KR100681945B1

KR100681945B1 - ＭｕｔＳ 돌연변이체-형광물질 결합체의 형광발광 변화를이용한 잘못 짝지어진 ＤＮＡ의 검출방법

Info

Publication number: KR100681945B1
Application number: KR1020050075618A
Authority: KR
Inventors: 반창일; 정서만; 조민선
Original assignee: 학교법인 포항공과대학교; 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2005-08-18
Filing date: 2005-08-18
Publication date: 2007-02-12

Abstract

본 발명은 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus, Taq.) 유래 MutS 돌연변이체와 형광물질(fluorophore)과의 결합체(conjugate)의 형광발광의 변화를 이용하여 잘못 짝지어진 DNA를 검출하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 야생형 Taq. MutS 단백질의 42번 시스테인을 시스테인 외의 다른 아미노산으로 치환시키고, 469번 트레오닌은 시스테인으로 치환시켜 티올-특이적인 형광물질을 결합시킨 MutS 돌연변이체에 시료 DNA를 첨가한 후 형광발광의 변화를 측정하여 잘못 짝지어진 DNA를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 검출방법은 겔 이동성 분석(gel mobility shift assay) 방법이나 표면에 고정화된 MutS를 이용하는 방법보다 훨씬 간단하고 쉽게 잘못 짝지어진 DNA를 검출할 수 있으므로 유전적 돌연변이의 검출뿐만 아니라 DNA 틀린 짝 복구(DNA mismatch repair) 기작을 규명하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＭｕｔＳ 돌연변이체-형광물질 결합체의 형광발광 변화를 이용한 잘못 짝지어진 ＤＮＡ의 검출방법{METHOD FOR DETECTING MISMATCHED DNA USING FLUORESCENCE CHANGE OF MutS MUTANT-FLUOROPHORE CONJUGATE}

도 1a는 잘못 짝지어진 DNA와 결합된 야생형 Taq . MutS의 DNA 결합 도메인의 결정 구조를 나타낸 것이고,

도 1b는 본 발명에 따라 MutS 돌연변이체-형광물질 결합체를 이용하여 잘못 짝지어진 DNA를 검출하는 과정을 나타낸 모식도이고,

도 2는 (a) Taq. MutS 돌연변이체와 상기 돌연변이체에 형광물질인 IAANS가 표지된 결합체를 SDS-PAGE로 분석한 결과와 (b) 상기 SDS-PAGE 겔의 형광 이미지를 나타낸 것이고,

레인 1: 분자량 마커, 레인 2: MutS 돌연변이체

레인 3: IAANS-MutS 돌연변이체 결합체

도 3은 GT 틀린 짝을 포함하는 dsDNA와 IAANS-MutS 돌연변이체 결합체 또는 표지되지 않은 MutS 돌연변이체의 결합여부를 확인한 겔 이동성 분석 결과이고,

도 4a는 GT 틀린 짝을 포함하는 dsDNA의 양을 증가시키면서 IAANS-MutS 돌연변이체 결합체의 방출 스펙트럼(emission spectra)의 변화를 관찰한 결과이고,

도 4b는 IAANS-MutS 돌연변이체 결합체에 대한 GT 틀린 짝을 포함하는 dsDNA의 결합 곡선(binding curve)을 나타낸 것이고,

도 4c는 서로 다른 틀린 짝을 포함하는 dsDNA에 대하여 IAANS-MutS 돌연변이체 결합체의 방출 스펙트럼을 비교한 결과이고,

도 5는 (a) CT 틀린 짝, (b) CC 틀린 짝, 및 (c) AT 짝을 포함하는 dsDNA의 양을 증가시키면서 IAANS-MutS 돌연변이체 결합체의 방출 스펙트럼의 변화를 측정한 결과이다.

본 발명은 써머스 아쿠아티쿠스(thermus aquaticus, Taq.) 유래 MutS 돌연변이체-형광물질 결합체의 형광발광 변화를 이용하여 잘못 짝지어진 DNA를 검출하는 방법에 관한 것이다.

많은 생명체들에서 메틸-유도된 DNA 틀린 짝 복구(methyl-directed DNA mismatch repair, MMR) 시스템을 담당하는 단백질인 MutS 및 그의 동족체들(homologues)은 서로 다른 형태의 틀린 짝들에 대하여 다양한 친화력을 가지고 1 내지 4 염기 삽입 또는 결실 루프뿐만 아니라 모든 가능한 단일-염기 틀린 짝들(single-base mismatches)을 특이적으로 인식하고 결합할 수 있다(Lu AL, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 4639-4643, 1983; Lieb M, J. Bacteriol. 169: 5241-5246, 1987; Jiricny J, et al., Nucleic Acids Res. 25: 7843-7853, 1988).

잘못 짝지어진 DNA를 검출하기 위한 MutS의 가능성은 겔 이동성 분석(gel mobility shift assay)(Geschwind DH, et al., Gene. Anal. Biomol. Eng. 13: 105-111, 1996; Smith J 및 Modrich P, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 4374-4379, 1996), 뉴클리아제 보호(nuclease protection)(Ellis LA, et al., Nucleic Acids Res. 22: 2710-2711, 1994), 필터 결합 분석(filter binding assay)(Lishanski A, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 2674-2678, 1994), 전기화학적 방법(electrochemical method)(Han A, et al., Nucleic Acids Res. Suppl. 2: 287-288, 2002), 표면 양자 공명(surface plasmon resonance, SPR)(Gotoh M, et al., Genet. Anal. Biomol. Eng. 14: 47-50, 1997), 석영 결정 미량천칭(quartz crystal microbalance, QCM)(Su X, et al., Anal. Chem. 76: 489-494, 2004) 및 단백질/DNA 칩-기초 분석(protein/DNA chip-based assay)(Bi LJ, et al., Anal. Chem. 75: 4113-4119, 2003; Behrensdorf HA, et al., Nucleic Acids Res. 30: e64, 2002)과 같은 다양한 방법들에서 검증되어 왔다. 그러나, 상기 방법들 뿐만 아니라 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNPs)과 같은 검출방법들은 탐침을 방사성 동위원소로 표지하거나 고형 표면에 고정시키는 등의 노동-집약적인 단계를 요구한다. 따라서, 잘못 짝지어진 DNA를 검출하기 위한 간단하고 정량적인 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

한편, 소량의 리간드에 대한 다양한 광학 바이오센서들(optical biosensors) 은 단백질에 형광물질을 부위 특이적으로 도입함으로써 성공적으로 제작되어 왔다(Morii T, et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 1138-1139, 2002; Chan P, et al., J. Am. Chem. Soc. 126: 4074-4075, 2004). 이때, 형광물질은 단백질의 활성에는 영향을 미치지 않으면서 국소적인 형태학적 변화만을 야기할 수 있는 지역에 도입되어야만 하고, 이러한 탐침의 정확한 배치가 단백질-형광물질 결합체를 바이오센서로 사용하는데 있어서 관건이 되고 있다.

써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus, Taq.) 유래 MutS는 (1) 넓은 범위의 pH 및 온도조건(0 내지 70℃)에서 활성을 유지할 수 있어서(Biswas I, et al., J. Biol. Chem. 271: 5040-5048, 1996) 이를 이용한 바이오센서는 정상적인 생리학적 조건을 벗어난 범위에서도 작동할 수 있고; (2) 티올-특이적인 형광물질(thiol-specific fluorophore)이 쉽게 부위-특이적으로 도입될 수 있는 단 한 개의 시스테인 잔기(Cys42)만을 가지고 있으며; (3) 잘못 짝지어진 DNA와 결합된 Taq. MutS의 결정 구조가 이미 보고되어 있어(Obmolova G, et al., Nature 407: 703-710, 2000; Alani E, et al., J. Biol. Chem. 278: 16088-16094, 2003), 이를 이용하면 환경변화에 민감한 형광물질들과의 공유결합(covalent attachment)을 위해 최소한의 구조적 혼란(structural perturbation)을 야기하면서 추가적인 시스테인 잔기들이 도입될 수 있는 위치를 규명할 수 있다는 장점이 있다.

이에, 본 발명자들은 잘못 짝지어진 DNA를 간단하고 정량적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 형광물질로 표지된 Taq. MutS 돌 연변이체가 잘못 짝지어진 DNA와 결합하게 되면 구조적인 변화가 야기되어 형광발광의 변화가 일어난다는 사실을 발견하고 이를 이용하여 간단하면서도 정량적으로 잘못 짝지어진 DNA를 검출할 수 있는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 MutS 돌연변이체-형광물질 결합체의 형광발광의 변화를 이용하여 기존의 검출방법에 비하여 훨씬 더 정량적이고 신속하면서도 간편하게 잘못 짝지어진 DNA를 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 검출방법을 이용하여 잘못 짝지어진 DNA를 정량적이고 신속하게 검출할 수 있는 바이오센서를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 야생형 Taq. MutS 단백질의 42번 시스테인을 시스테인 외의 다른 아미노산으로 치환시키고, 469번 트레오닌은 시스테인으로 치환시켜 티올-특이적인 형광물질을 결합시킨 MutS 돌연변이체에 시료 DNA를 첨가한 후 형광발광의 변화를 측정하여 잘못 짝지어진 DNA를 검출하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 검출방법의 특징은 잘못 짝지어진 DNA를 간편하고 신속하게 정량 적으로 검출하기 위하여 MutS 돌연변이체-형광물질 결합체를 이용한다는 것으로, 바람직하게는 하기와 같은 단계를 포함할 수 있다.

1) 야생형 Taq. MutS 단백질의 42번 시스테인을 시스테인 외의 다른 아미노산으로 치환시키고, 469번 트레오닌은 시스테인으로 치환시킨 MutS 돌연변이체의 상기 469번 변이 잔기에 티올-특이적인 형광물질을 결합시켜 MutS 돌연변이체-형광물질 결합체를 제조하는 단계;

2) 상기 MutS 돌연변이체-형광물질 결합체에 시료 DNA를 첨가하여 반응시키는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 반응물의 형광발광을 측정하여 반응 전의 MutS 돌연변이체-형광물질 결합체의 형광발광과 비교하는 단계.

단계 1)은 MutS의 치환 돌연변이체를 제조한 후 상기 돌연변이체에 부위 특이적으로 티올-특이적인 형광물질을 표지하는 단계이다.

MutS를 구성하는 다섯 개의 구조적 도메인들 중에서 도메인 Ⅰ 및 Ⅳ가 DNA 결합에 관여하는데(도 1a 참조), 잘못 짝지어진 DNA가 존재하는 경우에 상기 도메인들은 DNA와의 상호작용을 통해 Taq. MutS-틀린 짝 DNA 결합체의 결정 구조내에 배열된다. 이는 DNA 결합에 의해 상기 도메인들의 구조가 DNA 위에 적재될 수 있는 "열린 형태(open form)"에서 DNA를 감쌀 수 있는 "닫힌 형태(closed form)"로 전환됨을 제시하는 것이다. 본 발명에서는 야생형 Taq. MutS가 용액 내에서 이량체 형태로 존재한다는 사실을 고려하여 각 소단위(subunit)의 이량체 경계면에 존 재하는 아미노산 잔기에 형광물질이 표지되도록 한다. 이에, 본 발명에서는 MutS가 잘못 짝지어진 DNA와 결합되어 구조적인 변화가 야기되는 경우 MutS에 표지된 형광물질의 자가-소멸(self-quenching)에 의한 형광발광의 변화를 효과적으로 유도하기 위하여, 기존에 티올-특이적인 형광물질의 결합부위로 알려진 도메인 Ⅰ의 42번 시스테인 잔기를 시스테인 외의 다른 아미노산으로 치환하여 상기 형광물질의 결합을 차단하는 대신, 도메인 Ⅳ의 469번 트레오닌 잔기를 시스테인으로 치환하여 티올-특이적인 형광물질이 부착될 수 있는 MutS 돌연변이체를 제조한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 42번 시스테인 잔기를 알라닌으로 치환하는데, 알라닌은 기능성 그룹이 작고 다른 잔기에 대한 반응성이 없어 단백질의 전체 구조에 영향을 주지 않는다는 장점을 갖는다.

본 발명에서 도메인 Ⅰ의 42번 시스테인 잔기를 대신하여 형광물질 표지부위로 선택된 도메인 Ⅳ의 469번 트레오닌 잔기는 잘못 짝지어진 DNA와의 결합에 의해 격렬한 형태학적 변화를 거치게 된다(도 1b 참조).

상기 MutS 돌연변이체는 부위-특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의해 제조된 MutS의 돌연변이체를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 대장균 형질전환체를 배양한 후 이로부터 분리·정제하거나 통상적인 화학합성법으로 제조하여 준비할 수 있다.

이와 같이 준비된 MutS 돌연변이체에 티올-특이적인 형광물질을 표지하여 MutS 돌연변이체-형광물질 결합체를 제조한다. 티올-특이적인 형광물질은 표본으로 사용한 물질의 티올기에 결합하여 표본 물질에 적합한 파장대의 빛이 조사 (excitation)되면 형광을 발산(emission)하는 특징을 가지고 있는데, IAANS(2-(4'-(Iodoacetoamido)anilino) naphthalene-6-sulfonic acid), BADAN(6-bromoacetyl-2-dimethylamino naphthalene) 또는 N-(1-피렌) 이오도아세트아미드(N-(1-pyrene) iodoacetamide) 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 티올-특이적인 형광물질로 IAANS를 사용하는데, IAANS는 단백질과 결합하는 경우 형광 강도(fluorescence intensity) 및 방출 파장(emission wavelength)이 기질 결합(substrate binding), 단백질의 중첩/미중첩(folding/unfolding), 이온 강도에 있어서의 변화 및 표지된 단백질과 다른 단백질 또는 핵산과의 조합에 매우 민감하게 반응하기 때문에 단백질의 형태학적 연구에 광범위하게 사용되고 있다(Abbott MB, et al., J. Biol. Chem. 275: 20610-20617, 2005).

형광물질이 표지된 결합체를 제조하기 위하여, 티올-특이적인 형광물질 IAANS를 MutS 돌연변이체의 469번 시스테인 잔기에 공유 결합시킨다. 이때, MutS 돌연변이체와 IAANS는 1:1 내지 1:20의 몰비로 혼합하여 실온의 암실에서 3 내지 24시간 동안 반응시키는 것이 바람직하다.

단계 2)는 상기와 같이 제조된 MutS 돌연변이체-형광물질 결합체에 틀린 짝 염기를 포함하는지 여부를 조사하고자 하는 시료 DNA를 첨가하고 이들 간의 결합반응을 유도하는 단계이다. 상기 결합반응은 MutS 돌연변이체-형광물질 결합체와 시료 DNA를 1:0.15 내지 1:3의 몰비로 혼합하고 25℃에서 5 내지 10 분간 반응시켜 이루어진다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 인위적으로 GT 틀린 짝, CT 틀린 짝, CC 틀린 짝, 및 AT 짝을 포함하는 이중가닥 DNA들을 합성하여 이를 시료 DNA로 사용한다.

단계 3)은 시료 DNA가 잘못 짝지어진 DNA일 경우 MutS 돌연변이체-형광물질 결합체가 이에 결합하면서 야기되는 구조적인 변화로 인한 형광발광의 변화를 측정하는 단계이다.

MutS 돌연변이체-형광물질 결합체가 잘못 짝지어진 DNA와 결합하면 열린 형태에서 닫힌 형태로 구조가 바뀌면서 MutS 돌연변이체의 이량체 경계면에 위치한 각 단량체의 469번 변이 잔기에 표지된 두 형광물질 분자간의 거리가 매우 가까워진다. 이와 같이 인접한 형광물질 분자들은 서로간의 상호작용에 의해 형광의 자가-소멸(self-quenching)이 유도되어 형광발광이 현저히 감소하게 되고, 그러한 차이를 검출함으로써 시료 DNA가 틀린 짝 염기를 포함하는지 여부를 결정할 수 있다.

본 발명의 IAANS-MutS 돌연변이체 결합체를 GT 틀린 짝을 포함하는 이중가닥 DNA와 반응시키면 짝지어진 DNA의 농도가 증가할수록 결합체의 방출 강도(emission intensity)는 감소한다(도 4a 참조). 또한, IAANS-MutS 돌연변이체 결합체는 기존에 보고된 야생형의 MutS와 같이 GT 틀린 짝에 대해 가장 강한 결합 친화력을 보이고, 상대적으로 CT 틀린 짝, CC 틀린 짝 및 AT 짝에는 약한 결합력을 나타내어 틀린 짝 형태에 대하여 자체적인 선호도(preference)를 가지고 있다(도 4c 참조). IAANS-MutS 돌연변이체 결합체의 각각의 잘못 짝지어진 DNA에 대한 해리상수(dissociation constant)는 GT 틀린 짝에 대해서는 0.20 μM, CT 틀린 짝에 대해서 는 0.87 μM, CC 틀린 짝에 대해서는 2.6 μM, 동종이중체인 AT 짝에 대해서는 3.0 μM이고, 이는 겔 이동성 분석(gel mobility shift assay)에 의해 얻어진 결과들에 상응하는 것이다.

따라서, 본 발명에 따른 MutS 돌연변이체-형광물질 결합체의 형태학적 변화에 따른 형광발광의 변화를 이용하여 잘못 짝지어진 DNA를 검출하는 방법은 기존에 겔 이동성 분석이나 표면에 고정화된 MutS를 이용하는 방법보다 훨씬 간단하고 쉽게 잘못 짝지어진 DNA를 검출할 수 있으므로 유전적 돌연변이의 검출뿐만 아니라 DNA 틀린 짝 복구(DNA mismatch repair) 기작을 규명하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 검출방법을 이용하여 잘못 짝지어진 DNA를 검출할 수 있는 바이오센서도 발명의 범위에 포함한다.

본 발명에 따른 바이오센서는 환경변화에 민감한 형광물질, 바람직하게는 IAANS를 상술하는 MutS 돌연변이체의 469번 아미노산에 결합시킴으로써 제조된, 잘못 짝지어진 DNA를 직접적으로 검출할 수 있는 형광 바이오센서로서, 50 nM 정도로 낮은 수준의 GT 틀린 짝을 포함하는 DNA도 검출할 수 있다.

본 발명에 따른 바이오센서는 기존의 통상적인 겔 이동성 분석보다 훨씬 더 정량적이고 빠른 분석을 제공하고, 고체 표면 위에 탐침을 개별적으로 표지하고 고정화시키는 과정이 요구되지 않아 전기화학적 분석, SPR, QCM 및 단백질/DNA 칩-기초 분석과 같은 다른 기술들에 비하여 공정이 간단하기 때문에 고효율 스크리닝 포맷(high throughput screening format)에 용이하게 확대될 수 있다는 장점을 갖는 다. 따라서, 상기 바이오센서는 유전적 질병의 조기 진단에 적용될 수 있는 유전적 돌연변이 및 단일 염기 다형성을 검출하거나 실시간 형광 실험에 의해 DNA 틀린 짝 복구 기작을 평가하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> MutS 돌연변이체-형광물질 결합체의 제조

<1-1> MutS 돌연변이체의 제조

MutS가 잘못 짝지어진 DNA와 결합하여 구조적인 변화가 야기되는 경우 MutS에 표지된 형광물질의 자가-소멸(self-quenching)에 의한 형광발광의 변화를 효과적으로 유도하기 위하여 기존에 티올-특이적인 형광물질의 결합부위로 알려진 42번 시스테인 잔기를 알라닌으로 치환하여 상기 형광물질의 결합을 차단하는 대신, 이량체 경계면에 위치하는 469번 트레오닌 잔기를 시스테인으로 치환하여 티올-특이적인 형광물질이 부착되도록 돌연변이를 유도하였다.

구체적으로, Taq. MutS의 이중 점 돌연변이체 C42A/T469C를 제조하기 위한 부위-특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis)는 퀵체인지 부위-특이적 돌연변이화 킷트(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit, Stratagene)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 라운드 써클 PCR 방법(round circle PCR)에 의해 연속적으로 수행되었다. 먼저, 야생형 Taq. MutS의 1 내지 765번 아미노산 잔기를 암호화하는 유전자를 발현벡터 pET24d(+)(Novagen)에 삽입한 벡터를 주형으로 하고 서열번호: 1 및 2로 기재되는 돌연변이 유발 올리고뉴클레오티드 시발체 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초간 변성시킨 후 95℃에서 30초, 55℃에서 1분 및 68℃에서 14분간의 반응을 20회 반복하고 4℃에서 10분간 방치하였다.

이로부터 증폭된 메틸화된 PCR 산물을 dam 메틸화-특이적인 엔도뉴클리아제 제한효소(dam methylation-specific restriction endonuclease)인 DpnI으로 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 절단하였고 이로부터 돌연변이화가 되지 않은 DNA를 제거하여 MutS 돌연변이체 발현벡터 pET24d(+)-MutS(C42A/T469C)를 제조하였다. pET24d(+) 벡터는 C-말단 부위에 6개의 히스티딘 태그(histidine tag)가 융합되어 있어 간편하고 쉽게 MutS 돌연변이체를 분리해낼 수 있다. 벡터에 삽입된 MutS 돌연변이 삽입체는 전체 이중가닥 서열분석(sequencing)에 의해 서열을 분석하여 해당 아미노산의 변이를 확인하였다. 야생형 MutS 유전자가 클로닝된 발현벡터 pET24d(+)-MutS는 Taq. MutS cDNA(NIH의 Hsieh 박사로부터 제공받음)를 주형으로 하여 PCR를 수행한 후 이를 제한효소 EcoRI 및 HindⅢ로 37℃에서 3시간 동안 반응시켜 절단하고 과발현 벡터인 pET24d(+)(Novagen)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 제조하였다.

상기 발현벡터를 대장균에 형질전환시키기 위하여 DH5α 감응세포(competent cell, Novagen)를 LB 액체배지에 접종하고 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 후 이를 다시 LB 액체배지에 접종하여 OD₆₀₀이 0.4가 될 때까지 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 균체를 수확한 후 500 ㎖의 순수한 H₂O를 가하여 현탁시키고 4℃에서 2,500 rpm으로 20분간 원심분리하였다. 분리된 세포에 250 ㎖의 10％ 글리세롤(glycerol)을 첨가하여 4℃에서 2,500 rpm으로 20분간 다시 원심분리하였다. 이로부터 수확한 균체에 10 ㎖의 10％ 글리세롤을 첨가하여 분리시키고 2,500 rpm으로 20분간 다시 원심분리하여 감응세포를 수확하였다. 수확한 감응세포에 1 ㎖의 GYT 배지(10％ 글리세롤, 0.125％ 효모 추출액, 0.25％ 트립토판)를 가하여 재현탁하였다. 얻어진 현탁액 40 ㎕에 상기에서 얻은 발현벡터 각각을 첨가하고 전기충격(electrophoration)을 가하여 형질전환시켰다. 상기 형질전환체에 1 ㎖의 신선한 SOC 액체배지(0.5％ 효모 추출액, 2％ 트립토판, 8.5 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 20 mM 글루코스, 10 mM MgCl₂)를 넣고 37℃에서 1시간 동안 배양하여 안정화시켰다. 그후, 항생제인 카나마이신(kanamycin, 50 ㎍/㎖)이 들어있는 LB 고체배지에 도말하여 야생형 MutS 및 MutS 돌연변이체가 클로닝된 형질전환체를 선발하였다. 이를 상기와 동일한 방법으로 제조된 E. coli BL21(DE3)pLysS 감응세포에 형질전환시켜 단백질의 발현에 사용하였다.

<1-2> 단백질의 발현 및 정제

6개의 히스티틴 태그가 표지된 MutS 및 그의 돌연변이체를 기존에 보고된 방법을 약간 변형하여 대장균 형질전환체로부터 과발현시키고 정제하였다(Biswas, I, et al., J. Mol. Biol., 305: 805-816, 2005).

먼저, 상기 실시예 <1-1>에서 제조된 발현벡터 pET24d(+)-MutS 또는 pET24d(+)-MutS(C42A/T469C)로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)pLysS를 50 ㎍/㎖ 카나마이신 및 34 ㎍/㎖ 클로람페니콜(chloramphenicol)을 포함하는 1 ℓ의 LB 액체배지에 접종하여 OD₆₀₀이 0.5가 될 때까지 37℃에서 배양한 후 0.5 mM IPTG를 첨가하여 37℃에서 각 단백질의 발현을 유도하였다. 4시간 경과 후 원심분리에 의해 50 ㎖ 배양액으로부터 회수한 세포들을 프로테아제 혼합물(protease cocktail)이 첨가된 용해 완충용액(lysis buffer, 50 mM HEPES(pH 7.0), 500 mM NaCl, 0.5 mM β-머캅토에탄올) 1 ℓ에 재현탁하였다. 상기 현탁액에 라이소자임(lysozyme, 0.2 ㎎/㎖)을 첨가하여 세포를 파괴한 후 초음파분쇄를 수행하였다. 상기 세포 용해물을 원심분리하여 얻은 상등액을 70℃에서 1시간 동안 가열하였고, 이를 15,000 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 이로부터 분리된 상등액을 니켈-이온으로 미리 평형화시킨 5 ㎖의 하이트렙 킬레이팅 HP 컬럼(HiTrap Chelating HP, GE Healthcare)에 로딩하였다. 상기 컬럼을 15 mM 이미다졸(imidazole)을 포함하는 용해 완충용액으로 세척한 후 30 mM 이미다졸을 포함하는 용해 완충용액으로 용출하였다. 상기 단백질을 완충용액 A(buffer A, 50 mM HEPES(pH 7.0), 1 mM EDTA)로 평형화시킨 모노Q HR 10/10 컬럼(MonoQ HR 10/10 column, GE Healthcare)에 로딩한 후 NaCl 농도를 100 mM에서 500 mM까지 증가시키면서 완충용액 A로 용출하였다. His6-표지된 MutS 및 그의 돌연변이체는 250 내지 280 mM의 NaCl 농도에서 용출되었다.

<1-3> 형광물질 표지

형광물질이 표지된 결합체를 제조하기 위하여, 티올 특이적인 형광물질 IAANS(2-(4'-(Iodoacetoamido)anilino)naphthalene-6-sulfonic acid, Molecular Probes)를 야생형의 MutS에는 42번 시스테인 잔기에, MutS 돌연변이체에는 469번 시스테인 잔기에 각각 공유 결합시켰다. 상기 표지반응은 DMF(N,N-dimethlyformamide)에 용해시켜 신선하게 준비한 IAANS(10 mM)를 3 ㎖의 야생형 MutS 및 MutS 돌연변이체 단백질(10 μM) 각각에 몰비로 10배 이상 첨가한 후 실온의 암실에서 12시간 동안 수행하였다. 12시간 경과 후, 반응액에 DTT(dithiothreitol)를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 각각의 반응액을 G25 탈염 컬럼(G25 desalting column, GE Healthcare)에 로딩한 후 용출액(50 mM HEPES(pH 7.8), 5 mM MgCl₂, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM DTT 및 5％ 글리세롤)으로 용출하여 결합하지 않은 여분의 형광물질을 제거하였다.

이로부터 얻은 용출액을 SDS-PAGE로 분석하고 UV 하에서 관찰하여 MutS 돌연변이체에 형광물질이 표지되었음을 확인하였다(도 2). 이때, 형광물질의 표지 정도는 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

상기 식에서, A_x는 흡수 최대 파장(absorption maximum wavelength)에서 염료의 흡광도 값이고, ε은 흡수 최대 파장에서 염료의 몰 흡광 계수(molar extinction coefficient)이다.

이로부터 형광물질-대-단백질의 비가 약 1이 되는 반응조건을 설정하였는데, 형광물질/단백질 농도 및 반응시간과 관련하여 10 μM의 단백질에 10 mM의 형광물질을 12시간 동안 반응시키는 조건 하에서 최적의 형광물질 표지반응이 유도됨을 확인하였다.

<실시예 2> MutS 돌연변이체-형광물질 결합체를 이용한 잘못 짝지어진 DNA의 검출

<2-1> 틀린 짝 염기를 포함하는 DNA의 제조

하기 표 1에 나타낸 바와 같이, GT 틀린 짝을 포함하는 서열번호: 3 및 4로 기재되는 단일가닥 DNA들, CT 틀린 짝을 포함하는 서열번호: 5 및 6으로 기재되는 단일가닥 DNA들, CC 틀린 짝을 포함하는 서열번호: 7 및 8로 기재되는 단일가닥 DNA들, 및 AT 짝을 포함하는 서열번호: 9 및 10으로 기재되는 단일가닥 DNA들을 바이오닉스사(Bionics Co.)에 의뢰하여 합성하였다. 이와 같이 합성된 단일가닥 DNA들(100 μM)을 20 mM Tris-HCl(pH 8.8), 10 mM (NH₄)₂SO₄ 및 10 mM KCl 존재하에서 1:1의 비율로 혼합하여 상온에서 5분간 어닐링하고 95℃에서 10분간 가열한 후 20℃까지 6 내지 8시간 동안 천천히 냉각시켰다. 상기 반응액을 역상 컬럼 크로마토그래피(reverse phase column chromatography, Chromolith^TM Performance RP-18e, Merck KGaA)로 정제하여 각각의 틀린 짝 염기를 포함하는 이중가닥 DNA들을 분리하였다.

<2-2> 겔 이동성 분석(Gel mobility shift assay)

IAANS-표지된 야생형 MutS 및 그의 돌연변이체 단백질의 잘못 짝지어진 DNA에 대한 결합 친화력을 조사하기 위하여 하기와 같이 겔 이동성 분석을 수행하였다.

상기 실시예 <2-1>에서 제조된 GT 틀린 짝 염기를 포함하는 dsDNA(2 μM) 1 ㎕와 0.2 내지 1.0 μM의 IAANS-MutS 돌연변이체 결합체 또는 0.5 μM의 표지되지 않은 MutS 돌연변이체를 19 ㎖의 반응용액(50 mM HEPES(pH 7.8), 5 mM MgCl₂, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM DTT 및 5％ 글리세롤)에 첨가하고 혼합하였다. 상기 반응 혼합물을 60℃에서 15분간 반응시킨 후, 1 × TBE 및 10 mM MgCl₂를 포함하는 4.8％ 폴리아크릴아마이드 겔에 로딩하고 5 mM MgCl₂를 포함하는 1 × TBE를 전개 완충용액으로 사용하여 실온에서 전기영동을 수행하였다. 전기영동 완료 후 상기 겔을 형광염료인 SYBR Green(Molecular Probes)으로 염색하였고, 이미지 분석기(image analyzer, DNS Bio-image system)를 이용하여 관찰하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, GT 틀린 짝을 포함하는 이중가닥 DNA에 대한 IAANS-MutS 돌연변이체 결합체의 결합 친화력은 비표지된 MutS 돌연변이체의 결합 친화력에 상응하였으나, IAANS-야생형 MutS 결합체는 동일한 조건하에서 GT 틀린 짝을 포함하는 dsDNA에 결합하지 못하였다. CT 틀린 짝을 포함하는 이중가닥 DNA와 CC 틀린 짝을 포함하는 이중가닥 DNA에 대해서도 동일한 결과를 얻었다. MutS의 N-말단에서 Phe39-X40-Glu41 모티프는 잘못 짝지어진 DNA와의 결합에 중요한 역할을 담당하는데, Taq. MutS의 결정 구조에 따르면 Phe39의 곁가지(side chain)는 잘못 짝지어져 결합하지 않은 T 위에 적재되고 Glu41은 상기 T와 수소결합을 통해 접촉하게 된다(Schofield MJ, et al., J. Biol. Chem. 276: 45505-45508, 2001). 따라서, 상기 결과는 야생형 MutS의 42번 시스테인 잔기에 형광물질이 도입됨으로써 야생형 MutS와 잘못 짝지어진 DNA간의 결합양상이 심각하게 파괴되었기 때문인 것으로 판단된다. 반면, 단백질 이량체의 경계면 가장자리에 위치한 469번 트레오닌 잔기는 잘못 짝지어진 DNA와 직접적으로 접촉할 수 없는 위치에 존재하기 때문에, 상기 잔기가 시스테인으로 치환되어 형광물질이 표지된 본 발명의 MutS 돌연변이체는 잘못 짝지어진 DNA에 대한 결합 친화력을 그대로 유지할 수 있는 것이다.

<2-3> 형광 적정(Fluorescent titration)

잘못 짝지어진 DNA의 농도에 따른 MutS 돌연변이체-형광물질 결합체의 결합 친화력의 변화를 형광발광 스펙트럼으로 조사하였다.

GT 틀린 짝을 포함하는 dsDNA의 농도를 0.1 내지 0.9 μM 범위에서 0.1 μM 단위로 증가시키면서 0.06 μM의 IAANS-MutS 돌연변이체 결합체를 포함하는 반응용액(50 mM HEPES(pH 7.8), 5 mM MgCl₂, 0.1 mM DTT, 0.1 mM EDTA 및 5％ 글리세롤)에 첨가하고 25℃에서 15분간 반응시켰다. 현미경 광도계(PTI model D-104 microscope photometer)를 이용하여 IAANS-MutS 돌연변이체 결합체의 형광 방출 스펙트럼을 분석하였다(4 ㎚ 여기 틈 너비(excitation slit width); λ_ex=330 ㎚). 이때, 해리상수는 450 ㎚에서 형광 방출의 변화를 측정한 후 하기 수학식 2를 이용하여 결정하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

상기 식에서, ΔF는 형광강도의 변화를 나타내는 것이고, ΔF _max는 포화상태에서의 형광강도 변화를 나타낸 것이고, K _d는 해리상수(dissociation constant)를 나타낸 것이며(Sloan DJ 및 Hellinga HW, Protein Eng. 11: 819-823, 1998), DNA는 형광강도 측정시 사용된 DNA의 농도를 나타낸 것이다.

형광 방출 스펙트럼 분석 결과, 도 4a 및 4b에 나타난 바와 같이, IAANS-MutS 돌연변이체 결합체의 방출 강도(emission intensity)는 잘못 짝지어진 DNA의 농도가 증가할수록 감소하였다. 형광 강도의 감소는 DNA 농도가 0.05 μM 정도로 낮은 수준에서도 관찰되었다. 도 4b에서, (F₀-F)/(F₀-F_min)식은 IAANS-MutS와 DNA간의 결합곡선을 나타낸 것으로, F₀는 DNA 농도가 0일 때의 최대 형광값을 나타내는 것이고, F는 사용한 DNA 농도에서의 최대 형광값을 나타내는 것이고, F_min은 포화(saturation)되어 형광변화가 나타나지 않을 때의 DNA 농도에서 최대 형광값을 나타내는 것이다. 따라서, DNA 농도가 0일 때는 이 상기 식의 값이 0이 되는 것이고, DNA 농도가 포화되었을 때는 이 식의 값이 1이 되는 것이다. 이러한 형광 강도의 감소는 두 개의 동일한 형광 분자들이 매우 근접하여 존재하는 경우에 분자간 상호작용에 의해 형광 방출이 소멸된다는 사실로 설명될 수 있다(Zhuang X, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 14241-14244, 2000). 야생형 Taq. MutS는 용액에서 주로 이량체로 존재하기 때문에, 각 소단위(subunit)에 결합되어 있는 두 개의 형광물질들은 이량체 경계면에 근접하여 존재하게 된다. MutS 이량체 내 두 개의 Thr469 잔기의 곁가지들간의 거리는 MutS-DNA 복합체의 결정 구조에서 대략 4 Å 정도로 매우 가까워 형광의 자가-소멸(self-quenching)이 유도된 것이다.

MutS는 GT 틀린 짝 및 단일 미결합된 염기들과 강한 복합체를 형성하는 반면, CC 틀린 짝에는 약한 결합력을 보이는 것으로 알려져 있다(ΔT>GT>CT>TT=CC=AT) (Schofield MJ, et al., J. Biol . Chem. 276: 45505-45508, 2001). 이에 본 발명에 따른 MutS 돌연변이체-형광물질 결합체도 틀린 짝 염기의 종류에 따라 결합 친화력이 달라지는지 여부를 형광 방출 스펙트럼을 분석하여 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에서 제조된 GT 틀린 짝, CT 틀린 짝, CC 틀린 짝 및 AT 짝을 포함하는 dsDNA(0.5 μM) 각각을 IAANS-MutS 돌연변이체 결합체(0.3 μM)와 상기와 동일한 방법으로 반응시킨 후 각 반응 혼합물의 형광 방출 스펙트럼을 측정하여 비교하였다.

그 결과, 도 4c에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 IAANS-MutS 돌연변이체 결합체는 기존의 보고와 동일하게 GT 틀린 짝에 대해 가장 강한 결합 친화력을 나타내었고, CT 틀린 짝, CC 틀린 짝 및 AT 짝의 순으로 현저하게 감소된 결합 친화력을 나타내었다. 이러한 결과는 IAANS-MutS 돌연변이체 결합체가 야생형 MutS와 동일하게 DNA 틀린 짝 형태에 대하여 자체적인 선호도(preference)를 가지고 있으며 모든 잘못 결합된 DNA들(GT, GA, GG, AA, AC, CT, TT, CC 틀린 짝 DNA 및 1 내지 4 염기 DNA)을 검출할 수 있음을 명확하게 나타내는 것이다.

또한, CT 틀린 짝을 포함하는 dsDNA 0.2 내지 3.2 μM, CC 틀린 짝을 포함하는 dsDNA 0.2 내지 4.4 μM 및 AT 짝을 포함하는 dsDNA 0.5 내지 4.5 μM를 0.3 μM의 IAANS-MutS 돌연변이체 결합체와 상기와 같이 반응시키면서 450 ㎚에서 형광도를 측정하였고, 측정된 형광강도의 변화값을 상기 수학식 2의 결합 등온식에 적용하여 해리상수를 계산하였다.

그 결과, 도 4b 및 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 IAANS-MutS 돌연변이체 결합체를 이용하여 얻어진 해리상수들은 겔 이동성 분석에서 얻어진 값들에 상응하였는데(Schofield MJ, et al., J. Biol. Chem. 276: 45505-45508, 2001), IAANS-MutS 돌연변이체 결합체는 GT 틀린 짝을 포함하는 dsDNA에 대하서는 가장 강한 결합 친화력(K _d=0.20 mM)을 나타낸 반면, CC 틀린 짝을 포함하는 dsDNA에 대해서는 결합 친화력(K _d=2.6 mM)이 매우 낮았다.

상기에서 전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 MutS 돌연변이체-형광물질 결합체의 구조적 변화를 이용하여 잘못 짝지어진 DNA를 검출하는 방법은 기존에 겔 이동성 분석이나 표면에 고정화된 MutS를 이용하는 방법보다 훨씬 간단하고 쉽게 잘못 짝지어진 DNA를 검출할 수 있으므로 유전적 돌연변이의 검출뿐만 아니라 DNA 틀린 짝 복구(DNA mismatch repair) 기작을 규명하는데도 매우 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

야생형 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus, Taq.) MutS 단백질의 42번 시스테인을 알라닌으로 치환시키고, 469번 트레오닌은 시스테인으로 치환시킨 MutS 돌연변이체의 상기 469번 변이 잔기에 티올-특이적인 형광물질을 결합시킨 MutS 돌연변이체-형광물질 결합체에 시료 DNA를 첨가한 후 형광발광의 변화를 측정하여 잘못 짝지어진 DNA를 검출하는 방법.
삭제
제 1항에 있어서,

티올-특이적인 형광물질이 IAANS(2-(4'-(Iodoacetoamido)anilino)naphthalene-6-sulfonic acid), BADAN(6-bromoacetyl-2-dimethylamino naphthalene) 및 N-(1-피렌) 이오도아세트아미드(N-(1-pyrene) iodoacetamide)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,

MutS 돌연변이체-형광물질 결합체가 MutS 돌연변이체와 형광물질을 1:1 내지 1:20 의 몰비로 혼합하고 실온의 암실에서 3 내지 24시간 동안 반응시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,

MutS 돌연변이체-형광물질 결합체와 시료 DNA를 1:0.15 내지 1:3의 몰비로 혼합하고 25℃에서 5 내지 10분간 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
야생형 Taq. MutS 단백질 이량체에서 각 단량체의 42번 시스테인을 알라닌으로 치환시키고, 469번 트레오닌은 시스테인으로 치환시킨 MutS 돌연변이체의 상기 469번 변이 잔기에 티올-특이적인 형광물질을 결합시킨, 잘못 짝지어진 DNA를 검출하기 위한 MutS 돌연변이체-형광물질 결합체.
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