KR20030042581A - 대립유전자－특이적 프라이머 연장반응에서 프라이머간의 식별을 증가시키는 방법 - Google Patents

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KR20030042581A
KR20030042581A KR1020010073291A KR20010073291A KR20030042581A KR 20030042581 A KR20030042581 A KR 20030042581A KR 1020010073291 A KR1020010073291 A KR 1020010073291A KR 20010073291 A KR20010073291 A KR 20010073291A KR 20030042581 A KR20030042581 A KR 20030042581A
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

본　발명은　DNA칩　위에서 수행되는　대립유전자－특이적　프라이머　연장반응（allele-specific primer extension）에서，　고체　기판의 표면에 고정화되는 프라이머의　３'－말단　근처에 인위적인 불일치　염기를 도입하여 프라이머간의 식별을 증가시키므로써， 유전자　변이　분석（genotyping)의 정확도를　증진시키는 방법에　관한 것이다． 본 발명에　의하면，　기존의 방법에 비해　염기　서열　분석의　정확도를　획기적으로　개선시킨다．　따라서，　본　발명의　방법은 삽입（insertion）과 　결실（deletion）의　변이　검출에　매우　효과적으로　이용될　수　있다.

Description

대립유전자－특이적　프라이머　연장반응에서 프라이머 간의 식별을　증가시키는　방법{Method for improving discrimination between allele primers in allele-specific primer extension}
본　발명은　대립유전자－특이적　프라이머　연장반응（allele-specific primer extension，　이하　편의상　"ASPE"라　함）에서 그　프라이머　간의　식별（discrimination）을　증가시키는 방법에 관한 것이다. 좀 더　구체적으로, 본　발명은　DNA 마이크로어레이　위에서 수행되는　ASPE에서， 고체　기판　표면에 고정화되는 프라이머의　３'－말단　근처에 인위적인 불일치　염기를 도입하여 프라이머간의 식별을 증가시키므로써， 유전자　변이　분석（genotyping)의 정확도를　증진시키는 방법에　관한 것이다.
인간　지놈　프로젝트의　경이적인　진행과 함께, 유전병의 진단, 치료 및 예방에 있어서 막대한 양의　유전자　정보를 신속히 제공할 수 있는 방법에 대한 요구가 크게 증가하였다．　그　때까지　염기서열　분석법으로　사용되어　온　생거(Sanger)의 방법은 DNA를 복제하는 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)법의 개발 및 이의 자동화 등에 의해 꾸준히 발전하였음에도 불구하고, 과정이 번거롭고 많은 시간과 노력, 비용 및 고도의 숙련도를 필요로 하기 때문에，　방대한　양의　유전자를　분석할　수　없어，　새로운 염기서열　분석 시스템이 끊임없이　모색되었다.
이러한 시대적　필요에 의해 지난 수년간 DNA칩의　제작과，　그　이용기술　특히　염기　분석과 관련된 많은 부분에서　커다란　진보가 있었다.
미국　특허　제　５，７８０，２３３호는　변형된　올리고뉴클레오티드　프로브를 이용하여 변이（mutation)를 포함하는 표적　샘플（variant）로 부터 변이가　없는　샘플（control）을 식별하는 방법에　관한　것으로，　변형된 프로브는　자연　발생적으로　생긴　불일치　염기（true mismatch）즉，　변이　　뿐만　아니라， 이와　３∼４개　뉴클레오티드　떨어져　위치하는　적어도　하나　이상의 인위적　불일치　염기（artificial mismatch）를 포함하도록　디자인됨으로써， 혼성화(hybridization）에 의해 형성된 이중사슬（duplex）의 열　안정성（thermal stability）에 큰 차이를 제공하여，　변이　포함의 표적　샘플과　정상의　샘플을　구분하게　된다．　효과적인　구분을　위하여，　상기　특허발명에서는　변이에　대응하는　염기가　프로브의　중간에　위치하도록　프로브를　디자인하였다.
미국　특허　제　５，９８１，１７６호는　하기와　같은　특징으로　가지는　대립유전자－특이적　프라이머 ，및　전기　프라이머를　이용하여　하나의　염기에서만　서로　다른　２가지　핵산　서열을　구별하거나，　표적　핵산　서열의　대립유전자－특이적　뉴클레오티드를　확인（identify)하는　방법(ASPE 방법)을　개시하고　있다：　상기　프라이머의　5'-말단은　고체　기판　상의　원하는　위치에　고정화된　기선택의（preselected) 핵산　서열과　상보적이고， 3'-말단은 　표적　핵산　서열의　대립유전자－특이적　뉴클레오티드를　중심으로　그　표적　핵산의　３'　방향의　염기들과　상보적이다.
파스티넨（Pastinen T）등은 ASPE 방법을　DNA　칩에　응용하였는데，　대립유전자－특이적　프라이머가　고정화된　DNA 칩에 RNA 주형（template）을　혼성화시킨　다음， MMLV 역전사　효소에　의한　프라이머　연장을　진행시켜 SNP 서열분석(Genotyping　of single nucleotide polymorphism)하는　내용을　발표하였다(참조：Pastinen T．　et al., Genome Research, 10(7):1031-1042).
상술한　ASPE는　올리고뉴클레오티드　프라이머의　３'－말단　뉴클레오티드가　주형　DNA（DNA template）내에　있는　대립유전자　다양성（allelic variation）위치에　대응하도록　프라이머를　디자인한　다음，　주형　DNA의　대립유전자　다양성　위치의　뉴클레오티드（즉，　대립유전자　뉴클레오티드（allele nucleotide））를　중심으로　그　주형　DNA의　３'　방향과　상기　디자인된　프라이머를 어닐링시키고，　형광표지된　dNTP를　사용하여　프라이머　연장　반응을　확인함으로써，　대립유전자　뉴클레오티드를　분석하는　방법이다．　이　방법은　３'－말단　뉴클레오티드의　염기만이　A,　G,　C,　T로　다른　４가지　프라이머를　사용하므로，　대립유전자　뉴클레오티드와　완벽한　염기쌍을　이루는　프라이머는　연장　반응을　수행하게　되나，　나머지　３개의　프라이머는　연장　반응을　수행할　수　없게　되는　점을　이용한　것이다.
그러나，　상술한　ASPE에　의하여　대립유전자　뉴클레오티드를　실제　실험적으로　분석하는 경우，　프라이머의　3'－말단이　완벽한　염기쌍을　이루지　못하더라도，　표적　핵산　서열과의　혼성화　반응에　의해　생긴　이중사슬의　구조　변화가　크지　않아，　효소에　의한　프라이머　연장　반응이　수행되기　 때문에，　대립유전자　뉴클레오티드를　정확하게　분석할　수　없다는　문제점이　있었다．　특히，　프라이머의　3'-말단에　G-T 간의　염기　쌍　형성이　있는　경우에는　후속되는　프라이머　연장　반응이　용이하다.
이에，　본 발명자들은　상기에서　기술한　문제점들을 극복하기　위하여　예의　연구　노력한　결과，　대립유전자－특이적　프라이머의　3'　부분이　표적　핵산의 　대립유전자　뉴클레오티드와 　염기쌍을　이루는　뉴클레오티드，　그리고　적어도 하나 이상의　인위적　불일치　염기를　포함하도록　프라이머를　고안할　때，　대립유전자　뉴클레오티드와　완벽한　염기쌍을　이루지　못하는　프라이머들의　경우에서는　프라이머　3'-말단　근처의　불일치　염기쌍에　의한　프라이머　연장　반응이　완전히　차단되어，　대립유전자　뉴클레오티드를　정확하게　분석할　수　있음을　확인하고，　본　발명을　완성하게　되었다.
결국，본　발명의 목적은 프라이머가 고정된 DNA칩 상에 수행하는 ASPE 반응에서, 프라이머의　３'－말단　근처에 인위적인 불일치　염기를 도입하므로써，　프라이머간의 식별을 증가시키는　방법을　제공하는　것이다.
도 1은　１４개　변이　위치를　나타내는　정상　HNF-1α　엑손２의　유전자　서열이다.
도　２는　종래의　ASPE(allele-specific primer extension) 방법（a)과，　인위적　불일치　염기를　포함하는　프라이머를　이용한　본　발명의　ASPE　방법(b)을　수행하기　위한 프라이머와　표적　핵산의　염기서열을　나타낸다.
도 3은 도 2에 나타낸 프라이머와 표적 핵산을 사용하여 종래의 ASPE 방법과 본 발명의 ASPE 방법으로, PM（perfect match)과　MM(mismatch)의　형광　강도를　비교한 결과이다.
도　４는　정상인의　지놈　DNA로부터　증폭한　HNF-1α　엑손２의　유전자（단일가닥　RNA)를　표적　핵산으로　하고， 프라이머　연장　반응의 시간을　달리하여　본　발명의　ASPE 방법으로　실험한　결과（형광　강도）를　나타낸다．
이하, 본　발명을　보다　구체적으로 설명하고자 한다.
본　발명의　목적을　달성하기　위하여，DNA칩에　고정화되는　프라이머의　3'　부분(3' portion)이　표적　핵산의 대립유전자　다양성　위치의　뉴클레오티드（이하, '대립유전자　뉴클레오티드'라고 함）와 　염기쌍을　이루는　뉴클레오티드，　그리고　적어도 하나 이상의　인위적　불일치　염기를　포함하도록　프라이머를　고안한다．
바람직하게는，　표적　핵산의 　대립유전자　뉴클레오티드와 　염기쌍을　이루는　뉴클레오티드는　대립유전자－특이적　프라이머의　3'-말단에서부터　２번째∼４번째　뉴클레오티드에　위치하도록，　적어도 하나 이상의　인위적　불일치　뉴클레오티드는　전기　대립유전자　뉴클레오티드와　염기쌍을　이루는　뉴클레오티드로부터　5'- 또는 3'- 방향으로　1 번째∼ 2번째　뉴클레오티드에　위치하도록，프라이머를　고안한다．　가장　바람직하게는，　표적　핵산의 　대립유전자　뉴클레오티드와 　염기쌍을　이루는　뉴클레오티드는　대립유전자－특이적　프라이머의　3'-말단에서부터　２번째　뉴클레오티드에　위치하도록，　적어도 하나 이상의　인위적　불일치　뉴클레오티드는　전기　대립유전자　뉴클레오티드와　염기쌍을　이루는　뉴클레오티드로부터　5'-방향으로　1 번째　뉴클레오티드에　위치하도록，프라이머를　고안한다.
상기에서，　인위적　불일치　뉴클레오티드는　이에　대응하는　표적　핵산의　뉴클레오티드와　비　왓슨－클릭　염기쌍（non Watson-Crick base pair）을　이루는 자연적인 뉴클레오티드는　모두　가능하다．　바람직하게는，　퓨린－퓨린 염기쌍(purine-purine　base pair) 또는 피리미딘-피리미딘 염기쌍(pyrimidine-pyrimidine　base pair）을　이용한다．　아울러，　상기와　같은 자연적인 염기　외에도，　인위적인　염기，　바람직하게는　보편적인(universal) 염기를 이용할 수도 있다. 　보편적인　염기는　DNA의 이중나선　구조를 와해시키지 않으면서 베이스　스태킹（base stacking）을　최대화하는 인위적　염기이다．　바람직한　보편적인　염기에는　3-니트로피롤（nitropyrrole）이　있고，　이　염기는　표적　핵산에 있는 4개의 뉴클레오티드 A, C, G, 및 T에 동일한 세기로 결합되기 때문에 불일치 쌍(mismatch pairs)의 조합에 따른 변화(variation)를 줄일 수 있는 장점이 있다.
본 발명의　ASPE　방법에 사용되는　표적　핵산은　단일　가닥의 DNA　또는　RNA， 혹은　이중　가닥　DNA이다. 이들은 지놈 DNA로부터 PCR이나 시험관내 전사(in vitro transcription)의 과정을 통해 얻을 수 있다.
본 발명의 ASPE 방법에서 프라이머　연장　반응에　사용되는　중합효소는　표적 핵산의 종류에　따라　다르다．　　표적　핵산이　DNA인　경우에는 T4 DNA 중합효소， T7 DNA 중합효소 또는 T. aquaticus DNA 중합효소　등이고，　표적　핵산이　RNA인　경우에는 레트로바이러스의　역전사효소　등이다.
본 발명의 ASPE 방법에서 프라이머에 첨가되는 표지된 dNTP은, 예컨대 광흡광도(light absorbance) 측정, 형광(fluorescence) 측정, 형광 분극화(fluorescence polarization) 측정 또는 질량 분광측정(mass spectrometry)과 같은 스크리닝방법들중 어느 하나에 의해 검출될 수 있는 어떤 dNTP도 가능하나, 바람직하게는 형광 시그날을 방출하는 Cy3-dUTP 또는 Cy3-dCTP을 사용한다. 이들의 양은 레이저 스캐너(laser scanner)에 의하여 분석되며, 대립유전자에 특이적인 프라이머에 따라서 나타나는 형광 시그날(fluorescent signal)의 차이로부터 DNA의 변이를 식별할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게서 자명할 것이다.
실시예　1:　스폿팅에 의한 DNA 칩의　제작
하기　표　１에서와　같은　서열의　올리고뉴클레오티드　프로브（이는　후술하는　실시예의　ASPE　반응에서　이용되는　프라이머에　해당한다）를 100 mM NaHCO3(pH=9.0) 용액에　첨가하고　교반하여　37 ℃에서　1시간 동안　방치한　다음，　이를　스폿팅　용액으로　사용하였다.　상기　스폿팅　용액을，　아민기를　갖도록　표면처리된　유리　표면　위에　스폿팅한 후，4시간 동안 37 ℃의　습한　챔버（wet chamber）에서 방치하였다. 이어, 배경 노이즈의 제어(background control)에 필요한 공정， 즉　표적　핵산이　유리　표면에　부착하지　않도록　하기　위해　스폿팅되지　않은　위치의　유리　표면　아민기가　음전하를　띄도록　반응을　실행하고 건조기에 보관하였다.
하기 표　１의　프로브는　HNF-1α(hepatocyte nuclear factor-1)　유전자의　엑손（exon)　２에　위치하는　１４개　변이를　검출할　수　있는　서열을　가진다．　표　１에서，　진한　글씨의　프로브　서열은　변이가　없는　정상의　엑손　２　유전자와　상보적인　서열이고，　그　바로　아래　옅은　글씨의　프로브　서열은　점　돌연변이（point mutation)가　초래된　엑손　２　유전자와　상보적인　서열이다． 이들 프로브들은 본 발명에 따라서 표적　핵산의　변이　염기에 상보적인　뉴클레오티드를 3' 말단에서 두번째 위치에 놓고， 인위적인　불일치　뉴클레오티드를 ５'　방향의　바로　옆에 위치시켜 제조되었다.
도　１은　１４개　변이　위치를　나타내는　정상　HNF-1α　엑손２의　유전자　서열이다（서열번호　１）．　　도　１에서，　빨간색으로　진하게　표시된　뉴클레오티드는　변이가　초래되는　위치를　나타내고，　밑줄친　부분은　하기　실시예　３에서　사용되는　센스 프라이머와　안티센스 프라이머에　해당하는　염기　서열을　나타낸다.
변이＃ 변이　위치 프로브　서열
코돈번호 뉴클레오티드　번호
１ 117 1778 5'-TAGGACTTGACCATCGTC-3'(서열번호　２)5'-TAGGACTTGACCATCGCC-3'（서열번호３)
２ 122 1794 5'-TTGTGCTGCTGCAGTTA-3'（서열번호４)5'-TTGTGCTGCTGCAGTCA-3'（서열번호５)
３ 128 1812 5'-CCTCCCGCTGTGGTAT-3'(서열번호６)5'-CCTCCCGCTGTGGTTT-3'（서열번호７)
４ 129 1814 5'-ACCTCCCGCTGTTGG-3'(서열번호８)5'-ACCTCCCGCTGTTTG-3'（서열번호９)
５ 131 1820 5'-TATCGACCACCTCCAGC-3'(서열번호１０)5'-TATCGACCACCTCCAAC-3'（서열번호１１)
６ 131 1822 5'-GTATCGACCACCTCACG-3'(서열번호１２)5'-GTATCGACCACCTCATG-3'（서열번호１３)
７ 133 1826 5'-CAGTGGTATCGACCTCC-3'(서열번호１４)5'-CAGTGGTATCGACCTTC-3'（서열번호１５)
８ 142 1854 5'-GTTGGGACAGGTGCGA-3'(서열번호１６)5'-GTTGGGACAGGTGCAA-3'（서열번호１７)
９ 143 1856 5'-TGTTGGGACAGGCGG-3'(서열번호１８)5'-TGTTGGGACAGGCAG-3'（서열번호１９)
１０ 158 1903 5'-AGGGCGGCCCACT-3'(서열번호２０)5'-AGGGCGGCCCTAT-3'（서열번호２１)
１１ 159 1904 5'-ACAGGGCGGCCAGC-3'(서열번호２２)5'-ACAGGGCGGCCAAC-3'（서열번호２３)
１２ 159 1905 5'-TGTACAGGGCGGCACG-3'(서열번호２４)5'-TGTACAGGGCGGCATG-3'（서열번호２５)
１３ 161 1910 5'-CCAGGTGTACAGGCCG-3'（서열번호２６)5'-CCAGGTGTACAGGCTG-3'（서열번호２７)
１４ 171 1940 5'-CTGCGCCACCTCTAGC-3'(서열번호２８)5'-CTGCGCCACCTCTAAC-3'（서열번호２９)
실시예　２:　지놈　DNA(genomic DNA) 분리
지놈　DNA의 분리는　핵산 추출 키트(QAIGEN，USA)을 이용하였다. 사람 혈액 10ml에 완충용액 (1.28M 수크로스, 20mM MgCl2, 4% Triton X-100，40mM Tris-HCl, pH 7.5)　10ml, 증류수 30ml을 넣고 반응시킨 후, 얼음하에서　10분간 방치하고 미리 설정해 둔 원심분리기에　넣고 15분간 4000rpm으로 원심분리하였다. 　상층액을 제거하고 상기　완충용액으로　재현탁 및 원심분리를 2회 반복하여 혈구 세포를 분리하였다. 　분리된 혈구 세포에 5ml 완충용액(800mM 구아니딘－HCl, 30mM EDTA, 5% Tween-20, 0.5% Triton X-100, 30mM Tris-Cl, pH 8.0)을　넣고 볼텍싱하여 재현탁시킨 후, 200㎕의 단백질 분해효소(proteinase) K용액(10mg/ml)을 넣고, 50℃ 항온 수조에서 1시간 동안 반응시켜 혈구 세포를 완전히 파괴시켰다. 　전기　세포　용해액을 Genomic-tip 100/G 필터에 넣어 4000rpm으로 원심분리하고, 완충용액(1.25M NaCl, 15% 이소프로판올，50mM Tris-Cl, pH 8.5）을 넣고 다시 원심분리하여 지놈 DNA를 회수하였다. 　회수된 DNA　용액에 이소프로판올을 가하고 잘 혼합한 다음, 4000rpm에서 15분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 　70% 에탄올을 이용하여 침전물을 2회 반복 세척하고, 다시　4000rpm에서 원심 분리하여 침전물을 수득하였다. 이때 얻은 침전물을 잘 건조시킨　후, 10mM Tris-HCl（pH8.0）용액을 첨가하여 완전히 용해시켜 선택적으로 순수한 지놈 DNA를 수득히였다.
정제된 DNA는 분광광도계를 이용하여 농도를 측정하고, 하기 실시예에서 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 'PCR'이라 하기로 함)을 효율적으로 수행할 수 있도록 농도를 50ng/ul로 일정하게 조절하였다.
실시예　３:　중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 HNF-1α　유전자의　엑손２ 증폭
실시예　２에서　분리된　정상인의　지놈　DNA로부터 HNF-1α　유전자의　엑손２　단편을 증폭하기 위해서, 다음과 같이 중합효소 연쇄반응（총　반응액　50㎕）을　수행하였다.
인간 지놈 DNA 50ng, 열안정성 DNA 폴리머라제　2.5U, 200μM dNTP(dATP,dTTP, dGTP, dCTP), 50mM Tris-HCl（pH8.3）, 40mM KCl, 1.5mM MgCl2,　25pmol의 센스 프라이머(5'-taatacgactcactatagggCGAAGATGGTCAAGTCCTACCT-3'；　염기서열　３０)와 25pmol의 안티센스 프라이머(5'-GCCACCTCTCGCTGCTTGC；　염기서열　３１)를 이용하여，　변성(94℃,　30 초），어닐링(55℃，　30초），연장(72℃， 45초）를 1주기로 하여 35회 반복 시행하였고, 예비변성(pre-denaturation)과 최종 연장(last-extension)은 각각 94℃에서 5분, 72℃에서 5분간 수행하였다. 상기의　센스　프라이머는 5' 말단에 박테리오파지 T7 프로모터 서열(소문자로　표시）을 함유한다.
이렇게 하여 증폭된 PCR 산물(175bp）은 하기 실시예 ４의 시험관내 전사(in vitro transcription)를 통하여 라벨링된 단일가닥 RNA를 생성시키는데 사용된다.
실시예　4:　시험관내 전사를　통한 단일가닥 RNA의 제조
실시예　３에서　증폭된　PCR 산물 350ng, 40mM Tris-HCl（pH7.5）, 6mM MgCl2, 2mM 스퍼미딘（spermidine）, 10mM NaCl, 2mM DTT, 1mM의 각각 ATP, CTP, GTP, UTP　및 T7 RNA 중합효소(Promega, USA)로　구성된　혼합액（총부피　20 ㎕）을　37℃에서 3시간　반응시켰다.　 반응이 종결되면, QIAquick Nucleotide Removal kit(QAIGEN， USA)을 이용하여 정제하고, 최종적으로 10mM Tris-HCl(pH 8.0) 용액을 첨가하여 순수한 단일 가닥의 RNA만을 수득하였다.
실시예　５:　프라이머 연장　반응　 및　그의　민감도　측정
실시예　４에서　제조한　단일 가닥 RNA　10㎕(30nM), 10mM DTT, 3mM MgCl2,75mM KCl, 200 μM dATP, 200 μM dGTP, 10μM Cy3-dUTP, 10μM Cy3-dCTP, 200U 역전사효소(M-MLV Reverse Transcriptase)를 잘 혼합（총　부피　３0㎕）한　다음，　상기　실시예　１에서　제조한　DNA 칩(chip) 위에 떨어　뜨리고，　커버　글래스를 덮어 용액이 잘 퍼지도록 한 후 37℃에서 하룻밤 혼성화시켰다.　이때 단일 가닥 RNA는 칩에 고정화된 HNF-1α　엑손２프로브（프라이머）와 혼성 반응이 일어나며, 동시에 역전사효소에　의해 RNA를 주형으로 하여　프라이머 연장반응이 일어난다.
그런　다음，　슬라이드는 6XSSPET용액(0.9M NaCl, 60mM NaH2PO4, 6mM EDTA(pH8.0), 0.005%(v/v)Triton X-100)으로 5분간 1회, 3XSSPET(0.45M NaCl, 30mM NaH2PO4, 3mM EDTA(pH8.0), 0.005%(v/v)Triton X-100)로 역시 1회 세척하였다.
프라이머 연장　반응의　민감도는　Cy3의 형광 시그널을 스켄어레이 스캐너(ScanArray Scanner)를 사용하여 레졸루션 10㎛ pixel로 검출하였다(GSI Lunonics).
도　２는　종래의　ASPE　방법（a)과，　인위적　불일치　염기를　포함하는　프라이머를　이용한　본　발명의　ASPE(b)　방법을　수행하기　위한 프라이머와　표적　핵산의　염기서열（완벽한　염기쌍을　이루는　경우（perfect match(PM))와　프라이머의　３'말단　염기가　불일치하는　경우(mismatch(MM)）을　나타낸다.
도 ３은　도　２에　나타낸　프라이머와　표적　핵산을　사용하여（표적　핵산　서열은 5'-TCGTTGGTCGAAACGGAC-3'이고，변이　위치는 5'말단으로부터 6번째 염기인 G로　표기하였음, 서열번호 3２)， 종래의　ASPE 방법과 본 발명의 ASPE 방법으로，PM과　MM을　분별하는 정도를　비교한 결과이다．　도　３에서는　네 　스폿씩　스폿팅하였는데， 스폿　크기는 170 ±5um이고, 스폿간의 간격은 375um로 조절하였다.
도　３에서，　종래의　ASPE 방법으로　실험한　경우에서，PM은　DNA칩에　고정화된 프로브가 5'-GTCCGTTTCGACC-3'（3'말단의 C는　표적　핵산의　변이　위치에　대응함，서열번호 3３)　인　서열의　프라이머인　경우를　나타내고，MM１은　３'말단　염기가 G이라는　점을　제외하고는　서열번호　３3과　동일한　서열의　프라이머를 나타내고，MM２는　３'말단 염기가 A이라는　점을　제외하고는　서열번호　３３과　동일한　서열의　프라이머를 나타내고，MM３는 ３'말단 염기가 T이라는 점을　제외하고는　서열번호　３３과　동일한　서열의 프라이머를 나타내며； 본 발명의 ASPE 방법으로 실험한　경우에서, PM은　DNA칩에　고정화된 프로브가 5'-GTCCGTTTCGTCC-3'（3'말단으로부터 2번째 염기인 C는　표적　핵산의　변이　위치에　대응하고，3'말단으로부터 3번째 염기인 T는　불일치　염기를　나타냄，서열번호 3４)인　프라이머를　나타내고（검색대상의　염기에 상보적인　뉴클레오티드를 3' 말단에서 두번째 위치에 놓고， 인위적인　불일치　뉴클레오티드를 ５'　방향의　바로　옆에 위치시킨다），　MM１은　３'말단에서 두번째 위치의　염기가 G이라는　점을　제외하고는　서열번호　３４와　동일한　서열의　프라이머를 나타내고，MM２는　３'말단에서 두번째 위치의 염기가 A이라는　점을　제외하고는　서열번호　３４와　동일한　서열의　프라이머를 나타내고，MM３는 ３'말단 에서 두번째위치의　염기가 T이라는 점을　제외하고는　서열번호　３４와　동일한　서열의 프라이머를 나타낸다.
도　３에서　보듯이，　종래의　방법에서는　PM과　MM의　구별이　크지　않은　반면에，　본　방명의　방법에서는 　시그날의　강도가　 8414(PM)와 1322(MM２)로　나타나，　　PM과　MM의　변별력　차이가　큼을　알　수　있었다.
도　４는　상기　실시예들의　방법으로　ASPE（ 프라이머　연장　반응의 시간은　각각　３０분，　１시산，　２시간） 하여　스캐닝한　결과를　나타내며，　하기　표　２는　도　４에　나타난　형광의　강도를　수치화한　표이다．　도　４에서는 각 변이　위치의 두가지 대립유전자에 해당되는 염기를　분석（genotyping）할　수　있는 프라이머를 나란히（side by side） 스폿팅한 DNA 칩을　이용하여 실험을 수행하였는　바，　상기　표　１에　해당하는　프로브들(변이# 1 내지 14)을　순서대로　같은　행에서는　왼쪽에서　오른쪽　방향으로，　그　행을　채운　후　다음　행으로　이동하여　왼쪽에서　오른쪽　방향으로　스폿팅하였다.
도　４ 및　표　２에서　보듯이，프라이머　연장　반응의　시간에 따라서 시그날의　강도와　I(PM)/I(MM) 비율의 차이가 관찰되나， 정상　표적　핵산에 대한 염기　분석　정확도는　100%로 나타났다. 　14개의 모든 변이　위치에 대하여　염기　분석하는 기준은 I(PM)/I(MM) 비율의 값이 >1으로 나타나면，　PM에 해당되는 염기로　결정하고， I(PM)/I(MM) 비율이　 <1일 경우 MM에　해당되는　염기로　결정한다． 　따라서，　본 발명에 의하여 디자인된　프라이머들이 여러 가지의 변이점을　포함하는 실제　표적　핵산에　대하여 제대로 염기　분석함을　알　수　있었다.
이상에서 설명하고 입증하였듯이, DNA칩　상에서 수행되는　ASPE에서， 유리 표면에 고정화된 프라이머의　３'　부분에 인위적인 불일치　염기를　포함시키므로써 프라이머의 식별을 증가시키는 본 발명에　의하면，　기존의 방법에 비해　염기　서열　분석의　정확도를　획기적으로　개선시킬 수 있다．　따라서，　본　발명의　방법은 삽입（insertion）과 　결실（deletion）의　변이　검출에도　매우　효과적으로　이용될　수　있다.

Claims (7)

  1. ①　대립유전자　다양성（allelic variation）위치를　포함하는　표적　핵산을　준비하는　단계；
    ②　올리고뉴클레오티드　프라이머의　３'－부분（３'－portion)이　상기에서　준비된　표적　핵산의　대립유전자　다양성　위치의　뉴클레오티드（대립유전자　뉴클레오티드）와　염기쌍을　이루는　뉴클레오티드，　그리고　적어도 하나 이상의　인위적　불일치　염기를　포함하도록　프라이머를　합성한　다음，　그　프라이머를　고체　기판에　고정화시키는　단계；
    ③　상기　②의　기판에　고정화된　프라이머와　상기　①에서　준비된　표적　핵산을　혼성화시킨　다음，　표지된　dNTP 및　중합효소를　첨가하여　프라이머　연장　반응시키는　단계；및，
    ④ 상기　③의　연장　반응　산물을　스크리닝하는 단계를 포함하는,
    대립유전자－특이적　프라이머　연장반응에서 프라이머 간의 식별을　증가시키는　방법．
  2. 제　１항에　있어서，　표적　핵산의 　대립유전자　뉴클레오티드와 　염기쌍을　이루는　프라이머 뉴클레오티드는　프라이머의　3'-말단에서부터　２번째∼４번째　뉴클레오티드에　위치하고；　적어도 하나 이상의　인위적　불일치　뉴클레오티드는　표적　핵산의　대립유전자　뉴클레오티드와　염기쌍을　이루는　뉴클레오티드로부터　5'- 또는 3'- 방향으로　1 번째∼ 2번째　뉴클레오티드에　위치하는　것을　특징으로　하는　방법．
  3. 제　２항에　있어서，　표적　핵산의 　대립유전자　뉴클레오티드와 　염기쌍을　이루는　프라이머　뉴클레오티드는　프라이머의　3'-말단에서부터　２번째　뉴클레오티드에　위치하고；　적어도 하나 이상의　인위적　불일치　뉴클레오티드는　표적　핵산의　대립유전자　뉴클레오티드와　염기쌍을　이루는　프라이머　뉴클레오티드로부터　5'- 방향으로　１번째　뉴클레오티드에　위치하는　것을　특징으로　하는　방법．
  4. 제 1항　내지　제　３항　중　어느　한　항에　있어서, 인위적　불일치 뉴클레오티드는　그와　대응하는　위치의　표적　핵산　뉴클레오티드와　비　왓슨－클릭　염기쌍（non Watson-Crick base pairing）을 이루는 자연적　혹은　인위적　염기（natural or artificial base)인 것을　특징으로　하는　방법．
  5. 제　４항에　있어서， 자연적　염기는　표적　핵산의　뉴클레오티드와　퓨린－퓨린　염기쌍 (purine-purine　base pair) 또는　피리미딘-피리미딘 염기쌍 (pyrimidine-pyrimidine　base pair）을　이루는　것을　특징으로　하는　방법．
  6. 제　４항에　있어서， 인위적　염기는　이중나선　구조를 와해시키지 않으면서 베이스　스태킹（base stacking）을　이루는　보편적　염기（universal base）인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 표적　핵산은　단일　가닥의 DNA　또는 RNA，　혹은　이중　가닥의　DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
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