JPH08298A - 臨床材料中のキノロン−耐性スタフイロコツカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)病原体の検出のための迅速DNA試験 - Google Patents

臨床材料中のキノロン−耐性スタフイロコツカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)病原体の検出のための迅速DNA試験

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JPH08298A
JPH08298A JP7176891A JP17689195A JPH08298A JP H08298 A JPH08298 A JP H08298A JP 7176891 A JP7176891 A JP 7176891A JP 17689195 A JP17689195 A JP 17689195A JP H08298 A JPH08298 A JP H08298A
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gyrase
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Klaus-Dieter Dr Bremm
クラウス−デイーター・ブレム
Rainer Endermann
ライナー・エンデルマン
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    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は、臨床試料材料中のキノロン−耐性
スタフィロコッカス・アウレウス病原体を迅速に検出す
るためのスターターオリゴヌクレオチド(プライマ
ー)、DNAプローブ及び試験法につき記載する。 【効果】 臨床試料中のキノロン−耐性に関する分析を
便利に行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】本発明は臨床試料材料中のキノロン−耐性
スタフィロコッカス・アウレウス(Staphyloc
occus aureus)病原体を迅速に検出するた
めのスターターオリゴヌクレオチド(プライマー)、D
NAプローブ及び試験法を記載する。
【0002】フルオロキノロン類は問題の多いバクテリ
ア感染症の処置のための有力な抗バクテリア剤である。
メチシリン−耐性スタフィロコッカス類による感染症も
フルオロキノロン類、例えばシプロフロキサシンを用い
て処置することができる。
【0003】しかし、例えばナリジクス酸などの以前の
キノロン類の場合と同様にフルオロキノロン類に耐性の
スタフィロコッカス・アウレウス株がより頻繁に見いだ
される。
【0004】同時に、多くの病院がフルオロキノロン類
にも耐性となってしまったメチシリン−耐性スタフィロ
コッカス類の問題を経験している。メチシリン−耐性及
びキノロン−耐性スタフィロコッカス類による感染症に
対してわずかな抗バクテリア剤しか有効でないという観
点から、フルオロキノロン耐性の増加は特に重要であ
る。
【0005】従って可能な限り初期の段階に有効な抗生
物質を用いた治療を開始することが特に重要である。キ
ノロン−耐性スタフィロコッカス(Staphyloc
occi)類の古典的診断は時間がかかり、労力がかか
り、平板上で株を試験管内培養し、その後例えば“ap
i staph”(BioMerieux)などの試験
系を用いて生理学的に同定し、連続希釈試験(MIC
値)又は寒天拡散試験(阻止領域試験)を用いて抗生物
質耐性を決定することが必要である。ここで提供される
代替法は、QRSAジャイレース(gyrase)に基
づく遺伝子試験の開発であり、この試験は試験管内培養
を行わずに試料材料における直接の迅速な診断を可能に
する。
【0006】シプロフロキサシンは、酵素DNAジャイ
レースのA2B2テトラマー構造を阻害する4−キノロ
ン抗生物質である。DNAジャイレースは、DNA二本
鎖における過渡的切断を触媒することによりDNAのね
じれをもたらす。
【0007】ジャイレースAサブユニットにおける突然
変異はスタフィロコッカス・アウレウスのキノロン耐性
の分子的原因であることが示された(Sreedhar
an,S.,M.Oram,B.Jensen,L.
R.Peterson,L.M.Fisher,J.B
acteriol.7260−7262,1990)。
膜−付随輸送機構に影響を与え、それにより抗生物質の
吸収及び内部蓄積を妨害するノルA遺伝子における突然
変異(Yoshida,H.,M.Bogaki,
S.,Nakamura,K.Ubukata,N.K
onno,J.Bacteriol.172,6942
−6949,1990)はさらに加えられる原因となっ
ている。これに加えて、まだ知られていない機構により
キノロン耐性をもたらす別の遺伝子座における突然変異
が記載されている(Trucksis,M.,J.S.
Wolfson,D.C.Hooper,J.Bact
eriol.173,5854−5860,199
0)。
【0008】スタフィロコッカスのジャイレースA遺伝
子のセリン84及びセリン85コドンにおいて記載され
ている点突然変異はシプロフロキサシン耐性を伴うの
で、これらの点突然変異を含む2394〜2658のヌ
クレオチド領域をさらに詳細に調べた。
【0009】メチシリン及びシプロフロキサシンに関し
て異なるMIC値を有する50のキノロン−耐性スタフ
ィロコッカス・アウレウス単離物に関する我々の研究に
おいて、我々はHultman T,Stahl,
S.,Hornes,E.,Uhlen,M.Nucl
eic Acids Res.17,4937−494
6,1989の修正法を用い、磁気ビーズを用いたPC
R配列決定法により、ジャイレースA中に4つの型の突
然変異を検出した(表1を参照)。位置2540におけ
る点突然変異に基づくさらに別の型の突然変異は、タン
パク質のレベルでアミノ酸置換を生じず、ジャイレース
の耐性への影響を有していない。突然変異の3つに基づ
き、C/T、T/G及びG/A突然変異を検出するため
の点突然変異−特異的増幅試験を開発した。
【0010】この試験はシプロ耐性に関連するスタフィ
ロクッコス・アウレウスにおけるジャイレース突然変異
のすべてを検出する。
【0011】
【表1】
【0012】4〜128μg/mlのMIC値を有する
150種のキノロン−耐性ステフィロコックス類(QR
SA)(表1中の株を含む)(表2も参照)をこの遺伝
子試験を用いて分析した。株の92.1%が位置253
3における突然変異C/Tを有する。4つの株(2.6
%)が位置2532における突然変異T/Gを有し、3
つの株(2%)が位置2544における突然変異G/A
を有する。5つの株(3.3%)が、続いてこれらの株
につき行ったPCR配列決定により確証される通り、ジ
ャイレース中に位置していない他の突然変異を有する。
【0013】かくして3つの突然変異の検出に基づくこ
の試験に関し、かくして96.7%の検出感度が得られ
る。
【0014】
【表2】
【0015】
【表3】
【0016】
【表4】
【0017】本発明は臨床試料材料において直接キノロ
ン−耐性スタフィロコッカス類を迅速に検出するための
特異的なプライマー、ならびにオリゴフクレオチドプロ
ーブ及びポリヌクレオチドプローブ、ならびにそれらの
利用につき記載する。
【0018】1.プライマーはジャイレースA遺伝子の
遺伝子配列から化学的合成により製造した。
【0019】好ましいプライマーは、 a)突然変異型C/Tに特異的(プライマー1、配列番
号:1) b)突然変異型T/Gに特異的(プライマー2、配列番
号:2) c)突然変異型G/Aに特異的(プライマー3、配列番
号:3) d)相補鎖プライマーとしてキノロン−耐性及び感受性
ジャイレースに特異的(プライマー4、配列番号:4) である領域から選択された。
【0020】2.オリゴヌクレオチドプローブは領域2
553〜2588から化学的合成により製造した(配列
番号:5)。この領域はすべてのプライマーにより増幅
され、S.アウレウスに特異的である。別のポリヌクレ
オチドプローブ(配列番号:6)は、ヌクレオチド領域
2515〜3048をPCR増幅することにより製造し
た。
【0021】3.キノロン−耐性株のゲノムDNAは、
スタフィロコッカス類に適合させた核酸法を用いて単離
した。
【0022】4.ジャイレースA遺伝子の部分を、3’
末端に耐性突然変異の塩基(Cの代わりにT、Gの代わ
りにG)を有するコード領域からの特異的プライマー1
〜3、及びすべての増幅のための相補鎖プライマーとし
て用いられるジャイレースA遺伝子の非コード鎖からの
特異的プライマー4を用いて増幅した。
【0023】5.増幅は既知の増幅法、好ましくはPC
R DNA増幅法(EP 200362)を用いて行っ
た。
【0024】6.特異的増幅産物を a)アガロースゲルにおける増幅産物の直接電気泳動及
びエチジウムブロミドなどの挿入剤を用いた染色、 b)増幅の間に蛍光ヌクレオチド又は蛍光−標識プライ
マーで標識された増幅産物の蛍光の決定。増幅産物はや
はり挿入された(プライマーからヌクレオチドに)ビオ
チンを用いて分離される。
【0025】c)増幅の間に標識された増幅産物の、上
記のビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブへのハイ
ブリッド形成。ハイブリッド形成複合体はストレプタビ
ジン−塗布磁気粒子を用いて分離される。
【0026】d)形成されたハイブリッド形成複合体
を、アルカリ性ホスファターゼにカップリングさせた抗
ジゴキシゲニン抗体を用いた化学発光試験によりキノロ
ン−耐性スタフィロコッカス類の量又は存在の尺度とし
て評価することにより検出する。
【0027】外部、共−増幅スタフィロコッカスDNA
鎖が用いられる場合、臨床試料材料中のキノロン−耐性
スタフィロコッカス類の量を確定するために、評価を半
定量的に用いることができる。
【0028】特に増幅法と結び付けられた遺伝子−プロ
ーブ診断は迅速で特異的で感度の高い方法であり、DN
A/RNAレベルにおける病原体の初期の同定を可能に
する。方法は、試験管内培養を行わずに研究中の材料に
つき直接行うことができる。方法はDNA/RNAハイ
ブリッド形成法、すなわちWatson−Crick塩
基対の形成を伴う相補的1本鎖核酸の特異的試験管内結
合に基づく。形成されるDNA/DNA又はDNA/R
NA2本鎖は、ハイブリッドと呼ばれる。ハイブリッド
形成反応による病原体の特異的DNA又はRNAの検出
に、相補的な、配列特異的遺伝子プローブが用いられ
る。これらの遺伝子プローブは長さが10〜50ヌクレ
オチドの化学的に合成された短いオリゴヌクレオチドプ
ローブであるか、又は組み換え遺伝子法により製造され
た0.5〜10kbのDNA/RNAフラグメントであ
る。
【0029】遺伝子プローブに、光化学的に(N.Da
ttagupta,P.M.M.Rae,E.D.Hu
guenel,E.Carlson,A.Lyga,
J.S.Shapiro,J.P.Albarell
a,Analytical Biochem.177,
85,1989)又はニックトランスレーションにより
酵素的に(Rigby,P.W.J.et al,J.
Mol.Biol.113,237,1977)又はラ
ンダムプライム法(random primedtec
hniques)により(Feinberg and
Vogelsteil,Anal.Biochem.1
32,6,1983)、放射性又は非放射性標識を与え
ることができる。32P−NTPsを用いた標識又はジゴ
キシゲニン−dUTP、ビオチン−dUTPもしくはフ
ルオレセイン−dUTPを用いた非放射性標識、あるい
はアルカリ性ホスファターゼ又はホースラディッシュ
パーオキシダーゼなどの酵素を用いた直接標識がこの目
的に適している。
【0030】検出するべき病原体の核酸及び病原体−特
異的遺伝子プローブの間の特異的ハイブリッド形成を達
成するために、最初に核酸を変性(熱又はアルカリ処
理)により1本鎖に分離し、次いで温度、緩衝液のイオ
ン強度及び有機溶媒により達成される緊縮条件下で非常
に特異的に互いにハイブリッド形成させる。適したハイ
ブリッド形成条件下で、遺伝子プローブは検出するべき
DNA又はRNAの相補的配列のみに結合する。このハ
イブリッド形成反応は、例えばニトロセルロースなどの
支持体にカップリングさせた標的DNA又は遺伝子プロ
ーブの固相ハイブリッド形成として、あるいは液体ハイ
ブリッド形成として多様な試験形態で行うことができ
る。評価(読み取り)は、遺伝子プローブを上記のリポ
ーター分子で標識することにより、又はここで示される
逆相ハイブリッド形成系におけるように増幅の間にジゴ
キシゲニン−dUTPで標識された標的DNA、及び磁
気粒子に結合するようにビオチンで標識した遺伝子プロ
ーブを用いることにより行われる。標的DNA及び標識
遺伝子プローブを含むハイブリッド形成複合体は、非−
結合遺伝子プローブが除去されると、用いられるリポー
ター分子を用いて定量的に測定される。この読み取り
は、蛍光標識又は放射性標識の場合は直接、あるいは酵
素試験により、及びアルカリ性ホスファターゼなどの酵
素を含み、発色反応又は化学発光反応を可能にする抗体
共役体を用いた免疫学的方法を用いて間接的に行うこと
ができる。
【0031】この遺伝子−プローブ診断を用いて達成さ
れる試験感度は、1つの遺伝子の検出に基づいて105
〜106の微生物の範囲である。試験感度は、試験をD
NA又はRNA増幅法、例えばPCR(EP 2003
62)、LCR(EP 320308)、NASBA
(EP 329822)、QB(PCT 87/062
70)又はHAS(EP 427074)法と組み合わ
せることにより向上させることができる。これらの方法
を用い、検出するべきDNAを最高109倍とすること
ができる。このようにして、増幅及びハイブリッド形成
を組み合わせることにより、各DNA分子を検出するこ
とが可能になる。
【0032】感染症における血液中では101〜103
生物/mlという生物数が見いだされ、この方法は初期
の段階でキノロン−耐性感染症を認識する可能性を与え
る。これに加え、本発明はこれらのプライマー、オリゴ
ヌクレオチドプローブ及びポリヌクレオチドプローブの
利用、ならびに臨床試料材料中のシプロ耐性ステフィロ
コックス類の検出のための試験法につき記載する。この
方法の他の利点は、それが試料材料中のキノロン−耐性
感染性生物の量を半定量的に決定する可能性を与えるこ
とである。
【0033】プライマーの選択及び合成 ジャイレースA遺伝子又は表1に挙げたキノロン−耐性
スタフィロコッカス・アウレウス単離物のヌクレオチド
配列を、適した特異的プライマーの選択に用いた。これ
らの突然変異配列及び野生型ヌクレオチド配列(E.
E.C.Margerrison,R.Hopewel
l,L.M.Fisher,J.Bacteriol.
1596−1603,1992)に基づき、3’末端に
点突然変異の塩基を有するプライマーを選択した。突然
変異型C/Tの場合、配列番号:1のプライマーを合成
した。突然変異型T/Gの場合、配列番号:2のプライ
マー2を合成した。突然変異型G/Aの場合、配列番
号:3のプライマーを合成した。すべてのプライマーの
セット(プライマー1+4、2+4及び3+4)に共通
の配列番号:4のプライマー4を、突然変異を有する配
列の増幅のための相補鎖プライマーとして合成した。
【0034】選択されたプライマーをS.L.Beau
cage and M.Caruthers,Tetr
ahedron Letters,22,1859,1
981のホスホルアミダイト法を用いて化学的に合成し
た。
【0035】ゲノムQRSA DNAの増幅 ジャイレースA遺伝子の部分を増幅するために、上記の
プライマーをそれぞれの場合にプライマーセット1(プ
ライマー1+4)、プライマーセット2(プライマー2
+4)及びプライマーセット3(プライマー3+4)と
して用い、QRSAジャイレースの3つの突然変異型を
特異的に増幅した。キノロン−感受性ジャイレース遺伝
子のゲノムDNAの場合に用いると、それらはアガロー
スゲルにおいて可視の増幅産物を与えない。3つのプラ
イマーセットを用いた場合、それぞれ対応する突然変異
を有するジャイレース遺伝子を含むゲノムDNAは強い
増幅バンドを与え、それによりキノロン耐性のみでな
く、同時にジャイレース中に存在する点突然変異も示
す。
【0036】PCR増幅の間に、4つのdNTPs(デ
オキシアデノシン トリホスフェート、デオキシグアノ
シン トリホスフェート、デオキシシチジン トリホス
フェート及びチミジン トリホスフェート)の他に例え
ばジゴキシゲニン−dUTPも増幅産物中に挿入するこ
とができる。その結果増幅産物は、アルカリ性ホスファ
ターゼにカップリングさせた抗−ジゴキシゲニン抗体を
用い、例えば基質としてAMPPDを用いた化学発光試
験により、あるいはブロモクロロインドイルホスフェー
ト及びニトロブルーテトラゾリウムもしくはパラ−ニト
ロフェニルホスフェートを用いた染色試験により読み取
ることができる。
【0037】別の場合、蛍光−標識ヌクレオシド トリ
ホスフェート、例えばフルオレセイン−dUTP又はク
マリン−dUTPsを増幅産物に挿入し、それによりエ
チジウムブロミド染色を用いた場合よりずっと高い感度
で増幅産物を同定できる可能性がある。次いで、ビオチ
ニル化プライマーを用いた場合、蛍光−標識ビオチニル
化増幅産物をストレプタビジン−塗布磁気粒子を用いて
分離し、蛍光光度計でそれを定量的に測定する可能性が
ある。
【0038】オリゴヌクレオチドプローブの選択及び合
成 プライマーセットの増幅産物に関して特異的なオリゴフ
クレオチドプローブを、3つの突然変異−特異的増幅産
物のすべてに共通な領域2553〜2588から選択し
た。配列番号:5の配列を有し、3つの増幅産物に関し
て特異的な36量体を合成した。
【0039】それを、S.L.Beaucage an
d M.Caruthers,Tetrahedron
Letters,22,1859,1981のホスホ
ルアミダイト法を用いて化学的に合成した。
【0040】オリゴヌクレオチドプローブは突然変異−
特異的増幅産物に特異的にハイブリッド形成することが
できる。ジャイレースA遺伝子の部分を最初に突然変異
−特異的プライマーを用いて増幅し、次いで増幅産物を
特異的にオリゴフクレオチドプローブにハイブリッド形
成させる方法は、直接的な増幅診断と比較して以下の利
点を有する:増幅産物をゲルにおいて直接読み取る場
合、試験感度は1mlの試料材料当たり約1000生物
である。対照的に、オリゴヌクレオチドプローブへのハ
イブリッド形成及び化学発光読み取りの組み合わせの場
合、1mlの試料材料当たり10生物の検出が達成され
る。
【0041】代りのポリヌクレオチドプローブの選択及
び合成 オリゴヌクレオチドプローブの代わりに534塩基のポ
リヌクレオチドプローブを、突然変異−特異的増幅産物
のすべてに共通のヌクレオチド配列2515〜3048
から選択した。ポリヌクレオチドプローブは、プライマ
ー1(配列番号:1)及びプライマー4(配列番号:
4)を用いたPCR増幅により合成した。増幅の間に化
学発光試験のためのビオチン−dUTPを同時に増幅遺
伝子プローブ中に挿入した。
【0042】QRSAの検出 本発明に記載の3つのプライマーセットを用いたジャイ
レースA遺伝子の部分の増幅の直後に、いずれかの所望
の分析法を用いてQRSAを決定することができる。
【0043】1つの可能な読み取り法は、アガロースゲ
ル電気泳動により分離された増幅産物をエチジウムブロ
ミドなどの挿入剤を用いて染色することから成る。
【0044】別の可能性は、蛍光−標識ヌクレオシドト
リホスフェートを増幅産物中に挿入することである。こ
れは試験感度を顕著に向上させる。
【0045】さらに別の可能性は、増幅に蛍光−標識プ
ライマーを用いるか、又はビオチニル化プライマーを蛍
光ヌクレオチドと組み合わせ、ストレプタビジン−カッ
プリング磁気粒子に結合させ、分離し、蛍光を半定量的
に測定することができる末端ビオチニル化、蛍光−標識
増幅産物を得ることである。
【0046】同時に半定量的読み取りを可能にする最も
感度の高い方法は、3つの突然変異−特異的プライマー
セットの増幅産物を記載のオリゴヌクレオチドプローブ
にハイブリッド形成させる記載の方法である。この方法
も臨床試料材料中のQRSAを定量することを可能にす
る。例えばジゴキシゲニン−dUTPを増幅の間に挿入
し、ビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブを用いる
と、ハイブリッド形成複合体をストレプタビジン−塗布
磁気粒子上で分離することができ、アルカリ性ホスファ
ターゼにカップリングさせた抗ジゴキシゲニン抗体を用
いると、基質としてAMPDを用いた化学発光により複
合体を半定量的に読み取ることができる。限定された数
の細胞を含む試料を細胞標準として同時に共増幅し、化
学発光試験において読み取ると、臨床試料材料により発
光される化学発光シグナルから生物の数を半定量的に決
定することができる。
【0047】
【実施例】実施例1 スターターオリゴヌクレオチド(プライマー)の合成 選択されたスターターオリゴヌクレオチド(プライマ
ー)をS.L.Beaucage and M.Car
uthers,Tetrahedron Letter
s,22,1859,1981のホスホルアミダイト法
を用いて化学的に合成した。以下のヌクレオチド配列を
合成した。
【0048】PCRプライマー1、突然変異C/Tに関
して特異的:配列番号:1 PCRプライマー2、突然変異T/Gに関して特異的:
配列番号:2 PCRプライマー3、突然変異G/Aに関して特異的:
配列番号:4 PCRプライマー4、すべての突然変異に関する相補鎖
プライマー:配列番号:4実施例2 QRSAのためのオリゴヌクレオチドプローブの合成及
び選択 突然変異−特異的増幅産物のすべてに含まれ、スタフィ
ロコッカス・アウレウスのジャイレースAに特異的なヌ
クレオチド領域2553〜2588からオリゴヌクレオ
チドプローブを選択した。
【0049】選択されたオリゴヌクレオチドプローブを
S.L.Beaucage andM.Caruthe
rs,Tetrahedron Letters,2
2,1859,1981のホスホルアミダイト法を用い
て化学的に合成した。以下のヌクレオチド配列を合成し
た: GTACGTATGGCTAAGATTTCAGTTA
TCGTTATCCG ヌクレオチド領域2553〜2588からの36量体オ
リゴヌクレオチド、配列番号:5。
【0050】オリゴヌクレオチドプローブをその3’末
端においてBollum,The Enzymes,B
oyer ed,Vol 10,p145 Acade
micPress,New Yorkの方法を用いて標
識した。末端基標識はビオチン−dUTPを用いて非−
放射性的に行った。(Chang,L.M.S.,Bo
llum T.J.,J.Biol.Chem.246,9
09,1971)。
【0051】10μlの反応緩衝液(カコジル酸カリウ
ム、1モル/l;Tris/HCl、125ミリモル/
l;牛血清アルブミン、1.25mg/ml;pH6.
6;25℃)、1〜2μgのオリコヌクレオチド、25
単位のターミナルトランスフェラーゼ、CoCl2
2.5ミリモル/l及び1μlのビオチン−dUTP
(1ミリモル/l)を含み、37℃でインキュベートさ
れた50μlの混合物中で60分後に約50%の3’末
端−標識が達成される。
【0052】実施例3 QRSAのためのポリヌクレオチドプローブの合成及び
選択 突然変異−特異的増幅産物のすべてに含まれ、S.アウ
レウスのジャイレースAに特異的なヌクレオチド領域2
515〜3048からポリヌクレオチドプローブを選択
した。
【0053】それをプライマー1(配列番号:1)及び
プライマー4(配列番号:4)を用い、実施例4に従っ
てPCR増幅により合成した。実施例6に従う化学発光
試験のために、ビオチン−dUTPを増幅の間に増幅遺
伝子中に挿入した。
【0054】実施例4 PCRによるQRSA−特異的DNA増幅 標的DNAをポリメラーゼ連鎖反応により増幅した(E
P 200362;201184)。
【0055】PCR反応において以下を用いた:10p
gのキノロン−耐性スタフィロコッカス類に関するゲノ
ムDNA、0.17μモルのプライマー1〜4、配列番
号:1〜4、2.5単位のCetus/Perkin−
Elmer Taq ポリメラーゼ及び合計100μl
のPCR緩衝液(50mM KCl、10mM Tri
s/HCl、pH8.3、2mM MgCl2及び0.
01%ゼラチン)中の200μモル/lの各dNTP。
増幅はCetus/Perkin−ElmerからのP
CRプロセッサーにおいて行った。すべての場合、3つ
のPCR試料は3つのジャイレース突然変異に関して特
異的に調製し、それぞれプライマーセット1(プライマ
ー1+4)、プライマーセット2(プライマー2+4)
及びプライマーセット3(プライマー3+4)を含ん
だ。
【0056】実施例6に従う化学発光試験のために、P
CR産物を標識するために0.15μモルのジゴキシゲ
ニン−dUTPもPCRに含めた。
【0057】最初に95℃において2分30秒間のDN
Aの初期融解を試料につき行い、次いでこの後に1サイ
クル当たり95℃で1分間のDNA変性、58℃におい
て1分間のプライマーアニーリング、及び72℃におい
て1分間のプライマー伸長を行った。25サイクルの
後、試料を4℃に直接冷却した。
【0058】実施例5 増幅産物の直接評価 DNA増幅産物を直接評価するために、エチジウムブロ
ミドなどの挿入剤を増幅の後に用いるか、又はフルオレ
セイン−dUTPもしくはヒドロキシクマリン−dUT
Pなどの蛍光ヌクレオシドトリホスフェートを増幅の間
に挿入する。ビオチン−dUTPもしくはジゴキシゲニ
ン−dUTPも用いることができ、抗体にカップリング
させたアルカリ性ホスファターゼを用いて株の読み取り
を行う。感度が低い場合、蛍光マーカーを用いて適当に
標識されたプライマーも用いることができる。
【0059】増幅産物を0.8%アガロースゲル上に負
荷し、100mAにおいて30分間電気泳動させた。キ
ノロン−感受性及びキノロン−耐性スタフィロコッカス
類の蛍光シグナルをUVトランスイルミネーター下で直
接評価した。
【0060】実施例6 DNA増幅産物の化学発光遺伝子−プローブ試験 ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(EP 20036
2)及びLCR(EP320308)などの適した標的
増幅法を遺伝子プローブ法と組み合わせることにより、
従来の遺伝子−プローブ読み取り法の感度と比較して有
意な感度の向上が達成される。
【0061】液体ハイブリッド形成試験を実施例4に従
い、100ngの3’−ビオチニル化遺伝子プローブ及
び増幅DNAを用いた逆相試験として、50μlの体積
で行った。
【0062】100℃で10分間加熱し、次いで0℃に
冷却した後、50μlの2xハイブリッド形成混合物
(50mlの20xssC、1gの遮断剤(block
ingreagent)(Boehringer)、2
mlの10%ラウロイル サルコシン及び200μlの
20%SDS、二重蒸留H2Oを用いて100mlとす
る)を加え、ハイブリッド形成(オリゴヌクレオチドプ
ローブ)を37℃で5〜10分間行った。磁気ビーズを
1xハイブリッド形成混合物で予備処理し、磁石を用い
てそれらを分離した後に液体をピペットで除去し、ハイ
ブリッド形成試料及び100μlの1xハイブリッド形
成混合物を加え、穏やかに動かしながら混合物を室温で
5〜10分間インキュベートした。カップリングしたハ
イブリッド形成複合体をビーズと共に分離し、残留液を
ピペットで除去し、次いでビーズを緩衝液B(0.1S
SC;0.1%SDS)で1回洗浄した。
【0063】次いで遮断反応、及び化学発光を用いたハ
イブリッド形成の検出のための抗体反応を行った。DN
Aを装填したビーズを500μlの緩衝液2(0.1M
マレイン酸:0.15M NaCl、pH7.5;1%
遮断剤(Boehringer))で1回処理した。室
温で5分間インキュベートした後、ビーズを分離し、液
体をピペットで除去し;250μlの抗体共役体溶液
(緩衝液2中の1:2500のAC)を加え、混合物を
室温で10分間インキュベートし、次いでビーズを分離
し、液体をピペットで除去し、次いでビーズを500μ
lの洗浄緩衝液で穏やかに動かしながら30秒間で2
回、及び2分間で1回処理した。次いでビーズを緩衝液
3中の1:100のAMPPDを含む100μlの検出
溶液と共に37℃における水浴中で10分間インキュベ
ートし、次いで発光光度計において477nmで化学発
光を測定した(LumacからのLumacounte
r)。
【0064】106〜101スタフィロコッカス生物に相
当するDNA量をこの試験を用いて検出することができ
る。非特異的血液DNAを加えた後、血液1ml当たり
10生物という同じ検出限界も達成できた。血液DNA
自身は、ハイブリッド形成試験において低いバックグラ
ウンドシグナルを生ずるのみである。
【0065】実施例7 スタフィロコッカス核酸の単離 スタフィロコッカス類に感染した試料材料、例えば感染
血液を8000rpmにおいて5〜10分間遠心し、上
澄み液をピペットで除去して捨てた。15%のスクロー
スを含む50μlのTEを沈降物(約180〜200μ
l)に加え、その後20μlのリゾチーム+リゾスタフ
ィン(1mlの二重蒸留H2O中に10+5mg)を加
え、次いで混合物を37℃で15分間インキュベートし
た。続いてQuiagenからのQuiamp DNA
キットを用いて仕上げを行った。25μlのプロテイナ
ーゼK及び235μlのAL緩衝液を加えた後、成分を
混合し、70℃で10分間処理した。次いで混合物を氷
上で冷却し、240μlの100%エタノールを加え、
成分を簡単に混合した後、それをQuiagenカラム
上に負荷した。次いでカラムを8000rpmで1分間
遠心し、溶離物を捨てた。次いで700μlのAW洗浄
緩衝液をカラム上に負荷し、それをもう一度8000r
pmで1分間遠心した。次いでカラムをもう一度同量の
AW緩衝液で洗浄し、8000rpmで1分間及び14
000rpmで10秒間遠心し、溶離物を捨てた。次い
で200μlの二重蒸留H2Oをカラム上に負荷し、そ
れを8000rpmで1分間遠心した。溶離物は精製さ
れた核酸溶液を含み、それを増幅に用いることができ
る。
【0066】実施例8 臨床試料材料中のQRSAの検出 QRSA DNAを実施例7に記載の方法に従って臨床
試料材料から単離した。次いでスタフィロコッカスDN
Aライセートを、実施例4に記載の通りにQRSA−特
異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて適した増幅
法により増幅した。増幅された核酸を配列番号:5のオ
リゴヌクレオチドプローブにハイブリッド形成させ、緊
縮条件下で形成され、増幅スタフィロコッカス核酸及び
遺伝子−プローブDNAを含む特異的ハイブリッド形成
複合体をDynal磁気粒子を用いて分離し、実施例6
に記載の通りに化学発光読み取りを用いて定量的に測定
した。
【0067】ジャイレースA遺伝子−特異的ハイブリッ
ド形成シグナルは、101生物の濃度でQRSAに感染
した血液ライセートにおいてさえ検出された。
【0068】実施例9 QRSAの定量的検出 臨床試料材料、例えば血液から実施例7に記載の通りに
QRSAを単離し、実施例4及び6に記載の通りに増幅
の後に化学発光試験を行った。臨床試料の他に、500
ngの血液DNAの存在中で106〜100細胞の細胞数
に相当するQRSA DNAを含む試料を平行して増幅
し、化学発光試験において分析した。血液中において1
6〜10のQRSAの細胞標準の化学発光シグナル
を、平行して分析され、3セットのプライマーを用いた
試験において検出された103及び102の生物を含む試
験試料と比較した。細胞数DNA標準からの化学発光シ
グナル(103及び102)は103及び102生物を含む
試験試料の化学発光シグナルと非常に良く一致し、化学
発光試験を例えば血液中のQRSAを半定量的に測定す
るために用いることができることを示す。
【0069】本発明の主たる特徴及び態様は以下の通り
である。
【0070】1.配列表の配列番号:1及び4における
と同様のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするジャ
イレース:Aのヌクレオチド配列の位置2533のC/
T点突然変異を増幅し、特異的に検出するためのスター
ターオリゴヌクレオチド(プライマー)。
【0071】2.配列表の配列番号:2及び4における
と同様のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするジャ
イレース:Aのヌクレオチド配列の位置2532のT/
G点突然変異を増幅し、特異的に検出するためのスター
ターオリゴヌクレオチド(プライマー)。
【0072】3.配列表の配列番号:3及び4における
と同様のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするジャ
イレース:Aのヌクレオチド配列の位置2544のG/
A点突然変異を増幅し、特異的に検出するためのスター
ターオリゴヌクレオチド(プライマー)。
【0073】4.配列表の配列番号:5におけると同様
のヌクレオチド配列又はその標識配列を含むことを特徴
とするキノロン−耐性スタフィロコッカス類からのDN
A又はRNAとハイブリッド形成するオリゴヌクレオチ
ドプローブ。
【0074】5.534塩基又はその部分を含み、配列
表の配列番号:6におけると同様のヌクレオチド配列又
はその部分もしくはその標識配列を含むことを特徴とす
るキノロン−耐性スタフィロコッカス類からのDNA又
はRNAとハイブリッド形成するポリヌクレオチドプロ
ーブ。
【0075】6.a)上記1〜3項に記載の突然変異−
特異的プライマーセットを用いた増幅の後にキノロン−
耐性スタフィロコッカス・アウレウス生物からの核酸を
さらにハイブリッド形成させずに直接分析するか、ある
いは遺伝子プローブと反応させる、 b)上記4又は5項に記載のオリゴヌクレオチドプロー
ブ又はポリヌクレオチドプロードを用いてキノロン−耐
性スタフィロコッカス・アウレウス核酸に特異的にハイ
ブリッド形成させ、検出する、 c)オリゴヌクレオチドプローブ又はポリヌクレオチド
プローブを既知の方法を用いてリポーター分子で標識す
る、 d)増幅された標的DNA上の標識を用いることにより
ハイブリッド形成複合体がキノロン−耐性スタフィロコ
ッカス類の存在及び量の直接の尺度を与えることを特徴
とする試料材料中のキノロン−耐性スタフィロコッカス
・アウレウス生物の検出の方法。
【0076】7.上記1〜3項に記載のプライマーをジ
ャイレースA遺伝子の部分の増幅に用いることを特徴と
する上記6項に記載の方法。
【0077】8.上記4項に記載のオリゴヌクレオチド
プローブを用いることを特徴とする上記6項に記載の方
法。
【0078】9.上記5項に記載のポリヌクレオチドプ
ローブを用いることを特徴とする上記6項に記載の方
法。
【0079】10.上記1〜5項に記載のオリゴヌクレ
オチドの1つ又はそれ以上、ならびに又緩衝液及び他の
溶液を含む、臨床試料材料中のキノロン耐性に関する分
析を便利に行うための試験キット。
【0080】
【表5】
【0081】
【表6】
【0082】
【表7】
【0083】
【表8】
【0084】
【表9】
【0085】
【表10】
【0086】
【表11】
【図面の簡単な説明】
【図1】増幅試験の直接評価。3つのキノロン−耐性
S.アウレウス病原体から、及びキノロン−感受性野生
型からの、103細胞に相当するDNAを、点突然変異
−特異的プライマーセット、プライマーセット1(配列
番号:1及び配列番号:4のプライマー)、プライマー
セット(配列番号:2及び配列番号:4のプライマ
ー)、ならびにプライマーセット3(配列番号:3及び
配列番号:4のプライマー)を用いて増幅し、次いでア
ガロースゲル電気泳動により分析した。耐性株がそのジ
ャイレースA遺伝子中に対応する点突然変異を含む場
合、エチジウムブロミドで染色したアガロースゲルにお
いて1本のバンドが見えるだけである。野生型ジャイレ
ースには点突然変異がないので、キノロン−感受性S.
アウレウス野生型(WT25035)は、3つのプライ
マーセットを用いた増幅バンドは与えない。S.アウレ
ウス株25768はC/T突然変異を有し、株2590
8はT/G突然変異を有し、株25908はT/G突然
変異を有し、株25918はG/A突然変異を有する。
【図2】3つのキノロン−耐性S.アウレウス病原体、
25768(1)、25908(2)及び25918
(3)からの、約1000細胞に相当するDNA、なら
びにキノロン−感受性S.アウレウス野生型(2503
5(4))からのDNAを点突然変異−特異的プライマ
ーセット1〜3(配列番号:1〜4)を用いて増幅し、
同時にジゴキシゲニン−dUTPを増幅産物に挿入し
た。増幅産物をビオチニル化オリゴヌクレオチドプロー
ブ(配列番号:5)にハイブリッド形成させ、ハイブリ
ッド形成複合体をストレプタビジン−塗布磁気粒子を用
いて分離した。増幅産物の形成を実施例6に従って化学
発光シグナルを用いて測定した。化学発光シグナルは、
耐性株がジャイレースA遺伝子中に対応する点突然変異
を含み、そのために対応するプライマー対1、2又は3
により増幅される場合のみに得られる。キノロン−感受
性S/ウアレウス株25035は、野生型ジャイレース
中に点突然変異がないので、3つのプライマーセットを
用いた化学発光シグナルを与えない。適したプライマー
セットを用いて得られる増幅から明らかな通り、S.ア
ウレウス株25768はC/T突然変異のために耐性で
あり、株25908はT/G突然変異のために耐性であ
り、株25918はG/A突然変異のために耐性であ
る。
【図3】3つのキノロン−耐性S.アウレウス病原体、
25768(1)、25908(2)及び25918
(3)からの、約100細胞に相当するDNA、ならび
にキノロン−感受性S.アウレウス野生型(25035
(4))からのDNAを点突然変異−特異的プライマー
セット1〜3(配列番号:1〜4)を用いて増幅し、同
時にジゴキシゲニン−dUTPを増幅産物に挿入した。
増幅産物をビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブ
(配列番号:5)にハイブリッド形成させ、ハイブリッ
ド形成複合体をストレプタビジン−塗布磁気粒子を用い
て分離した。増幅産物の形成を実施例6に従って化学発
光シグナルを用いて測定した。化学発光シグナルは、耐
性株がジャイレースA遺伝子中に対応する点突然変異を
含み、そのために対応するプライマー対1、2又は3に
より増幅される場合のみに得られる。キノロン−感受性
S/ウアレウス株25035は、野生型ジャイレース中
に点突然変異がないので、3つのプライマーセットを用
いた化学発光シグナルを与えない。適したプライマーセ
ットを用いて得られる増幅から明らかな通り、S.アウ
レウス株25768はC/T突然変異のために耐性であ
り、株25908はT/G突然変異のために耐性であ
り、株25918はG/A突然変異のために耐性であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 //(C12Q 1/68 C12R 1:445) (C12Q 1/14 C12R 1:445) (72)発明者 ライナー・エンデルマン ドイツ42113ブツペルタール・インデンビ ルケン152アー

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 配列表の配列番号:1及び4におけると
    同様のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするジャイ
    レース:Aのヌクレオチド配列の位置2533のC/T
    点突然変異を増幅し、特異的に検出するためのスタータ
    ーオリゴヌクレオチド(プライマー)。
  2. 【請求項2】 配列表の配列番号:2及び4におけると
    同様のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするジャイ
    レース:Aのヌクレオチド配列の位置2532のT/G
    点突然変異を増幅し、特異的に検出するためのスタータ
    ーオリゴヌクレオチド(プライマー)。
  3. 【請求項3】 配列表の配列番号:3及び4におけると
    同様のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするジャイ
    レース:Aのヌクレオチド配列の位置2544のG/A
    点突然変異を増幅し、特異的に検出するためのスタータ
    ーオリゴヌクレオチド(プライマー)。
  4. 【請求項4】 配列表の配列番号:5におけると同様の
    ヌクレオチド配列又はその標識配列を含むことを特徴と
    するキノロン−耐性スタフィロコッカス類(Staph
    ylococci)からのDNA又はRNAとハイブリ
    ッド形成するオリゴヌクレオチドプローブ。
  5. 【請求項5】 534塩基又はその部分を含み、配列表
    の配列番号:6におけると同様のヌクレオチド配列又は
    その部分もしくはその標識配列を含むことを特徴とする
    キノロン−耐性スタフィロコッカス類からのDNA又は
    RNAとハイブリッド形成するポリヌクレオチドプロー
    ブ。
  6. 【請求項6】 a)請求項1〜3に記載の突然変異−特
    異的プライマーセットを用いた増幅の後にキノロン−耐
    性スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylo
    coccus aureus)生物からの核酸をさらに
    ハイブリッド形成させずに直接分析するか、あるいは遺
    伝子プローブと反応させる、 b)請求項4又は5に記載のオリゴヌクレオチドプロー
    ブ又はポリヌクレオチドプローブを用いてキノロン−耐
    性スタフィロコッカス・アウレウス核酸に特異的にハイ
    ブリッド形成させ、検出する、 c)オリゴヌクレオチドプローブ又はポリヌクレオチド
    プローブを既知の方法を用いてリポーター分子で標識す
    る、 d)増幅された標的DNA上の標識を用いることにより
    ハイブリッド形成複合体がキノロン−耐性スタフィロコ
    ッカス類の存在及び量の直接の尺度を与えることを特徴
    とする試料材料中のキノロン−耐性スタフィロコッカス
    ・アウレウス生物の検出の方法。
  7. 【請求項7】 請求項1〜5に記載のオリゴヌクレオチ
    ドの1つ又はそれ以上、ならびにさらに緩衝液及び他の
    溶液を含む、臨床試料材料中のキノロン耐性に関する分
    析を便利に行うための試験キット。
JP7176891A 1994-06-23 1995-06-21 臨床材料中のキノロン−耐性スタフイロコツカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)病原体の検出のための迅速DNA試験 Pending JPH08298A (ja)

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