JP2001046071A - ミスマッチＤＮＡを認識するｍｕｔＳ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチ部分を検出する
ために使用できる新規なmutS遺伝子を提供する。 【解決手段】 Pseudomonas putidaに由来するmutS遺伝
子を単離する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はＤＮＡ塩基配列決定
方法に関する。更に詳細には、本発明はハイブリダイゼ
ーションによる塩基配列決定方法におけるミスマッチＤ
ＮＡの検出に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡなどの核酸の塩基配列の解読が様
々な分野で広範に行われている。ＤＮＡの塩基配列の分
析と決定が加速された理由の一つは、ポリメラーゼ連鎖
増幅反応法（ＰＣＲ）の導入である。ＰＣＲ法の導入に
より、分析試料の微量化、操作性の簡便さと共に、比較
的短期間で結果を得ることが可能となった。

【０００３】また、ＤＮＡとＤＮＡとの間でその塩基配
列に相補性が高いときに２重鎖を形成することをハイブ
リダイゼーションといい、この原理を応用して、目的と
するＤＮＡの塩基配列決定などを行うための方法とし
て、ハイブリダイゼーション法が広く使用されている。

【０００４】しかし、ハイブリダイゼーション法を用い
た塩基配列決定法において、ハイブリダイズした二本鎖
ＤＮＡ中にミスマッチ部分が存在すると、正確な塩基配
列決定を行うことが困難となる。従って、ハイブリダイ
ゼーション法を用いた塩基配列決定法の信頼性を更に高
めるためには、ハイブリダイズした二本鎖ＤＮＡ中にミ
スマッチ部分が存在するか否か予め検出しておくことが
重要である。

【０００５】Shin-San Suらは、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, Vol. 83, pp.5057-5061, July 1986, Biochemi
stryに、大腸菌(Escherichia Coli)由来の、MutSでエン
コードされたタンパクをＤＮＡ塩基対に対して作用させ
ることにより、このＤＮＡ塩基対の中にミスマッチ部分
が存在するか否か決定する方法を記載している。図１に
示されるように、ＤＮＡ塩基対１の中にミスマッチ部分
３が存在する場合、そのミスマッチ部分３にMutS５が特
異的に結合するので、ミスマッチの無いＤＮＡと識別す
ることができる。

【０００６】また、Hidehisa Tachikiらは、Nucleic Ac
ids Research, 1998, Vol. 26, No.18, pp.4153-4159
に、Thermus thermophilus由来のMutSタンパクがＤＮＡ
塩基対の中にミスマッチ部分に結合する際の、MutS遺伝
子ドメイン構造を記載している。このMutS遺伝子ドメイ
ン構造を図２に示す。図示されているように、MutS遺伝
子のＮ末端側から１３０残基までがＡ１領域であり、ミ
スマッチを認識するドメインである。１３１残基から２
７４残基までがＡ２領域であり、二本鎖特異性を支配す
る支配するドメインである。２７５残基から５７０残基
までがＢ領域であり、二本鎖ＤＮＡ結合ドメインとされ
ている。５７１残基から８１９（Ｃ末端）残基までがＣ
領域であり、ここもＡ１と同様にミスマッチの認識に必
要なドメインである。

【０００７】しかし、Shin-San Suらの前掲書に記載さ
れた、大腸菌由来の、ミスマッチＤＮＡを認識するタン
パクをコードするMutS遺伝子では、コードするタンパク
の分子量が９０キロダルトンと非常に大きい。このた
め、ミスマッチ検出における、このMutS遺伝子のハンド
リングが非常に困難であるばかりか、その生産も容易で
はない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチ部分を検出するために使
用できる新規なmutS遺伝子を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】前記課題は、Psudomonas
putida由来の、下記の配列番号１で示される塩基配列
及びアミノ酸配列を有する、ミスマッチＤＮＡを認識す
るmutS遺伝子により解決される。前記アミノ酸配列は、
ミスマッチＤＮＡを認識することができる限りにおい
て、その配列の一部のアミノ酸が欠失、付加及び／又は
置換されていてもよい。実際には、遺伝子がコードする
蛋白質（アミノ酸配列）の働きによりミスマッチＤＮＡ
を認識するが、その蛋白質を大量生産するには、塩基配
列が重要になる。

【００１０】従来のThermus thermophilusのmutS遺伝子
は８１９個のアミノ酸残基により構成されているが、本
発明のPsudomonas putida由来mutS遺伝子は５６３個の
アミノ酸残基により構成されている。その結果、本発明
のmutS遺伝子は従来のものに比べて、取扱性が格段に改
善される。

【００１１】

【発明の実施の形態】I. Psudomonas putida由来mutS
のクローニング Psudomonas putida（以下「P.putida」という）染色体
のmutS遺伝子のクローニングを行った。まず、他の細菌
で保存されたアミノ酸領域の塩基配列をプライマーと
し、P.putidaのゲノムＤＮＡを鋳型に、ＰＣＲで目的の
領域を増幅させ、塩基配列決定した。目的の領域である
ことを確認した後、P.putidaのゲノムライブラリーを作
成し、コロニーハイブリダイゼーションを用いて陽性ラ
イブラリーを選択した。更に、得られたライブラリーを
制限酵素で切断し、サザンハイブリダイゼーションを用
いて目的のＤＮＡ断片をクローニングし、その塩基配列
の決定を行った。

【００１２】II. 試薬と実験方法 この塩基配列決定で使用される試薬と実験方法について
以下説明する。(1)本実験に使用した使用菌株、プラス
ミド、コスミドの遺伝子型を表１に、また、使用した合
成オリゴヌクレオチドを表２に示す。

【００１３】

【表１】 表１：使用菌株、プラスミド ─────────────────────────────────── 菌株／プラスミド 遺伝子型 ─────────────────────────────────── Psudomonas putida ATCC 33015 野生型 TOLプラスミド Escherichia coli JM109 recA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thi Δ(lac-proAB) F' [traD36 proAB + lacLq lacZΔM15] DH5αMCR- F-endA1 supE44 λ-thi-1 recA1 gyrA96 deoRΔ(lacZYA-argF)U169 ─────────────────────────────────── pUC119 クローニングベクター；AmpＲ,lacZα,M131G Lorist6改 コスミドベクター；Sp^R pGEM-T クローニングベクター；Amp^R,lacZα T7,SP6プロモータ ─────────────────────────────────── （注）AmpＲはアンピシリン耐性を示す。 Sp^Rはスペクチノマイシン耐性を示す。

【００１４】

【表２】 表２：オリゴヌクレオチド ─────────────────────────────────── オリゴヌクレオチド 配列 長さ 用途 ─────────────────────────────────── Ｓ１ GICA(T/C)CCIGTIGTIGA 16mer PCR Ｓ２ TC(G/A)AA(G/A)TA(G/A)TGIGTIG 16mer PCR ＭＵＴＳ５ CGGTCGGAACCTTGATTT 18mer シーケンシンク゛ ＭＵＴＳ３ GTCAGCCGAAGCGGTGAA 18mer シーケンシンク゛ M13フ゜ライマーM4 GTTTTCCCAGTCACGAC 17mer シーケンシンク゛ M13フ゜ライマーRV CAGGAAACAGCTATGAC 17mer シーケンシンク゛ ───────────────────────────────────

【００１５】(2)使用器具、試薬、培地 使用器具 本実験に使用した器具類は、全て滅菌したものを用い
た。ガラス器具は乾熱滅菌（１４０℃、１２時間以
上）、遠心チューブ、ピペットマン用チップなどは、オ
ートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分間）後、乾燥器で
十分に乾燥させて使用した。 使用試薬 本実験に使用した基本的な試薬とその調製法を以下説明
する。各実験に特有な試薬は各実験毎に示す。特に表記
していない試薬は、Mill-Q Labo(MILLIPORE社製）で製
造した水を純水とし、純水に溶解後、１２１℃で２０分
間オートクレーブ滅菌した。特別な調製法を用いるもの
はその都度示す。また、表記のないものは全て和光純薬
工業特級試薬を使用した。 (ア)０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０） ＥＤＴＡ・２Ｎａ(Dojin) １８６．１ｇ/ｌ ＮａＯＨ溶液でｐＨ８．０に調整後,メスアップしオー
トクレーブした。 (イ)１Ｍ Tris-ＨＣ１（ｐＨ７．４〜８．０） 2-アミノー2-ヒト゛ロキシメチル-1,3-フ゜ロハ゜ンシ゛オール（生化学用） ２
４２．３ｇ／ｌ ＨＣｌ溶液て目的のｐＨに調整後、メスアップしオート
クレーブ滅菌した。 (ウ)１０％ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム（生化学用） １００．０ｇ／
ｌ (エ)ＴＥ飽和フェノール フェノール結晶（核酸抽出用）５００ｇを６５℃の恒温
水中で溶解し酸化防止剤として、８−キノリノールを
０．５ｇ（終濃度０．１％）加えた後に、０．５ＭのTr
is-ＨＣ１（ｐＨ８．０）を約１／５量加え１５分間激
しく撹拝した。４℃で一晩放置し上層を除いた後に上記
の操作をもう一度繰り返し上層を取り除いた後に、０．
１ＭのTris-ＨＣ１（ｐＨ８．０）を約１／５量加え１
５分間激しく撹拝しｐＨ試験紙でｐＨを測定した。ｐＨ
が７．８以上に上がっていなければ０．１ＭのTris-Ｈ
Ｃ１（ｐＨ８．０）を約１／５量加え、ｐＨが上がるま
でこの操作を繰り返した。ｐＨが上がった時点て、上層
を１ｃｍ程度残し、終濃度１ｍＭのＥＤＴＡを加え、４
℃で遮光保存した。 (オ)フェノール，クロロホルム，イソアミルアルコール ＴＥ飽和フエノールとクロロホルム、イソアミルアルコ
ールを２５：２４：１（Ｖ／Ｖ）の割合で混合して使用
した。４℃で遮光保存した。 (カ)３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２） 酢酸ナトリウム ２４６．１ｇ／ｌ 酢酸溶液でｐＨ５．２に調整し、メスプッブした後にオ
ートクレーブ滅菌した。 (キ)７０％エタノール 滅菌水と混合して使用した。 (ク)抗生物質 抗生物質は全て適当な溶媒に溶解した後に、０．４５μ
ｍのフィルターで濾過してから使用した。溶媒が水のも
のは４℃で保存し、工タノールが含有されているものは
−２０℃で保存した。 (a)アンピシリン(Ampicillin) アンピシリン・ナトリウム塩(SIGMA) １００ｍｇ／ｍ
ｌ 溶媒 純水 (b)クロラムフェニコール(Chloramphenicol) クロラムフェニコール(SIGMA) １０ｍｇ／ｍｌ 溶媒 １００％エタノール (c)カナマイシン(Kanamycin) カナマイシンスルフェート（生化学用） １０ｍｇ／ｍ
ｌ 溶媒 純水 (d)スペクチノマイシン(Spectinomycin) スペクチノマイシンジヒドロクロライド(SIGMA) １０
ｍｇ／ｍｌ 溶媒 純水 (e)テトラサイクリン(Tetracycline) テトラサイクリン塩酸塩（生化学用） １０ｍｇ／ｍｌ 溶媒 ７０％エタノール (ケ)Ｘ‐Ｇａｌ 5-フ゛ロモ-4-クロロ-3-イント゛リル-β-D(-)カ゛ラクトヒ゜ラノシト゛（生化学
用） ４０ｍｇ／ｌ 粉末のまま適当量を培地が５０℃程度まで下がってから
加えた。 (コ)ＩＰＴＧイソフ゜ロヒ゜ル -β-D(-)チオカ゛ラクトヒ゜ラノシト゛（生化学用） ４０ｍ
ｇ／ｌ 粉末のまま適当量を培地が５０℃程度まで下がってから
加えた。 (サ)ＲＮａｃｅ Ａ リボヌクレアーゼ Ａ(SIGMA) １ｍｇ／ｍｌ 純粋に溶解し、煮沸後、室温で冷却して、４℃で保存し
た。 使用培地 ＬＢ培地 トリプトン(DIFCO) １０ｇ 酵母エキス ５ｇ ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ 寒天入り培地を作成するときは上記組成に、寒天粉末
（細菌培地用）を終濃度１．５％（Ｗ／Ｖ）になるよう
に加えて、オートクレーブ滅菌した。熱による分解を受
けやすいもの、または抗生物質などは、培地が５０℃程
度まで温度が下がってから加えた。

【００１６】(3)ＤＮＡの基本的な実験方法 P.putidaのゲノムＤＮＡの抽出 ゲノムＤＮＡの抽出法は中山広樹らによるバイオ実験イ
ラストレイテッド(2)“遺伝子解析の基礎”１１７〜１
２３頁（細胞工学別冊，秀潤社）を参考に行った。ＬＢ
寒天培地から一白金耳分の菌体をＬＢ培地１００ｍｌに
植菌し、３０℃で一晩培養した。この菌体溶液を３，５
００ｒｐｍ、５分間遠心し集菌した菌体をＴＮＥ緩衝液
で一度洗浄し遠心集菌してＴＮＥ緩衝液２５ｍｌずつ二
本に再懸濁した。この溶液に、１０％ＳＤＳを終濃度１
％になるように加え溶菌するまで穏やかに混ぜた。透明
になったら、Proteinase Kを終濃度１００μｇ／ｍｌに
なるように加え５０℃で一晩放置した。当量のフェノー
ル、クロロホルム、イソアミルアルコ一ルを加え、穏や
かに１０分間混合した。３，５００ｒｐｍ、１５分間遠
心し上層を中間の変性タンパク層を吸い上げないよう
に、注意して別のチユーブに移した。この操作を中間層
が出なくなるまで繰り返した。この溶液に１／１０量の
３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、二倍量のエタノールを静か
に重層した。滅菌したパスツールピペットの先端で、溶
液とエタノール層をゆっくり混ぜ合わせ、ゲル状のＤＮ
Ａを巻きとった。適当量の７０％エタノールで洗浄し風
乾した。１０ｍｌのＴＥ緩衝液に浸し、４℃で一晩放置
して溶かした。調製したＤＮＡ溶液は、４℃で保存し
た。 （試薬） (ア)ＴＮＥ緩衝液（ｐＨ８．０） １Ｍ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８．０） １０ｍｌ ０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０） ２．０ｍｌ ０．２Ｍ ＮａＣｌ １１．７ｇ／ｌ (イ)Proteinase K（生化学用） 粉末を終濃度１００μｇ／ｍｌになるように加えた。 (ウ)ＴＥ緩衝液 １Ｍ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８．０） １０ｍｌ ０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０） ２．０ｍｌ

【００１７】プラスミドＤＮＡの調製 プラスミドＤＮＡの調製は前掲のバイオ実験イラストレ
イテツド(2)１９〜２３頁を参考に行った。一晩培養し
た菌体を、１００μｌの溶液Iに懸濁しボルテックスで
よく懸濁した。２００μｌの溶液IIを加えて上下に軽く
混合し５分間氷上で放置した。更に１５０μｌの溶液II
Iを加え穏やかに混合し５分間氷上に放置した。１４，
０００ｒｐｍ、５分間遠心し上清を別のチユーブに移し
た。３００μｌのフェノール，クロロホルム，イソアミ
ルアルコールを加えボルテツクスで１０〜１５秒間混合
した。１４，０００ｒｐｍ、３分間遠心し上清を別のチ
ユーブに移した。１ｍｌのエタノールを加えボルテック
スでよく混含し氷上で５分間放置した。１４，０００ｒ
ｐｍ、５分間遠心しペレットを落とさないように上清を
捨てた。１ｍｌの７０％エタノールを加え、軽く混合し
１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心しペレットを落とさな
いように上清を捨てた。真空乾燥させ適当量のＲＮａｓ
ｅ入りのＴＥ緩衝液に懸濁した。調製したプラスミドＤ
ＮＡサンブルは−２０℃で保存した。 （試薬） (ア)溶液I グルコース ９ｇ ０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０） ２０ｍｌ １Ｍ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ２５０ｍｌ／ｌ (イ)溶液II ＮａＯＨ ８ｇ ＳＤＳ １０ｇ／ｌ ３ケ月を目安に作り替えた。 (ウ)溶液III 酢酸カリウム ２９４ｇ／ｌ 酢酸 １１５ｍｌ 純水でメスアップしてから、オートクレーブ滅菌した。
３ケ月を目安に作り替えた。 (エ)ＲＮａｓｅ入りＴＥ緩衝液 終濃度２０μｇ〜５０μｇになるように、ＲＮａｓｅを
ＴＥ緩衝液で希釈して使用した。

【００１８】プラスミドＤＮＡの精製 プラスミドＤＮＡの精製法は前掲のバイオ実験イラスト
レイテッド(2)２３〜２４頁を参考に行った。上記の方
法で調製したプラスミドを３０分間３７℃の恒温水中て
処理しＲＮａｓｅの作用でＲＮＡを分解させた。２００
μｌにフィルアッブし当量のフェノール，クロロホル
ム，イソアミルアルコールを加えボルテックスてよく混
合した。１４，０００ｒｐｍ、３分間遠心し上清を別の
チユーブに移し３Ｍ酢酸ナトリウムを１／１０量加え
２．５倍量のエタノールを加え氷上で５分間放置した。
１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心しＤＮＡをペレットに
しで上清を捨て７０％エタノールを１ｍｌ加え軽く混合
し１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心し上清を捨て真空乾
燥した。乾燥したペレットは５０μｌのＴＥ緩衝液に再
懸濁した。２０％ＰＥＧ／２．５ＭＮａＣｌを３０μｌ
加えボルテックスてよく混合して氷上で１時間から２時
間程度放置した。１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心しピ
ペッティングで液体を捨て１ｍｌの７０％エタノールを
加え軽く混合し、１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心しペ
レツトを落とさないように上清を捨て真空乾燥し滅菌水
でＤＮＡを溶解した。この方法で調製したプラスミドＤ
ＮＡも−２０℃で保存した。 （試薬） (ア)２０％ＰＥＧ／２．５ＭＮａＣ１ ポリエチレングリコール（和光，一級） ２００ｇ ＮａＣｌ １４６ｇ／ｌ 二倍濃度の各溶液を作成し等量混合した後、オートクレ
ーブ滅菌した。なおポリエチレングリコールは溶解しに
くい為電子レンジを用いて溶かした。

【００１９】ポリメラーザ連鎖反応（ＰＣＲ） ＰＣＲはTAKARAのタックポリメラーザ(Taq polymerase)
を使用した。必要に応じてＭｇＣｌ₂の濃度を変更し
た。

【００２０】アガロースゲル電気泳動 １×ＴＢＥ緩衝液に適当量のアガロースAgaloseSを加え
電子レンジで完全に溶解した後、５０℃程度まで冷まし
ミニゲル電気泳動システム用の型(Mupid-2)に流し込み
室温て固化させゲルを作成した。すぐに使用しない場合
は１×ＴＢＥ緩衝液中で保存した。電気泳動は泳動層に
１×ＴＢＥ緩衝液をゲルが浸る程度に満たしウェルを洗
浄した。ＤＮＡサンブルを１／１０量以上のローディン
グ緩衝液とよく混合してからウェルに注入し、電圧を５
０Ｖまたは１００Ｖ一定で泳動した。泳動終了後、ゲル
を臭化エチジウム溶液で約１５分間染色し長波長（３１
２ｎｍ）の紫外線を照射してＤＮＡを検出した。 （試薬） (ア)１０×ＴＢＥ緩衝液 Tris base（生化学用） １０８．０ｇ ホウ酸 ５．０ｇ ＥＤＴＡ・２Ｎａ(Dojin) ７．４ｇ／ｌ (イ)ローディング緩衝液 Takaraの制限酵素に付属の１０×ローディング緩衝液を
使用した。 １０×ローディング緩衝液 ＳＤＳ １％ グリセロール ５０％ ブロモフェノールブルー ０．０５％ (ウ)臭化エチジウム原液 2,7-シ゛アミノ-10-エチル-9-フェニル-フェナントリシ゛ニウム フ゛ロミト゛（SIGM
A) １０ｍｇ／ｍｌ純水に溶解した。 (エ)染色液 １０×ＴＢＥ緩衝液約２００ｍｌに臭化エチジウム原液
を１５０μｌ加えた。

【００２１】ＤＮＡの切断、修飾 ＤＮＡの制限酵素による消化はＴａｋａｒａの制限酵素
を用いて各酵素に添付の説明書に従い行った。適当量の
ＤＮＡ溶液に１／１０量の１０×緩衝液を加え制限酵素
を１μｌ〜５μｌ加え１時間半から一晩３７℃で反応さ
せた。ＤＮＡ断片をプラスミドベクターにクローニング
する際、連結にはＴａｋａｒａのリゲーションキットVe
r.IIを用い１６℃で３０分から一晩反応させた。また、
挿入ＤＮＡ断片の未端が異なる場合はＴ４ＤＮＡポリメ
ラーザゼで処理し末端の乎滑化を行い連結した。必要に
応じてベクター側の未端をＴａｋａｒａのアルカリフォ
スファターザゼ(Calf intestine)を用いて脱リン酸化処
理を行った。 ＤＮＡ断片の回収、精製 ＤＮＡ断片はＤＥＡＥ濾紙(ADVANTEC)を便用してアガロ
ースゲルより回収した。電気泳動し染色したゲルを長波
長（３１２ｎｍ）の紫外線の下で観察しながら目的のＤ
ＮＡ断片を含むアガロースをブロツクとして切り出し、
ブロックの陽極側にＤＥＡＥ濾紙を張り付けゲルを流し
込み固化した。固化後、１０分間電気泳動して目的のＤ
ＮＡ断片をＤＥＡＥ濾紙に吸着させた。溶離緩衝液４０
０ｍ１にＤＥＡＥ濾紙を浸し５５℃で１０分間保温し
た。チユーブの底に注射針で穴を開けフタを開けた別の
チユーブに重ね５，０００ｒｐｍ、１分間遠心し溶液の
みを回収した。その後、フェノール処理エタノール沈殿
を行いＤＮＡを回収した。エタノール沈殿の際には、３
Ｍ酢酸ナトリウムを１／１０量加えた。 ＤＥＡＥ濾紙の処理 購入したＤＥＡＥ濾紙を滅菌した１．５ＭＮａＣｌ溶液
に３０分間以上浸した後に、純水で２０回以上すすぎ乾
燥させた後、適当な大きさに切断してビーカーに入れて
オートクレ一ブ滅菌した。なお、この操作はすべて手袋
を着用して行った。 （試薬） (ア)溶離緩衝液 １Ｍ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ２０ｍｌ ０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０） ２ｍｌ ＮａＣ１ ８７．７ｇ／ｌ (イ)１．５Ｍ ＮａＣｌ ＮａＣｌ ８７．７ｇ／ｌ

【００２２】（４）大腸菌の形質転換法 コンピテントセルの調整法 一晩前培養した大腸菌を新たなＬＢ培地５０ｍｌに２％
植菌しクレットユニット(Klett Unit)７０〜８０(Mid l
og)まで培養してから３，５００ｒｐｍ、５分間遠心し
集菌した。１／２量の溶液Ａで菌体を洗浄し遠心集菌
後、さらに氷冷した１／２量の溶液Ｂに懸濁し氷上で４
０分間放置した。遠心集菌して１／１０〜１／５量の氷
冷した溶液Ｂに再懸濁して１１０μｌづつエッペンドル
フチユーブに分注した。操作は全て氷上にて無菌的に行
い分注したものは−８０℃で保存した。 （試薬） (ア)１Ｍ ＭｇＣｌ₂ ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ ２０３．３ｇ／ｌ (イ)溶液Ａ １Ｍ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ７．５） ５ｍｌ １Ｍ ＭｇＣｌ₂ ５ｍｌ ＮａＣｌ ５．８ｇ／ｌ (ウ)溶液Ｂ １Ｍ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ７．５） ５ｍｌ １Ｍ ＭｇＣｌ₂ ５ｍｌ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ １４．７ｇ／ｌ グリセロール ２００ｍｌ／ｌ

【００２３】形質転換法 大腸菌コンピテントセルを−８０℃より氷上に移し、約
１０分間後にＤＮＡ溶液、またはライゲーション反応後
の溶液を加えよく混含した後に、氷上でさらに３０分間
放置した。４２℃で２分間熱ショックを加えすぐに氷上
に戻した。５分問氷上に置いた後にＬＢ培地を１ｍｌ加
え、３７℃で３０分間後培養した。適当な抗生物質を含
む寒天培地に適当量接種しガラスピーズで塗り広げ、３
７℃で一晩培養した。

【００２４】エレクトロポレーション法 一晩前培養した大腸菌を新たなＬＢ培地１０ｍｌに２％
植菌し、クレットユニット７０〜８０(Mid log)まで培
養してから３，５００ｒｐｍ、５分間遠心集菌した。１
／２量の１０％グリセロールで数回洗浄し、１００μｌ
の１０％グリセロール溶液に懸濁した。ＤＮＡと混合
し、０．１ｃｍのキユベットに移し約１０分間放置後、
ジーンパルサー(Gene Pulser)(BIO-RAD)てパルスをかけ
た。パルスの条件は２５μＦ、２．５ｋＶ、４００Ωと
した。パルス後、すぐにＬＢ培地１ｍｌを加え、Ｌ字管
で１時間〜２時間程度後培養して適当な抗生物質を含む
寒天培地に適当量接種し、ガラスビーズで塗り広げ３７
℃で一晩培養した。 （試薬） (ア)１０％グリセロール １００ｍｌ／ｌ

【００２５】（５）ゲノムライブラリーの作製法 目的の細菌のゲノムＤＮＡを回収した後に、コスミドベ
クターのクローニングサイトの制限酵素て部分消化しコ
スミドベクターに連結した。大腸菌にλＤＮＡin vitro
パッケージングモジュール（アマシヤム）を用いて形質
導入した。

【００２６】λＤＮＡin vitroパッケージング ゲノムＤＮＡとコスミドベクターLorist６改（Ｓｐ^r）
を連結したＴＥ緩衝液に懸濁している溶液８μｌに、溶
解させたブルーチューブの溶液Ａを１０μｌ加えすぐに
イエローチューブの溶液Ｂを１５μｌ加えた。ピペッテ
ィングでよく混合した後に軽くスピンダウンし２０℃で
２時間反応させた。その後に４７０μｌのＳＭ緩衝液を
加え４℃で保存した。長期保存する場合は１０μｌのク
ロロホルムを加え、４℃で保存した。 （試薬） (ア)ＳＭ緩衝液 ＮａＣ１ ５．８ｇ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂０ ２．０ｇ ＴｒｉｓＢａｓｅ（生化学用） ６．１ｇ ２％ゼラチン ５ｍｌ／ｌ ＨＣ１でｐＨ７．５に調整後、メスアップしオートクレ
ーブ滅菌した。 大腸菌への形質導入 大腸菌ＤＨ５αＭＣＲをＬＢ培地５ｍｌに１ＭのＭｇＳ
Ｏ₄を５０μｌ、２０％マルトースを１００μ１加えた
培地で一晩培養した。ＳＭ緩衝液に懸濁している０．１
ｍｌのパッケージドリアクションに対して２ｍｌの一晩
培養した菌体を加えて３７℃で３０分間静置した。５ｍ
ｌのＬＢ培地を加えて３７℃で約１時間後培養した後、
スペクチノマイシンを含む寒天培地に接種しガラスビー
ズで塗り広げ３７℃で一晩培養した。 （試薬） (ア)１Ｍ ＭｇＳＯ₄ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂０ ２４６．５ｇ／ｌ (イ)２０％マルトース マルトース ２００ｇ／ｌ

【００２７】（６）ハイブリダイゼーション 核酸ののメンブレンヘのブロッティング 適当な制限酵素で切断したＤＮＡは、フェノール処理、
エタノール沈殿後、アガロースゲル電気泳動した。染色
後、ゲルをデプリネーション緩衝液中で振盪処理した。
染料が黄色に変色してから１０分間振盪し、溶液を捨て
純水で数回洗浄し、０．４ＮＮａＯＨ溶液を用い、毛細
管現象を利用してメンブレンに核酸をブロッティングし
た。メンブレンにはＨｙｂｏｎｄＮ⁺（アマシヤム）を
使用した。４時間から一晩放置し十分に核酸を吸着させ
ＤＮＡの吸着している面が分かるように鉛筆で印を付
け、２×ＳＳＣで軽くリンスし乾燥機て十分乾燥させて
からハイブリダイゼーションに使用した。 （試薬） (ア)２０×ＳＳＣ（ｐＨ７．０） ＮａＣｌ １７５．２ｇ クエン酸三ナトリウム・二水塩 ８８．４ｇ／ｌ ４℃で保存した。使用時に適当濃度に希釈して使用し
た。 (イ)デプリネーション溶液 ２５ｍＭ ＨＣｌ

【００２８】ブローブの調製 プローブの調製法、ハイブリダイゼーション、及びシグ
ナルの検出方法はAlkPhos DIRECT（アマシヤム）を用い
て行った。ラベルする核酸をまず１０ｎｇ／μ１に調製
し、ＤＮＡ溶液１０μ１を５分間熱湯中で熱変性した。
氷上に移し５分間放置し、スビンダウンしてチユーブの
底に溶液を集めた。反応緩衝液を１０μｌ加え穏やかに
混ぜた。更に、５倍に希釈しておいた架橋剤溶液を１０
μｌ加え穏やかに混合しスピンダウンしてチユーブの底
に溶液を集めた。３７℃３０分間反応後、氷上に移し
た。氷上て２時間まで安定であり、長期保存をする場合
は、グリセロールを５０％になるように加えて−３０℃
で保存した。

【００２９】ハイブリダイゼーション で作製したメンブレンを少し大きめのハイブリバック
に入れプローブの入っていない適当量のハイブリダイゼ
ーション緩衝液を加え、気泡を取り除きながらポリシー
ラーでシールし、実際にハイブリダイゼーションを行う
温度でプレハイブリダイゼーションを恒温水中で１５分
間以上行った。プレハイブリダイゼーションが終了した
ら、バックの回りの水分をふき取り、角を一ケ所切りプ
ローブをメンブレンに付かないように加えた。ポリシー
ラーでシールし恒温水中で４時間から一晩ハイブリダイ
ゼーションを行った。 （試薬） (ア)ハイブリダイゼーション緩衝液 ０．５Ｍ ＮａＣｌ ２．９２ｇ ４％(W/V)ブロッキング試薬（キットに添付） ４ｇ 上記の試薬にAlkPhos DIRECTキットに添付のハイブリダ
イゼーション緩衝液を５０ｍｌ加え１〜２時間撹拝して
から使用した。

【００３０】シグナルの検出 ハイブリバックの角を切りハイブリダイゼーション緩衝
液を取り出した。取り出したメンブレンはまず一次洗浄
緩衝液で１０分間二回洗浄した。このとき、５５℃以上
で洗浄するとシグナルが検出されなくなるのでその温度
以下で洗浄した。二次洗浄緩衝液で室温て１０分間二回
洗浄した。洗浄したら余分な水分を取り除きサランラッ
ブの上にＤＮＡ側を上にして置いた。メンブレンが全て
湿るように、検出試薬をかけ５分間発光反応させた。ラ
ップ上て余分な検出試薬を切り別のラツプに気泡が入ら
ないようにメンブレンを置き、ぎれいに包んだ。ＤＮＡ
側を上にしてフィルムカセット（岡本製作所）に入れ
た。暗室で、ラップに包んだメンブレンよりもわずかに
大きめにＸ‐線フィルム(FUJI MEDICAL X-RAYFILM RX-U
FUJIFILM)を切りメンブレンに重ねてカセットを閉じ
た。約一時間感光させ現像した。バットに適当量の現像
液、水、定着液を注ぎ、現像反応５分間、水洗１分間、
定着反応５分間を行った。このとき、水洗をきちんと行
わないとバックグラウンドが増えるので、十分に洗浄し
た。現像したＸ‐線フィルムは風乾して保管した。 （試薬） (ア)一次洗浄緩衝液 尿素 １２０ｇ １０％ＳＤＳ １０ｍｌ ０．５Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０） １００ｍｌ ＮａＣ１ ８．７ｇ １Ｍ ＭｇＣｌ₂ １０ｍｌ ブロッキング試薬 ０．２ｇ／ｌ 室温で１時間程度撹拝し十分溶解したことを確認した後
に冷蔵庫で保存した。およそ、１週間は保存可能であ
る。 (イ)２０×原液 二次洗浄緩衝液 Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ １２１ｇ ＮａＣ１ １１２ｇ／ｌ 使う直前に２０倍に希釈し、１ＭＭｇＣｌ₂を２ｍｌ／
１加えて使用した。 (ウ)現像液 ＲＥＮＤＯＬ(FUJIFILM) 約５０℃の温湯２リットルにＡの薬品を徐々に投入して
完全に溶かした後、Ｂの薬品を加えて完全に溶かして便
用した。作製後は遮光瓶に保存し常温で保存した。 (エ)定着液 ＲＥＮＦｌＸ(FUJIFILM) ３０℃以下の水２リットルに全薬品を連続的に投入し完
全に溶かして使用した。作製後は、遮光瓶に入れ室温て
保存した。

【００３１】コロニーハイブリダイゼーション用のメ
ンブレンの作製法 寒天培地に整列させて一晩培養した大腸菌を同じ抗生物
質の入った寒天培地にレプリカし３７℃で３時間程度培
養した。あらかじめシャーレより少し小さめに切って置
いたメンブレンフィルターをコロ二一の表面に付けた。
このとき上下が分かるように鉛筆でフィルターの番号と
適当な印を付けた。数分間放置し、確実にメンブレンフ
ィルターに菌体を吸着させた後に剥がした。５〜１０分
間風乾した後にラップを敷きその上に３ＭＭｐａｐｅｒ
(Whatman)を乗せ、メンブレン１枚当たり５ｍｌ程度の
変性溶液をしみこませた。フィルターをそのうえに乗せ
５分間置き菌体を溶かしＤＮＡを１本鎖としてフィルタ
ーに吸着させた。フィルターをピンセットでつまみ上げ
中和溶液をしみこませた３ＭＭｐａｐｅｒの上に移して
５分間置いた。変性、中和の操作をもう一度繰り返して
からフィルターを２×ＳＳＣで軽く洗い濾紙の上で十分
風乾させた。乾燥したフィルターをサランラツブで包み
長波長の紫外線を３分間照射し固定した。フィルターを
洗浄溶液に浸し１５分間ゆっくり振盪しながらフィルタ
ーを洗浄した。２×ＳＳＣ溶液の中で軽く洗い中和させ
ハイブリダイゼーションに用いた。 （試薬） (ア)変性溶被 ＮａＯＨ ２０．０ｇ ＮａＣ１ ８７．７ｇ／ｌ (イ)中和溶被 １Ｍ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ７．５） (ウ)洗浄浴被 ＮａＯＨ ２．０ｇ ＳＤＳ １．０ｇ／ｌ

【００３２】（７）シーケンス 前記の（３）に示したＤＮＡの基本操作に従って目的の
クローンよりプラスミドＤＮＡを回収、精製した。この
プラスミドＤＮＡを鋳型として、DNA Sequencing Kit:D
ye Terminator Cycle Sequencing Redady Reactions FS
(PERKIN ELMER)を用いてＰＣＲ増幅し、エタノール沈
殿した後に、真空遠心エバポレーターを用いてＰＣＲ産
物を乾燥させシーケンス産物を調製した。この産物をオ
ートシーケンサーＡＢＩ３７３Ａに供し、塩基配列を決
定した。

【００３３】（８）P.putidaゲノムよりＰＣＲによるmu
tSホモロジー領域の増幅とその塩基配列の決定 mutS遺伝子は、ほぽ全領域にわたってそのアミノ酸レベ
ルで保存されている。そこで、アミノ酸レベルで最も保
存された領壊を元にオリゴヌクレオチドホモロジーブラ
イマーを作製し、P.putidaより抽出したゲノムＤＮＡを
鋳型として、ＰＣＲによる増幅を試みた。通常のＰＣＲ
条件では添付の１０×ＰＣＲ緩衝液を用いて行うが、ア
ニール温度の条件を変更しても明確な増幅断片が得られ
なかったため、１０×ＰＣＲ緩衝液でＭｇイオンの混合
されていないものを使い、そのＭｇイオンの濃度を変更
してＰＣＲを行ってみた。その結果、目的のサイズのＤ
ＮＡ断片約４５ｂｐが明確に増福された。次に、この増
幅した断片が目的のmutS遺伝子のホモロジー領壊である
かどうかを確認するために、これをpGEM-Tベクターに連
結し、その塩基配列を決定した。塩基配列を決定した部
分をアミノ酸に変換しデータベースＧＥＮＥＴＹＸ−Ｃ
Ｄを用いて相同性の高いものを調べた結果、目的のmutS
遺伝子の保存された領域てあることが強く示唆された

【００３４】（９）全mutS遺伝子のクローニング 全mutS遺伝子をクローニングするためにP.putidaのゲノ
ムライブラリーをコスミドベクターを用いて作製した。
ＰＣＲ増幅によって得られたＤＮＡ断片をAlkPhos Dire
ct Kitを使用してラべルしブローブとした。約５００コ
ロニーをコロニーハイブリダイゼーション法によって、
目的のmutS遺伝子を保持しているライブラリーのスクリ
ーニングを行った。その結果、２−８７，３−４９，５
−４５の３種類のライブラリーが侯補として得られた。
各ＤＮＡを制限酵素Sal I，Sma I，Pst Iで完全消化
し、ＰＣＲ断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼ
ーションを行った。３種のライブラリーに共通してPst
Iで消化したレーンの同じ移動度の位置にシグナルが検
出されたことから、これらのライブラリーはゲノムの同
じ領域をクローン化していると考えられる。mutS遺伝子
は遺伝子の大きさで２．５ｋｂｐ程度の大きさであると
予想されるために、Sal Iで消化したレーンのシグナル
約４ｋｂｐにmutS遺伝子が全領域含まれていると考え、
２−８７ライブラリーを以後の実験に使用した。

【００３５】Sal I断片４ｋｂｐをｐＵＣ１１９にクロ
ーン化し、その塩基配列を決定したが、mutSの上流部分
がクローン化されでいないことが判明した。そこで再
度、様々な制限酵素を用いてライブラリー２−８７及び
５−４５を完全に消化しサザンハイブリダイゼーション
を行った。EcoR Iで完全消化したレーンのシグナル約１
３ｋｂｐのＤＮＡ断片をｐＵＣ１１９ヘクローン化し、
Sma Iでサブクローン化した。これをシーケンスして、
目的クローンを選択し、更にSph Iでサブクローン化し
て全体の塩基配列を決定した。このP.putida由来mutS遺
伝子の塩基配列を下記の配列表に示す。

【００３６】（１０）相補性試験 大腸菌のmutS破壊株(mutS215::Tn10(Tet))を用いて、こ
の株にP.putidaのmutSホモローグ遺伝子を発現ベクター
にクローン化して形質転換を行った。更に、ＰＣＲ法に
よりOne point mutationを導入したカナマイシン感受性
遺伝子を作成後、プラスミドベクターにより大腸菌mutS
株に形質転換して大腸菌野生株と比較してそのカナマイ
シン耐性の復帰の割合を測定することにより、前記のよ
うにしてクローニングされたP.putidaの遺伝子が実際に
mutS遺伝子であることを確認した。

【００３７】図２に示されるように、代表的な細菌では
mutS遺伝子はアミノ酸配列で約８００アミノ酸残基程度
の長さで保存されている。しかし、今回塩基配列を決定
したP.putidaのmutS遺伝子は、他の細菌に比べて約３０
０アミノ酸残基ほど短い、約５００アミノ酸残基の長さ
であった。その欠失している部分はT.thermophilusの解
析の結果では重要な機能を保持している部分である。そ
れにも拘わらず、大腸菌mutS株を相補したことは、P.pu
tidaのmutS遺伝子産物は短いながらも、他の細菌と同様
の機能を全て保持しているものと推認される。

【００３８】III. P.putida由来mutS遺伝子の機能 本発明により、P.putidaのmutS遺伝子が単離された。そ
の結果、本菌のmutSは他の細菌由来のものと比べてＮ未
端側が約３００アミノ酸残基（約３０ＫＤａ）小さいこ
とが判明した。図３に示すように、T.thermophilus由来
mutS遺伝子のドメイン構造はＮ末端側からＡ１（Ｎ末端
−１３０）、Ａ２（１３１−２７４）、Ｂ（２７５−５
７０）、Ｃ（５７１‐Ｃ末端）の四つである。他の細菌
間でのmutSのアミノ酸アライメントを参考にドメイン構
造の保存性を調べてみると、ＤＮＡへの結合に必要な共
通領域の存在が確認された。この保存領域は主にＣドメ
インに集中しており、図３に示したようにP.putidaのmu
tS遺伝子でも保存されていた。このことよりP.putidaの
mutS遺伝子はＤＮＡへの結合能力を有するものと考えら
れる。２ケ所のＤＮＡ結合部位の内、保存領域《３》に
はＤＮＡ結合に必須なリジン(Lys)残基が含まれてお
り、この部位がミスマッチを認識してＤＮＡに結合する
ことが推定される。

【００３９】図４に、P.putidaのmutSが二本鎖ＤＮＡ中
のミスマッチ部分に結合する状態のモデルを示す。本発
明のmutS遺伝子７はＡ１及びＡ２領域が無く、Ｃ領域で
二本鎖ＤＮＡ１のミスマッチ部分３を認識し、Ｂ領域で
二本鎖ＤＮＡ１に結合する。T.thermophilus由来mutS遺
伝子のＡ１ドメインにある保存領域《１》のフェニルア
ラニン(Phe)残基はミスマッチの結合に必要な残基であ
る。このことよりＡ１ドメインがミスマッチを認識して
いる機能を保持している可能性は高い。しかしながら、
本発明でクローン化したP.putidaのmutS遺伝子にはこの
部分は存在しない。にも拘わらず、前記の相補性試験で
大腸菌内で相補性が認められたことは、クローン化した
P.putidaのmutSは欠失しているＡ１ドメインの機能を他
の部分で補っているものと思われる。

【００４０】このmutSがP.putida内で機能していれば様
々な応用が可能となる。まず研究の目的で述べた進化分
子工学実験系の構築が行える。目的とするものが変異型
の酵素であり生育してきたものを選ぷことになるので現
在の方法ては長期の培養実験が必要になる。そこでmutS
株を宿主に用いると目的遺伝子内に変異が導入されやす
くなり、比較的短期に変異型酵素を取得する方法が考え
られる。

【００４１】更にこのmutSホモローグを使うことにより
mutSの機能ドメインや活性に必須なアミノ酸残基の解析
を行うことが容易になると考えられる。つまり小さい故
に活性に必須な部分を絞り込むことが可能でありアミノ
酸の置換などが行いやすいと考えられる。

【００４２】本発明のmutSはミスマッチを認識してＤＮ
Ａに結含するタンパクてあることから、機能ドメインを
絞り込み、最小型のmutSが構築できればこの面での応用
が可能になる。例えばＰＣＲ増幅は目的のＤＮＡを大量
に得たい場合に有効な方法であるが、酵素反応であるこ
とから、３’→５’のエキソヌクレアーゼ活性を保持し
ている耐熱性のＤＮＡポリメラーゼであってもその正確
性は１００％というわけには行かない。そこでＰＣＲ増
幅反応を行った後の産物にmutSを結合させミスマッチの
導入された産物のみを取り除く系を構築することができ
る。

【００４３】また、あるＤＮＡにミスマツチがあるかど
うかを検出したい場合にはmutSを作用させメンブレンフ
ィルターなどで簡単にミスマッチの入ったＤＮＡだけを
検出する系も構築できる。さらに細菌の種を同定する場
合、ある遣伝子を使ってサザンハイブリダイゼーション
を用い、ほぼ１００％ハイブリダイズしているシグナル
でもmutSに蛍光物質などを連結しておき、シグナルに作
用させることによって、その塩基配列を決定しなくても
遺伝子間のミスマツチの有無を検出できる系も構築でき
る。

【００４４】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
P.putidaから、従来の他の細菌由来のmutS遺伝子に比べ
て、Ｎ末端側が約３００アミノ酸残基（約３０キロダル
トン）小さい、mutS遺伝子が単離される。本発明のP.pu
tida由来mutS遺伝子は、従来の他の細菌由来のmutS遺伝
子と同様に、二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチ部分に結合す
るすることができる。従って、本発明のmutS遺伝子は、
二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチの有無を検出する目的に使
用できる。本発明のmutS遺伝子は分子量が小さいことか
ら、そのハンドリングが容易になり、また、該タンパク
の遺伝子組換えによる高生産が可能となる。

【配列表】 配列番号 ：１ 配列の長さ：１６８９ 配列の型 ：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： ATG GGA TAC CAG AAA ATC AAG GTT CCG ACC GAC GGC ACC AAA ATT ACC 48 Met Gly Tyr Gln Lys Ile Lys Val Pro Thr Asp Gly Thr Lys Ile Thr 5 10 15 GTC AAT GCA GAC CAT TCG CTT AAC GTG CCT GAC CAT CCG ATC ATT CCT 96 Val Asn Ala Asp His Ser Leu Asn Val Pro Asp His Pro Ile Ile Pro 20 25 30 TAC ATC GAA GGC GAC GGG ATC GGC GTC GAT GTT TCG CCG GTA ATG ATC 144 Tyr Ile Glu Gly Asp Gly Ile Gly Val Asp Val Ser Pro Val Met Ile 35 40 45 AAG GTG GTC GAT GCC GCC GTG CAG AAG GCC CGG ATT GGC CTG CGC AAT 192 Lys Val Val Asp Ala Ala Val Gln Lys Ala Arg Ile Gly Leu Arg Asn 50 55 60 GCC CGC CCG CGC GAC CTG GCA CGC CTG CGC GAT GCG CTG GGC GCG TTG 240 Ala Arg Pro Arg Asp Leu Ala Arg Leu Arg Asp Ala Leu Gly Ala Leu 65 70 75 80 CCA GAG CTG CAG AAC GCC ATG ACC GAG CTC GAA GCG CCG CAC CTG GCG 288 Pro Glu Leu Gln Asn Ala Met Thr Glu Leu Glu Ala Pro His Leu Ala 85 90 95 CGC CTG GCG GCC ATT ACC GGT ACC TAT CCG GAG CTG GCC AGC CTG TTG 336 Arg Leu Ala Ala Ile Thr Gly Thr Tyr Pro Glu Leu Ala Ser Leu Leu 100 105 110 GAG CGG GCG ATC ATC GAC AAC CCG CCG GCG GTG ATC CGC GAC GGC GGC 384 Glu Arg Ala Ile Ile Asp Asn Pro Pro Ala Val Ile Arg Asp Gly Gly 115 120 125 GTA CTG AAA GCC GGC TAT GAC AAC GAA CTG GAC GAG ATG CTG GCA ATC 432 Val Leu Lys Ala Gly Tyr Asp Asn Glu Leu Asp Glu Met Leu Ala Ile 130 135 140 AGC GAG AAC GCC GGC CAG TTC CTG ATC GAC CTG GAA GCC CGT GAA AAG 480 Ser Glu Asn Ala Gly Gln Phe Leu Ile Asp Leu Glu Ala Arg Glu Lys 145 150 155 160 GCT CGC ACC GGC CTG GCC AAC CTC AAG GTC GGT TAC AAC CGC GTG CAC 528 Ala Arg Thr Gly Leu Ala Asn Leu Lys Val Gly Tyr Asn Arg Val His 165 170 175 GGC TAC TTC ATC GAA CTG CCG ACC AAG CAG GCC GAG CAG GCC CCG GGC 576 Gly Tyr Phe Ile Glu Leu Pro Thr Lys Gln Ala Glu Gln Ala Pro Gly 180 185 190 GAC TAC ATC CGC CGC CAG ACC CTC AAA GGC GCC GAG CGC TTC ATC ACC 624 Asp Tyr Ile Arg Arg Gln Thr Leu Lys Gly Ala Glu Arg Phe Ile Thr 195 200 205 CCG GAA CTG AAA GCG TTC GAG GAC AAG GCA TTG TCG GCC AAG AGC CGC 672 Pro Glu Leu Lys Ala Phe Glu Asp Lys Ala Leu Ser Ala Lys Ser Arg 210 215 220 GCC CTG GCC CGC GAG AAG ATG CTC TAC GAC GCA CTG CTG GAA ACC CTG 720 Ala Leu Ala Arg Glu Lys Met Leu Tyr Asp Ala Leu Leu Glu Thr Leu 225 230 235 240 ATC AGC CAC CTG GCG CCA CTG CAG GAC AGC GCA GCC GCC CTG GCC GAA 768 Ile Ser His Leu Ala Pro Leu Gln Asp Ser Ala Ala Ala Leu Ala Glu 245 250 255 CTG GAC GTG CTC ATC AAC TTG GCC GAG CGC GCA CTG AAC CTC GAC CTG 816 Leu Asp Val Leu Ile Asn Leu Ala Glu Arg Ala Leu Asn Leu Asp Leu 260 265 270 AAC TGC CCA CGC TTC GTC GAC GAG CCT TGC CTG CGC ATC GAG CAG GGC 864 Asn Cys Pro Arg Phe Val Asp Glu Pro Cys Leu Arg Ile Glu Gln Gly 275 280 285 CGC CAC CCG GTG GTG GAG CAG GTG CTG ACC ACG CCG TTC GTG GCC AAC 912 Arg His Pro Val Val Glu Gln Val Leu Thr Thr Pro Phe Val Ala Asn 290 295 300 GAC CTG GGC CTG GAC AAC AGT ACG CGC ATG CTG ATC ATC ACC GGC CCG 960 Asp Leu Gly Leu Asp Asn Ser Thr Arg Met Leu Ile Ile Thr Gly Pro 305 310 315 320 AAC ATG GGC GGT AAG TCG ACC TAC ATG CGC CAG ACC GCC CTG ATC GTG 1008 Asn Met Gly Gly Lys Ser Thr Tyr Met Arg Gln Thr Ala Leu Ile Val 325 330 335 CTG CTG GCG CAC ATC GGC AGC TTC GTC CCT GCG GCG AGT TGC GAG TTG 1056 Leu Leu Ala His Ile Gly Ser Phe Val Pro Ala Ala Ser Cys Glu Leu 340 345 350 TCG CTG GTC GAC CGC ATC TTC ACC CGC ATC GGC TCC AGT GAC GAC CTG 1104 Ser Leu Val Asp Arg Ile Phe Thr Arg Ile Gly Ser Ser Asp Asp Leu 355 360 365 GCC GGC GGG CGC TCG ACC TTC ATG GTG GAG ATG AGC GAA ACC GCC AAC 1152 Ala Gly Gly Arg Ser Thr Phe Met Val Glu Met Ser Glu Thr Ala Asn 370 375 380 ATC CTG CAC AAT GCC ACC GAC CGC AGC CTG GTG CTG ATG GAC GAA ATG 1200 Ile Leu His Asn Ala Thr Asp Arg Ser Leu Val Leu Met Asp Glu Met 385 390 395 400 GGC CGC GGT ACC AGC ACC TTC GAC GGC CTG TCG CTG GCC TGG GCT GCC 1248 Gly Arg Gly Thr Ser Thr Phe Asp Gly Leu Ser Leu Ala Trp Ala Ala 405 410 415 GCT GAA CGC CTG GCC CAA CTG CGT GCC TAC ACC TTG TTC GCC ACC CAC 1296 Ala Glu Arg Leu Ala Gln Leu Arg Ala Tyr Thr Leu Phe Ala Thr His 420 425 430 TAC TTC GAA CTG ACC GTG CTG CCG GAG AGC GAG CCG CTG GTG GCC AAC 1344 Tyr Phe Glu Leu Thr Val Leu Pro Glu Ser Glu Pro Leu Val Ala Asn 435 440 445 GTG CAC CTG AAC GCC ACC GAG CAC AAT GAA CGC ATC GTG TTC CTG CAC 1392 Val His Leu Asn Ala Thr Glu His Asn Glu Arg Ile Val Phe Leu His 450 455 460 CAC GTG CTA CCC GGC CCT GCC AGC CAA AGT TAC GGC CTG GCC GTT GCG 1440 His Val Leu Pro Gly Pro Ala Ser Gln Ser Tyr Gly Leu Ala Val Ala 465 470 475 480 CAG TTG GCC GGC GTA CCG ACG GCA GTG ATC CAG CGT GCC CGC GAG CAC 1488 Gln Leu Ala Gly Val Pro Thr Ala Val Ile Gln Arg Ala Arg Glu His 485 490 495 CTT GGC CGG CTG GAA ACC ACC AGC CTG CCC CAT GAG CAG CCA GCG GCC 1536 Leu Gly Arg Leu Glu Thr Thr Ser Leu Pro His Glu Gln Pro Ala Ala 500 505 510 CAC AAG GCC AAG GAC GCG CCG CAA GTG CCG CAC CAG AGC GAC TTG TTT 1584 His Lys Ala Lys Asp Ala Pro Gln Val Pro His Gln Ser Asp Leu Phe 515 520 525 GCC AGC CTG CCG CAT CCA GCC ATC GAG AAG CTG GGC AAG CTG CAA CTG 1632 Ala Ser Leu Pro His Pro Ala Ile Glu Lys Leu Gly Lys Leu Gln Leu 530 535 540 GAC GAC ATG ACC CCG CGT CAA GCT ATC GAA ATG CTA TAT CAA CTA AAG 1680 Asp Asp Met Thr Pro Arg Gln Ala Ile Glu Met Leu Tyr Gln Leu Lys 545 550 555 560 AAC CTG TTA Asn Leu Leu

【図面の簡単な説明】

【図１】二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチ部分にmutS遺伝子
が結合する反応過程を示す模式図である。

【図２】二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチ部分にThermus th
ermophilus由来mutS遺伝子が結合するドメイン構造の概
念的構成図である。

【図３】Thermus thermophilus由来mutS遺伝子と本発明
のPseudomonas putida由来mutS遺伝子の保存領域を示す
構成図である。

【図４】二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチ部分に本発明のPs
eudomonas putida由来mutS遺伝子が結合するドメイン構
造の概念的構成図である。

【符号の説明】

１ 二本鎖ＤＮＡ ３ ミスマッチ部分 ５ 従来のmutS遺伝子 ７ 本発明のmutS遺伝子

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１の塩基配列及びアミノ酸配列
   を有し、前記アミノ酸配列の一部のアミノ酸が欠失、付
   加及び／又は置換されていてもよいことを特徴とするミ
   スマッチＤＮＡを認識するmutS遺伝子。
2. 【請求項２】 前記mutS遺伝子はPseudomonas putidaに
   由来することを特徴とする請求項１に記載のmutS遺伝
   子。
3. 【請求項３】 二本鎖ＤＮＡを、配列番号１の塩基配列
   及びアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列の一部のア
   ミノ酸が欠失、付加及び／又は置換されていてもよいmu
   tS遺伝子と反応させるステップからなることを特徴とす
   る、ミスマッチ部分を有する二本鎖ＤＮＡの検出方法。
4. 【請求項４】 前記mutS遺伝子はPseudomonas putidaに
   由来することを特徴とする請求項３に記載の方法。