JPH0698800A - アコレプラズマの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 アコレプラズマに特異的な遺伝子を明らかに
し、その検出方法及びそれに用いるキットを提供する。 【構成】 アコレプラズマの１６ＳｒＲＮＡをコードす
る遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間にあ
るスペーサー領域の遺伝子を検出するアコレプラズマの
検出方法。該スペーサー領域の遺伝子。該スペーサー領
域の遺伝子を増幅させるための特定のプライマーを含有
するアコレプラズマ検出キット。 【効果】 アコレプラズマを、迅速、かつ高感度に検出
することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アコレプラズマ (Acho
leplasma) の検出方法に関し、更に詳細には１６Ｓ／２
３ＳｒＲＮＡスペーサー領域の遺伝子領域を用いた迅速
かつ高感度なアコレプラズマの検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】アコレプラズマはマイコプラズマ (Myco
plasma) と同じモリクテス (Molicutes)綱に属する細胞
壁を欠如する原核生物であり、栄養要求性の違いによ
り、マイコプラズマと分類学的に区別される。アコレプ
ラズマは、１９３６年、下水及び堆肥から分離されたの
が最初で、その後、各種動物の上部気道あるいは生殖器
などに正常フローラとして存在していることが明らかに
されている〔輿水ら、「マイコプラズマとその実験法」
近代出版（１９８８）〕。アコレプラズマは、マイコプ
ラズマと同様に、組織培養中の汚染やワクチン等の生物
製剤への混入が問題となっており、汚染マイコプラズマ
と同じ方法で検出、除去する方法が研究されている。更
に、実験動物は医学・生物学の研究の上で果す重要性が
近年高まり、その品質についても高度なものが要求され
てきており、マウス、ラット等の実験動物のコロニーを
維持、管理する上でもアコレプラズマ汚染の診断と予防
はマイコプラズマと同様に重要な項目となってきてい
る。現在アコレプラズマの検出方法としてはマイコプラ
ズマと同様に、分離培養方法、ＤＮＡ蛍光染色方法、生
化学的方法、免疫学的方法などが開発されており、通常
利用されてはいるが、その操作は煩雑であり、簡便な方
法ではない。一方、近年種々の遺伝子診断方法が開発さ
れてきており、特にＰＣＲ法〔メソッズ イン エンザ
イモロジー（Methods in Enzymology)、第１５５巻、第
３３５〜３５０頁（１９８７）〕が微生物やウイルスの
迅速かつ高感度な検出法として利用されている。例え
ば、特開平２−１０６３５４号公報には、マイコプラズ
マに特異的な遺伝子領域をＰＣＲ法で増幅し、マイコプ
ラズマを迅速かつ高感度に検出する方法が記載されてい
る。しかしながら、アコレプラズマに特異的な遺伝子は
知られていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】つまり、アコレプラズ
マに特異的な遺伝子を特定できれば、該遺伝子を用いて
迅速かつ高感度な検出法を確立でき、前出のマイコプラ
ズマの検出と平行して行えば、組織培養等の管理が更に
確実なものとなる。すなわち、本発明の目的はアコレプ
ラズマに特異的な遺伝子を明らかにし、その検出方法及
びそれに用いるキットを提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はアコレプラズマの検出方法に関し、
アコレプラズマの１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と
２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間にあるスペーサ
ー領域の遺伝子を検出することを特徴とする。また、本
発明の第２の発明は、第１の発明のスペーサー領域の遺
伝子に関する。また、本発明の第３の発明は、第１の方
法を用いて検出を行うための検出キットであって、アコ
レプラズマのスペーサー領域の遺伝子を増幅させるため
の特定のプライマーを含有していることを特徴とする。

【０００５】アコレプラズマのｒＲＮＡをコードするＤ
ＮＡは、１６ＳｒＲＮＡ−スペーサー領域−２３ＳｒＲ
ＮＡ−スペーサー領域−５ＳｒＲＮＡの各ＤＮＡ配列で
構成されている。本発明者らは前記課題を解決するため
にアコレプラズマのｒＲＮＡをコードしているＤＮＡ配
列の一部、すなわち１６ＳｒＲＮＡ−スペーサー領域−
２３ＳｒＲＮＡをコードしている遺伝子の塩基配列の一
部を明らかにし、次にアコレプラズマに特異的な塩基配
列を見出した。次に、遺伝子検出方法として現在最も高
感度で簡便なＰＣＲ法を行うために、アコレプラズマに
特異的な遺伝子の特定領域をＰＣＲ法で増幅するための
オリゴヌクレオチドプライマーを合成した。次に、アコ
レプラズマＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を行い、アコレ
プラズマＤＮＡの特定領域が効率よく増幅され、アコレ
プラズマが特異的に検出できることを見出し、本発明を
完成した。

【０００６】以下、順を追って本発明を具体的に説明す
る。本発明に用いるアコレプラズマとしては例えばアコ
レプラズマ ライドラウイイ（Ａ．laidlawii)ＰＧ８株
（東京大学医学部動物実験施設より入手可能）がある。
アコレプラズマの検出に用いられるｒＲＮＡをコードす
る遺伝子の塩基配列としては、アコレプラズマに特異的
な配列であれば良いが、例えば１６ＳｒＲＮＡ−スペー
サー領域−２３ＳｒＲＮＡをコードする塩基配列より特
異的な配列を見出せば良い。１６ＳｒＲＮＡ及び２３Ｓ
ｒＲＮＡをコードする遺伝子は微生物間でよく保存され
ていることが知られている（特願平４−１１３１５４号
明細書）。

【０００７】

【表１】 表 １ R16-2の配列： 5' -G T G C G G C T G G A T C A C C T C C T-3^' ラクトバチルス カゼイ N N N N N N N N N - - - - - - - - - - - (Lactobacillus casei) バチルス ズブチリス - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - (Bacillus subtilis) エシェリヒア コリ C - - - - - T - - - - - - - - - - - - - (Escherichia coli) マイコバクテリウム ボビス - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - (Mycobacterium bovis) ハロバクテリウム ハロビ C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ウム(Halobacterium halobium) マイコプラズマ カプリコ - - - - - - A - - - - - - - - - - - - - ラム(Mycoplasma capricolum) シュードモナス アエルギ C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ノサ(Pseudomonus aeruginosa) サーマス サーモフィラス - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - (Thermus thermophilus) ハロコッカス モールアエ C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - (Halococcus morrhuae) ストレプトミセス リビダ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ンス(Streptomyces lividans) ヘリオバクテリウム クロ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ラム (Heliobacterium chlorum) フラボバクテリウム ヘパリ - N N N N N N N N - - - - - - - - - - - ナム (Flavobacterium heparinum)

【０００８】

【表２】

【０００９】上記表１及び表２は原核生物ｒＲＮＡ遺伝
子の保存されている塩基配列、及びそれらから選定した
プライマーの塩基配列を示すものであり、表１は１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子の、表２は２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の、そ
れぞれ保存されている塩基配列、及びそれらから選定し
たプライマーの塩基配列を表す。表１及び表２ではいず
れも、保存されている塩基を−で、異なる塩基をその塩
基の記号で、欠損している塩基を＊で、同定されていな
い塩基をＮで示した。

【００１０】例えば、配列表の配列番号１で表されるＲ
１６−２プライマーと配列表の配列番号２で表されるＲ
２３−１Ｒプライマーの組合せで、アコレプラズマのス
ペーサー領域をＰＣＲ法で増幅することができる。

【００１１】このプライマー対はＤＮＡ合成機により合
成でき、ＨＰＬＣにて精製できる。このプライマー対を
用い、アコレプラズマのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応
を行い、塩基配列決定用のＤＮＡの増幅を行う。ＰＣＲ
法についてはタック−ポリメラーゼ (Taq-polymerase)
を含む遺伝子増幅キット及び自動遺伝子増幅装置が宝酒
造社から市販されており、これと前述のプライマー対を
用い、アコレプラズマＤＮＡの増幅反応を行う。

【００１２】ＰＣＲ法としては、酵素として、例えば耐
熱性タック−ポリメラーゼを用い、ＤＮＡの変性（９４
℃）の工程、プライマーＤＮＡのアニーリング（５５
℃）の工程、ＤＮＡ相補鎖の酵素的合成（７２℃）の工
程より成る温度サイクルを３０回繰返し、目的遺伝子を
増幅する。この場合アニーリング温度、温度サイクル回
数は、鋳型ＤＮＡとプライマーＤＮＡの融解温度（Ｔ
ｍ）、鋳型、プライマー間の相同性を考慮して適宜選定
される。

【００１３】次に増幅されたＤＮＡの塩基配列を決定す
る。ＰＣＲ法によって増幅されたＤＮＡの塩基配列決定
は、一旦ＤＮＡをＭ１３又はｐＵＣ等のファージ又はプ
ラスミドベクターにクローニングする方法、又はこのク
ローニングのステップを省略し、直接ＰＣＲ増幅ＤＮＡ
を用いる方法〔ダイレクト シークエンス (Direct Seq
uence)法〕で決定することができる。タック−ポリメラ
ーゼを用いたイン ビトロ (in vitro) ＤＮＡ合成の際
に起こりうるミスインコーポレーションに起因するＤＮ
Ａ配列の読み間違いを防ぐためにも、また時間、費用を
制約するためにも、ダイレクト シークエンス法が有利
である。

【００１４】本発明者らは、アコレプラズマＤＮＡを鋳
型として前述のＲ１６−２プライマーとＲ２３−１Ｒプ
ライマーを用いてＰＣＲを行った。その結果、約４４０
bpと約２３０bpの断片が増幅され、それぞれをＵＬ、Ｕ
Ｓと命名した。次にこれらの断片の塩基配列を決定し
た。配列表の配列番号３にＵＬの塩基配列を、配列表の
配列番号４にＵＳの塩基配列を示す。１６ＳｒＲＮＡ、
スペーサー、２３ＳｒＲＮＡの各領域は既知配列との相
同性から決定することができ、既知配列としては例えば
ヌクレイック アシッズ リサーチ (Nucleic Acids Re
search) 、第１０巻、第１６０７〜１６２４頁（１９８
２）に記載のバチルス ズブチリスのものが知られてい
る。このようにして、配列表の配列番号３で表されるＵ
Ｌの塩基配列中の塩基番号１〜２１を１６ＳｒＲＮＡを
コードする領域、塩基番号２２〜３９５をスペーサー領
域、塩基番号３９６〜４４０を２３ＳｒＲＮＡをコード
する領域と決定し、同様に、配列表の配列番号４で表さ
れるＵＳの塩基配列中の塩基番号１〜２１を１６ＳｒＲ
ＮＡをコードする領域、塩基番号２２〜１８８をスペー
サー領域、塩基番号１８９〜２３３を２３ＳｒＲＮＡを
コードする領域と決定した。なお、ＵＬのスペーサー領
域には、ｔＲＮＡをコードする領域が２か所に導入され
ていた。

【００１５】このようにして決定したスペーサー領域の
塩基配列は、例えばＤＮＡＳＩＳシステム（宝酒造社）
を用いて解析することができ、アコレプラズマに特異的
な領域を検索することができる。

【００１６】次に、特異的な領域の検出方法としては、
サザンハイブリダイゼーション法等の遺伝子検出方法で
良いが、ＰＣＲ法が現在最も高感度でかつ簡便な方法で
ある。ＰＣＲ法に用いるプライマーとしては該領域にア
ニーリングできるものであれば良い。例えば配列表の配
列番号５〜９でそれぞれ表されるＡＦ５、ＡＦ６、ＡＦ
３、ＡＲ６、ＡＲ５の各プライマーが選定できる。例え
ば、ＡＦ５、ＡＦ６、ＡＦ３から選択されるプライマー
と、ＡＲ６、ＡＲ５から選択されるプライマーの組合せ
でＰＣＲを行うことができる。

【００１７】また、特異性と検出感度を更に高めるため
に、ネステッドＰＣＲ法を用いることができる。ネステ
ッドＰＣＲ法とは、まず、第１回目のＰＣＲ（ファース
トＰＣＲ）を行い、次にその増幅領域内で別のプライマ
ーセットをデザインし、それらをプライマーとして第２
回目のＰＣＲ（セカンドＰＣＲ）を行う方法である。こ
れによりファーストＰＣＲで生じた非特異的増幅産物が
セカンドＰＣＲの鋳型になる可能性が排除されるので、
特異性を高めることができる。また、ファーストＰＣＲ
で目的物が検出に十分な量の増幅がなされなかった場合
でも、セカンドＰＣＲを行うことにより確実に検出する
ことができる。例えば、ファーストＰＣＲのプライマー
対としてはＡＦ５とＡＦ６、又はＡＦ６とＡＲ６のプラ
イマー対を用いることができ、セカンドＰＣＲのプライ
マー対としてはＡＦ３とＡＲ５のプライマー対を用いる
ことができる。

【００１８】また、増幅後のアコレプラズマＤＮＡの検
出は、例えばアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動、スポット法、サザンブロット法を用
いて行うことができる。この場合は、増幅領域内でプロ
ーブＤＮＡを選択すればよい。プローブとしては例えば
増幅領域内でデザインしたプライマーセットにより増幅
した産物を、標識化して使用することもできる。これに
より、高感度な検出が可能となる。

【００１９】標識化の方法は放射性同位元素標識法に限
らず、酵素標識、蛍光標識、ビオチン、アビジン系標
識、ケミプローブ標識法等公知の方法なら何でもよい。
実際選定されたプライマーを用い、アコレプラズマ由来
の遺伝子のＰＣＲ反応を行うことができ、電気泳動法、
サザンハイブリダイゼーション法等により高感度に検出
することができる。

【００２０】このようにアコレプラズマに特有の遺伝子
領域が明らかになり、この領域を検出することによりア
コレプラズマを高感度に検出することができる。ＰＣＲ
法の場合、アコレプラズマ感染細胞１個よりの検出が可
能であり、アコレプラズマの早期検出が可能となり、汚
染細胞、汚染動物等の管理が容易となった。

【００２１】また、本発明に従って、アコレプラズマ特
定ＤＮＡ領域を増幅させるためのプライマー対をそろえ
てキットとしておくことにより、アコレプラズマの検出
を簡便に行うことができる。また、キット中には増幅さ
れたＤＮＡ領域を検出するためのプローブを入れてもよ
い。なお、キットに用いる試薬は溶液状でも良いし、凍
結乾燥物でもよい。

【００２２】以上ＰＣＲ法を用いたアコレプラズマの高
感度検出法について詳細に説明してきたが、本発明はＰ
ＣＲ法に限定されるものではなく、特定の核酸及びその
相補鎖を高感度に検出する方法はすべて本発明に含まれ
るものであり、例えばＱβ−レプリケース アンプリフ
ィケーション システム〔バイオ／テクノロジー(Bio／
technology) 、第６巻、第１１９７頁（１９８８）〕に
よる方法が挙げられる。

【００２３】

【実施例】以下本発明を実施例をもって詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例によって限定されるものでは
ない。

【００２４】実施例１ アコレプラズマの１６ＳｒＲＮＡ−スペーサー領域−２
３ＳｒＲＮＡをコードしているＤＮＡ領域の塩基配列決
定 （１）アコレプラズマＤＮＡの調製 培養細胞に高頻度で汚染するアコレプラズマ ライドラ
ウイイ ＰＧ８株（東大医学部動物実験施設より分与）
を公知の改良したエドワード (Edward) 培地３リットル
を用いて、３７℃で培養し、１００００ｇ、１時間遠心
して培地を除いた。ＴＥ緩衝液〔１０mMトリス (Tris)
−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１mM ＥＤＴＡ〕で菌体を洗浄
後、ラジン (Razin)らの方法〔インターナショナル ジ
ャーナルオブ システマチック バクテリオロジー（In
ternational Journal of Systematic Bacteriology) 、
第３３巻、第２０１〜２０６頁（１９８３）〕でアコレ
プラズマＤＮＡを調製した。

【００２５】（２）オリゴヌクレオチド プライマーＤ
ＮＡの合成及び精製 配列表の配列番号１で表されるＲ１６−２、配列表の配
列番号２で表されるＲ２３−１Ｒの各オリゴヌクレオチ
ド プライマーＤＮＡをＤＮＡ合成機（アプライドバイ
オシステムズ社）を用いて合成し、脱保護の後、イオン
交換ＨＰＬＣ（ＴＳＫゲル、ＤＥＡＥ−２ＳＷ、東ソー
社）で精製し、セプ−パク (Sep-Pack)Ｃ１８（ウォー
ターズ社）で脱塩し、各ＤＮＡを約５０μｇ得た。

【００２６】（３）ＰＣＲ法によるスペーサー領域の増
幅 実施例１−（１）で調製したゲノムＤＮＡ０．１μｇを
０．５ml用チューブ（バイオビック社）に取り、９４
℃、１０分間加熱処理した後、ジーン アンプキット
(Gene Amp Kit) （宝酒造社）中の１０μｌの１０×増
幅用バッファー〔１００mMトリス−ＨＣｌ、（ｐＨ８．
３）、５００mM ＫＣｌ、１５mM ＭｇＣｌ₂ 、０．１
％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン〕、１６μｌの１．２５mM ｄＮ
ＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ）、０．５μｌの５ユニット／μｌのタック−ポリメ
ラーゼ、１μｌの２０μＭ Ｒ１６−２プライマー、１
μｌの２０μＭ Ｒ２３−１Ｒプライマーを加え、これ
に滅菌水を加えて１００μｌの溶液にした。この反応液
は上層に１００μｌのミネラルオイル（シグマ社）を加
えた後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒
造社）により増幅反応を行った。反応条件は、９４℃、
０．５分間の変性→５５℃、２分間のプライマーのアニ
ーリング→７２℃、２分間の合成反応のサイクルを３０
サイクル行った。反応後１０μｌの反応液を取り、ヌシ
ーブ (Nusieve)３：１アガロース（ＦＭＣ社）ゲル電気
泳動を行い、エチジウムブロマイドでＤＮＡを染色し
て、増幅されたＤＮＡを確認した。その結果、約４４０
bpと約２３０bpのＤＮＡが増幅されており、該ＤＮＡ断
片をそれぞれＵＬ、ＵＳと命名した。

【００２７】（４）スペーサー領域のクローニング及び
シークエンシング 実施例１−（３）で得られた増幅ＤＮＡ反応液２００μ
ｌを２００μｌのフェノール／クロロホルム（等量混合
液）を加え緩やかに混合し、１２０００rpm 、１０分間
遠心し水層（上層）を回収した。次に、２００μｌのク
ロロホルムを加え緩やかに混合し、１２０００rpm 、１
０分間遠心し水層（上層）を回収した。最後に、２０μ
ｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと４００μｌのエタノールを加
え、１２０００rpm 、１０分間遠心し沈殿を回収した。
沈殿は８０％エタノールにて洗浄し、乾燥後、３０μｌ
のＴＥバッファーに溶解した。このＤＮＡ溶液を、１％
シープラーク（Sea Plaque) アガロースゲル（ＦＭＣ
社）電気泳動に供し、目的のＤＮＡを切り出した。切り
出したＤＮＡを含むゲルは、ＭＥＲmaid^TMキット（バイ
オ１０１社）により精製してＤＮＡ溶液を得た。まず切
り出したゲル（約０．２ｇ）に、ハイ ソルト バイン
デイング ソルーション (High salt binding solutio
n) ６００μｌ、グラス ホグ (glass fog)４０μｌを
加えて１０分間、よくかくはんし、１２０００rpm 、５
秒間遠心して上清を除去した。ハイ ソルト バインデ
イング ソルーション２００μｌで沈殿を洗浄し、１２
０００rpm 、５秒間遠心し、上清を除去した。エタノー
ル ウォッシュ（Ethanol wash) ３００μｌで沈殿を洗
浄し、２〜３秒間よくかくはんし、軽く遠心した。エタ
ノール ウォッシュで洗浄する操作を２〜３回繰返し
て、沈殿、乾燥後、４０μｌの滅菌水を加え、５０℃、
５分間インキュベート後、１２０００rpm 、１分間遠心
し、上清のＤＮＡ溶液を回収した。滅菌水でＤＮＡを溶
出する操作を後１〜２回繰返した。最後に、１０μｌの
３Ｍ酢酸ナトリウムと２００μｌのエタノールを加え、
１２０００rpm 、１０分間遠心し沈殿を回収した。沈殿
は８０％エタノールにて洗浄し、乾燥後、２０μｌのＴ
Ｅ緩衝液に溶解した。

【００２８】このようにして得られたＤＮＡを鋳型とし
てシークエナーゼ（Sequenase)シークエンシング キッ
ト（ＵＳＢ社）を用いて以下のようにダイレクトシーク
エンス法によるＤＮＡ塩基配列決定を行った。ＰＣＲに
よるＤＮＡ増幅に用いたプライマーＲ１６−２、及びプ
ライマーＲ２３−１Ｒをメガラベル（MEGALABEL)キット
（宝酒造社）を用いて、５′末端を〔γ−³²Ｐ〕ｄＡＴ
Ｐで放射性標識した。放射性標識したプライマーＲ１６
−２、あるいはＲ２３−１Ｒ ２０ng（４pmol) 鋳型Ｄ
ＮＡを約０．５pmol、５×緩衝液２μｌに滅菌水を加
え、８μｌにした後、９４℃で３０分間加熱し、氷中で
急冷した。この反応液に１μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、２
μｌの１／６希釈ラベリングミックス、０．５μｌの
〔α−³⁵Ｓ〕ｄＣＴＰ、及び２μｌの１／９希釈シーク
エナーゼを加え室温、５分間ラベリング反応を行った。
あらかじめそれぞれ２．５μｌのｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴ
Ｐ、ｄｄＴＴＰ、及びｄｄＣＴＰを加えた４本のチュー
ブにそれぞれ３．５μｌのラベリング反応液を加え３７
℃、５分間ターミネーション反応を行った後、４μｌの
反応停止液を加えた。この反応液を６％ポリアクリルア
ミドゲル中で４０ワット、１．５〜３時間電気泳動を行
った。泳動後、ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルム（コダック
社）によりオートラジオグラムを得た。オートラジオグ
ラムより塩基配列を解析した。またダイレクトシークエ
ンス法ではプライマー付近の塩基配列が得られないた
め、プライマー付近のみ目的のＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐ
１８ＲＦＤＮＡ（宝酒造社）にクローニングしてシーク
エンシングを行った。

【００２９】以上のようにして配列表の配列番号３及び
４でそれぞれ表されるＵＬ及びＵＳの塩基配列を決定し
た。更に、既知配列との相同性から１６ＳｒＲＮＡをコ
ードする領域、スペーサー領域、２３ＳｒＲＮＡをコー
ドする領域を決定した。なお、ＵＬのスペーサー領域に
はｔＲＮＡをコードする領域が挿入されていた。

【００３０】実施例２ ＰＣＲ法によるアコレプラズマの検出 （１）アコレプラズマ検出のためのプライマーの選定と
合成 実施例１−（４）で得られた塩基配列を基に、ＤＮＡＳ
ＩＳシステム（宝酒造社）を用いてアコレプラズマに特
異的な配列を解析し、配列表の配列番号５〜９でそれぞ
れ表される特異的プライマーＡＦ５、ＡＦ６、ＡＦ３、
ＡＲ６、ＡＲ５を選定した。これらのプライマーを実施
例１−（２）と同様の方法で合成及び精製した。

【００３１】（２）特異的プライマーを用いたＰＣＲ法
によるアコレプラズマＤＮＡの増幅 実施例１−（１）で得たアコレプラズマ ライドラウイ
イゲノムＤＮＡを鋳型に用いて、実施例１−（３）の方
法でＰＣＲ法による増幅、検出を行った。プライマーと
して、それぞれ１μｌの２０μＭ、ＡＦ５とＡＲ６、Ａ
Ｆ６とＡＲ６、ＡＦ３とＡＲ５を用いた。

【００３２】その結果、ＡＦ５とＡＲ６のプライマー対
より３８９bpと１８２bp、ＡＦ６とＡＲ６より、３１２
bp、ＡＦ３とＡＲ５より２４７bpのアコレプラズマの遺
伝子を特異的に増幅することができた。しかし、７種類
のマイコプラズマ〔マイコプラズマ ホミニス（Ｍ．ho
minis)、マイコプラズマ アルスリティディス（Ｍ．ar
thritidis)、マイコプラズマハイオリニス（Ｍ．hyorhi
nis)、マイコプラズマ プルモニス（Ｍ．pulmonis)、
マイコプラズマ ニューロリティカム（Ｍ．neurolytic
um) 、マイコプラズマサリバニウム（Ｍ．salivalium)
、マイコプラズマ アルギニニ（Ｍ．arginini) 〕、
マウス、及び大腸菌のＤＮＡを鋳型とした反応溶液で
は、バンドは認められなった。

【００３３】実施例３ ネステッドＰＣＲによるアコレプラズマＤＮＡの検出 （１）実施例２−（２）で、プライマー対としてプライ
マーＡＦ５とＡＲ６、あるいはＡＦ６とＡＲ６を用いて
反応を行った反応溶液１μｌを鋳型として、実施例１−
（３）の方法でＰＣＲ法による増幅、検出を行った。プ
ライマーとしてそれぞれ１μｌの２０μＭ ＡＦ３とＡ
Ｒ５を用いた。この結果、２４７bpのバンドが増幅され
たが、７種類のマイコプラズマＤＮＡ、マウスＤＮＡ、
大腸菌ＤＮＡを鋳型とした反応溶液ではバンドは認めら
れなかった。

【００３４】実施例４ 夾雑ＤＮＡの影響と検出感度 ヒトゲノムＤＮＡ中に、アコレプラズマＤＮＡを混合
し、そのＤＮＡ溶液からアコレプラズマのＤＮＡのみを
特異的に、かつ効率よく増幅するかどうかを検討した。
ヒトゲノムＤＮＡ１００ngに対して、アコレプラズマＤ
ＮＡを１ng、０．１ng、０．０１ng、０．００１ng加え
たサンプルを用意した。これらを鋳型とし、ＡＦ５とＡ
Ｒ６をプライマーとして、実施例１−（３）と同様にＰ
ＣＲ法による増幅、検出を行った。その結果、ヒトゲノ
ムＤＮＡの有無に関係なく、アコレプラズマＤＮＡが
０．００１ngまで増幅、検出されることを確認した。

【００３５】実施例５ アコレプラズマ検出キットの作成 試料中のアコレプラズマＤＮＡを増幅、検出するための
キットを作成した。ファーストＰＣＲ用プライマーとし
て、プライマーＡＦ６及びＡＲ６が、各２０μＭ溶液と
なるようにＴＥ緩衝液２０μｌに溶解し、アコレプラズ
マプライマー液（Ａ剤）とした。また、セカンドＰＣＲ
用プライマーとしてプライマーＡＦ３及びＡＲ６が各２
０μＭ溶液となるように、ＴＥ緩衝液２０μｌに溶解
し、アコレプラズマプライマー液（Ｂ剤）とした。Ａ
剤、Ｂ剤、及びＡ剤とＢ剤の組合せでキットＩ〜III を
作成した（表３）。

【００３６】

【表３】 表３ アコレプラズマ増幅・検出キット キットＩ Ａ剤 アコレプラズマプライマー液 20μｌ（１μｌ×20回分） キットII Ｂ剤 アコレプラズマプライマー液 20μｌ（１μｌ×20回分） キットIII Ａ剤 アコレプラズマプライマー液 20μｌ（１μｌ×20回分） Ｂ剤 アコレプラズマプライマー液 20μｌ（１μｌ×20回分）

【００３７】

【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明によ
りアコレプラズマの１６Ｓ／２３ＳｒＲＮＡスペーサー
領域の塩基配列が明らかになり、このスペーサー領域の
塩基配列を用いたアコレプラズマの迅速、かつ高感度な
検出方法が提供された。

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTGCGGCTGG ATCACCTCCT 20 配列番号：2 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CYTACSGAAC CGTGATCCTC 20 配列番号：3 配列の長さ：440 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源： 生物名：アコレプラズマ ライドラウイイ (Acholepla
sma laidlawii) 株名：PG8 配列の特徴： 1-21 16SrRNAをコードする領域 22-156 スペーサー領域 157-232 tRNAをコードする領域 233-254 スペーサー領域 255-328 tRNAをコードする領域 329-395 スペーサー領域 396-440 23SrRNA をコードする領域 配列： GGCTGGATCA CCTCCTTTCT AAGGAGAAAG GCTAACTAAC ACTTAGCACA AGATGACTAC 60 TAGTAAGTAG TAACATTCTC TAAATTTGTT CATCATATTC AGTTTTGAGA GACTTAAATG 120 TCACTCAAAC AAGTAACCAC ATATTAATAA TAAGTGGGGC CTGTAGCTCA GTTGGTTAGA 180 GCACTCGCTT GATAAGCGAG GGGTCGATGG TTCAAGTCGT TCAGGCCCAC CATTAATAAA 240 TATCAATAAA AATTGGGCCT TAGCTCAGCT GGGAGAGCGC CTGCCTTGCA CGCAGGAGGT 300 CAGCGGTTCG ATCCGCTAGG CTCCACCAAT ATAAAATTAG GGTAACCTAA TTGAGATCTT 360 TGAAAAGTAG ATAAATGATG TCTGAAAAGA AATAAGGTTA AGGAACAAAG GGCACACAGT 420 GGATGCCTTG GCACTAGGAG 440 配列番号：4 配列の長さ：233 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源： 生物名：アコレプラズマ ライドラウイイ (Acholepla
sma laidlawii) 株名：PG8 配列の特徴： 1-21 16SrRNAをコードする領域 22-188 スペーサー領域 188-233 23SrRNAをコードする領域 配列： GGCTGGATCA CCTCCTTTCT AAGGAGAAAG GCTAACTAAC ACTTAGCACA AGATGACTAC 60 TAGTAAGTAG TAATATTCTC TAAATTTGTT CATCATATTC AGTTTTGAAA GACTTAAAGT 120 AATTTAAGTG TTTCAAGAAG TAAAGAAAGT CTTTGAAAAG TAGATAAATG ATGTCTGAAA 180 AGAAATAAGG TTAAGGAACA AAGGGCACAC AGTGGATGCC TTGGCACTAG GAG 233 配列番号：5 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTAACTAACA CTTAGCACAA 20 配列番号：6 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GAGACTTAAA TGTCACTCAA 20 配列番号：7 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTCACTCAAA CAAGTAACCA 20 配列番号：8 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ACTGTGTGCC CTTTGTTCCT 20 配列番号：9 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTTCAAAGAT CTCAATTAGG 20

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 原澤 亮 東京都足立区六月３−９−12

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アコレプラズマの検出方法において、ア
   コレプラズマの１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２
   ３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間にあるスペーサー
   領域の遺伝子を検出することを特徴とするアコレプラズ
   マの検出方法。
2. 【請求項２】 請求項１記載のスペーサー領域の遺伝
   子。
3. 【請求項３】 請求項１記載の方法を用いて検出を行う
   ための検出キットであって、アコレプラズマの請求項２
   記載のスペーサー領域の遺伝子を増幅させるための特定
   のプライマーを含有していることを特徴とするアコレプ
   ラズマ検出キット。