MX2014006186A - Capacidad de respuesta a los inhibidores de la angiogenesis. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un método para determinar si un paciente está tratado más adecuadamente por una terapia con un inhibidor de la angiogénesis, como bevacizumab, mediante la determinación del genotipo del gen VEGFR-1. La invención está relacionada además con una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de la angiogénesis, como bevacizumab, para el tratamiento de un paciente que padece cáncer basado en el genotipo del gen VEGFR-1. La invención está relacionada además con un método para mejorar el efecto del tratamiento de la quimioterapia de un paciente que padece cáncer mediante la adición de un inhibidor de la angiogénesis, como bevacizumab, basado en el genotipo del gen VEGFR-1.

Description

CAPACIDAD DE RESPUESTA ? LOS INHIBIDORES DE LA ANGIOGÉNESIS Campo de la invención La presente invención está relacionada con los métodos para identificar qué pacientes se beneficiarán mejor del tratamiento con agentes anticancerígenos y monitorizar a los pacientes por su sensibilidad y capacidad de respuesta al tratamiento con agentes anticancerígenos.

Antecedentes de la invención La angiogénesis contribuye a enfermedades benignas y malignas como el desarrollo del cáncer y, especialmente en el cáncer, es necesaria para el crecimiento del tumor primario, invasividad y metástasis. Para poder crecer, un tumor debe sufrir un cambio angiogénico. El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es necesario para inducir este cambio angiogénico. El VEGF y los genes de la ruta VEGF se consideran mediadores importantes en la progresión del cáncer. La familia génica de VEGF incluye al gen VEGF, también denominado VEGFA, homólogo al VEGF que incluye, factor de crecimiento de la placenta (PlGF) , VEGFB, VEGFC, VEGFD, los receptores de VEGF, que incluye VEGFR-1 y VEGFR-2 (también denominados FLT1 y FLKl/KDR, respectivamente) , los inductores de VEGF, que incluye factores inducibles por hipoxia HIFl , - - HIF2 OÍ, y los sensores de oxígeno PHD1, PHD2 y PHD3.

La importancia de esta ruta en el crecimiento celular del cáncer y la metástasis ha conducido al desarrollo de agentes antiangiogénicos para su uso en la terapia contra el cáncer. Estas terapias incluyen, entre otras, bevacizumab, pegaptanib, sunitinib, sorafenib y vatalanib. A pesar de la prolongada supervivencia significativamente obtenida con los inhibidores de la angiogénesis, como bevacizumab, los pacientes todavía sucumben al cáncer. Además, no todos los pacientes responden a la terapia inhibidora de la angiogénesis. El mecanismo subyacente a la incapacidad de respuesta sigue siendo desconocido. Aún más, la terapia inhibidora de la angiogénesis está asociada con efectos secundarios, como perforación gastrointestinal, trombosis, sangrados, hipertensión y proteinuria.

En consecuencia, existe una necesidad de métodos para determinar qué pacientes responden particularmente bien a la terapia inhibidora de la angiogénesis .

Se ha descrito en WO 2011/015348 que uno o más variantes de alelos del gen VEGFR-l están asociados con una mejora de la respuesta al tratamiento antiangiogénico . Entre los SNP descritos en WO 2011/015348 están rs9554316, rs9582036, rs9513070 y rs9554320, mientras que otros SNP se han identificado mediante desequilibrio de ligamiento y por lo tanto unido a estos cuatro SNP.

Compendio de la invención Se ha encontrado que uno de los SNP identificados mediante desequilibrio de ligamiento y descrito en WO 2011/015348 es particularmente útil como biomarcador predictivo para el resultado del tratamiento de un inhibidor de la angiogénesis, como bevacizumab.

La presente invención por lo tanto está relacionada con un método para determinar si un paciente está más o menos adecuadamente tratado mediante una terapia con un inhibidor de la angiogénesis, como bevacizumab, mediante la determinación del genotipo en el T/C SNP sinónimo localizado en el exón 28 de VEGFR-1 que corresponde respectivamente con el codón TAT y el codón TAC de la tirosina en la posición 1213. La presente invención también está relacionada con una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de la angiogénesis, como bevacizumab, para el tratamiento de un paciente que padece cáncer y que posee el genotipo asociado con un efecto del tratamiento mejorado en el T/C SNP sinónimo localizado en el exón 28 de VEGFR-1 que corresponde respectivamente al codón TAT y al codón TAC de la tirosina en la posición 1213. La presente invención está relacionada además con un método para mejorar el efecto del tratamiento de la quimioterapia de un paciente que padece cáncer mediante la adición de un inhibidor de la angiogénesis , como bevacizumab, basado en el genotipo del SNP T/C sinónimo localizado en el exón 28 de VEGFR-1 que corresponde respectivamente al codón TAT y al codón TAC de la tirosina en la posición 1213.

Descripción detallada de las realizaciones 1. Definiciones El término "administración" significa la administración de una composición farmacéutica, como un inhibidor de la angiogénesis, al paciente. Por ejemplo, puede administrarse bevacizumab (Avastin") 2,5 mg/kg de peso corporal hasta 15 mg/kg de peso corporal cada semana, cada 2 semanas o cada 3 semanas, dependiendo del tipo de cáncer a tratar. Las dosis particulares incluye 5 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg y 15 mg/kg. Las dosis aún más particulares son 5 mg/kg cada 2 semanas, 10 mg/kg cada 2 semanas y 15 mg/kg cada 3 semanas.

El término "inhibidor de la angiogénesis" en el contexto de la presente invención se refiere a todos los agentes que alteran la angiogénesis (por ejemplo, el proceso de formación de vasos sanguíneos) e incluye agentes que inhiben la angiogénesis, que incluye, pero no se limita a, angiogénesis tumoral . En este contexto, la inhibición puede referirse al bloqueo de la formación de vasos sanguíneos y detener o ralentizar el crecimiento de vasos sanguíneos. Ejemplos de inhibidores de la angiogénesis incluyen bevacizumab (también conocido como Avastin®) , pegaptanib, sunitinib, sorafenib y vatalanib. Bevacizumab es un anticuerpo monoclonal IgGl recombinante humanizado que se une e inhibe la actividad biológica de VEGFA humano en un sistema de ensayos in vitro e in vivo. El término "bevacizumab" abarca todos los anticuerpos anti-VEGF correspondientes que cumplen los requisitos necesarios para obtener una autorización de comercialización como un producto idéntico o biosimilar en un país o territorio seleccionado entre el grupo de países que consiste en EE.UU., Europa y Japón. En el contexto de la presente invención, un inhibidor de la angiogénesis incluye un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo sobre VEGF que bevacizumab, más específicamente un anticuerpo que se une al mismo epítopo sobre VEGF que bevacizumab. Un anticuerpo que se une "esencialmente al mismo epítopo" que un anticuerpo de referencia, cuando los dos anticuerpos reconocen epítopos idénticos o estéricamente solapados . Los métodos más ampliamente utilizados y rápidos para determinar si dos epltopos se unen a epítopos idénticos o estéricamente solapados son los ensayos de competición, que pueden configurarse en todo número de diferentes formatos, utilizando antígeno marcado o anticuerpo marcado. Habitualmente, el antígeno está inmovilizado en una placa de 96 pocilios, y se mide la capacidad de los anticuerpos no marcados de bloquear la unión de anticuerpos marcados utilizando mareajes enzimáticos o radioactivos.

El término "cáncer" se refiere a la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza normalmente por una proliferación celular desregulada. Ejemplos de cáncer incluye pero no se limita a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de dichos cánceres incluye cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón (que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, y carcinoma escamoso de pulmón) , cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago (que incluye cáncer gastrointestinal) , cáncer pancreático (que incluye cáncer pancreático metastásico) , glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama (que incluye cáncer de mama localmente avanzado, recurrente o cáncer de mama HER-2 metastásico negativo) , cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endoraetrial o uterino, carcinoma de glándulas salivares, cáncer de riñon o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulval, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de linfocitos B (que incluye linfoma no Hodgkin folicular de grado bajo (NHL) ; NHL linfocítico pequeño (SL) ,-NHL folicular de grado intermedio; NHL difuso de grado intermedio; NHL immunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células pequeñas no escindidas grado alto; NHL de gran masa celular; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con SIDA; y Macroglobulinemia de Waldenstrom) ; leucemia linfocítica crónica (CLL) ; leucemia linfoblástica aguda (ALL) ; leucemia de células capilares; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-transplante (PTLD) , así como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (como el asociado a los tumores cerebrales) , y síndrome de Meigs.

Ejemplos de "anormalidades angiogénicas fisiológicas o patológicas" incluye, pero no se limita a, enfermedad ocular como degeneración macular relacionada con la edad (DME) , glioma de alto grado, glioblastoma, . Rendu-Osler, enferemedades de von-Hippel-Lindau, hemangiomas, psoriasis, sarcoma de Kaposi, neovascularización ocular, artritis reumatoide, endometriosis , aterosclerosis , isquemia miocárdica, isquemia periférica, isquemia cerebral y curación de heridas .

El término "agente quimioterapéutico" o "régimen de quimioterapia" incluye cualquier agente activo que pueda proporcionar un efecto terapéutico anticancerígeno y puede ser un agente químico o un agente biológico, en particular, que son capaces de interferir con el cáncer o células tumorales . Los agentes activos particulares son aquellos que actúan como agentes antineoplásicos (quimiotóxicos o quimioestáticos) que inhiben o previenen el desarrollo, maduración o proliferación de células malignas. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes como mostazas de nitrógeno (por ejemplo, mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalán y clorambucil) , nitrosoureas (por ejemplo, carmustina (BCNU) , lomustina (CCNU) , y semustina (metil-CCNU) ) , etileniminas/ metilmelaminas (por ejemplo, trietilenmelamina (TEM) , trietilen, tiofosforamida (tiotepa) , hexametilmelamina (HMM, altretamina) ) , sulfonatos de alquilo (por ejemplo, busulfán) , y triazinas (por ejemplo, dacarbazina (DTIC) ) ; antimetabolitos como análogos de ácido fólico (por ejemplo, metotrexato, trimetrexato) , análogos de pirimidina (por ejemplo, 5-fluorouracilo, capecitabina, fluorodesoxiuridina, gemcitabine, citosina arabinósido (AraC, citarabina) , 5-azacitidina, 2 , 2 ' -difluorodesoxicitidina) , y análogos de purina (por ejemplo, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, azatioprina, 2 ' -desoxicoformicina (pentostatina) , eritrohidroxinoniladenina (EHNA) , fludarabina fosfate, y 2-clorodesoxiadenosina (cladribina, 2-CdA) ) ,- fármacos antimitóticos desarrollados a partir de productos naturales (por ejemplo, paclitaxel, vinca alcaloides (por ejemplo, vinblastina (VLB) , vincristina, y vinorelbina) , docetaxel, estramustina, y estramustina fosfato) , epipodofilotoxinas (por ejemplo, etoposido, teniposido) , antibiotics (.e.g, actimomicina D, daunomicina (rubidomicina) , daunorubicon, doxorubicina, epirubicina, mitoxantrona, idarubicina, bleomicinas, plicamicina (mitramicina) , mitomicina C, actinomicina) , enzimas (por ejemplo, L-asparaginasa) , y modificadores de la respuesta biológica (por ejemplo, interferón-alfa, IL-2, G-CSF, GM-CSF) ; agentes diversos que incluyen complejos de coordinación de platino (por ejemplo, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino) , antracenodionas (por ejemplo, mitoxantrona) , urea sustituida (por ejemplo, hidroxiurea) , derivados de metilhidrazina (por ejemplo, N-metilhidrazina ( IH) , procarbazina) , supresores adrenocorticales (por ejemplo, mitotano (o,p'-DDD), aminoglutetimida) ; hormonas y antagonistas que incluye antagonistas de adrenocorticoesteroides (por ejemplo, prednisona y equivalentes, dexametasona, aminoglutetimida) , progestinas (por ejemplo, caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol) , estrógenos (por ejemplo, dietilestilbestrol , etinil estradiol y equivalentes de los mismos) ; antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifen) , yrógenos (por ejemplo, propionato de testosterona, fluoximesterona y equivalentes de los mismos) , antiandrógenos (por ejemplo, flutamida, análogos de la hormona liberadora de la gonadotropina, leuprolide) , antiandrógenos no esteroideos (por ejemplo, flutamida) , inhibidores del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, erlotinib, lapatinib, gefitinib) anticuerpos (por ejemplo, trastuzumab) , irinotecan y otros agentes como leucovorin. Para el tratamiento de cáncer pancreático metastásico, los agentes quimioterapéuticos para la administración con bevacizumab incluye gemcitabina y erlotinib y combinaciones de los mismos (véase también los ejemplos proporcionados aquí) . Para el tratamiento del cáncer de células renales, los agentes quimioterapéuticos para la administración con bevacizumab incluye interferón alfa (véase también los ejemplos proporcionados aquí) .

El término "alelo" se refiere a una variante de secuencia de nucleótido de un gen de interés.

El término "genotipo" se refiere a una descripción de los alelos de un gen contenido en un individuo o una muestra. En el contexto de esta invención, no se hace distinción entre el genotipo de un individuo y el genotipo de una muestra originada en un individuo. Aunque normalmente un genotipo está determinado a partir de muestras de células diploides, un genotipo puede determinarse a partir de una muestra de células haploides , como una célula de esperma.

Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" se utilizan de forma intercambiable y se refieren a una molécula compuesta de dos o más desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos , preferiblemente más de tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos factores, que a su vez dependen de su función última o uso del oligonucleótido. Un oligonucleótido puede derivarse sintéticamente o mediante clonaje. Las quimeras de desoxiribonucleótidos y ribonucleótidos pueden también estar en el alcance de la presente invención.

El término "polimorfismo" se refiere a la aparición de dos o más secuencias alternativas determinadas genéticamente de un gen en una población. Habitualmente, la primera forma alélica identificada está diseñada de forma arbitraria como la forma de referencia y otras formas alélicas se diseñan como variantes de alelos o alelos alternativos . La forma alélica que aparece más frecuentemente en una población seleccionada se refiere a veces como la forma de tipo salvaje El término un "polimorfismo de nucleótido único" o "SNP" es un sitio de un nucleótido que varía entre alelos. Polimorfismo de nucleótidos únicos puede ocurrir en cualquier región del gen. En algunos ejemplos el polimorfismo puede resultar en un cambio en la secuencia de proteina. El cambio en la secuencia de proteína puede afectar o no a la función de la proteína.

El término "paciente" se refiere a cualquier animal, más específicamente a un mamífero (que incluye animales no humanos como, por ejemplo, perros, gatos, caballos, conejos, animales de zoológicos, vacas, cerdos, ovejas, y primates no humanos) para el que se desea un tratamiento. Aún más específicamente, le paciente aquí es un humano. En el contexto de la presente invención, el paciente puede ser Caucasiano .

El término "sujeto" en este documento es cualquier sujeto humano, que incluye un paciente, elegible para el tratamiento que está sufriendo o ha sufrido uno o más signos, síntomas, u otros indicadores de un trastorno angiogénico. Se pretende incluir como sujeto cualquier sujeto implicado en ensayos de investigación clínica que no muestran ningún signo clínico de enfermedad, o sujetos involucrados en estudios epidemiológicos, o sujetos utilizados una vez como controles. El sujeto puede haber sido tratado previamente con un agente anticancerígeno, o no haber sido tratado. El sujeto puede no haber estado expuesto a agente (s) adicionales utilizados cuando el tratamiento en este documento se ha iniciado, por ejemplo, el sujeto no ha sido tratado previamente con, por ejemplo, un agente antineoplásico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor del crecimiento, un agente citotóxico en "línea basal" (por ejemplo, en el punto de ajuste del tiempo antes de la administración de una primera dosis de un anticancerígeno en el presente método de tratamiento, como el día de la selección del sujeto antes de comenzar el tratamiento) . Dichos sujetos "naive" se consideran en general como candidatos para el tratamiento con dichos agentes adicionales .

El término "un paciente que padece" se refiere a un paciente que muestra signos clínicos respecto a ciertas enfermedades malignas, como el cáncer, una enfermedad que implica angiogénesis fisiológica y patológica y/o enfermedades tumorosas .

Tal como se utiliza aquí, "terapia" o "tratamiento" se refiere a una intervención clínica en un intento de alterar el curso natural del individuo o célula a tratar, y puede realizarse ya sea por profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen prevenir la ocurrencia o recurrencia de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevenir la metástasis, disminuir la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad, y remisión o mejora del pronóstico.

El término "efecto del tratamiento" abarca los términos "supervivencia general" y "supervivencia libre de progresión".

El término "supervivencia general" se refiere al tiempo durante y tras el tratamiento que el paciente sobrevive. Tal como apreciará un experto en la materia, la supervivencia general de un paciente mejora o aumenta, si el paciente pertenece a un subgrupo de pacientes que posee un tiempo de supervivencia media mayor estadísticamente significativa si se compara con otro subgrupo de pacientes.

El término "supervivencia libre de progresión" se refiere al tiempo durante y tras el tratamiento durante el cual, de acuerdo con la valoración del medico o investigador, la enfermedad del paciente no empeora, por ejemplo, no progresa. Tal como apreciará un experto en la materia, la supervivencia libre de progresión de un paciente mejora o aumenta si el paciente pertenece a un subgrupo de pacientes que posee un tiempo más extenso durante el cual la enfermedad no progresa si se compara con la media de tiempo de supervivencia medio libre de progresión de un grupo control de pacientes situados de forma similar.

El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación estéril que está en dicha forma para permitir que la actividad biológica del medicamento sea efectiva, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al cual se le va a administrar la formulación. 2. Realizaciones detalladas En la presente invención, se identificó el rs7993418 SNP en el gen VEGFR-1 como marcadores o biomarcadores predictivos para la supervivencia general (SG) y/o supervivencia libre de progresión (SLP) al tratamiento con un inhibidor de la angiogénesis . Los términos "marcador" y "biomarcador predictivo" pueden utilizarse de forma intercambiable y se refieren a variantes de alelo específicas de genes. La variación o marcador puede también referirse como un polimorfismo de nucleótido único (SNP) . La información de la secuencia del SNP así como los aminoácidos y ácidos nucleicos de VEGFR-1 están disponibles en el sitio web del NCBI utilizando los correspondientes números de referencia/acceso, por ejemplo, rs7993418, NP_002010 y NM_002019. La información de la secuencia de rs7993418 también se muestra en la Tabla 1. En el contexto de la presente invención, el término "VEGFR-1" también abarca las variantes y/o isoformas de los mismos.

Tabla 1 De acuerdo con los métodos de la presente invención, los SNP de VEGFR-1 se analizaron utilizando las muestras derivadas de los dos ensayos de fase III con bevacizumab, es decir, AVITA (cáncer pancreático, véase, Van Cutsem, J. Clin.

Oncol. 2009 27:2231-2237) y AVOREN (cáncer renal, véase, Escudier et al., Lancet 2007 370:2103).

Tal como se muestra en los ejemplos, el rs7993418 SNP en VEGFR-1 se identificó como la variante funcional subyacente a la asociación entre el locus de VEGFR-1 representado por cuatro marcadores SNP, es decir, rs9554316, rs9582036, rs9513070 y rs9554320, y la SLP y la SG en los pacientes tratados con bevacizumab de AVITA. Además, rs7993418 se correlaciona con la SLP en pacientes tratados con bevacizumab en AVOREN (per-alelo HR=1,8, P=0,033). No se observó efecto en los sujetos tratados con placebo (per-alelo HR=0,8, P=0,49), lo que sugiere que rs7993418 puede servir como un marcador predictivo para el resultado favorable con el tratamiento de bevacizumab.

En consecuencia, la presente invención proporciona un método in vitro para determinar si un paciente que padece cáncer está tratado de forma adecuada mediante una terapia con un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo sobre VEGF como bevacizumab, dicho método comprende: (a) determinar en una muestra derivada de un paciente que padece cáncer el genotipo del SNP T/C sinónimo localizado en el exón 28 de VEGFR-1 que corresponde respectivamente al codón AT y al codón TAC de la tirosina en la posición 1213, y (b) identificar dicho paciente tratado más o menos adecuadamente mediante una terapia con un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo sobre VEGF que bevacizumab basado en dicho genotipo, en el que la presencia de dicho alelo T en dicho SNP indica un aumento de la probabilidad de que el paciente esté tratado más adecuadamente, o la presencia de dicho alelo C en dicho SNP indica un aumento de la probabilidad de que el paciente esté tratado menos adecuadamente. En una realización, el método comprende además tratar al paciente mediante la terapia con un inhibidor de la angiogénesis .

Más específicamente, la presente invención proporciona un método in vitro para determinar si un paciente está adecuadamente tratado por una terapia con un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo sobre VEGF que bevacizumab, dicho método comprende: (a) determinar en una muestra derivada de un paciente que padece cáncer el genotipo del SNP T/C sinónimo localizado en el exón 28 de VEGFR-1 que corresponde respectivamente al codón AT y al codón TAC de la tirosina en la posición 1213, y (b) identificar dicho paciente tratado más o menos adecuadamente por una terapia con un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo sobre VEGF que bevacizumab basado en dicho genotipo, en el que la presencia del genotipo TT o TC en dicho SNP indica un aumento de la probabilidad de que el paciente esté tratado más adecuadamente que un paciente que posee el genotipo CC en dicho SNP, o la presencia de genotipo CC en dicho SNP indica un aumento de la probabilidad de que el paciente esté tratado menos adecuadamente que un paciente que posee el genotipo TT o TC en dicho SNP, o (b' ) identificar un paciente tratado más o menos adecuadamente por una terapia con un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo sobre VEGF que bevacizumab basado en dicho genotipo, en el que la presencia de genotipo TT en dicho SNP indica un aumento de la probabilidad de que el paciente esté tratado más adecuadamente que un que posee el genotipo TC o CC en dicho SNP, o la presencia del genotipo TC o CC en dicho SNP indica un aumento de la probabilidad de que el paciente esté tratado menos adecuadamente que un paciente que posee el genotipo TT en dicho SNP. En una realización, el método comprende además tratar al paciente mediante la terapia con un inhibidor de la angiogénesis.

La presente invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epitopo sobre VEGF como bevacizumab para el tratamiento de un paciente que padece cáncer, en el que el paciente se ha identificado como más adecuadamente tratado con el inhibidor de la angiogénesis mediante un método in vitro que comprende : (a) determinar en una muestra derivada de un paciente que padece cáncer el genotipo del SNP T/C sinónimo localizado en el exón 28 de VEGFR-1 que corresponde respectivamente al codón TAT y al codón TAC de la tirosina en la posición 1213, y (b) identificar dicho paciente tratado más o menos adecuadamente por una terapia con un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epitopo sobre VEGF que bevacizumab basado en dicho genotipo, en el que la presencia de dicho alelo T en dicho SNP indica un aumento de la probabilidad de que el paciente esté tratado más adecuadamente, o la presencia de dicho alelo C en dicho SNP indica un aumento de la probabilidad de que el paciente esté tratado menos adecuadamente .

Más específicamente la presente invención proporciona a composición farmacéutica que comprende un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo sobre VEGF que bevacizumab, para el tratamiento de un paciente en necesidad de los mismos, en el que el paciente se ha identificado como más adecuadamente tratado con el inhibidor de la angiogénesis mediante un método in vitro que comprende: (a) determinar en una muestra derivada de un paciente que padece cáncer el genotipo del SNP T/C sinónimo localizado en el exón 28 de VEGFR-1 que corresponde respectivamente al codón TAT y al codón TAC de la tirosina en la posición 1213, y (b) identificar dicho paciente tratado más o menos adecuadamente por una terapia con un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo sobre VEGF que bevacizumab basado en dicho genotipo, en el que la presencia del genotipo TT o TC en dicho SNP indica un aumento de la probabilidad de que el paciente esté tratado más adecuadamente que un paciente que posee el genotipo CC en dicho SNP, o la presencia de genotipo CC en dicho SNP indica un aumento de la probabilidad de que el paciente esté tratado menos adecuadamente que un paciente que posee el genotipo TT o TC en dicho SNP, o (b' ) identificar un paciente tratado más o menos adecuadamente por una terapia con un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo sobre VEGF que bevacizumab basado en dicho genotipo, en el que la presencia de genotipo TT en dicho SNP indica un aumento de la probabilidad de que el paciente esté tratado más adecuadamente que un que posee el genotipo TC o CC en dicho SNP, o la presencia del genotipo TC o CC en dicho SNP indica un aumento de la probabilidad de que el paciente esté tratado menos adecuadamente que un paciente que posee el genotipo TT en dicho SNP.

La presente invención proporciona además un método para mejorar el efecto del tratamiento de un agente quimioterapéutico o régimen de quimioterapia de un paciente que padece cáncer mediante la adición de un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epitopo sobre VEGF que bevacizumab, dicho método comprende : (a) determinar en una muestra derivada de un paciente que padece cáncer el genotipo del SNP T/C sinónimo localizado en el exón 28 de VEGFR-1 que corresponde respectivamente al codón TAT y al codón TAC de la tirosina en la posición 1213; (b) identificar dicho paciente como más adecuadamente tratado mediante la adición de un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo sobre VEGF que bevacizumab basado en dicho genotipo, en el que la presencia de dicho alelo T en dicho SNP indica un aumento de la probabilidad de que el paciente esté tratado más adecuadamente; y (c) administrar dicho inhibidor de la angiogénesis en combinación con un agente quimioterapéutico o régimen de quimioterapia al paciente identificado como más adecuadamente tratado de acuerdo con (b) .

Más específicamente, la presente invención proporciona un método para mejorar el efecto del tratamiento de un agente quimioterapéutico o régimen de quimioterapia de un paciente que padece cáncer mediante la adición de un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo sobre VEGF que bevacizumab, dicho método comprende : (a) determinar en una muestra derivada de un paciente que padece cáncer el genotipo del SNP T/C sinónimo localizado en el exón 28 de VEGFR-1 que corresponde respectivamente al codón TAT y al codón TAC de la tirosina en la posición 1213; (b) identificar dicho paciente tratado más o menos adecuadamente por una terapia con un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo sobre VEGF que bevacizumab basado en dicho genotipo, en el que la presencia del genotipo TT o TC en dicho SNP indica un aumento de la probabilidad de que el paciente esté tratado más adecuadamente que un paciente que posee el genotipo CC en dicho SNP, o la presencia de genotipo CC en dicho SNP indica un aumento de la probabilidad de que el paciente esté tratado menos adecuadamente que un paciente que posee el genotipo TT o TC en dicho SNP, o (b' ) identificar un paciente tratado más o menos adecuadamente por una terapia con un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo sobre VEGF que bevacizumab basado en dicho genotipo, en el que la presencia de genotipo TT en dicho SNP indica un aumento de la probabilidad de que el paciente esté tratado más adecuadamente que un que posee el genotipo TC o CC en dicho SNP, o la presencia del genotipo TC o CC en dicho SNP indica un aumento de la probabilidad de que el paciente esté tratado menos adecuadamente que un paciente que posee el genotipo TT en dicho SNP; y (c) administrar dicho inhibidor de la angiogénesis en combinación con un agente quimioterapéutico o régimen de quimioterapia a un paciente identificado como más adecuadamente tratado de acuerdo con (b) o (b' ) .

En una realización, si un paciente está adecuadamente tratado mediante una terapia con un inhibidor de la angiogénesis se determina en términos de si SLP o la SG está mejorado, más específicamente si SLP está mejorado.

En una realización, el cáncer está seleccionado entre el grupo que consiste de cáncer colorectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer de ovarios, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer gástrico y cáncer de pulmón, más específicamente el grupo consiste en cáncer renal y cáncer de páncreas.

En una realización, un paciente puede ser un paciente diagnosticado con anormalidades angiogénicas fisiológicas o patológicas .

En una realización, el inhibidor de la angiogénesis se administra como un cotratamiento con un agente quimioterapéutico o régimen de quimioterapia. En otra realización, el inhibidor de la angiogénesis se administra con uno o más agentes seleccionados entre el grupo que consiste en taxanos como docetaxel y paclitaxel, interferón alfa, 5-fluorouracilo, leucovorin, gemcitabina, erlotinib y agentes quimioterapéuticos basados en el platino como carboplatino, cisplatino y oxaliplatino . Más específicamente, el inhibidor de la angiogénesis se administra como un cotratamiento con un agente quimioterapéutico o régimen de quimioterapia seleccionado entre el grupo que consiste en gemcitabina-erlotinib e interferón alfa. Además, el inhibidor de la angiogénesis puede administrarse como un cotratamiento con radioterapia.

En el contexto de la presente invención, la muestra es una muestra biológica y puede ser una muestra de sangre y/o muestra de tejido. En una realización, la muestra es una muestra de sangre, más específicamente una muestra de sangre periférica. En el contexto de la presente invención, la muestra es una muestra DNA. La muestra de DNA puede ser de DNA de línea germinal o DNA somático, más específicamente DNA de línea germinal.

En una realización, el genotipo se determina mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Además de la descripción detallada de la detección de SNP más abajo, la siguiente referencia proporciona una guía para la genotipificación de SNP basada en espectrometría de masas MALDI-TOF, por ejemplo, Storm et al., Methods Mol. Biol. 212:241-62, 2003. 3. Detección de polimorfismos de ácido nucleico Las técnicas de detección para analizar ácidos nucleicos para la presencia de un SNP implican procedimientos bien conocidos en el campo de la genética molecular. Muchos métodos, pero no todos, implican la amplificación de ácidos nucleicos. Se proporciona en el campo amplias guías para realizar la amplificación. Ejemplos de referencias incluyen manuales como PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification (ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N.Y. , 1992) ; PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, 1994-1999, que incluye actualizaciones en suplementos desde abril de 2004; Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3a Ed, 2001) . Métodos generales para la detección de polimorfismos de nucleótidos únicos están descritos en Single Nucleotide Polymorphisms : Methods and Protocols, Pui-Yan Kwok, ed. , 2003, Humana Press.

Aunque los métodos habitualmente utilizan los pasos de PCR, pueden utilizarse también otros protocolos de amplificación. Los métodos de amplificación adecuados incluyen reacción en cadena de la ligasa (véase, por ejemplo, u & Wallace, Genomics 4:560-569, 1988); ensayo de desplazamiento de cadena (véase, por ejemplo, Walker et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:392-396, 1992; Pat . EE.UU. N° 5.455.166); y varios sistemas de amplificación basados en la transcripción, que incluye los métodos descritos en las Pat. EE.UU. N° 5.437.990; 5.409.818; y 5.399.491; el sistema de la amplificación de la transcripción (TAS) (Kwoh et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:1173-1177, 1989); y replicación de secuencia autosostenida (3SR) (Guatelli et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:1874-1878, 1990; WO 92/08800). Alternativamente, pueden utilizarse los métodos que amplifican la sonda a niveles detectables, como amplificación mediante replicasa <2ß (Kramer & Lizardi, Nature 339:401-402, 1989; Lomeli et al., Clin. Chem. 35:1826-1831, 1989). Se proporciona una revisión de los métodos de amplificación conocidos, por ejemplo, en Abramson y Myers en Current Opinión in Biotechnology 4:41-47, 1993.

La detección del genotipo, haplotipo, SNP, microsatélites u otros polimorfismos de un individuo puede realizarse utilizando cebadores de oligonucleótido y/o sondas Los oligonucleótidos pueden prepararse mediante cualquier método adecuado, habitualmente síntesis química. Los oligonucleótidos pueden sintetizarse utilizando reactivos e instrumentos comercialmente disponibles. Alternativamente, pueden comprarse a través de fuentes comerciales. Los métodos de síntesis de oligonucleótidos son bien conocidos en la materia (véase, por ejemplo, Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979; Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981; y el método de soporte sólido de la Pat. EE.UU. N° 4.458.066). Además, pueden utilizarse modificaciones de los métodos de síntesis anteriormente descritos para modificar de forma deseada sobre el comportamiento de la enzima con respecto a los oligonucleótidos sintetizados. Por ejemplo, la incorporación de uniones fosfodiéster modificadas (por ejemplo, fosforotioato, metilfosfonatos , fosfoamidato, o boranofosfato) o pueden utilizarse uniones diferentes a las de los derivados de ácido fosfórico en un oligonucle ó tido para prevenir la escisión en el lugar seleccionado. Además, la utilización de azúcares 2'-amino modificados tiende a favorecer el desplazamiento sobre la digestión del oligonucle ótido cuando híbrida con un ácido nucleico que es también el molde para la síntesis de una nueva cadena de ácido nucleico.

El genotipo de un individuo puede determinarse utilizando muchos métodos de detección que son bien conocidos en la materia. La mayoría de ensayos abarcan uno de varios protocolos generales: hibridación utilizando oligonucleótidos específicos de alelo, extensión de cebadores, ligación específica de alelo, secuenciación, o técnicas de separación electroforé tica, por ejemplo, polimorfismo conformacional de cadena sencilla (SSCP) y análisis de heterodúplex. Ejemplos de ensayos incluye ensayos de 5'-nucleasa, incorporación de colorante terminador dirigido por molde, ensayos de baliza molecular de oligonucleótido específico de alelo, ensayos de extensión de base única, y SNP que puntúa mediante secuencias de pirofosfato a tiempo real. El análisis de secuencias amplificadas puede realizarse utilizando varias tecnologías como microchips, ensayos de polarización por fluorescencia, y espectrometría de masas MALDI-TOF (tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz) . Dos métodos que también pueden utilizarse son los ensayos basados en la escisión invasiva con nucleasas Flap y metodologías que utilizan sondas candado.

La determinación de la presencia o ausencia de un alelo particular se realiza generalmente mediante el análisis de una muestra de ácido nucleico que se obtiene del individuo a analizar. A menudo, la muestra de ácido nucleico comprende DNA genómico. El DNA genómico se obtiene habitualmente a partir de muestras de sangre, pero puede también obtenerse de otras células o tejidos.

Es también posible analizar las muestras de RNA para la presencia de alelos polimórficos . Por ejemplo, el mRNA puede utilizarse para determinar el genotipo de un individuo en uno o más sitios polimórficos . En este caso, la muestra de ácido nucleico se obtiene de las células en las que se expresa el ácido nucleico diana, por ejemplo, adipocitos. Dicho análisis puede realizarse primero mediante la transcripción reversa del RNA diana utilizando, por ejemplo, una transcriptasa reversa vírica, y después amplificar el cDNA resultante; o utilizar una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa combinada a alta temperatura (RT-PCR) , tal como se describe en las Pat . EE.UU. N° 5.310.652; 5.322.770; 5.561.058; 5.641.864; y 5.693.517.

Las metodologías utilizadas frecuentemente para el análisis de muestras de ácido nucleico para detectar SNP se describen brevemente. No obstante, cualquier método conocido en la materia puede utilizarse en la invención para detectar la presencia de sustituciones únicas de nucleótido. a. Hibridación específica de alelo Esta técnica, también denominada habitualmente como hibridación de oligonucleótido específica de alelo (ASO) (por ejemplo, Stoneking et al., Am. J. Hum. Genet . 48:70-382, 1991; Saiki et al., Nature 324, 163-166, 1986; PE 235.726; y WO 89/11548) , se basa en la distinción entre dos moléculas de DNA que se diferencia en una base por la hibridación de una sonda de oligonucleótidos que es específica de una de las variantes para un producto amplificado obtenido de amplificar la muestra de ácido nucleico. Este método habitualmente utiliza oligonucleótidos cortos, por ejemplo, 15-20 bases de longitud. Las sondas se diseñan para hibridar de forma diferenciada a una variante frente a otra. Los principios y guía para diseñar dicha sonda están disponibles en la materia, por ejemplo, en las referencias citadas aquí. Las condiciones de hibridación serán suficientemente astringentes como para que haya una diferencia significativa en la intensidad de hibridación entre alelos, y para producir esencialmente una respuesta binaria, en la que una sonda híbrida con uno solo de los alelos . Algunas sondas están diseñadas para hibridar con un segmento de DNA diana de forma que el sitio polimórfico se alinea con una posición central (por ejemplo, en un oligonucleótido de 15 bases en la posición 7; en un oligonucleótido de 16 bases en la posición 8 o 9) de la sonda, pero este diseño no es necesario.

La cantidad y/o presencia de un alelo se determina midiendo la cantidad de oligonucleótido específico de alelo que híbrida con la muestra. Habitualmente , el oligonucleótido está marcado con un mareaje como un mareaje fluorescente. Por ejemplo, se aplica un oligonucleótido específico de alelo a oligonucleótidos inmovilizados que representan secuencias de SNP. Tras una hibridación astringente y condiciones de lavado, se midió la intensidad de fluorescencia para cada oligonucleótido de SNP.

En una realización, el nucleótido presente en el sitio polimórfico se identificó mediante hibridación bajo condiciones de hibridación específicas de secuencia con una sonda de oligonucleótido o cebador exactamente complementario a uno de los alelos polimórficos en una región que abarca el sitio polimórfico. La secuencia que híbrida con la sonda o cebador y las condiciones de hibridación específicas de secuencia se seleccionan de forma que un único desemparejamiento en el sitio polimórfico desestabiliza al dúplex de hibridación suficientemente como para que no se forme de forma efectiva. Así, bajo condiciones de hibridación específicas de secuencia, los dúplex estables se formarán solo entre la sonda o cebador y la secuencia alélica exactatnente complementaria. Así, los oligonucleótidos de alrededor de 10 a alrededor de 35 nucleótidos de longitud, habitualmente entre alrededor de 15 a alrededor de 35 nucleótidos de longitud, que son exactamente complementarios a una secuencia de alelos en una región que abarca el sitio polimórfico están dentro del alcance de la invención.

En una realización alternativa, el nucleótido presente en el sitio polimórfico se identifica mediante hibridación bajo condiciones de hibridación suficientemente astringentes con un oligonucleótido sustancialmente complementario a uno de los alelos de SNP en una región que abarca el sitio polimórfico, y exactamente complementario al alelo en el sitio polimórfico. Debido a los desemparejamientos que aparecen en los sitios no polimórficos son desemparejamientos con ambas secuencias de alelos, la diferencia en el número de desemparejamientos en un dúplex formado con la secuencia de alelo diana y en un dúplex formado con la correspondiente secuencia de alelo no diana es la misma que la que se usa en un oligonucleótido exactamente complementario a la secuencia de alelo diana. En esta realización, las condiciones de hibridación se relajan lo suficiente para permitir la formación de dobletes estables con la secuencia diana, mientras se mantiene una astringencia suficiente para excluir la formación de dobletes estables con secuencias no diana. Bajo dichas condiciones de hibridación suficientemente astringentes, los dobletes estables se formarán solo entre la sonda o cebador y el alelo diana. Así, los oligonucleótidos de entre alrededor de 10 a alrededor de 35 nucleótidos de longitud, habitualmente entre alrededor de 15 a alrededor de 35 nucleótidos de longitud, que son sustancialmente complementarios a una secuencia de alelo en una región que abarca el sitio polimórfico, y son exactamente complementarios a la secuencia de alelo en el sitio polimórfico, están dentro del alcance de la invención.

La utilización de sustancialmente, más que exactamente, oligonucleótidos complementarios puede ser deseable en formatos de ensayo en los que la optimización de las condiciones de hibridación está limitada. Por ejemplo, en un formato de ensayo típico de oligonucleótido inmovilizado multi-diana, las sondas o cebadores para cada diana está inmovilizado en un soporte sólido único. Las hibridaciones se llevan a cabo de forma simultánea al poner en contacto el soporte sólido con una solución que contiene DNA diana. Como todas las hibridaciones se llevan a cabo bajo las mismas condiciones, las condiciones de hibridación no pueden optimizarse de forma separada para cada sonda o cebador. La incorporación de desemparejamientos en una sonda o cebador puede utilizarse para ajustar la estabilidad del dúplex cuando el formato de ensayo excluye el ajuste de las condiciones de hibridación. Se conoce bien el efecto en la estabilidad al introducir un desemparejamiento particular en un dúplex dúplex, y la estabilidad del dúplex puede estimarse y determinarse empíricamente de forma rutinaria, tal como se ha descrito anteriormente. Las condiciones de hibridación adecuadas, que dependen del tamaño exacto y la secuencia de la sonda o cebador, puede seleccionarse empíricamente utilizando las guías proporcionadas en este documento y son bien conocidas en la materia. La utilización de sondas o cebadores de oligonucleótido para detectar diferencias de una pareja de bases en la secuencia se describe en, por ejemplo, Conner et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 80:278-282, y Pat. EE.UU N° 5.468.613 y 5.604.099, cada una se incorpora en este documento mediante referencia.

El cambio proporcional en la estabilidad entre un doblete hibridación perfectamente emparejado y una base única desemparejada dependa de la longitud de los oligonucleótidos hibridados . Los dobletes formados con secuencias de sonda más cortas están proporcionalmente más desestabilizadas por la presencia de un desemparejamiento. Los oligonucleótidos entre alrededor de 15 y alrededor de 35 nucleótidos de longitud se utilizan a menudo para la detección específica de secuencia. Además, debido a que al extremo de un oligonucleótido hibridado sufre una disociación y rehibridación aleatoria de forma continua debido a la energía térmica, un desemparejamiento en el extremo desestabiliza el dúplex de hibridación menos que un desemparejamiento que ocurra de forma interna. Para discriminar un cambio único de parejas de bases en la secuencia diana, la secuencia de sonda se selecciona de forma que el sitio polimórfico hibride con la secuencia diana en la región interior de la sonda.

Los criterios anteriores para seleccionar una secuencia de sobra que hibride con un alelo específico se aplica a la región que híbrida de la sonda, por ejemplo, la parte de la sonda que participa en la hibridación con la secuencia diana. Una sonda puede unirse a una secuencia de ácido nucleico adicional, como una cola de poli-T utilizada para inmovilizar la sonda, sin alterar de forma significativa las características de hibridación de la sonda. Un experto en la materia reconocerá que para utilizar en los presentes métodos, una sonda unida a una secuencia de ácido nucleico adicional que no es complementaria a la secuencia diana y, por lo tanto, no está implicada en la hibridación, es esencialmente equivalente a la sonda no unida.

Los formatos de ensayo adecuados para detectar los híbridos formados entre las sondas y las secuencias de ácido nucleico diana en una muestra son conocidas en la materia e incluye los formatos de ensayo de diana inmovilizada (dot-blot) y sonda inmovilizada (dot-blot reverso o line-blot) . Los formatos de ensayo dot blot y dot blot reverso se describen en Pat . EE.UU N° 5.310.893; 5.451.512; 5.468.613; y 5.604.099; cada una incorporada en este documento por referencia.

En un formato dot-blot, el DNA diana amplificado está inmovilizado en un soporte sólido, como una membrana de nilón El complejo membrana-diana se incuba con una sonda marcada bajo condiciones de hibridación adecuadas, la sonda no hibridada se elimina mediante hibridación bajo condiciones astringentes, y la membrana se monitoriza por la presencia de sonda unida.

En el formato de dot-blot reverso (o line-blot) , las sondas están inmovilizadas en un soporte sólido, como una membrana de nilón o una placa microtitulada. El DNA diana se marca, habitualmente durante la amplificación mediante la incorporación de cebadores marcados . Uno o ambos cebadores puede marcarse. El complejo de membrana-sonda se incuba con el DNA diana marcado amplificado bajo condiciones de hibridación adecuadas, el DNA diana no hibridado se elimina mediante lavados bajo condiciones astringentes adecuadas, y la membrana se monitoriza por la presencia de DNA diana unido Se describe en el ejemplo un ensayo de detección line-blot reverso .

Una sonda especifica de alelo que es especifica para una de las variantes de polimorfismo se utiliza a menudo junto con la sonda específica de alelo para la otra variante de polimorfismo. En algunas realizaciones, las sondas están inmovilizadas en un soporte sólido y la secuencia diana en un individuo se analiza utilizando ambas sondas de forma simultánea. Ejemplos de matrices de ácidos nucleicos se describen en WO 95/11995. Puede utilizarse la misma matriz o una matriz diferente para el análisis de polimorfismos caracterizados. WO 95/11995 también describe submatrices que están optimizadas para la detección de formas de variante de un polimorfismo precaracterizado . Dicha submatriz puede utilizarse en la detección de la presencia de los polimorfismos descritos en este documento, b. Cebadores específicos de alelo Los polimorfismos tambi é n se detectan con frecuencia utilizando métodos de amplificación o extensión de cebadores específieos de alelo. Estas reacciones habitualmente implican el uso de cebadores que están diseñados para localizar especí freamente un polimorfismo mediante un desemparejamiento en el extremo 3 ' de un cebador. La presencia de un desemparejamiento afecta la capacidad de una polimerasa de extender un cebador cuando la polimerasa carece de la actividad correctora de errores. Por ejemplo, para detectar una secuencia alélica utilizando un método de basado en la amplificación o extensión específica de alelo, se diseña un cebador complementario a un alelo de un polimorfismo de forma que el nucleótido 3' -terminal híbrida en la posición polimórfica. La presencia del alelo particular puede determinarse mediante la capacidad del cebador de iniciar la extensión. Si el extremo 3 'está desemparejado, se impide la extensión.

En algunas realizaciones, el cebador se utiliza junto con un segundo cebador en una reacción de amplificación. El segundo cebador híbrida en el sitio no relacionado pon la posición polimórfica. La amplificación continua a partir de dos cebadores que conducen a un producto detectable que indica que la forma alélica particular está presente. Los métodos basados en la amplificación o extensión específica de alelo se describen en, por ejemplo, WO 93/22456; Pat . EE.UU N° 5.137.806; 5.595.890; 5.639.611; y Pat . EE.UU N° 4.851.331.

Si se utiliza la genotipificación basada en la amplificación específica de alelo, la identificación de los alelos requiere solo la detección de la presencia o ausencia de secuencias dianas amplificadas. Los métodos para la detección de secuencias dianas amplificadas son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, los ensayos de electroforesis en gel y los ensayos de hibridación de sonda descritos se utilizan a menudo para detectar la presencia de ácidos nucleicos.

En un método alternativo sin sondas, el ácido nucleico amplificado se detecta monitorizando el aumento en la cantidad total de DNA de doble cadena en la mezcla de reacción, y se describe, por ejemplo, en Pat. EE.UU. N° 5.994.056; y Publicación de patente Europea n° 487.218 y 512.334. La detección de DNA diana de doble cadena recae sobre los diferentes colorantes de unión a DNA con fluorescencia aumentada que presenta, por ejemplo, SYBR Green, cuando está unido a un DNA de doble cadena.

Tal como puede apreciar un experto en la materia, los métodos de amplificación específicos de alelo pueden realizarse en una reacción que utiliza múltiples cebadores específicos de alelo para localizar alelos particulares. Los cebadores para dichas aplicaciones multiplex se marcan generalmente con mareajes distinguibles o están seleccionados de forma que los productos de amplificación producidos a partir de los alelos son distinguibles por el tamaño. Así, por ejemplo, ambos alelos en una única muestra pueden identificarse utilizando una amplificación única mediante el análisis del gel del producto de amplificación.

Como en el caso de las sondas específicas de alelo, un cebador de oligonucle ó tido espec í fico de alelo puede ser exactamente complementario a uno de los alelos polimó rficos en la región de hibridación o puede tener algunos desemparejamientos en posiciones diferentes de las del extremo 3' del oligonucle ó tido, dichos desemparejamientos ocurren en sitios no polimórficos en ambas secuencias de alelo. c. Sondas detectables i) Sondas de ensayo nucleasa 5' La genotipificación puede también realizarse utilizando un " Taq an® " o "ensayo de nucleasa 5' , tal como se describe en la Pat . EE.UU N - 5.210.015; 5.487.972; y 5.804.375; y Holly et al., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:7276-7280. En el ensayo TaqMan®, las sondas de detección marcadas que hibridan dentro de la región amplificada se añaden durante la reacción de amplificación. Las sondas se modifican de forma que previenen a las sondas de actuar como cebadores para la síntesis de DNA. La amplificaci ó n se realiza utilizando una polimerasa de DNA que posee actividad exonucleasa 5' a 3'. Durante cada paso de síntesis de la amplificaci ó n, cualquier sonda que híbrida con el á cido nucleico diana corriente abajo del cebador que se va a extender se degrada mediante la actividad exonucleasa 5' a 3' de la polimerasa de DNA. Así, la síntesis de una nueva cadena diana también resulta en la degradación de una sonda, y la acumulación de producto de degradación proporciona una medida de la síntesis de las secuencias dianas.

La sonda de hibridación puede ser una sonda específica de alelo que discrimina entre los alelos SNP. Alternativamente, el método puede realizarse utilizando un cebador específico de alelo y una sonda marcada que se une al producto amplificado.

Cualquier método adecuado para detectar el producto de degradación puede utilizarse en un ensayo nucleasa 5'. A menudo, la sonda de detección está marcada con dos tinciones fluorescentes, una de las cuales es capaz de bloquear la fluorescencia de la otra tinción. Las tinciones se unen a la sonda, habitualmente una se une al extremo 5' y la otra se une a un sitio interno, por lo que el bloqueo sucede cuando la sonda está en un estado no hibridado y por lo que la escisión de la sonda mediante la actividad exonucleasa 5' a 3' de la polimerasa de DNA ocurre entre las dos tinciones. La amplificación resulta en la escisión de la sonda entre las tinciones con una eliminación concomitante del bloqueo y un aumento en la fluorescencia observable a partir de la tinción inicialmente bloqueada. La acumulación de producto de degradación se monxtoriza medxante la medición del aumento en la fluorescencia de la reacción. La Pat . EE.UU. N° 5.491.063 y 5.571.673, ambas incorporadas en este documento por referencia, describen métodos alternativos para detectar la degradación de la sonda que ocurre de forma concomitante con la amplificación. ii) Sondas de estructura secundaria Las sondas detectables tras un cambio estructural secundario son también adecuadas para la detección de un polimorfismo, que incluye SNP. Ejemplos de sondas de estructura secundaria o sondas de estructura en horquilla incluye balizas moleculares o cebadores/sondas Scorpion®. Las sondas de balizas moleculares son sondas de ácido oligonucleico de una cadena que pueden formar una estructura en horquilla en la que se sitúa habitualmente un fluoroforo y un bloqueador en los extremos opuestos del oligonucleótido . En cada extremo de la sonda pequeñas secuencias complementarias permiten la formación de un tallo intramolecular, que permite al fluoroforo y al bloqueador estar muy próximos. La porción del lazo de la baliza molecular es complementaria a un ácido nucleico diana de interés. La unión de esta sonda a su ácido nucleico diana de interés forma un híbrido que obliga a retirarse al tallo. Esto provoca un cambio en la conformación que desplaza el fluoroforo y el bloqueador lejos el uno del otro y conduce a una señal fluorescente más intensa. Las sondas de balizas moleculares, no obstante, son altamente sensibles a pequeñas variaciones de secuencia en la sonda diana (Tyagi S. y ramer F. R., Nature Biotechnology, Vol . 14, páginas 303-308 (1996); Tyagi et al., Nature Biotechnology, Vol. 16, páginas 49-53(1998); Piatek et al., Nature Biotechnology, Vol. 16, páginas 359-363 (1998); Marras S. et al., Genetic Analysis: Biomolecular Engineering, Vol. 14, páginas 151-156 (1999) ; Tpp I. et al, BioTechniques, Vol 28, páginas 732-738 (2000)). Un cebador/sonda Scorpion® comprende una sonda con estructura en horquilla unida covalentemente a un cebador. d. Secuenciación de DNA y extensiones de base única Los SNP pueden también detectarse mediante secuenciación directa. Los métodos incluyen por ejemplo, métodos basados en la secuenciación didesoxi y otros métodos como secuenciación de Maxam y Gilbert (véase, por ejemplo, Sambrook y Russell, supra) .

Otros métodos de detección incluye Pirosecuenciación ™ de productos de longitud de oligonucleótido. Dichos métodos a menudo emplean técnicas de amplificación como PCR. Por ejemplo, en la pirosecuenciación, un cebador de secuenciación hibrida con un molde de DNA de cadena sencilla, amplificado por PCR; y se incuba con las enzimas, polimerasa de DNA, sulfurilasa de ATP, luciferasa y apirasa, y los sustratos, adenosina 5' fosfosulfato (APS) y luciferina. Se añade a la reacción el primero de los cuatro desoxinucle ó tidos trifosfato (dNTP) . La polimerasa de DNA cataliza la incorporación del desoxinucleótido trifosfato en la cadena de DNA, si es complementario a la base en la cadena de molde. Cada evento de incorporación está acompañado por la liberación de pirofosfato (PPi) en una cantidad equimolar a la cantidad de nucle ó tido incorporado. La ATP sulfurilasa convierte cuantitativamente el PPi en ATP en presencia de adenosina 5' fosfosulfato. Este ATP conduce la conversión mediada de luciferase de luciferina en oxiluciferina que genera luz visible en cantidades que son proporcionales a la cantidad de ATP. La luz producida en la reacción catalizada por la luciferasa está detectada mediante una cámara de dispositivo de carga acoplados (CCD) y vista como un pico en un Pyrogram™ . Cada señal lumínica es proporcional al número de nucleótidos incorporados. La apirasa, una enzima que degrada los nucleótidos, degrada de forma continuada los dNTP no incorporados y el exceso de ATP. Cuando la degradación es completa, se añade otro dNTP.

Otro método similar para caracterizar SNP no requiere el uso de una PCR completa, pero habitualmente utiliza solo la extensión de un cebador mediante una molécula única de ácido didesoxiribonucleico (ddNTP) marcado con fluorescencia que es complementario al nucleótido a analizar. El nucleótido en el sitio polimórfico puede identificarse mediante la detección de un cebador que se ha extendido por una base y está marcado fluorescentemente (por ejemplo, Kobayashi et al, Mol. Cell. Probes, 9:175-182, 1995). e. Electroforesis Los productos de amplificación generados utilizando la reacción en cadena de la polimerasa pueden analizarse mediante la utilización de un gradiente desnaturalizante en gel de electroforesis . Pueden identificarse diferentes alelos basándose en las diferentes propiedades de fusión dependientes de la secuencia y de la migración electroforética del DNA en la solución (véase, por ejemplo, Erlich, ed. , PCR Technology, Principies and Applications for DNA Amplification, W. H. Freeman y Co, New York, 1992, Chapter 7) .

La distinción de los polimorfismos de microsatélites puede realizarse utilizando la electroforesis capilar. La electroforesis capilar permite convenientemente la identificación del número de repeticiones en un alelo microsatélite particular. La aplicación de electroforesis capilar al análisis de polimorfismos de DNA es bien conocido por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Szantai, et al, J Chromatogr A. (2005) 1079 (1-2) :41-9; Bjorheim y Ekstrom, Electrophoresis (2005) 26 (13) : 2520-30 y Mitchelson, Mol Biotechnol. (2003) 24 (1) : 41-68) . f. Análisis de polimorfismos conformacionales de cadena sencilla Los alelos de secuencias dianas pueden diferenciarse utilizando análisis de polimorfismos conformacionales de cadena sencilla, que identifica diferencias en las bases mediante la alteración en la migración electroforética de los productos de PCR de cadena sencilla, tal como se describe, por ejemplo, en Orita et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 2766-2770 (1989) . Los productos de PCR amplificados pueden generarse tal como se ha descrito anteriormente, y calentarse o desnaturalizarse de cualquier otra manera, para formar productos de amplificación de cadena sencilla. Los ácidos nucleicos de cadena sencilla pueden volverse a plegar o formar estructuras secundarias que dependen parcialmente de la secuencia de bases. Las diferentes movilidades electroforéticas de los productos de amplificación de cadena sencilla pueden relacionarse a la diferencia en la secuencia de bases entre alelos de secuencias diana.

Los métodos de detección de SNP a menudo utilizan oligonucleótidos marcados. Los oligonucleótidos pueden marcarse mediante la incorporación de una sonda detectable mediante medios espectroscópicos , fotoquímicos , bioquímicos, inmunoquímicos , o químicos. Los mareajes útiles incluyen tinciones fluorescentes, mareajes radioactivos, por ejemplo, 32P, reactivos electrodensos , enzimas, como peroxidasa o fosfatasa alcalina, biotina, o haptenos y proteínas para los que está disponible antisueros o anticuerpos monoclonales . Las técnicas de mareaje son bien conocidas en la materia (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, supra; Sambrook & Russell, supra) . 4. Métodos de tratamiento ® Las dosis de bevacizumab (Avastin ) para los tratamientos de cáncer específicos, de acuerdo con la EMEA, son como sigue. Para el carcinoma de colon o recto metastásico (mCRC) las dosis recomendadas son 5 mg/kg o 10 mg/kg de peso corporal una vez cada 2 semanas o 7,5 mg/kg o 15 mg/kg de peso corporal una vez cada 3 semanas, para el cáncer de mama metastásico (mBC) las dosis recomendadas son 10 mg/kg de peso corporal una vez cada 2 semanas o 15 mg/kg de peso corporal una vez cada 3 semanas como infusión intravenosa, y para el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) las dosis recomendadas son 7,5 mg/kg o 15 mg/kg de peso corporal una vez cada 3 semanas como en la infusión intravenosa. El beneficio clínico en los pacientes con NSCLC se ha demostrado con ambas dosis de 7,5 mg/kg y 15 mg/kg. Para detalles referir a la sección 5.1 Pharmacodynamic Properties, Non-s all cell lung cáncer (NSCLC) . Para cáncer renal avanzado y/o metastásico (mRCC) las dosis preferibles son 10 mg/kg de peso corporal una vez cada 2 semanas como en la infusión intravenosa (además de la quimioterapia basada en platino durante hasta 6 ciclos de tratamiento seguido de bevacizumab (Avastin*) como agente único hasta la progresión de la enfermedad) . Para el gliablastoma una dosis particular es 10 mg/kg cada 2 semanas.

En el contexto de la presente invención, el inhibidor de la angiogénesis puede administrarse además de o como coterapia o un cotratamiento con uno o más agentes quimioterapéuticos administrados como parte del régimen de quimioterapia estándar tal como se conoce en la materia. Ejemplos de agentes incluidos en dicho régimen de quimioterapias estándar incluye 5-fluorouracilo, leucovorina, irinotecan, gemcitabina, erlotinib, capecitabina, taxanos, como docetaxel y paclitaxel, interferón alfa, vinorelbina, y agentes quimioterapéuticos basados en el platino, como paclitaxel, carboplatino, cisplatino y oxaliplatino . Ejemplos de cotratamientos para el cáncer pancreático metastásico incluye gemcitabina-erlotinib más bevacizumab a una dosis de 5mg/kg o 10 mg/kg de peso corporal una vez cada dos semanas o 7,5 mg/kg o 15 mg/kg de peso corporal una vez cada tres semanas . Ej emplos de cotratamientos para el cáncer renal incluye interferón alfa más bevacizumab a una dosis de 10 mg/kg de peso corporal una vez cada dos semanas. Además, un paciente puede cotratarse con una combinación de irinotecan, 5-fluorouracilo, leucovorina, también denominados IFL, como, por ejemplo, un bolus-IFL, con una combinación de oxaliplatino, leucovorina, y 5-fluorouracilo, también denominados como régimen F0LF0X4, o con una combinación de capecitabina y oxaliplatino, también denominados como XELOX. En consecuencia, en otra realización de la invención, el paciente que padece una enfermedad maligna o una enfermedad que implica angiogénesis fisiológica y patológica se debe tratar con uno o más agentes quimioterapéuticos como 5-fluorouracilo, leucovorina, irinotecán, gemcitabina-erlotinib, capecitabina y/o agentes quimioterapéuticos basados en el platino, como paclitaxel, carboplatino y oxaliplatino. Ejemplos de coterapia o cotratamiento incluye 5 mg/kg de bevacizumab (Avastin*) cada dos semanas con bolus-IFL o 10 mg/kg de bevacizumab (Avastin®) cada 2 semanas con FOLFOX4 para el cáncer colorectal metastásico, 15 mg/kg de bevacizumab (Avastin ) cada 3 semanas con caboplatino/paclitaxel para el cáncer de pulmón de células pequeñas no escamosas, y 10 mg/kg de bevacizumab (Avastin"1) cada 2 semanas con paclitaxel para el cáncer de mama metastásico. Además, el inhibidor de la angiogénesis a administrar puede administrarse como coterapia o como cotratamiento con radioterapia. 5. Equipos La presente invención también está relacionada con una composición para el diagnóstico o equipo que comprende cualquiera de los oligonucleótidos mencionados y opcionalmente métodos adecuados para la detección.

El equipo de la invención puede de forma ventajosa utilizarse para llevar a cabo un método de la invención y puede utilizarse, inter alia, en una serie de aplicaciones, por ejemplo, en el campo de diagnóstico o como herramienta de investigación. Las partes del equipo de la invención pueden ser paquetes individuales en viales o en combinación en contenedores o unidades multicontenedor . La fabricación del equipo sigue preferiblemente los procedimientos estándar que son conocidos por el experto en la materia. El equipo o composiciones diagnósticas pueden utilizarse para la detección de una o más variantes de alelos de acuerdo con los métodos de la invención aquí descritos, utilizando, por ejemplo, técnicas de amplificación como las que aquí se han descrito.

En consecuencia, en otra realización de la presente invención proporciona un equipo útil para llevar a cabo los métodos descritos en este documento, que comprende oligonucleótidos o polinucleótidos capaces de determinar el genotipo de uno o más SNP. Los oligonucleótidos o polinucleótidos pueden comprender cebadores y/o sondas.

La presente invención se describe además mediante referencia a las siguientes figuras y ejemplos no limitantes así como WO 2011/015348 con referencia específica a los Ejemplos 1 y 2 y las Figuras 1 a 16 de WO 2011/015348.

Ejemplos PACIENTES Y MÉTODOS Diseño del estudio AVITA (BO17706) y AVOREN (BO17705) fueron ensayos multicéntricos, aleatorizados de fase III que respectivamente incluyeron 607 pacientes con adenocarcinoma pancreático metastásico y 649 pacientes con carcinoma renal metastásico. En AVITA, los pacientes se asignaron aleatoriamente para recibir gemcitabina-erlotinib más bevacizumab (n=306) o placebo (n=301) . En AVOREN, los pacientes se asignaron aleatoriamente para recibir interferón alfa-2a más bevacizumab (n=327) o placebo (n=322) . Los detalles de estos estudios se han descrito: - AVITA: Van Cutsem et al. Ensayo de fase III de bevacizumab en combinación con gemcitabina y erlotinib en pacientes con cáncer pancreático metastásico. J. Clinc. Oncol 27, 2231-7 (2009) - AVOREN: Escudier B, Pluzanska A, Koralewski P, Ravaud A, Bracarda S, Szczylik C, et al . Bevacizumab más interferón alfa-2a para el tratamiento de carcinoma renal metastásico: ensayo aleatorizado, doble ciego de fase III. Lancet . 2007;370 (9605) :2103-2111.

Los protocolos de ensayo y los estudios de bxomarcadores genéticos fueron aprobados por el comité de revisión institucional de cada centro y se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki, Buenas Prácticas Clinicas de la US Food and Drug Administration, y los requisitos éticos y legales locales. Todos los pacientes incluidos en los estudios de biomarcadores proporcionaron un consentimiento informado escrito por separado para el análisis de biomarcadores genéticos. Las muestras de sangre para estos análisis se recogieron antes de que empezara el inicio del tratamiento.

Selección de polimorfismo de nucleótido único Se seleccionaron los siguientes genes en la cascada de señalización de VEGF : el ligando de VEGF, homólogos de VEGF (factor de crecimiento déla placenta [P1GF] , VEGF-B, VEGF-C, y VEGF-D [también conocido como factor de crecimiento inducido por c-fos o F1GF] ) , receptor-2 de VEGF (VEGFR-2 o KDR) y receptor- 1 VEGF (VEGFR-1 o FLT1) , reguladores de la hipoxia (factor-la inducible por hipoxia [HIF1A] , HIF-2a [EPAS1] , el factor que inhibe HIF-?a [FIH1] , el supresor de tumores von Hippel-Lindau [VHL] , la histona acetiltransferasa EP300) , y los sensores de oxígeno (proteína-1, -2, y -3 que contiene el dominio prolil hidroxilasa [EGLN-2, -1, y -3] , respectivamente) . Las secuencias genómicas de hasta 5kb corriente arriba del sitio de inicio de la traducción y corriente abajo del sitio de 3 ' -poli-A-adenilización de cada gen se utilizó para seleccionar los SNP de la base de datos HapMap (liberación 24/fase II) . Los SNP marcados con colas se seleccionaron utilizando el Tagger (Pe'er I, de Bakker PI, Maller J, Yelensky R, Altshuler D, Daly MJ. Evaluating and improving power in whole-genome association studies using fixed marker sets. Nat Genet 2006;38:663-7) proporcionado en el paquete de programas HAPLOVIEW (Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps . Bioinformatics 2005;21:263-5). Solamente los SNP comunes, es decir, con menor frecuencia alélica (f)>0,l y umbral r2 >0,8, fueron considerados. En total, se seleccionaron 140 SNP marcados con colas utilizando estos criterios. De forma adicional, 14 SNP localizados en las secuencias exónicas e induciendo cambios no sinónimos de aminoácidos en una frecuencia de f>0,l se seleccionaron a partir de la base de datos dbSNP, como SNP adicionales en VEGF (rs699947, rs833061, rs2010963, y rs3025039) , VEGFR-1 (rslll458691) y VEGFR-2 (rs2071559) , ue se habían descrito previamente por afectar la función o expresión de estos genes Con los análisis futuros en mente, también se incluyeron en el diseño 24 SNP conocidos por aumentar la susceptibilidad a la hipertensión y trombosis. En total, 184 SNP se seleccionaron de esta manera para la genotipificación.

Genotipificación Se recogieron muestras de sangre periférica en tubos K2EDTA Vacutainer* y se extrajo el DNA de linea germinal de la fracción precipitada de leucocitos. La genotipificación se llevó a cabo de forma ciega en el Vesalius Research Center (Leuven, Bélgica) con MassARRAY® iPLEX Gold (Sequenom Inc, San Diego, CA, EE.UU.) . Los SNP que no funcionaron en la primera ronda de genotipificación se rediseñaron utilizando un grupo diferente de cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa y se reanalizaron. Los 27 SNP que también fallaron en el segundo diseño se consideraron fallos. Resumiendo, 157 SNP (85,3%) se genotiparon con éxito con una tasa de éxito general de 98,5% en AVITA. Las muestras de DNA de AVOREN y de los estudios de validación funcional se genotiparon para un grupo limitado de SNP que incluye rs7993418, rs9554320, rs9582036, rs9554316, y rs9513070 ® utilizando MassARRAY .

Estadística Diecinueve SNP aparecen con una frecuencia de f<0,l en AVITA y se excluyeron por lo tanto de posteriores análisis. Se analizó el equilibrio Hardy-Weinberg para los 138 SNP restantes utilizando una ?2 estándar con un grado de libertad No se detectaron violaciones mayores. Se analizó la fuerza de desequilibrio de ligamiento (LD) con estadística r2 y D' de Lewontin utilizando el paquete informático Haploview (Broad institute, Cambridge, MA, EEUU) . Las asociaciones entre los genotipos SNP y el tiempo de aparición de sucesos (SLP y SG) se evaluó primero utilizando el método de riesgos proporcionales de Cox de acuerdo con un modelo genético aditivo. El análisis de SG se realizó de forma separada para cada uno de los 138 SNP en el brazo de bevacizumab solo. El umbral de significación para una tasa de error general de tipo I de 0,05 se ajustó a P<0.00036 basado en la corrección Bonferroni para múltiples comparaciones en AVITA. Los SNP significativos identificados en este paso se analizaron posteriormente considerando un umbral de P<0,05 y utilizando un análisis de regresión Cox: (i) en el brazo de bevacizumab solo, mientras se ajusta para otras covariables pronosticas de línea basal; (ii) en el brazo de placebo solo, para evaluar si las asociaciones observadas fueron independientes del tratamiento, y (iii) en ambos grupos de tratamiento, para evaluar el genotipo mediante la interacción de tratamiento. Un modelo de selección por pasos se aplicó al subgrupo disponible para el análisis de biomarcadores genéticos para identificar un grupo de covariables en línea basal que afectan al resultado del tratamiento. Las variables seleccionadas utilizadas como covariables de ajuste fueron: contaje de neutrófilos, proteína C-reactiva, y localización del tumor. La asociación de rs7993418 se replicó en AVOREN considerando un umbral de P<0,05 y utilizando los análisis de regresión de Cox similar a AVITA.

RESULTADOS Caracterís icas del estudio AVITA Muestras de sangre de AVITA estuvieron disponibles en 160 de los 607 pacientes (26,4%); 6 pacientes eran asiáticos y 154 caucasianos. Ya que las frecuencias de SNP difieren entre grupos étnicos, solo se analizaron los especímenes de DNA de pacientes caucasianos. El subgrupo de biomarcadores genéticos fue comparable con la cohorte completa de pacientes respecto a la distribución de edad y género, hábito tabáquico, SG y SLP (Tabla 2) . La mediana de SG en el subgrupo fue de 7,4 y 6,7 meses en los brazos de bevacizumab y placebo, respectivamente (p=0,19), y la mediana de SLP fue de 5,3 y 4,1 meses, respectivamente (p=0,078).

Tabla 2. Datos demográficos de los pacientes de AVITA y características clínicas en la linea basal Los datos demográficos y las características clínicas se proporcionan para toda la cohorte del ensayo AVITA y para el subgrupo disponible para el análisis de biomarcadores genéticos. Bev indica bevacizumab; IC intervalo de confianza, GE gemcitabina-erlotinib, me meses.

Población de AVITA Subgrupo biomarcador Características GE (N=301) Bev+GE GE Bev+GE (N=306) (N= 77) <N= =77) Sexo - n° (%) Mujeres 113 (38) 132 (43) 25 (32) 29 (37) Hombres 188 (62) 174 (57) 52 (68) 48 (62) Categoría de edad — n° (%) <65 años 194 (64) 182 (59) 50 (65) 45 (58) >65 años 107 (36) 124 (41) 27 (35) 32 (42) Hábito tabáquico — n° (%) Fumador 63 (21) 50 (16) 18 (23) 14 (18) Ex fumador 99 (33) 104 (34) 36 (47) 32 (42) No fumador 137 (46) 151 (49) 22 (29) 31 (40) No sabe 2 (<1) 1 (<1) 1 (1) 0 (0) Rendimiento de Karnofsky n° (%) 60 11 (4) 12 (4) 2 (3) 2 (3) 70 26 (9) 28 (9) 5 (6) 6 (8) 80 71 (24) 78 (25) 14 (18) 20 (26) 90 120 (40) 119 (39) 37 (48) 30 (39) 100 73 (24) 69 (23) 19 (25) 19 (25) Puntuación de la escala analógica visual del dolor n° (%) <20 137 (61) 162 (64) 50 (75) 47 (67) >20 89 (39) 91 (36) 17 (25) 23 (33) Supervivencia libre de progresión Pacientes con eventos — n° (%) 295 (98, 0) 295 (96,4) 76 (98, 7) 72 (93,5) Pacientes sin eventos — n° (%) 6 (2,0) 11 (3,6) 1 (1,3) 5 (6,5) Mediana de tiempo hasta el 3,6 (3,4- 4,6 (3,8- 4, 1 (3,5- 5,3 (4,0- Tasa de riesgo (95% IC) 0,~74 (0,64-0,87)' 0,75 (l,03-0~54) Supervivencia general Pacientes con eventos — n° (%) 277 (92, 0) 276 (90,2) 75 (97,4) 69 (89,6) Pacientes sin eventos — n° (%) 24 (8,0) 30 (9,8) 2 (2,6) 8 (10,4) Mediana de tiempo hasta el 6,1 (5,5- 7,2 (6,6- 6, 7 (5,3; 7,4 (6,1; Tasa de riesgo (95% IC) 0,89 (0,76-1,05) 0,80 (1, 12-0, 58) El SNP rs9582036 en VEGFR-1 correlaciona con el resultado del 'tratamiento con bevacizumab De los 138 SNP, solamente el SNP rs9582036 en VEGFR-1 pasó el umbral del valor P ajustado para múltiples análisis. El efecto general de este SNP sobre la SG fue significativo en el brazo de bevacizumab (per-alelo HR=2,1, P=0, 00014) y consistente con un modelo de efecto de riesgo aditivo (Fig. 3 de WO 2011/015348). La mediana de la SG aumentó de 4,8 meses y 6,0 meses en los portadores CC y AC, respectivamente, hasta 10,3 meses en los portadores AA. Tras el ajuste del contaje de neutrófilos, el nivel de proteína C-reactiva y la localización del tumor, la asociación de rs9582036 con la SG en el brazo bevacizumab se atenuó ligeramente pero continuada siendo significativo (HR=1,9, P=0,002). El posterior análisis de regresión Cox para rs9582036 en el brazo de placebo no mostró una correlación estadísticamente significativa entre la SG y los genotipos SNP (Fig. 4 de WO 2011/015348) . Un análisis formal de la interacción entre rs9582036 y el tratamiento (bevacizumab o placebo) fue estadísticamente significativo (P=0,041), indicando que rs9582036 fue un marcador predictivo para el resultado del tratamiento en AVITA. El análisis de regresión de Cox también reveló una correlación entre rs9582036 y SLP en el brazo de bevacizumab (per-alelo HR=1,89, P=0, 00081; Fig. 5 de WO 2011/015348). No se observó dicho efecto para SLP en el brazo de placebo (P=0,58; Fig. 6 de O 2011/015348).

Los SNP asociados definen un locus en el dominio VEGFR-1 TK Tres SNP diferentes en VEGFR-1 (rs9554316, rs9513070, y rs9554320) también correlacionaron con la SG en el brazo de bevacizumab, pero no pasaron el umbral del valor P ajustado para análisis múltiples (P=0, 00042, P=0,0081, y P=0,0097, respectivamente) . Los efectos predictivos de estos SNP fueron similares a aquellos de rs9582036 (Figuras 7 a 10 de WO 2011/015348) . Los cuatro SNP se localizaron cerca el uno del otro, es decir, en los intrones 25, 27, 28, y 29 para rs9554320, rs9582036, rs9554316, y rs9513070, respectivamente, y representaron cuatro regiones consecutivas de gran desequilibrio de ligamiento dentro de VEGFR-1. Cuando se considera el valor P de cada SNP como medida de su asociación con la SG y se representa estos valores como una función de la localización de los SNP en VEGFR-1, una señal de asociación que abarca los exones 25 a 29, que codifican para los residuos de aminoácidos 1029 a 1272 en el dominio TK, se observó en el brazo bevacizumab. Tal como se esperaba, no se observó dicha señal en el grupo placebo .

Mapeado detallado del locus VEGFR-1 Para identificar todos los SNP localizados en VEGFR-1, se utilizó los datos completos de secuenciación dle genoma de 60 muestras HapMap caucasianas en los 1000 genomas del proyecto (población CEU, publicado en julio de 2010; www.1000genomes.org). Utilizando el programa VCF Tools versión 0.1.5, se seleccionaron los SNP en la región codificante de VEGFR-1 y 15kb corriente arriba y abajo de la secuencia (por ejemplo, en las coordenadas Chrl3 : 27763000-27982000 Ensembl 36.3). En total, se identificaron 628 SNP, de los cuales 381 tenían una frecuencia alélica menor (MAF) =0,05. Utilizando el programa Haploview 4.2, se identificaron 48 SNP que estaban en LD con uno de los cuatro mareajes de cola de SNP asociados con el resultado de tratamiento tras bevacizumab en AVITA (por ejemplo, rs9582036, rs9554316, rs9513070 y rs9554320). El umbral de LD se ajustó a r2=0.12 ya que fue la r2 más baja entre uno de los cuatro mareajes de SNP en las muestras analizadas (Tabla 3) .

Tabla 3 valor r2 rs9513070 rs9554316 rs9582036 rs9554320 rs9513070 - 0, 28 0, 21 0.12 rs9554316 0, 28 - 0,67 0.33 rs9582036 0, 21 0, 67 - 0.48 rs9554320 0, 12 0, 33 0,48 - Se muestra el desequilibrio de ligamiento de parejas entre los 4 mareajes de SNP en el locus VEGFR-1. SNPs, que están en correlación perfecta y son completamente sinónimos, posee un valor r2 de 1. Los SNP con un valor r2 de 0 aparecen independientemente el uno del otro.

Para identificar cual de estos 48 SNP afectan a la función de VEGFR-1 y causalmente contribuyen al resultado del tratamiento tras bevacizumab, se utilizaron las herramientas PupaSuite (Reumers J, Conde L, Medina I, et al. Joint annotation of coding and non-coding single nucleotide polymorphisms and mutations in the SNPeffect and PupaSuite databases. Nucleic Acids Res 2008 ; 36 : D825-9) y AnnoVar (Wang K, Li M, Hakonarson H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Res; 38 : el64) . En particular, se analizaron cuales de estos SNP están localizados en regiones codificantes, sitios de unión al factor de transcripción, potenciadores/silenciadores de corte y empalme exónico o sitios de unión a miRNA, o en otras regiones de secuencia evolutivamente conservada. Solamente un SNP se localizó en uno de los exones de VEGFR-1, por ejemplo, rs7993418 se localizó en el exón 28 de VEGFR-1. Dos SNP (por ejemplo, rs9513071 y rs7982283) se localizaron en un motivo de unión a factor de unión a CCCTC predicho (CTCF) , pero es improbable que afecte de manera funcional a VEGFR-1 ya que no rompe el dominio de unión al núcleo del motivo CTCF. Otros cinco SNP se localizaron en posiciones conservadas, que se definen como conservación de la posición del correspondiente nucleótido en al menos 10 mamíferos de las 44 especies de la base de datos. Estos SNP se localizaron corriente abajo del gen VEGFR-1 (rs9554309) , en secuencias intrónicas (rs9513073, rs9551471, rs7992940) y en el exón 28 de VEGFR-1 (rs7993418) . No se identificaron otros SNP relevantes. Señaladamente, de estos 5 SNP, rs7993418 mostró el mayor grado de LD con los cuatro mareajes de SNP en el locus TK de VEGFR-1 (valores r2 de 0,34, 0,83, 0,67 y 0,36 para LD con rs9513070, rs9554316, rs9582036 y rs9554320, respectivamente) . En total, basándose en este mapeado detallado y a los análisis in silico, se consideró que rs7993418 fue el SNP con el potencial más alto para poder afectar a la función de VEGFR-1. Rs7993418 es un SNP T/C sinónimo localizado en el exón 28 de VEGFR-1 que cambia el codón TAT de la tirosina 1213 en el codón TAC (Tyrl213Tyr) y está localizado en el bloque de aplotipo de rs9554316.

La variante rs7993418 afecta funcionalmente a la expresión de VEGFR-1 1. Transcripción/traducción in vitro de las construcciones de cDNA de VEGFR-1 Para demostrar que rs7993418 afecta de forma funcional a la expresión de VEGFR-1, se analizó su efecto sobre la transcripción y traducción del cDNA de VEGFR-1 in vitro utilizando el sistema de lisado de reticulocito de conejo. Se generaron dos versiones del cDNA de VEGFR-1, portadoras del codon TAT o el codón TAC para Tyrl213. Ambos cDNA se clonaron en el vector de expresión pcDNA3 y se utilizaron para transcripción/traducción in vitro utilizando el equipo de lisado de reticulocito de conejo comercial TnT T7 Quick-coupled (Promega, N° Cat . L1170) . El cDNA de longitud completa de VEGFR-1 portador del codón TAT salvaje o el codón TAC mutante proporcionaron las mismas cantidades de mRNA transcrito pero diferentes cantidades de proteína VEGFR-1 traducida. En particular, se observó un aumento del 27% en la proteína VEGFR-1 para las construcciones de cDNA portadoras de TAC versus TAT (P<0,001). De forma similar, la sobreexpresión transitoria en las células HEK293T confirmó que, aunque la expresión del mRNA de VEGFR-1 fue la misma entre células que expresan la construcción portadora de TAC y TAT, se tradujo hasta un 15% más proteína VEGFR-1 mediante las células que expresan TAC (P<0,001). La expresión de la isoforma soluble VEGFR-1 (sVEGFR-1) producida por la escisión proteolítica de VEGFR-1 transmembranal de longitud completa (tmVEGFR-1) aumentó de forma similar en células que expresan la construcción portadora de TAC (P<0,001) . 2. Niveles de expresión de sVEGFR-l en plasma humano Además, debido a que los niveles de proteína tmVEGFR-1 y sVEGFR-l están fuertemente correlacionados y sVEGFR-l puede analizarse fácilmente en plasma humano, se midieron los niveles en plasma de sVEGFR-l en dos cohortes independientes y se estratificaron para rs7993418. Se recogió plasma de 369 individuos sanos de ascendencia flamenca mediante la Cruz Roja (Leuven, Bélgica) y se genotipificó el DNA de estos individuos para rs7993418. Comparamos los niveles en plasma de sVEGFR-l de 30 y 28 portadores de TT y TC aleatoriamente seleccionados frente a cada uno de los 11 portadores CC (mutante) mediante el Inmunoensayo Human Soluble VEGF Rl/Flt-1 (R&D systems, n° de catálogo DVR100B) . Observamos que los portadores de CC presentan una mediana de expresión de VEGFR-1 aumentada un 18% comparada con los portadores de TT y TC (P=0,006) . Se utilizó A OVA de un factor para evaluar el efecto de rs7993418 sobre la expresión de sVEGFR-l; un valor P de dos factores <0,05 se consideró estadísticamente significativo. Se replicó esta asociación en una cohorte independiente de muestras de plasma de pacientes con cáncer de mama (recogidas en el Leuven Multidisciplinary Breast Center) . En resumen, se genotipificó DNA de 263 pacientes para niveles en plasma de rs7993418 y sVEGFR-1 a partir de 23 y 27 portadores de TT (salvaje) y TC aleatoriamente seleccionados comparado frente a cada uno de los 9 portadores de CC (mutante) detectados. Se notó un aumento similar en la expresión de sVEGFR-1 (19%) en portadores de CC versus portadores de TT y TC (P=0,014). Se utilizó A OVA de un factor para evaluar el efecto de rs7993418 sobre la expresión de sVEGFR-1; un valor P de dos factores <0,05 se consideró estadísticamente significativo. 3. Expresión de VEGFR-1 en HUVEC estratificado por genotipos rs7993418 Finalmente, al comparar los HUVEC portadores de los genotipos rs7993418 TT, TC y CC, no se pudo identificar ninguna diferencia para tmVEGFR- 1 (P=0,50) y sVEGFR-1 (P=0,91) en los niveles de expresión de mRNA. No obstante, similar a los experimentos de traducción in vitro, estos HUVEC mostraron niveles de expresión ligeramente aumentados de proteína tmVEGFR-1 para los portadores CC versus portadores TT o TC (aumento del 23%; P=0,049). Se observó un efecto similar entre los portadores CC versus portadores TC o TT para sVEGFR-1 (aumento del 39%; P=0,044). 4. Activación de ERK1/2 tras la estimulación con P1GF Los hallazgos anteriores indican que rs7993418, mediante el aumento de la eficacia de traducción del mR A, aumenta la expresión de tmVEGFR-1 y sVEGFR-l. Además, tal como se esperaba por el aumento en la expresión de VEGFR-1, los cultivos homozigotos de HÜVEC para el alelo C presentaron un aumento corriente abajo de la señalización de VEGFR-1 tras la activación con el ligando selectivo VEGFR-1, P1GF.

Esto se muestra mediante el aumento de los niveles de fosfo-ERKl y fosfo-ERK2 en portadores CC versus portadores TT rs7993418 (inducción 2 veces superior versus 1,6 para fosfo-ERKl y 2,1 veces superior versus inducción 1,4 veces superior para fosfo-ERK2; P=0,045 y P=0,046; n=3 versus 5). La fosforilación de ERK1 y ERK2 se midió utilizando el equipo de matrices Fosfo-MAPK (R&D systems) . Las proteínas fosforiladas se detectaron utilizando el sustrato quimioluminiscente Pierce ECL (Thermo Scientific) y se desarrollaron blots utilizando la película de fotografía científica (Kodak) . Los blots se escanearon y se cuantificaron las intensidades utilizando el programa ImageJ 1.43. Se corrigió el ruido de fondo de las intensidades y se escalaron con relación al control positivo interno del equipo de matriz Fosfo-MAPK. Los experimentos se realizaron por duplicado y se muestran los valores medios de ambos experimentos . Debido a que el equipo de matriz Human Fosfo-MAPK no corrige la cantidad total de ERK1 o 2, se midieron las concentraciones totales de ERKl/2 utilizando tecnología SureFire (Perkin Elmer) . Los niveles totales de ERKl/2 fueron similares para los portadores de TT y CC bajo condiciones estimuladas y no estimuladas (P=0,2 y 0,34, respectivamente).

Asociación de los locus VEGFR-l replicados en AVOREN Finalmente, en un intento de replicar la asociación del locus VEGFR-l con el resultado del tratamiento con bevacizumab, se investigó un estudio clínico de fase III que involucra pacientes con carcinoma renal metastásico (AVOREN) . Las muestras de sangre de AVOREN estuvieron disponibles de 110 de 649 pacientes (16,9%), 59 de los cuales recibieron bevacizumab (Tabla 4) .

Tabla . Datos demográficos de pacientes de AVOREN y características clínicas en la línea basal Los datos demográ icos y las características se proporcionan para la cohorte completa del estudio AVOREN y para el subgrupo disponible para el análisis de biomarcadores genéticos. Bev indica bevacizumab; IC intervalo de confianza, IFN Interferón alfa-2a, me meses.

Población AVOREN Subgrupo biomarcador Características IF Bev+IFN IF Bev+IF (N=322) (N=327) (N=51) (N=59) Sexo - n° (%) Mujeres 87 (27) 105 (32) 13 (25) 29 (29) Hombres 235 (73) 222 (68) 38 (75) 48 (71) Categoría de edad — n° (%) <65 años 204 (63) 206 (63) 30 (59) 37 (63) >S5 años 118 (37) 121 (37) 21 (41) 22 (37) Hábito tabáquico — n° (%) Fumador 43 (13) 45 (14) 9 (18) 6 (10) Ex fumador 129 (40) 126 (39) 20 (39) 23 (39) No fumador 148 (46) 154 (47) 22 (43) 30 (51) No sabe 2 (<1) 2 (<1) 0 (0) 0 (0) Supervivencia libre de progresión Pacientes con eventos - n° 298 (92,5) 301 (92,0) 42 (82,4) 56 (94,9) (%) Pacientes sin eventos — n° 24 (7,5) 26 (8,0) 9 (17,6) 3 (5,1) (%) Mediana de tiempo hasta el 5,5 (4,2- 10,2 (7,7- 8,7 (7,2- 15,5 evento - me (95% IC) 5,7) 11,1) 14,2) (13,5- 18,4) Tasa de riesgo (95% IC) 0,75 (0,64-0,88) 0,93 (0,62-1,40) Supervivencia general Pacientes con eventos - n° 224 (69,6) 220 (67,3) 28 (54,9) 30 (50,8) (%) Pacientes sin eventos - n° 98 (30,4) 107 (32,7) 23 (45,1) 29 (49,2) (%) Mediana de tiempo hasta el 21,3 23,3 37,2 34,9 evento - me (95% IC) (18,4- (20,4- (28,2- (30,0-,) 24,5) 27,0) 39,7) Tasa de riesgo (95% IC) 0,91 (0,76-1,10) 0,93 (0,55-1,55) Se realizó un análisis de SNP similar al del ensayo AVITA, tal como se ha descrito anteriormente, en las muestras genéticas de pacientes en el ensayo AVOREN. Debido a que los pacientes de AVOREN que recibieron bevacizumab cambiaron a terapias heterogéneas de segunda línea tras la progresión de la enfermedad, solo se analizó la correlación con SLP. Aunque el subgrupo de biomarcador genético se caracterizó por un SLP mayor que la cohorte completa de pacientes, rs7993418 se correlacionó con SLP en bevacizumab (per-alelo HR=1,8, P=0,033, Tabla 5), pero no en el brazo placebo (per-alelo HR=0, 8, P=0, 49) .

Tabla 5. Estimación de Kaplan-Meier de SLP en los grupos tratados con bevacizumab y placebo en AVOREN, de acuerdo con el genotipo rs7993418, rs9554316 y rs9513070.

Supervivencia libre de progresión Medicina de tiempo hasta evento — meses Genotipo IFN (N=51) Bev+IFN (N=59) rs7993418 o rs9554316* T 7,95 (N=26) 16,66 (N=36) TC 13,37 (N=17) 10,15 (N=18) CC 8,11 (N=2) 14,52 (N=l) Tasa de riesgo (95% IC) 0,83 (0,47 - 1,44) 1,81 (1,08 - 3,05) Valor P 0,49 0, 033 Bev indica bevacizumab; IC intervalo de confianza, IFN Interferón alfa-2a, me meses.

* Rs7993418 y rs9554316 fueron sinónimos entre ellos y el análisis en la Tabla 5 se llevó a cabo con rs9554316.

En la Tabla 5, el genotipo CC de rs7993418 involucra solamente a un paciente; por lo tanto, no se puede sacar una conclusión sobre la mediana de supervivencia de los portadores CC. No obstante, el efecto genotípico combinado de ambos portadores TC y CC de rs7993418 en AVOREN es estadísticamente significativo (P=0,033). Los resultados mostrados en la Tabla 5 junto con la caracterización funcional descrita anteriormente de rs7993418 apoya los hallazgos de la presente invención que indican que el alelo C afecta negativamente a la supervivencia de los pacientes tratados con bevacizumab porque aumenta la expresión de VEGFR-1, que puede amplificar el fenómeno bien descrito de angiogénesis compensatoria conducida por el ligando PlGF.

En conjunto, esto indica que el locus VEGFR-1 puede también ser predictivo para el resultado del tratamiento con bevacizumab en pacientes con carcinoma renal.

Se ha identificado en la presente invención un locus genético en el dominio TK de VEGFR-1 que está asociado con SLP y la SG en pacientes con cáncer pancreático metastásico (AVITA) y se replicó con SLP en pacientes con carcinoma renal (AVOREN) . Es importante destacar que esta asociación fue específica para pacientes que reciben bevacizumab ya que no se observaron efectos significativos en los pacientes tratados con placebo. También se validó este locus a nivel funcional demostrando que rs7993418 aumenta la eficacia de traducción del mRNA de VEGFR-1, conduciendo a un aumento de la expresión de la proteína VEGFR-1.

Respecto a cómo el aumento de la expresión de VEGFR-1 puede contribuir a reducir el resultado del tratamiento con bevacizumab, es bien conocido que la activación de VEGFR-1 dispara la angiogénesis, ya sea directamente mediante la transmisión de señales intracelulares o indirectamente mediante la transfosforilación de VEGFR-2, lo que resulta en un aumento de la angiogénesis dirigida por VEGFR-2. Curiosamente, los tumores que sobreexpresan el ligando selectivo de VEGFR-1, PlGF, crecen menos rápidamente en los ratones que carecen del dominio TK de VEGFR-1 como resultado de una vascularización reducida de estos tumores. Ya que los niveles de PlGF están también aumentados en pacientes tratados con bevacizumab, un locus genético que amplifica corriente abajo la señalización de VEGFR-1 podría hacer que la vasculatura dependiera más de PlGF y provocara la resistencia al tratamiento anti-VEGF. De forma similar, el aumento de los niveles de sVEGFR-1 puede secuestrar VEGF derivado de tumores, reduciendo así sus efectos pro-angiogénicos transducidos mediante VEGFR-2 y limitando los beneficios de la neutralización de VEGF a través de bevacizumab. En efecto, Mazzone et al. han mostrado que las células endoteliales que expresan tmVEGFR-1 y sVEGFR-1 contribuyen a la normalización de la vasculación del tumor, en parte debido a que estas células responden menos a la actividad mitogénica y migratoria de VEGF (Mazzone M, Dettori D, Leite de Oliveira R, et al. Heterozygous deficiency of PHD2 restores tumor oxygenation and inhibits metástasis via endothelial normalization. Cell 2009;136:839-51).

Extraordinariamente, los pacientes con cáncer rectal con un aumento en la expresión de sVEGFR-1 en plasma antes y durante el tratamiento poseen un beneficio reducido de bevacizumab, subrayando así las observaciones de la presente invención alrededor del valor potencial de VEGFR-1 como biomarcador del tratamiento con bevacizumab (Duda DG, et al. Plasma soluble VEGFR-1 is a potential dual biomarker of response and toxicity for bevacizumab with chemoradiation in locally advanced rectal cáncer. Oncologist. 2010 ; 15 (6) : 577-83 ) A primera vista, puede parecer sorprendente que un SNP sinónimo afecte la expresión de VEGFR-1 sin cambiar la secuencia de aminoácidos. No obstante, las mutaciones sinónimas se han descrito previamente por afectar la expresión de proteínas y ya se han visto implicadas en >40 enfermedades. Un mecanismo potencial en el que los SNP sinónimos pueden afectar la expresión de proteínas es a través del sesgo de codón. En particular, la variante de rs7993418 puede afectar al uso de codón de la tirosina localizada en la posición 1213 en el dominio TK de VEGFR-1. Este dominio se caracteriza por un fuerte sesgo hacia los codones TAC, es decir, los 16 codones TAC versus los 5 codones TAT, que codifican ambos para una tirosina. Dicho sesgo de codones está también presente en los genes altamente expresados a lo largo de varias especies, en las que representa un mecanismo para promover la traducción eficiente de genes altamente expresados. La traducción más eficiente de VEGFR-1 inducida por el codón TAC puede lograrse a través de varios mecanismos, que incluye i) la interacción más favorable del codón TAC con su anticodón de tRNA debido a la interacción más fuerte del enlace de hidrógeno G-C en la tercera posición del codón (Grosjean H, Fiers W. Preferential codon usage in prokaryotic genes: the optimal codon-anticodon interaction energy and the selective codon usage in efficiently expressed genes. Gene 1982;18:199-209), ii) aumento de la disponibilidad de tR A para el codón TAC (el tRNA de TAT está codificado por un único gen, mientras que existen 14 genes del tRNA para TAC) (Juhling F, Morí M, Hartmann RK, Sprinzl M, Stadler PF, Putz J. tRNAdb 2009: compilation of tRNA sequences and tRNA genes. Nucleid Acids Res 2009;37:D159-62) , y iii) el efecto del "reciclaje de tRNA" por los ribosomas, que favorece la reutilización de los codones utilizados más frecuentemente para mejorar la eficacia de la traducción (Cannarozzi G, Schraudolph NN, Faty M, et al. A role for codon order in translation dynamics. Cell; 141 : 355-67) . En conjunto, estos mecanismos apoyan la noción que el sesgo de codón media el efecto de rs7993418 en la expresión de VEGFR-1 y su asociación con el resultado del tratamiento de bevacizumab.

Claims (12)

REIVINDICACIO ES

1. Un método in vitro para determinar si un paciente que padece cáncer o anormalidades angiogénicas fisiológicas o patológicas está adecuadamente tratado mediante una terapia con un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo sobre VEGF que bevacizumab, dicho método comprende: (a) determinar en una muestra derivada de un paciente que padece cáncer o anormalidades angiogénicas fisiológicas o patológicas el genotipo del SNP T/C sinónimo localizado en el exón 28 de VEGFR-1 que corresponde respectivamente al codón TAT y al codón TAC de la tirosina en la posición 1213, y (b) identificar dicho paciente tratado más o menos adecuadamente por una terapia con un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo sobre VEGF que bevacizumab basado en dicho genotipo, en el que la presencia de dicho alelo T en dicho SNP indica un aumento de la probabilidad de que el paciente esté tratado más adecuadamente, o la presencia de dicho alelo C en dicho SNP indica un aumento de la probabilidad de que el paciente esté tratado menos adecuadamente .

2. El método de la reivindicación 1, en el que si un paciente está adecuadamente tratado mediante una terapia con un inhibidor de la angiogénesis se determina en los términos de si la supervivencia libre de progresión o supervivencia general ha mejorado.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el método comprende además tratar al paciente mediante la terapia con un inhibidor de la angiogénesis.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el inhibidor de la angiogénesis se administra como un cotratamiento con un agente quimioterapéutico o régimen de quimioterapia.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el inhibidor de la angiogénesis se administra con uno o más agentes seleccionados entre el grupo que consiste en taxanos, interferón alfa, 5-fluorouracilo, capecitabina, leucovorina, gemcitabina, erlotinib y agentes guimioterapéuticos basados en el platino.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el cáncer es cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer colorectal, cáncer de mama o cáncer de pulmón.

7. Una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo sobre VEGF que bevacizumab para el tratamiento de un paciente que padece cáncer o anormalidades angiogénicas fisiológicas o patológicas, en el que el paciente se ha identificado como más adecuadamente tratado con el inhibidor de la angiogénesis de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un equipo para llevar a cabo el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende oligonucleótidos capaces de determinar el genotipo del SNP T/C sinónimo localizado en el exón 28 de VEGFR-l que corresponde respectivamente al codón TAT y al codón TAC de la tirosina en la posición 1213.

9. Un método para mejorar el efecto del tratamiento de un agente quimioterapéutico o régimen de quimioterapia de un paciente que padece cáncer o anormalidades angiogénicas fisiológicas o patológicas mediante la adición de un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo sobre VEGF que bevacizumab, dicho método comprende: (a) determinar en una muestra derivada de un paciente que padece cáncer o anormalidades angiogénicas fisiológicas o patológicas el genotipo del SNP T/C sinónimo localizado en el exón 28 de VEGFR-l que corresponde respectivamente al codón TAT y al codón TAC de la tirosina en la posición 1213; (b) identificar dicho paciente como más adecuadamente tratado mediante la adición de un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo sobre VEGF que bevacizumab basado en dicho genotipo, en el que la presencia de dicho alelo T en dicho SNP indica un aumento de la probabilidad de que el paciente esté tratado más adecuadamente; y (c) administrar dicho inhibidor de la angiogénesis en combinación con un agente quimioterapéutico o régimen de quimioterapia al paciente identificado como más adecuadamente tratado de acuerdo con (b) .

10. El método de la reivindicación 9, en el que si un paciente está adecuadamente tratado mediante una terapia con un inhibidor de la angiogénesis se determina en términos de si la supervivencia libre de progresión o supervivencia general ha mejorado.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, en el que el inhibidor de la angiogénesis se administra con uno o más agentes seleccionados entre el grupo que consiste en taxanos, interferón alfa, 5-fluorouracilo, capecitabina, leucovorina, gemcitabina, erlotinib y agentes quimioterapéuticos basados en el platino.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el cáncer es cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer colorectal, cáncer de mama o cáncer de pulmón. ESUMEN La invención se refiere a un método para determinar si un paciente está tratado más adecuadamente por una terapia con un inhibidor de la angiogénesis , como bevacizumab, mediante la determinación del genotipo del gen VEGFR-l. La invención está relacionada además con una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de la angiogénesis, como bevacizumab, para el tratamiento de un paciente que padece cáncer basado en el genotipo del gen VEGFR-l. La invención está relacionada además con un método para mejorar el efecto del tratamiento de la quimioterapia de un paciente que padece cáncer mediante la adición de un inhibidor de la angiogénesis, como bevacizumab, basado en el genotipo del gen VEGFR-l.