KR20220166264A - 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균의 erm(41) 유전자의 1염기 변이를 판별하는 방법, 그 방법에 사용하는 프라이머 세트 및 프로브 - Google Patents

마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균의 erm(41) 유전자의 1염기 변이를 판별하는 방법, 그 방법에 사용하는 프라이머 세트 및 프로브 Download PDF

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Abstract

본 발명의 1 이상의 실시 형태는, 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의 1염기 변이를 판별하기 위한 새로운 수단을 제공한다. 본 발명의 1 이상의 실시 형태는, 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의 제28위에 상당하는 염기를 판정하는 방법이며, 상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 시토신의 경우에 게놈 DNA의 상기 erm(41) 유전자 이외의 영역에 존재하고, 티민의 경우에 존재하지 않는 지표 염기서열을, 판정 대상의 항산균의 게놈 DNA에 있어서 검출하는 것을 포함하고, 상기 지표 염기서열의 존재가, 상기 염기가 시토신인 것을 나타내고, 상기 지표 염기서열의 부존재가, 상기 염기가 티민인 것을 나타내는, 방법에 관한 것이다.

Description

마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균의 erm(41) 유전자의 1염기 변이를 판별하는 방법, 그 방법에 사용하는 프라이머 세트 및 프로브
본 발명은 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균의 erm(41) 유전자의 1염기 변이를 판별하는 방법, 그 방법에 사용하는 프라이머 세트 및 프로브에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항산균의 erm(41) 유전자의 1염기 변이를 판별하는 방법, 그 방법에 사용하는 프라이머 세트 및 프로브에 관한 것이다.
항산균은, 항상성, 비운동성의 그람 양성 간균이다. 항산균은, 결핵균 군(Mycobacterium tuberculosis complex)과 비결핵성 항산균(Nontuberculous mycobacteria; NTM)의 2개로 크게 구별된다.
비결핵성 항산균은 현재까지 170종 이상의 균종이 보고되고 있고, 그 중 30종 정도가 인간에게 병원성을 나타내는 것이 판명되어 있다.
비결핵성 항산균증 중에서도, 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스(Mycobacteroides abscessus complex)증은 기존의 항균약이 잘 듣지 않아서 유효한 치료법이 확립되지 않았기 때문에, 환자수는 쌓이고, 중증자도 늘어나고 있다. 원인균군인 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스는, 마이코박테로이데스·압세수스·아종 압세수스(Mycobacteroides abscessus subsp. abscessus), 마이코박테로이데스·압세수스·아종 마실리엔스(Mycobacteroides abscessus subsp. massiliense) 및 마이코박테로이데스·압세수스·아종 볼레티(Mycobacteroides abscessus subsp. bolletii)의 3아종을 포함한다. 또한, 마이코박테로이데스·압세수스는 마이코박테리움·압세수스라 칭해지는 경우가 있다.
특허문헌 1에서는, 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스의 상기의 3아종을 판별하기 위해서, 3아종에 공통되는 막 수송체 유전자의 하류 영역을 표적으로 하고 아종마다 증폭산물의 크기가 다르도록 설계된 제1 프라이머와, 3아종에 공통되는 ATP 결합 카세트 수송체 유전자의 하류 영역을 표적으로 하고 아종마다 증폭산물의 크기가 다르도록 설계된 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트가 개시되어 있다.
마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에서는, 유전자의 변이에 따라 항생 물질에 대한 내성을 발생하는 것이 알려져 있다. 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에는 마크롤라이드 감수성주와, 투약 중에 내성화하는 유도 내성주가 존재한다. 이 유도 내성의 유무에는 erm(41) 유전자의 1염기 다형이 관여하고 있고, erm(41) 유전자의 제28위 염기가 티민인 T28주는 유도 내성을 갖지만, 상기 염기가 시토신인 C28주는 감수성인 것이 알려져 있다(비특허문헌 1 참조).
한편, 폐렴 마이코플라즈마 등의 세균에 있어서의 마크롤라이드계 항생 물질 내성 변이균을 검출하는 방법으로서, 특허문헌 2에는, 표준주와 변이균주로 거동이 다른 가수 분해 프로브를 피검체의 생물학적 시료와 접촉시켜서, 리얼타임 PCR에서 검출하는 방법이 기재되어 있다.
유전자의 1염기 다형을 판별하는 기술로서, 알레르 특이적 프라이머에 의한 프라이머 신장 반응(핵산 증폭법을 포함한다)을 이용하는 기술이 알려져 있다. 알레르 특이적 프라이머란, 표적으로 하는 1염기 다형의 염기종에 의존해서 프라이머 신장 반응 효율에 현저한 차가 발생하는 프라이머를 말한다. 따라서, 예를 들어 알레르 특이적 프라이머를 사용해서 PCR을 행하고, 그 증폭산물량을 해석함으로써 표적으로 하는 1염기 다형의 염기종을 특정할 수 있다. 그러나, 이 경우, 반응 조건을 엄밀하게 규정하지 않으면 위양성의 문제가 발생한다. 특허문헌 3에는, 3'말단으로부터 2번째 및 3번째의 염기를 특정한 패턴으로 한, 3'말단 염기가 표적으로 하는 1염기 다형 대응하는 알레르 특이성 프라이머를 사용한, 위양성 반응이 적은 1염기 다형 판별법에 관한 기재가 있다. 그러나, 어떻든 1염기 다형을 직접 검출하기 위한 알레르 특이적 프라이머의 설계에 있어서는, 프라이머의 3'말단 부근에 1염기 다형 부위에 대응하는 부위를 배치할 필요가 있어, 설계의 유연성이 낮고, 1염기 다형의 주변 서열에 따라서는 판별에 충분한 프라이머 신장 효율과 위양성 반응의 적음을 겸비한 프라이머의 선발은 곤란하다.
일본특허공개 제2019-97493호 공보 국제공개 WO2013/136818 일본특허 제3859678호 공보
J Antimicrob Chemother 2017; 72: 1669-1677
상기한 바와 같이, 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스의 마크롤라이드 유도 내성의 유무에는 erm(41) 유전자의 1염기 다형이 관여하고 있고, erm(41) 유전자의 제28위 염기가 티민인 T28주는 유도 내성을 갖지만, 상기 염기가 시토신인 C28주는 감수성인 것이 알려져 있다. 그래서, 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스의 마크롤라이드 감수성을 추정한 후 T28주인지, C28주인지를 판별하는 것이 유용하다.
1염기 다형을 직접 검출하기 위한 알레르 특이적 프라이머를 취득하기 위해서는, 특허문헌 3에 기재되는 대로 판별에 충분한 프라이머 신장 효율과 위양성 반응의 적음을 겸비한 프라이머를, 한정된 서열 후보 중에서 설계할 필요가 있고, 실시는 용이하지 않다.
그래서 본 발명의 1 이상의 실시 형태는, 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의 제28위 염기가 시토신인지 티민인지를 판별하기 위한 새로운 수단을 제공한다. 또한, 본 발명의 1 이상의 실시 형태는, 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의 제28위 염기가 시토신인 것을 판별하기 위한 새로운 수단을 제공한다.
본 발명자들은 놀랍게도, 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균의 게놈 DNA 상에, erm(41) 유전자의 제28위 염기가 시토신의 경우에 존재하지만, 상기 염기가 티민의 경우에는 존재하지 않는 지표 염기서열을 발견했다. 그리고, 이 지표 염기서열의 유무에 기초하여, 판정 대상의 항산균 erm(41) 유전자의 제28위 염기를 판별할 수 있는 것을 발견하고, 이하의 발명을 완성하기에 이르렀다.
[1]
마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신인지 티민인지를 판정하는 방법이며,
상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 시토신의 경우에 게놈 DNA의 상기 erm(41) 유전자 이외의 영역에 존재하고, 티민의 경우에 존재하지 않는 지표 염기서열을, 판정 대상의 상기 항산균의 게놈 DNA에 있어서 검출하는 것
을 포함하고,
상기 지표 염기서열이 검출되는 것이, 상기 항산균의 게놈 DNA 중의 상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 시토신인 것을 나타내고,
상기 지표 염기서열이 검출되지 않는 것이, 상기 항산균의 게놈 DNA 중의 상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 티민인 것을 나타내는,
방법.
[2]
상기 지표 염기서열이, 서열번호 2의 염기서열에 포함되는 연속한 10염기 이상의 제1 염기서열 또는 상기 제1 염기서열에 상보적인 제2 염기서열인, [1]에 기재된 방법.
[3]
상기 제1 염기서열이, 서열번호 3, 5, 7, 9 또는 11의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열을 적어도 일부에 포함하는, [2]에 기재된 방법.
[4]
[1] 내지 [3]의 어느 하나에 기재된 방법을 포함하는, 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균의 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 판정하는 방법이며,
상기 지표 염기서열이 검출되는 것이, 상기 항산균이 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 갖는 것을 나타내고,
상기 지표 염기서열이 검출되지 않는 것이, 상기 항산균이 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 갖지 않는 것을 나타내는,
상기 방법.
[5]
마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신의 경우에 게놈 DNA의 상기 erm(41) 유전자 이외의 영역에 존재하고, 티민의 경우에 존재하지 않는 지표 염기서열을 검출하기 위한 프라이머 세트이며,
상기 지표 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 부분 염기서열 f11의 상보 염기서열과 하이브리다이즈 가능한 염기서열 f12를 3'말단에 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머와,
상기 지표 염기서열에 포함되고, 상기 부분 염기서열 f11의 3'말단보다 3'말단측에 위치하는, 연속한 10염기 이상의 부분 염기서열 r11과 하이브리다이즈 가능한 염기서열 r12를 3'말단에 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머
를 포함하는 프라이머 세트.
[6]
상기 지표 염기서열이, 서열번호 2의 염기서열에 포함되는 연속한 20염기 이상의 제3 염기서열인, [5]에 기재된 프라이머 세트.
[7]
상기 제3 염기서열에 포함되는, 상기 부분 염기서열 f11의 5'말단의 염기로부터, 부분 염기서열 r11의 3'말단의 염기까지의 염기서열이, 서열번호 3, 5, 7, 9 또는 11의 염기서열에 포함되는, 연속한 20염기 이상의 염기서열을 적어도 일부에 포함하는, [6]에 기재된 프라이머 세트.
[8]
상기 부분 염기서열 f11이,
(f11-12-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4624 내지 4668위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(f11-18-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2356 내지 2397위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(f11-20-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2624 내지 2663위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(f11-22-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4044 내지 4083위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(f11-24-1) 서열번호 2의 염기서열의 제6535 내지 6575위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(f11-26-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7478 내지 7520위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열, 또는
(f11-28-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7629 내지 7673위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열
이고,
상기 부분 염기서열 r11이,
(r11-13-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4694 내지 4740위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(r11-19-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2672 내지 2711위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(r11-21-1) 서열번호 2의 염기서열의 제3539 내지 3583위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(r11-23-1) 서열번호 2의 염기서열의 제5061 내지 5103위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(r11-25-1) 서열번호 2의 염기서열의 제6566 내지 6605위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(r11-27-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7931 내지 7976위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열, 또는
(r11-29-1) 서열번호 2의 염기서열의 제8302 내지 8346위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열
인,
[6] 또는 [7]에 기재된 프라이머 세트.
[9]
상기 제1 프라이머 및 상기 제2 프라이머의 한쪽이, 표지 물질과 결합 가능한 태그 또는 표지 물질인 표지부를 더 포함하고, 다른 쪽이, 고상 담체와 결합 가능한 태그인 결합부를 더 포함하는, [5] 내지 [8]의 어느 하나에 기재된 프라이머 세트.
[10]
[9]에 기재된 프라이머 세트와,
상기 결합부와 결합 가능한 부분을 적어도 일부에 포함하는 고상 담체를 포함하는,
마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신의 경우에 게놈 DNA의 상기 erm(41) 유전자 이외의 영역에 존재하고, 티민의 경우에 존재하지 않는 지표 염기서열을 검출하기 위한 키트.
[11]
마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신의 경우에 게놈 DNA의 상기 erm(41) 유전자 이외의 영역에 존재하고, 티민의 경우에 존재하지 않는 지표 염기서열을 검출하기 위한 프로브이며,
상기 지표 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 부분 염기서열 p1과 하이브리다이즈 가능한 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로브.
[12]
상기 지표 염기서열이, 서열번호 2의 염기서열에 포함되는 연속한 10염기 이상의 제1 염기서열 또는 상기 제1 염기서열에 상보적인 제2 염기서열인, [11]에 기재된 프로브.
[13]
상기 부분 염기서열 p1이, 서열번호 3, 5, 7, 9 또는 11의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열을 적어도 일부에 포함하는, [12]에 기재된 프로브.
[14]
상기 부분 염기서열 p1이,
(p1-12-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4624 내지 4668위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-18-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2356 내지 2397위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-20-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2624 내지 2663위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-22-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4044 내지 4083위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-24-1) 서열번호 2의 염기서열의 제6535 내지 6575위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-26-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7478 내지 7520위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-28-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7629 내지 7673위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-13-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4694 내지 4740위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-19-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2672 내지 2711위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-21-1) 서열번호 2의 염기서열의 제3539 내지 3583위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-23-1) 서열번호 2의 염기서열의 제5061 내지 5103위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-25-1) 서열번호 2의 염기서열의 제6566 내지 6605위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-27-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7931 내지 7976위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열, 또는
(p1-29-1) 서열번호 2의 염기서열의 제8302 내지 8346위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열
인, [12] 또는 [13]에 기재된 프로브.
[15]
마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신인지 티민인지를 판정하는 방법이며,
판정 대상의 상기 항산균의 게놈 DNA 또는 판정 대상의 상기 항산균의 게놈 DNA로부터 유도된 폴리뉴클레오티드를 주형으로 하고, [5] 내지 [9]의 어느 하나에 기재된 프라이머 세트를 사용하여, 핵산 증폭 반응을 행하는 것,
상기 핵산 증폭 반응에 의한 증폭산물을 검출하는 것, 및
상기 증폭산물이 검출된 경우에, 상기 항산균의 게놈 DNA 중의 상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 시토신이라고 판정하고, 상기 증폭산물이 검출되지 않은 경우에, 상기 염기가 티민이라고 판정하는 것,
을 포함하는 방법.
[16]
[15]에 기재된 방법을 포함하는, 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균의 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 판정하는 방법이며,
상기 증폭산물이 검출된 경우에, 상기 항산균이 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 갖는다고 판정하고, 상기 증폭산물이 검출되지 않은 경우에, 상기 항산균이 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 갖지 않는다고 판정하는 것,
을 포함하는 방법.
[17]
마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신인지 티민인지를 판정하는 방법이며,
판정 대상의 상기 항산균의 게놈 DNA 또는 판정 대상의 상기 항산균의 게놈 DNA로부터 유도된 폴리뉴클레오티드와, [11] 내지 [14]의 어느 하나에 기재된 프로브를, 하이브리다이즈 가능한 조건 하에서 인큐베이트하는 것,
상기 게놈 DNA 또는 상기 폴리뉴클레오티드와 상기 프로브와의 하이브리다이제이션을 검출하는 것, 및
상기 하이브리다이제이션이 검출된 경우에, 상기 판정 대상의 항산균의 게놈 DNA 중의 상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 시토신이라고 판정하고, 상기 하이브리다이제이션이 검출되지 않은 경우에, 상기 염기가 티민이라고 판정하는 것,
을 포함하는 방법.
[18]
[17]에 기재된 방법을 포함하는, 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균의 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 판정하는 방법이며,
상기 하이브리다이제이션이 검출된 경우에, 상기 항산균이 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 갖는다고 판정하고, 상기 하이브리다이제이션이 검출되지 않은 경우에, 상기 항산균이 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 갖지 않는다고 판정하는 것,을 포함하는 방법.
[19]
항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신인 것을 판정하는 방법이며,
상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 시토신의 경우에 게놈 DNA의 상기 erm(41) 유전자 이외의 영역에 존재하고, 티민의 경우에 존재하지 않는 지표 염기서열을, 판정 대상의 항산균의 게놈 DNA에 있어서 검출하는 것
을 포함하고,
상기 지표 염기서열이 검출되는 것이, 상기 판정 대상의 항산균의 게놈 DNA 중의 상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 시토신인 것을 나타내는,
방법.
[20]
상기 지표 염기서열이, 서열번호 2의 염기서열에 포함되는 연속한 10염기 이상의 제1 염기서열 또는 상기 제1 염기서열에 상보적인 제2 염기서열인, [19]에 기재된 방법.
[21]
상기 제1 염기서열이, 서열번호 3, 5, 7, 9 또는 11의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열을 적어도 일부에 포함하는, [20]에 기재된 방법.
[22]
[19] 내지 [21]의 어느 하나에 기재된 방법을 포함하는, 항산균의 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 판정하는 방법이며,
상기 지표 염기서열이 검출되는 것이, 상기 항산균이 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 갖는 것을 나타내는,
상기 방법.
[23]
항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신의 경우에 게놈 DNA의 상기 erm(41) 유전자 이외의 영역에 존재하고, 티민의 경우에 존재하지 않는 지표 염기서열을 검출하기 위한 프라이머 세트이며,
상기 지표 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 부분 염기서열 f11의 상보 염기서열과 하이브리다이즈 가능한 염기서열 f12를 3'말단에 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머와,
상기 지표 염기서열에 포함되고, 상기 부분 염기서열 f11의 3'말단보다 3'말단측에 위치하는, 연속한 10염기 이상의 부분 염기서열 r11과 하이브리다이즈 가능한 염기서열 r12를 3'말단에 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머
를 포함하는 프라이머 세트.
[24]
상기 지표 염기서열이, 서열번호 2의 염기서열에 포함되는 연속한 20염기 이상의 제3 염기서열인, [23]에 기재된 프라이머 세트.
[25]
상기 제3 염기서열에 포함되는, 상기 부분 염기서열 f11의 5'말단의 염기로부터, 부분 염기서열 r11의 3'말단의 염기까지의 염기서열이, 서열번호 3, 5, 7, 9 또는 11의 염기서열에 포함되는, 연속한 20염기 이상의 염기서열을 적어도 일부에 포함하는, [24]에 기재된 프라이머 세트.
[26]
상기 부분 염기서열 f11이,
(f11-12-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4624 내지 4668위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(f11-18-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2356 내지 2397위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(f11-20-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2624 내지 2663위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(f11-22-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4044 내지 4083위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(f11-24-1) 서열번호 2의 염기서열의 제6535 내지 6575위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(f11-26-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7478 내지 7520위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열, 또는
(f11-28-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7629 내지 7673위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열
이고,
상기 부분 염기서열 r11이,
(r11-13-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4694 내지 4740위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(r11-19-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2672 내지 2711위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(r11-21-1) 서열번호 2의 염기서열의 제3539 내지 3583위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(r11-23-1) 서열번호 2의 염기서열의 제5061 내지 5103위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(r11-25-1) 서열번호 2의 염기서열의 제6566 내지 6605위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(r11-27-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7931 내지 7976위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열, 또는
(r11-29-1) 서열번호 2의 염기서열의 제8302 내지 8346위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열
인,
[24] 또는 [25]에 기재된 프라이머 세트.
[27]
상기 제1 프라이머 및 상기 제2 프라이머의 한쪽이, 표지 물질과 결합 가능한 태그 또는 표지 물질인 표지부를 더 포함하고, 다른 쪽이, 고상 담체와 결합 가능한 태그인 결합부를 더 포함하는, [23] 내지 [26]의 어느 하나에 기재된 프라이머 세트.
[28]
[27]에 기재된 프라이머 세트와,
상기 결합부와 결합 가능한 부분을 적어도 일부에 포함하는 고상 담체를 포함하는,
항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신의 경우에 게놈 DNA의 상기 erm(41) 유전자 이외의 영역에 존재하고, 티민의 경우에 존재하지 않는 지표 염기서열을 검출하기 위한 키트.
[29]
항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신의 경우에 게놈 DNA의 상기 erm(41) 유전자 이외의 영역에 존재하고, 티민의 경우에 존재하지 않는 지표 염기서열을 검출하기 위한 프로브이며,
상기 지표 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 부분 염기서열 p1과 하이브리다이즈 가능한 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로브.
[30]
상기 지표 염기서열이, 서열번호 2의 염기서열에 포함되는 연속한 10염기 이상의 제1 염기서열 또는 상기 제1 염기서열에 상보적인 제2 염기서열인, [29]에 기재된 프로브.
[31]
상기 부분 염기서열 p1이, 서열번호 3, 5, 7, 9 또는 11의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열을 적어도 일부에 포함하는, [30]에 기재된 프로브.
[32]
상기 부분 염기서열 p1이,
(p1-12-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4624 내지 4668위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-18-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2356 내지 2397위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-20-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2624 내지 2663위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-22-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4044 내지 4083위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-24-1) 서열번호 2의 염기서열의 제6535 내지 6575위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-26-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7478 내지 7520위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-28-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7629 내지 7673위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-13-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4694 내지 4740위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-19-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2672 내지 2711위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-21-1) 서열번호 2의 염기서열의 제3539 내지 3583위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-23-1) 서열번호 2의 염기서열의 제5061 내지 5103위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-25-1) 서열번호 2의 염기서열의 제6566 내지 6605위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
(p1-27-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7931 내지 7976위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열, 또는
(p1-29-1) 서열번호 2의 염기서열의 제8302 내지 8346위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열
인, [30] 또는 [31]에 기재된 프로브.
[33]
항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신인 것을 판정하는 방법이며,
판정 대상의 상기 항산균의 게놈 DNA 또는 판정 대상의 상기 항산균의 게놈 DNA로부터 유도된 폴리뉴클레오티드를 주형으로 하고, [23] 내지 [27]의 어느 하나에 기재된 프라이머 세트를 사용하여, 핵산 증폭 반응을 행하는 것,
상기 핵산 증폭 반응에 의한 증폭산물을 검출하는 것, 및
상기 증폭산물이 검출된 경우에, 상기 항산균의 게놈 DNA 중의 상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 시토신이라고 판정하는 것,
을 포함하는 방법.
[34]
[33]에 기재된 방법을 포함하는, 항산균의 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 판정하는 방법이며,
상기 증폭산물이 검출된 경우에, 상기 항산균이 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 갖는다고 판정하는 것,
을 포함하는 방법.
[35]
항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신인 것을 판정하는 방법이며,
판정 대상의 상기 항산균의 게놈 DNA 또는 판정 대상의 상기 항산균의 게놈 DNA로부터 유도된 폴리뉴클레오티드와, [29] 내지 [32]의 어느 하나에 기재된 프로브를, 하이브리다이즈 가능한 조건 하에서 인큐베이트하는 것,
상기 게놈 DNA 또는 상기 폴리뉴클레오티드와 상기 프로브와의 하이브리다이제이션을 검출하는 것, 및
상기 하이브리다이제이션이 검출된 경우에, 상기 판정 대상의 항산균의 게놈 DNA 중의 상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 시토신이라고 판정하는 것,
을 포함하는 방법.
[36]
[35]에 기재된 방법을 포함하는, 항산균의 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 판정하는 방법이며,
상기 하이브리다이제이션이 검출된 경우에, 상기 항산균이 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 갖는다고 판정하는 것,
을 포함하는 방법.
[37]
항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신의 경우에 게놈 DNA의 상기 erm(41) 유전자 이외의 영역에 존재하고, 티민의 경우에 존재하지 않는 지표 염기서열을 검출하기 위한, [5] 내지 [8]의 어느 하나에 기재된 프라이머 세트, [10]에 기재된 키트, 또는 [11] 내지 [14]의 어느 하나에 기재된 프로브의 사용.
[38]
항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신인지 티민인지를 판정하기 위한, [5] 내지 [8]의 어느 하나에 기재된 프라이머 세트, [10]에 기재된 키트, 또는 [11] 내지 [14]의 어느 하나에 기재된 프로브의 사용.
[39]
항산균의 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 판정하기 위한, [5] 내지 [8]의 어느 하나에 기재된 프라이머 세트, [10]에 기재된 키트, 또는 [11] 내지 [14]의 어느 하나에 기재된 프로브의 사용.
[40]
항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신인 것을 판정하기 위한, [5] 내지 [8]의 어느 하나에 기재된 프라이머 세트, [10]에 기재된 키트, 또는 [11] 내지 [14]의 어느 하나에 기재된 프로브의 사용.
본 명세서는 본원의 우선권 기초가 되는 일본특허 출원번호 2020-066277호의 개시 내용을 포함한다.
본 발명의 1이상의 실시 형태에 따르면, 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의 제28위 염기가 시토신인지 티민인지를 용이하게 판별할 수 있다. 또한, 본 발명의 1 이상의 실시 형태에 따르면, 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의 제28위 염기가 시토신인 것을 용이하게 판별할 수 있다.
도 1은 핵산 검출 디바이스(10)의 모식도를 나타낸다. 1: 고상 담체, 2: 콘쥬게이트 패드(표지 물질 유지부), 3: 샘플 패드(시료 수용부), 4: 흡수 패드, 5: 기재, 6: 태그 포착 수단을 포함하는 부분.
도 2는 실시예 2에 있어서, 다른 항산균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 2에 나타내는 지표 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 사용한 PCR의 증폭산물을, 핵산 크로마토그래피에 의해 검출한 결과를 나타낸다.
도 3은 실시예 2에 있어서, 마이코박테로이데스 압세수스 ATCC19977(T28주) 및 마이코박테로이데스 압세수스 LRC18036(C28주)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 2에 나타내는 지표 염기서열의 다른 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 제2 내지 7의 프라이머 세트를 사용한 PCR의 증폭산물을, 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 검출한 결과를 나타낸다. 도 3 중, A는 제2 프라이머 세트, B는 제3 프라이머 세트, C는 제4 프라이머 세트, D는 제5 프라이머 세트, E는 제6 프라이머 세트, F는 제7 프라이머 세트를 사용한 PCR의 증폭산물을, 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 검출한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
<용어>
본 발명에 있어서 폴리뉴클레오티드 또는 핵산이라고 하는 용어는, DNA 또는 RNA를 가리키고, 전형적으로는 DNA이다. 폴리뉴클레오티드 또는 핵산이라고 하는 용어는, 염기수는 특별히 한정하는 것은 아니고 올리고뉴클레오티드도 포함한다. 본 발명에 있어서, 프라이머 또는 프로브에 포함되는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은, 전형적으로는, 천연의 뉴클레오티드 중합체이다. 천연의 뉴클레오티드란, 천연의 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 우라실의 염기 및, 디옥시리보스 또는 리보오스의 당부 및, 인산기로 구성되는 뉴클레오티드이며, 각 부분이 인공적인 수식을 받지 않고 있는 뉴클레오티드이다. 천연의 뉴클레오티드는 통상적으로는D형 뉴클레오티드이다. D형 뉴클레오티드란, 당 부분이 D형의 디옥시리보스 혹은 리보오스를 포함하는 뉴클레오티드를 나타낸다.
염기서열 X가 염기서열 Y에 「하이브리다이즈 가능」하다는 것은, 염기서열 X를 포함하는 폴리뉴클레오티드(특히 DNA 단편)가, 스트린젠트한 조건에서, 염기서열 Y를 포함하는 폴리뉴클레오티드(특히 DNA 단편)에 하이브리다이즈하고, 염기서열 Y를 갖고 있지 않은 폴리뉴클레오티드에는 하이브리다이즈하지 않는 것을 의미한다. 즉 하이브리다이즈한다는 것은, 특이적으로 하이브리다이즈하는 것을 가리킨다. 여기서, 「스트린젠트한 조건」이란, 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 의미하고, 예를 들어 Green and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed(2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press를 참조하여 적절히 결정할 수 있다. 구체적으로는, 서던 하이브리다이제이션 시의 온도나 용액에 포함되는 염 농도 및 서던 하이브리다이제이션의 세정 공정 시의 온도나 용액에 포함되는 염 농도에 의해 스트린젠트한 조건을 설정할 수 있다. 보다 상세하게는, 스트린젠트한 조건에서서는, 예를 들어 하이브리다이제이션 공정에서는, 나트륨 농도가 25 내지 500mM, 바람직하게는 25 내지 300mM이며, 온도가 40 내지 68℃, 바람직하게는 40 내지 65℃이다. 보다 구체적으로는, 하이브리다이제이션은, 1 내지 7×SSC(1×SSC는, 150mM 염화나트륨, 15mM 시트르산일나트륨, pH7.2), 0.02 내지 3% SDS, 온도 40℃ 내지 60℃에서 행할 수 있다. 또한, 하이브리다이제이션 후에 세정 공정을 행해도 되고, 세정 공정은, 예를 들어 0.1 내지 2×SSC, 0.1 내지 0.3% SDS, 온도 50 내지 65℃에서 행할 수 있다.
스트린젠트한 조건의 구체예로서는, 예를 들어 염기서열 X를 포함하는 DNA 단편과 염기서열 Y를 포함하는 DNA 단편과의 하이브리다이제이션을, 5×SSC, 0.1%(w/v)N-라우로일사르코신, 0.02%(w/v) SDS를 포함하는 하이브리다이제이션 용액 중에서 밤새(8 내지 16시간 정도)행하고, 계속해서, 세정을, 0.1 내지 0.5×SSC, 0.1%(w/v) SDS, 바람직하게는 0.1×SSC, 0.1%(w/v) SDS,를 포함하는 세정 용액을 사용해서 15분간, 2회 행하는 조건을 들 수 있다. 하이브리다이제이션 및 세정을 행하는 온도는 바람직하게는 50℃ 이상, 보다 바람직하게는 65℃ 이상인, 하이브리다이제이션 용액에는, 바람직하게는 0.5 내지 2(w/v)의 핵산 하이브리다이제이션용 블로킹 시약을 더 포함할 수 있다. 이 조건에서의 하이브리다이제이션 및 세정 후에, 염기서열 X를 포함하는 DNA프로브와 염기서열 Y를 포함하는 DNA 단편이 하이브리다이즈하고 있는 경우에, 염기서열 X가 염기서열 Y에 「하이브리다이즈 가능」하다고 할 수 있다.
염기서열 X가 염기서열 Y에 하이브리다이즈 가능한 경우, 염기서열 X를 포함하는 폴리뉴클레오티드(특히 DNA)와 염기서열 Y를 포함하는 폴리뉴클레오티드(특히 DNA)가, 핵산 증폭 반응의 어닐링 조건에 있어서 하이브리다이즈해서 안정한 이중쇄를 형성하기에 충분한 수소 결합을 형성할 수 있는 조합이면 되고, 서로 완전한 상보 염기서열일 필요는 없다. 예를 들어, 염기서열 X와 염기서열 Y 사이에, 10염기 중에 1미스매치, 20염기 중에 1미스매치 또는 30염기 중에 1 미스매치 등, 몇 가지의 미스매치가 존재하고 있어도 된다.
염기서열 X가 염기서열 Y에 하이브리다이즈 가능한 경우, 혹은 「염기서열 X와 하이브리다이즈 가능한 염기서열 Y」라고 표현하는 경우, 바람직하게는 이하의 (A) 내지 (C)의 1 이상의 관계를 충족한다.
(A) 염기서열 X의 상보 염기서열과 염기서열 Y가 동일하다. 또한, 염기서열 X의 상보 염기서열과 염기서열 Y의 한쪽이 DNA의 염기서열이고, 다른 쪽이 RNA의 염기서열인 경우, 한쪽에 있어서의 티민과 다른 쪽에 있어서의 우라실과는 동일한 염기라고 간주한다.
(B) 염기서열 Y가, 염기서열 X의 상보 염기서열에 있어서 1 혹은 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 및/또는 삽입된 염기서열이다.
(C) 염기서열 Y가, 염기서열 X의 상보 염기서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 염기서열이다.
상기 (B)에 있어서 「1 혹은 수개」란 바람직하게는 1 내지 5개, 보다 바람직하게는 1 내지 4개, 보다 바람직하게는 1 내지 3개, 특히 바람직하게는 1개 또는 2개를 가리키고, 가장 바람직하게는 1개이다.
상기 (C)에 있어서, 동일성의 값은, 복수의 염기서열간의 동일성을 연산하는 소프트웨어(예를 들어, FASTA, DANASYS 및 BLAST)를 사용해서 디폴트의 설정으로 산출한 값을 나타낸다. 염기서열의 동일성의 값은, 일치도가 최대가 되도록 한 쌍의 염기서열을 얼라인먼트했을 때에 일치하는 염기의 수를 산출하고, 당해 일치하는 염기의 수, 비교한 염기서열의 전체 염기수에 대한 비율로서 산출된다. 여기서, 갭이 있는 경우, 상기의 전체 염기수는, 1개의 갭을 1개의 염기로서 헤아리는 염기수이다. 동일성의 결정 방법의 상세에 대해서는, 예를 들어 Altschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977 및 Altschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990을 참조하고자 한다.
상기 (C)에 있어서, 동일성은, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 96% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상의 동일성이다.
상기 (A) 내지 (C) 중 상기 (A)가 특히 바람직하다.
본 발명에 있어서 프라이머 및/또는 프로브에 포함되는 폴리뉴클레오티드의 제조 방법은 특별히 한정되지 않고 폴리뉴클레오티드 합성 장치를 이용해서 제조해도 되고, 수탁 합성 서비스를 이용해서 제조해도 된다.
<핵산 증폭 반응>
본 발명의 1 이상의 실시 형태에 따른 프라이머 세트를 사용해서 핵산 증폭 반응을 행하는 경우, 내열성 폴리메라아제를 사용하는 핵산 증폭 반응이어도 되고, 쇄 치환형 폴리메라아제를 사용하는 핵산 증폭 반응이어도 된다. 폴리메라아제는 핵산 폴리메라아제를 가리키고, DNA 폴리메라아제 또는 RNA 폴리메라아제이며, 바람직하게는 DNA 폴리메라아제이다.
내열성 폴리메라아제를 사용하는 핵산 증폭 반응으로서는 폴리메라아제 연쇄 반응법(PCR법)을 들 수 있다. 내열성 폴리메라아제로서는, 시판 중인 DNA 폴리메라아제를 이용하는 것이 가능하고, 예를 들어 TaKaRa Ex Taq(등록상표) 등을 적합하게 이용할 수 있다. 또한, 온도, 시간, 완충액의 조성 등은, 사용하는 DNA 폴리메라아제나, 각 프라이머의 농도 등에 따라, 적절히 선택할 수 있다. PCR법에서의 변성, 어닐링, 신장의 각 공정의 시간, 온도, 완충액 조성, 기질 뉴클레오티드 농도, 사이클수 등의 각 조건은 선택한 DNA 폴리메라아제, 프라이머 서열, 표적 핵산의 염기수, 주형 농도 등의 요소를 고려해서 적절히 설정할 수 있다.
쇄 치환형 폴리메라아제는, 표적 핵산을 포함하는 이중쇄 핵산의 수소 결합을 스스로 해리하면서, 새로운 DNA쇄를 합성하는 효소이며, 예를 들어 φ29 DNA 폴리메라아제, Bst DNA 폴리메라아제, DNA 폴리메라아제 I의 클레뉴·프레그먼트, Vent DNA 폴리메라아제, Vent(Exo-)DNA 폴리메라아제, DeepVent DNA 폴리메라아제, DeepVent(Exo-)DNA 폴리메라아제, 96-7 DNA 폴리메라아제, Aac DNA 폴리메라아제 및 Csa DNA 폴리메라아제 등을 들 수 있다. 쇄 치환형 폴리메라아제는, 이중쇄의 해리를 필요로 하지 않기 때문에, 등온에서의 핵산 증폭이 가능하다.
쇄 치환형 폴리메라아제를 사용하는 핵산 증폭 반응으로서는, 등온핵산 증폭법이 바람직하고, RPA법(Recombinase Polymerase Amplification), TRIAmp법(Tandem Repeat-mediated Isothermal Amplification), LAMP법(Loop-mediated isothermal amplification, HDA법(Helicase-dependent amplification) 등의 방법을 예시할 수 있다.
쇄 치환형 폴리메라아제를 사용하는 등온핵산 증폭법은, 주형 핵산, 프라이머, 쇄 치환형 폴리메라아제 및 기질 뉴클레오티드를 공존시키고, 증폭 프라이머가 주형 핵산과 안정한 염기쌍 결합을 형성할 수 있고, 또한 효소 활성을 발휘할 수 있는 온도에서 인큐베이트 함으로써 진행한다. 등온핵산 증폭법에 의한 핵산 증폭 반응의 온도, 완충액 조성, 기질 뉴클레오티드 농도, 반응 시간 등의 각 조건은 선택한 쇄 치환형 폴리메라아제, 프라이머 서열, 표적 핵산의 염기수, 주형 핵산 농도 등의 요소를 고려해서 적절히 설정할 수 있다.
「표적 핵산」이란, 지표 염기서열 중 검출 및/또는 증폭하려고 하는 염기서열을 포함하는 핵산, 혹은 검출 및/또는 증폭하려고 하는 염기서열의 상보 염기서열을 포함하는 핵산을 가리킨다. 표적 핵산은 그 상보쇄와 함께 이중쇄로서 존재하고 있어도 된다. 이중쇄로서 존재하는 표적 핵산의 한쪽의 쇄를 가리켜서 「표적 핵산」이라고 칭해도 된다. 검출하려고 하는 핵산과, 그 상보쇄의 어느 쪽을 「표적 핵산」이라고 칭해도 된다. 즉, 본 발명에 있어서 「표적 핵산을 검출한다」 또는 「표적 핵산을 증폭한다」란, 표적 핵산 자체를 목적으로 해서 표적 핵산을 검출 또는 증폭하는 것과, 표적 핵산의 상보쇄 또는 표적 핵산과 상보쇄의 이중쇄 핵산의 검출 또는 증폭을 목적으로 하고, 표적 핵산, 표적 핵산의 상보쇄, 또는 표적 핵산과 상보쇄의 이중쇄 핵산을 검출 또는 증폭하는 것의 양쪽을 포함한다.
핵산 증폭 반응을 행하는 경우에 주형이 되는 핵산은, 지표 염기서열 및/또는 그 상보 염기서열을 일부에 포함하는 한 DNA여도 되고, RNA여도 되지만, 바람직하게는 DNA이다. 통상적으로는, 핵산 증폭 반응의 주형이 되는 핵산은, 표적 핵산을 적어도 일부에 포함하는 폴리뉴클레오티드쇄와, 해당 폴리뉴클레오티드쇄의 상보쇄의, 이중쇄 DNA이다.
주형이 되는 핵산은, 천연의 것이어도 되고, 인공적으로 합성된 것이어도 된다. 예를 들어, 생체 시료로부터 추출된 천연의 핵산이어도 되고, PCR 등의 핵산 증폭 반응에 의해 증폭된 것이나, 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA 등이어도 된다.
<항산균>
본 명세서에 있어서 판별의 대상이 되는 「항산균」은, 항상성, 비운동성의 그람 양성 간균을 의미한다. 본 명세서에 있어서 「항산균」은, 「비결핵성 항산균(Nontuberculous mycobacteria; NTM)」, 그 중에서도 「마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스(Mycobacteroides abscessus complex)에 속하는 항산균」을 포함할 수 있다. 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에는 이미 설명한 바와 같이 3아종이 포함된다. 본 발명의 1 이상의 실시 형태는, 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 있어서의 erm(41) 유전자의 제28위 염기의 변이를 검출하기 위해서 사용하는 것이 바람직하고, 마이코박테로이데스·압세수스·아종압세수스및 마이코박테로이데스·압세수스·아종 볼레티에 있어서의 erm(41) 유전자의 제28위 염기의 변이를 검출하기 위해서 사용하는 것이 특히 바람직하다. 또한, 마이코박테로이데스속은 마이코박테리움속으로 기재되는 경우가 있다.
<erm(41) 유전자>
erm(41) 유전자는, 에리트로마이신 리보솜 메틸트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자이다. erm(41) 유전자는, 클래리스로마이신 등의 마크롤라이드계 항생 물질의 존재 하에서 에리트로마이신 리보솜 메틸트랜스퍼라아제를 발현하고, 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 내성을 유도한다.
마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스의 표준주의 게놈 DNA에 포함되는 erm(41) 유전자는, 서열번호 1의 염기서열을 갖는다. 서열번호 1의 염기서열에서는, 제28위 염기가 티민이다. erm(41) 유전자가 서열번호 1의 염기서열을 갖는 항산균은, 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 내성을 유도할 수 있는 내성균이다.
한편, 약 10%의 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에서는, erm(41) 유전자의 염기서열이, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 티민부터 시토신에 변이하고 있다. 이 유전자형의 항산균은, 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 내성을 유도할 수 없어, 마크롤라이드계 항생 물질 감수성균이다.
또한 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균의 일부는, erm(41) 유전자의 서열번호 1에 나타내는 염기서열의 전체 길이를 갖고 있지 않고 일부분을 결손하고 있는, erm(41) 유전자 부분 결손주이다. erm(41) 유전자 부분 결손주이여도, 서열번호 1의 염기서열의 제28위의 염기보다 상류의 염기서열은 갖고 있어, 상기 염기가 티민인 주와, 시토신인 주가 존재한다.
이하의 설명에서는, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 티민인 형을, 「정상형」, 「erm(41)T28」 혹은 「T28」로 나타낸다. 그리고, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 티민인 항산균주를 「T28주」로 나타낸다. 또한, erm(41)T28 유전자의 염기서열은, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 티민인 것을 가리키고, 다른 위치의 염기서열은 서열번호 1의 염기서열과 동일해도 되고, 서열번호 1의 염기서열에 있어서 1 혹은 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 및/또는 삽입된 것이어도 되고, 상기와 같이 erm(41) 유전자에 28위보다 하류에 위치하는 부분 서열이 결손하고 있어도 된다.
이하의 설명에서는 또한, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신인 형을, 「변이형」, 「erm(41)C28」 혹은 「C28」로 나타낸다. 그리고, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신인 항산균주를 「C28주」라고 나타낸다. 또한, erm(41)C28 유전자의 염기서열은, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신인 것을 가리키고, 다른 위치의 염기서열은 서열번호 1의 염기서열과 동일해도 되고, 서열번호 1의 염기서열에 있어서 1 혹은 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 및/또는 삽입된 것이어도 되고, 상기와 같이 erm(41) 유전자에 28위보다 하류에 위치하는 부분 서열이 결손하고 있어도 된다.
상기의 2 단락에 있어서, 「1 혹은 수개」와는 바람직하게는 1 내지 5개, 보다 바람직하게는 1 내지 4개, 보다 바람직하게는 1 내지 3개, 특히 바람직하게는 1개 또는 2개를 가리키고, 가장 바람직하게는 1개이다.
<항산균의 erm(41) 유전자형의 판정 방법 1>
본 발명의 제1 실시 형태는,
마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신인지 티민인지를 판정하는 방법이며,
상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 시토신의 경우에 게놈 DNA의 상기 erm(41) 유전자 이외의 영역에 존재하고, 티민의 경우에 존재하지 않는 지표 염기서열을, 판정 대상의 상기 항산균의 게놈 DNA에 있어서 검출하는 것
을 포함하고,
상기 지표 염기서열이 검출되는 것이, 상기 항산균의 게놈 DNA 중의 상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 시토신인 것을 나타내고,
상기 지표 염기서열이 검출되지 않는 것이, 상기 항산균의 게놈 DNA 중의 상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 티민인 것을 나타내는,
방법에 관한 것이다.
상기 제1 실시 형태에 따른 방법에 의하면, 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균이 C28주인지 28주인지를, erm(41) 유전자에 있어서의 1염기 변이를 검출하는 것이 아니고, 상기 항산균이 C28주인 경우에 특이적으로 게놈 DNA의 상기 erm(41) 유전자 이외의 영역에 존재하는 지표 염기서열을 검출함으로써 판정하는 것이 가능하다. 상기 제1 실시 형태에 따른 방법으로는, 1염기의 변이를 직접 검출할 필요가 없고, 게놈 DNA 중의 지표 염기서열의 존재 또는 부존재를 검출할 수 있으면 C28주인지 T28주인지를 판정할 수 있기 위해서 간편하게 실시가 가능하다.
상기 제1 실시 형태에 따른 방법은 또한, 항산균, 특히 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균이, 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성 인지의 여부를 판별하기 위해서 사용할 수 있다. 항산균의 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 판정하는 방법은, 상기 지표 염기서열을, 판정 대상의 상기 항산균의 게놈 DNA에 있어서 검출하는 것을 포함하고, 상기 지표 염기서열이 검출되는 것이, 상기 항산균이 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 갖는 것을 나타내고, 상기 지표 염기서열이 검출되지 않는 것이, 상기 항산균이 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 갖지 않는 것을 나타낸다.
상기 지표 서열은 또한, 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신인 것을 판정하는 지표로서 사용할 수 있다.
본 발명자들은 놀랍게도, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 영역이 C28주의 게놈 DNA에 특이적으로 존재하고, T28주의 게놈 DNA에는 존재하지 않는 것을 발견했다.
서열번호 2의 염기서열은, 5'말단으로부터 3'말단에 걸쳐서, 서열번호 3의 염기서열, 서열번호 4의 염기서열, 서열번호 5의 염기서열, 서열번호 6의 염기서열, 서열번호 7의 염기서열, 서열번호 8의 염기서열, 서열번호 9의 염기서열, 서열번호 10의 염기서열 및 서열번호 11의 염기서열이, 이 순서로 연결한 염기서열이다. 서열번호 3 내지 11의 각염기서열의, 5'말단 및 3'말단의 염기, 서열번호 2의 염기서열 상에서의 이하의 표에 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00001
서열번호 2의 염기서열 중, 서열번호 3의 염기서열, 서열번호 5의 염기서열, 서열번호 7의 염기서열, 서열번호 9의 염기서열 및 서열번호 11의 염기서열이 특히, T28주의 게놈 DNA 중에 상동성이 비교적 높은 염기서열이 존재하지 않는 염기서열이기 때문에, C28주의 판정 지표로서 특히 바람직하다.
상기 지표 염기서열로서는, 항산균C28주의 게놈 DNA에 특이적으로 존재하는 염기서열이면 되고, 구체적으로는, 서열번호 2의 염기서열에 포함되는 연속한 10염기 이상의 제1 염기서열 또는 상기 제1 염기서열에 상보적인 제2 염기서열이 바람직하다. 상기 제1 염기서열은, 보다 바람직하게는, 서열번호 2의 염기서열에 포함되는 연속한 20염기 이상, 50염기 이상, 100염기 이상, 500염기 이상, 또는 1000염기 이상의 염기서열이다. 상기 제1 염기서열의 염기수의 상한은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 3000염기 이하, 또는 1500염기 이하일 수 있다.
상기 제1 염기서열은, 보다 바람직하게는, 서열번호 3, 5, 7, 9 또는 11의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 바람직하게는 20염기 이상, 50염기 이상, 100염기 이상, 500염기 이상, 또는 1000염기 이상의 염기서열을 적어도 일부에 포함한다. 이러한 제1 염기서열 또는 그 상보 염기서열인 제2 염기서열은, T28주의 게놈 DNA 중에 상동성이 비교적 높은 염기서열이 존재하지 않는 염기서열이기 때문에, 그 존재에 기초하여 C28주인 것을 고정밀도로 판정할 수 있다.
상기 제1 실시 형태에 따른 방법에 있어서, 상기 지표 염기서열을 검출하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 후술하는 프로브 또는 프라이머를 사용하는 방법에 의해 실시할 수 있다.
상기 제1 실시 형태에 따른 방법에 있어서, 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균의 게놈 DNA에 있어서 상기 지표 염기서열이 검출된 경우, 상기 항산균은 C28주라고 판정할 수 있고, 상기 항산균의 게놈 DNA에 있어서 상기 지표 염기서열이 검출되지 않은 경우, 상기 항산균은 T28주라고 판정할 수 있다.
<C28주에 특이적인 지표 염기서열을 검출하기 위한 프로브>
본 발명의 제2 실시 형태는,
마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신의 경우에 게놈 DNA의 상기 erm(41) 유전자 이외의 영역에 존재하고, 티민의 경우에 존재하지 않는 지표 염기서열을 검출하기 위한 프로브이며,
상기 지표 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 부분 염기서열 p1과 하이브리다이즈 가능한 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로브
에 관한 것이다.
상기 제2 실시 형태에 있어서의 상기 지표 염기서열은, 제1 실시 형태에 관해서 지표 염기서열과 마찬가지 범위에서 선택할 수 있다.
상기 부분 염기서열 p1은, 상기 지표 염기서열 중, 제2 실시 형태에 따른 프로브와 하이브리다이즈하는 영역이다.
상기 부분 염기서열 p1은, 상기 지표 염기서열 중 연속된 부분 염기서열이고, 특이성을 유지하기 위해서 필요한 염기수를 갖는 것이면 되고, 그 염기수는 10염기 이상이면 되지만, 보다 바람직하게는 15염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상이다. 상기 부분 염기서열 p1의 염기수의 상한은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 400염기 이하, 300염기 이하, 200염기 이하, 100염기 이하, 또는 50염기 이하의 상기 지표 염기서열의 부분 염기서열일 수 있다.
상기 부분 염기서열 p1은, 보다 바람직하게는, 서열번호 3, 5, 7, 9 또는 11의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 15염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상, 예를 들어 400염기 이하, 300염기 이하, 200염기 이하, 100염기 이하, 또는 50염기 이하의 염기서열을 적어도 일부에 포함한다.
상기 부분 염기서열 p1은,
바람직하게는
(p1-12-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4624 내지 4668위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-18-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2356 내지 2397위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-20-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2624 내지 2663위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-22-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4044 내지 4083위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-24-1) 서열번호 2의 염기서열의 제6535 내지 6575위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-26-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7478 내지 7520위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-28-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7629 내지 7673위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-13-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4694 내지 4740위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-19-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2672 내지 2711위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-21-1) 서열번호 2의 염기서열의 제3539 내지 3583위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-23-1) 서열번호 2의 염기서열의 제5061 내지 5103위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-25-1) 서열번호 2의 염기서열의 제6566 내지 6605위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-27-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7931 내지 7976위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열, 또는
(p1-29-1) 서열번호 2의 염기서열의 제8302 내지 8346위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열
이고,
보다 바람직하게는
(p1-12-2) 서열번호 2의 염기서열의 제4629 내지 4663위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-18-2) 서열번호 2의 염기서열의 제2361 내지 2392위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-20-2) 서열번호 2의 염기서열의 제2629 내지 2658위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-22-2) 서열번호 2의 염기서열의 제4049 내지 4078위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-24-2) 서열번호 2의 염기서열의 제6540 내지 6570위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-26-2) 서열번호 2의 염기서열의 제7483 내지 7515위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-28-2) 서열번호 2의 염기서열의 제7634 내지 7668위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-13-2) 서열번호 2의 염기서열의 제4699 내지 4735위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-19-2) 서열번호 2의 염기서열의 제2677 내지 2706위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-21-2) 서열번호 2의 염기서열의 제3544 내지 3578위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-23-2) 서열번호 2의 염기서열의 제5066 내지 5098위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-25-2) 서열번호 2의 염기서열의 제6571 내지 6600위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(p1-27-2) 서열번호 2의 염기서열의 제7936 내지 7971위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열, 또는
(p1-29-2) 서열번호 2의 염기서열의 제8307 내지 8341위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열
이다.
본 발명의 상기 제2 실시 형태에 따른 프로브는, 상기 지표 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 중 상기 부분 염기서열 p1의 영역에, 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈 할 수 있다. 이 때문에, 본 발명의 상기 제2 실시 형태에 따른 프로브는, 핵산 하이브리다이제이션법(예를 들어 서던 하이브리다이제이션)이나, 리얼타임 PCR법(예를 들어(예를 들어 TaqManTM법, 분자 비콘(Molecular Beacon)법) 등에 사용할 수 있다.
상기 제2 실시 형태에 따른 프로브를 구성하는 폴리뉴클레오티드는, 상기 부분 염기서열 p1의 상보 염기서열과 동일하거나 또는 상동의 염기서열을 포함한다. 여기서 「상동」이란, 상기 (B) 또는 (C)의 조건을 충족하는 것을 가리키고, 구체적으로는 이하의 (B1) 또는 (C1)의 조건을 충족한다.
(B1) 상기 제2 실시 형태에 따른 프로브를 구성하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열이, 상기 부분 염기서열 p1의 상보 염기서열에 있어서 1 혹은 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 및/또는 삽입된 염기서열이다.
(C1) 상기 제2 실시 형태에 따른 프로브를 구성하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열이, 상기 부분 염기서열 p1의 상보 염기서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 염기서열이다.
상기 (B1)에 있어서의 「1 혹은 수개」, 상기 (C1)에 있어서의 「동일성」의 바람직한 범위에 대해서는, 상기 (B) 및 (C)에 관해서 이미 설명한 바와 같다.
상기 제2 실시 형태에 따른 프로브를 구성하는 폴리뉴클레오티드는, 상기 부분 염기서열 p1의 상보 염기서열과 동일하거나 또는 상동의 염기서열(이하 「염기서열 q1」로 한다)만을 포함할 필요는 없고, 염기서열 q1의 5'말단측 및 3'말단측의 한쪽 또는 양쪽에 다른 염기서열이 부가되어 있어도 된다. 염기서열 q1은, 상기 부분 염기서열 p1의 상보 염기서열과 동일한 것이 특히 바람직하다.
상기 제2 실시 형태에 따른 프로브를 구성하는 폴리뉴클레오티드의 전체의 염기수는 특별히 한정되지 않지만, 8염기 이상, 10염기 이상, 보다 바람직하게는 15염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상으로 할 수 있고, 바람직하게는 400염기 이하, 300염기 이하 또는 200염기 이하로 할 수 있다. 당해 프로브를 리얼타임 PCR법에 사용하는 경우에는, 폴리뉴클레오티드는 50염기 이하가 바람직하고, 40염기 이하 또는 35염기 이하가 보다 바람직하다.
상기 제2 실시 형태에 따른 프로브를 구성하는 폴리뉴클레오티드의 구체예로서는,
서열번호 12, 13, 18 내지 29의 어느 것의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 15염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 특히 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드
를 예시할 수 있다.
상기 제2 실시 형태에 따른 프로브는, 상기 폴리뉴클레오티드에, 표지 물질과 결합 가능한 태그 또는 표지 물질인 표지부가 또한 부가된 것이어도 된다. 이러한 표지부의 구체예는 프라이머에 관해서 후술하는 바와 같다. 표지부를 포함하는 프로브와, 상기 지표 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 하이브리다이즈 해서 생성하는 복합체는, 표지부를 지표에 검출하는 것이 용이하다.
상기 제2 실시 형태에 따른 프로브는 또한, 상기 폴리뉴클레오티드에, 고상 담체와 결합 가능한 태그인 결합부가 또한 부가된 것이어도 된다. 이러한 결합부의 구체예는 프라이머에 관해서 후술하는 바와 같다. 결합부를 포함하는 상기 프로브와, 상기 지표 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 하이브리다이즈 해서 생성하는 복합체는, 결합부를 개재해서 고상 담체에 고정하는 것이 가능하고, 복합체의 검출 및 단리가 용이하다.
결합부를 포함하는 상기 프로브는, 결합부를 개재해서 미리 고상 담체에 고정한 상태에서 제공 해도 된다. 고상 담체에 고정한 상기 프로브는, 상기 지표 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포착할 수 있다.
상기 제2 실시 형태에 따른 프로브를, 리얼타임 PCR법에 사용하는 경우, 증폭산물의 리얼타임 검출에 있어서 통상 사용되고 있는 표지 물질로 표지화하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 프로브로서 사용하는 폴리뉴클레오티드의 5'말단에 리포터 형광 물질이 연결되어, 3'말단에 ??처 색소를 연결된다. 리포터 형광 물질로서는, 카르복시 플루오레세인(FAM), 헥사클로로 플루오레세인(HEX), 테트라클로로 플루오레세인(TET) 등을 예시할 수 있다. ??처 색소로서, 카르복시테트라메틸로다민(TAMRA) 등의 형광 물질, 블랙 홀 ??처(Black Hole Quencher) 색소(BHQ), 4-((4-(디메틸아미노)페닐)아조)벤조산(DABCYL) 등의 비형광 물질 등을 예시할 수 있다.
상기 제2 실시 형태에 따른 프로브는, 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신인지 티민인지를 판정하는 방법에 사용할 수 있다.
이 방법은, 구체적으로는,
판정 대상의 항산균의 게놈 DNA 또는 판정 대상의 항산균의 게놈 DNA로부터 유도된 폴리뉴클레오티드와, 상기 프로브를, 하이브리다이즈 가능한 조건 하에서 인큐베이트하는 것,
상기 게놈 DNA 또는 상기 폴리뉴클레오티드와 상기 프로브와의 하이브리다이제이션을 검출하는 것, 및
상기 하이브리다이제이션이 검출된 경우에, 상기 판정 대상의 항산균의 게놈 DNA 중의 상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 시토신이라고 판정하고, 상기 하이브리다이제이션이 검출되지 않은 경우에, 상기 염기가 티민이라고 판정하는 것,
을 포함하는 방법일 수 있다.
상기 제2 실시 형태에 따른 프로브는 또한, 항산균, 특히 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균의 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 판정하는 방법에 사용할 수 있다. 이 방법은, 구체적으로는,
판정 대상의 항산균의 게놈 DNA 또는 판정 대상의 항산균의 게놈 DNA로부터 유도된 폴리뉴클레오티드와, 상기 프로브를, 하이브리다이즈 가능한 조건 하에서 인큐베이트하는 것,
상기 게놈 DNA 또는 상기 폴리뉴클레오티드와 상기 프로브와의 하이브리다이제이션을 검출하는 것, 및
상기 하이브리다이제이션이 검출된 경우에, 상기 항산균이 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 갖는다고 판정하고, 상기 하이브리다이제이션이 검출되지 않은 경우에, 상기 항산균이 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 갖지 않는다고 판정하는 것,을 포함하는 방법일 수 있다.
상기 제2 실시 형태에 따른 프로브는 또한, 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신인 것을 판정하는 방법에 사용할 수 있다. 이 방법은, 구체적으로는,
판정 대상의 항산균의 게놈 DNA 또는 판정 대상의 항산균의 게놈 DNA로부터 유도된 폴리뉴클레오티드와, 상기 프로브를, 하이브리다이즈 가능한 조건 하에서 인큐베이트하는 것,
상기 게놈 DNA 또는 상기 폴리뉴클레오티드와 상기 프로브와의 하이브리다이제이션을 검출하는 것, 및
상기 하이브리다이제이션이 검출된 경우에, 상기 판정 대상의 항산균의 게놈 DNA 중의 상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 시토신이라고 판정하는 것,
을 포함하는 방법일 수 있다.
여기서 「판정 대상의 항산균의 게놈 DNA로부터 유도된 폴리뉴클레오티드」로서는 상기 게놈 DNA의 일부분의 부분 폴리뉴클레오티드나, 상기 게놈 DNA의 전체 또는 상기 지표 염기서열을 포함하는 부분을 핵산 증폭 반응에 의해 증폭한 증폭산물을 들 수 있다.
상기의 각 양태에 있어서의 「하이브리다이즈 가능한 조건」으로서는, 「스트린젠트한 조건」으로서 기재한 조건과 마찬가지 조건이 바람직하다.
<C28주에 특이적인 지표 염기서열을 검출하기 위한 프라이머 세트>
본 발명의 제3 실시 형태는,
마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신의 경우에 게놈 DNA의 상기 erm(41) 유전자 이외의 영역에 존재하고, 티민의 경우에 존재하지 않는 지표 염기서열을 검출하기 위한 프라이머 세트이며,
상기 지표 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 부분 염기서열 f11의 상보 염기서열이라고 하이브리다이즈 가능한 염기서열 f12를 3'말단에 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머와,
상기 지표 염기서열에 포함되고, 상기 부분 염기서열 f11의 3'말단보다 3'말단측에 위치하는, 연속한 10염기 이상의 부분 염기서열 r11과 하이브리다이즈 가능한 염기서열 r12를 3'말단에 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머
를 포함하는 프라이머 세트
에 관한 것이다.
상기 지표 염기서열로서는, 항산균 C28주의 게놈 DNA에 특이적으로 존재하는 염기서열이면 되고, 구체적으로는, 서열번호 2의 염기서열에 포함되는 연속한 20염기 이상의 제3 염기서열이 바람직하다. 상기 제3 염기서열은, 보다 바람직하게는, 서열번호 2의 염기서열에 포함되는 연속한 40염기 이상, 50염기 이상, 100염기 이상, 500염기 이상, 또는 1000염기 이상의 염기서열이다. 상기 제3 염기서열의 염기수의 상한은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 3000염기 이하, 또는 1500염기 이하일 수 있다.
상기 제3 염기서열에 포함되는, 상기 부분 염기서열 f11의 5'말단의 염기로부터, 부분 염기서열 r11의 3'말단의 염기까지의 염기서열을, 이하의 설명에서는 「표적 서열」이라고 칭한다. 표적 서열 및 그 상보 염기서열이, 본 실시 형태에 따른 프라이머 세트를 사용한 핵산 증폭 반응에 의해 증폭된다. 표적 서열은, 바람직하게는 서열번호 3, 5, 7, 9 또는 11의 염기서열에 포함되는, 연속한 20염기 이상, 바람직하게는 40염기 이상, 50염기 이상, 100염기 이상, 500염기 이상, 또는 1000염기 이상의 염기서열을 적어도 일부에 포함한다. 이 표적 서열은, T28주의 게놈 DNA 중에 상동성이 비교적 높은 염기서열이 존재하지 않는 염기서열이기 때문에, 그 존재에 기초하여 C28주인 것을 고정밀도로 판정할 수 있다.
상기 표적 서열의 길이는 특별히 한정되지 않는다. 검출 정밀도를 높이기 위해서는, 표적 서열이, 상기 지표 염기서열의, 바람직하게는 20염기 이상, 보다 바람직하게는 40염기 이상, 50염기 이상, 100염기 이상, 500염기 이상, 또는 1000염기 이상이 연속한 부분을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 표적 서열의 길이의 상한은 특별히 한정되지 않지만, 통상은 3000염기 이하 또는 1500염기 이하이다.
상기 부분 염기서열 f11은, 표적 서열의 5'말단에 위치한다. 상기 부분 염기서열 r11은, 표적 서열의 3'말단에 위치한다.
상기 부분 염기서열 f11 및 상기 부분 염기서열 r11의 길이는, 각각 10염기 이상이며, 보다 바람직하게는 15염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상일 수 있고, 전형적으로는 40염기 이하, 30염기 이하 또는 27염기 이하일 수 있다.
상기 부분 염기서열 f11은,
바람직하게는,
(f11-12-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4624 내지 4668위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(f11-18-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2356 내지 2397위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(f11-20-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2624 내지 2663위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(f11-22-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4044 내지 4083위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(f11-24-1) 서열번호 2의 염기서열의 제6535 내지 6575위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(f11-26-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7478 내지 7520위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열, 또는
(f11-28-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7629 내지 7673위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열
이고,
보다 바람직하게는,
(f11-12-2) 서열번호 2의 염기서열의 제4629 내지 4661위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(f11-18-2) 서열번호 2의 염기서열의 제2361 내지 2390위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(f11-20-2) 서열번호 2의 염기서열의 제2629 내지 2656위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(f11-22-2) 서열번호 2의 염기서열의 제4049 내지 4076위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(f11-24-2) 서열번호 2의 염기서열의 제6540 내지 6568위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(f11-26-2) 서열번호 2의 염기서열의 제7483 내지 7513위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열, 또는
(f11-28-2) 서열번호 2의 염기서열의 제7634 내지 7666위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열
이고,
특히 바람직하게는,
(f11-12-3) 서열번호 2의 염기서열의 제4629 내지 4658위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(f11-18-3) 서열번호 2의 염기서열의 제2361 내지 2387위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(f11-20-3) 서열번호 2의 염기서열의 제2629 내지 2653위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(f11-22-3) 서열번호 2의 염기서열의 제4049 내지 4073위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(f11-24-3) 서열번호 2의 염기서열의 제6540 내지 6565위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(f11-26-3) 서열번호 2의 염기서열의 제7483 내지 7510위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열, 또는
(f11-28-3) 서열번호 2의 염기서열의 제7634 내지 7663위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열
이다.
상기 (f11-12-1) 내지 (f11-28-1)에 있어서, 「연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열」은, 「3'말단으로부터 1 내지 12번째의 염기로부터 5'말단 방향으로 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열」인 것이 바람직하다.
상기 (f11-12-2) 내지 (f11-28-2)에 있어서, 「연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열」은, 바람직하게는 「3'말단으로부터 1 내지 5번째의 염기로부터 5'말단 방향으로 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열」인 것이 바람직하다.
상기 (f11-12-3) 내지 (f11-28-3)에 있어서, 「연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열」은, 바람직하게는 「3'말단으로부터 1 내지 2번째의 염기로부터 5'말단 방향으로 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열」인 것이 바람직하다. 여기서 「3'말단으로부터 1 내지 2번째의 염기」는, 보다 바람직하게는 「3'말단의 염기」이다.
상기 부분 염기서열 r11은,
바람직하게는,
(r11-13-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4694 내지 4740위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(r11-19-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2672 내지 2711위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(r11-21-1) 서열번호 2의 염기서열의 제3539 내지 3583위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(r11-23-1) 서열번호 2의 염기서열의 제5061 내지 5103위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(r11-25-1) 서열번호 2의 염기서열의 제6566 내지 6605위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(r11-27-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7931 내지 7976위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열, 또는
(r11-29-1) 서열번호 2의 염기서열의 제8302 내지 8346위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열
이고,
보다 바람직하게는,
(r11-13-2) 서열번호 2의 염기서열의 제4701 내지 4735위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(r11-19-2) 서열번호 2의 염기서열의 제2679 내지 2706위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(r11-21-2) 서열번호 2의 염기서열의 제3546 내지 3578위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(r11-23-2) 서열번호 2의 염기서열의 제5068 내지 5098위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(r11-25-2) 서열번호 2의 염기서열의 제6573 내지 6600위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(r11-27-2) 서열번호 2의 염기서열의 제7938 내지 7971위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열, 또는
(r11-29-2) 서열번호 2의 염기서열의 제8309 내지 8341위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열
이고,
특히 바람직하게는,
(r11-13-3) 서열번호 2의 염기서열의 제4704 내지 4735위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(r11-19-3) 서열번호 2의 염기서열의 제2682 내지 2706위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(r11-21-3) 서열번호 2의 염기서열의 제3549 내지 3578위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(r11-23-3) 서열번호 2의 염기서열의 제5071 내지 5098위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(r11-25-3) 서열번호 2의 염기서열의 제6576 내지 6600위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열,
(r11-27-3) 서열번호 2의 염기서열의 제7941 내지 7971위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열, 또는
(r11-29-3) 서열번호 2의 염기서열의 제8312 내지 8341위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열
이다.
상기 (r11-13-1) 내지 (r11-29-1)에 있어서, 「연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열」은, 「5'말단으로부터 1 내지 12번째의 염기로부터 3'말단 방향으로 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열」인 것이 바람직하다.
상기 (r11-13-2) 내지 (r11-29-2)에 있어서, 「연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열」은, 「5'말단으로부터 1 내지 5번째의 염기로부터 3'말단 방향으로 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열」인 것이 바람직하다.
상기 (r11-13-3) 내지 (r11-29-3)에 있어서, 「연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열」은, 「5'말단으로부터 1 내지 2번째의 염기로부터 3'말단 방향으로 연속한 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 염기서열」인 것이 바람직하다. 「5'말단으로부터 1 내지 2번째의 염기」는, 보다 바람직하게는 「5'말단의 염기」이다.
상기 부분 염기서열 f11과 상기 부분 염기서열 r11란, 상기 부분 염기서열 f11의 3'말단의 염기가, 부분 염기서열 r11의 5'말단의 염기보다, 서열번호 2의 염기서열에 있어서 5'말단측(상류측)에 위치하는 조합이면 된다.
바람직하게는, 상기 부분 염기서열 f11이 (f11-12-1), (f11-12-2) 또는 (f11-12-3)일 때, 상기 부분 염기서열 r11이 (r11-13-1), (r11-13-2), (r11-13-3), (r11-23-1), (r11-23-2), 또는 (r11-23-3)이다. 이 경우, 서열번호 7의 부분 염기서열을 증폭할 수 있다.
바람직하게는, 상기 부분 염기서열 f11이 (f11-18-1), (f11-18-2) 또는 (f11-18-3)일 때, 상기 부분 염기서열 r11이 (r11-19-1), (r11-19-2), (r11-19-3), (r11-21-1), (r11-21-2), 또는 (r11-21-3)이다. 이 경우, 서열번호 5의 부분 염기서열을 증폭할 수 있다.
바람직하게는, 상기 부분 염기서열 f11이 (f11-20-1), (f11-20-2) 또는 (f11-20-3)일 때, 상기 부분 염기서열 r11이 (r11-19-1), (r11-19-2), (r11-19-3), (r11-21-1), (r11-21-2), 또는 (r11-21-3)이다. 이 경우, 서열번호 5의 부분 염기서열을 증폭할 수 있다.
바람직하게는, 상기 부분 염기서열 f11이 (f11-22-1), (f11-22-2) 또는 (f11-22-3)일 때, 상기 부분 염기서열 r11이 (r11-13-1), (r11-13-2), (r11-13-3), (r11-23-1), (r11-23-2), 또는 (r11-23-3)이다. 이 경우, 서열번호 7의 부분 염기서열을 증폭할 수 있다.
바람직하게는, 상기 부분 염기서열 f11이 (f11-24-1), (f11-24-2) 또는 (f11-24-3)일 때, 상기 부분 염기서열 r11이 (r11-25-1), (r11-25-2), 또는 (r11-25-3)이다. 이 경우, 서열번호 9의 부분 염기서열을 증폭할 수 있다.
바람직하게는, 상기 부분 염기서열 f11이 (f11-26-1), (f11-26-2) 또는 (f11-26-3)일 때, 상기 부분 염기서열 r11이 (r11-27-1), (r11-27-2), (r11-27-3), (r11-29-1), (r11-29-2), 또는 (r11-29-3)이다. 이 경우, 서열번호 11의 부분 염기서열을 증폭할 수 있다.
바람직하게는, 상기 부분 염기서열 f11이 (f11-28-1), (f11-28-2) 또는 (f11-28-3)일 때, 상기 부분 염기서열 r11이 (r11-27-1), (r11-27-2), (r11-27-3), (r11-29-1), (r11-29-2), 또는 (r11-29-3)이다. 이 경우, 서열번호 11의 부분 염기서열을 증폭할 수 있다.
제1 프라이머 중의 폴리뉴클레오티드는, 상기 부분 염기서열 f11의 상보 염기서열과 하이브리다이즈 가능한 염기서열 f12를 3'말단에 포함하도록 설계할 수 있다. 제1 프라이머 중의 폴리뉴클레오티드는, 염기서열 f12를 3'말단에 포함하는 것이면 되고, 염기서열 f12의 5'말단측에는 또 다른 염기서열이 부가되어 있어도 된다. 제1 프라이머 중의 폴리뉴클레오티드의 전체 길이는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상으로 할 수 있고, 전형적으로는 40염기 이하, 30염기 이하 또는 27염기 이하로 할 수 있다.
상기 염기서열 f12이, 상기 부분 염기서열 f11의 상보 염기서열과 하이브리다이즈 가능한 경우, 상기 부분 염기서열 f11과 상기 염기서열 f12와는 동일하거나 또는 상동이다. 여기서 「상동」이란, 상기 (B) 또는 (C)의 조건을 충족하는 것을 가리키고, 구체적으로는 이하의 (B2) 또는 (C2)의 조건을 충족한다.
(B2) 상기 염기서열 f12이, 상기 부분 염기서열 f11에 있어서 1 혹은 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 및/또는 삽입된 염기서열이다.
(C2) 상기 염기서열 f12이, 상기 부분 염기서열 f11과 80% 이상의 동일성을 갖는 염기서열이다.
상기 (B2)에 있어서의 「1 혹은 수개」, 상기 (C2)에 있어서의 「동일성」의 바람직한 범위에 대해서는, 상기 (B) 및 (C)에 관해서 이미 설명한 바와 같다.
제2 프라이머 중의 폴리뉴클레오티드는, 상기 부분 염기서열 r11과 하이브리다이즈 가능한 염기서열 r12를 3'말단에 포함하도록 설계할 수 있다. 제2 프라이머 중의 폴리뉴클레오티드는, 염기서열 r12를 3'말단에 포함하는 것이면 되고, 염기서열 r12의 5'말단측에는 또 다른 염기서열이 부가되어 있어도 된다. 제2 프라이머 중의 폴리뉴클레오티드의 전체 길이는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 10염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상으로 할 수 있고, 전형적으로는 40염기 이하, 30염기 이하 또는 27염기 이하로 할 수 있다.
상기 염기서열 r12이, 상기 부분 염기서열 r11과 하이브리다이즈 가능한 경우, 상기 부분 염기서열 r11의 상보 염기서열과 상기 염기서열 r12와는 동일하거나 또는 상동이다. 여기서 「상동」이란, 상기 (B) 또는 (C)의 조건을 충족하는 것을 가리키고, 구체적으로는 이하의 (B3) 또는 (C3)의 조건을 충족한다.
(B3) 상기 염기서열 r12이, 상기 부분 염기서열 r11의 상보 염기서열에 있어서 1 혹은 수개의 염기가 결실, 치환, 부가 및/또는 삽입된 염기서열이다.
(C3) 상기 염기서열 r12이, 상기 부분 염기서열 r11의 상보 염기서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 염기서열이다.
상기 (B3)에 있어서의 「1 혹은 수개」, 상기 (C3)에 있어서의 「동일성」의 바람직한 범위에 대해서는, 상기 (B) 및 (C)에 관해서 이미 설명한 바와 같다.
제1 프라이머와 제2 프라이머와의 조합은 특별히 한정되지 않고 핵산 증폭 반응에 의해 게놈 DNA의 표적 영역을 폴리뉴클레오티드 단편으로서 증폭할 수 있도록 조합할 수 있다.
상기 제3 실시 형태에 따른 프라이머 세트의 바람직한 예로서는,
제1 프라이머가,
(C28f) 서열번호 12, 18, 20, 22, 24, 26 또는 28에 나타내는 염기서열과 동일하거나 또는 상동의 염기서열 C28fa에 포함되는 연속한 10염기 이상의 염기서열 C28fb를 3'말단에 포함하는 40염기 이하의 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 프라이머이며,
제2 프라이머가,
(C28r) 서열번호 13, 19, 21, 23, 25, 27 또는 29에 나타내는 염기서열과 동일하거나 또는 상동의 염기서열 C28ra에 포함되는 연속한 10염기 이상의 염기서열 C28rb를 3'말단에 포함하는 40염기 이하의 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 프라이머인,
프라이머 세트를 예시할 수 있다.
상기 (C28f)에 있어서, 염기서열 C28fa는, 서열번호 12, 18, 20, 22, 24, 26 또는 28의 염기서열과 동일하거나, 상동, 즉 상기 (B) 또는 (C)의 관계를 충족한다(서열번호 12, 18, 20, 22, 24, 26 또는 28의 염기서열이 염기서열 X, 염기서열 C28fa가 염기서열 Y에 상당한다).
상기 (C28f)에 있어서, 염기서열 C28fa는, 서열번호 12, 18, 20, 22, 24, 26 또는 28에 나타내는 염기서열과, 3'말단으로부터 연속한 바람직하게는 3 염기 이상, 보다 바람직하게는 5염기 이상, 보다 바람직하게는 10염기 이상, 보다 바람직하게는 12 염기 이상, 보다 바람직하게는 15염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 부분이 동일해서, 잔부가 상동 (즉 상기 (B) 또는 (C)의 관계를 충족한다(서열번호 12, 18, 20, 22, 24, 26 또는 28의 염기서열 잔부가 염기서열 X, 염기서열 C28fa의 잔부가 염기서열 Y에 상당한다))인 염기서열인 것이 바람직하고, 서열번호 12, 18, 20, 22, 24, 26 또는 28에 나타내는 염기서열과 동일한 것이 바람직하다.
상기 염기서열 C28fb는, 바람직하게는 상기 염기서열 C28fa에 포함되는 연속한 12 염기 이상, 15염기 이상, 17염기 이상, 또는 20염기 이상의 염기서열이고, 보다 바람직하게는, 상기 염기서열 C28fa의 3'말단의 염기로부터의 연속한 염기서열이다.
상기 염기서열 C28fb는, 보다 바람직하게는, 상기 염기서열 C28fa와 동일하다.
상기 (C28r)에 있어서, 염기서열 C28ra는, 서열번호 13, 19, 21, 23, 25, 27 또는 29의 염기서열과 동일하거나, 상동, 즉 상기 (B) 또는 (C)의 관계를 충족한다(서열번호 13, 19, 21, 23, 25, 27 또는 29의 염기서열이 염기서열 X, 염기서열 C28ra가 염기서열 Y에 상당한다).
상기 (C28r)에 있어서, 염기서열 C28ra는, 서열번호 13, 19, 21, 23, 25, 27 또는 29에 나타내는 염기서열과, 3'말단으로부터 연속한 바람직하게는 3 염기 이상, 보다 바람직하게는 5염기 이상, 보다 바람직하게는 10염기 이상, 보다 바람직하게는 12 염기 이상, 보다 바람직하게는 15염기 이상, 보다 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 20염기 이상의 부분이 동일해서, 잔부가 상동(즉 상기 (B) 또는 (C)의 관계를 충족한다(서열번호 13, 19, 21, 23, 25, 27 또는 29의 염기서열 잔부가 염기서열 X, 염기서열 C28ra의 잔부가 염기서열 Y에 상당한다))인 염기서열인 것이 바람직하고, 서열번호 13, 19, 21, 23, 25, 27 또는 29에 나타내는 염기서열과 동일한 것이 바람직하다.
상기 염기서열 C28rb는, 바람직하게는 상기 염기서열 C28ra에 포함되는 연속한 12 염기 이상, 15염기 이상, 17염기 이상, 또는 20염기 이상의 염기서열이고, 보다 바람직하게는, 상기 염기서열 C28ra의 3'말단의 염기로부터의 연속한 염기서열이다.
상기 염기서열 C28rb는, 보다 바람직하게는, 상기 염기서열 C28ra와 동일하다.
제1 프라이머는, 상기 폴리뉴클레오티드만을 포함하고 있어도 되고, 후술하는 표지부 또는 결합부를 더 포함해도 된다. 상기 폴리뉴클레오티드와 표지부 또는 결합부는, 후술하는 적당한 스페이서를 개재해서 화학적으로 연결할 수 있다. 제1 프라이머에 있어서, 표지부 및 결합부의 한쪽이 상기 폴리뉴클레오티드에 연결되는 위치는, 상기 폴리뉴클레오티드와 표적 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보쇄의 어닐링 및 핵산 증폭 반응에 있어서의 신장을 저해하지 않는 위치이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드의 5'말단이다.
제2 프라이머는, 상기 폴리뉴클레오티드만을 포함하고 있어도 되고, 후술하는 표지부 또는 결합부를 더 포함해도 된다. 상기 폴리뉴클레오티드와 표지부 또는 결합부와는, 후술하는 적당한 스페이서를 개재해서 화학적으로 연결할 수 있다. 제2 프라이머에 있어서, 표지부 및 결합부의 한쪽이 상기 폴리뉴클레오티드에 연결되는 위치는, 상기 폴리뉴클레오티드와 표적 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보쇄의 어닐링 및 핵산 증폭 반응에 있어서의 신장을 저해하지 않는 위치이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드의 5'말단이다.
제1 프라이머 및 제2 프라이머의 적어도 한쪽이, 표지부를 포함하는 경우, 이것을 사용한 핵산 증폭 반응에서는, 표지부를 포함하는 증폭산물이 얻어지기 때문에, 증폭산물의 검출이 용이하다.
제1 프라이머 및 제2 프라이머의 적어도 한쪽이, 결합부를 포함하는 경우, 이것을 사용한 핵산 증폭 반응에서는, 결합부를 포함하는 증폭산물이 얻어지기 때문에, 증폭산물을 고상 담체에 고정하는 것이 가능하고, 증폭산물의 검출이 용이하다.
보다 바람직하게는, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 한쪽이, 표지부를 더 포함하고, 다른 쪽이, 결합부를 더 포함한다. 이 양태의 프라이머 세트를 사용한 핵산 증폭 반응에서는, 표지부와 결합부를 포함하는 이중쇄의 증폭산물이 얻어지기 때문에, 핵산 크로마토그래피에 의한 검출이 용이하다.
이하, 표지부 및 결합부를 포함하는 프라이머 세트에 대해서 설명한다.
(표지부)
표지부는, 표지 물질과 결합 가능한 태그 또는 표지 물질의 어느 것이며, 바람직하게는 표지 물질과 결합 가능한 태그이다. 본 명세서에서는, 표지 물질과 결합 가능한 태그를 표지용 태그라 칭하는 경우가 있다. 표지부가 표지용 태그인 경우, 핵산 증폭 반응의 증폭산물과 표지 물질을 접촉시킴으로써 증폭산물의 일단부에 포함되는 태그를 표지할 수 있다. 표지부가 표지 물질인 경우, 핵산 증폭 반응의 증폭산물로서 표지 물질을 일단부에 포함하는 증폭산물을 얻을 수 있다.
표지 물질은 증폭산물의 검출을 가능하게 하는 것이면 되고 특별히 한정은 되지 않지만, 바람직하게는 증폭산물의 눈으로 보아 검출을 가능하게 하는 것이다. 이러한 표지 물질로서는, 착색 입자, 색소, 효소(퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, 루시페라아제 등) 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 착색 입자다. 「착색 입자」란, 금속(예를 들어, 금, 은, 구리, 백금 등) 입자, 금속 로드, 착색된 라텍스 입자, 색소를 포함하는 실리카 나노 입자 등을 들 수 있지만, 이들에 한정은 되지 않는다. 표지 물질의 크기는 증폭산물을 후술하는 고상 담체에 포착하는 것을 방해하는 것이 아니면 된다. 표지 물질은 검출 시에 발색이 좋은 것인 것이 바람직하고, 후술하는 고상 담체나, 고상 담체를 구비하는 핵산 검출 디바이스의 각종 다공질 부재의 구멍 직경보다 작은 사이즈가 되게, 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 표지 물질의 크기는 약 500㎚ 이하, 바람직하게는 약 0.1㎚ 내지 250㎚, 보다 바람직하게는 약 1㎚ 내지 100㎚의 입경으로 할 수 있다. 색소로서, 형광 색소(플루오로세인, 시아닌 등) 등도 사용 가능하지만, 그 경우에는 각 형광 색소의 여기 파장광을 조사하고, 검출하는 것이 바람직하다.
표지부로서 이용 가능한 표지용 태그는, 표지 물질과 결합 가능한 것이면 되고, 표지 물질의 구조에 따라서 적절히 선택하면 되고 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 핵산(DNA, RNA 등), 단백질, 펩티드, 혹은 다른 화합물(예를 들어, 비오틴, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 디곡시게닌(DIG) 등의 저분자 화합물), 또는 그들의 조합을 포함하는 것을 이용할 수 있다. 표지용 태그에 하나 바람직한 형태로서는, 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이다. 표지용 태그에 포함될 수 있는 해당 폴리뉴클레오티드는, 상기 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응의 실질적인 지장이 되지 않는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 염기수가 예를 들어 5 내지 50, 바람직하게는 10 내지 35인 폴리뉴클레오티드이며, 보다 바람직하게는, 서열번호 14 또는 15에 나타내는 염기서열 또는 그 부분 염기서열 혹은 그들의 상보 염기서열을 포함하는(또는 로 이루어지는) 폴리뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 표지용 태그의 또하나의 바람직한 형태로서는, 비오틴, FITC, DIG 등의 저분자 화합물을 포함하는 것이다.
표지부가 상기의 표지용 태그인 경우, 표지 물질과 표지용 태그와의 결합은, 직접적 결합이어도, 간접적 결합이어도 되고, 결합 수단은 이용하는 표지 물질과 표지용 태그의 조합에 따라서 적절히 적합한 것을 선택할 수 있다. 예를 들어, 표지용 태그가 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 표지 물질을 당해 폴리뉴클레오티드에 하이브리다이즈 가능한 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 당해 폴리뉴클레오티드의 염기서열과 상보적인 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드)에 결합시켜서, 양자의 폴리뉴클레오티드를 하이브리다이제이션시킴으로써 표지 물질과 표지용 태그를 간접적으로 결합할 수 있다. 표지 물질과 폴리뉴클레오티드와의 결합은 펩티드, 단백질, 핵산 등을 통하여 행해도 되고, 적당한 관능기를 개재해서 행해도 된다. 하이브리다이제이션의 조건은, 하이브리다이제이션이 발생하는 조건이면 잘 특별히 한정은 되지 않지만, 예를 들어 20℃ 내지 40℃에서, 10mM 내지 50mM의 인산을 포함하는 완충액(pH6 내지 7) 중으로 반응시킴으로써 행할 수 있다. 하이브리다이제이션 효율을 높이기 위해, 완충액에는 또한 염화나트륨 등의 염을 포함할 수 있다.
또한, 표지용 태그가 저분자 화합물의 경우, 그것과 특이적으로 결합하는 단백질(예를 들어 비오틴에 결합하는 아비딘, FITC에 결합하는 단백질), 항체(예를 들어 항DIG 항체), 앱타머 등의 결합성 물질과 연결한 표지 물질에 의해 표지할 수 있다. 이 경우, 표지용 태그와 결합성 물질이란, 각종 중성 부근의 완충액을 사용해서 결합시킬 수 있다.
표지부(표지용 태그 또는 표지 물질)와, 제1 프라이머에 포함되는 폴리뉴클레오티드, 또는 제2 프라이머에 포함되는 폴리뉴클레오티드는 임의의 수단에 의해 결합할 수 있고, 직접적으로, 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 단, 표지부 중 적어도 상기 폴리뉴클레오티드와 접속하는 부분이 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 핵산 증폭 반응에 의해 당해 부분이 상기 폴리뉴클레오티드와 함께 이중쇄화되지 않도록, DNA 폴리메라아제 반응의 진행을 억제 또는 정지하는 것이 가능한 스페이서를 개재하여, 상기 폴리뉴클레오티드와 표지부가 결합된다. 이러한 「스페이서」로서는, DNA 폴리메라아제 반응의 진행을 억제 또는 정지할 수 있고, 표지부의 이중쇄화를 방지하는 것이면 되고, 예를 들어 견고한 헤어핀 구조나 수도 노트 구조를 갖는 핵산 서열, L형 핵산, 펩티드 핵산(PNA), 가교화 핵산(Bridged Nucleic Acid(BNA) 혹은 잠금 핵산(Locked Nucleic Acid)(LNA)), 플루오레세인, Cy3, Cy5, 하기 식 I로 표시되는 아조벤젠 구조를 포함하는 2가기, 지방쇄(알킬렌쇄 또는 폴리옥시알킬렌쇄), 5'-5' 결합, 3'-3' 결합과 같은 역위 서열 구조를 포함하는 2가기 등을 들 수 있지만 이들에 한정은 되지 않는다.
Figure pct00002
식 I로 표시되는 2가기를 개재해서 2개의 폴리뉴클레오티드 분자를 접속하는 경우, 해당 2가기의 한쪽의 3'단의 인산기는, 한쪽의 폴리뉴클레오티드 분자의 5'말단의 뉴클레오티드 인산기를 가리키고, 다른 쪽의 5'단의 산소 원자는, 다른 쪽의 폴리뉴클레오티드 분자의 3'말단의 뉴클레오티드 인산기와 인산 에스테르 결합을 형성한다.
지방쇄의 스페이서로서는, 예를 들어 이하의 식 (II)로 표시되는 스페이서를 들 수 있다.
5'-O-CmH2m-O-3' 식 (II)
(식 중, 5'는 5'측의 인산 디에스테르 결합의 산소 원자를 나타내고, 3'는 3'측의 인산 디에스테르 결합의 산소 원자를 나타내고, m은 1 이상 40 이하의 정수를 나타낸다. H는 치환기에 의해 치환되어 있어도 된다.)
식 (II)에 있어서 m은, 바람직하게는 2 이상 36 이하이고, 보다 바람직하게는 3 이상 16 이하이다. 식 (II) 중의 H는, 치환기에 의해 치환되어 있어도 되고, 치환기로서는, 전형적으로는, 알킬기, 알콕시기, 수산기 등을 들 수 있다. 치환기로서의 알킬기 및 알콕시기의 탄소수는 1 내지 8인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1 내지 4이다. 또한, 2 이상의 치환기를 갖는 경우에는, 치환기는 동일하거나 상이해도 된다. 또한, 치환기를 갖고 있지 않은 것도 바람직하다.
또한, 기타 스페이서로서는, 이하의 식 (III)으로 표현되는 스페이서를 들 수 있다.
5'-(OCnH2n)L-O-3' 식 (III)
(식 중, 5'는 5'측의 인산 디에스테르 결합의 산소 원자를 나타내고, 3'는 3'측의 인산 디에스테르 결합의 산소 원자를 나타내고, n은 2 이상 4 이하의 정수를 나타내고, L은 1 이상의 정수이고, (n+1)×L은 40 이하가 되는 정수를 나타낸다. H는 치환기에 의해 치환되어 있어도 된다.)
식 (III)에 있어서 (n+1)×L은, 바람직하게는 2 이상 36 이하이고, 보다 바람직하게는 3 이상 16 이하이다. 식 (III) 중의 H의 치환기는, 식 (II) 중의 치환기와 마찬가지 양태가 적용된다.
다른 지방쇄의 스페이서로서는, 예를 들어 이하의 2가기를 들 수 있다.
Figure pct00003
이들 2가기를 개재해서 2개의 폴리뉴클레오티드 분자를 접속하는 경우, 각 2가기의 한쪽의 단의 인산기는, 한쪽의 폴리뉴클레오티드 분자의 3'말단 또는 5'말단의 뉴클레오티드에 인산기를 가리키고, 다른 쪽의 단의 산소 원자는, 다른 쪽의 폴리뉴클레오티드 분자의 5'말단 또는 3'말단의 뉴클레오티드 인산기와 인산 에스테르 결합을 형성한다.
(결합부 및 고상 담체)
결합부는, 후술하는 고상 담체와 결합 가능한 태그이다. 본 명세서에서는, 고상 담체와 결합 가능한 태그를 고정화용 태그라 칭하는 경우가 있다.
결합부로서 이용 가능한 고정화용 태그는, 고상 담체와 결합 가능한 것이면 되고, 고상 담체의 구조에 따라서 적절히 선택하면 되고 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 폴리뉴클레오티드(DNA, RNA 등), 단백질, 펩티드, 혹은 다른 화합물(예를 들어 저분자 화합물), 또는 그들의 조합을 포함하는 것을 이용할 수 있다. 고정화용 태그는, 바람직하게는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이다. 고정화용 태그에 포함될 수 있는 해당 폴리뉴클레오티드는, 상기 프라이머 세트에 의한 핵산 증폭 반응의 실질적인 지장이 되지 않는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 염기수가 예를 들어 5 내지 50, 바람직하게는 10 내지 35인 폴리뉴클레오티드이며, 보다 바람직하게는, 서열번호 14 또는 15에 나타내는 염기서열 또는 그 부분 염기서열 혹은 그들의 상보 염기서열을 포함하는(또는 로 이루어지는) 폴리뉴클레오티드를 사용할 수 있다.
고상 담체는 특별히 한정은 되지 않지만, 수지, 금속, 다당류, 광물 등을 포함하는 것을 이용할 수 있고, 멤브레인, 필름, 부직포, 플레이트, 겔 등의 형상과 할 수 있다. 바람직하게는 고상 담체는, 용액 중의 증폭산물이나 표지 물질이 전개 할 수 있도록 다공질 구조를 갖는 것이다. 본 발명에 있어서 이용 가능한 고상 담체로서는, 예를 들어 여과지, 니트로셀룰로오스 멤브레인, 폴리에테르술폰 멤브레인, 나일론 멤브레인, 건조시킨 각종 겔(실리카겔, 아가로오스 겔, 덱스트란 겔, 젤라틴 겔), 실리콘, 유리, 플라스틱 등을 들 수 있다. 고상 담체의 크기 및 형태는, 각종 조작이나 검출에 적절한 것을 적절히 선택할 수 있다.
고상 담체는, 적어도 일부의 부분이 고정화용 태그와 결합 가능하도록 구성되어 있으면 되고, 보다 바람직하게는 일부 부분만이 고정화용 태그와 결합 가능하도록 구성되어 있다. 고상 담체가 특정한 부분만을 고정화용 태그와 결합 가능하도록 구성함으로써, 고상 담체에 포착된 증폭산물은 상기 부분에만 국한해서 검출되기 때문에, 양성 또는 음성의 판별을 용이하게 할 수 있다.
고상 담체와 고정화용 태그와의 결합은, 직접적 결합이어도, 간접적 결합이어도 되고, 결합 수단은 이용하는 고상 담체와 고정화용 태그의 조합에 따라서 적절히 적합한 것을 선택할 수 있다. 예를 들어, 고정화용 태그가 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 고상 담체에 당해 폴리뉴클레오티드에 하이브리다이즈 가능한 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 당해 폴리뉴클레오티드의 염기서열과 상보적인 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드)를 고정화해서 태그 포착 수단으로 하고, 양자의 폴리뉴클레오티드를 하이브리다이제이션시킴으로써, 고상 담체와 고정화용 태그를 간접적으로 결합할 수 있다. 고상 담체에의 폴리뉴클레오티드의 고정화는 펩티드, 단백질, 핵산 등을 통하여 행해도 되고, 적당한 관능기를 개재해서 행해도 된다. 하이브리다이제이션의 조건은, 표지용 태그와 표지 물질과의 결합에 관해서 상기한 조건에 의해 행할 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 고상 담체에 고정화하는 경우, 특정한 부분에 국한해서 고정화함으로써, 포착된 증폭산물은 소정의 부분에만 국한해서 검출되기 때문에, 양성 또는 음성인 판별을 용이하게 할 수 있다.
결합부(고정화용 태그)와, 제1 프라이머에 포함되는 폴리뉴클레오티드, 또는 제2 프라이머에 포함되는 폴리뉴클레오티드와는 임의의 수단에 의해 결합할 수 있고, 직접적으로, 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 단, 고정화용 태그 중 적어도 상기 폴리뉴클레오티드와 접속하는 부분이 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 핵산 증폭 반응에 의해 당해 부분이 상기 폴리뉴클레오티드와 함께 이중쇄화되지 않도록, DNA 폴리메라아제 반응의 진행을 억제 또는 정지하는 것이 가능한 스페이서를 개재하여, 상기 폴리뉴클레오티드와 고정화용 태그가 결합된다. 결합부와 폴리뉴클레오티드 사이에 마련하는 스페이서의 구체예는, 표지부와 폴리뉴클레오티드 사이에 마련하는 스페이서에 관해서 상술한 것과 마찬가지이다.
<C28주에 특이적인 지표 염기서열을 검출하기 위한 프라이머 세트를 사용한 유전자형의 판정 방법>
상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 상기 제3 실시 형태에 따른 프라이머 세트를 사용하여, 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신인지 티민인지를 판정할 수 있다.
이 판정 방법은, 예를 들어,
판정 대상의 항산균의 게놈 DNA 또는 판정 대상의 항산균의 게놈 DNA로부터 유도된 폴리뉴클레오티드를 주형으로 하고, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 상기 제3 실시 형태에 따른 프라이머 세트를 사용하여, 핵산 증폭 반응을 행하는 것,
상기 핵산 증폭 반응에 의한 증폭산물을 검출하는 것, 및
상기 증폭산물이 검출된 경우에, 상기 항산균의 게놈 DNA 중의 상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 시토신이라고 판정하고, 상기 증폭산물이 검출되지 않은 경우에, 상기 염기가 티민이라고 판정하는 것,
을 포함한다.
상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 상기 제3 실시 형태에 따른 프라이머 세트는 또한, 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신인 것을 판정하는 방법에 사용할 수 있다. 이 방법은, 예를 들어,
판정 대상의 항산균의 게놈 DNA 또는 판정 대상의 항산균의 게놈 DNA로부터 유도된 폴리뉴클레오티드를 주형으로 하고, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 상기 제3 실시 형태에 따른 프라이머 세트를 사용하여, 핵산 증폭 반응을 행하는 것,
상기 핵산 증폭 반응에 의한 증폭산물을 검출하는 것, 및
상기 증폭산물이 검출된 경우에, 상기 항산균의 게놈 DNA 중의 상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 시토신이라고 판정하는 것,
을 포함하는 방법일 수 있다.
여기서 「판정 대상의 항산균의 게놈 DNA로부터 유도된 폴리뉴클레오티드」로서는 상기 게놈 DNA의 일부분의 부분 폴리뉴클레오티드나, 상기 게놈 DNA의 전체 또는 상기 지표 염기서열을 포함하는 부분을 핵산 증폭 반응에 의해 증폭한 증폭산물을 들 수 있다.
핵산 증폭 반응의 예는 이미 설명한 바와 같다.
판정 대상의 항산균의 게놈 DNA 또는 판정 대상의 항산균의 게놈 DNA로부터 유도된 폴리뉴클레오티드에, 상기 제1 프라이머와 상기 제2 프라이머를 사용한 핵산 증폭 반응에 의한 표적 서열이 포함되어 있는 경우, 증폭산물로서 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편이 발생한다.
핵산 증폭 반응에 의해 발생한 증폭산물의 검출 방법은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 핵산 증폭 반응의 반응액을 겔 전기 영동에 의해 분획하고, 소정의 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편에 상당하는 사이즈의 밴드의 유무를 확인하는 방법이나, 핵산 증폭 반응의 반응액 또는 그 생성물에, 소정의 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편에 특이적인 표지화된 폴리뉴클레오티드 프로브를 하이브리다이즈시켜서, 복합체를 검출하는 방법을 예시할 수 있다.
또한, 핵산 증폭 반응을, 폴리뉴클레오티드의 5'말단에 리포터 형광 물질이 연결되어, 3'말단에 ??처 색소를 연결된 본 발명의 제2 실시 형태에 따른 프로브의 존재 하에서 행하고, 소정의 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편이 증폭 한 경우에 발생하는 형광을 지표로 해서, 폴리뉴클레오티드 단편을 검출하는 것도, 증폭산물의 검출 방법의 일 양태이다.
또한, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 한쪽이, 표지 물질과 결합 가능한 태그 또는 표지 물질인 표지부를 더 포함하고, 다른 쪽이, 고상 담체와 결합 가능한 태그인 결합부를 더 포함하는 경우, 이하의 고상 담체를 사용한 검출 공정을 행할 수 있다.
(고상 담체를 사용한 검출 공정)
이 검출 공정에서는, 핵산 증폭 반응의 생성물을, 결합부와 결합 가능한 부분을 적어도 일부에 포함하는 고상 담체에 접촉시켜서, 표지부를 지표로 해서 고상 담체의 상기 부분에서의 증폭산물을 검출한다.
표지부가 상술한 표지용 태그인 경우에는, 표지 물질을 표지용 태그에 결합시키는 표지 공정을 또한 행하면 된다. 표지 공정의 상세는 후술한다. 표지부가 상술한 표지 물질인 경우에는 표지 공정은 불필요하다. 검출 공정에 있어서 「표지부를 지표로 해서」란, 표지부가 표지용 태그인 경우에는 표지 공정을 거쳐서 결합한 표지 물질을 지표로 해서 증폭산물을 검출하는 것을 가리키고, 표지부가 표지 물질인 경우에는 해당 표지 물질을 지표로 해서 증폭산물을 검출하는 것을 가리킨다.
핵산 증폭 반응의 생성물이란, 증폭산물을 포함하고 있는 가능성이 있는 핵산 증폭 반응의 반응액이나, 해당 반응액으로부터 증폭산물을 또한 고농도화한 시료 등을 가리킨다.
고상 담체의 상세는 이미 설명한 바와 같다.
고상 담체의 결합부와 결합 가능한 부분에의, 상기 생성물의 접촉은, 고상 담체와 결합부와의 조합에 따라, 상기 생성물 중에 증폭산물이 포함되어 있는 경우에 상기 부분에 증폭산물의 결합부가 결합하게 적절히 조절된 조건(예를 들어, 하이브리다이제이션의 조건, 혹은 pH5 내지 9 정도의 완충액 조건)에서 행하면 된다.
증폭산물의 검출은, 고상 담체에 포착된 증폭산물에 결합한 상기 표지 물질을 검출, 바람직하게는 눈으로 보아 검출함으로써 행할 수 있다. 증폭산물이 존재하는 경우에는, 고상 담체에 포착·결합된 증폭산물의 표지 물질이 검출된다. 당해 검출의 유무를 지표로 해서, 핵산 증폭 반응의 반응계 중의 증폭산물(표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편)의 유무를 판별할 수 있다.
(표지 공정)
표지 공정은, 프라이머 세트에 포함되는 상기 표지부가 상술한 표지용 태그인 경우에 행하는 공정이며, 핵산 증폭 반응의 생성물과 표지 물질을 접촉시켜서, 표지용 태그에 표지 물질에 결합시킴으로써 행한다. 표지 공정은 핵산 증폭 반응의 생성물을 고상 담체에 접촉시키기 전에 행해도 되고, 접촉시킨 후에 행해도 되고, 접촉시킴과 동시에 행해도 된다.
표지 물질과 상기 생성물과의 접촉은, 표지 물질과 표지용 태그의 조합에 따라, 상기 생성물 중에 증폭산물이 포함되어 있는 경우에 표지 물질과 증폭산물의 표지용 태그가 결합하게 적절히 조절된 조건(예를 들어 이미 설명한 하이브리다이제이션의 조건, 혹은 pH5 내지 9 정도의 완충액 조건)에서 행하면 된다.
(검출 디바이스)
상술한 검출 공정 및 표지 공정은, 핵산 크로마토그래피를 이용하는 핵산 검출 디바이스를 사용해서 행할 수 있다. 당해 핵산 검출 디바이스를 이용함으로써, 핵산 증폭 반응의 반응계 중의 증폭산물(표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편)의 유무를, 특수한 장치를 필요로 하지 않고 검출·판별할 수 있고, 간편 또한 신속하게 결과를 얻을 수 있다.
핵산 검출 디바이스는, 핵산 크로마토그래피법에 의해 표지된 핵산 증폭산물을 검출하기 위해서 이용되는 공지된 핵산 검출 디바이스(WO2012/070618)를 이용할 수 있다.
본 발명에서 이용 가능한 핵산 검출 디바이스의 일 실시 형태의 모식도를 도 1에 도시하지만, 핵산 검출 디바이스는 본 실시 형태에 한정되는 것은 아니다. 또한, 이하의 설명에 있어서, 각 부재에 첨부된 부호는, 도 1 중에 도시되는 부호에 대응한다.
도 1의 핵산 검출 디바이스(10)는, 기재(5) 상에, 핵산 증폭 반응의 반응계를 수용하기 위한 반응계 수용부인 샘플 패드(3), 표지 물질을 유지하는 콘쥬게이트 패드(2), 증폭산물에 포함되는 결합부와 결합 가능한 부분(6)을 일부에 포함하는 다공질 고상 담체(1) 및 흡수 패드(4)를 서로가 이 순으로 접촉하도록 배치해서 형성된다. 고상 담체(1)의 부분(6)은, 증폭산물을 포착하기 위한 수단(포착 수단)(예를 들어, 상기 올리고뉴클레오티드 등)이 국재해서 배치·고정화된 부분이다. 도시하지 않지만, 고상 담체(1)의 표면은 필름에 의해 덮여 있어도 된다. 샘플 패드(3), 콘쥬게이트 패드(2), 고상 담체(1) 및 흡수 패드(4)는 상기 고상 담체로서 이용 가능한 다공질 구조를 갖는 부재에 의해 구성할 수 있다. 이들은 동일한 부재로 구성되어 있어도 되고, 다른 부재로 구성되어 있어도 된다. 기재(5)는 그 위에 배치된 각종 부재를 지지할 수 있고, 핵산 검출 디바이스의 조작을 용이하게 하는 것이면 되고, 예를 들어 수지, 금속, 광물 등을 포함하는 것을 이용할 수 있다. 표지 물질을 전개 용액 중에 혼합하는 경우나, 표지부가 표지 물질인 경우에는, 콘쥬게이트 패드(2)는 생략할 수 있다.
핵산 증폭 반응의 반응계를 샘플 패드(3)에 첨가한다. 상기 반응계를 그대로 첨가해도 되고, 적당한 전개 용액(예를 들어, 인산 완충액, Tris 완충액, 굿 완충액, SSC 완충액)과 함께 첨가해도 된다. 전개 용액에는 필요에 따라, 계면 활성제, 염, 단백질, 핵산 등을 더 포함할 수 있다. 샘플 패드(3)에 첨가된 상기 반응계는, 도 1 중 화살표로 나타내는 방향으로 상류로부터 하류를 향해서 캐필러리 현상에 의해 전개한다.
또 다른 양태로서는, 핵산 증폭 반응의 생성물 및/또는 전개 용액을 유지한 용기(예를 들어, PCR 튜브, 에펜 튜브, 96웰 플레이트 등)에 당해 핵산 검출 디바이스를 넣고, 샘플 패드(3)를 핵산 증폭 반응의 생성물 및/또는 전개 용액에 침지시키는 방법으로 전개할 수도 있다. 그 경우, 핵산 증폭 반응의 생성물 및/또는 전개 용액을 유지한 용기에 샘플 패드(3)가 들어가도록, 샘플 패드(3)의 폭은 2.0 내지 10.0㎜로 하는 것이 바람직하고, 2.0 내지 5.0㎜로 하는 것이 보다 바람직하다.
상기 표지부가 표지용 태그인 실시 형태에서는, 반응계 중의 증폭산물은 표지 물질이 유지된 콘쥬게이트 패드(2)를 통과할 때에 표지 물질과 접촉하고, 표지용 태그를 개재해서 표지 물질에 의해 표지된다.
이어서, 반응계 중의 증폭산물은, 고상 담체(1)을 통과할 때에 부분(6)에 고정된 포착 수단과 접촉하고, 고정화용 태그를 개재해서 고상 담체(1)에 포착·결합된다.
증폭산물이 존재하는 경우에는, 포착 수단을 포함하는 고상 담체(1)의 부분(6)에 포착·결합된 증폭산물에 결합한 표지 물질이 부분(6)에 검출된다. 표지 물질이 눈으로 보아 확인할 수 있는 것이면, 표지 물질에 기인해서 부분(6)이 정색한다. 당해 표지 물질의 검출(정색)의 유무를 지표로 해서, 시료 중의 증폭산물의 유무를 판별할 수 있다.
<C28주에 특이적인 지표 염기서열을 검출하기 위한 프라이머 세트를 사용한 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성의 판정 방법>
상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 상기 제3 실시 형태에 따른 프라이머 세트를 사용하여, 항산균, 특히 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균의 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 판정할 수 있다.
이 판정 방법은, 예를 들어
판정 대상의 항산균의 게놈 DNA 또는 판정 대상의 항산균의 게놈 DNA로부터 유도된 폴리뉴클레오티드를 주형으로 하고, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 상기 제3 실시 형태에 따른 프라이머 세트를 사용하여, 핵산 증폭 반응을 행하는 것,
상기 핵산 증폭 반응에 의한 증폭산물을 검출하는 것, 및
상기 증폭산물이 검출된 경우에, 상기 항산균이 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 갖는다고 판정하고, 상기 증폭산물이 검출되지 않은 경우에, 상기 항산균이 마크롤라이드계 항생 물질에 대한 감수성을 갖지 않는다고 판정하는 것,
을 포함한다.
상기 판정 방법에 있어서의 핵산 증폭 반응 및 증폭산물의 검출은 상기와 마찬가지로 행할 수 있다.
<항산균의 erm(41) 유전자형의 판정 방법 2>
본 발명의 제4 실시 형태는,
마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신인지 티민인지를 판정하는 방법이며,
상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 티민의 경우에 게놈 DNA의 상기 erm(41) 유전자 이외의 영역에 존재하고, 시토신의 경우에 존재하지 않는 지표 염기서열을, 판정 대상의 상기 항산균의 게놈 DNA에 있어서 검출하는 것
을 포함하고,
상기 지표 염기서열이 검출되는 것이, 상기 항산균의 게놈 DNA 중의 상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 티민인 것을 나타내고,
상기 지표 염기서열이 검출되지 않는 것이, 상기 항산균의 게놈 DNA 중의 상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 시토신인 것을 나타내는,
방법에 관한 것이다.
실시예
마이코박테로이데스 압세수스 컴플렉스의 표준주의 게놈 정보는, NCBI 데이터베이스(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)로부터 취득했다. 마이코박테로이데스 압세수스 컴플렉스의 임상분리주 및 분양주(하기 표 5에 나타내는 주)의 게놈 정보는, 각각 순수 배양한 균체로 조제한 DNA를, 차세대 시퀀서(MiSeq(illumina))에 의해 해석해 취득했다. 이들 게놈 정보를 기초로, erm(41) 유전자의 정상형(T28)을 갖는 주(T28주)와 erm(41) 유전자의 변이형(C28)을 갖는 주(C28주)를, 분자 계통 해석한바, T28주와 C28주가 분자 계통적으로 2개의 다른 그룹으로 분류될 수 있는 것을 발견했다. 또한, Mauve 소프트웨어(Darling 외(2005))를 사용해서 핵산 서열의 얼라인먼트를 행하여 비교 해석한바, C28주 특이적으로 고도로 보존된 서열번호 2의 삽입 염기서열을 갖는 것을 발견했다.
서열번호 2의 염기서열을 「삽입 염기서열」이라고 칭하는 경우가 있다.
<실시예 1>
서열번호 2의 삽입 염기서열에 특이적으로 하이브리다이즈하는 프라이머 세트로 해서 C28-f 프라이머 및 C28-r 프라이머를 설계했다. 각 프라이머의 서열은 표 2에 나타낸다. 설계한 프라이머 세트를 사용해서 PCR을 행하고, 핵산 증폭산물을 핵산 크로마토그래피에 의해 해석함으로써, C28주를 특이적으로 검출할 수 있는지 검증했다.
(I) 프라이머의 구조
핵산 크로마토그래피에서의 검출에 대응하기 위해서, 각 프라이머의 5'말단에 폴리메라아제 반응을 저해하는 아조벤젠 구조를 포함하는, 상기 식 I로 표시되는 2가기를 개재하여, 이하의 태그 서열을 포함하는 DNA를 연결했다. 이때, 상기 식 I에 나타내는 아조벤젠의 구조를 포함하는 2가기의 5'단과, 태그 서열을 포함하는 DNA의 3'말단의 뉴클레오티드 인산기가 인산 에스테르 결합을 형성하고, 해당 2가기의 3'단의 인산기와, 상기 프라이머의 프라이머 부분의 5'말단의 뉴클레오티드의 디옥시리보스의 5'위의 수산기가 인산 에스테르 결합을 형성한다.
서열번호 12의 염기서열을 포함하는 C28-f 프라이머의 5'말단에는, 아조벤젠 구조를 개재해서 서열번호 15의 염기서열을 포함하는 고정화용 태그 1을 부가했다. 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 C28-r 프라이머의 5'말단에는 마찬가지로 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 표지용 태그 1을 부가했다.
각각 태그 부가된 C28-f 프라이머 및 C28-r 프라이머의 조합을 제1 프라이머 세트로 해서 사용했다.
서열번호 12의 염기서열은, 서열번호 2의 제4634위 내지 제4658위의 부분 염기서열이고, 서열번호 7의 제581위 내지 제605위의 부분 염기서열이다.
서열번호 13의 염기서열은, 서열번호 2의 제4704위 내지 제4730위의 부분 염기서열의 상보 염기서열이고, 서열번호 7의 제651위 내지 제677위의 부분 염기서열의 상보 염기서열이다.
[표 2]
Figure pct00004
(II) 올리고뉴클레오티드 결합 금 콜로이드의 제작
금 콜로이드(Gold Colloid, 40㎚, 9.0×1010(입자수/ml), British Biocell International사제)와 표 3의 서열번호 16의 염기서열을 갖는 티올기 함유 올리고뉴클레오티드를 혼합하고, 50℃에서 16시간 인큐베이트했다. 6000rpm으로 15분간 원심 분리하고, 상청을 제거하고, 0.05M 염화나트륨, 5mM 인산 버퍼(pH7)를 첨가하고 혼화 후, 다시 50℃에서 40시간 인큐베이트했다.
인큐베이트 후, 원심 분리(6000rpm, 15분간)를 행하고, 상청을 제거하고, 5mM 인산 버퍼(pH7)를 첨가했다. 이 버퍼 치환을 다시 행하였다.
이상의 조작에 의해 올리고뉴클레오티드 결합 금 콜로이드를 조제했다.
조제된 올리고뉴클레오티드 결합 금 콜로이드의 현탁액을 유리 섬유제 패드에 균일해지도록 첨가한 후, 진공 건조기에서 건조시키고, 콘쥬게이트 패드로 하였다.
(티올기 함유 올리고뉴클레오티드)
티올기 함유 올리고뉴클레오티드는, 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 3'말단의 3'위의 인산기와, HO-(CH2)m-SH(m은 6)로 표현되는 화합물의 수산기가 인산 에스테르 결합에 의해 결합한 것이다.
(III) 태그 포착 수단을 고정화한 멤브레인의 제작
태그 포착 수단으로서, 서열번호 17의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브 1을 포함하는 용액을, 머크 밀리포아사제 니트로셀룰로오스 멤브레인(Hi-Flow180)에, 디스펜서를 사용하여, 전개 방향과 직교하는 폭 1㎜의 라인 상으로 도포했다. 그 후 40℃에서 30분간 건조시킴으로써 태그 포착 수단을 구비한 멤브레인으로 하였다. 서열번호 17의 올리고뉴클레오티드 프로브 1이 도포된 라인을 T1 라인으로 설정했다.
[표 3]
Figure pct00005
(IV) 핵산 검출 디바이스의 제작
핵산 검출 디바이스를, 도 1의 모식도에 도시되는 검출 디바이스에 준거해서 제작했다.
즉, 기재(5)로서 폴리프로필렌제 백킹 시트(Lohmann사), 콘쥬게이트 패드(2)로서 상기 (II)에서 제작한 콘쥬게이트 패드, 상기 (III)에서 제작한, 부분(6)에 태그 포착 수단으로서 올리고뉴클레오티드 프로브 1을 구비하는 멤브레인(고상 담체)(1), 샘플 패드(3)로서 유리 섬유제의 샘플 패드, 흡수 패드(4)로서 셀룰로오스제의 흡수 패드를, 각각 도 1에 도시한 바와 같이 서로 중첩시켜서 접합하여, 핵산 검출 디바이스(10)을 제작했다.
(V) PCR
상기 (I)에 기재된 태그 부가된 제1 프라이머 세트를 사용하여, TaKaRa TaqHS perfect Mix의 매뉴얼에 따라, 하기의 PCR용 반응액을 조제했다.
[표 4]
Figure pct00006
주형 DNA로서는, 표 5에 나타내는 항산균주(마이코박테로이데스 압세수스 컴플렉스 및 기타 항산균의 임상 분리주, 분양주, 근연의 항산균주)에서 정제한 DNA를 사용했다. 네거티브 컨트롤로서, 상기 주형 DNA 용액 대신에 멸균 증류수를 1μL 사용한 것 이외에는 마찬가지 조성의 PCR 반응액을 조제했다. 5μM Fw 프라이머 용액 및 5μM Rv 프라이머 용액은 소정의 프라이머를 5μM의 농도가 되도록 멸균 증류수 중에 용해시킨 것이다.
PCR 반응액을, PCR 장치(Bioer사, LifeEco)에 세트하고, 94℃에서 1분간 반응 후, 94℃-5초/62℃-10초/72℃-5초의 사이클을 35회 반복했다.
또한, 상기한 바와 같이, 시험에 사용한 마이코박테로이데스 압세수스 컴플렉스의 주 각각에 대해서, 시퀀스 해석에 의해 T28주인지 C28주인지를 식별했다.
(VI) 핵산 크로마토그래피 검출계를 사용한 검출
상기 조건에서의 PCR 후의 반응액을, 상기 핵산 검출 디바이스(10)에 적용하고, 핵산 증폭산물의 검출을 시도했다. 구체적으로는, 상기 디바이스(10) 상의 샘플 패드(3)에 PCR 후의 반응액 5μL를 첨가하고, 추가로 80μL의 전개 용액(계면 활성제를 배합한 시트르산 완충액)을 첨가함으로써, 반응액을 전개했다. 실온에서 10분 후, 멤브레인(1) 상의 라인상으로 고정화된 태그 포착 수단을 포함하는 부분(6)의 T1 라인의 착색의 유무를 눈으로 보아 확인했다.
T1 라인의 착색이 확인된 경우, C28주에 특이적으로 존재하는, 서열번호 2에 나타내는 삽입 염기서열이 주형 DNA에 포함되어 있던 것을 나타내고, C28주에서 유래하는 핵산 증폭산물이 얻어진 것을 나타낸다.
결과를 표 5(표 5-1 및 표 5-2), 도 2에 나타낸다. 표 5에 있어서, 착색이 확인된 경우에는 「+」, 확인되지 않은 경우에는 「-」라 표기했다.
[표 5-1]
Figure pct00007
[표 5-2]
Figure pct00008
시험의 결과, 구축한 크로마토그래피 검출계는, 마이코박테로이데스 압세수스 컴플렉스의, erm(41) 유전자의 제28위가 시토신인 주(C28주)를 특이적으로 검출 가능하고, T28주나 기타의 항산균종과 교차 반응이 없는 것이 확인되었다.
<실시예 2>
C28주의 게놈 DNA에 특이적으로 존재하는 서열번호 2의 삽입 염기서열의 서열 정보를 기초하여, C28주를 특이적으로 검출하는 프라이머를 설계했다. 각 프라이머는, 삽입 염기서열 중의 부분 염기서열에 특이적으로 하이브리다이즈하고, C28주 유래 DNA가 검체 중에 포함되는 경우에 핵산 증폭 반응이 발생하도록 설계했다. 설계한 프라이머를 사용해서 PCR을 행하고, 핵산 증폭산물을 아가로오스 겔 전기 영동법에 의해 해석함으로써, C28주를 특이적으로 검출할 수 있는지 검증했다.
[표 6]
Figure pct00009
(I) PCR
표 6에 기재된 서열번호 18 및 19를 포함하는 제2 프라이머 세트, 서열번호 20 및 21을 포함하는 제3 프라이머 세트, 서열번호 22 및 23을 포함하는 제4 프라이머 세트, 서열번호 24 및 25를 포함하는 제5 프라이머 세트, 서열번호 26 및 27을 포함하는 제6 프라이머 세트, 서열번호 28 및 29를 포함하는 제7 프라이머 세트,를 각각 사용하여, TaKaRa TaqHS perfect Mix의 매뉴얼에 따라, 하기의 PCR용 반응액을 조제했다.
[표 7]
Figure pct00010
주형 DNA로서, 마이코박테로이데스 압세수스 ATCC19977 및 마이코박테로이데스 압세수스 LRC18036으로부터 각각 조제한 정제 게놈 DNA를 사용했다. 마이코박테로이데스 압세수스 ATCC19977은 T28주이며, 마이코박테로이데스 압세수스 LRC18036은 C28주이다. 염기서열 정보로부터, 제2 프라이머 세트를 사용해서 마이코박테로이데스 압세수스 LRC18036의 게놈 DNA를 주형으로 해서 PCR을 실시하면, 336bp의 영역이 특이적으로 핵산 증폭산물로서 얻어진다고 추정된다. 제3 프라이머 세트를 사용해서 마찬가지로 PCR을 실시하면, 940bp의 영역이 특이적으로 핵산 증폭산물로서 얻어진다고 추정된다. 제4 프라이머 세트를 사용해서 마찬가지로 PCR을 실시하면, 1040bp의 영역이 특이적으로 핵산 증폭산물로서 얻어진다고 추정된다. 제5 프라이머 세트를 사용해서 마찬가지로 PCR을 실시하면, 51bp의 영역이 특이적으로 핵산 증폭산물로서 얻어진다고 추정된다. 제6 프라이머 세트를 사용해서 마찬가지로 PCR을 실시하면, 479bp의 영역이 특이적으로 핵산 증폭산물로서 얻어진다고 추정된다. 제7 프라이머 세트를 사용해서 마찬가지로 PCR을 실시하면, 698bp의 영역이 특이적으로 핵산 증폭산물로서 얻어진다고 추정된다. 한편, T28주인 마이코박테로이데스 압세수스 ATCC19977의 게놈 DNA를 주형으로 해서 PCR을 실시하면, 제2 내지 제7 프라이머 세트의 어느 것을 사용해도 핵산 증폭산물이 얻어지지 않는다고 추정된다.
네거티브 컨트롤로서는, 상기 주형 DNA 용액 대신에 멸균 증류수를 1μL 사용한 것 이외에는 마찬가지 조성의 PCR 반응액을 조제했다. 5μM Fw 프라이머 용액 및 5μM Rv 프라이머 용액은 소정의 프라이머를 5μM의 농도가 되도록 멸균 증류수 중에 용해시킨 것을 사용했다.
PCR 반응액을, PCR 장치(Bioer사, LifeEco)에 세트하고, 94℃에서 1분간 반응 후, 94℃-5초/62℃-10초/72℃-5초의 사이클을 35회 반복했다. 반응 후의 PCR 반응액을 아가로오스 겔 전기 영동 해석에 제공하여, 핵산 증폭산물의 유무를 검출했다. 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3 중, A는 제2 프라이머 세트, B는 제3 프라이머 세트, C는 제4 프라이머 세트, D는 제5 프라이머 세트, E는 제6 프라이머 세트, F는 제7 프라이머 세트를 사용한 PCR의 증폭산물을, 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 검출한 결과를 나타낸다.
시험의 결과, 어느 프라이머 세트를 사용한 경우도, 마이코박테로이데스 압세수스 컴플렉스의 C28주(마이코박테로이데스 압세수스 LRC18036) 유래 DNA가 검체 중에 포함되는 경우만 특이적인 핵산 증폭산물이 아가로오스 겔 전기 영동 해석에 의해 확인되었다. 이 결과로부터 서열번호 2에 나타내는 삽입 염기서열의 유무를 검출함으로써, C28주를 특이적으로 검출 가능한 것이 확인되었다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에 편입시킬 수 있는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> JAPAN AS REPRESENTED BY DIRECTOR-GENERAL OF NATIONAL INSTITUTE OF INFECTIOUS DISEASES Kaneka Corporation <120> Method of detecting a single base mutation in erm(41) gene of Mycobacterium abscessus complex, and a probe and a primer set used for the method <130> B190585 <150> JP 2020-066277 <151> 2020-04-01 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 522 <212> DNA <213> Mycobacterium abscessus <400> 1 gtgtccggcc aacggtcgcg acgccagtgg ggctggtatc cgctcactga tgactgggcg 60 gcgcggatcg tcgccgaatc cggtgttcgc tcaggggagt tcgttgtgga tctgggcgca 120 ggacacggcg cgctgacggc acatctggtt gccgctggtg ccagggtgct agccgtcgag 180 ctgcatccgg ggcgggctcg acaccttcgt tcacggtttg ccgaggaaga tgtccggata 240 gcggaagcgg acctgctcgc cttccggtgg ccgcgacggc catttcgggt ggtggcgagc 300 ccgccctacc aagtcaccag cgcactgata cggagtctct tgacgccgga atcccggctg 360 ctggctgccg acctggtgct gcagcgcggg gctgtgcaca aacatgcgaa gcgagcacct 420 gttcgccatt ggacgctacg ggccggaatc acattgccgc gaagcgcttt ccatcatcca 480 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cttgcggcag tgtgcgcagt agcggcagga 540 catcaggcgg ttctccctcc ctgggcttgc gcccagctga cgtgacgcgg gcagggcttg 600 agtccgtcat cgacttcgat ccggcccaag tcgtcgcaat ccgggcagtc ccgaatcacc 660 tgcacggctg cgcgtttgcg ttcggcctcc gacgccgtgg cagccttgcg cagcgctgcg 720 cagtcgcggc agctctcacc cacccaggca tcaggtgcga tgtgcgcgtg cttggcgcaa 780 cgcgtccccg tctcattgcc gttagctgat tgccgccctc ggctggcggg ggtgatcgcg 840 taggcgtccg ggtcgtcaag ttccgtaccc ccataacgca accccctctt ttgatgtggt 900 cctgatgtgg tggggggcac cgccgtgcgg gtcaaagagg caccgccgta cgggctatcg 960 gaccgttgac ccgcaccgct gtgcgggctt tggctgtttt gacccgcacg gccatgcggg 1020 gtatcaccgt tttgacccgc accgccatgc ggggtatttg cgatcggaac cagccgatac 1080 acggcggcat gacgcttgaa tccgtttgct gtgcgctgga tgagccccag ctcgcggcct 1140 cgcttgagcg ccgtttccac agcccgttcg gtgagcccgc atttccgcat gagcccttct 1200 attccaggcc gcgcgttggt gccgtccgcg tagtcggcga acgtctcaag cgccaggaga 1260 actatccgct gggccaacgt cagggccttg gccccgagaa cataatcgcg ccagtcacgg 1320 cgctgctctg gcgtcacg 1338 <210> 9 <211> 164 <212> DNA <213> Mycobacterium abscessus <400> 9 gtaagccgcc ctgtgcgtca gcaggcaatg cacggcttcg gctagcgcgc acgctggcgt 60 gcaactgggc cgcgcgatgc acgtcgcagc gcacaacagg gcgcacacca tcacgcaccg 120 tgacgcacaa ctcgtgcact cccccaggcc catcgggcag ccga 164 <210> 10 <211> 892 <212> DNA <213> Mycobacterium abscessus <400> 10 ccaacaagcc cgccgcccaa tggtgcccgt gcgcactcac gcagaggcat cgcgctccac 60 cgcgtgatga gtgcaatctg ttccgatcac aaggactcca cgacctcagc ggcggcgcgc 120 agcgcatcag tcaggcgtcg cgccgcgctc gcttccatcc agtcctcgac accattgacc 180 caacgcacgc cccactcaac cgaaccatct gcggcctgct gggtgccctc tatgagcaca 240 tgccccaagc cctcgcccac ctcgaaccgg gcgccctcta gcctgcgccc ccagtccggc 300 gattccttag agcccatgtt catccactgg tcagcatgtg aggcttgagc tgggatcggc 360 acatgcgcga accggatacc agcttgatgc gtctcgatat cgagggtgat cttgaaaagg 420 agactcaacg ctgcgttgtc ggcctgactc gtggcccgcc atggcgtgac cccagccgcc 480 gccaactcct cggcgcgctc caactgcgct acccagtcag ccggtagtcg atcaaccaag 540 tcacgccatg tccgggtgtc gtcgccaaat tcgatctgta ccatgagatt tacctacttt 600 ctgttgatgg ttggttgcag cggctcccgc ccgacgttgc cgcgtcgggg actacggggg 660 ccgttggcat agccgaactt gtgccgacga gctgaacttg tgcgcgatat tcgcgcttgg 720 ccccgtcagc gtcggtcacg gtcaccgtga tcacatcgcc ctcggcctcc acgctggccg 780 tggaattcgg aaccaccttg ccatcccgaa taatgcatgg cgacaaggga acccacggct 840 cttgcgctag ccgcgccgcg atcctgtacg cctcgatact cacgccgcgc ct 892 <210> 11 <211> 849 <212> DNA <213> Mycobacterium abscessus <400> 11 tcaagcttgg cgatgtactc gttgatctgc ctgtcagtgc tgaatcggcg cttaccaatc 60 ctcacgctgg cgagggcacc agagtgccag agctggaaca ccagcgttct gctgatacct 120 ccgagctttg cccccactgc cttgtggtcg tgcattgcgt cctcctccgt tcatggctgc 180 ttgtgcgttc aaacacgcag acatccgata agttgcgttt ctgcgactca atagatacca 240 ggcggatggc aatgaacgca agcagtgcat atcctgcgtg tcatgacgca atcagggccg 300 aaaaggccga gttggacgga acggccgccc gacagctggg cggaacgtga agcgcataga 360 ttggcgcgcg aggtttaccg gcttcgcgga aagaggtcag cgcagtggct tgcggctcgg 420 accaaggaac tcggccacga agtatcccgt tcggtgattt ccgatttgga gaatgggcga 480 cgtaggtatg tcacgaccgc tgagctagta atactcgctg ccgcactcga tacgtcccca 540 gtaacgctga tgtaccccgg cccgtattcc gattcggtgg aatttctacc tgaacgagaa 600 gttccggaat tcgatgcagc gcagtggttt tcggcaaacg ggtggtcgca agagctagcg 660 agtgcgttcg acggcgattt cggatttgct tggcgcacag atcagcttcg ccaatggcga 720 cgcctggcgg aattggaaga tgcccgcgcc cgcgtgacgg cgcgagccga acttgaccgt 780 gaccgcgatc aaatcgaaat gtacgacaga atgattcgcg aattgtggca acaaatcgag 840 ggtaacgag 849 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> C28-f primer <400> 12 tcctcggaat cggcactgtc cgttg 25 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> C28-r primer <400> 13 tacagcagct caacagtgac accgaag 27 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> tag <400> 14 tggcaacatt tttcactggg tttatag 27 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> tag <400> 15 tgcatcgagt gacagctaat gtgtgat 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> tag <400> 16 ctataaaccc agtgaaaaat gttgcca 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> tag <400> 17 atcacacatt agctgtcact cgatgca 27 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 1-C28-1f primer <400> 18 gcgcgatgag acaggtcacc cg 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 1-C28-1r primer <400> 19 gcagtctctg tgacggtcac 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 1-C28-2f primer <400> 20 gacgcagata cgatggtgca 20 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 1-C28-2r primer <400> 21 tgaaaccggc tgctggtgcg atgtg 25 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 2-C28-1f primer <400> 22 cttcagcggc agcttcaagc 20 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 2-C28-1r primer <400> 23 ttgcacccaa tgcgccacgg gag 23 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 3-C28-1f primer <400> 24 cgcaccgtga cgcacaactc g 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 3-C28-1r primer <400> 25 tcggctgccc gatgggcctg 20 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 4-C28-1f primer <400> 26 tcaagcttgg cgatgtactc gtt 23 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 4-C28-1r primer <400> 27 cgcccattct ccaaatcgga aatcac 26 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 4-C28-2f primer <400> 28 gcattgcgtc ctcctccgtt catgg 25 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 4-C28-2r primer <400> 29 ctcgttaccc tcgatttgtt gccac 25 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T28-1f primer <400> 30 gatgagtgcg cccgaag 17 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T28-1r primer <400> 31 tctactcgtc gccgcttg 18

Claims (13)

  1. 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신인지 티민인지를 판정하는 방법이며,
    상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 시토신의 경우에 게놈 DNA의 상기 erm(41) 유전자 이외의 영역에 존재하고, 티민의 경우에 존재하지 않는 지표 염기서열을, 판정 대상의 상기 항산균의 게놈 DNA에 있어서 검출하는 것
    을 포함하고,
    상기 지표 염기서열이 검출되는 것이, 상기 항산균의 게놈 DNA 중의 상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 시토신인 것을 나타내고,
    상기 지표 염기서열이 검출되지 않는 것이, 상기 항산균의 게놈 DNA 중의 상기 erm(41) 유전자의 상기 염기가 티민인 것을 나타내는,
    방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 지표 염기서열이, 서열번호 2의 염기서열에 포함되는 연속한 10염기 이상의 제1 염기서열 또는 상기 제1 염기서열에 상보적인 제2 염기서열인, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1 염기서열이, 서열번호 3, 5, 7, 9 또는 11의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열을 적어도 일부에 포함하는, 방법.
  4. 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신의 경우에 게놈 DNA의 상기 erm(41) 유전자 이외의 영역에 존재하고, 티민의 경우에 존재하지 않는 지표 염기서열을 검출하기 위한 프라이머 세트이며,
    상기 지표 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 부분 염기서열 f11의 상보 염기서열과 하이브리다이즈 가능한 염기서열 f12를 3'말단에 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머와,
    상기 지표 염기서열에 포함되고, 상기 부분 염기서열 f11의 3'말단보다 3'말단측에 위치하는, 연속한 10염기 이상의 부분 염기서열 r11과 하이브리다이즈 가능한 염기서열 r12를 3'말단에 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머
    를 포함하는, 프라이머 세트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 지표 염기서열이, 서열번호 2의 염기서열에 포함되는 연속한 20염기 이상의 제3 염기서열인, 프라이머 세트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제3 염기서열에 포함되는, 상기 부분 염기서열 f11의 5'말단의 염기로부터, 부분 염기서열 r11의 3'말단의 염기까지의 염기서열이, 서열번호 3, 5, 7, 9 또는 11의 염기서열에 포함되는, 연속한 20염기 이상의 염기서열을 적어도 일부에 포함하는, 프라이머 세트.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 부분 염기서열 f11이,
    (f11-12-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4624 내지 4668위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (f11-18-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2356 내지 2397위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (f11-20-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2624 내지 2663위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (f11-22-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4044 내지 4083위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (f11-24-1) 서열번호 2의 염기서열의 제6535 내지 6575위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (f11-26-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7478 내지 7520위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열, 또는
    (f11-28-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7629 내지 7673위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열
    이고,
    상기 부분 염기서열 r11이,
    (r11-13-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4694 내지 4740위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (r11-19-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2672 내지 2711위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (r11-21-1) 서열번호 2의 염기서열의 제3539 내지 3583위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (r11-23-1) 서열번호 2의 염기서열의 제5061 내지 5103위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (r11-25-1) 서열번호 2의 염기서열의 제6566 내지 6605위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (r11-27-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7931 내지 7976위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열, 또는
    (r11-29-1) 서열번호 2의 염기서열의 제8302 내지 8346위의 범위의 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열
    인,
    프라이머 세트.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 프라이머 및 상기 제2 프라이머의 한쪽이, 표지 물질과 결합 가능한 태그 또는 표지 물질인 표지부를 더 포함하고, 다른 쪽이, 고상 담체와 결합 가능한 태그인 결합부를 더 포함하는, 프라이머 세트.
  9. 제8항에 기재된 프라이머 세트와,
    상기 결합부와 결합 가능한 부분을 적어도 일부에 포함하는 고상 담체를 포함하는,
    마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신의 경우에 게놈 DNA의 상기 erm(41) 유전자 이외의 영역에 존재하고, 티민의 경우에 존재하지 않는 지표 염기서열을 검출하기 위한, 키트.
  10. 마이코박테로이데스·압세수스·컴플렉스에 속하는 항산균에 있어서, erm(41) 유전자의, 서열번호 1의 염기서열의 제28위에 상당하는 염기가 시토신의 경우에 게놈 DNA의 상기 erm(41) 유전자 이외의 영역에 존재하고, 티민의 경우에 존재하지 않는 지표 염기서열을 검출하기 위한 프로브이며,
    상기 지표 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 부분 염기서열 p1과 하이브리다이즈 가능한 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 프로브.
  11. 제10항에 있어서, 상기 지표 염기서열이, 서열번호 2의 염기서열에 포함되는 연속한 10염기 이상의 제1 염기서열 또는 상기 제1 염기서열에 상보적인 제2 염기서열인, 프로브.
  12. 제11항에 있어서, 상기 부분 염기서열 p1이, 서열번호 3, 5, 7, 9 또는 11의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열을 적어도 일부에 포함하는, 프로브.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 부분 염기서열 p1이,
    (p1-12-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4624 내지 4668위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (p1-18-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2356 내지 2397위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (p1-20-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2624 내지 2663위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (p1-22-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4044 내지 4083위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (p1-24-1) 서열번호 2의 염기서열의 제6535 내지 6575위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (p1-26-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7478 내지 7520위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (p1-28-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7629 내지 7673위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (p1-13-1) 서열번호 2의 염기서열의 제4694 내지 4740위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (p1-19-1) 서열번호 2의 염기서열의 제2672 내지 2711위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (p1-21-1) 서열번호 2의 염기서열의 제3539 내지 3583위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (p1-23-1) 서열번호 2의 염기서열의 제5061 내지 5103위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (p1-25-1) 서열번호 2의 염기서열의 제6566 내지 6605위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열,
    (p1-27-1) 서열번호 2의 염기서열의 제7931 내지 7976위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열, 또는
    (p1-29-1) 서열번호 2의 염기서열의 제8302 내지 8346위의 범위의 염기서열 또는 그 상보 염기서열에 포함되는, 연속한 10염기 이상의 염기서열
    인, 프로브.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3859678B2 (ja) 2005-04-18 2006-12-20 英二 戸島 食事用エプロン
WO2013136818A1 (ja) 2012-03-15 2013-09-19 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 マクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法及び検出キット
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2012070618A1 (ja) 2010-11-24 2014-05-19 株式会社カネカ 増幅核酸検出方法及び検出デバイス
JP7123734B2 (ja) 2018-10-22 2022-08-23 Ｔｏｙｏ Ｔｉｒｅ株式会社 空気入りタイヤ

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3859678B2 (ja) 2005-04-18 2006-12-20 英二 戸島 食事用エプロン
WO2013136818A1 (ja) 2012-03-15 2013-09-19 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 マクロライド系抗生物質耐性変異菌の検出方法及び検出キット
JP2019097493A (ja) 2017-12-04 2019-06-24 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 非結核性抗酸菌３亜種を識別できるプライマーセット、及び、非結核性抗酸菌３亜種の識別方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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J Antimicrob Chemother 2017; 72: 1669-1677

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