JP2001507921A - 生物学的液体中の遺伝子配列の検出 - Google Patents

生物学的液体中の遺伝子配列の検出

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Abstract

(57)【要約】 生物学的液体中の遺伝子例えば突然変異した遺伝子及び癌遺伝子を検出し及び定量するための方法を提供する。液体試料（例えば、血漿、血清、尿等）を得て、除蛋白し、試料中に存在するＤＮＡを抽出する。ＤＮＡの変性の後に、増幅手順例えばＰＣＲ又はＬＣＲを行なって突然変異した遺伝子配列を増幅する。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的液体中の遺伝子配列の検出発明の背景 可溶性ＤＮＡは、健康な個人の血液中に約５〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在す ることが知られている。可溶性ＤＮＡは、自己免疫疾患特に全身性エリテマト− デス（ＳＬＥ）及び、ウイルス性肝炎、癌及び肺塞栓症を含む他の病気を有する 個人の血液において高いレベルで存在すると考えられている。循環可溶性ＤＮＡ が、特に血液中に現れやすいＤＮＡの特定の型を代表するか否かは知られていな い。しかしながら、研究は、このＤＮＡが二本鎖ＤＮＡとして又は二本鎖及び一 本鎖ＤＮＡの混合物として振る舞うこと及びそれが一本鎖領域を有する天然のＤ ＮＡからなるらしいことを示している。Dennin，R.H.，Klin．Wochenschr．57:4 51-456，(1979)。 Steinman，C.R.，J．Clin．Invest.，73:832-841，(1984)。Fournie，G.J．等、Analytical Biochem．158:250-256，（1986）。ＳＬＥの患者においては、正常 のヒトゲノムＤＮＡに比べて、ヒト反復配列（Ａｌｕ）含有断片に富んでいると いう証拠もある。 癌患者においては、血液中の循環可溶性ＤＮＡのレベルは、有意に増大してい る。高いＤＮＡレベルの高い発病率を有するらしい癌の型は、膵臓癌、乳癌、結 腸直腸 癌及び肺癌を含む。これらの形態の癌において、血液中の循環可溶性ＤＮＡのレ ベルは、通常、５０ｎｇ／ｍｌを超え、一般に、その平均値は１５０ｎｇ／ｍｌ を上回る。Leon等、Can．Res．37:646-650，1977;Shapiro等、Cancer 51:2116-2 120，1983。 突然変異した癌遺伝子が実験及びヒト腫瘍において記載された。幾つかの例に おいては、ある種の突然変異した癌遺伝子は、特定の型の腫瘍と関連している。 これらの例は、それぞれ約７５％、５０％及び３５％の発病率を有する膵臓、結 腸及び肺の（コドン１２の位置１若しくは２に突然変異を有するKirsten ras（K -ras）遺伝子の）腺癌である。最も高頻度の突然変異は、グリシンからバリン（ GGTからGTT）、グリシンからシステイン（GGTからTGT）及びグリシンからアスパ ラギン酸（GGTからGAT）への変化である。コドン１２の他の突然変異は、一般的 突然変異より少ないが、AGT及びCGTへの突然変異を含む。かかる患者の体細胞中 のK-ras遺伝子は、突然変異していない。 血液試料等の少量の生物学的液体の試料中の突然変異した癌遺伝子又は他の遺 伝子の配列を検出する能力は、有用な診断用の道具を提供するであろう。突然変 異したK-ras遺伝子配列の血漿中の存在は、患者の中に突然変異した癌遺伝子を 含む腫瘍が存在することを示している。突然変異したK-ras遺伝子の源は他に知 られていないので、恐らく、これは、特異的な腫瘍マーカーとなろ う。それ故に、この評価は、診断を示唆し及び／又は確認するのに有用であろう 。突然変異したK-ras配列の血漿中の量は、腫瘍の大きさ、腫瘍の成長速度及び ／又は腫瘍の退行に関係し得る。それ故に、突然変異したK-ras配列の逐次的定 量は、腫瘍塊の変化を測定するのに有用であり得る。殆どのヒトの癌は突然変異 した配列を有するので、血漿ＤＮＡの突然変異配列についての評価は、非常に広 い適用可能性及び有用性を有し得る。発明の要約 この発明は、遺伝子配列（例えば、癌遺伝子配列）が血液中に存在することを 認識し、生物学的液体例えば血漿中の遺伝子配列例えば突然変異した癌遺伝子及 びその他の遺伝子を検出し定量する方法を提供する。この方法を診断技術として 用いて、血中の循環性可溶性ＤＮＡのレベルが増加する傾向のあるある種の癌及 び他の病気を検出することが出来る。更に、この方法は、ある種の癌患者に対す る治療養生法の進行を評価する場合にも有用である。 この発明の方法は、生物学的液体（例えば、尿、血漿若しくは血清、痰、脳脊 髄液）の試料を得る初期工程、その次の除蛋白及びＤＮＡの抽出を含む。このＤ ＮＡを、次いで、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣ Ｒ）等の技術によって、試料中に存在する正常遺伝子配列を突然変異した遺伝子 配列から区 別する対立遺伝子特異的方法で増幅する。突然変異の位置が知られた一具体例に おいては、４対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、対立遺伝子特異的な ＰＣＲ増幅を行なう。これらの４プライマー対は、第１鎖上の突然変異部位に隣 接する遺伝子配列に相補的な、４つの対立遺伝子特異的な第１のプライマーのセ ットを含む。これらの４つのプライマーは、互いにユニークであり、野生型ヌク レオチド又はこの公知の位置に起こり得る３つの可能な突然変異の１つに相補的 な３’ヌクレオチドにおいてのみ異なる。これらの４つのプライマー対は又、４ つのユニークな第１鎖プライマーの各々と組み合わせて用いる単一の共通プライ マーをも含む。この共通プライマーは、第１のプライマー位置から幾らか離れた このＤＮＡの第２鎖の断片に相補的である。 この増幅手順は、この突然変異を含む公知の塩基対断片を増幅する。従って、こ の技術は、１０7倍過剰の正常ＤＮＡのバックグラウンド中の僅かしか突然変異 していないＤＮＡ配列を検出することが出来るので高レベルの感度を示す利点を 有する。この方法は、正常ＤＮＡが２０倍過剰より多いと突然変異を検出しない 対立遺伝子特異的な放射性標識プローブを用いるＰＣＲ生成物のハィブリダイゼ ーションにより点突然変異を検出する方法よりもずっと高感度であると考えられ る。 上記の具体例は、突然変異がＤＮＡ上の公知の位置に存在する場合に有用であ る。突然変異が２つの可能な位 置の１つに存在することが知られている他の具体例において、４つのプライマー 対の第１のセット（即ち、各々が共通プライマーと対を形成する４つのユニーク な対立遺伝子特異的プライマー）は、上述の通りである。４つのプライマー対の 第２のセットは、センス鎖上の第２の可能な突然変異部位に隣接する遺伝子配列 に相補的な４つの対立遺伝子特異的なプライマーを含む。これらの４プライマー は、互いにユニークであり、野生型ヌクレオチド又はこの第２の公知の部位に起 こり得る３つの可能な突然変異の１つに相補的な３’ヌクレオチドにおいてのみ 異なる。これらの対立遺伝子特異的なプライマーの各々は、突然変異の位置から 離れた、他の鎖に相補的な他の共通プライマーと対を作る。 上記のＰＣＲ技術は、好ましくは、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠きそれ故 に校正能力を欠くＤＮＡポリメラーゼを利用する。好ましいＤＮＡポリメラーゼ は、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）ＤＮＡポリメラーゼであ る。 増幅手順においては、通常、ＤＮＡ熱サイクラーにおいて約３０サイクルを行 なえば十分である。５分間の初期変性期間の後に、各増幅サイクルは、好ましく は、９５℃での約１分間の変性期間、５８℃で約２分間のプライマーアニーリン グ期間及び７２℃で約１分間の伸長期間を含む。 増幅の後に、ＰＣＲから増幅したＤＮＡのアリコート を、エチジウムブロミド染色を用いるアガロースゲル中での電気泳動等の技術に よって分析することが出来る。標識したプライマーを用い、続いて、フィルム上 で放射能又は化学ルミネセンスを検出することにより増幅した生成物を同定する ことによって改善された感度が達成され得る。標識したプライマーは又、元の試 料中の標的配列の量を測定するために利用し得る増幅した生成物の定量をも与え 得る。 ここで用いる場合には、対立遺伝子特異的な増幅は、突然変異した対立遺伝子 に特異的なプライマーを用い、それ故に、プライマーの３’末端と標的遺伝子配 列との間に１００％の相補性がある場合に配列の増幅を生じさせるこの発明の特 徴をいう。従って、対立遺伝子特異的な増幅は、突然変異した対立遺伝子がなけ れば増幅が起こらず有利である。これは、極めて鋭敏な検出技術を提供する。図面の簡単な説明 図１Ａ及び１Ｂは、K-rasの単一の公知の位置に存在する突然変異を有する突 然変異K-ras遺伝子の検出のための増幅戦略の図式表示である。 図２Ａ及び２Ｂは、K-rasの２つの可能な位置の２番目に存在する突然変異を 有する突然変異K-ras遺伝子の検出のための増幅戦略の図式表示である。発明の詳細な説明 突然変異したＤＮＡ（特異的な単一コピー遺伝子等）の検出は、診断目的及び ／又は病気の程度の評価のために潜在的に有用である。正常な血漿は、１ｍｌ当 たり約１０ｎｇの可溶性ＤＮＡを含むと考えられている。血漿中の可溶性ＤＮＡ の濃度は、癌及びある種の他の病気を有する患者において著しく増加することが 知られている。公知の突然変異遺伝子配列例えば医学的状況を示すK-ras遺伝子 配列の存在を検出する能力は、従って、非常に望ましい。 本発明は、生物学的液体中のかかる突然変異対立遺伝子の検出を、１０7倍過 剰の正常ＤＮＡのバックグラウンドに対してでも、可能にする高度に鋭敏な診断 方法を提供する。この方法は、一般に、可溶性ＤＮＡを含む生物学的液体の試料 を得る工程、ＤＮＡの除蛋白、抽出及び変性の工程を含み、その後に、突然変異 対立遺伝子に特異的なプライマーを含むプライマーのセットを用いて対立遺伝子 特異的な方法でＤＮＡを増幅する。この対立遺伝子特異的な増幅技術によって、 その突然変異対立遺伝子のみが増幅される。増幅の後に、種々の技術を用いて増 幅されたＤＮＡの存在を検出し、増幅されたＤＮＡを定量することが出来る。増 幅されたＤＮＡの存在は、突然変異遺伝子の存在を表しており、存在する増幅し た遺伝子の量は、病気の程度の指標を提供することが出来る。 この技術は、単一コピー遺伝子に由来し、その遺伝子の公知の位置で突然変異 した配列の生物学的液体中での同定に適用することが出来る。可溶性ＤＮＡを有 する生物学的液体（例えば、血漿、血清、尿、痰、脳脊髄液）の試料を集め、Ｄ ＮＡを除蛋白して抽出するために処理する。その後に、そのＤＮＡを変性させる 。このＤＮＡを、次いで、突然変異を有する遺伝子を増幅するように対立遺伝子 特異的な方法で増幅する。 この液体試料からのＤＮＡの除蛋白中に、蛋白質の迅速な除去及び任意のＤＮ アーゼの実質的に同時の不活性化が重要であると考えられる。ＤＮＡを、試料の アリコートに等容の２０％ＮａＣｌを加え、次いでその混合物を約３〜４分間煮 沸することによって除蛋白する。続いて、標準技術を用いて、ＤＮＡの抽出及び 単離を達成することが出来る。好ましい抽出工程は、液体試料中のＤＮＡ量を遠 心分離等の技術によって濃縮することを含む。 ２０％ＮａＣｌ溶液の利用とその後の煮沸とは、蛋白質を迅速に除去し且つ同 時に存在する任意のＤＮアーゼを不活性化すると考えられる。血漿中に存在する ＤＮＡは、ヌクレオソームの形態であると考えられ、それ故に、血液中において ＤＮアーゼから保護されていると考えられる。しかしながら、一度ＤＮＡを抽出 すれば、それはＤＮアーゼに感受性となる。従って、除蛋白と同時にＤＮアーゼ を不活性化してＤＮアーゼが増幅に利用し 得るＤＮＡの量を減じることにより増幅工程を阻害するのを防止することは重要 である。２０％ＮａＣｌ溶液が現時点で好適であっても、他の濃度のＮａＣｌ及 び他の塩類も又用い得ることは理解される。 ＤＮアーゼが利用可能なＤＮＡに影響するのを防止する間に、他の技術も又Ｄ ＮＡを抽出するために用いることが出来る。血漿ＤＮＡはヌクレオソーム（主と して、ヒストン及びＤＮＡ）の形態であると考えられるので、血漿ＤＮＡは又、 ヒストン又は他のヌクレオソーム蛋白質に対する抗体を用いて単離することも出 来よう。他のアプローチは、血漿（又は血清）を、ヌクレオソームと結合するで あろう付着させた抗ヒストン抗体を有する固体支持体上を通すことであろう。す すいだ後で、ヌクレオソームを抗体から、豊富な画分又は精製画分として溶出さ せることが出来る。続いて、ＤＮＡを、上記の又はその他の従来法を用いて抽出 することが出来る。 一具体例において、検出したい遺伝子の特異的点突然変異に相補的な３’末端 ヌクレオチドを有するプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によ って対立遺伝子特異的な増幅を達成することが出来る。ＰＣＲは、好ましくは、 Saiki，「ゲノムＤＮＡの増幅」、ＰＣＲプロトコール、M.A．Innis等編、Acade mic Press，San Diego(1990)，13頁により記載された方法により行なう。更に、 ＰＣＲを、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠きそれ故に増幅中にＤＮＡプライマ ーの３’末端ヌクレ オチドにおける単一塩基ミスマッチを修復する能力を欠く熱安定性のＤＮＡポリ メラーゼを用いて行なう。前記のように、好ましいＤＮＡポリメラーゼはT．aqu aticus ＤＮＡポリメラーゼである。適当なT．aquaticusＤＮＡポリメラーゼは、 Perkin-ElmerからAmpliTaqＤＮＡポリメラーゼとして市販されている。３’エキ ソヌクレアーゼ活性を欠く他の有用なＤＮＡポリメラーゼは、New England Biol abs，Inc．から市販されているVentR（exo-）(古細菌Thermococcus litoralisに 由来するＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する大腸菌株から精製)、Thermus flauu s に由来し、Amersham Corporationから市販されているHot Tub ＤＮＡポリメラ ーゼ、及びThermus thermophilusに由来し、Molecular Biology Resource Inc., 又はPerkin-Elmer Corp.から市販されているTthＤＮＡポリメラーゼを含む。 この方法は、４対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる増幅を行なう。４ つのプライマーの第１のセットは、互いにユニークな４つの対立遺伝子特異的な プライマーを含む。これらの４つの対立遺伝子特異的なプライマーは、それぞれ 、対立遺伝子特異的なプライマーから離れた他のＤＮＡ鎖とアニールする共通の 離れたプライマーと対を作る。１つの対立遺伝子特異的なプライマーは、野生型 対立遺伝子（即ち、正常な対立遺伝子に特異的な対立遺伝子）に相補的であるが 、他方、他のプライ マーはプライマーの３’末端ヌクレオチドにてミスマッチを有する。上記のよう に、これらの４つのユニークなプライマーは、個々に、増幅（例えば、ＰＣＲ増 幅）のために共通の離れたプライマーと対を作る。突然変異対立遺伝子が存在す るときは、対立遺伝子特異的なプライマーを含むプライマー対は、検出可能な生 成物を効率よく増幅して産生する。ミスマッチしたプライマーはアニールするこ とが出来ても、その鎖は、増幅の間に伸長しない。 上記のプライマーの組合せは、突然変異が関心のある対立遺伝子上の単一位置 に存在することが知られている場合に有用である。突然変異が２つの位置の１つ に存在し得る場合には、８対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることが出 来る。４対の第１のセットは、上記のようである。第２の４対又はプライマーは 、センス鎖上の第２の可能な突然変異部位に隣接する遺伝子配列に相補的な４つ の対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを含む。これらの４つのプ ライマーは、野生型ヌクレオチド又はこの第２の公知の位置に起こり得る３つの 可能な突然変異の１つに相補的な末端３’ヌクレオチドにおいて異なっている。 ４つの対立遺伝子特異的なプライマーの各々は、突然変異の上流のアンチセンス 鎖に相補的な単一の共通の離れたプライマーと対を作る。 上記プライマーを用いるＰＣＲ増幅の間に、存在する 対立遺伝子に完全に相補的なプライマーのみがアニールして伸長する。これらの 非相補的なヌクレオチドを有するプライマーは、部分的にアニールするが、増幅 工程中に伸長しない。増幅は、一般に、適当なサイクル数即ち約２０〜４０最も 好ましくは約３０回にわたって進行される。この技術は、標的遺伝子の突然変異 含有断片を増幅し、十分な感度を有して、正常ＤＮＡの重大なバックグラウンド に対して、突然変異した標的遺伝子の検出を可能にする。 このK-ras遺伝子は、通常、公知のコドンにおいて１又は２の公知の位置に起 きる点突然変異を有する。他の癌遺伝子は、公知であるが変化し易い位置を有し 得る。K-ras遺伝子の突然変異は、典型的に、ある種の癌例えば肺、膵臓及び結 腸の腺癌と関連していることが知られている。図１Ａから図２Ｂは、ＰＣＲ増幅 によって、K-ras癌遺伝子の第１２コドンの第１又は第２位置に生じる突然変異 を検出するための戦略を説明している。前述のように、K-rasの第１２コドンの 第１又は第２位置の突然変異は、しばしば、ある種の癌例えば肺、膵臓及び結腸 の腺癌に関連している。 図１Ａ及び１Ｂに言及して、患者試料からのＤＮＡをセンス鎖及びアンチセン ス鎖を表す２本鎖（Ａ及びＢ）に分ける。このＤＮＡは、同一コドン（即ち、コ ドン１２）の１位置（Ｘ1）に起きる点突然変異を有する癌遺伝子を表す。１位 置の突然変異を検出するために用い る対立遺伝子特異的なプライマーは、４つのＰ１センスプライマー（Ｐ１−Ａ） のセットを含んでおり、各々は他に対してユニークである。これらの４つのＰ１ −Ａプライマーは、Ａ鎖上の突然変異部位に隣接する遺伝子配列に相補的である 。これらの４つのＰ１−Ａプライマーは、好ましくは、互いに、野生型ヌクレオ チド又はこの公知の位置に起こり得る３つの可能な突然変異の１つに相補的な末 端３’ヌクレオチドだけが異なっている。対立遺伝子上に突然変異を含む断片に 完全に相補的なＰ１−Ａプライマーだけが増幅中にアニールして伸長する。 Ｐ１−Ａプライマーの位置に対して下流のＢ鎖の断片に相補的な共通の下流プ ライマー（Ｐ１−Ｂ）を各Ｐ１−Ａプライマーと組合せて用いる。図１で説明し たＰ１−Ｂプライマーは、ＰＣＲ中に対立遺伝子にアニールして伸長する。表１ に同定され且つ図１Ｂに説明されているＰ１−Ａ及びＰ１−Ｂプライマーは、１ ６１塩基対を有する癌遺伝子の断片を増幅する。 図２Ａ及び２Ｂは、４つのユニークな、対立遺伝子特異的プライマー（Ｐ２− Ａ）の更なるセットを利用して癌遺伝子のコドン１２の位置２（Ｘ2）に起こり 得る突然変異を検出する計画を説明する。図１Ａ及び１Ｂに説明した増幅戦略は 、図２Ａ及び２Ｂに説明したものと組合せて、コドン１２の位置１（Ｘ1）及び 位置２（Ｘ2）の何れかの突然変異を検出するために用いられよう。 図２Ａ及び２Ｂに言及して、４つのユニークな対立遺伝子特異的なプライマー （Ｐ２−Ａ）のセットを用いてコドン１２の位置２（Ｘ2）に存在する突然変異 を検出する。これらの４つのＰ２−Ａプライマーは、第２の可能な突然変異部位 に隣接する遺伝子配列に相補的である。これらの４つのプライマーは、互いにユ ニークであり、好ましくは、野生型ヌクレオチド又は第２の公知の位置（Ｘ2） に起こり得る３つの可能な突然変異の１つに相補的な末端３’ヌクレオチドにお いてのみ異なっている。 この突然変異のＡ鎖の上流の断片に相補的な単一の共通上流プライマー（Ｐ２ −Ｂ）を、ユニークなＰ２−Ａプライマーの各々と組合せて用いる。表１に同定 され且つ図２Ｂで説明されたＰ２−Ａ及びＰ２−Ｂプライマーは、１４６塩基対 を有する断片を増幅する。 この増幅手順中に、ポリメラーゼ連鎖反応を約２０〜４０サイクル最も好まし くは約３０サイクルまで進行させる。約５分間の初期変性期間の後に、各サイク ルは、AmpliTaqＤＮＡポリメラーゼを用いて、典型的には、約１分間の９５℃で の変性、２分間の約５８℃でのプライマーアニーリング及び１分間の７２℃での 伸長を含む。上記の温度及びサイクル回数が現在好ましいが、種々の改変が可能 であることを注意する。実際、異なるＤＮＡポリメラーゼ及び／又は異なるプラ イマーの利用は、増幅条件の変化を必要とし得る。当業者は、容易に増幅条 件を最適化することが出来るであろう。 コドン１２の第１又は第２位置に点突然変異を有するK-ras遺伝子を検出する この発明の方法を実施するのに有用な典型的なＤＮＡプライマーを、表１に説明 する。表１ K-ras遺伝子（５’−３’）のコドン１２の位置１及び２の突然変異を（ＰＣＲ によって）増幅するのに用いるプライマー *下線を引いた塩基は、突然変異を示す。 これらの表１に説明したプライマーは、当然、単なる例である。通常の知識を 有する当業者に理解されるよう に、これらのプライマーに種々の改変を行なうことが可能である。例えば、これ らのプライマーを長くすることや短くすることが出来よう（但し、３’末端ヌク レオチドは同じに維持しなければならない）。更に、３’末端から３〜６ヌクレ オチド戻る幾つかのミスマッチが起こり得るが、効率を妨げることはありそうも ない。これらの共通プライマーも又、異なる部位に相補的であってもっと長い又 は短い増幅した生成物を産生するように様々に組み立てることが出来る。 一具体例において、各対立遺伝子特異的なプライマーの長さは異なってよく、 多数の対立遺伝子特異的なプライマーを同じＰＣＲ反応においてそれらの共通の 離れたプライマーと組合せることを可能にする。増幅された生成物の長さは、ど の対立遺伝子特異的なプライマーが増幅に利用されたかを示すであろう。増幅さ れた生成物の長さは、どの突然変異が試料中に存在するかを示すであろう。 表１並びに図１Ｂ及び図２Ｂに説明したプライマー及び他の利用出来るであろ うものは、通常の知識を有する当業者によって容易に合成され得る。例えば、類 似のプライマーの製造が、Stork等、Oncogene，6:857-862，1991により記載され た。 他の増幅方法及び戦略を利用して、この発明の方法によって生物学的液体中の 遺伝子配列を検出することも出来る。例えば、他のアプローチは、ＰＣＲとリガ ーゼ連 鎖反応（ＬＣＲ）とを組合せることであろう。ＰＣＲはＬＣＲより早く増幅し且 つ開始のために一層少ない標的ＤＮＡのコピーしか必要としないので、ＰＣＲを 第１工程として用い、次いで、ＬＣＲを進めることが出来よう。上述の対立遺伝 子特異的増幅で用いる共通プライマー等のプラィマーは、長さが約２８５塩基対 に及び、多かれ少なかれK-rasのコドン１２上に集中するが、標準ＰＣＲ条件を 用いてこの断片を増幅するために用いることが出来よう。増幅した生成物（約２ ８５塩基対配列）を、次いで、突然変異が存在するか否かを指示するであろう対 立遺伝子特異的な方法で、ＬＣＲ又はリガーゼ検出反応（ＬＤＲ）において用い ることが出来よう。他の恐らくは一層感度の劣っているアプローチは、増幅及び 対立遺伝子特異的な識別の両方にＬＣＲ又はＬＤＲを用いることであろう。遅い 反応は、直鎖状増幅を生じて有利である。従って、増幅した生成物の量は、元の 試料中の標的ＤＮＡの量の反映であり、それ故、定量を与える。 ＬＣＲは、完全長の標的配列に相補的な隣接オリゴヌクレオチドの対を利用す る（Barany F.，PNAS 88:189-193，1991;Barany F.，PCR Methods and Applicat ions 1:5-16，1991）。もし標的配列がプライマーとこれらの配列の接合部にお いて完全に相補的であるならば、ＤＮＡリガーゼは、隣接する３’及び５’末端 ヌクレオチドを結合して結合した配列を形成するであろう。 もし熱安定性ＤＮＡリガーゼを熱サイクルで用いれば、結合した配列が順次増幅 されよう。オリゴヌクレオチドの接合部における単一塩基ミスマッチは、ライゲ ーション及び増幅を妨げるであろう。従って、この工程は、対立遺伝子特異的で ある。突然変異に特異的な３’ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの他の セットは、他の反応において、突然変異対立遺伝子を同定するのに用いられよう 。一連の標準的条件を用いて、任意の公知の部位におけるすべての可能な突然変 異を検出することが出来よう。ＬＣＲは、典型的には、４つのプライマーとのオ リゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのためにゲノムＤＮＡの両鎖を標的と して利用し、反復熱サイクルにより、生成物は指数的に増加する。 この反応の変形が、標的ＤＮＡに相補的であり且つＤＮＡリガーゼによって同 様に結合される２つの隣接オリゴヌクレオチドを利用するリガーゼ検出反応（Ｌ ＤＲ）である（Barany F.，PNAS 88:189-193，1991）。多数の熱サイクルの後に 、生成物は、直鎖状で増幅される。従って、ＬＤＲの生成物の量は、標的ＤＮＡ の量を反映する。これらのプライマーの適当な標識は、増幅した生成物の検出を 、対立遺伝子特異的な方法で可能にし、並びに、元の標的ＤＮＡの量の定量を可 能にする。この型の反応の１つの利点は、自動化定量を可能にすることである（ Nickerson等、PNAS 87：8923-8927，1990）。 対立遺伝子特異的なライゲーション及び増幅のための ＬＣＲで用いてK-ras遺伝子のコドン１２の位置１の突然変異を同定するのに適 当なオリゴヌクレオチドの例を、下記に、表２に説明する。表２ ＬＣＲで用いるためのオリゴヌクレオチド （５’−３’） *下線を引いた塩基は、突然変異を示す。 ＬＣＲを含む増幅手順の間に、４オリゴヌクレオチドを一度に用いる。例えば 、オリゴヌクレオチドＡ１及び各Ａ２オリゴヌクレオチドは別個にセンス鎖上で 対を作る。オリゴヌクレオチドＢ１及び各Ｂ２オリゴヌクレオチドも又、別個に アンチセンス鎖上で対を作る。ＬＣＤ 手順について、２つのオリゴヌクレオチドが対を作る（即ち、正常の及び突然変 異した標的ＤＮＡ配列の直鎖状増幅のためのＡ２オリゴヌクレオチドの各々を伴 うＡ１）。 この発明の方法は、種々の生物学的液体中に存在するＤＮＡ中の他の癌遺伝子 の検出及び定量に適用することが出来る。ｐ５３遺伝子は、この遺伝子における 変化が、ヒトの癌における最も一般的な遺伝的異常であって多くの解剖学的部位 から生じる多くの組織学的型の癌に起きるので、便利な検出及び定量が有用であ り得る遺伝子である。ｐ５３の突然変異は、この遺伝子内の多くのコドンに起こ り得るが、８０％は４つの保存された領域内に位置し、又はエクソン５、６、７ 及び８内の「ホットスポット」内に位置する。ｐ５３内の突然変異を同定する現 在最も人気のある方法は、多段階手順である。それは、ゲノムＤＮＡからのエク ソン５〜８のＰＣＲ増幅を、個々に、組合せて（即ち、多重に）、又はときには １つより多いエクソンの単位として含む。別のアプローチは、全細胞ＲＮＡを単 離し、逆転写酵素で転写することである。反応混合物の一部を直接、適当なオリ ゴヌクレオチドの対をプライマーとして用いて、ＰＣＲにかけてｐ５３ｃＤＮＡ の領域を増幅する。これらの２つの型の増幅の後に、ポリアクリルアミドゲル中 で電気泳動したときに移動度の差によって正常ＤＮＡから点突然変異を有する増 幅した試料を同定する一本鎖コンホメーショ ン多形分析（ＳＳＣＰ）を行なう。もし断片がＳＳＣＰによって突然変異を含む ことが示されたならば、後者を非対称ＰＣＲにより増幅して配列をジデオキシチ ェーンターミネーション法により決定する（Murakami等、Can．Res.，51:3356-3 3612，1991）。 更に、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、同時多数突然変異を一層よく評価する ことが出来るので、ｐ５３に有用である。突然変異を測定した後に、その後の臨 床過程において患者の血漿中の突然変異した遺伝子を多数回定量するための対立 遺伝子特異的プライマーを調製することが出来る。 好ましくは、この発明の方法は、約５ｍｌの生物学的液体試料を用いて行なう 。しかしながら、この方法は又、試料供給が限られている場合にはもっと少ない 試料サイズを用いて実施することも出来る。かかる場合には、試料中に存在する ＤＮＡを先ず共通プライマーを用いて増幅するのが有利であろう。その後、対立 遺伝子特異的プライマーを用いて増幅を行なうことが出来る。 この発明の方法は、診断用キットにおいて具体化することが出来る。かかるキ ットは、ＤＮＡの単離のための試薬並びに検出法において用いるプライマーのセ ット、及び増幅に有用な試薬を含むことが出来る。このキットに有用な試薬の内 、ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅を達成する。好適ポリメラーゼは、Perkin-E lmerからAmpliTaqＤＮＡポリメラーゼとして市販されているThermus aquaticusＤＮＡポリメラーゼである。突然変異遺伝子配列の定量のた めに、このキットは又、陽性対照のための突然変異ＤＮＡの試料、並びに既知量 の工作した（engineered）配列を有する競争ＰＣＲによる定量のためのチューブ をも含む。 スロットブロットサザーンハイブリダイゼーション又は競争ＰＣＲを用いて、 突然変異K-ras配列の定量を達成することが出来る。スロットブロットサザーン ハイブリダイセーションは、Verlaan-de Vries等、Gene 50:313-20，1986により 記載されたような比較的緊縮条件下で、対立遺伝子特異的プライマーをプローブ として用いて達成することが出来る。５ｍｌの血漿から抽出した全ＤＮＡを、１ ０倍の連続稀釈を用いてスロットブロットし、その後に、対立遺伝子特異的プラ イマーのバッテリー及びＰＣＲ及びＬＣＲを用いるスクリーニングによって前に 測定された特定の患者の腫瘍ＤＮＡにおける公知の突然変異に相補的であるよう に選択した末端標識した対立遺伝子特異的プローブにハイブリダイズさせる。陽 性のオートラジオグラフィーシグナルを、K-rasのコドン１２に同じ突然変異を 有する腫瘍細胞培養からの稀釈ＤＮＡの標準シリーズ（１〜５００ｎｇ）との比 較の後に濃度測定により半定量的に等級付ける（同じ方法におけるスロットブロ ットとして調製）。 改変競争ＰＣＲ（Gilliland等、Proc ．Nat．Acad．Sci. ，USA 87:2725:79;199 0;Gilliland等、「ＭＲＮ Ａの定量のための競争ＰＣＲ」、ＰＣＲプロトコール（Acad．Press）６０〜６ ９頁、1990）は、潜在的に一層敏感なスロットブロットサザーンハイブリダイゼ ーションとは別の定量方法として働くことが出来よう。この定量方法においては 、同じ対又はプライマーを用いて、増幅工程の間互いに競争する２つのＤＮＡテ ンプレートを増幅させる。１つのテンプレートは、未知量の関心ある配列即ちK- rasであり、他方は、既知量の工作した欠失変異体（増幅したときに、増幅した 突然変異K-ras配列と区別し得る一層短い生成物を産生する）である。上記のよ うに血漿から抽出した全ＤＮＡを、スロットブロットサザーンハイブリダイゼー ションを用い、放射性標識したヒト反復配列プローブ（ＢＬＵＲ８）を用いて定 量する。これは、全抽出プラスミッドＤＮＡの定量を与えるので同じ量を各ＰＣ Ｒ反応において用いることが出来る。各患者からのＤＮＡ（１００ｎｇ）を、各 患者について前に同定した特定の突然変異に対応するＰ１又はＰ２対立遺伝子特 異的プライマーを含むＰＣＲマスターミクスチャーに、総容量４００μｌで加え る。１０ｎｇの血漿ＤＮＡを含む４０μｌのマスターミクスチャーを、０．１〜 １０アトモルにわたる競争テンプレートの１０μｌを含む１０チューブの各々に 加える。各反応混合物は、ｄＮＴＰ（終濃度２５μＭで、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ を５０μＣｉ／ｍｌで含む）、５０ピコモルの各プライマー、２ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２単位のT ．aquaticus ＤＮＡポリメラーゼ、１×ＰＣＲ緩衝液、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ 及び最終容量を４０μｌとする水を含む。３０サイクルのＰＣＲの後に、増幅さ れた生成物の電気泳動を行なう。エチジウムブロミドにより同定したバンドを切 り出して、カウントし及びK-ras配列の欠失変異配列に対する比を計算する。分 子量の差を修正するために、ゲノムK-rasのバンドについて得たｃｐｍに、位置 １（Ｐ１）プライマーを用いたか位置２（Ｐ２）プライマーを用いたかに応じて 、１４１／１６１又は１２６／１４６を乗じる。（正確な比は、欠失変異の長さ に依存する。）データを、欠失テンプレートＤＮＡ／K-ras ＤＮＡの対数比対投 入欠矢テンプレートＤＮＡの対数としてプロットする（Gilliland等、1990a，19 90b）。 改変競争ＰＣＲは又、１つのプライマーがビオチン部分を有する修飾５’末端 を有し且つ他のプライマーが蛍光発色団を有する５’末端を有するように開発す ることが出来よう。増幅した生成物を、次いで、固体支持体に結合したアビジン 又はストレプトアビジンへの吸着によって反応混合物から分離することが出来る 。ＰＣＲで形成した生成物の量を、固定化ＤＮＡをアルカリで変性し、次いで蛍 光性一本鎖を固体支持体から溶出しそしてその蛍光を測定することにより、二本 鎖ＤＮＡ中に取り込まれた蛍光プライマーの量を測定することによって定量する ことが出来る（Landgraf等、Anal．Biochem．182 :231-235，1991）。 競争テンプレートは、好ましくは、前記のＰ１及びＰ２シリーズのプライマー により増幅した野生型K-ras及び突然変異K-ras遺伝子の断片に匹敵する配列を有 する工作した欠失変異体を含む（但し、約２０ヌクレオチドの内部欠失がある） 。それ故に、これらの増幅した生成物は、一層小さい（即ち、Ｐ１プライマー及 びＰ２プライマーを用いた場合には、それぞれ、約１４０塩基対及び１２５塩基 対である）。こうして、同じプライマーを用いることが出来、更に、工作した突 然変異体から増幅した生成物を増幅したゲノム配列から容易に識別することが出 来る。 ８つの欠失変異体を、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて生成する（Higuchi等、N ucleic Acid Res ．16:7351-67 1988;Vallette等、Nucleic Acid Res．17:723-33 ，1989:Higuchi，PCR Technology，Ch.6，61-70頁(Stockton Press，1989)）。 出発材料は、野生型K-rasを表す正常ゲノムＤＮＡ又はコドン１２の位置１及び ２に可能な点突然変異のそれぞれを有することが知られた腫瘍からの腫瘍ＤＮＡ となろう。野生型のコドン１２はＧＧＴである。下記の腫瘍ＤＮＡを用いること が出来る： 第１位置のコドン１２突然変異 Ｇ→Ａ Ａ５４９ Ｇ→Ｔ* Calul、ＰＲ３７１ Ｇ→Ｃ Ａ２１８２、Ａ１６９８ 第２位置のコドン１２突然変異 Ｇ→Ａ* Aspcl Ｇ→Ｔ* ＳＷ４８０ Ｇ→Ｃ ８１８−１、１８１−４、８１８−７ （*第１又は第２位置におけるＧ→Ｔトランスバージョンは、肺癌において見出 される点突然変異の約８０％を占め、ＧＡＴ（アスパラギン酸）又はＧＴＴ（バ リン）は膵臓癌において最も一般的である。） 約２０残基欠失を有する欠失変異体が、前に記載された（Vallette等、1989） ようにして誘導されよう。要約すれば、Ｐ１及びＰ２プライマーを、正常ＤＮＡ 又は各特異的突然変異を有する腫瘍細胞系統からのＤＮＡを用いて、対立遺伝子 特異的方法で用いる。これらの各々を、増幅のために、通常Ｐ１及びＰ２対立遺 伝子特異的プライマーと共に用いる共通プライマー即ち「Ｐ１−Ｂ」又は「Ｐ２ −Ｂ」の配列を５’末端に含み、約２０塩基下流から始まり従って欠失領域に及 ぶ配列を表す残基の付着シリーズを有する共通プライマー（共通欠失プライマー １及び２、ＣＤ１及びＣＤ２）と対にする。プライマーの３’部分の正確な位置 及びそれ故に配列を、OLIGO（ミネソタ州、Plymouth在、NB1）、最適プライマー の選択を容易にするコンピュータープログラムを用いるこの領域内のras遺伝子 の配列分析の後で決定する。 生じた増幅生成物の正確な長さは、重要ではなく、それ故、２０〜２５残基の欠 失を生成するであろう最も可能性の高いプライマーを選択する。例えば、Ｐ２プ ライマーを用いる場合は、野生型に対する対立遺伝子特異的プライマーは、コー ド領域内の３５〜５１残基に相補的な５’ACTCTTGCCTACGCCAC 3’となろう。相 補鎖内に約２０残基の欠失を達成するために、野生型と共に用いるべき共通上流 プライマー及びコドン１２の位置２の突然変異に対する３つの対立遺伝子特異的 プライマーは、−９５〜−７８残基に相補的な４０残基長（ＣＤ２）であろう（ Ｐ２対立遺伝子特異的プライマー及び約−５８〜−２５残基に用いるための現時 点で好適な共通上流プライマー）。増幅したもっと短い生成物は、ゲル電気泳動 によりサイズ分離され、Prep-a-Gene（Biorad）により精製されよう。ＤＮＡ濃 度は、エチジウムブロミド染色して既知濃度のＤＮＡ希釈物と比較することによ り測定する。このアプローチを、上記のように組み立てた４つのＰ１プライマー 及び共通プライマー（ＣＤ１）を用いて８回繰り返し、４つのＰ２プライマー及 び共通プライマー（ＣＤ２）を用いて４回繰り返す。これらの欠失変異を、ゲノ ムＤＮＡを増幅するのに用いるのと同じ対立遺伝子特異的プライマーを用いて増 幅する。それ故、それらを、続いて、概説したように、競争ＰＣＲにおいて既知 の連続希釈で用いることが出来る。 この発明を、更に、下記の非制限的実施例によって説 明する。実施例１ 血液を、０．０５ｍｌの１５％Ｋ3ＥＤＴＡを含む１３×７５ｍｍのバキュテ ナー（vacutainer）チューブ中に採取した。これらのチューブを直ちに４℃で３ ０分間、１０００ｇで遠心分離し、血漿を除去して４℃で更に３０分間、１００ ０ｇで再遠心分離した。その血漿を−７０℃で貯蔵した。次に、５ｍｌの血漿の アリコートに等容の２０％ＮａＣｌを加えることによりＤＮＡを除蛋白し、次い で、３〜４分間煮沸した。冷却後に、これらの試料を３０００ｒｐｍで３０分間 遠心分離した。上清を取り出し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１ｍ Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）（「ＴＥ」）（３回取り換えた）に対して４℃で１ ８〜２４時間透析した。このＤＮＡを２倍容のフェノールで１回、１倍容のフェ ノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で２回、そし て１倍容のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で２回抽出した。 続いてＤＮＡを０．３Ｍ ＮａＣｌ、２０μｇ／ｍｌグリコーゲン（キャリアー ）及び２．５倍容の１００％エタノールで−２０℃で２４時間沈殿させた。エッ ペンドルフ遠心分離機にて、４℃３０分間の遠心分離によってＤＮＡを回収した 。このＤＮＡを、次いで、ＴＥ緩衝液に再懸濁させた。上記の方法で抽出し、調 製したＤＮＡを、次いで、増幅することが出来た。実施例２ 実施例１により獲得し調製したＤＮＡの対立遺伝子特異的な増幅を下記のよう にＰＣＲにより行なって、K-ras遺伝子のコドン１２の位置１又は２に突然変異 を有するＤＮＡ中のK-ras遺伝子を検出した。８反応チューブの各々に、０．５ ｍｌの血漿から抽出したＤＮＡを添加した（６７ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８． ８）、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、１６．６μＭ 硫酸アンモニウム 、６．７μＭ ＥＤＴＡ、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、 ２５μＭ ｄＮＴＰを含み、全量４０μｌ）。表１に同定されたプライマーの各 ５０ｐモルも又、３単位のThermus aquaticus ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elm erからAmpliTaqとして市販）と共に含まれた。ＰＣＲを、ＤＮＡ熱サイクラー（ Cetus;コネチカット州、Norwalk在、Perkin-Elmer Corp.）中で、９５℃で５分 間の初期変性、それに続く３０サイクルのＰＣＲ増幅にて行なった。各増幅サイ クルは、９５℃で１分間の変性、５８℃で２分間のプライマーアニーリング期間 及び７２℃で１分間の伸長期間を含む。 増幅の完了後に、各ＰＣＲ反応生成物の１０〜１５μｌを、２％アガロースゲ ル／１×ＴＡＥ−０．５μｇ／ｍｌ ＥｔＢｒにおける電気泳動により分析する 。電気泳動は、１００ボルトの加電圧を９０分間用いる。次いで、試料の写真を 標準条件下で紫外光を用いて撮る。 請求の範囲に記載の発明の範囲から離れずに本発明に種々の改変をなし得るこ とは理解される。
【手続補正書】 【提出日】平成１２年４月１４日（２０００．４．１４） 【補正内容】 １．請求の範囲を別紙の通りに補正する。 ２．明細書第４頁第１４行の「断片」を「セグメント」に訂正する。 ３．明細書第１３頁第９行及び第１１行の「断片」を、それぞれ、「セグメント 」に訂正する。 ４．明細書第１４頁第１１行の「断片」を「セグメント」に訂正する。 ５．明細書第１７頁第１５行の「直鎖状」を「直線的」に訂正する。 ６．明細書第１８頁第１８行の「直鎖状で」を「直線的に」に訂正する。 ７．明細書第２０頁第２〜３行の「直鎖状」を「直線的」に訂正する。 請求の範囲 １．突然変異した対立遺伝子を検出する方法であって、下記の工程： 関心のある突然変異した対立遺伝子を含む可溶性ＤＮＡを含む生物学的液体の 試料を用意し、 その試料からＤＮＡを抽出し、 ＤＮＡを変性してそのＤＮＡの第１及び第２鎖を遊離させ、 関心のある突然変異した対立遺伝子を、少なくとも、ＤＮＡの第１鎖上の突然 変異含有セグメントに相補的な１つのプライマーを有する４つの対立遺伝子特異 的オリゴヌクレオチドプライマーの第１のセット及び増幅の間各対立遺伝子特異 的プライマーと対を形成する第１の共通プライマーを用いて、対立遺伝子特異的 な方法で増幅し（この共通プライマーは、第１のプライマーの位置に対して離れ たこのＤＮＡの第２鎖のセグメントに相補的である）、そして 関心のある突然変異した対立遺伝子の存在を検出することを含む、上記の方法 。 ２．ＤＮＡを抽出する工程の前に、試料から蛋白質を除去し、試料内の任意のＤ Ｎアーゼを不活性化する工程を更に含む、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．突然変異した対立遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて対立 遺伝子特異的方法で増幅する、請求の範囲第２項に記載の方法。 ４．増幅工程の後で、関心のある突然変異した対立遺伝子の存在を検出する工程 が、ＰＣＲの増幅生成物を用いて、対立遺伝子特異的リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ ）又はリガーゼ検出反応（ＬＤＲ）を行なうことを含む、請求の範囲第３項に記 載の方法。 ５．塩溶液を試料に添加し、続いて、試料を煮沸することによって、蛋白質を除 去し、ＤＮアーゼを不活性化する、請求の範囲第２項に記載の方法。 ６．生物学的液体を、全血液、血清、血漿、尿、痰及び脳脊髄液からなる群より 選択する、請求の範囲第２項に記載の方法。 ７．突然変異した対立遺伝子が公知の位置に点突然変異を有する遺伝子配列を含 む、請求の範囲第２項に記載の方法。 ８．第１のＤＮＡ鎖がセンス鎖であり、第２のＤＮＡ鎖がアンチセンス鎖である 、 請求の範囲第７項に記載の方法。 ９．突然変異した対立遺伝子をＰＣＲを用いて増幅する工程を３’エキソヌクレ アーゼ活性を欠きそれ故にプライマーの３’末端における単一ヌクレオチドミス マッチを修復する能力を欠くＤＮＡポリメラーゼを用いて行なう、請求の範囲第 ２項に記載の方法。 １０．ＤＮＡポリメラーゼがThermus aquaticusＤＮＡポリメラーゼである、請 求の範囲第９項に記載の方法。 １１．対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの第１のセットが： ４つのセンスプライマー（その１つは、センス鎖の点突然変異に相補的な３’ 末端ヌクレオチドを有し、残りの３つは、増幅すべきセグメントに対する野生型 配列及び、センス鎖の突然変異点における残りの２つの可能な突然変異を有する 配列に相補的である）、及び センスプライマーがアニールするセンス鎖上の位置から離れたアンチセンス鎖 のセグメントに相補的な共通アンチセンスプライマー（この共通アンチセンスプ ライマーは、増幅中、センスプライマーの各々と対になる） を含む、請求の範囲第９項に記載の方法。 １２．相補的センスプライマーの３’末端ヌクレオチドがセンス鎖の突然変異し たヌクレオチドとアニールする、請求の範囲第１１項に記載の方法。 １３．突然変異した対立遺伝子が２つの公知の位置の１つに点突然変異を有する 遺伝子配列を含む、請求の範囲第３項に記載の方法。 １４．突然変異した対立遺伝子をＰＣＲにより増幅する工程が、４つの対立遺伝 子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの第２のセットを第１のセットと共に利 用することを更に含み、この対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの 第２のセットが： ４つのセンスプライマー（その１つは、センス鎖の点突然変異に相補的な３’ 末端ヌクレオチドを有し、残りの３つは、増幅すべきセグメントに対する野生型 配列及び、センス鎖の突然変異点における残りの２つの可能な突然変異を有する 配列に相補的である）及び センスプライマーがアニールするセンス鎖上の位置から離れたアンチセンス鎖 のセグメントに相補的な共通アンチセンスプライマー（この共通アンチセンスプ ライマーは、増幅中に、センスプライマーの各々と対になる） を含む、請求の範囲第１３項に記載の方法。 １５．相補的センスプライマーの３’末端ヌクレオチドがセンス鎖の突然変異し たヌクレオチドとアニールする、請求の範囲第１４項に記載の方法。 １６．検出すべき突然変異した対立遺伝子が第１２コドンの位置１又は２に突然 変異を有するK-ras遺伝子配列である、請求の範囲第１５項に記載の方法。 １７．対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの第１のセットが下記の 配列を有するセンスプライマー 及び下記の配列を有する共通アンチセンスプライマーを含む、請求の範囲第１６項に記載の方法。 １８．対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの第２のセットが下記の 配列を有するセンスプライマー 及び下記の配列を有する共通アンチセンスプライマー を含む、請求の範囲第１４項に記載の方法。 １９．増幅したＤＮＡの存在を検出する工程を、１〜５％アガロースゲルにおけ るゲル電気泳動によって行なう、請求の範囲第２項に記載の方法。 ２０．生物学的液体を、全血液、血清、血漿、尿、痰及び脳脊髄液からなる群よ り選択する、請求の範囲第２項に記載の方法。 ２１．生物学的液体中の突然変異したK-ras遺伝子配列の存在を検出するための 診断用キットであって、突然変異が第１２コドンの位置１に存在し、該キットが ＤＮＡの除蛋白及び単離を容易にする試薬、 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を容易にする試薬、 熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ、並びに 下記の配列を有する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドセンスプライマー 及び下記の配列を有する共通アンチセンスプライマー の第１のセット を含む、上記の診断用キット。 ２２．下記の配列 を有する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドセンスプライマー、及び下記の配 列 を有する第２の共通アンチセンスプライマーの第２のセットを更に含み、対立遺 伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー及び第２の共通プライマーの第２のセ ットが、生物学的液体中の第１２コドンの位置２が突然変異したK-ras遺伝子配 列の存在を検出するのに有用である、請求の範囲第２１項に記載の診断用キット 。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．突然変異した対立遺伝子を検出する方法であって、下記の工程： 関心のある突然変異した対立遺伝子を含む可溶性ＤＮＡを含む生物学的液体の 試料を用意し、 その試料からＤＮＡを抽出し、 ＤＮＡを変性してそのＤＮＡの第１及び第２鎖を遊離させ、 関心のある突然変異した対立遺伝子を、少なくとも、ＤＮＡの第１鎖上の突然 変異含有断片に相補的な１つのプライマーを有する４つの対立遺伝子特異的オリ ゴヌクレオチドプライマーの第１のセット及び増幅の間各対立遺伝子特異的プラ イマーと対を形成する第１の共通プライマーを用いて、対立遺伝子特異的な方法 で増幅し（この共通プライマーは、第１のプライマーの位置に対して離れたこの ＤＮＡの第２鎖の断片に相補的である）、そして 関心のある突然変異した対立遺伝子の存在を検出することを含む、上記の方法 。 ２．ＤＮＡを抽出する工程の前に、試料から蛋白質を除去し、試料内の任意のＤ Ｎアーゼを不活性化する工程を更に含む、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．突然変異した対立遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて対立 遺伝子特異的方法で増幅する、 請求の範囲第２項に記載の方法。 ４．増幅工程の後で、関心のある突然変異した対立遺伝子の存在を検出する工程 が、ＰＣＲの増幅生成物を用いて、対立遺伝子特異的リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ ）又はリガーゼ検出反応（ＬＤＲ）を行なうことを含む、請求の範囲第３項に記 載の方法。 ５．塩溶液を試料に添加し、続いて、試料を煮沸することによって、蛋白質を除 去し、ＤＮアーゼを不活性化する、請求の範囲第２項に記載の方法。 ６．生物学的液体を、全血液、血清、血漿、尿、痰及び脳脊髄液からなる群より 選択する、請求の範囲第２項に記載の方法。 ７．突然変異した対立遺伝子が公知の位置に点突然変異を有する遺伝子配列を含 む、請求の範囲第２項に記載の方法。 ８．第１のＤＮＡ鎖がセンス鎖であり、第２のＤＮＡ鎖がアンチセンス鎖である 、請求の範囲第７項に記載の方法。 ９．突然変異した対立遺伝子をＰＣＲを用いて増幅する工程を３’エキソヌクレ アーゼ活性を欠きそれ故にプライマーの３’末端における単一ヌクレオチドミス マッチを修復する能力を欠くＤＮＡポリメラーゼを用いて行なう、請求の範囲第 ２項に記載の方法。 １０．ＤＮＡポリメラーゼがThermus aquaticusＤＮＡポリメラーゼである、請 求の範囲第９項に記載の方法。 １１．対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの第１のセットが： ４つのセンスプライマー（その１つは、センス鎖の点突然変異に相補的な３’ 末端ヌクレオチドを有し、残りの３つは、増幅すべき断片に対する野生型配列及 び、センス鎖の突然変異点における残りの２つの可能な突然変異を有する配列に 相補的である）、及び センスプライマーがアニールするセンス鎖上の位置から離れたアンチセンス鎖 の断片に相補的な共通アンチセンスプライマー（この共通アンチセンスプライマ ーは、増幅中、センスプライマーの各々と対になる） を含む、請求の範囲第９項に記載の方法。 １２．相補的センスプライマーの３’末端ヌクレオチドがセンス鎖の突然変異し たヌクレオチドとアニールする、請求の範囲第１１項に記載の方法。 １３．突然変異した対立遺伝子が２つの公知の位置の１つに点突然変異を有する 遺伝子配列を含む、請求の範囲第３項に記載の方法。 １４．突然変異した対立遺伝子をＰＣＲにより増幅する工程が、４つの対立遺伝 子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの第２のセットを第１のセットと共に利 用することを更に含み、この対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの 第２のセットが： ４つのセンスプライマー（その１つは、センス鎖の点突然変異に相補的な３’ 末端ヌクレオチドを有し、残り の３つは、増幅すべき断片に対する野生型配列及び、センス鎖の突然変異点にお ける残りの２つの可能な突然変異を有する配列に相補的である）及び センスプライマーがアニールするセンス鎖上の位置から離れたアンチセンス鎖 の断片に相補的な共通アンチセンスプライマー（この共通アンチセンスプライマ ーは、増幅中に、センスプライマーの各々と対になる） を含む、請求の範囲第１３項に記載の方法。 １５．相補的センスプライマーの３’末端ヌクレオチドがセンス鎖の突然変異し たヌクレオチドとアニールする、請求の範囲第１４項に記載の方法。 １６．検出すべき突然変異した対立遺伝子が第１２コドンの位置１又は２に突然 変異を有するK-ras遺伝子配列である、請求の範囲第１５項に記載の方法。 １７．対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの第１のセットが下記の 配列を有するセンスプライマー 及び下記の配列を有する共通アンチセンスプライマー を含む、請求の範囲第１６項に記載の方法。 １８．対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの第２のセットが下記の 配列を有するセンスプライマー 及び下記の配列を有する共通アンチセンスプライマーを含む、請求の範囲第１４項に記載の方法。 １９．増幅したＤＮＡの存在を検出する工程を、１〜５％アガロースゲルにおけ るゲル電気泳動によって行なう、請求の範囲第２項に記載の方法。 ２０．生物学的液体を、全血液、血清、血漿、尿、痰及び脳脊髄液からなる群よ り選択する、請求の範囲第２項に記載の方法。 ２１．生物学的液体中の突然変異したK-ras遺伝子配列の存在を検出するための 診断用キットであって、突然変異が第１２コドンの位置１に存在し、該キットが ： ＤＮＡの除蛋白及び単離を容易にする試薬、 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を容易にする試薬、 熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ、並びに 下記の配列を有する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドセンスプライマー 及び下記の配列を有する共通アンチセンスプライマー の第１のセット を含む、上記の診断用キット。 ２２．下記の配列 を有する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドセンスプ ライマー、及び下記の配列 を有する第２の共通アンチセンスプライマーの第２のセットを更に含み、対立遺 伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー及び第２の共通プライマーの第２のセ ットが、生物学的液体中の第１２コドンの位置２が突然変異したK-ras遺伝子配 列の存在を検出するのに有用である、請求の範囲第２１項に記載の診断用キット 。
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