KR20140096073A

KR20140096073A - 혈관신생 억제제에 대한 반응성

Info

Publication number: KR20140096073A
Application number: KR1020147013725A
Authority: KR
Inventors: 피터 카멜리엣; 하스 산느 리스벳 드; 디더 람브레슈츠; 스테판 쉐러
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게; 라이프 사이언시즈 리써치 파트너즈 브이지더블유; 브이아이비 브이지더블유
Priority date: 2011-11-23
Filing date: 2012-11-19
Publication date: 2014-08-04
Also published as: MX2014006186A; SG11201402554SA; AU2012342682A8; CN104066852A; ZA201403447B; AR088939A1; US20150004136A1; JP2014533956A; AU2012342682A1; WO2013076029A1; IL232573A0; EP2783015A1; CA2854568A1; US20170066822A1; RU2014123166A; NZ624442A

Abstract

본 발명은 VEGFR-1 유전자의 유전자형을 결정함으로써, 베바시주맙과 같은 혈관신생 억제제를 사용한 치료에 의해 환자가 보다 적절하게 치료되는지를 결정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 VEGFR-1 유전자의 유전자형에 근거하여 암을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한, 베바시주맙과 같은 혈관신생 억제제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 VEGFR-1 유전자의 유전자형에 근거하여, 베바시주맙과 같은 혈관신생 억제제를 첨가함으로써 암을 앓고 있는 환자의 화학요법의 치료 효과를 개선하는 방법에 관한 것이다.

Description

혈관신생 억제제에 대한 반응성{RESPONSIVENESS TO ANGIOGENESIS INHIBITORS}

본 발명은 어떤 환자가 항암제 치료로부터 가장 이익을 얻을 것인지를 확인하고, 항암제 치료에 대한 민감성 및 반응성에 대해 환자를 모니터링하는 방법에 관한 것이다.

혈관신생은 암 발생과 같은 양성 및 악성 질환에 원인이 되며, 특히 암에서, 원발성 종양 성장, 침습 및 전이에 필수적이다. 성장하기 위해, 종양은 혈관신생 전환(angiogenic switch)이 일어나야 한다. 상기 혈관신생 전환을 유도하기 위해서는 혈관 내피 성장 인자(VEGF, vascular endothelial growth factor)가 필요하다. VEGF 및 VEGF 경로내 유전자는 암 진행의 중요한 매개인자로 간주된다. VEGF 유전자족은, 태반 성장 인자(PlGF), VEGFB, VEGFC, VEGFD를 포함한, VEGF에 대한 동족체인, VEGFA로도 지칭되는 VEGF 유전자; VEGFR-1 및 VEGFR-2(각각 FLT1 및 FLK1/KDR로도 지칭된다)를 포함한 VEGF 수용체; 저산소증 유도 인자 HIF1α, HIF2α를 포함한 VEGF 유도인자; 및 산소 센서 PHD1, PHD2 및 PHD3을 포함한다.

암세포 성장 및 전이에서 상기 경로의 중요성은 암치료에 사용하기 위한 항-혈관신생제의 개발을 이끌었다. 상기 치료는, 특히 베바시주맙, 페가프타닙, 수니티닙, 소라페닙 및 바탈라닙을 포함한다. 베바시주맙과 같은 혈관신생 억제제를 사용하여 달성된 상당히 연장된 생존기간에도 불구하고, 환자들은 여전히 암으로 쓰러지고 있다. 또한, 모든 환자가 혈관신생 억제제 치료에 반응하는 것은 아니다. 비-반응성의 기초가 되는 메카니즘은 알려지지 않고 있다. 게다가, 혈관신생 억제제 치료는 위장 천공, 혈전증, 출혈, 고혈압 및 단백뇨와 같은 부작용과 관련된다.

따라서, 어떤 환자가 혈관신생 억제제 치료에 특히 잘 반응하는지를 결정하는 방법이 요구된다.

WO 2011/015348 호에는 VEGFR-1 유전자의 하나 이상의 변이 대립유전자가 항-혈관신생 치료의 개선된 결과와 연관되는 것으로 기술되었다. WO 2011/015348 호에 개시된 SNP 중에는 rs9554316, rs9582036, rs9513070 및 rs9554320이 있는 한편, 다른 SNP들은 연관 불균형(linkage disequilibrium)에 의해 확인되므로 상기 4개의 SNP와 관련된다.

연관 불균형에 의해 확인되고 WO 2011/015348 호에 개시된 SNP들 중 하나는 베바시주맙(bevacizumab)과 같은 혈관신생 억제제의 치료 결과에 대한 예측 바이오마커로서 특히 유용한 것으로 밝혀졌다.

그러므로, 본 발명은 위치 1213에서 티로신에 대한 TAT 코돈 및 TAC 코돈에 각각 상응하는 VEGFR-1의 엑손 28에 위치한 동의(synonymous) T/C SNP에서의 유전자형을 결정함으로써, 베바시주맙과 같은 혈관신생 억제제를 사용한 치료에 의해 환자가 더 또는 덜 적절하게 치료되는지를 결정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 암을 앓고 있으며 위치 1213에서 티로신에 대한 TAT 코돈 및 TAC 코돈에 각각 상응하는 VEGFR-1의 엑손 28에 위치한 동의 T/C SNP에서 개선된 치료 효과와 연관되는 유전자형을 갖는 환자의 치료를 위한, 베바시주맙과 같은 혈관신생 억제제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 위치 1213에서 티로신에 대한 TAT 코돈 및 TAC 코돈에 각각 상응하는 VEGFR-1의 엑손 28에 위치한 동의 T/C SNP에서의 유전자형에 근거하여, 베바시주맙과 같은 혈관신생 억제제를 첨가함으로써 암을 앓고 있는 환자의 화학요법의 치료 효과를 개선하는 방법에 관한 것이다.

1. 정의

용어 "투여하는"은 환자에게 약학 조성물, 예를 들면, 혈관신생 억제제의 투여를 의미한다. 예를 들면, 2.5 내지 15 mg/kg 체중의 베바시주맙(아바스틴(Avastin, 등록상표))을, 치료되는 암의 유형에 따라, 매주, 2주마다 또는 3주마다 투여할 수 있다. 특정 투여량은 5, 7.5, 10 및 15 mg/kg을 포함한다. 보다 더 특정한 투여량은 2주마다 5 mg/kg, 2주마다 10 mg/kg 및 3주마다 15 mg/kg이다.

본 발명에 있어서, 용어 "혈관신생 억제제"는 혈관신생(예를 들면, 혈관 형성 과정)을 변화시키는 모든 약제를 말하며, 종양 혈관신생을 포함하나 이로 한정되지는 않는 혈관신생을 억제하는 약제를 포함한다. 이와 관련하여, 억제는 혈관 생성을 차단하고, 혈관의 성장을 중단시키거나 지연시키는 것을 말할 수 있다. 혈관신생 억제제의 예로는 베바시주맙(bevacizumab)(아바스틴(등록상표)으로도 알려져 있다), 페가프타닙(pegaptanib), 수니티닙(sunitinib), 소라페닙(sorafenib) 및 바탈라닙(vatalanib)이 포함된다. 베바시주맙은 시험관내 및 생체내 분석 시스템에서 인간 VEGFA에 결합하여 그의 생물 활성을 억제하는 재조합 인간화 단클론성 IgG1 항체이다. 용어 "베바시주맙"은 미국, 유럽 및 일본으로 이루어진 국가들의 군에서 선택된 국가 또는 지역에서 동일 제품 또는 바이오시밀러(biosimilar) 제품으로서 시판 허가를 받기 위해 필수적인 조건들을 충족시키는 모든 상응하는 항-VEGF 항체를 포함한다. 본 발명에 있어서, 혈관신생 억제제는 필수적으로 베바시주맙과 VEGF상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 보다 특히 베바시주맙과 VEGF 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 2개의 항체가 동일하거나 또는 입체적으로 중첩되는 에피토프를 인식하는 경우, 항체는 기준 항체와 "필수적으로 동일한 에피토프"에 결합한다. 2개의 에피토프가 동일하거나 또는 입체적으로 중첩되는 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위한 가장 널리 사용되고 신속한 방법은 경쟁 분석법으로서, 상기 분석법은 표지된 항원 또는 표지된 항체를 사용하여 많은 상이한 포맷으로 구성될 수 있다. 통상적으로, 항원은 96-웰 플레이트 상에 고정화되며, 표지된 항체의 결합을 차단하는 비표지된 항체의 능력은 방사성 또는 효소 표지를 사용하여 측정된다.

용어 "암"은 전형적으로 제어되지 않는 세포 증식을 특징으로 하는, 포유동물에서의 생리학적 상태를 말한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 상기 암의 보다 특정한 예로는 다음이 포함된다: 편평세포암, 폐암(소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암 및 폐의 편평상피암 포함), 복막암, 간세포암, 위암(위장암 포함), 췌장암(전이성 췌장암 포함), 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암(liver cancer), 방광암, 간암(hepatoma), 유방암(국소 진행성, 재발성 또는 전이성 HER-2 음성 유방암 포함), 결장암, 대장암, 자궁내막암 또는 자궁암, 침샘암, 신장암 또는 신세포암, 간암, 전립선암, 외음암, 갑상선암, 간 암종 및 다양한 유형의 두경부암 뿐 아니라, B-세포 림프종(저등급/여포성 비-호지킨(non-Hodgkin) 림프종(NHL); 소림프구성(SL) NHL; 중간 등급/여포성 NHL; 중간 등급 확산성 NHL; 고등급 면역모세포성 NHL; 고등급 림프모구성 NHL; 고등급 소 비-분할 세포 NHL; 거대(bulky) 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's Macroglobulinemia) 포함); 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프모구성 백혈병(ALL); 모양 세포성 백혈병; 만성 림프모구성 백혈병; 및 이식후 림프증식성 질환(PTLD), 및 모반증과 관련된 이상 혈관 증식, 부종(예를 들면, 뇌종양과 관련된 부종), 및 메이그스(Meigs) 증후군.

"생리학적 또는 병리학적 혈관신생 이상"의 예로는 안 질환, 예를 들면, 연령관련 황반 변성(age-related macular degeneration, AMD), 고등급 신경교종, 교모세포종, 렌두-오슬러(M. Rendu-Osler) 질환, 폰-히펠-린다우(von-Hippel-Lindau) 질환, 혈관종, 건선, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 안구내 신혈관형성, 류마티스성 관절염, 자궁내막염, 죽상동맥경화증, 심근허혈, 말초허혈, 뇌허혈 및 상처 치유가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.

용어 "화학치료제" 또는 "화학치료요법"은 항암 치료 효과를 제공할 수 있고 화학 약제 또는 생물 약제일 수 있는 임의의 활성 약제, 특히 암 또는 종양 세포를 저해할 수 있는 임의의 활성 약제를 포함한다. 특정 활성 약제는 악성 세포의 발생, 성숙 또는 증식을 억제하거나 방지하는 항-신생물(화학독성 또는 화학물질환경조절) 약제로 작용하는 것들이다. 화학치료제의 예로는 다음이 포함된다: 알킬화제, 예를 들면, 질소 머스타드(예, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란 및 클로람부실), 니트로소우레아(예, 카무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU) 및 세무스틴(메틸-CCNU)), 에틸렌이민/메틸멜라민(예, 트라이에틸렌멜라민(TEM), 트라이에틸렌, 티오포스포르아미드(티오테파), 헥사메틸멜라민(HMM, 알트레타민)), 알킬 설포네이트(예, 부설판) 및 트라이아진(예, 다카바진(DTIC)); 항대사물질, 예를 들면, 폴산 유사체(예, 메토트렉세이트, 트라이메트렉세이트), 피리미딘 유사체(예, 5-플루오로우라실, 카페시타빈, 플루오로데옥시우리딘, 겜시타빈, 시토신 아라비노시드(AraC, 시타라빈), 5-아자시티딘, 2,2'-다이플루오로데옥시시티딘), 및 퓨린 유사체(예, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 아자티오프린, 2'-데옥시코포마이신(펜토스타틴), 에리트로하이드록시노닐아데닌(EHNA), 플루다라빈 포스페이트, 및 2-클로로데옥시아데노신(클라드리빈, 2-CdA)); 천연 산물로부터 개발된 항유사분열 약물(예, 파클리탁셀, 빈카 알칼로이드(예, 빈블라스틴(VLB), 빈크리스틴 및 비노렐빈), 도세탁셀, 에스트라무스틴 및 에스트라무스틴 포스페이트), 에피포도필로톡신(예, 에토포시드, 테니포시드), 항생물질(예, 액티노마이신 D, 다우노마이신(루비도마이신), 다우노루비콘, 독소루비신, 에피루비신, 미토잔트론, 이다루비신, 블레오마이신, 플리카마이신(미트라마이신), 미토마이신 C, 액티노마이신), 효소(예, L-아스파라기나제), 및 생물 반응 조절제(예, 인터페론-알파, IL-2, G-CSF, GM-CSF); 백금 배위 착물을 포함하는 복합제(miscellaneous agent)(예, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴), 안트라센디온(예, 미토잔트론), 치환된 우레아(즉, 하이드록시우레아), 메틸하이드라진 유도체(예, N-메틸하이드라진(MIH), 프로카바진), 부신피질 억제제(예, 미토테인(o,p'-DDD), 아미노글루테티미드); 호르몬 및 부신피질스테로이드 길항물질을 포함한 길항물질(예, 프레드니손 및 등가물, 덱사메타손, 아미노글루테티미드), 프로게스틴(예, 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트), 에스트로겐(예, 다이에틸스틸베스트롤, 에티닐 에스트라디올 및 그의 등가물); 항에스트로겐(예, 타목시펜), 안드로겐(예, 테스토스테론 프로피오네이트, 플루옥시메스테론 및 그의 등가물), 항안드로겐(예, 플루타미드, 고나도트로핀-방출 호르몬 유사체, 류프롤리드) 및 비-스테로이드성 항안드로겐(예, 플루타미드), 상피세포 성장 인자 억제제(예, 에를로티닙, 라파티닙, 게피티닙), 항체(예, 트라스투주맙), 이리노테칸, 및 류코보린과 같은 기타 약제. 전이성 췌장암의 치료를 위해, 베바시주맙과 함께 투여하기 위한 화학치료제로는 겜시타빈 및 에를로티닙 및 그의 혼합물이 포함된다(또한 본원에 제공된 실시예 참조). 신세포암의 치료를 위해, 베바시주맙과 함께 투여하기 위한 화학치료제로는 인터페론 알파가 포함된다(또한 본원에 제공된 실시예 참조).

용어 "대립유전자"는 해당 유전자의 뉴클레오티드 서열 변이체를 말한다.

용어 "유전자형"은 개체 또는 샘플에 함유된 유전자의 대립유전자의 표현을 말한다. 본 발명의 맥락에서, 개체의 유전자형과 개체로부터 수득된 샘플의 유전자형 사이에는 차이가 없다. 전형적으로 유전자형은 2배체 세포의 샘플로부터 결정되지만, 유전자형은 정자 세포와 같은 반수체 세포의 샘플로부터 결정될 수 있다.

용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용되며, 2개 이상, 바람직하게는 3개보다 많은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로 이루어진 분자를 말한다. 그의 정확한 크기는 많은 요인들에 따라 달라질 것이며, 상기 요인들은 올리고뉴클레오티드의 최종 기능 또는 용도에 따라 달라진다. 올리고뉴클레오티드는 합성적으로 또는 클로닝에 의해 유도될 수 있다. 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드의 키메라도 또한 본 발명의 범위에 속할 수 있다.

용어 "다형성"은 개체군내 유전자의 2개 이상의 유전적으로 결정된 대체 서열의 발생을 말한다. 전형적으로, 첫번째 확인된 대립유전자 형태는 기준 형태로서 임의로 지정되고, 다른 대립유전자 형태는 대체 또는 변이 대립유전자로서 지정된다. 선택된 개체군에서 가장 흔히 나타나는 대립유전자 형태는 때때로 야생형으로도 지칭된다.

용어 "단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism)" 또는 "SNP"는 대립유전자 사이에서 변화되는 1개 뉴클레오티드의 부위이다. 단일 뉴클레오티드 다형성은 유전자의 임의 영역에서 일어날 수 있다. 일부 경우에서, 다형성은 단백질 서열에 변화를 야기할 수 있다. 단백질 서열에서의 상기 변화는 단백질 기능에 영향을 미치거나 미치지 않을 수 있다.

용어 "환자"는 치료가 바람직한 임의의 단일 동물, 보다 특히는 포유동물(예를 들면, 개, 고양이, 말, 토끼, 동물원 사육동물, 소, 돼지, 양 및 비-인간 영장류와 같은 비-인간 동물 포함)을 말한다. 보다 더 특히, 본원에서 환자는 인간이다. 본 발명의 맥락에서, 환자는 백인 대상자일 수 있다.

용어 "대상자"는 본원에서 혈관신생 질환의 하나 이상의 징후, 증상 또는 다른 지표를 경험하고 있거나 경험했던, 치료 대상이 되는, 환자를 포함한 임의의 단일 인간 대상자이다. 대상자로서 질환의 어떤 임상 증상도 나타내지 않는 임상 연구 실험에 포함된 임의의 대상자, 또는 역학적 연구에 포함된 대상자, 또는 대조군으로서 한번 참가한 대상자가 포함된다. 상기 대상자는 항암제로 이미 치료받았을 수 있거나, 치료되지 않았을 수 있다. 상기 대상자는 본원의 치료가 시작될 때 사용되고 있는 추가의 약제(들)을 접하지 않았을 수 있다, 즉, 상기 대상자는, 예를 들면, "기준선"(즉, 본원의 치료 방법에서 첫번째 용량의 항암제 투여전 설정 시점, 예를 들면, 치료가 개시되기전 대상자를 선별하는 날)에서, 항-신생물제, 화학치료제, 성장 억제제, 세포독성제로 미리 치료되지 않았을 수 있다. 상기 "무경험" 대상자는 일반적으로 상기 추가의 약제(들)에 의한 치료에 후보인 것으로 간주된다.

용어 "앓고 있는 환자"는 암과 같은 특정 악성 질환, 생리학적 및 병리학적 혈관신생을 수반하는 질환 및/또는 종양성 질환과 관련된 임상 증상을 나타내는 환자를 말한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "치료법" 또는 "치료"는 치료되는 개체 또는 세포의 자연적 과정을 변화시키기 위한 시도의 임상적 개입을 말하며, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적 병리학적 결과의 경감, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함한다.

용어 "치료 효과"는 용어 "전체 생존기간" 및 "무진행 생존기간"을 포함한다.

용어 "전체 생존기간"은 치료 중 및 치료 후 환자가 생존하는 시간의 길이를 말한다. 숙련된 자가 인지하듯이, 환자가 또다른 환자 소집단과 비교하여 통계학적으로 의미있는 더 긴 평균 생존 시간을 갖는 환자 소집단에 속하는 경우에, 환자의 전체 생존기간은 개선되거나 향상된다.

용어 "무진행 생존기간"은 주치의 또는 연구자의 평가에 따라 환자의 질환이 악화되지 않는, 즉, 진행하지 않는 치료 중 및 치료 후 시간 길이를 말한다. 숙련된 자가 인지하듯이, 환자가 유사한 상황의 환자들로 이루어진 대조군의 평균 무진행 생존 시간에 비해 질환이 진행하지 않는 더 긴 시간 길이를 갖는 환자의 소집단에 속하는 경우 환자의 무진행 생존기간은 개선되거나 향상된다.

용어 "약학 조성물"은 약제의 생물 활성이 효과적이 되게 하기 위한 형태이며, 제형이 투여될 대상자에게 허용될 수 없을 정도로 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 멸균 제제를 말한다.

2. 상세한 태양

본 발명에서, VEGFR-1 유전자에서의 rs7993418은 혈관신생 억제제를 사용한 치료에 대해 전체 생존기간(OS) 및/또는 무진행 생존기간(PFS)에 대한 마커 또는 예측 바이오마커로서 확인되었다. 용어 "마커" 및 "예측 바이오마커"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 유전자의 특정 대립유전자 변이체를 말한다. 상기 변이 또는 마커는 또한 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)으로도 지칭될 수 있다. VEGFR-1의 SNP 뿐 아니라 아미노산 및 핵산에 대한 서열 정보는 각각의 참조/등록 번호, 예를 들면, rs7993418, NP_002010 및 NM_002019를 사용하여 NCB1 웹사이트에서 시용가능하다. rs7993418의 서열 정보는 표 1에 추가로 나와 있다. 본 발명에 있어서, 용어 "VEGFR-1"은 또한 그의 변이체 및/또는 이소폼(isoform)을 포함한다.

[표 1]

본 발명의 방법에 따라서, 베바시주맙을 사용한 2가지 3상(Phase III) 시험, 즉, AVITA(췌장암, 문헌 [Van Cutsem, J. Clin. Oncol. 27:2231-2237 (2009)] 참조) 및 AVOREN(신세포암, 문헌 [Escudier et al., Lancet 370:2103 (2007)] 참조)으로부터 얻은 샘플을 이용하여, VEGFR-1의 SNP를 분석하였다.

실시예에서 보이는 바와 같이, VEGFR-1에서의 rs7993418 SNP는 4개의 태깅(tagging) SNP, 즉, rs9554316, rs9582036, rs9513070 및 rs9554320으로 대표되는 VEGFR-1 유전자좌와 AVITA로부터의 베바시주맙-치료 환자에서의 PFS 및 OS 사이의 연관성의 기초가 되는 기능적 변이체로서 확인되었다. 또한, rs7993418은 AVOREN의 베바시주맙-치료 환자에서 PFS와 상관되었다(대립유전자당 HR = 1.8, P=0.033). 위약 대상자에서는 어떤 효과도 나타나지 않아서(대립유전자당 HR = 1.8, P=0,49), rs7993418이 베바시주맙 치료에 의한 유리한 결과에 대한 예측 마커로 작용할 수 있음을 시사하였다.

따라서, 본 발명은, 암을 앓고 있는 환자가 베바시주맙 또는 필수적으로 베바시주맙과 VEGF 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 혈관신생 억제제를 사용한 치료에 의해 적절히 치료되는지를 결정하는 시험관내 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:

(a) 암을 앓고 있는 환자로부터 얻은 샘플에서, 위치 1213에서 티로신에 대한 TAT 코돈 및 TAC 코돈에 각각 상응하는 VEGFR-1의 엑손 28에 위치한 동의 T/C SNP에서의 유전자형을 결정하고,

(b) 상기 유전자형에 근거하여, 베바시주맙 또는 필수적으로 베바시주맙과 VEGF 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 혈관신생 억제제를 사용한 치료에 의해 환자가 더 또는 덜 적절하게 치료되는 것을 확인하되, 이때 상기 SNP에서의 각각의 T 대립유전자의 존재는 상기 환자가 더 적절하게 치료될 증가된 가능성을 나타내거나, 또는 상기 SNP에서의 각각의 C 대립유전자의 존재는 상기 환자가 덜 적절하게 치료될 증가된 가능성을 나타낸다. 한 태양에서, 상기 방법은 혈관신생 억제제를 사용한 치료에 의해 환자를 치료하는 것을 또한 포함한다.

보다 특히, 본 발명은, 환자가 베바시주맙 또는 필수적으로 베바시주맙과 VEGF 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 혈관신생 억제제를 사용한 치료에 의해 적절히 치료되는지를 결정하는 시험관내 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:

(b) 상기 유전자형에 근거하여, 베바시주맙 또는 필수적으로 베바시주맙과 VEGF 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 혈관신생 억제제를 사용한 치료에 의해 환자가 더 또는 덜 적절하게 치료되는 것을 확인하되, 이때 상기 SNP에서의 TT 또는 TC 유전자형의 존재는 상기 환자가 상기 SNP에서 CC 유전자형을 갖는 환자보다 더 적절하게 치료될 증가된 가능성을 나타내거나, 또는 상기 SNP에서의 CC 유전자형의 존재는 상기 환자가 상기 SNP에서 TT 또는 TC 유전자형을 갖는 환자보다 덜 적절하게 치료될 증가된 가능성을 나타내거나, 또는

(b') 상기 유전자형에 근거하여, 베바시주맙 또는 필수적으로 베바시주맙과 VEGF 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 혈관신생 억제제를 사용한 치료에 의해 환자가 더 또는 덜 적절히 치료되는 것을 확인하되, 이때 상기 SNP에서의 TT 유전자형의 존재는 상기 환자가 상기 SNP에서 TC 또는 CC 유전자형을 갖는 환자보다 더 적절하게 치료될 증가된 가능성을 나타내거나, 또는 상기 SNP에서의 TC 또는 CC 유전자형의 존재는 상기 환자가 상기 SNP에서 TT 유전자형을 갖는 환자보다 덜 적절하게 치료될 증가된 가능성을 나타낸다. 한 태양에서, 상기 방법은 혈관신생 억제제를 사용한 치료에 의해 환자를 치료하는 것을 또한 포함한다.

본 발명은 또한, 다음을 포함하는 시험관내 방법에 의해 혈관신생 억제제로 더 적절히 치료되는 것으로 확인된, 암을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한, 베바시주맙 또는 필수적으로 베바시주맙과 VEGF 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 혈관신생 억제제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다:

(b) 상기 유전자형에 근거하여, 베바시주맙 또는 필수적으로 베바시주맙과 VEGF 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 혈관신생 억제제를 사용한 치료에 의해 환자가 더 또는 덜 적절하게 치료되는 것을 확인하되, 이때 상기 SNP에서의 각각의 T 대립유전자의 존재는 상기 환자가 더 적절하게 치료될 증가된 가능성을 나타내거나, 또는 상기 SNP에서의 각각의 C 대립유전자의 존재는 상기 환자가 덜 적절하게 치료될 증가된 가능성을 나타낸다.

보다 특히, 본 발명은, 다음을 포함하는 시험관내 방법에 의해 혈관신생 억제제로 더 적절히 치료되는 것으로 확인된, 치료를 필요로 하는 환자를 치료하기 위한, 베바시주맙 또는 필수적으로 베바시주맙과 VEGF 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 혈관신생 억제제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다:

(b') 상기 유전자형에 근거하여, 베바시주맙 또는 필수적으로 베바시주맙과 VEGF 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 혈관신생 억제제를 사용한 치료에 의해 환자가 더 또는 덜 적절히 치료되는 것을 확인하되, 이때 상기 SNP에서의 TT 유전자형의 존재는 상기 환자가 상기 SNP에서 TC 또는 CC 유전자형을 갖는 환자보다 더 적절하게 치료되는 것을 나타내거나, 또는 상기 SNP서의 TC 또는 CC 유전자형의 존재는 상기 환자가 상기 SNP에서 TT 유전자형을 갖는 환자보다 덜 적절하게 치료될 증가된 가능성을 나타낸다.

본 발명은 또한, 베바시주맙 또는 필수적으로 베바시주맙과 VEGF 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 혈관신생 억제제를 첨가함으로써 암을 앓고 있는 환자의 화학치료제 또는 화학치료요법의 치료 효과를 개선하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:

(b) 상기 유전자형에 근거하여, 베바시주맙 또는 필수적으로 베바시주맙과 VEGF 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 혈관신생 억제제의 첨가에 의해 환자가 더 적절히 치료되는 것을 확인하되, 이때 상기 SNP에서의 각각의 T 대립유전자의 존재는 상기 환자가 더 적절하게 치료될 증가된 가능성을 나타내고;

(c) 상기 혈관신생 억제제를 화학치료제 또는 화학치료요법과 함께, 상기 (b)에 따라 더 적절히 치료되는 것으로 확인된 환자에게 투여한다.

보다 특히, 본 발명은, 베바시주맙 또는 필수적으로 베바시주맙과 VEGF 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 혈관신생 억제제를 첨가함으로써 암을 앓고 있는 환자의 화학치료제 또는 화학치료요법의 치료 효과를 개선하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:

(b') 상기 유전자형에 근거하여, 베바시주맙 또는 필수적으로 베바시주맙과 VEGF 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 혈관신생 억제제를 사용한 치료에 의해 환자가 더 또는 덜 적절하게 치료되는 것을 확인하되, 이때 상기 SNP에서의 TT 유전자형의 존재는 상기 환자가 상기 SNP에서 TC 또는 CC 유전자형을 갖는 환자보다 더 적절하게 치료될 증가된 가능성을 나타내거나, 또는 상기 SNP에서의 TC 또는 CC 유전자형의 존재는 상기 환자가 상기 SNP에서 TT 유전자형을 갖는 환자보다 덜 적절하게 치료될 증가된 가능성을 나타내며;

(c) 상기 혈관신생 억제제를 화학치료제 또는 화학치료요법과 함께, 상기 (b) 또는 (b')에 따라 더 적절히 치료되는 것으로 확인된 환자에게 투여한다.

한 태양에서, 환자가 혈관신생 억제제를 사용한 치료에 의해 적절히 치료되는지 여부는 PFS 또는 OS가 개선되는지, 보다 특히는 PFS가 개선되는지의 관점에서 결정된다.

한 태양에서, 암은 대장암, 교모세포종, 신세포암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위암 및 폐암으로 이루어진 군에서, 보다 특히 신세포암 및 췌장암으로 이루어진 군에서 선택된다.

한 태양에서, 환자는 생리학적 또는 병리학적 혈관신생 이상으로 진단된 환자일 수 있다.

한 태양에서, 혈관신생 억제제는 화학치료제 또는 화학치료요법과 병행-치료(co-treatment)로서 투여된다. 다른 태양에서, 혈관신생 억제제는 도세탁셀 및 파클리탁셀과 같은 탁산, 인터페론 알파, 5-플루오로우라실, 류코보린, 겜시타빈, 에를로티닙 및 백금-기재 화학치료제, 예를 들어, 카보플라틴, 시스플라틴 및 옥살리플라틴으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 약제와 함께 투여된다. 보다 특히, 혈관신생 억제제는 겜시타빈-에를로티닙 및 인터페론 알파로 이루어진 군에서 선택된 화학치료제 또는 화학치료요법과 병행-치료로서 투여된다. 또한, 혈관신생 억제제는 방사선치료와 병행-치료로서 투여될 수 있다.

본 발명에 있어서, 샘플은 생물 샘플이며, 혈액 및/또는 조직 샘플일 수 있다. 한 태양에서, 샘플은 혈액 샘플, 보다 특히는 말초혈 샘플이다. 본 발명의 맥락에서, 샘플은 DNA 샘플이다. DNA 샘플은 생식세포 DNA 또는 체세포 DNA, 보다 특히 생식세포 DNA일 수 있다.

한 태양에서, 유전자형은 MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 결정된다. 하기에서 SNP의 검출에 대한 상세한 설명 이외에, 하기 참조문헌, 예를 들면, 문헌 [Storm et al., Methods Mol. Biol. 212:241-262 (2003)]은 MALDI-TOF 질량 분석법-기초 SNP 유전자형분석에 대한 지침을 제공한다.

3. 핵산 다형성의 검출

SNP의 존재에 대해 핵산을 평가하기 위한 검출 기술은 분자 유전학 분야에서 공지되어 있는 절차들을 포함한다. 상기 방법들의 전부는 아니지만 많은 방법들이 핵산의 증폭을 포함한다. 증폭을 수행하기 위한 충분한 지침이 당해 분야에 제공되어 있다. 대표적인 참조문헌들로는 문헌 [PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (ed. H.A. Erlich, Freeman Press, NY, N.Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, 1994-1999, including supplemental updates through April 2004; Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd Ed, 2001)]과 같은 매뉴얼들이 포함된다. 단일 뉴클레오티드 다형성의 검출을 위한 일반적인 방법들은 문헌 [Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols, Pui-Yan Kwok, ed., Humana Press (2003)]에 개시되어 있다.

상기 방법들은 전형적으로 PCR 단계들을 사용하지만, 다른 증폭 프로토콜도 또한 사용될 수 있다. 적합한 증폭 방법으로는 리가제 쇄 반응(예를 들면, 문헌 [Wu & Wallace, Genomics 4:560-569 (1988)] 참조); 가닥 치환 분석법(예를 들면, 문헌 [Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396 (1992)]; 미국 특허 제 5,455,166 호 참조); 및 미국 특허 제 5,437,990; 5,409,818; 및 5,399,491 호에 기술된 방법을 포함하여 여러 전사-기초 증폭 시스템; 전사 증폭 시스템(TAS)[Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177 (1989)]; 및 자가-지속 서열 복제(3SR)(문헌 [Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878 (1990)]; WO 92/08800 호)가 포함된다. 또는, 프로브를 검출가능한 수준으로 증폭시키는 방법, 예를 들면, Qβ-레플리카제 증폭을 이용할 수 있다[Kramer & Lizardi, Nature 339:401-402 (1989); Lomeli et al., Clin. Chem. 35:1826-1831 (1989)]. 공지되어 있는 증폭 방법에 대한 개관은, 예를 들면, 문헌 [Abramson and Myers, Current Opinion in Biotechnology 4:41-47 (1993)]에 제공되어 있다.

개체의 유전자형, 반수체형(haplotype), SNP, 미세부수체(microsatellite) 또는 다른 다형성의 검출은 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 프로브를 사용하여 수행할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 임의의 적합한 방법, 통상적으로 화학 합성에 의해 제조될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 상업적으로 시판되는 시약 및 기기들을 사용하여 합성될 수 있다. 또는, 이들은 상업적 공급원으로부터 구입할 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 [Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99 (1979); Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151 (1979); Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 (1981)]; 및 미국 특허 제 4,458,066 호의 고체 지지체 방법 참조). 또한, 합성된 올리고뉴클레오티드와 관련된 효소 작용에 바람직하게 영향을 미치기 위해 전술한 합성 방법에 대한 변형을 이용할 수 있다. 예를 들면, 변형된 포스포다이에스터 결합(예, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포아미데이트 또는 보라노포스페이트), 또는 인산 유도체가 아닌 다른 결합의 올리고뉴클레오티드 내로의 혼입을 이용하여 선택된 부위에서의 절단을 방지할 수 있다. 또한, 2'-아미노 변형된 당의 사용은, 또한 새로운 핵산 가닥의 합성을 위한 주형인 핵산에 하이브리드화될 때 올리고뉴클레오티드의 절단 동안 치환을 유리하게 하는 경향이 있다.

개체의 유전자형은 당해 분야에 공지되어 있는 많은 검출 방법들을 이용하여 측정될 수 있다. 대부분의 분석법들은 여러 일반적 프로토콜 중 하나를 수반한다: 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드를 사용한 하이브리드화, 프라이머 연장, 대립유전자-특이적 접합, 서열분석, 또는 전기영동 분리 기술, 예를 들면, 단일-가닥 구조 다형성(SSCP, single-stranded conformational pholymorphism) 및 이형2중가닥(heteroduplex) 분석. 대표적인 분석법으로는 5'-뉴클레아제 분석법, 주형-유도성 염료-종결인자 혼입, 분자 비콘(molecular beacon) 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 분석법, 단일-염기 연장 분석법, 및 실시간 피로포스페이트 서열에 의한 SNP 스코어링이 포함된다. 증폭된 서열의 분석은 다양한 기술, 예를 들면, 마이크로칩, 형광 편광 분석법 및 MALDI-TOF(매트릭스 이용 레이저 탈착 이온화 - 비행 시간) 질량 분석법을 사용하여 수행될 수 있다. 또한 사용될 수 있는 두가지 방법은 플랩(Flap) 뉴클레아제에 의한 침습성 절단을 기초로 한 분석법 및 자물쇠(padlock) 프로브를 사용하는 방법이다.

특정 대립유전자의 존재 또는 부재의 결정은 일반적으로, 분석될 개체로부터 수득되는 핵산 샘플을 분석함으로써 수행된다. 종종, 핵산 샘플은 게놈 DNA를 포함한다. 게놈 DNA는 전형적으로 혈액 샘플로부터 수득되지만, 또한 다른 세포 또는 조직으로부터도 수득될 수 있다.

다형성 대립유전자의 존재에 대해 RNA 샘플을 분석하는 것도 또한 가능하다. 예를 들면, 하나 이상의 다형성 부위에서 개체의 유전자형을 결정하기 위해 mRNA를 사용할 수 있다. 이 경우, 핵산 샘플은 표적 핵산이 발현되는 세포, 예를 들면, 지방세포로부터 수득된다. 상기 분석은, 먼저, 예를 들면, 바이러스 역전사효소를 사용하여 표적 RNA를 역-전사시킨 다음, 생성된 cDNA를 증폭시킴으로써; 또는 미국 특허 제 5,310,652; 5,322,770; 5,561,058; 5,641,864; 및 5,693,517 호에 기술된 바와 같은 복합 고온 역-전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 이용함으로써 수행될 수 있다.

SNP를 검출하기 위해 핵산 샘플의 분석에 흔히 사용되는 방법을 간략히 기술한다. 그러나, 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 단일 뉴클레오티드 치환의 존재를 검출하기 위해 본 발명에서 사용할 수 있다.

a. 대립유전자-특이적 하이브리드화

흔히 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 하이브리드화(ASO)(예를 들면, 문헌 [Stoneking et al., Am. J. Hum. Genet. 48:70-382 (1991); Saiki et al., Nature 324, 163-166 (1986)]; EP 235,726 호; 및 WO 89/11548 호)로도 지칭되는 이 기술은, 핵산 샘플을 증폭시켜 수득된 증폭된 생성물에 대한 변이체들 중 하나에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 하이브리드화시킴으로써 1개의 염기가 상이한 2개의 DNA 분자 사이의 식별을 필요로 한다. 상기 방법은 전형적으로 짧은, 즉, 15 내지 20개 염기 길이의 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 프로브는 또 다른 변이체에 비해 한 변이체에 차별적으로 하이브리드화되도록 설계된다. 상기 프로브를 설계하기 위한 원리 및 지침은 당해 분야에서, 예를 들면, 본원에 인용된 참조문헌에서 이용가능하다. 하이브리드화 조건은 대립유전자 사이의 하이브리드화 강도에 상당한 차이가 존재하여 필수적으로 2원 반응을 제공하도록 충분히 엄격해야 하며, 이때 프로브는 대립유전자 중 하나에만 하이브리드화된다. 일부 프로브는, 다형성 부위가 프로브의 중심 위치에 맞춰(예를 들면, 7번 위치에서 15개-염기 올리고뉴클레오티드 중에; 8 또는 9번 위치에서 16개-염기 올리고뉴클레오티드 중에) 정렬되도록 표적 DNA의 단편에 하이브리드화되도록 설계되지만, 상기 디자인은 필요하지 않다.

대립유전자의 양 및/또는 존재는 샘플에 하이브리드화되는 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드의 양을 측정함으로써 결정된다. 전형적으로, 상기 올리고뉴클레오티드는 형광성 표지와 같은 표지로 표지화된다. 예를 들면, 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드는 SNP 서열을 나타내는 고정화된 올리고뉴클레오티드에 적용된다. 엄격한 하이브리드화 및 세척 조건 후에, 각 SNP 올리고뉴클레오티드에 대해 형광 강도를 측정한다.

한 태양에서, 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드는 서열-특이적 하이브리드화 조건하에서, 다형성 부위를 포함하는 영역내 다형성 대립유전자 중 하나에 정확하게 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머를 사용한 하이브리드화에 의해 확인된다. 서열을 하이브리드화시키는 프로브 또는 프라이머, 및 서열-특이적 하이브리드화 조건은, 다형성 부위에서의 단일 미스매치가 하이브리드화 이중가닥(duplex)을 충분히 불안정화시켜 상기 이중가닥이 효과적으로 형성되지 못하도록 선택된다. 따라서, 서열-특이적 하이브리드화 조건하에서, 안정한 이중가닥은 프로브 또는 프라이머 및 정확히 상보적인 대립유전자 서열 사이에서만 형성될 것이다. 따라서, 다형성 부위를 포함하는 영역내 대립유전자 서열에 정확히 상보적인, 약 10 내지 약 35개 뉴클레오티드 길이, 통상적으로 약 15 내지 약 35개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 범위에 속한다.

대안적 태양에서, 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드는, 충분히 엄격한 하이브리드화 조건하에서, 다형성 부위를 포함하는 영역내의 SNP 대립유전자 중 하나에 실질적으로 상보적이고 다형성 부위에서의 대립유전자에 정확하게 상보적인 올리고뉴클레오티드를 사용한 하이브리드화에 의해 확인된다. 비-다형성 부위에서 발생하는 미스매치는 두 대립유전자 서열 모두와의 미스매치이므로, 표적 대립유전자 서열에 의해 형성된 이중가닥 및 상응하는 비-표적 대립유전자 서열에 의해 형성된 이중가닥에서의 미스매치 수의 차이는 표적 대립유전자 서열에 정확하게 상보적인 올리고뉴클레오티드를 사용한 경우와 동일하다. 상기 태양에서, 하이브리드화 조건은, 비-표적 서열과의 안정한 이중가닥의 형성을 방지하기에 충분한 엄격성을 유지하면서, 표적 서열과의 안정한 이중가닥의 형성을 허용할만큼 충분히 느슨하다. 상기 충분히 엄격한 하이브리드화 조건하에서, 안정한 이중가닥은 프로브 또는 프라이머와 표적 대립유전자 사이에서만 형성될 것이다. 따라서, 다형성 부위를 포함하는 영역내의 대립유전자 서열에 실질적으로 상보적이고 다형성 부위에서의 대립유전자 서열에 정확하게 상보적인, 약 10 내지 약 35개 뉴클레오티드 길이, 통상적으로 약 15 내지 약 35개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레이티드는 본 발명의 범위에 속한다.

정확하게 상보적인 것보다 실질적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드의 사용이, 하이브리드화 조건의 최적화가 제한받는 분석 포맷에서 바람직할 수 있다. 예를 들면, 전형적인 다중-표적 고정화-올리고뉴클레오티드 분석 포맷에서는, 각 표적에 대한 프로브 또는 프라이머를 단일 고체 지지체 상에 고정화시킨다. 하이브리드화는 고체 지지체를 표적 DNA를 함유하는 용액과 접촉시킴으로써 동시에 수행된다. 모든 하이브리드화가 동일한 조건하에서 수행되므로, 하이브리드화 조건은 각각의 프로브 또는 프라이머에 대해 별도로 최적화되지 않을 수 있다. 분석 포맷이 하이브리드화 조건의 조정을 배제하는 경우 이중가닥 안정성을 조정하기 위해 프로브 또는 프라이머 내로의 미스매치의 혼입을 이용할 수 있다. 이중가닥 안정성에 대한 특정 도입된 미스매치의 영향은 공지되어 있으며, 전술한 바와 같이 이중가닥 안정성은 통상적으로 평가되고 실험적으로 측정될 수 있다. 프로브 또는 프라이머의 정확한 크기 및 서열에 따라 달라지는 적합한 하이브리드화 조건은 본원에 제공되고 당해 분야에 공지되어 있는 지침을 이용하여 실험적으로 선택될 수 있다. 서열중 단일 염기쌍 차이를 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머의 사용은, 예를 들면, 각각 본원에 참고로 인용된 문헌 [Conner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278-282 (1983)], 및 미국 특허 제 5,468,613 및 5,604,099 호에 기술되어 있다.

완벽하게 매치되는 하이브리드화 이중가닥과 단일-염기 미스매치된 하이브리드화 이중가닥 사이에서 안정성의 비례적 변화는 하이브리드화 올리고뉴클레오티드의 길이에 따라 달라진다. 더 짧은 프로브 서열에 의해 형성된 이중가닥은 미스매치의 존재에 의해 비례적으로 더 불안정화된다. 약 15 내지 약 35개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드는 종종 서열-특이적 검출에 사용된다. 또한, 하이브리드화 올리고뉴클레오티드의 말단들은 열 에너지로 인한 연속적인 무작위적 분리 및 재-어닐링이 일어나기 때문에, 어느 한 말단에서의 미스매치는 하이브리드화 이중가닥을 내부적으로 발생하는 미스매치보다 덜 불안정화시킨다. 표적 서열에서의 단일 염기쌍 변화의 식별을 위해, 다형성 부위가 프로브의 내부 영역에 생기도록 표적 서열에 하이브리드화되는 프로브 서열을 선택한다.

특정 대립유전자에 하이브리드화되는 프로브 서열을 선택하기 위한 상기 기준은 프로브의 하이브리드화 영역, 즉, 표적 서열과의 하이브리드화에 수반되는 프로브의 부분에 적용된다. 프로브는, 프로브의 하이브리드화 특성을 별로 변화시키지 않으면서, 프로브를 고정화시키기 위해 사용되는 폴리-T 꼬리와 같은 추가의 핵산 서열에 결합될 수 있다. 당해 분야에 숙련된 자는, 본 발명의 방법에 사용하기 위해, 표적 서열에 상보적이지 않은 추가의 핵산 서열에 결합되고, 따라서 하이브리드화에 수반되지 않는 프로브가 근본적으로 비결합 프로브와 동등함을 인지할 것이다.

프로브와 샘플중 표적 핵산 서열 사이에 형성된 하이브리드를 검출하기에 적합한 분석 포맷은 당해 분야에 공지되어 있으며, 고정화 표적 (점-블롯(dot-blot)) 포맷 및 고정화 프로브 (역상 점-블롯 또는 선-블롯) 분석 포맷을 포함한다. 점 블롯 및 역상 점 블롯 분석 포맷은 미국 특허 제 5,310,893; 5,451,512; 5,468,613; 및 5,604,099 호에 기술되어 있으며, 이들은 각각 본원에 참고로 인용된다.

점-블롯 포맷에서, 증폭된 표적 DNA는 나일론 막과 같은 고체 지지체 상에 고정화된다. 막-표적 복합체는 적합한 하이브리드화 조건하에서 표지된 프로브와 함께 배양되고, 비하이브리드화 프로브는 적절히 엄격한 조건하에서 세척하여 제거되며, 막은 결합 프로브의 존재에 대해 모니터링된다.

역상 점-블롯(또는 선-블롯) 포맷에서는, 프로브가 나일론막 또는 미세적정 플레이트와 같은 고체 지지체 상에 고정화된다. 표적 DNA는 전형적으로 증폭시에 표지된 프라이머의 혼입에 의해 표지화된다. 프라이머중 하나 또는 둘 다가 표지화될 수 있다. 막-프로브 복합체는 적합한 하이브리드화 조건하에서 표지된 증폭된 표적 DNA와 함께 배양되고, 비하이브리드화 표적 DNA는 적절히 엄격한 조건하에서 세척하여 제거되며, 막은 결합된 표적 DNA의 존재에 대해 모니터링된다. 역상 선-블롯 검출 분석법은 실시예에서 기술된다.

다형성 변이체 중 하나에 특이적인 대립유전자-특이적 프로브는 종종 다른 다형성 변이체에 대한 대립유전자-특이적 프로브와 함께 사용된다. 일부 태양에서, 프로브는 고체 지지체 상에 고정화되고 한 개체에서 표적 서열은 두 프로브를 동시에 사용하여 분석된다. 핵산 어레이의 예는 WO 95/11995 호에 기술되어 있다. 동일한 어레이 또는 상이한 어레이를 특성화된 다형성의 분석에 사용할 수 있다. WO 95/11995 호는 또한 미리-특성화된 다형성의 변이체 형태의 검출을 위해 최적화된 서브어레이(subarray)를 기술하고 있다. 상기 서브어레이는 본원에 기술된 다형성의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다.

b. 대립유전자-특이적 프라이머

다형성은 또한 일반적으로 대립유전자-특이적 증폭 또는 프라이머 연장 방법을 이용하여 검출된다. 상기 반응들은 전형적으로 프라이머의 3'-말단에서의 미스매치에 의한 다형성을 특이적으로 표적화하도록 설계된 프라이머의 사용을 포함한다. 미스매치의 존재는 폴리머라제가 오류-정정(error-correcting) 활성이 결여될 때 프라이머를 연장시키는 폴리머라제의 능력에 영향을 미친다. 예를 들면, 대립유전자-특이적 증폭- 또는 연장-기초 방법을 이용하여 대립유전자 서열을 검출하기 위해, 3'-말단 뉴클레오티드가 다형성 위치에서 하이브리드화되도록, 다형성을 갖는 하나의 대립유전자에 상보적인 프라이머를 설계한다. 특정 대립유전자의 존재는 연장을 개시하는 프라이머의 능력에 의해 결정될 수 있다. 3'-말단이 미스매치되는 경우, 연장은 지연된다.

일부 태양에서, 프라이머는 증폭 반응에 제 2의 프라이머와 함께 사용된다. 제 2 프라이머는 다형성 위치와 무관한 부위에서 하이브리드화된다. 증폭은 특정 대립유전자 형태가 존재하는 것을 의미하는 검출가능한 생성물을 유도하는 2개의 프라이머로부터 진행된다. 대립유전자-특이적 증폭- 또는 연장-기초 방법은, 예를 들면, WO 93/22456 호; 미국 특허 제 5,137,806; 5,595,890; 5,639,611; 및 4,851,331 호에 기술되어 있다.

대립유전자-특이적 증폭-기초 유전자형분석을 이용하여, 대립유전자의 확인은 증폭된 표적 서열의 존재 또는 부재의 검출만을 필요로 한다. 증폭된 표적 서열의 검출 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 겔 전기영동 및 기술된 프로브 하이브리드화 분석법은 종종 핵산 존재를 검출하기 위해 사용된다.

대안적인 무-프로브 방법에서는, 증폭된 핵산을 반응 혼합물중 이중-가닥 DNA의 총량의 증가를 모니터링함으로써 검출하며, 예를 들면, 미국 특허 제 5,994,056 호 및 유럽 특허 공보 제 487,218 및 512,334 호에 기술되어 있다. 이중-가닥 표적 DNA의 검출은, 이중-가닥 DNA에 결합될 때 다양한 DNA-결합 염료, 예를 들면, SYBR 그린이 나타내는 증가된 형광에 의존한다.

당해 분야에 속한 자가 인지하듯이, 대립유전자-특이적 증폭 방법은 다중 대립유전자-특이적 프라이머를 사용하여 특정 대립유전자를 표적화하는 반응으로 수행될 수 있다. 상기 다중 적용을 위한 프라이머들은 일반적으로 식별가능한 표지로 표지화되거나, 또는 대립유전자로부터 생성된 증폭 생성물이 크기에 의해 식별되도록 선택된다. 따라서, 예를 들면, 단일 샘플 중 두 대립유전자 모두 증폭 생성물의 겔 분석에 의해 단일 증폭을 이용하여 확인될 수 있다.

대립유전자-특이적 프로브의 경우에서와 같이, 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하이브리드화 영역내 다형성 대립유전자중 하나에 정확하게 상보적일 수 있거나, 또는 올리고뉴클레오티드의 3'-말단 이외의 다른 위치에서 약간의 미스매치를 가질 수 있으며, 상기 미스매치는 두 대립유전자 서열 모두에서 비-다형성 부위에서 일어난다.

c. 검출가능한 프로브

i) 5'-뉴클레아제 분석 프로브

유전자형분석은 또한 미국 특허 제 5,210,015; 5,487,972; 및 5,804,375 호; 및 문헌 [Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7276-7280 (1988)]에 기술된 바와 같이 "TaqMan(등록상표)" 또는 "5'-뉴클레아제 분석법"을 이용하여 수행할 수 있다. TaqMan(등록상표) 분석법에서는, 증폭 영역 내에서 하이브리드화되는 표지된 검출 프로브를 증폭 반응 시에 첨가한다. 프로브는, 프로브가 DNA 합성을 위한 프라이머로 작용하는 것을 방지하도록 변형된다. 증폭은 5'-에서 3'-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 수행된다. 증폭의 각각의 합성 단계 동안, 연장되는 프라이머로부터 하류의 표적 핵산에 하이브리드화되는 임의의 프로브는 DNA 폴리머라제의 5'-에서 3'-엑소뉴클레아제 활성에 의해 분해된다. 따라서, 새로운 표적 가닥의 합성은 또한 프로브의 분해를 야기하며, 분해 산물의 축적은 표적 서열 합성의 척도를 제공한다.

하이브리드화 프로브는 SNP 대립유전자 사이에서 구별되는 대립유전자-특이적 프로브일 수 있다. 또는, 상기 방법은 대립유전자-특이적 프라이머 및 증폭된 생성물에 결합하는 표지된 프로브를 사용하여 수행될 수 있다.

분해 산물을 검출하기에 적합한 임의의 방법을 5'-뉴클레아제 분석법에 사용할 수 있다. 종종, 검출 프로브는 2개의 형광 염료로 표지화되는데, 상기 염료 중 하나는 다른 염료의 형광을 소멸시킬 수 있다. 염료는 프로브에 결합되는데, 통상적으로 하나는 5'-말단에 결합되고, 다른 하나는 내부 부위에 결합되어, 프로브가 비하이브리드화된 상태인 경우 소광이 일어나고, DNA 폴리머라제의 5'-에서 3'-엑소뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단이 두 염료 사이에서 일어난다. 증폭은 소광 및 초기 소광된 염료로부터 관찰할 수 있는 형광의 증가를 동시에 배제하면서 염료 사이에서 프로브의 절단을 야기한다. 분해 산물의 축적은 반응 형광의 증가를 측정함으로써 모니터링된다. 둘 다 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 5,491,063 및 5,571,673 호는 증폭과 함께 일어나는 프로브의 분해를 검출하기 위한 대안적 방법을 기술하고 있다.

ii) 2차 구조 프로브

2차 구조 변화시 검출가능한 프로브도 또한 SNP를 포함한 다형성의 검출에 적합하다. 예시된 2차 구조 또는 스템-루프(stem-loop) 구조 프로브는 분자 비콘 또는 스콜피온(Scorpion, 등록상표) 프라이머/프로브를 포함한다. 분자 비콘 프로브는, 형광단 및 소광제(quencher)가 통상적으로 올리고뉴클레오티드의 반대쪽 말단들 상에 배치되는 머리핀 구조를 형성할 수 있는 단일-가닥 올리고핵산 프로브이다. 프로브의 어느 한쪽 말단에서 짧은 상보성 서열은 분자내 줄기의 형성을 가능하게 하며, 이것은 형광단 및 소광제를 매우 근접시킬 수 있다. 분자 비콘의 루프 부분은 해당 표적 핵산에 상보적이다. 해당 표적 핵산에 대한 상기 프로브의 결합은 줄기를 분리시키는 하이브리드를 형성한다. 이것은 형광단 및 소광제를 서로 멀리 이동시키고 보다 강한 형광 신호를 유도하는 구조 변화를 야기한다. 그러나, 분자 비콘 프로브는 프로브 표적에서의 작은 서열 변이에 매우 민감하다[Tyagi S. and Kramer F.R., Nature Biotechnology, Vol. 14, pages 303-308 (1996); Tyagi et al., Nature Biotechnology, Vol. 16, pages 49-53 (1998); Piatek et al., Nature Biotechnology, Vol. 16, pages 359-363 (1998); Marras S. et al., Genetic Analysis: Biomolecular Engineering, Vol. 14, pages 151-156 (1999); Tpp I. et al., BioTechniques, Vol 28, pages 732-738 (2000)]. 스콜피온(등록상표) 프라이머/프로브는 프라이머에 공유 결합된 스템-루프 구조 프로브를 포함한다.

d. DNA 서열분석 및 단일 염기 연장

SNP는 또한 직접 서열분석에 의해 검출될 수 있다. 방법은, 예를 들면, 디데옥시 서열분석-기초 방법, 및 막삼(Maxam) 및 길버트(Gilbert) 서열(예를 들면, 문헌 Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd Ed, 2001)] 참조)과 같은 다른 방법들을 포함한다.

다른 검출 방법으로는 올리고뉴클레오티드-길이 생성물의 피로서열분석(Pyrosequencing, 등록상표)이 포함된다. 상기 방법은 종종 PCR과 같은 증폭 기술을 사용한다. 예를 들면, 피로서열분석에서, 서열분석 프라이머는 단일 가닥의 PCR-증폭된 DNA 주형에 하이브리드화되고; 효소인 DNA 폴리머라제, ATP 설퍼릴라제, 루시퍼라제 및 아피라제, 및 기질인 아데노신 5' 포스포설페이트(APS) 및 루시페린과 함께 배양된다. 4개 데옥시뉴클레오티드 트라이포스페이트(dNTP) 중 첫번째를 반응에 첨가한다. DNA 폴리머라제는, DNA 가닥이 주형 가닥중의 염기에 상보적인 경우, DNA 가닥내로의 데옥시뉴클레오티드 트라이포스페이트의 혼입을 촉진한다. 각각의 혼입 반응은 혼입된 뉴클레오티드의 양에 동몰량으로 피로포스페이트(PPi)의 방출이 동반된다. ATP 설퍼릴라제는 아데노신 5' 포스포설페이트의 존재하에 PPi를 ATP로 정량적으로 전환시킨다. 상기 ATP는, ATP의 양에 비례하는 양으로 가시광선을 생성하는, 루시페린의 옥시루시페린으로의 루시퍼라제-매개 전환을 유도한다. 루시퍼라제-촉진된 반응에서 생성된 빛은 전하 결합 소자(CCD, charge coupled device) 카메라에 의해 검출되고 피로그램(Pyrogram, 등록상표)에서 피크로서 나타난다. 각각의 광 신호는 혼입된 뉴클레오티드의 수에 비례한다. 뉴클레오티드 분해 효소인 아피라제는 비혼입 dNTP 및 과량의 ATP를 계속적으로 분해한다. 분해가 완료되면, 또 다른 dNTP를 첨가한다.

SNP를 특성화하기 위한 또 다른 유사한 방법은 완전 PCR의 사용을 필요로 하지 않으며, 전형적으로 조사될 뉴클레오티드에 상보적인 단일 형광-표지된 디데옥시리보핵산 분자(ddNTP)에 의한 프라이머의 연장 만을 이용한다. 다형성 부위에서의 뉴클레오티드는 1개 염기만큼 연장되고 형광 표지된 프라이머의 검출을 통해 확인될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Kobayashi et al., Mol. Cell. Probes, 9:175-182 (1995)]).

e. 전기영동

중합효소 연쇄 반응을 이용하여 생성된 증폭 생성물은 변성 구배 겔 전기영동을 이용하여 분석할 수 있다. 상이한 대립유전자는 용액 중 DNA의 상이한 서열-의존성 용융 특성 및 전기영동 이동에 근거하여 확인할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Erlich, ed., PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification, W.H. Freeman and Co, New York, Chapter 7 (1992)] 참조).

미세부수체 다형성의 식별은 모세관 전기영동을 이용하여 수행될 수 있다. 모세관 전기영동은 편리하게는 특정 미소부수체 대립유전자 중 반복서열의 수의 확인을 가능케 한다. DNA 다형성 분석에 모세관 전기영동의 적용은 당해 분야에 속한 자들에게 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 [Szantai, et al., J Chromatogr A., 1079(1-2):41-49 (2005); Bjorheim and Ekstrom, Electrophoresis, 26(13):2520-2530 (2005); and Mitchelson, Mol Biotechnol. 24(1):41-68 (2003)] 참조).

f. 단일-가닥 구조 다형성 분석

표적 서열의 대립유전자는 단일-가닥 구조 다형성 분석을 이용하여 구별될 수 있으며, 상기 분석은 문헌 [Orita et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 2766-2770 (1989)]에 기술된 바와 같이, 단일 가닥 PCR 생성물의 전기영동 이동에서의 변화에 의해 염기 차이를 확인한다. 증폭된 PCR 생성물은 전술한 바와 같이 생성될 수 있으며, 가열되거나 그렇지 않으면 변성되어 단일 가닥 증폭 생성물을 생성한다. 단일-가닥 핵산은 리폴딩되거나 또는 염기 서열에 부분적으로 의존하는 2차 구조를 형성할 수 있다. 단일-가닥 증폭 생성물의 상이한 전기영동 이동도는 표적의 대립유전자들 사이의 염기-서열 차이와 관련될 수 있다.

SNP 검출 방법은 종종 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 올리고뉴클레오티드는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 표지를 혼입함으로써 표지화될 수 있다. 유용한 표지로는 형광 염료, 방사성 표지, 예를 들면, 32P, 전자-고밀도 시약, 효소, 예를 들면, 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제, 비오틴 또는 합텐, 및 그에 대한 항혈청 또는 단클론성 항체가 이용가능한 단백질이 포함된다. 표지 기술은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, 1994-1999, including supplemental updates through April 2004; Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd Ed, 2001)] 참조).

4. 치료 방법

EMEA에 따른, 특정 암의 치료를 위한 베바시주맙(아바스틴(등록상표))의 투여량은 다음과 같다. 결장 또는 직장의 전이성 암(mCRC)의 경우, 권장 투여량은 2주에 1회씩 5 또는 10 mg/kg 체중, 또는 3주에 1회씩 7.5 또는 15 mg/kg 체중이며, 전이성 유방암(mBC)의 경우, 권장 투여량은 정맥내 주사로서 2주에 1회씩 10 mg/kg 체중 또는 3주에 1회씩 15 mg/kg 체중이고, 비-소세포 폐암(NSCLC)의 경우, 권장 투여량은 정맥내 주사로서 3주에 1회씩 7.5 또는 15 mg/kg 체중이다. NSCLC 환자에서 임상적 이점은 7.5 mg/kg 및 15 mg/kg 용량 둘 다에서 입증되었다. 상세한 내용에 대해서는 5.1 약력학적 성질, 비-소세포 폐암( NSCLC ) 부분을 참조하시오. 진행성 및/또는 전이성 신세포암(mRCC)의 경우, 바람직한 투여량은 정맥내 주사로서 2주에 1회씩 10 mg/kg 체중이다(6 주기 이하의 치료 동안 백금-기재 화학치료제에 더하여, 이어서 질환이 진행될 때까지 단일 약제로서 베바시주맙(아바스틴, 등록상표)). 교모세포종의 경우, 특정한 투여량은 2주마다 10 mg/kg이다.

본 발명에 있어서, 혈관신생 억제제는 당해 분야에 공지된 바와 같은 표준 화학치료요법의 일부로서 투여되는 하나 이상의 화학치료제 이외에, 또는 이와 병행-치료 또는 동시-치료로서 투여될 수 있다. 상기 표준 화학치료요법에 포함되는 약제의 예로는 5-플루오로우라실, 류코보린, 이리노테칸, 겜시타빈, 에를로티닙, 카페시타빈, 탁산, 예를 들면, 도세탁셀 및 파클리탁셀, 인터페론 알파, 비노렐빈, 및 백금-기재 화학치료제, 예를 들어, 파클리탁셀, 카보플라틴, 시스플라틴 및 옥살리플라틴이 포함된다. 전이성 췌장암에 대한 병행-치료의 예는 2주에 1회씩 5 또는 10 mg/kg 체중, 또는 3주에 1회씩 7.5 또는 15 mg/kg 체중의 투여량으로 겜시타빈-에를로티닙과 베바시주맙을 포함한다. 신세포암에 대한 병행-치료의 예는 2주에 1회씩 10 mg/kg 체중의 투여량으로 인터페론 알파와 베바시주맙을 포함한다. 또한, 환자는, IFL, 예를 들면, 볼루스(bolus)-IFL로도 지칭되는, 이리노테칸, 5-플루오로우라실, 류코보린의 조합과, 또는 FOLFOX4 요법으로도 지칭되는, 옥살리플라틴, 류코보린 및 5-플루오로우라실의 조합과, 또는 XELOX로도 지칭되는, 카페시타빈 및 옥살리플라틴의 조합과 병행-치료될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 태양에서, 악성 질환, 또는 생리학 및 병리학적 혈관신생을 수반하는 질환을 앓고 있는 환자는 5-플루오로우라실, 류코보린, 이리노테칸, 겜시타빈-에를로티닙, 카페시타빈 및/또는 백금-기재 화학치료제, 예를 들면, 파클리탁셀, 카보플라틴 및 옥살리플라틴과 같은 하나 이상의 화학치료제로 치료된다. 병행-치료 또는 동시-치료의 예는, 전이성 대장암의 경우, 볼루스-IFL과 함께 2주마다 5 mg/kg 베바시주맙(아바스틴(등록상표)) 또는 FOLFOX4와 함께 2주마다 10 mg/kg 베바시주맙(아바스틴(등록상표)), 비-편평상피성 비-소세포 폐암의 경우, 카보플라티스/파클리탁셀과 함께 3주마다 15 mg/kg 베바시주맙(아바스틴(등록상표)), 및 전이성 유방암의 경우, 파클리탁셀과 함께 2주마다 10 mg/kg 베바시주맙(아바스틴(등록상표))을 포함한다. 또한, 투여될 혈관신생 억제제는 방사선치료와 병행-치료 또는 동시-치료로서 투여될 수 있다.

5. 키트

본 발명은 또한 임의의 언급한 올리고뉴클레오티드 및 선택적으로 검출에 적합한 수단을 포함하는 진단 조성물 또는 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위해 유리하게 사용될 수 있으며, 특히 다양한 용도에서, 예를 들면, 진단 분야에서 또는 연구 도구로서 사용될 수 있다. 본 발명의 키트의 요소들은 병에 개별적으로, 또는 용기 또는 다중용기 유닛에 함께 포장될 수 있다. 키트의 제조는 바람직하게는 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있는 표준 절차를 따른다. 키트 또는 진단 조성물은, 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은 증폭 기술을 사용하여, 본 발명의 본원에 기술된 방법에 따라 하나 이상의 변이 대립유전자의 검출을 위해 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 태양에서, 하나 이상의 SNP의 유전자형을 결정할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 본원에 기술된 방법을 수행하기에 유용한 키트가 제공된다. 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 프라이머 및/또는 프로브를 포함할 수 있다.

본 발명은 하기의 비-제한 도면 및 실시예 뿐 아니라, WO 2011/015348 호의 실시예 1 및 2 및 도 1 내지 16과 특별히 관련하여 WO 2011/015348 호를 참조하여 더 기술된다.

실시예

환자 및 방법

연구 설계

AVITA(BO17706) 및 AVOREN(BO17705)은 각각 전이성 췌장 선암을 갖는 607 명의 환자 및 전이성 신세포암을 갖는 649 명의 환자를 포함하는 다기관(multicenter), 무작위 3상 시험이었다. AVITA에서, 환자들은 겜시타빈-에를로티닙과 함께 베바시주맙(n = 306) 또는 위약(n = 301)을 투여받도록 무작위 배정되었다. AVOREN에서, 환자들은 인터페론 알파-2a와 함께 베바시주맙(n = 327) 또는 위약(n = 322)을 투여받도록 무작위 배정되었다. 상기 연구들의 세부사항은 다음에 기술되었다:

- AVITA: 문헌 [Van Cutsem et al., Phase III trial of bevacizumab in combination with gemcitabine and erlotinib in patients with metastatic pancreatic cancer, J. Clinc. Oncol. 27:2231-2237 (2009)]

- AVOREN: 문헌 [Escudier B, Pluzanska A, Koralewski P, Ravaud A, Bracarda S, Szczylik C, et al., Bevacizumab plus interferon alfa-2a for treatment of metastatic renal cell carcinoma: a randomised, double-blind phase III trial, Lancet. 370(9605):2103-2111 (2007)]

시험 프로토콜 및 유전자 바이오마커 연구는 각 사이트에서 임상시험 심사 위원회(institutional review board)에 의해 승인되었으며, 현재 미국 식품 의약국 임상시험 실시 기준(US Food and Drug Administration Good Clinical Practices)인 헬싱키 선언(Declaration of Helsinki), 및 지역 윤리 및 법적 요구사항에 따라 수행되었다. 바이오마커 연구에 포함된 모든 환자들은 유전자 바이오마커 시험을 위해 별도의 서면 사전 동의서를 제출하였다. 상기 분석을 위한 혈액 샘플은 연구 치료가 시작되기 전에 수집되었다.

단일 뉴클레오티드 다형성 선택

VEGF 신호전달계(signalling cascade) 중에서 하기의 유전자들을 선택하였다: VEGF 리간드, VEGF 동족체(태반 성장 인자[PlGF], VEGF-B, VEGF-C 및 VEGF-D[c-fos-유도성 성장 인자 또는 FlGF로도 알려져 있다]), VEGF 수용체-2(VEGFR-2 또는 KDR) 및 VEGF 수용체-1(VEGFR-1 또는 FLT1), 저산소증의 조절인자(regulator)(저산소증-유도성 인자-1α[HIF1A], HIF-2α[EPAS1], HIF-1α를 억제하는 인자[HIF1], 폰 히펠-린다우 종양 억제인자[VHL], 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 EP300), 및 산소 센서(프롤릴 하이드록실라제 도메인-함유 단백질-1, -2 및 -3[EGLN-2, -1 및 -3] 각각). 각 유전자의 번역 개시 부위의 5 kb 상류 및 3' 폴리-A-아데닐화 부위의 하류까지의 게놈 서열을 이용하여, HapMap 데이터베이스(release 24/phase II)로부터 SNP를 선택하였다. 태깅 SNP는 태거(Tagger(Pe'er I, de Bakker PI, Maller J, Yelensky R, Altshuler D, Daly MJ)를 사용하여 선택하였다. 고정 마커 세트를 사용하는 전장-게놈(whole-genome) 연관성 연구[Nat Genet 38:663-667 (2006)]에서 전력을 평가하고 개선하는 것은 HAPLOVIEW 소프트웨어 패키지[Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps, Bioinformatics 21:263-265 (2005)]에 제공되었다. 통상적인 SNP, 즉, 소수 대립유전자 빈도 (f)≥0.1 및 최고 r² 임계치>0.8을 갖는 SNP 만을 고려하였다. 다 합쳐서, 140개 태깅 SNP를 상기 기준에 따라서 선택하였다. 또한, 엑손 서열에 위치하고 빈도 f≥0.1로 비-동의(non-synonymous) 아미노산 변화를 유도하는 14개 SNP를 dbSNP 데이터베이스에서 선택하고, 마찬가지로 VEGF에서(rs699947, rs833061, rs2010963 및 rs3025039), VEGFR-1에서(rs111458691) 및 VEGFR-2에서(rs2071559) 추가의 SNP를 선택하였으며, 이들은 상기 유전자들의 기능 또는 발현에 영향을 미치는 것으로 이미 보고되었다. 계획중인 추후의 분석에서, 고혈압 및 혈전증에 대한 민감성을 증가시키는 것으로 알려진 24개의 SNP도 또한 설계에 포함되었다. 다 합쳐서, 184개의 SNP가 유전자형분석을 위해 상기와 같이 선택되었다.

유전자형분석

말초혈을 K2EDTA 배큐테이너(Vacutainer, 등록상표) 관에 샘플링하고, 생식세포 DNA를 침전된 백혈구 세포 분획으로부터 추출하였다. 유전자형분석은 매스어레이(MassARRAY, 등록상표) 아이플렉스 골드(iPLEX Gold)(시쿼놈 인코포레이티드(Sequenom Inc.) 미국 캘리포니아 샌디에이고)를 이용하여 베살리우스 연구 센터(Vesalius Research Center, 벨기에 루벤)에서 맹검 방식으로 수행하였다. 첫번째 유전자형분석 단계에서 실패한 SNP는 상이한 세트의 중합효소 연쇄 반응 프라이머를 이용하여 재설계하고 재시험하였다. 두번째 설계도 실패한 27개 SNP는 실패로 간주하였다. 전체적으로, 157개 SNP(85.3%)가 AVITA에서 98.5%의 전체 성공률하에 성공적으로 유전자형분석되었다. AVOREN 및 기능 확인 연구로부터의 DNA 샘플을 매스어레이(등록상표)를 이용하여 rs7993418, rs9554320, rs9582036, rs9554316 및 rs9513070을 포함한 한정된 SNP 세트에 대해 유전자형분석하였다.

통계학적분석

19개의 SNP가 AVITA에서 빈도 f≤0.1로 발생하였으므로, 추가 분석에서 배제하였다. 1의 자유도하에 표준 χ²을 이용하여 남은 138개 SNP에 대해 하디-바인베르크(Hardy-Weinberg) 평형을 평가하였다. 큰 벗어남은 검출되지 않았다. 연관 불균형(LD) 강도는 Haploview 소프트웨어 패키지(브로드 인스티튜트(Broad Institute), 미국 매사추세츠 케임브리지)를 이용하여 r² 및 르원틴(Lewontin)의 D' 통계학으로 평가하였다. SNP 유전자형과 치료 결과까지의 시간(PFS 및 OS) 사이의 연관성을 부가 유전 모델에 따른 콕스 비례 위험 분석방법(Cox proportional hazards method)을 이용하여 먼저 평가하였다. OS 분석은 베바시주맙 부문(arm) 단독에서 138개 SNP 각각에 대해 별도로 수행하였다. 0.05의 전체 1형 오류율에 대한 유의적 임계치는 AVITA에서 다중 비교를 위한 본페로니 교정(Bonferroni correction)을 기준으로 P<0.00036에 맞춰졌다. 상기 단계에서 확인된 유의적 SNP는 P<0.05의 임계치를 고려하고 콕스 회귀 분석을 이용하여 더 분석하였다: (i) 다른 기준선 예후 공변수(covariate)에 대해 조정하면서 베바시주맙 부문에서만; (ii) 관찰된 연관성이 치료와 무관한지를 평가하기 위해 위약 부문에서만; (iii) 치료상호작용에 의해 유전자형을 평가하기 위해 두 치료 군 모두에서. 치료 결과에 영향을 미치는 일련의 기준선 공변수를 확인하기 위해 유전자 바이오마커 분석에 이용가능한 소집단에 단계적 모델 선택 접근방법을 적용하였다. 조정 공변수로 사용된 선택된 변수는 호중구수, C-반응성 단백질 및 종양 위치였다. P<0.05의 임계치를 고려하고 AVITA와 유사한 콕스 회귀 분석을 이용하여 rs7993418의 연관성을 AVOREN에서 반복검증하였다.

결과

AVITA 연구 특징

AVITA로부터의 혈액 샘플은 607 명의 환자중 160 명으로부터 이용가능하였고(26.4%); 6 명의 환자는 아시아인이었으며 154 명은 백인이었다. SNP 빈도는 인종 군들간에서 상이하므로, 백인 환자로부터의 DNA 시료만을 분석하였다. 유전자 바이오마커 소집단은 연령 및 성별 분포, 흡연 상태, OS 및 PFS에 관해 전체 환자 집단(cohort)과 비슷하였다(표 2). 소집단에서 중간 OS는 베바시주맙 및 위약 부문에서 각각 7.4 및 6.7 개월이었고(p = 0.19), 중간 PFS는 각각 5.3 및 4.1 개월이었다(p = 0.078).

[표 2] 기준선에서의 AVITA 환자 인구통계자료 및 임상 특징

인구통계자료 및 임상 특징들을 전체 AVITA 시험 집단 및 유전자 바이오마커 분석에 이용가능한 소집단에 대해 제공하였다. Bev는 베바시주맙을 나타내고; CI는 신뢰구간을, GE는 겜시타빈-에를로티닙을, mo는 개월을 나타낸다.

VEGFR-1 에서 rs9582036 은 베바시주맙 치료 결과와 상관된다

모두 138개 SNP 중에서, VEGFR-1에서의 rs9582036 SNP 만이 다중 시험에 대해 조정된 P값 임계치를 통과하였다. OS에 대한 상기 SNP의 전체 효과는 베바시주맙 부문에서 유의적이었으며(대립유전자당 HR = 2.1, P=0.00014), 부가 위험 효과 모델(WO 2011/015348 호의 도 3)과 일치하였다. 중간 OS는 CC 및 AC 보유자에서 각각 4.8 개월 및 6.0 개월로부터, AA 보유자에서 10.3 개월로 증가되었다. 호중구수, C-반응성 단백질 수준 및 종양 위치에 대해 조정한 후, 베바시주맙 부문에서 rs9582036과 OS와의 연관성은 약간 약화되었지만, 여전히 유의적이었다(HR = 1.9, P=0.002). 위약 부문에서 rs9582036에 대한 후속 콕스 회귀 분석은 OS와 SNP 유전자형 사이에 통계적으로 유의적인 상관관계를 나타내지 않았다(WO 2011/015348 호의 도 4). rs9582036과 치료(베바시주맙 또는 위약) 사이의 상호작용에 대한 공식 검사는 통계적으로 유의하여(P=0.041), rs9582036이 AVITA에서 치료 결과에 대한 예측 마커였음을 시사하였다. 콕스 회귀 분석은 또한 베바시주맙 부문에서 rs9582036과 PFS 사이의 상관관계를 입증하였다(대립유전자당 HR = 1.89, P=0.00081; WO 2011/015348 호의 도 5). PFS에 대한 상기 효과가 위약 부문에서는 관찰되지 않았다(P = 0.58; WO 2011/015348 호의 도 6).

연관된 SNP 는 VEGFR -1 TK 도메인에서 유전자좌를 한정한다

VEGFR-1에서의 3개의 다른 SNP(rs9554316, rs9513070 및 rs9554320)도 또한 베바시주맙 부문에서 OS와 상관되었으나, 다중 시험에 대해 조정된 P값 임계치는 통과하지 못했다(각각 P=0.00042, P=0.0081 및 P=0.0097). 상기 SNP들의 예측 효과는 rs9582036과 유사하였다(WO 2011/015348 호의 도 7 내지 10). 4개의 SNP 모두 서로에 가깝게, 즉, rs9554320, rs9582036, rs9554316 및 rs9513070에 대해 각각 인트론 25, 27, 28 및 29에 위치하였으며, VEGFR-1 내에 높은 연관 불균형을 갖는 4개의 연속 영역들을 나타내었다. OS와의 그의 연관성의 척도로서 모든 SNP의 P값을 고려하고 상기 값들을 VEGFR-1중 SNP의 위치의 함수로서 플로팅하는 경우, TK 도메인중 아미노산 잔기 1029 내지 1272를 암호화하는 엑손 25 내지 29를 포함하는 연관성 신호가 베바시주맙 부문에서 관찰되었다. 예상된 바와 같이, 위약군에서는 상기 신호가 관찰되지 않았다.

VEGFR -1 유전자좌의 상세-지도작성

VEGFR-1에 위치한 모든 SNP를 확인하기 위해, 1000 게놈 프로젝트(CEU 개체군, 배포 2010년 7월; www.1000genomes.org)에서 60개의 백인 HapMap 샘플로부터의 전장-게놈 서열분석 데이터를 이용하였다. VCF 툴(Tool) 버전 0.1.5를 이용하여, VEGFR-1의 암호화 영역 중 및 15kb 상류- 및 하류 서열(즉, CHr13:2776300-27982000 인셈블(Ensemble) 36.3 배위) 중의 SNP를 선택하였다. 전체적으로, 628개의 SNP를 확인하였으며, 그 중 381개는 소수 대립유전자 빈도(MAF)≥0.05를 가졌다. Haploview 4.2 소프트웨어를 이용하여, AVITA에서 베바시주맙 후의 치료 결과와 연관된 4개의 태깅 SNP(즉, rs9582036, rs9554316, rs9513070 및 rs9554320) 중 하나와 함께 LD중에 존재하는 48개 SNP를 확인하였다. LD에 대한 임계치는, 분석된 샘플중 4개의 태그 SNP중 하나와의 사이에 최저 r²이었으므로, r²≥0.12로 설정되었다(표 3).

[표 3]

VEGFR-1 유전자좌에서의 4개 태깅 SNP 사이에서 쌍별 연관 불균형이 나타난다. 완전한 상관관계에 있고 완전히 동일한 SNP는 1의 r² 값을 갖는다. 0의 r² 값을 갖는 SNP는 서로와 무관하게 발생한다.

상기 48개 SNP 중 어느 것이 VEGFR-1 기능에 영향을 미치고 베바시주맙 후의 치료 결과에 원인적으로 기여하는지를 확인하기 위해, PupaSuite[Reumers J, Conde L, Medina I, et al., Joint annotation of coding and non-coding single nucleotide polymorphisms and mutations in the SNPeffect and PupaSuite databases, Nucleic Acids Res 36:D825-829 (2008)] 및 AnnoVar[Wang K, Li M, Hakonarson H, ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data, Nucleic Acids Res 38:e164] 도구를 사용하였다. 특히, 상기 SNP들 중 어느 것이 암호화 영역, 전사 인자 결합 부위, 엑손 스플라이싱 인핸서(enhancer)/사일렌서(silencer) 또는 miRNA 결합 부위, 또는 다른 진화적으로 보존된 서열 영역에 위치하는지를 평가하였다. 1개의 SNP만이 VEGFR-1 엑손 중 하나에 위치하였다, 즉, rs7993418이 VEGFR-1의 엑손 28에 위치하였다. 2개의 SNP(즉, rs9513071 및 rs7982283)가 예측된 CCCTC-결합 인자(CTCF) 결합 모티프에 위치하였지만, 이들은 CTCF 모티프의 코어-결합 도메인을 파괴하지 않았기 때문에 VEGFR-1 기능에 기능적으로 영향을 미치는 것 같지 않았다. 5개의 다른 SNP들은, 데이터베이스에서 44 종들으로부터 적어도 10가지 포유동물에서 각각의 뉴클레오티드 위치의 보존으로 정의된 보존된 위치 상에 위치하였다. 이들 SNP는 VEGFR-1 유전자의 하류에(rs9554309), 인트론 서열에(rs9513073, rs9551471, rs7992940) 및 VEGFR-1의 엑손 28에(rs7993418) 위치하였다. 다른 적절한 SNP는 확인되지 않았다. 특히, 상기 5개의 SNP 중에서, rs7993418은 VEGFR-1 TK 유전자좌에서 4개의 태그 SNP 하에 최고 정도의 LD를 나타내었다(rs9513070, rs9554316, rs9582036 및 rs9554320 하에 LD에 대해 각각 0.34, 0.83, 0.67 및 0.36의 r² 값). 전체적으로, 상기 상세-지도작성 및 인실리코(in silico) 분석에 근거하여, rs7993418은 VEGFR-1 기능에 영향을 미치는 최고의 가능성을 갖는 SNP인 것으로 간주되었다. rs7993418은 티로신 1213의 TAT 코돈을 TAC 코돈으로 변화시키며(Tyr1213Tyr) rs9554316의 반수체형 블럭에 위치하는 VEGFR-1의 엑손 28에 위치한 동의 T/C SNP이다.

rs7993418 변이체는 VEGFR -1 발현에 기능적으로 영향을 미친다

1. VEGFR -1 cDNA 구조물의 시험관내 전사/번역

rs7993418이 VEGFR-1 발현에 기능적으로 영향을 미치는 것을 입증하기 위해, VEGFR-1 cDNA의 전사 및 번역에 대한 그의 영향을 토끼의 망상적혈구 용해물 시스템을 사용하여 시험관내에서 평가하였다. Tyr1213에 대해 TAT 또는 TAC 코돈을 갖는 VEGFR-1 cDNA의 2가지 버전을 생성하였다. 두 cDNA 모두 pcDNA3 발현 벡터내에 클로닝하고, 상업적인 TnT T7 퀵(Quick)-커플링된 토끼 망상적혈구 용해물 키트(프로메가(Promega), Cat# L1170)를 이용하여 시험관내 전사/번역을 위해 사용하였다. 야생형 TAT 또는 돌연변이 TAC 코돈을 갖는 전장(full-length) VEGFR-1 cDNA는 동일한 양의 전사된 mRNA, 및 상이한 양의 번역된 VEGFR-1 단백질을 제공하였다. 특히, TAT-함유 cDNA 구조물에 비해 TAC에 대해 VEGFR-1 단백질에서 27% 증가가 관찰되었다(P<0.001). 유사하게, HEK293T 세포에서의 일시적 과발현은, VEGFR-1 mRNA 발현이 TAC 및 TAT-함유 구조물을 발현하는 세포들 사이에서 동일하였지만 15%까지 더 많은 VEGFR-1 단백질이 TAC-발현 세포에 의해 번역되었음을 보여주었다(P<0.001). 전장 막관통 VEGFR-1(tmVEGFR-1)의 단백질분해성 절단에 의해 생성된 가용성 VEGFR-1 이소폼(sVEGFR-1)은 TAC-함유 구조물을 발현하는 세포에서 유사하게 증가되었다(P<0.001).

2. 인간 혈장에서 sVEGFR -1 발현 수준

또한, tmVEGFR-1 및 sVEGFR-1 단백질 수준은 매우 상관되고 sVEGFR-1은 인간 혈장에서 용이하게 평가될 수 있기 때문에, sVEGFR-1 혈장 수준은 2개의 독립적인 집단에서 측정하고 rs7993418에 대해 계층화시켰다. 혈장은 적십자(벨기에 루벤)를 통해 플레미시(Flemish) 혈통의 369 명의 건강한 개체로부터 수집하고, 이들 개체로부터의 DNA를 rs7993418에 대해 유전자형 분석하였다. 인간 가용성 VEGF R1/Flt-1 면역분석(Human Soluble VEGF R1/Flt-1 Immunoassay)(R&D 시스템즈, 카탈로그 # DVR100B)에 의해 11명의 CC(돌연변이체) 보유자 각각에 대해 30명 및 28명의 무작위 선택된 TT 및 TC 보유자로부터의 sVEGFR-1 혈장 수준을 비교하였다. CC 보유자가 TT 및 TC 보유자에 비해 18% 증가된 중간 VEGFR-1 발현을 나타냄을 관찰하였다(P=0.006). 일원(one-way) ANOVA를 이용하여 sVEGFR-1 발현에 대한 rs7993418의 영향을 평가하였으며; 양측(two-sided) P 값 <0.05를 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다. 유방암 환자로부터의 혈장 샘플(루벤 멀티디사이플리너리 브레스트 센터(Leuven Multidisciplinary Breast Center)에서 수집)의 독립적 집단에서의 상기 연관성을 반복검증하였다. 간략하게, 263 명의 환자로부터의 DNA를 rs7993418에 대해 유전자형 분석하고, 23명 및 27명의 무작위 선택된 TT(야생형) 및 TC 보유자로부터의 sVEGFR-1 혈장 수준을 9명의 검출된 CC(돌연변이체) 보유자 각각에 대해 비교하였다. TT 및 TC 보유자에 비해 CC 보유자에서 sVEGFR-1 발현에 유사한 증가(19%)가 주목되었다(P=0.014). 일원 ANOVA를 이용하여 sVEGFR-1 발현에 대한 rs7993418의 영향을 평가하였으며; 양측 P 값<0.05를 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.

3. rs7993418 유전자형에 대해 계층화된 HUVEC 에서 VEGFR -1 발현

최종적으로, rs7993418 TT, TC 및 CC 유전자형을 갖는 HUVEC를 비교함으로써, tmVEGFR-1(P=0.50) 및 sVEGFR-1(P=0.91) mRNA 발현 수준에 대해 어떤 차이도 확인할 수 없었다. 그러나, 시험관내 번역 실험과 유사하게, 상기 HUVEC는 TT 또는 TC 보유자에 비해 CC 보유자에 대해 약간 증가된 tmVEGFR-1 단백질 발현 수준을 나타내었다(23% 중가; P=0.049). CC 대 TC 또는 TT 보유자 사이에 유사한 효과가 sVEGFR-1에 대해 관찰되었다(39% 증가; P=0.044).

4. P1GF 자극시 ERK1 /2 활성화

상기 결과는 rs7993418이 mRNA 번역 효율을 증대시킴으로써 tmVEGFR-1 및 sVEGFR-1의 발현을 증가시킴을 시사한다. 또한, VEGFR-1 발현의 증가에 의해 예상되듯이, C-대립유전자에 대해 동형접합성인 HUVEC 배양물은 선택성 VEGFR-1 리간드, P1GF로 활성화시 증가된 하류 VEGFR-1 신호전달을 나타내었다. 이것은 TT rs7993418 보유자에 비해 CC 보유자에서 포스포-ERK1 및 포스포-ERK2의 증가된 수준에 의해 나타난다(포스포-ERK1에 대해 2.0배 대 1.6배 유도, 및 포스포-ERK2에 대해 2.1배 대 1.4배 유도; P=0.045 및 P=0.046; n = 3 대 5). ERK1 및 ERK2 포스포릴화는 포스포-MAPK 어레이 키트(R&D 시스템즈)를 사용하여 측정하였다. 포스포릴화 단백질은 피어스(Pierce) ECL 화학발광 기질(터모 사이언티픽(Thermo Scientific))을 사용하여 검출하였으며, 블롯들은 사이언티픽 영상 필름(코닥(Kodak))을 사용하여 현상시켰다. 블롯들을 스캐닝하고 이미지J(ImageJ) 1.43 소프트웨어를 이용하여 강도를 정량화하였다. 강도를 배경 보정하고 포스포-MAPK 어레이 키트의 내부 양성 대조군에 대해 등급화하였다. 실험은 2회 수행하였으며, 두 실험 모두의 평균값을 나타내었다. 인간 포스포-MAPK 어레이 키트는 ERK1 또는 2의 총량에 대해 보정하지 않으므로, 슈어파이어(SureFire) 기술(퍼킨 엘머(Perkin Elmer))을 이용하여 전체 ERK1/2 농도를 측정하였다. 전체 ERK1/2 수준은 비자극 및 자극 조건하에서 TT 및 CC 보유자에 대해 유사하였다(각각 P=0.2 및 0.34).

AVOREN 에서 VEGFR -1 유전자좌의 연관성의 반복검증

최종적으로, VEGFR-1 유전자좌와 베바시주맙 치료 결과와의 연관성을 반복검증하기 위한 시도로, 전이성 신세포암 환자를 포함하는 두번째 3상 임상 연구(AVOREN)를 수행하였다. AVOREN으로부터의 혈액 샘플은 649 명 환자 중에서 110 명으로부터(16.9%) 이용가능하였으며, 그중 59 명이 베바시주맙을 투여받았다(표 4).

[표 4]

기준선에서의 AVOREN 환자 인구통계자료 및 임상 특징:

인구통계자료 및 임상 특징들을 전체 AVOREN 시험 집단 및 유전자 바이오마커 분석에 이용가능한 소집단에 대해 제공하였다. Bev는 베바시주맙을 나타내고; CI는 신뢰구간을, IFN은 인터페론 알파-2a를, mo는 개월을 나타낸다.

전술한 바와 같은 AVITA 시험과 유사한 SNP 분석을 AVOREN 시험에서 환자들로부터의 유전자 샘플에 대해 수행하였다. 베바시주맙을 투여받은 AVOREN 환자는 질환 진행시 이질성 2차 치료로 전환되었으므로, PFS에 대한 상관관계만을 평가하였다. 유전자 바이오마커 소집단은 전체 환자 집단보다 더 긴 PFS를 특징으로 하였지만, rs7993418은 베바시주맙에서는 PFS와 상관되었지만(대립유전자당 HR = 1.8, P=0.033, 표 5), 위약 부문에서는 그렇지 않았다(대립유전자당 HR = 0.8, P=0.49).

[표 5]

rs7993418, rs9554316 및 rs9513070 유전자형에 따른, AVOREN에서 베바시주맙 및 위약 치료군에서의 PFS의 카플란-메이어 평가

Bev는 베바시주맙을 의미하고; CI는 신뢰구간을, IFN은 인터페론 알파-2a를, mo는 개월을 나타낸다. *rs7993418 및 rs9554316은 서로에 동일하였으며 표 5에서의 분석은 rs9554316에 대해 수행되었다.

표 5에서, rs7993418의 CC 유전자형은 한명의 환자만을 포함하므로; CC 보유자의 중간 생존기간에 대해서는 결론을 이끌어 낼 수 없다. 그럼에도 불구하고, AVOREN에서 rs7993418의 TC 및 CC 보유자 둘 다에 의한 복합적 유전자형 영향은 통계적으로 유의하다(P=0.033). rs7993418의 전술한 기능적 특성들과 함께 표 5에 나타낸 결과는 C 대립유전자가 VEGFR-1의 발현을 증가시킴으로써 베바시주맙-치료 환자에서 생존에 불리하게 영향을 미친다는 본 발명의 결과를 지지하며, 이것은 P1GF 리간드에 의해 유도된 잘 인지된 보상적 혈관신생 현상을 증폭시킬 수 있다.

전체적으로, 상기 결과는 VEGFR-1 유전자좌가 신세포암 환자에서 베바시주맙 치료 결과에 대해 또한 예측할 수 있음을 시사한다.

전이성 췌장암 환자(AVITA)에서 PFS 및 OS와 연관되는 VEGFR-1 TK 도메인에서의 유전자좌를 본 발명에서 확인하였으며 신세포함 환자(AVOREN)에서 PFS와의 연관성을 반복검증하였다. 중요하게, 상기 연관성은 위약-치료 환자에서는 두드러진 영향이 관찰되지 않았기 때문에 베바시주맙을 투여받은 환자에 대해 특이적이었다. rs7993418이 VEGFR-1 mRNA 번역 효율을 증대시켜 VEGFR-1 단백질의 증가된 발현을 유도함을 입증함으로써 기능적 수준에서 상기 유전자좌를 확인하였다.

증가된 VEGFR-1 발현이 감소된 베바시주맙 치료 결과에 어떻게 기여할 수 있는지에 관해, VEGFR-1의 활성화가 세포내 신호를 전달함으로써 직접적으로 또는 VEGFR-2의 트랜스포스포릴화에 의해 간접적으로 혈관신생을 유발하여 증가된 VEGFR-2-유도된 혈관신생을 야기하는 것이 공지되어 있다. 흥미롭게, VEGFR-1 선택성 리간드, P1GF를 과발현하는 종양은, 상기 종양의 감소된 혈관화(vascularization)의 결과로 VEGFR-1 TK 도메인이 결여된 마우스에서 덜 신속하게 성장한다. P1GF 수준은 또한 베바시주맙으로 치료된 환자에서도 증가되므로, VEGFR-1의 하류 신호전달을 증폭시키는 유전자좌는 맥관구조가 P1GF에 더 의존성이 되게하며 항-VEGF 치료에 대한 내성을 야기한다. 유사하게, 증가된 sVEGFR-1 수준은 종양-유도성 VEGF를 격리시킴으로써 VEGFR-2를 통해 변환된 혈관형성촉진(pro-angiogenic) 효과를 감소시키고 베바시주맙을 통한 VEGF 중화의 이점을 제한할 수 있다. 사실상, 마존(Mazzone) 등은, 고도의 tmVEGFR-1 및 sVEGFR-1 발현 내피 세포가, 부분적으로 이들 세포가 VEGF의 유사분열촉진 및 이동 활성에 덜 반응성이기 때문에, 종양 맥관구조 정상화에 기여함을 밝혔다[Mazzone M, Dettori D, Leite de Oliveira R, et al., Heterozygous deficiency of PHD2 restores tumor oxygenation and inhibits metastasis via endothelial normalization, Cell 136:839-851 (2009)]. 현저하게, 치료전 및 치료중에 증가된 혈장 sVEGFR-1 발현을 갖는 직장암 환자는 베바시주맙으로부터 감소된 이익을 가짐으로써, 베바시주맙 치료의 바이오마커로서 VEGFR-1의 잠재적 가치에 대한 본 발명의 견해를 분명히 보여준다[Duda DG, et al., Plasma soluble VEGFr-1 is a potential dual biomaker of response and toxicity for bevacizumab with chemoradiation in locally advanced rectal cancer. Oncologist. 15(6):577-583 (2010)].

처음에는, 동의 SNP가 아미노산 서열을 변화시키지 않고 VEGFR-1 발현에 영향을 미친다는 것은 놀랍게 보일 수 있다. 그러나, 동의 돌연변이는 이전에 단백질 발현에 영향을 미치는 것으로 보고되었고 40가지보다 많은 질환에서 이미 관여되었다. 그에 의해 동의 SNP가 단백질 발현에 영향을 미칠 수 있는 한가지 가능한 메카니즘은 코돈 편향(codon bias)을 통해서이다. 특히, rs7993418 변이체는 VEGFR-1의 TK 도메인중 위치 1213에 위치한 티로신의 코돈 활용에 영향을 미칠 수 있다. 상기 도메인은 TAC 코돈에 대해 강한 편향, 즉 16개 TAC 코돈 대 5개 TAT 코돈(둘 다 티로신을 암호화한다)을 특징으로 한다. 상기 코돈 편향은 또한 다양한 종에 걸쳐서 고도로 발현된 유전자에도 존재하는데, 여기서 이것은 고도로 발현된 유전자의 효과적인 번역을 촉진하는 메카니즘을 나타낸다. TAC 코돈에 의해 유도된 더 효과적인 VEGFR-1 번역은, i) 세번째 코돈 위치에서 더 강한 G-C 수소 결합 상호작용으로 인한 그의 tRNA 안티코돈과의 TAC 코돈의 더 유리한 상호작용[Grosjean H, Fiers W. Preferential codon usage in prokaryotic genes: the optimal codon-anticodon interaction energy and the selective codon usage in efficiently expressed genes, Gene 18:199-209 (1982)]; ii) TAC 코돈에 대한 tRNA의 증가된 이용가능성(TAT tRNA는 단일 유전자에 의해서만 암호화되는 반면, TAC에 대해서는 14개의 tRNA 유전자가 존재한다)[Juhling F, Morl M, Hartmann RK, Sprinzl M, Stadler PF, Putz J, tRNAdb 2009: compilation of tRNA sequences and tRNA genes, Nucleic Acids Res 37:D159-162 (2009)]; 및 iii) 번역 효율을 개선하기 위한 가장 자주 사용되는 코돈의 재사용을 촉진하는 리보솜에 의한 'tRNA 재순환'의 효과[Cannarozzi G, Schraudolph NN, Faty M, et al., A role for codon order in translation dynamics, Cell 141:355-367]를 포함하여, 다양한 메카니즘을 통해 달성될 수 있다. 모두 함께, 상기 메카니즘들은 코돈 편향이 VEGFR-1 발현에 대한 rs7993418의 효과 및 베바시주맙의 치료 결과와의 그의 연관성을 매개한다는 개념을 뒷받침한다.

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG VIB vzw Life Sciences Research Partners vzw <120> Responsiveness to Angiogenesis Inhibitors <130> 30723 <140> PCT/EP2012/072953 <140> 2012-11-19 <150> EP 11190229.2 <151> 2011-11-23 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aggctcatga acttgaaagc atttacrtat ctaatgaaga aacagaaaga at 52

Claims

다음을 포함하는, 암 또는 생리학적 또는 병리학적 혈관신생 이상을 앓고 있는 환자가 베바시주맙 또는 필수적으로 베바시주맙과 VEGF 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 혈관신생 억제제를 사용한 치료에 의해 적절하게 치료되는지를 결정하는 시험관내 방법:
(a) 암 또는 생리학적 또는 병리학적 혈관신생 이상을 앓고 있는 환자로부터 수득된 샘플에서, 위치 1213에서 티로신에 대한 TAT 코돈 및 TAC 코돈에 각각 상응하는 VEGFR-1의 엑손 28에 위치한 동의 T/C SNP에서의 유전자형을 결정하고;
(b) 상기 유전자형에 근거하여, 베바시주맙 또는 필수적으로 베바시주맙과 VEGF 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 혈관신생 억제제를 사용한 치료에 의해 상기 환자가 더 또는 덜 적절하게 치료되는 것을 확인하되, 이때 상기 SNP에서 각각의 T 대립유전자의 존재는 상기 환자가 더 적절하게 치료될 증가된 가능성을 나타내거나, 또는 상기 SNP에서의 각각의 C 대립유전자의 존재는 상기 환자가 덜 적절하게 치료될 증가된 가능성을 나타낸다.
제 1 항에 있어서,
환자가 혈관신생 억제제를 사용한 치료에 의해 적절하게 치료되는지 여부가 무진행 생존기간 또는 전체 생존기간이 개선되는지의 관점에서 결정되는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
혈관신생 억제제를 사용한 치료에 의해 환자를 치료하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
혈관신생 억제제가 화학치료제 또는 화학치료요법과 병행-치료로서 투여되는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
혈관신생 억제제가 탁산, 인터페론 알파, 5-플루오로우라실, 카페시타빈, 류코보린, 겜시타빈, 에를로티닙 및 백금-기재 화학치료제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 약제와 함께 투여되는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
암이 췌장암, 신세포암, 대장암, 유방암 또는 폐암인 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 혈관신생 억제제로 더 적절하게 치료되는 것으로 확인된, 암 또는 생리학적 또는 병리학적 혈관신생 이상을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한, 베바시주맙 또는 필수적으로 베바시주맙과 VEGF 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 혈관신생 억제제를 포함하는 약학 조성물.
위치 1213에서 티로신에 대한 TAT 코돈 및 TAC 코돈에 각각 상응하는 VEGFR-1의 엑손 28에 위치한 동의 T/C SNP에서의 유전자형을 결정할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 키트.
다음을 포함하는, 베바시주맙 또는 필수적으로 베바시주맙과 VEGF 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 혈관신생 억제제를 첨가함으로써 암 또는 생리학적 또는 병리학적 혈관신생 이상을 앓고 있는 환자의 화학치료제 또는 화학치료요법의 치료 효과를 개선하는 방법:
(a) 암 또는 생리학적 또는 병리학적 혈관신생 이상을 앓고 있는 환자로부터 수득된 샘플에서, 위치 1213에서 티로신에 대한 TAT 코돈 및 TAC 코돈에 각각 상응하는 VEGFR-1의 엑손 28에 위치한 동의 T/C SNP에서의 유전자형을 결정하고;
(b) 상기 유전자형에 근거하여, 베바시주맙 또는 필수적으로 베바시주맙과 VEGF 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하는 혈관신생 억제제의 첨가에 의해 상기 환자가 더 적절하게 치료되는 것을 확인하되, 이때 상기 SNP에서 각각의 T 대립유전자의 존재는 상기 환자가 더 적절하게 치료될 증가된 가능성을 나타내고;
(c) (b)에 따라 더 적절하게 치료되는 것으로 확인된 환자에게 상기 혈관신생 억제제를 화학치료제 또는 화학치료요법과 함께 투여한다.
제 9 항에 있어서,
환자가 혈관신생 억제제를 사용한 치료에 의해 적절하게 치료되는지 여부가 무진행 생존기간 또는 전체 생존기간이 개선되는지의 관점에서 결정되는 방법.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
혈관신생 억제제가 탁산, 인터페론 알파, 5-플루오로우라실, 카페시타빈, 류코보린, 겜시타빈, 에를로티닙 및 백금-기재 화학치료제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 약제와 함께 투여되는 방법.
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
암이 췌장암, 신세포암, 대장암, 유방암 또는 폐암인 방법.