、前記試験ＤＮＡ中の前記変異またはＳＮＰの存在を示す、
方法。 - 請求項１または３に記載の方法であって、前記検出が、以下：
（ａ）ＭｕｔＳおよび前記プローブ；
（ｂ）ＭｕｔＳおよびＲｅｃＡ；
（ｃ）ＭｕｔＳ、ＲｅｃＡおよび該プローブ；
（ｄ）ＭｕｔＳおよびＳＳＢ；
（ｅ）ＭｕｔＳ，ＳＳＢおよび該プローブ；または
（ｆ）ＭｕｔＳ，ＳＳＢ、該プローブおよびＲｅｃＡ、
に結合した２つ、３つまたは４つの標識の同時発生を検出するフローサイトメトリーによる、方法。 - 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記プローブが、標識したデオキシヌクレオチド３リン酸またはヌクレオチドターミネータを使用するポリメラーゼ伸長によって標識される、方法。
- 前記試験ＤＮＡが、固体支持体に固定化されている、請求項１または２に記載の方法。
- 請求項１または２に記載の方法であって、前記プローブが、該プローブの固定化、その後の前記Ｄループ構造の形成を可能にする付加物に結合されている、方法。
- 前記付加物が、オリゴヌクレオチドである、請求項２４に記載の方法。
- 前記付加物が、ビオチンまたはジオキシゲニンである、請求項２４に記載の方法。
- ＤＮＡサンプル中の１つ以上の変異または多型を検出するために有用なキットであって、該キットは、その中に１つ以上の容器を受けるように適合されており、以下：
（ａ）必要に応じて検出可能に標識されているＲｅｃＡタンパク質を含む、第１の容器；
（ｂ）必要に応じて検出可能に標識されているＭｕｔＳタンパク質を含む、第２の容器；および
（ｃ）緩衝液、および結合したＭｕｔＳを検出し得る試薬を含む、第３の容器または複数の容器、
を備える、キット。 - ＤＮＡサンプル中の特定の変異もしくは多型、または特定の群の変異もしくは多型を検出するため、あるいは、任意の変異または多型についてＤＮＡの特定の領域を試験するために有用なキットであって、該キットは、その中に１つ以上の容器を受けるように適合されており、以下：
（ａ）必要に応じて検出可能に標識されているＲｅｃＡタンパク質を含む、第１の容器；
（ｂ）必要に応じて検出可能に標識されているＭｕｔＳタンパク質を含む、第２の容器；および
（ｃ）特定のオリゴヌクレオチドプローブを含む第３の容器または複数の容器であって、該プローブは、該サンプルの該ＤＮＡの特定の領域中の特定の配列に相補的であるように選択され、該特定のＤＮＡ領域中に変異配列または多型配列を有するミスマッチ含有へテロ二重鎖または不対塩基含有二重鎖を形成し、該プローブは、必要に応じて検出可能に標識されている、第３の容器または複数の容器；ならびに
（ｄ）緩衝液、および該プローブと該サンプルＤＮＡとの間に形成された特定のヘテロ二重鎖に結合しているＭｕｔＳを検出し得る試薬を含む、第４の容器または複数の容器、
を備える、キット。
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