CN103946395A

CN103946395A - 用于预测与抗血管发生疗法有关的高血压的风险的方法

Info

Publication number: CN103946395A
Application number: CN201280053021.9A
Authority: CN
Inventors: S.L.德哈斯; P.德尔马; D.拉姆布雷赫茨; S.谢尔
Original assignee: Life Science Is Formed A Partnership Institute; Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB; F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: Life Science Is Formed A Partnership Institute; Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB; Life Sciences Research Partners vzw; F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2011-08-31
Filing date: 2012-08-28
Publication date: 2014-07-23
Also published as: JP2014526901A; ZA201400950B; US20140294811A1; WO2013030168A1; ES2589455T3; CA2845386A1; AR087714A1; IL230783A0; EP3085793A1; EP2751280B1; BR112014004763A2; MX2014002307A; NZ620343A; RU2014110270A; AU2012300986A1; SG2014008585A; KR20140064924A; EP2751280A1

Abstract

本发明关注一种通过测定KDR基因和/或EGF基因的基因型来预测患者形成与抗血管发生治疗诸如贝伐单抗有关的高血压的易感性的方法。本发明还涉及一种包含血管发生抑制剂诸如贝伐单抗的药物组合物，其用于基于KDR基因和/或EGF的基因型来治疗患有癌症的患者。本发明还涉及一种通过测定KDR基因和/或EGF基因的基因型在患有癌症的患者中降低与抗血管发生疗法诸如贝伐单抗有关的高血压的风险的方法。

Description

用于预测与抗血管发生疗法有关的高血压的风险的方法

发明领域

本发明针对预测经历抗血管发生疗法(包括使用贝伐单抗的疗法)的患者中的高血压风险的方法。

发明背景

血管发生有助于良性和恶性疾病诸如癌症形成，而且尤其在癌症中，是原发性肿瘤生长、侵袭和转移所必需的。为了生长，肿瘤必须进行血管发生转换。需要血管内皮生长因子(VEGF)来诱导此血管发生转换。VEGF和VEGF途径中的基因被视为癌症进展的重要介导物。VEGF基因家族包括VEGF基因(亦称为VEGFA)，VEGF的同源物，包括胎盘生长因子(PlGF)、VEGFB、VEGFC、VEGFD，VEGF受体，包括VEGFR-1和VEGFR-2(亦分别称为FLT1和FLK1/KDR)，VEGF诱导物，包括缺氧可诱导因子HIF1α、HIF2α，和氧传感器PHD1、PHD2和PHD3。

此途径在癌细胞生长和转移中的重要性导致开发出用于癌症疗法的抗血管发生剂。这些疗法包括贝伐单抗(bevacizumab)、哌加他尼(pegaptanib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)和瓦他拉尼(vatalanib)。尽管用血管发生抑制剂诸如贝伐单抗获得显著延长的存活，但患者仍然死于癌症。另外，并非所有患者都响应血管发生抑制剂疗法。不响应性的根本机制仍然是未知的。而且，血管发生抑制剂疗法与副作用诸如胃肠穿孔、血栓形成、出血、高血压和蛋白尿有关。

因此，需要确定哪些患者对血管发生抑制剂疗法响应得特别好和/或哪些患者对与抗血管发生治疗有关的副作用易感的方法。

发明概述

本发明涉及一种通过测定KDR中多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)和/或EGF中rs4444903(SEQ ID NO.4)处与降低的高血压风险有关的基因型来确定患者形成与通过血管发生抑制剂如贝伐单抗的疗法有关的高血压的易感性的方法。本发明还涉及包含血管发生抑制剂如贝伐单抗的药物组合物，其用于治疗患有癌症且在多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)和/或rs4444903(SEQ ID NO.4)处具有与降低的高血压风险有关的基因型的患者。本发明还涉及一种通过检测rs2305949(SEQ ID NO.3)和/或rs4444903(SEQ ID NO.4)处与降低的高血压风险关联的基因型在患有癌症的患者中降低与抗血管发生疗法如贝伐单抗有关的高血压风险的方法。

本发明的一个实施方案提供确定患者形成与包含血管发生抑制剂的疗法有关的高血压的易感性的方法，其中所述血管发生抑制剂包括贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体。所述方法包括：(a)在自患有癌症的患者衍生的样品中测定多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处的基因型，并(b)基于所述基因型鉴定患者为更多地易感于或更少地易感于形成与通过血管发生抑制剂的疗法有关的高血压，所述血管发生抑制剂包括贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，其中多态性rs2305949(SEQID NO.3)处CC基因型的存在指示所述患者比在多态性rs2305949(SEQ IDNO.3)处具有CT或TT基因型的患者更多地易感于形成高血压，或者多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处CT或TT基因型的存在指示所述患者比在多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处具有CC基因型的患者更少地易感于形成高血压。在一些实施方案中，所述方法是体外方法。在一些实施方案中，所述疗法还包括化疗剂或化疗方案。在一些实施方案中，所述血管发生抑制剂与选自下组的一种或多种药剂一起施用：紫杉烷、干扰素α、5-氟尿嘧啶、亚叶酸(leucovorin)、伊立替康(irinotecan)、吉西他滨(gemcitabine)-厄洛替尼(erlotinib)和基于铂的化疗剂。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌、肾细胞癌、结直肠癌、乳腺癌或肺癌。在一些实施方案中，所述样品是血液样品。在一些实施方案中，所述基因型通过MALDI-TOF质谱术测定。在一些实施方案中，所述方法进一步包括对所述患者施用所述疗法。

本发明的另一个实施方案提供包含如本文中限定的血管发生抑制剂的药物组合物，其用于治疗有此需要的患者，其中依照本文中描述的方法已确定所述患者为更少地易感于形成与包含所述血管发生抑制剂的疗法有关的高血压。

本发明的一个别的实施方案提供用于实施本文所述方法的试剂盒。所述试剂盒包含能够测定多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处基因型的寡核苷酸。

本发明的再一个实施方案提供降低形成与包含血管发生抑制剂的疗法有关的高血压风险的方法，其中所述血管发生抑制剂包括贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体。所述方法包括：(a)在自患有癌症的患者衍生的样品中测定多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处的基因型；

(b)鉴定患者为更少地易感于形成与通过血管发生抑制剂的疗法有关的高血压，所述血管发生抑制剂包括贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，其中多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处CT或TT基因型的存在指示所述患者比在多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处具有CC基因型的患者更少地易感于形成高血压；并(c)对在多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处具有CT或TT基因型、依照(b)鉴定为更少地易感于形成高血压的患者施用所述血管发生抑制剂。在一些实施方案中，所述疗法还包括化疗剂或化疗方案。在一些实施方案中，所述血管发生抑制剂与选自下组的一种或多种药剂一起施用：紫杉烷、干扰素α、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、伊立替康、吉西他滨-厄洛替尼和基于铂的化疗剂。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌、肾细胞癌、结直肠癌、乳腺癌或肺癌。在一些实施方案中，所述样品是血液样品。在一些实施方案中，所述基因型通过MALDI-TOF质谱术测定。

本发明的再一个实施方案提供治疗患者的方法。所述方法包括对所述患者施用包含血管发生抑制剂的疗法，所述血管发生抑制剂包括贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，其中已测定所述患者在多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处的基因型为CT或TT。

本发明的又一个实施方案提供确定患者形成与包含血管发生抑制剂的疗法有关的高血压的易感性的方法，所述血管发生抑制剂包括贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体。所述方法包括：(a)在自患有癌症的患者衍生的样品中测定多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处的基因型，并(b)基于所述基因型鉴定患者为更多地易感于或更少地易感于形成与通过血管发生抑制剂的疗法有关的高血压，所述血管发生抑制剂包括贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，其中多态性rs4444903(SEQ IDNO.4)处GA基因型的存在指示所述患者比在多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处具有GG或AA基因型的患者更多地易感于形成高血压，或者多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处GG或AA基因型的存在指示所述患者比在多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处具有GA基因型的患者更少地易感于形成高血压。在一些实施方案中，所述方法是体外方法。在一些实施方案中，所述疗法还包括化疗剂或化疗方案。在一些实施方案中，所述血管发生抑制剂与选自下组的一种或多种药剂一起施用：紫杉烷、干扰素α、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、伊立替康、吉西他滨-厄洛替尼和基于铂的化疗剂。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌、肾细胞癌、结直肠癌、乳腺癌或肺癌。在一些实施方案中，所述样品是血液样品。在一些实施方案中，所述基因型通过MALDI-TOF质谱术测定。在一些实施方案中，所述方法进一步包括对所述患者施用所述疗法。

本发明的再一个实施方案提供包含如本文中限定的血管发生抑制剂的药物组合物，其用于治疗有此需要的患者，其中依照本文中描述的方法已确定所述患者为更少地易感于形成与通过所述血管发生抑制剂的疗法有关的高血压。

本发明的又一个实施方案提供用于实施本文所述方法的试剂盒。所述试剂盒包含能够测定多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处基因型的寡核苷酸。

本发明的再一个实施方案提供降低形成与包含血管发生抑制剂的疗法有关的高血压风险的方法，其中所述血管发生抑制剂包括贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体。所述方法包括：(a)在自患有癌症的患者衍生的样品中测定多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处的基因型；(b)鉴定患者为更少地易感于形成与通过血管发生抑制剂的疗法有关的高血压，所述血管发生抑制剂包括贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，其中多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处GG或AA基因型的存在指示所述患者比在多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处具有GA基因型的患者更少地易感于形成高血压；并(c)对在多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处具有GG或AA基因型、依照(b)鉴定为更少地易感于形成高血压的患者施用所述血管发生抑制剂。在一些实施方案中，所述疗法还包含化疗剂或化疗方案。在一些实施方案中，所述血管发生抑制剂与选自下组的一种或多种药剂一起施用：紫杉烷、干扰素α、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、伊立替康、吉西他滨-厄洛替尼和基于铂的化疗剂。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌、肾细胞癌、结直肠癌、乳腺癌或肺癌。在一些实施方案中，所述样品是血液样品。在一些实施方案中，所述基因型通过MALDI-TOF质谱术测定。

本发明的另一个实施方案提供治疗患者的方法。所述方法包括对所述患者施用包含血管发生抑制剂的疗法，所述血管发生抑制剂包括贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，其中已测定所述患者在多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处的基因型为GG或AA。

附图简述

图1：临床数据的终点分布。无进展存活(PFS)的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)图。

图2：临床数据的终点分布。总体存活(OS)的卡普兰-迈耶图。

图3：临床数据的终点分布。最佳总体响应(BOR)的柱形图。BOR比率在用BEV治疗的受试者中为49％，而在用PBO治疗的受试者中为46％。

图4：临床数据的终点分布。与研究药物并非无关的高血压的柱形图。高血压比率在用BEV治疗的受试者中为18％，而在用PBO治疗的受试者中为7％。

图5：Leuven功效集合分析中VEGFA和PFS的关联性分析结果。

图6：在测试对PFS的关联性时VEGFA中rs699946(SEQ ID NO.1)的Forest图。

图7：在用BEV治疗的白种人受试者中rs12505758(SEQ ID NO.2)与OS关联性的Forest图。

图8：rs12505758(SEQ ID NO.2)和OS之间关联性的卡普兰-迈耶图。

图9：rs2305949(SEQ ID NO.3)(KDR)相关高血压频率。

图10：在用BEV治疗的白种人受试者中对于高血压，KDR中rs2305949(SEQ ID NO.3)的Forest图。

图11：rs4444903(SEQ ID NO.4)(EGF)相关高血压频率。

图12：EGF中rs4444903(SEQ ID NO.4)与PGx-SP-BEV-白种人中高血压的Forest图。

图13：在用BEV治疗的白种人受试者中rs11133360(SEQ ID NO.5)与PFS关联性的Forest图。

图14：在元分析中测定基因型且与贝伐单抗结果有关的SNP序列。SEQID NO.1对应于rs699946，其中位置51是A或G。SEQ ID NO.2对应于rs12505758，其中位置51是C或T。SEQ ID NO.3对应于rs2305949，其中位置51是C或T。SEQ ID NO.4对应于rs4444903，其中位置51是A或G。SEQ ID NO.5对应于rs11133360，其中位置51是C或T。

发明详述

1.定义

术语“施用”意指对患者施用药物组合物，如血管发生抑制剂。例如，根据所治疗的癌症类型，2.5mg/kg体重至15mg/kg体重的贝伐单抗可每周、每2周或每3周施用。具体的剂量包括5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg和15mg/kg。甚至更具体的剂量为5mg/kg每2周、10mg/kg每2周和15mg/kg每3周。

术语“血管发生抑制剂”在本发明的背景中指改变血管发生(例如形成血管的过程)的所有药剂，并且包括抑制血管发生(包括但不限于肿瘤血管发生)的药剂。在此背景中，抑制可指阻断血管形成并停止或延迟血管的生长。血管发生抑制剂的例子包括贝伐单抗(亦称为)、哌加他尼、舒尼替尼、索拉非尼和瓦他拉尼。贝伐单抗是一种重组的人源化单克隆IgG1抗体，其在体外和体内测定系统中结合并抑制人VEGFA的生物学活性。术语“贝伐单抗”涵盖满足在选自美国、欧洲和日本的国家或地区中获得作为相同或生物相似产品的销售授权必需的要求的所有相应的抗VEGF抗体。在本发明的背景中，血管发生抑制剂包括一种与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，更具体地结合与贝伐单抗结合VEGF上相同表位的抗体。当两种抗体识别相同或空间上重叠的表位时，抗体与参照抗体结合“基本相同的表位”。用于测定两种抗体是否结合相同或空间上重叠的表位的最广泛使用和快速的方法是竞争测定法，其可以使用经标记的抗原或经标记的抗体以所有数目的不同形式配置。通常地，将抗原固定化在96孔板上，并使用放射性或酶标记物来测量未标记抗体阻断经标记抗体的结合的能力。

术语“癌症”指哺乳动物中特征通常为细胞增殖不受调控的生理学疾患。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌(包括转移性胰腺癌)、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌(包括局部晚期的、复发或转移性的HER-2阴性乳腺癌)、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)及各种类型的头和颈癌、以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级无裂性小细胞NHL、贮积病(bulky disease)NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病(phakomatoses)、水肿(如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖。

术语“化疗剂”或“化疗方案”包括可以提供抗癌治疗效果，并且可以是化学药剂或生物学药剂，特别是能够干扰癌或肿瘤细胞的化学药剂或生物学药剂的任何活性剂。具体的活性剂是那些充当抗赘生物(化学毒性或化学抑制性)药剂的，其抑制或阻止恶性细胞的形成、成熟或增殖。化疗剂的例子包括烷化剂(alkylating agents)诸如氮芥类(nitrogen mustards)(例如，双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)和苯丁酸氮芥(chlorambucil))、亚硝脲类(nitrosoureas)(例如，卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、和司莫司汀(semustine)(甲基-CCNU))、乙撑亚胺类(ethylenimines)/甲基蜜胺类(methylamelamines)(例如，三乙撑蜜胺(thriethylenemelamine)(TEM)、三乙烯(triethylene)、硫代磷酰胺(thiophosphoramide)(塞替派(thiotepa))、六甲蜜胺(hexamethylmelamine)(HMM，六甲蜜胺(altretamine))、磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)(例如，白消安(busulfan))、和三嗪(triazines)(例如，达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC))；抗代谢物诸如叶酸类似物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)、三甲曲沙(trimetrexate))、嘧啶类似物(例如，5-氟尿嘧啶、卡培他滨、氟脱氧尿嘧啶(fluorodeoxyuridine)、吉西他滨、阿糖胞苷(cytosinearabinoside)(AraC，阿糖胞苷)、5-氮胞苷(azacytidine)、2,2’-二氟脱氧胞苷(2,2’-difluorodeoxycytidine)、和嘌呤类似物(例如，6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤(azathioprine)、2’-脱氧助间型霉素(deoxycoformycin)(喷司他丁(pentostatin))、红羟基壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine,EHNA)、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)、和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨(cladribine)，2-CdA))；自天然产物开发的抗有丝分裂药物(例如，帕利他塞、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(例如，长春碱(vinblastine,VLB)、长春新碱(vincristine)、和长春瑞滨(vinorelbine))、多西他赛(docetaxel)、雌莫司汀(estramustine)、和磷酸雌莫司汀)、表鬼臼毒素类(epipodophylotoxins)(例如，依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide))、抗生素(例如，放线菌素(actimomycin)D、道诺霉素(daunomycin)(柔红霉素(rubidomycin))、daunorubicon、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、伊达比星(idarubicin)、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)(光神霉素(mithramycin))、丝裂霉素(mitomycin)C、放线菌素(actinomycin))、酶(例如，L-门冬酰胺酶)、和生物反应修饰剂(biological response modifier)(例如，干扰素-α、IL-2、G-CSF、GM-CSF)；混杂的药剂，包括铂配位复合物(例如，顺铂、卡铂、奥沙利铂)、蒽二酮类(anthracenediones)(例如，米托蒽醌(mitoxantrone))、取代的脲(即，羟基脲(hydroxyurea))、甲基肼(methylhydrazine)衍生物(例如，N-甲基肼(MIH)、丙卡巴肼(procarbazine))、肾上腺皮质抑制剂(例如，米托坦(mitotane)(o,p’-DDD)、氨鲁米特(aminoglutethimide))；激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂(例如，泼尼松(prednisone)和等同物，地塞米松(dexamethasone)、氨鲁米特(aminoglutethimide))、黄体酮(progestin)(例如，己酸羟孕酮(hydroxyprogesterone caproate)、醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate))、雌激素(例如，己烯雌酚(diethylstilbestrol)、乙炔基雌二醇(ethinyl estradiol)及其等同物)；抗雌激素(例如，他莫昔芬(tamoxifen))、雄激素(例如，丙酸睾酮(testosteronepropionate)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)及其等同物)、抗雄激素(例如，氟他胺(flutamide)、促性腺素释放素类似物、亮丙瑞林(leuprolide))、非类固醇抗雄激素(例如，氟他胺)、表皮生长因子抑制剂(例如厄洛替尼、拉帕替尼(lapatinib)、吉非替尼(gefitinib))、抗体(例如曲妥单抗(trastuzumab))、伊立替康(irinotecan)和其他药剂如亚叶酸。对于转移性胰腺癌的治疗，用于与贝伐单抗一起施用的化疗剂包括吉西他滨和厄洛替尼及其组合(亦见本文中提供的例子)。对于肾细胞癌的治疗，用于与贝伐单抗一起施用的化疗剂包括干扰素α(亦见本文中提供的例子)。

术语“等位基因”指感兴趣基因的核苷酸序列变体。

术语“基因型”指对个体或样品中含有的基因的等位基因的描述。在本发明的背景中，在个体的基因型和源自该个体的样品的基因型之间没有产生差异。尽管通常从二倍体细胞的样品测定基因型，但也可从单倍体细胞如精子细胞的样品测定基因型。

术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可交换使用，且指包含2个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸(优选超过3个)的分子。它的确切大小将取决于许多因素，其相应地取决于该寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可合成或通过克隆得到。脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合体也可在本发明的范围内。

术语“多态性”指群体内存在基因的两种或更多种遗传测定的备选序列。通常而言，第一鉴定的等位形式被随意称为参照形式，而其他等位形式被称为备选的或变异等位基因。在选定群体中最频繁存在的等位形式有时称为野生型形式。

术语“单核苷酸多态性”或“SNP”是在等位基因之间变化的一个核苷酸位点。单核苷酸多态性可发生在基因的任何区域。在一些情况中，所述多态性可能导致蛋白质序列中的变化。所述蛋白质序列中的变化可能影响或不影响蛋白质功能。

术语“高血压(hypertension)”指较高的血压(high blood pressure)。“与治疗/疗法有关的高血压”可测量为根据国家癌症研究院的用于不良事件的常用术语标准(Common Terminology Criteria for Adverse Events)(CTCAE v2-3)的不同级别。如本领域技术人员会领会，如果患者属于与另一个亚组的患者相比具有统计学显著的形成高血压的可能性的患者亚组，那么该患者更多地易感于形成高血压。类似地，如果患者属于与另一个亚组的患者相比具有统计学显著的不形成高血压的可能性的患者亚组，那么该患者更少地易感于形成高血压。

术语“患者”指期望治疗的任何单个动物，更具体地是哺乳动物(包括非人动物如例如犬、猫、马、家兔、动物园动物、牛、猪、绵羊和非人灵长类)。甚至更具体地，本文中所述患者是人。在本发明的背景中，所述患者可以是白种人受试者。

术语“受试者”在本文中是任何单个人受试者，包括适于接受治疗的患者，他正经受或者已经经受血管生成性病症的一种或多种体征、症状、或其它指标。意图作为受试者包括的有参加临床研究试验而没有显示出任何疾病临床体征的任何受试者、或参加流行病学研究的受试者、或曾经用作对照的受试者。受试者先前可能已用抗癌剂治疗过，或没有如此治疗过。当启动本文中治疗时，受试者可能是初始接触使用的另外的药剂，即受试者先前可能没有在“基线”处(即在本文治疗方法中的第一剂抗癌物施用之前的设定时间点，如在开始治疗之前的受试者筛选日)用例如抗赘生药剂、化疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂治疗过。这类“初始”受试者一般视为用此类另外的药剂治疗的候选。

术语“患有…的患者”指显示关于特定恶性疾病如癌症(一种牵涉生理学和病理学血管发生和/或肿瘤性疾病的疾病)的临床体征的患者。

如本文中使用的，“疗法”或“治疗/处理”指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。

术语“总体存活”指治疗期间和治疗后患者存活的时间长度。

术语“无进展存活”指治疗期间和治疗后，依照治疗内科医生或调查人员的评估，患者的疾病不变坏，即不进展的时间长度。

术语“药物组合物”指其形式容许药物的生物学活性是有效的，且不含对会施用该配制剂的受试者产生不可接受的毒性的别的成分的无菌制备物。

2.详细的实施方案

在本发明中，令人惊讶地鉴定出KDR和EGF基因中的变异为对于形成与通过血管发生抑制剂治疗有关的高血压的易感性的标志物/预测物。术语“标志物”和“预测物”可交换使用，并且指基因的特定等位基因变体。所述变异或标志物还可称为单核苷酸多态性(SNP)。

依照本发明的方法，使用源自5项使用贝伐单抗的II期和III期试验的样品来进行对SNP的元分析，所述试验即NO16966(晚期原发性结直肠癌，参见Saltz et al.,2008,J.Clin.Oncol.26:2013-2019和Hurwitz et al.,2004,N.Engl.J.Med.350:2335-2342)、AVITA(胰腺癌，参见Van Cutsem,J.Clin.Oncol.200927:2231-2237)、AVAiL(非小细胞肺癌，参见Reck et al.,J.Clin.Oncol.200927:1227)、AVOREN(肾癌，参见Escudier et al.,J.Clin.Oncol.201028:2144)和AVADO(乳腺癌，参见Miles,J.Clin.Oncol.201028:3239)。

如实施例中显示的，10种SNP与贝伐单抗诱导的高血压有关(p<0.05)，但其中没有一种超过多重检验的阈值(p<0.0003)。显示最强烈关联性(p<0.01)的两种SNP为：KDR中的rs2305949(SEQ ID NO.3)(等位OR0.93，95％CI0.88-0.98，p＝0.0067)和EGF中的rs4444903(SEQ ID NO.4)(等位OR1.06，95％CI1.02-1.11，p＝0.0052)。对于rs2305949(SEQ ID NO.3)(KDR)，CC携带者(野生型)在用BEV治疗时显示更高的形成高血压的频率，而用安慰剂治疗的患者确实显示相当对立的结果，其在携带TT的患者中显示最高的高血压频率。对于rs4444903(SEQ ID NO.4)(EGF)，杂合子GA携带者显示最高的高血压频率，一种在用安慰剂治疗的患者中未看到的效应，因为在不同基因型之间没有看到差异。有意思的是，rs2305949(SEQ ID NO.3)和rs4444903(SEQ ID NO.4)与发生在KDR和EGF位置273和708上的氨基酸变化紧密相关，表明这些变化可能功能性地影响两种基因并由此作用于高血压。

因此，本发明提供一种测定患者形成与通过血管发生抑制剂的疗法有关的高血压的易感性的体外方法，其中所述血管发生抑制剂包括贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，所述方法包括：

(a)在自患有癌症的患者衍生的样品中测定多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处的基因型，并

(b)基于所述基因型鉴定患者为更多地易感于或更少地易感于形成与通过血管发生抑制剂的疗法有关的高血压，所述血管发生抑制剂包括贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，其中多态性rs2305949(SEQ IDNO.3)处CC基因型的存在指示所述患者比在多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处具有CT或TT基因型的患者更多地易感于形成高血压，或者多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处CT或TT基因型的存在指示所述患者比在多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处具有CC基因型的患者更少地易感于形成高血压。在一个实施方案中，癌症选自下组：结直肠癌、成胶质细胞瘤、肾癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和肺癌，更具体地结直肠癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌，甚至更具体地结直肠癌、肾癌和肺癌。

本发明进一步提供包含血管发生抑制剂的药物组合物用于治疗有此需要的患者，所述血管发生抑制剂包括贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，其中依照一种体外方法已确定所述患者为更少地易感于形成与通过所述血管发生抑制剂的疗法有关的高血压，所述体外方法包括：

(b)基于所述基因型鉴定患者为更多地易感于或更少地易感于形成与通过血管发生抑制剂的疗法有关的高血压，所述血管发生抑制剂包括贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，其中多态性rs2305949(SEQ IDNO.3)处CC基因型的存在指示所述患者比多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处具有CT或TT基因型的患者更多地易感于形成高血压，或者多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处CT或TT基因型的存在指示所述患者比在多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处具有CC基因型的患者更少地易感于形成高血压。在一个实施方案中，癌症选自下组：结直肠癌、成胶质细胞瘤、肾癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和肺癌，更具体地结直肠癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌，甚至更具体地结直肠癌、肾癌和肺癌。

本发明进一步提供一种降低形成与通过血管发生抑制剂的疗法有关的高血压风险的方法，其中所述血管发生抑制剂包括贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，所述方法包括：

(a)在自患有癌症的患者衍生的样品中测定多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处的基因型；

(b)鉴定患者为更少地易感于形成与通过血管发生抑制剂的疗法有关的高血压，所述血管发生抑制剂包括贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，其中多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处CT或TT基因型的存在指示所述患者比在多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处具有CC基因型的患者更少地易感于形成高血压；并

(c)对在多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处具有CT或TT基因型、依照(b)鉴定为更少地易感于形成高血压的患者施用所述血管发生抑制剂。在一个实施方案中，癌症选自下组：结直肠癌、成胶质细胞瘤、肾癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和肺癌，更具体地结直肠癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌，甚至更具体地结直肠癌、肾癌和肺癌。

本发明还提供测定患者形成与通过血管发生抑制剂的疗法有关的高血压的易感性的一种体外方法，其中所述血管发生抑制剂包括贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，所述方法包括：

(a)在自患有癌症的患者衍生的样品中测定多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处的基因型，并

(b)基于所述基因型鉴定患者为更多地易感于或更少地易感于形成与通过血管发生抑制剂的疗法有关的高血压，所述血管发生抑制剂包括贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，其中多态性rs4444903(SEQ IDNO.4)处GA基因型的存在指示所述患者比在多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处具有GG或AA基因型的患者更多地易感于形成高血压，或者多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处GG或AA基因型的存在指示所述患者比在多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处具有GA基因型的患者更少地易感于形成高血压。在一个实施方案中，癌症选自下组：结直肠癌、成胶质细胞瘤、肾癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和肺癌，更具体地结直肠癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌，甚至更具体地结直肠癌、肾癌和乳腺癌。

本发明进一步提供包含血管发生抑制剂的药物组合物用于治疗有此需要的患者，所述血管发生抑制剂包括贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，其中通过一种体外方法已确定所述患者为更少地易感于形成与通过所述血管发生抑制剂的疗法有关的高血压，所述体外方法包括：

本发明进一步提供一种降低形成与通过血管发生抑制剂的疗法有关的高血压的风险的方法，其中所述血管发生抑制剂包括贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，所述方法包括：

(a)在自患有癌症的患者衍生的样品中测定多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处的基因型；

(b)鉴定患者为更少地易感于形成与通过血管发生抑制剂的疗法有关的高血压，所述血管发生抑制剂包括贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，其中多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处GG或AA基因型的存在指示所述患者比在多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处具有GA基因型的患者更少地易感于形成高血压；并

(c)对在多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处具有GG或AA基因型、依照(b)鉴定为更少地易感于形成高血压的患者施用所述血管发生抑制剂。在一个实施方案中，癌症选自下组：结直肠癌、成胶质细胞瘤、肾癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和肺癌，更具体地，结直肠癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌，甚至更具体地，结直肠癌、肾癌和肺癌。

在一个实施方案中，血管发生抑制剂作为共治疗物与化疗剂或化疗方案一起施用。在一个进一步的实施方案中，血管发生抑制剂与一种或多种选自下组的药剂一起施用：紫杉烷如多西他赛(docetaxel)和帕利他赛(paclitaxel)、干扰素α、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、伊利替康、吉西他滨-厄洛替尼和基于铂的化疗剂如卡铂、顺铂和奥沙利铂。另外，血管发生抑制剂可作为共治疗物与放疗一起施用。

在本发明的背景中，所述样品是生物学样品且可以是血液和/或组织样品。在一个实施方案中，所述样品是血液样品，更具体地是外周血样品。在本发明的背景中，所述样品是DNA样品。所述DNA样品可以是种系DNA或体细胞DNA，更具体地是种系DNA。

在一个实施方案中，所述基因型通过MALDI-TOF质谱术测定。除了下文对SNP检测的详细描述以外，以下参考文献提供了对基于MALDI-TOF质谱的SNP基因型分型的指导，例如Storm et al.,Methods Mol.Biol.212:241-62,2003。

3.核酸多态性的检测

用于评估核酸中SNP存在的检测技术牵涉分子遗传学领域公知的规程。许多但并非所有方法牵涉核酸的扩增。本领域中提供了实施扩增的大量指导。例示性参考包括手册如PCR Technology:Principles and Applications forDNA Amplification(H.A.Erlich编,Freeman Press,NY,N.Y.,1992)；PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications(Innis et al.,编,Academic Press,San Diego,Calif.,1990)；Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,1994-1999，包括补充更新至2004年4月；Sambrook&Russell,MolecularCloning,A Laboratory Manual(3rd Ed,2001)。用于检测单核苷酸多态性的一般方法披露于Single Nucleotide Polymorphisms:Methods and Protocols,Pui-Yan Kwok编,2003,Humana Press。

尽管所述方法通常采用PCR步骤，但也可以使用其他扩增方案。合适的扩增方法包括连接酶链式反应(参见例如Wu&Wallace,Genomics4:560-569,1988)；链置换测定法(参见例如Walker et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:392-396,1992；美国专利No.5,455,166)；和数种基于转录的扩增系统，包括记载于美国专利No.5,437,990；5,409,818；和5,399,491的方法；转录扩增系统(TAS)(Kwoh et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173-1177,1989)；和自身持续(self-sustained)的序列复制(3SR)(Guatelli et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874-1878,1990；WO92/08800)。或者，可使用将探针扩增至可检测水平的方法，如Qβ复制酶扩增(Kramer&Lizardi,Nature339:401-402,1989；Lomeli et al.,Clin.Chem.35:1826-1831,1989)。提供对已知扩增方法的综述，例如Abramson和Myers于Current Opinion in Biotechnology4:41-47,1993。

可使用寡核苷酸引物和/或探针来实施对个体基因型、单体型、SNP、微卫星或其他多态性的检测。寡核苷酸可通过任何合适的方法制备，通常是化学合成。寡核苷酸可使用商品化的试剂和仪器合成。或者，可经由商业性来源购买它们。合成寡核苷酸的方法是本领域中公知的(参见例如Narang et al.,Meth.Enzymol.68:90-99,1979；Brown et al.,Meth.Enzymol.68:109-151,1979；Beaucage et al.,Tetrahedron Lett.22:1859-1862,1981；和美国专利No.4,458,066的固体支持物方法)。另外，可利用对上述合成方法的改良来期望性地影响关于合成的寡核苷酸的酶行为。例如，可利用将经修饰的磷酸二酯连接(例如硫代磷酸、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯或硼烷磷酸酯(boranophosphate))或除亚磷酸衍生物以外的连接掺入寡核苷酸中来防止在选定位点处的切割。另外，当与也是用于合成新核酸链的模板的核酸杂交时，2’-氨基经修饰的糖的使用倾向于利于对寡核苷酸消化的置换。

可使用本领域公知的许多检测方法来测定个体的基因型。大多数测定法需要数种一般性方案之一：使用等位基因特异性寡核苷酸的杂交、引物延伸、等位基因特异性连接、测序或电泳分离技术，例如单链构象多态性(SSCP)和异双链体分析。例示性的测定法包括5’-核酸酶测定法、模板指导的染料-终止子掺入、分子信标等位基因特异性寡核苷酸测定、单碱基延伸测定、和通过实时焦磷酸序列的SNP打分。对扩增序列的分析可使用各种技术进行，如微芯片、荧光偏振测定法和MALDI-TOF(基质辅助激光解吸离子化-飞行时间)质谱。还可使用的两种方法是基于使用Flap核酸酶的侵入性切割的测定法和采用挂锁(padlock)探针的方法学。

对特定等位基因的存在或不存在的确定一般通过分析从要分析的个体获得的核酸样品来进行。所述核酸样品经常包含基因组DNA。所述基因组DNA通常从血液样品获得，但也可从其他细胞或组织获得。

还可能对RNA样品分析多态性等位基因的存在。例如，mRNA可用于测定一个或多个多态性位点处个体的基因型。在此情况中，核酸样品从其中表达靶核酸的细胞如脂肪细胞获得。这类分析可通过以下进行：首先逆转录靶RNA(使用例如病毒逆转录酶)，然后扩增所得cDNA；或使用组合的高温逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，如记载于美国专利No.5,310,652；5,322,770；5,561,058；5,641,864；和5,693,517的。

简短描述了用于分析核酸样品以检测SNP的经常使用的方法学。然而，可在本发明中使用本领域中已知的任何方法来检测单核苷酸取代的存在。

a.等位基因特异性杂交

此技术(亦普遍称为等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO))(例如Stonekinget al.,Am.J.Hum.Genet.48:70-382,1991；Saiki et al.,Nature324,163-166,1986；EP235,726；和WO89/11548)依赖于在仅有一个碱基不同的两种DNA分子之间进行区分，其通过将特异于变体之一的寡核苷酸探针与从扩增核酸样品获得的扩增产物杂交。该方法通常采用短寡核苷酸，例如长度为15-20个碱基。探针设计为对一种变体相对于另一种变体差异性杂交。设计这类探针的原理和指导是本领域中可获的，例如在本文所引用的参考文献中。杂交条件应当足够严格从而在等位基因之间杂交强度有显著差异，并产生基本二元性响应，由此探针仅与一种等位基因杂交。一些探针设计为与靶DNA的区段杂交，从而多态性位点与探针的中心位置(例如在15个碱基的寡核苷酸中在位置7；在16个碱基的寡核苷酸中在位置8或9)联配，但该设计不是必需的。

通过测量与样品杂交的等位基因特异性寡核苷酸的量来测定等位基因的量和/或存在。典型地，将寡核苷酸用标记物如荧光标记物标记。例如，将等位基因特异性寡核苷酸应用于固定化的代表SNP序列的寡核苷酸。在严格的杂交和清洗条件后，对每种SNP寡核苷酸测量荧光强度。

在一个实施方案中，鉴定在多态性位点处存在的核苷酸，其通过在序列特异性杂交条件下使用与涵盖多态性位点的区域中的多态性等位基因之一准确互补的寡核苷酸探针或引物的杂交。所述探针或引物杂交序列和序列特异性杂交条件选定为使得多态性位点处的单个错误匹配将杂交双链体充分去稳定从而不能有效形成双链体。如此，在序列特异性杂交条件下，稳定的双链体将仅在探针或引物与准确互补的等位基因序列之间形成。如此，长度为约10至约35个核苷酸(通常长度为约15至约35个核苷酸)、与涵盖多态性位点的区域中的等位基因序列准确互补的寡核苷酸在本发明的范围内。

在一个备选的实施方案中，鉴定在多态性位点处存在的核苷酸，其通过在足够严格的杂交条件下使用与涵盖多态性位点的区域中的SNP等位基因之一基本互补且与多态性位点处的等位基因准确互补的寡核苷酸的杂交。由于存在于非多态性位点处的错误匹配是对两种等位基因序列的错误匹配，与靶等位基因序列形成的双链体中和与相应的非靶等位基因序列形成的双链体中错误匹配数的差异与使用对靶等位基因序列准确互补的寡核苷酸时相同。在该实施方案中，杂交条件足够松以允许与靶序列形成稳定的双链体，并维持足够的严格性以排除与非靶序列形成稳定双链体。在这类充分严格的杂交条件下，稳定的双链体将仅在探针或引物与靶等位基因之间形成。如此，长度为约10至约35个核苷酸(长度通常为约15至约35个核苷酸)、与涵盖多态性位点的区域中的等位基因序列基本互补且与多态性位点处的等位基因序列准确互补的寡核苷酸在本发明的范围内。

可能期望在其中限制杂交条件优化的测定形式中使用基本而非准确互补的寡核苷酸。例如，在典型的多靶物固定化的寡核苷酸测定形式中，每种靶物的探针或引物固定化于单个固体支持物上。通过使固体支持物与含有靶DNA的溶液接触来同时实施杂交。由于所有杂交均在等同条件下进行，因此杂交条件不能针对每种探针或引物分别优化。当测定形式排除调整杂交条件时，可利用错误匹配到探针或引物中的掺入来调整双链体稳定性。引入的特定错误匹配对双链体稳定性的影响是公知的，且双链体稳定性可常规地估测和经验性测定，如上文描述的。可使用本文中提供和本领域中公知的指导来经验性选择依赖于探针或引物的确切大小和序列的适宜杂交条件。使用寡核苷酸探针或引物来检测序列中的单碱基对差异记载于例如Conner et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:278-282以及美国专利No.5,468,613和5,604,099，其各自通过提述并入本文。

完美匹配的和单碱基错配的杂交双链体之间稳定性的成比例变化依赖于杂交的寡核苷酸的长度。与更短的探针序列形成的双链体由错误匹配的存在成比例更多地去稳定。长度为约15至约35个核苷酸之间的寡核苷酸经常用于序列特异性检测。此外，由于杂交的寡核苷酸端经历连续的随机解离和再退火(由于热能量)，在任一端的错误匹配比存在于内部的错误匹配使杂交双链体更少地去稳定。为了区分靶序列中的单碱基对变化，选择与靶序列杂交的探针序列从而多态性位点存在于探针的内部区域。

上文用于选择与特定等位基因杂交的探针序列的标准适用于探针杂交区域，即涉及与靶序列杂交的探针部分。探针可结合额外的核酸序列，如用于固定化探针的聚T尾部，而不显著改变探针的杂交特征。本领域技术人员将认可对于在所述方法中的使用，结合额外的核酸序列、与靶序列不互补如此不涉及杂交的探针基本与不结合的探针等同。

用于检测探针和样品中靶核酸序列之间形成的杂合体的合适的测定形式是本领域中已知的且包括固定化的靶物(点印迹)形式和固定化的探针(反向点印迹或线印迹)测定形式。点印迹和反向点印迹测定形式记载于美国专利No.5,310,893；5,451,512；5,468,613；和5,604,099；其各自通过提述并入本文。

在点印迹形式中，扩增的靶DNA固定化于固体支持物如尼龙膜上。将膜-靶物复合物与经标记的探针在适宜的杂交条件下温育，未杂交的探针通过在适宜严格条件下清洗除去，并对膜监测结合的探针的存在。

在反向点印迹(或线印迹)形式中，探针固定化于固体支持物如尼龙膜或微滴定板上。靶DNA是经标记的，通常在扩增期间通过掺入经标记的引物。可标记引物之一或两者。将膜-探针复合物与经标记的扩增后靶DNA在适宜的杂交条件下温育，通过在适宜的严格条件下清洗除去未杂交的靶DNA，并监测膜上结合的靶DNA的存在。反向线印迹检测测定法记载于实施例。

特异于多态性变体之一的等位基因特异性探针经常连同针对其他多态性变体的等位基因特异性探针一起使用。在一些实施方案中，探针固定化于固体支持物上且同时使用两种探针来分析个体中的靶序列。核酸阵列的例子由WO95/11995描述。同一阵列或不同阵列可用于分析表征的多态性。WO95/11995还描述了针对预表征的多态性变体形式的检测优化过的子阵列。这类子阵列可用于检测本文中描述的多态性的存在。

b.等位基因特异性引物

多态性还普遍使用等位基因特异性扩增或引物延伸方法检测。这些反应通常牵涉设计为特异性靶向多态性的引物的使用，所述靶向经由引物3’端的错配。错配的存在影响聚合酶在缺少错误校正活性时延伸引物的能力。例如，要使用基于等位基因特异性扩增或延伸的方法来检测等位基因序列，与多态性的一种等位基因互补的引物设计为使得3’末端核苷酸在多态性位置处杂交。特定等位基因的存在可由引物启动延伸的能力确定。如果3’末端错误匹配，那么延伸受到阻碍。

在一些实施方案中，在扩增反应中引物连同第二引物一起使用。第二引物在与多态性位置不相关的位点杂交。扩增从两条引物前进产生可检测产物，表示存在特定的等位形式。基于等位基因特异性扩增或延伸的方法记载于例如WO93/22456；美国专利No.5,137,806；5,595,890；5,639,611；和美国专利No.4,851,331。

使用基于等位基因特异性扩增的基因型分型，对等位基因的鉴定仅需要检测扩增的靶序列的存在或不存在。用于检测扩增后靶序列的方法是本领域中公知的。例如，描述的凝胶电泳和探针杂交测定经常用于检测核酸的存在。

在一个备选的探针较少(probe-less)的方法中，通过监测反应混合物中双链DNA总量的增加来检测扩增的核酸，其记载于例如美国专利No.5,994,056；和欧洲专利公开文本No.487,218和512,334。双链靶DNA的检测依赖于增加的荧光，其由各种结合DNA的染料例如SYBR Green在结合双链DNA时显示。

如本领域技术人员领会的，可在采用多种等位基因特异性引物来靶向特定等位基因的反应中进行等位基因特异性扩增方法。针对这类多重应用的引物一般用可区分的标记物标记或选择为使得从等位基因产生的扩增产物可通过大小区分。如此，例如可使用单一扩增通过对扩增产物的凝胶分析来鉴定单一样品中的两种等位基因。

如在等位基因特异性探针中的，等位基因特异性寡核苷酸引物可与杂交区中的多态性等位基因之一准确互补，或者可在寡核苷酸3’末端以外的位置具有一些错误匹配，该错误匹配存在于两种等位基因序列中的非多态性位点处。

c.可检测探针

i)5’-核酸酶测定探针

基因型分型还可使用“”或“5’-核酸酶测定法”，如记载于美国专利No.5,210,015；5,487,972；和5,804,375；和Holland et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7276-7280的实施。在测定中，在扩增反应期间添加在扩增区内杂交的经标记检测探针。所述探针经修饰以预防探针充当DNA合成的引物。扩增使用具有5’至3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶进行。在扩增的每个合成步骤期间，任何与延伸的引物下游靶核酸杂交的探针均通过DNA聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性降解。如此，新靶物链的合成还导致探针的降解，而降解产物的积累提供对靶序列合成的量度。

杂交探针可以是在SNP等位基因之间进行区分的等位基因特异性探针。或者，所述方法可使用等位基因特异性引物和结合扩增产物的经标记探针进行。

任何适用于检测降解产物的方法可用于5’-核酸酶测定。经常将检测探针用两种荧光染料标记，其中一种能将另一种染料的荧光猝灭。染料附接于探针，通常一种附接于5’末端而另一种附接于内部位点，从而当探针在未杂交状态时发生猝灭且从而通过DNA聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性对探针的切割发生在两种染料之间。扩增导致染料之间探针的切割，其伴随有猝灭消除以及可从初始猝灭的染料观察到的荧光中的增加。降解产物的积累通过测量反应荧光中的增加来监测。通过提述均并入本文的美国专利No.5,491,063和5,571,673描述了用于检测伴随扩增发生的探针降解的备选方法。

ii)二级结构探针

在二级结构变化时可检测的探针也适用于检测多态性，包括SNP。例示性的二级结构或茎环结构探针包括分子信标或引物/探针。分子信标探针是单链寡核酸探针，其可形成发夹结构，其中荧光团和猝灭剂通常位于寡核苷酸的相反端。在探针的任一端，短互补序列允许形成分子内的茎，其使得荧光团和猝灭剂进入紧密临近。分子信标的环部分与感兴趣的靶核酸互补。该探针对感兴趣的其靶核酸的结合形成迫使茎分开的杂合体。这导致将荧光团和猝灭剂彼此移开的构象变化且导致更强烈的荧光信号。然而，分子信标探针对探针靶物中的小序列变化高度敏感(Tyagi S.和Kramer F.R.,Nature Biotechnology,Vol.14,303-308页(1996)；Tyagi et al.,NatureBiotechnology,Vol.16,49-53页(1998)；Piatek et al.,Nature Biotechnology,Vol.16,359-363页(1998)；Marras S.et al.,Genetic Analysis:BiomolecularEngineering,Vol.14,151-156页(1999)；Tpp I.et al.,BioTechniques,Vol28,732-738页(2000))。引物/探针包含共价连接于引物的茎环结构探针。

d.DNA测序和单碱基延伸

SNP还可通过直接测序检测。方法包括例如基于双脱氧测序的方法和其他方法如Maxam和Gilbert序列(参见例如Sambrook和Russell，见上文)。

其他检测方法包括寡核苷酸长度产物的Pyrosequencing^TM。这类方法经常采用扩增技术如PCR。例如，在焦磷酸测序中，将测序引物杂交到单链的PCR扩增的DNA模板；并与酶DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、萤光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶，以及底物腺苷5’磷酸硫酸(APS)和萤光素温育。将4种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)的第一种添加到反应。如果脱氧核苷酸三磷酸与模板链中的碱基互补的话，DNA聚合酶催化其掺入DNA链中。每个掺入事件均伴随有焦磷酸(PPi)的释放，其以与掺入的核苷酸量等摩尔的量。ATP硫酸化酶在存在腺苷5’磷酸硫酸的情况下定量地将PPi转化成ATP。该ATP驱动萤光素酶介导的萤光素到氧化萤光素的转化，其生成量与ATP量成比例的可见光。萤光素酶催化的反应中产生的光由电荷耦合装置(CCD)照相机检测到并在Pyrogram^TM中看到为一个峰。每个光信号均与掺入的核苷酸数目成比例。腺苷三磷酸双磷酸酶，一种核苷酸降解酶，连续降解未掺入的dNTP和过量的ATP。当降解完成时，添加另一种dNTP。

另一种用于表征SNP的类似方法不需要使用完整的PCR，但通常仅使用通过与要研究的核苷酸互补的单一的、用荧光标记的双脱氧核糖核酸分子(ddNTP)的引物延伸。多态性位点处的核苷酸可经由对已延伸一个碱基且经荧光标记的引物的检测来鉴定(例如Kobayashi et al.,Mol.Cell.Probes,9:175-182,1995)。

e.电泳

可通过使用变性梯度凝胶电泳分析使用聚合酶链式反应生成的扩增产物。不同的等位基因可基于不同序列依赖性解链特性和DNA在溶液中的电泳迁移来鉴定(参见例如Erlich编,PCR Technology,Principles and Applicationsfor DNA Amplification,W.H.Freeman and Co,New York,1992,Chapter7)。

对微卫星多态性的区分可使用毛细管电泳完成。毛细管电泳便利地允许鉴定出特定微卫星等位基因中的重复数。对DNA多态性分析应用毛细管电泳是本领域中技术人员公知的(参见例如Szantai et al.,J Chromatogr A.(2005)1079(1-2):41-9；Bjorheim和Ekstrom,Electrophoresis(2005)26(13):2520-30和Mitchelson,Mol Biotechnol.(2003)24(1):41-68)。

f.单链确认多态性分析

可使用单链确认多态性分析来区分靶序列的等位基因，该分析通过单链PCR产物的电泳迁移变化来识别碱基差异，如记载于例如Orita et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.86,2766-2770(1989)的。扩增的PCR产物可如上文所述的生成，并加热或变性以形成单链扩增产物。单链核酸可重折叠或形成二级结构，其部分取决于碱基序列。单链扩增产物的不同电泳迁移性可与靶物等位基因之间的碱基序列差异相关。

SNP检测方法经常采用经标记的寡核苷酸。可通过掺入标记物来标记寡核苷酸，所述标记物可通过光谱、光化学、生化、免疫化学或化学手段检出。可用的标记物包括荧光染料、放射性标记物例如32P、电子致密性试剂、酶如过氧化物酶或碱性磷酸酶、生物素、或对其可获得抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白质。标记技术是本领域中公知的(参见例如Current Protocols inMolecular Biology，见上；Sambrook&Russell，见上)。

4.治疗方法

依照EMEA用贝伐单抗来治疗特定癌症的剂量如下。对于转移性结肠或直肠癌(mCRC)，推荐的剂量为5mg/kg或10mg/kg体重每2周给药一次，或7.5mg/kg或15mg/kg体重每3周给药一次，对于转移性乳腺癌(mBC)，推荐的剂量为以静脉输注10mg/kg体重每2周给药一次或15mg/kg体重每3周给药一次，而对于非小细胞肺癌(NSCLC)，推荐的剂量为以静脉输注7.5mg/kg或15mg/kg体重每3周给药一次。在NSCLC患者中的临床受益已用7.5mg/kg和15mg/kg两种剂量证明。详情见5.1Pharmacodynamic Properties,Non-small cell lung cancer(NSCLC)部分。对于晚期和/或转移性肾细胞癌(mRCC)，优选的剂量为以静脉输注10mg/kg体重每2周给药一次(除了长达6个治疗周期的基于铂的化疗之外继之以作为单药剂的贝伐单抗直至疾病进展)。对于成胶质细胞瘤，具体的剂量为10mg/kg每2周。

在本发明的背景中，所述血管发生抑制剂可另外地施用或作为共疗法或共治疗物与一种或多种为本领域中已知的标准化疗方案一部分的化疗剂一起施用。这类标准化疗方案中包含的药剂的例子包括5-氟尿嘧啶、亚叶酸、伊立替康、吉西他滨、厄洛替尼、卡培他滨、紫杉烷如多西他赛和帕利他赛、干扰素α、长春瑞滨和基于铂的化疗剂如帕利他赛、卡铂、顺铂和奥沙利铂。用于转移性胰腺癌的共治疗物的例子包括吉西他滨-厄洛替尼加剂量为5mg/kg或10mg/kg体重每两周给药一次或7.5mg/kg或15mg/kg体重每三周给药一次的贝伐单抗。用于肾细胞癌的共治疗物的例子包括干扰素α加剂量为10mg/kg体重每两周给药一次的贝伐单抗。此外，可用伊立替康、5-氟尿嘧啶、亚叶酸的组合(亦称为IFL)如例如推注-IFL，用奥沙利铂、亚叶酸和5-氟尿嘧啶的组合(亦称为FOLFOX4方案)，或用卡培他滨和奥沙利铂的组合(亦称为XELOX)共治疗患者。因此，在本发明的一个进一步的实施方案中，将患有恶性疾病或牵涉生理学和病理学血管发生的疾病的患者用一种或多种化疗剂如5-氟尿嘧啶、亚叶酸、伊立替康、吉西他滨-厄洛替尼、卡培他滨、和/或基于铂的化疗剂如帕利他赛、卡铂和奥沙利铂治疗。共疗法或共治疗物的例子包括5mg/kg贝伐单抗每两周与推注IFL一起，或10mg/kg贝伐单抗每2周与FOLFOX4一起用于转移性结直肠癌，15mg/kg贝伐单抗每3周与卡铂/帕利他赛一起用于非鳞状非小细胞肺癌，以及10mg/kg贝伐单抗每2周和帕利他赛一起用于转移性乳腺癌。另外，要施用的血管发生抑制剂可作为共疗法或共治疗物与放疗一起施用。

5.试剂盒

本发明还涉及诊断用组合物或试剂盒，其包含任一种提及的寡核苷酸和任选地用于检测的适宜工具。

本发明的试剂盒可有利地用于实施本发明的方法且可以在多种应用中例如在诊断领域或作为研究工具等等采用。本发明试剂盒的各部分可以是分别在管形瓶中的包装或组合于容器或多容器单元中。试剂盒的制备依照本领域技术人员已知的优选标准规程。所述试剂盒或诊断用组合物可用于依照本发明的所述方法检测一种或多种变异等位基因，其采用例如如本文中描述的扩增技术。

因此，本发明的一个进一步的实施方案提供可用于实施本文所述方法的试剂盒，其包含能测定一种或多种SNP基因型的寡核苷酸或多核苷酸。所述寡核苷酸或多核苷酸可包含引物和/或探针。

本发明通过提述以下非限制性的附图和实施例进一步描述。

实施例

实施例1：

遗传决定能影响内皮对VEGF的敏感性。据此且在本发明的背景中，我们探索了根本信号传导途径中的遗传变异性以发现抗血管发生治疗和在此治疗方案下形成高血压的预测模式。在该分析中，在5项不同试验中评估了VEGF-A信号传导途径中的遗传变异性与具有不同晚期原发性癌症的患者的临床结果的相关性。所有5项试验均为随机化的平行试验，其调查具有转移性结直肠癌(NO16966)、转移性胰腺癌(AVITA)、晚期或复发的非鳞状非小细胞肺癌(AVAIL)、转移性肾癌(AVOREN)和HER2阴性转移性乳腺癌(AVADO)的受试者中BEV(贝伐单抗)的功效和安全性。

在所有5项试验中，纳入任选的DNA生物标志物取样用于SNP分析。总共从1346位患者可获得种系DNA。基于参考文献并使用SNP标记办法(f≥0.1和r²≤0.8)选择位于缺氧可诱导因子1α和2α、VEGF-A、其受体(VEGFR-1和2)和其他相关基因中的常见单核苷酸多态性(SNP)。使用MALDI-TOF质谱术成功测定157种SNP的基因型。使用Cox回归分析计算风险和存活估测。

进行两种类型的分析。

1.遗传标志物对PFS和OS的相关性。

2.遗传标志物对不归类为“与研究药物无关”的高血压的相关性。

位于VEGF-A启动子中的rs699946(SEQ ID NO.1)SNP与用bev治疗的受试者中改进的PFS有关，等位基因HR为1.26(95％CI1.07-1.48，p＝0.005)。在安慰剂受试者中未看到影响，表明rs699946(SEQ ID NO.1)可能是用贝伐单抗治疗的有利结果中的预测性标志物。此外，位于VEGFR2中的rs11133360(SEQ ID NO.5)SNP与用贝伐单抗治疗的受试者中改进的PFS有关，等位基因HR为1.15(95％CI1.02-1.30，p＝0.02)。就OS而言，VEGFR2中的rs12505758(SEQ ID NO.2)SNP与用bev治疗的患者中改进的OS最显著相关(等位基因HR1.50，95％CI1.21-1.86，p＝0.0002)。在安慰剂患者中未看到rs12505758(SEQ ID NO.2)的影响。

10种SNP与贝伐单抗诱发的高血压有关(p<0.05)，但其中没有一种超过多重检验的阈值(p<0.0003)。显示最强烈关联性(p<0.01)的两种SNP为：KDR中的rs2305949(SEQ ID NO.3)(等位基因OR0.93，95％CI0.88-0.98，p＝0.0067)和EGF中的rs4444903(SEQ ID NO.4)(等位基因OR1.06，95％CI1.02-1.11，p＝0.0052)。有意思的是，rs2305949(SEQ ID NO.3)和rs4444903(SEQ ID NO.4)与在KDR和EGF位置273和708上发生的氨基酸变化有密切联系，表明这些变化可能功能性地影响这两种基因并由此促成高血压。特别地，WNK1中的rs11064560也与贝伐单抗诱发的高血压有关(等位基因OR1.06，95％CI1.01-1.10，p＝0.02)，由此支持了先前在有限数目的患者中的观察结果[Frey et al.,J Clin Oncol26:2008(May20suppl；abstr11003)]。

患者和方法

样品

所有5项试验方案均得到每个地方的机构审查委员会(institutional reviewboard)批准，并依照赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)、目前的美国食品和药品管理局优良临床实践(Good Clinical Practices)、和地方伦理和法律要求进行。总共对1346位受试者测定基因型。在这些受试者中，1225位为白种人而121位为非白种人。由于非白种人患者与白种人患者遗传不同且SNP频率在两个种族组之间可能不同，进一步的分析省去非白种人患者。所有患者对于遗传生物标志物测试均提供分别的书面知情同意书。

评估

依照如在下列参考文献中记载的研究方案来评估患者：

-AVITA：Van Cutsem et al.,J.Clinc.Oncol.27,2231-7(2009)

-AVAIL：Reck M,von Pawel J,Zatloukal P et al.,Phase III trial of cisplatin plusgemcitabine with either placebo or bevacizumab as first-line therapy fornonsquamous non-small-cell lung cancer:AVAiL.J Clin Oncol2009；27(8):1227-34

-AVOREN：Escudier B,Pluzanska A,Koralewski P,Ravaud A,Bracarda S,Szczylik C et al.,Bevacizumab plus interferon alfa-2a for treatment of metastaticrenal cell carcinoma：a randomised,double-blind phase III trial.Lancet.2007；370(9605):2103-2111

-AVADO：Miles DW et al.,J Clin Oncol2010a；28(20):3239-47

-NO16966：Saltz LB,Clarke S,Diaz-Rubio E et al.,Bevacizumab incombination with oxaliplatin-based chemotherapy as first-line therapy inmetastatic colorectal cancer：a randomized phase III study.J Clin Oncol2008；26(12):2013-2019

单核苷酸多态性选择

分析考虑两种标志物集合：Roche集合和Leuven集合。Roche集合由通过对BEV治疗的潜在相关性的文献审查选定的35种遗传多态性组成。该集合由位于以下基因中的SNP和重复多态性构成：VEGFA、NOS3、FLT1(VEGFR1)、KDR(VEGFR2)、WNK1、IL8、IL8R和IFNAR2。Leuven集合由来自VEGF信号传导级联或来自已知的副作用(高血压或血栓形成)的候选基因的186种标签SNP组成，且包括以下基因：VEGF配体、VEGF同源物(胎盘生长因子或PlGF、VEGF-B和-C、以及VEGF-D或FlGF)、VEGF受体2(KDR或VEGFR-2)和VEGF受体1(FLT1或VEGFR-1)。使用每个基因翻译起始位点上游5kb直至3’polyA腺苷酸化位点的基因组序列来从HapMap数据库(HapMapData Rel24/II阶段，08年11月，NCBI B36组装，dbSNP b126)选择SNP。使用如在HAPLOVIEW软件包(Barrett,J.C.et al.,Bioinformatics.21,263-5(2005))中提供的Tagger(Pe'er,I.et al.,Nat.Genet.38,663-7(2006))来选择标记SNP。仅考虑普遍存在(即具有次要等位基因频率f≥0.1和最小r²阈值≥0.8)的SNP。遵循这些标准总共选出167种标记SNP。另外，从dbSNP数据库中选出位于外显子序列中并以f≥0.1的频率诱导非同义氨基酸变化的11种SNP，以及VEGF中的4种SNP(rs699947、rs833061、rs2010963和rs3025039)、VEGFR-1中的1种SNP(rsTP53_R-1)和VEGFR-2中的1种SNP(rs2071559)，它们先前已报告为影响这些基因的功能或表达。

这两种集合的标志物之间有一些重叠，且集合的大小在6项试验的持续期间已稍微增加，因此较早期的试验可获得较少的标志物。目前的元分析限定于在研究的至少两项试验中测定了基因型的标志物。

如下定义4种标志物套组：

·‘所有标志物’由测定的获得至少一种基因型的所有标志物组成。

·‘Roche标志物’由来自Roche集合的标志物组成，其通过质量检查(见下文)并在白种人受试者中具有大于1％的频率。

·‘Leuven功效标志物’由来自Leuven集合的那些位于牵连VEGF途径的基因座中的标志物组成，其通过质量检查(见下文)并在白种人受试者中具有大于1％的频率。

·‘Leuven安全性标志物’由来自Leuven集合的那些位于涉及高血压或血栓形成的候选基因中的标志物组成，其通过质量检查(见下文)并在白种人受试者中具有大于1％的频率。

测定基因型

将外周血取样到K2EDTA塑料Vacutainer管中。离心后，依照标准规程从沉淀的白血球细胞级分提取种系DNA。

对于Roche集合的SNP，以盲测方式在Roche翻译研究科学遗传学实验室(Translational Research Sciences Genetics laboratories)(Basel,Switzerland)实施基因型测定，其使用等位基因特异性PCR扩增、Sanger测序和片段分析平台进行(AVAIL、AVITA、AVOREN、AVADO、NO16966)。

对于Leuven集合的SNP，以盲测方式在Vesalius研究中心(Leuven,Belgium)实施基因型测定，其使用Sequenom iPLEX平台(Sequenom Inc,SanDiego,CA,USA)进行。将任何不能在第一轮基因型测定中提供有力基因型的SNP使用不同的聚合酶链式反应引物套组重新设计并重新测试。总共有157种(85.3％)成功进行基因型测定，总体成功率为98.5％。第二次设计仍失败的27种SNP视为失败。

设计以下扩增引物用于SNP rs699946(SEQ ID NO.1)、rs12505758(SEQID NO.2)、rs2305949(SEQ ID NO.3)、rs4444903(SEQ ID NO.4)和rs11133360(SEQ ID NO.5)。对于rs699946(SEQ ID NO.1)，使用ACGTTGGATGCTACCACTAGTGTTGGCTTG(SEQ ID NO.6)和ACGTTGGATGTGAGCTCCACACTGCCTTC(SEQ ID NO.7)。对于SNPrs12505758(SEQ ID NO.2)，使用ACGTTGGATGCTTTACTCTGCCAAATCTATG(SEQ ID NO.8)和ACGTTGGATGGCTAATAAGCTTATACATTTG(SEQ ID NO.9)。对于rs2305949(SEQ ID NO.3)，使用ACGTTGGATGATCCTATACCCTAGAGCAAG(SEQ ID NO.10)和ACGTTGGATGATCTGTGCAAAGTTATAGGC(SEQ ID NO.11)。对于rs4444903(SEQ ID NO.4)，使用ACGTTGGATGTCTTCTTTCAGCCCCAATCC(SEQ ID NO.12)和ACGTTGGATGAAGAAAGGAAGAACTGATGG(SEQ ID NO.13)。对于rs11133360(SEQ ID NO.5)，使用ACGTTGGATGTTTCACATTGCTATGCCCAA(SEQ ID NO.14)和ACGTTGGATGCTCTTTCTTCACTTTGACTG(SEQ ID NO.15)。

设计以下非延伸引物(探针)用于SNP rs699946(SEQ ID NO.1)、rs12505758(SEQ ID NO.2)、rs2305949(SEQ ID NO.3)、rs4444903(SEQ IDNO.4)和rs11133360(SEQ ID NO.5)。对于rs699946(SEQ ID NO.1)，使用ATTAGTCAATTCTCTGACAGAGACA(SEQ ID NO.16)。对于rs12505758(SEQ ID NO.2)，使用TTACTCTGCCAAATCTATGATGCCA(SEQ ID NO.17)。对于rs2305949(SEQ ID NO.3)，使用CTAGAGCAAGTAAATTGAAAAAA(SEQ ID NO.18)。对于rs4444903(SEQID NO.4)，使用GCATCTCCAATCCAAGGGTTGT(SEQ ID NO.19)。对于rs11133360(SEQ ID NO.5)，使用CACATTGCTATGCCCAACACATC(SEQID NO.20)。

质量检查

如下检查数据质量：

·确保测定链的均一性

·汇总缺失数据的水平

·排除具有次要等位基因频率(MAF<1％)的标志物

·排除对于等位基因频率同质性测试失败的标志物

·进行Hardy Weinberg平衡(HWE)检验来协助解读

在质量检查后，将25种Roche标志物、133种Leuven功效标志物和22种Leuven安全性标志物进行合并关联性分析。

统计学分析

对所有具有同质性频率的标志物应用通过研究分层的个体患者数据的合并分析。对于功效候选标志物测试与PFS和OS的关联性，其使用Cox比例风险回归(Proportional Hazards Regression)进行。对于安全性候选标志物测试与高血压的关联性，其使用逻辑回归(Logistic Regression)进行。在适宜时，主要分析牵涉来自ITT(对于功效终点)和SP(高血压)的用BEV治疗的白种人受试者。在所有关联性测试中对以下协变量进行调整：区域、研究和剂量以及背景化疗方案。还调整使用后向逐步回归(backward stepwise regression)通过终点选定的以下变量子集：ECOG表现状态(0对1)、性别(男性对女性)、年龄、LDH、碱性磷酸酶水平(正常范围以内对正常范围之上)、血清清蛋白(<2.9g/dL对>＝2.9g/dL)和转移性部位的基线数目(>2对<＝2)。为了调查任何检出的关联性是否反映暂时的而非治疗效果，还在用安慰剂治疗的白种人受试者中进行关联性测试。为了进一步表征任何检出的关联性，还在白种人受试者中进行基因型x治疗相互作用分析。

数据

26种Roche标志物、136种Leuven功效标志物和22种Leuven安全性标志物通过质量检查并进行同质性分析。表1显示要纳入元分析的受试者的数目。注意到ITT中的3位受试者不在SP中，且3位受试者对于随机化的每周剂量具有缺失值(RNDWD)。

表1：用于分析的受试者套组和大小

分析群体	计数
		PGx-ITT-所有臂-所有种族	1346
PGx-ITT-所有臂-白种人	1225
		PGx-ITT-BEV-所有种族	668
PGx-ITT-BEV-白种人	629
		PGx-ITT-PBO-白种人	593
PGx-SP-所有臂-白种人	1223
		PGx-SP-BEV-所有种族	667
PGx-SP-BEV-白种人	628
		PGx-SP-PBO-白种人	592

遗传患者群体的临床特征

对于PGx-ITT-BEV-所有种族中的受试者在表2中按临床试验和总体将人口学和终点特征列表。在图1-4中图示绘出了终点分布。

表2：人口学和终点数据的汇总

来自5项试验的1348位受试者可获得临床数据，在治疗和安慰剂上总共有大致相等的数目。与其他试验相反，没有男性参与BO17708(AVADO)，其为晚期乳腺癌试验。年龄分布和白种人比例广泛同质，不过在最大的试验NO16966中白种人受试者比例稍低。OS和PFS的中值长度如审查率一样广泛变化。如预期的，OS的审查远超PFS，而且就统计项而言，影响将会是相比于PFS降低检测OS关联性的检验力(power)。BOR比率在用BEV治疗的受试者中为49％，而在用PBO治疗的受试者中为46％。高血压比率在用BEV治疗的受试者中为18％，而在用PBO治疗的受试者中为7％(图4)。

在PGx-ITT中629位用BEV治疗的白种人受试者中，对于PFS有592件事件，而对于OS有438件事件。在PGx-SP中总共628位用BEV治疗的白种人受试者中，对于高血压有113件事件。表3显示要纳入元分析中的白种人受试者的数目。

表3：白种人受试者的遗传药理学元分析的受试者计数

群体	治疗	计数
			ITT	BEV	629
ITT	PBO	593

SP	BEV	628
			SP	PBO	592

ITT：意图治疗群体

SP：安全性群体

功效结果

无进展存活

用贝伐单抗治疗的患者亚组中的分析

VEGF-A中与PFS的最强关联为rs699946(SEQ ID NO.1)(p＝0.005)。尽管在针对多重检验的调整后该结果不会是显著的，但它提供了与由Schneider etal.,J Clin Oncol200826:4672发表的标志物rs699947一致的上游信号。在图5中给出了整个基因中关联性的散点图。

标志物

Chr

BP

MAF

N

HR

95％CI

p值

基因

rs699946

Chr6

43732669

0.18

542

1.26

(1.07,1.48)

0.0047

VEGFA

相对于AA携带者，rs699946(SEQ ID NO.1)AG携带者的HR为1.26(95％CI1.07-1.48，p＝0.005)。这意味着每个增加的G等位基因与进展或死亡风险中27％的增加有关。在安慰剂受试者中未看到影响，表明rs699946(SEQ IDNO.1)可能是用贝伐单抗治疗的有利结果的预测性标志物。

如图6中显示的，对于除AVOREN/BO17705(肾癌)(考虑的最小研究)以外的所有研究均观察到rs699946(SEQ ID NO.1)的一致影响。

另外，rs11133360(SEQ ID NO.5)与PFS微弱相关(p＝0.02)(图13)。

标志物

Chr

BP

MAF

N

HR

95％CI

p值

基因

rs11133360

Chr4

55982752

0.45

579

1.15

(1.02,1.30)

0.02

KDR

相对于TT携带者，rs11133360(SEQ ID NO.5)CT携带者的HR为1.15(95％CI1.02-1.30，p＝0.02)。这意味着每个增加的C等位基因与进展或死亡风险中15％的增加有关。

总体存活分析

用贝伐单抗治疗的患者亚组中的分析

在对OS的关联性分析中，133种标志物中有6种在治疗的白种人受试者中具有p<0.05。其中一种，rs12505758(SEQ ID NO.2)在针对158项测试的Bonferroni调整后是显著的。该标志物是在KDR(激酶插入域受体；VEGFR2；FLK1)中的内含子SNP，而且其与该基因中的另一种内含子SNP即rs1531289(来源：HapMap发布22；该标志物在HapMap v3发布2中不可得)处于LD(r2＝0.31)。该标志物在用安慰剂治疗的白种人受试者中不相关，因此可以说具有预测性质，与预后性质相对。对Forest图(图7)的检视显示，该影响主要由NO16966(结直肠癌)和BO17705(AVOREN；肾癌)驱动。该影响在另外3项研究中较弱或不存在。

标志物

Chr

BP

MAF

N

HR

95％CI

p值

基因

rs12505758

Chr4

55966898

0.12

581

1.50

(1.21,1.86)

2.00E-04

KDR

相对于TT携带者，rs12505758(SEQ ID NO.2)TC携带者的HR为1.50(95％CI1.21-1.86，p＝0.0002)。这意味着每个增加的C等位基因与死亡风险中50％的增加有关。在安慰剂受试者中未看到rs12505758(SEQ ID NO.2)的影响。

卡普兰-迈耶图显示估测风险比随着次要等位基因拷贝数增加而增加(图8)。

SNP的其他信息

由于rs699946(SEQ ID NO.1)SNP位于VEGF启动子中，我们检查了它对人血浆样品中VEGF-A表达的影响。我们发现GG携带者比AG和AA(野生型)携带者具有增加27％的中值VEGF表达。rs699946(SEQ ID NO.1)的次要等位基因与rs699947的次要等位基因连锁(D’0.98；r²＝0.23)，rs699947是先前显示为与对贝伐单抗疗法响应有关的另一种VEGF启动子SNP[Schneider et al.,JClin Oncol200826:4672]。此外，rs699946(SEQ ID NO.1)还与rs833058(-6589C>T)连锁，rs833058在元分析中显现为VEGF中针对PFS的第二命中(D’＝0.95，r²＝0.35)。

其他研究的结论：我们证明了VEGF-A启动子中rs699946(SEQ ID NO.1)的G等位基因与血浆VEGF-A表达增加有关，而且rs699946(SEQ ID NO.1)与rs699947(先前由Schneider等显示为与对贝伐单抗的响应有关的另一种VEGF-A启动子SNP)连锁。

VEGFR-2中的rs11133360(SEQ ID NO.5)是一种内含子SNP，其位于编码VEGFR-2蛋白的胞外域的外显子之间。我们发现对于次要C等位基因纯合的HUVEC在VEGF刺激时相比于CT和TT携带者具有增加的增殖。重要的是，rs11133360还与rs2305948处于强连锁(D’＝1)，rs2305948是一种诱导Val297Ile替代且已报告影响VEGF对VEGFR-2结合的非同义SNP。

高血压结果

显示最强关联性(p<0.01)的2种SNP为：KDR中的rs2305949(SEQ ID NO.3)(等位基因OR0.93，95％CI0.88-0.98，p＝0.0067)、EGF中的rs4444903(SEQID NO.4)(等位基因OR1.06，95％CI1.02-1.11，p＝0.0052)；见表4，但其中没有一种超过多重检验的阈值(p<0.0003)。有趣的是，rs2305949(SEQ ID NO.3)和rs4444903(SEQ ID NO.4)与在KDR和EGF位置273和708上发生的氨基酸变化有密切联系，表明这些变化可能功能性地影响这两种基因并由此促成高血压。

表4：SNP标志物与高血压的关联性结果

标志物	Chr	BP	MAF	N	OR	95％CI	p值	基因
									rs2305949	4	55980456	0.22	578	0.93	(0.88,0.98)	0.0067	KDR
rs4444903	4	111053559	0.43	609	1.06	(1.02,1.11)	0.005	EGF

Chr＝染色体；MAF：次要等位基因频率；OR＝优势比

rs2305949(SEQ ID NO.3)(KDR)

如图9中显示的，对于CC携带者看到较高的高血压频率。图10显示3项研究(NO16966、AVAIL/BO17704和AVOREN/BO17705)驱动该关联性。用安慰剂治疗的白种人受试者的Forest图(未显示)显示研究间的均值影响在相反方向微弱，因而可得出结论该标志物具有预测性特征。

rs4444903(SEQ ID NO.4)(EGF)

如图11中显示的，对于GA携带者看到较高的高血压频率，对于AA携带者频率最低，而GG携带者的频率居中。对于EGF中的标志物rs4444903(SEQID NO.4)，对Forest图(图12)的检查显示研究间合理的一致性，其中在BO17708/AVADO(乳腺癌)中观察到最弱影响。安慰剂臂中受试者的Forest图(未显示)显示该标志物具有预测性特征，与预后特征相对。

Claims

1.一种确定患者形成与通过血管发生抑制剂的疗法有关的高血压的易感性的方法，其中所述血管发生抑制剂包含贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，所述方法包括：

(a)在自患有癌症的患者衍生的样品中测定多态性rs2305949(SEQ IDNO.3)处的基因型，并

(b)基于所述基因型鉴定患者为更多地易感于或更少地易感于形成与通过血管发生抑制剂的疗法有关的高血压，所述血管发生抑制剂包含贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，其中多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处CC基因型的存在指示所述患者比在多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处具有CT或TT基因型的患者更多地易感于形成高血压，或者多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处CT或TT基因型的存在指示所述患者比在多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处具有CC基因型的患者更少地易感于形成高血压。

2.权利要求1的方法，其中所述疗法进一步包含化疗剂或化疗方案。

3.权利要求1至2中任一项的方法，其中所述血管发生抑制剂与选自下组的一种或多种药剂一起施用：紫杉烷、干扰素α、5-氟尿嘧啶、亚叶酸(leucovorin)、伊立替康(irinotecan)、吉西他滨(gemcitabine)-厄洛替尼(erlotinib)和基于铂的化疗剂。

4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述癌症是胰腺癌、肾细胞癌、结直肠癌、乳腺癌或肺癌。

5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述样品是血液样品。

6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述基因型通过MALDI-TOF质谱术测定。

7.权利要求1至6中任一项的方法，其进一步包括对所述患者施用所述疗法。

8.一种药物组合物，其包含如权利要求1至7中限定的血管发生抑制剂，用于治疗有此需要的患者，其中依照权利要求1至7中任一项的方法已确定所述患者为更少地易感于形成与包含所述血管发生抑制剂的疗法有关的高血压。

9.一种用于实施权利要求1至7中任一项的方法的试剂盒，其包含能够测定多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处基因型的寡核苷酸。

10.一种降低形成与包含血管发生抑制剂的疗法有关的高血压的风险的方法，其中所述血管发生抑制剂包含贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，所述方法包括：

(a)在自患有癌症的患者衍生的样品中测定多态性rs2305949(SEQ IDNO.3)处的基因型；

(b)鉴定患者为更少地易感于形成与通过血管发生抑制剂的疗法有关的高血压，所述血管发生抑制剂包含贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，其中多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处CT或TT基因型的存在指示所述患者比在多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处具有CC基因型的患者更少地易感于形成高血压；并

(c)对在多态性rs2305949(SEQ ID NO.3)处具有CT或TT基因型、依照(b)鉴定为更少地易感于形成高血压的患者施用所述血管发生抑制剂。

11.权利要求10的方法，其中所述疗法进一步包含化疗剂或化疗方案。

12.权利要求10至11中任一项的方法，其中所述血管发生抑制剂与选自下组的一种或多种药剂一起施用：紫杉烷、干扰素α、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、伊立替康、吉西他滨-厄洛替尼和基于铂的化疗剂。

13.权利要求10至12中任一项的方法，其中所述癌症是胰腺癌、肾细胞癌、结直肠癌、乳腺癌或肺癌。

14.权利要求10至13中任一项的方法，其中所述样品是血液样品。

15.权利要求10至14中任一项的方法，其中所述基因型通过MALDI-TOF质谱术测定。

16.一种治疗患者的方法，所述方法包括对所述患者施用包含血管发生抑制剂的疗法，所述血管发生抑制剂包含贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，其中已测定所述患者在多态性rs2305949(SEQID NO.3)处的基因型为CT或TT。

17.一种确定患者形成与包含血管发生抑制剂的疗法有关的高血压的易感性的方法，所述血管发生抑制剂包含贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，所述方法包括：

(a)在自患有癌症的患者衍生的样品中测定多态性rs4444903(SEQ IDNO.4)处的基因型，并

(b)基于所述基因型鉴定患者为更多地易感于或更少地易感于形成与通过血管发生抑制剂的疗法有关的高血压，所述血管发生抑制剂包含贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，其中多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处GA基因型的存在指示所述患者比在多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处具有GG或AA基因型的患者更多地易感于形成高血压，或者多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处GG或AA基因型的存在指示所述患者比在多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处具有GA基因型的患者更少地易感于形成高血压。

18.权利要求17的方法，其中所述疗法进一步包含化疗剂或化疗方案。

19.权利要求17至18中任一项的方法，其中所述血管发生抑制剂与选自下组的一种或多种药剂一起施用：紫杉烷、干扰素α、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、伊立替康、吉西他滨-厄洛替尼和基于铂的化疗剂。

20.权利要求17至19中任一项的方法，其中所述癌症是胰腺癌、肾细胞癌、结直肠癌、乳腺癌或肺癌。

21.权利要求17至20中任一项的方法，其中所述样品是血液样品。

22.权利要求17至21中任一项的方法，其中所述基因型通过MALDI-TOF质谱术测定。

23.权利要求17至22中任一项的方法，其进一步包括对所述患者施用所述疗法。

24.一种药物组合物，其包含如权利要求17至23中限定的血管发生抑制剂，用于治疗有此需要的患者，其中依照权利要求17至23中任一项的方法已确定所述患者为更少地易感于形成与通过所述血管发生抑制剂的疗法有关的高血压。

25.一种用于实施权利要求17至23中任一项的方法的试剂盒，其包含能够测定多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处基因型的寡核苷酸。

26.一种降低形成与包含血管发生抑制剂的疗法有关的高血压的风险的方法，其中所述血管发生抑制剂包含贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，所述方法包括：

(a)在自患有癌症的患者衍生的样品中测定多态性rs4444903(SEQ IDNO.4)处的基因型；

(b)鉴定患者为更少地易感于形成与通过血管发生抑制剂的疗法有关的高血压，所述血管发生抑制剂包含贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，其中多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处GG或AA基因型的存在指示所述患者比在多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处具有GA基因型的患者更少地易感于形成高血压；并

(c)对在多态性rs4444903(SEQ ID NO.4)处具有GG或AA基因型、依照

(b)鉴定为更少地易感于形成高血压的患者施用所述血管发生抑制剂。

27.权利要求26的方法，其中所述疗法进一步包含化疗剂或化疗方案。

28.权利要求26至27中任一项的方法，其中所述血管发生抑制剂与选自下组的一种或多种药剂一起施用：紫杉烷、干扰素α、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、伊立替康、吉西他滨-厄洛替尼和基于铂的化疗剂。

29.权利要求26至28中任一项的方法，其中所述癌症是胰腺癌、肾细胞癌、结直肠癌、乳腺癌或肺癌。

30.权利要求26至29中任一项的方法，其中所述样品是血液样品。

31.权利要求26至30中任一项的方法，其中所述基因型通过MALDI-TOF质谱术测定。

32.一种治疗患者的方法，所述方法包括对所述患者施用包含血管发生抑制剂的疗法，所述血管发生抑制剂包含贝伐单抗或与贝伐单抗结合VEGF上基本相同表位的抗体，其中已测定所述患者在多态性rs4444903(SEQID NO.4)处的基因型为GG或AA。