JPH08298A - 臨床材料中のキノロン−耐性スタフイロコツカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）病原体の検出のための迅速ＤＮＡ試験 - Google Patents
臨床材料中のキノロン−耐性スタフイロコツカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）病原体の検出のための迅速ＤＮＡ試験Info
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- JPH08298A JPH08298A JP7176891A JP17689195A JPH08298A JP H08298 A JPH08298 A JP H08298A JP 7176891 A JP7176891 A JP 7176891A JP 17689195 A JP17689195 A JP 17689195A JP H08298 A JPH08298 A JP H08298A
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-
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、臨床試料材料中のキノロン−耐性
スタフィロコッカス・アウレウス病原体を迅速に検出す
るためのスターターオリゴヌクレオチド（プライマ
ー）、ＤＮＡプローブ及び試験法につき記載する。 【効果】 臨床試料中のキノロン−耐性に関する分析を
便利に行うことができる。
スタフィロコッカス・アウレウス病原体を迅速に検出す
るためのスターターオリゴヌクレオチド（プライマ
ー）、ＤＮＡプローブ及び試験法につき記載する。 【効果】 臨床試料中のキノロン−耐性に関する分析を
便利に行うことができる。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は臨床試料材料中のキノロン−耐性
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）病原体を迅速に検出するた
めのスターターオリゴヌクレオチド（プライマー）、Ｄ
ＮＡプローブ及び試験法を記載する。
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）病原体を迅速に検出するた
めのスターターオリゴヌクレオチド（プライマー）、Ｄ
ＮＡプローブ及び試験法を記載する。
【０００２】フルオロキノロン類は問題の多いバクテリ
ア感染症の処置のための有力な抗バクテリア剤である。
メチシリン−耐性スタフィロコッカス類による感染症も
フルオロキノロン類、例えばシプロフロキサシンを用い
て処置することができる。
ア感染症の処置のための有力な抗バクテリア剤である。
メチシリン−耐性スタフィロコッカス類による感染症も
フルオロキノロン類、例えばシプロフロキサシンを用い
て処置することができる。
【０００３】しかし、例えばナリジクス酸などの以前の
キノロン類の場合と同様にフルオロキノロン類に耐性の
スタフィロコッカス・アウレウス株がより頻繁に見いだ
される。
キノロン類の場合と同様にフルオロキノロン類に耐性の
スタフィロコッカス・アウレウス株がより頻繁に見いだ
される。
【０００４】同時に、多くの病院がフルオロキノロン類
にも耐性となってしまったメチシリン−耐性スタフィロ
コッカス類の問題を経験している。メチシリン−耐性及
びキノロン−耐性スタフィロコッカス類による感染症に
対してわずかな抗バクテリア剤しか有効でないという観
点から、フルオロキノロン耐性の増加は特に重要であ
る。
にも耐性となってしまったメチシリン−耐性スタフィロ
コッカス類の問題を経験している。メチシリン−耐性及
びキノロン−耐性スタフィロコッカス類による感染症に
対してわずかな抗バクテリア剤しか有効でないという観
点から、フルオロキノロン耐性の増加は特に重要であ
る。
【０００５】従って可能な限り初期の段階に有効な抗生
物質を用いた治療を開始することが特に重要である。キ
ノロン−耐性スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｉ）類の古典的診断は時間がかかり、労力がかか
り、平板上で株を試験管内培養し、その後例えば“ａｐ
ｉ ｓｔａｐｈ”（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）などの試験
系を用いて生理学的に同定し、連続希釈試験（ＭＩＣ
値）又は寒天拡散試験（阻止領域試験）を用いて抗生物
質耐性を決定することが必要である。ここで提供される
代替法は、ＱＲＳＡジャイレース（ｇｙｒａｓｅ）に基
づく遺伝子試験の開発であり、この試験は試験管内培養
を行わずに試料材料における直接の迅速な診断を可能に
する。
物質を用いた治療を開始することが特に重要である。キ
ノロン−耐性スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｉ）類の古典的診断は時間がかかり、労力がかか
り、平板上で株を試験管内培養し、その後例えば“ａｐ
ｉ ｓｔａｐｈ”（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）などの試験
系を用いて生理学的に同定し、連続希釈試験（ＭＩＣ
値）又は寒天拡散試験（阻止領域試験）を用いて抗生物
質耐性を決定することが必要である。ここで提供される
代替法は、ＱＲＳＡジャイレース（ｇｙｒａｓｅ）に基
づく遺伝子試験の開発であり、この試験は試験管内培養
を行わずに試料材料における直接の迅速な診断を可能に
する。
【０００６】シプロフロキサシンは、酵素ＤＮＡジャイ
レースのＡ２Ｂ２テトラマー構造を阻害する４−キノロ
ン抗生物質である。ＤＮＡジャイレースは、ＤＮＡ二本
鎖における過渡的切断を触媒することによりＤＮＡのね
じれをもたらす。
レースのＡ２Ｂ２テトラマー構造を阻害する４−キノロ
ン抗生物質である。ＤＮＡジャイレースは、ＤＮＡ二本
鎖における過渡的切断を触媒することによりＤＮＡのね
じれをもたらす。
【０００７】ジャイレースＡサブユニットにおける突然
変異はスタフィロコッカス・アウレウスのキノロン耐性
の分子的原因であることが示された（Ｓｒｅｅｄｈａｒ
ａｎ，Ｓ．，Ｍ．Ｏｒａｍ，Ｂ．Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．
Ｒ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｌ．Ｍ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．７２６０−７２６２，１９９０）。
膜−付随輸送機構に影響を与え、それにより抗生物質の
吸収及び内部蓄積を妨害するノルＡ遺伝子における突然
変異（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．，Ｍ．Ｂｏｇａｋｉ，
Ｓ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．Ｕｂｕｋａｔａ，Ｎ．Ｋ
ｏｎｎｏ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２，６９４２
−６９４９，１９９０）はさらに加えられる原因となっ
ている。これに加えて、まだ知られていない機構により
キノロン耐性をもたらす別の遺伝子座における突然変異
が記載されている（Ｔｒｕｃｋｓｉｓ，Ｍ．，Ｊ．Ｓ．
Ｗｏｌｆｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．Ｈｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．１７３，５８５４−５８６０，１９９
０）。
変異はスタフィロコッカス・アウレウスのキノロン耐性
の分子的原因であることが示された（Ｓｒｅｅｄｈａｒ
ａｎ，Ｓ．，Ｍ．Ｏｒａｍ，Ｂ．Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．
Ｒ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｌ．Ｍ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．７２６０−７２６２，１９９０）。
膜−付随輸送機構に影響を与え、それにより抗生物質の
吸収及び内部蓄積を妨害するノルＡ遺伝子における突然
変異（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．，Ｍ．Ｂｏｇａｋｉ，
Ｓ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．Ｕｂｕｋａｔａ，Ｎ．Ｋ
ｏｎｎｏ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２，６９４２
−６９４９，１９９０）はさらに加えられる原因となっ
ている。これに加えて、まだ知られていない機構により
キノロン耐性をもたらす別の遺伝子座における突然変異
が記載されている（Ｔｒｕｃｋｓｉｓ，Ｍ．，Ｊ．Ｓ．
Ｗｏｌｆｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．Ｈｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．１７３，５８５４−５８６０，１９９
０）。
【０００８】スタフィロコッカスのジャイレースＡ遺伝
子のセリン８４及びセリン８５コドンにおいて記載され
ている点突然変異はシプロフロキサシン耐性を伴うの
で、これらの点突然変異を含む２３９４〜２６５８のヌ
クレオチド領域をさらに詳細に調べた。
子のセリン８４及びセリン８５コドンにおいて記載され
ている点突然変異はシプロフロキサシン耐性を伴うの
で、これらの点突然変異を含む２３９４〜２６５８のヌ
クレオチド領域をさらに詳細に調べた。
【０００９】メチシリン及びシプロフロキサシンに関し
て異なるＭＩＣ値を有する５０のキノロン−耐性スタフ
ィロコッカス・アウレウス単離物に関する我々の研究に
おいて、我々はＨｕｌｔｍａｎ Ｔ，Ｓｔａｈｌ，
Ｓ．，Ｈｏｒｎｅｓ，Ｅ．，Ｕｈｌｅｎ，Ｍ．Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７，４９３７−４９４
６，１９８９の修正法を用い、磁気ビーズを用いたＰＣ
Ｒ配列決定法により、ジャイレースＡ中に４つの型の突
然変異を検出した（表１を参照）。位置２５４０におけ
る点突然変異に基づくさらに別の型の突然変異は、タン
パク質のレベルでアミノ酸置換を生じず、ジャイレース
の耐性への影響を有していない。突然変異の３つに基づ
き、Ｃ／Ｔ、Ｔ／Ｇ及びＧ／Ａ突然変異を検出するため
の点突然変異−特異的増幅試験を開発した。
て異なるＭＩＣ値を有する５０のキノロン−耐性スタフ
ィロコッカス・アウレウス単離物に関する我々の研究に
おいて、我々はＨｕｌｔｍａｎ Ｔ，Ｓｔａｈｌ，
Ｓ．，Ｈｏｒｎｅｓ，Ｅ．，Ｕｈｌｅｎ，Ｍ．Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７，４９３７−４９４
６，１９８９の修正法を用い、磁気ビーズを用いたＰＣ
Ｒ配列決定法により、ジャイレースＡ中に４つの型の突
然変異を検出した（表１を参照）。位置２５４０におけ
る点突然変異に基づくさらに別の型の突然変異は、タン
パク質のレベルでアミノ酸置換を生じず、ジャイレース
の耐性への影響を有していない。突然変異の３つに基づ
き、Ｃ／Ｔ、Ｔ／Ｇ及びＧ／Ａ突然変異を検出するため
の点突然変異−特異的増幅試験を開発した。
【００１０】この試験はシプロ耐性に関連するスタフィ
ロクッコス・アウレウスにおけるジャイレース突然変異
のすべてを検出する。
ロクッコス・アウレウスにおけるジャイレース突然変異
のすべてを検出する。
【００１１】
【表１】
【００１２】４〜１２８μｇ／ｍｌのＭＩＣ値を有する
１５０種のキノロン−耐性ステフィロコックス類（ＱＲ
ＳＡ）（表１中の株を含む）（表２も参照）をこの遺伝
子試験を用いて分析した。株の９２．１％が位置２５３
３における突然変異Ｃ／Ｔを有する。４つの株（２．６
％）が位置２５３２における突然変異Ｔ／Ｇを有し、３
つの株（２％）が位置２５４４における突然変異Ｇ／Ａ
を有する。５つの株（３．３％）が、続いてこれらの株
につき行ったＰＣＲ配列決定により確証される通り、ジ
ャイレース中に位置していない他の突然変異を有する。
１５０種のキノロン−耐性ステフィロコックス類（ＱＲ
ＳＡ）（表１中の株を含む）（表２も参照）をこの遺伝
子試験を用いて分析した。株の９２．１％が位置２５３
３における突然変異Ｃ／Ｔを有する。４つの株（２．６
％）が位置２５３２における突然変異Ｔ／Ｇを有し、３
つの株（２％）が位置２５４４における突然変異Ｇ／Ａ
を有する。５つの株（３．３％）が、続いてこれらの株
につき行ったＰＣＲ配列決定により確証される通り、ジ
ャイレース中に位置していない他の突然変異を有する。
【００１３】かくして３つの突然変異の検出に基づくこ
の試験に関し、かくして９６．７％の検出感度が得られ
る。
の試験に関し、かくして９６．７％の検出感度が得られ
る。
【００１４】
【表２】
【００１５】
【表３】
【００１６】
【表４】
【００１７】本発明は臨床試料材料において直接キノロ
ン−耐性スタフィロコッカス類を迅速に検出するための
特異的なプライマー、ならびにオリゴフクレオチドプロ
ーブ及びポリヌクレオチドプローブ、ならびにそれらの
利用につき記載する。
ン−耐性スタフィロコッカス類を迅速に検出するための
特異的なプライマー、ならびにオリゴフクレオチドプロ
ーブ及びポリヌクレオチドプローブ、ならびにそれらの
利用につき記載する。
【００１８】１．プライマーはジャイレースＡ遺伝子の
遺伝子配列から化学的合成により製造した。
遺伝子配列から化学的合成により製造した。
【００１９】好ましいプライマーは、 ａ）突然変異型Ｃ／Ｔに特異的（プライマー１、配列番
号：１） ｂ）突然変異型Ｔ／Ｇに特異的（プライマー２、配列番
号：２） ｃ）突然変異型Ｇ／Ａに特異的（プライマー３、配列番
号：３） ｄ）相補鎖プライマーとしてキノロン−耐性及び感受性
ジャイレースに特異的（プライマー４、配列番号：４） である領域から選択された。
号：１） ｂ）突然変異型Ｔ／Ｇに特異的（プライマー２、配列番
号：２） ｃ）突然変異型Ｇ／Ａに特異的（プライマー３、配列番
号：３） ｄ）相補鎖プライマーとしてキノロン−耐性及び感受性
ジャイレースに特異的（プライマー４、配列番号：４） である領域から選択された。
【００２０】２．オリゴヌクレオチドプローブは領域２
５５３〜２５８８から化学的合成により製造した（配列
番号：５）。この領域はすべてのプライマーにより増幅
され、Ｓ．アウレウスに特異的である。別のポリヌクレ
オチドプローブ（配列番号：６）は、ヌクレオチド領域
２５１５〜３０４８をＰＣＲ増幅することにより製造し
た。
５５３〜２５８８から化学的合成により製造した（配列
番号：５）。この領域はすべてのプライマーにより増幅
され、Ｓ．アウレウスに特異的である。別のポリヌクレ
オチドプローブ（配列番号：６）は、ヌクレオチド領域
２５１５〜３０４８をＰＣＲ増幅することにより製造し
た。
【００２１】３．キノロン−耐性株のゲノムＤＮＡは、
スタフィロコッカス類に適合させた核酸法を用いて単離
した。
スタフィロコッカス類に適合させた核酸法を用いて単離
した。
【００２２】４．ジャイレースＡ遺伝子の部分を、３’
末端に耐性突然変異の塩基（Ｃの代わりにＴ、Ｇの代わ
りにＧ）を有するコード領域からの特異的プライマー１
〜３、及びすべての増幅のための相補鎖プライマーとし
て用いられるジャイレースＡ遺伝子の非コード鎖からの
特異的プライマー４を用いて増幅した。
末端に耐性突然変異の塩基（Ｃの代わりにＴ、Ｇの代わ
りにＧ）を有するコード領域からの特異的プライマー１
〜３、及びすべての増幅のための相補鎖プライマーとし
て用いられるジャイレースＡ遺伝子の非コード鎖からの
特異的プライマー４を用いて増幅した。
【００２３】５．増幅は既知の増幅法、好ましくはＰＣ
Ｒ ＤＮＡ増幅法（ＥＰ ２００３６２）を用いて行っ
た。
Ｒ ＤＮＡ増幅法（ＥＰ ２００３６２）を用いて行っ
た。
【００２４】６．特異的増幅産物を ａ）アガロースゲルにおける増幅産物の直接電気泳動及
びエチジウムブロミドなどの挿入剤を用いた染色、 ｂ）増幅の間に蛍光ヌクレオチド又は蛍光−標識プライ
マーで標識された増幅産物の蛍光の決定。増幅産物はや
はり挿入された（プライマーからヌクレオチドに）ビオ
チンを用いて分離される。
びエチジウムブロミドなどの挿入剤を用いた染色、 ｂ）増幅の間に蛍光ヌクレオチド又は蛍光−標識プライ
マーで標識された増幅産物の蛍光の決定。増幅産物はや
はり挿入された（プライマーからヌクレオチドに）ビオ
チンを用いて分離される。
【００２５】ｃ）増幅の間に標識された増幅産物の、上
記のビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブへのハイ
ブリッド形成。ハイブリッド形成複合体はストレプタビ
ジン−塗布磁気粒子を用いて分離される。
記のビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブへのハイ
ブリッド形成。ハイブリッド形成複合体はストレプタビ
ジン−塗布磁気粒子を用いて分離される。
【００２６】ｄ）形成されたハイブリッド形成複合体
を、アルカリ性ホスファターゼにカップリングさせた抗
ジゴキシゲニン抗体を用いた化学発光試験によりキノロ
ン−耐性スタフィロコッカス類の量又は存在の尺度とし
て評価することにより検出する。
を、アルカリ性ホスファターゼにカップリングさせた抗
ジゴキシゲニン抗体を用いた化学発光試験によりキノロ
ン−耐性スタフィロコッカス類の量又は存在の尺度とし
て評価することにより検出する。
【００２７】外部、共−増幅スタフィロコッカスＤＮＡ
鎖が用いられる場合、臨床試料材料中のキノロン−耐性
スタフィロコッカス類の量を確定するために、評価を半
定量的に用いることができる。
鎖が用いられる場合、臨床試料材料中のキノロン−耐性
スタフィロコッカス類の量を確定するために、評価を半
定量的に用いることができる。
【００２８】特に増幅法と結び付けられた遺伝子−プロ
ーブ診断は迅速で特異的で感度の高い方法であり、ＤＮ
Ａ／ＲＮＡレベルにおける病原体の初期の同定を可能に
する。方法は、試験管内培養を行わずに研究中の材料に
つき直接行うことができる。方法はＤＮＡ／ＲＮＡハイ
ブリッド形成法、すなわちＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩
基対の形成を伴う相補的１本鎖核酸の特異的試験管内結
合に基づく。形成されるＤＮＡ／ＤＮＡ又はＤＮＡ／Ｒ
ＮＡ２本鎖は、ハイブリッドと呼ばれる。ハイブリッド
形成反応による病原体の特異的ＤＮＡ又はＲＮＡの検出
に、相補的な、配列特異的遺伝子プローブが用いられ
る。これらの遺伝子プローブは長さが１０〜５０ヌクレ
オチドの化学的に合成された短いオリゴヌクレオチドプ
ローブであるか、又は組み換え遺伝子法により製造され
た０．５〜１０ｋｂのＤＮＡ／ＲＮＡフラグメントであ
る。
ーブ診断は迅速で特異的で感度の高い方法であり、ＤＮ
Ａ／ＲＮＡレベルにおける病原体の初期の同定を可能に
する。方法は、試験管内培養を行わずに研究中の材料に
つき直接行うことができる。方法はＤＮＡ／ＲＮＡハイ
ブリッド形成法、すなわちＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩
基対の形成を伴う相補的１本鎖核酸の特異的試験管内結
合に基づく。形成されるＤＮＡ／ＤＮＡ又はＤＮＡ／Ｒ
ＮＡ２本鎖は、ハイブリッドと呼ばれる。ハイブリッド
形成反応による病原体の特異的ＤＮＡ又はＲＮＡの検出
に、相補的な、配列特異的遺伝子プローブが用いられ
る。これらの遺伝子プローブは長さが１０〜５０ヌクレ
オチドの化学的に合成された短いオリゴヌクレオチドプ
ローブであるか、又は組み換え遺伝子法により製造され
た０．５〜１０ｋｂのＤＮＡ／ＲＮＡフラグメントであ
る。
【００２９】遺伝子プローブに、光化学的に（Ｎ．Ｄａ
ｔｔａｇｕｐｔａ，Ｐ．Ｍ．Ｍ．Ｒａｅ，Ｅ．Ｄ．Ｈｕ
ｇｕｅｎｅｌ，Ｅ．Ｃａｒｌｓｏｎ，Ａ．Ｌｙｇａ，
Ｊ．Ｓ．Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｊ．Ｐ．Ａｌｂａｒｅｌｌ
ａ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７７，
８５，１９８９）又はニックトランスレーションにより
酵素的に（Ｒｉｇｂｙ，Ｐ．Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１３，２３７，１９７７）又はラ
ンダムプライム法（ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｄｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ）により（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ ａｎｄ
Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１
３２，６，１９８３）、放射性又は非放射性標識を与え
ることができる。32Ｐ−ＮＴＰｓを用いた標識又はジゴ
キシゲニン−ｄＵＴＰ、ビオチン−ｄＵＴＰもしくはフ
ルオレセイン−ｄＵＴＰを用いた非放射性標識、あるい
はアルカリ性ホスファターゼ又はホースラディッシュ
パーオキシダーゼなどの酵素を用いた直接標識がこの目
的に適している。
ｔｔａｇｕｐｔａ，Ｐ．Ｍ．Ｍ．Ｒａｅ，Ｅ．Ｄ．Ｈｕ
ｇｕｅｎｅｌ，Ｅ．Ｃａｒｌｓｏｎ，Ａ．Ｌｙｇａ，
Ｊ．Ｓ．Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｊ．Ｐ．Ａｌｂａｒｅｌｌ
ａ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７７，
８５，１９８９）又はニックトランスレーションにより
酵素的に（Ｒｉｇｂｙ，Ｐ．Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１３，２３７，１９７７）又はラ
ンダムプライム法（ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｄｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ）により（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ ａｎｄ
Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１
３２，６，１９８３）、放射性又は非放射性標識を与え
ることができる。32Ｐ−ＮＴＰｓを用いた標識又はジゴ
キシゲニン−ｄＵＴＰ、ビオチン−ｄＵＴＰもしくはフ
ルオレセイン−ｄＵＴＰを用いた非放射性標識、あるい
はアルカリ性ホスファターゼ又はホースラディッシュ
パーオキシダーゼなどの酵素を用いた直接標識がこの目
的に適している。
【００３０】検出するべき病原体の核酸及び病原体−特
異的遺伝子プローブの間の特異的ハイブリッド形成を達
成するために、最初に核酸を変性（熱又はアルカリ処
理）により１本鎖に分離し、次いで温度、緩衝液のイオ
ン強度及び有機溶媒により達成される緊縮条件下で非常
に特異的に互いにハイブリッド形成させる。適したハイ
ブリッド形成条件下で、遺伝子プローブは検出するべき
ＤＮＡ又はＲＮＡの相補的配列のみに結合する。このハ
イブリッド形成反応は、例えばニトロセルロースなどの
支持体にカップリングさせた標的ＤＮＡ又は遺伝子プロ
ーブの固相ハイブリッド形成として、あるいは液体ハイ
ブリッド形成として多様な試験形態で行うことができ
る。評価（読み取り）は、遺伝子プローブを上記のリポ
ーター分子で標識することにより、又はここで示される
逆相ハイブリッド形成系におけるように増幅の間にジゴ
キシゲニン−ｄＵＴＰで標識された標的ＤＮＡ、及び磁
気粒子に結合するようにビオチンで標識した遺伝子プロ
ーブを用いることにより行われる。標的ＤＮＡ及び標識
遺伝子プローブを含むハイブリッド形成複合体は、非−
結合遺伝子プローブが除去されると、用いられるリポー
ター分子を用いて定量的に測定される。この読み取り
は、蛍光標識又は放射性標識の場合は直接、あるいは酵
素試験により、及びアルカリ性ホスファターゼなどの酵
素を含み、発色反応又は化学発光反応を可能にする抗体
共役体を用いた免疫学的方法を用いて間接的に行うこと
ができる。
異的遺伝子プローブの間の特異的ハイブリッド形成を達
成するために、最初に核酸を変性（熱又はアルカリ処
理）により１本鎖に分離し、次いで温度、緩衝液のイオ
ン強度及び有機溶媒により達成される緊縮条件下で非常
に特異的に互いにハイブリッド形成させる。適したハイ
ブリッド形成条件下で、遺伝子プローブは検出するべき
ＤＮＡ又はＲＮＡの相補的配列のみに結合する。このハ
イブリッド形成反応は、例えばニトロセルロースなどの
支持体にカップリングさせた標的ＤＮＡ又は遺伝子プロ
ーブの固相ハイブリッド形成として、あるいは液体ハイ
ブリッド形成として多様な試験形態で行うことができ
る。評価（読み取り）は、遺伝子プローブを上記のリポ
ーター分子で標識することにより、又はここで示される
逆相ハイブリッド形成系におけるように増幅の間にジゴ
キシゲニン−ｄＵＴＰで標識された標的ＤＮＡ、及び磁
気粒子に結合するようにビオチンで標識した遺伝子プロ
ーブを用いることにより行われる。標的ＤＮＡ及び標識
遺伝子プローブを含むハイブリッド形成複合体は、非−
結合遺伝子プローブが除去されると、用いられるリポー
ター分子を用いて定量的に測定される。この読み取り
は、蛍光標識又は放射性標識の場合は直接、あるいは酵
素試験により、及びアルカリ性ホスファターゼなどの酵
素を含み、発色反応又は化学発光反応を可能にする抗体
共役体を用いた免疫学的方法を用いて間接的に行うこと
ができる。
【００３１】この遺伝子−プローブ診断を用いて達成さ
れる試験感度は、１つの遺伝子の検出に基づいて１０5
〜１０6の微生物の範囲である。試験感度は、試験をＤ
ＮＡ又はＲＮＡ増幅法、例えばＰＣＲ（ＥＰ ２００３
６２）、ＬＣＲ（ＥＰ ３２０３０８）、ＮＡＳＢＡ
（ＥＰ ３２９８２２）、ＱＢ（ＰＣＴ ８７／０６２
７０）又はＨＡＳ（ＥＰ ４２７０７４）法と組み合わ
せることにより向上させることができる。これらの方法
を用い、検出するべきＤＮＡを最高１０9倍とすること
ができる。このようにして、増幅及びハイブリッド形成
を組み合わせることにより、各ＤＮＡ分子を検出するこ
とが可能になる。
れる試験感度は、１つの遺伝子の検出に基づいて１０5
〜１０6の微生物の範囲である。試験感度は、試験をＤ
ＮＡ又はＲＮＡ増幅法、例えばＰＣＲ（ＥＰ ２００３
６２）、ＬＣＲ（ＥＰ ３２０３０８）、ＮＡＳＢＡ
（ＥＰ ３２９８２２）、ＱＢ（ＰＣＴ ８７／０６２
７０）又はＨＡＳ（ＥＰ ４２７０７４）法と組み合わ
せることにより向上させることができる。これらの方法
を用い、検出するべきＤＮＡを最高１０9倍とすること
ができる。このようにして、増幅及びハイブリッド形成
を組み合わせることにより、各ＤＮＡ分子を検出するこ
とが可能になる。
【００３２】感染症における血液中では１０1〜１０3−
生物／ｍｌという生物数が見いだされ、この方法は初期
の段階でキノロン−耐性感染症を認識する可能性を与え
る。これに加え、本発明はこれらのプライマー、オリゴ
ヌクレオチドプローブ及びポリヌクレオチドプローブの
利用、ならびに臨床試料材料中のシプロ耐性ステフィロ
コックス類の検出のための試験法につき記載する。この
方法の他の利点は、それが試料材料中のキノロン−耐性
感染性生物の量を半定量的に決定する可能性を与えるこ
とである。
生物／ｍｌという生物数が見いだされ、この方法は初期
の段階でキノロン−耐性感染症を認識する可能性を与え
る。これに加え、本発明はこれらのプライマー、オリゴ
ヌクレオチドプローブ及びポリヌクレオチドプローブの
利用、ならびに臨床試料材料中のシプロ耐性ステフィロ
コックス類の検出のための試験法につき記載する。この
方法の他の利点は、それが試料材料中のキノロン−耐性
感染性生物の量を半定量的に決定する可能性を与えるこ
とである。
【００３３】プライマーの選択及び合成 ジャイレースＡ遺伝子又は表１に挙げたキノロン−耐性
スタフィロコッカス・アウレウス単離物のヌクレオチド
配列を、適した特異的プライマーの選択に用いた。これ
らの突然変異配列及び野生型ヌクレオチド配列（Ｅ．
Ｅ．Ｃ．Ｍａｒｇｅｒｒｉｓｏｎ，Ｒ．Ｈｏｐｅｗｅｌ
ｌ，Ｌ．Ｍ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１５９６−１６０３，１９９２）に基づき、３’末端に
点突然変異の塩基を有するプライマーを選択した。突然
変異型Ｃ／Ｔの場合、配列番号：１のプライマーを合成
した。突然変異型Ｔ／Ｇの場合、配列番号：２のプライ
マー２を合成した。突然変異型Ｇ／Ａの場合、配列番
号：３のプライマーを合成した。すべてのプライマーの
セット（プライマー１＋４、２＋４及び３＋４）に共通
の配列番号：４のプライマー４を、突然変異を有する配
列の増幅のための相補鎖プライマーとして合成した。
スタフィロコッカス・アウレウス単離物のヌクレオチド
配列を、適した特異的プライマーの選択に用いた。これ
らの突然変異配列及び野生型ヌクレオチド配列（Ｅ．
Ｅ．Ｃ．Ｍａｒｇｅｒｒｉｓｏｎ，Ｒ．Ｈｏｐｅｗｅｌ
ｌ，Ｌ．Ｍ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１５９６−１６０３，１９９２）に基づき、３’末端に
点突然変異の塩基を有するプライマーを選択した。突然
変異型Ｃ／Ｔの場合、配列番号：１のプライマーを合成
した。突然変異型Ｔ／Ｇの場合、配列番号：２のプライ
マー２を合成した。突然変異型Ｇ／Ａの場合、配列番
号：３のプライマーを合成した。すべてのプライマーの
セット（プライマー１＋４、２＋４及び３＋４）に共通
の配列番号：４のプライマー４を、突然変異を有する配
列の増幅のための相補鎖プライマーとして合成した。
【００３４】選択されたプライマーをＳ．Ｌ．Ｂｅａｕ
ｃａｇｅ ａｎｄ Ｍ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２，１８５９，１
９８１のホスホルアミダイト法を用いて化学的に合成し
た。
ｃａｇｅ ａｎｄ Ｍ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２，１８５９，１
９８１のホスホルアミダイト法を用いて化学的に合成し
た。
【００３５】ゲノムＱＲＳＡ ＤＮＡの増幅 ジャイレースＡ遺伝子の部分を増幅するために、上記の
プライマーをそれぞれの場合にプライマーセット１（プ
ライマー１＋４）、プライマーセット２（プライマー２
＋４）及びプライマーセット３（プライマー３＋４）と
して用い、ＱＲＳＡジャイレースの３つの突然変異型を
特異的に増幅した。キノロン−感受性ジャイレース遺伝
子のゲノムＤＮＡの場合に用いると、それらはアガロー
スゲルにおいて可視の増幅産物を与えない。３つのプラ
イマーセットを用いた場合、それぞれ対応する突然変異
を有するジャイレース遺伝子を含むゲノムＤＮＡは強い
増幅バンドを与え、それによりキノロン耐性のみでな
く、同時にジャイレース中に存在する点突然変異も示
す。
プライマーをそれぞれの場合にプライマーセット１（プ
ライマー１＋４）、プライマーセット２（プライマー２
＋４）及びプライマーセット３（プライマー３＋４）と
して用い、ＱＲＳＡジャイレースの３つの突然変異型を
特異的に増幅した。キノロン−感受性ジャイレース遺伝
子のゲノムＤＮＡの場合に用いると、それらはアガロー
スゲルにおいて可視の増幅産物を与えない。３つのプラ
イマーセットを用いた場合、それぞれ対応する突然変異
を有するジャイレース遺伝子を含むゲノムＤＮＡは強い
増幅バンドを与え、それによりキノロン耐性のみでな
く、同時にジャイレース中に存在する点突然変異も示
す。
【００３６】ＰＣＲ増幅の間に、４つのｄＮＴＰｓ（デ
オキシアデノシン トリホスフェート、デオキシグアノ
シン トリホスフェート、デオキシシチジン トリホス
フェート及びチミジン トリホスフェート）の他に例え
ばジゴキシゲニン−ｄＵＴＰも増幅産物中に挿入するこ
とができる。その結果増幅産物は、アルカリ性ホスファ
ターゼにカップリングさせた抗−ジゴキシゲニン抗体を
用い、例えば基質としてＡＭＰＰＤを用いた化学発光試
験により、あるいはブロモクロロインドイルホスフェー
ト及びニトロブルーテトラゾリウムもしくはパラ−ニト
ロフェニルホスフェートを用いた染色試験により読み取
ることができる。
オキシアデノシン トリホスフェート、デオキシグアノ
シン トリホスフェート、デオキシシチジン トリホス
フェート及びチミジン トリホスフェート）の他に例え
ばジゴキシゲニン−ｄＵＴＰも増幅産物中に挿入するこ
とができる。その結果増幅産物は、アルカリ性ホスファ
ターゼにカップリングさせた抗−ジゴキシゲニン抗体を
用い、例えば基質としてＡＭＰＰＤを用いた化学発光試
験により、あるいはブロモクロロインドイルホスフェー
ト及びニトロブルーテトラゾリウムもしくはパラ−ニト
ロフェニルホスフェートを用いた染色試験により読み取
ることができる。
【００３７】別の場合、蛍光−標識ヌクレオシド トリ
ホスフェート、例えばフルオレセイン−ｄＵＴＰ又はク
マリン−ｄＵＴＰｓを増幅産物に挿入し、それによりエ
チジウムブロミド染色を用いた場合よりずっと高い感度
で増幅産物を同定できる可能性がある。次いで、ビオチ
ニル化プライマーを用いた場合、蛍光−標識ビオチニル
化増幅産物をストレプタビジン−塗布磁気粒子を用いて
分離し、蛍光光度計でそれを定量的に測定する可能性が
ある。
ホスフェート、例えばフルオレセイン−ｄＵＴＰ又はク
マリン−ｄＵＴＰｓを増幅産物に挿入し、それによりエ
チジウムブロミド染色を用いた場合よりずっと高い感度
で増幅産物を同定できる可能性がある。次いで、ビオチ
ニル化プライマーを用いた場合、蛍光−標識ビオチニル
化増幅産物をストレプタビジン−塗布磁気粒子を用いて
分離し、蛍光光度計でそれを定量的に測定する可能性が
ある。
【００３８】オリゴヌクレオチドプローブの選択及び合
成 プライマーセットの増幅産物に関して特異的なオリゴフ
クレオチドプローブを、３つの突然変異−特異的増幅産
物のすべてに共通な領域２５５３〜２５８８から選択し
た。配列番号：５の配列を有し、３つの増幅産物に関し
て特異的な３６量体を合成した。
成 プライマーセットの増幅産物に関して特異的なオリゴフ
クレオチドプローブを、３つの突然変異−特異的増幅産
物のすべてに共通な領域２５５３〜２５８８から選択し
た。配列番号：５の配列を有し、３つの増幅産物に関し
て特異的な３６量体を合成した。
【００３９】それを、Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎ
ｄ Ｍ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２，１８５９，１９８１のホスホ
ルアミダイト法を用いて化学的に合成した。
ｄ Ｍ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２，１８５９，１９８１のホスホ
ルアミダイト法を用いて化学的に合成した。
【００４０】オリゴヌクレオチドプローブは突然変異−
特異的増幅産物に特異的にハイブリッド形成することが
できる。ジャイレースＡ遺伝子の部分を最初に突然変異
−特異的プライマーを用いて増幅し、次いで増幅産物を
特異的にオリゴフクレオチドプローブにハイブリッド形
成させる方法は、直接的な増幅診断と比較して以下の利
点を有する：増幅産物をゲルにおいて直接読み取る場
合、試験感度は１ｍｌの試料材料当たり約１０００生物
である。対照的に、オリゴヌクレオチドプローブへのハ
イブリッド形成及び化学発光読み取りの組み合わせの場
合、１ｍｌの試料材料当たり１０生物の検出が達成され
る。
特異的増幅産物に特異的にハイブリッド形成することが
できる。ジャイレースＡ遺伝子の部分を最初に突然変異
−特異的プライマーを用いて増幅し、次いで増幅産物を
特異的にオリゴフクレオチドプローブにハイブリッド形
成させる方法は、直接的な増幅診断と比較して以下の利
点を有する：増幅産物をゲルにおいて直接読み取る場
合、試験感度は１ｍｌの試料材料当たり約１０００生物
である。対照的に、オリゴヌクレオチドプローブへのハ
イブリッド形成及び化学発光読み取りの組み合わせの場
合、１ｍｌの試料材料当たり１０生物の検出が達成され
る。
【００４１】代りのポリヌクレオチドプローブの選択及
び合成 オリゴヌクレオチドプローブの代わりに５３４塩基のポ
リヌクレオチドプローブを、突然変異−特異的増幅産物
のすべてに共通のヌクレオチド配列２５１５〜３０４８
から選択した。ポリヌクレオチドプローブは、プライマ
ー１（配列番号：１）及びプライマー４（配列番号：
４）を用いたＰＣＲ増幅により合成した。増幅の間に化
学発光試験のためのビオチン−ｄＵＴＰを同時に増幅遺
伝子プローブ中に挿入した。
び合成 オリゴヌクレオチドプローブの代わりに５３４塩基のポ
リヌクレオチドプローブを、突然変異−特異的増幅産物
のすべてに共通のヌクレオチド配列２５１５〜３０４８
から選択した。ポリヌクレオチドプローブは、プライマ
ー１（配列番号：１）及びプライマー４（配列番号：
４）を用いたＰＣＲ増幅により合成した。増幅の間に化
学発光試験のためのビオチン−ｄＵＴＰを同時に増幅遺
伝子プローブ中に挿入した。
【００４２】ＱＲＳＡの検出 本発明に記載の３つのプライマーセットを用いたジャイ
レースＡ遺伝子の部分の増幅の直後に、いずれかの所望
の分析法を用いてＱＲＳＡを決定することができる。
レースＡ遺伝子の部分の増幅の直後に、いずれかの所望
の分析法を用いてＱＲＳＡを決定することができる。
【００４３】１つの可能な読み取り法は、アガロースゲ
ル電気泳動により分離された増幅産物をエチジウムブロ
ミドなどの挿入剤を用いて染色することから成る。
ル電気泳動により分離された増幅産物をエチジウムブロ
ミドなどの挿入剤を用いて染色することから成る。
【００４４】別の可能性は、蛍光−標識ヌクレオシドト
リホスフェートを増幅産物中に挿入することである。こ
れは試験感度を顕著に向上させる。
リホスフェートを増幅産物中に挿入することである。こ
れは試験感度を顕著に向上させる。
【００４５】さらに別の可能性は、増幅に蛍光−標識プ
ライマーを用いるか、又はビオチニル化プライマーを蛍
光ヌクレオチドと組み合わせ、ストレプタビジン−カッ
プリング磁気粒子に結合させ、分離し、蛍光を半定量的
に測定することができる末端ビオチニル化、蛍光−標識
増幅産物を得ることである。
ライマーを用いるか、又はビオチニル化プライマーを蛍
光ヌクレオチドと組み合わせ、ストレプタビジン−カッ
プリング磁気粒子に結合させ、分離し、蛍光を半定量的
に測定することができる末端ビオチニル化、蛍光−標識
増幅産物を得ることである。
【００４６】同時に半定量的読み取りを可能にする最も
感度の高い方法は、３つの突然変異−特異的プライマー
セットの増幅産物を記載のオリゴヌクレオチドプローブ
にハイブリッド形成させる記載の方法である。この方法
も臨床試料材料中のＱＲＳＡを定量することを可能にす
る。例えばジゴキシゲニン−ｄＵＴＰを増幅の間に挿入
し、ビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブを用いる
と、ハイブリッド形成複合体をストレプタビジン−塗布
磁気粒子上で分離することができ、アルカリ性ホスファ
ターゼにカップリングさせた抗ジゴキシゲニン抗体を用
いると、基質としてＡＭＰＤを用いた化学発光により複
合体を半定量的に読み取ることができる。限定された数
の細胞を含む試料を細胞標準として同時に共増幅し、化
学発光試験において読み取ると、臨床試料材料により発
光される化学発光シグナルから生物の数を半定量的に決
定することができる。
感度の高い方法は、３つの突然変異−特異的プライマー
セットの増幅産物を記載のオリゴヌクレオチドプローブ
にハイブリッド形成させる記載の方法である。この方法
も臨床試料材料中のＱＲＳＡを定量することを可能にす
る。例えばジゴキシゲニン−ｄＵＴＰを増幅の間に挿入
し、ビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブを用いる
と、ハイブリッド形成複合体をストレプタビジン−塗布
磁気粒子上で分離することができ、アルカリ性ホスファ
ターゼにカップリングさせた抗ジゴキシゲニン抗体を用
いると、基質としてＡＭＰＤを用いた化学発光により複
合体を半定量的に読み取ることができる。限定された数
の細胞を含む試料を細胞標準として同時に共増幅し、化
学発光試験において読み取ると、臨床試料材料により発
光される化学発光シグナルから生物の数を半定量的に決
定することができる。
【００４７】
【実施例】実施例１ スターターオリゴヌクレオチド（プライマー）の合成 選択されたスターターオリゴヌクレオチド（プライマ
ー）をＳ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｍ．Ｃａｒ
ｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ，２２，１８５９，１９８１のホスホルアミダイト法
を用いて化学的に合成した。以下のヌクレオチド配列を
合成した。
ー）をＳ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｍ．Ｃａｒ
ｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ，２２，１８５９，１９８１のホスホルアミダイト法
を用いて化学的に合成した。以下のヌクレオチド配列を
合成した。
【００４８】ＰＣＲプライマー１、突然変異Ｃ／Ｔに関
して特異的：配列番号：１ ＰＣＲプライマー２、突然変異Ｔ／Ｇに関して特異的：
配列番号：２ ＰＣＲプライマー３、突然変異Ｇ／Ａに関して特異的：
配列番号：４ ＰＣＲプライマー４、すべての突然変異に関する相補鎖
プライマー：配列番号：４実施例２ ＱＲＳＡのためのオリゴヌクレオチドプローブの合成及
び選択 突然変異−特異的増幅産物のすべてに含まれ、スタフィ
ロコッカス・アウレウスのジャイレースＡに特異的なヌ
クレオチド領域２５５３〜２５８８からオリゴヌクレオ
チドプローブを選択した。
して特異的：配列番号：１ ＰＣＲプライマー２、突然変異Ｔ／Ｇに関して特異的：
配列番号：２ ＰＣＲプライマー３、突然変異Ｇ／Ａに関して特異的：
配列番号：４ ＰＣＲプライマー４、すべての突然変異に関する相補鎖
プライマー：配列番号：４実施例２ ＱＲＳＡのためのオリゴヌクレオチドプローブの合成及
び選択 突然変異−特異的増幅産物のすべてに含まれ、スタフィ
ロコッカス・アウレウスのジャイレースＡに特異的なヌ
クレオチド領域２５５３〜２５８８からオリゴヌクレオ
チドプローブを選択した。
【００４９】選択されたオリゴヌクレオチドプローブを
Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄＭ．Ｃａｒｕｔｈｅ
ｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２
２，１８５９，１９８１のホスホルアミダイト法を用い
て化学的に合成した。以下のヌクレオチド配列を合成し
た： ＧＴＡＣＧＴＡＴＧＧＣＴＡＡＧＡＴＴＴＣＡＧＴＴＡ
ＴＣＧＴＴＡＴＣＣＧ ヌクレオチド領域２５５３〜２５８８からの３６量体オ
リゴヌクレオチド、配列番号：５。
Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄＭ．Ｃａｒｕｔｈｅ
ｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２
２，１８５９，１９８１のホスホルアミダイト法を用い
て化学的に合成した。以下のヌクレオチド配列を合成し
た： ＧＴＡＣＧＴＡＴＧＧＣＴＡＡＧＡＴＴＴＣＡＧＴＴＡ
ＴＣＧＴＴＡＴＣＣＧ ヌクレオチド領域２５５３〜２５８８からの３６量体オ
リゴヌクレオチド、配列番号：５。
【００５０】オリゴヌクレオチドプローブをその３’末
端においてＢｏｌｌｕｍ，Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｂ
ｏｙｅｒ ｅｄ，Ｖｏｌ １０，ｐ１４５ Ａｃａｄｅ
ｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの方法を用いて標
識した。末端基標識はビオチン−ｄＵＴＰを用いて非−
放射性的に行った。（Ｃｈａｎｇ，Ｌ．Ｍ．Ｓ．，Ｂｏ
ｌｌｕｍ Ｔ.Ｊ.，Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ．２４６，９
０９，１９７１）。
端においてＢｏｌｌｕｍ，Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｂ
ｏｙｅｒ ｅｄ，Ｖｏｌ １０，ｐ１４５ Ａｃａｄｅ
ｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの方法を用いて標
識した。末端基標識はビオチン−ｄＵＴＰを用いて非−
放射性的に行った。（Ｃｈａｎｇ，Ｌ．Ｍ．Ｓ．，Ｂｏ
ｌｌｕｍ Ｔ.Ｊ.，Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ．２４６，９
０９，１９７１）。
【００５１】１０μｌの反応緩衝液（カコジル酸カリウ
ム、１モル／ｌ；Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１２５ミリモル／
ｌ；牛血清アルブミン、１．２５ｍｇ／ｍｌ；ｐＨ６．
６；２５℃）、１〜２μｇのオリコヌクレオチド、２５
単位のターミナルトランスフェラーゼ、ＣｏＣｌ2、
２．５ミリモル／ｌ及び１μｌのビオチン−ｄＵＴＰ
（１ミリモル／ｌ）を含み、３７℃でインキュベートさ
れた５０μｌの混合物中で６０分後に約５０％の３’末
端−標識が達成される。
ム、１モル／ｌ；Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１２５ミリモル／
ｌ；牛血清アルブミン、１．２５ｍｇ／ｍｌ；ｐＨ６．
６；２５℃）、１〜２μｇのオリコヌクレオチド、２５
単位のターミナルトランスフェラーゼ、ＣｏＣｌ2、
２．５ミリモル／ｌ及び１μｌのビオチン−ｄＵＴＰ
（１ミリモル／ｌ）を含み、３７℃でインキュベートさ
れた５０μｌの混合物中で６０分後に約５０％の３’末
端−標識が達成される。
【００５２】実施例３ ＱＲＳＡのためのポリヌクレオチドプローブの合成及び
選択 突然変異−特異的増幅産物のすべてに含まれ、Ｓ．アウ
レウスのジャイレースＡに特異的なヌクレオチド領域２
５１５〜３０４８からポリヌクレオチドプローブを選択
した。
選択 突然変異−特異的増幅産物のすべてに含まれ、Ｓ．アウ
レウスのジャイレースＡに特異的なヌクレオチド領域２
５１５〜３０４８からポリヌクレオチドプローブを選択
した。
【００５３】それをプライマー１（配列番号：１）及び
プライマー４（配列番号：４）を用い、実施例４に従っ
てＰＣＲ増幅により合成した。実施例６に従う化学発光
試験のために、ビオチン−ｄＵＴＰを増幅の間に増幅遺
伝子中に挿入した。
プライマー４（配列番号：４）を用い、実施例４に従っ
てＰＣＲ増幅により合成した。実施例６に従う化学発光
試験のために、ビオチン−ｄＵＴＰを増幅の間に増幅遺
伝子中に挿入した。
【００５４】実施例４ ＰＣＲによるＱＲＳＡ−特異的ＤＮＡ増幅 標的ＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応により増幅した（Ｅ
Ｐ ２００３６２；２０１１８４）。
Ｐ ２００３６２；２０１１８４）。
【００５５】ＰＣＲ反応において以下を用いた：１０ｐ
ｇのキノロン−耐性スタフィロコッカス類に関するゲノ
ムＤＮＡ、０．１７μモルのプライマー１〜４、配列番
号：１〜４、２．５単位のＣｅｔｕｓ／Ｐｅｒｋｉｎ−
Ｅｌｍｅｒ Ｔａｑ ポリメラーゼ及び合計１００μｌ
のＰＣＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．３、２ｍＭ ＭｇＣｌ2及び０．
０１％ゼラチン）中の２００μモル／ｌの各ｄＮＴＰ。
増幅はＣｅｔｕｓ／Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒからのＰ
ＣＲプロセッサーにおいて行った。すべての場合、３つ
のＰＣＲ試料は３つのジャイレース突然変異に関して特
異的に調製し、それぞれプライマーセット１（プライマ
ー１＋４）、プライマーセット２（プライマー２＋４）
及びプライマーセット３（プライマー３＋４）を含ん
だ。
ｇのキノロン−耐性スタフィロコッカス類に関するゲノ
ムＤＮＡ、０．１７μモルのプライマー１〜４、配列番
号：１〜４、２．５単位のＣｅｔｕｓ／Ｐｅｒｋｉｎ−
Ｅｌｍｅｒ Ｔａｑ ポリメラーゼ及び合計１００μｌ
のＰＣＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．３、２ｍＭ ＭｇＣｌ2及び０．
０１％ゼラチン）中の２００μモル／ｌの各ｄＮＴＰ。
増幅はＣｅｔｕｓ／Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒからのＰ
ＣＲプロセッサーにおいて行った。すべての場合、３つ
のＰＣＲ試料は３つのジャイレース突然変異に関して特
異的に調製し、それぞれプライマーセット１（プライマ
ー１＋４）、プライマーセット２（プライマー２＋４）
及びプライマーセット３（プライマー３＋４）を含ん
だ。
【００５６】実施例６に従う化学発光試験のために、Ｐ
ＣＲ産物を標識するために０．１５μモルのジゴキシゲ
ニン−ｄＵＴＰもＰＣＲに含めた。
ＣＲ産物を標識するために０．１５μモルのジゴキシゲ
ニン−ｄＵＴＰもＰＣＲに含めた。
【００５７】最初に９５℃において２分３０秒間のＤＮ
Ａの初期融解を試料につき行い、次いでこの後に１サイ
クル当たり９５℃で１分間のＤＮＡ変性、５８℃におい
て１分間のプライマーアニーリング、及び７２℃におい
て１分間のプライマー伸長を行った。２５サイクルの
後、試料を４℃に直接冷却した。
Ａの初期融解を試料につき行い、次いでこの後に１サイ
クル当たり９５℃で１分間のＤＮＡ変性、５８℃におい
て１分間のプライマーアニーリング、及び７２℃におい
て１分間のプライマー伸長を行った。２５サイクルの
後、試料を４℃に直接冷却した。
【００５８】実施例５ 増幅産物の直接評価 ＤＮＡ増幅産物を直接評価するために、エチジウムブロ
ミドなどの挿入剤を増幅の後に用いるか、又はフルオレ
セイン−ｄＵＴＰもしくはヒドロキシクマリン−ｄＵＴ
Ｐなどの蛍光ヌクレオシドトリホスフェートを増幅の間
に挿入する。ビオチン−ｄＵＴＰもしくはジゴキシゲニ
ン−ｄＵＴＰも用いることができ、抗体にカップリング
させたアルカリ性ホスファターゼを用いて株の読み取り
を行う。感度が低い場合、蛍光マーカーを用いて適当に
標識されたプライマーも用いることができる。
ミドなどの挿入剤を増幅の後に用いるか、又はフルオレ
セイン−ｄＵＴＰもしくはヒドロキシクマリン−ｄＵＴ
Ｐなどの蛍光ヌクレオシドトリホスフェートを増幅の間
に挿入する。ビオチン−ｄＵＴＰもしくはジゴキシゲニ
ン−ｄＵＴＰも用いることができ、抗体にカップリング
させたアルカリ性ホスファターゼを用いて株の読み取り
を行う。感度が低い場合、蛍光マーカーを用いて適当に
標識されたプライマーも用いることができる。
【００５９】増幅産物を０．８％アガロースゲル上に負
荷し、１００ｍＡにおいて３０分間電気泳動させた。キ
ノロン−感受性及びキノロン−耐性スタフィロコッカス
類の蛍光シグナルをＵＶトランスイルミネーター下で直
接評価した。
荷し、１００ｍＡにおいて３０分間電気泳動させた。キ
ノロン−感受性及びキノロン−耐性スタフィロコッカス
類の蛍光シグナルをＵＶトランスイルミネーター下で直
接評価した。
【００６０】実施例６ ＤＮＡ増幅産物の化学発光遺伝子−プローブ試験 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（ＥＰ ２００３６
２）及びＬＣＲ（ＥＰ３２０３０８）などの適した標的
増幅法を遺伝子プローブ法と組み合わせることにより、
従来の遺伝子−プローブ読み取り法の感度と比較して有
意な感度の向上が達成される。
２）及びＬＣＲ（ＥＰ３２０３０８）などの適した標的
増幅法を遺伝子プローブ法と組み合わせることにより、
従来の遺伝子−プローブ読み取り法の感度と比較して有
意な感度の向上が達成される。
【００６１】液体ハイブリッド形成試験を実施例４に従
い、１００ｎｇの３’−ビオチニル化遺伝子プローブ及
び増幅ＤＮＡを用いた逆相試験として、５０μｌの体積
で行った。
い、１００ｎｇの３’−ビオチニル化遺伝子プローブ及
び増幅ＤＮＡを用いた逆相試験として、５０μｌの体積
で行った。
【００６２】１００℃で１０分間加熱し、次いで０℃に
冷却した後、５０μｌの２ｘハイブリッド形成混合物
（５０ｍｌの２０ｘｓｓＣ、１ｇの遮断剤（ｂｌｏｃｋ
ｉｎｇｒｅａｇｅｎｔ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、２
ｍｌの１０％ラウロイル サルコシン及び２００μｌの
２０％ＳＤＳ、二重蒸留Ｈ2Ｏを用いて１００ｍｌとす
る）を加え、ハイブリッド形成（オリゴヌクレオチドプ
ローブ）を３７℃で５〜１０分間行った。磁気ビーズを
１ｘハイブリッド形成混合物で予備処理し、磁石を用い
てそれらを分離した後に液体をピペットで除去し、ハイ
ブリッド形成試料及び１００μｌの１ｘハイブリッド形
成混合物を加え、穏やかに動かしながら混合物を室温で
５〜１０分間インキュベートした。カップリングしたハ
イブリッド形成複合体をビーズと共に分離し、残留液を
ピペットで除去し、次いでビーズを緩衝液Ｂ（０．１Ｓ
ＳＣ；０．１％ＳＤＳ）で１回洗浄した。
冷却した後、５０μｌの２ｘハイブリッド形成混合物
（５０ｍｌの２０ｘｓｓＣ、１ｇの遮断剤（ｂｌｏｃｋ
ｉｎｇｒｅａｇｅｎｔ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、２
ｍｌの１０％ラウロイル サルコシン及び２００μｌの
２０％ＳＤＳ、二重蒸留Ｈ2Ｏを用いて１００ｍｌとす
る）を加え、ハイブリッド形成（オリゴヌクレオチドプ
ローブ）を３７℃で５〜１０分間行った。磁気ビーズを
１ｘハイブリッド形成混合物で予備処理し、磁石を用い
てそれらを分離した後に液体をピペットで除去し、ハイ
ブリッド形成試料及び１００μｌの１ｘハイブリッド形
成混合物を加え、穏やかに動かしながら混合物を室温で
５〜１０分間インキュベートした。カップリングしたハ
イブリッド形成複合体をビーズと共に分離し、残留液を
ピペットで除去し、次いでビーズを緩衝液Ｂ（０．１Ｓ
ＳＣ；０．１％ＳＤＳ）で１回洗浄した。
【００６３】次いで遮断反応、及び化学発光を用いたハ
イブリッド形成の検出のための抗体反応を行った。ＤＮ
Ａを装填したビーズを５００μｌの緩衝液２（０．１Ｍ
マレイン酸：０.１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７.５；１％
遮断剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））で１回処理した。室
温で５分間インキュベートした後、ビーズを分離し、液
体をピペットで除去し；２５０μｌの抗体共役体溶液
（緩衝液２中の１：２５００のＡＣ）を加え、混合物を
室温で１０分間インキュベートし、次いでビーズを分離
し、液体をピペットで除去し、次いでビーズを５００μ
ｌの洗浄緩衝液で穏やかに動かしながら３０秒間で２
回、及び２分間で１回処理した。次いでビーズを緩衝液
３中の１：１００のＡＭＰＰＤを含む１００μｌの検出
溶液と共に３７℃における水浴中で１０分間インキュベ
ートし、次いで発光光度計において４７７ｎｍで化学発
光を測定した（ＬｕｍａｃからのＬｕｍａｃｏｕｎｔｅ
ｒ）。
イブリッド形成の検出のための抗体反応を行った。ＤＮ
Ａを装填したビーズを５００μｌの緩衝液２（０．１Ｍ
マレイン酸：０.１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７.５；１％
遮断剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））で１回処理した。室
温で５分間インキュベートした後、ビーズを分離し、液
体をピペットで除去し；２５０μｌの抗体共役体溶液
（緩衝液２中の１：２５００のＡＣ）を加え、混合物を
室温で１０分間インキュベートし、次いでビーズを分離
し、液体をピペットで除去し、次いでビーズを５００μ
ｌの洗浄緩衝液で穏やかに動かしながら３０秒間で２
回、及び２分間で１回処理した。次いでビーズを緩衝液
３中の１：１００のＡＭＰＰＤを含む１００μｌの検出
溶液と共に３７℃における水浴中で１０分間インキュベ
ートし、次いで発光光度計において４７７ｎｍで化学発
光を測定した（ＬｕｍａｃからのＬｕｍａｃｏｕｎｔｅ
ｒ）。
【００６４】１０6〜１０1スタフィロコッカス生物に相
当するＤＮＡ量をこの試験を用いて検出することができ
る。非特異的血液ＤＮＡを加えた後、血液１ｍｌ当たり
１０生物という同じ検出限界も達成できた。血液ＤＮＡ
自身は、ハイブリッド形成試験において低いバックグラ
ウンドシグナルを生ずるのみである。
当するＤＮＡ量をこの試験を用いて検出することができ
る。非特異的血液ＤＮＡを加えた後、血液１ｍｌ当たり
１０生物という同じ検出限界も達成できた。血液ＤＮＡ
自身は、ハイブリッド形成試験において低いバックグラ
ウンドシグナルを生ずるのみである。
【００６５】実施例７ スタフィロコッカス核酸の単離 スタフィロコッカス類に感染した試料材料、例えば感染
血液を８０００ｒｐｍにおいて５〜１０分間遠心し、上
澄み液をピペットで除去して捨てた。１５％のスクロー
スを含む５０μｌのＴＥを沈降物（約１８０〜２００μ
ｌ）に加え、その後２０μｌのリゾチーム＋リゾスタフ
ィン（１ｍｌの二重蒸留Ｈ2Ｏ中に１０＋５ｍｇ）を加
え、次いで混合物を３７℃で１５分間インキュベートし
た。続いてＱｕｉａｇｅｎからのＱｕｉａｍｐ ＤＮＡ
キットを用いて仕上げを行った。２５μｌのプロテイナ
ーゼＫ及び２３５μｌのＡＬ緩衝液を加えた後、成分を
混合し、７０℃で１０分間処理した。次いで混合物を氷
上で冷却し、２４０μｌの１００％エタノールを加え、
成分を簡単に混合した後、それをＱｕｉａｇｅｎカラム
上に負荷した。次いでカラムを８０００ｒｐｍで１分間
遠心し、溶離物を捨てた。次いで７００μｌのＡＷ洗浄
緩衝液をカラム上に負荷し、それをもう一度８０００ｒ
ｐｍで１分間遠心した。次いでカラムをもう一度同量の
ＡＷ緩衝液で洗浄し、８０００ｒｐｍで１分間及び１４
０００ｒｐｍで１０秒間遠心し、溶離物を捨てた。次い
で２００μｌの二重蒸留Ｈ2Ｏをカラム上に負荷し、そ
れを８０００ｒｐｍで１分間遠心した。溶離物は精製さ
れた核酸溶液を含み、それを増幅に用いることができ
る。
血液を８０００ｒｐｍにおいて５〜１０分間遠心し、上
澄み液をピペットで除去して捨てた。１５％のスクロー
スを含む５０μｌのＴＥを沈降物（約１８０〜２００μ
ｌ）に加え、その後２０μｌのリゾチーム＋リゾスタフ
ィン（１ｍｌの二重蒸留Ｈ2Ｏ中に１０＋５ｍｇ）を加
え、次いで混合物を３７℃で１５分間インキュベートし
た。続いてＱｕｉａｇｅｎからのＱｕｉａｍｐ ＤＮＡ
キットを用いて仕上げを行った。２５μｌのプロテイナ
ーゼＫ及び２３５μｌのＡＬ緩衝液を加えた後、成分を
混合し、７０℃で１０分間処理した。次いで混合物を氷
上で冷却し、２４０μｌの１００％エタノールを加え、
成分を簡単に混合した後、それをＱｕｉａｇｅｎカラム
上に負荷した。次いでカラムを８０００ｒｐｍで１分間
遠心し、溶離物を捨てた。次いで７００μｌのＡＷ洗浄
緩衝液をカラム上に負荷し、それをもう一度８０００ｒ
ｐｍで１分間遠心した。次いでカラムをもう一度同量の
ＡＷ緩衝液で洗浄し、８０００ｒｐｍで１分間及び１４
０００ｒｐｍで１０秒間遠心し、溶離物を捨てた。次い
で２００μｌの二重蒸留Ｈ2Ｏをカラム上に負荷し、そ
れを８０００ｒｐｍで１分間遠心した。溶離物は精製さ
れた核酸溶液を含み、それを増幅に用いることができ
る。
【００６６】実施例８ 臨床試料材料中のＱＲＳＡの検出 ＱＲＳＡ ＤＮＡを実施例７に記載の方法に従って臨床
試料材料から単離した。次いでスタフィロコッカスＤＮ
Ａライセートを、実施例４に記載の通りにＱＲＳＡ−特
異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて適した増幅
法により増幅した。増幅された核酸を配列番号：５のオ
リゴヌクレオチドプローブにハイブリッド形成させ、緊
縮条件下で形成され、増幅スタフィロコッカス核酸及び
遺伝子−プローブＤＮＡを含む特異的ハイブリッド形成
複合体をＤｙｎａｌ磁気粒子を用いて分離し、実施例６
に記載の通りに化学発光読み取りを用いて定量的に測定
した。
試料材料から単離した。次いでスタフィロコッカスＤＮ
Ａライセートを、実施例４に記載の通りにＱＲＳＡ−特
異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて適した増幅
法により増幅した。増幅された核酸を配列番号：５のオ
リゴヌクレオチドプローブにハイブリッド形成させ、緊
縮条件下で形成され、増幅スタフィロコッカス核酸及び
遺伝子−プローブＤＮＡを含む特異的ハイブリッド形成
複合体をＤｙｎａｌ磁気粒子を用いて分離し、実施例６
に記載の通りに化学発光読み取りを用いて定量的に測定
した。
【００６７】ジャイレースＡ遺伝子−特異的ハイブリッ
ド形成シグナルは、１０1生物の濃度でＱＲＳＡに感染
した血液ライセートにおいてさえ検出された。
ド形成シグナルは、１０1生物の濃度でＱＲＳＡに感染
した血液ライセートにおいてさえ検出された。
【００６８】実施例９ ＱＲＳＡの定量的検出 臨床試料材料、例えば血液から実施例７に記載の通りに
ＱＲＳＡを単離し、実施例４及び６に記載の通りに増幅
の後に化学発光試験を行った。臨床試料の他に、５００
ｎｇの血液ＤＮＡの存在中で１０6〜１０0細胞の細胞数
に相当するＱＲＳＡ ＤＮＡを含む試料を平行して増幅
し、化学発光試験において分析した。血液中において１
０6〜１０のＱＲＳＡの細胞標準の化学発光シグナル
を、平行して分析され、３セットのプライマーを用いた
試験において検出された１０3及び１０2の生物を含む試
験試料と比較した。細胞数ＤＮＡ標準からの化学発光シ
グナル（１０3及び１０2）は１０3及び１０2生物を含む
試験試料の化学発光シグナルと非常に良く一致し、化学
発光試験を例えば血液中のＱＲＳＡを半定量的に測定す
るために用いることができることを示す。
ＱＲＳＡを単離し、実施例４及び６に記載の通りに増幅
の後に化学発光試験を行った。臨床試料の他に、５００
ｎｇの血液ＤＮＡの存在中で１０6〜１０0細胞の細胞数
に相当するＱＲＳＡ ＤＮＡを含む試料を平行して増幅
し、化学発光試験において分析した。血液中において１
０6〜１０のＱＲＳＡの細胞標準の化学発光シグナル
を、平行して分析され、３セットのプライマーを用いた
試験において検出された１０3及び１０2の生物を含む試
験試料と比較した。細胞数ＤＮＡ標準からの化学発光シ
グナル（１０3及び１０2）は１０3及び１０2生物を含む
試験試料の化学発光シグナルと非常に良く一致し、化学
発光試験を例えば血液中のＱＲＳＡを半定量的に測定す
るために用いることができることを示す。
【００６９】本発明の主たる特徴及び態様は以下の通り
である。
である。
【００７０】１．配列表の配列番号：１及び４における
と同様のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするジャ
イレース：Ａのヌクレオチド配列の位置２５３３のＣ／
Ｔ点突然変異を増幅し、特異的に検出するためのスター
ターオリゴヌクレオチド（プライマー）。
と同様のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするジャ
イレース：Ａのヌクレオチド配列の位置２５３３のＣ／
Ｔ点突然変異を増幅し、特異的に検出するためのスター
ターオリゴヌクレオチド（プライマー）。
【００７１】２．配列表の配列番号：２及び４における
と同様のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするジャ
イレース：Ａのヌクレオチド配列の位置２５３２のＴ／
Ｇ点突然変異を増幅し、特異的に検出するためのスター
ターオリゴヌクレオチド（プライマー）。
と同様のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするジャ
イレース：Ａのヌクレオチド配列の位置２５３２のＴ／
Ｇ点突然変異を増幅し、特異的に検出するためのスター
ターオリゴヌクレオチド（プライマー）。
【００７２】３．配列表の配列番号：３及び４における
と同様のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするジャ
イレース：Ａのヌクレオチド配列の位置２５４４のＧ／
Ａ点突然変異を増幅し、特異的に検出するためのスター
ターオリゴヌクレオチド（プライマー）。
と同様のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするジャ
イレース：Ａのヌクレオチド配列の位置２５４４のＧ／
Ａ点突然変異を増幅し、特異的に検出するためのスター
ターオリゴヌクレオチド（プライマー）。
【００７３】４．配列表の配列番号：５におけると同様
のヌクレオチド配列又はその標識配列を含むことを特徴
とするキノロン−耐性スタフィロコッカス類からのＤＮ
Ａ又はＲＮＡとハイブリッド形成するオリゴヌクレオチ
ドプローブ。
のヌクレオチド配列又はその標識配列を含むことを特徴
とするキノロン−耐性スタフィロコッカス類からのＤＮ
Ａ又はＲＮＡとハイブリッド形成するオリゴヌクレオチ
ドプローブ。
【００７４】５．５３４塩基又はその部分を含み、配列
表の配列番号：６におけると同様のヌクレオチド配列又
はその部分もしくはその標識配列を含むことを特徴とす
るキノロン−耐性スタフィロコッカス類からのＤＮＡ又
はＲＮＡとハイブリッド形成するポリヌクレオチドプロ
ーブ。
表の配列番号：６におけると同様のヌクレオチド配列又
はその部分もしくはその標識配列を含むことを特徴とす
るキノロン−耐性スタフィロコッカス類からのＤＮＡ又
はＲＮＡとハイブリッド形成するポリヌクレオチドプロ
ーブ。
【００７５】６．ａ）上記１〜３項に記載の突然変異−
特異的プライマーセットを用いた増幅の後にキノロン−
耐性スタフィロコッカス・アウレウス生物からの核酸を
さらにハイブリッド形成させずに直接分析するか、ある
いは遺伝子プローブと反応させる、 ｂ）上記４又は５項に記載のオリゴヌクレオチドプロー
ブ又はポリヌクレオチドプロードを用いてキノロン−耐
性スタフィロコッカス・アウレウス核酸に特異的にハイ
ブリッド形成させ、検出する、 ｃ）オリゴヌクレオチドプローブ又はポリヌクレオチド
プローブを既知の方法を用いてリポーター分子で標識す
る、 ｄ）増幅された標的ＤＮＡ上の標識を用いることにより
ハイブリッド形成複合体がキノロン−耐性スタフィロコ
ッカス類の存在及び量の直接の尺度を与えることを特徴
とする試料材料中のキノロン−耐性スタフィロコッカス
・アウレウス生物の検出の方法。
特異的プライマーセットを用いた増幅の後にキノロン−
耐性スタフィロコッカス・アウレウス生物からの核酸を
さらにハイブリッド形成させずに直接分析するか、ある
いは遺伝子プローブと反応させる、 ｂ）上記４又は５項に記載のオリゴヌクレオチドプロー
ブ又はポリヌクレオチドプロードを用いてキノロン−耐
性スタフィロコッカス・アウレウス核酸に特異的にハイ
ブリッド形成させ、検出する、 ｃ）オリゴヌクレオチドプローブ又はポリヌクレオチド
プローブを既知の方法を用いてリポーター分子で標識す
る、 ｄ）増幅された標的ＤＮＡ上の標識を用いることにより
ハイブリッド形成複合体がキノロン−耐性スタフィロコ
ッカス類の存在及び量の直接の尺度を与えることを特徴
とする試料材料中のキノロン−耐性スタフィロコッカス
・アウレウス生物の検出の方法。
【００７６】７．上記１〜３項に記載のプライマーをジ
ャイレースＡ遺伝子の部分の増幅に用いることを特徴と
する上記６項に記載の方法。
ャイレースＡ遺伝子の部分の増幅に用いることを特徴と
する上記６項に記載の方法。
【００７７】８．上記４項に記載のオリゴヌクレオチド
プローブを用いることを特徴とする上記６項に記載の方
法。
プローブを用いることを特徴とする上記６項に記載の方
法。
【００７８】９．上記５項に記載のポリヌクレオチドプ
ローブを用いることを特徴とする上記６項に記載の方
法。
ローブを用いることを特徴とする上記６項に記載の方
法。
【００７９】１０．上記１〜５項に記載のオリゴヌクレ
オチドの１つ又はそれ以上、ならびに又緩衝液及び他の
溶液を含む、臨床試料材料中のキノロン耐性に関する分
析を便利に行うための試験キット。
オチドの１つ又はそれ以上、ならびに又緩衝液及び他の
溶液を含む、臨床試料材料中のキノロン耐性に関する分
析を便利に行うための試験キット。
【００８０】
【表５】
【００８１】
【表６】
【００８２】
【表７】
【００８３】
【表８】
【００８４】
【表９】
【００８５】
【表１０】
【００８６】
【表１１】
【図１】増幅試験の直接評価。３つのキノロン−耐性
Ｓ．アウレウス病原体から、及びキノロン−感受性野生
型からの、１０3細胞に相当するＤＮＡを、点突然変異
−特異的プライマーセット、プライマーセット１（配列
番号：１及び配列番号：４のプライマー）、プライマー
セット（配列番号：２及び配列番号：４のプライマ
ー）、ならびにプライマーセット３（配列番号：３及び
配列番号：４のプライマー）を用いて増幅し、次いでア
ガロースゲル電気泳動により分析した。耐性株がそのジ
ャイレースＡ遺伝子中に対応する点突然変異を含む場
合、エチジウムブロミドで染色したアガロースゲルにお
いて１本のバンドが見えるだけである。野生型ジャイレ
ースには点突然変異がないので、キノロン−感受性Ｓ．
アウレウス野生型（ＷＴ２５０３５）は、３つのプライ
マーセットを用いた増幅バンドは与えない。Ｓ．アウレ
ウス株２５７６８はＣ／Ｔ突然変異を有し、株２５９０
８はＴ／Ｇ突然変異を有し、株２５９０８はＴ／Ｇ突然
変異を有し、株２５９１８はＧ／Ａ突然変異を有する。
Ｓ．アウレウス病原体から、及びキノロン−感受性野生
型からの、１０3細胞に相当するＤＮＡを、点突然変異
−特異的プライマーセット、プライマーセット１（配列
番号：１及び配列番号：４のプライマー）、プライマー
セット（配列番号：２及び配列番号：４のプライマ
ー）、ならびにプライマーセット３（配列番号：３及び
配列番号：４のプライマー）を用いて増幅し、次いでア
ガロースゲル電気泳動により分析した。耐性株がそのジ
ャイレースＡ遺伝子中に対応する点突然変異を含む場
合、エチジウムブロミドで染色したアガロースゲルにお
いて１本のバンドが見えるだけである。野生型ジャイレ
ースには点突然変異がないので、キノロン−感受性Ｓ．
アウレウス野生型（ＷＴ２５０３５）は、３つのプライ
マーセットを用いた増幅バンドは与えない。Ｓ．アウレ
ウス株２５７６８はＣ／Ｔ突然変異を有し、株２５９０
８はＴ／Ｇ突然変異を有し、株２５９０８はＴ／Ｇ突然
変異を有し、株２５９１８はＧ／Ａ突然変異を有する。
【図２】３つのキノロン−耐性Ｓ．アウレウス病原体、
２５７６８（１）、２５９０８（２）及び２５９１８
（３）からの、約１０００細胞に相当するＤＮＡ、なら
びにキノロン−感受性Ｓ．アウレウス野生型（２５０３
５（４））からのＤＮＡを点突然変異−特異的プライマ
ーセット１〜３（配列番号：１〜４）を用いて増幅し、
同時にジゴキシゲニン−ｄＵＴＰを増幅産物に挿入し
た。増幅産物をビオチニル化オリゴヌクレオチドプロー
ブ（配列番号：５）にハイブリッド形成させ、ハイブリ
ッド形成複合体をストレプタビジン−塗布磁気粒子を用
いて分離した。増幅産物の形成を実施例６に従って化学
発光シグナルを用いて測定した。化学発光シグナルは、
耐性株がジャイレースＡ遺伝子中に対応する点突然変異
を含み、そのために対応するプライマー対１、２又は３
により増幅される場合のみに得られる。キノロン−感受
性Ｓ／ウアレウス株２５０３５は、野生型ジャイレース
中に点突然変異がないので、３つのプライマーセットを
用いた化学発光シグナルを与えない。適したプライマー
セットを用いて得られる増幅から明らかな通り、Ｓ．ア
ウレウス株２５７６８はＣ／Ｔ突然変異のために耐性で
あり、株２５９０８はＴ／Ｇ突然変異のために耐性であ
り、株２５９１８はＧ／Ａ突然変異のために耐性であ
る。
２５７６８（１）、２５９０８（２）及び２５９１８
（３）からの、約１０００細胞に相当するＤＮＡ、なら
びにキノロン−感受性Ｓ．アウレウス野生型（２５０３
５（４））からのＤＮＡを点突然変異−特異的プライマ
ーセット１〜３（配列番号：１〜４）を用いて増幅し、
同時にジゴキシゲニン−ｄＵＴＰを増幅産物に挿入し
た。増幅産物をビオチニル化オリゴヌクレオチドプロー
ブ（配列番号：５）にハイブリッド形成させ、ハイブリ
ッド形成複合体をストレプタビジン−塗布磁気粒子を用
いて分離した。増幅産物の形成を実施例６に従って化学
発光シグナルを用いて測定した。化学発光シグナルは、
耐性株がジャイレースＡ遺伝子中に対応する点突然変異
を含み、そのために対応するプライマー対１、２又は３
により増幅される場合のみに得られる。キノロン−感受
性Ｓ／ウアレウス株２５０３５は、野生型ジャイレース
中に点突然変異がないので、３つのプライマーセットを
用いた化学発光シグナルを与えない。適したプライマー
セットを用いて得られる増幅から明らかな通り、Ｓ．ア
ウレウス株２５７６８はＣ／Ｔ突然変異のために耐性で
あり、株２５９０８はＴ／Ｇ突然変異のために耐性であ
り、株２５９１８はＧ／Ａ突然変異のために耐性であ
る。
【図３】３つのキノロン−耐性Ｓ．アウレウス病原体、
２５７６８（１）、２５９０８（２）及び２５９１８
（３）からの、約１００細胞に相当するＤＮＡ、ならび
にキノロン−感受性Ｓ．アウレウス野生型（２５０３５
（４））からのＤＮＡを点突然変異−特異的プライマー
セット１〜３（配列番号：１〜４）を用いて増幅し、同
時にジゴキシゲニン−ｄＵＴＰを増幅産物に挿入した。
増幅産物をビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブ
（配列番号：５）にハイブリッド形成させ、ハイブリッ
ド形成複合体をストレプタビジン−塗布磁気粒子を用い
て分離した。増幅産物の形成を実施例６に従って化学発
光シグナルを用いて測定した。化学発光シグナルは、耐
性株がジャイレースＡ遺伝子中に対応する点突然変異を
含み、そのために対応するプライマー対１、２又は３に
より増幅される場合のみに得られる。キノロン−感受性
Ｓ／ウアレウス株２５０３５は、野生型ジャイレース中
に点突然変異がないので、３つのプライマーセットを用
いた化学発光シグナルを与えない。適したプライマーセ
ットを用いて得られる増幅から明らかな通り、Ｓ．アウ
レウス株２５７６８はＣ／Ｔ突然変異のために耐性であ
り、株２５９０８はＴ／Ｇ突然変異のために耐性であ
り、株２５９１８はＧ／Ａ突然変異のために耐性であ
る。
２５７６８（１）、２５９０８（２）及び２５９１８
（３）からの、約１００細胞に相当するＤＮＡ、ならび
にキノロン−感受性Ｓ．アウレウス野生型（２５０３５
（４））からのＤＮＡを点突然変異−特異的プライマー
セット１〜３（配列番号：１〜４）を用いて増幅し、同
時にジゴキシゲニン−ｄＵＴＰを増幅産物に挿入した。
増幅産物をビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブ
（配列番号：５）にハイブリッド形成させ、ハイブリッ
ド形成複合体をストレプタビジン−塗布磁気粒子を用い
て分離した。増幅産物の形成を実施例６に従って化学発
光シグナルを用いて測定した。化学発光シグナルは、耐
性株がジャイレースＡ遺伝子中に対応する点突然変異を
含み、そのために対応するプライマー対１、２又は３に
より増幅される場合のみに得られる。キノロン−感受性
Ｓ／ウアレウス株２５０３５は、野生型ジャイレース中
に点突然変異がないので、３つのプライマーセットを用
いた化学発光シグナルを与えない。適したプライマーセ
ットを用いて得られる増幅から明らかな通り、Ｓ．アウ
レウス株２５７６８はＣ／Ｔ突然変異のために耐性であ
り、株２５９０８はＴ／Ｇ突然変異のために耐性であ
り、株２５９１８はＧ／Ａ突然変異のために耐性であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｑ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:445） (72)発明者 ライナー・エンデルマン ドイツ42113ブツペルタール・インデンビ ルケン152アー
Claims (7)
- 【請求項１】 配列表の配列番号：１及び４におけると
同様のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするジャイ
レース：Ａのヌクレオチド配列の位置２５３３のＣ／Ｔ
点突然変異を増幅し、特異的に検出するためのスタータ
ーオリゴヌクレオチド（プライマー）。 - 【請求項２】 配列表の配列番号：２及び４におけると
同様のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするジャイ
レース：Ａのヌクレオチド配列の位置２５３２のＴ／Ｇ
点突然変異を増幅し、特異的に検出するためのスタータ
ーオリゴヌクレオチド（プライマー）。 - 【請求項３】 配列表の配列番号：３及び４におけると
同様のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするジャイ
レース：Ａのヌクレオチド配列の位置２５４４のＧ／Ａ
点突然変異を増幅し、特異的に検出するためのスタータ
ーオリゴヌクレオチド（プライマー）。 - 【請求項４】 配列表の配列番号：５におけると同様の
ヌクレオチド配列又はその標識配列を含むことを特徴と
するキノロン−耐性スタフィロコッカス類（Ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｉ）からのＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリ
ッド形成するオリゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項５】 ５３４塩基又はその部分を含み、配列表
の配列番号：６におけると同様のヌクレオチド配列又は
その部分もしくはその標識配列を含むことを特徴とする
キノロン−耐性スタフィロコッカス類からのＤＮＡ又は
ＲＮＡとハイブリッド形成するポリヌクレオチドプロー
ブ。 - 【請求項６】 ａ）請求項１〜３に記載の突然変異−特
異的プライマーセットを用いた増幅の後にキノロン−耐
性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）生物からの核酸をさらに
ハイブリッド形成させずに直接分析するか、あるいは遺
伝子プローブと反応させる、 ｂ）請求項４又は５に記載のオリゴヌクレオチドプロー
ブ又はポリヌクレオチドプローブを用いてキノロン−耐
性スタフィロコッカス・アウレウス核酸に特異的にハイ
ブリッド形成させ、検出する、 ｃ）オリゴヌクレオチドプローブ又はポリヌクレオチド
プローブを既知の方法を用いてリポーター分子で標識す
る、 ｄ）増幅された標的ＤＮＡ上の標識を用いることにより
ハイブリッド形成複合体がキノロン−耐性スタフィロコ
ッカス類の存在及び量の直接の尺度を与えることを特徴
とする試料材料中のキノロン−耐性スタフィロコッカス
・アウレウス生物の検出の方法。 - 【請求項７】 請求項１〜５に記載のオリゴヌクレオチ
ドの１つ又はそれ以上、ならびにさらに緩衝液及び他の
溶液を含む、臨床試料材料中のキノロン耐性に関する分
析を便利に行うための試験キット。
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